Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết nước từ thực vật tại vườn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng

Nội dung text: Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết nước từ thực vật tại vườn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ LOẠI CAO CHIẾT NƯỚC TỪ THỰC VẬT TẠI VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP NÚI BÀ, TỈNH LÂM ĐỒNG Ngành: CÔNG NGHÊ ̣ SINH HOC̣ Chuyên ngành: CÔNG NGHÊ ̣ SINH HOC̣ Giảng viên hướng dẫn : Th.S Phaṃ Minh Nhưṭ Sinh viên thực hiện : Trần Thi ̣Tú Vy MSSV: 1211100244 Lớp: 12DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2016
2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM KẾT Tôi xin cam đoan những nội dung tôi viết trong đồ án này đều do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của ThS Phạm Minh Nhựt khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong đồ án còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình. Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Trần Thị Tú Vy
3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời tri ân đến thầy Phạm Minh Nhựt đã tận tình chỉ dạy em trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Xin cảm ơn thầy về những buổi học trên lớp, những buổi nói chuyện, thảo luận, nhờ đó em đã củng cố thêm sự đam mê và định hướng được nghiên cứu khoa học của mình. Ngoài ra, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cho em trong suốt quãng thời gian học tập tại Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM. Những kiến thức và kinh nghiệm này không chỉ giúp em thực hiện đồ án tốt nghiệp mà còn là nền tảng kiến thức cho công việc sau này. Em cũng xin cảm ơn thật nhiều những giúp đỡ và hỗ trợ từ các bạn cùng thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm – những người luôn sát cánh, động viên em hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Cuối cùng, em xin cảm ơn các thầy cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án. Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến thầy cô. Do kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế nên đồ án tốt nghiệp của em sẽ có nhiều sơ sót, mong thầy cô chỉ bảo để em được hoàn thiện đồ án này thật tốt cũng như củng cố kiến thức cho công việc sau này. Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Trần Thị Tú Vy
4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Đăṭ vấ n đề 1 2. Tınh̀ hınh̀ nghiên cứ u 2 3. Mục tiêu nghiên cứu 2 4. Nội dung nghiên cứu 3 5. Phạm vi nghiên cứu 3 6. Kết cấ u củ a Đồ á n tố t nghiêp̣ 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4 1.1. Vai trò của cây thuốc dân gian trong đời sống 4 1.1.1 Vai trò của cây thuốc nam trong đời sống 4 1.1.2 Lơị ı́ch của viêc̣ sử dung̣ thuốc 5 1.1.3 Tı̀nh hı̀nh sử dung̣ cây thuốc nam 6 1.2 Thành phần hóa học của thực vật 7 1.2.1 Carbohydrate 7 1.2.1.1 Khái niệm 7 1.2.1.2 Tính chất 7 1.2.1.3 Vai trò 8 1.2.2 Amino acid 8 1.2.2.1 Khái niệm 8 1.2.2.2 Tính chất 9 1.2.2.3 Vai trò 9 1.2.3 Glycosides 9 1.2.3.1 Khái niệm 9 1.2.3.2 Tính chất 10 1.2.3.3 Tác dung̣ 11 1.2.4 Alkaloid 11 1.2.4.1 Khái niệm 11 1.2.4.2 Tính chất 11 1.2.4.3 Vai trò 12 1.2.5 Steroids 12 1.2.5.1 Khái niệm 12 i
5. Đồ án tốt nghiệp 1.2.5.2 Tính chất 12 1.2.5.3 Vai trò 12 1.2.6 Tannin 14 1.2.6.1 Khái niệm 14 1.2.6.2 Tı́nh chất 14 1.2.6.3 Vai trò 15 1.2.7 Isoprenoid (Terpene) 15 1.2.7.1 Khái niệm 15 1.2.7.2 Tính chất 16 1.2.7.3 Vai trò 16 1.3 Tổng quan về kháng khuẩn thực vật 16 1.3.1 Khái niệm 16 1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn 16 1.3.3 Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật 18 1.3.3.1 Alkaloids 18 1.3.3.2 Terpenoids và tinh dầu 20 1.3.3.3 Phenol đơn và acid phenolic 21 1.3.3.4 Saponin 24 1.3.3.5 Lectin và polypeptide 25 1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình 25 1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 25 1.4.1.1 Escherichia coli 25 1.4.1.2 Shigella 26 1.4.1.3 Salmonella 27 1.4.1.4 Vibrio 28 1.4.1.5 Listeria 29 1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da 30 1.4.2.1 Pseudomonas aeruginosa 30 1.4.2.2 Staphylococcus aureus 32 1.4.2.3 Enterococcus feacalis 33 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 ii
6. Đồ án tốt nghiệp 2.1 Địa điểm và thời gian 34 2.1.1 Địa diểm 34 2.1.2 Thời gian 34 2.2 Vật liệu 34 2.2.1 Nguồn mẫu phân tích 34 2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị 35 2.2.3 Hóa chất, môi trường 36 2.2.4 Dụng cụ, thiết bị 36 2.3 Phương pháp nghiên cứu 37 2.3.1 Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu 37 2.3.2 Phương pháp tăng sinh VSV chı ̉ thi ̣ 37 2.3.3 Phương pháp định lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đo OD 38 2.3.4 Phương pháp bảo quản và giữ giống 39 2.3.5 Phương pháp tách chiết cao 39 2.3.6 Chuẩn bi dung̣ dicḥ cao thuốc kháng sinh 39 2.3.7 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) . 39 2.3.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học 41 2.3.8.1 Carbohydrate 41 2.3.8.2 Alkaloid 41 2.3.8.3 Saponin (thử nghiệm Foam) 42 2.3.8.4 Cardiac glycosides 42 2.3.8.5 Anthaquinone glycosides (thử nghiệm Bontrager) 43 2.3.8.6 Flavonoid 43 2.3.8.7 Phenolic 43 2.3.8.8 Tannin 45 2.3.8.9 Steroid 45 2.3.8.10 Amino acid 45 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 46 2.4 Sơ đồ bố trı́ thı́ nghiêṃ tổng quá t 47 2.4.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiêụ quả chiết cao chủa dung môi nướ c đối vớ i các mẫu cây 48 2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết nước 50 iii
7. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.1 Thuyết minh quy trình 51 2.4.2.2 Đọc kết quả 51 2.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định thành phần hóa học của các cao chiết. 52 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao 54 3.2 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cá c mẫu cao chiết nướ c 55 3.2.1 Kết quả đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn E. coli . 55 3.2.2 Kết quả đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn Listeria 37 3.2.3 Kết quả đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn Salmonella 39 3.2.4 Kết quả đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn Shigella 40 3.2.5 Kết quả đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn Vibrio . 42 3.2.6 Kết quả đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hôị trên da 44 3.2.7 Tổng hơp̣ kết quả các kết quả kháng khuẩn 45 3.3 Kết quả thử nghiêṃ đinḥ tı́nh xác định thành phần hóa học củ a cá c mẫu cao chiết nướ c 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 4.1 Kết luận 52 4.2 Đề nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 iv
8. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Aco: cây thuốc Acorus sp. Cal: cây thuốc Calamus sp. CIP 8: kháng sinh Cirproflaxacin 8mg/ml CIP 500: kháng sinh Cirproflaxacin 500mg/ml Ele: cây thuốc Elephatopus sp. Euo: cây thuốc Euodia sp. Eup: cây Eupatorium sp. Lan: cây thuốc Lantana sp. Med: cây thuốc Medinilla sp. Pod: cây thuốc Podocarpus sp. Pol: cây thuốc Polygala sp. Ste: cây thuốc Streptocaulon sp. Xid: cây thuốc Xidi klung VSV: vi sinh vâṭ v
9. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 1.1 Môṭ số Glycoside phổ biến 9 Bảng 3.1 Kết quả kháng khuẩn của các cao chiết khác nhau trên tổng số 20 chủng vi sinh vật khảo sát 47 Bảng 3.2 Bảng kết quả thành phần hóa hoc̣ của các mẫu cao chiết nướ c 49 vi
10. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THI ̣ Hình 1.1 Một số cây thuốc nam phổ biến 4 Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của các loại Carbonhydrate 8 Hı̀nh 1.3 Alanine – Môṭ amino acid 8 Hı̀nh 1.4 Cardenolic và Bufadiennolid 11 Hı̀nh 1.5 Ephedrin và Hyoscyamin 11 Hı̀nh 1.6Testosteron 12 Hı̀nh 1.7 Mô ̣t số tannin 14 Hı̀nh 1.8 Limonene và Ocimene 15 Hình 1.9 Các cơ chế kháng sinh 17 Hình 1.10 Solamargine 19 Hình 1.11 Berberine 20 Hình 1.12 Một số Terpenenes và Terpenoid 21 Hình 1.13 Một số Quinones thông thường 22 Hình 1.14 Gallotannin và Gallic acid 23 Hình 1.15 Một số Flavonoid 24 Hı̀nh 1.16 Saponin 24 Hı̀nh 1.17 Các cấu trúc của peptide 25 Hình 1.18 Hình ảnh Escherichia coli O157: H7 dưới kính hiển vi 26 Hình 1.19 Hı̀nh ảnh của Shigella sp. 27 Hình 1.20 Hình ảnh của Salmonella typhii và Salmonella typhimurium 28 Hình 1.21 Hình ảnh vi khuẩn Vibrio cholerae và Vibrio harveyi 29 Hình 1.22 Hình ảnh của Listeria monocytogenes 30 Hình 1.23 Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa 31 Hình 1.24 Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus 32 Hı̀nh 2.1 Môṭ số dung̣ cu ̣và thiết bi thı̣ ́ nghiêṃ 36 Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu 37 Hı̀nh 2.3 Hı̀nh ảnh về kết quả kháng khuẩn của môṭ mẫu vi khuẩn chı̉ thi ̣(bên trái là không có kết quả kháng khuẩn và và bên phải là có kết quả kháng khuẩn) 41 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 47 vii
11. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.5. Quy trình khảo đánh giá hiêụ quả chiết cao của dung môi nướ c đối vớ i các mẫu cây. 49 Hình 2.6. Dịch lọc qua các lần ngâm của các mẫu cây Xidi klung 49 Hình 2.7. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn 50 Hình 2.8. Quy trình xác định thành phần hóa học 52 Hı̀nh 3.1. Hiêụ suất tách chiết các cao chiết nướ c 54 Hı̀nh 3.2. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Escherichia coli. 37 Hı̀nh 3.3. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Listeria spp. 38 Hı̀nh 3.4. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Salmonella spp. 39 Hı̀nh 3.5. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Shigella spp. 41 Hı̀nh 3.6. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Vibrio spp. 43 Hı̀nh 3.7. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết nướ c đối vớ i các vi khuẩn gây bênḥ về da 44 viii
12. Đồ án tốt nghiệp ix
13. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đăṭ vấ n đề Được đánh giá là bước ngoặc trong lịch sử Y học về điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, kháng sinh ra đời không chỉ được sử dụng trong y học mà còn được sử dụng rộng rãi trong trồng trọt, chăn nuôi gia súc, gia cầm và thủy sản nhằm mục đích tăng trưởng. Việc sử dụng kháng sinh là hết sức cần thiết để điều trị cho người bệnh. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh không hợp lý, lạm dụng kháng sinh, điều trị kháng sinh khi không mắc bệnh lý nhiễm khuẩn đã làm gia tăng tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh. Viêc̣ laṃ dung̣ thuốc kháng sinh để laị các tác haị rất lớn. Môṭ trong những tác haị lớn nhất đó là các VSV không còn nhaỵ cảm vớ i thuốc, dẫn đến viêc̣ điều tri ̣ngày càng khó khăn hơn. Ngoài ra, viêc̣ sử dung̣ kháng sinh liều cao trong môṭ thờ i gian dài se ̃ làm ảnh hưở ng đến chứ c năng của các cơ quan trong cơ thể, chẳng haṇ như sử dung̣ chloraphicol vớ i liều cao se ̃ gây suy tủy. Thực tế, kháng sinh có phổ rộng tiêu diệt cả vi khuẩn xấu và tốt vì vậy nếu dùng không đúng hướng dẫn, lạm dụng sẽ tiêu diệt cả khuẩn có lợi có trong đường ruột, làm mất cân bằng mang tính tự nhiên của cơ thể. Một khi bị mất cân bằng, khuẩn xấu hoành hành, dễ phát sinh nhiều bệnh nan y, như rối loạn dạ dày, làm cho các chứng bệnh nghiêm trọng hơn và làm giảm hiệu quả của thuốc kháng sinh. Vấn đề về thực trạng kháng kháng sinh đã mang tính toàn cầu và đặc biệt nổi trội ở các nước đang phát triển với gánh nặng của các bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí bắt buộc cho việc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới, đắt tiền. Các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hoá, đường hô hấp, các bệnh lây truyền qua đường tình dục và nhiễm khuẩn bệnh viện là các nguyên nhân hàng đầu có tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong cao ở các nước đang phát triển. Việc kiểm soát các loại bệnh này đã và đang chịu sự tác động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn. Có thể nói rằng, vi khuẩn càng phơi nhiễm nhiều với kháng sinh thì “sức ép về thuốc” càng lớn các chủng kháng thuốc càng có nhiều cơ hội để phát triển và lây lan. Đăc̣ biêṭ ở Viêṭ Nam, tình trạng kháng thuốc diễn ra 1
14. Đồ án tốt nghiệp trầm trọng hơn do việc sử dụng kháng sinh tùy tiện khi không có đơn của bác sỹ, người dân có thể tự ý mua kháng sinh ở các hiệu thuốc. Không ít dược sỹ bán thuốc không đúng quy định, các bác sỹ điều trị kê đơn thuốc lạm dụng kháng sinh, chỉ định kháng sinh không phù hợp. Do đó việc phát hiện ra các hợp chất kháng khuẩn mới có nguồn gốc tự nhiên để thay thế kháng sinh tổng hơp̣ trở thành một hướng nghiên cứu rất đáng quan tâm. Vận dụng điều đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết nước từ thực vật tại vườn quốc gia Bidoup Núi Bà, tı̉nh Lâm Đồng”. 2. Tınh̀ hınh̀ nghiên cứ u Từ thờ i xa xưa, cao chiết nước đa ̃ đươc̣ ngườ i dân sử dung̣ rông̣ raĩ trong các bài thuốc tri ̣bênḥ dân gian. Tuy nhiên, những bài thuốc dân gian đó chı̉ dưạ trên kinh nghiêṃ trải qua nhiều đờ i, chưa đươc̣ chứ ng minh bằng thưc̣ nghiêṃ khoa hoc.̣ Thờ i gian gần đây, nhu cầu tı̀m kiếm về môṭ hơp̣ chất kháng sinh mớ i đa ̃ thúc đẩy sư ̣ nghiên cứ u về các công dung̣ của các cây thuốc dân gian ngày càng nhiều hơn. Đa ̃ có rất nhiều công trı̀nh nghiên cứ u về tác dung̣ ứ c chế VSV của các cao chiết nướ c. Parekh và ctv (2006) đa ̃ thưc̣ hiêṇ công trı̀nh nghiên cứ u về tiềm năng của môṭ số mẫu cao chiết nước từ cây thuốc truyền thống ở Ấ n Đô ̣ để làm thuốc kháng khuẩn và từ kết quả nghiên cứ u đa ̃ choṇ ra đươc̣ cây Bauhinia variegata tiếp tuc̣ nghiên cứ u taọ thành chế phẩm thuốc. Bassam Abu-Shanneb và ctv (2006) đa ̃ cũng đa ̃ nghiên cứ u về khả năng ứ c chế chủng Staphylococcus aureus kháng methicillin của cao chiết nướ c từ 4 cây thuốc dân gian ở Palestine. Ngoài ra, môṭ số công trı̀nh nghiên cứ u khác về khả năng kháng khuẩn của cao chiết nướ c của Antara Sen và Amila Batra (2012); Akinvemi và ctv (2006), 3. Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của một số cây thuốc dân gian với dung môi là nước. 2
15. Đồ án tốt nghiệp - Xác định thành phần hóa học có trong một số loại cao chiết nước từ các cây thuốc dân gian. 4. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá ảnh hưởng của dung môi nước đến hiệu suất thu hồi từ các cây thuốc dân gian. - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước của các cây thuốc dân gian. - Xác định thành phần hóa học của cao chiết nước của một số cây thuốc dân gian. 5. Phạm vi nghiên cứu Tiến hành thử nghiệm và khảo sát một số mẫu cây thuốc dân gian đươc̣ lấy từ vườn quốc gia Bidoup, Núi Bà, tı̉nh Lâm Đồng. 6. Nô ̣i dung Đồ á n tốt nghiê ̣p Nôị dung Đồ án tốt nghiêp̣ gồm có 4 chương: Chương 1: Tổng quan – Tóm tắ t tà i liêụ có liên quan đến đồ á n tốt nghiêp.̣ Chương 2: Phương phá p và nôị dung nghiên cứ u Chương 3: Kết quả và thảo luâṇ Chương 4: Kết luâṇ và đề nghi ̣ 3
16. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Vai trò của cây thuốc dân gian trong đời sống 1.1.1 Vai trò của cây thuố c nam trong đời số ng Thuốc nam được coi như những di sản quý báu của dân tộc Việt Nam, danh y Tuệ Tĩnh từng nói “Nam dược trị nam nhân” (thuốc nam chữa bệnh cho người Nam). Từ xa xưa, cây thuốc nam gắn liền với cuộc sống của các gia đình người Việt và có giá trị quý báu trong điều trị bệnh. Chỉ là những cỏ cây gần gũi thân quen xung quanh con người cũng được sử dụng làm bài thuốc chữa bệnh đơn giản, thông thường cho người Việt Nam. Ví dụ, ban đầu củ gừng, củ tỏi chỉ được dùng với mục đích nấu nướng để làm thay đổi và đa dạng hóa mùi vị, tạo ra những thức ăn ngon miệng, nhưng dần dần về sau người ta nhận thấy chúng còn có khả năng làm ấm bụng và dễ tiêu, làm hết đi lỏng do ăn phải những đồ sống lạnh , Hình 1.1 Một số cây thuốc nam phổ biến (từ trái sáng, trên xuống: lô hội, atiso, tía tô, mã đề) 4
17. Đồ án tốt nghiệp Trong dân gian thuốc nam có từ hơn 3.000 năm trước, cùng với sự phát triển của y học cổ truyền. Nước ta có nhiều dược liệu, kể cả cỏ cây, động vật và khoáng vật, trong đó có những thứ rất quý, cần được sưu tầm nghiên cứu và sử dụng để phòng bệnh, chữa bệnh cho nhân dân. Trải qua kinh nghiệm quý báu của cha ông, những bài thuốc nam có tác dụng trong chữa bệnh được lưu truyền từ đời này sang đời khác và được áp dụng hiệu quả. 1.1.2 Lơị ı́ch của viêc̣ sử dung̣ thuố c Trái với Tây y, Đông y xem toàn bộ thân thể người là một hệ thống hoàn chỉnh. Học thuyết về kinh lạc, tử ngọ lưu chú đồ, học thuyết âm dương ngũ hành, đều nhấn mạnh vào chỉnh thể. Từ góc nhìn ấy, Đông y tinh vi hơn Tây y. Tất cả được khái quát lại bằng 7 lợi ích trọng yếu như sau: - Trị bệnh theo các bài thuốc Đông y, tuy thời gian khỏi bệnh có tiến triển chậm hơn, nhưng khi khỏi bệnh thì tỷ lệ tái phát rất thấp hơn so với những phương pháp khác. - Chữa bệnh Đông y trị bệnh từ gốc, Tây y trị bệnh ở ngọn. - Tây y dùng chiết xuất từ dược liệu tự nhiên nhưng thành phần chủ yếu là tinh chất và hàm lượng rất lớn nguyên liệu. Trong khi đó, các hoạt chất tồn tại trong mỗi cây thuốc Đông y là phức hợp và liều lượng phù hợp. Vì vậy, khi dùng thuốc từ cây cỏ hoa lá tự nhiên ngoài tác dụng chữa bệnh sẽ ít những phản ứng phụ gây hại cho con người. - Không gây tổn hại gan, thận như thuốc Tây bởi thuốc Đông y không sản sinh độc tố nên ít gây tổn hại cho cơ thể. - Nền y học phương Tây mặc dù có nhiều tiến bộ hơn châu Á và châu Phi, nhưng khả năng đề kháng với các loại bệnh tật của họ lại yếu hơn người ở hai châu lục này. Điều này chứng tỏ thói quen dùng thuốc Tây làm giảm đi khả năng miễn dịch của cơ thể. Còn dùng thuốc từ cỏ cây hoa lá giúp cho hệ miễn dịch tốt hơn. 5
18. Đồ án tốt nghiệp - Người dùng thuốc Tây nhiều có khả năng bị ung thư cao hơn gần 10 lần so với người có thói quen dùng thuốc Đông y. - Thuốc Tây tuy tiện lợi nhưng thời gian sử dụng là hữu hạn. Thuốc Đông y dễ trồng, dễ tìm: Xung quanh chúng ta đâu đâu cũng là cây thuốc, vị thuốc hữu ích. 1.1.3 Tı̀nh hı̀nh sử dung̣ cây thuố c nam Ngay từ thời xa xưa khi con người còn sống trong xã hội nguyên thủy, người ta đã biết lựa chọn và sử dụng các loại cây cỏ sẵn có để làm thuốc chữa bệnh và bảo vệ sức khỏe. Vốn kinh nghiệm này ngày càng được tích lũy, sàng lọc và bổ sung thêm để tạo dựng nên một nền Y – Dược học cổ truyền có bản sắc riêng trong cộng đồng các dân tộc Việt Nam. Và trên thực tế, nền Y học cổ truyền (YHCT) đó đã đảm nhận vai trò chăm sóc và bảo vệ sức khỏe của nhân dân và đồng hành cho đến khi có Y học hiện đại (YHHĐ) du nhập vào nước ta. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, thích hợp cho sự phát triển của cây trồng nói chung. Một số vùng cao lại có khí hậu á nhiệt đới, phù hợp với việc trồng cây thuốc ưa khí hậu mát. Đất đai ở miền núi nước ta, đặc biệt trên dãy Trường Sơn rộng lớn, còn rất nhiều đất hoang chưa được khai thác sử dụng để phát triển kinh tế. Theo N.B. Hoạt (2002), đất chưa sử dụng ở huyện Sa Pa (Lào Cai) còn 40.463 ha (chiếm 59,7% diện tích), trong đó có 8.874 ha đất có độ dốc dưới 200 có thể khai thác cho sản xuất nông nghiệp, và 25.766 ha đất đồi núi chưa sử dụng. Từ trước đến nay, nhiều địa phương trong nước ta đã có truyền thống trồng cây thuốc, như Quế (ở Yên Bái, Thanh Hoá, Quảng Nam, Quảng Ngãi ), Hồi (ở Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Giang, Lai Châu), Hoè (ở Thái Bình). Có những làng chuyên trồng cây thuốc như Đại Yên (Hà Nội), Nghĩa Trai (Văn Lâm, Hưng Yên). Gần đây, nhiều loài cây thuốc ngắn ngày cũng được trồng thành công trên quy mô lớn như Ác ti sô, Bạc hà, Cúc hoa, Địa liền, Gấc, Hương nhu, Ích mẫu, Kim tiền thảo, Mã đề, Sả, Thanh cao hoa vàng, Ý dĩ, vv. Những số liệu trên cho thấy việc phát triển trồng cây thuốc ở nước ta có nhiều tiềm năng và cho hiệu quả kinh tế cao. Cần giúp cho người dân biết cách chuyển đổi 6
19. Đồ án tốt nghiệp cơ cấu cây trồng, kết hợp trồng rừng với trồng cây thuốc ở những nơi có khí hậu và đất đai phù hợp, để nâng cao thu nhập, cải thiện đời sống, góp phần tích cực trong việc xoá đói giảm nghèo cho người dân ở vùng núi. Theo kinh nghiệm ở Sa Pa, thu nhập từ trồng cây thuốc đạt 14-24 triệu đồng/ha/năm, trong khi thu nhập từ cây lương thực chỉ đạt 2,4-4,8 triệu đồng/ha/năm (N.B. Hoạt, 2002). 1.2 Thành phần hóa học của thực vật 1.2.1 Carbohydrate 1.2.1.1 Khái niệm Carbohydrate là một phân tử sinh học gồm các nguyên tử carbon (C), hydro (H) và oxy (O), thường tỷ lệ nguyên tử hydro-oxy trong phân tử carbonhydrate là 2:1, công thức thực nghiệm Cm(H2O)n (thườ ng m = n). Một số trường hợp ngoại lệ tồn tại; ví dụ, deoxyribose, một thành phần đường của DNA, có công thức C5H10O4. (John M. Coulter, C. R. Barnes, H. C. Cowles, 1930) Ở thực vật carbohydrate tập trung chủ yếu ở thành tế bào, mô nâng đỡ và mô dự trữ. Carbohydrate có thể chia thành 4 nhóm: - Monosaccharide: glucose, fructose - Disaccharide: saccharose, lactose, maltose - Oligosaccharide: raffinose, kestose,, stachyose - Polysaccharide: tinh bột, cellulose. 1.2.1.2 Tính chất Chúng có đặc tính chung là dễ hoà tan trong nước, đồng hoá và sử dụng nhanh để tạo glycogen. Các carbohydrate đơn giản đều có vị ngọt, khi vào cơ thể xuất hiện tương đối nhanh trong máu. 7
20. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của các loại Carbonhydrate 1.2.1.3 Vai trò - Cung cấp năng lượng cho tế bào và cơ thể thực vật - Vai trò cấu trúc, tạo hình (Cellulose, ). - Bảo vệ (Mucopolysaccharide). - Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể). 1.2.2 Amino acid 1.2.2.1 Khái niệm Amino acid là một phân tử chứa cả nhóm amin và carboxylate. Công thức chung: (H2N)x – R – (COOH)y. Hınh̀ 1.3 Alanine – Môṭ amino acid 8
21. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2.2 Tính chất Các amino acid là những chất rắn ở dạng tinh thể không màu, vị hơi ngọt, dễ tan trong nước (do tồn tại kiểu muối nội phân tử). Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 200 – 3000C. 1.2.2.3 Vai trò - Amino acid thiên nhiên (hầu hết là α-amino acid) là cơ sở để kiến tạo nên các loại protein của cơ thể sống. - Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất ở thực vật. - Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật. - Tăng khả năng ra hoa và quả (Trumbo P, 2013) 1.2.3 Glycosides 1.2.3.1 Khái niệm Glycoside là dạng phổ biến của nhiều hợp chất tự nhiên. Glycoside là những hợp chất hữu cơ ta ̣o thành do sự ngưng tu ̣ giữa mô ̣t phân tử đườ ng vớ i môṭ phẩn tử không đườ ng khác như rươu,̣ aicd, aldehide. Phenol, Phần đường của glycosid gọi là glycon, phần không đường gọi là aglycon hoặc genin. Bả ng 1.1 Môṭ số Glycoside phổ biến Glycoside Phân bố Tính chất Không có vị đắng. Thủy phân tạo ra Hesperidin Cùi cam, chanh, đường rhamnose, glucose, C H O quýt, bưởi 50 60 27 hssperiten. Cà chua xanh, Solanin Vị đắng. Khi vào cơ thể bị thủy cà tím, khoai C H 0 phân tạo HCN rất độc 45 17 15 tây 9
22. Đồ án tốt nghiệp Hạt mơ, hạt Amygdadin Vị đắng. Trong cơ thể người bị thủy hạnh nhân C H O phân cho HCN gây độc 20 27 11 đắng, mận Manihotin Vỏ, cùi củ sắn Khi thủy phân tạo HCN gây độc 1.2.3.2 Tính chất Glycoside là dạng tinh thể không màu. Phần đường và phần không đường liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycosid dễ bị phân huỷ khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzyme (men) có chứa trong cây. Phần đường trong glycoside chủ yếu là monosaccarid hoặc oligosaccarid, thường là glucose, rhamnose, galactose. Trong thành phần của một số glycoside có đường đặc biệt không có trong các glycoside khác (ví dụ trong glycosid tim). Phần aglycon của các glycoside có thể thuộc các nhóm chất hữu cơ khác nhau ví dụ cồn, andehyd, acid, phenol, dẫn chất anthracen đôi khi có các aglycon có chứa nitơ, lưu huỳnh song thường chứa carbon, hydro, oxy. Do đặc tính dễ bị phân huỷ, khó thu được ở dạng tinh khiết nên việc nghiên cứu cấu trúc thường gặp nhiều khó khăn. Tác dụng phụ thuộc vào phần aglycon, phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác dụng của chúng. 10
23. Đồ án tốt nghiệp Hınh̀ 1.4 Cardenolic và Bufadiennolid 1.2.3.3 Tá c dung̣ - Hỗ trơ ̣ tim - Hỗ trợ hê ̣ thần kinh - Hỗ trơ ̣ các cơ quan trong cơ thể: gan, thân, cơ tim, các cơ. 1.2.4 Alkaloid 1.2.4.1 Khái niệm Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được cung cấp bởi amino acid, đa số có nhân dị vòng. Alkaloid thườ ng đươc̣ tı̀m thấy trong thưc̣ vâṭ và đôi khi còn tı̀m thấy trong cơ thể đông̣ vât.̣ Một số dược liệu chứa alkaloid: cà độc dược, cà phê, chè, trinh nữ hoàng cung, vàng đắng, Hınh̀ 1.5 Ephedrin và Hyoscyamin 1.2.4.2 Tính chất Đa số các alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng như base mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin và cũng có chất tính base rất yếu như caffein, piperin Vài trường hợp ngoại lệ có những allcaloid không có phản ứng kiềm như colchicin, ricinin, theobromine và cá biệt cũng có chất có phản ứng acid yếu như arecaidin, guvacin. Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng những kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, carbonate kiềm, NaOH 11
24. Đồ án tốt nghiệp Khi định lượng alkaloid bằng phương pháp đo acid người ta phải căn cứ vào độ kiềm để lựa chọn chỉ thị màu cho thích hợp. Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt ) tạo ra muối phức. 1.2.4.3 Vai trò - Alkaloid có tác dụng diệt khuẩn. - Tác động lên hệ thần kinh trung ương: morphin, codein, strychnin, cafein - Hạ huyết áp: ajmalin, quinidlin - Chống ung thư (Ngô Văn Thu, 2011) 1.2.5 Steroids 1.2.5.1 Khái niệm Steroid là một loại hợp chất hữu cơ, có chứa một sự sắp xếp đặc trưng của bốn vòng cycloalkane được nối với nhau. Hınh̀ 1.6Testosteron 1.2.5.2 Tính chất Steroid là hợp chất chất béo hữu cơ hòa tan, có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp. Khi đun nóng với Se ở 36000C sẽ tạo hợp chất Hidrocarbon Diel. 1.2.5.3 Vai trò 12
25. Đồ án tốt nghiệp Steroid tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống. Cho đến nay, người ta đã biết đến hàng chục nghìn steroid và trong số đó có hàng trăm chất được sử dụng trong y học. 13
26. Đồ án tốt nghiệp 1.2.6 Tannin 1.2.6.1 Khái niệm Tannin là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino acid và alkaloid). Hınh̀ 1.7 Môṭ số tannin 1.2.6.2 Tı́nh chất Tannin thườ ng là bôṭ vô đinḥ hı̀nh từ màu ngà vàng cho đến màu nâu sáng, không mùi hoăc̣ mùi rất nhe,̣ vi rậ ́t chát, gây săn se niêm mac.̣ Tanin thườ ng là những chất rất phân cực, dễ tan trong các dung môi phân cực như nướ c, aceton, glycol, methanol, glycerin etylacetat, không tan trong các dung môi kém phân cưc̣ hoăc̣ không phân cưc̣ như hexan, benzene, dầu hỏa, diethyl ether, Tanin kết hợp với protein không tan trong nước và dung môi hữu cơ nhưng chiết ra được bằng dung dịch kiềm. Tanin tủa bông trắng với dung dịch gelatin. 14
27. Đồ án tốt nghiệp Tanin tủa với alcaloid, muối kim loại nặng như ch́ì, thuỷ ngân, kẽm, sắt. Với muối sắt những tanin khác nhau cho màu xanh lá hay xanh đen với đậm độ khác nhau. (Có thể dựa vào tủa với muối sắt để xác định tanin trên vi phẫu - nhỏ muối sắt III, kalibicromat 10%, tạo thành tủa nâu trên tế bào chứa tanin). 1.2.6.3 Vai trò - Tannin bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu. - Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng. - Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy. (Katie E. Ferrell và Thorington và Richard W, 2006). 1.2.7 Isoprenoid (Terpene) 1.2.7.1 Khái niệm Isoprenoid là một nhóm chất lớn và đa dạng. Bộ khung carbon được tạo thành từ đơn vị cơ bản isoprene-C5H8. Ngoài các hydrocarbon không no, các dẫn xuất của chúng như alcol, andehyde, cetone, cacboxylic acid cũng được gọi là terpene. Tuỳ theo số nguyên tử carbon trong mạch hydrocarbon, người ta phân chúng thành các nhóm: monoterpene, secpuiterpene, diterpene, triterpene, tetraterpene, polyterpene. Trong đó monoterpene là quan trọng nhất trong terpenoid. Nó có cấu trúc mạch hở, mạch vòng. Isoprenoid có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài họ thông và trong tinh dầu thảo mộc như tinh dầu xả, quế, cam, chanh. Hınh̀ 1.8 Limonene và Ocimene 15
28. Đồ án tốt nghiệp 1.2.7.2 Tính chất Terpene thường nhẹ hơn nước, chất lỏng không màu có mùi thơm. Không hòa tan hoặc ít tan trong nước, dễ tan trong ethanol. 1.2.7.3 Vai trò Terpene là thành phần chính của các loại tinh dầu của nhiều loại cây và hoa. Tinh dầu được sử dụng rộng rãi như là chất phụ gia hương vị tự nhiên cho thực phẩm, như nước hoa nước hoa, và trong y học và thuốc thay thế như hương liệu . Biến thể tổng hợp và các dẫn xuất của tecpen thiên nhiên và terpenoids đa dạng của các hương liệu được sử dụng trong nước hoa và hương vị được sử dụng trong các chất phụ gia thực phẩm. Vitamin A là một terpene (Đỗ Tất Lợi, 2004). 1.3 Tổng quan về kháng khuẩn thực vật 1.3.1 Khái niệm Kháng khuẩn thưc̣ vâṭ là tên goị chung chı̉ các hơp̣ chất hữu cơ có trong thưc̣ vâṭ có tác dung̣ tiêu diêṭ hay kı̀m hãm sư ̣ phát triển của VSV. Các chất kháng khuẩn thường có tác dung̣ đăc̣ hiêụ lên các loài VSV khác nhau ở môṭ nồng đô ̣ thương rất nhỏ. Những tı́nh chất này có thể thuôc̣ nhiều cấu trúc hóa hoc̣ khác nhau như alkaloid, tannin, flavonoid, tinh dầu, 1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn 16
29. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.9 Các cơ chế kháng sinh Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn: vách tế bào của vi khuẩn (đặc biệt là các vi khuẩn Gram dương) được cấu tạo bởi các phức hợp peptidoglycan, phức hợp này được trùng hợp bởi các enzyme transpeptidases. Các kháng sinh nhóm b - actamin gắn chọn lọc vào các transpeptidase này làm cho vách tế bào của vi khuẩn bị tan rã khiến vi khuẩn bị tiêu diệt. Ức chế chức năng của màng tế bào (tổn thương màng tế bào): kháng sinh gắn lên màng tế bào, làm thay đổi tính thấm chọn lọc khiến một số chất cần thiết cho vi khuẩn (nucleotid, pyrimidin, purin ) lọt ra ngoài, làm tổn hại và chết vi khuẩn. Các KS nhóm polymycin, aminosid Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác. Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide. 17
30. Đồ án tốt nghiệp Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide. Tạo protein bất thường, vô dụng: Tetracyclin và aminoside có khả năng gắn vào phần 30S của ribosom vi khuẩn, gây nên đọc sai mã của ARN - thông tin khiến protein được tạo ra bất thường, vô dụng đối với đời sống của vi khuẩn. Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: bất hoạt RNA, DNA: Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin). Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xo ắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA. Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (ρ-aminobenzoic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid. Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic. (Amoros, M., F. Sauvager, L. Girre và M. Cormier, 1992). Canḥ tranh đối khá ng: Đây là kiểu tác dụng của các sunfonamit. Acid folic giữ vai trò cần thiết trong quá trình tổng hợp acid nucleic. Để tổng hợp ra acid folic, một số vi khuẩn phải sử dụng acid paraaminobenzoic (PAB) có trong môi trường. Sunfonamit có cấu trúc hóa học tương tự PAB nên đã cạnh tranh thay thế PAB, dẫn đến ngừng tổng hợp acid nucleic của vi khuẩn. 1.3.3 Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật 1.3.3.1 Alkaloids Môṭ số Alkaloid có hoaṭ tı́nh khá ng khuẩn  Solamargine Solamargine là một glycoalkaloid có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum khasianum), và các alkaloid khác trong loài cây này có tác dung̣ chống lại sự lây nhiễm khi đã mắc phải HIV. 18
31. Đồ án tốt nghiệp Kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy. Hình 1.10 Solamargine  Berberine Berberine có trong cây hoàng liên chân gà, hoàng đằng, hoàng bá, Berberine cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với Shigella, tụ cầu khuẩn, nhiều vi khuẩn Gram dương, Gram âm và các vi khuẩn acid. Ngoài ra có còn chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh. Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với trùng gây bệnh sốt rét. Cơ chế kháng khuẩn Berberine là do khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn. Đặc biệt khi dùng berberin điều trị các nhiễm trùng đường ruột sẽ không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột. Các nghiên cứu gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu phối hợp với berberin sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột. 19
32. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.11 Berberine 1.3.3.2 Terpenoids và tinh dầu Tinh dầu thuôc̣ nhóm chất isoprenoid, là sản phẩm trao đổi chất bâc̣ 2. Các chất thuôc̣ nhóm ispronoid có đăc̣ tı́nh chung là không hòa tan trong các dung môi hữu cơ. Tinh dầu rất ı́t hòa tan trong nướ c và hòa tan nhiều trong rươụ đâṃ đăc.̣ Dướ i tác dung̣ của oxy, môṭ phần của tinh dầu chủ yếu là hơp̣ chất không no bi ̣oxy hóa và có thể taọ thành Terpenoid. Nói chung mùi thơm của tinh dầu chủ yếu do ester, aldehide, cetone và những chất hữu cơ khác quyết đinh.̣ Tổng lương̣ của những chất này chı̉ chiếm 10% lương̣ tinh dầu, 90% còn laị là những chất đêm.̣ Về bản chất hóa hoc,̣ tinh dầu thường là hỗn hơp̣ các chất khác nhau: hydrocarbon, rươu,̣ phenol, aldehide, acid, ester, tuy nhiên, quan trong̣ và thườ ng gă ̣p hơn cả là trong hợp phần của tinh dầu là terpen và các dẫn xuất chứ a oxy của terpen.  Hoaṭ tı́nh kháng khuẩn Các loại terpenoids tinh dầu cũng có khả năng kháng khuẩn nhờ các khả năng hòa tan lipid trong màng tế bào vi khuẩn bởi các hợp chất lipophilic phá vỡ vách tế bào. Terpenenes và terpenoid có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, virus và động vật nguyên sinh. Năm 1977, có nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của tinh dầu có khả năng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế được vi khuẩn. 20
33. Đồ án tốt nghiệp Các acid betulinic triterpenoid chỉ là một trong nhiều terpenoid có khả năng ức chế được HIV. Gần đây các nhà khoa học thực phẩm cũng đã tìm thấy các terpenoid hiện diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát vi khuẩn Listeria monocytogenes. Hình 1.12 Một số Terpenenes và Terpenoid 1.3.3.3 Phenol đơn và acid phenolic Các hơp̣ chất phenolic taọ ra hương vi ̣và màu sắc cho các loaị cây trồng, rau trái. Ngoài ra chúng còn bảo vê ̣ cho cây trồng chống là sư ̣ tấn công của các VSV, côn trùng và đông̣ vâṭ ăn cỏ. Vai trò của phenol trong sinh lý hoc̣ thưc̣ vâṭ đa ̃ đươc̣ toàn diêṇ xem xét laị trong những năm gần đây. Sư ̣ tı́ch lũy các hơp̣ chất phenolic phu ̣ thuôc̣ vào loài và/hoăc̣ giống, trang̣ thái sinh lý, và vi ̣trı ́ điạ lý của các loài cây (Lattanzio, 1988; Mueller Harvey và Dhanoa, 1991). Trong rau quả, sư ̣ tổng hơp̣ các hơp̣ chất phenolic đươc̣ diễn ra trong suốt quá trı̀nh sinh trưở ng. Các hơp̣ chất phenolic mà có khả năng ứ c chế sư ̣ phát triển của nấm sơị có thể có măṭ trong các loaị rau trái không bi ̣hư hỏng hoăc̣ cac mô quả bi ̣ nhiễm mầm bênh.̣ Các hơp̣ chất phenolic này có sẵn trong các loaị rau trái có vai trò ngăn ngừ a các bênḥ xảy ra trong quá trı̀nh bảo quản sau thu hoach.̣ 21
34. Đồ án tốt nghiệp Phenolics được xem là nguyên nhân dẫn đến sự ức chế enzyme bởi các hợp chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua sự tương tác không đặc hiệu của các chất này với protein. Môṭ số hơp̣ chất phenolic có hoaṭ tı́nh khá ng khuẩn  Quinones Quinone là những vòng thơm với hai nhóm thể ketone. Quinone có thể tạo phức không thay đổi được với các amino acid ái nhân trong protein, thường dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein. Vì lí do đó khả năng kháng khuẩn của quinone rất lớn. Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào, polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng. Hình 1.13 Một số Quinones thông thường  Tannin Tannin là những hơp̣ chất polyphenol có trong thưc̣ vâṭ có vi ̣chát, đươc̣ tı̀m thấy chủ yếu trong thưc̣ vâṭ bâc̣ cao ở những cây hai lá mầm. Tannin có khả năng liên kết với protein làm mất hoạt tính của các protein chức năng, ức chế enzyme được xem là cơ chế chung của các hợp chất tannin. 22
35. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.14 Gallotannin và Gallic acid  Flavonoid Flavonoid là môṭ nhóm hơp̣ chất lớ n thườ ng găp̣ trong thưc̣ vât.̣ Hơn môṭ nử a rau quả thườ ng dùng có chứ a flavonoid. Flavonoid cũng là thành phần thườ ng hay găp̣ trong dươc̣ liêụ nguồn gốc từ thưc̣ vât.̣ Flavonoid có khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào và tạo phức với thành tế bào vi khuẩn. Các flavonoid càng ưa béo càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật. Chúng có khả năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucose. Flavonoid ức chế transpeptidaza làm cho mucopeptit – yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được, ức chế tổng hợp axit nucleic của vi khuẩn, tác dụng vào DNA khuôn, ức chế tổng hợp RNA của vi khuẩn. 23
36. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.15 Một số Flavonoid 1.3.3.4 Saponin Nhóm saponin, chủ yếu là asiaticosid có tác dụng lên Mycobacterium leprae. Tác dụng được giải thích do asiaticosid làm tan màng sáp của vi khuẩn. Hınh̀ 1.16 Saponin 24
37. Đồ án tốt nghiệp 1.3.3.5 Lectin và polypeptide Peptides đươc̣ dùng để ứ c chế VSV đươc̣ nghiên cứ u và công bố đầu tiên vào năm 1942. Peptides được tı́ch điê ̣n dương và có chứ a liên kết disulfua. Cơ chế kháng khuẩn là do có sự hình thành của các ion trên màng vi sinh vật, hoặc do sự cạnh tranh và ức chế sự bám dính protein trên cơ quan nhận cảm vật chủ ở vi sinh vật. Bên cạnh đó chúng còn phá vỡ màng tế bào, cản trở sự trao đổi chất và ảnh hưởng tới các thành phần tế bào chất. Hınh̀ 1.17 Các cấu trúc của peptide 1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình 1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 1.4.1.1 Escherichia coli  Đặc điểm Escherichia coli là môṭ trong những loài vi khuẩn chı́nh kı ́ sinh trong đườ ng ruôṭ của đông̣ vâṭ máu nóng. E.coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,sống ký sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính. 25
38. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.18 Hình ảnh Escherichia coli O157: H7 dưới kính hiển vi  Phần lớn các vi khuẩn E.coli không có ảnh hưởng gì đáng kể đến sức khỏe trừ một số có thể gây tiêu chảy và tùy vào địa phương, độ tuổi người bệnh mà các vi khuẩn trên đây có những ảnh hưởng khác nhau.  Khả năng gây bệnh của một số Escherichia coli: - E O15:H7: sản xuất ra đôc̣ tố manḥ gây tổn thương niêṃ mac̣ ruôṭ non, gây tiêu chảy ra máu. - EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): gây xuất huyết ở ruột. - EPEC (Enteropathogenic E.coli): gây bệnh đường ruột, chủ yếu gây bệnh ở trẻ em, cơ chế gây bệnh chưa rõ. - ETEC (Enterotoxigenic E.coli): sinh độc tố ruột. - EIEC (Enteroinvasive E.coli ): gây bệnh do xâm lấn tế bào. - EAGGEC hay EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli kết tập ở ruột. (Cao Minh Nga, 2014). 1.4.1.2 Shigella  Đặc điểm Shigella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,sống ký sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính. 26
39. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.19 Hı̀nh ảnh của Shigella sp. Shigella gây bệnh ở động vật linh trưởng, nhưng không gây bênḥ ở động vật có vú khác. Nó chỉ được tìm thấy tự nhiên trong cơ thể người và khỉ đột. Shigella là một trong những nguyên nhân hàng đầu của vi khuẩn tiêu chảy trên toàn thế giới, gây ra một ước tính 80-165,000,000 trường hợp và 600.000 ca tử vong mỗi năm.  Khả năng gây bệnh của một số Shigella: gây bệnh lỵ trực trùng, có 4 nhóm: - Nhóm A: S. dysenteriae: tiết độc tố shiga, là nguyên nhân chủ yếu gây ra bê ̣nh kiết li ̣ ở những nơi tâ ̣p trung như các tra ̣i ti ̣ na ̣n trên thế giớ i. - Nhóm B: S. flexneri: tiết độc tố giống shiga (shiga- like- toxin), là chủng phổ biến nhất trên thế giớ i, gây ra 60% ca bênḥ ở các nướ c đang phát triển. - Nhóm C: S. boydii: không tiết độc tố. - Nhóm D: S. sonnei: tiết độc tố giống shiga, là nguyên nhân gây ra 77% số ca bênḥ kiết li ̣ở những nướ c phát triển. Nhóm A – C về măṭ sinh lý tương tư ̣ nhau, S.sonnei có thể khác biêṭ trên cơ sở xét nghiêṃ chuyển hóa sinh hóa. 1.4.1.3 Salmonella  Đặc điểm Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tuỳ nghi, không sinh bào tử , sống ký sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi 27
40. Đồ án tốt nghiệp trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính. Hình 1.20 Hình ảnh của Salmonella typhii và Salmonella typhimurium Salmonella được tìm thấy trên toàn thế giới trong cả động vật máu lạnh và động vật máu nóng, và trong môi trường. Các chủng vi khuẩn Salmonella gây ra các bệnh như thương hàn, phó thương hàn, nhiễm trùng máu và ngộ độc thực phẩm.  Khả năng gây bệnh của một số Salmonella - S. typhi: gây sốt thương hàn. - S. choleraesuis: gây nhiễm trùng máu và áp-xe khu trú ở các cơ quan nội tạng. - S.enteridis: gây viêm ruột (Cao Minh Nga, 2014). 1.4.1.4 Vibrio  Đặc điểm Nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và catalase dương tính, là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí, tạo nitrite từ nitrate. Một số loài vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh. Hầu hết các chủng gây bệnh có liên quan với viêm dạ dày ruột, nhưng cũng có thể lây nhiễm các vết thương hở và gây nhiễm trùng huyết. 28
41. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.21 Hình ảnh vi khuẩn Vibrio cholerae và Vibrio harveyi  Khả năng gây bệnh của một số Vibrio: - V. alginolyticu: gây nhiễm trùng vết thương, chúng cũng có mặt trong các cơ quan của động vật như cá nóc. - V. cholera : tác nhân gây bệnh tả. - V. harveyi : tác nhân gây bệnh của một số loài động vật thủy sinh. - Vibrio parahaemolyticus (có trong hải sản sống hoặc nấu chưa chín): nguyên nhân chủ yếu là viêm dạ dày cấp tính, nhiễm trùng vết thương cũng xảy ra, nhưng ít phổ biến hơn so với bệnh thủy sản gây ra. 1.4.1.5 Listeria  Đặc điểm Listeria là một vi khuẩn hı̀nh que, Gram dương, kị khí tùy nghi, không sinh bào tử. Có thể được tìm thấy trong đất, nước, trong các loại thịt chưa nấu chín, rau sống, trái cây, thực phẩm làm từ sữa, và thực phẩm chế biến. 29
42. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.22 Hình ảnh của Listeria monocytogenes  Một số Listeria - Listeria innocua - L. monocytogenes - L. welshimeri - L. aquatica - L. ivanovii - L. marthii (Jemmi và Stephan, 2006)  Khả năng gây bệnh Các bệnh của người trong chi Listeria thường do Listeria monocytogenes gây ra. Đây là loại vi khuẩn gây độc, với 20% đến 30% số ca nhiễm lâm sàng gây nên bệnh Listeriosis dẫn đến tử vong. Một số triệu chứng liên quan với bệnh listeriosis bao gồm sốt, đau cơ, tiêu chảy, nôn và buồn nôn. Phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh, người già và những người có hệ miễn dịch kém là dễ bị bệnh listeriosis. 1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da 1.4.2.1 Pseudomonas aeruginosa  Đặc điểm Pseudomonas aeruginosa là một vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và con người. Nó được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi sinh vật trên da và các môi 30
43. Đồ án tốt nghiệp trường nhân tạo trên khắp thế giới. Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Pseudomonas aeruginosa không chỉ phát triển trong môi trường không khí bình thường, mà còn có thể sống trong môi trường có ít khí ôxy, và do đó có thể cư trú trong nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo. Hình 1.23 Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử.Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen.  Khả năng gây bệnh Pseudomonas là một trong những vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và con người. Vi khuẩn này phát triển bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ; trong cơ thể, nhờ khả năng thích ứng vi khuẩn cho nên nó lây nhiễm và phá hủy các mô của người bị suy giảm hệ miễn dịch. Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông thường là gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu và thận sẽ gây ra những tử vong cao; bởi vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt niêm mạc bên trong cơ thể. Bên cậnh đó, vi khuẩn này cũng được phát hiện trên các dụng cụ y khoa bao gồm catheter, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch. Đây cũng là nguyên nhân gây ra viêm chân lông. 31
44. Đồ án tốt nghiệp 1.4.2.2 Staphylococcus aureus  Đặc điểm Staphylococcus aureus là một loài tụ cầu khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy nghi. S. aureus có rải rác trong tự nhiên như trong đất, nước, không khí, đặc biệt người là nguồn chứa chính của tụ cầu vàng, chủ yếu là ở vùng mũi họng (30%), nách, âm đạo, mụn nước trên da, các vùng da trầy xướt và tầng sinh môn. Tỷ lệ mang vi khuẩn cao hơn ở các nhân viên y tế, bệnh nhân lọc máu, có bệnh tiểu đường type 1, nhiễm HIV, mắc bệnh da mãn tính. Hình 1.24 Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus  Khả năng gây bệnh Trong đa số trường hợp, tụ cầu khuẩn không gây ra vấn đề gì hoặc chỉ gây nhiễm khuẩn nhẹ như nổi mụn hoặc bóng nước. Nhưng trong một số trường hợp, tụ cầu khuẩn có thể gây nhiễm khuẩn trầm trọng hơn. Staphylococcus aureus là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong các loài tụ cầu. Nó là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy ở cả mũi và da. (Ogston A, 1984). 32
45. Đồ án tốt nghiệp 1.4.2.3 Enterococcus feacalis  Đặc điểm Enterococcus feacalis là vi khuẩn Gram dương, lên men glucose, sinh acid làm giảm pH môi trường. E. feacalis không sinh độc tố, không tạo ra phản ứng catalase với hydrogen peroxide. Nó có thể tạo ra một phản ứng pseudocatalase trên môi trường thạch máu. Hình 1.9. Hình ảnh Enterococcus feacalis  Khả năng gây bệnh E. faecalis có thể gây ra viêm nội tâm mạc và nhiễm khuẩn huyết, nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm màng não và nhiễm trùng khác ở người. 33
46. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm và thời gian 2.1.1 Địa diểm - Thu mẫu: vườn quốc gia Bidoup- Núi Bà, địa bàn huyện Lạc Dương, Đam Rông, tỉnh Lâm Đồng - Thí nghiệm: phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học- Thực phẩm- Môi trường, trường Đại học Công nghệ TpHCM. 2.1.2 Thời gian Tháng 11/2015 đến tháng 07/2016. 2.2 Vật liệu 2.2.1 Nguồn mẫu phân tích Cao chiết nước từ 10 mẫu cây thuốc dân gian thu tại vườn quốc gia Bidoup, Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng, bao gồm: - Podocarpus sp. - Polygala sp. - Medinilla sp. - Eupatorium sp. - Elephantopus sp. - Lantana sp. - Acorus sp. - Euodia sp. - Calamus sp. - Streptocaulon sp. - Xidi klung (tên goị dân gian thương goi,̣ chưa có đươc̣ đinḥ danh) 34
47. Đồ án tốt nghiệp Hınh̀ 2.1 Hınh̀ ảnh môṭ số cây thuốc: Lantana sp., Medimilla sp., Elephamtopus sp., Podocarpus sp. (từ trá i qua, trên xuống) 2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị - 4 chủng Escherichia: Escherichia coli, Enterotoxigenic Escherichia coli – ETEC, Escherichia coli 0517:H7, Escherichia 0208 - 4 chủng Salmonella: Salmonella typhii, Salmonella typhimurium, Salmonella dublin, Salmonella enteritidis - 4 chủng Vibrio: Vibrio alginolyticus, Vibrio cholera, Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus - 3 chủng Shigella: Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei - 2 chủng Listeria: Listeria monocytogenes, Listeria innocua - Pseudomonas aeruginosa - Staphylococcus aureus - Enterococcus feacalis 35
48. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3 Hóa chất, môi trường - Dung môi Dimethysulfoside - Nước cất (DMSO) - NaCl - Methanol - Môi trường TSA, TSB - Ethanol - Agar - Cồn 2.2.4 Dụng cụ, thiết bị - Tủ cấy vô khuẩn - Giấy lọc - Autoclave - Bình tam giác - Tủ ấm, Tủ lạnh - Pipette loại 100 – 1000 μl. - Tủ sấy - Đầu típ loại 100- 1000 μl - Máy lắc - Ống nghiệm - Máy đo OD - Que cấy trang, que cấy vòng - Cân điện tử, Cân phân tích - Đèn cồn, đĩa petri - Bếp điện - Parafilm - Phễu Hınh̀ 2.1 Môṭ số dung̣ cu ̣và thiết bi thı̣ ́ nghiêṃ 36
49. Đồ án tốt nghiệp 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu Mẫu cây Rửa sạch Phơi khô đến trọng lượng không đổi Xay mẫu thành bột mịn Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu Lá, thân, cành của các cây sau khi được thu thập sẽ được đem về phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Công Nghệ Tp.HCM. Mẫu cây được rửa sạch và phơi khô trong phòng thí nghiệm tới khi trọng lượng không đổi. Các mẫu phơi khô được nghiền thành bột mịn. Bột mẫu được đựng trong túi nhựa và được bảo quản ở 400C. 2.3.2 Phương pháp tăng sinh VSV chı̉ thi ̣  Mục đích: tăng sinh khối vi sinh vật chỉ thị đến số lượng cần thiết, giúp hoạt hóa vi khuẩn trở về trạng thái bình thường sau khi bị suy yếu trong quá trình bảo quản.  Nguyên tắc: nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng phải chứa thành phần đa lượng và vi lượng để vi sinh vật phát triển, đảm bảo có đủ điều kiện lý hóa thích hợp để vi sinh vật trao đổi chất với môi trường.  Tiến hành: 37
50. Đồ án tốt nghiệp - Chuẩn bị chai chứa 10ml môi trường tăng sinh (môi trườ ng TSB). - Dùng pipette hút 100µl sinh khối vi sinh vật từ ống eppendort cho vào chai môi trường. - Lắc 150 vòng/phút, 18 – 24 giờ ở nhiệt độ phòng (sinh khối vi sinh vật tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy). 2.3.3 Phương pháp định lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đo OD  Nguyên tắc: - Đô ̣ đuc̣ của huyền phù tỷ lê ̣ thuâṇ vớ i số lương̣ VSV hiêṇ diêṇ trong môi trườ ng. Trong môṭ thời gian nhất đinh,̣ mối quan hê ̣giữa số lương̣ VSV trong nướ c tı̉ lê ̣tuyến tı́nh với đô ̣đuc̣ môi trường. - Đinḥ lương̣ VSV trong môi trườ ng bằng máy đo đô ̣đuc̣ hay máy so màu ở bướ c sóng 550 – 610nm. - Trong phương pháp này cần xây dưng̣ biểu đồ tương quan tuyến tı́nh giữa đô ̣ đục và số lượng VSV trong môi trườ ng bằng phương pháp đếm trực tiếp.  Tiến hành: - Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào: Pha loãng một huyền phù tế bào cần kiểm định có mật độ tế bào bất kì thành các huyền phù khác nhau có độ đục ở OD 600nm đạt các giá trị lân cận 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5. Đo OD ở 600nm của các huyền phù vừa pha được, ghi nhận các số liệu. Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kinh hiển vi (buồng đếm hồng cầu) xác định mật độ tế bào (cfu/ml) của các huyền phù này. Tính giá trị log (N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với độ đục. vẽ đường biển diễn của log (N/ml) theo OD ở 600nm. - Xác định mật độ tế bào theo độ đục: đo độ đục của một huyền phù tế bào cần xác định mật độ. Từ giá trị OD ở bước sóng 600nm đo được, suy ra số log (N/ml) và trị số mật độ (cfu/ml) từ đường chuẩn. 38
51. Đồ án tốt nghiệp 2.3.4 Phương pháp bảo quản và giữ giống - Giữ giống thạch nghiêng: lấy giống VSV cấy vào ống thạch nghiêng, ủ cho VSV phát triển, đem trữ lạnh ở nhiệt độ 40C. Giống này thường được sử dụng cho sản xuất. Thời gian sử dụng từ 7 – 10 ngày. - Giữ giống trong glycerol 20% ở nhiệt độ -40C: vi khuẩn sau khi tăng sinh, hút vào eppendorf và ly tâm 5000 v/p trong thời gian 15 phút. Loại bỏ dịch và giữ cặn. Bổ sung 1 ml glycerol 20% và đồng nhất rồi bảo quản ở nhiệt độ -40C. Giống này được sử dụng để cấy chuyển qua thạch nghiêng. Thời gian sử dụng từ 1 – 3 tháng. 2.3.5 Phương pháp tách chiết cao  Mục đích: tách chiết hợp chất kháng khuẩn thực vật để nghiên cứu  Nguyên tắc: sử dụng dung môi nước để tách chiết các hợp chất trong thực vật nhờ lực liên kết hóa học.  Tiến hành: - Cân 50g mẫu cao + 1000ml dung môi cho vào erlen, ngâm 4 giờ, lọc, thu dịch lần 1. - Bã + 1000ml dung môi ngâm 4 giờ, lọc, thu dịch lần 2. - Ngâm tiếp tục cho đến khi dịch trong, lặp lại khoảng 3 lần. 2.3.6 Chuẩn bi ̣dung dicḥ cao thuố c khá ng sinh Cao thuốc khô: cân 1,5g cao thuốc khô, hòa tan vớ i 13,5ml dung dicḥ DMSO 1% và nướ c cất (nồng đô ̣ DMSO 1% không vươṭ quá 10%. Thu đươc̣ dicḥ cao chiết nồng đô ̣cao thuốc đaṭ 100mg/ml. Dicḥ cao chiết nồng đô ̣ 100mg/ml (cao khô đã hò a tan sẵn trong dung môi DMSO 1%): hòa tan 1ml cao vớ i 9ml nướ c cất. Thu đươc̣ dicḥ cao chiết nồng đô ̣ 2.3.7 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method)  Nguyên tắc 39
52. Đồ án tốt nghiệp Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng của cao chiết với vi khuẩn chỉ thị trên môi trường nuôi cấy. Cao chiết có khả năng khuếch tán trong môi trường agar và tác động lên vi khuẩn. Khi kháng được vi khuẩn sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch.  Tiến hành - Các chủng vi khuẩn sau khi đã tăng sinh được tiến hành pha loãng bằng nước muối sinh lý. Pha loãng đến nồng độ 106 cfu/ml. - Hút 100 µl từ dịch pha loãng vào đĩa petri chứa sẵn môi trường TSA. Tiến hành cấy trang. - Sau đó, tạo những giếng nhỏ có đường kính 8 mm với thanh kim loại vô trùng. Mỗi đĩa thạch trung bình từ 6 – 9 giếng thạch. - Nhỏ 100l dung dịch cao chiết (nồng độ 100 mg/ml) vào mỗi giếng của đĩa thạch đã ấy trang. - Để yên đĩa trong vòng 2 giờ. - Ủ 37oC trong 24 giờ cho vi khuẩn phát triển. - Đọc kết quả  Hoạt tính kháng khuẩn được tính bằng vòng kháng khuẩn quanh miệng giếng trên đĩa: - Không có vòng kháng khuẩn: không có hoạt tính kháng khuẩn. - Đường kính vòng kháng khuẩn từ 8 đến 10mm: tính kháng trung bình. - Đường kính vòng kháng khuẩn > 10mm: tính kháng mạnh. 40
53. Đồ án tốt nghiệp Hınh̀ 2.3 Hı̀nh ảnh về kết quả kháng khuẩn của môṭ mẫu vi khuẩn chı̉ thi (bêṇ trái là không có kết quả kháng khuẩn và và bên phải là có kết quả kháng khuẩn) 2.3.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học 2.3.8.1 Carbohydrate a. Thí nghiệm Molisch - Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm vào 5-6 giọt thuốc thử Molisch. - Nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc trên thành ống nghiệm. - Kết quả: Hình thành phức hợp màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách. b. Thí nghiệm Feling - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào 100mg cao chiết. - Đun cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả. - Kết quả: Quan sát kết tủa màu đỏ của CuO. c. Barfoed - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm 2 ml thuốc thử Barfoed. - Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và đọc kết quả.  Kết quả: Hình thành kết tủa màu đỏ gạch. 2.3.8.2 Alkaloid a. Mayer - Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Cho vài giọt thuốc thử Meyer.  Kết quả: Quan sát kết tủa màu đục tạo thành. b. Dragendroff - Hút 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm. - Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendroff. - Kết quả: Hình thành kết tủa màu vàng cam. 41
54. Đồ án tốt nghiệp c. Hager - Tiến hành: - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm 2 ml thuốc thử Hager. - Kết quả: Hình thành kết tủa màu vàng. d. Wagner - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm 2 ml thuốc thử Wagner. - Kết quả: Hình thành kết tủa màu nâu đỏ. 2.3.8.3 Saponin (thử nghiệm Foam) - Hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Lắc mạnh. - Kết quả: Hình thành bọt ổn định. 2.3.8.4 Cardiac glycosides a. Legal - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm 1 ml pyridine và 1 ml Na nitro prusside. - Nhỏ 5 – 6 giọt NaOH 10%. - Kết quả: Xuất hiện màu đỏ đậm. b. Keller Killiani - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm 2 ml acid acetic glacial và 1 ml dung dịch FeCl3. - Cho từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm. - Kết quả: Xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic. 42
55. Đồ án tốt nghiệp 2.3.8.5 Anthaquinone glycosides (thử nghiệm Bontrager) - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm 2 ml H2SO4 loãng và đun sôi. - Tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc. - Thêm 3 ml benzene và lắc đều rồi để yên. - Tách lấy lớp benzene. - Thêm 2 ml ammonia và quan sát màu trong lớp ammonia. - Kết quả: Xuất hiện màu đỏ. 2.3.8.6 Flavonoid a. Alkaline - Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện với đối chứng là mẫu và nước cất để so sánh. - Thêm vài giọt HCl loãng mất màu chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid - Kết quả: Xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho HCl. b. Shinoda - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Cho dịch mẫu bột Magnesium và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm. - Bổ sung 5 ml cồn 95%. - Kết quả: Nếu mẫu có màu cam, hồng, đỏ đến tím chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid. c. Ferric chloride - Lấy 2 ml cho vào ống nghiệm. - Thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10%. - Kết quả: Xuất hiện màu xanh hoặc tím. 2.3.8.7 Phenolic a. Lead acetate - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm - Cho 1,5 ml Chì acetate 10% 43
56. Đồ án tốt nghiệp - Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng. b. Gelatin - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm một vài gelatin 1% - Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng. 44
57. Đồ án tốt nghiệp 2.3.8.8 Tannin a. Ferric chloride - Hút 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%. - Cho vào 4 giọt ferric chloride 10%. - Kết quả: Xuất hiện màu xanh. b. Lead acetate - Hút 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%. - Cho vào 4 giọt Chì acetate. - Kết quả: Xuất hiện kết tủa màu vàng. 2.3.8.9 Steroid a. Salkowski - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc. - Lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp. - Đọc kết quả ở mặt phân cách. - Kết quả: Xuất hiện màu đỏ ở lớp dưới: sterol. Hình thành màu vàng ở lớp dưới: triterpenoid. b. Libermann Burchard - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm 2 ml acetic anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh. - Nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm. - Kết quả: Xuất hiện vòng màu đỏ ở mặt phân cách: steroid. Hình thành vòng màu nâu đỏ đậm: triterpenoid. 2.3.8.10 Amino acid 45
58. Đồ án tốt nghiệp - 1 ml dịch chiết, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin. - Đun sôi cách thủy trong 5 phút. - Kết quả: Xuất hiện màu tím. 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu Sừ dụng phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 và phần mềm Microsoft Excel 2007 để xử lý số liệu. 46
59. Đồ án tốt nghiệp 2.4 Sơ đồ bố trı́ thı́ nghiêṃ tổng quá t Nguồn mâũ Ngâm trong dung môi nước (tỉ lệ 1:20 w/v) Chiết và cô cao Cao chiết nư ớc Xác định thành phần hóa học Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Xác định chỉ số MIC Đọc kết quả Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 47
60. Đồ án tốt nghiệp 2.4.1 Thí nghiệm 1: Đá nh giá hiêụ quả chiết cao chủa dung môi nướ c đố i vớ i cá c mẫu cây Mẫu cây Phơi khô, xay nhuyễn Podo- Poly- Medi- Eupa- Ele- Lan- Aco- Euo- Cala Xidi Strep- carpus gala nilla toriu phant tana rus dia -mus klun tocaul sp. sp. sp. m sp. opus sp. sp. sp. sp. g on sp. sp. Ngâm trong nước (tỉ lệ 1:20 w/v) trong 4 giờ Lọc chân không Ngâm lần 2, loc̣ Ngânm lần 3, loc̣ Ba ̃ Cô cách thủy 700C Thu cao Cao chiết từ n ước 48
61. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.5. Quy trình khảo đánh giá hiêụ quả chiết cao của dung môi nướ c đối với các mẫu cây.  Tiến hành: Cân 5g mẫu cao + 100ml dung môi nước (tỉ lệ 1:20, w/v) cho vào erlen, ngâm trong 4 giờ, lọc, thu dịch lần 1. Ba ̃ loc̣ sau đó se ̃ đươc̣ đổ thêm 100ml nướ c cất vào, tiếp tuc̣ ngâm 4 giờ, sau đó tiến hành loc,̣ thu dicḥ loc̣ lần 2. Tiếp tuc̣ tiến hành ngâm ba ̃ và loc̣ khoảng 3,4 lần cho đến khi dicḥ loc̣ trong. Sau đó toàn bô ̣ dicḥ loc̣ cao se ̃ đươc̣ cô cách thủy ở nhiêṭ đô ̣700C đến khi thu đươc̣ cao khô hoàn toàn.  Hiệu suất tách chiết cao: mcao thu được (g): khối lượng cao thu được sau khi cô cách thủy mcao ban đầu (g): khối lượng bột cao ban đầu Hình 2.6. Dịch lọc qua các lần ngâm của các mẫu cây Xidi klung 49
62. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết nước Giống vi khuẩn Tăng sinh trong TSB và TSB+NaCl 1.5% Lắc 150 v/p,nhiệt độ phòng, 18 – 24 giờ Đo OD 600nm 6 Nước muối Pha loãng vi sinh vật nồng độ 10 cfu/ml sinh lý Hút 100µl vào đĩa petri chứa TSA/TSA+NaCl 1.5%, trang đều Đục lỗ(d=6mm) trên môi trường TSA Cao chiết Dịch cao (100mg/ml) DMSO 1% Nhỏ 100l dịch chiết vào giếng trên môi trường TSA Ủ 370C, 24h Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn bằng đường kính vòng kháng Hình 2.7. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn 50
63. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.1 Thuyết minh quy trình Chuẩn bị 20 chai có chứa 10ml môi trường tăng sinh, sau đó tiến hành thao tác cấy các chủng VSV chı̉ thi ̣vào chai môi trường đa ̃ chuẩn bi. ̣ Sau khi tăng sinh, lắc các chai môi trườ ng trên khoảng 150 vòng/phút trong 18- 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Thu di ̣ch chứ a VSV. Dịch VSV sau khi được tăng sinh, tiến hành đo OD ở 600 nm để xác đinḥ mâṭ đô ̣ VSV trong dicḥ chiết. Khi đa ̃ xác đinḥ đươc̣ mâṭ đô ̣ vi khuẩn, tiến hành pha loãng các chủng vi sinh vật theo công thức: C.V=C’.V’ để được mật độ 106 cfu/ml. Dùng pipette hút 1ml từ dicḥ VSV đa ̃ pha loang̃ cho vào ống chứa 9ml nước muối sinh lý, lắc manh.̣ Tiếp theo, dùng pippete hút 100l cho vào đĩa petri (chứa sẵn môi trường TSA vô trùng), trang đều đĩa cho đến khi khô hoàn toàn thı̀ đục lỗ trên đĩa. Dùng pippêt hút 100l dịch cao (cao + DMSO 1%) nồng độ 100 mg/ml cho vào từng giếng thạch, để đĩa yên trong 2 giờ. Ủ các đıã petri ở 37oC trong 24 giờ . Đọc kết quả, đo vòng kháng khuẩn. 2.4.2.2 Đọc kết quả Tiến hành đo vòng kháng khuẩn của mẫu cao trong các đıã petri đa ̃ ủ. So sánh vòng kháng khuẩn của mẫu cao và kháng sinh. Nếu lỗ nào có vòng kháng khuẩn xung quanh chứng tỏ cao có kháng khuẩn chủng vi khuẩn đó. Ta sử dụng chủng vi khuẩn này tiếp tục thử nghiệm xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC). 51
64. Đồ án tốt nghiệp 2.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định thành phần hóa học của các cao chiết. Mẫu cao chiết nước Ngâm trong H2SO4 Ngâm trong DMSO 1% 10% Lọc Lọc Alkloid Carbon- Saponnin, Flavonoid, Steroid, hydrate althraquinone, phenolic acid cardiac compound, amin glycoside tannin Hình 2.8. Quy trình xác định thành phần hóa học Đối với chỉ tiêu alkaloid: mẫu cao được ngâm trong H2SO4 10% trong khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc. Thu phần dịch trong để tiến hành thử nghiệm. Đối với các chỉ tiêu còn lại: mẫu cao được pha trong DMSO cho đến khi tan hoàn toàn. Sau đó, tiến hành pha loãng và lọc qua giấy lọc để thu dịch trong để tiến hành thử nghiệm.  Tiến hành các thử nghiệm để xác định thành phần hóa học trong cây thuốc gồm:  Carbohydrate: thử nghiệm Molisch, thử nghiệm Feling, thử nghiệm Barfoed.  Alkaloid: thử nghiệm Mayer, Dragendorff, thử nghiệm Hager, thử nghiệm Wagner.  Saponin: thử nghiệm Foam.  Cardiac glycosides: thử nghiệm Legal, thử nghiệm Keller Killiani. 52
65. Đồ án tốt nghiệp  Anthaquinone glycosides: thử nghiệm Bontrager.  Flavonoid: thử nghiệm Alkaline, thử nghiệm Shinoda, thử nghiệm Ferric chloride.  Phenolic: thử nghiệm Lead acetate, thử nghiệm Gelatin.  Tannin: thử nghiệm Ferric chloride, thử nghiệm Lead acetate.  Steroid: thử nghiệm Salkowski, thử nghiệm Libermann Burchard.  Amino acid: thử nghiệm xác định Amino acid. 53
66. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao Để có thể đánh giá hiệu quả tách chiết cao của dung môi nướ c đối với các mẫu cây thuốc thì hiệu suất tách chiết là một trong những tiêu chí cần xác định. Kết quả đánh giá hiệu suất tách chiết cao của cao chiết nướ c từ các cây thuốc đươc̣ thử nghiêṃ đươc̣ trı̀nh bày trong hı̀nh 3.1 Hınh̀ 3.1. Hiêụ suất tách chiết các cao chiết nướ c Hı̀nh 3.1 thể hiêṇ kết quả hiêụ suất tách chiết cao từ dung môi nướ c từ các cây thuốc. Kết quả trên cho thấy rằng hiệu suất tách chiết cao nướ c từ các cây thuốc khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Kết quả tách chiết cao của cây Euodia sp. cho hiệu suất trung bình cao nhất 30%, kế đến là các cây Arcorus sp., 54
67. Đồ án tốt nghiệp Eupatoriium sp., Xidi klung, Calamus sp., Polygala sp., Medinilla sp. vớ i hiệu suất tách chiết trung bình lần lượt là 26%; 25,46%; 21%, 21% 20,53% và 20,18%. Bên canḥ đó, các cao nướ c cây Streptocaulon sp., Elephatorium sp., Podocarpus sp., cho hiêụ suất tách chiết tương đối thấp (< 20%) vớ i hiêụ suất thu hồi trung bı̀nh lần lươṭ là 16%, 15,15%, 11,99% và cuối cùng cây Lantana sp. cho hiêụ suất thu hồi thấp nhất vớ i giá tri trung̣ bı̀nh 11%. Kết quả đánh giá hiêụ suất thu hồi của các mẫu cao chiết nướ c từ các loaị cây cho thấy rằng nướ c là môṭ dung môi có thể sử dung̣ đươc̣ trong quá trı̀nh tách chiết các hơp̣ chất có trong thưc̣ vâṭ do hiêụ suất thu hồi tốt. Trong cao chiết có khả năng thu nhâṇ đươc̣ các hơp̣ chất có hoaṭ tı́nh sinh hoc̣ như alkaloid, flavonoid, tannin và các hơp̣ chất phenolic. Hơn nữa, viêc̣ sử dung̣ nướ c là dung môi tách chiết cũng phù hơp̣ vớ i cách sử dung̣ cây thuốc trong các bài thuốc dân gian, đồng thờ i nó cũng là dung môi phổ biến, rẻ tiền và nhất là không đôc̣ haị đối với ngườ i sử dung.̣ Tuy nhiên, để đánh giá nướ c có thưc̣ sư ̣ là môṭ dung môi tách chiết tốt hay không thı ̀ ngoài hiêụ suất tách chiết, hoa ̣t tı́nh sinh ho ̣c cũng đóng mô ̣t vai trò quan tro ̣ng. Do đó, cần phải khảo sát hoaṭ tı́nh sinh hoc̣ mà trong đề tài này là hoaṭ tı́nh kháng khuẩn để có thể đánh giá chı́nh xác nướ c có phải là dung môi tách chiết tốt nhất hay không. 3.2 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cá c mẫu cao chiết nướ c Các mẫu cao chiết nướ c sau khi đươc̣ pha loang̃ ở nồng đô ̣100mg/ml đươc̣ tiến hành đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn đối vớ i 20 chủng vi khuẩn gây bênḥ bao gồm 4 chủng E. coli, 2 chủng Listeria, 4 chủng Salmonella, 3 chủng Shigella, 4 chủng Vibrio và các vi khuẩn gây bênḥ cơ hôị trên da bao gồm Pseudomonas aerusginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus feacalis. 55
68. Đồ án tốt nghiệp 3.2.1 Kết quả đá nh giá hoaṭ tı́nh khá ng khuẩn đố i vớ i nhóm vi khuẩn Escherichia coli Kết quả đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của 11 loaị cao chiết nướ c đối vớ i nhóm vi khuẩn Escherichia coli đươc̣ thể hiêṇ trong hı̀nh 3.2. Hınh̀ 3.2. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Escherichia coli. Dựa vào hı̀nh 3.2 nhận thấy rằng cao chiết nướ c từ các cây thuốc Medinilla sp., Xidi klung, Polygala sp., và Streptocaulon sp. có khả năng kháng laị sư ̣ phát triển của nhóm vi khuẩn E. coli khảo sát, trong đó cao chiết nướ c cây Medinilla sp. thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn tốt nhất khi kháng cả 4 chủng vi khuẩn E. coli khảo sát với đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 9,83mm đến 11mm. Cao chiết nước từ cây Xidi klung cũng thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn ở 3/4 chủng vi khuẩn nhóm E. coli 37
69. Đồ án tốt nghiệp là E. coli O157:H7, E. coli và ETEC vớ i đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 9,17mm đến 11,67mm. Thêm vào đó, cao chiết nướ c Polygala sp. cũng thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn ở 2/4 chủng vi khuẩn E. coli là E. coli và ETEC vớ i đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh lần lươṭ là 8,17mm và 8,75mm. Ngoài ra, cao chiết nước cây Streptocaulon sp. cũng thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn ở vi khuẩn E. coli O157:H7 vớ i đường kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh là 9,2mm. Các cao chiết nướ c còn laị không thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng vi khuẩn nhóm E. coli. Kết quả trên cho thấy rằng cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. và cây Xidi klung có khả năng ứ c chế nhóm vi khuẩn E. coli tốt hơn so vớ i các loaị cao chiết nướ c từ các cây thuốc còn laị trong đề tài. Tuy nhiên, kết quả kháng khuẩn E. coli của 2 mẫu này khi so sánh với Ciprofloxacin nồng đô ̣ 500mg/ml thı̀ vẫn còn thấp hơn môṭ cách có ý nghıã thống kê (p < 0,05). Thử nghiêṃ của Thilza và ctv (2010) về hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cao chiết nướ c cây Moringa oleifera với nồng đô ̣ 200mg/ml trên chủng E. coli cho kết quả vòng kháng khuẩn trung bı̀nh là 7mm. Trong thử nghiêṃ này, mẫu cao nước nồng đô ̣ 100mg/ml của cây Medinilla sp. cho vòng kháng khuẩn trung bı̀nh là 10,17mm và mẫu cao nướ c nồng đô ̣ 100mg/ml của cây Xidi klung cho vòng kháng khuẩn trung bı̀nh là 9,33mm, cao hơn vòng kháng của nghiên cứ u nêu trên. 3.2.2 Kết quả đá nh giá hoaṭ tı́nh khá ng khuẩn đố i vớ i nhóm vi khuẩn Listeria spp. Sau khi tiến hành thử nghiêṃ đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của 11 loaị cao chiết nướ c đối vớ i nhóm vi khuẩn Listeria, kết quả thu được từ thử nghiê ̣m được thể hiê ̣n trong hı̀nh 3.3. 37
70. Đồ án tốt nghiệp Hınh̀ 3.3. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Listeria spp. Từ kết quả thu đươc̣ ở hı̀nh 3.3, nhận thấy rằng cao chiết nướ c từ các cây thuốc khác nhau thể hiện hoạt tính ứ c chế khác nhau đối với 2 chủng vi khuẩn Listeria khảo sát. Cao chiết nước từ cây Medinilla sp. thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn tốt nhất vớ i cả 2 chủng vi khuẩn Listeria khảo sát, đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh lần lươṭ là 10,2mm và 12,8mm. Đối vớ i chủng L. monocytogenes, cao chiết nướ c từ cây Polygala sp. và cây Streptocaulon sp. thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn tốt tương đương vớ i kháng sinh đối chứ ng Ciprofloxacin ở nồng đô ̣ 500mg/ml, đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn lần lươṭ là 10mm và 11,3mm. Đối vớ i chủng L. innocua, cao chiết từ cây Xidi klung thể hiêṇ hoaṭ tı́nh tốt nhất và tương đương vớ i kháng sinh đối chứ ng Ciprofloxacin ở nồng đô ̣500mg/ml, đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh 10mm. 38
71. Đồ án tốt nghiệp Các kết quả trên cho thấy rằng nhóm vi khuẩn nhóm Listeria khảo sát bi ̣ứ c chế sư ̣ phát triển bởi cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. cao hơn so với các loại cao chiết nướ c từ các cây thuốc khác trong đề tài. Khi so sánh với hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của đối chứ ng Ciprofloxacin 500mg/ml, hoaṭ tı́nh ứ c chế vi khuẩn nhóm Listeria của cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. tốt tương đương về phương diêṇ thống kê (p < 0,05). 3.2.3 Kết quả đá nh giá hoaṭ tı́nh khá ng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn Salmonella spp. Kết quả quả thử nghiêṃ đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của 11 loaị cao chiết nướ c từ các cây thuốc đối vớ i nhóm vi khuẩn Salmonella đươc̣ thể hiêṇ trong hı̀nh 3.4. Hınh̀ 3.4. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Salmonella spp. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn thu đươc̣ ở hı̀nh 3.4 cho thấy rằng 7/11 loaị cao chiết nướ c từ các cây thuốc không kháng laị sư ̣ phát triển của vi khuẩn nhóm Salmonella 39
72. Đồ án tốt nghiệp khảo sát, trong khi đó các cao chiết nướ c từ các cây còn laị là Medinilla sp., Xidi klung, Polygala sp., Podocarpus sp. có khả năng kháng laị vi khuẩn nhóm Salmonella. Cao chiết nướ c cây Medinilla sp. thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn tốt nhất khi kháng cả 4 chủng vi khuẩn Salmonella khảo sát, đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 9,7mm đến 11mm và cao thuốc nướ c cây Xidi klung cũng thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn tốt ở 2 chủng vi khuẩn S. typhii và S. typhimurium vớ i đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh của 2 chủng vi khuẩn lần lươṭ là 11mm và 11,5mm. Cao chiết nước cây Podocarpus sp. và cây Polygala sp., ứ c chế vi khuẩn S. typhii vớ i đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh là 9,8mm và 3,8mm. Từ kết quả trên nhâṇ thấy rằng cao chiết nước cây Medinilla sp. ứ c chế sư ̣ phát triển của nhóm vi khuẩn Salmonella tốt hơn các loại cao chiết nướ c từ các cây thuốc khác khi kháng đươc̣ 4/4 chủng vi khuẩn Salmonella. Khi so sánh hoaṭ tı́nh kháng khuẩn vớ i Ciprofloxacin 500mg/ml, hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cao chiết nước từ cây Medinilla sp. cho kết quả tốt tương đương môṭ cách có ý nghıã thống kê (p < 0,05). Khi so sánh vớ i thử nghiêṃ của Adebolu và Oladimeji về hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cao chiết nước từ lá cây Ocimum gratissimum đươc̣ chần nướ c sôi, kết quả thử nghiêṃ này laị thấp hơn khi vòng kháng khuẩn trong thử của Adebolu và Oladimeji đối vớ i vi khuẩn S. typhii là 30mm và đối vớ i vi khuẩn S. typhimurim là 39mm. Tương tư,̣ trong môṭ thı́ nghiêṃ của Doughari (2006) về hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cao nướ c chiết xuất từ vỏ cây Tamarindus indica Linn, vớ i nồng đô ̣ 100mg/ml, vòng kháng khuẩn ghi nhâṇ đươc̣ 24mm, cao hơn so vớ i trong kết quả trong thử nghiêṃ này. 3.2.4 Kết quả đá nh giá hoaṭ tı́nh khá ng khuẩn đố i vớ i nhóm vi khuẩn Shigella spp. Tiến hành thử nghiêṃ đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn Shigella của 11 loaị cao chiết nướ c, kết quả thu đươc̣ từ thử nghiêṃ đươc̣ thể hiêṇ trong hı̀nh 3.5. 40
73. Đồ án tốt nghiệp Hınh̀ 3.5. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Shigella spp. Dựa vào kết quả từ hı̀nh 3.5 nhận thấy rằng 5/11 mẫu cao chiết nướ c gồm Pococarpus sp., Eupatorium sp., Medinilla và Xidi klung có hoạt tính kháng 3 chủng vi khuẩn Shigella, trong đó cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn tốt nhất khi cho kết quả vòng kháng khuẩn ở cả 3 chủng vi khuẩn với đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 9,3mm đến 11,3mm Bên canḥ đó, cao chiết nướ c cây Xidi klung cũng thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn ở 2 chủng vi khuân Shi. flexneri và Shi. sonnei, đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh đối vớ i 2 chủng vi khuẩn lần lươṭ là 9,3mm và 8,5mm. Đối vớ i vi khuẩn Shi. flexneri, cao thuốc nướ c từ cây Elephatopus sp. thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn tốt nhất với vòng kháng khuẩn 11,2mm, tương đương vớ i hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của Ciprofloxacin ở nồng độ 500mg/ml. Đối vớ i vi khuẩn Shi. boydii, cao chiết từ cây Eupatorium sp. cho kết quả tốt nhất, đường kı́nh vòng kháng 13,2mm trong khi đối chứ ng dương Ciprofloxacin 500mg/ml laị không thể 41
74. Đồ án tốt nghiệp hiêṇ kết quả kháng. Ở vi khuẩn Shi. sonnei, cao thuốc từ cây Medinilla sp. cho kết quả tốt nhất, tuy nhiên laị thấp hơn so vớ i đối chứ ng dương Ciprofloxacin 500mg/ml. Kết quả này cho thấy rằng nhóm vi khuẩn Shigella bi ̣ứ c chế bở i cao chiết nướ c cây Medinilla sp. cao nhất khi kháng đươc̣ cả 3 chủng vi khuẩn Shigella và cho kết quả vòng phân giải lớ n nhất so vớ i các cao chiết nước từ các mẫu cây khác trong thı ́ nghiêm.̣ Hơn nữa, hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. cũng thể hiêṇ kết quả tốt tương đương với đối chứ ng Ciprofloxacin 500mg/ml. Trong môṭ thử nghiêṃ tương tư ̣ của Doughari (2006) về cao nướ c chiết xuất từ vỏ cây và lá cây Tamarindus indica Linn, cao chiết từ vỏ cây vớ i nồng đô ̣ 100mg/ml cho kết quả vòng kháng khuẩn trên vi khuẩn Shi. flexneri là 18mm, cao hơn so vớ i trong kết quả trong thử nghiêṃ này. Tuy nhiên, kết quả vòng kháng khuẩn của mẫu cao chiết từ lá cây laị ghi nhâṇ kết quả thấp hơn vớ i vòng kháng khuẩn trung bı̀nh chı̉ 3mm. 3.2.5 Kết quả đá nh giá hoaṭ tı́nh khá ng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn Vibrio spp. Kết quả ghi nhâṇ đươc̣ trong quá trı̀nh thưc̣ hiêṇ thử nghiêṃ đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cao chiết nước từ 11 mẫu cây đối với nhóm vi khuẩn Vibrio trên da đươc̣ thể hiêṇ ở bảng 3.6 42
75. Đồ án tốt nghiệp Hınh̀ 3.6. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Vibrio spp. Kết quả ở hı̀nh 3.6 cho thấy rằng nhóm Vibrio khảo sát bi ̣ứ c chế bở i 4 loaị cao chiết nướ c từ các cây Medinilla sp., Xidi klung, Eupatorium sp., Podocarpus sp Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn tốt nhất đươc̣ thể hiêṇ ở cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. khi kháng đươc̣ cả 4 chủng Vibrio vớ i đường kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 9,8mm đến 10,7mm, tiếp theo là hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cao chiết nướ c từ cây Polygala sp. khi kháng khuẩn ở 3 chủng vi khuân của nhóm là V. alginolyticus, V. harveyi và V. parahaemolyticus, đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 5,5mm đến 9,2mm. Ngoài ra, cao chiết nướ c cây Eupatorium sp. và cây Podocarpus sp. thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn đối vớ i chủng vi khuẩn V. harveyi, đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh lần lươṭ là 10mm và 15,8mm. 43
76. Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả ghi nhâṇ đươc̣ ở trên, nhâṇ thấy rằng cao chiết nướ c cây Medinilla sp. và cây Polygala sp. kháng laị sư ̣ sinh trưở ng của nhóm vi khuẩn Vibrio khảo sát tốt với hơn so với các loại cao chiết nướ c từ các cây thuốc khác. Tuy nhiên, khi so sánh với hoạt tính kháng khuẩn của Ciprofloxacin ở nồng độ 8 mg/ml thì phổ kháng khuẩn và hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cao chiết nướ c từ 2 cây này laị thấp hơn môṭ cách có ý nghıã thống kê (p < 0,05). 3.2.6 Kết quả đá nh giá hoaṭ tı́nh khá ng khuẩn đố i vớ i nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hôị trên da Ngoài hoaṭ tı́nh kháng vi khuẩn gây bênḥ tiêu chảy, hoaṭ tı́nh kháng vi khuẩn gây bênḥ trên da cũng đươc̣ tiến hành đánh giá và ghi nhâṇ kết quả. Kết quả ghi nhâṇ đươc̣ thể hiêṇ ở bảng 3.7 Hınh̀ 3.7. Kết quả kháng khuẩn của các loaị cao chiết nướ c đối với các vi khuẩn gây bênḥ về da 44
77. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào hı̀nh 3.7 nhận thấy rằng ngoài cao chiết nước từ các cây Medinilla sp., Podocarpus sp., Eupatorium sp., và Polygala sp., các cao chiết từ các cây thuốc khác đều không có hoạt tính kháng khuẩn đối với các chủng vi khuẩn cơ hôị gây bênḥ trên da ngoài môṭ cách khác nhau, trong đó cao thuốc nướ c từ cây Medinilla sp. thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn tốt ở cả 3 chủng vi khuẩn, đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 9,5mm đến 9,8mm. Ngoài ra, vi khuẩn S. aureus cũng bi ̣ứ c chế bở i cao chiết từ cây Podocarpus sp. và Eupatorium sp. vớ i đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn lần lươṭ là 9,7mm và 6,2mm. Thêm vào đó, vi khuẩn E. feacalis cũng bi ̣kháng laị bở i cao chiết nướ c từ cây Polygala sp. thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn vớ i đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh là 11,5mm. Kết quả này cho thấy rằng nhóm vi khuẩn gây bênḥ trên da đươc̣ khảo sát bi ̣ứ c chế bở i hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cao chiết nướ c cây Medinilla sp. cao hơn các loại cao chiết nước từ các cây thuốc khác khi cao chiết nướ c từ cây này kháng đươc̣ cả 3 chủng vi khuẩn vớ i đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn lớ n nhất. Tuy nhiên, hoaṭ tı́nh này vẫn còn thấp hơn theo mứ c ý nghıã thống kê ( p < 0,05) khi so sánh vớ i Ciprofloxacin ở nồng độ 500mg/ml. Thử nghiêṃ của Thilza và ctv (2010) về hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cao chiết nướ c cây Moringa oleifera vớ i nồng đô ̣ 200mg/ml trên chủng Pseudomonas và S. aureus không ghi nhâṇ đươc̣ kết quả vòng kháng khuẩn. Dưạ trên kết quả của thử nghiêṃ trên, ta có thể thấy đươc̣ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cây Medinilla sp. trong thử nghiêṃ này là tốt hơn khi ghi nhâṇ đươc̣ kết quả kháng khuẩn trên cả 2 chủng vi khuẩn trên. 3.2.7 Tổng hơp̣ kết quả cá c kết quả khá ng khuẩn của cá c loaị cao chiết nướ c đố i vớ i cá c chủng vi khuẩn chı̉ thi ̣ Từ các kết quả thu nhâṇ đươc,̣ ta nhâṇ thấy cao chiết nướ c từ các cây hầu hết đều không thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn chı̉ thi ̣hoăc̣ chı ̉ thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn vớ i môṭ vài chủng vi khuẩn. Tuy nhiên, trong thử nghiêṃ này, cao chiết nướ c cây Medinilla sp. cây Polygala sp. cây Xidi klung laị cho kết quả kháng đươc̣ môṭ số vi khuẩn khảo sát. Kết quả 45
78. Đồ án tốt nghiệp kháng khuẩn của cao chiết nướ c cây Medinilla sp., Polygala sp. và Xidi klung đươc̣ thể hiêṇ ở Bả ng 3.1 46
79. Đồ án tốt nghiệp ổng số chủng20 sinhvi vật khảo sát ên t ết quả kháng khuẩn của các cao chiếtkhác nhau tr K ng 3.1 ̉ Ba 47
80. Đồ án tốt nghiệp Dưạ vào bảng 3.1, ta có thể thấy đươc̣ cao chiết nướ c cây Medinilla sp. có phổ kháng khuẩn rông̣ nhất, khảng đươc̣ tất cả các chủng vi khuẩn khảo sát, vòng kháng khuẩn trung bı̀nh 9,3mm – 12,83mm. Trong khi đó, cao chiết nướ c cây Polygala sp. có hoaṭ tı́nh kháng khuẩn vớ i 8/20 chủng vi khuẩn khảo sát, vòng kháng khuẩn từ 3,0mm – 11,5mm. Cao chiết nước cây Xidi klung cũng cho hoaṭ tı́nh kháng khuẩn vớ i 8/20 chủng vi khuẩn khảo sát, vòng kháng khuẩn từ 8,2mm – 11,5mm. Từ các kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết nướ c, cao chiết từ cây Medinilla sp, Pogygaly sp. và Xidi klung có hoạt tính sinh học khá tốt so với một số loại thực vật, đăc̣ biêṭ là cây Medinilla sp. cho kết quả kháng tất cả chủng vi khuẩn khảo sát và hiêụ suất thu hồi cao tốt. 3.3 Kết quả thử nghiêṃ đinḥ tı́nh xác định thành phần hóa học củ a cá c mẫu cao chiết nướ c Kết quả thử nghiêṃ đinḥ tı́nh thành phần hóa hoc̣ của các mẫu cao chiết nướ c từ các cây thuốc đươc̣ thể hiêṇ ở bảng 3.2 48
81. Bang 3.2 Bang kết qua thanh phần hoa hoc̣ cua cac mẫu cao chiết nươc Đ ̉ ̉ ̉ ̀ ́ ̉ ́ ́ ồ án t án ố t nghit ệ p 49
82. Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả đinḥ tı́nh sơ bô ̣ thành phần hóa hoc̣ của các mẫu cao nước từ các cây, chúng tôi nhận thấy rằng nướ c là dung môi có khả năng tách chiết được rất nhiều hợp chất từ các cây thuốc bao gồm các hợp chất thông thường và cả những hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hợp chất thông thường được tìm thấy trong các mẫu cao chiết nướ c hầu hết các nhóm carbohydrate (thử nghiệm Molisch, Fehling và Barfoed đều dương tính), nhưng không thấy có sự hiện diện của amino acid. Hoạt tính kháng khuẩn của thực vật do chúng có các thành phần như alkaloids, flavonoid, hợp chất phenolic, tannin. Theo nghiên cứu của Cowan (1999), xét cụ thể ở hợp chất alkaloids có thể thấy tồn tại dẫn chất berberine và dẫn chất piperrine có chức năng xen vào thành tế bào hoặc DNA của vi sinh vật phá hủy và tiêu diệt chúng. Trong khi đó, trên hợp chất phenolic thấy sự tồn tại của các dẫn chất như catechol, epicatechin, cinnamic acid, hypericin warfarin hay trong hợp chất của flavonoids có dẫn chất flavone và flavonols, ngoài ra còn có hợp chất tannin có dẫn chất ellagitannin, ở hợp chất terpennoids, tinh dầu thì có dẫn chất là capsaicin. Tất cả các dẫn chất trên đều có chức năng phá vỡ màng tế bào, liên kết bám dính, tạo phức hợp với thành tế bào, khử hoạt tính enzyme và bám dính protein, các chức năng trên giúp tiêu diệt vi sinh vật. Cao chiết nước của các cây thử nghiêṃ hầu hết đều có sư ̣ hiêṇ diêṇ của saponin, cardiac glycosides, flavonoid, hơp̣ chất phenolic, tanin (trừ Podocarpus sp.), steroid (trừ Eupatorium sp). Ta cũng thấy rằng cao chiết nướ c từ các cây không hoăc̣ ı́t thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn như Podocarpus sp., Eupatorium sp., Elephantopus sp., Lantana sp., Acorus sp., Calamus sp., Streptocaulon sp. đều không có sư ̣ hiêṇ diêṇ của alkaloid. Tuy nhiên, cây Medinilla sp. cũng không cho kết quả có sự hiê ̣n diê ̣n của alkaloid măc̣ dù hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cây tốt nhất trong số các cây thuốc đươc̣ khảo sát đánh giá. Có thể hoaṭ tı́nh của cây Medinilla sp. là do các hoaṭ tı́nh kháng khuẩn khác hiêṇ diêṇ trong cây như flavonoid, hợp chất phenolic, tannin. Các cây thuốc khác cũng cho kết quả kháng khuẩn tốt là Xidi klung, Polygala sp. đều có sư ̣ hiêṇ của alkaloid, chứ ng tỏ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các cây thuốc này có thể do alkaloid, flavonoid, hợp chất phenolic, tannin góp phần taọ thành. 50
83. Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả của các thử nghiêṃ trên, ta nhâṇ thấy cao chiết nướ c từ cây Polygala sp., Xidi klung và Medinilla sp. là những loại cây thuốc có hoạt tính sinh học khá cao, đặc biệt là hoạt tính kháng khuẩn khi cho kết quả kháng đươc̣ nhiều loaị vi khuẩn gây bênh,̣ đăc̣ biêṭ là bênḥ tiêu chảy. Măc̣ dù hiêụ suất tách chiết cao không cao (≥ 21%) nhưng không thể không đề cao chất có hoaṭ tı́nh sinh hoc̣ tốt như alkaloid, flavonoid, hơp̣ chất phenolic, tanin có trong cao chiết nướ c của các cây kể trên. Chı́nh những hơp̣ chất này hı̀nh thành nên hoaṭ tı́nh sinh hoc̣ của các cao chiết ấy. Với những nghiên cứu cơ bản về hoạt tính sinh học của các cây này sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về khả năng trị bệnh của chúng đặc biệt là khả năng trị bệnh tiêu chảy – một trong những bệnh phổ biến nhất hiện. 51
84. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến quá trình tách chiết cao từ các cây thuốc dân gian thì cao chiết từ nướ c cất có hiệu suất thu hồi cao nhất (30%) là cây Euodia sp. - Trong các thử nghiêṃ về hoaṭ tı́nh kháng khuẩn, cao chiết nướ c có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất là cây Medinilla sp. (cho kết quả ứ c chế hoăc̣ đối kháng 20/20 chủng). Ngoài ra, các cây Polygala sp. và Xidi klung cũng cho kết quả ứ c chế hoăc̣ đối kháng tốt ở môṭ số chủng vi khuẩn gây bênḥ tiêu chảy. Cây Polygala sp. kháng đươc̣ 8/20 chủng vi khuẩn, cây Xidi klung đối kháng hoăc̣ ứ c chế đươc̣ 8/20 chủng vi khuẩn. - Kết quả thành phần hóa hoc̣ trong các cao chiết từ các cây thuốc cho sư ̣ hiêṇ diêṇ nhiều thành phần hóa hoc̣ như: carbonhydrate, alkaloids, saponin, cardiac glycosides, flavonoid, phenolic compound, tannin, steroid. 4.2 Đề nghị - Tiến hành định danh loài cho cây Polygala sp., Xidi klung và Medinilla sp. - Xác đinḥ giá tri MIC̣ của các cao chiết nướ c từ các cây Polygala sp., Xidi klung và Medinilla sp. - Khảo sát khả năng trị tiêu chảy của cây Polygala sp., Xidi klung và Medinilla sp trên mô hình động vật. - Đinh lượng các thành phần hóa học có trong cây Polygala sp., Xidi klung và Medinilla sp. 52
85. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Andrew Chevallier Fnimh (2006), Dược thảo toàn thư, NXBTHTPHCM. Hà Minh Hiển (2014), Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả mù u để ứng dụng trong kiểm nghiệm, Luận án tiến sĩ dược học, Đại học y dược TPHCM. nhHien-LA.pdf TS. Đặng Văn Hoài (2009 – 2010), Hóa hữu cơ NK Bài 2: steroid và cholesterol, Đại học Y dược TPHCM. BS Nguyễn Văn Minh Hoàng (2013), Đặc Điểm Shigella.sp gây tiêu chảy tại bệnh viện Nhiệt Đới TP HCM, Bệnh viện Nhiệt Đới TP HCM. chay-cap-tai-benh-vien-nhiet-doi-thanh-pho-ho-chi-minh-40933/ Phùng Trung Hùng và cộng tác viên (2013), Đại cương carbohydrate. Đỗ Tấn Lợi (1992), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXBKHKT TPHCM. Nguyễn Hữu Liêm (2013), Tìm hiểu về vi khuẩn Salmonella, Khóa luận tốt nghiệp 2010 – 2013, Đại học công nghệ TPHCM. Hoàng Ngân (2013), Bệnh tả và cách điều trị bệnh tả hiệu quả, Tạp chí sức khỏe và đời sống. Quỳnh Ngọc (2013), Flavonoid – Bảo vệ sức khỏe an toàn, NXB Trung tâm thông tin KH&CN TPHCM. Trần Kim Hùng Nguyên (2005), Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh vật đường ruột của cây Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum), Khóa luận tốt nghiệp 2001-2005, Trường đại học Nông Lâm. nang-khang-mot-so-chung-vi-sinh-vat-duong-ruot-cua-cay-xuan-hoa-38059/ Dương Văn Sĩ (2010), Tìm hiểu về vi khuẩn Streptococcus faecalis (Enterococcus faecalis), Chyên đề tốt nghiệp, Trường đại học Nông Lâm TPHCM. enterococcus-faecalis-mon-kiem-nghiem-chat-luong-thuc-pham-ban-trinh-chieu- 29121/ 53
86. Đồ án tốt nghiệp Vũ Xuân Tạo (2011), Nghiên cứu alkaloid & quy trình tách chiết một số chất có bản chất là alkaloid, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TPHCM Lương Văn Tiến và ctv (2015), Kết quả nghiên cứu bước đầu về thành phấn hóa học của dầu hạt lai (Aleurites moluccana), Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam. Nguyễn Tấn Thịnh (2013), Tìm hiểu thành phần hợp chất thứ cấp trong cây lược vàng, Trường đại học công nghệ TPHCM. cay-luoc-vang-callisia-fragrans-lindl-wood-52390/ Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng dược liệu, tập I, Trường đại học Dược Hà Nội Ngô Văn Thu (2011), Bài giảng dược liệu, tập I, Trường đại học Dược Hà Nội. Hồ Chí Tuấn (2009), Bài giảng Amino acid, Trường Đại học Y Hà Nội Đào Thị Thùy (2009), Nghiên cứu ảnh hưởng của chế biến cổ truyền đến thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của vị thuốc viễn chí (Radix Polygalae), Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 2004-2009, Trường đại học Y Dược Hà Nội. 54
87. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU TIẾNG ANH Abba D., Inabo, H. I., Yakubu, S. E. and Olonitola, O. S. (2009), Phytochemical analysis and antibacterial activity of some powered herbal preparations marketed in Kaduna metropolis, Full Lengh Research Article. Harborne B. (1989) Plant Phenolics. Academic Press, UK p: 6 Harborne B. (1998) Phytochemical Methods: A guide to modern techniques of plant analysis. Chapman & Hall Pub. London, UK pp: 40-42; 49; 84. James Hamuel Doughari (2010), Phytochemicals: Extraction Methods, Basic Structures and Mode of Action, Potential Chemotherapeutic Agents. James Hamuel Doughari (2012), Phytochemical: extraction methods, basic structures and mode of action as potential chemotherapeutic agents. Department of Microbiology, School of Pure and Applied Sciences, Federal Univercity of Technology, Yola Nigeria. Jean B. (1995), Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants - Technique & Documentation, Lavoisier. JH Doughari (2006), Antimicrobial Activity of Tamarindus indica Linn. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, December 2006; 5 (2): 597-603. Jigna Parekh, Nehal Karathia and Sumitra Chanda (2006), Screening of some traditionally used medicinal plants for potential antibacterial activity, International Journal of Engineering and Applied Sciences Karkare S., Adou E, Cao S., Brodie P., Miller J. S., Andrianjafy N. M., Razafitsalama J., Andriantsiferana R., Rasamison V. E., Kingston D. G. I. (2007), Cytotoxic cardenolide glycosides of Roupellina (Strophanthus) boivinii, The Madagascar rainforest, J Nat Prod, pp:70:1766 – 1770. Mon M. M.,Maw S. S. and Oo Z. K. (2011), Screening of antioxidant, anti-tumor and antimicrobial herbal drugs/diets from some Myanmar traditional herbs, International Journal of Bioscience, Biochemitry and Bioinformatics. Nicholson R., Vermerris W. (2008), Phenolic Compound Biochemistry, Springer USA, pp: 2; 40-151. Rayes A. A.H. (2012), Screening of some natural and cultivated plants in sudia arabia fight infections and inhibit growth of pathogenic bacteria, Faculty of Applied Sciences, Umm A1 – Qura University Makkah Saudi Arabia. Rozman T., Jersek B. (2009), Antimicrobial activity of rosemary extracts (Rosmarimus officinalis L.) against diferent species of Listeria, Acta agriculturae Slovenica. Salami Olufunmilayo Olamide, Afolabi Qasim Olaitan (2014), Antimicrobial activities of hot water extract and phytochemical screening of Acalypha wilkesiana (Red 55
88. Đồ án tốt nghiệp acalypha) on some selected organisms causing infection, International Journal of Engineering and Applied Sciences. Salem W. M., Sayed W. F., Haridy M. and Hassan N. H. (2014), Antibacterial activity of Calotropis procera and Ficus sycomorus extracts on some pathogenic microorganisms, African Journal of Biotechnology. Satheesh K. B., Sachetha K. N., Vadisha S. B., Sharmila K.P., Mahesh P. B. (2012) Preliminary phytochemical screening of various extracts of punica granatum peel, whole fruit and seeds, Nite University Journal of Health Science. Saxena Mamta and Saxena Jyoti (2012), Phytochemical screening of Acorus calamus and Lantana Camara, Interational Research Journal of Pharmacy. Silva N. C. C., Fermandes J. A. (2010), Biological properties of medicinal plants: a review of their antimicrobial activity, The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. Thilza I.B. , Sanni S., Zakari Adamu Isah , F.S. Sanni, Muhammed Talle, Musa Bamaiyi Joseph (2010), In vitro Antimicrobial activity of water extract of Moringa oleifera leaf stalk on bacteria normally implicated in eye diseases, Academia Arena, 2010;2(6):80-82 Valgas C., Souza S. M., Smania E. F. A., Smania Jr A. (2006), Screening methods to determine antibacterial activity of natural products, Brazillian Journal ò Microbiology. Venketeshwer Rao (2012), Phytochemicals – A global perspective of their role in nutrition and health. Wendakoon C., Calderon P., Gagnon D. (2012), Evaluation of selected medicinal plants extracted in different ethanol concentrations for antibacterial activity against human pathogens, Journal of Medicinally Active Plants. Wilfred Vermerris and Ralph Nicholson (2006), Phenolic compound biochemistry, Published, Springer, Netherlands. Witkowska A. M., Hickey. D. K., Alonso-Gomez M and Wilkinson M. (2013), Evaluation of antimicrobial activities of commercial herb and Spice extracts against selected food-borne bacteria, Journal of Food Research. Yadav P. D., Bharadwaj N. S. P.,Yedukondalu M., Methushala C. H., Ravi K. (2013), Phytochemical evaluation of nyctanthes arbortristis, nerium oleander and catharathnus roneus, Indian Journal of Research in Pharmacy and Biotechnology. Yusuf A. Z., Zakir A., Shemau Z., Abdullahi M., and Halima S. A. (2014) Phytochemical analysis of the methanol leaves extract of Paullinia pinnata linn, Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy. 56
89. Đồ án tốt nghiệp 57
90. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHU ̣ LUC̣ A: CÁ CH PHA MÔṬ SỐ DUNG DICḤ THUỐ C THỬ A.1. Cá c thử nghiêṃ đinḥ tı́nh carbonhydrate  Thuốc thử Molisch: Hòa tan 5g α- napthol vào ethanol 95% và pha loãng thành 100 ml  Thuố c thử Feling: Thuốc thử Fehling A: hòa tan 34,6 g CuSO4.5H2O vào 500ml nước cất. Thuốc thử Fehling B: Hòa tan 125g KOH và 173g Kali Natri tartrate.7H2O vào 500 ml nước cất.  Thuốc thử Barfoed: Thêm 10 ml acid acetic glacial vào 1000ml nước cất Cân 66,5 g Copper (II) acetate monohydrate Đun và khuấy đến khi tan hoàn A.2. Cá c thử nghiêṃ đinḥ tı́nh Alkaloids  Thuố c thử Mayer: Hòa tan 1,358g HgCl2 trong 60ml nước, sau đó đổ vào trong dung dịch này 5 g KI được pha trong 10ml nước. Sau đó định mức lên 100 ml.  Thuốc thử Dragendroff gồm 2 dung dịch: Dung dịch A: hòa tan 0,5 g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml acid acetic 20%. Dung dịch B: dung dịch KI 40% pha trong nước. Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với 5 ml dung dịch B và 70ml nước.  Thuốc thử Hager: Hòa tan 1 g acid picric vào 100ml nước cất  Thuốc thử Wagner: Hòa tan 2g iodine và 6g KI vào 100ml nước. A.3. Cá c thử nghiêṃ đinḥ tı́nh Cardiac glycosides  Thuốc thử Na nitro prusside (trong phản ứ ng Legal): 1g Na nitrofer-ricyanide và bổ sung 10 ml nước cất. A.4. Cá c thử nghiêṃ đinḥ tı́nh Cardiac glycosides  Thuốc thử Ninhydrin: 0,5 g ninhydrin và bổ sung 10 ml n – butanol. Gia nhiệt 70 – 800C, khuấy đều bằng cá từ cho tới khi tan hoàn toàn. Định mức bằng n – butanol lên 100 ml. 58
91. Đồ án tốt nghiệp PHU ̣ LUC̣ B: XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ MỨC ĐỘ KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC LOẠI CAO CHIẾT KHÁC NHAU TRÊN CÁC NHÓM VI SINH VẬT CHỈ THỊ B.1. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn E. coli O157:H7 Bả ng one way ANOVA Source Sum of Squares Mean F-Ratio P-Value Square Between groups 718.5 102.643 1970.74 0.0000 Within groups 0.833333 0.0520833 Total (Corr.) 719.333 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD Homogeneous CAY Count Mean Groups Elephantopus sp. 3 0.0 X Xidi klung 3 0.0 X Polygala sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Eupatorium sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 9.16667 X Medinilla sp. 3 11.0 X Ciprofloxacin 3 13.1667 X B.2. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn E. coli 0208 Bả ng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 661.74 7 94.5342 432.16 0.0000 groups Within 3.5 16 0.21875 groups Total (Corr.) 665.24 23 59
92. Đồ án tốt nghiệp Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD Homogeneous CAY Count Mean Groups Elephantopus sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 0.0 X Polygala sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Eupatorium sp. 3 0.0 X Xidi klung 3 9.16667 X Medinilla sp. 3 10.6667 X Ciprofloxacin 3 12.3333 X B.3 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn E. coli (K) Bảng one way ANOVA Sum of Mean Source Df F-Ratio P-Value Squares Square Between 669.458 7 95.6369 483.22 0.0000 groups Within 3.16667 16 0.197917 groups Total (Corr.) 672.625 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD Homogeneous CAY Count Mean Groups Eupatorium sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 0.0 X Elephantopus sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Polygala sp. 3 8.33333 X Xidi klung 3 9.33333 XX 60