Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết ethanol 70% từ một số loại thực vật tại Vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm Đồng

90 trang thiennha21 12/04/2022 4170

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết ethanol 70% từ một số loại thực vật tại Vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm Đồng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_danh_gia_hoat_tinh_khang_khuan_cua_mot_so_loai_cao_chi.pdf

Nội dung text: Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết ethanol 70% từ một số loại thực vật tại Vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm Đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ LOẠI CAO CHIẾT ETHANOL 70% TỪ MỘT SỐ LOẠI THỰC VẬT TẠI VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP NÚI BÀ, TỈNH LÂM ĐỒNG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Trịnh Tuấn Anh MSSV: 1211100332 Lớp: 12DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2016
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM KẾT Tôi xin cam đoan tất cả nội dung trong đồ án này đều do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS Phạm Minh Nhựt khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực vào chưa được công bố dưới bất kì hình thức nào. Mọi tài liệu tham khảo dùng trong đồ án này đều được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm công bố. Những số liệu của các bảng phân tích, biểu đồ, đánh giá được thu thập từ nhiều nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo và chú thích nguồn gốc. Tất cả nội dung, sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, không trung thực, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Trịnh Tuấn Anh
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Gíam Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, cùng các thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học Thực phẩm Môi trường đã quan tâm và giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình học tập tại trường. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em chân thành gửi đến thầy Phạm Minh Nhựt đã tận tâm hướng dẫn chúng em qua từng buổi học trên lớp cũng như những buổi nói chuyện, thảo luận về lĩnh vực sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, định hướng nghiên cứu. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy. Em cũng xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô khoa Công nghệ sinh học Môi trường Thực phẩm trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM đã tận tình truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cũng như niềm đam mê nghiên cứu khoa học cho em. Điều này không chỉ giúp em thực hiện đồ án này tốt nhất có thể mà còn là nền tảng kiến thức cho công như việc sau này. Em cảm ơn các bạn, anh, chị đã hỗ trợ và giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm. Cuối cùng, em xin cảm ơn các thầy cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án. Do kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế nên đồ án tốt nghiệp của em còn nhiều thiếu sót, mong các thầy cô chỉ dạy đề em hoàn thiện đồ án này tốt hơn cũng như thu nhận thêm được kiến thức. Em xin gửi lời chúc sức khoẻ đế các thầy cô. Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Trịnh Tuấn Anh
Đồ án tốt nghiệp MUC̣ LUC̣ MỞ ĐẦU 4 1. Đặt vấn đề 9 2. Mục tiêu nghiên cứu 10 3. Nội dung nghiên cứu 10 4. Phạm vi nghiên cứu 11 5. Nội dung Đồ án tốt nghiệp 11 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 12 1.1. Giới thiệu 12 1.1.1. Vai trò của cây thuốc trong đời sống 12 1.1.2. Lợi ích sử dụng cây thuốc 13 1.1.3 Tình hình sử dụng cây thuốc 13 1.2. Thành phần hóa học của thực vật 14 1.2.1 Carbohydrate 14 1.2.1.1 Khái niệm 14 1.2.1.2 Tính chất 14 1.2.1.3 Vai trò 15 1.2.2 Amino acid 15 1.2.2.1 Khái niệm 15 1.2.2.2 Tính chất 16 1.2.2.3 Vai trò 16 1.2.3 Alkaloid 16 1.2.3.1 Khái niệm 16 1.2.3.2 Tính chất 16 1.2.3.3 Vai trò 17 1.2.4 Glycosides 17 1.2.4.1 Khái niệm 17 1.2.4.2 Tính chất 18 1.2.4.3 Vai trò 18 1
Đồ án tốt nghiệp 1.2.5 Steroids 19 1.2.5.1 Khái niệm 19 1.2.5.2 Tính chất 19 1.2.5.3 Vai trò 19 1.2.6 Tannin 19 1.2.6.1 Khái niệm 19 1.2.6.2 Đặc điểm 20 1.2.6.3 Vai trò 20 1.2.7 Isoprenoid (Terpene) 20 1.2.7.1 Khái niệm 20 1.2.7.2 Tính chất 21 1.2.7.3 Vai trò 21 1.3 Tổng quan về hợp chất kháng khuẩn thực vật 21 1.3.1 Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn 21 1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn 22 1.3.3 Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật 23 1.3.3.1 Alkaloids 23 1.3.3.2 Terpenoids và tinh dầu 25 1.3.3.3 Phenol đơn và acid phenolic 25 1.3.3.4 Lectin và polypeptide 27 1.3.3.5 Saponin 27 1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình 28 1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 28 1.4.1.1 Escherichia coli 28 1.4.1.2 Shigella 29 1.4.1.3 Salmonella 30 1.4.1.4 Vibrio 31 1.4.1.5 Listeria 32 1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da 33 2
Đồ án tốt nghiệp 1.4.2.1 Pseudomonas aeruginosa 33 1.4.2.2 Staphylococcus aureus 34 1.4.2.3 Enterococcus feacalis 35 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Địa điểm và thời gian 36 2.1.1 Địa diểm 36 2.1.2 Thời gian 36 2.2 Vật liệu 36 2.2.1 Nguồn mẫu phân tích 36 2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị 37 2.2.3 Hóa chất, môi trường 37 2.3 Phương pháp nghiên cứu 38 2.3.1 Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu 38 2.3.2 Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị. 38 2.3.3 Phương pháp định lượng tế bào VSV bằng đo mật độ quang 39 2.3.4 Phương pháp bảo quản và giữ giống 39 2.3.5 Phương pháp tách chiết cao 40 2.3.6 Chuẩn bị dung dịch cao thuốc kháng sinh 40 2.3.7 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) 40 2.3.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học 41 2.3.8.1 Carbohydrate 41 2.3.8.2 Alkaloid 42 2.3.8.3 Saponin (thử nghiệm Foam) 42 2.3.8.4 Cardiac glycosides 42 2.3.8.5 Anthaquinone glycosides (thử nghiệm Bontrager) 43 2.3.8.6 Flavonoid 43 2.3.8.7 Phenolic 44 2.3.8.8 Tannin 44 2.3.8.9 Steroid 44 3
Đồ án tốt nghiệp 2.3.8.10 Amino acid 45 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 45 2.4 Bố trí thí nghiệm 46 2.4.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết ethanol 70% của các mẫu cây thuốc. 47 2.4.3 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết ethanol . 49 2.4.5 Thí nghiệm 4: Xác định thành phần hóa học 50 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi 52 3.2 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây khảo sát 53 3.2.1 Đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 53 3.2.2 Đối với nhóm vi khuẩn Listeria 54 3.2.3 Đối với nhóm vi khuẩn Salmonella 55 3.2.4 Đối với nhóm vi khuẩn Shigella 57 3.2.5 Đối với nhóm vi khuẩn Vibrio 58 3.2.6 Nhóm vi sinh vật gây bệnh khác 59 3.3 Kết quả xác định thành phần hoá học 63 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65 1. Kết luận 65 2. Đề nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 4
Đồ án tốt nghiệp DANH MUC̣ HÌNH Ả NH Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của các loại Carbonhydrate 15 Hình 1.3.Alanine 15 Hình 1.4. Epherdin và Hyoscyamin 16 Hình 1.5. Cardenolic và Bufadiennolid 18 Hình 1.6. Steroid 19 Hình 1.7. Tannin 20 Hình 1.8. Limonene và Ocimene 21 Hình 1.9. Một số cơ chế kháng sinh 22 Hình 1.10. Solamargine 24 Hình 1.11. Berberine 24 Hình 1.12.Một số Terpenenes và Terpenoid 25 Hình 1.13.Một số Quinones thông thường 26 Hình 1.14. Gallotannin 26 Hình 1.15. Một số Flavonoid 27 Hình 1.16. Saponin 28 Hình 1.17. Hình ảnh Escherichia coli O15:H7 dưới kính hiển vi 28 Hình 1.18. Ảnh chụp của Shigella sp. trong một mẫu phân 29 Hình 1.19. Hình ảnh của S. typhii và S. typhimurium 30 Hình 1.20. Hình ảnh Vibrio cholerae và Vibrio harvey i 31 Hình 1.21. Hình ảnh Listeria monocytogenes 32 Hình 1.22. Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa 33 Hình 1.24. Hình ảnh Enterococcus feacalis 35 Hình 2.1. Quy trình xử lý mẫu 38 Hình 3.1. Hiệu xuất tách chiết của ethanol 70% với các mẫu cây thuốc 52 Hình 3.2. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Escherichia coli 53 Hình 3.3. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Listeria 55 Hình 3.4. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Salmonella 56 5
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Shigella 57 Hình 3.6. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Vibrio 58 Hình 3.7. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm vi sinh vậy gây bệnh 59 6
Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT MIC (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu DMSO : Dung môi dimethysufoside TSA : môi trường Tryptone casein soy agar TSB : môi trường Trypticase Soy Broth 7
Đồ án tốt nghiệp DANH MUC̣ BẢ NG Bảng 1.1 Môṭ số Glycosides phổ biến 17 Bảng 3.1 Kết quả kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% đối vớ i 20 chủng vi khuẩn 64 Bảng 3.2 Kết quả xác đinḥ thành phần hóa hoc̣ 67 8
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nhân loại đã có những bước phát triển vượt bậc, tạo điều kiện chăm sóc sức khoẻ cộng đồng, phòng chống bệnh lây nhiễm, nhất là các bệnh do vi khuẩn gây ra. Tiếp nối sự thành công của một trong những phát hiện lớn nhất của y học trong trong thế kỉ 20 đó là việc tìm ra kháng sinh Penicillin vào năm 1928 của Alexander Fleming. Đến nay đã có nhiều loại thuốc kháng sinh được tạo ra. Hiện nay, ở Việt Nam, cũng như các nước trên thế giới việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh cũng trở nên phổ biến. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh chưa được quản lí chặt chẽ. “Phần lớn kháng sinh được bán mà không có đơn, 88% thành thị và 91% nông thôn. Mua kháng sinh để điều trị ho 31,6% thành thị và sốt 21,7% nông thôn. Ba loại kháng sinh được bán nhiều nhất là ampicillin/amoxicillin 29,1%, cephalexin 12,.2% và azithromycin 7,3%. Người dân thường yêu cầu được bán kháng sinh mà không có đơn 49,7% thành thị và 28,2% nông thôn.”( Khánh Linh, 2015). Đây là một thực trạng đáng báo động không chỉ ở Việt Nam mà trên toàn thế giới. Việc sử dụng thuốc kháng sinh không theo đơn của bác sĩ gây hậu quả nghiêm trọng khi bệnh nhân không chữa khỏi hoàn được bệnh mà nghiêm trọng hơn, điều này dẫn đến việc kháng thuốc kháng sinh. Hiện nay, đã xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh. “Kháng với thuốc kháng sinh cephalosporin thế hệ ba, xảy ra ở Áo, Úc, Canada, Pháp, Nhật Bản, Na Uy, Slovenia, Nam Phi, Thụy Điển và Vương quốc Anh. Thuốc kháng sinh cephalosporin không còn hiệu nghiệm trong việc điều trị bệnh lậu trong khi mỗi ngày trên thế giới có hơn 1 triệu người nhiễm bệnh lậu. ;” ( Nguyễn Thị Hồng Mến, 2015). “Ở Việt Nam, các chủng Streptococcus pneumoniae một trong những nguyên nhân thường gặp nhất gây nhiễm khuẩn hô hấp kháng penicillin (71.4%) và kháng erythromycin (92.1%) – có tỉ lệ phổ biến cao nhất trong số 11 nước trong mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP) năm 20002001.” ( TS. Nguyễn Văn Kính, 2010). Điều này đặt ra gánh nặng về kinh tế trong điều trị bệnh khi thay thế bằng các loại 9
Đồ án tốt nghiệp kháng sinh mới đắt tiền hơn hoặc không có kháng sinh thích hợp trong điều tri bệnh. Trước thực trạng kháng thuốc kháng sinh hiện nay đã có nhiều hướng nghiên cứu được tiến hành. Trong đó, bắt nguồn từ việc phát hiện ra các hợp chất kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên. Cây thuốc từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong y học phương Đông và ở Việt Nam “Chúng thường là những cây cỏ rất quen thuộc, mọc hoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn như: Hành, Tỏi, Hẹ, Kim ngân, Sâm đại hành, lá Móng tay, được nhân dân ta dùng làm thuốc tiêu độc, tiêu viêm, sát khuẩn, chữa các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da, mụn nhọt, chốc lở, viêm họng, viêm phế quản và nhiều bệnh nhiễm khuẩn khác” (Liên Hồng,CTQ25,2016). Với khả năng kháng sinh, đặc biệt là ít gây ra các tai biến có hại như các loại thuốc kháng sinh tổng hợp trong qua trình điều trị và nhiều ưu điểm khác. Nắm được vấn đề đó, chúng tôi đã áp dụng tiến hành đề tài: “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết ethanol 70% từ môṭ số loaị thực vật tại vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm Đồng”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cây thuốc dân gian với dung môi là ethanol 70%. Xác định thành phần hoá học có trong một số loại cao chết ethanol 70% từ các cây thuốc dân gian. 3. Nội dung nghiên cứu Đánh giá ảnh hưởng của dung môi ethanol 70% đến hiệu suất thu hồi từ các cây thuốc dân gian. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% của các cây thuốc dân gian Xác định thành phần hoá học của cao chiết ethanol 70% của một số loại cây thuốc dân gian 10
Đồ án tốt nghiệp 4. Phạm vi nghiên cứu Tiến hành thử nghiệm và khảo sát trên một số cây thuốc dân gian. 5. Nội dung Đồ án tốt nghiệp Nội dung của Đồ án tốt nghiệp này gồm có 4 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và đề nghị 11
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu 1.1.1. Vai trò của cây thuốc trong đời sống Từ hơn 3000 năm trước, ông cha ta đã biết đến nguồn dược liệu phong phú, từ động vật, thực vật đến khoáng vật trong khắp đất nước. Trong đó, phải kể đến các loại dược liệu có nguồn gốc từ thực vật. Qua thời gian, cây thuốc dần có vai trò quan trọng trong đời sống của nhân dân. Từ các gia vị như gừng, tỏi, như một gia vị trong bếp, đã được sử dụng để trị các chứng bệnh thường gặp như hạ sốt, đầy hơi khó tiêu, hay sử dụng lá tía tô kèm cháo trắng có tác dụng giải cảm ” Gừng tươi, lá tía tô cùng một số thảo dược khác rất có ích cho người bị ảnh hưởng của khí phong hàn (gió và lạnh), mắc một số bệnh mùa lạnh như: Cảm lạnh, ho, lạnh bụng, tiêu chảy, hoặc đau nhức xương khớp do phong hàn thấp.” (Huỳnh Châu,2014).“Cây vẩy ốc chữa phong thấp, kiết lị, quả chín bổ thận; cây mảnh trấu chữa u xơ tiền liệt tuyến; cây hẹ có tác dụng cầm máu, ăn thay rau thơm có tác dụng bổ dương”(Minh Hường, 2015) 1 2 3 4 Hình 1.1. Một số cây thuốc (1:Lantana sp., 2: Acorus sp., 3: Euodia sp., 4: Calamus sp) 12
Đồ án tốt nghiệp Với kinh nghiệm, kiến thức thu thập được qua nhiều thế hệ. Các bài thuốc từ cây thuốc ngày càng trở nên đa dạng và phong phú, góp phần vào kho tàng y học to lớn của dân tộc. 1.1.2. Lợi ích sử dụng cây thuốc Ngày nay, các cây thuốc có giá trị to lớn đối y học dân tộc cũng như đời sống nhân dân. Các cây thuốc thường là những cây dễ trồng, phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam. Việc chữa bệnh bằng các cây thuốc tuy chậm hơn các loại thuốc kháng sinh tổng hợp nhưng mang lại hiệu quả tốt hơn, không xuất hiện các tác dụng phụ. Bên cạnh đó, có thể sử dụng lâu dài các loại cây thuốc như một thực phẩm hỗ trợ và không gây hại cho cơ thể con người. Có thể sử dụng như nước giải khát: nước trà gừng, nước lô hội, nước lá vối “Lá vối có tác dụng kiện tỳ, giúp ăn ngon, tiêu hoá tốt. Mỗi khi ăn một bữa có nhiều thịt, mỡ, người ta thường nấu một nồi nước vối thật đặc để uống cả ngày. Chất đắng trong vối sẽ kích thích tiết nhiều dịch tiêu hóa, chất tanin bảo vệ niêm mạc ruột, còn chất tinh dầu có tính kháng khuẩn nhưng không hại vi khuẩn có ích trong ruột.” (Trần Thị Hải, 2015). 1.1.3 Tình hình sử dụng cây thuốc Việt Nam là một nước nhiệt đới, có diện tích rừng bao phủ trải dài khắp cả nước. Điều này tạo điều kiện cho thuận lợi cho các cây thuốc phát triển đa dạng và phong phú.”Ở nước ta có 3.948 loài cây thuốc thuộc 307 họ của 9 ngành thực vật bậc cao cũng như bậc thấp (kể cả nấm), cũng theo kết quả điều ta này, trong số 3.948 loài cây thuốc đã biết ở trên, phần lớn loài là được ghi nhận từ kinh nghiệm sử dụng cảu cồng đồng các dân tộc khắp các địa phương”.(Viện Dược LiệuBộ Y tế, 2004). “Việt Nam có hơn 12.000 loài thực vật thì có gần 4.000 loài thức vật cho công dụng làm thuốc, vùng phân bố rộng khắp cả nước, có nhiều loài dược liệu được xếp vào loài quý và hiếm trên thế giới, như: Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang, Bách hợp, Thông đỏ, Vàng đắng, Hoàng liên ô rô, Hoàng liên gai, Thanh thiên quỳ, Ba gạc Vĩnh Phú ” (Nguồn: Minh Tuấn, 2014.). Tuy nhiên việc chặt phá rừng bừa bãi và khai thác tràn lan đang làm cho nhiều loại cây thuốc tuyệt chủng.” Việc khai thác dược liệu quá mức mà không đi đôi với việc tái tạo, bảo tồn 13
Đồ án tốt nghiệp dược liệu đã dẫn đến số lượng loài cây dược liệu có khả năng khai thác tự nhiên còn rất ít (trên cả nước hiện chỉ còn khoảng 206 loài cây dược liệu có giá trị có thể khai thác tự nhiên), nhiều loài cây dược liệu quý hiếm trong nước đang đứng trước nguy cơ cạn kiệt”. (Minh Tuấn 2014). Để không lãng phí nguồn tài nguyên quý báu đó, chúng ta cần phải nhanh chóng có những biện pháp nghiên cứu để bảo tồn và phát triển giá trị của các cây thuốc. Đưa cây thuốc, kinh nghiệm dân gian vào nghiên cứu, áp dụng với khoa học công nghệ hiện đại để phục vụ sức khoẻ và đời sống con người. 1.2. Thành phần hóa học của thực vật 1.2.1 Carbohydrate 1.2.1.1 Khái niệm Carbohydrate là một phân tử sinh học được tạo nên từ các nguyên tố: carbon (C), hydro (H) và Oxy (O), thường tỷ lệ nguyên tử Hydrooxi trong carbonhydrate là 2:1 Công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n và là nhóm phổ biến nhất trong bốn nhóm phân tử sinh học chính. Ở thực vật carbohydrate tập trung chủ yếu ở thành tế bào, mô nâng đỡ và mô dự trữ. Một số trường hợp ngoại lệ tồn tại, ví dụ: deoxyribose, một thành phần đường DNA, có công thức C5H10O4. (John M Coulter, C. R. Barrnes, H. C. Cowles, 1930). Carbohydrate có thể chia thành 4 nhóm: Monosaccharide: glucose, fructose Disaccharide: saccharose, lactose, maltose Oligosaccharide: rafinose, kestose, stachyose Polysaccharide: tinh bột, cellulose 1.2.1.2 Tính chất Chúng có đặc tính chung là dễ hoà tan trong nước, đồng hoá và sử dụng nhanh để tạo glycogen. Các carbohydrate đơn giản đều có vị ngọt. Ở thực vật, carbohydrate chiếm khoảng 75% khối lượng, nằm trong hầu hết các bộ phận như: củ, quả, lá, thân, cành. 14
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của các loại Carbonhydrate 1.2.1.3 Vai trò Cung cấp năng lượng cho tế bào và cơ thể thực vật Vai trò cấu trúc, tạo hình (Cellulose, ) Bảo vệ (Mucopolysaccharide) Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể). 1.2.2 Amino acid 1.2.2.1 Khái niệm Amino acid là một phân tử chứa cả nhóm amin và carboxylate. Công thức chung: (H2N)x – R – (COOH)y. Hình 1.3. Alanine 15
Đồ án tốt nghiệp 1.2.2.2 Tính chất Các amino acid là những chất rắn ở dạng tinh thể không màu, vị hơi ngọt, dễ tan trong nước (do tồn tại kiểu muối nội phân tử). Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 200 – 3000C. 1.2.2.3 Vai trò Amino acid thiên nhiên (hầu hết là αamino acid) là cơ sở để kiến tạo nên các loại protein của cơ thể sống. Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất ở thực vật. Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật. Tăng khả năng ra hoa và quả (Trumbo P, 2013). 1.2.3 Alkaloid 1.2.3.1 Khái niệm Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được cung cấp bởi amino acid, đa số có nhân dị vòng. Alkaloid thường được tìm thấy trong thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong cơ thể đông vật. Một số dược liệu chứa akaloid: cà độc dược, cà phê, chè, trinh nữ hoàng cung. Hình 1.4. Epherdin và Hyoscyamin 1.2.3.2 Tính chất Đa số các alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng như base mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin, cũng có chất tính base rất 16
Đồ án tốt nghiệp yếu như caffein, piperin vài trường hợp ngoại lệ có những alkaloid không có phản ứng kiềm như colchicin, ricinin, theobromine và cá biệt cũng có chất có phản ứng acid yếu như arecaidin, guvacin. Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng những kiềm trung bình và mạnh như: NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH Khi định lượng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng. Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt ) tạo ra muối phức. 1.2.3.3 Vai trò Alkaloid có tác dụng diệt khuẩn. Tác động lên hệ thần kinh trung ương: morphin, codein, strychnin, cafein. Hạ huyết áp: ajmalin, quinidlin Chống ung thư (Ngô Văn Thu, 2011). 1.2.4 Glycosides 1.2.4.1 Khái niệm Glycoside là dạng phổ biến của nhiều hợp chất tự nhiên, cấu trúc của các hợp chất này gồm hai thành phần – phần đường và phần không đường. Phần đường của glycosid gọi là glycon, phần không đường gọi là aglycon hoặc genin. Glycosides là những sản phẩm ngưng tụ của đường Bảng 1.1 Một số Glycosides phổ biến Glycoside Phân bố Tính chất Hesperidin Cùi cam, chanh, Không có vị đắng. Thuỷ phân tạo ra đường (C50H60O27) quýt, bưởi rhamnose, glucose Solamin Cà chua xanh, cà Vị đắng. Khi vào cơ thể bị thuỷ phân tạo (C45H17O15) tím, khoai tây HCN rất độc. Amygdadin Hạt mơ, hạt hạnh Vị đắng. Trong cơ thể người bị thuỷ phân (C20H27O11) nhân đắng, mận tạo HCN rất độc. Manihotin Vỏ, cùi củ sắn Thuỷ phân tạo HCN rất độc. 17
Đồ án tốt nghiệp 1.2.4.2 Tính chất Glycoside là dạng tinh thể không màu. Phần đường và phần không đường liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycosid dễ bị phân huỷ khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzyme (men) có chứa trong cây. Phần đường trong glycoside chủ yếu là monosaccarid hoặc oligosaccarid, thường là glucose, rhamnose, galactose. Trong thành phần của một số glycoside có đường đặc biệt không có trong các glycoside khác (ví dụ trong glycosid tim). Phần aglycon của các glycoside có thể thuộc các nhóm chất hữu cơ khác nhau ví dụ cồn, andehyd, acid, phenol, dẫn chất anthracen đôi khi có các aglycon có chứa nitơ, lưu huỳnh song thường chứa cacbon, hydro, oxy. Do đặc tính dễ bị phân huỷ, khó thu được ở dạng tinh khiết nên việc nghiên cứu cấu trúc thường gặp nhiều khó khăn. Tác dụng phụ thuộc vào phần aglycon, phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác dụng của chúng. Hình 1.5. Cardenolic và Bufadiennolid 1.2.4.3 Vai trò Hỗ trợ tim Hỗ trợ hệ thần kinh Hỗ trợ các cơ quan trong cơ thể: gan, thận, co tim, các cơ khác. 18
Đồ án tốt nghiệp 1.2.5 Steroids 1.2.5.1 Khái niệm Steroid là một loại hợp chất hữu cơ, có chứa một sự sắp xếp đặc trưng của bốn vòng cycloalkane được nối với nhau Hình 1.6. Steroid 1.2.5.2 Tính chất Steroid là hợp chất chất béo hữu cơ hòa tan, có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp. Khi đun nóng với Se ở 36000C sẽ tạo hợp chất Hidrocacbon Diel. 1.2.5.3 Vai trò Steroid tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống. Cho đến nay, người ta đã biết đến hàng chục nghìn steroid và trong số đó có hàng trăm chất được sử dụng trong y học. Thường dùng làm các thuốc kích thích. 1.2.6 Tannin 1.2.6.1 Khái niệm Tannin là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino axit và alkaloid). 19
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7. Tannin 1.2.6.2 Đặc điểm Tanin có vị chát, có tác dụng làm săn da, tan được trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ. Tanin kết hợp với protein không tan trong nước và dung môi hữu cơ nhưng chiết ra được bằng dung dịch kiềm. Tanin tủa bông trắng với dung dịch gelatin. Tanin tủa với alkaloid, muối kim loại nặng như ch́ì, thuỷ ngân, kẽm, sắt. Với muối sắt những tanin khác nhau cho màu xanh lá hay xanh đen với đậm độ khác nhau. (Có thể dựa vào tủa với muối sắt để xác định tanin trên vi phẫu nhỏ muối sắt III, kalibicromat 10%, tạo thành tủa nâu trên tế bào chứa tanin). 1.2.6.3 Vai trò Tannin bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy. (Katie E. Ferrell và Thorington và Richard W, 2006) 1.2.7 Isoprenoid (Terpene) 1.2.7.1 Khái niệm Isoprenoid là một nhóm chất lớn và đa dạng. Bộ khung carbon được tạo thành từ đơn vị cơ bản isopreneC5H8. Ngoài các hydrocacbon không no, các dẫn xuất của chúng như ancol, andehyd, ceton, cacboxylic acid cũng được gọi là tecpen. 20
Đồ án tốt nghiệp Tuỳ theo số nguyên tử cacbon trong mạch hydrocacbon, người ta phân chúng thành các nhóm: monoterpen, secpuiterpen, diterpen, triterpen, tetraterpen, polyterpen. Trong đó monoterpen là quan trọng nhất trong terpenoid. Nó có cấu trúc mạch hở, mạch vòng. Terpene có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài họ thông và trong tinh dầu thảo mộc như tinh dầu xả, quế, cam, chanh. Hình 1.8. Limonene và Ocimene 1.2.7.2 Tính chất Terpene thường nhẹ hơn nước, chất lỏng không màu có mùi thơm. Không hòa tan hoặc ít tan trong nước, dễ tan trong ethanol. 1.2.7.3 Vai trò Terpene là thành phần chính của các loại tinh dầu của nhiều loại cây và hoa. Tinh dầu được sử dụng rộng rãi như là chất phụ gia hương vị tự nhiên cho thực phẩm, như nước hoa nước hoa, và trong y học và thuốc thay thế như hương liệu . Biến thể tổng hợp và các dẫn xuất của tecpen thiên nhiên và terpenoids đa dạng của các hương liệu được sử dụng trong nước hoa và hương vị được sử dụng trong các chất phụ gia thực phẩm. Vitamin A là một terpene. (Đỗ Tất Lợi, 2004) 1.3 Tổng quan về hợp chất kháng khuẩn thực vật 1.3.2 Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn Hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi khuẩn, bằng cách tác động ở mức phân tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết của vi 21
Đồ án tốt nghiệp khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa của chúng, thường có tác dụng đặc hiệu với một nồng độ rất nhỏ. Các chất kháng khuẩn thực vật thường là các hợp chất như alkaloid, flavonoid, tanin và một số loại tinh dầu. 1.3.3 Cơ chế kháng khuẩn Hình 1.9. Một số cơ chế kháng sinh Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn: vách tế bào của vi khuẩn (đặc biệt là các vi khuẩn Gram dương) được cấu tạo bởi các phức hợp peptidoglycan, phức hợp này được trùng hợp bởi các enzyme transpeptidases. Các kháng sinh nhóm b – actamin gắn chọn lọc vào các transpeptidases này làm cho vách tế bào của vi khuẩn bị tan rã khiến chúng bị tiêu diệt. Ức chế chức năng của màng tế bào (tổn thương màng tế bào): kháng sinh gắn lên màng tế bào, làm thay đổi tính thấm chọn lọc khiến một số chất cần thiết cho vi khuẩn (nucleotid, pyrimidin, purin ) lọt ra ngoài, làm tổn hại và chết vị khuẩn. Các kháng sinh nhóm Polymycin, aminosid Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác. Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme 22
Đồ án tốt nghiệp peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide. Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide. Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: bất hoạt RNA, DNA: Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin). Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA. Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzoic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid. Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic. (Amoros, M., F. Sauvager, L. Girre và M. Cormier, 1992) Cạnh tranh đối kháng: đây là kiểu tác dụng của các sunfonamit. Acid folic giữ vai trò cần thiết trong quá trình tổng hợp acid nucleic. Để tổng hợp ra acid folic, một số vi khuẩn phải sử dụng acid paraminobenzoic (PAB) có trong môi trường. Sunfonamit có cấu trúc hoá học tương tự PAB nên đã cạnh tranh thay thế PAB, dẫn đến ngừng tổng hợp acid nucleic của vi khuẩn. 1.3.4 Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật 1.3.4.1 Alkaloids  Solamargine Solamargine, một glycoalkaloid có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum khasianum), và các alkaloid khác trong loài cây này có tác dụng chống lại sự lây nhiễm khi đã mắc phải HIV. Kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy. 23
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.10. Solamargine  Berberine Berberine cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với Shigella spp, tụ cầu khuẩn, nhiều vi khuẩn Gram dương, Gram âm và các vi khuẩn axit. Ngoài ra có còn chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh. Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với trùng gây bệnh sốt rét. Cơ chế kháng khuẩn Berberine là do khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn. Đặc biệt khi dùng berberin điều trị các nhiễm trùng đường ruột sẽ không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột. Các nghiên cứu gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu phối hợp với berberin sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột. Hình 1.11. Berberine 24
Đồ án tốt nghiệp 1.3.4.2 Terpenoids và tinh dầu Các loại terpenoids tinh dầu cũng có khả năng kháng khuẩn nhờ các khả năng hòa tan lipid trong màng tế bào vi khuẩn bởi các hợp chất lipophilic. Phá vỡ vách tế bào. Terpenenes và terpenoid có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, virus và động vật nguyên sinh. Năm 1977, có nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của tinh dầu có khả năng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế được vi khuẩn. Các acid betulinic triterpenoid chỉ là một trong nhiều terpenoid có khả năng ức chế được HIV. Gần đây các nhà khoa học thực phẩm cũng đã tìm thấy các terpenoid hiện diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria monocytogenes. Hình 1.12. Một số Terpenenes và Terpenoid 1.3.4.3 Phenol đơn và acid phenolic Phenolics được xem là nguyên nhân dẫn đến sự ức chế enzyme bởi các hợp chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua sự tương tác không đặc hiệu của các chất này với protein. 25
Đồ án tốt nghiệp  Quinones Quinones có thể tạo phức không thay đổi được với các amino acid ái nhân trong protein, thường dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein. Vì lí do đó, khả năng kháng khuẩn của quinone rất lớn. Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào, polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng. Hình 1.13. Một số Quinones thông thường  Tannin Tannin có khả năng liên kết với protein làm mất hoạt tính của các protein chức năng, ức chế enzyme được xem là cơ chế chung của các hợp chất tannin. Hình 1.14. Gallotannin 26
Đồ án tốt nghiệp  Flavonoid Flavonoid có khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào và tạo phức với thành tế bào vi khuẩn. Các flavonoid càng ưa béo có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật. Chúng có khả năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucose. Flavonoid ức chế transpeptidaza làm cho mucopeptit – yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được, ức chế tổng hợp axit nucleic của vi khuẩn, tác dụng vào DNA khuôn, ức chế tổng hợp RNA của vi khuẩn. Hình 1.15. Một số Flavonoid 1.3.4.4 Lectin và polypeptide Cơ chế kháng khuẩn là do có sự hình thành của các ion trên màng vi sinh vật, hoặc do sự cạnh tranh và ức chế sự bám dính protein trên cơ quan nhận cảm vật chủ ở vi sinh vật. Bên cạnh đó chúng còn phá vỡ màng tế bào, cản trở sự trao đổi chất và ảnh hưởng tới các thành phần tế bào chất. 1.3.4.5 Saponin Nhóm saponin, chủ yếu là asiaticosid có tác dụng lên Mycobacterium leprae. Tác dụng được giải thích do asiaticosid làm tan màng sáp của vi khuẩn. 27
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.16. Saponin 1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình 1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 1.4.2.1 Escherichia coli  Đặc điểm Escherichia coli là một trong những loài vi khuẩn chính kí sinh trong đường ruột của động vật máu nóng. E.coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, sống ký sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính. Phần lớn các vi khuẩn E.coli không ảnh hưởng đáng kể dến sức khoẻ trừ một số có thể gây bệnh tiêu chảy và tuỳ và từng địa phương, tuỳ và độ tuổi mà ảnh hưởng của vi khuẩn này cũng khác nhau. Hình 1.17. Hình ảnh Escherichia coli O15:H7 dưới kính hiển vi 28
Đồ án tốt nghiệp  Khả năng gây bệnh của một số Escherichia coli E.coli O15:H7: sản xuất ra độc tố gây tổn thương niêm mạc ruột non, gây bệnh tiểu chảy ra máu. EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): gây xuất huyết ở ruột. EPEC (Enteropathogenic E.coli): gây bệnh đường ruột, chủ yếu gây bệnh ở trẻ em, cơ chế gây bệnh chưa rõ. ETEC (Enterotoxigenic E.coli): sinh độc tố ruột. EIEC (Enteroinvasive E.coli ): gây bệnh do xâm lấn tế bào. EAGGEC hay EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli kết tập ở ruột. (Cao Minh Nga, 2014) 1.4.2.2 Shigella spp.  Đặc điểm Shigella spp. là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,sống ký sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính. Shigella spp. gây bệnh ở động vật sinh trưởng, nhưng không gây bệnh ở động vật có vú khác. Nó chỉ được tìm thấy tự nhiên trong cơ thể người và khỉ đột. Shigella spp. là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tiêu chảy do vi khuẩn. Ước tính mỗi năm có từ 80165,000,000 trường hợp nhiễm bệnh và 600,000 ca tử vong Hình 1.18. Ảnh chụp của Shigella sp. trong một mẫu phân 29
Đồ án tốt nghiệp  Khả năng gây bệnh của một số Shigella spp.:Gây bệnh lỵ trực trùng, có 4 nhóm: Nhóm A: S. dysenteriae: tiết độc tố shiga, là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh kiết lị ở những nơi tập trung các trại tị nạn trên thế giới. Nhóm B: S. flexneri: tiết độc tố giống shiga (shiga like toxin), là chủng phổ biến nhất thế giới, gây 60% ca bệnh ở các nước đang phát triển. Nhóm C: S. boydii: không tiết độc tố Nhóm D: S. sonnei: tiết độc tố giống shiga, là nguyên nhân gây ra 77% số ca bệnh kiết lị ở các nước đang phát triển. Nhóm A – C về mặt sinh lý tương tự nhau. S.sonnei có thể khác biệt trên cơ sở xét nghiệm chuyển hoá sinh hoá. 1.4.2.3 Salmonella spp  Đặc điểm Salmonella spp. là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tuỳ nghi, sống ký sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính. Salmonella spp, được tìm thấy trên toàn thế giới và có cả trong động vật máu nóng , động vật máu lạnh và ngoài môi trường. Các chủng vi khuản Salmonella spp gây ra các bệnh như thương hàn, phó thương hàn, nhiễm trùng máu và ngộ độc thực phẩm. Hình 1.19. Hình ảnh của Salmonella typhii và Salmonella typhimurium 30
Đồ án tốt nghiệp  Khả năng gây bệnh của một số Salmonella S. typhii: gây sốt thương hàn S. choleraesuis: gây nhiễm trùng máu và áp xe khu trú ở các cơ quan nội tạng S.enteritidis: gây viêm ruột (Cao Minh Nga, 2014) 1.4.2.4 Vibrio spp.  Đặc điểm Nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và catalase dương tính, là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí, tạo nitrite từ nitrate. Hình 1.20. Hình ảnh Vibrio cholerae và Vibrio harveyi  Khả năng gây bệnh của một số Vibrio spp. Một số loài vi khuẩn Vibrio spp. là tác nhân gây bệnh. Hầu hết các chủng gây bệnh có liên quan với viêm dạ dày ruột, nhưng cũng có thể lây nhiễm các vết thương hở và gây nhiễm trùng huyết. Tiêu biểu như Vibrio alginolyticus gây nhiễm trùng vết thương, chúng cũng có mặt trong các cơ quan của động vật như cá nóc. V. cholera là tác nhân gây bệnh tả. V. harveyi là một tác nhân gây bệnh của một số loài động vật thủy sinh. Vibrio parahaemolyticus ăn phải vi khuẩn có trong hải sản sống hoặc nấu chưa chín, thường là hàu, là nguyên nhân chủ yếu là viêm dạ dày cấp tính, 31
Đồ án tốt nghiệp nhiễm trùng vết thương cũng xảy ra, nhưng ít phổ biến hơn so với bệnh thủy sản gây ra. 1.4.2.5 Listeria spp.  Đặc điểm Listeria spp. là một vi khuẩn Gram dương, kị khí tùy nghi, không sinh bào tử. Có thể được tìm thấy trong đất, nước, trong các loại thịt chưa nấu chín, rau sống, trái cây, thực phẩm làm từ sữa, và thực phẩm chế biến. Hình 1.21. Hình ảnh Listeria monocytogenes  Khả năng gây bệnh Các bệnh của người trong chi Listeria spp. thường do Listeria monocytogenes gây ra. Đây là loại vi khuẩn gây độc, với 20% đến 30% số ca nhiễm lâm sàng gây nên bệnh Listeriosis dẫn đến tử vong. Một số triệu chứng liên quan với bệnh Listeriosis bao gồm sốt, đau cơ, tiêu chảy, nôn và buồn nôn. Phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh, người già và những người có hệ miễn dịch kém là dễ bị bệnh Listeriosis.  Một số chủng Listeria Listeria innocua L. monocytogenes L. welshimeri (Jemmi và Stephan, 2006) 32
Đồ án tốt nghiệp 1.4.3 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da 1.4.3.1 Pseudomonas aeruginosa  Đặc điểm Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Trong số những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học. Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử. Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen. Hình 1.22. Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa  Khả năng gây bệnh Pseudomonas là một trong những vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và con người. Vi khuẩn này phát triển bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ; trong cơ thể, nhờ khả năng thích ứng vi khuẩn cho nên nó lây nhiễm và phá hủy các mô của người bị suy giảm hệ miễn dịch. Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông thường là gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu và thận sẽ gây ra những tử vong cao; bởi vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt niêm mạc bên trong cơ 33
Đồ án tốt nghiệp thể. Bên cạnh đó, vi khuẩn này cũng được phát hiện trên các dụng cụ y khoa bao gồm catheter, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch. Đây cũng là nguyên nhân gây ra viêm chân lông. 1.4.3.2 Staphylococcus aureus  Đặc điểm Staphylococcus aureus là một loài tụ cầu khuẩn Gram dương kỵ khí tùy nghi. Hình 1.23. Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus S.aureus có rải rác trong tự nhiên như đất, nước, không khí, đặc biệt người là nguồn chứa chính của tụ cầu vàng, chủ yếu ở vùng mũi họng ( chiếm khoảng 30%), nách, mụn dưới da, các vùng da trầy xướt và tầng sinh môn. Tỷ lệ mang vi khuẩn cao hơn ở các nhân viên y tế, bệnh nhân lọc máu, người bị bệnh tiểu đường type 1, người nhiễm HIV, mắc bệnh da mãn tính.  Khả năng gây bệnh Trong đa số trường hợp, tụ cầu khuẩn không gây ra vấn đề gì, hoặc chỉ nhiễm khuẩn nhẹ như nổi mụn hay bóng nước, nhưng trong một số trường hợp, tụ cầu khuẩn có thể nghiêm trọng hơn. Staphylococcus aureus là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong các loài tụ cầu. Nó là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy ở cả mũi và da. (Ogston A, 1984). 34
Đồ án tốt nghiệp 1.4.3.3 Enterococcus feacalis  Đặc điểm Enterococcus feacalis: Gram dương, lên men glucose, sinh acid làm giảm pH môi trường. Không tạo độc tố, không tạo ra một phản ứng catalase với hydrogen peroxide. Nó có thể tạo ra một phản ứng pseudocatalase nếu trên môi trường thạch máu. Hình 1.24. Hình ảnh Enterococcus feacalis  Khả năng gây bệnh E. faecalis có thể gây ra viêm nội tâm mạc và nhiễm khuẩn huyết, nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm màng não và nhiễm trùng khác ở người. 35
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm và thời gian 2.1.1 Địa diểm Thu mẫu: vườn quốc gia Bidoup Núi Bà, địa bàn huyện Lạc Dương, Đam Rông, tỉnh Lâm Đồng. Vườn quốc gia Bidoup Núi Bà nằm trên cao nguyên Lâm Viên có độ cao trung bình từ 1.500 1.800m, địa hình chia cắt mạnh được chắn bởi các dãy núi cao như đỉnh Hòn Giao (2.060m), Bidoup (2.287m), LangBiang (2.167m). Khí hậu nơi đây ôn hoà, nhiệt độ không khí trung bình năm 180C, lượng mưa trung bình năm 1800mm, tại các đai cao trên, lượng mưa có thể đạt 2800 3000mm/năm. Thảm thực vật rừng ở đây được đặc trưng, phong phú. Thí nghiệm: phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học Thực phẩm Môi trường, trường Đại học Công nghệ TpHCM. 2.1.2 Thời gian Tháng 11/2015 đến tháng 6/2016 2.2 Vật liệu 2.2.1 Nguồn mẫu phân tích Các mẫu cao chiết từ các mẫu cây được lựa chọn từ các đề tài khảo sát trước đây và từ kinh nghiệm dân gian. Các mẫu cao chiết ethanol 70% được lựa từ mẫu cây thuốc dân gian thu tại vườn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng. Đây là những mẫu cây thuốc có khả năng điều trị một số bệnh tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu về các mẫu cây thuốc này. Có 6 mẫu cây thuốc được lựa chọn trong thí nghiệm lần này, bao gồm : Lantana sp. Acorus sp. Euodia sp. Calamus sp. Xidi Klung. Streptocaulon sp. 36
Đồ án tốt nghiệp 2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị 4 chủng Escherichia coli: E.coli, ETEC, E.coli 0571:H7, E 0208 4 chủng Salmonella spp: S.typhii, S.typhimutium, S. dublin, S.enteritidis 4 chủng Vibrio : V.alginolytycus, V.cholera, V.harveyi, V.parahaemolyticus 3 chủng Shigella spp: S.dysenteriae, S.flexneri, S.boydii, S.sonnei 2 chủng Listeria spp: L.monocytogenens, L.innocua Pseudomonas aeruginosa Staphylococus aureus Enterococus feacalis 2.2.3 Hóa chất, môi trường Dung môi dimethysulfoside (DMSO) Ethanol Nước cất NaCl Môi trường TSA, TSB Agar Dụng cụ, thiết bị Tủ cấy vô trùng Giấy lọc Autoclave Bình tam giác Tủ ấm, Tủ lạnh Pipette loại 100 – 1000 μl.Đầu Tủ sấy típ loại 100 1000 μl Máy lắc Ống nghiệm Máy đo OD Que cấy trang, que cấy vòng Cân điện tử, Cân phân tích Đèn cồn, đĩa petri Bếp điện Parafilm Phễu 37
Đồ án tốt nghiệp 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu Lá, thân cành của cây mẫu, sau khi thu thập được sẽ rửa sạch và phơi khô trong không khí tới khối lượng không đổi. Các mẫu phơi khô được nghiền thành bột. Bột mẫu được đựng trong túi nhựa và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Mẫu cây thuốc Rửa sạch Phơi khô đến khi trọng lượng không đổi Xay mẫu thành bột mịn Mẫu Hình 2.1. Quy trình xử lý mẫu 2.3.2 Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị. Mục đích: tăng sinh khối vi sinh vật chỉ thị đến số lượng cần thiết, giúp hoạt hóa vi khuẩn trở về trạng thái bình thường sau khi bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Nguyên tắc: nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng phải chứa thành phần đa lượng và vi lượng để vi sinh vật 38
Đồ án tốt nghiệp phát triển, đảm bảo có đủ điều kiện lý hóa thích hợp để vi sinh vật trao đổi chất với môi trường. Tiến hành: vi sinh vật chị thị được tăng sinh trong môi trường thích hợp để thu sinh khối. Sau đó đem đi ủ, lắc 150 vòng/phút, thời gian từ 1824 giờ ở nhiệt độ phòng ( sinh khối vi sinh vật tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy). 2.3.3 Phương pháp định lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đo mật độ quang  Nguyên tắc: Độ đục của huyền phù tỷ lệ thuận với số lượng vi sinh vật hiện diện trong môi trường. Trong thời gian nhất định, mối quan hệ giữa số lượng vi sinh vật trong nước tỉ lệ tuyến tính với độ đục môi trường. Định lượng vi sinh vật trong môi trường bằng máy đo độ đục hay máy so màu ở bước sóng 600nm. Trong phương pháp này cần xây dựng biểu đồ tương quan tuyến tính giữa độ đục và số lượng vi sinh vật trong môi trường bằng phương pháp đếm trực tiếp.  Tiến hành: - Xây dựng đường tuyến tương qua tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào: Pha loãng dịch huyền phù tế bào cần kiểm định có mật độ tế bào bất kì thành các huyền phù khác nhau có độ đục ở OD 600nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Đo OD ở 600nm của ác huyền phù vừa pha được, ghi nhận các số liệu. Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi ( buồng đếm hồng cầu) xác định mật độ tế bào (cfu/ml) của các huyền phù này. Tính giá trị log (N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với độ đục, vẽ đường đường biểu diễn của log (N/ml) theo OD ở 600nm. Xác định mật độ tế bào theo độ đục: đo độ đục của một huyền phù tế bào cần xác định mật độ. Từ giá trị OD ở bước sóng 600nm đo được, suy ra số log (N/ml) và trị số mật độ (cfu/ml) từ đường chuẩn. 2.3.4 Phương pháp bảo quản và giữ giống 39
Đồ án tốt nghiệp Giữ giống thạch nghiêng: lấy giống VSV cấy vào ống thạch nghiêng, ủ cho VSV phát triển, đem trữ lạnh ở nhiệt độ 40C. Giống này thường được sử dụng cho sản xuất. Thời gian sử dụng từ 7 – 10 ngày. Giữ giống trong glycerol 20% ở nhiệt độ 40C: vi khuẩn sau khi tăng sinh, hút vào eppendorf và ly tâm 5000 v/p trong thời gian 15 phút. Loại bỏ dịch và giữ cặn. Bổ sung 1 ml glycerol 20% và đồng nhất rồi bảo quản ở nhiệt độ 40C. Giống này được sử dụng để cấy chuyển qua thạch nghiêng. Thời gian sử dụng từ 1 – 3 tháng. 2.3.5 Phương pháp tách chiết cao  Mục đích: Tách chiết hợp chất kháng khuẩn thực vật để nghiên cứu  Nguyên tắc: Sử dụng dung môi để tách chiết các hợp chất trong thực vật nhờ lực liên kết hoá học. Đây là phương pháp tách chiết pha lỏng rắn với pha lỏng là dung môi và pha rắn là mẫu bột cao.  Tiến hành: Mẫu được ngâm trong dung môi ethanol 70% (tỷ lệ 1:20, w/v), cho vào erlen, ngâm trong 24 giờ, lọc, thu dịch. Tiếp tục ngâm cho đến khi dịch trong, lặp lại khoảng 3 lần. 2.3.6 Chuẩn bị dung dịch cao thuốc kháng sinh Cao thuốc khô: cân 1,5g cao thuốc khô, hoà tan với 13,5ml dung dịch DMSO 1% và nước cất ( nồng độ DMSO 1% không vượt quá 10%). Thu được dịch cao chiết, nồng độ cao thuốc đạt 100mg/ml khi tan hoàn toàn. Dịch cao chiết nồng độ 100mg/ml (cao khô hoà tan sẵn trong dung môi DMSO 1%): hoà tan 1ml cao với 9ml cất. Thu được dịch cao chiết. 2.3.7 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method)  Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng của cao chiết với vi khuẩn chỉ thị trên môi trường nuôi cấy. Cao chiết có khả năng khuếch tán trong môi trường 40
Đồ án tốt nghiệp agar và tác động lên vi khuẩn chỉ thị. Khi kháng được vi khuẩn chỉ thị sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch.  Tiến hành Các chủng vi khuẩn sau khi tăng sinh được tiến hành pha loãng bằng nước muối sinh lí. Pha loãng đến nồng độ 106 cfu/ml. Hút 100µl từ dịch pha loãng vào đĩa petri chứa sẵn môi trường TSA. Tiến hành cấy trang. Tiếp theo, đục các giếng nhỏ có đường kính 6mm với thanh kim loại vô trùng. Mỗi đĩa thạch trung bình 6 9 giếng. Nhỏ 100µl dung dịch cao chiết có nồng độ (100mg/ml) và mỗi giếng của đĩa đã cấy trang. Để yên trong 2 giờ. Đem ủ ở nhiệt độ 37OC trong 24 giờ cho vi khuẩn phát triển.  Đọc kết quả Tính kháng khuẩn được biểu hiện khi vòng kháng khuẩn quanh miệng giếng. Đường kính vòng kháng khuẩn 10mm: tính kháng khuẩn mạnh 2.3.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học 2.3.8.1 Carbohydrate  Thử nghiệm Molisch Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm Thêm vào 56 giọt thuốc thử Molisch. Nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc trên thành ống nghiệm Kết quả: Hình thành phức hợp màu đỏ tím ở lớp ngăn cách  Thử nghiệm Fehling Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm Cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào 100mg cao chiết. Đun cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả Kết quả: Quan sát kết tủa màu đỏ của Cu2O.  Thử nghiệm Barfoed 41
Đồ án tốt nghiệp Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm Thêm 2 ml thuốc thử Barfoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và đọc kết quả Kết quả: Hình thành kết tủa màu đỏ gạch 2.3.8.2 Alkaloid  Thử nghiệm Mayer Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm Cho vài giọt thuốc thử Mayer. Kết quả: Quan sát kết tủa màu đục tạo thành.  Thử nghiệm Dragendorff Hút 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff Kết quả: Hình thành kết tủa màu vàng cam.  Thử nghiệm Hager Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm Thêm 2 ml thuốc thử Hager Kết quả: Hình thành kết tủa màu vàng.  Thử nghiệm Wagner Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm Thêm 2 ml thuốc thử Wagner Kết quả: Hình thành kết tủa màu nâu đỏ. 2.3.8.3 Saponin (thử nghiệm Foam) Hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm Lắc mạnh Kết quả: Hình thành bọt ổn định. 2.3.8.4 Cardiac glycosides  Thử nghiệm Legal Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm Thêm 1 ml pyridine và 1 ml Na nitro prusside 42
Đồ án tốt nghiệp Nhỏ 5 – 6 giọt NaOH 10% Kết quả: Xuất hiện màu đỏ đậm.  Thử nghiệm Keller Killiani Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm Thêm 2 ml acid acetic glacial và 1 ml dung dịch FeCl3 Cho từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm Kết quả: Xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic. 2.3.8.5 Anthaquinone glycosides (thử nghiệm Bontrager) Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm Thêm 2 ml H2SO4 loãng và đun sôi Tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc. Thêm 3 ml benzene và lắc đều rồi để yên. Tách lấy lớp benzene Thêm 2 ml ammonia và quan sát màu trong lớp ammonia Kết quả: Xuất hiện màu đỏ. 2.3.8.6 Flavonoid  Alkaline Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện với đối chứng là mẫu và nước cất để so sánh. Thêm vài giọt HCl loãng mất màu chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid Kết quả: Xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho HCl.  Shinoda Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm Cho dịch mẫu bột Magnesium và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm. Bổ sung 5 ml cồn 95% Kết quả: Nếu mẫu có màu cam, hồng, đỏ đến tím chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid.  Ferric chloride 43
Đồ án tốt nghiệp Lấy 2 ml cho vào ống nghiệm Thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% Kết quả: Xuất hiện màu xanh hoặc tím 2.3.8.7 Phenolic  Lead acetate Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm Cho 1,5 ml Chì acetate 10% Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng.  Gelatin Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm Thêm một vài gelatin 1% Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng. 2.3.8.8 Tannin  Ferric chloride Hút 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%. Cho vào 4 giọt ferric chloride 10%. Kết quả: Xuất hiện màu xanh.  Lead acetate Hút 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%. Cho vào 4 giọt Chì acetate Kết quả: Xuất hiện kết tủa màu vàng. 2.3.8.9 Steroid  Salkowski Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm Thêm 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc Lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp Đọc kết quả ở mặt phân cách Kết quả: Xuất hiện màu đỏ ở lớp dưới: sterol 44
Đồ án tốt nghiệp Hình thành màu vàng ở lớp dưới: triterpenoid  Libermann Burchard Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm Thêm 2 ml acetic anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh Nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm. Kết quả: Xuất hiện vòng màu đỏ ở mặt phân cách: steroid Hình thành vòng màu nâu đỏ đậm: triterpenoid 2.3.8.10 Amino acid Thuốc thử Ninhydrin 1 ml dịch chiết, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin. Đun sôi cách thủy trong 5 phút Kết quả: Xuất hiện màu tím. 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu Sừ dụng phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 và phần mềm Microsoft Excel 2007 để xử lý số liệu 45
Đồ án tốt nghiệp 2.4 Bố trí thí nghiệm Nguồn mẫu Ngâm trong dung môi ethanol 70% (tỉ lệ 1:20 w/v) Chiết và cô cao Cao chiết ethanol 70% Xác định thành phần hoá học Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Tổng hợp kết quả Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 46
Đồ án tốt nghiệp 1. 2.4.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết ethanol 70% của các mẫu cây thuốc. Mẫu cây Phơi khô, xay nhuyễn Lantana Acorus sp. Euodia Streptocaulon Calamus Xidi Klung sp. sp. sp. sp. Ngâm trong ethanol 70% ( tỉ lệ 1:20 w/v) trong 24 giờ Lọc chân không Bã Cô cách thuỷ 70OC Thu cao Cao chiết ethanol 70% Hình 2.3. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của dung môi ethanol 70% đến hiệu suất tách chiết cao của các mẫu cây thuốc khác nhau 47
Đồ án tốt nghiệp  Tiến hành: Mẫu cây sau khi rửa sạch sẽ được phơi khô cho đến khi khối lượng không đổi, sau đó đem ra say nhuyễn thành bột. Đem ngâm bột trong dung môi ethanol 70%, đem lắc đều hỗn hợp trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Lọc hỗn hợp bằng phễu lọc chân không, bã thu được sẽ được ngâm tiếp tục cho đến khi dịch trong, khoảng 3 lần. Phần dung dịch thu được sẽ được cô cách thuỷ ở nhiệt độ 70O để đuổi hết dung môi và không làm mất hoạt tính của mẫu. Sau khi dung dịch cô cạn hoàn toàn sẽ được cao chiết ethanol. Hiệu suất tách chiết cao: % = đượ × 100% ẫ ạ ộ đượ(g):khối lượng mẫu cao thu được sau khi cô cách thuỷ ẫ ạ ộ(g): khối lượng bột mẫu ban đầu 2. 3. 48
Đồ án tốt nghiệp 2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết ethanol Chủng vi khuẩn Tăng sinh trong TSB và TSB+ NaCl 1,5% Lắc 150v/p, nhiệt độ phòng, 1824 giờ Đo OD 600nm Môi trường chứa Pha loãng vi sinh vật nồng độ 106 Nước muối TSA/TSA+ NaCl 1,5% cfu/ml sinh lý Hút 100µl vào đĩa petri chứa Đổ đĩa TSA/TSA+ NaCl 1,5%, cấy trang Cao chiết Đục lỗ (d=6mm) trên môi trường Dịch cao DMSO 1% Nhỏ 100µl dịch cao chiết và giếng trên môi trường Ủ 37OC, 24 giờ Đo đường kính vòng kháng khuẩn Hình 2.4. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn 49
Đồ án tốt nghiệp  Tiến hành Chủng vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường TSB và TSB + NaCl 1,5%, ủ ở nhiệt độ phòng 1824 giờ, lắc 150 vòng/phút. Dịch vi sinh vật sau khi tăng sinh được đo ở OD ở bước sóng 600nm để tiến hành pha loãng ở mật độ 106 cfu/ml. Sau đó cấy trang trên đĩa petri chứa môi trường TSA vô trùng. Đục lỗ trên đĩa đã cấy trang. Hút 100µl dịch cao vào từng giếng thạch. Để yên trong 2 giờ, đem đi ủ ở nhiệt độ 37OC trong 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo vòng kháng khuẩn.  Đọc kết quả Đo vòng kháng khuẩn của mẫu cao đối với từng chủng vi sinh vật. So sánh vòng kháng khuẩn của mẫu cao và kháng sinh. Nếu giếng nào có vòng kháng khuẩn xung quanh chứng tỏ cao có kháng khuẩn chủng vi khuẩn đó. Ta sử dụng chủng vi khuẩn này tiếp tục thử nghiệm xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC). 2.4.3 Thí nghiệm 4: Xác định thành phần hóa học Mẫu cao chiết Ethanol Ngâm trong H2SO4 10% Ngâm trong DMSO 1% Lọc Lọc Alkaloid Carbohydrate Saponnin, Flavonoid, Steroid, cardiac phenolic amino acid glycoside, compound, althraquinone tannin Hình 2.6. Quy trình xác định thành phần hóa học 50
Đồ án tốt nghiệp Đối với chỉ tiêu alkaloid: mẫu cao được ngâm trong H2SO4 10% trong khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc. Thu phần dịch trong để tiến hành thử nghiệm. Đối với các chỉ tiêu còn lại: mẫu cao được pha trong DMSO cho đến khi tan hoàn toàn. Sau đó, tiến hành pha loãng và lọc qua giấy lọc để thu dịch trong để tiến hành thử nghiệm. Tiến hành các thử nghiệm để xác định thành phần hoá học trong cây thuốc, gồm: Carbohydrate: thử nghiệm Molish, thử nghiệm Fehling, thử nghiệm Barfoed. Alkaloid: thử nghiệm Mayer, Dragendorff, thử nghiệm Hager, thử nghiệm Wagner. Saponin: thử nghiệm Foam. Cardiac glycosides: thử nghiệm Legal, thử nghiệm Keller Killiani. Anthaquinone glycosides: thử nghiệm Bontranger. Flaconoid thử nghiệm Alkaline, thử nghiệm Shinoda, thử nghiệm Ferric chloride. Phenlic: thử nghiệm Lead acetate, thử nghiệm Gelatin. Tannin: thử nghiệm Ferric chloride, thử nghiệm Lead acetate. Steoid: thử nghiệm Salkowski, thử nghiệm Libermann Burchard. Amino acid: thử nghiệm Ninhydrin. 51
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết Ethanol 70% từ các mẫu cây. Một trong những tiêu chí đánh giá hiệu quả của dung môi đến việc tách chiết cao là hiệu suất thu hồi cao. Sử dụng dung môi có hiệu suất thu hồi cao kết hợp với hoạt tính sinh học tốt sẽ là lựa chọn tối ưu. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao của các cây thuốc ở các dung môi ethanol 70% được trình bày ở hình 3.1 25 20 15 10 Hiệu suất thu hồi cao % hồicao suất thu Hiệu 5 0 Latana sp Acorus sp Euodia sp Calamus sp Xidi Klung Streptocaulon sp Mẫu cây Hình 3.1. Hiệu xuất tách chiết của ethanol 70% với các mẫu cây thuốc Dựa vào kết quả hình 3.1 cho thấy mỗi loại cây khác nhau khi tách chiết cao bằng dung môi ethanol 70% sẽ thu được lượng cao khác nhau, trong đó hiệu suất thu hồi cao chiết ethanol 70% từ cây Acorus sp là cao nhất với hiệu suất lên đến 22%, hiệu suất thu hồi cao chiết ethanol 70% từ cây Euodia thấp nhất chỉ đạt 9,5%. Ethanol 70% là dung môi phân cực vạn năng có khả năng hoà tan rất nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học như glycosides, alkaloids, saponins hay các chất flavonoids, tannin Đồng thời ethanol 70% cũng là dung môi có khả năng bay hơi nhanh nên trong quá trình cô mẫu cũng giúp cho quá trình thu hồi cao nhanh hơn. Hơn nữa, việc sử dụng dung môi phân cực trong quá trình tách chiết an toàn hơn so với các dung môi không phân cực (Ngô Văn Thu, 2011). 52
Đồ án tốt nghiệp Kết quả này cho thấy rằng, cao chiết ethanol 70% từ cây Acorus sp chứa nhiều hợp chất nhất. Tuy nhiên, những hợp chất này có chứa hoạt tính sinh học hay không thì cần phải tiến hành những thí nghiệm tiếp theo để có thể đánh giá chính xác. Một trong những tiêu chí khảo sát là hoạt tính kháng khuẩn. 3.2 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây khảo sát Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn là một trong các tiêu chí đánh giá hoạt tính sinh học của các mẫu cây khảo sát cũng như đánh giá hiệu quả của dung môi đến việc tách chiết cao từ các mẫu cây này. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% trên các nhóm vi khuẩn Escherichia coli, Listeria spp., Salmonella spp., Shigella spp., Vibriospp. và các chủng vi sinh vật gây bệnh khác. 3.2.1 Đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli Sau khi tiến hành đánh hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây trên nhóm vi khuẩn Escherichia coli, kết quả được trình bày ở hình 3.3 35 a 30 25 20 ab a a 15 b b a c b b b khuẩn khuẩn (mm) 10 c c 5 Đường kính trung bình vòng kháng 0 Lantana sp Acorus sp Euodia sp Streptocaulon Calamus sp Xidi Klung Ciproflocaxin Mẫu cây sp E.coli O157:H7 E.coli 0208 E.coli ETEC Hình 3.2. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Escherichia coli 53
Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả hình 3.3 nhận thấy rằng 3/6 mẫu cao chiết có khả năng ức chế 4 chủng vi khuẩn E.coli trong đó mẫu cao chiết Lantana sp chỉ ức chế 1/4 chủng vi khuẩn là E.coli O157:H7, nhưng có đường kính trung bình vòng kháng khuẩn lớn nhất là 15mm. Mẫu cao chiết Xidi Klung có khả năng ức chế cả 4/4 chủng vi khuẩn, đường kính trung bình vòng kháng khuẩn 10 – 12.8mm. Mẫu cao chiết Calamus sp khả năng ức chế 3/4 chủng vi khuẩn gồm là E.coli O157:H7, E.coli và ETEC đường kính trung bình vòng kháng khuẩn 8.8 – 9.5mm và mẫu cao chiết Euodia sp khả năng ức chế 2/4 chủng là E.coli O157:H7, E.coli 0208 có đường bình trung bình vòng kháng khuẩn là 8.6mm và 12.,3mm. Kết quả trên cho thấy, mẫu cao chiết Lantana sp có đường kính trung bình vòng kháng khuẩn lớn nhất là 15mm cao hơn so với đối chứng dương là ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Mẫu cao chiết Xidi Klung thể hiện khả năng ức chế với cả 4/4 chủng vi khuẩn và có đường kính trung bình vòng kháng khuẩn lớn nhất thể hiện đối với chủng E.coli O157:H7 là 12,8mm nhưng vẫn thấp hơn so với đối chứng dương là Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Từ kết quả nhận thấy rằng mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung thể hiện khả năng ức chế đối với 4/4 chủng vi khuẩn trong nhóm E.coli, cho thấy nhóm E.coli khảo sát nhạy cảm với mẫu cao chiết ethanol 70% của cây Xidi Klung. Trong nghiên cứu của Mosafa và cộng tác viên (2013) về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% từ lá cây Salvia officinalis ở nồng độ 100mg/ml trên chủng E.coli là 6,6mm, đối với cao chiết ethanol 70% của cây Xidi Klung trên chủng E.coli là 10,3mm. 3.2.2 Đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây trên nhóm vi khuẩn Listeria spp. gồm 2 chủng vi khuẩn là L.innocua và L.monocytogenes được thể hiện ở hình 3.4 54
Đồ án tốt nghiệp 14.0 a a a 12.0 b 10.0 8.0 ung bình ung bình vòng kháng uẩn (mm) 6.0 kh 4.0 2.0 Đường kính Đườngkính tr 0.0 Mẫu cây Lantana sp Acorus sp Euodia sp Streptocaulon Calamus sp Xidi Klung Ciproflocaxin sp L.innocua L.monocytogenes Hình 3.3. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Listeria spp. Từ kết quả trên hình 3.4, nhận thấy rằng mẫu cao chiết ethanol 70% từ mẫu cây Xidi Klung có khả năng ức chế đối với cả 2 chủng vi khuẩn với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn lần lượt là 9.8mm với vi khuẩn L.innocua và 11.6mm đối với vi khuẩn L.monocytogenes. Các mẫu cao chiết còn lại không xuất hiện khả năng ức chế đối với 2 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Listeria spp. trong khảo sát. Kết quả này cho thấy, mẫu cao chiết Xidi Klung có hoạt tính kháng khuẩn tốt đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp, đây là nhóm vi khuẩn gây bệnh rất nguy hiểm cho con người qua thực phẩm, đặc biệt là phụ nữ mang thai, trẻ em. Khả năng ức chế của mẫu cao chiết Xidi Klung đối với 2 chủng thuộc nhóm Listeria thấp hơn so với đối chứng dương là Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). 3.2.3 Đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây trên nhóm vi khuẩn Salmonella spp. được trình bày ở hình 3.5 55
Đồ án tốt nghiệp 16 a 14 a a b a 12 a a a a b c a 10 c 8 ng bình vòngkháng ẩn (mm) 6 khu 4 2 Đường kính Đường kính tru 0 Mẫu cây Lantana sp Acorus sp Euodia sp Streptocaulon Calamus sp Xidi Klung Ciproflocaxin sp S.dublin S.enteritidis S.typhi S.typhimurium Hình 3.4. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Salmonella spp. Kết quả thu được trên hình 3.5 cho thấy rằng 4/6 mẫu cao chiết có hoạt tính đối kháng với chủng vi khuẩn Salmonella spp. Mẫu cao chiết Xidi Klung có khả năng ức chế với cả 4/4 chủng vi khuẩn tiến hành khảo sát với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn thay đổi từ 9.8mm đến 11.5mm. Các mẫu cao chiết từ các cây Calamus sp, Euodia sp, Lantana sp đều thể hiện khả năng ức chế với 1/4 chủng vi khuẩn là S.typhimirium. Đường kính trung bình vòng kháng khuẩn của cả 4 mẫu cao chiết đối với chủng S.typhimurium tương đương với với đối chứng dương là Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Các mẫu cao chiết Acorus sp và Stretocaulon sp không thể hiện khả năng ức chế đối với nhóm vi khuẩn Salmonella. Trong các mẫu cao chiết tiến hành khảo sát trên vi khuẩn Salmonella spp. , chỉ có mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung có khả năng ức chế với cả 4/4 chủng vi khuẩn trong nhóm Salmonella spp. Điều này cho thấy nhóm vi khuẩn Salmonella spp. khảo sát nhạy cảm với mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung. Nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ cây Khaya senegalensis với nồng độ 50mg/ml( Desr. A. Juss) của Ugoh SC và cộng cộng sự 56
Đồ án tốt nghiệp (2014) trên chủng S.typhii có đường kính vòng kháng khuẩn 14mm, trong khi đó mẫu cao chiết ethanol từ cây Xidi Klung ở nồng độ 100 mg/ml có kết quả vòng kháng khuẩn trung bình đối chủng vi khuẩn S.typhii là 10,3mm. 3.2.4 Đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây trên nhóm vi khuẩn Shigella spp. gồm các chủng vi khuẩn S.boydii, S.flexneri, S.sonnei được thể hiện ở hình 3.6 40 35 a 30 25 20 a 15 b khuẩn khuẩn (mm) a c b 10 5 Đưuòng kính trung bình vòng kháng 0 Lantana sp Acorus sp Euodia sp Streptocaulon Calamus sp Xidi Klung Ciproflocaxin Mẫu cây sp S.boydii S.flexneri S.sonnei Hình 3.5. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Shigella spp. Kết quả trên hình 3.6 cho thấy rằng 4/6 mẫu cao chiết không có khả năng ức chế nhóm vi khuẩn Shigella spp. là từ các mẫu cây Lantana sp, Acorus sp, Stretocaulon sp và Calamus sp. Cao chiết từ mẫu cây Xidi Klung xuất hiện vòng kháng khuẩn với cả 3/3 chủng vi khuẩn tiến hành khảo sát với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn thay đổi từ 10.5mm đến 11.6mm. Mẫu cao chiết Euodia sp xuất hiện vòng kháng khuẩn với 1/3 chủng vi khuẩn là chủng S. flexneri với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 11mm. Kết quả trên cho thấy, đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp., mẫu đối chứng dương Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml không thể hiện khả năng ức chế đối với 57
Đồ án tốt nghiệp chủng vi khuẩn S.boydii. Trong khi đó, mẫu cây Xidi Klung vẫn có khả năng ức chế với chủng S.boydii với đường kính trung bình vòng kháng là 11,1mm. Vi khuẩn S.boydii là chủng vi khuẩn nguy hiểm khi chỉ cần 100 tế bào vi khuẩn cũng có thể gây các bệnh như tiêu chảy, tổn thương đại tràng, buồn nôn Khả năng ức chế 3/3 chủng thuộc nhóm vi khuẩn Shigella spp. đã cho thấy nhóm vi khuẩn Shigella spp. nhạy cảm đối với mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung. Nghiên cứu của M.Mashiar Rahman (2009) về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ là cây Moringa oleifera lên chủng vi khuẩn S.sonnei có đường kính vòng kháng khuẩn là 21,5mm, với cùng chủng vi khuẩn ở mẫu cao chiết ethanol 70% từ mẫu cây Xidi Klung có đường kính kháng khuẩn trung bình 10,5mm. 3.2.5 Đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây trên nhóm vi khuẩn Vibrio spp. được trình bày ở hình 3.5 20 a 18 a 16 14 a a 12 bc b b a a c b 10 b (mm) 8 6 4 2 Đường kính trung bình vòng kháng khuẩn khuẩn kháng vòng bình kính trung Đường 0 Mẫu cây Lantana sp Acorus sp Euodia sp Streptocaulon Calamus sp Xidi Klung Ciproflocaxin sp V.alginolyticus V.cholerae V.harveyi V.parahaemolyticus Hình 3.6. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Vibrio spp. 58
Đồ án tốt nghiệp Kết quả thu được trên hình 3.6 cho thấy rằng 3/6 các mẫu cao chiết từ các cây Acorus sp, Euodia sp, Stretocaulon sp không có khả năng ức chế vi khuẩn. Trong các mẫu cao chiết có khả năng ức chế chủng vi khuẩn Vibrio spp., nổi bật nhất là mẫu cao chiết Xidi Klung có khả năng ức chế cả 4/4 chủng vi khuẩn với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn có sự thay đổi từ 1013mm. Mẫu cao chiết Camalus sp xuất hiện vòng kháng khuẩn 1/4 chủng vi khuẩn là V.harveyi với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 11mm và mẫu cây Lantana sp có vòng kháng khuẩn 3/4 chủng vi khuẩn là V.alginolytius, V.harveyi, V.chorlerae đường kính kháng trung bình vòng kháng lần lượt là 9.6mm, 10.8mm, 9.5mm . Mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung là mẫu cao chiết duy nhất có khả ức chế chủng vi khuẩn V.parahaemolytius trong 6 cây với đường kính là 11,3mm. Kết quả này tương đương với kết quả của đối chứng dương là Ciprofloxacin ở nồng độ 8µg/ml một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Với khả năng ức chế 4/4 chủng vi khuẩn Vibio spp. đã cho thấy, chủng vi khuẩn Vibro spp. nhạy cảm với của mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung hơn các loại cao chiết của các loại cây khác. 3.2.6 Nhóm vi sinh vật gây bệnh khác Kết quả khảo sát các chủng vi sinh vật gây bệnh khác thể hiện ở bảng 3.6 14 a a a b a a 12 10 8 6 4 kháng kháng khuẩn (mm) 2 ường kính trung bình vòng 0 Đ Mẫu cây Lantana sp Acorus sp Euodia sp Streptocaulon Calamus sp Xidi Klung Ciproflocaxin sp P. aeruginosa S.aureus E.feacalis Hình 3.7. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm vi sinh vậy gây bệnh 59
Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả hình 3.6 cho thấy 5/6 mẫu cao chiết không có hoạt tính ức chế đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh P.aeruginosa, S.aureus, E.feacadis được tách chiết từ các cây Lantana sp, Acorus sp, Euodia sp, Stretocaulon sp và Camalus sp. Mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung thể hiện khả năng ức chế các chủng vi khuẩn với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn từ 11,2mm đến 11,6 mm. Kết quả này cho thấy hoạt tính đối kháng của mẫu cao chiết ethanol 70% từ mẫu cây Xidi Klung là rất tốt. So sánh với kết quả với kết quả thu được từ cao Hà Thủ Ô nồng độ 64µg/l sử dụng dung môi methanol, có hoạt tính đối kháng với chủng vi khuẩn S.aureus và tạo vòng kháng khuẩn là 24,0mm (Đài Thị Xuân Trang, Lâm Hồng Bảo Ngọc và Võ Thị Tú Anh, 2015) so với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn đối với cùng chủng S.aureus của mẫu cao chiết từ cây Xidi Klung là 11,6mm. Trong nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ cây Aristolochias sp ở nồng độ 100mg/ml của B.Venkatadri và các cộng sự (2015) có đường kính vòng kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn P.aeruginosa là 17mm và đối với chủng vi khuẩn S.aureus là 16mm. Đối với mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung có đường kính vòng kháng khuẩn trung bình lần lượt chủng vi khuẩn P.aeruginosa và chủng vi khuẩn S.aureus là 11,3mm và 11,6mm. Sau khi tiến hành các thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây, kết quả được tổng hợp trình bày ở bảng sau 60
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1 Kết quả kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% đối với 20 chủng vi sinh 61
Đồ án tốt nghiệp Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy, mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung xuất hiện hoạt tính đối kháng 20/20 chủng vi khuẩn khảo sát,với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn từ 9.8 – 12.8mm. Mẫu cao chiết từ cây Euodia sp xuất hiện hoạt tính đối kháng 7/20 chủng vi khuẩn khảo sát, đường kính trung bình vòng kháng khuẩn từ 8.7 – 12.3mm. Mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Calamus sp xuất hiện hoạt tính đối kháng với 4/20 chủng vi khuẩn khảo sát, đường kính trung bình vòng kháng khuẩn 8.8 – 9.7mm. Mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Lantana sp xuất hiện hoạt tính đối kháng với 3/20, đường kính trung bình vòng kháng khuẩn 6.2 – 10.5mm. Mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Acorus sp xuất hiện hoạt tính đối kháng 2/20 mẫu cây, đường kính trung bình vòng kháng khuẩn 9.3 – 11mm. Mẫu cây Streptocaulon sp không xuẩ hiện vòng kháng đối với bất kì chủng vi khuẩn khảo sát nào. Từ kết quả kháng khuẩn cho thấy, mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất trong các mẫu cây tiến hành khảo sát. So sánh với dịch cao chiết từ cây Mò hoa trắng nồng độ 100mg/ml sử dụng dung môi tách chiết là ethanol 70% cho kết quả vòng kháng với chủng E.coli là 10mm.(Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Thanh Hải, 2014). Với chủng vi sinh vật là E.coli các mẫu cao chiết ethanol 70% khảo sát có kết quả kháng khuẩn tương đương như mẫu cây Camalus sp 9.7mm hay mẫu cây Xidi Klung 10mm. Từ kết quả đánh gia hoạt tính kháng khuẩn, các mẫu cao chiết từ dung môi ethanol 70% cho khả năng xuất hiện hoạt tính kháng khuẩn cao tiêu biểu như mẫu cao chiết từ cây Xidi Klung cho kết quả kháng khuẩn tốt nhất, một số mẫu cao chiết có kết quả ít hơn từ Camalus sp, Lantana sp, Euodia sp hay Acorus sp. Đặc biệt với mẫu cao chiết từ Streptocaulon sp hoàn toàn không xuất hiện hoạt tính đối kháng với các chủng vi khuẩn tiến hành khảo sát. Với kết quả như vậy, để có được đánh giá khách quan nhất về hoạt tính sinh học của cao chiết từ dung môi ethanol 70% và để chuẩn bị cho các công tác nghiên cứu sau này, cần tiến hành xác đinḥ thành phần hóa hoc̣ của các mẫu cao chiết. 62
Đồ án tốt nghiệp 3.3 Kết quả xác định thành phần hoá học Sau khi tiến hành các thử nghiệm đánh giá về hoạt tính kháng khuẩn, sẽ tiếp tục tiến hành khảo sát để xác định các thành phần hoá học của các mẫu cao chiết từ các mẫu cây. Dựa vào bảng kết quả phân tích thành phần hoá học của các mẫu cao chiết cho thấy sư ̣ khác nhau về thành phần hóa hoc̣ giữa các mẫu cao chiết. Dung môi ethanol 70% có khả năng tách chiết nhiều hợp chất chứa trong các mẫu cây. Các hợp chất thông thường như nhóm carbohydrate qua các thử nghiệm Molisch, Fehling và Barfoed đều cho kết quả dương tính. Một số mẫu cây cho kết quả tốt như Streptocaulon sp, Aucorus sp Trong thử nghiệm alkaloid, các mẫu cây Streptocaulon sp, Aucorus sp, Camalus sp cho kết quả âm tính thì ở mẫu cây Xidi Klung, Euodia sp, Lantana sp lại cho kết quả dương tính. Ở thực vật, hoạt tính kháng khuẩn chủ yếu do các thành phần alkaloid, flavonoid, hợp chất phenolic, tannin Trong 6 mẫu cao chiết ethanol 70% từ mẫu cây tiến hành khảo sát, mẫu cao chiết Xidi Klung cho kết quả dương tính nhiều nhất, kết quả này cho thấy mẫu cây Xidi Klung có chứa nhiều các hoạt chất khác nhau, bao gồm cả các hoạt chất kháng khuẩn như tannin hay flavonoid Điều này giải thích cho khả năng kháng khuẩn tốt của cây. Theo nghiên cứu của Cowan (1999), xét cụ thể ở hợp chất alkaloids có thể thấy tồn tại dẫn chất berberine và dẫn chất piperrine có chức năng xen vào thành tế bào hoặc DNA của vi sinh vật phá hủy và tiêu diệt chúng. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các flavonoid như swertifrancheside, glycyrrhizin có khả năng ức chế vi khuẩn. Trong 6 mẫu cây thuốc tiến hành khảo sát, mẫu cây Xidi Klung có hoạt tính sinh học tốt, đặc biệt là hoạt tính kháng khuẩn. Mẫu cao chiết ethanol 70% của mẫu cây Xidi Klung có khả năng kháng 20/20 chủng vi khuẩn khảo sát với hoạt tính tốt như các chủng vi khuẩn nguy hiểm như Escherichia coli, Listeria spp, Salmonella spp, so sánh với cây có hoạt tính kháng khuẩn xếp thứ 2 là Euodia sp chỉ có 6/20 chủng có xuất hiện khả năng kháng khuẩn. Những thử nghiệm cơ bản về hoạt tính sinh học của cây Xidi Klung cũng như các cây Euodia sp, Calamus sp, Aucorus sp, 63
Đồ án tốt nghiệp Lantana sp, Streptocaulon sp sẽ tạo tiền đề cho các nghiên cứu về sau trên các mẫu cây này. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.3. 64
Đồ án tốt nghiệp 65
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2 Kết quả xác đinḥ thành phần hóa hoc̣ Sapo- Cardiac Anthra Phenolic Thử nghiệm Carbohydrate Alkaloid Flavonoid Tannin Steroid AA nin glycosides quinone compound Drage Alka Lead Mo Feh Bene Ma Ha Wag Foam Leg Bon Shi Ferric Gela Ferric Lead Salkow Liber Nin Mẫu n Keller aceat lisch ling dict yer ger ner test al trager noda clorid tin clorid acetate ski mann hydrin droff line e Xidi Klung + ++ ++ + + + + + + + + + + ++ + + ++ + + Euodia sp ++ + + + + + + + + + + + + + + + + Aucorus sp ++ ++ ++ + + + + + + + + + + + Lantana sp ++ ++ ++ + + + + + + + + + + + + + + + Calamus sp ++ + + + + + + + +++ + + + + + Streptocaulon +++ ++ ++ + + + + + + + + + + + + sp Chú thích: +++: rất nhiều, ++: nhiều, +: dương tính; : âm tính. 64
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận Khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của dung môi ethanol 70% đến hiếu xuất tách chiết cao từ 6 mẫu cây cho kết quả: mẫu cây thuốc có hiệu xuất thu hồi thấp nhất là Eudia sp 9.5%, tiếp đến là các cây Lantana sp 15.5%, cây Xidi Klung 17.5%, cây Streptocaulon sp 17.5%, Calamus sp 18% và cao nhất là Acorus sp 22%. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn của 6 mẫu cây : mẫu cây Xidi Klung xuất hiện vòng kháng khuẩn 20/20 chủng vi khuẩn khảo sát, mẫu cây Euodia sp xuất hiện vòng kháng khuẩn 7/20 chủng vi khuẩn khảo sát, mẫu cây Calamus sp xuất hiện vòng kháng khuẩn 4/20 chủng vi khuẩn khảo sát, mẫu cây Lantana sp xuất hiện vòng kháng khuẩn 3/20 chủng vi khuẩn khảo sát, mẫu cây Acorus sp xuất hiện vòng kháng khuẩn 2/20 chủng vi khuẩn khảo sát. Mẫu cây Streptocaulon sp không xuất hiện vòng kháng đối với bất kì chủng vi khuẩn khảo sát nào. Kết quả thành phần hóa học cho thấy trong 6 cây khảo sát đều chứa rất nhiều thành phần hóa học như Carbohydrate, hợp chất trong alkaloid, saponin, cardiac glycoside, flavonoid, tannin, nhóm steroid và nhóm các hợp chất phenol. Trong đó mẫu cây Xidi Klung có đầy đủ các thành phần hoá học nhất trong các cây tiến hành khảo sát 2. Đề nghị Khảo sát thêm các thử nghiệm đối với các mẫu cây Xidi Klung, Euodia sp, Calamus sp, Lantana sp, Acorus sp ở các nồng độ ethanol 50%, 90% hay các dung môi khác như methanol, nước. Tiến hành thử nghiệm nồng đô ̣ ứ c chế tối thiểu (MIC),định danh loài, đinḥ lương̣ thành phần hóa hoc̣ của cây Xidi Klung. Khảo sát khả năng điều trị các bệnh liên quan đến khả năng kháng các chủng vi khuẩn như Escherichia coli spp, Listeria spp, Salmonella spp của cây Xidi Klung trên mô hình động vật 65
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Bài giảng Dược liệu Tập I, 1998, Trường đại học y dược TPHCM Cao Minh Nga, 2014. Thực tập vi sinh học. Nhà xuất bản giáo dục,67,68 Đài Thị Xuân Trang, Lâm Hồng Bảo Ngọc và Võ Thị Tú Anh (2015), “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hoá của cao methanol cây Hà Thủ Ô Trắng”, (Streptocaulon juventas MERR.). Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ. Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học Ngô Văn Thu, 2011. Bài giảng dược liệu, tập I. Trường đại học Dược Hà Nội Nguyễn Văn Thanh , Nguyễn Thanh Hải (2014),”nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn In Vitro của dịch chiết cây Mò Hoa Trắng (Clerodendron fragrans Vent) trên vi khuẩn E.coli, Samonella spp. Phân lập từ phân lợn con theo mẹ mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy và thử nghiệm điều trị” Phạm Thanh Kỳ và cs, 1998. Bài giảng dược liệu, tập II. Trường đại học Dược Hà Nội Viện Dược liệu (2004), “Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam”, tập II, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật. Viện dược liệu, 2004. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I. Nhà xuất bản khoa hoc kỹ thuật Võ Thị Mai Hương, Trần Thanh Phong (2014), “Một số đặc trưng hoá sinh và khả năng kháng khuẩn của dịch chiết quả Nhàu ( Morinda citrifolia L.)”. Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. Vũ Văn Dũng. 1996. Cây rừng Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 66
Đồ án tốt nghiệp Tài liệu tham khảo tiếng Anh Abdillahi, HS, et al. (2011). Anti-inflammatory, antioxidant, anti-tyrosinase and phenolic contents of four Podocarpus species used in traditional medicine in South Africa. Journal of Ethnopharmacology 136(3), 496503. Amoros, M., F. Sauvager, L. Girre, and M. Cormier (1992), In vitro antiviral activity of propolis. Apidologie 23:231–240. Austin, B. & D.A. Austin. 1993. Bacterial fish pathogens, Diseases in farmed and wild fish, 2nd edn. Ellis Horwood Ltd., Chichester Jemmi, T., and Stephan, R.,2006, Listeria monocytogenes: food-borne pathogen and hygiene indicator. Science Magazine Vol (25):571580 Katie E. Ferrell; Thorington, Richard W. (2006). Squirrels: the animal answer guide. Baltimore: Johns Hopkins University Press. 91 Nguyen Tien Hiep, Pan Ke Loc, Nguyen Duc To Luu, PI Thomas, A. Farjon, L. Averyanov & J. Regalado Jr. 2004. Vietnam Conifers: Conservation Status Review 2004. Fauna & Flora International, Vietnam Programme, Hanoi. Ugoh SC, Agarry OO, Garba SA.(2014) .Studies on the antibacterial activity of Khaya senegalensis [(Desr.) A. Juss)] stem bark extract on Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi [(ex Kauffmann and Edwards) Le Minor and Popoff]. M. Mashiar Rahman1, M. Mominul Islam Sheikh1, Shamima Akhtar Sharmin, M. Soriful Islam, M. Atikur Rahman, M. Mizanur Rahman,3 and M. F. Alam (2009), Antibacterial Activity of Leaf Juice and Extracts of Moringa oleifera Lam. against Some Human Pathogenic Bacteria. B. Venkatadri N. Arunagirinathan, M. R. Rameshkumar, Latha Ramesh, A. Dhanasezhian,and P. Agastian (2005), In vitro Antibacterial Activity of Aqueous and Ethanol Extracts ofAristolochia indica and Toddalia asiatica, Against MultidrugResistant Bacteria 67
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC LOẠI CAO CHIẾT ETHANOL Ở CÁC NỒNG ĐỘ KHÁC NHAU TRÊN CÁC NHÓM VI SINH VẬT CHỈ THỊ Tên chủng Vi sinh vật Lantana sp Acorus sp Euodia sp Stretocaulon sp Calamus sp Xidi Klung E.coli O157:H7 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 12.5 12.0 12.5 0.0 0.0 0.0 9.5 10.0 9.0 12.5 13.0 13.0 E.coli 0208 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 8.5 9.0 8.5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 10.5 10.5 10.5 E.coli (K) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 10.0 10.0 9.0 10 9.5 10.5 ETEC 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 9.0 9.0 8.5 11.5 11.5 12 L.innocua 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 9.5 10.0 10.0 L.monocytogenes 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 10.0 13.0 12.0 S.dublin 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 10.0 10.0 10.0 S.enteritidis 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 12.5 12 12 S.typhi (K) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 10.5 11.5 11 S.typhimurium 10.0 9.5 9.5 0.0 0.0 0.0 10.0 10.0 10.5 0.0 0.0 0.0 8.5 9.0 10.0 9.5 10.0 10.0 S.boydii 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 11 10 10.5 S.flexneri 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 10.0 9.5 9.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 11.5 11.5 12.5 S.sonnei 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 11.5 11 12 V.alginolyticus 9.5 10.5 9.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 10.5 11 10 V.cholerae 9.5 9.0 10.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 12 12 12 V.harveyi 11.0 10.5 11.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 11.0 12.0 11.0 10 10 10 V.parahaemolyticus 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 9 10.5 11.5 P. aeruginosa 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 11.5 10.5 12 S.aureus 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 11.5 12.5 11 E.feacalis 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 11.5 11 11 1
Đồ án tốt nghiệp 2
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ MỨC ĐỘ KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC LOẠI CAO CHIẾT ETHANOL TRÊN CÁC NHÓM VI SINH VẬT CHỈ THỊ C.1. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Escherichia coli a. E.coli 0157:H7 ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 760.667 6 126.778 1774.89 0.0000 Within groups 1.0 14 0.0714286 Total (Corr.) 761.667 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Coun Mean Homogeneous t Groups Lantana sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 9.5 X Euodia sp. 3 12.3333 X Xidi Klung. 3 12.8333 XX Ciproflacaxin 3 13.1667 X 3
Đồ án tốt nghiệp b. E.coli 0208 ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 587.167 6 97.8611 4110.17 0.0000 Within groups 0.333333 14 0.0238095 Total (Corr.) 587.5 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Lantana sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 8.66667 X Xidi Klung 3 10.5 X Ciprofloxacin 3 12.3333 X c. E.coli ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 638.405 6 106.401 1117.21 0.0000 Within groups 1.33333 14 0.0952381 Total (Corr.) 639.738 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous 4
Đồ án tốt nghiệp Groups Acorus sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 9.66667 X Xidi Klung 3 10.0 X Ciprofloxacin 3 13.1667 X d. ETEC ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2388.74 6 398.123 6688.47 0.0000 Within groups 0.833333 14 0.0595238 Total (Corr.) 2389.57 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Acorus sp 3 0.0 X Lantana sp 3 0.0 X Euodia sp 3 0.0 X Streptocaulon sp 3 0.0 X Calamus sp 3 8.83333 X Xidi Klung 3 11.6667 X Ciprofloxacin 3 31.0 X 5
Đồ án tốt nghiệp C.2. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Listeria a. L.innocua ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 517.786 6 86.2976 1812.25 0.0000 Within groups 0.666667 14 0.047619 Total (Corr.) 518.452 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Acorus sp 3 0.0 X Calamus sp 3 0.0 X Euodia sp 3 0.0 X Streptocaulon sp 3 0.0 X Lantana sp 3 0.0 X Xidi Klung 3 9.83333 X Ciprofloxacin 3 12.0 X b. L.monocytogenes ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 600.286 6 100.048 271.10 0.0000 Within groups 5.16667 14 0.369048 Total (Corr.) 605.452 20 6
Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Coun Mean Homogeneous t Groups Acorus sp 3 0.0 X Calamus sp 3 0.0 X Euodia sp 3 0.0 X Streptocaulon sp 3 0.0 X Lantana sp 3 0.0 X Xidi Klung 3 11.6667 X Ciprofloxacin 3 12.0 X C.3 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Salmonella a. S.dublin ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 533.5 6 88.9167 1067.00 0.0000 Within groups 1.16667 14 0.0833333 Total (Corr.) 534.667 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Acorus s 3 0.0 X Calamus sp 3 0.0 X 7
Đồ án tốt nghiệp Euodia sp 3 0.0 X Streptocaulon sp 3 0.0 X Lantana sp 3 0.0 X Xidi Klung 3 10.0 X Ciprofloxacin 3 12.1667 X b. S.enteritidis ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 679.643 6 113.274 2378.75 0.0000 Within groups 0.666667 14 0.047619 Total (Corr.) 680.31 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Acorus sp 3 0.0 X Calamus s 3 0.0 X Euodia sp 3 0.0 X Streptocaulon sp 3 0.0 X Lantana sp 3 0.0 X Xidi Klung 3 12.1667 X Ciprofloxacin 3 13.0 X c. S.typhi ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 8
Đồ án tốt nghiệp Between groups 595.071 6 99.1786 1388.50 0.0000 Within groups 1.0 14 0.0714286 Total (Corr.) 596.071 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Acorus sp 3 0.0 X Calamus sp 3 0.0 X Euodia sp 3 0.0 X Streptocaulon sp 3 0.0 X Lantana sp 3 0.0 X Xidi Klung 3 11.0 X Ciprofloxacin 3 12.5 X d. S.typhimurium ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 418.905 6 69.8175 18.92 0.0000 Within groups 51.6667 14 3.69048 Total (Corr.) 470.571 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Acorus sp 3 0.0 X Streptocaulon sp 3 0.0 X 9
Đồ án tốt nghiệp Calamus sp 3 5.83333 X Lantana sp 3 9.66667 X Xidi Klung 3 9.83333 X Euodia sp 3 10.1667 X Ciprofloxacin 3 11.0 X C.4. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Shigella a. S.boydii ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 283.5 6 47.25 1323.00 0.0000 Within groups 0.5 14 0.0357143 Total (Corr.) 284.0 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Acorus sp 3 0.0 X Ciprofloxacin 3 0.0 X Euodia sp 3 0.0 X Calamus s 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp 3 0.0 X Xidi Klung 3 10.5 X 10
Đồ án tốt nghiệp b. S.flexneri ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 700.81 6 116.802 1226.42 0.0000 Within groups 1.33333 14 0.0952381 Total (Corr.) 702.143 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Lantana sp 3 0.0 X Calamus 3 0.0 X Streptocaulon sp 3 0.0 X Acorus sp 3 0.0 X Euodia s 3 9.5 X Xidi Klung 3 11.8333 X Ciprofloxacin 3 13.1667 X c. S.sonnei ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2815.07 6 469.179 6568.50 0.0000 Within groups 1.0 14 0.0714286 Total (Corr.) 2816.07 20 11
Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Acorus sp 3 0.0 X Calamus sp 3 0.0 X Euodia sp 3 0.0 X Streptocaulon sp 3 0.0 X Lantana sp 3 0.0 X Xidi Klung 3 11.5 X Ciprofloxacin 3 33.0 X C.5. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Vibrio a. V.alginolyticus ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 829.405 6 138.234 1055.61 0.0000 Within groups 1.83333 14 0.130952 Total (Corr.) 831.238 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Acorus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 0.0 X 12
Đồ án tốt nghiệp Lantana sp 3 9.66667 X Xidi Klung 3 10.5 X Ciprofloxacin 3 16.1667 X b. V.Cholerae ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 653.786 6 108.964 3051.00 0.0000 Within groups 0.5 14 0.0357143 Total (Corr.) 654.286 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Calamus sp 3 0.0 X Acorus sp 3 0.0 X Euodia sp 3 0.0 X Streptocaulon sp 3 0.0 X Lantana sp 3 9.5 X Ciprofloxacin 3 12.0 X Xidi Klung 3 12.0 X c. V.harveyi ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 930.833 6 155.139 1628.96 0.0000 Within groups 1.33333 14 0.0952381 13
Đồ án tốt nghiệp Total (Corr.) 932.167 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Streptocaulon sp 3 0.0 X Acorus sp 3 0.0 X Euodia sp 3 0.0 X Xidi Klung 3 10.0 X Lantana 3 10.8333 XX Calamus sp 3 11.3333 X Ciprofloxacin 3 18.0 X d. V.parahaemolyticus ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 504.476 6 84.0794 353.13 0.0000 Within groups 3.33333 14 0.238095 Total (Corr.) 507.81 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Acorus sp 3 0.0 X Calamus sp 3 0.0 X Euodia sp 3 0.0 X Streptocaulon sp 3 0.0 X 14
Đồ án tốt nghiệp Lantana sp 3 0.0 X Xidi Klung 3 10.3333 X Ciprofloxacin 3 11.3333 X C.6. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn khác a. P. aeruginosa ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 592.738 6 98.7897 754.39 0.0000 Within groups 1.83333 14 0.130952 Total (Corr.) 594.571 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Acorus sp 3 0.0 X Calamus sp 3 0.0 X Euodia sp 3 0.0 X Streptocaulon sp 3 0.0 X Lantana sp 3 0.0 X Xidi Klung 3 11.3333 X Ciprofloxacin 3 12.1667 X 15
Đồ án tốt nghiệp b. S.aureus ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 600.286 6 100.048 1200.57 0.0000 Within groups 1.16667 14 0.0833333 Total (Corr.) 601.452 20 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Acorus sp 3 0.0 X Calamus sp 3 0.0 X Euodia sp 3 0.0 X Streptocaulon sp 3 0.0 X Lantana s 3 0.0 X Xidi Klung 3 11.6667 X Ciprofloxacin 3 12.0 X c. E.feacalis ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 567.452 6 94.5754 3972.17 0.0000 Within groups 0.333333 14 0.0238095 Total (Corr.) 567.786 20 16
Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Acorus sp 3 0.0 X Calamus sp 3 0.0 X Euodia sp 3 0.0 X Streptocaulon sp 3 0.0 X Lantana s 3 0.0 X Xidi Klung 3 11.1667 X Ciprofloxacin 3 11.8333 X 17
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: CÁC THUỐC THỬ DÙNG TRONG QUÁ TRÌNH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC C.1. Thử nghiệm định tính Carbohydrate Molisch: Thuốc thử Molisch: Hòa tan 5g α napthol vào ethanol 95% và pha loãng thành 100 ml Feling: Thuốc thử Fehling A: hòa tan 34,6 g CuSO4.5H2O vào 500ml nước cất. Thuốc thử Fehling B: Hòa tan 125g KOH và 173g Kali Natri tartrate.7H2O vào 500 ml nước cất. Barfoed: Thuốc thử Barfoed: Thêm 10 ml acid acetic glacial vào 1000ml nước cất, cân 66,5g Copper (II) acetate monohydrate, dun và khuấy đến khi tan hoàn toàn. C.2. Thử nghiệm định tính Alkaloid Mayer: Hòa tan 1,358g HgCl2 trong 60ml nước, sau đó đổ vào trong dung dịch này 5 g KI được pha trong 10ml nước. Sau đó định mức lên 100 ml. Dragendroff gồm 2 dung dịch: Dung dịch A: hòa tan 0,5 g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml acid acetic 20%. Dung dịch B: dung dịch KI 40% pha trong nước. Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với 5 ml dung dịch B và 70ml nước. Hager:Thuốc thử Hager: Hòa tan 1 g acid picric vào 100ml nước cất Wagner:Thuốc thử Wagner: Hòa tan 2g iodine và 6g KI vào 100ml nước cất C.3. Thử nghiệm định tính Cardiac glycosides Legal: Thuốc thử Na nitro prusside: 1 g Na nitroferricyanide và bổ sung 10 ml nước cất 18