Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây elephantopus sp.

Nội dung text: Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây elephantopus sp.

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT METHANOL TỪ CÂY ELEPHANTOPUS SP. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: Th S. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện: Phạm Hữu Tuấn MSSV: 1151110538 Lớp: 11DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2015
2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Sinh viên Phạm Hữu Tuấn
3. LỜI CÁM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng 2015 Sinh viên Phạm Hữu Tuấn
4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC TRANG Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục i Danh sách các chữ viết tắt iv Danh sách các hình v Danh sách các bảng vii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục đích nghiên cứu 1 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Phạm vi nghiên cứu 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu về cây Elephantopus sp 3 1.1.1. Nguồn gốc 3 1.1.2. Phân loại 3 1.1.3. Đặc điểm của một số loài thuộc Elephantopus sp. 3 1.1.4. Phân bố 5 1.1.5. Công dụng 5 1.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật 6 1.2.1. Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật 6 1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật 6 i
5. Đồ án tốt nghiệp 1.2.3. Một số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 8 1.2.4. Tình hình nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn ở thực vật trên thế giới và tại Việt Nam 12 1.3. Ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của thực vật . 14 1.4. Giới thiệu một số nhóm vi sinh vật gây bệnh 15 1.4.1. Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 15 1.4.2. Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da 21 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1. Thời gian và địa điểm 27 2.1.1. Thời gian 27 2.1.2. Địa điểm 27 2.2. Vật liệu 27 2.2.1. Nguồn mẫu 27 2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị 27 2.2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 28 2.4. Phương pháp nghiên cứu 29 2.4.1. Phương pháp xử lý và tách chiết hợp chất kháng khuẩn 29 2.4.2. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị 29 2.4.3. Phương pháp pha loãng mẫu 30 2.4.4. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật chỉ thị 30 2.4.5. Phương pháp tách các phân đoạn từ cao tổng methanol 30 2.4.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 31 2.4.7. Phương pháp xác định chỉ số MIC 32 ii
6. Đồ án tốt nghiệp 2.4.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học 33 2.4.9. Phương pháp xử lý số liệu 34 2.5. Bố trí thí nghiệm 34 2.5.1. Thí nghiệm 1: Thu nhận cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp 34 2.5.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol từ cây Elephantopus sp. 36 2.5.3. Thí nghiệm 3: Tách chiết các phân đoạn từ cao tổng methanol 75% từ cây Elephantopus sp. 37 2.5.4. Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn của cao tổng methanol 38 2.5.5. Thí nghiệm 5: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao tổng methanol Elephantopus sp 39 2.5.6. Thí nghiệm 6: Định tính một số thành phần có trong cây Elephantopus sp 41 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Hiệu suất thu hồi cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp 45 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao tổng methanol từ cây Elephantopus sp. . 45 3.3. Nồng độ ức chế tối thiểu của cao tổng Elephantopus sp 49 3.4. Định tính sơ bộ thành phần hóa học cây Elephantopus sp 50 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng Elephantopus sp. qua từng phân đoạn 53 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 4.1. Kết luận 58 4.2. Đề nghị 58 Tài liệu tham khảo 59 iii
7. Đồ án tốt nghiệp iv
8. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BF: Butanol fraction EF: Ethyl acetate fraction EMB: Eosin Methylene Blue HF: Hexan fraction ME: dịch chiết methanol 75% MIC: Minimum Inhibitory Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu PSMs: Plant Secondary Metabolites TSA: Trypticase Soya Agar TSB: Trypton Soya Broth XLD: Xylose Lysine Deoxycholate WF: Water fraction v
9. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình thái cây Elephantopus scaber 4 Hình 1.2. Hình thái cây Elephantopus mollis 4 Hình 1.3. Hình thái cây Elephantopus tomentosus 5 Hình 1.4. Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm 7 Hình 1.5. Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử 15 Hình 1.6. Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB 16 Hình 1.7. Hình thái Vibrio trên kính hiển vi điện tử 17 Hình 1.8. Khuẩn lạc Vibrio trên môi trường Chrom agar 17 Hình 1.9. Hình thái Salmonella trên kính hiển vi điện tử 18 Hình 1.10. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD 19 Hình 1.11. Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử 20 Hình 1.12. Khuẩn lạc Shigella trên môi trường Macconkey 20 Hình 1.13. Hình thái Pseudomonas trên kính hiển vi điện tử 22 Hình 1.14. Khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa trên môi trường thạch thường22 Hính 1.15. Hình thái Enterococcus faecalis trên kính hiển vi điện tử 23 Hình 1.16. Khuẩn lạc Enterococcus faecalis trên môi trường thạch máu BA 24 Hình 1.17. Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử 25 Hình 1.18. Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường Baird Parker bổ sung egg yolk 25 Hình 2.1. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết methanol 75% (100 mg/ml) đối với chủng Escheriachia coli (trái) và Shigella flexneri 37 vi
10. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2. Hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn hexan (20 mg/ml) và butanol (50 mg/ml) đối với chủng Escheriachia coli và Shigella flexneri 39 Hình 2.3. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết methanol 75% (25 mg/ml) đối với chủng Listeria monocytogenes và Vibrio alginolyticus (phải). 40 Hình 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol 75% (100 mg/ml) đối với nhóm Escherichia spp. 45 Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol 75% (100 mg/ml) đối với chủng Shigella flexneri, Salmonella typhii, Vibrio cholerae và Vibrio alginolyticus 46 Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol 75% (100 mg/ml) đối với chủng Listeria monocytogen Pseudomonas aeruginosa 47 Hình 3.4. Thử nghiệm định tính tannin 52 Hình 3.5. Thử nghiệm định tính alkaloid 53 Hình 3.6. Thử nghiệm định tính flavonoid 53 Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn đối với nhóm Escherichia54 Hình 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của của các phân đoạn đối với chủng Shigella flexneri, Salmonella typhii, Vibrio cholerae và Vibrio alginolyticus 54 Hình 3.9. Hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn lên chủng Listeria monocytogenes và chủng Pseudomonas aeruginosa 55 vii
11. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của dịch chiết methanol 75% từ cây Elephantopus sp . 48 Bảng 3.2. Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết methanol 75% từ cây Elephantopus sp 49 Bảng 3.3. Định tính một số thành phần hóa học có trong cao chiết methanol cây Elephantopus sp. 50 Bảng 3.4. Kết quả tổng hợp của hoạt tính kháng khuẩn cao tổng methanol 75% và 4 phân đoạn hexan, ethyl acetate, butanol và nước từ cây Elephantopus sp. 56 viii
12. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Trong những năm đầu thế kỉ XIX khi người ta tìm cách chữa trị các vết thương, nhiễm trùng do các tác sinh học cụ thể là vi khuẩn thì kháng sinh là sự lựa chọn được ưu tiên hàng đầu. Các loại kháng sinh thời điểm đó chủ yếu được phân lập từ nấm ví dụ như penicillin được phân lập từ nấm Penicillium nhưng cho tới nay do sự hiện tượng kháng thuốc đã xuất hiện và trở nên mạnh mẽ và lan rộng hơn thì việc sử dụng các hợp chất có nguồn gốc thực vật nên được quan tâm và nghiên cứu nhiều hơn. Thật vậy khi dân số ngày càng tăng nhanh ở các nước đang phát triển, tỷ lệ dịch bệnh ngày càng tăng và đa dạng cùng với đó sự gia tăng của các loại thuốc hóa học cũng mang tới những hệ quả không mong muốn thì việc tạo ra loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên vừa rẻ tiền vừa gần gũi với cuộc sống luôn được mọi người đón nhận. Đã từ rất lâu, khi cuộc sống con người vẫn chưa có nhiều tiện nghi, các phương tiện cũng như các loại thuốc tân thời, việc con người sử dung các loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên rất được con người ưa chuộng. các thầy thuốc giỏi chữa được nhiều căn bệnh hiểm nghèo thường có một kiến thức rất uyên thâm về cây thuốc và các công dụng của chúng họ quan niệm rằng các cây thuốc và các vị thuốc luôn ở quanh ta, cây thuốc sau khi được đem về sẽ được phơi khô và chủ yếu ngâm với nước sắc làm thuốc uống, thuốc này trị được nhiều bệnh và như một bài thuốc dân gian nó vẫn tồn tại cho tới ngày nay Để tìm hiểu một cách cặn kẽ và chi tiết hơn về tác dụng trị các bệnh có nguồn gốc sinh học cũng như kiểm chứng khả năng thay thế những loại thuốc tân thời chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây elephantopus sp.”. Đề tài nghiên cứu này dựa tên một loài cây được dân gian dùng như một vị thuốc, hy vọng sẽ làm sáng tỏ một số công dụng được dân gian truyền tụng dưới ánh nhìn khoa học và thuyết phục hơn. 2. Mục đích Xác định khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ cây Elephantopus sp. 1
13. Đồ án tốt nghiệp Bước đầu xác định thành phần hóa học có trong cây Elephantopus sp. 3. Nội dung nghiên cứu Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol và các phân đoạn từ cây Elephantopus sp. Xác định chỉ số MIC và MBC của cao chiết methanol và các phân đoạn từ cây Elephantopus sp. Định tính một số thành phần hóa học có trong cây Elephantopus sp. 4. Phạm vi nghiên cứu Các khảo sát thực hiện chỉ trên hệ dung môi methanol 75% và 4 phân đoạn của methanol 75% bao gồm Hexan, Butanol, Ethyl acetate và nước. Trong phản ứng xác định thành phần hóa học chỉ giới hạn ở mức độ định tính các nhóm chất chung. Giới hạn khảo sát chỉ trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị. Chỉ khảo sát cây thuốc ở mức độ chi 2
14. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây Elephantopus sp. 1.1.1. Nguồn gốc Elephantopus sp. là loại cây sống lâu năm thuộc họ Cúc, có khoảng 26 loài, chúng đã được mô tả từ lâu đời điển hình như Elephantopus tomentosus được mô tả lần đầu vào năm 1753, Elephantopus mollis được Kunth mô tả vào năm 1820, còn Elephantopus scaber thì được mô tả lần đầu vào năm 1753 bởi Lour. 1.1.2. Phân loại Giới Plantae Ngành Magnoliophyta Lớp Angiospermae Loại Campanulids Bộ Asterales Họ Asteraceae Giống Elephantopus Loại Elephantopus sp. 1.1.3. Đặc điểm của một số loài thuộc Elephantopus sp. 1.1.3.1. Elephantopus scaber Elephantopus scaber cao 30-60 cm. Lá mọc thành hoa thị ở gốc, thuôn thon hay thành cuống ôm thân, tù ở đầu, dài 6 -12cm, rộng 3-5 cm, có răng, có lông ráp ở cả hai mặt, với lông trắng, cứng, áp sát. Hoa tím hay hồng, xếp 4 cái thành đầu; các đầu này lại tập hợp thành ngù bao bởi hai lá bắc hình tam giác, dài 10-15mm, rộng ở gốc. Quả bế có 10 cạnh, hình thoi, có lông, cụt ở đỉnh; mào lông cứng xếp một dãy, thường ra hoa vào mùa thu giữa tháng 6 tới tháng 12, (Wang và ctv 2004). 3
15. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1. Hình thái cây Elephantopus scaber 1.1.3.2. Elephantopus mollis Elephantopus mollis cao 0,5-1m, phủ đầy lông. Lá mọc dài theo thân, không cuống; phiến thon dạng bay, dài 10-15cm, gốc ôm thân, mép khía lượn, có lông mềm ngắn ở mặt dưới; các lá trên rất tiêu giảm. Cụm hoa dài theo thân, nhánh mang nhiều hoa đầu kép trong một bao chung; các hoa đầu phụ cao 8 mm, mang 4 tới 5 hoa trắng, quả bế cao 3mm, có rãnh; mào lông có 5 tơ và thường ra hoa vào tháng 6 và 7 (Alyokhin và ctv 2002). Hình 1.2. Hình thái cây Elephantopus mollis 1.1.3.3. Elephantopus tomentosus 4
16. Đồ án tốt nghiệp Elephantopus tomentosus cao từ 60 tới 120 cm, thân cây thẳng đứng nhiều nhánh, góc cạnh có lông tơ trắng, phần thân rễ khỏe mạnh hình sợi hướng thẳng lên, lá thường bị úa khi cây bắt đầu nở hoa, hầu như không có cuốn lá hoặc cuốn lá rất nhỏ, lá nằm bên dưới có hình chữ nhật hay oval diện tích khoảng 8-22 × 3-7 cm, một gân chính, lá nằm trên có hình elip hay hình chữ nhật có diện tích vào khoảng 7-8 × 1,5-2 cm, hướng trục có lằn xếp và nổi cộm lên lông tơ thưa thớt hoặc dày đặc, cụm hoa vào khoảng 12 tới 20 cụm, cuốn thon dài (Wang và ctv, 2012). Hình 1.3. Hình thái cây Elephantopus tomentosus 1.1.4. Phân bố Elephantopus sp. thường mọc nhiều ở châu Phi, Nam Á, Úc và Châu Mỹ, một vài loài thuộc Đông Nam Mỹ và số ít ở Ấn Độ và Himalaya. Loài Elephantopus mollis được tìm thấy ở dọc các bờ biển Philippines, ngoài ra còn có thể tìm thấy ở Mexico, Đài Loan và Borneo. Tại Việt Nam có thể gặp một trong hai loài là Elephantopus scaber hay Elephantopus tomentosus. 1.1.5. Công dụng Elephantopus sp. được dân gian sử dụng như một loại thuốc cổ truyền để điều trị các bệnh như viêm thận, phù nề, sốt tức ngực, lở loét, đau khớp do thương 5
17. Đồ án tốt nghiệp tích, ho do viêm phổi. chúng cũng còn được dùng như một loại thuốc bổ tăng cường sức khỏe, làm thuốc hạ sốt, viêm cuống phổi và hen suyễn. Người Thái Lan đã dùng Elephantopus scaber để chữa chứng ho, làm thuốc bổ (Inta và ctv, 2008). Ở Malaysia nước sắc rễ cây Elephantopus scaber giúp ngăn chặn viêm nhiễm sau khi sinh con, ngoài ra toàn bộ cây Elephantopus scaber được nấu cùng với đậu đỏ có thể trị chứng đầy hơi (Hammer và Johns, 1993), Elephantopus scaber ở Brazil được sử dụng như một phương thuốc truyền thống giúp hạ sốt, lợi tiểu, loại sỏi thận (Poli và ctv, 1992). Trong nghiên cứu hiện tại chúng cũng được kiểm tra khá kỹ lưỡng về tính độc, khả năng hạ sốt, khả năng giảm đau, kháng viêm, lợi tiểu và gây táo bón. Elephantopus mollis có công dụng lợi tiểu, hạ sốt, trị thương, kháng khuẩn và virus, rễ cây Elephantopus mollis có công dụng chống nôn mửa còn lá cây có công dụng trong việc chữa các vết loét và bệnh chàm, cả rễ và lá có công dụng làm mềm vết thương, trị tiêu chảy và các chứng đau lỗ tiểu và đau dạ dày (Muthiumani và ctv, 2010). Ở Malaysia người ta sử dụng Elephantopus tomentosus như một vị thuốc lợi tiểu, hạ sốt, giảm đau và trị giun, ngoài ra chúng còn được dùng làm thuốc bôi ngoài da (Jaganath, 2000). Trong báo cáo của Yam và ctv (2009) thì Elephantopus tomentosus được sử dụng để điều trị kháng viêm. 1.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật 1.2.1. Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật Chất kháng khuẩn thực vật là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có tác dụng tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở nồng độ thường rất nhỏ (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010). 1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật Cơ chế chung của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật bao gồm việc phá vỡ màng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình tổng hợp cùng chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian tế bào, gây đông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền thông tin 6
18. Đồ án tốt nghiệp của tế bào. Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả PSMs (Plant secondary metabolites) tác động tới màng tế bào, khuếch tán qua màng tế bào rồi tác động tương tác với các thành phần nội bào từ đó ảnh hưởng tác động tới hoạt động tế bào (Radulovíc và ctv 2013). Hình 1.4. Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm Các hợp chất từ thực vật có tác động kháng khuẩn không chỉ là đối với vi khuẩn Gram dương và Gram âm mà còn với cả nấm, trong đó các chủng Gram âm là nhạy cảm dễ bị các hợp chất thực vật tác động lên nhất, có tới 5 hướng mà các hợp chất thực vật có thể tác động tới các chủng Gram âm. Trường hợp điển hình là của thymol, hợp chất này có tác động tới cả màng tế bào của tế bào chất bên ngoài và bên trong bằng cách tích hợp vào nhóm đầu cực của lớp đôi lipid dẫn tới sự chênh lệch, làm tăng tính bán thấm của màng tế bào và gây chết, tuy nhiên thymol cũng có thể tham gia vào việc quy định các gen tham gia vào tổng hợp protein màng ngoài, ức chế enzym liên quan đến bảo vệ chống lại stress nhiệt, tổng hợp ATP, các con đường trao đổi chất citric. Tiềm năng kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của PSMs có thể bị ảnh hưởng và phụ thuộc bởi rất nhiều yếu tố như tính năng của tế bào đích (vi khuẩn, nấm, Gram dương, Gram âm), điều kiện môi trường, khả năng hòa tan, nồng 7
19. Đồ án tốt nghiệp độ, nhiệt độ, độ pH ảnh hưởng quan trọng tới tác động kháng khuẩn của PSMs cũng như các hỗn hợp của chúng (Radulovíc và ctv, 2013). (Hình 1.4). 1.2.3. Một số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 1.2.3.1. Alkaloid Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được cung cấp bởi amino acid, đa số có nhân dị vòng. Đa số các alkaloid đều có tính base yếu. Chủ yếu trong thực vật, tập trung ở một số họ: Apocynaceae (họ Trúc đào) gần 800 alkaloid, Papaveraceae (họ Thuốc phiện) gần 400 alkaloid, Fabaceae (họ Đậu) 350 alkaloid, Solanaceae (họ Cà) gần 200 alkaloid. Phương pháp định tính alkaloid: Thử nghiệm Wagner, thử nghiệm Hager, thử nghiệm Mayer, thử nghiệm Dragendroff. Vai trò của alkaloid chủ yếu là tác động diệt khuẩn, ảnh hưởng lên hệ thần kinh, hạ huyết áp, chống ung thư. Một số alkaloid có tính kháng khuẩn: Solamargine là một glycoalkaloid có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum khasinum), và các loại alkaloid khác trong loài cây này có tác dụng chống lại sự lây nhiễm khi đã mắc phải HIV. Kháng khuẩn tốt nhất dối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan trực tiếp tới việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy. Ngoài solamargine thì berbein cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với shigella, Staphylococcus. Những năm gần đây một số nghiên cứu mới nhất cho thấy berberine có tinh kháng khuẩn với nhiều vi khuẩn Gram dương, Gram âm ngoài ra berberine còn chống lại nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh. Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với khuẩn gây sốt rét. Cơ chế kháng khuẩn berberine là khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn gây bệnh số rét, chính vì thế mà tác dụng kháng khuẩn của berberine đối với loài này khá mạnh. Đặc biệt khi dùng berberine điều trị các bệnh nhiễm trùng đường ruột sẽ không ảnh hưởng tới sự phất triển bình thường của hệ vi sinh vật có lợi ở ruột. Vì vậy berberine đang được chú ý phát triển ơ nhiều nước (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010). 1.2.3.2. Saponin 8
20. Đồ án tốt nghiệp Saponin thuộc nhóm glycosides, dưới tác dụng của các enzyme thực vật, vi khuẩn hay acid loãng, saponin bị thuỷ phân thành genin (gọi là sapogenin) và phần glucid thường ở dạng vô định hình, có vị đắng, tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan, hòa tan vào nước từ đó làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo bọt. phát hiện trong mẫu có Saponin bằng thử nghiệm lắc tạo bọt Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi lỏng), một số saponin có tác dụng chống viêm, một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus, kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, theo Hoàng Sầm và Hứa Văn Thao (2012). 1.2.3.3. Anthraquinone glycoside Anthraquinone glycosides là hợp chất thường có màu từ vàng, cam tới đỏ, gắn vào nhân thường có các nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH , tuỳ theo vị trí các nhóm chức gắn vào nhân mà có các dẫn chất khác nhau. Anthraquinone glycosides được định tính bằng thử nghiệm Borntrager. Một số nghiên cứu cho thấy các dẫn chất anthraquinon có tác dụng kích thích miễn dịch chống ung thư. Thành phần ức chế vi khuẩn trong cây Đại Hoàng chủ yếu là dẫn chất của anthraquinone, có tác dụng kháng khuẩn rộng chủ yếu đối với tụ cầu, liên cầu, song cầu khuẩn lậu, trực khuẩn bạch hầu, thương hàn, phó thương hàn, kiết lị, theo Mạnh Hùng (2015). 1.2.3.4. Flavonoids Flavonoids là một sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc của hoa, giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa. Bộ khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon, có độ tan không giống nhau. Flavonoid glycosides, flavonoid sulfat không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước, cồn, aglycon flavonoid tan trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước. flavonoids được phân loại dựa trên vị trí của gốc aryl đính vào. flavonoids được xác định bằng các thử nghiệm chì acetate, thử nghiệm acid clohidric và thử nghiệm Benidict. 9
21. Đồ án tốt nghiệp Flavonoids có vai trò là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn acid ascorbic trong tế bào, ngăn cản 1 số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng ), tham gia quá trình lọc tia cực tím (UV), cộng sinh cố định đạm và sắc tố hoa. Một số hợp chất Flavonoids có hoạt tính kháng khuẩn có thể kể đến như catechin. Chúng là một trong những hợp chất flavonoid có khả năng ức chế Vibrio cholera, Streptococcus mutans, Shigella và một số vi sinh vật khác. Catechin hoạt động bằng cách vô hoạt độc tố gây bệnh tả của Vibrio, ức chế enzyme glucosyltransferase của Streptococcus mutans, cơ chế hoạt động là do khả năng tạo phức không thuận nghịch với các amino acid ái nhân trong protein từ đó làm bất hoạt chức năng gây bệnh của protein trong vi sinh vật. Galangin có hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram dương cũng như nấm sợi và virus, đặc biệt là HSV-1 và Coxsackie B type I (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010). 1.2.3.5. Phenolic Phenolic là những hợp chất hóa học được tìm thấy ở khắp các chất màu của hoa quả được cấu tạo từ các tiểu đơn phân phenol, đa số được tổng hợp từ phenylalanine, ở thực vật nhóm phenolic chủ yếu được tìm thấy là caffeic acid (Một trong những hợp chất đơn giản có độc tinh sinh học được cấu tạo từ dẫn xuất thế vòng phenolic). Phenolic chủ yếu được phân thành 2 loại chính là phenolic acid và flavonoid polyphenol. Chủ yếu người ta dùng các loại thuốc thử Folin để xác định sự có mặt của phenolic. Phenolic có vai trò bảo vệ thực vật chống lại mầm bệnh và các động vật ăn cỏ, chất chống oxi hóa tự nhiên và tìm thấy trong táo, trà xanh, chống ung thư, ngăn ngừa bệnh tim và kháng viêm, một hợp chất phenolic khác là chlorogenic acid được biết như là chất gây ra viêm da dị ứng ở người. Một số hợp chất phenolic có hoạt tinh kháng khuẩn như eugenol là hợp chất phenolic có chứa 1 nhánh thế mà có carbon ở trạng thái oxy hóa thấp không chứa oxy được xem là chất kìm hãm đồng thời chống lại cả nấm sợi và vi khuẩn. Catechol và pyrogallol là hai hợp chất hydroxyl hóa của phenol cho thấy là có độc tính đối với vi 10
22. Đồ án tốt nghiệp sinh vật. Catechol có 2 nhóm OH và pyrogallol có 3 nhóm OH. Vị trí và số lượng các nhóm hydroxyl trên vòng phenol được xem như là có liên quan tới độc tính của chúng lên vi sinh vật, cụ thể là tăng sự hydroxyl hóa thì độc tính của chúng sẽ tăng lên. Ngoài ra, người ta còn nhận thấy rằng phenol ở trạng thái oxy hóa càng cao thì khả năng ức chế vi sinh vật càng tăng. Cơ chấ này được cho là nguyên nhân dẫn tới độc tính của các hợp chất phenolic này đối với vi sinh vật bao gồm sự ức chế enzyme bởi các hợp chất oxi hóa, có thể thông qua các phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua sự tương tác không đặc hiệu của các chất này đối với protein (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010). 1.2.3.6. Tannin Tannin là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino axit và alkaloid), có vị chát, tan trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, đa số không tan trong các dung môi hữu cơ, tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt). Có thể chia tannin làm hai loại tannin thủy phân được (Tannin pyrogalic) và tannin không thủy phân được (Tannin pyrocatechic). Tannin thủy phân được thì được thuỷ phân bằng acid (hoặc enzyme tanaza) tạo thành phần đường (glucose) và phần không đường (các acid), nối với nhau theo dây nối este, tủa xanh đen với muối sắt III, dễ tan trong nước, ví dụ: Ðại hoàng, Ðinh hương, lá cây Bạch đàn. Tannin không thủy phân được thì dễ tạo thành chất phlobaphen không tan, thường là chất trùng hợp từ catechin (hoặc từ leucoanthoxyanidin), (hoặc là những chất đồng trùng hợp của hai loại), tủa xanh với muối sắt III, ví dụ: Vỏ Quế, Canhkina, Ðại hoàng. Tannin thường được định tính bằng thử nghiệm Gelatin mặn, thử nghiệm chì acetate, thử nghiệm FeCl3, thử nghiệm KMnO4. Tannin có vai trò bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu, tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng, công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy. 11
23. Đồ án tốt nghiệp Cơ chế kháng khuẩn của tannin chủ yếu là là tạo phức với các protein gây bất hoạt chúng giống như ở flavonoid. Condensed tannin đã được xác định có thể liên kết với thành tế bào vi khuẩn có trong hệt tiêu hóa của động vật nhai lại, ngăn chặn sự sinh trưởng và ức chế hoạt tính của protease. Tính kháng khuẩn của tannin được tăng cường bởi tia UV ở bước sóng 320 tới 400 nm (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010). 1.2.3.7. Terpene Terpene là một nhóm chất lớn và đa dạng. Bộ khung carbon của terpene được tạo thành từ đơn vị cơ bản isoprene-C5H8, terpene có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài họ thông, theo Nguyễn Tiến Thắng (2011). Terpenenes có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, virus và các động vật nguyên sinh. Cơ chế kháng khuẩn của terpenenes được cho là liên quan tới sự phá vỡ màng tế bào bởi các hợp chất lipophilic. Các terpenoid hiện diện trong các loại tinh dầu thực vật có khả năng kiểm soát được Listeria monocytogenes. 1.2.4. Tình hình nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn ở thực vật trên thế giới và tại Việt Nam: Trong nghiên cứu của Anees và ctv (2009) thì 6 hợp chất có được từ cây Elephantopus.scaber trong quá trình cô đặc từ 2 loại dung môi n-hexane và methanol từ 3 phần khác nhau của cây gồm rễ, thân và lá thu được hợp chất stigmasterol, lupeol, stearic acid, đồng phân deoxyelephantopin, đồng đẳng 1 và 2 của deoxyelephantopin. Thành phần hóa học chính của cây Elephantopus mollis là elephantopin, triterpenes, stigmasterol epifriedelinol và lupeol (Consolacion, 2009). Cũng trong nghiên cứu này thì phần tan dichloromethane của lá E.mollis đã đưa ra phương pháp NMR quang phổ và theo đó đã tìm ra được các hợp chất sau: 2-deethoxy-2- hydroxyphantomolin, ester của acid béo và α amyrin, ester của acid béo và lupeol, stigmasterol. 12
24. Đồ án tốt nghiệp Kết quả của Chaghaby (2011) ghi nhận các dịch chiết khác nhau từ lá cây Annona Squamosa đều có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram dương mạnh hơn Gram âm. Kết quả của của Chaghaby dựa trên nghiên cứu của Chopra và Greenwood cho rằng vi khuẩn Gram âm ít bị ảnh hưởng nhiều bởi những chất có chiết xuất từ thực vật hơn so với vi khuẩn Gram dương là do chúng có một lớp màng ngoài bao gồm các lipoprotein và lipopolysaccharide cho phép chúng có khả năng điều hòa, vận chuyển các chất ra vào bên trong cơ cấu nội bào. Mỗi một dịch chiết đều thể hiện khả năng kháng ít nhất 6/27 chủng vi khuẩn chỉ thị, tuy nhiên những bất đồng được quan sát thấy ở những dịch chiết lên các chủng vi sinh vật là khác nhau. Sự khác nhau đó là do sự khác biệt giữa các hợp chất hóa học có trong mỗi loại dịch chiết, theo nghiên cứu của Doriane (2013). Trong nghiên cứu của Ibtisam (2011) đã thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết ethanol trên 6 loại cây gồm có Ginger (Zingiber officinale), Cinnamon (Cinnamomum verum), black cumin (Nigella sativa), Clove (Syzygium aromaticum) black pepper (Piper nigrum) và chamomile (Anthemis nobilis) để chống lại các chủng vi khuẩn Gram dương thông thường bao gồm Staphylococus aureus và Bacillus subtilis, các chủng vi khuẩn Gram âm Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và nấm men Candida albicans, kết quả ghi nhận dịch chiết của cây Syzygium aromaticum có khả năng ức chế mạnh đến sự phát triển của Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa và Candida albicans, dịch chiết cây Cinnamomum verum có khả năng ức chế mạnh đến sự phát triển của Bacillus subtilis và Candida albicans, còn dịch chiết của những cây còn lại ở mức trung bình. Nghiên cứu của Lê Thị Bích Uyên (2007) trên cây Aloe vera và Mirabilis jalapa L cho thấy dịch chiết ethanol của cây lô hội Aloe vera ngoài tự nhiên có khả năng kháng được các chủng vi khuẩn E.coli, Pseudomonas aeruginosa và không có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Staphylococcus và nấm Candida albicans, tuy nhiên dịch chiết của Aloe vera ngoài tự nhiên cho khả năng kháng rất yếu chủ yếu là ức chế cho vòng kháng mờ và nhỏ, dịch chiết trong ethanol của cây lô hội invitro có khả năng kháng được chủng vi khuẩn E.coli, Pseudomonas aeruginosa và 13
25. Đồ án tốt nghiệp Staphylococcus, với khả năng kháng cao hơn. Cũng trong nghiên cứu trên thì dịch chiết ethanol của mô sẹo cây hoa phấn tự nhiên Mirabilis jalapa L. và cây hoa phấn invitro có khả năng kháng chủng vi khuẩn E.coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus. 1.3. Ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của thực vật: Theo kết quả nghiên cứu của Antara Sen (2012) thì dịch chiết của cây Melia azedarach L trên tất cả các hệ dung môi ethanol, methanol, petroleum ether và nước đều có khả năng kháng lại các chủng vi khuẩn gây bệnh cho người đã được phân lập trước đó bao gồm Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, và Pseudomonas aeruginosa. Nghiên cứu trên chỉ ra rằng dịch chiết của cây thu được nhờ hệ dung môi Petroleum ether cho kết quả dối kháng tốt với tất cả các chủng. Cùng với đó trong một nghiên cứu khác của Murugesan (2011) trên cây Memecylon umbellatum thì dịch chiết của cây này trong dung môi Petroleum ether có hoạt tính tốt lên các chủng vi sinh vật chỉ thị. Từ dịch chiết trên ông thu nhận sự có mặt của amino acid, carbonhydrate, flavonoid, protein, nhóm hợp chất phenolic, saponin và steroid. Ngoài ra, dịch chiết nước từ lá của cây Pterospermum acerifolium trong nghiên cứu của Thatoi (2008) còn có hoạt tính kháng khuẩn nổi bật chống lại một số chủng vi khuẩn gây bệnh Gram dương và Gram âm. Dịch chiết của lá cây Bryophyllum pinnatum và Kalanchoe crenata trong nghiên cứu của Aibinu (2007) sử dụng bào gồm 5 loại dịch chiết: nước, methanol và các loại dịch chiết địa phương bao gồm rượu dừa, gin và “omi ekan-ogi”, các loại dịch chiết của 2 loại cây trên được thử hoạt tính chống lại một số chủng vi sinh vật Gram âm Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Salmonella paratyphii, Citrobacter spp, các chủng Gram dương Staphylococcus aureus ATCC 25213, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis và nấm Candida albicans, trong nghiên cứu 14
26. Đồ án tốt nghiệp này phương pháp đục lỗ thạch và phương pháp pha loãng ống nghiệm dùng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu từ nồng độ 4mg/ml tới 512 mg/ml, dịch chiết của cây Kalanchoe crenata cho kết quả kháng tốt nhất với chủng Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Bacillus subtilis tại nồng độ 8 mg/ml, Shigella flexneri tại 32 mg/ml, 64 mg/ml với Escherichia coli và 128 mg/ml đối với Staphylococcus aureus trong khi kết quả MBC là 256 mg/ml đối với chủng Bacillus subtilis và Klebsiella pneumoniae, các chủng Gram dương thì khá nhạy cảm với dịch chiết methanol và dịch chiết địa phương gin của cây Bryophyllum pinnatum, còn lại những dịch chiết khác cho kết quả kháng khuẩn yếu hơn. Qua các nghiên cứu trên có thể nhận thấy dung môi có ảnh hưởng lên hoạt tính kháng khuẩn, do khả năng lôi kéo các hợp chất có khả năng kháng khuẩn trong cùng mội loài cây là khác nhau điều đó dẫn tới khả năng kháng khuẩn giữa chúng cũng khác nhau. 1.4. Giới thiệu một số nhóm vi sinh vật gây bệnh 1.4.1. Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 1.4.1.1. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Escherichia a) Đặc điểm Escherichia là một loài vi khuẩn Gram âm hình que, kị khí tùy nghi, không sinh bào tử. Nhiệt độ thích hợp 370C, pH 7.2-7.4. Sống chủ yếu hội sinh trong đường ruột của người và động vật. chúng được biết đến như là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm trùng đường tiết niệu và các bệnh đường tiêu hóa. Đơn cử là Escherichia coli (Trần Văn Cường, 2009). Hình 1.5. Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử 15
27. Đồ án tốt nghiệp Escherichia phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy phổ thông. Môi trường thạch thường: hình thành khuẩn lạc tròn ướt, lồi, bóng láng, màu trắng xám hơn đục, đường kính 2-3mm. Môi trường MacConkey khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn, lồi, không làm chuyển màu môi trường. Môi trường thạch máu khuẩn lạc Escherichia to, bóng, lồi, màu xám nhạt. một số chủng có khả năng gây hiện tượng tan máu. Môi trường Simmon citrat khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục. Môi trường Endo khuẩn lạc màu đỏ. Môi trường EMB khuẩn lạc có ánh kim tím. Hình 1.6. Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB Đặc điểm sinh hóa dòng Escherichia: do chúng có phản ứng lên men đường nên dòng Escherichia cụ thể là E. coli lên men sinh hơi các loại đường lactose, fructose, glucose, levulose, galactose, xylose, manitol; lên men không chắc chắn các loại đường duncitol, saccarose và salixin. Ngoài ra chúng còn có một số phản ứng sinh hoá khác như phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứng H2S, VP, Urea âm tính (Trần Văn Cường, 2009). b) Khả năng gây bệnh Escherichia sản sinh nhiều loại độc tố: Enterotoxin, vertoxin, neurotoxin. Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra (Trần Văn Cường, 2009). 1.4.1.3. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Vibrio: a) Đặc điểm Vibrio là trực khuẩn Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0.3-0.5 x 1.4-2.6 μm. Chúng không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiên 16
28. Đồ án tốt nghiệp mao hoặc nhiều tiên mao mảnh, kỵ khí tùy nghi. Chúng phát triển tốt trong môi trường dinh dưỡng thường và môi trường kiềm (pH >7) vibrio có thể sống được vài ngày đến 2-3 tuần. Dễ bị diệt bởi nhiệt độ (80°C/5 phút), bởi hoá chất thông thường và môi trường axit. nhiệt độ thích hợp là 370C, có thể phát triển tốt trong môi trường kiềm (pH 8,5 - 9,5), có nồng độ NaCl cao (3%) (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2006). Hình 1.7. Hình thái Vibrio trên kính hiển vi điện tử Trong môi trường pepton kiềm mọc nhanh và tạo váng. Trên môi trường thạch kiềm sau 18h có thể quan sát thấy khuẩn lạc tròn, lồi nhẵn và trong suốt. Trên thạch MacConkey khuẩn lạc trong (không lên men đường lactose). Trên môi trường TCBS khuẩn lạc có màu vàng vì lên men đường sucrose, trên môi trường ChromAgar khuẩn lạc V.parahaemolyticus có màu tím hoa cà. V.vulnificus và V.cholerae có màu xanh lá cây chuyển sang màu xanh ngọc, V.alginolyticus không màu (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2006). Hình 1.8. Khuẩn lạc Vibrio trên môi trường Chrom agar 17
29. Đồ án tốt nghiệp Nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và catalase dương tính (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2006). b) Khả năng gây bệnh: Vibrio gây bệnh bằng độc tố ruột (choleragen). Đây là nội độc tố có cấu trúc gồm hai đơn nguyên: đơn nguyên A (trọng lượng phân tử là 27 000 dalton, mang độc tính cao) và đơn nguyên B có tính kháng nguyên đặc hiệu và một cầu nối A2 có tác dụng kích thích tăng cAMP (Adenosin 3,5-cyclic mono phosphat). Độc tố ruột gắn vào niêm mạc ruột non, hoạt hoá enzyme adenylcyclase dẫn đến tăng cAMP, làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết Cl- và nước gây tiêu chảy cấp tính theo Nguyễn Hoàng Tuấn và ctv (2012). 1.4.1.2. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Salmonella a) Đặc điểm Salmonella là trực khuẩn Gram âm kị khí chịu oxy, hình que, có khả năng di động, kích thước 0.4 – 0.6 x 1 – 3 μm thích hợp phát triển tốt ở nhiệt độ 370C, pH 7.2-7.6 (Trần Văn Cường, 2009). Hình 1.9. Hình thái Salmonella trên kính hiển vi điện tử Salmonella được nuôi cấy trên các môi trường: Môi trường canh thịt: môi trường bị đục, sinh cặn ở đáy ống nghiệm, có mùi thối. Môi trường SS (Salmonella – Shigella): Do không lên men đường lactose, khuẩn lạc ở dạng trong hoặc không màu. Môi trường Endo: khuẩn lạc có màu vàng. Môi trường thạch EMB: khuẩn lạc có màu 18
30. Đồ án tốt nghiệp đỏ. Môi trường XLD khuẩn lạc tròn lồi trong suốt có tâm đen đôi khi tâm đen lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ (Trần Văn Cường, 2009). Hình 1.10. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD b) Khả năng gây bệnh Salmonella cũng có khả năng sản sinh ra độc tố enterotoxin, ngoài việc phá hủy lớp niêm mạc ruột, độc tố này cũng có tác động gây tiêu chảy, độc tố thẩm xuất chậm (DPF - Delayed Permeability Factor – Độc tố không chịu nhiệt) và độc tố thẩm xuất nhanh (RPF - Rapid Permeability Factor - Độc tố chịu nhiệt) (Trần Văn Cường, 2009). 1.4.1.4. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Shigella: a) Đặc điểm Shigella là trực khuẩn Gram âm mảnh dài 1-3 micromet, rộng 0,5-0,6 micromet, không có tiên mao, vì vậy không có khả năng di động, không có vỏ không sinh bào tử, Shigella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 370C (Chang Tran, 2014). 19
31. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.11. Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử Trong môi trường lỏng Shigella làm đục đều môi trường. Trên môi trường đặc SS (Salmonella- Shigella) sau 24h khuẩn lạc có đường kính khoảng 2mm, tròn lồi mặt nhẵn bờ đều (Chang Tran, 2014). Hình 1.12. Khuẩn lạc Shigella trên môi trường Macconkey Shigella lên men glucose không sinh hơi, lên men manitol (trừ Shigella dysenteriae không lên men manitol), hầu hết Shigella không lên men lactose, chỉ có Shigella sonnei lên men lactose nhưng chậm. Không sinh H2S, Urease âm tính phản ứng Indol thay đổi, phản ứng đỏ metyl dương tính, phản ứng VP âm tính, phản ứng citrat âm tính (Chang Tran, 2014). b) Khả năng gây bệnh: Các shigella đều có độc ruột (enterotoxin) là ShET-1 và ShET-2 chúng làm thay đổi sự vận chuyển điện giải ở các tế bào niêm mạc đại tràng, gây tăng tiết dịch. 20
32. Đồ án tốt nghiệp Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc tính mạnh nhưng tính kháng nguyên yếu. Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản ứng tại ruột. Ngoại độc tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của Vibrio cholerae 01 và ETEC, hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn Shiga là tác dụng độc đối với tế bào. Shigella gây bệnh lỵ trực khuẩn ở người, đây là một bệnh truyền nhiễm có thể gây thành các vụ dịch địa phương và thương tổn đặc hiệu khu trú ở ruột già, trên lâm sàng biểu hiện bằng hội chứng lỵ với các triệu chứng như đau bụng quặn, đi ngoài nhiều lần, phân có nhiều nhầy và thường có máu. Shigella gây bệnh bằng cơ chế xâm nhập vào tế bào biểu mô của niêm mạc ruột và nhân lên với số lượng lớn trong tổ chức ruột. Các Shigella đều có nội độc tố. Riêng trực khuẩn Shiga còn có thêm ngoại độc tố bản chất là protein. Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc tính mạnh nhưng tính kháng nguyên yếu. Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản ứng tại ruột. Ngoại độc tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của Vibrio cholerae 01 và ETEC, hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn Shiga là tác dụng độc đối với tế bào (Chang Tran, 2014). 1.4.2. Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da 1.4.2.1. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas a) Đặc điểm Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Đặc điểm hình thái học chung của Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử.Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen (Trần Quang Cảnh, 2012). 21
33. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.13. Hình thái Pseudomonas trên kính hiển vi điện tử Pseudomonas aeruginosa mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp 370C nhưng phát triển được ở nhiệt độ 5 - 420C, pH thích hợp 7,2 – 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0. Trên môi trường đặc: khuẩn lạc thường to giống như quả trứng ốp (fried eggs), nhẵn, dẹt, trung tâm lồi, có màu xanh ánh kim và có xu hướng mọc lan. Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc mọc gây tan máu hoàn toàn (β) (Trần Quang Cảnh, 2012). Một số đặc điểm sinh hóa chính của Pseudomonas aeruginosa như không lên men glucose, có khả năng thủy giải gelatin, khử nitrate, oxidase dương tính, sản xuất hydrogensulphide từ thiosulphate, sản xuất 2-keto-D-gluconateacid từ D-gluconate, sử dụng glycerol, succinate,L-arabinose, formate, acetate, lactose, xylose, mannitol, rhamnose, P-arabinose, trehalose, cellobiose, inositol, sucrose (Trần Quang Cảnh, 2012). Hình 1.14. Khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa trên môi trường thạch thường b) Khả năng gây bệnh 22
34. Đồ án tốt nghiệp Độc tính của chủ yếu là exotoxin của vi sinh vật bao gồm loài Pseudomonas đuợc biết là gây độc trên ấu trùng của loài muỗi cũng như lòai sâu bọ cánh phấn. Pseudomonas fluorescens gây chết loài muỗi ở giai đọan ấu trùng, nhộng, và theo nghiên cứu loài này cũng gây độc tố đối với họ nhà bay. Mặc dù phuơng thức hoạt động của độc tố này chưa đuợc hiểu rõ, những loại độc tố như của P. aeruginosa đuợc hấp thụ hấp thụ qua biểu bì của loài côn trùng và họat động trên protein tan huyết. Dịch formulation (VCRC B426) từ sự trao đổi chất của P. fluorescens tiết ra như là phuơng pháp đuợc sử dụng để chống lại loài muỗi (Nguyễn Thị Như Yến và ctv, 2011). 1.4.2.2 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus (E.faecalis) a) Đặc điểm Hình 1.15. Hình thái Enterococcus faecalis trên kính hiển vi điện tử Enterococcus faecalis là vi khuẩn Gram dương kỵ khí tùy nghi, vi khuẩn phát triển tốt hơn ở điều kiện khí trường có thêm 5-10% CO2 và thường đòi hỏi môi trường nuôi cấy có nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh, đường. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 370C, một số phát triển được ở 10 tới 400C (Dương Văn Sĩ, 2010). Khuẩn lạc có màu hồng tới đỏ đậm khi nuôi cấy trong môi trường azide tetrazolium chứa triphenyl tetrazolium chloride (TTC), trên môi trường thạch máu thì khuẩn lạc tròn, lồi, bóng khô, có màu hơi xám trong. Có phản ứng catalase và oxidase âm tính, có khả năng lên men đường glucose, sinh acid làm giảm pH môi trường (Dương Văn Sĩ, 2010). 23
35. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.16. Khuẩn lạc Enterococcus faecalis trên môi trường thạch máu BA b) Khả năng gây bệnh Enterococcus faecalis là nguyên nhân dẫn tới viêm họng, viêm hạch có mủ, viêm khớp, viêm thận cấp tính, viêm các van tim. Gây đau dạ dày và mùi hôi ở cổ họng (Dương Văn Sĩ, 2010). 1.4.2.3. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus Staphylococcus là các cầu khuẩn Gram dương không tạo nha bào có đường kính khoảng 1 μm, không di động và sắp xếp theo mọi hướng và thường tạo thành cụm (tụ) trông giống như chùm nho. Staphylococcus chủ yếu phân thành 2 nhóm: Staphylococcus có enzyme coagulase: Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius và Staphylococcus không có enzyme coagulase: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus simulans, Staphylococcus hominis, Staphylococcus warneri. a) Đặc điểm Staphylococcus thuộc loại vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Staphylococcus có khả năng phát triển được ở khoảng nhiệt độ dao động từ 10 tới 450C và môi trường có nồng độ muối cao tới 10% (Trần Quang Cảnh, 2012). 24
36. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.17. Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử Trên môi trường thạch thường khuẩn lạc dạng S, đường kính 1 - 2mm, sau 24 giờ khuẩn lạc có màu vàng rơm (đối với Staphylococcus aureus) hoặc có màu trắng (đối với các loại Staphylococcus khác) (Trần Quang Cảnh, 2012). Trên môi trường thạch máu Staphylococcus phát triển nhanh: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, tan máu hoàn toàn, có màu vàng. Khuẩn lạc tụ cầu khác: dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, có màu trắng và thường không gây tan máu, khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm, có màu đen bóng,lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc một số dòng S. Aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc (Trần Quang Cảnh, 2012). Hình 1.18. Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường Baird Parker bổ sung egg yolk 25
37. Đồ án tốt nghiệp b) Khả năng gây bệnh Gây bệnh nhờ yếu tố độc lực nội bào: Staphylococcus aureus còn sản xuất nhiều yếu tố độc lực có liên quan đến cấu tạo của vách vi khuẩn. Vỏ polysaccharide: một số chủng Staphylococcus có thể tạo vỏ polysaccharide. Vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào. Hầu hết các chủng Staphylococcus aureus đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt (protein A) có khả năng gắn với mảnh Fc của các globuline miễn dịch. Chính nhờ hiện tượng gắn độc đáo này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống. Vì mảnh Fc của các globuline miễn dịch có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hóa: chúng là các receptor cho các đại thực bào. Quá trình gắn trên giúp Staphylococcus aureus tránh không bị thực bào bởi đại thực bào. Ngoài ra phần lớn các chủng tụ cầu đều có khả năng sản xuất một chất kết dính gian bào. Nhờ chất này, vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc (Trần Quang Cảnh, 2012). Gây bệnh nhờ yếu tố độc lực ngoại bào: Ngoài coagulase và yếu tố kết cụm thì Staphylococcus còn sản xuất một số enzyme quan trọng góp phần tạo nên độc lực mạnh mẽ của chủng vi khuẩn này, cụ thể như hyaluronidase là một enzyme có khả năng phá hủy mô liên kết của tổ chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong cơ thể. Hemolysine và leukocidine: phá hủy hồng cầu (tan máu) và gây chết các tế bào bạch cầu hạt cũng như đại thực bào. Exfoliatine: là các enzyme phá hủy lớp thượng bì. Enzyme này gây tổn thương da tạo các bọng nước. Ví dụ điển hình là hội chứng Lyell do tụ cầu. Sáu độc tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E, F) đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm. Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc là nguyên nhân gây nên hội chứng sốc nhiễm độc, một hội chứng sốc trầm trọng. Hầu hết các chủng Staphylococcus đều sản xuất được men penicillinase (beta- lactamase). Enzyme này phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng (Trần Quang Cảnh, 2012). 26
38. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm 2.1.2. Thời gian Đề tài được thực hiện từ tháng 05/2015 đến 08/2015 2.1.1. Địa điểm Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường đại học Công Nghệ TP. HCM. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguồn mẫu Cây Elephantopus sp. được lấy từ vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà - Lâm Đồng. 2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị Vi sinh vật chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu là 20 chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Viện vệ sinh y tế công cộng, trường đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II bao gồm: Nhóm vi khuẩn Escherichia coli: Escherichia coli O157:H7, Escherichia coli 0208, Escherichia coli và Enterotoxigenic E.coli-ETEC Nhóm vi khuẩn Listeria: Listeria innocua và Listeria monocytogenes Nhóm vi khuẩn Salmonella: Salmonella dublin, Salmonella enteritidis, Salmonella typhii và Salmonella typhimurium, Nhóm vi khuẩn Shigella: Shigella boydii, Shigella flexneri và Shigella sonnei Nhóm vi khuẩn Vibrio: Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio harveyi và Vibrio parahaemolyticus Nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da khác: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và Enterococcus feacalis. 27
39. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.3.1. Hóa chất - Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ). - Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ). - Ethanol (Việt Nam) - DMSO (Dimethy lsulfoxide) (Trung Quốc) - Ciprofloxacin (Việt Nam) - Các loại thuốc thử : Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendroff, Hager, Wagner, Ninhydrin, NaOH, NaCl, chì acetate, acetic anhydride, gelatin, chloroform, ferric chlodride, H2SO4 đậm đặc. 2.2.3.2. Dụng cụ và thiết bị a) Dụng cụ - Micropipet (100-1000 μl), (10-100 μl) - Erlen (250 ml), (500 ml) - Que cấy trang, que cấy vòng - Đĩa petri - Ống nghiệm - Bình môi trường 250 ml, 500 ml - Efpendoff (2 ml) - Becher (100ml), (250 ml), (500 ml), - Các loại dụng cụ khác như: Đầu típ các loại, đũa thủy tinh, đèn cồn dao, kéo, thước đo, bao chịu nhiệt, bông thấm và bông không thấm nước, thun, muỗng, b) Thiết bị 28
40. Đồ án tốt nghiệp Cân phân tích (Orbital - Gemany), bếp từ (Billy - England), máy ly tâm (Tuttligen - Germany), tủ ấm (Memmert - Gemany), Autoclave (Huxky - Taiwan), máy cô quay chân không (Hahn shin - Korea), máy đông khô (Virtis - USA), máy tạo nước cất (Branstead - USA), máy lắc (IKA - Germany). 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp xử lý và tách chiết hợp chất kháng khuẩn Mục đích: Tách chiết các hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật nhằm phục vụ cho các nghiên cứu về sau. Nguyên tắc: Sử dụng các loại dụng môi để tách chiết các hợp chất có trong cây thuốc nhờ lực liên kết hóa học nhờ đó ta có thể lôi kéo các chất cần thiết ra khỏi mẫu cây thuốc. Mẫu cây thuốc tươi được rửa sạch để lọai bỏ bụi bẩn sau đó đem đi phơi khô rồi nghiền thành dạng bột. Bột cây thuốc sẽ được ngâm để trích ly hợp chất với methanol trong 24 giờ và lặp lại từ 3 đến 5 lần cho đến khi dịch chiết đã hoàn toàn trong suốt. Dịch chiết sẽ được loại bỏ dung môi methanol để giữ lại phần cao chiết bằng cách cô quay chân không ở nhiệt độ nhỏ hơn 50oC. Cao chiết thu được sẽ được chia vào trong chai và bảo quản ở nhiệt độ -4oC (Atta và Mouneir, 2004) 2.4.2. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị Mục đích: giúp tăng nhanh sinh khối của vi sinh vật chỉ thị đến số lượng cần thiết để phục vụ cho thí nghiệm ngoài ra còn giúp hoạt hóa vi khuẩn trở về với trạng thái bình thường sau khi bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Nguyên tắc: sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những phải chứa đầy đủ các thành phần đa lượng và vi lượng để vi sinh vật phát triển mà phải đảm bảo có đủ các điều kiện lý hóa thích hợp để vi sinh vật thực hiện trao đối chất với môi trường. Đối với các giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật được chỉ thị giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy 29
41. Đồ án tốt nghiệp sinh khối vi khuẩn cho vào chai thủy tinh chứa 10ml môi trường TSB. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/ phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thùy Trang, 2013). 2.4.3. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyễn tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng rất cần thiết trong hầu hết các thí nghiệm . Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình phân tích nhờ đó giúp nâng cao được tính chính xác của các thí nghiệm. Đối với mẫu lỏng: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào các ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng để tạo nồng độ pha loãng 10-1 . Tiếp tục hút 1 ml dịch từ ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-1 vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ 10-2. Tiếp tục pha loãng theo nguyên tắc trên cho đến khi đạt được nồng độ cần thiết. Đối với mẫu rắn: Cân chính xác 10 gram mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-1. Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1 ml dịch pha loãng ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ 10-2. Tiếp tục thực hiện tương tự cho đến khi được nồng độ cần thiết, (Nguyễn Thúy Hương, 2011). 2.4.4. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật chỉ thị 2.4.4.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản nhất, các chủng vi sinh vật được cấy trên muôi trường thạch nghiêng và ủ ở điều kiện phù hợp cho chủng vi sinh vật phát triên. Sau đó các chủng vi sinh vật được chuyển vào tủ mát có nhiệt độ từ 3-5oC để bảo quản. Quá trình này được lặp đi lặp lại sau một thời gian nhất định để đảm bảo vi sinh vật không bị già và chết .Thời gian chu kỳ cấy chuyển của từng chủng vi sinh vật là khác nhau, tuy nhiên thời gian tối đa có thể đạt được của phương pháp này là 3 tháng một lần. 30
42. Đồ án tốt nghiệp Đối với giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật chỉ thị: cấy chuyền định kỳ 1 tháng/ lần trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và bảo quản ở nhiệt độ 4oC (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.4.4.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng còn có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Nguyên nhân dẫn đến việc tế bào bị vỡ là do sự tích lũy các chất diện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước đâm thủng tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol. Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm để loại bỏ dịch và thu căn chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ -15oC (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.4.5 Phương pháp tách các phân đoạn từ cao tổng methanol Nguyên tắc: Phương pháp tách chiết các phân đoạn từ cao tổng chủ yếu nhờ vào khả năng lôi kéo khác nhau của các hệ dung môi một cách có trình tự và liên tiếp theo chu kỳ trên cùng một mẫu nhằm phân tích chi tiết hơn thành phần hóa học chứa trong cao tổng. Quá trình phân tách dung môi được thực hiện dựa trên phương pháp của Martins và ctv (2013) và được tiến hành với quy trình như sau: Đầu tiên lần lược cho các dung môi n-hexan, ethyl acetate và 1-butanol và mẫu với tỷ lệ 1:1 vào bình lắng. Sau đó lắc đều và chờ tách lớp. Phần dịch chiết được thu nhận và lưu trữ. Lặp lại các bước này từ 4 tới 6 lần với các hệ dung môi khác nhau. Phần dịch chiết cuối cùng thu nhận được là phân đoạn của nước. 2.4.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 31
43. Đồ án tốt nghiệp Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết dựa trên phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của (Aibinu và ctv, 2007) các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết khuếch tán vào trong môi trường agar và tác động lên vi khuẩn chỉ thị. Nếu các hợp chất trong cây có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Phương pháp được thực hiện như sau: Hút dịch vi khuẩn chỉ thị có mật độ 106 cfu/ml để trang trên đĩa TSA. Sau khi trang đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút đợi đĩa khô. Sau đó dùng cây đục lỗ đã hấp khử trùng đục 3 lỗ mỗi đĩa thạch, dùng kim đã hấp tiệt trùng ghim các khối thạch ra bỏ. Dùng 100 µl dịch vi khuẩn cần khảo sát, nhỏ vào mỗi lỗ trên đĩa thạch vừa tráng vi khuẩn chỉ thị, tiến hành dán parafilm để tránh nhiễm. Đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 37oC trong 24 giờ và đo đường kính vòng kháng khuẩn. 2.4.7. Phương pháp xác định chỉ số MIC Phương pháp xác định chỉ số MIC của cao chiết dựa trên phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của (Aibinu và ctv, 2007) tại các nồng độ cao chiết khác nhau, các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết khuếch tán vào trong môi trường agar cũng khác nhau và cùng tác động lên vi khuẩn chỉ thị. Nồng độ cao chiết thấp nhất mà tại đó chúng bắt đầu có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch gọi là nồng độ ức chế tối thiểu. Phương pháp được thực hiện như sau: Hút dịch vi khuẩn chỉ thị có mật độ 106 cfu/ml để trang trên đĩa TSA. Sau khi trang đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút đợi đĩa khô. Sau đó dùng cây đục lỗ đã hấp khử trùng đục 3 lỗ mỗi đĩa thạch, dùng kim đã hấp tiệt trùng ghim các khối thạch ra bỏ. Hút 100 µl dịch cao chiết với nồng độ khác nhau, nhỏ vào các lỗ trên đĩa thạch vừa tráng vi khuẩn chỉ thị, tiến hành dán parafilm để tránh nhiễm. 32
44. Đồ án tốt nghiệp Đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 37oC trong 24 giờ và đo đường kính vòng kháng khuẩn. 2.4.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học Phương pháp xác định thành phần hóa học dựa theo phương pháp của Yadav và ctv (2013) nhằm định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết từ cây Elephantopus sp. bằng các phản ứng với thuốc thử đặc trưng dựa trên tính chất hóa học của chúng bao gồm các thử nghiệm: Định tính thành phần carbohydrate bằng phản ứng với các loại thuốc thử Molisch, Fehling và Barfoed. Định tính thành phần alkaloid bằng phản ứng với các loại thuốc thử Mayer, Dragendroff , Hager và Wagner. Định tính thành phần saponin bằng phản ứng tạo bọt. Định tính thành phần anthraquinone glycosides bằng phản ứng Bontrager. Định tính thành phần flavonoid bằng phản ứng alkaline, phản ứng Shinoda, phản ứng ferric chloride. Định tính thành phần phenolic bằng phản ứng với chì acetate và phản ứng với gelatin. Định tính thành phần tannin bằng phản ứng với chì acetate và phản ứng với ferric chloride. Định tính thành phần steroids bằng phản ứng Salkowski và phản ứng Libermann – Burchard. Định tính thành phần amino acid bằng phản ứng với thước thử Ninhydrin Phương pháp xác định thành phần hóa học dựa theo phương pháp của (Phani Deepthi Yadav và ctv, 2013). 2.4.9. Phương pháp xử lý số liệu 33
45. Đồ án tốt nghiệp Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft® Excel® 2013 (15.0.4745.1000) và phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey 2.5. Bố trí thí nghiệm Mẫu Elephantopus sp Xử lý mẫu tạo cao chiết methanol Cao tổng methanol từ cây Elephantopus sp. Xác định chỉ số MIC Định tính một số thành Kiểm tra hoạt tính kháng và MBC của cây phần hóa học có trong khuẩn cao chiết Elephantopus sp. cây Elephantopus sp. tách chiết các phân đoạn Phân đoạn HF, BF, EF, và WF từ cao tổng methanol 2.5.1. Thí nghiệm 1: Thu nhận cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp. 2.5.1.1. Quy trình 34
46. Đồ án tốt nghiệp Mẫu cây Elephantopus sp. Phơi khô, xay bột. Ngâm trong dung môi methanol x 3 75% theo tỷ lệ 1:15 (w/v) bã sử dụng máy cô quay chân không và máy đông khô Cao chiết methanol Elephantopus sp. 2.5.1.2. Thuyết minh quy trình Mẫu cây Elephantopus sp. thu thập từ vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà được phơi khô từ 3 - 5 ngày sau đó toàn cây được đem đi xay thành bột. Một phần bột được đem bảo quản ở nhiệt độ 40C. Phần còn lại đem đi ngâm với dung môi methanol 75% theo tỷ lệ 1:15 trong vòng 24 giờ. Sau đó ly tâm 4000 v/p trong 10 phút thu được dịch lần 1, bã còn lại tiếp tục được ngâm với methanol 75% theo tỷ lệ 1:15 trong 24 giờ và ly tâm được dịch lần 2, làm tương tự thu được dịch lần 3. Tiến hành cô quay chân không ở 500C tới khi thu được thể tích không đổi. Lượng dịch này sau đó được đông khô ở -200C trong 3 ngày thu được cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp. 35
47. Đồ án tốt nghiệp 2.5.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol từ cây Elephantopus sp. 2.5.2.1 Quy trình Vi sinh vật chỉ thị Cao tổng methanol Tăng sinh trong môi trường TSB Pha dịch chiết có nồng độ Lắc 150 vòng/phút trong 18 giờ 100 mg/ml Đo quang phổ ở 600 nm và pha loãng VSV trong nước muối sinh lý VSV đạt nồng độ 106 cfu/ml Cấy trang lên môi trường TSA Nhỏ 100 μl dịch chiết (100mg/ml) vào các giếng trên môi trường TSA 0 Ủ 37 C trong 24 giờ Đọc kết quả 2.5.2.2. Thuyết minh quy trình Vi sinh vật chỉ thị bảo quản lạnh ở nhiệt độ 40C được lấy tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi trường TSB được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau đó môi trường TSB chứa vi sinh vật được lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 18 giờ. 36
48. Đồ án tốt nghiệp Sau khi tiến hành đo quang phổ bước sóng 600 nm, các chai môi trường được pha loãng theo dãy thập phân trong ống nước muối sinh lý vô trùng sao cho mật độ vi sinh vật đạt 106 cfu/ml. Hút 0.1 ml dịch khuẩn cho vào đĩa môi trường thạch TSA, tiến hành trang dịch vi khuẩn trên đĩa cho tới khi khô hoàn toàn. Các đĩa thạch sau đó được đục lỗ tạo thành các miệng giếng bằng một ống kim loại hình trụ thẳng, không gỉ có đường kính 6 mm, khoảng cách giữa các lỗ được tính toán từ trước sao cho cân bằng và khoảng cách giữa các vòng kháng không trùng lên nhau. Các công đoạn trên được thực hiện trong điều kiện vô trùng với ngọn lửa đèn cồn. Cao chiết methanol Elephantopus sp. trữ lạnh được cân và hòa với DMSO 1% sao cho thu được dịch chiết methanol 100 mg/ml. Sử dụng micropipet hút chính xác 100 μl dịch chiết và nhỏ vào các giếng trong đĩa môi trường TSA đã được đục lỗ trước đó thí nghiệm được lặp lại 3 lần trên mỗi chủng vi sinh vật chỉ thị. Các thao tác trên đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Đuờng kính vòng kháng khuẩn được xác định sau khi ủ các đĩa TSA ở 370C trong vòng 24 giờ. Hình 2.1. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết methanol 75% (100 mg/ml) đối với chủng Escheriachia coli (trái) và Shigella flexneri 2.5.3. Thí nghiệm 3: Tách chiết các phân đoạn từ cao tổng methanol 75% từ cây Elephantopus sp. 2.5.3.1. Quy trình 37
49. Đồ án tốt nghiệp Cao tổng methanol 75% từ cây Elephantopus sp. n-hexan Phân đoạn hexan x3 ethyl acetate Phân đoạn ethyl acetate 1-butanol Phân đoạn butanol nước Phân đoạn nước bã 2.5.3.2. Thuyết minh quy trình Cao tổng methanol 75% được ngâm lần lượt với dung môi n-hexan, ethyl acetate, 1-butanol và nước theo tỷ lệ 1:1 vào trong bình lắng. Lắc đều và chờ tách lớp. Thu phần dịch chiết lần lượt của các phân đoạn hexan, ethyl acetate, butanol và nước, bã thu được tiếp tục ngâm lặp lại với các dung môi, quy trình được lặp lại từ 4 tới 6 lần để các chất trong cao tổng ngấm kiệt vào dung môi các phân đoạn. 2.5.4. Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn của cao tổng methanol Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của 4 phân đoạn từ cao tổng methanol bao gồm hexan fraction, butanol fraction, ethyl acetate fraction và water fraction được thực hiện giống với quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol nhưng được thực hiện với các nồng độ như sau: HF (20 mg/ml), BF (50 mg/ml), EF (40 mg/ml) và WF (50 mg/ml). 38
50. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2. Hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn hexan (20 mg/ml) (trái) và butanol (50 mg/ml) (phải) đối với chủng Escheriachia coli (trái) và Shigella flexneri (phải) 2.5.5. Thí nghiệm 5: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao tổng methanol Elephantopus sp. 2.5.5.1. Quy trình Vi sinh vật chỉ thị Cao tổng methanol Tăng sinh trong môi trường TSB Lắc 150 vòng/phút trong 18 giờ Pha dãy nồng độ dịch chiết theo hệ số pha loãng là 2 Đo quang phổ ở 600 nm và pha loãng VSV trong nước muối sinh lý (106cfu/ml) Cấy trang lên môi trường TSA Nhỏ 100 μl dịch chiết mỗi nồng độ vào các giếng trên môi trường TSA 0 Ủ 37 C trong 24 giờ Đọc kết quả 39
51. Đồ án tốt nghiệp 2.5.5.2 Thuyết minh quy trình Cao chiết methanol được cân và ngâm trong DMSO 1% theo dãy nồng độ 100, 50, 25, 12.5 mg/ml với hệ số pha loãng bằng 2 vào mỗi chai thủy tinh đã được hấp khử trùng trước đó Vi sinh vật chỉ thị bảo quản lạnh ở nhiệt độ 40C được lấy tăng sinh trong chai chứa 10 ml môi trường TSB đã được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau đó môi trường TSB chứa vi sinh vật được lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 18 giờ. Tiến hành đo quang phổ bước sóng 600 nm bằng máy đo quang phổ. Các chai môi trường sau đó được pha loãng theo dãy thập phân trong ống nước muối sinh lý vô trùng sao cho mật độ vi sinh vật đạt 106 cfu/ml. Hút 0.1 ml dịch khuẩn cho vào đĩa môi trường thạch TSA, tiến hành trang dịch vi khuẩn trên đĩa cho tới khi khô hoàn toàn. Các đĩa thạch sau đó được đục lỗ tạo thành các miệng giếng bằng một ống kim loại hình trụ thẳng, không gỉ có đường kính 6 mm, khoảng cách các lỗ được tính toán từ trước sao cho cân bằng và khoảng cách giữa các vòng kháng không trùng lên nhau. Dùng micropipet hút chính xác 100 µl cao chiết các nồng độ nhỏ vào các giếng thạch. Mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần trên từng chủng vi sinh vật chỉ thị. Các công đoạn trên được thực hiện trong điều kiện vô trùng với ngọn lửa đèn cồn. Chỉ số MIC được xác định ở nồng độ dịch chiết thấp nhất mà tại đó đuờng kính vòng kháng khuẩn bắt đầu xuất hiện và ghi nhận sau khi ủ các đĩa TSA ở 370C trong vòng 24 giờ. Hình 2.3. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết methanol 75% (25 mg/ml) đối với chủng Listeria monocytogenes (trái) và Vibrio alginolyticus (phải). 40
52. Đồ án tốt nghiệp 2.5.6. Thí nghiệm 6: Định tính một số thành phần có trong cây Elephantopus sp. 2.5.6.1. Quy trình Cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp. Ngâm trong H2SO4 10% Ngâm trong DMSO 1% Lọc Lọc test thử nghiệm test các thử nghiệm Alkaloid Carbohydrate Saponin Flavonoid Amino acid Anthraquinone Steroid Tannin Phenolic glycoside s 2.5.6.2. Thuyết minh quy trình Cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp. được chia làm 2 phần. Phần thứ nhất pha với H2SO4 10% sau đó lọc hết cặn, dịch thu được dùng để thực hiện các thử nghiệm kiểm tra sự có mặt của nhóm alkaloid. Phần thứ hai sẽ pha trong DMSO 1% sau đó bỏ cặn thu dịch, dịch này được đem phân tích và định tính một số thành phần hóa học như carbohydrate, saponin, flavonoid, amino acid, anthraquinone glycoside, steroid, phenolic, tannin và cardiac glycoside. a) Định tính thành phần carbohydrate Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, thêm vào 5-6 giọt thuốc thử Molisch, nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc trên thành ống nghiệm và quan sát sự hình thành phức hợp màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách. 41
53. Đồ án tốt nghiệp Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào, đun cách thủy trong 5 phút và quan sát sự xuất hiện kết tủa màu đỏ của CuO. - Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Barfoed, đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và quan sát sự hình thành kết tủa màu đỏ gạch. b) Định tính thành phần alkaloid Thử nghiệm Mayer: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, cho vài giọt thuốc thử Mayer. Quan sát kết tủa màu đục tạo thành. Thử nghiệm Dragendroff : Hút 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendroff và quan sát sự hình thành kết tủa màu vàng cam. Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Hager và quan sát hình thành kết tủa màu vàng. Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Wagner và quan sát sự hình thành kết tủa màu nâu đỏ. c) Định tính thành phần saponin Thử nghiệm tạo bọt: Hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm, lắc mạnh và quan sát sự hình thành bọt ổn định. e) Định tính thành phần anthraquinone glycosides Thử nghiệm Bontrager: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml H2SO4 loãng và đun sôi trong 30 phút, thêm H2O2 hoặc FeCl3 Tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc, thêm 3 ml benzene và lắc đều rồi để yên, tách lấy lớp benzene, thêm 2 ml ammonia 10% và đun trong 30 phút quan sát màu trong lớp ammonia. Quan sát sự xuất hiện màu đỏ. f) Định tính thành phần flavonoid Thử nghiệm alkaline: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện với đối chứng là mẫu và nước 42
54. Đồ án tốt nghiệp cất để so sánh, thêm vài giọt HCl loãng. Quan sát sự xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho HCl. Thử nghiệm Shinoda: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. Cho một ít bột Mg và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm. Bổ sung 5 ml cồn 95%. Nếu mẫu có màu cam, hồng, đỏ đến tím chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid. Thử nghiệm ferric chloride: Lấy 2 ml cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử ferric chloride 10%. Quan sát sự xuất hiện màu xanh hoặc tím g) Định tính thành phần phenolic Thử nghiệm chì acetate: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, cho 1,5 ml chì acetate 10%. Quan sát sự xuất hiện kết tủa trắng Thử nghiệm gelatin: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm một vài giọt gelatin 1% và quan sát sự xuất hiện kết tủa trắng h) Định tính thành phần tannin Thử nghiệm chì acetate: 2 ml dịch chiết được cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%. Cho vào 4 giọt Chì acetate. Quan sát sự xuất hiện kết tủa màu vàng. Thử nghiệm ferric chloride: 2 ml dịch chiết được cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%. Cho vào 4 giọt ferric chloride 10%. Quan sát sự xuất hiện màu xanh. i) Định tính thành phần steroid Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp và quan sát ở mặt phân cách nếu xuất hiện màu đỏ ở lớp dưới sterol, màu vàng ở lớp dưới triterpenoid Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2ml acetic anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh, nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo 43
55. Đồ án tốt nghiệp thành ống nghiệm. Quan sát nếu xuất hiện màu xanh dương đậm hay xanh lá cây steroid, nếu hình thành vòng màu nâu đỏ đậm triterpenoid. j) Định tính thành phần amino acid Thử nghiệm Ninhydrin: hút 1 ml dịch cao chiết, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin. Đun sôi cách thủy trong 5 phút và quan sát sự xuất hiện màu tím. 44
56. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Hiệu suất thu hồi cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp. Kết quả tách chiết hợp chất từ Elephantopus sp. bằng dung môi methanol 75% có hiệu suất thu hồi là 11,23 % 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao tổng methanol từ cây Elephantopus sp. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol 75% của cây Elephantopus sp. được xác định thông qua mức độ kháng khuẩn với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị. Trong đó ciproloxacin được sử dụng như đối chứng dương tại nồng độ 500 µg/ml và 8 µg/ml đối với nhóm chủng Vibrio. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của methanol 75% đối với 20 chủng chỉ thị cho thấy rằng cao chiết methanol 75% từ cây Elephantopus sp. thể hiện hoạt tính đối kháng 10 trên 20 chủng với 4 chủng Escherichia (Hình 3.1); 1 chủng Salmonella, 1 chủng Shigella và 2 chủng Vibrio (Hình 3.2) 1 chủng Listeria và Pseudomonas aeruginosa (Hình 3.3). E. coli-ETEC E. coli E. coli 0208 E. coli O157:H7 Đường kính vùng ức chế (mm) Hình 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol 75% (100 mg/ml) đối với nhóm Escherichia spp. 45
57. Đồ án tốt nghiệp Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol 75% (100 mg/ml) từ cây Elephantopus sp. cho kết quả khá tốt đối với cả 4 chủng Escherichia coli, E.coli- ETEC và Escherichia coli O175:H7. Điều này cho thấy dịch chiết methanol 75% có khả năng lôi kéo các nhóm chất hóa học có trong cây Elephantopus sp. chống lại các chủng vi sinh vật gây bệnh đường ruột. Trong nghiên cứu của Dương Minh Trí (2015) dịch chiết ethanol 70% trên cây Elephantopus sp. thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tương đương với dịch chiết methanol trên cùng chủng E. coli O157:H7, E. coli. Nhìn chung kết quả kháng khuẩn của dịch chiết methanol 75% và ethanol 70% là tương tự nhau, riêng trường hợp E.coli-ETEC dịch chiết ethanol 70% không có hoạt tính kháng khuẩn trong khi dịch chiết methanol 75% thể hiện khả năng kháng đặc hiệu (17,5 ± 0,87 mm). So với đối chứng, hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol 75% đối với nhóm Escherichia thấp hơn một cách có ý nghĩa so với đối chứng ciprofloxacin 500 µg/ml. Riêng với chủng Escherichia coli, hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol 75% so với ciprofloxacin không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Đường kính vùng ức chế (mm) Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol 75% (100 mg/ml) đối với chủng Shigella flexneri, Salmonella typhii, Vibrio cholerae và Vibrio alginolyticus 46
58. Đồ án tốt nghiệp Kết quả kháng khuẩn đối với chủng Samonella typhii của cao chiết methanol 75% không có sự khác biệt so với đối chứng ciprofloxacin 500 µg/ml (Hình 3.2). Trong đó hoạt tính của cao chiết methanol 100 mg/ml có hoạt tính kháng khuẩn tương đương ciprofloxacin 500 µg/ml. Trong kết quả của Nguyễn Thị Hồng Vân (2015) với dịch chiết methanol từ cây Podocarpus sp. cho kết quả ức chế chủ yếu với nhóm salmonella, shigella và một số chủng vi sinh vật gây bệnh khác, không có hoạt tính chống lại nhóm Escherichia coli, nhưng nhìn chung khả năng kháng khuẩn của Podocarpus sp. không cao hơn so với cây Elephantopus sp. Kết quả kháng khuẩn của cao chiết methanol 75% (100 mg/ml) có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê và yếu hơn so với ciprofloxacin 500 µg/ml trên chủng Shigella Trong báo cáo của Phạm Thị Thảo (2015) dịch chiết nước của cây Elephantopus sp. (100 mg/ml) có hoạt tính cao hơn (12,17 ± 0,29 mm) một cách có ý nghĩa so với dịch chiết 100 mg/ml methanol 75% (10,67 ± 0,58 mm) trên cùng một cây. Kết quả dịch chiết methanol 75% (100mg/ml) của cây Elephantopus sp. và ciprofloxacin 500 µg/ml không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê đối với chủng Vibrio cholerae và Vibrio alginolyticus (Hình 3.2). Nghiên cứu của Dương Minh Trí (2015) chỉ ra rằng dịch chiết ethanol 70% (100 mg/ml) của cây Elephantopus sp. thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tương đương với dịch chiết methanol 75% (100 mg/ml) trên cùng chủng V. alginolyticus Đường kính vùng ức chế (mm) Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol 75% (100 mg/ml) đối với chủng Listeria monocytogen Pseudomonas aeruginosa 47
59. Đồ án tốt nghiệp Kết quả ghi nhận hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol 75% (100 mg/ml) và ciprofloxacin 500 µg/ml là như nhau trên cùng chủng Pseudomonas aeruginosa (Hình 3.3) Cùng với đó kết quả kháng khuẩn đối với chủng Listeria monocytogens của cao chiết methanol 75% không có sự khác biệt so với đối chứng ciprofloxacin 500 µg/ml. Kết quả kháng khuẩn sơ bộ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol 75% (100 mg/ml) chủ yếu kháng tập trung vào nhóm Escherichia và các chủng sinh vật gây bệnh đường ruột. Điều này lý giải vì sao trong dân gian thường sử dụng Elephantopus sp. như một vị thuốc chữa các bệnh về rối loạn tiêu hóa. Bảng 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của dịch chiết methanol 75% từ cây Elephantopus sp. Hoạt tính kháng Hoạt tính STT Chủng vi khuẩn STT Chủng vi khuẩn khuẩn kháng khuẩn 1 E. coli O157:H7 11,17 ± 0,76 6 S. typhii 11,33 ± 0,58 2 E. coli 0208 10,67 ± 0,29 7 S. flexneri 10,67 ± 0,58 3 E. coli 13,33 ± 0,57 8 V. alginolyticus 14,83 ± 1,04 4 E.coli-ETEC 17,50 ± 0,87 9 V. cholerae 11,67 ± 1,53 5 L. monocytogenes 12,50 ± 0,87 10 P. aeruginosa 13,00 ± 1,32 Hoạt tính của cao tổng methanol 75% có phổ kháng khuẩn chủ yếu đối với nhóm vi sinh vật đường ruột. Khả năng kháng khuẩn mạnh đặc biệt là đối với chủng E.coli-ETEC (17,5 ± 0,87 mm). Trong nghiên cứu của Kang và ctv (2011) dịch chiết methanol 75% của 8 loại cây được đối kháng với các chủng vi khuẩn chỉ thị Gram dương và Gram âm trong đó dịch chiết của cây Agastache rugosaia không có hoạt tính kháng khuẩn chống lại 2 chủng L. monocytogenes và P. aeruginosa trong khi dịch chiết cây Elephantopus sp. thể hiện hoạt tính chống lại chủng vi khuẩn trên lần lược là 12,5 ± 0,87 mm và 13 ± 1,32 mm. Hoạt tính của cao chiết methanol 75% từ cây Ocimum gratissimum có khả năng đối kháng cao với chủng E. coli so với dịch chiết methanol 75% từ cây Elephantopus sp. cùng nghiên cứu trên của Alo và ctv 48
60. Đồ án tốt nghiệp (2012) với dịch chiết cây Aframomum melegueta không thể hiện được hoạt tính trên cùng chủng E. coli. 3.3. Nồng độ ức chế tối thiểu của cao tổng Elephantopus sp. Dịch chiết methanol từ cây Elephantopus sp. thể hiện hoạt tính kháng khuẩn lên 10 chủng vi khuẩn bao gồm E. coli O157:H7, E. coli 0208, E. coli, E.coli-ETEC, L. monocytogenes, S. typhii , S. flexneri, V. alginolyticus, V. cholerae, Pseudomonas tiếp tục được sử dụng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) kết quả được thể hiện qua bảng 3.2. Bảng 3.2. Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết methanol 75% từ cây Elephantopus sp. Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ở các nồng độ (mg/ml) STT Chủng vi sinh vật 50 25 12.5 1 E. coli O157:H7 9,67 ± 0,76 0 0 2 E. coli 0208 10,17 ± 0,76 0 0 3 E. coli 9,00 ± 0,87 0 0 4 E.coli-ETEC 10,50 ± 1,32 8,83 ± 0,76 0 5 L. monocytogenes 12,00 ± 0,50 8,67 ± 1,15 0 6 S. typhii 11,00 ± 1,00 0 0 7 S. flexneri 8,67 ± 0,29 8,50 ± 0,50 0 8 V. alginolyticus 9,00 ± 0,50 8,67 ± 0,58 0 9 V. cholerae 0 0 0 10 P. aeruginosa 0 0 0 49
61. Đồ án tốt nghiệp Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định dựa trên kết quả bảng 3.2. Đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị chỉ số MIC của dịch chiết methanol 75% từ 100 mg/ml tới 25 mg/ml. Trong đó nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết methanol 75% đối với chủng V. cholerae và P. aeruginosa nằm trong khoảng 100 mg/ml đến 50 mg/ml; Đối với E. coli O157:H7, E. coli 0208 và S. typhii trong khoảng 50 mg/ml đến 25 mg/ml; Và đối với các chủng E.coli-ETEC, L. monocytogenes, S. flexneri và V. alginolyticus là 25 mg/ml đến 12.5 mg/ml. Ở nồng độ 50 mg/ml cao chiết có hoạt tính kháng khuẩn lên 8 trên tổng số 10 chủng vi khuẩn chỉ thị trong đó E. coli 0208 và E.coli-ETEC tỏ ra nhạy cảm với cao chiết methanol 50 mg/ml hơn cả (Bảng 3.2). Ở nồng độ 25 mg/ml cao chiết methanol có tác động kháng khuẩn lên E.coli-ETEC, L. monocytogenes, S. flexneri và V. alginolyticus. Kết quả cho thấy đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột, dịch chiết methanol 75% thể hiện khả năng ức chế với liều lượng nhỏ (25 mg/ml đối với E.coli-ETEC, S. flexneri và V. alginolyticus). Điều này thể hiện dịch chiết methanol 75% từ cây Elephantopus sp. chứa những hoạt chất có tác dụng đặc hiệu lên các vi khuẩn gây bệnh đường ruột nói chung và nhóm Escherichia nói riêng. 3.4. Định tính sơ bộ thành phần hóa học cây Elephantopus sp. Nhằm định tính sơ bộ thành phần hóa học cũng như xác định các nhóm hợp chất chứa trong cây Elephantopus sp. có khả năng kháng khuẩn. Đặc biệt tác động đối với nhóm Escherichia và các chủng vi khuẩn gây bệnh khác. Để giải quyết những vấn đề trên thì việc xác định thành phần hóa học của cây Elephantopus sp. chứa trong dịch chiết methanol 75% là cần thiết và kết quả định tính thành phần hóa học được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Định tính một số thành phần hóa học có trong cao chiết methanol cây Elephantopus sp. Thành phần Thành phần Kết quả Kết quả hóa học hóa học Carbohydrate Steroid 50
62. Đồ án tốt nghiệp A. Molisch’s test − A. Salkowski Sterol B. Libermann B. Fehling’s test + Sterol Burchard test Anthraquinone C. Barfoed’s test + glycoside Alkaloid A. Borntrager’s test − A. Mayer − Phenolic compound B. Dragendroff + A. Lead acetate test − C. Hager’s test + B. Gelatin test − D. Wagner’s test + Saponin Flavonoid A. Foam test + A. Alkaline − Tannin B. Shinoda − A. Ferric chloride + C. Ferric clorid + B. Lead acetate + Amino acid A. Ninhydrin − (−): Âm tính (+): Dương tính Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học có trong cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp. được thể hiện trong bảng 3.3. kết quả chỉ ra trong dịch chiết cây chứa các hợp chất alkaloid, steroid, flavonoid, saponin, tannin và carbohydrate. Trong thử nghiệm xác định flavonoid có 3 phản ứng trong đó dịch chiết methanol chỉ thỏa 1 trong 3 nhưng vẫn xét dương tính với flavonoid (Hình 3.6) vì trong flavonoid có nhiều nhóm hợp chất trong đó mỗi phản ứng định tính giúp nhận biết một nhóm chất riêng trong trường hợp này phản ứng của ferric clorid giúp nhận biết chalcon trong nhóm chất flavonoid (Đặng Thị Luyến và ctv, 2008), phản ứng alkaline giúp phân biệt nhóm flavon và flavonol (Manpreet Kaur, 2015) và phản ứng shinoda giúp phân biệt anthocyanidins trong nhóm chất flavonoid (Greg, 2014). Trong nghiên cứu của 51
63. Đồ án tốt nghiệp Phạm Thị Thảo (2015) trên dịch chiết nước của cây Elephantopus sp. không có sự hiện diện của alkaloid. Cũng nghiên cứu trên Elephantopus sp. kết quả của Dương Minh Trí, (2015) trên dịch chiết ethanol 70% thu được khá tương đồng với dịch chiết methanol 75%. Kết quả định tính steroid trên methanol 75% và dịch chiết nước đều cho kết quả dương tính với sterol còn dịch chiết ethanol 70% thì dương tính với triterpenoid. Trái lại trong thử nghiệm định tính phenolic thì cả 2 dịch chiết nước và ethanol 70% đều cho kết quả dương tính thì đối với dịch chiết methanol 75% kết quả thu được âm tính với nhóm hợp chất này. Hoạt tính của cao tổng methanol 75% được quyết định bởi các hợp chất có khả năng kháng khuẩn tồn tại trong dịch chiết mà dung môi metanol 75% có khả năng lôi kéo. Các hợp chất đó bao gồm alkaloid (Cushnie và ctv 2014), flavonoid (Cushnie và Lamb, 2006), tannin (Akiyama và ctv, 2001) và saponin (Arabski và ctv, 2012). Qua các kết quả trên có thể nhận thấy ảnh hưởng của các dung môi khác nhau trong việc ly trích và lôi kéo các hợp chất khác nhau có trong cùng một cây là khác nhau, điều đó lý giải vì sao dù trên cùng một loại cây nhưng kết quả kháng khuẩn cũng như định tính thành phần hóa học của các dung môi khác nhau là không giống nhau. Một trong những yếu tố quyết định nên khả năng kháng khuẩn mạnh hay yếu của một dịch chiết là bản thân thực vật đó có mang trong mình những hợp chất có khả năng kháng khuẩn hay không và dung môi trích ly chúng có khả năng hấp thu hết những hợp chất đó hay không. Ferric cloric (dương tính) Lead acetate (dương tính) Hình 3.4. Thử nghiệm định tính tannin 52
64. Đồ án tốt nghiệp Wagner (dương tính) Dragendroff (dương tính) Mayer (âm tính) Hager (dương tính) Hình 3.5. Thử nghiệm định tính alkaloid Shinoda Ferric cloric Đối chứng (âm tính) (dương tính) Thí nghiệm Alkaline (âm tính) Hình 3.6. Thử nghiệm định tính flavonoid 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng Elephantopus sp. qua từng phân đoạn Qua kết quả định tính thành phần hóa học đã xác định được một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn có trong cây Elephantopus sp. để xác định chi tiết hơn việc phân bố các nhóm chất kháng khuẩn có trong dịch chiết methanol 75% trong cây Elephantopus sp. nhóm nghiên cứu quyết định kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn đối với các phân đoạn gồm: Hexan, ethyl acetate, butanol, và nước. Kết quả được thề hiện ở bảng 3.3. 53
65. Đồ án tốt nghiệp E. coli-ETEC E. coli E. coli 0208 Đường kính E. coli O157:H7 vùng ức chế (mm) Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn đối với nhóm Escherichia spp. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn cao tổng đối với nhóm Escherichia khả đồng bộ, phân đoạn hexan cho khả năng kháng đối với 4 chủng Escherichia coli. Kết quả kháng khuẩn các phân đoạn cao tổng có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê so với ciprofloxacin 500 µl/ml. Đối với chủng E. coli 0208 và E. coli O157:H7 phân đoạn hexan, ethyl acetate và butanol là như nhau nhưng vẫn thấp hơn so với ciprofloxacin 500 µl/ml (Hình 3.7). Đường kính vùng ức chế (mm) Hình 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của của các phân đoạn đối với chủng Shigella flexneri, Salmonella typhii, Vibrio cholerae và Vibrio alginolyticus 54
66. Đồ án tốt nghiệp Phân đoạn hexan 20mg/ml có hoạt tính kháng khuẩn tương tự với phân đoạn butanol 50 mg/ml và có sự khác biệt có ý nghĩa đối với ciprofloxacin 500 µl/ml đối với chủng Shigella flexneri (Hình 3.8) Hoạt tính phân đoạn nước 50 mg/ml không mạnh bằng các phân đoạn khác nhưng cũng có hoạt tính kháng khuẩn đối với Salmonella typhii và thấp hơn một cách có ý nghĩa so với ciprofloxacin. Đối với nhóm Vibrio hoạt tính của phân đoạn hexan 20 mg/ml thể hiện lên 2 chủng Vibrio cholerae và Vibrio alginolyticus, trong khi khả năng kháng khuẩn của phân đoạn hexan 20 mg/ml tương tự với phân đoạn ethyl acetate 40mg/ml với chủng Vibrio cholerae thì hoạt tính kháng khuẩn lại thấp hơn ciprofloxacin 8 µg/ml một cách có ý nghĩa. Đường kính vùng ức chế (mm) Hình 3.9. Hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn lên chủng Listeria monocytogenes và chủng Pseudomonas aeruginosa. Hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn butanol và ciprofloxacin 500 µl/ml đối với chủng Listeria không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê, hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn ethyl acetate 40 mg/ml và ciprofloxacin 500 µl/ml có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Còn đối với chủng Pseudomonas aeruginosa thì phân đoạn nước thể hiện khả năng đối kháng tương đương với ciprofloxacin về mặt thống kê (Hình 3.9). 55
67. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. Kết quả tổng hợp của hoạt tính kháng khuẩn cao tổng methanol 75% và 4 phân đoạn hexan, ethyl acetate, butanol và nước từ cây Elephantopus sp. Chủng vi khuẩn ME HF EF BF WF E. coli O157:H7 11,17 ± 0,76 9,83 ± 0,58 10,5 ± 0,87 10 ± 0,05 E. coli 0208 10,67 ± 0,29 9,17 ± 0,28 8,83 ± 0,58 9,83 ± 1,44 E. coli 13,33 ± 0,57 10,67 ± 1,04 12,5 ± 0,87 9,17 ± 0,76 E.coli-ETEC 17,50 ± 0,87 13,33 ± 0.29 16,67 ± 1,44 15,17 ± 0,76 L. monocytogenes 12,50 ± 0,87 9,33 ± 1,04 10,67 ± 0,29 S. typhii 11,33 ± 0,58 10,17 ± 0,58 S. flexneri 10,67 ± 0,58 8,83 ± 0,58 9,83 ± 0,29 V. alginolyticus 14,83 ± 1,04 8,83 ± 0,76 V. cholerae 11,67 ± 1,53 10,17 ± 0,76 9,17 ± 0,29 P. aeruginosa 13,00 ± 1,32 11,83 ± 1,89 Kết quả chung cho thấy các phân đoạn đều ức chế với 10 chủng vi sinh vật chỉ thị, kết quả này tương đồng với kết qủa kháng khuẩn của cao tổng methanol, trong đó đáng kể nhất là hoạt tính kháng với 4 chủng Escherichia. Kết quả phân đoạn hexan 20 mg/ml hầu như xuất hiện xuyên suốt trên các chủng khuẩn chỉ thị bị ức chế bởi cao tổng methanol 100 mg/ml điều đó cho thấy các chất có khả năng ức chế với nhóm Escherichia chủ yếu tan tốt trong phân đoạn hexan bao gồm alkaloid, flavonoid, tannin, và saponin. Phân đoạn hexan tiếp tục thể hiện khả năng ức chế đối với nhóm Vibrio, vùng ức chế của cao chiết methanol mạnh hơn nhiều so với phân đoạn hexan trên cùng chủng Vibrio alginolyticus. Nhìn chung phân đoạn hexan 20 mg/ml cho kết quả kháng khuẩn tốt nhất tiếp theo là phân đoạn butanol 50 mg/ml, ethyl acetate 40mg/ml trong đó chủng E.coli-ETEC đặc biệt nhạy với phân đoạn ethyl acetate và cuối cùng là phân đoạn nước 50 mg/ml, phân đoạn hexan cho kết quả kháng cao nhất do quá trình phân tách các phân đoạn từ cao tổng với dung môi đầu tiên là hexan, hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn còn lại đối với các nhóm vi khuẩn khác chỉ ở mức trung bình. 56
68. Đồ án tốt nghiệp Như vậy, cao chiết methanol 75% của Elephantopus sp. có hoạt tính kháng khuẩn khá tốt kháng lại được 10 trên 20 chủng vi khuẩn chỉ thị khảo sát. Mặc dù hoạt tính MIC của cao chiết methanol không cao nhưng chúng vẫn có hoạt tính kháng khuẩn tốt và các thành phần tạo nên hoạt tính sinh học của cao chiết methanol 75% tập trung nhiều vào phân đoạn hexan và phân đoạn butanol. Tóm lại, nghiên cứu này mở ra các hướng nghiên cứu tiếp theo về hoạt tính sinh học của cây Elephantopus trong việc điều trị một số bệnh thông thường. 57
69. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Cao tổng methanol 75% từ cây Elephantopus sp. có hoạt tính kháng khuẩn đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột bao gồm E. coli O157:H7, E. coli 0208, E. coli, E.coli-ETEC, S. typhii, S. flexneri, V. alginolyticus, V. cholerae và một số chủng vi sinh vật gây bệnh cơ hội khác bao gồm L. monocytogenes, P. aeruginosa. Chỉ số MIC của dịch chiết methanol 75% từ cây Elephantopus sp. từ 25 mg/ml đến 100 mg/ml. Thành phần hóa học chứa trong cây Elephantopus sp. bao gồm carbohydrate, alkaloid, flavonoid, sterol, saponin, tannin. Phân đoạn hexan từ cao tổng methanol 75% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng E. coli O157:H7, E. coli 0208, E. coli, E.coli-ETEC, S. flexneri, V. alginolyticus, V. cholerae. Phân đoạn butanol thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng E. coli O157:H7, E. coli 0208, E. coli, E.coli-ETEC, S. flexneri và L. monocytogenes. Phân đoạn ethyl acetate thể hiện hoạt tính đối với chủng E. coli O157:H7, E. coli 0208, E.coli-ETEC, V. cholerae và L. monocytogenes. Cuối cùng là phân đoạn nước thể hiện họa tính đối với chủng E. coli, S. typhii và P. aeruginosa. 4.2. Đề nghị Định danh xác định loài Elephantopus Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cây Elephantopus sp. trên nhiều loại dung môi Xác định MIC bằng bằng phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng (broth dilution method). Định lượng thành phần hóa học chứa trong cây Elephantopus sp. 58
70. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Chang Tran (2014). Trực khuẩn lỵ (Shigella), Xetnghiemmau, 07-05-2014, xem 17- 06-2015, link: . Trần Quang Cảnh (2012). Trực khuẩn mủ xanh. Xetnghiemdakhoa.com. 23-09-2012, xem 17-06-2015, link: . Trần Quang Cảnh (2012). Tụ cầu khuẩn. Xetnghiemdakhoa.com. 27-06-2012, xem 17-06-2015, link: . Trần Văn Cường (2009). Phân lập, xác định đăc tính sinh học của E. coli, Salmonella gây tiêu chảy cho lợn sau cai sữa nuôi tại tỉnh Lào Cai và đề xuất biện pháp phòng trị. Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, thú y, trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội. Nguyễn Thị Hiền và ctv (2010). Chất kháng khuẩn thực vật. Tiểu luận môn công nghệ chế biến rau trái, Kỹ thuật hóa học. Đại học bách khoa TP.HCM. Mạnh Hùng (2015). Đại Hoàng và những ứng dung trong chế phẩm của OPC, Opcpharma, 04/03/2015, xem 17-06-2015, link: . Nguyễn Thúy Hương (2011). Phân tích vi sinh thực phẩm, Khoa công nghệ thực phẩm, Đại học công nghiệp thực phẩm TP.HCM. Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2006). “Xác định vị trí phân loại và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon)”. Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, 42-52, Trường Đại học Cần Thơ. 59
71. Đồ án tốt nghiệp Hoàng Sầm và Hứa Văn Thao (2012). Hoạt tính sinh học của saponin với ung thư, TruongSinhThang. 17/08/2012, xem 17-06-2015, link: . Dương Văn Sĩ (2010). Tìm hiểu về vi khuẩn streptococcus faecalis (Enterococcus faecalis), Chuyên đề, Nông học, Đại học Nông Lâm. Nguyễn Hoàng Tuấn và ctv (2012). Bệnh tả. www.thuoc.vn. 18-08-2012 xem 17-06- 2015, link: . Lê Thị Bích Uyên (2007). Khảo sát hoạt tinh kháng khuẩn và kháng nấm của các chất chiết thô từ cây lô hội (Aloe vera) và cây hoa phấn (Mirabilis jalapa L.) nuôi cấy In vitro. Khóa luận tốt nghiệp, công nghệ sinh học, Đại học nông lâm TP.HCM. Nguyễn Thị Như Yến và cộng sự (2011). Pseudomonas flourescens và khả năng tạo độc tố mosquitocidal exotoxin. Seminar. Công nghệ sinh học-Thực phẩm-Môi trường, Đại học Công Nghệ TP.HCM. 60
72. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU TIẾNG ANH Aibinu và ctv (2007). “In vitro antimicrobial activity of crude extracts from plants Bryophyllum pinnatum and Kalanchoe crenata”. Afr. J. Traditional, Complementary and Alternative Medicines, 4 (3): 338 – 344. Alyokhin A.V, (2002). “Infestation of Elephantopus mollis (Asteraceae) flowerheads by Tetreuaresta obscuriventris (Diptera: Tephritidae) on Kauai, Hawaiian islands”. Entomological News, 113(4):247-252. Anees, A., Abbas, F. A., Sufia, H., & Lim, H.K. (2009). “Extraction, separation and identification of chemical ingredients of Elephantopus scaber using Factorial design of experiment. International Journal of chemistry vol.1, No 1 Antara Sen and Amla Batra (2012). “Evaluation of antimicrobial activity of different solvent extracts of medicinal plant: Melia azedarach L”. International journal of current pharmaceutical Research. Vol 4, I (2): 67-73. Chang-Geun Kang và ctv (2011). “Evaluation of Antimicrobial Activity of the Methanol Extracts”. Toxicol. Res, Vol. 27, No. 1, pp. 31-36. Consolacion, Y.R., Agnes, B.A., & Chien-Chang, S. (2009). “Antimicrobial terpenoids from Elephantopus mollis”. NRCP Research Journal, 10 (1): 33-38 Doriane E Djeussi và ctv (2013). “Antibacterial activities of selected edible plants extracts against multidrug-resistant Gram-negative bacteria”. BMC Complementary and Alternative Medicine, 13:164. Ghadir A. El-Chaghaby và ctv (2011). Evaluation of the antioxidant and antibacterial properties of various solvents extracts of Annona squamosa L. leaves. Arabian Journal of Chemistry, 7, 227–233. Hammer M.L.A. và Johns E.A. (1993). “Tapping an Amazonian plethora: four medicinal plants of Marajo Island, Para (Brazilourna)”. J. Ethnopharm. 40, 53-75 61
73. Đồ án tốt nghiệp Ibtisam Mohammed Ababutain (2011). “Antimicrobial Activity of Ethanolic Extracts From Some Medicinal Plant”. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 5(11): 678-683. Inta, A và ctv. (2008). “A comparative study on medicinal plants used in Akha’s traditional medicine in China and Thailand, cultural coherence or ecological divergence?”. J. Ethnopharmacol. 116: 508-517. Jaganath I.B. (2000). Herbs the green pharmacy of Malaysia. Kuala Lumpur: Vinpress,76−7. Jasmine R và Daisy P, (2008). “Effect of crude extract and fraction from Elephantopus scaber on hyperglycemia in Streptozotocin-diabetic rats”. Int. J. Biol. Chem. 1: 111-116. Murugesan S và ctv (2011). “Phytochemical screening and Antimicrobial activity of the leaves of Memecylon umbellatum Burm. F”.Journal of Applied Pharmaceutical Science. 1 (1): 42-45. Muthumani P và ctv (2010). “Anti-diarrhoeal and cardiotonic activity of extracts of Elephantopus scaber linn in experimental animals”. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. Volume 1 Issue 3 Page No. 1. Poli A và ctv (1992). Preliminary pharmacologic evaluation of crude whole plant extracts of Elephantopus scaber. Part I: In vivo studies. J Ethnopharmacol. 37(1):71- 6. Radulovíc và ctv (2013). “Antimicrobial Plant Metabolites: Structural Diversity and Mechanism of Action”. Current Medicinal Chemistry, 20, 932-952. Silvia Martins và ctv (2013). Antibacterial activity of crude methanolic extract and fractions obtained from Larrea tridentata leaves. Industrial Crops and Products, 306– 311. 62
74. Đồ án tốt nghiệp Thatoi H.N, và ctv (2008). “Antimicrobial Activity and Ethnomedicinal Uses of Some Medicinal Plants”. Similipal Biosphere Reserve, Orissa. Asian J. of Plant Sci. 7: 260-267. Tim Cushnie và ctv (2014). “Alkaloids: An overview of their antibacterial, antibiotic- enhancing and antivirulence activities”. 44(5), pp 377–386. Wang B và ctv (2012). “A new sesquiterpene lactone from Elephantopus tomentosus”. J Asian Nat Prod Res. 14(7):700-3 Wang L và ctv (2004). “Chemical composition of the essentia oil of the Elephantopus scaber from Southern China”. Z Naturforsch C, 59(5-6):327-9 Yam, M.F và ctv (2009). “Anti-inflammatory and Analgesic Effects of Elephantopus tomentosus Ethanolic Extract”. J Acupunct Meridian Stud. 2(4):280−287. 63
75. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ KHÁNG KHUẨN CÂY ELEPHANTOPUS SP. Bảng.A.1. Kết quả kháng khuẩn dịch chiết methanol 75% (100 mg/ml) từ cây Elephantopus sp. Methanol Chủng VSV Lần 1 Lần 2 Lần 3 Escherichia coli O157:H7 12 11 10.5 Escherichia coli 0208 11 10.5 10.5 Escherichia coli 14 13 13 Enterotoxigenic E.coli-ETEC 18 16.5 18 Listeria innocua Listeria monocytogenes 11.5 13 13 Salmonella dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhii 11 11 12 Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri 11 11 10 Shigella sonnei Vibrio alginolyticus 16 14.5 14 Vibrio cholerae 10 12 13 Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Pseudomonas 14.5 12 12.5 Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis Đường kính giếng thạch lỗ 6 mm 1
76. Đồ án tốt nghiệp Bảng A.2. Hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn hexan (HF 20 mg/ml), ethyl acetate (EF 40 mg/ml), butanol (BF 50 mg/ml) và nước (WF 50 mg/ml)từ phân đoạn methanol 75% HF EF BF WF Chủng vi sinh vật L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 Escherichia coli O157:H7 10.5 9.5 9.5 11 9.5 11 10 9.5 10.5 Escherichia coli 0208 9 9.5 9 8.5 8.5 9.5 9 9 11.5 Escherichia coli 11 9.5 11.5 13.5 12 12 9 10 8.5 Enterotoxigenic E.coli- ETEC 13 13.5 13.5 15 17.5 17.5 15 14.5 16 Listeria innocua Listeria monocytogenes 8.5 10.5 9 11 10.5 10.5 Salmonella dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhii 9.5 10.5 10.5 Salmonella typhimurium 2
77. Đồ án tốt nghiệp Shigella boydii Shigella flexneri 8.5 9.5 8.5 10 10 9.5 Shigella sonnei Vibrio alginolyticus 9 9.5 8 Vibrio cholerae 9.5 11 10 9.5 9 9 Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Pseudomonas aeruginosa 10.5 11 14 Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis Đường kính giếng thạch lỗ 6 mm 3
78. Đồ án tốt nghiệp Bảng A.3. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC của cao tổng methanol 75% từ cây Elephantopus sp. (mm) 100 50 25 12.5 Chủng VSV L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 Escherichia coli O157:H7 12 11 10.5 10 9.5 9.5 Escherichia coli 0208 11 10.5 10.5 10 11 9 Escherichia coli 14 13 13 8.5 8.5 10 Enterotoxigenic E.coli- ETEC 18 16.5 18 9.5 10 12 9.5 9 8 Listeria innocua Listeria monocytogenes 11.5 13 13 12.5 12 11.5 10 8 8 Salmonella dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhii 11 11 12 11 12 10 Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri 11 11 10 9 8.5 8.5 8.5 9 8 Shigella sonnei 4
79. Đồ án tốt nghiệp Vibrio alginolyticus 16 14.5 14 9.5 9 8.5 8 9 9 Vibrio cholerae 10 12 13 Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Pseudomonas aeruginosa 14.5 12 12.5 Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis Đường kính giếng thạch lỗ 6 mm 5
80. Đồ án tốt nghiệp Bảng A.4. Hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh ciprofloxacin 500 µg/ml và 8 500 µg/ml (mm) 8 500 Chủng vi sinh vật L1 L2 L3 L1 L2 L3 Escherichia coli O157:H7 0 0 0 13 13 13.5 Escherichia coli 0208 0 0 0 12.5 12 12.5 Escherichia coli 0 0 0 13 13 13.5 Enterotoxigenic E.coli-ETEC 0 0 0 30.5 31 31.5 Listeria innocua 0 0 0 11.5 12 12.5 Listeria monocytogenes 0 0 0 12 12 12.5 Salmonella dublin 0 0 0 12 11.5 13 Salmonella enteritidis 0 0 0 13.5 13 12.5 Salmonella typhii 0 0 0 13 12 12.5 Salmonella typhimurium 0 0 0 11 11 11 Shigella boydii 0 0 0 0 0 0 Shigella flexneri 0 0 0 13 13 13.5 Shigella sonnei 15 14.5 15.5 33.5 33 32.5 Vibrio alginolyticus 16.5 16 16 34 34.5 34 Vibrio cholerae 13 13 14 22.5 22.5 22 Vibrio harveyi 17.5 18 18.5 32.5 33 33.5 Vibrio parahaemolyticus 11.5 11.5 11 28 28 28.5 Pseudomonas aeruginosa 0 0 0 12.5 11.5 12.5 Staphylococcus aureus 0 0 0 12 12 12.5 Enterococcus feacalis 0 0 0 12 11.5 12.5 Đường kính giếng thạch lỗ 6 mm 6
81. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ Kết quả được xử lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey Bảng B.1. Kết quả xử lý thống kê hoạt tính kháng khuẩn Escherichia VSV Count Mean Homogeneous Groups E.coli 0208 3 10.6667 X E.coli O157:H7 3 11.1667 XX DC 0208 3 12.3333 XX DC K 3 13.1667 X DC O157H7 3 13.1667 X E.coli (K) 3 13.3333 X E.coli-ETEC 3 17.5 X DC ETEC 3 31.0 X Bảng B.2. Kết quả xử lý thống kê hoạt tính kháng khuẩn Samonella VSV Count Mean Homogeneous Groups S.typhi (K) 3 11.3333 X DC 3 12.5 X Bảng B.3. Kết quả xử lý thống kê hoạt tính kháng khuẩn Shigella VSV Count Mean Homogeneous Groups S.flexneri 3 10.6667 X DC 3 13.1667 X Bảng B.4. Kết quả xử lý thống kê hoạt tính kháng khuẩn Vibrio VSV Count Mean Homogeneous Groups V. cholerae 3 11.6667 X DC cholerae 3 13.3333 XX V. alginolyticus 3 14.8333 XX DC algino 3 16.1667 X Bảng B.5. Kết quả xử lý thống kê hoạt tính kháng khuẩn Listeria VSV Count Mean Homogeneous Groups DC 3 12.1667 X L.monocytogenes 3 12.5 X Bảng B.6. Kết quả xử lý thống kê hoạt tính kháng khuẩn Psedomonas aegurinosa VSV Count Mean Homogeneous Groups DC 3 12.1667 X Pseudomonas (K) 3 13.0 X Bảng B.7. Kết quả xử lý số liệu hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn của cao chiết methanol đối với Escheriachia Bảng B.7.1. Escherichia 0208 7