›

Đồ án Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón lá

pdf 151 trang thiennha21 13/04/2022 6780
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón lá", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_san_xuat_vi_khuan_bacillus_subtilis_va_lact.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón lá

  1. tên đề tài.txt c Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hai SV: Huỳnh Phương Thảo Lớp: 13DSH03 MSSV: 1311100669 Page 1
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh. Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án của mình. TP Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực hiện Huỳnh Phương Thảo
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này em đã nhận được nhiều sự quan tâm giúp đỡ của Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gủi đến cô Nguyễn Thị Hai đã luôn tận tình quan tâm hướng dẫn và chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập cho đến khi xây dựng đề cương và hoàn thành đồ án này. Em xin chân thành cám ơn quý Thầy Cô khoa Công nghệ sinh học- Thực phẩm - Môi trường đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt quá trình học tập tại đây. Em xin gửi lời cám ơn đến gia đình đã luôn đã chăm sóc,dạy dỗ và hỗ trợ em cũng như luôn bên cạnh và làm chỗ dựa tinh thần cho em. Em cũng xin gửi lời cám ơn đến tất cả các anh chị và bạn bè cùng thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm đã luôn quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ với em khi thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Cuối cùng em xin gửi lời cám ơn đến quý Thầy Cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Với điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế của một sinh viên, đồ án này không thể tránh được những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của quý Thầy Cô để em có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức của mình, nhằm phục vụ tốt hơn công tác thực tế sau này. Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý Thầy Cô. Em xin chân thành cám ơn! TP Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực hiện Huỳnh Phương Thảo
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Tình hình nghiên cứu 2 2.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước 2 2.2. Tình hình nghiên cứu enzyme protease ngoài nước 2 2.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis và Lactobacillus tạo phân bón vi sinh. 4 2.4. Tình hình chất thải thực phẩm thừa. 6 3. Mục đích nghiên cứu 7 4. Phương pháp nghiên cứu 8 4.1 - Phương pháp tổng hợp tài liệu 8 4.2 - Phương pháp thu thập và xử lí số liệu 8 5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 8 6. Kết quả đạt được 8 7. Ý nghĩa đề tài 9 8. Kết cấu đồ án 9 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1.Tổng quan về vi sinh vật dùng để phối trộn vào thức ăn thừa 10 1.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis 10 1.1.2. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus 15 1.2. Tổng quan về enzyme 20 1.2.1. Enzyme protease 20 1.2.2. Enzyme amylase 24 1.2.3. Enzyme cellulase 28 1.3.Tổng quan về phân bón 30 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.3.1.Khái niệm 30 1.3.2. Phân loại 31 1.3.3. Thành phần dinh dưỡng 33 1.3.4. Ưu điểm của phân bón hữu cơ 33 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 334 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 34 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu 34 2.1.2. Thời gian nghiên cứu 34 2.2. Vật liệu nghiên cứu 34 2.2.1. Nguồn vi sinh vật 34 2.2.2. Hóa chất và môi trường 35 2.3.Thiết bị và dụng cụ 36 2.3.1. Thiết bị 36 2.3.2. Dụng cụ 36 2.4.1. Bố trí thí nghiệm chung 37 2.4.2. Bố trí thí nghiệm chi tiết 38 2.5. Phương pháp nghiên cứu 52 2.5.1. Phương pháp tăng sinh 52 2.5.2. Phương pháp pha loãng mẫu 52 2.5.3. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc 53 2.5.4. Phương pháp quan sát hình thái tế bào 54 2.5.5. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 55 2.5.6. Phương pháp đục lỗ thạch 56 2.5.7. Phương pháp nghiên cứu khả năng phân giải tinh bột, protein, cellulose. 57 2.5.8. Phương pháp xử lí số liệu 58 2.5.9. Xác định mật độ tế bào VSV 58 2.5.10. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn. 59 2.5.11. Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn 60 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.5.12. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn. 61 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 63 3.1. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh, cellulse và protein của các chủng BM13 và BDH 63 3.1.1. Kết quả khảo sát khả năng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn BM và BDH. 65 3.1.2. Kết quả khảo sát khả năng phân giải protein của các chủng vi khuẩn BM và BDH. 65 3.1.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân CMC của các chủng vi khuẩn BM và BDH. 67 3.2. Kết quả khẳng định lại đặc điểm hình thái của chủng BDH4 63 3.2.1. Kết quả nhuộm Gram 70 3.2.2. Kết quả nhuộm bào tử 70 3.3. Kết quả khẳng định lại đặc điểm hình thái của chủng L2 71 3.4. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của chủng Bacillus subtilis BDH4 với Lactobacillus L2 73 3.5. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme protease của 2 chủng Bacillus subtilis BDH4 với Lactobacillus L2 khi trộn chung với nhau 74 3.6. Khảo sát điều kiện nuôi cấy để nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis BDH4. 75 3.6.1. Thời gian nuôi cấy 75 3.6.2. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng BDH4. 77 3.7. Khảo sát điều kiện nuôi cấy để nhân sinh khối vi khuẩn Lactobacillus L2. 78 3.7.1. Thời gian nuôi cấy 78 3.7.2. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn L2 80 3.8. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của chủng BDH4 82 3.9. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của chủng L2 827 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 92 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp 1. Kết luận 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 93 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 97 iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH BẢNG Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis (Theo Holt,1992) 13 Bảng 2.1. Danh sách các chủng vi khuẩn BM và BDH được chọn để khảo sát 34 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh amylase của các chủng vi khuẩn BM và BDH 63 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn BM và BDH 65 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân CMC sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn BM và BDH 67 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BDH4 75 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng BDH4 77 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn L2 78 Bảng 3.7. Khảo sát pH ban đầu của môi trường đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn L2 80 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của chủng BDH4 82 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy đến sự ST và khả năng sinh enzyme của chủng L2 87 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis 11 Hình 1.2. Hình dạng tế bào của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus 17 Hình 2.1. Sơ đồ tổng quan bố trí các bước thí nghiệm 37 Hình 2.2. Sơ đồ quy làm thuần các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH 38 Hình 2.3. Sơ đồ quy trình làm thuần chủng Lactobacillus L2 40 Hình 2.4. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme protease của các chủng BM và BDH 42 Hình 2.5. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme amylase của các chủng BM và BDH 44 Hình 2.6. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn BM và BDH 46 Hình 2.7. Khảo sát tính đối kháng của hai chủng VSV được tuyển chọn dùng để phối trộn vào thức ăn thừa. 48 Hình 2.8. Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả năng sinh enzyme protease của chủng Bacillus subtilis được tuyển chọn 50 Hình 3.1. Vòng phân giải tinh bột của các chủng BM và BDH 64 Hình 3.2. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh enzyme amylase của các chủng vi khuẩn BM và BDH 64 Hình 3.3. Khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease cuả các chủng BM và BDH 65 Hình 3.4. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease của 65 chủng vi khuẩn BM và BDH 66 Hình 3.5. Vòng phân giải CMC của các chủng BM và BDH sau 48 giờ 67 Hình 3.6. Vòng phân giải CMC của 6 chủng vi khuẩn BM và BDH sau 2 ngày nuôi cấy 68 Hình 3.7. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng Bacillus subtilis BDH4 nhuộm Gram trên kính hiển vi x100 70 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8 – Kết quả nhuộm bào tử chủng vi khuẩn BDH4 71 Hình 3.9. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng s L2 nhuộm Gram trên kính hiển vi x100 72 Hình 3.10. Khả năng đối kháng chủng Bacillus subtilis BDH4 với Lactobacillus L2 73 Hình 3.11. Khả năng sinh enzyme protease khi trộn 2 chủng vi khuẩn BDH4 và L2 . 74 Hình 3.13. Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng BDH4 sau 36 giờ nuôi cấy 77 Hình 3.14. Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn L2 79 Hình 3.16. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy cho sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme amylase của chủng BDH4 83 Hình 3.17. Môi trường nuôi cấy chủng Bacillus subtilis BDH4 83 Hình 3.18. Hình thái khuẩn lạc chủng BDH4 khi nuôi cấy trên từng loại môi trường 84 Hình 3.19. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase của chủng vi khuẩn BDH4 85 Hình 3.20. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme protease của chủng vi khuẩn BHD4 86 Hình 3.21. Ảnh hưởng môi trưởng nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme protease của chủng L2 88 Hình 3.22. Môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn Lactobacillus L2 88 Hình 3.23. Hình thái khuẩn lạc chủng L2 khi được nuôi cấy trên 4 môi trường 89 Hình 3.24. Kết quả khảo sát khả năng sinh amylase của chủng L2 được nuôi cấy trên 4 loại môi trường 90 Hình 3.25. Kết quả khảo sát khả năng sinh protease của chủng L2 được nuôi cấy trên 4 loại môi trường 90 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Food and Agriculture Organization of FAO the United Nations MĐVSV Mật độ vi sinh vật NA Nutrient agar NB Nutient broth ĐKVPG Đường kính vòng phân giải VSV Vi sinh vật viii
  12. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Xã hội ngày càng phát triển, những tiến bộ về khoa học và kĩ thuật làm cho cuộc sống con người có những thay đổi lớn. Ngành công nghiệp dịch vụ ăn uống mở rộng. Hàng ngày, một lượng lớn thức ăn thừa được thải bỏ từ các nhà hàng, khách sạn dịch vụ ăn uống. Việc gia tăng lượng thức ăn thừa đang là vấn nạn trên phạm vi toàn cầu (Syeda Azeem Unnisa, 2015). Ở Việt Nam, chỉ một lượng nhỏ thức ăn thừa được thu hồi để làm thức ăn chăn nuôi. Đa phần, thức ăn thừa được đổ bỏ theo rác sinh hoạt. Thức ăn thừa là nguồn rác thải thải giàu chất hữu cơ nên việc đổ thức ăn thừa theo rác thải thường tạo ra mùi hôi, là nơi trú ẩn của côn trùng và vi sinh vật có hại đến sức khỏe con người (Jayathilakan et al , 2012). Ngoài ra,việc phân hủy thức ăn thừa tại các bãi rác tạo ra một lượng không nhỏ CH4 và CO2 tác nhân gây hiệu ứng nhà kính. Vì vậy, Syeda Azeem Unnisa, (2015) cho rằng, việc xử lý thức ăn thừa tại các bãi rác là không tốt cho môi trường và kém bền vững. Các tác giả cho biết, sử dụng các vi khuẩn như Bacillus subtilis và Lactobacillus spp. để phân hủy thức ăn thừa trong điều kiện thiếu oxy, tạo phân bón dạng lỏng là một hướng đi đầy triển vọng vừa làm giảm ô nhiễm môi trường, vừa tạo được phân bón hữu cơ thay thế cho phân bón vô cơ trong sản xuất nông nghiệp. Trong số các chủng vi sinh vật được dùng để phối trộn vào thức ăn thừa để chế tạo phân bón vi sinh thì có hai chủng được biết đến nhiều là Bacillus subtilis và Lactobacillus (Ieshita et al. 2011, Syeda Azeem Unnisa, 2015). Tuy nhiên, ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn để phân hủy thức ăn thừa, tạo phân bón dạng lỏng. Xuất phát từ thực tế trên, nhóm sinh viên tiến hành thực hiện đề tài “ Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón lá”. 1
  13. Đồ án tốt nghiệp 2. Tình hình nghiên cứu 2.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự (2005), đã tuyển chọn từ 70 chủng vi khuẩn phân giải protein (phân lập từ ao nuôi tôm) hai chủng có hoạt tính protease mạnh là P42 và P62. Đã khảo sát điều kiện sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp protease của chúng. Kết quả cho thấy, trong môi trường Vinogradski dịch thể cả hai chủng vi khuẩn đều thích nghi với pH môi trường là 8.0, thời gian nuôi cấy 42 giờ ở nhiệt độ 300C. Chủng P42 thích hợp với nguồn carbon là rỉ đường còn chủng P62 là glucose và cả hai chủng vi khuẩn sinh trưởng phát triển cũng như sinh tổng hợp protease mạnh nhất với nguồn nitrogen là gelatine. (Phạm Thị Ngọc Lan và Nguyễn Công Minh, 2005) Nguyễn Văn Hiếu và ctv (2010), đã tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp protease kiềm của chủng B. subtilis HT24 phân lập ở Việt Nam. T9. Nguyễn Hiền Trang và ctv (2010), cũng tuyển chọn và nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease ngoại bào của vi khuẩn B.amyloliquefaciens. Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009. Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm. 2.2. Tình hình nghiên cứu enzyme protease ngoài nước Protease chiếm khoảng 60% tổng số enzyme thương mại trên thế giới và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Trong công nghiệp sản xuất enzyme thường sử dụng vi sinh vật để sản xuất protease bởi chúng có thời gian sinh trưởng nhanh và chi phí thấp, đem lại lợi ích kinh tế cho việc thương mại hóa sản phẩm (Lưu Thị Nguyệt Minh, 2007). 2
  14. Đồ án tốt nghiệp Naidu K.S và ctv (2005) xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của protease là 550C ở pH 9 với tỷ lệ giống 4% (w/v) cấy trong môi trường có chứa cám gạo 1% sau 96 giờ. (Naidu K.S.B., Devi K.L, 2005). Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu khác nhau về hoạt tính enzyme protease của các chủng Bacillus, đặc biệt là Bacillus subtilis. (Đỗ Thị Bích Thủy, 2012). Tác giả Kumar và cộng sự (2010) đã cố định tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis vào các chất mang khác nhau, sau đó đem nuôi cấy để thu enzyme protease có hoạt độ cao nhất là 10,8 UI/ml trên chất mang gelatin (Kumar R. and Vats R, 2010). Yang và ctv (2000) đã nghiên cứu khả năng tách protein trong phế thải vỏ tôm, cua, tôm hùm của chủng vi khuẩn B. subtilis bằng cách lên men trong môi trường lỏng với các phế thải chưa xử lí. Tác giả cho thấy rằng hiệu quả tách protein của chủng này khá cao, nó tách protein khỏi vỏ tôm, cua, tôm hùm lần lượt là 88%, 67% và 83% trong điều kiện nuôi cấy ở 30oC, thời gian là 96 giờ (Yang J.K., Shih I.L., Tzeng Y.M., Wang S.L, 2000). Ghafoor và ctv (2008) cùng nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho sản xuất protease ngoại bào từ B. subtilis AG-1 và B. subtilis EAG-1. Kết quả pH môi trường tối ưu lần lượt là 7 và 7,2, nhiệt độ là 35oC và 37oC, thể tích ủ khoảng 1% (v/v). Thời gian nuôi cấy thích hợp từ 24 - 32 giờ cho cả hai chủng (Ghafoor A., Hasnain S, 2008). Das và ctv (2010) nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp để B. subtilis sản xuất protease với lượng lớn. Vi khuẩn Bacillus subtilis tăng trưởng tối ưu ở 37ºC trong 48 giờ ở pH 8,0 với nguồn carbon và nitơ thử nghiệm với tối ưu tăng trưởng trong dextrose và peptone tương ứng sản xuất protease tốt nhất, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp. 3
  15. Đồ án tốt nghiệp Hindhumathi và ctv (2011) đã xác định điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp protease ngoại bào của chủng vi khuẩn Bacillus GPA4. Trong môi trường nuôi cấy có bổ sung 0,1% casein, với nguồn carbon là glucose, nguồn nitrogen là bột đậu nành, pH 8,0, thời gian nuôi cấy 24-36 giờ, tốc độ lắc 100 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất enzyme với hoạt độ protease mạnh nhất (Hindhumathi M., Vijayalakshmi S., Thankamani V, 2011). 2.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis và Lactobacillus tạo phân bón vi sinh. 2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước. Phạm Văn Toản đã nghiên cứu áp dụng công nghệ mới nhằm mở rộng việc sản xuất, ứng dụng phân VSV cố định đạm và phân giải lân phục vụ phát triển nông nghiệp bền vững. (Phạm Văn Toản , 2002). Lê Thị Thanh Thủy đã chọn được chủng Bacillus velezensis (kí hiệu M), Bacillus subtilis (kí hiệu Ba51), chủng Bacillus polymyxa (kí hiệu B14) và chủng Lactobacillus farraginis (kí hiệu L15) được phân lập từ các vùng trồng ớt và các cây họ cà, các chế phẩm sinh học và sản phẩm lên men truyền thống trong việc tạo chế phẩm VSV hỗn hợp để nâng cao năng suất , chất lượng và hiệu quả trồng trọt của ớt cay và ớt ngọt thông qua việc ứng dụng chế phẩm làm tăng hiệu quả sử dụng dinh dưỡng và hạn chế bệnh héo rũ, thối quả cho cây trồng (Lê Thị Thanh Thủy, 2010). Nguyễn Văn Thao và ctv,đã sử dụng hỗn hợp các chế phẩn VSV gồm: CPVSV1 ( Penicillum sp, Aspergillus sp., Psendomonas sp., Saccharomyces sp, Bacillus sp, Streptomyces sp); CPVSV2 (Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis; Bacillus mycodes; Streptomyces sp. F; Saccharomyces cerevisiae); CPVSV3(Bacillus subtilis, Streptomyces sp. F, Aspergillus oryzae, Kluyveromyces marxianus, Trichoderma spp) để sản xuất phân hữu cơ sinh học từ bã nấm và phân 4
  16. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Rengathavasi và ctv (2011) đã phân lập được chủng Lactobacillus delbrueckii từ bánh dầu có khả năng phân giải dầu thô một cách tự nhiên và dùng bổ sung trong xử lý phân giải sinh học đồng thời phối trộn vào phân bón cho hiệu quả cao. Kengo Yamada và Hui-Lian Xu (2008) đã chứng minh được tác động có lợi trực tiếp của phân bón vi sinh chứa các vi sinh vật như Lactobacillus spp, nấm actinomycetes và nấm men cũng như tác động gián tiếp của các sản phẩm chuyển hóa 2.3.3. Tình hình sử dụng phân bón VSV ở Việt Nam Các nhóm VSV chính sử dụng làm phân bón sinh học bao gồm: VSV cố định nitơ, VSV phân giải hợp chất photpho khó tan, VSV tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật, VSV đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng và VSV chuyển hoá chất hữu cơ. Theo số liệu của Hiệp hội Phân bón Việt Nam (FAV), nhu cầu phân bón ở Việt Nam hiện nay vào khoảng trên 10 triệu tấn các loại. Trong đó, Urea khoảng 2 triệu tấn, DAP khoảng 900.000 tấn, SA 850.000 tấn, Kali 950.000 tấn, phân Lân trên 1,8 triệu tấn, phân NPK khoảng 3,8 triệu tấn, ngoài ra còn có nhu cầu khoảng 400.000 - 500.000 tấn phân bón các loại là vi sinh, phân bón lá.Tuy nhiên, theo thông tin thực tế thì hiệu suất sử dụng phân bón hiện nay mới chỉ đạt 40-45% với phân đạm, 25-30% với phân lân và khoảng 55-60% với phân kali. Như vậy, nếu ước tính hiệu suất sử dụng các loại phân bón trung bình khoảng 45-50%, có nghĩa lượng phân bón bị thất thoát ra môi trường hoặc bị cố định trong đất, cây trồng không sử dụng được chiếm 50-55% (tương đương trên 5 triệu tấn) thì mỗi năm ngành nông nghiệp đã lãng phí khoảng 40-44 nghìn tỷ đồ.(Tập đoàn hoá chất Việt Nam, 2.3.4. Một số chế phẩm sinh học được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus và Lactic Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế phẩm VSV hữu hiệu bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic. Hiệu quả của chế 5
  17. Đồ án tốt nghiệp phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường. Chế phẩm sinh học Lactobacillus acidophilus được sử dụng nhiều nhờ lợi ích từ sản phẩm này đối với sức khỏe con người và vật nuôi, tổng hợp vitamin, sinh chất diệt khuẩn, acid lactic. 2.4. Tình hình chất thải từ lượng thực phẩm thừa 2.4.1. Tình hình chất thải thực phẩm thừa trong nước Theo Tổ chức Nông-Lương Liên Hợp Quốc (FAO), mỗi năm có 1,3 tỉ tấn lương thực bị lãng phí. Khối lượng này tương đương với giá trị sản xuất được của khu vực Châu Phi cận Sahara. Đồng thời, cứ 7 người trên thế giới có 1 người đói và hơn 20.000 trẻ em dưới 5 tuổi chết mỗi ngày vì đói. Với nỗ lực duy trì sự sống cho 7 tỉ người trên toàn thế giới, FAO ước tính khoảng 1/3 sản lượng thực phẩm toàn cầu hoặc là bị lãng phí hoặc bị mất mát. Trong đó, chất thải thực phẩm là một nguồn thải khổng lồ đối với tài nguyên thiên nhiên và gây ra các tác động tiêu cực về môi trường. Và theo đó, tác động ngược lại đến chính sức khỏe của người dân như đối mặt với nguồn nước ô nhiễm, không khí ô nhiễm và cả không gian ô nhiễm cũng không là ngoại lệ (Dương Hà - Phạm Ngọc, 2017). 2.4.2. Tình hình chất thải thực phẩm thừa trên thế giới Các phương pháp xử lí thường tạo ra mùi hôi do các hợp chất nitơ và lưu huỳnh thoát ra trong quá trình xử lí. Phần lớn chi phí cho việc xử lí chất thải của thành phố dao động từ 75% đến 80% ngân sách của thành phố và thêm 30% chi phí cho việc đổ rác (Arvanitoyannis, 2008 ). Năm 2012 có khoảng 9.278 tấn chất thải rắn đô thị đã được xử lý tại các bãi rác mỗi ngày, trong đó khoảng 3.337 tấn là chất thải thực phẩm. Gần 809 tấn chất thải thực phẩm được tạo ra từ nhà hàng, khách sạn, chợ ướt, sản xuất và chế biến 6
  18. Đồ án tốt nghiệp thực phẩm. Chất thải thực phẩm có hàm lượng chất hữu cơ cao, nhưng thực tiễn cho thấy việc xử lý rác thải thực phẩm ở bãi chôn lấp không thân thiện và bền vững, làm giảm diện tích đất, tạo ra mùi khó chịu (Birdie và ctv, 2014). Tại Hàn Quốc đã tăng 8% mỗi năm nhưng đạt đến đỉnh điểm vào năm 1991 và giảm sau đó. Tuy nhiên, chất thải thực phẩm vẫn duy trì tỷ lệ cao (31,6%) và thành phần chất thải dự kiến khoảng 41% tổng lượng chất thải rắn đô thị (Ministry of Environment, 1996 và Environmental Newspaper, 1996). Tại Ấn Độ, gần 700 triệu tấn chất thải hữu cơ được tạo ra hàng năm, dẫn đến những thách thức đối với việc xử lý chất thải an toàn, với chất thải thường được đem đi đốt hoặc đổ đầy tại các bãi chôn lấp (Bhiday 1994, Nagavallemma và cộng sự 2006, Zeinhom và cộng sự 2010) Tại EU, ước tính khoảng 88 triệu tấn thực phẩm bị lãng phí hàng năm, khoảng 20% lương thực,thực phẩm được sản xuất và 95-115 kilogam thực phẩm / người mỗi năm. EU đang nỗ lực để giảm tác động đến môi trường của chất thải thông qua chiến lược kinh tế bằng cách duy trì giá trị của nguyên vật liệu trong nền kinh tế càng lâu càng tốt và để giảm lượng rác thải đặc biệt là chất thải thực phẩm thừa ( Stoknes và ctv, 2016). Sự sản xuất thực phẩm ở Mỹ sử dụng khoảng 50% diện tích đất của họ, và sử dụng 80% tổng lượng nước sạch được tiêu thụ. Tuy nhiên, khoảng 40% tổng sản lượng lương thực là chất thải tương đương với 165 tỷ USD mỗi năm (Gunders, 2012). Ngược lại, hiện nay hơn một tỷ người bị suy dinh dưỡng mãn tính (Foley và ctv 2011). Về lý thuyết, tổng lượng chất thải thực phẩm sản xuất ở Bắc Mỹ và Châu Âu có thể có khả năng giảm tình trạng đói nghèo trên thế giới ba lần (Stuart, 2009). 3. Mục đích nghiên cứu Nhân sinh khối được chủng Bacillus subtilis và Lactobacillus để tăng cường quá trình thủy phân thức ăn thừa tạo ra được phân bón dạng lỏng. 7
  19. Đồ án tốt nghiệp 4. Phương pháp nghiên cứu 4.1 - Phương pháp tổng hợp tài liệu Nghiên cứu thu thập tài liệu tham khảo, tài liệu internet liên quan đến đề tài. Tổng hợp lựa chọn các đề tài liên quan đến mục tiêu đề tài 4.2 - Phương pháp thu thập và xử lí số liệu + Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát. + Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System (SAS). 5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng: Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH được phân lập từ ruột cá bởi Hồng Sêch Hếnh (2016) và chủng Lactobacillus L2 đã được phân lập bởi và Nguyễn Thị Phương Vy (2015). Phạm vi nghiên cứu + Tuyển chọn chủng có khả năng phân giải enzyme ngoại bào tốt nhất để phối trộn vào thức ăn thừa trong việc tạo chế phẩm phân bón lá. + Khảo sát điều kiện nuôi cấy và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme protease và amylase cho 2 chủng vi khuẩn được tuyển chọn. 6. Kết quả đạt được Tuyển chọn được 1 chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh enzyme ngoại bào cao nhất trong 6 chủng khảo sát. Hoạt hóa lại chủng Lactobacillus L2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho 2 chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn. 8
  20. Đồ án tốt nghiệp Xác đinh được tỷ lệ phối trộn của 2 chủng vào thức ăn thừa để tạo phân bón dạng lỏng. Đánh giá được chất lượng của phân bón được tạo thành thông qua các việc đánh giá sự có mặt của vi khuẩn Coliform, Salmonella, khả năng kích thích sinh trưởng của hạt, của cây trồng. 7. Ý nghĩa đề tài + Ý nghĩa khoa học: Tuyển chọn được chủng Bacillus subtilis có khả năng phân hủy protein, tinh bột và cellulose tốt nhất và khả năng sinh acid lactic của chủng Lactobacillus sp tốt nhất . Đồng thời khảo sát khả năng thủy phân protein khi phối trộn 2 chủng vi khuẩn này lại với nhau. Bên cạnh đó có thể xác định được hình thái khuẩn lạc, điều kiện nuôi cấy, yếu tố môi trường và môi trường nhân sinh khối tối ưu cho các chủng vi khuẩn. + Ý nghĩa thực tiễn: Việc phân hủy thức ăn thừa để tạo chế phẩm phân bón sẽ giảm ô nhiễm môi trường, cung cấp phân bón sạch cho nền nông nghiệp hữu cơ, giảm tiêu tốn ngoại tệ cho việc nhập phân bón từ nước ngoài. 8. Kết cấu đồ án Phần mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu. Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến các dụng cụ , thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án. Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận biện chứng cho kết quả thu được. Phần kết luận và đề nghị: nội dung tóm tắt lại những kết quả mà đề tai đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài 9
  21. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về vi sinh vật dùng để phối trộn vào thức ăn thừa 1.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis 1.1.1.1. Lịch sử nghiên cứu về Bacillus subtilis Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis. (Lý Kim Hữu, 2005) Năm 1941 Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời (Lý Kim Hữu, 2005). 1.1.1.2. Đặc điểm phân loại Bacillus subtilis - Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc: Giới (Kingdom): Bacteria Ngành (Division): Firmicutes Lớp (Class): Bacilli Bộ (Order): Bacillales Họ (Family): Bacillaceae Giống (Genus): Bacillus 10
  22. Đồ án tốt nghiệp Loài (Species): Bacillus subtilis Hì nh 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis 1.1.1.3. Đặc điểm phân bố trong tự nhiên Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. (Cohn, 1872). Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất, đường tiêu hóa của động vật nhai lại và của con người (theo Nguyễn Đức Duy Anh, 2005). Bacillus subtilis thường được tìm thấy trong đất và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 10 – 100 triệu cfu/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì (trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương và chao. Bacillus subtilis đóng vai trò đáng kể về mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học (Vũ Thị Thứ, 1996). Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ là vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như Bacillus popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát 11
  23. Đồ án tốt nghiệp triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB)( theo Hiroshi Fujikawa và Mitsugu Matsushita ,1991). 1.1.1.4. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Bacillus subtilis Bacillus subtilis là trực khuẩn gram dương, hai đầu tròn, phản ứng catalase dương tính, chúng có khả năng tạo bào tử để tồn tại trong môi trường khắc nghiệt. Bacillus subtilis có các roi giúp chúng di chuyển, vì vậy chúng có khả năng di chuyển nhanh chóng trong chất lỏng. Kích thước tế bào của chúng khoảng 0,5- 0,8µm × 1,8-3 µm . Khi gặp điều kiện bất lợi, Bacillus subtilis sẽ hình thành bào tử để vượt qua điều kiện bất lợi, nếu gặp điều kiện thuận lợi bào tử Bacillus subtilis sẽ nảy mầm và phát triển như một tế bào mới với chu kỳ sống mới. Bào tử B.subtilis có hình bầu dục, kích thước khoảng 0,6 - 0,9 µm. Phân bố không theo quy tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm theo (Hong và ctv, 2009). 1.1.1.5. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis Bacillus subtilis có một số test sinh hóa đặc trưng sau: lên men nhưng không sinh hơi các loại đường glucose, maltose, mannitol, sucrose, xylos; Indol (-); VP (+); nitrate (+); H2S (-); NH3 (+); catalase (+); amylase (+); casein (+); citrate (+); có khả năng di động và hiếu khí. (Lý Kim Hữu, 2005) Phản ứng sinh hóa Kết quả Catalase + Indol - MR + VP + Citrate + Nitrate + Gelatin + Di động + Amylase + 12
  24. Đồ án tốt nghiệp Arabinose + Xylose + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis (Theo Holt, 1992) 1.1.1.6. Đặc điểm tế bào và khả năng sinh bào tử a) Đặc điểm tế bào Tế bào Bacillus subtilis hình que, là tế bào gram dương, chúng có khả năng sinh ra bào tử để tồn tại qua thời điểm khó khăn, điều kiện môi trường khắc nghiệt như nhiệt độ tăng cao, môi trường dinh dưỡng cạn kiệt, khô hạn. Thành phần hóa học chủ yếu của vách tế bào là lớp peptidoglycan dày mang diện tích dương đóng vai trò là duy trì cấu trúc của vách tế bào (McKenney và ctv , 2013). b) Cấu tạo bào tử Bacillus subtilis sinh bào tử, chiều ngang bào tử không vượt quá chiều ngang của tế bào vi khuẩn nên không làm thay đổi hình thái tế bào mang bào tử (Ngô Tự Thành và ctv, 2009). Bào tử là một cấu trúc hình thành do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong một giai đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn như điều kiện môi trường không thuận lợi, tế bào phát triển đến một giai đoạn nhất định. Hai chủng vi khuẩn gram dương có khả năng tạo bào tử là Bacillus và Clostridium (Ngô Tự Thành và ctv 2009). Bào tử vi khuẩn là một cấu trúc rất phức tạp (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005), bào tử có nhiều lớp màng bao bọc, lớp ngoài cùng gọi là lớp màng khá mỏng và đó là lớp vỏ của tế bào mẹ,ngay dưới đó là lớp áo bào tử, lớp áo bào tử gồm nhiều lớp 13
  25. Đồ án tốt nghiệp protein mỏng và không có tính thấm, lớp áo bào tử này đảm bảo tính kháng của bào tử (Ngô Tự Thành và ctv, 2009). Vỏ của bào tử gồm nhiều lớp peptidoglycan chiếm một thể tích khá lớn, ít cầu nối nội peptide và ít liên kết chéo. Trong cùng của bào tử là lõi bào tử được vách bào tử bao bọc có cấu trúc như một tế bào bình thường nhưng đang trong tình trạng bất hoạt (McKenney và ctv, 2013). c) Đặc điểm của bào tử Bào tử ở Bacillus subtilis không phải là hình thức sinh sản như ở nấm mà chúng là dạng cấu trúc đặc biệt có tính kháng chuyên biệt giúp chủng loài tồn tại qua giai đoạn điều kiện sống bất lợi. Bào tử không chỉ có khả năng lưu tồn tốt trong những điều kiện khó khăn của môi trường sống mà chúng còn có khả năng sống rất lâu (bào tử trong xác sinh vật cổ đại 1000 năm hoặc dưới đáy băng hà 3000 năm hoặc trong quặng mỏ 250 triệu năm đến nay vẫn còn sống (Ngô Tự Thành và ctv, 2009). Nhiệt độ 1000C, bào tử của một số loài Bacillus có thể chịu đựng được từ 2,5 - 20 giờ. Ngoài việc chịu được nhiệt độ khô cao, bào tử có thể chịu được khô hạn cũng như tác động của nhiều loại hóa chất cũng như các loại tia sáng. Quá trình hình thành bào tử: các tế bào sinh bào tử trong những điều kiện thiếu thức ăn hoặc có tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình hình thành bào tử.Trong bào tử nước liên kết chiếm đến 40% và chứa nhiều ion Ca2+ (Ngô Tự Thành và ctv, 2009) d) Sự nảy mầm của bào tử Quá trình chuyển từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn được gọi là quá trình nảy mầm của bào tử. Quá trình gồm 3 giai đoạn là: hoạt hóa, nảy mầm và sinh trưởng. Khả năng tạo bào tử: theo Bùi Thị Phi (2007) thì một trong những đặc điểm quan trọng nhất của Bacillus subtilis là khả năng sinh bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis hình thành bào tử theo chu kỳ sống hay khi gặp điều kiện bất lợi (Ngô Tự Thành và ctv, 2009). 14
  26. Đồ án tốt nghiệp Theo Bùi Thị Phi (2007) sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn và mất đến 8 giờ để hoàn tất. e) Ứng dụng của Bacillus subtilis trong sản xuất và đời sống ( Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009) Trong nông nghiệp, Nhật Bản có sản phẩm EM dùng sản xuất phân bón hữu cơ. 1983 viện vaxcin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất Biosubtyl dạng bột khô rất thuận tiện cho người sử dụng. Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội đã sản xuất chế phẩm subtin từ Bacillus subtilis để phòng trừ nấm bệnh Ostriniaa furnacalis trên bắp. 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Kumura từ Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm Aspergillus Flavus, A. paraciticus. 1977, Nguyễn Vĩnh Phước, Bacillus subtilis tạo kháng sinh subtilin và Bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gr+ và Gr-. 1.1.2. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus 1.1.2.1. Lịch sử nghiên cứu về Lactobacillus. Trong suốt 15 năm qua, các nhà nghiên cứu đã tìm ra được gần hơn 25 loài khác nhau từ các chi Lactobacillus trong đó phải kể đến các chủng tiêu biểu như Lactobacillus acidophilus (L.acidophilus), Lactobacillus casei (L.casei), Lactobacillus fermentum (L.fermentum), Lactobacillus plantarum (L.plantarum), Lactobacillus brevis (L.brevis) hay Lactobacillus bulgaricus (L.bulgaricus) (M.Champ và ctv, 1983). Phần lớn các chủng Lactobacillus có nguồn gốc từ dạ dày – ruột người và trong âm đạo. Hầu hết chúng đều có khả năng chuyển đường thành acid lactic, ngoài ra nó còn có thể tiết ra Bacteriocin – một loại hợp chất có hoạt tính kháng 15
  27. Đồ án tốt nghiệp khuẩn có phổ ức chế vi sinh vật khá rộng và không gây ra tính kháng kháng sinh ở các vi khuẩn gây bệnh. Hiện nay chúng là đối tượng nghiên cứu chính về probiotic cho con người vì có tiềm năng trong việc điều trị các bệnh viêm nhiễm, kháng các vi khuẩn gây bệnh, khử cholesterol huyết thanh, chống ung thư mang nhiều lợi ích đối với sức khỏe con người. Ngoài ra Lactobacillus còn điều hòa các miễn dịch không đặc hiệu bằng cách kích thích hoạt động của lympho bào, các đại thực bào và giảm cytokine. (Lee và Seppo, 2009) Bên cạnh đó Lactobacillus từ lâu đã được ứng dụng trong thương mại đặc biệt là trong lĩnh vực thực phẩm nhất là trong công nghiệp sản xuất các thực phẩm lên men chua như sữa chua, phô mai, bắp cải muối, dưa chua, bia, rượu vang, rượu táo, kim chi, hoặc trong lĩnh vực y học một số chủng đáng chú ý được biết đến như Lactobacillus acidophilus sản xuất niacin, acid folic và pyridoxine, một nhóm các hợp chất chung được gọi là vitamin B hay chủng Lactobacillus GG được phân lập từ người trong những năm 1980 bởi tiến sĩ Sherwood Gorbach và Barry Goldin (Kandler và ctv 1984). Lactobacillus GG là một hứa hẹn tuyệt vời do chúng có thể sống trong đường ruột, ở đó các vi khuẩn tạo ra một hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn giúp duy trì hệ vi sinh đường ruột khỏi vi khuẩn xâm nhập. 1.1.2.2. Phân loại vi khuẩn Lactobacillus Theo khóa phân loại của vi khuẩn của Bergey’s (Kandler và ctv 1984). Lactobacillus được phân loại như sau : Giới (Kingdom): Bacteria Ngành (Phylum): Firmicutes Lớp (Class): Bacilli Bộ (Order): Lactobacillales Họ (Family): Lactobacillaceae Chi (Genus): Lactobacillus 16
  28. Đồ án tốt nghiệp Loài (Species): Lactobacillus spp. 1.1.2.3. Đặc điểm phân bố Phần lớn các loài Lactobacillus là nhóm vi khuẩn có nguồn gốc từ dạ dày – ruột người, âm đạo. Chúng thường phân bố tương đối rộng rãi trong tự nhiên, có nhiều ở các môi trường sống chứa nhiều cacbohydrate và trong hầu hết các thực phẩm lên men như sữa chua, kim chi, phô mai, trong đường ruột của động vật, thủy sản và trong đường ruột, đường tiết niệu, đường sinh dục của người (Kandler và ctv, 1984). 1.1.2.4. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus spp. Lactobacillus là một nhóm gồm đa dạng các loài vi sinh vật. Chúng là những vi khuẩn Gram dương, kích thước lớn 0,5 – 1,2 μm × 1 - 10 μm, đại bộ phận các loài không di động, không sinh bào tử, hình dạng thay đổi: dạng que thẳng dài, que hơi cong như hình lưỡi liềm cho đến hình cầu có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng rẽ (Cintas và ctv, 2001). Hì nh 1.2. Hình dạng tế bào của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus 1.1.2.5. Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus spp. Vi khuẩn Lactobacillus là vi khuẩn kị khí tùy nghi, chịu môi trường acid, có nhu cầu về dinh dưỡng phức tạp, phát triển trong điều kiện kị khí và sinh acid lactic (Mair và ctv 1986). Nhiệt độ phát triển tối ưu thường là 30 – 450 C, pH tối ưu là 5,5 17
  29. Đồ án tốt nghiệp – 6,8. Lactobacillus được đặc trưng bởi khả năng sản xuất acid lactic là một sản phẩm của quá trình chuyển hóa glucose. Dựa trên các sản phẩm của quá trình biến dưỡng để phân chia các loài Lactobacillus chia thành 2 nhóm: lên men đồng hình và lên men dị hình (Nguyễn Lân Dũng, 2000; Nguyễn Đức Lương, 2006; Đồng Thị Thanh Thu, 2003). + Nhóm lên men lactic đồng hình (điển hình): là quá trình lên men trong đó các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, aceton, di-acetyl Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men: 4 C6H12O6 2CH3CHOHCOOH + 21,8 x 10 J Các vi khuẩn lên men lactic đồng hình phân giải glucose theo con đường Embden - Mayerhof, nhưng chúng không có đủ enzyme carboxylase nên acid pyruvic không bị phân giải tiếp tục mà chỉ nhận hydro để tạo thành acid lactic, một phần nhỏ acid lactic bị decarboxyl để tạo một lượng nhỏ sản phẩm phụ nói trên. Lên men lactic đồng hình có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và công nghệ thực phẩm, đặc biệt là trong công nghệp sữa như sản xuất sữa chua, phomai. Các chủng vi khuẩn tham gia trong kiểu lên men này chủ yếu là hai giống: Lactobacillus (Lactobacillus bulgaricum, Lactobacillus plantarum, ) và Streptococcus (Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, ) + Nhóm lên men lactic dị hình: là quá trình lên men tạo sản phẩm đa dạng, ngoài acid lactic còn hàng loạt các sản phẩm khác với tỉ lệ khá cao như: acid lactic 40%, acid sucxinic và ethanol 20%, acid acetic 10% , các chất khí (CO2, H2) 20% Phương trình chung biểu diễn cho quá trình lên men C6H12O6 CH3CHOHCOOH + HOOC(CH)2COOH + CH3COOH + C2H5OH + CO2 18
  30. Đồ án tốt nghiệp Theo giả thuyết hiện nay, trong hệ vi khuẩn lactic dị hình thiếu các enzyme chủ yếu của con đường Embden – Mayerhoff đó là aldolase, triosephosphate isomerase. Vì thế giai đoạn đầu của sự phân giải glucose xảy ra theo con đường pentosephosphate, tạo ra sản phẩm trung gian là xilulose-5-phosphate, sau đó nó bị phân hủy thành andehit photphoglycerinic và acetyl photphat tiếp tục chuyển hóa theo 2 hướng để tạo etanol và acid acetic. Quá trình lên men dị hình tạo nhiều sản phẩm nên việc tách và cô lập các sản phẩm khác nhau rất tốn kém. Tuy nhiên quá trình này cũng có vai trò rất quan trọng trong việc chế biến một số loại thực phẩm. vi khuẩn lactic dị hình có thể làm cho sản phẩm có mùi vị thơm ngon và đặc trưng hơn Khuẩn lạc của Lactobacillus thường có hình tròn, màu trắng đục hoặc trắng sữa có bờ đều, láng và lồi, mờ đục. Chúng không tạo mùi đặc trưng trên môi trường nuôi cấy thông thường (Sharpe và ctv, 1966). 1.1.2.6. Khả năng phân giải protein của vi khuẩn Lactobacillus. Đa số các loài Lactobacillus có khả năng sản sinh enzyme phân giải protein. Phổ biến trong số đó là các chủng Lactobacillus bulgaricus, L. casein, L. paracasein, L. fermentum và L. plantarum. Hệ enzyme phân giải protein của nhiều loài Lactobacillus mang tính đặc hiệu cao tuy nhiên ở enzyme của một số loài lại có tính đặc hiệu ở phổ rộng dẫn đến có nhiều vùng cắt đặc hiệu cho một cơ chất.Hoạt tính này giúp cho các chế phẩm lên men từ Lactobacillus trở thành nguồn dinh dưỡng có giá trị cao cho con người, động vật hoặc trong phân bón. 1.1.2.7. .Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn như các acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic), hydrogen peroxide, carbondioxide và diacetyl và đặc biệt là bacteriocin. (Nguyễn Thế Trang, 2011; Ouwehand và ctv, 1999) Nhiều vi khuẩn Gram (+), Gram (-) bị ức chế bởi hydrogen peroxide. (Nguyễn Thế Trang , 2011; Hollang và ctv, 1987). 19
  31. Đồ án tốt nghiệp Acid lactic do vi khuẩn Lactobacillus sinh ra cùng với các cơ chất khác sẽ tạo một môi trường bất lợi cho vi sinh vật gây thối trong đường tiêu hóa phát triển do đó lượng urase trong ruột giảm, hơn nữa pH thấp do acid lactic tạo ra gây trở ngại cho NH3 hấp thu từ ruột vào mô và thúc đẩy việc bài tiết NH3 từ máu vào ruột. Những vi khuẩn gây thối rửa ở ruột kết tạo các enzyme β-glucuronidase, azoreductase và nitroreductase thành carcinogen (chất có vai trò trong việc hình thành và phát triển khối u), bằng các ức chế cạnh tranh và tạo môi trường acid không thuận lợi (Ivanova và ctv 2000) Lactobacillus đã kiềm hãm sự trao đổi chất của vi khuẩn trong ruột điều này làm giảm sự hình thành carcinogen ở ruột già. (Muralihara và ctv, 1977; Gilliland và ctv, 1980). Ngoài ra còn phải đặc biệt kể đến các bacteriocin, đây là các hợp chất không có tính kháng sinh điển hình tức chỉ kìm hãm mà không tiêu diệt vi sinh vật. Điển hình như plantaricin được tạo ra từ Lactobacillus plantaru (Joerger và ctv, 2000). 1.2. Tổng quan về enzyme 1.2.1. Enzyme protease Protease là enzyme xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptide [-CO-NH-], giữa các loại acid amin trong phân tử protein để tạo thành acid amin. 1.2.1.1. Sơ lược về lịch sử nghiên cứu protease Từ trước thế kỷ 17 con người đã biết sử dụng rộng rãi các quy trình enzyme vào hoạt động thực tế như làm bánh mì, bia rượu , nhưng việc ứng dụng trong giai đoạn này hoàn toàn mang tính chất kinh nghiệm. Từ thế kỷ 18, các nhà tự nhiên học Pháp là Reomur đã làm thí nghiệm và đã phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt. Năm 1936, Schawm đã quan sát được hoạt dộng phân giải protein của dịch vị. Năm 1937, Covisar đã tách được Trypsin từ dịch tụy và cũng là protein đầu tiên nhận được dưới dạng chế phẩm dù vẫn chưa được tinh sạch. - 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm Chymozin . 20
  32. Đồ án tốt nghiệp - 1879, Wutz tách thành công protein từ thực vật, bằng phương pháp tủa cồn lạnh ông đã thu nhận được papain từ cây đu đủ. - 1918-1919, Waksman đã phát hiện ra khả năng phân giải protein của xạ khuẩn. - Từ năm 1950 protease của vi sinh vật được chú ý nghiên cứu và có một số công trình nghiên cứu như: - Subtilizin A từ Bacillus subtilis của Guntelberg và Ottensen,1950 - Peptidase A từ Streptococcus của Elliot, 1950. - Protein kiềm từ Aspergillus oryzae của Crewther và Lennox, 1950. - Aspergillopeptidase từ Aspergillus satoi của Yoshida, 1956. - Protease kiềm từ Pseudomonas aeruginosa của Morihara, 1957. - Subtilopeptidase từ Bacillus amyloliquefaciens của Hagihara cùng cộng sự, 1958. - Keratinase từ Streptomyces fradiae của Nickerson và Durand, 1963. (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013). 1.2.1.2. Phân loại Có thể phân loại protease thành các dạng sau (Nguyễn Huỳnh Mai Nhi, 2015) - Endopeptidase: cắt ngẫu nhiên nội phân tử sợi polypeptide hay còn gọi là proteinase. - Exopeptidase cắt liên kết peptide ở đầu N (aminopeptidase) hoặc đầu C (carboxypeptidase) Protease là nhóm enzyme phân giải protein mà phần lớn được tế bào tiết ra bên ngoài và hoạt động ở bên ngoài tế bào là chủ yếu. Protease có chức năng sinh học rất đa dạng, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa quá trình trao đổi chất ở sinh vật sống (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013). Protease là nhóm enzyme phân giải protein gồm các enzyme phân giải như trypsin (là endopeptidase tác động lên liên kết nội phân tử từ protein của amino acid có tính kiềm như Agr, His, Lys), pepsin (là endopeptidase tác động lên liên kết 21
  33. Đồ án tốt nghiệp peptide nội phân tử protein của aminoacid có vòng thơm như Phe, Tyr, Trp), chymotrypsin là nhóm endopeptidase tác động lên liên kết peptide nội phân tử mà nhóm carboxyl thuộc về một amino acid có vòng thơm, aminopeptidase là exopeptidase tác động lên liên kết peptide của amino acid ở đầu N của sợi polypeptide, carboxypeptidase là exopeptide tác động lên liên kết peptide của amino acid ở đầu C của sợi polypeptide. Theo phân loại quốc tế thì protease được chia làm 4 phân nhóm phụ: Aminopeptidase, Carboxypeptidase, Dipeptihydrolase, Proteinase. Nếu phân loại theo trung tâm hoạt dộng thì protease được chia làm 4 nhóm nhỏ (Barret, 1984): Protease serine (EC 3.4.21.) Là protease có nhóm (-OH) của serin trong trung tâm hoạt động, các protease nay thường hoạt động trong vùng pH kiềm và tính đặc hiệu tương đối rộng. Protease cysteine (EC 3.4.22.) Là nhóm protease có nhóm thiol của acid amin cysteine trong trung tâm hoạt động, nhóm (-SH) này có vị trí đặc biệt trong trung tâm enzyme vì nó có khả năng tham gia phản ứng cao, tham gia nhiều biến đổi hóa học. Protease aspatic (EC 3.4.23.) là nhóm protease có nhóm (-COOH) trong trung tâm hoạt động. nhóm protease này hoạt động mạnh ở vùng pH acid. Protease kim loại (EC 3.4.24.) Là những enzyme mà trung tâm hoạt dộng của nó có những ion kim loại, nhóm này thường hoạt động ở vùng pH trung tính. Theo nồng độ pH thì protease được chia làm 3 nhóm: protease acid, trung tính và kiềm (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013). Cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cơ chế chung như sau: E+S →E-S→E-S*+P1 → E+ P2. Trong đó: E là enzyme, S là cơ chất. E-S là phức chất enzyme-cơ chất E-S* là phức chất trung gian enzyme- cơ chất hóa P1 là sản phẩm đầu tiên của phản ứng P2 là sản phẩm thứ 2 của phản ứng 22
  34. Đồ án tốt nghiệp 1.2.1.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật Vi sinh vật có protease ngoại bào và nội bào, mỗi loại có một vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật. Protease ngoại bào phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong nhiều dung dịch thành các phân tử thấp để vi sinh vật hấp thụ. Protease nội bào phân giải các peptide được đưa từ bên ngoài vào thành các acid amin để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S. Tham gia quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme và việc này có thể có nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật, chúng còn có thể phân hủy các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến hoặc tham gia vào quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. (Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009) 1.2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật Quá trình tổng hợp enzyme protease chịu nhiều tác động của các yếu tố vật lý môi trường khác nhau như nhiệt độ, độ pH, nồng độ oxy, thành phần môi trường Mỗi loài vi sinh vật có một ngưỡng nhiệt độ khác nhau tối ưu cho loài, và cho từng chủng loài, nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ và hoạt tính của enzyme được tổng hợp, như ở loài Bacillus subtilis thì ngưỡng nhiệt độ tối ưu cho loài này phát triển và sinh enzyme là 370C. pH của môi trường cũng ảnh hưởng lớn đến quá trình lên men của vi sinh vật. Thành phần môi trường cũng là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme, để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn C,N thích hợp. Đối với chủng Bacillus subtilis thì khi môi trường nuôi cấy tăng sinh có bổ sung thêm rỉ đường nồng độ 2% thì hiệu quả sinh tổng hợp protease sẽ là tốt nhất (Cohn, 1872), trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu enzyme protease cần phải có chất cảm ứng và các nguồn nitơ hữu cơ (Nakano và ctv, 1998). 1.2.1.5. Ứng dụng Protease từ vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và dược phẩm như công nghiệp chế biến thực phẩm (chế biến cá, thịt, sữa, làm bánh mì hay sản 23
  35. Đồ án tốt nghiệp xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein cho những người bị bệnh tiêu hóa do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme (Nakano và ctv, 1998) Protease còn được ứng dụng rộng rãi trong thức ăn chăn nuôi dưới dạng phối trộn hoặc probiotic như: enzymebiosub của công ty vaxcin và sinh phẩm số 2, Baciflora for Shrimp, VIME 1.2.2. Enzyme amylase Amylase là enzyme xúc tác làm cho quá trình thủy phân tinh bột, glycogen và các polysaccharide tương tự diễn ra nhanh hơn, theo tính chất và tính đặc hiệu với liên kết glucoside, amylase được chia làm ba loại là α-amylase, β-amylase và glucoamylase (γ- amylase), tuy nhiên các chủng Bacillus thường chỉ có khả năng tổng hợp được α-amylase mà không tổng hợp được β-amylase và glucose amylase. Trong số khoảng 100 enzyme công nghiệp thì có hơn một nửa là có nguồn gốc từ nấm mốc và 1/3 từ vi khuẩn. Enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật được ưa chuộng hơn so với từ những nguồn khác vì chúng rẻ hơn, dễ kiểm soát, nguyên liệu dễ tìm và khả năng thu hồi và tinh sạch đơn giản hơn do chúng không chứa các hợp chất không mong muốn như phenol (ở thực vật) và chất ức chế enzyme (ở động vật) (Nguyễn Hoài Hương, 2015). Tuy nhiên trên thực tế thì phần lớn enzyme được sản xuất từ một số nhỏ chi như Aspergillus, Bacillus, Trichoderma, Saccharomyces 1.2.2.1. Lịch sử phát hiện Những nghiên cứu đầu tiên về enzyme amylase được bắt đầu vào những năm 1811-1814. Những nghiên cứu này do nhà bác học người Nga – viện sĩ K.S Kirhof thực hiện nhằm nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết dại mạch nảy mầm (malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. Amylase thường được tìm thấy trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn. 24
  36. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2.2. Cấu tạo enzyme và cơ chế hoạt động α-amylase là enzyme xúc tác làm cho quá trình thủy phân liên kết α-1,4 glucozid nội mạch ở trong phân tử tinh bột được diễn ra có cơ chất là amylose. α-amylase cho ra sản phẩm thủy phân chủ yếu là maltose (khoảng 87%) và một ít glucose với cơ chất là amylopectin, α-amylase chỉ thủy phân liên kết 1,4 mà không thủy phân được liên kết 1,6 trong phân tử tinh bột. và theo Nguyễn Thị Trần Thụy thì trong họ Bacillus thường gặp rất nhiều chủng phát triển ở nhiệt độ không cao nhưng lại sinh ra α-amylase chịu nhiệt cao (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013). 1.2.2.3. Vi sinh vật tiết enzyme amylase Các vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất trong việc sản xuất và thu enzyme amylase là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Các chủng nấm mốc hay được sử dụng như: Aspergillus, Rhizopus. Các chủng nấm men hay được sử dụng như: Candida, Saccharomyces, Endomycospsis, Endomyces. Các chủng vi khuẩn hay được sử dụng như: Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis, Bacillus lichenformis, Bacillus macecassavarum, Clostridium acetobutylium . Và các chủng vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh, phát triển tốt và ít bị nhiễm các vi sinh vật khác khi nuôi cấy chúng ở nhiệt độ cao. Bacillus subtilis là vi khuẩn ưa ấm sinh amylase mạnh được nghiên cứu sử dụng rộng rãi nhất. Theo Bùi Thị Phi, riêng ở Nhật, hằng năm sản xuất tới hàng chục nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ loài Bacillus subtilis này.(Bùi Thị Phi, 2007). 1.2.2.4. Đặc tính của enzyme amylase α-amylase phân giải các liên kết α-1,4 glucoside ở giữa chuỗi mạch polysaccharide, vì vậy cũng gọi là “endo-amylase” tạo thành các phân tử dextrin phân tử thấp.(Nguyễn Huỳnh Mai Nhi, 2015) 25
  37. Đồ án tốt nghiệp α-amylase không chỉ thủy phân được hồ tinh bột mà nó còn có khả năng thủy phân được cả hạt tinh bột còn nguyên nhưng tốc độ lại rất chậm. Dưới tác dụng của amylase thì độ nhớt của dung dịch giảm mạnh do tinh bột đã bị α-amylase thủy phân thành các phân tử dextrin phân tử thấp, maltose, glucose . α-amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng. α-amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Tất cả enzyme α-amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+ , Hg2+. Có một đặc điểm của enzyme từ vi khuẩn là enzyme α-amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hóa trội hơn hoạt lực đường hóa so với α-amylase của nấm mốc. Amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh bột còn nguyên nhanh hơn 2-2,5 lần so với α-amylase của nấm mốc (Bùi Thị Phi, 2007) pH tối ưu của enzyme α-amylase thu được từ vi khuẩn là 5,8 – 6,0 và vùng hoạt động tốt là khoảng pH từ 5,8 – 7,0. α-amylase của vi khuẩn chịu nhiệt cao hơn rất nhiều so với enzyme này thu được từ nấm mốc ( khoảng 920C so với 700C ở nấm mốc) (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013). β-amylase xúc tác các phản ứng thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside kể từ đầu không khử tạo thành chủ yếu là maltose và dextrin phân tử lớn. (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013). β-amylase không thủy phân hạt tinh bột mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột, β- amylase chỉ phổ biến ở loài thực vật (hạt đang nảy mầm) mà không có ở vi khuẩn (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013). Glucose amylase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside bắt đầu từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide và tạo ra sản phẩm chủ yếu được tạo thành gồm glucose và dextrin (Nguyễn Huỳnh Mai Nhi, 2015). Loại enzyme này có tính chất acid thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5 – 5. 26
  38. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2.5. Sinh tổng hợp enzyme amylase và các yếu tố ảnh hưởng Amylase ở vi khuẩn được có thể được sinh ra trong quá trình phát triển tăng sinh khối của vi sinh vật hoặc chúng có thể được tích trữ dần trong quá trình sinh trưởng và phát triển của mình trong tế bào hay trong môi trường. Riêng đối với chủng Bacillus subtilis thì chỉ tìm thấy được amylase khi vi khuẩn đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng vì amylase ngoại bào được tổng hợp ở tế bào đang chuyển qua thời kỳ tự phân (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013). + Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase. Ảnh hưởng của nguồn carbon dinh dưỡng: các nguồn carbon và nguồn năng lượng dễ hấp thu có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp amylase. (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013) Môi trường nuôi cấy dùng để thu amylase từ vi khuẩn có thể dùng tinh bột, maltose, saccharose và nếu như bổ sung CaCO3 làm tác nhân điều chỉnh pH và pepton thì α-amylase được tổng hợp gấp 2 lần vì trong thành phần môi trường có Ca2+ có tác dụng nâng cao khả năng tổng hợp α-amylase, làm ổn định enzyme có tác dụng bảo vệ enzyme này đối với protease (VASEP, 2015). Để tổng hợp α-amylase thì môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu enzyme này cần có các dạng muối magie, phosphor, Kali , Mangan, kẽm nồng độ muối MnSO4 thích hợp để vi sinh vật tổng hợp α-amylase là 0,05%, thiếu muối thì α- amylase không được hình thành. Điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và sự thông khí cũng ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật (Nakano và ctv 1998) 1.2.2.6. Ứng dụng của enzyme amylase Các amylase vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp bia (thay thế một phần đại mạch), công nghiệp nước chấm, công nghiệp sản xuất glucose, công nghiệp sản xuất bánh mỳ (nâng cao chất lượng bánh), 27
  39. Đồ án tốt nghiệp công nghiệp chế biến rau quả, công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi, công nghiệp giấy, công nghiệp sợi 1.2.3. Enzyme Cellulase Enzyme Cellulase là một phức hợp enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua phân cắt liên kết 1,4-D – glucoside trong cellulose tạo sản phẩm glucose cung cấp cho công nghiệp lên men. Nguồn thu cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật. Hệ cellulase gồm: + endo -(1,4) –β-D-glucanase (EC.3.2.1.4) + exo-(1,4)-β-D-glucanase (EC.3.2.1.91) + β-glucosidases (EC.3.2.1.21) Hoạt động phối trộn thủy phân cellulose thành glucose (Nguyễn Thị Cúc, 2014). 1.2.3.1. Cơ chế tác động của enzyme cellulase Cellulose là enzyme phức tạp xúc tác sự phân giải cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Gồm ba giai đoạn chủ yếu: Giai đoạn 1: dưới tác động của cellulose và các tác nhân của môi trường làm thay đổi tính chất lý hóa của cellulose, làm cho phân tử cellulose từ dạng tinh thể thành dạng hoạt động. Khi phân tử cellulose ở dạng hoạt động, các endocellulose dễ dàng tác động và phân giải chúng thành cellulose hòa tan (polysaccharide), cellotetrose, cellobiose, glucose, mà chủ yếu của giai đoạn này là tạo thành các cellulose hòa tan. Giai đoạn thứ 2: Cellulose biến đổi sau giai đoạn 1 bị phân giải các cellobiose (disaccharide) và cellotetrose dưới tác dụng của exocellulase. Giai đoạn cuối cùng: dưới tác dụng của cellobiose (β-1,4-glucosidase), các đoạn cellobiose bị thủy phân thành glucose, β-1,4-glucosidase là những enzyme rất đặc hiệu thủy phân cellobiose thành D-glucose. (Trần Đông Bách, 2008). 28
  40. Đồ án tốt nghiệp 1.2.3.2. Phân loại và đặc điểm của enzyme cellulase Theo Wood và Mc.Cral (1979) enzyme cellulase được phân chia theo chức năng thành 3 nhóm: Exocellulase (exobiohydrolase; 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase). Endocellulase (endoglucanase; 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase). β-glucosidase (cellbiase; β-D-glucoside glucohydrolase). Hoạt tính của hệ enzyme cellulase đạt cao nhất khi nhiệt độ nằm trong khoảng từ 40- 600C, pH nằm tong khoảng 4 – 7. Cellulase bị ức chế bởi những sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose. Hg2+ ức chế hoàn toàn cellulose, trong khi các ion như Mn2+, Ag+, Cu2+ và Zn2+ chỉ ức chế nhẹ. Hoạt tính của chế phẩm cellulase bị mất hoàn toàn sau 10 – 15 phút ở 800C (Trần Đông Bách, 2008). Exocellulase được tổng hợp bởi Trichoderma reesei và đã được các nhà khoa học nghiên cứu rất kỹ. Chúng bao gồm hai loại: exocellulase kiểu I và exocellulase kiểu II. Exocellulase kiểu I chiếm 60% lượng protein có trong dịch nuôi cấy Trichoderma reesei. Chúng có phân tử lượng khoảng 66.000 Da, điểm đẳng điện là 4,4(PI =4,4). Loại enzyme này tác dụng cả lên cellulose vô định hình và cellulose kết tinh. Nhưng chúng lại không tác đến cellulose biến tính như carboxylmethyl cellulose (CMC) hay hydroxyethycellulose, cellohexaose β-nitrophenyl, β-glucoside hay β-glucan. Exocellulase kiểu I chứa khoảng 496 amino acid (Trần Đông Bách, 2008). Exocellulase kiểu II có phân tử lượng 53.000 Da, PI = 5,0. Chúng cũng không tác động lên CMC, chúng có khả năng tác động đến cellulose hòa tan và cả cellulose không hòa tan. Exocellulose kiểu II chưa khoảng 471 amino acid. Exocellulase của Cellulomonas fimi có một số tính chất khác biệt so với của Trichoderma reesei. Exocellulase của Cellomonas fimi có chứa 443 amino acid. Enzyme này có ba cầu nối disufide. Hai cầu nối disufide nằm trong trung tâm hoạt động còn một cầu nối nằm ngoài trung tâm hoạt động. 29
  41. Đồ án tốt nghiệp Exocellulase của Clostridium thermocellum có phân tử lượng 68.000 – 75.000 Da. Endoglucanase có nhiều trong dịch nuôi cấy Trichoderma reesei. Các nhà khoa học chia chúng thành hai loại endoglucaase kiểu I và endogglucanase kiểu II. Endoglucanase kiểu I chứa 459 amino acid, phân tử lượng khoảng 48.121 Da. Edoglucanase kiểu II chứa 418 amino acid, phân tử lượng 42.200 Da. Các enzyme này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao . Ngoài ea endoglucanase còn được tìm thấy ở Clostridium themocellum, Cellulomonas fimi và các vi sinh vật khác. Các endoglucanase của các vi sinh vật khác thường không khác biệt nhiều. β-glucosidase là nhóm enzyme khá phức tạp, chúng có khả năng hoạt động trong pH rất rộng (pH từ 4,4 – 8,4), phân tử lượng 50.000 – 98.000 Da, PI (isoeletric point) 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao. Β-glucosidase của Trichoderma reesei chứa đến 713 amino acid với phân tử lượng là 75.340 Da. Trong dịch chiết, chúng chiếm 1% so với tổng lượng protein thu được. β- glucosidase của Clostridium thermocellum được chia làm hai loại β-glucosidase A và β-glucosidase B. β-glucosidase A chứa khoảng 448 amino acid và có phân tử lượng 51.82 Da. Chúng hoạt động mạnh ở pH 6,0 – 6,5 và ở nhiệt độ 60oC. Chúng tham gia thủy phân cellobiose nhưng không thủy phân CMC (Trần Đông Bách, 2008). 1.3. Tổng quan về phân bón 1.3.1. Khái niệm Phân bón là những chất hoặc hợp chất có chứa một hay nhiều chất dinh dưỡng thiết yếu đối với cây trồng, giúp cây trồng sinh trưởng, phát triển tốt cho năng suất và chất lượng cao hoặc làm tăng độ phì nhiêu của đất. Trong phân bón có chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của cây trồng. Thiếu phân cây sẽ không thể sinh trưởng, phát triển và cho năng suất, phẩm chất cao. Các loại phân bón hữu cơ và một số loại phân bón khai thác vô cơ đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ, trong khi các loại phân bón hoá học tổng hợp vô cơ chỉ 30
  42. Đồ án tốt nghiệp được phát triển mạnh từ thời cách mạng công nghiệp. Sự hiểu biết và sử dụng tốt các loại phân bón là những thành phần quan trọng của cuộc Cách mạng Nông nghiệp Anh (tiền công nghiệp) và cuộc cách mạng xanh (công nghiệp) ở thế kỷ 20 (Phan Phát, 2013). 1.3.2. Phân loại 1.3.2.1. Theo nguồn gốc a) Phân hữu cơ Là loại phân bao gồm phế phụ phẩm của cây trồng và gia súc ở các giai đoạn khác nhau của quá trình phân giải và được bón vào đất nhằm cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng và cải thiện tính chất đất. Phân hữu cơ bao gồm phế phụ phẩm của trồng trọt, lâm nghiệp, rác thải từ các ngành sản xuất như nghành sản xuất giấy, đường, bùn cống rãnh và phế phụ phẩm từ các ngành chế biến nông sản (Phan Phát, 2013. b) Phân vô cơ (phân khoáng, phân hóa học) Là loại phân bón được sản xuất theo qui trình công nghiệp. Trong quá trình sản xuất có sử dụng một số nguyên liệu tự nhiên hoặc tổng hợp. Tùy thuộc vào nguyên tố dinh dưỡng có chứa trong phân bón, phân hóa học có thể là phân đạm, lân, kali, canxi, lưu huỳnh Phân hóa học có thể là phân đơn (chứa 1 nguyên tố dinh dưỡng), phân đa nguyên tố (chứa 2 hoặc nhiều nguyên tố dinh dưỡng) (Phan Phát, 2013) c) Phân vi sinh Phân có chứa một hay nhiều loại vi sinh vật sống có ích, với mật độ phù hợp với tiêu chuẩn đã ban hành. Thông qua các hoạt động sống của chúng tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng được (N, P, K, S, Fe ) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất, chất lượng nông sản. Phân vi sinh phải bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến người, động vật, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản (theo TCVN 6169-1996) (Phan Phát, 2013) 31
  43. Đồ án tốt nghiệp 1.3.2.2. Theo chức năng a) Phân bón gốc Là các loại phân bón được bón trực tiếp vào đất để cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng thông qua bộ rễ. b) Phân bón lá Là các hợp chất dinh dưỡng hòa tan trong nước được phun lên lá để cây hấp thụ, thông qua hệ thống khí khổng ở bề mặt lá. 1.3.2.3. Theo thành phần dinh dưỡng a) Phân bón đa lượng Phân có chứa trong thành phần từ 2 hoặc nhiều hơn các nguyên tố dinh dưỡng cần thiết cho cây trồng. b) Phân bón trung lượng Phân có chứa một loại chất dinh dưỡng trung lượng như: Mg, S, Ca, Các loại chất dinh dưỡng này cây cần với một lượng trung bình nhưng rất cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng. c) Phân bón vi lượng Phân có chứa một yếu tố dinh dưỡng vi lượng như: Cu, Fe, Zn, Mo, Các loại chất dinh dưỡng này cây trồng cần một lượng rất nhỏ nhưng nó lại ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng, phát triển cũng như chất lượng của nông sản phẩm. 1.3.2.4. Theo dạng a) Phân bón dạng rắn Các chất dinh dưỡng và chất mang của phân được để ở dạng rắn, dùng để bón gốc, bón lót 32
  44. Đồ án tốt nghiệp b) Phân bón dạng lỏng Các chất dinh dưỡng dưới dạng hoà tan, sử dụng để phun vào lá, gốc 1.3.3. Thành phần dinh dưỡng Thành phần dinh dưỡng trong phân bón thường có: - Chất đa lượng: đạm (N), lân (P), kali (K) - Chất trung lượng: canxi (Ca), lưu Huỳnh (S), magiê (Mg), - Chất vi lượng: sắt (Fe), kẽm (Zn), mangan (Mn), Bo (B), đồng (Cu), Clo (Cl), Molypden (Mo) theo (Glass và Anthony, 2003). 1.3.4. Ưu điểm của phân bón hữu cơ Phân hữu cơ nói chung có ưu điểm là chứa đầy đủ các nguyên tố dinh dưỡng đa, trung và vi lượng mà không một loại phân khoáng nào có được. Ngoài ra, phân hữu cơ cung cấp chất mùn làm kết cấu của đất tốt lên, tơi xốp hơn, bộ rễ phát triển mạnh, hạn chế mất nước trong quá trình bốc hơi từ mặt đất, chống được hạn, chống xói mòn (Bùi Huy Hiền,2014) Bón phân hữu cơ làm tăng năng suất cây trồng. Kết quả nghiên cứu khoa học trong rất nhiều năm của các viện, trường, cũng như kết quả điều tra kinh nghiệm của các hộ nông dân cho thấy, năng suất cây trồng và hiệu quả kinh tế cao, ổn định ở những nơi có bón tỷ lệ N hữu cơ và N vô cơ cân đối với tỷ lệ N tính từ hữu cơ chiếm khoảng 25-30% tổng nhu cầu của cây trồng. Ước tính do bón phân hữu cơ năng suất cây trồng đã tăng được 10-20%. Nếu tính riêng về thóc do bón phân hữu cơ (chủ yếu là phân chuồng) đã đạt khoảng 2,5-3,0 triệu tấn thóc/năm. (Bùi Huy Hiền, 2014). Bón phân hữu cơ còn làm giảm bớt lượng phân khoáng cần bón do phân hữu cơ có chứa các nguyên tố di dưỡng đa lượng, trung lượng và vi lượng. Kết quả nghiên cứu và điều tra cho thấy nếu bón 10 tấn phân chuồng/ha có thể giảm bớt được 40-50% lượng phân kali cần bón.heo Bùi Huy Hiền (2014). 33
  45. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường, trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài này được thực hiện từ tháng 2/2017 đến tháng 7/2017 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Nguồn vi sinh vật Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH được phân lập bởi Hồng Sêch Hếnh (2015). Bảng 2.1. Danh sách các chủng vi khuẩn BM và BDH được chọn để khảo sát STT Chủng VSV 1 BM13 2 BDH1 3 BDH2 4 BDH3 5 BDH4 6 BDH5 - Chủng Lactobacillus L2 được phân lập từ bởi Nguyễn Đình Phương Vy (2015). 34
  46. Đồ án tốt nghiệp 2.2.2. Hóa chất và môi trường 2.2.2.1. Hóa chất Cao thịt Pepton Lugol Cao nấm men Malachite Green 5% NaCl Casein CuSO4 20% Tinh bột tan K2HPO4 NaOH 1N Gelatin HCl 1N Glycerol TCA 10% Cồn Nước cất Thuốc thử Kovac’s Thuốc thử Methylred Thuốc thử Griess A, Griess B Glucose KH2PO4 Sodium acetat Mangiesium sulfate Manganese sulfate Amonium citrate Rỉ đường KI 2.2.2.2. Môi trường Môi trường Nutrient Broth (NB) Môi trường Nutrient Agar (NA). Môi trường MRS Môi trường thu enzyme. Môi trường Casein Môi trường CMC Môi trường Starch agar. 35
  47. Đồ án tốt nghiệp Môi trường MRT Môi trường HI Môi trường LBS 2.3.Thiết bị và dụng cụ 2.3.1. Thiết bị - Tủ cấy vi sinh - Tủ lạnh - Tủ ấm - Bếp từ - Máy quang phổ - Nồi hấp - Autoclave - Bể điều nhiệt - Máy lắc - Máy ly tâm - Kính hiển vi - Cân phân tích - Thùng chụp hình đĩa petri 2.3.2. Dụng cụ - Ống nghiệm. - Đèn cồn - Đĩa petri - Dụng cụ đục lỗ thạch - Đũa thủy tinh - Bông thấm nước - Ống ly tâm - Bông không thấm - Giấy đo pH - Cốc thủy tinh các loại - Ống đong các loại - Chai thủy tinh - Pipette thủy tinh 1ml, 5 ml, 10 ml - Dây cấy vòng - Erlen 100 ml, 250ml - Dây cấy thẳng - Chai đun môi trường 200 ml, 500 ml - Que cấy trang - Micropipette 100µl, 1000µl 36
  48. Đồ án tốt nghiệp 2.4. Bố trí thí nghiệm 2.4.1. Bố trí thí nghiệm chung VSV Hoạt hóa Chủng thuần Giữ giống khiết Nhuộm Gram Nhuộm bào tử Khảo sát khả năng sinh enzyme của các chủng Bacillus subtilis Chọn chủng vi khuẩn BDH4 Khảo sát tính đối kháng và khả năng sinh enzyme ngoại bào của hai chủng BDH4 và L2 được tuyển chọn Khảo sát thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng Khảo sát pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn BDH4 và L2 Khảo sát môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của hai chủng BDH4 và L2 Hì nh 2.1. Sơ đồ tổng quan bố trí các bước thí nghiệm 37
  49. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Bố trí thí nghiệm chi tiết 2.4.2.1. Làm thuần các chủng Bacillus subtilis BM và BDH Các chủng BM và BDH Tăng sinh trong môi trường NB Lắc 150 vòng/phút trong 24 – 48 giờ Tiến hành pha loãng đến dãy nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 và cấy trang dịch lên môi trường NA Ủ nhiệt độ 370C trong 24 - 48 giờ Chọn khuẩn lạc rời rạc Định tính khả Nhuộm Nhuộm năng sinh enzyme gram bào tử ngoại bào Chủng thuần khiết Giữ giống trong eppendoff cùng glycerol 40% Hì nh 2.2. Sơ đồ quy trình làm thuần các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH 38
  50. Đồ án tốt nghiệp  Thuyết minh quy trình VSV được lấy từ các chủng được phân lập từ mẫu ruột cá, đã được định danh sơ bộ bằng các thử nghiệm sinh hóa đặc trưng và khảo sát pH thích hợp đến khả năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH tại phòng thí nghiệm Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM. VSV được giữ trong eppendorf , quấn kỹ bằng paraffin và được bảo quản lạnh sâu. Những ống eppendorf chứa vi khuẩn được tuyển chọn phải là những ống còn nguyên vẹn, không bị nứt, được bao bọc kỹ bởi paraffin và chủng vi khuẩn không bị chảy ra ngoài. Tiến hành tăng sinh trong bình môi trường NB (không chọn lọc) đã được hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. Cho 1 ml chủng VSV trong eppendorf vào bình môi trường chứa 19 ml môi trường NB (không chọn lọc) vô trùng với tỉ lệ cấy giống 5% . Thí nghiệm thực hiện trong tủ cấy dưới ngọn lửa đèn côn trong điểu kiện vô trùng. Đem ủ và lắc ở 150 vòng/phút từ 24 – 48 giờ khi thấy môi trường chuyển sang đục và có sinh khối bám trên thành bình là có thể đưa vào thí nghiệm tiếp theo. Sau đó tiến hành đem đi pha loãng. Dùng micropipette hút 1 ml dịch tăng sinh để pha loãng đến nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 dùng cho cấy trang sau đó. Tiến hành đỗ đĩa môi trường NA đã được hấp khử trùng, dùng micropipette hút 100 µl dịch đồng nhất vào đĩa môi trường NA và tiến hành cấy trang đến khi mặt thạch khô ráo hẳn. Mỗi nồng độ pha loãng được cấy ra 3 đĩa để đảm bảo kết quả. Ủ trong tủ ấm 37 0C trong 24 - 48 giờ cho đến khi khuẩn lạc đặc trưng của Bacillus subtilis bắt đầu mọc. Tiếp theo ta chọn khuẩn lạc rời rạc và đem quan sát hình thái bằng cách nhuộm gram và nhuộm bào tử. Sau khi xác định đó là chủng Bacillus subtilis thì từng chủng vi khuẩn được test định tính khả năng sinh enzyme protease trên môi trường đĩa thạch casein 1% ; khả năng sinh enzyme amylase trên môi trường đĩa thạch tinh bột 1%; khả năng 39
  51. Đồ án tốt nghiệp sinh enzyme cellulase trên môi trường đĩa thạch CMC 1%, tiến hành giữ giống trong eppendorf trong glycerol 40 % những chủng có khả năng sinh enzyme mạnh để bảo quản . 2.4.2.2. Làm thuần chủng Lactobacillus L2 Chủng L2 Tăng sinh trong môi trường MRS broth Lắc 150 vòng/phút trong 24 – 48 giờ Tiến hành pha loãng đến dãy nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 và cấy trang dịch lên môi trường MRS - agar Ủ nhiệt độ 370C trong 24 - 48 giờ Chọn khuẩn lạc rời rạc Chủng thuần khiết Khảo sát khả Nhuộm Nhuộm năng sinh acid gram bào tử lactid Giữ giống trong eppendorf cùng glycerol 40% Hì nh 2.3. Sơ đồ quy trình làm thuần chủng Lactobacillus L2 40
  52. Đồ án tốt nghiệp  Thuyết minh quy trình Chủng Lactobacillus L2 được phân lập từ cơm mẻ đã được xác định có khả năng kháng tốt đối với VSV gây bệnh nhưng không kháng với Bacillus subtilis (Nguyễn Thị Phương Vy, 2015). Chủng VSV được giữ trong eppendorf được quấn kỹ bằng paraffin và được bảo quản lạnh sâu. Những ống eppendorf chứa vi khuẩn được tuyển chọn phải là những ống còn nguyên vẹn, không bị nứt, được bao bọc kỹ bởi paraffin và chủng vi khuẩn không bị chảy ra ngoài. Tiến hành tăng sinh trong bình môi trường MRS đã được hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. Cho 1 ml chủng VSV trong eppendorf vào bình môi trường chứa 19 ml môi trường MRS vô trùng với tỉ lệ cấy giống 5% . Thí nghiệm thực hiện trong tủ cấy dưới ngọn lửa đèn cồn trong điều kiện vô trùng. Đem ủ và lắc ở 150 vòng/phút từ 24 – 48 giờ khi thấy có sinh khối bám trên thành bình là có thể đưa vào thí nghiệm tiếp theo. Sau đó tiến hành đem đi pha loãng. Dùng micropipette hút 1 ml dịch tăng sinh đem pha loãng đến nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 dùng cho cấy trang sau đó Tiến hành đỗ đĩa môi trường MRS - agar đã được hấp khử trùng, dùng micropipette hút 100 µl dịch đồng nhất vào đĩa môi trường MRS - agar và tiến hành cấy trang đến khi mặt thạch khô ráo hẳn. Mỗi nồng độ pha loãng được cấy ra 3 đĩa để đảm bảo kết quả. Ủ trong tủ ấm 37 0C trong 24 - 48 giờ cho đến khi khuẩn lạc đặc trưng của Lactobacillus sp bắt đầu mọc. Tiếp theo ta chọn khuẩn lạc rời rạc và đem quan sát hình thái bằng cách nhuộm gram. Sau khi xác định đó là chủng Lactobacillus sp thì chủng vi khuẩn được định tính khả năng sinh acid lactid trên môi trường thạch MRS có chứa 5 g/l CaCO3, tiến hành giữ giống trong eppendorf với glycerol 40 % và tiến hành các thí nghiệm nhân sinh khối. 41
  53. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn BM và BDH a) Khảo sát khả năng sinh enzyme protease Các chủng thuần khiết Tăng sinh trong môi trường NB pH 7, lắc 150 vòng/ phút trong 24 giờ Hút 1ml dịch nuôi cấy đi ly tâm 10000 vòng/ phút/ 15 phút thu dịch trong làm dịch enzyme thô Cặn Chuẩn bị môi trường NA bổ sung thêm cơ chất casein 1% Hút 0,1 ml dịch enzyme thô bơm vào lỗ thạch môi trường NA có bổ sung cơ chất casein 1% Đỗ đĩa Đục lỗ thạch Để yên và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ và đo đường kính vòng phân giải Chọn đường kình vòng phân giải lớn nhất cho hoạt tính cho hoạt tính enzyme protease cao nhất Hì nh 2.4. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme protease của các chủng BM và BDH 42
  54. Đồ án tốt nghiệp  Thuyết minh quy trình Từ kết quả phân lập đã được thực hiện bởi Hồng Sếnh Hếnh (2015) đã chọn ra 5 chủng có khả năng sinh enzyme cao nhất để đưa vào khảo sát : BM13, BDH1, BDH2, BDH3, BDH4, BDH5. Đầu tiên, những chủng vi khuẩn được chọn đưa vào thí nghiệm được giữ trong eppendorf với thể tích 1 ml sẽ được tăng sinh trong chai môi trường 100 ml với 19 ml môi trường NB vô trùng với, pH = 7. Với tỉ lệ cấy giống 5% các chai môi trường được lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/ phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Sau 24 giờ nuôi cấy hút 1ml dịch tăng sinh của mỗi chủng vi khuẩn đem đi ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 15 phút .Chai môi trường không được cấy giống vi khuẩn sẽ được giữ lại làm mẫu đối chứng âm cho thử nghiệm này. Chuẩn bị môi trường NA bổ sung cơ chất casein 1% đem hấp khử trùng 1210C trong 15 phút. Sau khi hấp khử trùng chai môi trường được cho vào bể ủ 600C để môi trường hạ nhiệt xuống còn 600C thì tiến hành đỗ đĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15-20ml. Tiếp theo ta tiến hành đục lỗ thạch (đường kính 6 mm) thành các giếng. Dùng micropipette hút 0,1 ml dịch enzyme thô của các chủng vi khuẩn bơm vào các giếng thạch. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Để yên đĩa thạch và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ rồi tiến hành đo đường kính vòng phân giải casein bằng cách nhỏ thuốc thử TCA 10% vào và quan sát vòng phân giải quanh giếng thạch. 43
  55. Đồ án tốt nghiệp b) Khảo sát khả năng sinh enzyme amylase các của chủng BM và BDH Các chủng thuần khiết Tăng sinh trong môi trường NB pH = 7, lắc 150 vòng /phút trong 24 giờ Hút 1ml dịch nuôi cấy đi ly tâm 10000 vòng/ phút trong 15 phút thu dịch trong làm dịch Cặn enzyme thô Chuẩn bị môi trường NA bổ sung thêm cơ chất tinh bột 1% Hút 0,1 ml dịch enzyme thô bơm vào lỗ thạch môi trư ờ ng ĐNAỗ đĩa có b ổ sung Đcơục ch lỗấ tth tinhạch bột 1% Để yên và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ và đo đường kính vòng phân giải Chọn đường kính vòng phân giải lớn nhất cho hoạt tính enzyme amylase cao nhất Hì nh 2.5. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme amylase của các chủng BM và BDH 44
  56. Đồ án tốt nghiệp  Thuyết minh quy trình Theo nghiên cứu bởi Hồng Sếnh Hếnh (2015) đã đưa ra 5 chủng có triển vọng là : BM13, BDH1. BDH2, BDH3, BDH4, BDH5. Cả 5 chủng được đưa vào khảo sát để chọn ra chủng có khả năng cho sinh khối cao sinh enzyme amylase tốt nhất nhằm tăng cường phân hủy thức ăn thừa. Đầu tiên, những chủng vi khuẩn được chọn đưa vào thí nghiệm được giữ trong eppendort với thể tích 1 ml sẽ được tăng sinh trong chai môi trường 100 ml với 19 ml môi trường NB vô trùng với, pH = 7. Với tỉ lệ cấy giống 5% các chai môi trường được lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/ phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Sau 24 giờ nuôi cấy hút 1ml dịch tăng sinh của mỗi chủng vi khuẩn đem đi ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút .Chai môi trường không được cấy giống vi khuẩn sẽ được giữ lại làm mẫu đối chứng âm cho thử nghiệm này. Chuẩn bị môi trường NA bổ sung cơ chất tinh bột 1% đem hấp khử trùng 1210C trong 15 phút. Sau khi hấp khử trùng chai môi trường được cho vào bể ủ 600C để môi trường hạ nhiệt xuống còn 600C thì tiến hành đỗ đĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15-20ml. Tiếp theo ta tiến hành đục lỗ thạch (đường kính 6 mm) thành các giếng. Dùng micropipette hút 0,1 ml dịch enzyme thô của các chủng vi khuẩn bơm vào các giếng thạch. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Để yên đĩa thạch và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ rồi tiến hành đo đường kính vòng phân giải tinh bột bằng cách nhỏ lugol vào nhằm làm vòng phân giải tinh bột hiện rõ để có thể đo được đường kính vòng phân giải xung quanh giếng. 45
  57. Đồ án tốt nghiệp c) Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn BM và BDH Các chủng thuần khiết Tăng sinh trong môi trường NB pH7, lắc 150 vòng/ phút trong 24 giờ Hút 1ml dịch nuôi cấy đi ly tâm 10000 vòng/ phút/ 15 phút thu dịch trong làm dịch enzyme thô Cặn Chuẩn bị môi trường NA bổ sung thêm cơ chất CMC 1% Đỗ đĩa Đục lỗ thạch Hút 0,1 ml dịch enzyme thô bơm vào lỗ thạch môi trường NA có bổ sung cơ chất CMC 1% Để yên và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ và đo đường kính vòng phân giải Chọn đường kình vòng phân giải lớn nhất cho hoạt tính cho hoạt tính enzyme cellulase cao nhất Hì nh 2.6. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn BM và BDH 46
  58. Đồ án tốt nghiệp  Thuyết minh quy trình Tương tự như đối với các khảo sát khả năng sinh enzyme protease và amylase của các chủng BM và BDH được tuyển chọn thì ở khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase sinh viên cũng tiến hành thực hiện như sau : Đầu tiên, những chủng vi khuẩn được chọn đưa vào thí nghiệm được giữ trong eppendort với thể tích 1 ml sẽ được tăng sinh trong chai môi trường 100 ml với 19 ml môi trường NB vô trùng với, pH = 7. Với tỉ lệ cấy giống 5% các chai môi trường được lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/ phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Sau 24 giờ nuôi cấy hút 1ml dịch tăng sinh của mỗi chủng vi khuẩn đem đi ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút .Chai môi trường không được cấy giống vi khuẩn sẽ được giữ lại làm mẫu đối chứng âm cho thử nghiệm này. Chuẩn bị môi trường NA bổ sung cơ chất CMC 1% đem hấp khử trùng 1210C trong 15 phút. Sau khi hấp khử trùng chai môi trường được cho vào bể ủ 600C để môi trường hạ nhiệt xuống còn 600C thì tiến hành đỗ đĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15-20 ml. Tiếp theo ta tiến hành đục lỗ thạch (đường kính 6 mm) thành các giếng. Dùng micropipette hút 0,1 ml dịch enzyme thô của các chủng vi khuẩn bơm vào các giếng thạch. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Để yên đĩa thạch và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ rồi tiến hành đo đường kính vòng phân giải CMC bằng cách nhỏ lugol vào nhằm làm vòng phân giải CMC hiện rõ để có thể đo được đường kính vòng phân giải xung quanh giếng. 47
  59. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.4. Khảo sát tính đối kháng của hai chủng VSV được tuyển chọn được dùng để phối trộn vào thức ăn thừa. Vi khuẩn Chủng Bacilus subtilis Lactobacillus L2 được tuyển chọn Tăng sinh trong MRS broth Tăng sinh trong môi trường NB 0 0 Lắc 150 vòng/phút ở 30 C, Lắc 150 vòng/phút ở 30 C, 24 - 48 giờ. 24 - 48 giờ. - Ly tâm 10000 vòng trong 5 phút - Pha loãng đến nồng độ 10-6 để loại bớt sinh khối - Tiến hành cấy trang trên đĩa - Điều chỉnh pH =7 bằng NaOH môi trường MRS - agar Đục lỗ thạch Hút 0,1 ml dịch nổi cho vào lỗ thạch Đĩa môi trường MRS - agar Ủ ở 370C trong 48 giờ Kiểm tra khả năng đối kháng của hai chủng VSV Hì nh 2.7. Khảo sát tính đối kháng của hai chủng VSV được tuyển chọn dùng để phối trộn vào thức ăn thừa. 48
  60. Đồ án tốt nghiệp  Thuyết minh quy trình Vi khuẩn Bacillus subtilis BDH4 đã được tuyển chọn được tăng sinh trong 19 ml môi trường NB đã được hấp khử trùng đem lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 - 48 giờ. Tương tự tăng sinh vi khuẩn Lactobacillus L2 trong 19 ml môi trường MRS broth rồi đem lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau khi tăng sinh pha loãng dịch vi khuẩn Lactobacillus L2 đến nồng độ pha loãng 10-6. Đổ môi trường MRS - agar trên đĩa petri để khảo sát khả năng đối kháng, sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành hút 0,1ml dịch pha loãng của vi khuẩn chỉ thị cấy trang lên bề mặt thạch MRS - agar. Tiếp theo đục 3 lỗ thạch đường kính 6 mm lên đĩa thạch rồi nhỏ 0,1ml dịch trong (dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis BDH4 đã li tâm 10.000 vòng trong 5 phút) vào các giếng thạch đã đục. Ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau đó quan sát sự tạo vòng kháng khuẩn và đo đường kính vòng phân giải. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn được tính bằng đường kính vòng kháng khuẩn ∆D (Schillinger và ctv, 1989). ∆D = D-d (mm) Trong đó: D: đường kính vòng vô khuẩn (mm); d: đường kính lỗ thạch (mm) 49
  61. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme protease của chủng Bacillus subtilis BDH4. Chủng thuần khiết Tăng sinh trong môi trường NB pH = 7, lắc 150 vòng/ phút/ 24 giờ Cấy giống : hút 1ml dịch tăng sinh cấy vào môi trường NB có bổ sung rỉ đường 2%, điều chỉnh pH về mức pH 3 ,4, 5, 6, 7, 8 lắc 150vòng/phút/24 giờ Quan sát và ghi nhận sự tăng trưởng của các chủng thử nghiệm Hút 1ml dịch nuôi cấy đi ly tâm 10000 vòng/ phút/ 15 phút thu dịch trong làm dịch enzyme thô Cặn Hút 0,1 ml dịch enzyme thô bơm vào lỗ thạch casein đã điều chỉnh pH về pH4, 5, 6, 7, 8. Để yên và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ và đo đường kính vòng phân giải Chọn giá trị pH tối ưu cho hoạt tính enzyme cao nhất Hì nh 2.8. Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả năng sinh enzyme protease của chủng Bacillus subtilis được tuyển chọn 50
  62. Đồ án tốt nghiệp  Thuyết minh quy trình Đầu tiên, những chủng vi khuẩn được chọn đưa vào thí nghiệm sẽ được tăng sinh trong chai NB vô trùng, pH = 7 lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/ phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Sau 24 giờ nuôi cấy, sử dụng dịch tăng sinh này để làm giống cấy vào môi trường NB có bổ sung 2 % rỉ đường đã vô trùng, hút 1ml dịch tăng sinh cấy vào mỗi chai thủy tinh 100 ml chứa sẵn 20 ml dịch môi trường nuôi cấy có bổ sung 2% rỉ đường đã tiệt trùng và đã điều chỉnh pH về các mức 4, 5, 6, 7, 8 bằng dung dịch HCl 1N và NaOH 1 N nhằm mục đích thu dịch enzyme thô của vi khuẩn dưới ảnh hưởng của các nồng độ pH khác nhau từ acid đến base. Với tỷ lệ cấy giống là 5%, các chai môi trường được đặt vào máy lắc và lắc 150 vòng / phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Chai môi trường không được cấy giống vi khuẩn sẽ được giữ lại làm mẫu đối chứng âm cho thử nghiệm này. Sau khi lắc được 24 giờ, hút 1 ml dịch nuôi cấy từ mỗi chai môi trường cho vào eppendoff đem li tâm 10000 vòng/ 15 phút bỏ cặn thu dịch enzyme thô. Dịch nuôi cấy trước khi ly tâm cần hạ thấp nhiệt độ trước nhằm hạn chế sự gia tăng nhiệt độ trong quá trình ảnh hưởng đến hoạt tính của protease. Dùng micropipette hút 0,1 ml dịch enzyme thô bơm vào các giếng thạch Casein đã điều chỉnh về pH 4, 5, 6, 7, 8. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Để yên đĩa thạch và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ rồi tiến hành đo đường kính vòng phân giải casein bằng cách nhỏ lugol vào nhằm làm vòng phân giải Casein hiện rõ để có thể đo được đường kính vòng phân giải để xác định pH tối ưu ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis system phục vụ cho các mục đích thí nghiệm khác liên quan đến khả năng sinh enzyme và hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn phân lập được. 51
  63. Đồ án tốt nghiệp 2.5. Phương pháp nghiên cứu 2.5.1. Phương pháp tăng sinh  Mục đích : Phương pháp này nhằm giúp cho vi khuẩn hồi phục khả năng sinh trưởng để phát triển bình thường trong môi trường nuôi cấy tiếp theo giúp làm ổn định giống và nâng cao tính chính xác của các thí nghiệm.  Phương pháp: Đối với các chủng Bacillus subtilis Môi trường NB (không chọn lọc) được sử dụng để làm môi trường tăng sinh. Môi trường này được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút ở 1 atm. Thực hiện thao tác trong điều kiện vô trùng, cho 1 ml chủng vi khuẩn trong eppendorf hay 1 ml dịch nuôi cấy trong môi trường tăng sinh trước đó hoặc dùng que cấy ria lấy 1 khuẩn lạc riêng rẽ cho vào chai môi trường NB, ủ và lắc ở 150 vòng/ phút trong 24 giờ trước khi đưa vào thí nghiệm chính. Đối với chủng Lactobacillus L2 Môi trường MRS broth được sử dụng để làm môi trường tăng sinh. Môi trường này được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút ở 1 atm. Thực hiện thao tác trong điều kiện vô trùng, cho 1 ml chủng vi khuẩn trong eppendorf hay 1 ml dịch nuôi cấy trong môi trường tăng sinh trước đó hoặc dùng que cấy ria lấy 1 khuẩn lạc riêng rẽ cho vào chai môi trường MRS broth. 2.5.2. Phương pháp pha loãng mẫu  Mục đích : làm giảm mật độ vi khuẩn có mặt trong dịch tăng sinh mẫu hay dịch đồng nhất mẫu giúp cho việc phân lập riêng rẽ từng khuẩn lạc tế bào được dễ dàng hơn.  Nguyên tắc : pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhất trong phương pháp phân tích vi sinh nhưng rất quan trọng, việc pha loãng mẫu ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả thí nghiệm, khi mẫu được pha loãng đến nồng độ thích hợp sẽ thuận lợi cho người phân tích vi sinh đọc kết quả hay thực hiện các phân tích định lượng một cách dễ dàng nhất có thể. 52
  64. Đồ án tốt nghiệp  Phương pháp. Phương pháp này chỉ dùng trong trường hợp vi sinh vật phân bố nhiều trong mẫu và để định lượng vi sinh vật trong mẫu thí nghiệm. Dung dịch pha loãng là nước muối sinh lý Chuẩn bị sẵn dung dịch nước muối sinh lý 0,9 % và chính xác 9 ml vào mỗi ống nghiệm có nút đậy rồi đem hấp khử trùng. Dùng micropipette hút 1 ml dung dịch cần pha loãng cho vào ống nước muối sinh lý đã chuẩn bị vô trùng để pha loãng và tiến hành thao tác pha loãng đến một dãy nồng độ nhất định thích hợp. Dung dịch gốc nồng độ sẽ được ghi nhận là 100, ống nước muối sinh lý đã hút 1 ml dung dịch cần pha loãng vào sẽ là ống có nồng độ pha loãng là 10-1, pha loãng tiếp sẽ là 10-2, 10-3, 10-4, 10-5,10-6 . (Phạm Minh Nhựt, 2014) 2.5.3. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc  Nguyên tắc : VSV khi phát triển trên bề mặt các môi trường đặc trưng sẽ hình thành các dạng khuẩn lạc đặc trưng của loài đó. Sử dụng môi trường NB là đặc trưng cho loài Bacillus subtilis và sử dụng môi trường MRS broth là đặc trưng cho các loài thuộc chi Lactobacillus.  Phương pháp. Đầu tiên tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy vi khuẩn đã hoạt hóa từ 24 – 48 giờ, ở các dãy nồng độ 10-3, 10-4, . Tiếp đến dùng micropipet hút 0,1 ml dịch nuôi cấy đã pha loãng nhỏ lên bề môi trường đĩa thạch NA đối với Bacillus subtilis và MRS broth đối với chủng Lactobacillus spp. Dùng que trang trang đều khắp bề mặt đĩa thạch. Sau đó đặt trong tủ ủ 370C trong 2 – 3 ngày. Quan sát và nhận xét đặc điểm hình thái, màu sắc, kích thước, tính chất bề mặt của khuẩn lạc bằng kính hiển vi soi nổi. 53
  65. Đồ án tốt nghiệp 2.5.4. Phương pháp quan sát hình thái tế bào Các chủng sau khi được làm thuần bằng phương pháp cấy trang được quan sát hình thái vi thể bằng phương pháp nhuộm gram để xác định từng chủng vi khuẩn này thuộc nhóm Gram dương hay Gram âm. Chúng được tăng sinh trong môi trường thích hợp trong 18-24 giờ, lắc 150 vòng/ phút ở điều kiện nhiệt độ phòng. (Phạm Minh Nhựt, 2014).  Kỹ thuật nhuộm Gram - Làm tiêu bản : dùng que cấy lấy sinh khối làm vết bôi trên lame. Vết bôi sẽ được cố định trên ngọn lửa đèn cồn. - Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Crystal violet trong 30 giây. - Rửa nước - Nhuộm lugol trong 1 phút. - Rửa nước. - Tẩy cồn 960 trong 20-30 giây, để nghiêng tiêu bản và nhỏ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu. - Rửa nước. - Nhuộm bổ sung Fushin hoặc Safranin từ 10-30 giây. - Rửa nước. - Để khô và quan sát dưới kính hiển vi.  Nhuộm bào tử - Vi sinh vật được nhuộm bào tử để xác định khả năng sinh bào tử của chúng, nếu chúng có khả năng sinh bào tử chứng tỏ chúng có thể là Bacillus subtilis và ngược lại thì không. Cấy ria hoặc trang vi khuẩn từ đĩa khuẩn lạc thuần nhất sang đĩa môi trường NA mới và tiến hành đem ủ ở 370C trong 4 - 5 ngày với mục đích cho vi khuẩn sinh bào tử. Dùng que cấy vòng vô trùng lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc riêng lẻ để làm vết bôi trên lame. Cố định vết bôi bằng ngọn lửa đèn cồn. 54
  66. Đồ án tốt nghiệp Đặt một cốc nước lên bếp từ và đun từ từ đến khi đạt khoảng 800C nhằm tăng độ hấp thụ malachite Green của bào tử rồi đặt một tấm giấy lọc lên miệng cốc. Đặt lame có vết bôi lên trên tấm giấy lọc và đặt thêm 1 tấm giấy lọc nữa lên vết bôi, nhỏ từ từ malachite green 5% lên phía trên vết bôi và luôn giữ cho chúng không bị khô trong vòng 5 phút nhuộm. Rửa vết bôi bằng nước cất khoảng 30 giây. Nhuộm bổ sung với thuốc nhuộm Fushin trong khoảng 60 - 90 giây rồi rửa lại bằng nước cất. Thấm khô và quan sát dưới vật kính 100x cùng dầu soi kính (Phạm Minh Nhựt, 2014). 2.5.5. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật  Nguyên tắc : Phải đảm bảo tốt điều kiện trong quá trình bảo quản để không làm thay đổi đặc tính, phẩm chất ban đầu của giống. Làm chậm quá trình trao đổi chất và hô hấp của vi sinh vật và đồng thời cũng ngăn cản quá trình sinh sản của chúng.  Mục đích. Giữ và bảo quản các chủng phân lập dược nhằm đảm bảo nguồn giống để thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo có liên quan đến chủng vi khuẩn đã phân lập (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.4.5.1. Phương pháp cấy chuyền vi sinh vật Phương pháp cấy chuyền này thực hiện trên môi trường thạch NA đối với vi khuẩn Bacillus subtilis và môi trường MRS – agar đối với chủng vi khuẩn Lactobacillus. Các môi trường phải được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút trước khi tiến hành thí nghiệm. Dùng que cấy vòng vô trùng (hơ trên ngọn lửa đèn cồn) lấy sinh khối VSV cấy zich zắc trên bề mặt môi trường thạch nghiêng . Đậy nút bông lại , quấn paraffin và ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ , khi thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 40C để giữ giống. Phương pháp này được thực hiện định kỳ 1-2 55
  67. Đồ án tốt nghiệp tháng cấy chuyền một lần, đảm bảo chủng vi khuẩn luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết và giống không phải hoạt hóa trước khi nhân giống.  Ưu điểm Phương pháp này có thể thực hiện áp dụng cho mọi loài vi sinh vật, ngoài ra phương pháp này còn đơn giản, dễ thực hiện.  Khuyết điểm Thời gian bảo quản ngắn, hao phí môi trường, công sức và thời gian cho công việc. Nếu không duy trì được điều kiện tối ưu thì khả năng chủng giống sẽ thay đổi phẩm chất ban đầu mà rất khó xác định được nguyên nhân trong quá trình cấy chuyền (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.5.6. Phương pháp đục lỗ thạch  Nguyên tắc: Thí nghiệm theo phương pháp của Egorow NX (1976), dựa vào khả năng khuếch tán của các enzyme được bơm vào lỗ thạch, phân giải protein của các chủng VSV bằng cách đo kích thước vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc.  Enzyme tác động lên cơ chất trong môi trường agar, cơ chất bị phân hủy, độ đục của môi trường bị giảm và trở nên trong suốt. Độ lớn của vòng phân giải phản ánh hoạt lực của enzyme.  Phương pháp : Pha môi trường chứa 1% casein, 1,7% agar, 1000 ml mước cất; chuẩn bị đầu tuýp 1000µl, 100µl, eppendorf đem hấp vô trùng ở 1210C trong 15 phút. - Chuẩn bị dịch enzyme, tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy thích hợp. Nuôi cấy trong 24 giờ sau đó hút 1 ml cho vào eppendorf đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút. - Hút 0,1 ml dịch nổi cho vào các lỗ thạch đã đục sẵn. - Ủ ở nhiệt độ phòng 24 giờ , quan sát vòng phân giải. - Nếu xảy ra hiện tượng phân giải protein thì sẽ hình thành vòng phân giải trong suốt xung quanh giếng thạch khi cho TCA 10% vào và ngược lại thì không. 56
  68. Đồ án tốt nghiệp - Khả năng phân giải protein được đánh giá qua hiệu số (D-d) mm. D-d càng lớn thì khả năng phân giải protein càng cao. Trong đó : - D : là đường kính vòng phân giải (mm) - d : là đường kính giếng thạch (mm) 2.5.7. Phương pháp nghiên cứu khả năng phân giải tinh bột, protein, cellulose.  Mục đích: để xác định khả năng phân hủy tinh bột, protein, cellulose của các chủng vi khuẩn, tiến hành thử sơ bộ theo phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch.  Phương pháp: nuôi vi sinh vật trong môi trường lỏng có chứa cơ chất là tinh bột, casein, CMC ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/ phút. Sau 24 giờ nuôi cấy thu lấy dịch nuôi trong điều kiện vô trùng, ly tâm 10.000 vòng/phút thu lấy dịch trong. Tiếp theo, đổ môi trường đĩa thạch có chứa cơ chất tinh bột, casein, CMC vô trùng vào đĩa petri. Chờ cho môi trường nguội và đông lại tiếp theo đục lỗ thạch (đường kính 6 -8 mm) thành các giếng. Dùng micropipette hút 1ml dung dịch thu được sau ly tâm bơm vào các giếng trong đĩa petri. Ủ 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, quan sát vòng phân giải bằng thuốc thử. Dùng thuốc thử đổ lên bề mặt thạch nếu có enzyme thì nó tạo thành vùng phân giải xung quanh giếng.  Kiểm tra khả năng sinh enzyme amylase trên môi trường chứa tinh bột tan Dùng dung dịch lugol đổ lên bề mặt nuôi cấy. Nếu vi khuẩn sinh amylase thì sẽ có một vòng trong suốt xung quanh giếng còn vùng chưa bị phân giải thì có màu tím.  Kiểm tra khả năng sinh enzyme protease trên môi trường chứa casein Dùng thuốc thử TCA 10% đỗ đầy lên bề mặt nuôi cấy. Nếu vi khuẩn sinh protease thì sẽ có một vòng trong suốt xung quanh giếng, do protein bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với TCA. Các vùng không bị phân giải sẽ có màu trắng đục.  Kiểm tra khả năng sinh enzyme cellulase trên môi trường chứa CMC 57
  69. Đồ án tốt nghiệp Dùng dung dịch lugol đổ lên bề mặt nuôi cấy. Nếu vi khuẩn sinh cellulase thì sẽ xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng, còn vùng chưa bị phân giải sẽ có màu tím. 2.5.8. Phương pháp xử lí số liệu Số liệu và biểu đồ được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010. Các số liệu thô được xử lý outlier trên phần mềm Statgraphics Centurion XV. Các số liệu sau đó được phân tích ANOVA và được trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05. 2.5.9. Xác định mật độ tế bào VSV Mục đích: Xác định mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus để thực hiện cho các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy của chủng vi khuẩn được tuyển chọn chính xác hơn. Tiến hành: Tăng sinh chủng Lactobacillus trên môi trường MRS broth và chủng Bacillus subtilis trên môi trường NB. Ủ ở 37℃ trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ nuôi cấy, ta tiến hành đo OD600nm và cấy trang ở cùng thời điểm.  Đo OD600nm: Ta thực hiện pha loãng dịch tăng sinh VSV đã được xác định mật độ theo hệ số 2푛 bằng cách: + Hút 2ml nước muối sinh lí đã được khử trùng ở 121℃ trong 15 phút vào 10 ống nghiệm, trong đó gồm 9 ống dùng để pha loãng và 1 ống làm mẫu trắng. + Đối với 9 ống nghiệm để pha loãng (tất cả đều được đánh số thứ tự rõ ràng): + Hút 2ml dịch tăng sinh cho vào ống thứ nhất, lắc đều ta được dung dịch pha loãng 2 lần. Sau đó từ ống thứ nhất hút 2ml sang ống thứ 2, lắc đều ta được dung dịch pha loãng 4 lần. + Tiến hành tương tự ta được chuỗi ống nghiệm chứa dung dịch pha loãng theo hệ số 2n: 2 lần, 4 lần, 8 lần, 16 lần, 32 lần, 64 lần, + Đo OD600nm 9 ống chứa dịch đã pha loãng. (Phạm Minh Nhựt, 2014). 58
  70. Đồ án tốt nghiệp  Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc: Pha loãng mẫu: Chuẩn bị 9 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước muối sinh lý đã được hấp khử trùng ở 121℃ trong 30 phút. Đánh số thứ tự từ 1 đến 9 tương ứng với 9 nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-9. Hút 1ml dịch tăng sinh vào ống thứ nhất, lắc đều. Sau đó, hút 1ml từ ống thứ nhất sang ống thứ 2, tương tự thao tác cho đến hết 9 ống. Cấy trang: Hút 0.1ml dịch pha loãng ở ống 10−5 vào đĩa petri chứa môi trường MRS agar đối với chủng Lactobacillus spp và môi trường NA đối với chủng Bacillus subtilis. Chọn nồng độ từ 10−5đế푛 10−9 để cấy trang, mỗi nồng độ lặp lại trên 3 đĩa. Sau khi trang khô, ta ủ ở nhiệt độ 37℃ trong 24 – 48 giờ cho khuẩn lạc có thể phát triển thuận lợi để đếm. Sau khi đếm khuẩn lạc, ta định lượng vi sinh vật bằng công thức ΣC N = (n1 + 0.1n2)d N – số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu. C – số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri đã chọn (chọn các đĩa có số khuẩn lạc dao động từ 25 – 250 khuẩn lạc). 푛1,푛2 – số đĩa petri ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp đã chọn. d – hệ số pha loãng mẫu Từ kết quả đo OD600nm và kết quả đếm khuẩn lạc của 2 chủng vi khuẩn ta tiến hành dựng đường chuẩn tế bào và có được phương trình đường chuẩn cho các khảo sát tiếp theo. 2.5.10. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn. Để xác định thời điểm nuôi cấy thích hợp cho sự sinh truởng của 2 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BDH4 và Lactobacillus L2. Sinh viên tiến hành nuôi cấy các trên môi trường MRS broth. 59
  71. Đồ án tốt nghiệp Thu nhận mẫu tại từng thời điểm 0h; 12h; 24h; 36h; 48h; 60h và 72h. Xác định sự tăng trưởng bằng cách tiến hành đo OD600nm. Sau đó dựa vào phương trình đường chuẩn đã được khảo sát để xác định mật độ tế bào VSV nhằm kết luận được thời điểm nuôi cấy thích hợp nhất cho sự sinh trưởng 2 chủng VSV được tuyển chọn. 2.5.11. Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn Giá trị của pH ban đầu trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và trao đổi chất của VSV. Những biến đổi dù nhỏ của các ion H+ và OH- trong môi trường cũng làm ảnh hưởng đến VSV. Nguyên tắc: dựa vào khả năng sinh trưởng của VSV trong môi trường thích hợp với các độ pH khác nhau.  Cách tiến hành: Đối với vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành cho 1 ml dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn vào trong 19 ml môi trường lỏng NB đã được hấp khử trùng. Với tỉ lệ cấy giống 5%. Lắc ở 150 vòng/phút từ 24 - 48 giờ. Sau đó từ bình tăng sinh hút 1ml cấy chuyền sang các bình môi trường NB đã được điều chỉnh pH 4,5,6,7,8,9 đã được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Đem lắc trên máy lắc ở 150 vòng/phút với thời gian đã xác định ở thí nghiệm trên. Đo mật độ quang OD600nm để xem khả năng tăng trưởng đồng thời kiểm tra sự thay đổi pH môi trường. Sau đó dựa vào phương trình đường chuẩn đã được khảo sát trước đó để xác định mật độ tế bào VSV nhằm kết luận được pH ban đầu thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của chủng VSV được tuyển chọn. 60
  72. Đồ án tốt nghiệp Đối với vi khuẩn Lactobacillus Tiến hành cho 1 ml dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn vào trong 19 ml môi trường lỏng MRS broth đã được hấp khử trùng. Với tỉ lệ cấy giống 5%. Lắc ở 150 vòng/phút từ 24 - 48 giờ. Sau đó từ bình tăng sinh hút 1 ml cấy chuyền sang các bình môi trường MRS broth đã được điều chỉnh pH 5,6,7,8,9,10 đã được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Đem lắc trên máy lắc ở 150 vòng/phút với thời gian đã xác định ở thí nghiệm trên . Đo mật độ quang OD600nm để xem khả năng tăng trưởng đồng thời kiểm tra sự thay đổi pH môi trường. Sau đó dựa vào phương trình đường chuẩn đã được khảo sát trước đó để xác định mật độ tế bào VSV nhằm kết luận được pH ban đầu thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của chủng VSV được tuyển chọn. Xác định pH môi trường ban đầu tối ưu dựa vào mật độ tế bào log(cfu/ml) 2.5.12. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn. Môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của các chủng VSV. Vì vậy việc tìm môi trường nhân sinh khối thích hợp sẽ giúp cho việc phối trộn vào thức ăn thừa để tạo phân bón của các chủng vi khuẩn càng hiệu quả. Cách tiến hành: Đối với Bacillus subtilis Tiến hành tăng sinh chủng Bacillus subtilis trên môi trường NB đã được hấp khử trùng, lắc 150 vòng/ phút trong 24 giờ Sau đó tiến hành cấy chuyền sang các môi trường: 1. Môi trường 1 (MT1): NB + 1% tinh bột 2. Môi trường 2 (MT2): NB + 1% glucose 3. Môi trường 3 (MT3): tham khảo dựa trên thành phần môi trường lên men Bacillus subtilis của tập đoàn ICFOOD cung cấp cho khách hàng 61