›

Đồ án Bước đầu ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans trong xử lý nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate

pdf 112 trang thiennha21 12/04/2022 7890
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Bước đầu ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans trong xử lý nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_buoc_dau_ung_dung_chung_vi_khuan_phan_nitrate_achromob.pdf

Nội dung text: Đồ án Bước đầu ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans trong xử lý nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate

  1. LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của ThS. Huỳnh Văn Thành – Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Công Nghệ Tp.Hồ Chí Minh. Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về đồ án tốt nghiệp của mình. TP.HCM, ngày 31 tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện Võ Phương Huỳnh
  2. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy ThS. Huỳnh Văn Thành đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Đồng thời, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức trong thời gian dài học tập. Với những kiến thức mà em đã tiếp thu được không chỉ giúp em thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp mà còn là nền tảng kiến thức cho công việc sau này. Em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, Ba Mẹ đã luôn động viên, chăm sóc và là chỗ dựa vững chắc cho em trong suốt những năm qua. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Lê Trần Ánh Tuyết, cùng các bạn lớp 10DSH, những người luôn động viên và giúp đỡ hết mình để em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này. Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy Cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này. TP.HCM, ngày 31 tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện Võ Phương Huỳnh
  3. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 2 4. Phương pháp nghiên cứu 3 5. Các kết quả đạt được của đề tài 4 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 4 1.1. Tổng quan về vi khuẩn phản nitrate A. xylosoxidans 4 1.1.1. Giới thiệu chung 4 1.1.2. Đặc điểm hình thái 4 1.1.3. Đặc điểm sinh lý 5 1.1.4. Đặc điểm sinh hóa 5 1.1.5. Nguồn phân lập vi khuẩn A. xylosoxidans 6 1.1.6. Định danh bằng giải mã trình tự gene rRNA 16S 9 1.1.7. Một số ứng dụng của vi khuẩn A. xylosoxidans 11 1.1.7.1. Xử lý các hợp chất khó phân hủy 11 1.1.7.2. Khả năng khử màu của malachite green 11 1.1.8. Khả năng phản nitrate của vi khuẩn A. xylosoxidans 12 1.1.8.1. Cơ chế quá trình phản nitrate 12 1.1.8.2. Các điều kiện thích hợp cho quá trình phản nitrate của vi khuẩn A. xylosoxidans 15 1.2. Tổng quan về nƣớc thải chế biến thủy sản 17 1.2.1. Nước thải chế biến thủy sản 17 i
  4. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2. Hiện trạng xử lý nước thải chế biến thủy sản 19 1.3. Phƣơng pháp xử lý sinh học 21 1.4. Tổng quan về mô hình xử lý nƣớc thải MBBR 22 1.4.1. Nguyên tắc hoạt động 22 1.4.2. Hoạt động của giá thể 23 1.4.3. Ưu điểm của quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp MBBR 24 CHƢƠNG II:VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP 25 2.1. Vật liệu - Thiết bị - Hóa chất 25 2.1.1. Vật liệu 25 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 25 2.1.2.1. Thiết bị 25 2.1.2.2. Dụng cụ 25 2.1.3. Hóa chất 26 2.1.3.1. Thành phần môi trường giữ giống, nhân giống, khảo sát 26 2.1.3.2. Hóa chất sử dụng 27 2.2. Bố trí thí nghiệm 27 2.3. Nội dung nghiên cứu 29 2.3.1. Nhân giống chủng vi khuẩn phản nitrate A. xylosoxidans 29 2.3.2. Giữ giống chủng vi khuẩn phản nitrate A. xylosoxidans 29 2.3.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn bằng bộ KIT API 20 NE 29 2.3.4. Khảo sát sự thích ứng của vi khuẩn A. xylosoxidans với tỷ lệ phối trộn giữa nước thải và môi trường Giltay cải tiến 29 2.3.5. Khảo sát mật độ vi khuẩn A. xylosoxidans thích hợp bổ sung vào nước thải giàu nitrate 30 2.3.6. Khảo sát thời gian xử lý nitrate của vi khuẩn A. xylosoxidans trong nước thải giàu nitrate 31 2.3.7. Tiến hành thực hiện mô hình bioreactor quy mô phòng thí nghiệm 32 ii
  5. Đồ án tốt nghiệp 2.4. Phƣơng pháp phân tích 34 2.4.1. Phương pháp dựng đường chuẩn 34 2.4.1.1. Phương pháp dựng đường chuẩn nitrate 34 2.4.1.2. Phương pháp dựng đường chuẩn nitrite 36 2.4.1.3. Phương pháp dựng đường chuẩn amoni 37 - - + 2.4.2. Phương pháp định lượng N-NO3 , N-NO2 , N-NH4 38 - 2.4.2.1. Phương pháp định lượng N-NO3 38 - 2.4.2.2. Phương pháp định lượng N-NO2 39 + 2.4.2.3. Phương pháp định lượng N-NH4 39 2.4.3. Phương pháp khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn A. xylosoxidans bằng bộ KIT API 20 NE 40 2.4.3.1. Chuẩn bị 40 2.4.3.2. Phương pháp 41 2.4.3.3. Cách đọc kết quả 43 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn A. xylosoxidans bằng bộ KIT API 20 NE 46 3.2. Kết quả dựng đƣờng chuẩn 49 3.2.1. Kết quả dựng đường chuẩn nitrate 49 3.2.2. Kết quả dựng đường chuẩn nitrite 50 3.2.3. Kết quả dựng đường chuẩn amoni 52 3.3. Sự thích ứng của vi khuẩn A. xylosoxidans với tỷ lệ phối trộn giữa nƣớc thải và môi trƣờng Giltay cải tiến 53 3.4. Mật độ vi khuẩn A. xylosoxidans thích hợp bổ sung vào nƣớc thải giàu nitrate 56 3.5. Thời gian xử lý nitrate của vi khuẩn A. xylosoxidans trong nƣớc thải giàu nitrate 58 iii
  6. Đồ án tốt nghiệp 3.6. Khảo sát mô hình bioreactor quy mô phòng thí nghiệm 62 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 4.1. Kết luận 65 4.2. Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC iv
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A. xylosoxidans Achromobacter xylosoxidans C Cacbon C/N Tỷ lệ cacbon trên nitơ COD Nhu cầu oxy hóa học MBBR Mô hình xử lý nước thải giá thể lơ lửng N Nitơ v
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn A. xylosoxidans 6 Bảng 1.2. Khử nitrate đồng hòa và khử nitrate dị hóa trong chu trình nitơ của vi khuẩn 13 Bảng 1.3. Thành phần nước thải chế biến thủy sản 19 Bảng 2.1. Các thông số mô hình MBBR xây dựng từ thí nghiệm 32 Bảng 2.2. Trình tự tiến hành dựng đưởng chuẩn nitrate 35 Bảng 2.3. Trình tự tiến hành dựng đường chuẩn nitrite 37 Bảng 2.4. Trình tự tiến hành dựng đường chuẩn amoni 38 Bảng 2.5. Các mức Mc Farland 40 Bảng 3.1. Kết quả các thử nghiệm sinh hóa của vi khuẩn A.xylosoxidans 48 Bảng 3.2. Độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn nitrate 49 Bảng 3.3. Độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn nitrite 51 Bảng 3.4. Độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn amoni 52 vi
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn A. xylosoxidans 5 Hình 1.2. Quy trình phân lập chủng vi khuẩn A. xylosoxidans 8 Hình 1.3. Kết quả giải trình tự gene 16S 10 Hình 1.4. Kết quả so sánh trình tự rRNA 16S với Genbank 10 Hình 1.5. Công thức cấu tạo của malachite green 11 Hình 1.6. Sơ đồ công nghệ xử lý nước thải chế biến thủy sản áp dụng công nghệ sinh học hiếu khí với bùn hoạt tính lơ lửng 20 Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm 28 Hình 2.2. Mô hình bioreactor có giá thể bám dính 34 Hình 2.3. Các mức Mc Farland 41 Hình 2.4. Bộ KIT API 20 NE và thuốc thử 41 Hình 2.5. So sánh độ đục của vi khuẩn A. xylosoxidans trong nước muối sinh lý với mức Mc Farland 0,5 42 Hình 2.6. API AUX MEDIUM sau khi cho 200 µl huyền phù vào 42 Hình 2.7. Bộ KIT API 20 NE sau khi bơm dịch 43 Hình 2.8. Mẫu so sánh kết quả của bộ KIT API 20 NE 45 Hình 3.1. Kết quả bộ KIT sau 24 giờ 46 Hình 3.2. Kết quả bộ KIT sau 48 giờ 47 Hình 3.3. Kết quả so sánh trên API WEB 49 Hình 3.4. Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn nitrate 50 Hình 3.5. Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn nitrite 51 Hình 3.6. Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn amoni 53 Hình 3.7. Mật độ quang của vi khuẩn 54 Hình 3.8. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình 55 Hình 3.9. Động học phản nitrate và hiệu quả xử lý của vi khuẩn A.xylosoxidans theo mật độ 57 vii
  10. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình 57 Hình 3.11. Động học phản nitrate và hiệu quả xử lý của vi khuẩn A. xylosoxidans theo thời gian 59 Hình 3.12. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình 60 Hình 3.13. Động học phản nitrate và hiệu quả xử lý của vi khuẩn A. xylosoxidans theo thời gian 62 Hình 3.14. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình 63 viii
  11. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngành công nghiệp chế biến thủy sản là một ngành kinh tế mũi nhọn đi đầu trong hội nhập kinh tế quốc tế. Bên cạnh những thành quả đạt được về kinh tế - xã hội, ngành công nghiệp này cũng gây ra những vấn đề môi trường đáng lo ngại như gây ô nhiễm không khí, ô nhiễm chất thải rắn, và nghiêm trọng hơn nữa là ô nhiễm nguồn nước. Nước thải chế biến thủy sản chứa thành phần ô nhiễm hữu cơ như COD, BOD và hàm lượng nitrate khá cao. Với các phương pháp xử lý nước thải hiện nay như phương pháp xử lý hóa lý, phương pháp xử lý hóa học, có thể xử lý hiệu quả được COD và BOD nhưng vẫn chưa xử lý triệt để được nguồn nitrate tồn đọng trong nước thải. Hiện nay, các phương pháp xử lý nước thải ngày càng đi sâu vào áp dụng các phương pháp sinh học. Đối với nước thải chế biến thủy sản, việc áp dụng phương pháp xử lý sinh học rất thích hợp vì có hàm lượng chất hữu cơ cao, dễ phân hủy sinh học bởi vi khuẩn. So với các phương pháp xử lý hóa lý, hóa học thì phương pháp xử lý sinh học tiết kiệm hơn về quy mô cũng như giá thành đầu tư. Đặc biệt phương pháp xử lý sinh học sẽ không gây tái ô nhiễm môi trường – một nhược điểm mà phương pháp xử lý hóa học hay mắc phải. Do đó, để xử lý được nguồn nitrate tồn đọng cần áp dụng các phương pháp xử lý sinh học, ứng dụng các chủng vi khuẩn phản nitrate vào quy trình xử lý để đạt hiệu quả xử lý cao hơn. Trước tình hình trên, được sự cho phép của khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, tác giả thực hiện đề tài “Bƣớc đầu ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans trong xử lý nƣớc thải chế biến thủy sản giàu nitrate”. 1
  12. Đồ án tốt nghiệp 2. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát các điều kiện thích hợp cho quá trình xử lý nitrate của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong nước thải giàu nitrate. Ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans vào xử lý nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate quy mô phòng thí nghiệm. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Khảo sát đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans. Khảo sát sự thích ứng của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans theo sự phối trộn giữa tỷ lệ nước thải chế biến thủy sản : tỷ lệ môi trường Giltay cải tiến. Khảo sát mật độ thích hợp của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans bổ sung vào nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate. Khảo sát thời gian xử lý nitrate của chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans trong nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate. Chạy mô hình MBBR phản nitrate quy mô phòng thí nghiệm. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp tổng hợp tài liệu: - Thu thập, nghiên cứu các tài liệu tham khảo, tài liệu internet có liên quan đến đề tài. - Lựa chọn, tổng hợp các tài liệu liên quan đến mục tiêu đề ra trong đề tài. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: - Sử dụng chủng vi khuẩn phản nitrate. - Khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn phản nitrate bằng bộ KIT API 20 NE. - Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và khả năng phản nitrate của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong nước thải 2
  13. Đồ án tốt nghiệp chế biến thủy sản như thời gian, mật độ tế bào vi khuẩn, tỷ lệ môi trường thích hợp để đạt hiệu quả xử lý nitrate cao và không tích lũy nitrite cũng như phát sinh amoni. - Dựa trên các thông số thí nghiệm tiến hành chạy mô hình xử lý nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate quy mô phòng thí nghiệm. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu: - Ghi nhận số liệu từ kết quả thí nghiệm khảo sát theo từng thời điểm. - Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel. - Xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV. Các số liệu sau đó được phân tích ANOVA và được trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05. 5. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài Tìm ra được tỷ lệ phối trộn, mật độ và thời gian xử lý thích hợp của vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxindans để ứng dụng vào xử lý nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate quy mô phòng thí nghiệm. 3
  14. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về vi khuẩn phản nitrate Achromobacter Xylosoxidans 1.1.1. Giới thiệu chung Achromobacter xylosoxidans là vi khuẩn Gram (-), gần giống với chủng Alcaligenes, có khả năng phản nitrate theo con đường dị hóa trong điều kiện yếm khí (anaerobic) cho sản phẩm cuối cùng là N2, tương tự như Pseudomonas stutzeri, Paracoccus denitrificans, Rhodobacter capsulatus, Thiobacillus denitrificans và Thiosphera pantotropha. Phân loại vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans: Giới: Vi khuẩn Ngành: Proteobacteria Lớp: Beta Proteobacteria Bộ: Burkhol deriales Họ: Alcaligenaceae Chi: Achromobacter Loài: Achromobacter xylosoxidans 1.1.2. Đặc điểm hình thái Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans là: - Vi khuẩn Gram âm (-) - Hình que. - Kích thước 0.4 x 0.7 – 1.0µm. - Có tiên mao. 4
  15. Đồ án tốt nghiệp Gram (-) Tiên mao Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans 1.1.3. Đặc điểm sinh lý Vi khuẩn Achromobacter xylososidans là: - Vi khuẩn kỵ khí tùy nghi. - Có khả năng di động. - Không sinh nội bào tử. 1.1.4. Đặc điểm sinh hóa Các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans được thể hiện trong bảng 1.1. 5
  16. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn A. xylosoxidans STT Thử nghiệm Kết quả 1 Catalase (+) 2 O/F O+/F- 3 Oxidase (+) 4 MR (-) 5 VP (-) 6 Indol (+) 7 Tạo màng biofilm (+) 1.1.5. Nguồn phân lập vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans được phân lập từ: - Nguồn nước thải giàu nitơ như nước thải chế biến thủy sản, nước thải chăn nuôi, - Nguồn nước thải nhiễm 2,4,6 – trinitrotoluene (TNT). Quy trình phân lập chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans từ nguồn nước thải chế biến thủy sản được thể hiện ở hình 1.2 (Nguyễn Thị Hồng Đào, 2012). 6
  17. Đồ án tốt nghiệp Nước thải chế biến thủy sản - Tăng sinh trong môi trường Giltay NO3 - Quan sát MT đục, Định tính khử Định tính NO2 tạo - sinh khí NO3 thành Chọn ống tăng sinh đục, sinh khí, khử nitrate - Phân lập trên môi trường thạch Giltay NO3 Chọn ra chủng vi khuẩn thuần khiết - Tăng sinh trong môi trường Giltay NO2 + Quan sát MT đục, Định tính khử Định tính NH4 - sinh khí NO2 tạo thành + Chọn chủng khử nitrite, sinh ít NH4 7
  18. Đồ án tốt nghiệp Test O/F và các test sinh hóa khác Chọn chủng không lên men glucose - Khảo sát khả năng khử N-NO2 Định tính, định lượng Xác định thể tích Xác định pH môi - - + NO3 , NO2 , NH4 khí sinh ra trường - + Chọn chủng khử NO3 , sinh ít NH4 , sinh khí, tăng pH - Khảo sát khả năng khử N-NO3 - Chọn chủng có hiệu suất xử lý N-NO3 cao, - + không tích lũy N-NO2 , nồng độ NH4 sinh ra ít (Nguyễn Thị Hồng Đào, 2012) Hình 1.2. Quy trình phân lập chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans 8
  19. Đồ án tốt nghiệp Mẫu nước thải được pha loãng bằng nước muối sinh lý (0,85%). Sau đó được tăng sinh trên môi trường Giltay có chứa nguồn C là acid citric, N là KNO3 và một số chất quan trọng khác. Dấu hiệu nhận biết sự phát triển của vi khuẩn khử nitrate là có sinh khí trong ống durham, đục môi trường và pH môi trường giảm. Từ các ống dương tính khử nitrate, thực hiện cấy ria sang môi trường thạch - Giltay NO3 (agar 2% - 2,5). Các khuẩn lạc riêng rẽ được tiến hành cấy ria nhiều lần trên môi trường Giltay thạch cho đến khi thu được các chủng vi khuẩn thuần khiết. Tiến hành các test sinh hóa đối với chủng vi khuẩn phản nitrate phân lập được và khảo sát khả năng khử nitrate, nitrite của chủng vi khuẩn phân lập. 1.1.6. Định danh bằng giải mã trình tự gene rRNA 16S Kết quả định danh bằng giải mã trình tự gene rRNA 16S (Lê Trần Ánh Tuyết, 2013) và tra cứu trong hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey cho thấy đây là vi khuẩn phản nitrate tiềm năng và thuộc mức độ an toàn sinh học loại 2 (Busse, HJ và cộng sự, 2006). Ngoài ra, vi khuẩn này cũng thể hiện nhiều khả năng sử dụng nhiều nguồn năng lượng hữu cơ khác nhau. Đây là vi khuẩn được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới để phân hủy các hợp chất xenobiotic như endosulfan (Li W và cộng sự, 2009), chrysene (Chirag M và cộng sự, 2011), estradiol (Iasur-Kruh L và cộng sự, 2011), hợp chất phenol (Ho YN và cộng sự , 2012), thuốc nhuộm (Manikandan N và cộng sự , 2012). 9
  20. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Kết quả giải trình tự chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans Hình 1.4. Kết quả so sánh trình tự rRNA 16S với Genbank 10
  21. Đồ án tốt nghiệp 1.1.7. Một số ứng dụng của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans 1.1.7.1. Xử lý các hợp chất khó phân hủy Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có khả năng phân hủy một số hợp chất như PAHs, 2,4,6-tribromophenol, p-nitrophenol (Niansheng Wan và cộng sự, 2007). Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans sử dụng p-nitrophenol như nguồn carbon, nitơ và năng lượng duy nhất, phân hủy hoàn toàn sau 7 ngày ở điều kiện hiếu khí (Niansheng Wan và cộng sự, 2007). Ngoài ra, vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans còn có khả năng phân hủy hợp chất 2,4,6 – trinitrotoluene (TNT) là chất có độc tính cao đối với nhiều sinh vật (Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự, 2009). Đối với con người, TNT được biết đến là chất gây ung thư nhóm C, gây hỏng gan, rồi loạn chức năng cơ thể dẫn đến các bệnh về đường tiêu hóa và hô hấp. Chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có khả năng sử dụng TNT như nguồn nitrogen và sử dụng làm năng lượng cho quá trình sinh trưởng (Esteve và cộng sự, 2001). Các enzyme nội bào và ngoại bào của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans đóng vai trò quan trọng, tham gia vào quá trình phân hủy sinh học TNT. 1.1.7.2. Khả năng khử màu của malachite green Malachite green có tên hóa học là triphenylmetan. Danh pháp quốc tế: 4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl methyl]-N, N- dimethyl-aniline. Công thức phân tử: C23H25ClN2 Công thức cấu tạo: Hình 1.5. Công thức cấu tạo của malachite green 11
  22. Đồ án tốt nghiệp Malachite green thường được biết đến như một loại phẩm nhuộm màu xanh. Ngoài ra malachite green còn được sử dụng như chất sát trùng, diệt nấm, dùng để sát trùng ao hồ, Khi bị hấp thụ vào trong cơ thể dưới cơ chế tác động của cơ thể malachite green sẽ bị biến đổi thành hai dạng quan trọng. Dạng thứ nhất là Carbinol, dạng này che phủ tế bào rất nhanh. Khi vào bên trong tế bào Carbinol sẽ kết hợp với quá trình trao đổi chất và biến thành dạng Leuco malachite green (LMG). Dạng này có độc tính và tồn tại trong cơ thể lâu hơn so với dạng phẩm nhuộm malachite green. Một vài nghiên cứu đã cho thấy rằng malachite green có độc tính cao đối với những loài cá nước ngọt, ở cả tình trạng cấp tính và mãn tính (Steffens và cộng sự., 1961). Malachite green cũng là một chất độc đối với đường hô hấp (Werth, 1985). Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có khả năng xử lý rất mạnh màu của malachite green. Tỷ lệ xử lý khoảng 86% trong khoảng một giờ khi nồng độ của malachite green là 2000 mg/L. Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có khả năng tẩy màu của malachite green là nhờ các enzyme nội bào và enzyme ngoại bào. Kết quả kỹ thuật PCR cho thấy vi khuẩn có khả năng phân hủy malachite có chứa một gene triphenylmethane TMR. Để kiểm tra khả năng xử lý màu của chủng vi khuẩn, thí nghiệm kiểm tra tiến hành bổ sung 100 mg/l thuốc nhuộm và tỷ lệ cấy giống là 5%. Điều chỉnh pH về 7, ủ ở nhiệt độ 370C trong khoảng 48 giờ. Sự khử màu được theo dõi bằng cách đo OD của sinh khối tế bào ở bước sóng 538 nm. 1.1.8. Khả năng phản nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans 1.1.8.1. Cơ chế quá trình phản nitrate Tìm hiểu sâu về cơ chế khử nitrate, thì vi khuẩn có thể thực hiện hai quá trình khử nitrate theo hai mục đích khác nhau (Bảng 1.2). - Tổng hợp năng lượng nhờ quá trình hô hấp kỵ khí mà nitrate là chất nhận điện tử cuối cùng, gọi là khử nitrate dị hóa. 12
  23. Đồ án tốt nghiệp - + - Chuyển hóa NO3 thành NH4 để tổng hợp nên cấu trúc tế bào, gọi là khử nitrate đồng hóa. Bảng 1.2. Khử nitrate đồng hóa và khử nitrate dị hóa trong chu trình N của vi khuẩn Khử nitrate dị hóa Khử nitrate đồng hóa Đồng hóa Amoni hóa Phản nitrate (sinh tổng hợp các hợp chất (khử độc tế bào) chứa nitơ) Khử nitrate hô hấp Khử nitrate đồng hóa - - - - NO3 → NO2 NO3 → NO2 (giải phóng nitrite hoặc khử tiếp) (khử tiếp) Khử nitrite hô hấp thành Amoni hóa làm giảm nitrite nitrite oxide rồi nitrous Khử nitrite đồng hóa NO - → NH + 2 4 - + oxide NO2 → NH4 - (giải phóng amoni) NO2 → NO →N2O (đồng hóa amoni) (sinh khí) Hô hấp khử N2O thành nitơ N2O → N2 (sinh khí) (Nguồn: Zumft WG., 1997) 13
  24. Đồ án tốt nghiệp - Khử nitrate dị hóa Sau khi khử nitrate dị hóa thành nitrite qua hô hấp kị khí, có thể xảy ra đồng thời hai quá trình khử nitrite : - Phản nitrate: nhánh thứ nhất khử tiếp NO2 → NO (k) → N2O (k) và cuối cùng tạo ra N2. Khử nitrate dị hóa amoni hóa: quá trình này còn được gọi là quá trình khử độc tế bào. - Khử nitrate đồng hóa + Khử nitrate đồng hóa được diễn ra với mục đích tạo ra NH4 là nguồn N cho quá trình tổng hợp tế bào của vi khuẩn. Enzyme xúc tác cho sự chuyển hóa nitrite thành + amoni (NH4 ) và amoniac (NH3) là NirA do gen nirA và NasB do gene nasB mã hóa. Cả hai cơ chế khử nitrate dị hóa và khử nitrate đồng hóa, bước đầu đều khử nitrate về nitrite nhưng enzyme xúc tác là khác nhau. Ở khử nitrate đồng hóa enzyme xúc tác do gene nas mã hóa, trong khi khử nitrate dị hóa là do gene nar/nap mã hóa. Như vậy, trong quá trình phản nitrate chỉ có quá trình khử nitrate dị hóa – hô hấp nitrate kị khí mới có ý nghĩa xử lý N trong nước thải. Đó là cơ sở để tiến hành phân lập chủng vi khuẩn mong muốn. Nghĩa là chủng vi khuẩn đó có khả năng khử nitrate và khử nitrite hoàn toàn, tạo thành khí N2 và không hoặc ít tạo ra amoni + (NH4 ).Vì nếu lượng amoni tạo ra nhiều sau quá trình xử lý thì việc ứng dụng vi khuẩn đó vào xử lý nước thải không còn ý nghĩa, ngược lại còn làm cho nước ô nhiễm nghiêm trọng hơn. 14
  25. Đồ án tốt nghiệp 1.1.8.2. Các điều kiện thích hợp cho quá trình phản nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans  Ảnh hưởng của oxy lên khả năng tăng trưởng và khả năng phản nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans được tăng sinh trong điều kiện hiếu khí để tăng mật độ vi khuẩn và xử lý nitrate trong điều kiện thiếu khí kết hợp với giá thể bám dính. Theo kết quả (Lê Trần Ánh Tuyết, 2013) cho thấy trong điều kiện hiếu khí khả năng tăng trưởng của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans tốt hơn so với điều kiện thiếu khí. Do đó, sinh khối nên được tăng sinh riêng và tăng cường cho hệ thống xử lý để việc ứng dụng vi khuẩn khử nitrate hiệu quả hơn.  Nguồn cacbon thích hợp cho khả năng phản nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosixidan Trong xử lý loại bỏ nitơ trong nước thải, nếu quá trình phản nitrate tiến hành trước quá trình xử lý hiếu khí (tiền phản nitrate - pre-denitrification treatment), thì nguồn năng lượng và C cho vi khuẩn phản nitrate chính là nguồn carbon hữu cơ trong nước thải. Tuy nhiên, nếu thực hiện công nghệ hậu phản nitrate (post-denitrification), COD nước thải đã giảm phần lớn sau quá trình bùn hoạt tính, không còn đủ cung cấp cho vi khuẩn phản nitrate. Khi ấy một nguồn carbon bên ngoài cần được bổ sung. Trước đây, methanol thường được bổ sung đóng vai trò này, nhưng sau này các nguồn hữu cơ khác đã được nghiên cứu, trong đó theo nhiều tài liệu, acetate là nguồn C thích hợp hơn cả (Huỳnh Văn Thành, 2013). Khảo sát các môi trường để tìm ra môi trường chứa nguồn cacbon thích hợp cho sự tăng trưởng và khả năng phản nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans đã chọn ra được môi trường thích hợp là môi trường Giltay được thay thế asparagines bằng pepton, citrate được thay thế bằng acetate. Môi trường này có nguồn C và N thích 15
  26. Đồ án tốt nghiệp hợp cho chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans phát triển. (Lê Trần Ánh Tuyết, 2013).  Ảnh hưởng của tỷ lệ C/N đến khả năng phản nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans Trong quá trình phản nitrate, dù trong công nghệ tiền phản nitrate hay hậu phản nitrate thì tỉ lệ C/N cũng được quan tâm, C là nguồn năng lượng và N là tải trọng N- - NO3 . Tỉ lệ C/N thích hợp bảo đảm năng lượng đầu vào cho vi khuẩn phản nitrate cung cấp cho chuỗi hô hấp khử hoàn toàn nitrate. Theo kết quả (Lê Trần Ánh Tuyết, 2013) sau khi xử lý cho thấy không có sự khác biệt giữa các tỷ lệ C/N, điều này cho thấy nếu áp dụng công nghệ tiền phản nitrate thì tỉ lệ C/N cao đến 18 không ảnh hưởng đến hiệu quả xử lý, trong khi đó nếu áp dụng công nghệ hậu phản nitrate thì tỉ lệ C/N = 4 chưa phải là tỉ lệ thấp nhất. Như vậy có thể cung cấp năng lượng cho vi khuẩn ít hơn nữa để chuyển hóa hoàn toàn nitrate.  Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng phản nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans Nước thải chế biến thủy sản thường chứa nồng độ muối cao. Theo kết quả (Lê Trần Ánh Tuyết, 2013) chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có thể tăng trưởng và chuyển hóa nitrate trong điều kiện môi trường có muối và nồng độ muối có thể chịu đựng được là 3%.  Ảnh hưởng của giá thể và sinh khối vi khuẩn ban đầu đến khả năng phản nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans Theo kết quả (Lê Trần Ánh Tuyết, 2013) thì mô hình có giá thể không chứa muối, hiệu quả xử lý dễ dàng đạt 100% sau 24 giờ. Để tăng cường sinh học luôn phải kiểm soát nồng độ vi khuẩn ban đầu sau khi bổ sung sinh khối vào môi trường, nhất là trong điều kiện thiếu khí khả năng tăng trưởng của vi khuẩn hạn chế. Tuy nhiên nếu nồng độ vi khuẩn quá cao sẽ dẫn đến giá thành xử lý cao. 16
  27. Đồ án tốt nghiệp Theo kết quả (Lê Trần Ánh Tuyết, 2013) ở nồng độ 108 cfu/ml cho hiệu quả xử lý cao nhất (99%) sau 36 giờ xử lý. 1.2. Tổng quan về nƣớc thải chế biến thủy sản 1.2.1. Nước thải chế biến thủy sản Ngành chế biến thủy sản là một trong những ngành gây ô nhiễm nghiêm trọng đến môi trường. Ảnh hưởng của ngành chế biến thủy sản đến môi trường không chỉ phụ thuộc vào loại hình chế biến, mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như quy mô sản xuất, nguyên liệu đầu vào, mùa vụ, trình độ kỹ thuật, công nghệ và tổ chức quản lý sản xuất, Một số tác động đặc trưng của ngành chế biến thủy sản gây ảnh hưởng đến môi trường: - Ô nhiễm không khí: mùi hôi phát sinh từ việc lưu trữ các phế thải trong quá trình sản xuất. Khí thải Clo sinh ra trong quá trình khử trùng thiết bị, nhà xưởng chế biến và khử trùng nguyên liệu. Khí thải từ các máy phát điện dự phòng. Trong các nguồn ô nhiễm không khí, mùi là vấn đề chính đối với các nhà máy chế biến thủy sản. - Chất thải rắn: phát sinh chủ yếu từ quá trình chế biến, bao gồm các loại đầu vỏ tôm, vỏ nghêu, da/mai mực, nội tạng mực và cá, - Chất thải lỏng nước thải sản xuất trong chế biến thủy sản chiếm 85 – 90% tổng lượng nước thải. Chủ yếu phát sinh từ các công đoạn: rửa trong xử lý nguyên liệu, chế biến, vệ sinh nhà xưởng, dụng cụ, thiết bị và nước thải sinh hoạt. Trong các nguồn ô nhiễm, nước thải là nguồn gây ô nhiễm nghiêm trọng đến môi trường bởi phát sinh thể tích nước thải lớn với nồng độ ô nhiễm cao nếu không được xử lý thích hợp. Nước thải chế biến thủy sản chứa các phần lớn các chất thải hữu cơ có nguồn gốc từ động vật và có thành phần chủ yếu là protein và chất béo. Trong hai thành phần này, chất béo khó bị phân hủy bởi vi sinh vật. 17
  28. Đồ án tốt nghiệp Trong nước thải chứa các chất như carbon hydrate, protein, chất béo, khi thải vào nguồn nước sẽ làm suy giảm nồng độ oxy hòa tan trong nước do vi sinh vật sử dụng oxy hòa tan để phân hủy các chất hữu cơ. Nồng độ oxy hòa tan giảm không những gây suy thoái tài nguyên thủy sản mà còn làm giảm khả năng tự làm sạch của nguồn nước, dẫn đến giảm chất lượng nước cấp cho sinh hoạt và công nghiệp. Các chất rắn lơ lửng làm cho nước đục hoặc có màu, hạn chế độ sâu tầng nước được ánh sáng chiếu xuống, gây ảnh hưởng đến quá trình quang hợp của tảo, rong rêu, Nồng độ các chất nitơ, photpho cao gây nên hiện tượng bùng phát các loại tảo, đến mức độ giới hạn tảo sẽ chết và phân hủy gây nên hiện tượng thiếu oxy. Nếu nồng độ oxy giảm đến 0 sẽ gây ra hiện tượng thủy vực chết, ảnh hưởng đến chất lượng nước của thủy vực. Ngoài ra các loại tảo nổi trên mặt nước tạo thành lớp màng khiến cho bên dưới không có ánh sáng. Quá trình quang hợp của thực vật tầng dưới bị ngưng trệ. Tất cả các hiện tượng trên gây tác động xấu đến chất lượng nước, ảnh hưởng tới hệ thủy sinh, nghề nuôi trồng thủy sản, du lịch và cấp nước. Tùy thuộc vào loại hình và trình độ công nghệ chế biến, đặc tính nguyên liệu và yêu cầu về chất lượng sản phẩm mà nước thải từ các nguồn phát sinh có sự khác biệt về thành phần, tính chất cũng như lưu lượng. Thành phần của nước thải của một số loại hình chế biến thủy sản được thể hiện trong bảng 1.3. 18
  29. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.3. Thành phần nước thải chế biến thủy sản Nồng độ Thủy sản Chỉ tiêu Đơn vị Cá da trơn Tôm lạnh đông lạnh (Tra –Basa) hỗn hợp pH - 6,5 – 9 6,5 – 7 5,5 – 9 SS mg/l 100 – 300 500 – 1200 50 – 194 COD mgO2/l 800 – 2000 800 – 2500 694 – 2070 BOD5 mgO2/l 500 – 1500 500 – 1500 391 – 1539 NTổng mg/l 50 – 200 100 – 300 30 – 100 PTổng mg/l 10 – 120 50 – 100 3 – 50 Dầu và mỡ mg/l - 250 – 830 2,4 – 100 (Nguồn: Tổng cục môi trường, 2009) 1.2.2. Hiện trạng xử lý nước thải chế biến thủy sản Theo Viện nghiên cứu hải sản, hiện nay cả nước ta có 1015 cơ sở chế biến thủy sản quy mô lớn nhỏ khác nhau. Phần lớn những nhà máy và cơ sở chế biến thủy sản ở Việt Nam có quy mô vừa và nhỏ. Trang thiết bị và công nghệ được đánh giá là nhanh chóng đáp ứng so với những trang thiết bị và công nghệ của những ngành công nghiệp khác. Tuy nhiên, vẫn chậm đáp ứng nếu so sánh với trang thiết bị và công nghệ của những quốc gia khác. Mặc dù những nhà máy và cơ sở sản xuất đã quan tâm đến vấn đề bảo vệ môi trường, đã thiết lập các trạm xử lý nước thải nhưng hoạt động của các trạm này còn kém hiệu quả, không theo quy cách. Hệ thống xử lý nước thải còn chưa được hoàn chỉnh, chất thải nguy hại tồn đọng ngày càng nhiều gây ảnh hưởng đến con người và hệ sinh thái. 19
  30. Đồ án tốt nghiệp Hiện nay, công nghệ xử lý nước thải đang được áp dụng phổ biến ở các nhà máy và cơ sở chế biến thủy sản là công nghệ sinh học hiếu khí bùn hoạt tính lơ lửng (Nguyễn Thế Đồng, 2011). Sơ đồ công nghệ bùn hoạt tính hiếu khí lơ lửng thể hiện trong hình 1.6. Nước thải Song chắn Ngăn thu gom Bể điều hòa rác Bể khử trùng Bể lắng Bùn hoạt tính hiếu khí Nguồn tiếp nhận Bể chứa bùn Tuần hoàn bùn Bùn thải (Nguồn: Tổng cục môi trường, 2011) Hình 1.6. Sơ đồ công nghệ xử lý nước thải chế biến thủy sản áp dụng công nghệ sinh học hiếu khí với bùn hoạt tính lơ lửng Từ hình 1.6 cho thấy công nghệ xử lý nước thải chế biến thủy sản trên chủ yếu giảm COD, BOD và xảy ra quá trình amoni hóa, nitrate hóa nên nước thải đầu ra chứa hàm lượng nitrate cao. Để khắc phục nhược điểm của công nghệ trên nên áp dụng phương pháp xử lý sinh học, sử dụng chủng vi khuẩn phản nitrate để xử lý lượng nitrate và nitrite còn tồn đọng trong nước thải. 1.3. Phƣơng pháp xử lý sinh học Nhìn chung, nước thải chế biến thủy sản thường có các thành phần ô nhiễm vượt quá tiêu chuẩn cho phép nhiều lần. Trong khi đó, lưu lượng nước thải tính trên một đơn vị sản phẩm cũng khá lớn, thường từ 30 – 80m3 cho một tấn thành phẩm. (Lâm Minh Triết và cộng sự, 2004). 20
  31. Đồ án tốt nghiệp Xây dựng hệ thống xử lý nước thải hoàn chỉnh cho bất cứ nhà máy hay cơ sở chế biến thủy sản nào đều không đơn giản, đòi hỏi kinh phí thực hiện cũng như diện tích xây dựng khá lớn. Điều này chính là rào cản cho việc đầu tư xử lý nước thải của các nhà máy và cơ sở chế biến thủy sản. Vì vậy, việc áp dụng, lựa chọn các phương pháp hợp lý để xử lý nguồn nước thải là vấn đề cấp thiết. Hiện nay, công nghệ xử lý nước thải ngày càng chú trọng vào áp dụng công nghệ sinh học và các biện pháp công nghệ sinh học cũng đã chứng minh hiệu quả triệt để, hơn hẳn những phương pháp xử lý khác. Trong nhiều phương pháp xử lý ô nhiễm, phương pháp sinh học được đặc biệt quan tâm sử dụng. So với các phương pháp xử lý hóa lý, hóa học thì phương pháp xử lý sinh học tiết kiệm hơn về quy mô cũng như giá thành đầu tư. Đặc biệt phương pháp xử lý sinh học sẽ không gây tái ô nhiễm môi trường – một nhược điểm mà phương pháp xử lý hóa học thường mắc phải. Phương pháp xử lý sinh học sử dụng một đặc điểm rất quý của vi sinh vật, đặc điểm đã thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu và các nhà sản xuất là khả năng đồng hóa được rất nhiều nguồn cơ chất khác nhau của vi sinh vật, từ tinh bột, cellulose, lipid, đến các kim loại nặng như chì, thủy ngân, Bản chất của phương pháp này là dựa trên hoạt động sống của vi sinh vật (sử dụng các hợp chất hữu cơ và một số chất khoáng có trong nước thải làm nguồn dinh dưỡng và năng lượng) để biến đổi các hợp chất hữu cơ cao phân tử có trong nước thải thành các hợp chất đơn giản hơn. Trong quá trình dinh dưỡng này vi sinh vật sẽ nhận được các chất làm vật liệu để xây dựng tế bào, sinh trưởng và sinh sản, nên sinh khối được tăng lên. Phương pháp xử lý sinh học để xử lý nước thải có thể làm sạch hoàn toàn các loại nước thải công nghiệp chứa các loại chất bẩn hòa tan hoặc phân tán nhỏ. Do vậy, phương pháp này thường dùng sau khi loại bỏ các tạp chất phân tán thô ra khỏi chất thải. 21
  32. Đồ án tốt nghiệp 1.4. Tổng quan về mô hình xử lý nƣớc thải MBBR 1.4.1. Nguyên tắc hoạt động MBBR là từ viết tắt của cụm Moving Bed Biofilm Reactor, được mô tả một cách dễ hiểu là quá trình xử lý nhân tạo trong đó sử dụng các vật làm giá thể cho vi sinh dính bám vào để sinh trưởng và phát triển, là sự kết hợp giữa Aerotank truyền thống và lọc sinh học hiếu khí. Công nghệ MBBR là công nghệ kết hợp giữa các điều kiện thuận lợi của quá trình xử lý bùn hoạt tính hiếu khí và bể lọc sinh học. Bể MBBR hoạt động giống như quá trình xử lý bùn hoạt tính hiếu khí trong toàn bộ thể tích bể. Đây là quá trình xử lý bằng lớp màng biofilm với sinh khối phát triển trên giá thể mà những giá thể này lại di chuyển tự do trong bể phản ứng và được giữ bên trong bể phản ứng. Bể MBBR không cần quá trình tuần hoàn bùn giống như các phương pháp xử lý bằng màng biofilm khác, vì vậy nó tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xử lý bằng phương pháp bùn hoạt tính trong bể, bởi vì sinh khối ngày càng được tạo ra trong quá trình xử lý. Công nghệ MBBR là công nghệ mới nhất hiện nay trong lĩnh vực xử lý nước thải vì tiết kiệm được diện tích và hiệu quả xử lý cao. Vật liệu làm giá thể phải có tỷ trọng nhẹ hơn nước đảm bảo điều kiện lơ lửng. Các giá thể này luôn chuyển động không ngừng trong toàn thể tích bể nhờ các thiết bị thổi khí và cánh khuấy. Qua đó thì mật độ vi sinh ngày càng gia tăng, hiệu quả xử lý ngày càng cao. Tương tự Aerotank truyền thống, bể MBBR hiếu khí cũng có một MBBR thiếu khí (Anoxic) để đảm bảo khả năng xử lý nitơ trong nước thải. Thể tích của màng MBBR so với thể tích bể được điều chỉnh theo tỷ lệ phù hợp, thường là <50% thể tích bể (Lê Hồng Thái, 2013). 1.4.2. Hoạt động của giá thể Nhân tố quan trọng của quá trình xử lý này là các giá thể động có lớp màng biofilm dính bám trên bề mặt. Những giá thể này được thiết kế sao cho diện tích bề mặt 22
  33. Đồ án tốt nghiệp hiệu dụng lớn để lớp màng biofilm dính bám trên bề mặt của giá thể và tạo điều kiện tối ưu cho hoạt động của vi sinh vật khi những giá thể này lơ lửng trong nước. Tất cả các giá thể có tỷ trọng nhẹ hơn so với tỷ trọng của nước, tuy nhiên mỗi loại giá thể có tỷ trọng khác nhau. Điều kiện quan trọng nhất của quá trình xử lý này là mật độ giá thể trong bể, để giá thể có thể chuyển động lơ lửng ở trong bể thì mật độ giá thể chiếm tứ 25 – 50% thể tích bể và tối đa trong bể MBBR phải nhỏ hơn 67%. Trong mỗi quá trình xử lý bằng màng sinh học thì sự khuếch tán của chất dinh dưỡng (chất ô nhiễm) ở trong và ngoài lớp màng là nhân tố đóng vai trò quan trọng trong quá trình xử lý, vì vậy chiều dày hiệu quả của lớp màng cũng là một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả xử lý. Đặc trưng của giá thể là tính kị nước cao, khả năng bám dính sinh học cao. Chất lượng màng sinh học tốt, khó rơi ra khỏi vật liệu, độ dày lớp biofilm ngoài 10 - 200 µm, lớp biofilm trong có độ dày thay đổi theo tải trọng. Ngoài ra còn có enzyme sinh học kích hoạt khả năng xử lí của sinh vật trong nước thải. Chiếm khoảng không gian ít, không bị nghẹt bùn trong khoảng thời gian dài hoạt động. Tạo bùn nặng dễ lắng, tạo ra 40 - 80% bùn ít hơn quá trình bùn hoạt tính. Hiệu quả xử lí 30 – 50% cao hơn quá trình bùn hoạt tính trong khi đó chi phí hoạt động giảm ít nhất 30%. Có thể được thả trực tiếp trong bể hiếu khí, kỵ khí, thiếu khí. Không cần phải thay thế trong vòng 30 năm. Không bị ảnh hưởng bởi hình dạng bể, có thể sử dụng cho tất cả các loại bể (Lê Hồng Thái, 2013). 1.4.3. Ưu điểm của quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp MBBR Mật độ vi sinh vật xử lý trên một đơn vị thể tích cao hơn so với hệ thống xử lý bằng phương pháp bùn hoạt tính lơ lửng, vì vậy tải trọng hữu cơ của bể MBBR cao hơn. Chủng loại vi sinh vật xử lý đặc trưng: Lớp màng biofilm phát triển tùy thuộc vào loại chất hữu cơ và tải trọng hữu cơ trong bể xử lý. 23
  34. Đồ án tốt nghiệp Hiệu quả xử lý cao. Tiết kiệm diện tích xây dựng: diện tích xây dựng của MBBR nhỏ hơn so với hệ thống xử lý nước thải hiếu khí đối với nước thải đô thị và công nghiệp. Dễ dàng vận hành. Điều kiện tải trọng cao: Mật độ vi sinh vật trong lớp màng biofilm rất cao, do đó tải trọng hữu cơ trong bể MBBR rất cao. (Lê Hồng Thái, 2013). 24
  35. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG II: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu - thiết bị - hóa chất 2.1.1. Vật liệu Chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans được lấy từ Trung tâm Thí nghiệm Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Mẫu nước thải được lấy từ trạm xử lý nước thải của Nhà máy Chế biến thực phẩm Tân Phú Trung. Địa chỉ: Lô C2-1, Đường D4, Quốc lộ 22, ấp Trạm Bơm, xã Tân Phú Trung, huyện Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh. 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 2.1.2.1. Thiết bị - Nồi hấp tiệt trùng Autoclave. - Máy đo độ hấp thụ quang học. - Cân điện tử. - Máy lắc. - Tủ hút. - Tủ ủ. - Tủ cấy vô trùng. - Tủ lạnh. - Máy lắc. - Máy nước cất. 2.1.2.2. Dụng cụ - Đèn cồn. - Bình định mức 100ml. - Đũa thủy tinh. - Dây cấy vòng. - Bông không thấm. 25
  36. Đồ án tốt nghiệp - Giấy lọc. - Cốc thủy tinh: 100 ml, 250 ml, 1000 ml. - Ống đong: 50 ml, 100 ml. - Bình tam giác: 100 ml, 250 ml. - Pipet: 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml. - Micro pipet: 100 µl, 1000 µl. - Ống nghiệm. - Đĩa petri. - Cuvet thủy tinh. - Enppendorf. - Bóp cao su. - Giấy đo pH. 2.1.3. Hóa chất 2.1.3.1. Thành phần môi trường giữ giống, nhân giống, khảo sát - Môi trường Giltay (Egorov NS, 1986) Dung dịch A: Asparagine (C4H8N2O3.H2O) 1g KNO3 1g Nước máy 0,25 l Dung dịch B: Citric acid 5g KH2PO4 1g MgSO4.7H2O 1g CaCl2.6H2O 1g FeCl2.4H2O vết Nước máy 0,25 l 26
  37. Đồ án tốt nghiệp Hòa 0,25 l dung dịch A vào 0,25 l dung dịch B và dùng KOH 10% để chỉnh pH = 7, sau đó thêm nước máy đến 1lít, dung dịch môi trường Giltay hoàn tất. ̶ Môi trường tối ưu tương tự môi trường Giltay khi thay Asparagine bằng Peptone và Citric acid bằng Acetate natri. 2.1.3.2. Hóa chất sử dụng Cồn 700 và cồn 960. Thuốc thử: Griess A, Griess B, Diphenylamine, Nessler. (Egorov NS, 1986) Các hóa chất dùng để định lượng nitrate, nitrite, amon. (Nguyễn Văn Phước, 2005) Bộ KIT Test đặc điểm sinh hóa API 20NE và các thuốc thử kèm theo. 2.2. Bố trí thí nghiệm: Các bước thí nghiệm được trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau: (Hình 2.1) 27
  38. Đồ án tốt nghiệp Chủng vi khuẩn phản nitrate A. xylosoxidans ( III - 8) Nhân giống Khảo sát sự thích ứng của chủng vi khuẩn phản nitrate Giữ giống A. xylosoxidans theo tỷ lệ phối trộn giữa nƣớc thải và môi trên môi trƣờng Giltay cải tiến trường (Xác định hàm lƣợng N-NO -, N-NO -, N-NH +) thạch 3 2 4 nghiêng Giltay nitrate Khảo sát mật độ thích hợp của chủng vi khuẩn phản hoặc nitrate A. xylosoxidans bổ sung vào nƣớc thải giàu nitrate Glycerol - - + (Xác định hàm lƣợng N-NO3 , N-NO2 , N-NH4 ) Khảo sát Khảo sát thời gian xử lý nitrate của chủng vi khuẩn phản đặc điểm nitrate A. xylosoxidans trong nƣớc thải giàu nitrate - - + sinh hóa (Xác định hàm lƣợng N-NO3 , N-NO2 , N-NH4 ) chủng vi khuẩn phản nitrate bằng bộ Chạy mô hình xử lý nƣớc thải quy mô phòng thí nghiệm - - + KIT API (Xác định hàm lƣợng N-NO3 , N-NO2 , N-NH4 ) 20NE Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm 28
  39. Đồ án tốt nghiệp 2.3. Nội dung nghiên cứu 2.3.1. Nhân giống chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans Chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC. Vì vậy, khi sử dụng cần hoạt hóa giống bằng cách cấy chuyền sang ống thạch nghiêng mới, đặt trong tủ ấm 30oC sau 24 – 48 giờ. Chủng sau khi phát triển tốt được cấy chuyền sang môi trường lỏng trong bình tam giác. Nuôi ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trong 12 – 24 giờ. 2.3.2. Giữ giống chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans Mục đích của việc cấy chuyền và giữ giống là để bảo quản giống, tránh hiện tượng thoái hóa giống. Chủng giống thuần khiết Achromobacter xylosoxidans được bảo quản trong ống thạch nghiêng môi trường Giltay giữ trong tủ lạnh 4oC, sau 1 – 2 tháng phải cấy chuyền bằng cách: dùng dây cấy vòng lấy sinh khối rồi cấy ria sang ống thạch nghiêng mới. Đem nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong vòng 24 – 48 giờ rồi đem bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC. Hoặc giữ giống trong eppendorf sau ly tâm dưới lớp glycerol. 2.3.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa bằng bộ KIT API 20 NE Tiến hành khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans bằng bộ KIT API 20 NE. 2.3.4. Khảo sát sự thích ứng của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans với tỷ lệ phối trộn giữa nước thải và môi trường Giltay cải tiến Tăng sinh chủng chọn lọc trong môi trường Giltay nitrate lỏng, lắc trên máy lắc 150 vòng/phút, trong thời gian 24 giờ. Xác định sinh khối dịch tăng sinh bằng cách đo OD 600 nm. Sử dụng dịch tăng sinh để tiến hành cấy giống. Thể tích môi trường 90 ml, tỷ lệ cấy giống 10%. Nước thải phải được để lắng để loại bỏ những chất cặn lơ lửng, bổ 29
  40. Đồ án tốt nghiệp sung hàm lượng carbon và nitơ theo tỷ lệ C/N = 12. Tiến hành xác định hàm lượng ban - - + đầu của N-NO3 , N-NO2 , N-NH4 có trong nước thải. Tỷ lệ nước thải và môi trường tối ưu lần lượt được bố trí là 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1, 10:0. Thí nghiệm được thực hiện ở điều kiện thiếu khí, không bổ sung giá thể. - - + Nồng độ N-NO3 , N-NO2 , N-NH4 và sinh khối vi khuẩn được xác định tại các thời điểm: 0 giờ và 48 giờ. Tốc độ chuyển hóa nitrơ trung bình do quá trình phản nitrate được tính theo công thức (2.1) (Nguyễn Hoài Hương và cộng sự, 2013): - - + - - Vtrung bình = [(NO3 đầu + NO2 đầu + NH4 đầu) – (NO3 cuối + NO2 cuối + + NH4 cuối)] / T (2.1) - - + Trong đó, N-NO3 cuối, N-NO2 cuối, + N-NH4 cuối lần lượt là các nồng độ N - trong nitrate, nitrite, amoni đầu ra (môi trường sau khi nuôi cấy vi khuẩn) và N-NO3 - + đầu, N-NO2 đầu, N-NH4 đầu lần lượt là nồng độ N trong nitrate, nitrite, amoni đầu vào. KgN m-3, T = thời gian chuyển hóa, giờ. 2.3.5. Khảo sát mật độ vi khuẩn thích hợp bổ sung vào nước thải giàu nitrate Tăng sinh vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong môi trường lỏng có tỷ lệ phối trộn giữa nước thải và môi trường Giltay cải tiến tốt nhất, lắc 150 vòng/phút, trong thời gian 24 giờ. Xác định sinh khối dịch tăng sinh bằng cách đo OD 600 nm. Pha loãng dịch tăng sinh về nồng độ 105 ,106, 107, 108 cfu/ml. Thí nghiệm ở điều kiện thiếu khí được thực hiện theo mô hình thiếu khí có bổ sung 5 g giá thể. Cấy giống từ các bình mật độ giống trên vào nước thải giàu nitrate để đạt nồng độ vi khuẩn ban đầu là 105, 106, 107, 108 cfu/ml. Thể tích môi trường 90 ml tỷ lệ cấy giống 10%. Nước thải phải được để lắng để loại bỏ những chất cặn lơ lửng, bổ sung hàm lượng carbon và nitơ theo tỷ lệ C/N = 12. Tiến hành xác định hàm lượng ban - - + đầu của N-NO3 , N-NO2 , N-NH4 có trong nước thải. - - Sinh khối tự do được đánh giá qua đo OD 600 nm. Nồng độ N-NO3 , N-NO2 , + N-NH4 được xác định tại các thời điểm: 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. 30
  41. Đồ án tốt nghiệp Mẫu đối chứng không tiến hành cấy giống, chỉ có môi trường nước thải, cũng - - + tiến hành định lượng các nồng độ N-NO3 , N-NO2 , N-NH4 tại các thời điểm: 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình do quá trình phản nitrate được tính theo công thức (2.1). Hiệu quả phản nitrate được đánh giá dựa trên khả năng khử nitrate mà không + tích lũy nitrite và không sinh ra NH4 và được tính toán theo công thức (2.2) (Nguyễn Hoài Hương và cộng sự, 2013): - - + - - H%= [1 -(N-NO3 cuối+ N-NO2 cuối+ N-NH4 cuối)/(N-NO3 đầu+N-NO2 đầu + +N-NH4 đầu)]*100 (2.2) - - + Trong đó, N-NO3 cuối, N-NO2 cuối, N-NH4 cuối lần lượt là các nồng độ N - trong nitrate, nitrite, amoni đầu ra (môi trường sau khi nuôi cấy vi khuẩn) và N-NO3 - + đầu, N-NO2 đầu, N-NH4 đầu lần lượt là nồng độ N trong nitrate, nitrite, amoni đầu vào. 2.3.6. Khảo sát thời gian xử lý nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong nước thải giàu nitrate Vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans được tăng sinh trong môi trường lỏng có tỷ lệ phối trộn giữa nước thải và môi trường Giltay cải tiến tốt nhất, lắc trên máy lắc 150 vòng/phút, trong thời gian 24h. Xác định sinh khối dịch tăng sinh bằng cách đo OD 600 nm. Sử dụng dịch tăng sinh cấy vào môi trường nước thải. Thể tích môi trường 90 ml, tỉ lệ cấy giống 10%. Nước thải phải được để lắng để loại bỏ những chất cặn lơ lửng, bổ sung hàm lượng carbon và nitơ theo tỷ lệ C/N = 12. Tiến hành xác định hàm - - + lượng ban đầu của N-NO3 , N-NO2 , N-NH4 có trong nước thải. Thí nghiệm được thực hiện theo mô hình thiếu khí có bổ sung 5 g giá thể. Nồng - - + độ N-NO3 , N-NO2 , N-NH4 được xác định tại các thời điểm: 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. 31
  42. Đồ án tốt nghiệp Mẫu đối chứng không tiến hành cấy giống, chỉ có nước thải, tiến hành định - - + lượng các nồng độ N-NO3 , N-NO2 , N-NH4 tại các thời điểm: 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình do quá trình phản nitrate được tính theo công thức (2.1). Hiệu quả phản nitrate được đánh giá dựa trên khả năng khử nitrate, không tích + lũy nitrite, không sinh ra NH4 và được tính toán theo công thức (2.2). 2.3.7. Tiến hành thực hiện mô hình bioreactor quy mô phòng thí nghiệm Để ứng dụng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans vào thí nghiệm xử lý phản nitrate cần xây dựng mô hình bioreactor thích hợp. Mô hình chọn dựa trên giá thể bám dính theo kiểu MBBR, các thông số được xây dựng được trình bày trên bảng 2.1. Bảng 2.1. Các thông số mô hình bioreactor xây dựng từ thí nghiệm Thông số bình thí Mô hình STT Tên thông số nghiệm nhỏ bioreactor 1 Chiều cao, cm 6,5 H 2 Đường kính, cm 4,0 D 3 3 Thể tích, cm (ml) 100 V 4 Giá thể Nhựa plastic từ ống Nhựa plastic từ ống hút hút 5 Thể tích hình học, ml 0,42 6 Chiều cao giá thể, cm 1,5 1,5 7 Đường kính giá thể, cm 0,6 0,6 8 Khối lượng giá thể, g 0,0294 0,0294 9 Khối lượng giá thể / bình, g 5 M Bề mặt bám dính giá thể 10 m2/kg 19,23 19,23 m2/m3 1177 1177 (Huỳnh Văn Thành, 2013) 32
  43. Đồ án tốt nghiệp Chọn bình hình trụ, có van lấy mẫu, có kích thước như sau làm mô hình bioreactor (Hình 2.2): - H = 30,7 cm - D = 15,5 cm - V = 5793 cm3 = 5,79 L - Cần tính lượng giá thể - Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường có tỷ lệ phối trộn giữa nước thải và môi trường Giltay cải tiến tốt nhất. Tỷ lệ cấy giống 10%, xác định - - + hàm lượng N-NO3 , N-NO2 , NH4 tại các thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. - Mẫu đối chứng không tiến hành cấy giống, chỉ có môi trường nước thải, - - + cũng tiến hành định lượng các nồng độ N-NO3 , N-NO2 , N-NH4 tại các thời điểm: 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. - Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình do quá trình phản nitrate được tính theo công thức (2.1). - Hiệu quả phản nitrate được đánh giá dựa trên khả năng khử nitrate mà + không tích lũy nitrite và không sinh ra NH4 và được tính toán theo công thức (2.2). 33
  44. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2. Mô hình bioreactor có giá thể bám dính 2.4. Phƣơng pháp phân tích 2.4.1. Phương pháp dựng đường chuẩn 2.4.1.1. Phương pháp dựng đường chuẩn nitrate Sử dụng dung dịch Nitrate chuẩn để tiến hành dựng đường chuẩn. Dung dịch Nitrate chuẩn (100 µg/ml) : hòa tan 0,163 g KNO3 khan (hoặc 0,137 g NaNO3 khan) trong nước cất và định mức đến 1 lít. 34
  45. Đồ án tốt nghiệp Cho dung dịch Nitrate chuẩn theo từng thể tích khác nhau vào các cốc 100 ml và cô cạn. Cô cạn đến khi vừa khô nhưng không được cháy vì phản ứng tạo thành nitrophenoldisulfonic acid chỉ xảy ra với muối nitrate ở thể rắn. Khi mẫu đã cô cạn và nguội thì cho vào 1 ml dung dịch PDA (phenol disulfonic acid) và lắc đều cho tan mẫu. Cho thêm 25 ml nước cất và lắc đều. Trung hòa acid dư bằng NaOH 10% đến pH trung tính (thử bằng giấy đo pH) cho đến khi dung dịch chuyển sang màu vàng thì dừng lại. Chuyển dung dịch màu vàng sang bình định mức 100 ml, định mức tới vạch và tiến hành đo độ hấp thu của phức tạo thành ớ bước sóng 410 nm trên máy đo quang. Ghi nhận lại độ hấp thu của mẫu. Khi đo độ hấp thu của mẫu, nhất thiết phải tính đến độ hấp thu của mẫu trắng chính là mẫu có chứa đủ các hóa chất và thao tác tương tự như mẫu thử, nhưng thay mẫu thử bằng nước cất. Bảng 2.2. Trình tự tiến hành dựng đường chuẩn nitrate Các bình định mức số Hóa chất 0 1 2 3 4 5 Thể tích dung dịch Nitrate chuẩn (ml) 0 5 10 15 20 25 Cô cạn mẫu đến khi khô, để nguội Thể tích dung dịch PDA (ml) 1 1 1 1 1 1 Thể tích nước cất (ml) 25 25 25 25 25 25 Trung hòa acid dư bằng NaOH 10% đến pH trung tính Chuyển vào bình định mức 100 ml – định mức tới vạch Đo độ hấp thu các mẫu chuẩn ở bước sóng 410 nm Độ hấp thu Từ các số liệu đo được, tiến hành lập đường chuẩn, xác định các hệ số của phương trình hồi quy tuyến tính = + (yêu cầu đường chuẩn phải có hệ số tương 35
  46. Đồ án tốt nghiệp quan R ≥ 0,99 mới là đạt yêu cầu) từ đó tính kết quả của mẫu đo từ phương trình hồi quy tuyến tính đạt yêu cầu. Nếu trị số độ hấp thu của mẫu vượt quá các trị số đo độ hấp thu trong dung dịch chuẩn, cần pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp. 2.4.1.2. Phương pháp dựng đường chuẩn nitrite Sử dụng dung dịch N-NO2 chuẩn để dựng đường chuẩn. Dung dịch N-NO2 chuẩn được pha loãng từ dung dịch N-NO2 lưu trữ. Dung dịch N-NO2 lưu trữ (1 ml = 250 µg N-NO2): hòa tan 1,232 g NaNO2 trong nước cất và định mức đến 1 lít. Dung dịch N-NO2 chuẩn được pha loãng từ dung dịch N-NO2 lưu trữ, sử dụng 2 ml dung dịch N-NO2 lưu trữ rồi thêm nước cất cho đến 1 lít. Cho dung dịch chuẩn N-NO2 theo từng thể tích khác nhau và bổ sung lượng nước cất cho đủ 25 ml vào các cốc 100 ml. Thêm vào mỗi cốc 0,5 ml dung dịch EDTA và 0,5 ml dung dịch acid sulfanilic. Sau đó đợi khoảng 10 phút rồi cho vào mỗi cốc 0,5 ml dung dịch naphthylamine và 0,5 ml đệm acetate. Đợi khoảng 20 phút rồi tiến hành đo độ hấp thu của mẫu ở bước sóng 520 nm. Khi đo độ hấp thu của mẫu, nhất thiết phải tính đến độ hấp thu của mẫu trắng chính là mẫu có chứa đủ các hóa chất và thao tác tương tự như mẫu thử, nhưng thay mẫu thử bằng nước cất. 36
  47. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.3. Tiến trình dựng đường chuẩn nitrite Các cốc mẫu Hóa chất 0 1 2 3 4 5 Thể tích dung dịch N-NO2 chuẩn, ml 0 2,5 5 7,5 10 12,5 Thể tích nước cất, ml 25 22,5 20 17,5 15 12,5 Thể tích dung dịch EDTA, ml 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Thể tích dung dịch acid sulfanilic, ml 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Đợi 10 phút Thể tích dung dịch naphthylamine 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Thể tích dung dịch đệm acetate 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Đợi 20 phút Đo độ hấp thu Từ các số liệu đo được, tiến hành lập đường chuẩn, xác định các hệ số của phương trình hồi quy tuyến tính = + (yêu cầu đường chuẩn phải có hệ số tương quan R ≥ 0,99 mới là đạt yêu cầu) từ đó tính kết quả của mẫu đo từ phương trình hồi quy tuyến tính đạt yêu cầu. Nếu trị số độ hấp thu của mẫu vượt quá các trị số đo độ hấp thu trong dung dịch chuẩn, cần pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp. 2.4.1.3. Phương pháp dựng đường chuẩn amoni Sử dụng dung dịch N-NH3 chuẩn để dựng đường chuẩn. Dung dịch N-NH3 chuẩn được pha loãng từ dung dịch N-NH3 lưu trữ. Dung dịch lưu trữ N-NH3 (1 ml = 1 mg = 1000 µg N-NH3). Hòa tan 3,819 g NH4Cl trong nước cất và định mức lên đến 1 lít. Dung dịch chuẩn N-NH3 (1 ml = 10 µg N-NH3). Dung dịch chuẩn được pha loãng từ dung dịch lưu trữ, lấy 10 ml dung dịch lưu trữ pha loãng với nước cất và định mức đến 1 lít. 37
  48. Đồ án tốt nghiệp Cho dung dịch chuẩn vào bình tam giác 100 ml theo từng thể tích khác nhau và bổ sung nước cất cho đủ 50 ml. Sao đó cho vào mỗi bình 2 ml dung dịch thuốc thử Nessler, sau đó đợi khoảng 10 phút rồi đo độ hấp thu của mẫu ở bước sóng 430 nm. Khi đo độ hấp thu của mẫu, nhất thiết phải tính đến độ hấp thu của mẫu trắng chính là mẫu có chứa đủ các hóa chất và thao tác tương tự như mẫu thử, nhưng thay mẫu thử bằng nước cất. Bảng 2.4. Tiến trình dựng đường chuẩn amoni Các bình mẫu Hóa chất 0 1 2 3 4 5 Thể tích dung dịch N-NH3 chuẩn, ml 0 1 2 3 4 5 Thể tích nước cất, ml 50 49 48 47 46 45 Thể tích dung dịch nessler, ml 2 2 2 2 2 2 Độ hấp thu Từ các số liệu đo được, tiến hành lập đường chuẩn, xác định các hệ số của phương trình hồi quy tuyến tính = + (yêu cầu đường chuẩn phải có hệ số tương quan R ≥ 0,99 mới là đạt yêu cầu) từ đó tính kết quả của mẫu đo từ phương trình hồi quy tuyến tính đạt yêu cầu. Nếu trị số độ hấp thu của mẫu vượt quá các trị số đo độ hấp thu trong dung dịch chuẩn, cần pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp. - - + 2.4.2. Phương pháp định lượng N-NO3 , N-NO2 , N-NH4 - 2.4.2.1. Phương pháp định lượng N-NO3 (Nguyễn Văn Phước, 2005) Từ một bình mẫu nuôi cấy, lắc đều và dùng pipet vô trùng hút ra 1ml mẫu cho vào cốc thủy tinh, thêm vào 9 ml nước cất và 1 ml dung dịch urea – acetic rồi đem cô cạn trên bếp điện. Đợi cho mẫu thật nguội thì cho 1 ml dung dịch PDA (phenol disulfonic acid) vào cốc mẫu, lắc cho mẫu tan đều vào acid. Đợi 10 phút rồi thêm 25 ml nước cất vào cốc và lắc đều, sau đó trung hòa acid dư trong mẫu bằng NaOH 10% 38
  49. Đồ án tốt nghiệp (cho đến khi pH trung tính và dung dịch trong cốc chuyển sang màu vàng là được), chuyển dung dich màu vàng vào bình định mức 100 ml và định mức đến vạch. Xác định hàm lượng nitrate trong mẫu bằng máy so màu spectrophotometer ở bước sóng 410 nm. Tính toán kết quả theo phương trình tuyến tính = + . Từ trị số độ hấp thu (OD) của mẫu, ta tính được hàm lượng nitrate trong mẫu. - 2.4.2.2. Phương pháp định lượng N-NO2 (Nguyễn Văn Phước, 2005) Xác định hàm lượng nitrite trong mẫu bằng phương pháp so màu, với sự bắt màu của nitrite trong mẫu với dung dich acid sulfanilic và dung dịch napthylamine. Sử dụng máy so màu spectrophotometer ở bước sóng 520 nm. Từ bình nuôi cấy, lắc đều và dùng micro pipet và đầu tuýp vô trùng để hút 10 µl mẫu cho vào cốc 100 ml, thêm 25 ml nước cất vào cốc chứa mẫu. Sau đó thêm vào cốc 0,5 ml dung dịch acid sulfanilic và 0,5 ml dung dịch EDTA, đợi 10 phút rồi thêm tiếp 0,5 ml napthylamine và 0,5 ml đệm acetate vào cốc chứ mẫu, đợi 20 phút, lắc mẫu thật đều và tiến hành đo độ hấp thu của mẫu ở bước sóng 520 nm. Tính hàm lượng nitrite trong mẫu theo phương trình tuyến tính = + . Dựa vào trị số hấp thu của mẫu, ta tính toán hàm lượng nitrite trong dung dịch. + 2.4.2.3. Phương pháp định lượng N-NH4 (Nguyễn Văn Phước, 2005) Từ bình mẫu nuôi cấy, lắc đều, dùng pipet vô trùng hút 3ml mẫu cho vào cốc thủy tinh và thêm 297 ml nước cất vào để pha loãng mẫu, từ mẫu pha loãng 100 lần ấy ta khuấy đều và hút ra 3 bình tam giác, mỗi bình 50 ml mẫu đã được pha loãng và tiến hành thêm lần lượt các hóa chất như sau: thêm 0,5 ml dung dịch ZnSO4 và 0,25 ml dung dịch NaOH 6N và 50 ml mẫu, đợi cho mẫu kết tủa và lọc mẫu bằng giấy lọc. Mẫu sau khi lọc thêm vào 1 ml dung dịch Na2S2O3 N/70, 1 giọt dung dịch EDTA và 2 ml dung dịch thuốc thử Nessler, đợi 10 phút rồi đem đo độ hấp thu ở bước sóng 430 nm. Tính hàm lượng amoni trong mẫu theo phương trình tuyến tính = + . 39
  50. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào trị số hấp thu của mẫu, ta tính toán hàm lượng amoni trong dung dịch mẫu nuôi cấy. 2.4.3. Phương pháp khảo sát các đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Achromobacter xyosoxidans bằng bộ KIT API 20 NE Tiến hành định danh chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans bằng bộ KIT API 20 NE. 2.4.3.1. Chuẩn bị: Tăng sinh chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong môi trường Giltay lỏng, lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ. Cấy trang vi sinh vật lên môi trường Giltay agar, ở các nồng độ 10-3, 10-4, 10-5. Mỗi nồng độ cấy trang trên 3 đĩa. Chuẩn bị nước cất vô trùng. Dầu khoáng (parafirm oil): sấy ở nhiệt độ 1500C trong khoảng 1 giờ. Chuẩn bị nước muối sinh lý 0.85%. Chuẩn bị Mc Farland để so sánh. Ở đây sử dụng Mc Farland ở mức 0.5 để so sánh. Các mức Mc Farland thể hiện ở bảng 2.6 và hình 2.4. Bảng 2.5. Các mức Mc Farland 0.5 1 2 3 4 1% BaCl2 0.05 ml 0.1 ml 0.2 ml 0.3 ml 0.4 ml 1% H2SO4 9.95 ml 9.9 ml 9.8 ml 9.7 ml 9.6 ml 40
  51. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3. Các mức Mc Farland Hình 2.4. Bộ KIT API 20 NE và thuốc thử 2.4.3.2. Phương pháp: Nhỏ nước cất vô trùng vào khay. Lấy khuẩn lạc từ đĩa cấy trang trên môi trường Giltay cho vào nước muối sinh lý để tạo huyền phù. So sánh độ đục tương đương với Mc Farland mức 0.5 41
  52. Đồ án tốt nghiệp A.xylosoxidans Mc Farland 0.5 Hình 2.5. So sánh độ đục của chủng vi khuẩn A.xylosoxidans trong nước muối sinh lý với mức Mc Farland 0.5 Lấy khoảng 200휇푙 huyền phù cho vào API AUX MEDIUM. Sau đó mới bơm vào kit. Hình 2.6. API AUX MEDIUM sau khi cho 200µl huyền phù vào 42
  53. Đồ án tốt nghiệp Các test NO3, TRP, GLU, ADH, URE, ESC, GEL, PNPG chỉ bơm dịch vào tube, không bơm vào cupule. Các test từ GLU đến PAC thì bơm dịch vào cả tube và cupule. Chú ý là mực nước phải phẳng hoặc hơi lồi lên. Cupule không quá ít cũng không quá nhiều. Bổ sung dầu khoáng vào cupule của GLU, ADH, URE Đóng nắp khay lại, ủ ở nhiệt độ 290C trong khoảng 24 giờ và 48 giờ, sau đó tiến hành đọc kết quả. Hình 2.7. Bộ KIT API 20 NE sau khi được bơm dịch 2.4.3.3. Cách đọc kết quả  Sau 24 giờ: Đọc kết quả của NO3, TRP và GLU trước. GLU: không cần sử dụng thuốc thử. - Xanh dương chuyển sang xanh lá là phản ứng âm tính (-). - Vàng là phản ứng dương tính (+). NO3: - Nhỏ 1 giọt NIT 1 và 1 giọt NIT 2 vào cupule, sau 5 phút nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính. - Nếu âm tính, cho thêm 2 – 3 mg bột Zn vào cupule. Sau 5 phút, nếu cupule không màu rồi chuyển sang hồng đỏ thì phản ứng âm tính (-). 43
  54. Đồ án tốt nghiệp TRP: - Nhỏ 1 giọt JAMES vào cupule, xuất hiện màu hồng trong cupule là phản ứng dương tính (+). - Không màu hoặc vàng nhạt là phản ứng âm tính (-).  Sau 48 giờ: Đọc các kết quả còn lại. Assimilation: quan sát sự phát triển của vi khuẩn, cupule bị đục là phản ứng dương tính. Cupule trong suốt là phản ứng âm tính ADH: - Vàng là phản ứng âm tính (-). - Cam/hồng/đỏ là phản ứng dương tính (+). URE: - Vàng là phản ứng âm tính (-). - Hồng/đỏ là phản ứng dương tính (+). ESC: - Vàng là phản ứng âm tính (-). - Xám/nâu/đen là phản ứng dương tính (+). GEL: - Không có sự khuếch tán sắc tố đen là phản ứng âm tính (-). - Có sự khuếch tán sắc tố đen là phản ứng dương tính (+). PNPG: - Không màu là phản ứng âm tính(-). - Vàng là phản ứng dương tính (+). Từ GLU đến PAC: - Trong suốt, không màu là phản ứng âm tính (-). - Đục, mờ là phản ứng dương tính (+).  Ghi nhận kết quả và so sánh kết quả với hình mẫu của bộ KIT (Hình 2.8). 44
  55. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.8. Mẫu so sánh kết quả của bộ KIT API 20 NE (Nguồn: Api Web) 45
  56. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans bằng bộ KIT API 20 NE Kết quả khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans bằng bộ KIT API 20 NE:  Sau 24 giờ, đọc kết quả của NO3, TRP và GLU (Hình 3.1). NO3: - Trước khi nhỏ thuốc thử: không màu, có bọt khí. - Khi nhỏ NIT 1 và NIT 2 vào, thì không chuyển sang màu hồng. Sau đó cho kẽm vào, xuất hiện bọt khí quanh kẽm và không đổi màu.(+) TRP: - Nhỏ thuốc thử JAMES vào, có màu vàng nhạt. (-) - GLU: có màu xanh lá cây. (-). Hình 3.1. Kết quả của bộ KIT sau 24 giờ  Sau 48 giờ, đọc các kết quả còn lại (Hình 3.2). - ADH: Vàng (-). - URE: Cam (-). - ESC: Nâu (+). - GEL: Không khuếch tán sắc tố đen (-). - PNPG: Trắng (-). 46
  57. Đồ án tốt nghiệp - GLU, GNT, CAP, ADI, MLT, CIT, PAC: Đục (+). - ARA, MNE, MAN, NAG, MAL: Trong (-). Hình 3.2. Kết quả của bộ KIT sau 48 giờ Kết quả của các thử nghiệm đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans bằng bộ KIT API 20 NE được thể hiện trong bảng 3.1. 47
  58. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Kết quả các thử nghiệm sinh hóa của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans bằng bộ KIT API 20 NE STT Thử nghiệm Kết quả 1 NO3 (+) 2 TRP (-) 3 GLU (-) 4 ADH (-) 5 URE (-) 6 ESC (+) 7 GEL (-) 8 PNG (-) 9 GLU (+) 10 ARA (-) 11 MNE (-) 12 MAN (-) 13 NAG (-) 14 MAL (-) 15 GNT (+) 16 CAP (+) 17 ADI (+) 18 MLT (+) 19 CIT (+) 20 PAC (+) So sánh kết quả ghi nhận được với kết quả của bộ KIT API 20 NE trên hệ thống so sánh API WEB cho thấy chủng vi khuẩn trên có kết quả trùng lắp 94,5 % (số kiểu sinh học 1440477) với chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans. Kết quả được thể 48
  59. Đồ án tốt nghiệp hiện trên hình 3.3. Kết quả này phù hợp với kết quả định danh bằng giải mã trình tự gene rRNA 16S (Lê Trần Ánh Tuyết, 2013). Hình 3.3. Kết quả so sánh trên API WEB 3.2. Kết quả dựng đƣờng chuẩn 3.2.1. Kết quả dựng đường chuẩn nitrate Đo độ hấp thụ quang của 6 mẫu dung dịch chuẩn ở bước sóng 410 nm. (Bảng 3.2). - Biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang với nồng độ N-NO3 bằng đồ thị. (Hình 3.3). Bảng 3.2. Độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn - Dung dịch chuẩn N-NO3 (mg/ml) Độ hấp thụ quang 1 0 0 2 0,5 0,196 3 1 0,403 4 1,5 0,599 5 2 0,852 6 2,5 1,021 49
  60. Đồ án tốt nghiệp Sau khi đo được độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn, tiến hành xây dựng đường chuẩn và tìm ra phương trình hồi quy tương quan. 1.2 y = 0.415x - 0.007 1 R² = 0.998 0.8 0.6 0.4 OD 410 410 nm OD 0.2 0 0 1 2 3 - N-NO3 , mg/ml Hình 3.4. Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn nitrate Sau khi thiết lập đường chuẩn ta được phương trình y = 0,415x – 0,007 với y là độ hấp thụ quang, x là nồng độ. 3.2.2. Kết quả phương trình đường chuẩn nitrite Đo độ hấp thụ quang của 6 mẫu dung dịch chuẩn ở bước sóng 520 nm. (Bảng 3.3). - Biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang với nồng độ N-NO2 bằng đồ thị. (Hình 3.4). 50
  61. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3. Độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn - Dung dịch chuẩn N-NO2 (mg/ml) Độ hấp thụ quang 1 0 0 2 0,05 0,136 3 0,1 0,266 4 0,15 0,381 5 0,20 0,515 6 0,25 0,639 Sau khi đo được độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn, tiến hành xây dựng đường chuẩn và tìm ra phương trình hồi quy tương quan. 0.7 y = 2.541x + 0.005 0.6 R² = 0.999 0.5 0.4 0.3 OD 520 520 nm OD 0.2 0.1 0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 - N-NO2 , mg/ml Hình 3.5. Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn nitrite Sau khi thiết lập đường chuẩn ta được phương trình 2,541x + 0,005 với y là độ hấp thụ quang, x là nồng độ. 51
  62. Đồ án tốt nghiệp 3.2.3. Kết quả phương trình đường chuẩn amoni Đo độ hấp thụ quang của 6 mẫu dung dịch chuẩn ở bước sóng 430 nm. (Bảng 3.4). + Biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang với nồng độ N-NH4 bằng đồ thị. (Hình 3.5). Bảng 3.4. Độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn + Dung dịch chuẩn N-NH4 (mg/ml) Độ hấp thụ quang 1 0 0 2 0,2 0,026 3 0,4 0,052 4 0,6 0,085 5 0,8 0,114 6 1 0,143 Sau khi đo được độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn, tiến hành xây dựng đường chuẩn và tìm ra phương trình hồi quy tương quan. 52
  63. Đồ án tốt nghiệp 0.16 y = 0.144x - 0.002 0.14 R² = 0.998 0.12 0.1 0.08 0.06 OD 430 430 nm OD 0.04 0.02 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 + NH4 , mg/ml Hình 3.6. Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn amoni Sau khi thiết lập đường chuẩn ta được phương trình y = 0,144x – 0,002 với y là độ hấp thụ quang, x là nồng độ. 3.3. Sự thích ứng của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans với tỷ lệ phối trộn giữa nƣớc thải và môi trƣờng Giltay cải tiến Thí nghiệm này được thực hiện nhằm mục đích tìm ra được tỷ lệ phối trộn phù hợp, giúp cho quá trình thích nghi và tăng sinh khối của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có hiệu quả tốt nhất. Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện thiếu khí với các tỷ lệ phối trộn giữa nước thải và môi trường Giltay cải tiến như sau 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1, 10:0. Khảo sát khả năng thích ứng của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans theo thời gian dựa vào lượng sinh khối tự do được đo ở bước sóng 600 nm trong từng thời điểm 0 giờ và 48 giờ của từng tỷ lệ phối trộn. Kết quả thí nghiệm trình bày trên hình 3.7. 53
  64. Đồ án tốt nghiệp Mật độ vi khuẩn 8.600 8.500 8.400 8.300 8.200 0h 8.100 48h Log (OD 600 nm) 600 nm) (OD Log 8.000 7.900 5 : 5 6 : 4 7 : 3 8 : 2 9 : 1 10 : 0 Tỷ lệ nƣớc thải : môi trƣờng, ml Hình 3.7. Mật độ vi khuẩn Kết quả hình 3.7 thể hiện sinh khối của vi khuẩn trong các tỷ lệ phối trộn. Ở tỷ lệ phối trộn 5:5 vi khuẩn tăng trưởng tốt nhất, thể hiện qua lượng sinh khối tạo ra sau 48 giờ cao nhất so với các tỷ lệ phối trộn còn lại. Tại thời điểm 0 giờ, mật độ quang của vi khuẩn ở tỷ lệ 5:5 là 8,152; sau 48 giờ đã tăng lên đến 8,511. Khả năng chuyển hóa nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosixidans được đánh giá qua tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình của vi khuẩn trong từng tỷ lệ phối trộn. Kết quả được thể hiện trên hình 3.8. 54
  65. Đồ án tốt nghiệp Tốc độ chuyển hóa 1.400 1.316 1.200 0.956 1.000 / giờ giờ / 0.800 3 0.607 0.593 0.600 / m g 0.400 0.312 0.200 0.047 0.000 5 : 5 6 : 4 7 : 3 8 : 2 9 : 1 10 : 0 Tỷ lệ nƣớc thải : môi trƣờng Hình 3.8. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình Kết quả hình 3.8 thể hiện tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans ở từng tỷ lệ phối trộn khác nhau. Tốc độ chuyển hóa giảm dần từ tỷ lệ 5:5 đến tỷ lệ 10:0. Tốc độ chuyển hóa ở tỷ lệ 5:5 đạt 1,316 g/m3/giờ cao nhất trong các tỷ lệ phối trộn, điều này chứng tỏ khả năng chuyển hóa nitơ của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans mạnh nhất ở tỷ lệ phối trộn 5:5 giữa nước thải và môi trường Giltay cải tiến. Từ những kết quả trên cho thấy, tỷ lệ phối trộn 5:5 giữa nước thải và môi trường Giltay cải tiến thì vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans tăng trưởng tốt nhất và thể hiện khả năng chuyển hóa nitơ tốt nhất so với các tỷ lệ phối trộn khác. 55
  66. Đồ án tốt nghiệp 3.4. Mật độ vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans thích hợp bổ sung vào nƣớc thải giàu nitrate Để tăng cường sinh học luôn phải kiểm soát mật độ vi khuẩn khi bổ sung sinh khối vào môi trường, nhất là trong điều kiện thiếu khí khả năng tăng trưởng của vi khuẩn hạn chế. Tuy nhiên nếu mật độ vi khuẩn quá cao sẽ dẫn đến giá thành xử lý cao. Thí nghiệm này được thực hiện trong điều kiện thiếu khí có bổ sung giá thể với mật độ vi khuẩn khảo sát là 108, 107, 106 và 105 cfu/ml. Đánh giá khả năng phản nitrate của vi - - khuẩn Achromobacter xylosoxidans theo thời gian dựa vào hàm lượng N-NO3 , N-NO2 + , N-NH4 được xác định trong từng thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ của từng mật độ vi khuẩn. Kết quả thí nghiệm trình bày trên hình 3.9. 250 40 35 200 30 150 10^4 25 10^4 , mg/L mg/L , mg/L , - - 2 3 10^5 20 10^5 100 15 NO NO - - 10^6 10 10^6 N N 50 5 0 10^7 0 10^7 0h 12h 24h 36h 48h 10^8 0h 12h 24h 36h 48h 10^8 Thời gian, giờ Thời gian, giờ (a) (b) 56
  67. Đồ án tốt nghiệp 200 100% 150 80% 10^4 10^4 60% , mg/L mg/L , 100 + 10^5 4 40% 10^5 NH 50 10^6 20% 10^6 0 10^7 %lý,xử quả Hiệu 0% 10^7 0h 12h 24h 36h 48h 10^8 0h 12h 24h 36h 48h 10^8 Thời gian, giờ Thời gian, giờ (c) (d) Hình 3.9. Động học phản nitrate và hiệu quả xử lý của vi khuẩn Achromobacter - - xylosoxidans theo mật độ. (a) Biến đổi N-NO3 , (b) Biến đổi N-NO2 , (c) Biến đổi N- + NH4 , (d) Hiệu quả xử lý. Tốc độ chuyển hóa 6.000 5.493 5.000 4.000 / giờ giờ / 2.925 3 3.000 2.583 2.283 2.058 / m g 2.000 1.000 0.000 10^4 10^5 10^6 10^7 10^8 Mật độ vi khuẩn Hình 3.10. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình Theo kết quả hình 3.9 (a) có sự khác biệt về sự chuyển hóa nitrate ở các mật độ vi khuẩn khác nhau được bổ sung vào nước thải (Bảng phụ lục B). Sự chuyển hóa 8 - nitrate thể hiện rõ ràng nhất ở mật độ 10 , từ hàm lượng N-NO3 là 166,63 mg/L ở 0 giờ đã giảm còn 51,81 mg/L ở 36 giờ và chỉ còn lại 1,69 mg/L sau 48 giờ. Ở các mật 57
  68. Đồ án tốt nghiệp độ còn lại thì sự chuyển hóa nitrate diễn ra chậm hơn so với mật độ 108, điển hình ở 7 - mật độ 10 thì hàm lượng N-NO3 từ 173,61 mg/L lúc 0 giờ giảm còn 148,67 mg/L sau - 8 48 giờ xử lý vẫn cao hơn hàm lượng N-NO3 của mật độ 10 ở khoảng thời gian tương đương. Kết quả hình 3.9 (b), (c) cho thấy ở các mật độ vi khuẩn nhau thì sự tích lũy N- - + 8 - NO2 và sinh N-NH4 cũng khác nhau. Ở mật độ 10 sự chuyển hóa hàm lượng N-NO2 - hiệu quả nhất, cụ thể hàm lượng N-NO2 từ 6,72 mg/L ở lúc 0 giờ đã giảm còn 4,536 mg/L ở lúc 24 giờ và hết hoàn toàn sau 36 giờ xử lý. Trong khi đó ở các mật độ khác 4 5 6 7 - 10 , 10 , 10 , 10 đến 48 giờ hàm lượng N-NO2 vẫn còn lại lần lượt là 3,070 mg/L; 6,513 mg/L; 0,925 mg/L; 18,142 mg/L. Sự chuyển hóa amoni ổn định nhất ở mật độ 9 + 10 , hàm lượng N-NH4 từ 92,756 mg/L lúc 0 giờ giảm còn 39,753 mg/L ở lúc 24 giờ và chỉ còn lại 0,747 mg/L sau 48 giờ xử lý. Trong khi đó ở các mật độ khác 104, 105, 6 7 - 10 , 10 đến 48 giờ hàm lượng N-NO2 vẫn còn lại lần lượt là 28,741 mg/L; 16,797 mg/L; 2,986 mg/L; 0,747 mg/L. Kết quả hình 3.9 (d) cho thấy hiệu quả xử lý ở các mật độ vi khuẩn, trong đó mật độ 108 đạt hiệu quả xử lý 99% sau 48 giờ xử lý, cao nhất trong các mật độ vi khuẩn. Hình 3.10 thể hiện tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình của các mật độ vi khuẩn, trong đó mật độ 108 có tốc độ chuyển hóa đạt 5,493 g/m3/giờ cao nhất so với các mật độ khác, phù hợp với các thông số của các nghiên cứu khác (Huỳnh Văn Thành, 2013). Kết luận của thí nghiệm này là qua khảo sát ở các mật độ vi khuẩn thì mật độ vi khuẩn 108 có khả năng chuyển hóa nitrate tốt nhất so với các mật độ còn lại, đồng thời đạt hiệu quả xử lý và tốc độ chuyển hóa cao nhất trong các mật độ khảo sát. 3.5. Thời gian xử lý nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong nƣớc thải giàu nitrate Thí nghiệm được thực hiện nhằm mục đích nghiên cứu thời gian xử lý hoàn toàn lượng nitrate của chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans trong môi nước thải giàu nitrate có bổ sung giá thể. Đánh giá khả năng phản nitrate của vi khuẩn 58
  69. Đồ án tốt nghiệp - - Achromobacter xylosoxidans theo thời gian dựa vào hàm lượng N-NO3 , N-NO2 , N- + NH4 được xác định trong từng thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ. Kết quả thí nghiệm được trình bày trên hình 3.11. 200 250 150 200 150 , mg/L mg/L , , mg/L mg/L , - - 2 3 100 Đối chứng 100 Đối chứng NO NO - - 50 N N 50 Khảo sát Khảo sát 0 0 0h 12h 24h 36h 48h 0h 12h 24h 36h 48h Thời gian, giờ Thời gian, giờ (a) (b) 70 100% 60 80% 50 , mg/L mg/L , 40 60% + 4 30 Đối chứng 40% Đối chứng NH - 20 20% N 10 Khảo sát Khảo sát 0 %lý,xử quả Hiệu 0% 0h 12h 24h 36h 48h 0h 12h 24h 36h 48h Thời gian, giờ Thời gian, giờ (c) (d) Hình 3.11. Động học phản nitrate và hiệu quả xử lý của vi khuẩn Achromobacter - - xylosoxidans theo thời gian. (a) Biến đổi N-NO3 , (b) Biến đổi N-NO2 , (c) Biến đổi N- + NH4 , (d) Hiệu quả xử lý. 59
  70. Đồ án tốt nghiệp Tốc độ chuyển hóa 6.000 4.874 5.000 4.000 / giờ giờ / 3 3.000 / m g 2.000 1.000 0.709 0.000 Đối chứng Khảo sát Hình 3.12. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình sau 48 giờ - Kết quả hình 3.11 (a) cho thấy ở mẫu khảo sát khả năng khử N-NO3 của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có hiệu quả tăng dần theo thời gian thích nghi. Có sự khác biệt về sự chuyển hóa nitrate giữa các thời gian xử lý, ở thời điểm 36 giờ và 48 - giờ hàm lượng nitrate được chuyển hóa tốt nhất (Bảng phụ lục B). Hàm lượng N-NO3 giảm dần từ 0 giờ cho đến 24 giờ, và giảm mạnh nhất tại thời điểm 36 giờ và 48 giờ. - Tại thời điểm 0 giờ hàm lượng N-NO3 là 178,55 mg/L, sau 24 giờ thì còn lại 57,23 mg/L, và giảm mạnh còn 2,53 mg/L ở 48 giờ. - Ở mẫu đối chứng, hàm lượng N-NO3 cũng giảm dần theo thời gian, nhưng - chậm hơn so với mẫu khảo sát. Tại thời điểm 0 giờ thì hàm lượng N-NO3 ở mẫu đối chứng là 187,23 mg/L, đến 48 giờ sau đó giảm còn 7,83 mg/L. Sở dĩ hàm lượng N- - NO3 trong mẫu đối chứng giảm là do chính trong nước thải cũng có sẵn một số vi khuẩn có khả năng phản nitrate, những vi khuẩn này khi gặp điều kiện thích hợp (điều kiện thiếu khí, môi trường có bổ sung giá thể) sẽ phát huy khả năng phản nitrate. 60
  71. Đồ án tốt nghiệp Kết quả hình 3.11 (b) và (c) cho thấy ở mẫu khảo sát, trong quá trình thích nghi - + thì vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có tích lũy N-NO2 và sinh N-NH4 tại thời - + điểm 12 giờ và 24 giờ nhưng với hàm lượng thấp. Sau đó lượng N-NO2 và N-NH4 - được chuyển hóa và giảm mạnh ở thời điểm 36 giờ và 48 giờ. Hàm lượng N-NO2 ở mẫu khảo sát là 9,97 mg/L lúc 0 giờ, trong thời gian thích nghi của vi khuẩn đã tăng lên 71,13 mg/L ở 24 giờ, nhưng sau đó giảm còn 2,16 mg/L ở 36 giờ và giảm hết hoàn + toàn ở 48 giờ. Hàm lượng N-NH4 ở mẫu khảo sát tại thời điểm 0 giờ là 49,46 mg/L, trong thời gian thích nghi của vi khuẩn đã tăng lên 61,96 mg/L ở 12 giờ, nhưng sau đó giảm còn 2,24 mg/L ở 36 giờ và còn lại 1,49 mg/L ở 48 giờ thấp hơn hàm lượng N- + NH4 được phép có trong nước thải sau xử lý ở cột A (QCVN 11 : 2008/BTNMT). Có sự khác biệt về sự chuyển hóa nitrite và amoni của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans ở các khoảng thời gian xử lý, ở thời điểm 36 giờ và 48 giờ vi khuẩn thể hiện khả năng chuyển hóa nitrite và amoni tốt nhất (Bảng phụ lục B). Qua đó thấy được khả năng khử nitrate, không tích lũy nitrite và sinh ít amoni của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong môi trường nước thải giàu nitrate. - Ở mẫu đối chứng, hàm lượng N-NO2 tại thời điểm 0 giờ là 0 mg/L, sau 48 giờ + đã tăng lên đến 237,5 mg/L. Hàm lượng N-NH4 tại thời điểm 0 giờ là 31,91 mg/L, sau 24 giờ đã tăng lên đến 58,42 mg/L, sau 48 giờ đã giảm còn lại 7,84 mg/L. Kết quả này cho thấy một số vi khuẩn có sẵn trong nước thải trong quá trình tăng trưởng gây tích - lũy lượng N-NO2 . Kết quả hình 3.11 (d) cho thấy hiệu quả xử lý của mẫu khảo sát vượt trội hơn mẫu đối chứng rất nhiều. Hiệu quả xử lý của mẫu khảo sát đạt 98% tại thời điểm 48 giờ trong khi mẫu đối chứng chỉ đạt 16% tại thời điểm tương ứng Kết quả hình 3.12 thể hiện tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình của mẫu đối chứng và mẫu khảo sát. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình của mẫu khảo sát cao hơn so với mẫu đồi chứng, mẫu khảo sát chuyển hóa được 4,874 g/m3/giờ trong khi mẫu đối chứng chỉ đạt 0,709 g/m3/giờ. 61
  72. Đồ án tốt nghiệp Kết luận của thí nghiệm này là mẫu khảo sát có bổ sung vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans có khả năng xử lý nitrate theo thời gian tốt hơn mẫu đối chứng không bổ sung vi khuẩn. Khả năng xử lý nitrate của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans thể hiện mạnh nhất ở thời gian từ 36 giờ đến 48 giờ. 3.6. Khảo sát mô hình bioreactor quy mô phòng thí nghiệm Mô hình được xây dựng nhằm mục đích bước đầu ứng dụng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans vào việc xử lý nguồn nước thải chế biến thủy sản giàu - - + nitrate. Thí nghiệm được bố trí với tổng hàm lượng nitơ (N-NO3 , N-NO2 , N-NH4 ) ban đầu ≈ 341.04mg/l. Kết quả xử lý của mô hình bioreactor được thể hiện ở hình 3.13. 300 50 250 40 200 30 , mg/L mg/L , mg/L , - - 2 3 150 Đối chứng 20 Đối chứng NO NO - - 100 N N Khảo sát Khảo sát 50 10 0 0 0h 12h 24h 36h 48h 0h 12h 24h 36h 48h Thời gian, giờ Thời gian, giờ (a) (b) 62
  73. Đồ án tốt nghiệp 100 100% 90 90% 80 80% 70 70% 60 60% , mg/L mg/L , + 4 50 50% 40 Đối chứng 40% Đối chứng NH - 30 30% N Khảo sát Khảo sát 20 %lý,xử quả Hiệu 20% 10 10% 0 0% 0h 12h 24h 36h 48h 0h 12h 24h 36h 48h Thời gian, giờ Thời gian, giờ (c) (d) Hình 3.13. Kết quả động học phản nitrate và hiệu quả xử lý của vi khuẩn - Achromobacter xylosoxidans sau khi chạy mô hình bioreactor. (a) Biến đổi N-NO3 , (b) - + Biến đổi N-NO2 , (c) Biến đổi N-NH4 , (d) Hiệu quả xử lý. Tốc độ chuyển hóa 25.0 20.6 20.0 15.0 13.1 / ngày / 3 8.6 9.1 Đối chứng 10.0 7.4 / m g 6.7 6.9 6.2 Khảo sát 5.0 0.0 12h 24h 36h 48h Thời gian, giờ Hình 3.14. Tốc độ chuyển hóa nitơ ở từng thời điểm 63
  74. Đồ án tốt nghiệp - Kết quả hình 3.13 (a) cho thấy ở mẫu khảo sát khả năng chuyển hóa N-NO3 của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans tăng dần theo thời gian. Theo số liệu xử lý thống kê, có sự khác biệt về sự chuyển hóa nitrate giữa các khoảng thời gian xử lý - (Bảng phụ lục B). Hàm lượng N-NO3 giảm mạnh từ 0 giờ cho đến 12 giờ, và giảm - mạnh nhất tại thời điểm 24 giờ. Tại thời điểm 0 giờ hàm lượng N-NO3 là 246,75 mg/L, sau 24 giờ thì còn lại 3,98 mg/L, và giảm còn 1,81 mg/L sau 48 giờ xử lý. Sở dĩ, hàm lượng nitrate trong thời gian đầu giảm mạnh là do trong giai đoạn thích nghi với môi trường vi khuẩn sử dụng nguồn nitrate làm năng lượng cho quá trình tăng trưởng và phát triển, vì vậy lượng nitrate được vi khuẩn chuyển hóa nhiều. - Ở mẫu đối chứng, hàm lượng N-NO3 cũng giảm dần theo thời gian, trong - khoảng thời gian đầu từ 0 giờ đến 24 giờ thì hàm lượng N-NO3 được chuyển đổi chưa đạt cao như mẫu khảo sát, do trong giai đoạn này mật độ vi khuẩn có sẵn trong mẫu - nước thải ít nên quá trình chuyển hóa N-NO3 diễn ra chậm, sau thời điểm 24 giờ thì - mật độ vi khuẩn đã đủ lớn nên sự chuyển hóa N-NO3 diễn ra nhanh hơn làm hàm - - lương N-NO3 giảm mạnh. Tại thời điểm 0 giờ thì hàm lượng N-NO3 ở mẫu đối chứng là 265,78 mg/L, đến 24 giờ sau đó giảm còn 110,12 mg/L và sau 36 giờ thì còn lại 7,95 mg/L. Kết quả hình 3.13 (b) cho thấy ở mẫu khảo sát, trong quá trình thích nghi thì vi - khuẩn Achromobacter xylosoxidans có tích lũy N-NO2 tại thời điểm 12 giờ nhưng với - hàm lượng thấp. Sau đó lượng N-NO2 được chuyển hóa và giảm mạnh ở thời điểm 24 - giờ và 36 giờ, sau đó tăng nhẹ ở thời điểm 48 giờ. Hàm lượng N-NO2 ở mẫu khảo sát là 4,34 mg/L lúc 0 giờ, trong thời gian thích nghi của vi khuẩn đã tăng lên 18,15 mg/L ở 12 giờ, nhưng sau đó giảm còn 0,84 mg/L ở 24 giờ và giảm còn 0,74 mg/L ở 36 giờ. Ở mẫu đối chứng, tuy trong nước thải có sẵn một số vi khuẩn có khả năng phản nitrate, - có thể làm giảm hàm lượng N-NO3 nhưng theo thời gian, sự phát triển của một số vi - - khuẩn này làm tích lũy nhiều N-NO2 . Hàm lượng N-NO2 tại thời điểm 0 giờ là 0,66 64
  75. Đồ án tốt nghiệp mg/L nhưng sau 36 giờ đã tăng lên đến 47,42 mg/L, sau 48 giờ thì giảm còn 29,07 mg/L, hàm lượng này cao hơn nhiều so với mẫu khảo sát. + Kết quả hình 3.13 (c) cho thấy hàm lượng N-NH4 ở mẫu khảo sát giảm dần theo thời gian. Theo số liệu xử lý thống kê, có sự khác biệt về sự chuyển hóa amoni + giữa các khoảng thời gian xử lý. Tại thời điểm 0 giờ hàm lượng N-NH4 là 89,96 mg/L, sau đó giảm còn 22,96 mg/L ở 24 giờ và giảm mạnh chỉ còn lại 0,75 mg/L sau 48 giờ + xử lý thấp hơn hàm lượng N-NH4 được phép có trong nước thải đầu ra cột A là 10 + mg/L (QCVN 11: 2008/BTNMT). Đối với mẫu đối chứng, hàm lượng N-NH4 tại thời điểm 0 giờ là 76,52 mg/L sau 48 giờ đã giảm còn lại 11,20 mg/L vẫn cao hơn hàm + lượng N-NH4 của mẫu khảo sát tại thời điểm xử lý tương tự và cao hơn hàm lượng N- + NH4 được phép có trong nước thải đầu ra cột A (QCVN 11: 2008/BTNMT). Kết quả trên hình 3.13 (d) cho thấy ở thời điểm 12 giờ, hiệu quả xử lý nitơ của mẫu đối chứng đạt 30%, mẫu khảo sát đạt 73% cao hơn so với mẫu đối chứng. Sau 48 - giờ hiệu quả mẫu khảo sát đạt 97% với hàm lượng N-NO3 giảm từ 246,75 mg/L xuống - + còn 1,81mg/L, tích lũy 6,35mg/L N-NO2 và sinh 0,75mg/L N-NH4 . Trong khi đó ở - mẫu đối chứng hiệu quả xử lý đạt 87%, với hàm lượng N-NO3 giảm từ 265,8 mg/L N- - - + NO3 xuống còn 3,37 mg/L , tích lũy 29,07 mg/L N-NO2 và sinh 11,20 mg/L N-NH4 . Kết quả trên hình 3.14 thể hiện tốc độ chuyển hóa nitơ của mẫu đối chứng và mẫu khảo sát theo từng thời điểm khác nhau. Dựa vào kết quả xử lý thống kê xét theo - - từng mốc thời gian xử lý, có sự khác biệt về tốc độ chuyển hóa nitơ (N-NO3 , N-NO2 , + N-NH4 ) giữa mẫu khảo sát và mẫu đối chứng, cụ thể như sau: tại thời điểm 12 giờ, tốc độ chuyển hóa ở mẫu đối chứng là 8,6 g/m3/giờ, ở mẫu khảo sát là 20,6 g/m3/giờ, từ kết quả trên cho thấy tại thời điểm 12 giờ mẫu khảo sát chuyển hóa hàm lượng nitơ nhanh hơn mẫu đối chứng. Ở các thời điểm còn lại 24 giờ, 36 giờ, và 48 giờ tốc độc chuyển hóa nitơ của mẫu đối chứng là 7,4 g/m3/giờ; 6,7 g/m3/giờ; 6,2 g/m3/giờ và ở mẫu khảo sát là 13,1g/m3/giờ; 9,1g/m3/giờ; 6,9 g/m3/giờ. Ở từng thời điểm, tốc độ chuyển hóa 65
  76. Đồ án tốt nghiệp của mẫu khảo sát đều cao hơn mẫu đối chứng, qua đó thấy được khả năng chuyển hóa nitơ của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong nước thải giàu nitrate. Từ các kết quả trên thấy được khả năng chuyển hóa nitơ ở mẫu khảo sát có bổ sung vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans tốt hơn ở mẫu đối chứng không bổ sung vi khuẩn. Do đó, nên ứng dụng chủng vi khuẩn Achromobacter xylosixidans vào mô hình xử lý nước thải giàu nitrate để rút ngắn thời gian xử lý và đạt hiệu quả hơn. 66
  77. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Đề tài: “Bƣớc đầu ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans trong xử lý nƣớc thải giàu nitrate” đạt được một số kết quả sau: - Khảo sát các đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans bằng bộ KIT TEST API 20 NE và tra cứu trên hệ thống API WEB cho thấy chủng vi khuẩn được nghiên cứu là chủng vi khuẩn phản nitrate tiềm năng thuộc loài Achromobacter xylosoxidans. - Tỷ lệ phối trộn giữa nước thải giàu nitrate và môi trường Giltay cải tiến thích hợp để vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans tăng trưởng và thể hiện khả năng chuyển hóa nitrate tốt nhất là tỷ lệ 5:5. - Thời gian để chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans xử lý nguồn nitrate trong nước thải hiệu quả nhất là sau 48 giờ xử lý trong điều kiện thiếu khí, tỷ lệ cấy giống 10%, môi trường có bổ sung giá thể với tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình là 4,874 g/m3/giờ. - Mật độ vi khuẩn thích hợp bổ sung vào nước thải giàu nitrate để chuyển hóa nitrate tốt nhất là 108 cfu/ml sau 36 giờ xử lý trong điều kiện thiếu khí, tỷ lệ cấy giống 10%, môi trường có bổ sung giá thể với tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình là 5,493 g/m3/giờ. - Sau khi chạy mô hình bioreactor quy mô phòng thí nghiệm, chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có khả năng chuyển hóa 244,94 mg/L hàm lượng - - + N-NO3 sau 48 giờ xử lý, tích lũy 6,35 mg/L hàm lượng N-NO2 và sinh rất ít N-NH4 (<1 mg/L). Hiệu quả xử lý cao nhất đạt 97%. 67
  78. Đồ án tốt nghiệp 4.2. Kiến nghị Do thời gian có hạn nên đề tài chỉ tiến hành khảo sát trên một nguồn nước thải từ Nhà máy Chế biến thực phẩm Tân Phú Trung, trong quy trình xử lý nước thải của nhà máy đã có bổ sung một số vi khuẩn để xử lý nitrate nên kết quả khảo sát giữa mẫu nước thải có bổ sung chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans và mẫu nước thải không bổ sung vi khuẩn chưa thể hiện rõ được hiệu quả xử lý nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans. Do đó, tác giả kiến nghị khảo sát trên nhiều nguồn nước thải giàu nitrate khác để thấy rõ hơn khả năng phản nitrate của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans. Cần khảo sát ảnh hưởng của các chất ức chế vi khuẩn và điều kiện thích ứng của vi khuẩn trong nước thải giàu nitrate. Thiết kế bioreactor dạng MBBR theo mô hình thiếu khí có giá thể và có hệ thống thu khí hoàn chỉnh. Cần khảo sát điều kiện tối ưu để áp dụng mô hình lớn hơn để xử lý nước thải giàu nitrate. 68
  79. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Thanh Thủy (2009). Đặc điểm của vi khuẩn phân lập từ xử lý sinh học tẩy độc nước thải bị ô nhiễm 2,4,6 – Trinitrotoluen, Tạp chí Công nghệ sinh học, 7(3), 389 – 396. [2] Huỳnh Văn Thành (2013). Phân lập tuyển chọn vi sinh vật xử lý loại bỏ nitơ trong nước thải chế biến thủy sản, Luận văn Thạc sĩ Kỹ Thuật Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh. [3] Lâm Minh Triết, Nguyễn Thanh Hùng, Nguyễn Phước Dân (2008). Xử lý nước thải đô thị và công nghiệp, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh. [4] Lê Trần Ánh Tuyết (2013). Định danh vi khuẩn phản nitrate và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phản nitrate của vi khuẩn nhằm ứng dụng trong xử lý nước thải giàu nitrate, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh. [5] Nguyễn Hoài Hương, Huỳnh Văn Thành (2013), Hiệu quả phản nitrate trong môi trường giàu nitrate của vi khuẩn phân lập từ nước thải chế biến thủy sản, Tạp chí Khoa học và Công nghệ. [6] Nguyễn Thế Đồng (2011). Tài liệu kỹ thuật hướng dẫn đánh giá sự phù hợp của công nghệ xử lý nước thải và giới thiệu một số công nghệ xử lý nước thải đối với ngành Chế biến thuỷ sản, Dệt may, Giấy và bột giấy. Hà Nội, Tổng Cục Môi Trường. [7] Nguyễn Thị Hồng Đào (2012), Phân lập tuyển chọn vi khuẩn phản nitrate xử lý nitơ trong nước thải chế biến thủy sản, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh. [8] Nguyễn Văn Phước (2005), Thí nghiệm Hóa Kỹ Thuật Môi Trường – Phần I : Phân tích chất lương nước, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh. [9] Quy chuẩn Việt Nam QCVN 11:2008/BTNMT. Nước thải chế biến thủy sản. 69
  80. Đồ án tốt nghiệp Tài liệu tiếng nƣớc ngoài [10] Esteve NA, Caballero A, Ramos JL (2001), Biological degradation of 2,4,6 – Trinitrotuoluen, Microbiol Mol Biol Rev 65, 335 – 352. [11] Busse, HJ. & Stolz, A . (2006), Achromobacter, Alcaligenes and related genera. In The Prokaryotes: a Handbook on the Biology of Bacteria, 3rd edn, edited by M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K. H. Schleifer & E. Stackebrandt, New York: Springer, 675–700. [12] Chirag M., Ghevariya, Jwalant. Bhatt K., Bharti P., Dave (2011), Enhanced chrysene degradation by halotolerant Achromobacter xylosoxidans using Response Surface Methodology, Bioresource Technology, Volume 102, Issue 20, 9668–9674. [13] Ho YN (2012), Selection and application of endophytic bacterium Achromobacter xylosoxidans strain F3B for improving phytoremediation of phenolic pollutants, Journal of Hazardous Materials, 15: 43–49. [14] Iasur-Kruh L, Yitzhak Hadar, Dror Minz (2011), Isolation and bioaugmentation of an estradiol-degrading bacterium and its integration into a mature biofilm, Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 30:973-80. [15] Manikandan N, Kuzhali SS, Kumuthakalavalli R (2012). Biodegradation of Textile Dye by Using Achromobacter xylosoxidans GRIRKNM11 Isolated from Dye Polluted Site, J Environ Anal Toxicol 2:160. [16] Niansheng Wan, Ji – Dong Gu, Yan Yan (2007). Degradation of p – nitrophenol by Achromobacter xylosoxidans Ns isolated from Wetland sedimen, Int Biodeter Biodegr 59 (2), 90 – 96. [17] Li W, Dai Y, Xue B, Li Y, Peng X, Zhang J, Yan Y. (2009). Biodegradation and detoxification of endosulfan in aqueous medium and soil by Achromobacter xylosoxidans strain CS5. J Hazard Mater, 167:209-16. 70
  81. Đồ án tốt nghiệp [18] Smets BF, Hong Y, Esteve AN (2007), TNT biotransfomation when chemistry confronts mineralization, App Microbiol Biotechnol 76, 267 – 277. [19] Steffens, W.Leider, U.Hattop, W.H (1961), Moglichkeiten und Gefahrn derr Anwendung von Malachite green in der fischerci, Zeritshrift fur Fisherie 10, 745 – 771. [20] Wang J, Qiao M, Ding J, Zhang KQ, Huang X (2011), Decolorizing activity of malachite green and its mechanisms involved in dye biodegradation by Achromobacter xylosoxidans MG 1, Microbiol Biotechnol, 20 (4), 220 – 227. [21] Werth G (1958), Die erzeugung von storugen in erbgefuge und von tumoren durch experimenttelle of websanoxio, Arzn Forsh 8, 725 – 744. Tài liệu internet [22] [23] [24] thai-mbbr 71
  82. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC - - + PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ ĐO OD ĐỊNH LƯỢNG NO3 , NO2 , NH4 , MẬT ĐỘ QUANG VI KHUẨN, TÍNH TOÁN HIỆU QUẢ XỬ LÝ, TỐC ĐỘ CHUYỂN HÓA TRONG CÁC MÔ HÌNH KHẢO SÁT 1. Khảo sát sự thích ứng của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans theo tỷ lệ phối trộn giữa nƣớc thải và môi trƣờng Giltay cải tiến - Mật độ quang của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong các môi trường phối trộn, đo ở bước sóng 600 nm. Tỷ lệ nƣớc thải : môi trƣờng Giltay cải tiến Thời gian 5 : 5 6 : 4 7 : 3 8 : 2 9 : 1 10 : 0 0 giờ 0,13 0,223 0,136 0,176 0,177 0,216 48 giờ 0,297 0,252 0,251 0,187 0,154 0,139 - Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình. Tốc độ chuyển hóa (g/m3/giờ) 5 : 5 6 : 4 7 : 3 8 : 2 9 : 1 10 : 0 3,882 0,956 0,607 0,593 0,312 0,047 2. Khảo sát mật độ thích hợp của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans bổ sung vào nƣớc thải giàu nitrate - Hàm lượng nitrate, nitrite, amoni và hiệu quả xử lý nitơ của các mật độ vi khuẩn theo thời gian. 1
  83. Đồ án tốt nghiệp - - NO3 mg/L NO2 mg/L Giờ 104 105 106 107 108 104 105 106 107 108 0 165,54 178,80 167,23 173,61 166,63 0,212 0,310 0,625 1,712 6,72 12 188,31 207,95 230,48 159,64 136,99 0,585 1,486 3,060 7,349 0,35 24 226,02 120,48 79,52 77,47 165,42 0,354 1,535 5,952 5,609 4,54 36 218,43 214,94 221,45 218,92 51,81 10,43 18,595 22,963 34,848 0 48 107,95 113,37 160,60 148,67 1,69 3,070 6,513 0,925 18,142 0 + NH4 mg/L Hiệu quả xử lý Giờ 104 105 106 107 108 104 105 106 107 108 0 83,611 81,558 86,224 101,34 92,756 0% 0% 0% 0% 0% 12 75,959 81,372 81,185 75,213 76,706 6% 12% 24% 12% 20% 24 57,109 73,72 69,8 53,19 39,753 14% 25% 39% 51% 21% 36 163,3 69,8 90,703 94,436 36,953 57% 16% 32% 26% 67% 48 28,741 16,797 2,986 0,747 0,747 44% 48% 35% 39% 99% - Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình Tốc độ chuyển hóa (g/m3/giờ) 104 105 106 107 108 3,882 0,956 0,607 0,593 0,312 3. Khảo sát thời gian xử lý nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong nƣớc thải giàu nitrate - Hàm lượng nitrate, nitrite, amoni, hiệu quả xử lý nitơ của mẫu đối chứng (ĐC) và khảo sát (KS) theo thời gian. 2
  84. Đồ án tốt nghiệp - - + NO3 mg/L NO2 mg/L NH4 mg/L Hiệu quả xử lý Giờ ĐC KS ĐC KS ĐC KS ĐC KS 0 187,23 178,55 0 9,97 31,91 49,46 0% 0% 12 186,14 109,76 1,57 46,39 30,98 61,69 0% 8% 24 114,22 57,23 31,24 71,13 58,42 47,4 7% 26% 36 7,83 2,41 159,39 2,16 19,41 2,24 15% 97% 48 7,83 2,53 237,5 0 7,84 1,49 16% 98% - Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình. Tốc độ chuyển hóa (g/m3/giờ) Đối chứng Khảo sát 0,709 4,874 4. Chạy mô hình xử lý nƣớc thải quy mô phòng thí nghiệm - Hàm lượng nitrate, nitrite, amoni và hiêu quả xử lý nitơ của mẫu đối chứng (ĐC) và khảo sát (KS) sau khi chạy mô hình. - - + NO3 mg/L NO2 mg/L NH4 mg/L Hiệu quả xử lý Giờ ĐC KS ĐC KS ĐC KS ĐC KS 0 265,78 246,75 0,66 4,34 76,52 88,96 0% 0% 12 157,11 47,23 7,96 18,15 75,0 28,37 30% 73% 24 110,12 3,98 8,22 0,84 47,03 22,96 52% 92% 36 7,95 2,29 47,42 0,74 46,66 11,38 70% 96% 48 3,37 1,81 29,07 6,35 11,2 0,75 87% 97% - Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình. 3
  85. Đồ án tốt nghiệp Tốc độ chuyển hóa (g/m3/giờ) Giờ Đối chứng Khảo sát 0 0 0 12 14,8 20,6 24 7,4 13,1 36 6,7 9,1 48 6,2 6,9 5. Giá trị các thông số làm cở sở tính toán các giá trị tối đa cho phép trong nƣớc thải chế biến thủy sản (QCVN 11:2008). Giá trị C STT Thông số Đơn vị A B 1 pH - 6 – 9 5,5 - 9 o 2 BOD5 ở 20 C mg/l 30 50 3 COD mg/l 50 80 Tổng chất rắn lơ lửng 4 mg/l 50 100 (TSS) 5 Amoni (tính theo N) mg/l 10 20 6 Tổng nitơ mg/l 30 60 Tổng dầu, mỡ động thực 7 mg/l 10 20 vật 8 Clo dư mg/l 1 2 9 Tổng Coliforms MPN/100ml 3000 5000 4
  86. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ 1. Khảo sát mật độ thích hợp của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans bổ sung vào nƣớc thải giàu nitrate Multifactor ANOVA - Ham luong nitrate Analysis of Variance for Ham luong nitrate – Type III Sums of Squares Source Sum of Df Mean F- P- Squares Square Ratio Value MAIN EFFECTS A:Mat do 56029.4 4 14007.3 222.89 0.0000 B:Thoi gian 74633.9 4 18658.5 296.90 0.0000 INTERACTIONS AB 117669. 16 7354.32 117.02 0.0000 RESIDUAL 3142.26 50 62.8452 TOTAL 251475. 74 (CORRECTED) Table of Least Squares Means for Ham luong nitrate with 95.0 Percent Confidence Intervals Stnd. Lower Upper Level Count Mean Error Limit Limit GRAND 75 155.483 MEAN Mat do 10^5 15 181.493 2.04687 177.382 185.605 10^6 15 166.168 2.04687 162.057 170.279 10^7 15 171.213 2.04687 167.102 175.325 10^8 15 154.988 2.04687 150.877 159.099 10^9 15 103.551 2.04687 99.4401 107.663 Thoi gian 0 gio 15 170.521 2.04687 166.41 174.633 12 gio 15 183.647 2.04687 179.536 187.759 24 gio 15 132.387 2.04687 128.275 136.498 36 gio 15 185.558 2.04687 181.447 189.669 48 gio 15 105.301 2.04687 101.189 109.412 Mat do by Thoi gian 10^5,0 gio 3 167.95 4.57694 158.757 177.143 5
  87. Đồ án tốt nghiệp 10^5,12 gio 3 187.71 4.57694 178.517 196.903 10^5,24 gio 3 224.177 4.57694 214.984 233.37 10^5,36 gio 3 218.393 4.57694 209.2 227.586 10^5,48 gio 3 109.237 4.57694 100.044 118.43 10^6,0 gio 3 178.473 4.57694 169.28 187.666 10^6,12 gio 3 205.14 4.57694 195.947 214.333 10^6,24 gio 3 120.32 4.57694 111.127 129.513 10^6,36 gio 3 215.34 4.57694 206.147 224.533 10^6,48 gio 3 111.567 4.57694 102.374 120.76 10^7,0 gio 3 167.23 4.57694 158.037 176.423 10^7,12 gio 3 226.587 4.57694 217.394 235.78 10^7,24 gio 3 79.52 4.57694 70.3269 88.7131 10^7,36 gio 3 223.937 4.57694 214.744 233.13 10^7,48 gio 3 158.793 4.57694 149.6 167.986 10^8,0 gio 3 173.413 4.57694 164.22 182.606 10^8,12 gio 3 159.44 4.57694 150.247 168.633 10^8,24 gio 3 77.9933 4.57694 68.8003 87.1864 10^8,36 gio 3 218.877 4.57694 209.684 228.07 10^8,48 gio 3 145.217 4.57694 136.024 154.41 10^9,0 gio 3 165.54 4.57694 156.347 174.733 10^9,12 gio 3 139.36 4.57694 130.167 148.553 10^9,24 gio 3 159.923 4.57694 150.73 169.116 10^9,36 gio 3 51.2433 4.57694 42.0503 60.4364 10^9,48 gio 3 1.69 4.57694 -7.50308 10.8831 Multiple Range Tests for Ham luong nitrate by Mat do Method: 95.0 percent LSD Mat Count LS LS Homogeneous do Mean Sigma Groups 10^9 15 103.551 2.04687 X 10^8 15 154.988 2.04687 X 10^6 15 166.168 2.04687 X 10^7 15 171.213 2.04687 X 10^5 15 181.493 2.04687 X Contrast Sig. Difference +/- Limits 10^5 - 10^6 * 15.3253 5.81421 6
  88. Đồ án tốt nghiệp 10^5 - 10^7 * 10.28 5.81421 10^5 - 10^8 * 26.5053 5.81421 10^5 - 10^9 * 77.942 5.81421 10^6 - 10^7 -5.04533 5.81421 10^6 - 10^8 * 11.18 5.81421 10^6 - 10^9 * 62.6167 5.81421 10^7 - 10^8 * 16.2253 5.81421 10^7 - 10^9 * 67.662 5.81421 10^8 - 10^9 * 51.4367 5.81421 Multifactor ANOVA - Ham luong nitrite Analysis of Variance for Ham luong nitrite - Type III Sums of Squares Source Sum of Df Mean F- P- Squares Square Ratio Value MAIN EFFECTS A:Mat do 1303.61 4 325.903 771.43 0.0000 B:Thoi gian 1466.77 4 366.694 867.99 0.0000 INTERACTIONS AB 1711.99 16 106.999 253.27 0.0000 RESIDUAL 21.1233 50 0.422465 TOTAL 4503.49 74 (CORRECTED) Table of Least Squares Means for Ham luong nitrite with 95.0 Percent Confidence Intervals Stnd. Lower Upper Level Count Mean Error Limit Limit GRAND 75 5.32836 MEAN Mat do 10^5 15 2.90173 0.167822 2.56465 3.23882 10^6 15 5.7426 0.167822 5.40552 6.07968 10^7 15 2.48973 0.167822 2.15265 2.82682 10^8 15 13.2776 0.167822 12.9405 13.6147 10^9 15 2.23013 0.167822 1.89305 2.56722 Thoi gian 0 gio 15 1.86087 0.167822 1.52378 2.19795 12 gio 15 2.55607 0.167822 2.21898 2.89315 7
  89. Đồ án tốt nghiệp 24 gio 15 2.92007 0.167822 2.58298 3.25715 36 gio 15 13.8286 0.167822 13.4915 14.1657 48 gio 15 5.4762 0.167822 5.13912 5.81328 Mat do by Thoi gian 10^5,0 gio 3 0.21 0.375262 - 0.96373 0.54373 8 8 10^5,12 gio 3 0.58333 0.375262 - 1.33707 3 0.17040 4 10^5,24 gio 3 0.34766 0.375262 - 1.1014 7 0.40607 1 10^5,36 gio 3 10.2977 0.375262 9.54393 11.0514 10^5,48 gio 3 3.07 0.375262 2.31626 3.82374 10^6,0 gio 3 0.305 0.375262 - 1.05874 0.44873 8 10^6,12 gio 3 1.48267 0.375262 0.72892 2.2364 9 10^6,24 gio 3 1.52833 0.375262 0.77459 2.28207 6 10^6,36 gio 3 18.8903 0.375262 18.1366 19.6441 10^6,48 gio 3 6.50667 0.375262 5.75293 7.2604 10^7,0 gio 3 0.62 0.375262 - 1.37374 0.13373 8 10^7,12 gio 3 3.053 0.375262 2.29926 3.80674 10^7,24 gio 3 2.912 0.375262 2.15826 3.66574 10^7,36 gio 3 5.63767 0.375262 4.88393 6.3914 10^7,48 gio 3 0.226 0.375262 - 0.97973 0.52773 8 8 10^8,0 gio 3 1.70533 0.375262 0.95159 2.45907 6 10^8,12 gio 3 7.343 0.375262 6.58926 8.09674 10^8,24 gio 3 5.444 0.375262 4.69026 6.19774 10^8,36 gio 3 34.3173 0.375262 33.5636 35.0711 8
  90. Đồ án tốt nghiệp 10^8,48 gio 3 17.5783 0.375262 16.8246 18.3321 10^9,0 gio 3 6.464 0.375262 5.71026 7.21774 10^9,12 gio 3 0.31833 0.375262 - 1.07207 3 0.43540 4 10^9,24 gio 3 4.36833 0.375262 3.6146 5.12207 10^9,36 gio 3 0.0 0.375262 - 0.75373 0.75373 8 8 10^9,48 gio 3 0.0 0.375262 - 0.75373 0.75373 8 8 Multiple Range Tests for Ham luong nitrite by Mat do Method: 95.0 percent LSD Mat do Count LS LS Sigma Homogeneous Mean Groups 10^9 15 2.23013 0.167822 X 10^7 15 2.48973 0.167822 XX 10^5 15 2.90173 0.167822 X 10^6 15 5.7426 0.167822 X 10^8 15 13.2776 0.167822 X Contrast Sig. Difference +/- Limits 10^5 - * -2.84087 0.476706 10^6 10^5 - 0.412 0.476706 10^7 10^5 - * -10.3759 0.476706 10^8 10^5 - * 0.6716 0.476706 10^9 10^6 - * 3.25287 0.476706 10^7 10^6 - * -7.535 0.476706 10^8 10^6 - * 3.51247 0.476706 10^9 9
  91. Đồ án tốt nghiệp 10^7 - * -10.7879 0.476706 10^8 10^7 - 0.2596 0.476706 10^9 10^8 - * 11.0475 0.476706 10^9 Multifactor ANOVA - Ham luong amoni Analysis of Variance for Ham luong amoni - Type III Sums of Squares Source Sum of Df Mean F- P- Squares Square Ratio Value MAIN EFFECTS A:Mat do 7732.46 4 1933.12 144.62 0.0000 B:Thoi gian 67517.3 4 16879.3 1262.7 0.0000 7 INTERACTIONS AB 22864.4 16 1429.02 106.91 0.0000 RESIDUAL 668.346 50 13.3669 TOTAL 98782.5 74 (CORRECTED) Table of Least Squares Means for Ham luong amoni with 95.0 Percent Confidence Intervals Stnd. Lower Upper Level Count Mean Error Limit Limit GRAND 75 64.7191 MEAN Mat do 10^5 15 81.1477 0.943996 79.2516 83.0437 10^6 15 63.5794 0.943996 61.6833 65.4755 10^7 15 65.5702 0.943996 63.6741 67.4663 10^8 15 64.1765 0.943996 62.2805 66.0726 10^9 15 49.1216 0.943996 47.2255 51.0177 Thoi gian 0 gio 15 87.9409 0.943996 86.0449 89.837 12 gio 15 77.9873 0.943996 76.0912 79.8833 24 gio 15 58.3039 0.943996 56.4079 60.2 36 gio 15 90.2553 0.943996 88.3593 92.1514 48 gio 15 9.10793 0.943996 7.21186 11.004 10
  92. Đồ án tốt nghiệp Mat do by Thoi gian 10^5,0 gio 3 83.1133 2.11084 78.8736 87.3531 10^5,12 gio 3 75.8973 2.11084 71.6576 80.1371 10^5,24 gio 3 57.4827 2.11084 53.2429 61.7224 10^5,36 gio 3 162.992 2.11084 158.752 167.232 10^5,48 gio 3 26.253 2.11084 22.0132 30.4928 10^6,0 gio 3 79.2567 2.11084 75.0169 83.4964 10^6,12 gio 3 80.8737 2.11084 76.6339 85.1134 10^6,24 gio 3 73.5333 2.11084 69.2936 77.7731 10^6,36 gio 3 69.1783 2.11084 64.9386 73.4181 10^6,48 gio 3 15.055 2.11084 10.8152 19.2948 10^7,0 gio 3 85.4773 2.11084 81.2376 89.7171 10^7,12 gio 3 80.874 2.11084 76.6342 85.1138 10^7,24 gio 3 68.3073 2.11084 64.0676 72.5471 10^7,36 gio 3 90.4547 2.11084 86.2149 94.6944 10^7,48 gio 3 2.73767 2.11084 -1.50209 6.97742 10^8,0 gio 3 99.288 2.11084 95.0482 103.528 10^8,12 gio 3 75.1503 2.11084 70.9106 79.3901 10^8,24 gio 3 53.1277 2.11084 48.8879 57.3674 10^8,36 gio 3 92.5697 2.11084 88.3299 96.8094 10^8,48 gio 3 0.747 2.11084 -3.49275 4.98675 10^9,0 gio 3 92.5693 2.11084 88.3296 96.8091 10^9,12 gio 3 77.141 2.11084 72.9012 81.3808 10^9,24 gio 3 39.0687 2.11084 34.8289 43.3084 10^9,36 gio 3 36.082 2.11084 31.8422 40.3218 10^9,48 gio 3 0.747 2.11084 -3.49275 4.98675 Multiple Range Tests for Ham luong amoni by Mat do Method: 95.0 percent LSD Mat Count LS LS Sigma Homogeneous do Mean Groups 10^9 15 49.1216 0.943996 X 10^6 15 63.5794 0.943996 X 10^8 15 64.1765 0.943996 X 10^7 15 65.5702 0.943996 X 10^5 15 81.1477 0.943996 X Contrast Sig. Differen +/- 11