Khóa luận Khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại Khoa Vi sinh Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên

63 trang thiennha21 13/04/2022 3600

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại Khoa Vi sinh Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_khao_sat_tinh_hinh_vi_khuan_ho_duong_ruot_sinh_esb.pdf

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại Khoa Vi sinh Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THANH HẰNG Tên đề tài: KHẢO SÁT TÌNH HÌNH VI KHUẨN HỌ ĐƯỜNG RUỘT SINH ESBL TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TẠI KHOA VI SINH BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH – CNTP Khóa học : 2016-2020 THÁI NGUYÊN, NĂM 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THANH HẰNG Tên đề tài: KHẢO SÁT TÌNH HÌNH VI KHUẨN HỌ ĐƯỜNG RUỘT SINH ESBL TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TẠI KHOA VI SINH BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ Sinh học Lớp : K48 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2016 - 2020 Người hướng dẫn: TS. Bùi Tri Thức ThS.BS. Lương Thị Hồng Nhung THÁI NGUYÊN, NĂM 2020
i LỜI CẢM ƠN Qua quá trình học tập và rèn luyện tại Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên, được sự đồng ý của Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm em được phân công đến thực tập tại Khoa Vi sinh - Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên với đề tài: “Khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại Khoa Vi sinh Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên”. Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới ThS. BS Lương Thị Hồng Nhung và toàn thể anh, chị kỹ thuật viên làm việc tại Khoa Vi sinh - Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực tập. Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới TS. Bùi Tri Thức - Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Đồng thời, em cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy/Cô trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian học tập. Với điều kiện thời gian có hạn cũng như kinh nghiệm và kiến thức còn hạn chế nên đề tài của em sẽ không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận đươc sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của quý Thầy/Cô để em có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức phục vụ cho việc học tập, công việc sau này. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thanh Hằng
ii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT AK,AN Amikacin AMP Ampicillin ATM,AT Imipenem AUG Amoxicillin C Chloramphenicol CAZ Atreoman CIP Ciprofloxacin CIT Citrate Clinical and Laboratory Standards Institute (Viện các CLSI chuẩn mực lâm sàng và xét nghiệm) CNSH-CNTP Công nghệ sinh học-Công nghệ thực phẩm CRO Cefuroxime CTX Cefotaxime CXM Cefazidime DTH Dịch tỵ hầu E. coli Escherichia coli ESBL Extended - Spectrum Beta Lactamase FEP,CPM Cefepime G Glucose GARP-VN Hợp tác toàn cầu về kháng kháng sinh GAS Khí GAS GM Getanmycin H2S Sunfua hiro I Intermediate IND Indol K.leb Klebsiella pneumoniae KIA Kligler Iron Agar LEV Levofloxacin
iii LPS Lipopolysaccarie LYS Lysin MEM Meropenem MH Mueller Hinton Agar (Thạch Mueller Hinton) MR Methyl Red OFX Ofloxacin P.aeruginosa Pseudomonas aeruginosa P.mirabillis Proteus mirabillis P.morgamii Proteus morgamii P.rettegri Proteus rettegri PAD Phenylalanine Deaminase PBPs Penicillin biding proteins PRL,PIP Piprecillin PTZ,TZP Piperracillin R Resistant S Susceptible S.marcescens Serratia marcescens S.typhi Salmonellatyphi SAM Ampicillin SIM Simmom SXT Trimethoprim T,TE,TET Tetracyline TOB,TN Tobramycin Tr Trang URE Urease VP Voges Proskauer WHO World Health Organization FOS,FOT Fosfomycin
iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Tính chất sinh hóa của một số loại vi khuẩn đường ruột thường gặp 5 Bảng 1.2. Các nhân cơ bản của kháng sinh thuộc nhóm β-lactam 10 Bảng 1.3. Các lớp ESBL chính. 17 Bảng 3.1. Môi trường nuôi cấy cho từng loại bệnh phẩm 25 Bảng 3.2. Đường kính khoang giấy kháng sinh đồ của họ vi khuẩn đường ruột 35 Bảng 4.1. Tỉ lệ các loại vi khuẩn đường ruột phân lập được (243 chủng) 37 Bảng 4.2. Tỉ lệ các loại vi khuẩn đường ruột phân lập được theo chỉ số 38 Bảng 4.3. Tỉ lệ các chủng vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặpsinh ESBL 39 Bảng 4.4. Tỉ lệ kháng kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm đường ruộtthường gặp sinh ESBL 40 Bảng 4.5. Tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn E .coli sinh ESBL 43 Bảng 4.6. Tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Klebsiella spp. sinh ESBL 45 Bảng 4.7. Tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Proteus spp. sinh ESBL 47
v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hoạt động phân giải penicillin của penicillinase . 14 Hình 1.2. Cơ chế làm thay đổi thụ thể đối với thuốc. 14 Hình 1.3. Cơ chế thay thế con đường trao đổi chất . 15 Hình 1.4. Cơ chế bơm thuốc ra khỏi tế bào. 15 Hình 3.1. API 20E sử dụng trong chuẩn đoán, định danh vi khuẩnGram âm oxydase âm 31 Hình 3.2. API 20NE sử dụng trong chuẩn đoán, định danh họ vi khuẩnGram âm oxydase dương 32
vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v MỤC LỤC vi Phần 1.MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu của đề tài 2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3 Phần 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Tổng quan về vi khuẩn 4 2.1.1 Vi khuẩn 4 2.1.2 Vi khuẩn đường ruột 4 2.2 Tổng quan về các kháng sinh thuộc nhóm β - lactam 10 2.2.1 Phân loại kháng sinh thuộc nhóm β-lactam 11 2.2.2 Cơ chế tác dụng 12 2.3 Tổng quan về đề kháng kháng sinh của vi khuẩn 13 2.3.1 Định nghĩa 13 2.3.2 Phân loại 13 2.3.3 Cơ chế đề kháng kháng sinh 13 2.3.4 Các biện pháp hạn chế sự gia tăng kháng kháng sinh 15 2.4 Tổng quan về ESBL 16 2.4.1 Nguồn gốc về ESBL 16
vii 2.4.2 Phân loại 16 2.4.3 Phương pháp phát hiện 18 2.4 Tình hình nghiên cứu các họ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL trên thế giới và tại Việt Nam 20 2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 20 2.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 21 Phần 3.ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 22 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 22 3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22 3.2.1 Địa điểm 22 3.2.2 Thời gian 22 3.3 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị sử dụng 22 3.3.1 Dụng cụ, thiết bị 22 3.3.2 Hóa chất 22 3.4 Nội dung nghiên cứu 23 3.5 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 23 3.6 Xử lý số liệu 23 3.7 Phương pháp nghiên cứu 23 3.7.1 Phương pháp 1: Thu mẫu bệnh phẩm(theo sổ tay hướng dẫn lấy mẫu của khoa gửi tới các khoa cận lâm sàng) 23 3.7.2 Phương pháp 2: Phân lập và định danh 24 3.7.3 Phương pháp 3:Làm kháng sinh đồ theo phương pháp khuếch tán 34 3.7.4 Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn sinh ESBL 36 Phần 4.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Kết quả nghiên cứu tỉ lệ các vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. 37
viii 4.2 Kết quả nghiên cứu tổng hợp tỉ lệtheo chỉ số của các loại vi khuẩn đường ruột phân lập được theo nhóm tuổi của bệnh nhân tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. 38 4.3 Tỉ lệ các chủng vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL 39 4.4 Khảo sát tình hình kháng kháng thuốc của các vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. 40 4.5 Khảo sát tình hình kháng kháng thuốc của vi khuẩn E. colisinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. 43 4.6 Khảo sát tình hình kháng kháng thuốc của vi khuẩn Klebsiella spp. sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. 45 4.7 Khảo sát tình hình kháng kháng thuốc của vi khuẩn Proteus spp. sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. 47 Phần 5.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 5.1 Kết luận 49 5.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Kháng sinh là một vũ khí quan trọng để chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Tuy nhiên với tình hình sử dụng kháng sinh không có sự kiểm soát như hiện nay đã dẫn tới một loạt các hệ quả mà ngày nay con người đang phải vất vả đề khắc phục nó. Các hệ quả có thể thấy ngay, đó là vi khuẩn đã trở nên kháng thuốc hơn làm giảm hiệu quả của quá trình đều trị kháng sinh.Chính vì xu hướng kháng lại các thuốc kháng sinh thường dùng, đã dẫn đến tình trạng chúng ta đang chết dần chết mòn vì kháng sinh. Tuy nhiên, với lượng kháng sinh loại mới tuy rất hiệu quả nhưng vẫn không đáp ứng kịp với tốc độ đề kháng ngày càng tăng của vi khuẩn. Đặc biệt, tại các nước đang phát triển các chủng vi khuẩn kháng thuốc đã và đang xuất hiện ngày càng nhiều. Sự phát triển của vi khuẩn kháng kháng sinh không sớm thì muộn cũng xảy ra, tuy nhiên con người chính là yếu tố tác động chính để quá trình đó diễn ra một cách nhanh hơn do sự lạm dụng thuốc kháng sinh quá mức. Nhóm trực khuẩn Gram âm, đang là tác nhân hàng đầu gây lên nhiễm khuẩn nặng tại bệnh viện. Thường có tỉ lệ gây tử vong cao do cơ chế sinh bệnh khá phức tạp, đồng thời còn khó chọn được kháng sinh thích hợp vì từ ngay ban đầu khả năng đề kháng khá cao với các kháng sinh mạnh phổ rộng[24].Trong nhóm trực khuẩn Gram âm kháng thuốc hiện nay, đáng lưu ý nhất là nhóm vi khuẩn họ đường ruột. Phổ biến nhất là Escherichia coli, Klebsiella spp. và Proteus spp. với sự gia tăng đề kháng qua các năm. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự đề kháng kháng sinh nhóm Cephalosporins là do vi khuẩn sinh ra enzyme β-lactamase. Đặc biệt, việc sinh enzyme β-lactamase phổ rộng (Extended - Spectrum - β - lactamase: ESBL) là một cơ chế quan trọng trong việc giúp vi khuẩn chống lại các Penicilin, Cephalosporin thế hệ 3,4 và Monobactam. Vì vậy, sự lựa chọn kháng sinh ban đầu hiện nay là lựa chọn các kháng sinh phổ rộng đủ mạnh, bao phủ phần lớn các tác nhân gây bệnh. Sau khi có kết quả kháng sinh đồ
2 sẽ điều chỉnh lại cho phù hợp, đảm bảo tính hiệu quả, ít tốn kém và giảm sự phơi nhiễm của các kháng sinh. Tại Việt Nam, tình trạng này đang diễn ra một cách nghiêm trọng hơn khi việc mua thuốc mà không cần có đơn đang được diễn ra một cách dễ dàng tại các quầy thuốc tư nhân. Bên cạnh đó, ở một số phòng khám tư đã nắm bắt được tâm lý muốn nhanh khỏi bệnh của bệnh nhân đã kê các kháng sinh liều cao, đắt tiền. Bệnh sẽ khỏi nhanh hay là triệu chứng bệnh sẽ giảm nhanh. Điều này đã chứng minh rõ vì sao tổ chức Y tế thế giới đã xếp Việt Nam vào những nước có tỉ lệ kháng thuốc kháng sinh cao nhất thế giới. Chính những tác hại do vi khuẩn đường ruột sản sinh ra ESBL gây ra ảnh hưởng rất nhiều đến sức khỏe cộng đồng[24]. Đặc biệt, tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên là một trong số những bệnh viện lớn trong khu vực Phía Đông Bắc Việt Nam, tập trung nhiều bệnh nhân nặng và là tuyến cuối của các bệnh viện cơ sở trong khu vực nên là nơi nghi ngờ sẽ có khả năng kháng thuốc cao. Xuất phát chính từ những tác nhân đó và muốn tìm hiểu sâu hơn về vi khuẩn đường ruột sinh ESBLmà nhóm nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại Khoa Vi sinh Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên”. 1.2 Mục tiêu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của vi sinh vật đường ruộtđược phân lập từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa Vi sinh, Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. 1.2.2 Mục tiêu cụ thể -Khảo sát tỉ lệ các chủng vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp trong bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. -Khảo sát tỉ lệ vi khuẩn Gram âm đường ruột sinh ESBL. -Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của các vi khuẩn trên.
3 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học -Đánh giá được thực trạng của vi khuẩn đường ruột kháng thuốc. -Cung cấp tư liệu về vi khuẩn kháng thuốc phục vụ các nghiên cứu sâu hơn về vi sinh vật kháng thuốc và trong điều trị bệnh liên quan đến vi khuẩn đường ruột. 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Xây dựng kháng sinh đồ cho những bệnh nhân cụ thể góp phần xây dựng chế độ hóa trị liệu liên quan cho bệnh nhân, góp phần hạn chế sự lây lan của của vi khuẩn Escherichia coli, Klebsiella spp. và Proteus spp. sinh ESBL ngoài cộng đồng.
4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về vi khuẩn 2.1.1Vi khuẩn Vi khuẩn là nhóm các sinh vật đơn bào, kích thước nhỏ, cấu tạo tế bào nhân sơ (Procaryote), có hình cầu (cầu khuẩn), hình que (trực khuẩn), hình xoắn (xoắn khuẩn)[1]. Vi khuẩn (Bacteria) theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là cái gậy. Được hiểu theo nghĩa rộng bao gồm các vi sinh vật thuộc ngành Bacteria. Theo nghĩa hẹp thì không bao gồm các vi khuẩn nhầy, xạ khuẩn, xoắn thể, Ricketxi, Mycoplasma[1]. Nhóm trực khuẩn được chia thành hai loại là Gram âm và Gram dương, nhóm Gram âm bao gồm các vi khuẩn thuộc họ đường ruột là phổ biến nhất. 2.1.2Vi khuẩn đường ruột Ở người tập trung rất nhiều loại vi khuẩn họ đường ruột, nhưng đông nhất vẫn là ở hệ tiêu hóa cụ thể là ở trong ruột người.Căn cứ theo đặc tính gây bệnh của vi khuẩn đường ruột người ta chia thành 2 nhóm: -Nhóm vi khuẩn gây bệnh đây là nhóm vi khuẩn có thể gây ra bệnh[2]. -Nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội đây là nhóm gây bệnh gây khi hệ thống miễn dịch của cơ thểbị suy yếu hoặc hoặc do tăng độc lực của các loài vi khuẩn[2]. Đặc điểm sinh học Hình thể: Vi khuẩn đường ruột có hình thể dạng que, dài khoảng 1-5µm, thường có flagella, không sinh bào tử, oxydase âm tính. Hầu hết các loài trong nhóm này có peritrichous type I fimbriae tham gia vào việc bám dính của tế bào vi khuẩn vào ký chủ[4]. Chỉ có một số ít vi khuẩn họ đường ruột là có lông và có vỏ. Về vị trí phân loại thì thuộc giới Bacteria, ngành Proteobacteria, lớp Gramma Proteobacteria, bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae[4].Vi khuẩn họ đường ruột có rất nhiều loại phổ biến gây bệnh trên người, nhưng trong số đó thì phổ biến nhất vẫn là Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp.
5 Tính chất nuôi cấy: Các vi khuẩn đường ruột đều nuôi cấy dễ trên môi trường thông thường. Trong môi trường lỏng có thể lắng cặn hoặc làm đục môi trường, có thể vừa làm đục môi trường vừa có cặn ở đáy ống, cũng có thể tạo váng trên bề mặt[3]. Trên môi trường đặc có ba dạng khuẩn lạc là[3]: + Dạng S: Khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng + Dạng R: Mặt khô, xù xì, thường gặp khi nuôi cấy giữ chủng + Dạng M: Khuẩn lạc nhày, kích thước lớn hơn khuẩn lạc dạng S, các khuẩn lạc thường có xu hướng hòa vào nhau. Hình thức phát triển này thường gặp ở những vi khuẩn có khả năng tạo thành vỏ. Tính chất sinh hóa: Vi khuẩn đường ruột có một số tính chất về sinh hóa như sau: có thể di động hoặc không di động. Quá trình lên men một số loại đường có thể xảy ra hoặc không. Hai loại đường được xác định dễ thực hiện lên men nhất là glucose và lactose. Nếu vi khuẩn không lên men đường glucose thì không thuộc họ vi khuẩn đường ruột. Bên cạnh đó, còn có việc sinh hơi hay không sinh hơi khi lên men đường. Có hay không có một số enzyme. Ba loại enzyme thường được xác định nhất là: oxydase, urease, tryptophanease (sinh indole). Trong đó nếu oxydase dương tính thì không thuộc họ vi khuẩn đường ruột. Khả năng sinh sulfua hidro (H2S) khi dị hóa protein, acid amin hoặc các chất dẫn có lưu huỳnh. Phát triển được hay không phát triển được trên một số môi trường tổng hợp tối thiểu[4]. Trong đó, khả năng sử dụng Citrate là nguồn cung cấp carbon duy nhất có trong môi trường Simmon thường được thử nghiệm nhất[3].Chính vì những tính chất này, đã giúp cho việc xác định vi khuẩn đường ruột được diễn ra một cách dễ dàng hơn. Bảng 1.1. Tính chất sinh hóa của một số loại vi khuẩn đường ruột thường gặp G GAS H2S MR VP IND CIT URE LYS PAD Escherichia + + - + - + - - + - coli Klebsiella + + - - + - + + + - pneumoniae Proteus spp. + +/- + + - + -/+ + - +
6 Kháng nguyên Đối với kháng nguyên thường có 3 loại kháng nguyên như sau: O (thân), H (roi- flagellar) và K (vỏ capsular)[3]. -Kháng nguyên O: là kháng nguyên thân của vi khuẩn. Đây là thành phần kháng nguyên của thành tế bào. Thành phần gồm: lipopolysaccarie (LPS), lipoprotein và peptidoglycan. LPS là kháng nguyên vách chủ yếu của vi khuẩn đường ruột chính là nội độc tố[4]. Kháng thể chủ yếu của kháng nguyên O là IgM. -Kháng nguyên H: là kháng nguyên lông của tế bào vi khuẩn nên chỉ có ở các loài vi khuẩn có lông. Kháng nguyên H có bản chất là protein. Kháng thể chủ yếu của kháng nguyên H là IgG. Yếu tố quyết định trong kháng nguyên H là chức năng của trình tự chuỗi acid amin trong protein flagellar (flagellin). -Kháng nguyên K: là kháng nguyên vỏ hoặc màng bọc nằm bên ngoài kháng nguyên thân. Bản chất hóa học là protein hoặc polisaccharide. Nó có thể dưới dạng một lớp vỏ dày, quan sát được dưới kính hiển vi quang học thông thường hoặc một lớp rất mỏng chỉ có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử. Khả năng gây bệnh Các vi khuẩn đường ruột chủ yếu gây bệnh ở đường tiêu hoá như tiêu chảy, viêm ruột ỉa chảy, viêm đại tràng. Mỗi loài vi khuẩn có thể gây bệnh ở các vị trí khác nhau trên đường tiêu hoá và cơ chế gây bệnh cũng khác nhau. 2.1.2.1 Escherichia coli Escherichia coli (viết tắt: E. coli) hay trực khuẩn lị là một loài vi khuẩn Gram âm. Ngoài ra, E. coli còn được biết đến là vi khuẩn đại tràng. Là vi khuẩn sống cộng sinh, chiếm 80% vi khuẩn ở ruột. Vi khuẩn tổng hợp ra một số vitamin B, K, E và giữ cân bằng quần thể vi khuẩn đường ruột[3]. Đặc điểm sinh học: Hình thể Vi khuẩn E. coli có kích thước trung bình 2- 3µm x 0,5 µm, trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ: môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ. Rất ít chủng vi khuẩn E. coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di
7 động. Về vị trí phân loại, loại vi khuẩn này thuộc họ Enterobacteriaceae, chi Escherichia và loài E. coli[3]. Đề kháng Chủng vi khuẩn này có sức đề khángkhá kháng yếu dao động từ 55 - 60oC trong vòng 30 phút và dễ bị diệt bởi hoá chất khử trùng thông thường[3]. Tính chất nuôi cấy Là một loại vi khuẩn dễ nuôi, ưa khí và kỵ khí, nhiệt độ thích hợp 5 - 40oC, pH 5,5 - 8. Nếu trên môi trường lỏng sẽ làm đục môi trường và tạo thành váng mỏng hoặc vòng trắng quanh ống nghiệm. Môi trường đặc sẽ có khuẩn lạc dạng S, màu trắng, những ngày sau khuẩn lạc chuyển sang màu xám xanh, mọc lan rộng ra xung quanh. Có thể gặp khuẩn lạc R hoặc M[3]. Đặc tính sinh hóa Thực hiện quá trình lên men nhiều loại đường (glucose, lactose, mantose). Bên cạnh đó còn sinh ra gas, không sinh H2S, có thể khử nitrat thành nitrit, phản ứng indole dương, MR dương, VP âm, Citrat âm, PAD âm[4]. Kháng nguyên Vi khuẩn E. coli có các loại kháng nguyên như sau: kháng nguyên O, kháng nguyên K, kháng nguyên H. Khả năng gây bệnh Trong số vi khuẩn hiếu khí đường tiêu hóa, E. coli chiếm tỉ lệ cao nhất (khoảng 80%) và sống nhiều nhất trong ruột già, nó đứng hàng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật. Mức độ kháng thuốc Vi khuẩnE. coli thường sản xuất enzyme β-lactamase thông thường và một số chủng sinh enzyme β-lactamase phổ rộng (ESBL). 2.1.2.2 Klebsiella spp. Klebsiella spp. được phát hiện đầu tiên vào thế kỉ 19 bởi nhà vi sinh vật học người Đức - Edwin Klebslà một giống trực khuẩn không di động. Đây là một mầm bệnh thường trực với con người, các chủng Klebsiella gây ra nhiều chứng bệnh đặc biệt như nhiễm trùng đường nước tiểu,
8 Đặc điểm sinh học Hình thể Các vi khuẩn thuộc giống Klebsiella spp. có hình que, kích thước trung bình 0,3 - 1 x 0,6 - 6 µm, thường không có lông nên không di động, có vỏ dày, kích thước có thể gấp 2-3 lần tế bào vi khuẩn. Vỏ của Klebsiella spp.có bản chất là polysaccharide được cấu tạo bởi nhiều loại monosaccharide như: L - fructose, L - rhamnose, D - mannose, D - glucose, D - galactose, D - glucuromic acid hoặc D- galacturomic acid, một số chủng có thêm nhóm O - acetyl và pyruvate. Vỏ có tính ưa nước[3]. Vị trí phân loại: Các loài vi khuẩn thuộc chủng này có họ Enterobacteriaceae, thuộc chi Klebsiella. Và bao gồm các loài:Klebsiella pneumoniae, Klebsiella gramanulomatis, Klebsiella ozaenae, Klebsilla rhinoscleromatis, Klebsiella oxytoca, Klebsiella ornitholytica, Klebsiella planticola, Klebsiella terrigena. Trong số các loài của chi Klebsiella thì Klebsiella pneumoniae có tầm quan trọng nhất và được chọn làm đại diện điển hình của chi này. Đặc tính sinh hóa Thực hiện quá trình lên men nhiều loại đường (glucose, lactose, mantose), đồng thời cũng sinh ra khí gas mạnh, không sinh H2S, MR âm, VP dương, phản ứng indol âm, Citrat dương, chuyển hóa nitrat thành nitrit, PAD âm[4]. Kháng nguyên Các loài thuộc giống Klebsiella chỉ có 2 loại kháng nguyên đó là kháng nguyên O và kháng nguyên K[3]. Khả năng gây bệnh Klebsiella có trong hệ vi khuẩn bình thường ở ruột người trưởng thành, ngoài ra cũng tìm thấy trong hệ hô hấp. Chủ yếu gây bệnh cơ hội ở cộng đồng hoặc trong bệnh viện, là một trong những nguyên nhân gây nhiễm trùng bệnh viện thường gặp. Trong đó, Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca là hai giống thường gặp nhất trong các tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện. Hầu hết các cơ quan đều có thể bị nhiễm trùng doK. pneumoniae là một căn nguyên gây viêm phổi đã được nói đến từ
9 lâu, bệnh thường gặp ở trẻ sơ sinhtỉ lệ tử vong rất cao nếu không được điều trị sớm. Ngoài ra nó còn có khả năng gây nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xoang, viêm nhiễm khuẩn đường tiết niệu, áp xe gan. Thời gian nằm viện kéo dài, sử dụng kháng sinh phổ rộng và điều trị tại các khoa chăm sóc đặc biệt là các yếu tố nguy cơ nhiễm Klebsiella spp.[4]. Mức độ kháng thuốc Cũng như các loài kháng trong họ đường ruột, Klebsiella spp. kháng cao với ngoại cảnh và kháng sinh. Hiện nay,Klebsiella spp. là một trong những nguyên nhân quan trọng trong nhiễm khuẩn bệnh viện và nhiễm khuẩn mắc phải trong cộng đồng vì tính đa kháng thuốc do tiết enzyme ESBL. 2.1.2.3 Proteus spp. Vi khuẩn Proteus spp. sinh sống trong đường ruột, hốc tự nhiên của cơ thể và trong môi trường. Proteus spp.cũng là nguyên nhân hay gặp gây các vụ ngộ độc thực phẩm. Ngoài gây bệnh đường ruột, vi khuẩn này còn có thể gây ra nhiễm khuẩn trên nhiều cơ quan khác trên cơ thể. Đặc điểm sinh học Hình thể Chủng vi khuẩnProteus spp.thường có lông xung quanh thân do đó có khả năng di động[3]. Vị trí phân loại Là một loại vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, chi Proteus gồm một số loại vi khuẩn cho chủng Proteus spp.điển hình như:Proteus vulgaris, P. mirabillis, P. morganii, P. rettgeri. Đặc tính sinh hóa Thực hiện quá trình lên men một số loại đường có sinh ra hơi. Không thực hiện lên men lactose. Có khả năng khử amin đối với phenylalamine và tryptophan (PAD dương), Oxydase âm, phenylalanine dương, urease dương, H2S dương[4]. Kháng nguyên Vi khuẩnProteus spp.cũng giống như chủng vi khuẩnKlebsiella spp.chỉ có hai loại kháng nguyên là kháng nguyên O và kháng nguyên H[4]. Khả năng gây bệnh
10 Proteus spp. phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có thể phân lập được từ phân của nhiều loài động vật và từ phân của người bình thường. Chúng là vi khuẩn gây bệnh cơ hội, chủ yếu là gây nhiễm trùng bệnh viện. Trong các nhiễm khuẩn do chúng gây ra, nhiễm trùng đường tiết niệu chiếm tỉ lệ cao nhất. Ngoài ra chúng có thể gây viêm tai giữa, nhiễm khuẩn huyết, viêm mủ vết thương[4]. Mức độ kháng thuốc Proteus spp. còn khá nhạy cảm với các kháng sinh thuộc nhóm β-lactamase. 2.2 Tổng quan về các kháng sinh thuộc nhóm β - lactam Các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam là một trong những nhóm kháng sinh quan trọng nhất cả về mặt lịch sử lẫn y học. Nhóm kháng sinh này bao gồm các chất chứa vòng β-lactam (vòng amid 4 cạnh) và có cấu trúc nhân cơ bản như trong bảng[9][10]. Bảng 1.2. Các nhân cơ bản của kháng sinh thuộc nhóm β-lactam Tên nhân Cấu trúc hóa Kháng sinh đại diện học chung Ampicillin Nhân Penam Các penicillin tự nhiên và Amoxcillin bán tổng hợp Penicillin V Các penicillin kháng β- lactamase Acid clavulanic Nhân Clavam Các penicillin kháng β- Sulbactam lactamase Tazobactam Nhân Cephem Cefadroxil Các cephalosporin và Cefaclor cephamycin Cephalexin Cefixim Ceftibulen Nhân carbapenem Các carbapenem bán tổng imipenem, hợp meropenem Nhân monobactam Aztreonam hay β-lactam
11 2.2.1 Phân loại kháng sinh thuộc nhóm β-lactam Theo cấu trúc hóa học của kháng sinh thuộc nhóm β-lactam được chia thành 4 loại:Penicillin, Cephalosporin, Carbapenem, Monobactam. 2.2.1.1 Penicillin Nhóm kháng sinh này gồm có cấu tạo gồm 2 vòng β-lactam nối với vòng thiazolidin chỉ khác nhau ở gốc R của mạch ngang. Đối với các Penicillin kháng β-lactamase: Điển hình ở đây là Acid clavulanic - một kháng sinh phổ rộng có hoạt tính kháng β-lactamase, tác dụng lên nhiều loại vi khuẩn cả Gram dương và Gram âm, đặc biệt có tác dụng ức chế mạnh β-lactamase truyền qua plasmid gây kháng penicillin và cephalosporin. Do đó, acid calvulanic thường được sử dụng kết hợp với các loại kháng sinh khác để tăng hiệu quả trong việc chống lại các vi khuẩn sinh β- lactamase mạnh. Đặc biệt là chống lại các vi khuẩn kháng penicillin và cephalosporin. Sulbactam và tazobactam tương tự cũng là những chất kháng sinh được dùng kết hợp với các kháng sinh khác trong việc chống lại các vi khuẩn kháng thuốc[5]. 2.2.1.2 Cephalosporin Nhóm kháng sinh Cephalosporin là nhóm thuốc quan trọng nhất trong các thuốc kháng sinh hiện nay. Nhóm này đứng thứ 7 trong số 10 loại thuốc được sử dụng nhiều nhất để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn[5].Cephalosporin và cephamycin có cấu trúc gồm vòng β-lactam liên kết với dị vòng dihyrothiazin (nhân cephem). Các cephamycin khác với cephalosporin ở nhóm –OCH3 tại vị trí CR7 (R2). 2.2.1.3 Carbapenem Nhóm Carbapenem là loại kháng sinh có cấu trúc vòng β-lactam có hoạt động kháng khuẩn rộng đặc biệt chống lại hầu hết các β-lactamase. Carbapenem được phát triển từ thienamycin được phát hiện ở Streptomyces cattleya vào năm 1976. Do đó, carbapenem được coi là kháng sinh cuối cùng trong các loại thuốc chống lại các vi khuẩn kháng thuốc. Carbepenem có cấu trúc gần giống penicilline nhưng thay thế carbon cho phân tử lưu huỳnh ở vị trí số1 [5].
12 2.2.1.4 Monobactam Monobactam cũng là chất kháng sinh có cấu trúc vòng β-lactam mà không có vòng thứ hai thiazolidine 5 cạnh của nhóm Penicillin, hay vòng 6 cạnh dihydrothiazine của cephalosporin. Monobactam chỉ có tác dụng với các loại vi khuẩn Gram âm. Được dùng rộng rãi hiện nay với tên aztreonam (Azactam). 2.2.2 Cơ chế tác dụng Cơ chế tác dụng chung của nhóm kháng sinh này là tác động lên thành tế bào của vi khuẩn. Khác với tế bào nhân thực, tế bào vi khuẩn có áp suất thẩm thấu bên trong tế bào cao hơn nên chúng có thành bao bọc bên ngoài tế bào. Thành tế bào có cấu tạo là peptidoglycan (mucopeptit, murein) gồm nhiều chuỗi polysaccharide thẳng dọc và những đoạn ngang penta - peptide. Polysaccharide gồm nhiều phân tử đường chứa gốc amin: N - acetyl - glucosamine và N - acetyl - muramic. Các β-lactam ức chế có chọn lọc sự tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn từ đó ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Đầu tiên β-lactam bám vào các thụ thể PBPs (Penicillin biding proteins). Có khoảng 3 đến 6 PBPs, một trong số đó là các enzyme transpeptidase. Sau khi các β-lactam gắn vào một hay nhiều thụ thể thì làm cho quá trình transpeptidation bị ức chế và ngăn chặn việc tổng hợp peptidoglycan, một thành phần quan trọng của thành tế bào[6]. Khi thiếu sự tạo thành peptidoglycan một cách chính xác thì tế bào vi khuẩn đang sinh trưởng sẽ có một thành tế bào yếu ớt, kém đề kháng với áp suất thẩm thấu. Màng tế bào bị phồng ra ở các phần bị yếu đi khi nước chuyển vào tế bào và cuối cùng tế bào bị vỡ ra. Giai đoạn này có liên quan tới việc hoạt hóa các enzyme tự tiêu (autolytic enzyme) gây ra sự ly giải của tế bào ở môi trường đẳng trương. Trong môi trường ưu trương những tế bào bị biến đổi thành protoblast hay spheroblast chỉ được bao bọc bởi một màng tế bào nên rất dễ vỡ. Tuy nhiên, các loại kháng sinh thuộc nhóm β-lactam chỉ ngăn cản vi khuẩn tăng số lượng nguyên liệu thành tế bào song không có tác dụng lên phần peptidoglycan có sẵn, nên chúng chỉ tác động lên các tế bào đang sinh trưởng hoặc
13 sinh sản, các tế bào nghỉ không bị ảnh hưởng. Dĩ nhiên, chúng không ảnh hưởng lên tế bào động vật và thực vật vì các loại tế bào này không mang thành tế bào chứa peptidoglycan. 2.3 Tổng quan về đề kháng kháng sinh của vi khuẩn 2.3.1 Định nghĩa Kháng sinh có tác dụng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn nhưng trong môi trường có kháng sinh mà vi khuẩn vẫn phát triển thì được coi là sự đề kháng kháng sinh[7]. 2.3.2 Phân loại Kháng sinh được chia ra làm hai nhóm là: Đề kháng tự nhiên: Đề kháng tự nhiên là khả năng đã được hình thành ở mầm bệnh ngay khi chúng chưa tiếp xúc với môi trường chưa có kháng sinh. Nguyên nhân: Có thể đột biến ngẫu nhiên trong nhiễm sắc thể làm cho quần thể vi sinh vật gây bệnh xuất hiện các chủng khả năng kháng thuốc. Khi bệnh nhân được điều trị trong thời gian nhất định thì chỉ có các chủng bình thường bị tiêu diệt, còn những chủng kháng thuốc sẽ sống sót, tiếp tục sinh trưởng, phát tiển. Cuối cùng làm thay đổi hoàn toàn bản chất vi sinh của bệnh và vô hiệu hóa tác dụng điều trị của kháng sinh đồ[7][8]. Ví dụ: E. coli không chịu tác dụng của Erythomycin, Đề kháng thu được: Đề kháng thu được là khả năng kháng thuốc của vi sinh vật xuất hiện sau khi chúng tiếp xúc với kháng sinh. Với nguyên nhân là do biến cố di truyền mà vi khuẩn từ chỗ không có trở nên có gen đề kháng với kháng sinh. Những biến cố này bao gồm biến đổi gen và nhận được gen kháng thuốc[7][8]. Ví dụ: Samonella kháng Cloramphenicol 2.3.3 Cơ chế đề kháng kháng sinh Vi khuẩn sẽ tạo ra một số enzyme làm biến đổi hoặc phá hủy cấu trúc hóa học của phân tử kháng sinh.Ví dụ: β-lactamase phá vỡ các vòng β-lactam của penicillin và các phân tử tương tự, biến nó thành dạng không hoạt động. Người ta đã xác định
14 được trên 200 loại lactamase khác nhau. Các gen quy định chúng thường nằm trên plasmid R[9][10]. Hình 1.1. Hoạt động phân giải penicillin của penicillinase[24]. Các tác nhân gây bệnh khi mà có sự đề kháng sẽ làm chậm hoặc là ngăn chặn hoàn toàn sự xâm nhập của kháng sinh vào bên trong tế bào. Cơ chế này thường có liên quan đến những sự thay đổi trong cấu trúc hoặc điện tích của các protein màng tế bào chất tạo nên các kênh hay các lỗ. Các protein này nằm trong màng ngoài của vi khuẩn Gram âm gọi là các porin.Các protein porin bị thay đổi bắt nguồn từ những thay đổi trong các gen nhiễm sắc thể. Các tác nhân gây bệnh khi mà cósự đề kháng, có thể làm thay đổi thụ thể đối với thuốc do vậy nó không thể gắn vào hoặc liên kết một cách hiệu quả tới đích của nó. Dạng đề kháng này thường gặp trong trường hợp chống lại các chất kháng trao đổi chất (như sunfonamit) và kháng lại các thuốc (như erythromycin) cản trở sự dịch mã[9][10]. Hình 1.2. Cơ chế làm thay đổi thụ thể đối với thuốc[24]. Vi khuẩn thay đổi đường chuyển hóa làm cho thuốc kháng sinh không tác dụng được vào quá trình chuyển hóa của vi khuẩn. Chẳng hạn, một tế bào có thể trở thành đề kháng với một loại thuốc nhờ sinh ra nhiều phân tử enizim hơn đối với con đường trao đổi chất bị tác động. Một cách khác, các tế bào trở nên đề kháng với các
15 sunfonamit bằng cách từ bỏ sự tổng hợp axid folic, thay vào đó chúng hấp thụ acid này từ ngoài môi trường[9][10]. Hình 1.3. Cơ chế thay thế con đường trao đổi chất[24]. Các tế bào đề kháng có thể bơm thuốc ra khỏi tế bào trước khi thuốc có thể gây tác dụng[9][10]. Hình 1.4. Cơ chế bơm thuốc ra khỏi tế bào[24]. 2.3.4 Các biện pháp hạn chế sự gia tăng kháng kháng sinh Một số biện pháp đã được đưa ra nhằm hạn chế sự gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh như sau: -Chỉ dùng kháng sinh để điều trị những bệnh truyền nhiễm. -Chọn kháng sinh theo kết quả của kháng sinh đồ (lưu ý: nên ưu tiên các loại kháng sinh có tác dụng đặc hiệu trên vi khuẩn gây bệnh và có sự khuếch tán tốt nhất đến vi khuẩn). -Dùng kháng sinh với một liều lượng vừa đủ và trong thời gian phù hợp (áp dụng cho một đợt điều trị). -Duy trì thường xuyên việc giám sát sự phát triển đề kháng kháng sinh của vi khuẩn để từ đó sẽ đưa ra được chiến lược phù hợp nhất.
16 2.4 Tổng quan về ESBL 2.4.1 Nguồn gốc về ESBL ESBLlà loại enzyme do vi khuẩn sản xuất ra nhằm chống lại sự càn quét của các loại thuốc kháng sinh trị bệnh, có nguồn gốc từ đột biến của β-lactamase do cephalosporins thế hệ 3 cảm ứng tạo thành. Những đột biến này do sự thay đổi ở một nhóm khoảng từ 1 đến 7 acid amin nằm gần trung tâm hoạt động của enzyme. Những thay đổi trên đã tạo ra trung tâm hoạt động của enzyme linh hoạt hơn, tiến hóa hơn. Vì thế tăng ái lực và tăng hoạt động thủy phân đối với cephalosporins thế hệ 3 (như ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone, ) và monobactams (aztreonam). 2.4.2Phân loại Hầu hết ESBL bắt nguồn từ enzyme TEM và SHV.Hiện nay đã có hơn 90 loại enzyme loại TEM và 25 enzyme loại SHV. TEM và SHV thường được tìm thấy ở E. coli và K. pneumoniae. Tuy nhiên, chúng cũng có thể được tìm thấy ở Proteus spp và các chủng vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae[25]. TEM: TEM-1 là loại β-lactamase thường gặp ở vi khuẩn Gram âm. Hơn 90 chủng E. coli kháng lại với ampicillin là nhờ có TEM-1. TEM-1 có khả năng thủy phân penicillin và các cephalosporins thế hệ 1 như cephalothin và cephaloridine. TEM-2 là dẫn xuất đầu tiên của TEM-1, có sự thay thế 1 acid amin so với β-lactamase nguyên thủy. TEM-3 được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1989, là loại TEM - β-lactamase đầu tiên bộc lộ kiểu hình của ESBL[28]. TEM-3 có khả năng phân giải cephalosporin phổ rộng. Sau đó, hơn 130 β- lactamase TEM được mô tả[27]. Mặc dù β-lactamase là loại TEM thường tìm thấy nhiều nhất ở chủngE. coli vàK. pneumoniae, nhưng chúng cũng được tìm thấy ở những chủng vi khuẩn Gram âm khác và tần số này ngày càng gia tăng. SHV: SHV - 1 thường được tìm thấy ởK. pneumoniae, và chính nó đã gây ra hơn 20% sựđề kháng ampicillin qua trung gian plasmid ở chủng này.Không như TEM-1, SHV- 1 chỉ có vài dẫn xuất. Phần lớn các SHV khác nhau mang kiểu hình ESBL được đặc trưng
17 bởi sự thay đổi acid amin tại vị trí 238, thay serine bằng glycine[28]. Bảng 1.3. Các lớp ESBL chính[26]. Lớp Nguồn gốc Các biến thể Các đột biến TEM penicillinase, nguồn gốc TEM (A) Trên 100 không rõ, các thay thế 1 – 7 acid amin Các đột biến SHV penicillinase, ở K. SHV (A) pneumoniae thì xuất phát Trên 50 từ nhiễm sắc thể; thay thế ≥ 1 acid amin Ở Kluyvera spp. hầu hết hay tất cả các phân lớp đều Trên 40, trong 5 phân CTX-M (A) xuất phát từ nhiễm sắc thể, lớp rồi được chuyển động nhờ các chuyển động chèn Đột biến OXA - 2, được OXA-15 (D) biết từ lâu là penicillinase 1 có nguồn ngốc không rõ Đột biến OXA - 10 (=PSE OXA-11, 14, 15, 16, 17 - 2), được biết từ lâu là > 5 (D) penicillinase có nguồn ngốc không rõ Ngày nay, phần lớn các SHV có kiểu hình của ESBL. Tuy nhiên, duy nhất SHV-10, được báo cáo là có kiểu hình đề kháng - ức chế. Enzyme này có nguồn gốc từ SHV-5 và chứa thêm một glycine thay cho serine 130[26]. Phần lớn SHV được tìm
18 thấy ở chủng K. pneumoniae. CTX-M: Đây là loại enzyme qua trung gian plasmid và có khả năng phân giải mạnh cefotaxim. Enzyme này chủ yếu được tìm thấy ở E. coli, nhưng cũng được mô tả ở những chủng khác của họ Enterobacteriaceae. Sự mở rộng hoạt tính của CTX-M.ESBL đề kháng với cephalosporin phổ rộng không liên quan đến việc thay đổi một vài acid amin như TEM hay SHV. Mà là do phần còn lại của serine ở vị trí 237, hiện diện ở tất cả các CTX-M. Năm 2006 phát hiện CTX-M-15 phổ biến ở chủng E. coli ở Anh và lan rộng khắp thế giới.Hiện nay, có trên 40 loại CTX-M[25]. OXA: Enzyme có tên là OXA vì có liên quan đến khả năng thủy phân oxacillin. Đây là enzyme khác với TEM và SHV về cấu trúc phân tử (thuộc lớp D) và chức năng (thuộc nhóm 2d)[27]. Chúng đề kháng với ampicillin, cephalothin, hoạt động thủy phân mạnh oxacillin, cloxacillin ít bị ức chế bởi acid clavulanic. Trong khi hầu hết các ESBL được tìm thấy ở E. coli, K. pneumoniae. 2.4.3 Phương pháp phát hiện Nguyên tắc xét nghiệm ESBL trong vi sinh lâm sàng gồm 2 bước[13]: -Bước 1: Xét nghiệm sàng lọc -Bước 2: Xét nghiệm xác định Xét nghiệm sàng lọc: Chọn lựa cephalosporin(s) chỉ điểm. Mục đích là khảo sát sự đề kháng hay giảm nhạy cảm trong những xét nghiệm sàng lọc với cephalosporin(s) chỉ điểm, nhờ đó phát hiện các chủng có thể có ESBL[11].Do đó, nếu càng sử dụng nhiều cephalosporin thì càng có nhiều cơ hội phát hiện những kiểu kháng thuốc ít gặp. Các kháng sinh được khuyên dùng để thử nghiệm các chủng thuộc họ Enterobacteriaceae là cefpdoxime, ceftazidime, aztreonam, cefotaxim và ceftriaxone. Nếu đường kính vòng vô khuẩn nhỏ hơn hoặc bằng điểm gãy (BP: Breakpoint) của một trong những kháng sinh ở trên thì có thể chỉ điểm chủng vi khuẩn sinh ESBL. Khi đó, sẽ làm tiếp bước 2. Xét nghiệm xác định: Xét nghiệm xác định ESBL dựa vào tìm kiếm sự cộng hưởng giữa oxymino-cephalosporin và clavulanate. Nhờ đó phân biệt các chủng
19 ESBL (cộng hưởng dương) khỏi các chủng kháng thuốc vì nhiều lý do khác (cộng hưởng âm), vì clavulanate có tác dụng ức chế ESBL. Nhiều phương pháp phát hiện ESBL được đề nghị dựa trên nguyên tắc đĩa khuyếch tác của Kirby - Bauer. Hiện nay, các phương pháp cộng hưởng đang được sử dụng rộng rãi là: Phương pháp đĩa đôi, phương pháp đĩa kết hợp và phương pháp E - test. -Phương pháp đĩa đôi: Phương pháp này được mô tả bởi Jarlier và cộng sự (1988).Dựa trên nguyên tắc clavulanic acid ức chế ESBL nên làm giảm mức độ đề kháng của cephalosporins và mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh cephalosporins khi đặt gần một đĩa kháng sinh chứa clavulanic acid[11]. Vi khuẩn được cấy trên đĩa thạch Mueller - Hinton. Đặt đĩa cephalosporin (30µg) với đĩa amoxicillin-clavulanate (20µg) cách nhau 20 - 25mm trên mặt thạch. Trước đây,khoảng cách yêu cầu là 30mmnhưng hiện naykhoảng cách được giảm xuống để tăng độ nhảy cảm của phương pháp. Có cộng hưởng khi có sự mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporin ở vùng giao tiếp với đĩa chứa clavulanate. Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện. Nhưng khuyết điểm là có thể bỏ sót một số chủng vi khuẩn có ESBL. -Phương pháp đĩa kết hợp[11]: Phương pháp này được Jacoby và Hans mô tả lần đầu tiên vào năm 1999. Bằng cách sử dụng hai loại đĩa kháng sinh là cephalosporins thế hệ 3 và cephalosporins thế hệ 3 tương ứng phối hợp với clavulanic acid. Vi khuẩn tiết ESBL khi hiệu số đường kính vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporins có phối hợp với clavulanic acid so đĩa cephalosporins ≥5mm. Các loại đĩa kháng sinh được sử dụng là cefotaxime (30µg)/cefotaxime - clavulanic acid (30/10µg),ceftazidime (30µg)/ceftazidimeclavulanic acid (30/10µg), cefpodoxime (10 µg)/cefpodoxime (10/10 µg). Tiêu chuẩn CLSI yêu cầu mới phương pháp này cần phải thực hiện đồng thời trên cả hau hệ thống là: cefotaxime (30µg)/cefotaxime - clavulanic acid (30/10µg); ceftazidime (30µg)/ceftazidime-clavulanic acid (30/10µg). Phương pháp này dễ thực hiện và ít tốn kém nhưng yêu cầu phòng thí nghiệm phải có đĩa kháng sinh cefotaxime - clavulanic acid và ceftazidime-clavulanic acid. Một số trường hợp cho kết quả
20 dương tính giả do một số vi khuẩn sinh AmpC cũng xuất hiện sự gia tăng đường kính vòng vô khuẩn khi có clavulanic acid. -Phương pháp E - test: Dùng que E - test (AB Biodisk, Solna, Sweden), một đầu là dãy chứa nồng độ của cephalosporin và đầu đối diện là dãy nồng độ của cephalosporin/clavulanic acid. Khi đầu chứa clavulanic acid cho MIC giảm ≥ 8 lần so với đầu còn lại thì suy ra được rằng vi khuẩn có sinh ESBL. Phương pháp này cho kết quả chính xác nhưng giá thành khá cao. 2.4 Tình hình nghiên cứu các họ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL trên thế giới và tại Việt Nam 2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới kể từ khi hiện tượng ESBL bắt đầu xuất hiện ở Tây Âu cho đến nay đã được phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới như Mỹ, Châu Á. Tần suất xuất hiện vi khuẩn sinh ESBL thay đổi tùy theo quốc gia, viện nghiên cứu. Vấn đề kháng thuốc kháng sinh đã trở thành vấn đề đáng báo động trên toàn cầu. Gánh nặng về chi phí điều trị do kháng kháng sinh gây ra khá là lớn, do việc thay thế cá kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới, đắt tiền. Ở Mỹ, tỉ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL thay đổi từ 0 - 25% tùy theo từng viện nghiên cứu, với tỉ lệ quốc gia chung là khoảng 3% Một nghiên cứu của SENTRY đã chỉ ra rằng, tỉ lệ K. pneumoniae ở Mỹ sinh ESBL là 7,6 % so với 4,9% ở Canada. Tỉ lệ E. coli sinh ESBL là 4,2% ở Mỹ và 3,3% ở Canada. Một nghiên cứu của Moland và các cộng sự vào năm 2001 - 2002 trên khắp nước Mỹ đã chỉ ra rằng tỉ lệ sinh ESBL ở K. pneumoniae là 11,3% và ởE. coli là 2,6%[28]. Ở Châu Âu, tỉ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL cũng thay đổi theo từng quốc gia. Tại Hà Lan, một nghiên cứu trên 11 phòng thí nghiệm vào năm 1999 cho thấy <1% E. coli và K. pneumoniae có sinh ESBL[31]. Tuy nhiên, các nghiên cứu ở Pháp lại chỉ ra rằng, có đến 40% các chủng K. pneumoniae phân lập được kháng ceftazidime[29]. Trên khắp Châu Âu, tỉ lệ K. pneumoniae kháng ceftazidime là 20% ở các cơ sở điều trị thông thường và 42% ở các cơ sở chăm sóc đặc biệt [25].
21 Ở Châu Á, tỉ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL vẫn còn thấp, ở mức < 0,1% đối với E. coli và 0,3% đối với K. pneumoniae trong các nghiên cứu trên khắp Nhật Bản. Ở Hàn Quốc, tỉ lệ này là 4,8%, trong khi đó, ở Đài Loan là 8,5% và 12% tại Hồng Kông. Tại Ả Rập Xêut, nghiên cứu trên 3231 vi khuẩn Gram âm cho thấy tỉ lệ sinh ESBL là 4,8%, tại Ấn Độ là 26,6% [29]. 2.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam Tại Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỉ lệ khá cao các vi khuẩn E. coli, K. pneumoniae và Poteus spp. sinh ESBL. Theo tác giả Hoàng Thị Phương Dung thực hiện nghiên cứu từ 7-12/2008 tại bệnh viện Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh, tỉ lệ sinh ESBL là 32,4% (66/204 chủng) Trong đó, tỉ lệ sinh ESBL cao nhất là E. coli với 71,2% (47/66 chủng), tiếp đến là K. pneumoniae với 15,2% (10/66 chủng)[12]. Công trình nghiên cứu tổng kết tình hình đề kháng các kháng sinh đã ghi nhận từ 15 bệnh viện tại Việt Nam (GARP-VN)[13] cho thấy tỉ lệ vi khuẩn E. coli và K. pneumoniae tiết ESBL là rất đáng báo động tại nhiều bệnh viện như Chợ Rẫy (49% và 58%), Việt Đức (57% và 49%), Nhiệt đới Quốc Gia (55% và 73%), Bình Định (36% và 54%). Tại các khoa hồi sức tích cực, vấn đề này còn nan giải hơn, do nơi đây tập trung những bệnh nhân nặng nhất, qua nhiều khoa điều trị, đặc biệt là các vi khuẩn gram âm mang gen kháng thuốc như β-lactamase. Hiện nay, theo báo cáo của WHO giai đoạn 2011 - 2014, Việt Nam nằm trong các nước có tỉ lệ vi khuẩn E. coli sinh ESBL cao nhất trên thế giới với tỉ lệ trên 60%[31].
22 Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3.1.1Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi sinh vậtEscherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp.được phân lập tại phòng nuôi cấy-kháng sinh đồ. Khoa vi sinh-Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu Các chủng vi khuẩn đã được phân lập từ bệnh nhân thuộc khoa Vi sinh-Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. 3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.2.1 Địa điểm Tại phòng nuôi cấy vi khuẩn và kháng sinh đồ, khoa Vi sinh bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. 3.2.2 Thời gian Từ tháng 28/12/2019 đến 31/05/2020 3.3 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị sử dụng 3.3.1 Dụng cụ, thiết bị Dụng cụ: Đĩa peptri, kính hiển vi, lam kính, phiến kính, đèn cồn, ống nghiệm, que cấy, tăm bông vô trùng, ăng cấy, Thiết bị: Tủ ấm, tủ sấy, cân phân tích, máy hấp vô trùng, máy cấy máu, tủ lạnh, tủ cấy vô trùng. 3.3.2 Hóa chất -Thuốc nhuộm Gram: thuốc tím getian, dung dịch lugol, cồn tẩy 90◦, dung dịch fuchsin. -Nước muối sinh lý đã được khử trùng. -Thuốc thử phản ứng VP. -Thuốc thử tính chất vật lý hóa học. -Nước oxy già, các hóa chất để pha môi trường.
23 -Môi trường nuôi cấy: Thạch máu, Uri, Mác, -Môi trường kháng sinh đồ: MH -Kovac -Các khoanh giấy kháng sinh. 3.4 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. Nội dụng 2: Phân lập và định danh các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp. Nội dung 3: Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp. Nội dung 4: Khảo sát tình hình vi khuẩn Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp. sinh ESBL. 3.5 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu -Kỹ thuật nuôi cấy phân lập -Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán Kirby-Bauer -Diễn giải kết quả kháng sinh đồ theo hướng dẫn tài liệu CLSI năm 2018 để xác định mức độ nhạy cảm (S), trung gian (I) hoặc đề kháng (R). 3.6 Xử lý số liệu -Thu thập số liệu, hồi cứu phiếu kết quả cấy vi sinh định danh vi khuẩn và -phiếu kết quả kháng sinh đồ. -Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS. 3.7Phương pháp nghiên cứu 3.7.1 Phương pháp 1: Thu mẫu bệnh phẩm(theo sổ tay hướng dẫn lấy mẫu của khoa gửi tới các khoa cận lâm sàng) Tùy vào vị trí tổn thương, cũng như là từng loại mẫu bệnh phẩm mà ta có các kỹ thuật lấy mẫu bệnh phẩm khác nhau[14]:
24 Bệnh phẩm mủ: Dùng tăm bông vô trùng lấy bệnh phẩm tại nơi ranh giới tiếp giáp tổ chức vết thương với tổ chức lành, lấy mủ giới. Hoặc là mủ được lấy bằng bơm tiêm vô trùng sau khi mổ. Bệnh phẩm dịch tỵ hầu: Hướng đãn bệnh nhân ngồi đúng tư thế, dùng tăm bông dịch tị hầu vô trùng đưa vào mũi của bệnh nhân đến vùng tỵ hầu thì tiến hành xoay nhẹ, lấy ra. Bệnh phẩm nước tiểu: Phải lấy bằng ống tăm bông vô khuẩn, đảm bảo thể tích >0.5ml. Bệnh phẩm đờm: Dùng ống hút dịch khí quản hút dịch phế quản vào tăm bông vô trùng. Bệnh phẩm máu: Là các chai cấy máu có chưa môi trường dinh dưỡng và chất hấp phụ kháng sinh để những vi khuẩn trong máu đã bị kháng sinh ức chế vẫn mọc được trong môi trường cấy máu, đối với trẻ em (sử dụng chai của trẻ em): lấy từ 3-5 ml máu bệnh nhân bơm vào trong chai. Đối với người lớn (sử dụng chai của người lớn): lấy từ 5-10ml máu của bệnh nhân bơm vào trong chai, (Lưu ý: mọi thao tác diễn ra phải tuyệt đối tuân theo quy trình hướng dẫn lấy máu, nếu không tuân thủ theo quy trình máu sẽ dễ bị nhiễm). 3.7.2 Phương pháp 2: Phân lập và định danh Sẽ được tiến hành theo 2 bước: -Bước 1: Nhuộm soi, soi tươi sơ bộ mẫu bệnh phẩm -Bước 2: Nuôi cấy và định danh Nhuộm soi, soi tươi sơ bộ mẫu bệnh phẩm[15]: Quan sát bằng kính hiển vi sẽ cho phép người thực hiện sẽ nhìn thấy hình dạng, khả năng bắt màu của vi khuẩn. Việc soi tươi tiêu bản để phát hiện khả năng di chuyển, sự có mặt của nấm. Nhuộm tiêu bản để phát hiện hình thái, kích thước và cách sắp xếp của vi khuẩn. Thông qua kết quả có thể định hướng cho việc nuôi cấy. Soi tươi: Nhỏ 1-2 giọt NaCl 0.9% vô khuẩn lên lam kính, dùng que cấy hoặc tăm bông vô trùng hòa đều với giọt NaCl 0.9% trên lam kính. Đặt phiến kính lên giọt canh khuẩn nhẹ nhàng tránh tạo bọt khí. Soi dưới vật kính X10, hoặc X40.
25 Nhuộm soi: Sử dụng kỹ thuật nhuộm Gram Làm tiêu bản: Dùng que cấy lấy bệnh phết dàn mỏng lên phiến kính theo đường xoắn ốc đường kính 1cm, để tự khô hoặc cho vào tủ ấm. Sau đó tiến hành cố định trên ngọn lửa đèn cồn. Tiến hành nhuộm: -Nhỏ dung dịch thuốc tím Gentian lên tiêu bản, chờ trong 1 phút, rửa vòi nước đang chảy. -Nhỏ tiếp dung dịch Lugol lên tiêu bản, đợi 30 giây, rửa vòi nước đang chảy. -Nhỏ cồn tuyệt đối lên phiến kính, khi thấy màu tím vừa phai hết, rửa nước ngay. -Nhỏ dung dịch Fucsin lên tiêu bản, đợi 1 phút rửa vòi nước đang chảy. - Đợi tiêu bản khô, soi dưới vật kính dầu X100. Đọc kết quả: Vi khuẩn có bắt màu tím là Gram dương. Vi khuẩn bắt màu đỏ là Gram âm. Nuôi cấy và định danh: Bệnh phẩm sau khi được lấy về, tùy theo từng loại bệnh phẩm mà ta tiến hành nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Bảng 3.1.Môi trường nuôi cấy cho từng loại bệnh phẩm Bệnh phẩm Mủ Đờm Phân Dịch tỵ hầu Máu Nước tiểu Môi trường Máu+ Máu+ SS ½máu+ Máu+ Máu+ 1/2 Uti Soco+Mác ½ Soco ½Uti ½Uti
26 Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên các mẫu bệnh phẩm: Đối với bệnh phẩm là mủ, đờm, dịch tỵ hầu, phân: Đánh dấu thông tin mặt sau hộp thạch và mẫu bệnh phẩm sao cho trùng khớp nhau Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, ngón cái và ngón giữa tay trái mở nắp đĩa môi trường Nhúng que cấy vào bệnh phẩm, cấy ria trên bề mặt môi trường theo kĩ thuật cấy 3 vùng Đóng nắp đĩa peptri, nuôi trong tủ CO2,37◦C(DTH), bệnh phẩm khác nuôi trong tủ 36◦C 18-24h Đọc kết quả Đối với bệnh phẩm nước tiểu: Đánh dấu thông tin mặt sau hộp thạch và mẫu bệnh phẩm sao cho trùng khớp nhau Sử dụng ăng cấy 1µl, nhúng vào bệnh phẩm, cấy ria trên bề mặt môi trường theo kĩ thuật cấy 3 vùng Nuôi trong tủ ấm 36◦C 18-24h Đọc kết quả
27 Định danh vi khuẩn: Vi khuẩn sau khi mọc khuẩn lạc sẽ được mang đi định danh, phương pháp thông thường được sử dụng để xác định là dựa vào tính chất hóa học của vi khuẩn đó. Ngoài ra, hiện nay người ta đã sản suất ra các bộ xác định đồng thời các tính chất sinh vật hóa học của vi khuẩn như API 20E (áp dụng vi khuẩn họ đường ruột, trực khuẩn Gram âm) hoặc 20NE (áp dụng trực khuẩn Gram dương), bộ đường này sẽ xác định được 20 tính chất của vi khuẩn. Phương pháp thông thường là sẽ dựa vào một số tính chất như sau để xác định vi khuẩn. Chuyển hóa đường: Sử dụng môi trường KIA(Kligler Iron Agar): là môi trường tổng hợp gồm có hai loại đường là glucose và lactose, trong đó tỉ lệ giữa glucose và lactose là 1/10 và chất chỉ thị pH phenol đỏ. Nuôi cấy vi khuân và môi trường để ở nhiệt độ 37◦C trong 24h nếu vi khuẩn có màu đỏ sang màu vàng ở phần chân ống thạch (môi trường KIA đổ thạch nghiêng) thì môi trường có khả năng lên men đường glucose mà không lên men đường lactose. Nếu vi khuẩn có khẻ năng lên men đường lactose thì toàn bộ môi trường chuyển sang màu vàng[16]. Sử dụng môi trường Manitol: Là môi trường có chứa manit. Nuôi cấy vi khuẩn và môi trường để ở nhiệt độ 37◦C trong 24h nếu vi khuẩn có khả năng sử dụng manit thì môi trường sẽ chuyển từ màu đỏ đậm sang màu vàng. Môi trường có màu đỏ đậm thạch bằng nên khi cấy dùng que cấy thẳng chọc vào giữa ống[16]. Các tính chất khác trong quá trình lên men đường: Phản ứng Methyl Red (MR): Một số loài vi khuẩn có khả năng sinh ra các axit(lactic, acetic, ) từ glucose qua con đường lên men nhất là các vi khuẩn đường ruột. Chúng sản sinh ra đủ một lượng axit để môi trường nuôi cấy luôn giữ pH ≤ 4,4. Sử dụng các môi trường lỏng như Clack-lubs để nuôi cấy[16]. Cách tiến hành: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc của vi khuẩn cấy vào vi khuẩn. Ủ trong tủ ấm, sau 24-48h, nhỏ 2 - 3 giọt MR là ta có thể phát hiện ra chúng. Đoc kết quả: Phản ứng dương tính: môi trường chuyển sang màu đỏ (pH=4,4).
28 Phản ứng âm tính: môi trường chuyển sang màu vàng (pH=6). Phản ứng Indol: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường nước pepton. Ủ trong tủ ấm. Sau 24h, nhỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, lắc nhẹ[17]. Đọc kết quả: Phản ứng dương tính (sinh indol): xuất hiện vòng màu đỏ phía trên môi trường. Phản ứng âm tính (không sinh indol): không xuất hiện vòng màu đỏ. Phản ứng Voges-Proskauer(VP): Một số vi khuẩn trong quá trình lên men đường có khả năng tạo ra chất trung gian là acetone. Có thể phát hiện chất này dựa trên sự biến đổi của acetone thành diacetone thành một phức chất màu đỏ dưới sự xúc tác của anpha-napthol và creatin, để phát hiện khả năng này ta nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường Clack - lubs [24]. Cách tiến hành: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường. Ủ trong tủ ấm, sau 24-48h thì nhỏ dung dịch thử VP. Đọc kết quả: Phản ứng dương tính: môi trường chuyển từ màu vàng nhạt sang màu đỏ. Phản ứng âm tính: môi trường có màu vàng nhạt. Khả năng sử dụng Citrat: Môi trường Xitrat Simmons là môi trường thạch nghiêng có màu xanh lá cây. Môi trường có chứa Natri citrat là một loại muối của axit citric, là phân tử chứa một amion cũng là một nguồn carbon duy nhất và môi trường còn có (NH2)H2PO4 chứa nguồn nitro duy nhất[16]. Cách tiến hành: Sử dụng que cấy, lấy khuẩn lạc của vi khuẩn cấy vào môi trường. Đem đi ủ trong tủ ấm, sau 18-24h thì đọc kết quả. Đọc kết quả:Nếu vi khuẩn có khả năng phân giải natri citrate sẽ làm biến đổi màu môi trường từ xanh lá cây sang xanh dương thẫm. Khả năng sinh H2S: Một số là vi khuẩn có khả năng giải phóng sulfua từ các axit amin hoặc hợp chất khác chứa lưu huỳnh ở dạng H2S[16].
29 Cách tiến hành: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường manitol hoặc môi trường SIM. Đọc kết quả: Đối với môi trường manitol: nếu vi khuẩn sử dụng đường manitol thì môi trường có màu vàng. Khả năng di động của vi khuẩn bằng môi trường lỏng: Có một số loài vi khuẩn có lông, nên chúng có thể phát hiện bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường thạch mềm (thạch bằng có màu trắng)[16]. Cách tiến hành: Dùng que cấy chích sâu lấy khuẩn lạc cấy thẳng xuống gần đáy của ống nghiệm có môi trường thạch lỏng. Ủ trong tủ ấm. Đọc kết quả sau 24h: Phản ứng dương tính (có khả năng di động): môi trường đục, không nhìn rõ đường cấy chích sâu và vi khuẩn mọc lan quanh đường cấy như rễ cây. Phản ứng âm tính: môi trường trong và nhìn thấy đường cấy chích sâu. Khả năng phân giải ure: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường thạch urê.Ủ trong tủ ấm[16]. Đọc kết quả sau 24h: Phản ứng dương tính: môi trường chuyển sang màu hồng. Phản ứng âm tính: môi trường không chuyển màu. Thử nghiệm Oxydase: Các vi khuẩn hiếu khí luôn có oxydase, để phát hiện được tính chất này ta nhỏ một giọt dung dịch dimetylparaphenylendiamin lên một miếng giấy lọc rồi lấy một ít khuẩn lạc của vi khuẩn để lên miếng giấy ẩm[16]. Đọc kết quả sau 10s đến 30s. Phản ứng dương tính: Vi khuẩn có màu xanh tím là dương tính (+). Phản ứng âm tính: Vi khuẩn không thay đổi màu sắc là âm tính (-).
30 Xác định các vi khuẩn Gram dương (Oxydase âm) bằng dùng hệ thống API 20E: Api 20E là một hệ thống chuẩn được sử dụng để định các trục khuẩn Gram âm, có test Oxydase âm sử dụng thanh bao gồ 21 test tiểu sinh hóa và một số cơ sở dữ liệu. Nguyên tắc: Thanh Api 20E gồm có 20 giếng nhỏ chứa các môi trường đông khô. Các test được gây chủng bằng huyền dịch vi khuẩn. Trong khi ủ, quá trình thay đổi chất làm thay đổi màu theo hướng tự phát hoặc là biểu hiện ra khi thêm các thuốc thử. Phản ứng được dựa vào bảng có sẵn và kết quả định danh sẽ được dựa vào một phần mềm định danh đã có sẵn. Quy trình thực hiện: Dùng que tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5 ml nước muối sinh lý hoặc nước cất tiệt trùng, lắc trộn đều. Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ kít để giữ ẩm khi ủ trong tủ ấm. Dùng pipet với đầu týp tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào mỗi ô của bộ kít. Nhỏ dung dịch vi khuẩn vừa đủ vào tất cả các ô CIT, VP, GEL thì nhỏ đầy, 5 ô ADH, LDC, ODC, H2S và URE cho thêm Parafin tiệt trùng để tạo điều kiện yếm khí. Đậy nắp khay lại và ủ trong tủ ấm. Đọc kết quả sau 18h đến 24h Kiểm tra và ghi nhận tất cả các chỉ tiêu không cần cho thêm thuốc thử. Các chỉ tiêu cần sử dụng thuốc thử: TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Màu đen xuất hiện thì kết quả là phản ứng dương tính, màu vàng thì kết quả phản ứng âm tính. IND: Nhỏ một giọt thuốc thử JAMES. Đợi 2 min, xuất hiện một vòng màu đỏ là phản ứng dương tính, màu vàng là âm tính. VP: Thêm một giọt lần lượt mỗi dung dịch thuốc thử VP1, VP2. Đợi ít nhất 10 phút, màu hồng hoặc đỏ xuất hiện là phản ứng dương tính. Nếu màu hồng nhạt xuất hiện trong vòng 10 phút đến 12 phút là phản ứng âm tính. Nhập kết quả vào phần mềm ApiWeb → định danh được vi khuẩn.
31 Hình 3.1.API 20E sử dụng trong chuẩn đoán, định danh vi khuẩn Gram âm oxydase âm Xác định các vi khuẩn Gram âm (Oxydase dương) bằng dùng hệ thống API 20NE Api 20NE là một hệ thống chuẩn được sử dụng để định các trục khuẩn Gram âm, có test Oxydase dương sử dụng thanh bao gồ 20 test tiểu sinh hóa và một số cơ sở dữ liệu. Nguyên tắc: Thanh Api 20NE gồm có 20 giếng nhỏ có chất nền (8 test thông thường và 12 test đồng hóa), khi cho canh khuẩn vào và ủ ở 300 C trong 18-24h, sự trao đổi chất trong quá trình ủ sẽ trực tiếp làm đổi màu môi trường, hay khi cho thêm hóa chất thích hợp đối với các test thông thường hoặc làm đục môi trường đối với các test đồng hóa mà mắt thường nhìn thấy được. Kết quả của các phản ứng này được đọc bằng phần mềm hoặc sách hướng dẫn của hãng Bio Merieux. Từ các kết quả đó ta có các xác xuất của vi khuẩn nào đó (theo nghiên cứu của nhà sản xuất đã được công nhận). Quy trình thực hiện: Sau khi test oxydase dương tính thì ghi kết lại kết quả và sẽ điền vào vị trí 21 của kết quả làm giá đường. Chỉ làm giá đường Api 20NE với các trực khuẩn Gram âm có test Oxydase dương tính (không phải họ đường ruột). Chuẩn bị cho thanh Api 20NE: Lấy 1 hộp ủ nhựa (khay và nắp cung cấp kèm trong hộp Api) và cho khoảng 5ml nước cất hoặc nước sinh hoạt vào đầy các lỗ trên khay. Ghi lại các thông tin của mẫu cần chạy lên khay (số bệnh phẩm, ngày giờ thực hiện ). Lấy thanh Api 20NE ra khỏi vỏ. Đặt thanh Api 20NE vào trong hộp ủ.
32 Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: Mở nắp ống nước muối sinh lý 5ml đã hấp vô trùng (hoặc ống API Supspension medium 2ml). Dùng que cấy lấy 2-3 khuẩn lạc đã nuôi cấy thuần nhất qua đêm (18h -24h) nghiềnvào trong ống nước muối để tạo huyền dịch có độ đục 0,5 Mac Faland (so với độ đục chuẩn hoặc đo bằng máy). Tiến hành ủ: Dùng pipet vô khuẩn hút canh khuẩn vừa pha nhỏ vào các giếng: nhỏ vừa đủ đến miệng giếng từ giếng NO3 đến PNPG. Mở nắp ống Api AUX medium 7ml, cho khoảng 10 giọt (200 µl) canh khuẩn vào trộn đều và nhỏ vào các giếng từ GLU tới PAC, chú ý phải nhỏ bằng mặt giếng hoặc có vồng (nhỏ quá ít hoặc bị tràn có thể làm sai kết quả). Nhỏ paraphin vào đầy các giếng có gạch chân là GLU, ADH, URE. Đậy nắp khay của hộp ủ. Để vào tủ ấm 300 C (29 0C ± 20 C) ủ trong vòng 24h. Đọc kết quả sau 18h đến 24h: Sau giai đoạn ủ ta lấy giá đường ra và đọc kết quả âm tính hay dương tính của các giếng theo bảng phụ lục. Giếng NO3 phải nhỏ thêm 1 giọt NIT1 và 1 giọt NIT2 và đợi 5 phút trước khi đọc kết quả, kết quả dương tính có màu đỏ. Giếng TRP phải nhỏ thêm 1 giọt JAMES và đợi 5 phút trước khi đọc kết quả, kết quả dương tính khi giếng chuyển sang màu hồng. Các test đồng hóa (các giếng từ GLU tới PAC) dương tính khi bề mặt bị đục. Hình 3.2.API 20NE sử dụng trong chuẩn đoán, định danh họ vi khuẩn Gram âm oxydase dương
33 Xác định các vi khuẩn Gram âm bằng hệ thống tự động Vitek II Định danh vi khuẩn Gram âm gây bệnh. Nguyên tắc: Định danh vi khuẩn Gram âm gây bệnh dựa vào phương pháp đo màu để nhận biết các tính chất sinh vật hóa học của vi khuẩn thông qua sự đổi màu các giếng trong môi trường có sẵn trong card. Quy trình thực hiện: Chuẩn bị card xét nghiệm định danh. Chủng vi khuẩn cần thử nghiệm phải thuần nhất trong điều kiện tối ưu và đang ở giai đoạn phát triển mạnh (nuôi cấy sau 18-24 giờ).Chuẩn bị huyền dịch trực tiếp từ khuẩn lạc: Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ 3-5 khuẩn lạc có hình thái giống nhau nghiền đều vào ống nghiệm vô trùng 12mm x 75mm đã có 3ml nước muối được hút bằng Dispenser, lắc đều trên máy lắc để có huyền dịch đồng nhất đo độ đục đạt khoảng 0,55-0,65 McFarland (đo bằng DENSICHEK).Huyền dịchvi khuẩn sau khi pha, phải được sử dụng ngay trong vòng 15 phút. Chuẩn bị card xét nghiệm làm kháng sinh đồ. Sau đó, dùng pipette 280 μl (đối với card gram dương), dùng pipette 145μl (đối với card gram âm) và dùng pipette phù hợp hút huyền dịch vi khuẩn vào ống nghiệm đã có chứa 3ml nước muối (saline0,45%). Tiến hành Đặt ống nghiệm và card lên cassette. Tiếp theo, đưa cassette vào buông hút. Khi có 1 tiếng tín hiệu phát ra chuyển các cassette đã được hút mẫu qua loading station. Đọc kết quả sau 18h đến 24h: Thay vì phải đọc bằng mắt thường xem sự phát triển của vi khuẩn có hay không, hệ thống tự động sẽ đo độ đục của canh khuẩn hoặc đo tín hiệu huỳnh quang biến đổi có trong môi trường nuôi cấy để xác định vi khuẩn. Hơn nữa, hệ thống tự động có thể kết nối với phần mềm quản lý của phòng xét nghiệm để chuyển trực tiếp kết quả từ hệ thống tự động sang hệ thống phần mềm quản lý.
34 3.7.3 Phương pháp 3:Làm kháng sinh đồ theo phương pháp khuếch tán Sau khi phân lập và định danh được, chúng ta tiến hành làm kháng sinh đồ bằng kĩ thuật khoanh giấy khuếch tán trong thạch (kỹ thuật Kirby-Bauer) kĩ thuật này cho phép xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, từ đó có thể lựa chọn được kháng sinh có hiệu quả cho điều trị[10][20][22]. Nguyên tắc: Kháng sinh tẩm vào đĩa giấy với nồng độ quy định theo tiêu chuẩn quốc tế sẽ khuếch tán vào thạch, ức chế sự phát triển của vi khuẩn, tạo thành vòng vô khuẩn, đo đường kính vô khuẩn xuất hiện quanh đĩa giấy kháng sinh để xác định sự nhạy cảm hay đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh đã dùng[10][20][22]. Môi trường: Môi trường được cân, cho lượng nước cất thích hợp vào bình tròn, nấu tan. Sau đó phân ra các đĩa peptri với độ dày thạch chừng 4mm. Sau đó ủ môi trường ở 35°C trong vòng 24h để loại trừ các hộp thạch bị nhiễm khuẩn. Cách tiến hành pha canh khuẩn: Dùng que cấy lấy khúm vi khuẩn cho vào trong ống nghiệm chứa dịch BHI và để khoảng 15-20 phút để tăng sinh. Lượng vi khuẩn lấy sao cho khi cho vào ống BHI thì có độ đục tương đương 10^8 vi khuẩn/ml (so sánh với độ đục chuẩn: Mc Farland 0,5). Dùng tăm bông vô trùng nhúng vào dịch, ép hết nước thừa trên thành ống nghiệm rồi trải đều lên mặt thạch của hộp MH. Để yên 5-10 phút cho khô[10][20][22]. Cách đặt khoanh kháng sinh: Dùng kẹp vô trùng hoặc dùng mũi kim tiêm lấy các đĩa kháng sinh và đặt lên trên mặt thạch sao cho mặt đĩa kháng sinh tiếp xúc đều với mặt thạch. Các đĩa kháng sinh cách mép hộp thạch từ 2-2,5cm và cách nhau 2,5-3,5cm. Để ở nhiệt độ phòng khoảng 20 phút. Ủ 37◦C trong vòng 18 - 24h[10][20][22]. Sau 18-24h đọc kết quả, kết quả sẽ được so sánh với bảng đường kính khoang kháng sinh đồ theo tiêu chuẩn CLSI.
35 Bảng 3.2. Đường kính khoang giấy kháng sinh đồ của họ vi khuẩn đường ruột Kháng sinh Ký hiệu S I R Ampicillin AMP ≥17 14-16 ≤13 Piprecillin PRL,PIP ≥21 18-20 ≤17 Amoxicillin AUG ≥18 14-17 ≤13 Ampicillin SAM ≥15 12-14 ≤11 Piperracillin PTZ,TZP ≥21 18-20 ≤17 Cefepime FEP,CPM ≥25 19-24 ≤18 Cefotaxime CTX ≥26 23-25 ≤22 Cefuroxime CRO ≥23 20-22 ≤19 Cefazidime CXM ≥18 15-17 ≤14 Atreoman CAZ ≥21 18-20 ≤17 Imipenem ATM,AT ≥23 18-20 ≤17 Meropenem MEM ≥23 20-22 ≤19 Getanmycin GM ≥15 20-22 ≤19 Tobramycin TOB,TN ≥15 13-14 ≤12 Amikacin AK,AN ≥17 15-16 ≤14 Tetracyline T,TE,TET ≥15 12-14 ≤11 Ciprofloxacin CIP ≥26 22-25 ≤21 Levofloxacin LEV ≥21 17-20 ≤16 Ofloxacin OFX ≥16 13-15 ≤12 Trimethoprim SXT ≥16 11-15 ≤10 Chloramphenicol C ≥18 13-17 ≤12 Fosfomycin FOS,FOT ≥16 13-15 ≤12
36 Đánh giá độ nhạy của kháng sinh theo mức độ (S), (I), (R) theo tiêu chuẩn CLSI đo dường kính vùng ức chế từ sau mặt đĩa thạch bằng thước đo tính bằng mm. So sánh đường kính vùng ức chế do được với bảng “Giới hạn đường kính vùng ức chế” cho từng loại kháng sinh để phân biệt mức độ của vi khuẩn: nhạy cảm (S: susceptible), trung gian (I: intermediate), và kháng (R: resistant). 3.7.4 Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn sinh ESBL Thực hiện đồng thời với làm kháng sinh đồ. Xét nghiệm sàng lọc dùng kháng sinh chỉ điểm là Ceitazidime 30µg, Cefotaxime 30µg, Ceftriaxone 30µg. Xét nghiệm xác định là dùng phương pháp đĩa kết hợp với 2 loại đĩa giấy kháng sinh là Ceftazidime-acid clavulanic 30/10µg và Cefotaxime-acid clavulanic 30/10µg.Kỹ thuật thực hiện tương tự như kỹ thuật làm kháng sinh đồ. Đọc kết quả ESBL: Đo đường kính vòng vô khuẩn và dựa theo tiêu chuẩn CLSI để xác định vi khuẩn sinh ESBL.
37 Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1Kết quả nghiên cứu tỉ lệ các vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. Trong thời nghiên cứu từ ngày 30/12/2019 đến ngày 31/05/2020, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu bệnh phẩm từ các bệnh nhân tại bệnh viện, tiến hành nuôi cấy, phân lập và định danh bằng API 20E đã thu được kết quả 243 chủng các loại vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm. Bảng 4.1.Tỉ lệ các loại vi khuẩn đường ruột phân lập được (243 chủng) Số lượng Tỉ lệ(%) Vi khuẩn đường ruột sinh ESBL 127 52,26 Vi khuẩn đường ruột không sinh ESBL 116 47,74 Tổng 243 100 Từ kết quả bảng 4.1 cho thấy,tỉ lệ vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL tương đối là cao, trong tổng số 243 chủng phân lập được thì tỉ lệ sinh ESBL đã đạt tới mức là 127 chủng (chiếm 52,26%). Đây là một tỉ lệ khá cao do việc sử dụng các kháng sinh thuốc nhóm cephalosporins và fluoroquinolones không được kiểm soát chặt chẽ cùng với kĩ thuật phát hiện ESBL của phòng xét nghiệm vi sinh đã được quan tâm nhiều hơn. Kể từ khi hiện tượng vi khuẩn sinh ESBL bắt đầu xuất hiện đầu tiên tại Tây Âu, cho đến nay đã được phát hiện ở rất nhiều nơi trên thế giới như Mỹ, Chấu Á. Tần suất xuất hiện của vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL ở mỗi quốc gia là khác nhau. Và trong quốc gia đó, thì tỉ lệ sự xuất hiện ở mỗi bệnh viện cũng thay đổi tùy theo. Tại Việt Nam:Năm 2004, tác giả Nguyễn Thị Ngọc Huệ cùng một số cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tại bệnh viện Đa khoa Bình Định và kết quả nhận thấy có tới 22% số chủng vi khuẩn đường ruột sinh ESBL[17]. Cho đến năm 2005, thì tác giả Chu Thị Nga cũng cùng với các cộng sự của mình, thực hiện nghiên cứu trên 117 chủng E. coli, Klebsiella spp., Proteus spp.được
38 phân lập tại bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng. Kết quả đã chỉ ra rằng, có 34/117 chủng sinh ESBL, chiếm tỉ lệ 29,06%[18]. Một nghiên cứu khác được diễn ra ở bệnh viện Trung ương Huế vào năm 2008 của tác giả Mai Văn Tuấn đã phân lập được 65 chủng vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL trên tổng 214 chủng, chiếm tỉ lệ 30,4%[19]. Từ kết quả của ba tác giả, so sánh với kết quả nghiên cứu của chúng tôi, tỉ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL thấp hơn nhiều. Điều này đã chứng minh rằng, tỉ lệ vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL tăng theo từng năm. Lý giải cho điều này, chính là việc tự ý sử dụng thuốc kháng sinh không theo chỉ định của bác sĩ. 4.2 Kết quả nghiên cứu tổng hợp tỉ lệtheo chỉ số của các loại vi khuẩn đường ruột phân lập được theo nhóm tuổi của bệnh nhân tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. Bảng 4.2.Tỉ lệ các loại vi khuẩn đường ruột phân lập được theo chỉ số Vi khuẩn E. coli Klebsiella spp. Proteus spp. Tổng Tỉ lệ(%) Chỉ số Số lượng bệnh nhân 70 39 26 5 70 28,81 Tổng 143 78 22 243 100 Nam 83 30 12 125 51,44 Nữ 60 48 10 118 48,56 Tổng 143 78 22 243 100 Từ kết quả bảng 4.2 đã cho thấy, tỉ lệ vi khuẩn họ đường ruột của bệnh nhân theo lứa tuổi là không giống nhau và tỉ lệ này thay đổi theo từng lứa tuổi. Nhóm từ
39 50-70 tuổi, đạt tỉ lệ là cao nhất chiếm 35,39%. Tiếp đến, nhóm tuổi trên 70 có tỉ lệ chiếm 28,81% và thấp nhất là 4,94% thuộc vào nhóm từ 10-29 tuổi. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát và phân lập được 243 chủng khuẩn lạc là vi khuẩn họ đường ruột, tương ứng vói 243 bệnh nhân. Từ kết quả bảng đã cho thấy, có tới 125 bệnh nhân là giới tính nam chiếm 51,44% cótỉ lệ cao hơn bệnh nhân là giới tính nữ (48,56%). So sánh với kết quả của Phạm Hùng Vân và cộng sự có sự tương đồng về bệnh nhân nam chiếm 58,9%, còn bệnh nhân nữ chiếm 41,1%[20].Kết quả nghiên cứu này cũng chỉ ra điều tương tự là tỉ lệ nam cao hơn nữ. Điều này cho thấy tỉ lệ vi khuẩn đừng ruột liên quan đến giới tính, trong đó tỉ lệ giới tính nam cao hơn nữ. Có thể vì một số lý do sinh học và xã hội đã ảnh hưởng đến yếu tố này. 4.3 Tỉ lệ các chủng vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL Bảng 4.3. Tỉ lệ các chủng vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL Vi khuẩn Số lượng ESBL(+) Tỉ lệ(%) ESBL(-) Tỉ lệ(%) E. coli 143 83 65,4 60 51,7 Klebsiella spp. 78 34 26,8 44 37,9 Proteus spp. 22 10 7,87 12 10,3 Tổng 243 127 100 116 100 Đa số các nghiên cứu trước đây đều đã nhận thấy trong các vi khuẩn họ đường ruột thì vi khuẩn E. coli và K. pneumoniae chiếm tỉ lệ cao nhất. Cụ thể: Theo nghiên cứu tại bệnh viện Đại học Y dược (2009) của tác giả Hoàng Thị Phương Dung đã cho thấy có tới 55,3% vi khuẩn E. coli và 21,3% Klebsiella spp. sinh ESBL[12]. Một báo cáo kết quả nghiên cứu ở 19 bệnh viện ở Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh và Hải Phòng trong hai năm 2009-2010 về tình trạng kháng thuốc kháng sinh đã chỉ ra 3 loại vi khuẩn họ đường ruột kháng kháng sinh thường gặp là E. coli, Klebsiella spp. và Proteus spp.
40 Một nghiên cứu khác của Nguyễn Văn Duy và cộng sự năm 2016, cũng tại bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên đã cho thấy tỉ lệ kháng thuốc của vi khuẩnE. coli là cao nhất chiếm 24,48%. Còn vi khuẩn Klebsiella spp. chiếm 2,66%[21]. So sánh kết quả của nghiên cứu của ba tác giả trên với kết quả nghiên cứu của chúng tôi, đã thấy có sự tương đồng. Từ bảng kết quả 4.3, thì vi khuẩn E. coli sinh ESBL chiếm tỉ lệ cao nhất (65,4%) trong tổng số các chủng vi khuẩn sinh ESBL mà chúng tôi phân lập được. Tiếp theo là vi khuẩn Klebsiella spp. chiếm tỉ lệ 26,8 % và cuối cùng là Proteus spp. chiếm 7,87%E. coli chiếm tỉ lệ cao nhất trong ba loại chủng vi khuẩn do đây là loại vi khuẩn phổ nhất trong hệ đường ruột khi đạt đến 80%, trong khi đó Proteus spp. đạt tỉ lệ thấp hơn do đây là chủng vi khuẩn gây bệnh cơ hội, chỉ xuất hiện khi cơ thể con người bị suy giảm miễn dịch. 4.4Khảo sát tình hình kháng kháng thuốc của các vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. Bảng 4.4. Tỉ lệ kháng kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL Trung Nhạy Kháng(R) gian(I) cảm(S) Tổng Ký Tên kháng sinh Tỷ Tỷ Tỷ sốc hiệu Số Số Số lệ lệ lệ chủng chủng chủng chủng (%) (%) (%) Ampicillin AMP 107 84 9 7,1 11 8,7 127 Piperacillin PRL 106 83 9 7,1 12 9,4 127 Amoxicillin- AUG 69 54,3 21 16,5 37 29,1 127 clavulanic Apicillin- SAM 37 29,1 25 19,7 65 51,2 127 sulbactam
41 Piperracillin- PTZ 24 18,9 16 12,6 87 68,5 127 tazobactam Cefepime CPM 83 65,4 28 22 16 12,6 127 Cefotaxime CTX 123 99,2 0 0 1 0,81 127 Ceftriaxone CRO 103 81,1 6 4,72 18 14,2 127 Cefuroxime CXM 93 73,2 14 11 20 15,7 127 Cefazidime CAZ 95 74,8 12 9,45 20 15,7 127 Imipenem IPM 15 11,8 11 8,66 101 79,5 127 Gentamycin GM 41 32,3 16 12,6 70 55,1 127 Tobramycin TOB 48 37,8 8 6,3 71 55,9 127 Tetracycline TE 76 59,8 9 7,09 42 33,1 127 Ciprofloxacin CIP 94 74 17 13,4 16 12,6 127 Levofloxacin LEV 67 52,8 15 11,8 45 35,4 127 Ofloxacin OFX 66 52 1 0,79 60 47,2 127 Trimethoprim- SXT 73 57,5 20 15,7 34 26,8 127 sulfamethoxazole Chloramphenicol C 40 31,5 3 2,36 84 66,1 127 Fosfomycin FOS 10 7,9 3 2,4 114 90 127 Nhìn biểu đồ 4.4 chúng tôi thấy tỉ lệ kháng kháng sinh nhóm β-lactam của các vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL như sau: kháng sinh thuộc nhóm Penicillin 18,9%-84%, kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin 65,4% - 99,2%, kháng sinh nhóm Carbapenems 11,8%, kháng sinh thuộc nhóm monobactams 0%. Từ kết quả của bảng 4.4 nhóm nghiên cứu của chúng tôi đưa ra nhận xét như sau: Tỉ lệ kháng kháng sinh thuộc nhóm Penicillin khá là cao (kháng Ampicillin lên tới 84%). Tuy nhiên, tỉ lệ kháng các Penicillin phối hợp với chất ức chế β-lactam (acid clavulanic, tazobactam) lại thấp (kháng Amoxicillin/clavulanic acid: 54,3%, Piperacillin-tazobactam: 18,9%, Ticarcillin-clavulanic acid: 29,1%).
42 Tỉ lệ kháng kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin cao (65,4%-99,2%) kể cả Cephalosporin thế hệ 4 (Cefepim)thì tỉ lệ kháng cũng cao (65,4%). Trong các Cephalosporin khảo sát thì chỉ có Cefotaxime (Cephalosporin thế hệ3) và Cefazidime (Cephamycin) thì tỉ lệ kháng còn đạt giá trị cao hơn (Cefotaxime: 99,2%, Cefazidime: 74,8%). Vì vậy, ESBL là một trong những cơ chế quan trọng nhất gây kháng các kháng sinh Cephalosporin. Theo báo cáo nghiên cứu của các tác giả Vũ Thị Kim Cương(2007)[22],Hoàng Thị Phương Dung(2009)[12], Mai Văn Tuấn(2008)[19]về tỉ lệ kháng Cefotaxime lần lượt là như sau: 95,7% của tác giả Vũ Thị Kim Cương và tác giả Hoàng Thị Phương Dung, 100% của tác giả Mai Văn Tuấn. So sánh kết quả của các tác giả với kết quả nghiên cứu của nhóm chúng tôi (99,2%) đã nhận thấy rằng, có tương đồng khá lớn trong tỉ lệ kháng Cefotaxime. Có một nghiên cứu của tác giả Hoàng Thị Phương Dung[13] tại Bệnh viện Đại học Y-Dược đã chỉ rằng có sự xuất hiện tỉ lệ kháng kháng sinh thuộc nhóm Carbapenem (Imipenem thì các chủng vi khuẩn sinh ESBL này vẫn còn khá là nhạy cảm chiếm tỉ lệ 100%). Tương đồng với kết quả nghiên cứu của nhóm chúng tôi 79,5% (chỉ chênh lệch nhau khoảng 20% không đáng kể). Đây là một vấn đề cần được quan tâm và cần phải làm rõ cơ chế vì nếu vi khuẩn đường ruột mà tiết ra men carbapenemase thì nguy cơ lan truyền tính kháng thuốc sẽ rất dễ dàng xảy ra. Nhìn chung, các vi khuẩn sinh ESBL vẫn còn khá nhạy với các kháng sinh thuộc nhóm Carbapenem. Điều này có ý nghĩa trong việc sử dụng kháng sinh này trong điều trị nhiễm khuẩn. Ngoài ra, nghiêm cứu của nhóm chúng tôi cũng đã thấy rõ sự kháng các kháng sinh thuộc nhómAminoglycosides, Trimethoprim/Sunftamethoxazole và Tetracyclines có tỉ lệ tương đối cao như: Kháng Gentamicin 32,3%, kháng Tobramycin 37,8%, kháng Tetracycline với tỉ lệ 59,8%, kháng Ciprofloxacin cao nhất 74%, kháng Levofloxacin 52,8% và kháng Trimethoprim/Sulfamethoxazole 57,5%. Tương tự như các nghiên cứu trước đó. Điều này cũng giúp nhận thấy sự đa kháng thuốc của các chủng vi khuẩn sinh ESBL này.
43 4.5Khảo sát tình hình kháng kháng thuốc của vi khuẩn E.colisinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. Bảng 4.5. Tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli sinh ESBL Kháng Trung gian Nhạy cảm Tổng Ký (R) (I) (S) số Tên kháng sinh hiệu Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ chủn chủng (%) chủng (%) chủng (%) g Ampicillin AMP 75 90,40 3 3,61 5 6,02 83 Piperacillin PRL 22 64,70 5 14,70 7 20,60 83 Amoxicillin- AUG 42 50,60 13 15,70 28 33,70 83 clavulanic Apicillin- SAM 22 26,50 18 21,70 43 51,80 83 sulbactam Piperracillin- PTZ 5 14,70 6 17,60 23 67,60 83 tazobactam Cefepime CPM 67 80,70 5 6,02 11 13,30 83 Cefotaxime CTX 81 97,60 0 0,00 2 2,41 83 Ceftriaxone CRO 72 86,70 3 3,61 8 9,64 83 Cefuroxime CXM 66 79,50 9 10,80 8 8,00 83 Cefazidime CAZ 68 81,90 6 7,23 9 10,80 83 Atreonam ATH 68 81,90 6 7,23 9 10,80 Imipenem IPM 6 7,20 8 9,60 69 83,00 83 Gentamycin GM 27 32,50 5 6,02 51 61,40 83 Tobramycin TOB 28 33,70 6 7,23 49 59,00 83 Amikacin AK 60 72,30 7 8,43 16 19,30 Tetracycline TE 53 63,90 6 7,23 24 28,90 83 Ciprofloxacin CIP 64 77,10 8 9,64 11 13,30 83 Levofloxacin LEV 48 57,80 8 9,64 27 32,50 83 Ofloxacin OFX 49 59,00 0 0,00 34 41,00 83 Trimethoprim- SXT 53 63,90 16 19,3 14 16,90 83 sulfamethoxazole Chloramphenicol C 22 26,50 0 0,00 61 73,50 83 Fosfomycin FOS 10 12,0 0 0,00 73 88,00 83
44 Nhìn bảng kết quả 4.5, kháng kháng sinh nhóm β-lactam: Kháng sinh thuộc nhóm Penicillin 14,7% - 90,4%, kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin 79,5% - 97,6%, kháng sinh nhóm Carbapenems 7,2%, kháng sinh thuộc nhóm monobactams 0%. Trong nghiên cứu này thì Ampicillin hầu như không còn có tác dụng đối với E. coli. Như ở bảng kết quả 4.5 ta cũng thấy rõ tỉ lệ kháng là 90,4%. Kết quả trên cũng tương tự với nghiên cứu của tác giả Phạm Hùng Vân (99%) [20].Tuy nhiên đối với các kháng sinh thuộc nhóm Penicillin có bổ sung thêm chất ức chế β-lactamase thì tỉ lệ kháng thấp (14,7%-50,6%). Đối với kháng sinh nhóm Cephalosporins, tỉ lệ kháng cũng cao đều >50%. Trong đó, tỉ lệ kháng Cefotaxime, Cefazidime, Cefepime rất cao > 80%. Trong số các kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporins thì chỉ còn có Cefuroxime là còn tác dụng với tỉ lệ kháng 79.5%. Kết quả này so với nghiên cứu của tác giả Phạm Hùng Vân cũng tương đương nhau[20]. Còn nhóm kháng sinh Carbapenems, thì tỉ lệ kháng Imipenem của nhóm chúng nghiêm cứu đạt tỉ lệ kháng là 7,2%. Còn theo tác giả Vũ Thị Kim Cương thì tỉ lệ kháng Imipenem là 2,6%[22].So sánh, hai kết quả với nhau thì sự chênh lệch tỉ lệ kháng không đáng kể. Dựa vào bảng kết quả, chúng ta cũng nhận thấy vi khuẩn E.coli kháng hầu hết với các kháng sinh như Gentamicin, Tobramycin tỉ lệ >30%, còn Tetracycline, Ciprofloxacin, Levofloxacin, Trimethoprim/Sulfamethoxazole, Chloramphenicol, Amikacin với tỉ lệ kháng đều trên >50%. Ngoài ra, vi khuẩn này chỉ còn nhạy với Fosfomycin (tỉ lệ kháng 12%). Kết quả này cũng đồng thời tương đương với những nghiên cứu trước đây của tác giả Phạm Hùng Vân [20].Trong số 24 loại kháng sinh được khảo sát thì vi khuẩn E.coli kháng với 16 loại và chỉ còn nhạy với 8 loại kháng sinh đó là: Amoxicillin/clavulanic acid, Piperacillin-tazobactam, Ticarcillin-clavulanic acid, Cefoxitin, Imipenem, Meropenem, Amikacin, Netilmicin. Điều đó cũng cho thấy rằngE. coli sinh ESBL có tính kháng đa kháng sinh.
45 4.6Khảo sát tình hình kháng kháng thuốc của vi khuẩn Klebsiella spp. sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. Bảng 4.6. Tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Klebsiella spp. sinh ESBL Kháng(R) Trung gian(I) Nhạy cảm(S) Tổng Ký Tên kháng sinh số hiệu Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ chủng (%) chủng (%) chủng (%) chủng Ampicillin AMP 22 64,70 6 17,60 6 17,60 34 Piperacillin PRL 22 64,70 5 14,70 7 20,60 34 Amoxicillin-clavulanic AUG 21 61,80 5 14,70 8 23,50 34 Apicillin-sulbactam SAM 12 35,30 4 17,60 18 52,90 34 Piperracillin-tazobactam PTZ 5 14,70 6 14,70 23 67,60 34 Cefepime CPM 14 41,20 15 14,70 5 14,70 34 Cefotaxime CTX 32 94,10 1 17,60 1 2,94 34 Ceftriaxone CRO 24 70,60 0 14,70 10 29,40 34 Cefuroxime CXM 18 52,90 5 14,70 11 32,40 34 Cefazidime CAZ 25 73,50 5 17,60 4 11,80 34 Imipenem IPM 9 26,00 3 14,70 22 65,00 34 Gentamycin GM 8 23,50 10 29,40 16 47,10 34 Tobramycin TOB 15 44,10 2 5,88 17 50,00 34 Amikacin AK 14 41,20 7 20,60 13 38,20 34 Tetracycline TE 16 47,10 3 8,82 15 44,10 34 Ciprofloxacin CIP 24 70,60 9 26,50 1 2,94 34 Levofloxacin LEV 15 44,10 5 14,70 14 41,20 34 Ofloxacin OFX 12 35,30 1 2,94 21 61,80 34 Trimethoprim- SXT 13 38,20 16 11,80 17 50,00 34 sulfamethoxazole Chloramphenicol C 13 38,20 2 5,88 19 55,90 34 Fosfomycin FOS 0 0,00 3 8,82 31 91,20 34 Kháng kháng sinh thuộc nhóm β-lactam: Kháng sinh thuộc nhóm Penicillin 14,7%-64,7%, kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin 41,2%-73,5%, kháng sinh nhóm Carbapenems 26%, kháng sinh thuộc nhóm monobactams 0%.
46 Nhìn chung, nghiên cứu của tác giả Mai Văn Tuấn ở bệnh viện trung ương Huế (2006) thì tỉ lệ kháng kháng sinh của K. pneumoniae là >70% [19].Trong nghiên cứu của chúng tôi, hầu hết trong 21 loại kháng sinh được khảo sát thì tỉ lệ kháng kháng sinh của Klebsiella spp. tương tự so với E. coli. Tuy nhiên, tỉ lệ kháng các kháng sinh thuộc nhóm Penicillin có bổ sung thêm chất ức chế β-lactamase, ceftazidime của Klebsiella spp. (14,7%-61,8% đối với kháng sinh có bổ sung thêm chất ức chế làβ-lactamase,và 73.5% đối với Cefazidime) lại cao hơn E. coli (14,7%-50,6%) đối với kháng sinh của bổ sung chất ức chế β-lactamase) và thấp hơnđối với ceftazidime (81,9%) và tỉ lệ kháng cefotaxime của Klebsiella spp. là 94,1% thấp hơn so với E. coli là 97,1%.Trong khi đó nghiên cứ của tác giả Hoàng Thị Phương Dung[12] thì tỉ lệ này chỉ đạt 40% thấp hơn nghiên cứu của chúng tôi khoảng 50%. Bên cạnh đó tỉ lệ kháng Ceftriaxome (70,6%) và cũng thấp hơn nhiều so vớiE. coli (86,7%). Chỉ có duy nhất nhóm kháng sinh Carbapenems thì có tỉ lệ (26%) cao hơn E.coli(7,2%). Ngoài ra, dựa theo bảng kết quả chúng tôi nhận thấy vi khuẩn Klebsiella spp. sinh ESBL cũng khá mạnh với hầu hết kháng sinh nhóm Aminoglycoside(tỉ lệ kháng Gentamycin 23,5%, kháng Tobramycin (44,1%), kháng Tetracycline 47,1%, còn nhóm kháng sinhQuinolones(tỉ lệ kháng Ciprofloxacin là 70,6%, kháng Levofloxacin là 44,1%), tỉ lệ kháng Trimethoprim-sulfamethoxazole 38,2% và kháng Chloramphenicol với tỉ lệ 38,2%.Cuối cùng,đối với kháng sinh Amikacin thì tỉ lệ kháng 41,2%. So sánh với kết quả nghiên cứu của tác giả Hoàng Thị Phương Dung[12], nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã nhìn thấy sự chênh lệch, nhưng không đáng kể. Cụ thể,tỉ lệ kháng kháng sinh lần lượt là (Gentamicin 44,7%, Tobramycin 42,6%, Levofloxacin 60,7%, Trimethoprim/ Sulfamethoxazole 87,2%). Qua đó chúng ta cũng thấy được Klebsiella spp. trong nghiên cứu này cũng là một chủng đa kháng thuốc, kháng kháng sinh nhóm β-lactam, đồng thời kháng cả nhómAminoglycosides,Tetracyclines,Trimethoprim/Sulfamethoxazole,Chloraphenicol. Trong số 21 kháng sinh khảo sát thì chỉ có duy nhất kháng sinh Fosfomycin là còn tác dụng với chủng vi khuẩn này.
47 4.7. Khảo sát tình hình kháng kháng thuốc của vi khuẩn Proteus spp.sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. Bảng 4.7. Tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Proteus spp. sinh ESBL Kháng Trung Nhạy cảm Tổng (R) gian(I) (S) Tên kháng sinh Ký số hiệu Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ chủng chủng (%) chủng (%) chủng (%) Ampicillin AMP 10 100,00 0 0,00 0 0,00 10 Piperacillin PRL 8 80,00 2 20,00 0 0,00 10 Amoxicillin- AUG 6 60,00 3 30,00 1 10,00 10 clavulanic Apicillin- SAM 3 30,00 3 30,00 4 40,00 10 sulbactam Piperracillin- PTZ 4 40,00 0 0,00 6 60,00 10 tazobactam Cefepime CPM 2 20,00 5 50,00 3 30,00 10 Cefotaxime CTX 10 100,00 0 0,00 0 0,00 10 Ceftriaxone CRO 7 70,00 0 0,00 3 30,00 10 Cefuroxime CXM 9 90,00 0 0,00 1 10,00 10 Cefazidime CAZ 2 20,00 1 10,00 7 70,00 10 Imipenem IPM 0 0,00 0 0,00 10 100,00 10 Gentamycin GM 6 60,00 1 10,00 3 30,00 10 Tobramycin TOB 5 50,00 0 0,00 5 50,00 10 Tetracycline TE 9 90,00 0 0,00 1 10,00 10 Ciprofloxacin CIP 9 90,00 0 0,00 1 10,00 10 Levofloxacin LEV 5 50,00 0 0,00 5 50,00 10 Ofloxacin OFX 5 50,00 0 0,00 5 50,00 10 Trimethoprim- SXT 8 80,00 0 0,00 2 20,00 10 sulfamethoxazole Chloramphenicol C 5 50,00 0 0,00 5 50,00 10 Fosfomycin FOS 3 30,00 0 0,00 7 70,00 10
48 Kháng kháng sinh thuộc nhóm β-lactam: Kháng sinh thuộc nhóm Penicillin 40%-100%, kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin 20%-100%, kháng sinh nhóm Carbapenems 0%, kháng sinh thuộc nhóm monobactams 0%. Nhóm nghiên cứu của chúng tôi, tiến hành nghiên cứu và khảo sát trên 22 chủng vi khuẩn Proteus spp. Tuy nhiên, chỉ có 10 chủng là sinh ESBL và kết quả đã được thể hiện rõ ở bảng 4.7. Đa số, chủng vi khuẩn Proteus spp. hầu hết kháng tất cả 20 loại kháng sinh duy nhất chỉ có kháng sinh Imipenem là còn nhạy cảm đối với vi khuẩn. Cụ thể, vi khuẩn Proteus spp.kháng 100% đối với các loại kháng sinh Ampicillin, Cefotaxime. Chỉ có một số loại kháng sinh bổ sung thêm chất ức chếβ- lactamase thì tỉ lệ kháng dao động 30-40% (đối với Piperracillin-tazobactam và Apicillin-sulbactam). Tuy nhiên, kháng sinh Cefazidime khi sử dụng ở chủng vi khuẩn này, thì tỉ lệ kháng chỉ đạt 20 % thấp hơn rất nhiều so với Klebsiella spp. và E. coli. Tetracycline (90%), Tobramycin (50%), Gentamicin (60%), Ciprofloxacin (90%), Levofloxacin (50%),
49 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: Tỉ lệ vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL là 52,26% (127/243 chủng) và tỉ lệ các chủng vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL lần lượt là E. coli:65,4% (83/127 chủng),Klebsiella spp.:26,8% (34/127 chủng),Proteus spp.: 7,9% (10/127 chủng). Tỉ lệ nhóm tuổi từ 50-70 chiếm tỉ lệ vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL cao nhất chiếm 35,39% và thấp nhất nhóm tuổi 10-29 chiếm 4,94%. Tỉ lệ bệnh nhân là nam giới chiếm 51,44% cao hơn bệnh nhân nữa là 48,56%. Vi khuẩn E.coli: Kháng nhóm khángsinh thuộc nhóm Penicillin 14,7%-90,4%, kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin 79,5%-97,6%, kháng sinh nhóm Carbapenems 7,2%. Vi khuẩn Klebsiella spp.:Kháng nhóm kháng sinh thuộc nhóm Penicillin 14,7%-64,7%, kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin 41,2%-73,5%, kháng sinh nhóm Carbapenems 26%. Vi khuẩn Proteus spp.:Kháng nhóm kháng sinh thuộc nhóm Penicillin 100%, chỉ có một số loại kháng sinh bổ sung thêm chất ức chế β-lactamase thì tỉ lệ kháng giao động 30-40% (đối với Piperracillin-tazobactam và Apicillin-sulbactam). 5.2 Kiến nghị Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã chỉ ra rằng vi khuẩn họ đường ruột kháng thuốc ngày càng tăng nhiều (một số không kháng sinh không còn tác dụng), nguyên nhân chính xuất phát từ ý thức sử dụng thuốc một cách tự ý không theo chỉ định của bác sỹ bên cạnh đó vi khuẩn họ đường ruột là một loại vi khuẩn phổ biến gây nên rất nhiều bệnh. Nhóm nghiên cứu chúng tôikiến nghị việc sử dụng kháng sinh nêntheo chỉ định của bác sĩ.
50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1.Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Dương Đức Tiến (1979), “Vi sinh vật học”, Nhà xuất bản Đại Học và Trung học chuyên nghiệp. 2.Nguyễn Thị Phương Dung(2014),”Khảo sát sự kháng kháng sinh cảu các vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp trong bệnh viện sinh ESBL”, Tạp chí khoa học ĐHSP TPHCM, số 3, Tr. 23-29. 3.Lê Văn Phủng (2009), “Vi khuẩn y học”, Nhà xuất bản Giáo dục. 4.Đại học Y dược(2007),” Bộ môn Vi sinh”, Thực tập vi sinh & miễn dịch. 5.Từ Minh Koóng (2007), “Kỹ thuật sản xuất dược phẩm- tập II”, Nhà xuât bản Y học. 6.Cao Thị Hồng (2006), “Thiết lập hệ thống đĩa giấy kháng sinh phát hiện ESBL”, Luận văn cử nhân công nghệ sinh học. Đại học Mở Tp. Hồ Chí Minh. 7.Bộ y tế(2006), “Vi khuẩn học”, Trường đại học Y dược TP.HCM - Khoa Y bộ môn vi sinh. 8.Nguyễn Thị Thu Ba(2011),”Cơ chế đề kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc”, Tập đoàn Y khoa Hoàn Mỹ. 9.Kiều Hữu Ảnh (2007), “Giáo trình vi sinh vật học – Lý thuyết và bài tập giải sẵn”, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật. 10.Nguyễn Thanh Bảo (2009), “Một số kỹ thuật cơ bản trong xét nghiệm vi sinh lâm sàng”, Nhà xuất bản Y học. 11.Trần Phương Bình, Phạm Hùng Vân (2007),“Nghiên cứu phát triển hệ thống phát hiện ESBL bằng cách kết hợp phương pháp đĩa đôi và phương pháp đĩa kết hợp”,Y Học TP. Hồ Chí Minh, Tr. 146-150. 12.Hoàng Thị Phương Dung (2009), “Khảo sát trực khuẩn Gram âm sinh men β – lactamse phổ rộng phân lập tại bệnh viện Đại học Y dược”, Luận văn thạc sĩ, Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh. 13.Bộ Y Tế và GARP –VN (2009). “Báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt Nam”.
51 14.Nguyễn Thanh Bảo (2009), “Một số kỹ thuật cơ bản trong xét nghiệm vi sinh lâm sàng”, Nhà xuất bản Y học. 15.Bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Hà Nội(1998),”Thực tập Vi sinh y học”,Nhà xuất bản y học. 16.Lê Hồng Minh(2009), “Vi sinh y học”, NXB giáo dục Việt Nam. Tr. 20-30. 17.Nguyễn Thị Ngọc Huệ và cộng sự (2004), “Kết quả giám sát tính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập được tại bệnh viện đa khoa Bình Định năm 2002 – 2004”, Tài liệu Hội nghị tổng kết hoạt động theo dõi sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại Việt Nam (ASTS)”, Tr. 86. 18.Chu Thị Nga và cộng sự (2005), “Tỉ lệ sinh beta- lactamase phổ rộng – ESBL ở các chủng Klebsiella, E. coli, và Enterobacter phân lập tại bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng từ tháng 7/2005 đến 12/ 2005, Báo cáo hội nghị tổng kết hoạt động thuốc và điều trị; hoạt động theo dõi sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thường gặp năm 2005”, Tr. 38 - 43. 19.Mai Văn Tuấn (2008), “Khảo sát trực khuẩn Gram âm sinh men β – lactamase phổ rộng phân lập tại bệnh viện trung ương Huế”, Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí Minh, số 12, Tr. 30-35. 20.Phạm Hùng Vân(2002), “Các kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng”, Bộ y tế, Trường Đại học Y dược TP HCM. Tr. 26-28. 21.Nguyễn Văn Duy, Quàng Thị Chính, Lưu Hồng Sơn, Nguyên Thị Phương Mai, Nguyễn Thị Huyền,” Khảo sát tình hình kháng thuốc của một số vi khuẩn gây bệnh tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên”, Tạp chí KH&CN Đại học Thái Nguyên, Tr. 145-152. 22.Vũ Thị Kim Cương (2007), “Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây nhiễm bệnh viện tại bệnh viện Thống Nhất từ 15/10/2004 đến 30/06/2005”, Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh. 23.Nguyễn Văn Duy, Nông Thị Đẹp, Nguyễn Thị Huyền (2017), “ Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của nhóm trực khuẩn Gram âm được phân lập tại bệnh viện đa khoa Trung ương Thái Nguyên”, Tr. 1-2.
52 Tài liệu Tiếng Anh 24.Patricia A. Bradford (2001), “Extended – spectrum β-lactamases in the 21th centrury characterization, epidemiology, and detection of this importan resistance threat”, Clinical Microbiology reveiw, vol.14, pp. 933 – 951. American Society for Microbiology. 25.Sougakoff W, Goussard S, Courvalin P. (1998), “The TEM-3 β-lactamase, which hydrolyzes broad-spectrum cephalosporins, is derived from the TEM2 penicillinase by two amino acid substitutions”, FEMS Microbiol Lett, 56:343–348. 26.Tzouvelekis LS, Bonomo R A. (1999), “SHV-type β-lactamases”, Curr Pharm Des, 5:847–864. 27.Danel, F., L.M.C. Hall, B.Duke, D. Gur, and D.M. Livermore (1999), “OXA – 17, a futher extended – spectrum variant of OXA – 10 β-lactamase, isolated from Pseudomonas aeruginosa”, Antimicrob. Agents Chemother, pp 1362 – 1366. 28.Moland ES, Hanson ND, Black JA, Hossain A, Song W, Thomson KS. (2001), “Prevalence of newer beta-lactamases in gram-negative clinical isolates collected in the United States from 2001 to 2002”, J Clin Microbiol, 44: 3318–3324. 29.Dennesen PJ et al. (2001), “Resolution of infectious parameters after antimicrobial therapy in patients with ventilator – associated P. pneumonia”, Am J Respire Crit Care Med, 161:1371 – 5. 30.Yoichi Hirakata, Junichi Matsuda (2005), “Regional variation in the prevalence of extended – spectrum β-lactamases- producing clinical isolates in Asia – Pacific region”, Diagnostic Microbiology and Infectious Diease, pp 323 – 329. Tài liệu Internet 31. 20171113070319572.htm
PHẦN PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trường nuôi cấy, phân lập, xác định tính chất sinh hóa và làm kháng sinh đồ. Môi trường Thành phần Số lượng Cách pha chế Đun nóng chảy 250 ml thạch thường đựng trong bình cầu, Thạch thường để nguội khoảng 55-60◦C. 250ml Thạch máu Máu thỏ đã loại tơ Cho 15ml máu thỏ vào bình 15ml huyết thạch. Lấy tay lắc xoay tròn cho máu tan đều. Đổ môi trường vào đãi peptri. Làm như thạch máu rồi đun Thạch thường 250ml cách thủy 80◦C trong 10 Máu thỏ đã loại bỏ 15ml Thạch Chocolate phút. Chú ý phải lắc đều tơ huyết trong bình thạch. Đẻ nguội Soco 12g 45-50◦C. Đun cách thủy môi trường cho tan thạch. Hấp ở 121◦C Muller- Hinton 15g trong 15 phút. Để nguội 45- Muller- Hinton Nước cất 0.31ml 50◦C, đổ ra đĩa peptri(độ pH=7.0-7.2 dày môi trường ±4mm). Đảm bảo vô trùng. Đun sôi hòa tan các chất, Nước cất 300ml đem đi hấp ở 110◦C trong 30 Thạch Uti Uti 20g phút. Đợi nguội 45-50◦C, đổ đều ra các đĩa peptri. Đun sôi hòa tan các chất, 300ml Nước cất đem đi hấp ở 110◦C trong 30 Thạch Mac 17g Mac phút. Đợi nguội 45-50◦C, đổ đều ra các đĩa peptri.