›

Đồ án Bước đầu thử nghiệm khả năng xử lý dầu thô ở phòng thí nghiệm của các chủng vi khuẩn phân lập từ biển Cần Giờ

pdf 61 trang thiennha21 12/04/2022 6620
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Bước đầu thử nghiệm khả năng xử lý dầu thô ở phòng thí nghiệm của các chủng vi khuẩn phân lập từ biển Cần Giờ", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_buoc_dau_thu_nghiem_kha_nang_xu_ly_dau_tho_o_phong_thi.pdf

Nội dung text: Đồ án Bước đầu thử nghiệm khả năng xử lý dầu thô ở phòng thí nghiệm của các chủng vi khuẩn phân lập từ biển Cần Giờ

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG XỬ LÝ DẦU THÔ Ở PHÒNG THÍ NGHIỆM CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ BIỂN CẦN GIỜ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : CN. Nguyễn Hoàng Mỹ Sinh viên thực hiện : Tống Khánh Tuyền MSSV: 107111215 Lớp: 07DSH2 TP. Hồ Chí Minh, 2011
  2. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền CHƢƠNG MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Từ khi được phát hiện cho đến nay, dầu thô đã và đang là nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá của mỗi quốc gia nói riêng và toàn thế giới nói chung. Ngay nay dầu thô và các sản phẩm của dầu thô được khai thác và sử dụng với khối lượng ngày càng tăng. Dầu thô đang có mặt trong hầu hết các lĩnh vực đời sống sinh hoạt hàng ngày của con người cũng như trong hoạt động công – nông nghiệp. Bên cạnh ưu điểm về kinh tế và xã hội, các sản phẩm dầu thô là mối đe dọa ô nhiễm môi trường. Những yếu tố khách quan và chủ quan khi khai thác và sử dụng dầu đều có thể gây nên hiểm họa cho môi trường sinh thái. Có rất nhiều vụ tràn dầu trên sông, biển đã xảy ra trên toàn thế giới và để lại hậu quả đáng lo ngại. Đó là chưa kể đến việc khai thác dầu ở thềm lục địa và việc rửa tàu chuyên chở dầu vô ý thức đã và đang gây nên ảnh hưởng nghiêm trọng đến các hệ sinh thái. Ở Việt Nam trong vòng 10 năm qua đã có hơn 50 vụ tràn dầu lớn nhỏ, thiệt hại không kiểm soát được. Chính vì thế việc nghiên cứu tìm cách phòng ngừa ô nhiễm dầu và đưa ra các chính sách bảo vệ môi trường nói chung, ô nhiễm dầu gây ra nói riêng đã trở nên hết sức cấp thiết. Hiện nay có nhiều phương pháp khắc phục các sự cố tràn dầu trên biển như: phương pháp cơ học, phương pháp hóa học, phương pháp sinh học. Nhưng các biện pháp cơ học và hóa học sử dụng các thiết bị tách dầu hiện đại nhất hiện nay cũng không loại bỏ được các thành phần độc của dầu. Trong khi đó phương pháp sinh học là một trong các phương pháp làm sạch ô nhiễm dầu có tính ưu việt nhất với giá thành rẻ, không gây ô nhiễm về sau. Xử lý dầu tràn bằng các chủng vi sinh vật giúp làm sạch dầu trên biển và giúp chúng ta hiểu hơn về quá trình chuyển hóa của các thành phần dầu và 1
  3. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền qua đó có thể điều khiển quá trình phân hủy sinh học dễ dàng hơn nhằm làm tăng hiệu quả xử lý. Góp phần trong công tác ứng cứu tràn dầu trên biển và làm sạch dầu trong quá trình khai thác và vận chuyển đặc biệt là tại Việt Nam, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: „„Bước đầu thử nghiệm khả năng xử lý dầu thô ở quy mô phòng thí nghiệm của các chủng vi khuẩn phân lập từ biển Cần Giờ”. 2. Tình hình nghiên cứu  Nghiên cứu ở Việt Nam Năm 2003, tác giả Lại Thúy Hiền nghiên cứu về chất hoạt động bề mặt sinh học do vi sinh vật tạo ra, ứng dụng trong công nghệ dầu khí cả xử lý môi trường. Kết quả phân lập được 4 chủng vi sinh vật Pseudomonas pesudomatei, Pseudomonas aeruginosa, Cryptococcus terreus và Candida guiller có khả năng sinh ra các chất hoạt động bề mặt có hoạt tính cao, tác dụng làm tăng quá trình phân hủy dầu tổng. Kết quả 67% lượng dầu tràn, thúc đẩy nhanh quá trình xử lý ô nhiễm dầu. [7] Đề tài cấp nhà nước số KHCN 02 – 12 “Nghiên cứu và làm sạch dầu bằng phương pháp phân hủy dầu mỏ bằng phương pháp phân hủy sinh học” do tiến sỹ Đặng Thị Cẩm Hà chủ trì cùng đồng nghiệp tiến hành từ năm 1999 – 2000, đã được hội đồng nghiệm thu nhà nước đánh giá đạt loại xuất sắc. Thành quả đạt được của đề tài là chế phẩm cung cấp cho quá trình xử lý dầu ô nhiễm ở các môi trường sinh thái khác nhau và xây dựng quy trình xử lý ô nhiễm dầu ở môi trường nước. [1] Viện Công nghệ sinh học đã sản xuất và đưa vào sử dụng hiện nay gồm Oicleanser 1, Oicleanser 2, Oicleanser 3. Các chế phẩm sinh học, các chất vi lượng đã được sản xuất và đáp ứng yêu cầu xử lý các loại hình ô nhiễm dầu ở các điều kiện sinh thái khác nhau. [1] 2
  4. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền  Nghiên cứu trên thế giới Các nhà khoa học ở California đã có một cải tiến quan trọng trong kỹ thuật làm sạch dầu loang ở biển, hồ và những khu vực lưu thông đường thủy, đó là máy lọc dầu cải tiến. Đây là thiết bị chủ yếu thu hồi dầu loang trên biển, đối với một khu vực có bề mặt dầu loang rộng lớn, thiết bị có nhiều rãnh này sẽ thu được nhiều dầu hơn thiết bị hớt váng dầu thông thường với bề mặt phẳng, thiết bị này thu gom gần như 100% dầu bám dính trên mặt thiết bị. Nhóm nghiên cứu thuộc Viên Công Nghệ Massaachusetts (MIT) ở Mỹ đã nghiên cứu ra một loại bọt biển nano có thể hút dầu loang khởi mặt nước. Loại bọt biển này là một tấm lưới gồm những sợi nano bằng oxit mangan có đường kính khoảng 20 nano mét đan nối với nhau, thiết bị còn được phủ lên một lớp silicon trên lưới đã giúp nó không thấm nước. Do có nhiều lỗ thông khí, lưới nano hoạt động như một miếng bọt biển, có thể hút được lượng dầu gấp 20 lần trọng lượng của nó. Với bề mặt không thấm nước, bọt biển này chỉ hút những chất không tan trong nước như dầu, bọt biển này chỉ hút những chất không tan trong nước hầu như dầu, bọt biển nano còn có thể đẩy ra gần như 100% nước. Hiện nay trên thị trường thế giới có rất nhiều chế phẩm cung cấp cho quá trình xử lý dầu tràn. Một số chế phẩm làm từ bông phế thải, chỉ có tính chất thu hồi dầu ở trên sàn dính dầu và không có khả năng phân hủy dầu. Các chế phẩm này sau khi thu gom phải xử lý tiếp, hoặc đốt ở nhiệt độ cao (<12000C) hay xử lý bằng phương pháp sinh học. Gần đây xuất hiện một số loại vật liệu thấm dầu có kết hợp phân hủy vi sinh vật của các nước tiên tiến như: Enretech (Mỹ), Non – Oil (Anh), Spill – Sorb (Canada), [12][14] 3
  5. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền 3. Mục đích nghiên cứu Xác định khả năng xử lý của các chủng vi sinh vật phân lập có khả năng phân hủy dầu trên mẫu nước biển nhiễm dầu ở quy mô phòng thí nghiệm. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Xây dựng sơ đồ bố trí thí nghiệm xử lý. Xây dựng khả năng phân hủy dầu của các chủng vi sinh vật. Đánh giá tiềm năng ứng dụng của các chủng vi sinh vật trên thực tế. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp thu thập tài liệu. Phương pháp xác định vi sinh vật. Phương pháp thử nghiệm khả năng phân hủy dầu của các vi sinh vật. 6. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài Tuyển chọn các chuẩn vi sinh khuẩn có khả năng phân hủy dầu từ nguồn nước nhiễm dầu. Đánh giá được một số vi khuẩn có khả năng phân hủy dầu mạnh làm cơ sở cho việc sử dụng hợp lý, hiệu quả các nguồn mẫu vi sinh vật tại chỗ nhằm nâng cao hiệu quả xử lý. 4
  6. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về dầu thô 1.1.1. Định nghĩa Dầu thô là một chất lỏng sánh đặc màu nâu hoặc ngả lục. Dầu thô tồn tại trong các lớp đất đá tại một số nơi trong vỏ Trái Đất. Dầu thô là một chất phức tạp, là một hợp chất hữu cơ cao phân tử hỗn hợp trong thiên nhiên, hầu như chỉ chứa các hydrocarbon, thuộc gốc alkane, thành phần rất đa dạng. Hiện nay 88% dầu thô chủ yếu dùng để sản xuất dầu hỏa, diezen và xăng nhiên liệu, 12% dầu thô cũng là nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất ra các sản phẩm của các ngành hóa dầu như dung môi, phân hóa học, nhựa, thuốc trừ sâu, nhựa đường Đây là nguồn năng lượng không tái tạo, được hình thành từ xa xưa bằng những phản ứng phức tạp xảy ra dưới điều kiện áp suất và nhiệt độ ở độ sâu nhất định, cùng với các vận động địa chất. [2] 1.1.2. Thành phần – tính chất hóa học Một cách tổng quát thì thành phần hóa học của dầu thô được chia làm thành hai thành phần chính: Các hợp chất hydrocarbon (HC): là hợp chất mà trong thành phần của nó chỉ chứa hai nguyên tố là carbon và hydro. Các hợp chất phi hydrocarbon: là các hợp chất mà trong thành phần của nó ngoài carbon, hydro còn chứa thêm các nguyên tố khác như nitơ, lưu huỳnh, oxy Ngoài HC trong dầu thô còn có các thành phần khác như: các chất nhựa, asphanten, và các kim loại nặng. Trong dầu thô, hàm lượng HC là thành phần chủ yếu. Đây cũng là yếu tố quyết định loại sản phẩm và hiệu suất trong quá trình sản xuất các sản phẩm từ dầu. Đối với các hợp chất phi HC, mặc dù chiếm hàm lượng không 5
  7. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền lớn nhưng hầu hết là các hợp chất có hại. Vì vậy trong quá trình chế biến ra các sản phẩm cần phải loại bỏ các thành phần trong hợp chất phi HC. [2][10] 1.1.2.1. Các hợp chất hydrocarbon của dầu Trong dầu thô có tới hàng trăm loại hydrocarbon khác nhau ở tính bay hơi, tính hòa tan, tính hấp thụ đại diện cho nhiều loại cấu trúc hóa học riêng biệt. HC được chia làm 3 loại:  Các hợp chất parafin Parafin là loại HC rất phổ biến trong các loại HC của dầu thô. Tùy theo cấu trúc mà parafin được chia 2 loại đó là: parafin mạch thẳng không nhánh (n-parafin) và parafin có nhánh (iso-parafin). N-parafin là loại hydrocarbon dễ tách và dễ xác định nhất trong số các loại hydrocarbon của dầu thô, cho nên hiện nay với việc sử dụng phương pháp sắc ký kết hợp với rây phân tử để tách n-parafin, đã xác định được tất cả các n-parafin từ C1 đến C45. Hàm lượng chung các n-parafin trong dầu thường chiếm 25 – 30% thể tích. Tùy theo dầu được tạo thành từ những thời kỳ địa chất nào, mà sự phân bố các n-parafin trong dầu sẽ khác nhau. Sự phân bố này tuân theo quy tắc sau: tuổi càng cao, độ sâu lún chìm càng lớn, thì hàm lượng n-parafin trong dầu càng nhiều. I-parafin trong dầu thô có cấu trúc đơn giản, mạch chính dài, mạch phụ ít và ngắn. Các nhánh phụ thường là các gốc mêtyl, đối với các iso-parafin một nhánh phụ thì thường dính vào vị trí carbon số 2 hoặc số 3. [2][10]  Các hợp chất vòng no hay các hợp chất naphten Naphten là các hợp chất vòng no, đây là một trong số các hydrocarbon phổ biến và quan trọng của dầu thô. Hàm lượng của chúng trong dầu thô có thể thay đổi từ 30 – 60% trọng lượng. Naphten của dầu thô thường gặp dưới 3 dạng chính: loại vòng 5 cạnh, loại vòng 6 cạnh hoặc loại vòng ngưng tự hoặc qua cầu nối còn những loại vòng 7 cạnh trở lên thường rất ít không đáng kể. 6
  8. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Bằng phương pháp phân tích quang phổ khối cho biết số vòng của naphten có thể lên đến 10 - 12 có nhiệt độ sôi rất cao.  Các hydrocarbon thơm hay aromatic Các hydrocarbon thơm là hợp chất hydrocarbon mà trong phân tử của chúng có chứa ít nhất một nhân thơm. Trong dầu thô có chứa cả loại một hoặc nhiều vòng. Hàm lượng của chúng chiếm khoảng 10 – 20%. Hiện nay có hơn 425 loại hydrocarbon trong dầu thô với số carbon từ C5 đến C60, tương ứng với trọng lượng phân tử từ 855 đvC đến 880 đvC. Bằng những phương pháp hiện đại đã xác định được một số hydrocarbon có trong dầu thô (Bảng 2.1). [2][10] 1.1.2.2. Các hợp chất phi hydrocarbon Là những hợp chất hữu cơ mà trong phân tử của nó ngoài carbon, hydro còn chứa oxy, nitơ, lưu huỳnh.  Hợp chất lưu huỳnh trong dầu thô Đây là loại hợp chất phổ biến nhất và cũng đáng chú ý nhất trong số các hợp chất không thuộc loại hydrocarbon của dầu thô. Những loại dầu thô ít lưu huỳnh thường có hàm lượng lưu huỳnh không quá 0,3 – 0,5%. Nhưng loại dầu thô nhiều lưu huỳnh thường 1 – 2% trở lên. 7
  9. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Bảng 2.1: Một số hydrocarbon đã xác định trong dầu thô Dãy đồng Số nguyên tử STT Các hydrocarbon đẳng trong phân tử 1 N-parafin CnH2n+2 C1 – C45 2 I-parafin CnH2n+2 C4 – C11 3 I-parafin (loại iso prenoid) CnH2n+2 C14 – C25 Cycloparafin 1 vòng CnH2n C5 – C12 2 vòng CnH2n-2 C8 – C12 4 3 vòng CnH2n-4 C10 – C13 4 vòng CnH2n-6 C14 – C30 5 vòng CnH2n-8 C14 – C30 Hydrocarbon thơm 1 vòng CnH2n-6 C6 – C11 1 vòng có nhiều nhóm thế CnH2n-6 C9 – C12 2 vòng CnH2n-12 C10 – C16 5 2 vòng loại difenyl CnH2n-14 C12 – C15 3 vòng loại phênanten CnH2n-18 C14 – C16 3 vòng loại fluoren CnH2n-16 C15 – C16 4 và nhiều vòng CnH2n-24 C16 – C18 Hydrocarbon hổn hợp 6 naphten – thơm ( loại CnH2n-8 C9 – C14 indan & tetralin) (Nguồn: Báo cáo chuyên đề CNSH-MT, trường đại học Nông Lâm Tp.HCM) 8
  10. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Hiện nay trong dầu thô đã xác định được 250 loại hợp chất của lưu huỳnh. Một số hợp chất của lưu huỳnh: Mercaptan: R-S-H Sunfua: R-S-R‟ Đisunfua: Lưu huỳnh tự do: S, H2S  Hợp chất của nitơ trong dầu thô Các hợp chất của nitơ đại bộ phận điều nằm trong phân đoạn có nhiệt độ sôi cao của dầu thô. Ở các phân đoạn nhẹ, các hợp chất chứa nitơ chỉ thấy dưới dạng vết. Hợp chất chứa nitơ có trong dầu thô không thấm nhiều lắm, hàm lượng nguyên tố nitơ chỉ từ 0,01 đến 1%. Trong cấu trúc phân tử của nó có thể có loại chứa một nguyên tử nitơ, hay loại chứa 2, 3 thậm chí 4 nguyên tử nitơ. Những hợp chất chứa một nguyên tử nitơ được nghiên cứu nhiều, chúng thường mang tính bazơ như pyridin, quinolin, iso quinolin, acrylin hoặc có tính chất trung tính như các vòng pyrol, indol, cacbazol, benzocacbazol. Những hợp chất chứa 2 nguyên tử nitơ trở lên thường có rất ít, chúng thường ở dạng Indolquinolin, Indolcacbazol và porfirin. [2][10]  Hợp chất của oxy trong dầu thô Là các hợp chất chứa oxy thường có dưới dạng các axit (-COOH), xetôn (-C=O), phenol, và các loại ester và lacton. 9
  11. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Trong số các chất chứa oxy thì ở dạng axit là quan trọng nhất. Các axit trong hầu hết là các axit một chức. Trong các phân đoạn có nhiệt độ sôi thấp của dầu thô các axit hầu như không có. Axit chứa nhiều nhất ở phân đoạn có nhiệt độ sôi trung bình của dầu thô (C20 – C23) các axit có gốc là vòng naphten nên chúng được gọi là các axit Naphtenic. Phân đoạn có nhiệt độ sôi cao hơn thì hàm lượng các axit lại giảm đi. Các phenol trong dầu thô thường gặp là phenol và các đồng đẳng của nó. Hàm lượng phenol nói chung chỉ khoảng 0,1 – 0,2%. Các xêtôn mạch thẳng C2 – C5 tìm thấy trong dầu, nhiệt độ sôi cao thì có xêtôn vòng. [2][10] 1.1.2.3. Các thành phần khác Kim loại có trong dầu thô chiếm từ vài phần triệu đến vài phần vạn, thường ở các phân đoạn có nhiệt độ sôi cao dưới dạng phức với các hợp chất hữu cơ (cơ – kim), thông thường là dạng phức với các chất hữu cơ khác trong dầu thô, dạng phức với porphirin thường có số lượng ít hơn. Những kim loại nằm trong phức porphirin thường là các Niken (Ni) và Vanidi (Va). Trong những loại dầu thô nhiều lưu huỳnh chứa nhiều porphinrin dưới dạng phức với Vanidi, ngược lại trong dầu ít lưu huỳnh, đặt biệt chứa nhiều nitơ thì thường chứa nhiều porphirin dưới dạng phức Niken. Trong dầu chứa nhiều lưu huỳnh tỷ lệ Va/Ni > 1 (310 lần), dầu chứa ít lưu huỳnh tỷ lệ Va/Ni < 1 (0,1). Ngoài Va và Ni còn có thể có Fe, Cu, Zn, Ti, Ca, Mn Số lượng các phức kim loại này thường rất ít so với các phức Va và Ni. Ngoài pophirin còn có những vòng thơm hoặc naphten ngưng tụ. Loại phức này tuy chiếm phần lớn, nhưng vẫn chưa nghiên cứu được đầy đủ. Bên cạnh các kim loại trong dầu thô thì có các chất nhựa và asphalten của dầu thô là những chất mà trong cấu trúc phân tử của nó ngoài C và H còn có đồng thời các nguyên tố khác như: S, O, N. 10
  12. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Asphalten có màu nâu sẫm hoặc đen dưới dạng bột rắn thù hình, đun nóng cũng không chảy mềm, chỉ có bị phân hủy nếu nhiệt độ đun sôi cao hơn 3000C tạo thành khí và cốc, nên trọng lượng phân tử của chúng có thể thay đổi trong phạm vi rộng từ 1000 đvC tới 10000 đvC hoặc cao hơn. Asphalten không hòa tan trong rượu, trong xăng nhẹ, nhưng có thể hòa tan trong benzene, clorofor và CS2. Asphalten hòa tan trong một số dung môi trên thì thực ra chỉ là quá trình trương trong để hình thành nên dịch keo. Các chất nhựa, nếu tách ra khỏi dầu thô chúng sẽ là những chất lỏng đặt quánh, đôi khi ở trạng thái rắn. Chúng có màu sẫm vàng hoặc nâu, tỷ trọng lớn hơn 1, trọng lượng phân tử từ 500 đvC đến 2000 đvC. Nhựa hòa tan được hoàn toàn trong các loại dầu nhờn của dầu thô, xăng nhẹ, cũng như trong benzen, chloroform, etse. Khác với asphalten, nhựa khi hòa tan trong các dung môi trên chúng tạo thành dung dịch thực. [2][10] 1.1.3. Khái thác và vận chuyển dầu Khai thác dầu khí ở Việt Nam đứng hàng thứ tư Đông Nam Á, sau Malysia, Indonesia và Philippine, đứng hàng thứ 44 trong danh sách các nước sản xuất dầu trên thế giới. Các mỏ đã đưa vào khai thác: Tiền Hải C, Đông Quan D, D14 (bể Sông Hồng); Bạch Hổ, Rồng, Rạng Đông, Phương Đông, Ruby, Sư Tử Đen, Sư Tử Vàng, Cá Ngừ Vàng (bể Cửu Long); Đại Hùng, Lan Tây, Rồng Đôi, Rồng Đôi Tây (bể Nam Côn Sơn); Cái Nước, Sông Đốc (bể Malay - Thổ chu). Trong những năm gần đây sản lượng dầu hiện đang giảm mạnh, nhất là các mỏ đã được khai thác từ trước như: Bạch Hổ, Sư Tử Đen, (Bảng 1.2) 11
  13. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Bảng 1.2: Sản lượng khai thác dầu ở Việt Nam (triệu tấn/năm) Tên mỏ 2009 2010 2011 Bạch Hổ 5,45 4,82 4,26 Rồng 0,84 1,21 1,03 Sư Tử Đen 1,49 1,12 0,84 Sư Tử vàng 3,29 2,8 2,24 Cá Ngừ vàng 0,57 0,34 0,21 Rạng Đông 1,17 0,88 0,66 (Nguồn: Tập chí thông tin dầu khi) Công tác tìm kiếm và thăm dò dầu khí đã được Tập đoàn Dầu khí Việt Nam triển khai mạnh mẽ trên toàn thềm lục đại Việt Nam với mục tiêu phát triển nhiều mỏ dầu mới, đáp ứng nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Sau thời gian tìm kiếm và thăm dò đã đạt được kết quả sau: Các mỏ chuẩn bị đưa vào khai thác: Bạch Hổ 19, Trung tâm và Nam trung tâm Rồng, Sư Tử Trắng, Hải Sư Trắng, Hải Sư Đen, Thăng Long, Đông Đô, Topaz, Pearl, Diamond (bể Cửu Long); Hải Thạch, Mộc Tinh, Lan Đỏ, Thiên Ưng, Mãng Cầu (bể Nam Côn Sơn); Hoa Mai, cụm mỏ Rạch Tàu - Phú Tân - Khánh Mỹ, Kim Long (bể Malay - Thổ Chu). Bên cạnh Tập đoàn dầu khí Việt Nam đã và đang triển khai thành công các hoạt động tìm kiếm, thăm dò khai thác dầu thô ở nước ngoài. Hiện nay đã tham gia đầu tư vào 13 dự án ở: Cuba, Lào, Campuchia, Indonesia Trong giai đoạn từ năm 2011 – 2015, Petro Việt Nam là tập đoàn dầu khí lớn ở Việt Nam đã đầu tư vào 25 dự án thăm dò khai thác và phát triển dầu khí với mức đầu tư 2.35 tỷ USD tại Nga, Venezuela và các nước Châu Mỹ Latin, Bắc Phi Muốn khai thác dầu thô, người ta khoan những lỗ khoan gọi là giếng dầu. Khi khoan trúng lớp dầu mỏng, dầu sẽ tự phun lên do áp suất cao của khí 12
  14. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền dầu. Khi lượng dầu giảm thì áp suất khí cũng giảm, người ta phải dùng bơm hút dầu lên hoặc bơm nước xuống để đẩy dầu lên. [11][13] 1.2. Tổng quan về vi sinh vật phân hủy dầu 1.2.1. Sự phân bố Các vi sinh vật có khả năng phân hủy hydrocarbon thô và các hợp chất liên quan xuất hiện khắp nơi, trong môi trường nước biển, nước ngọt và đất. Cho đến nay, người ta đã xác định hơn 200 loài vi khuẩn, và nấm có khả năng phân hủy được các hydrocarbon. Trong môi trường biển vi khuẩn là nhóm phân hủy hydrocarbon ưu thế và phân bố trong cả vùng cực lạnh. Còn trong nước ngọt, nấm đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy dầu. Số lượng và thành phần vi sinh vật không đồng đều ở những khu vực khác nhau ở những độ sâu khác nhau tùy theo điều kiện môi trường cụ thể. Những môi trường có chứa nhiều chất hữu cơ, số lượng và thành phần vi sinh vật phát triển mạnh. Ngược lại, những khu vực nghèo chất hữu cơ, số lượng và thành phần vi sinh vật ít hơn. Trên mặt đất, số lượng và thành phần vi sinh vật rất ít, do độ ẩm không thích hợp và do tác động của tia ánh sáng mặt trời làm cho phần lớn vi sinh vật bị tiêu diệt. Trong đất, thường gặp các loài vi khuẩn như: Bac.mycoides, Bac.subtilis, Bac.mensentriricus, Micrococcusslbus. Độ sâu từ 10cm đến 20cm, số lượng và thành phần vi sinh vật tập chung nhiều ở độ sâu này, độ ẩm vừa thích hợp (50% - 90%), các chất dinh dưỡng lại tích lũy nhiều, không bị tác dụng của chiếu sáng nên vi sinh vật phát triển nhanh. Các quá trình chuyển hóa quan trọng trong đất chủ yếu xảy ra ở độ sâu này. Số lượng và thành phần vi sinh vật giảm ở độ sâu trên 30cm, vi sinh vật có độ sâu này thường là nhóm yếm khí, đồng thời có khả năng chịu được áp suất lớn. Ở lớp đất này hầu như chất hữu cơ rất hiếm nên vi sinh vật rất khó phát triển. Số 13
  15. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền lượng và thành phần vi sinh vật phân hủy dầu trong đất còn giảm mạnh ở những nơi có nhiều đá cuội, cát, sỏi làm cho số lượng và thành phần vi sinh vật ít hơn. [6][8][12] 1.2.2. Các nhóm vi sinh vật phân hủy dầu 1.2.2.1. Vi sinh vật phân hủy hydrocarbon Năm 1897, Miyoshi công bố rằng Isotrytis Cinevea có khả năng phân hủy paraffin. Năm 1906, Rahn nghiên cứu sự phân giải paraffin của nấm mốc. Bắt đầu từ đó mà có hàng loạt các nghiên cứu cho thấy rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng phân hủy dầu ở bảng 1.3. [12] 1.2.2.2. Cơ chế phân hủy hydrocarbon Vi sinh vật sử dụng hydrocarbon làm nguồn dinh dưỡng và năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển. Việc sử dụng các hydrocarbon của vi sinh vật có thể xảy ra theo hai hướng. Với một số hydrocarbon tan trong nước, vi sinh vật có thể hấp thụ trực tiếp. Với các hydrocarbon khó tan mà có thể tan dưới dạng nhũ tương dầu – nước thì quá trình phân hủy vi sinh vật theo trình tự các bước: đầu tiên là hòa tan các hydrocarbon dưới dạng nhũ tương dầu nước bằng cách tiết ra các chất hoạt hóa bề mặt sinh học, sau đó vi sinh vật tiếp xúc với dầu, cuối cùng nó tiết ra các enzyme để chuyển hóa các hydrocarbon thành các chất mà nó có thể sử dụng được. [6]  Cơ chế phân hủy hydrocarbon Khả năng phân hủy của các ankan phụ thuộc vào cấu trúc phân tử của chúng. Thông thường các hydrocarbon bậc 1 và bậc 2 dễ phân hủy hơn các hydrocarbon bậc 3 và 4. 14
  16. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Bảng 1.3: Những vi sinh vật phân hủy hydrocarbon trong dầu. Vi sinh vật Hydrocarbon Nấm Vi khuẩn Microccoccus Cerificans Candida Tropicalis Hecxandecan Micrococcus Cerificans Candida sp. Bacillus Thermophil Mycobacterium Lacticotum Nocardia Sp M.Rubum Vas propanicum Oxadecan Candida lipolyticu M.Flavum Vas Math Nicum Fseudomonas Aerygimosa Nocardia Sp. Mycobacterium Phiei C12 – C20 Candida Guilliermondi C12 – C15 Micrococcu Cerficans C13 – C19 Candida Tropicalis Torulopsis C14 – C18 Candida Tropicalis Lipolytica C.Pelliculosa C.Intermedia C14 – C19 Candida Intermetia C. Lipolytica Candida albicans C.Tropicalis C15 – C28 Candida lipolytica N-paraffin Pseudomonas (Nguồn: Lại Thúy Hiền, Giáo trình vi sinh vật dầu mỏ) 15
  17. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền  Cơ chế phân hủy n-ankan: Quá trình phân hủy ankan nhờ vào enzyme mono-oxygenaza và di- oxygenaza, đòi hỏi có sự tham gia của một phân tử oxy và chất cho điện tử NADPH2.  Các giai đoạn oxy hóa ankan: Giai đoạn 1: Tạo thành rượu, xảy ra qua 2 bước Tạo thành hợp chất peoxyt R - CH2 - CH3 + O2 R - CH2 - CH2 - OOH Hợp chất peoxyt không bền dưới tác dụng của NADPH2 tạo thành rượu và nước: R - CH2 - CH2 - OOH + NADPH2 RCH2 - CH2 - OH + H2O + NADP (2) Từ ankan chuyển thành rượu có hai khả năng xảy ra: Tạo thành rượu bậc 1: xảy ra khi nhóm OH gắn vào C bậc 1 (2) Tạo thành rược bậc 2: khi nhóm OH gắn với C bậc 2 R - CH2 - CH2 - OOH + O2 + NADPH2 R-CH- CH + H2O + NADP OH Giai đoạn 2: Rượu bậc 1 tạo thành andehit: R - CH2 - CH2 - OH + 1/2O2 R - CH2 - CHO + H2O Rượu bậc 2 tạo thành xeton: R - CH - CH3 + 1/2O2 R - CH - CH3 + H2O OH O Giai đoạn 3: tạo thành axit béo Các xeton bị oxy hóa thành ester, liên kết ester bị phá vỡ tạo ra một axit và rược bậc một, rược bậc 1 lại bị oxy hóa thành andehit rồi bị oxy thành axit béo. 16
  18. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền R- CH2 - C- CH3 R - CH2 - O - C - CH3 R- CH2 - OH + CH3 - COOH O O Các andehit bị oxy hóa bằng axit béo: R - CH2 - CHO + 1/2O2 R - CH2 - COOH Các trường hợp sự oxy hóa xảy ra ở cả hai đầu của ankan tạo thành các diol, các dicacbonxylie. Giai đoạn 4: Các axit béo bị oxy hóa tiếp nhờ quá trình oxy hóa. Axit béo mạch dài dưới tác dụng của một loải enzyme chuyển sang dạng acety coenzyme A và chuyển hóa tiếp dưới tác dụng của nhiều enzyme khác. Kết quả là sau mỗi chu kì chuyển hóa, một nhóm acetyl CoA bị cắt ra và phân tử axit béo bị cắt đi hai nguyên tử carbon. Sản phẩm cuối cùng của chu trình oxy hóa là CO2 và nước.  Cơ chế phân hủy các ankan mạch nhánh. Do cản trở về mặt không gian nên khả năng phân hủy ưu tiên C bậc 1 và bậc 2, còn C bậc 3 và 4 thì khó phân hủy hơn. Ankan là nhóm metyl ở đầu mạch khó phân hủy hơn ở giữa mạch. Ankan có mạch dài dễ bị phân hủy hơn ankan có mạch nhánh ngắn. Trong quá trình sự phân hủy các ankan mạch nhánh, người ta đề xuất biến dạng của chu trình Metylcitrat, thay vào vị trí của axit citric và metylcitrat.  Cơ chế phân hủy các cycloankan. Cycloankan là cấu tử chính của dầu thô sự phân hủy cycloankan cũng là cá enzyme monooxygenaza và oxygennaza. Dưới tác dụng của các enzyme này, các cyloankan bị phân hủy thành các cycloankanol. Khả năng phân hủy của cyclohexan là mạnh nhất trong dãy đồng đẳng cyloankan. Cùng vòng cycloankan chất nào có mạch nhánh dài hơn thì sẽ dễ phân hủy hơn. 17
  19. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Khi phân hủy cyclohexan, quá trình hydroxyl hóa được xúc tác bởi enzyme oxydaza chức năng tạo ra một rượu mạch vòng. Rượu mạch vòng sẽ bị dehydro hóa để tạo ra xeton, xeton bị oxy hóa tiếp thành lacton. Lacton sẽ bị thủy phân, nhóm hydroxyl bị oxy hóa thành một nhóm andehit và một nhóm carboxyl. Kết quả là axit dicacboxylic bị biến đổi tiếp nhờ chu trình oxy hóa. Các vi sinh vật có khả năng phát triển trên cyclohexan phải thực hiện tất cả các phản ứng trên. Tuy nhiên ta thường gặp các vi sinh vật có khả năng chuyển cyclohexan thành rượu mạch vòng nhưng không có khả năng lacton hóa và mở mạch vòng. Do vậy cơ chế cộng sinh và trao đổi chất (co- metabolism) đóng một vai trò rất quan trọng trong phân hủy sinh học các hợp hydrocarbon mạch vòng. [6]  Cơ chế phân hủy hydrocarbon thơm  Benzen Xúc tác ban đầu cho quá trình oxy hóa benzene là enzyme dioxygenaza, tức là phân tử oxy sẽ gắn trực tiếp vào carbon của vòng thơm.  Naphtalen Xúc tác đầu tiên là enzyme oxygenaza gắn phân tử oxy vào phân tử naphtalen để tạo thành cis-1,2 dihydroxyl 1,2 dihydro naphtalen, sau đó tách nước để thành 1,2-dihydroxynaphtalen. Tại đây, vòng bị cắt để tạo thành cis- hydroxyl benzan pyruvic axit, sau đó tiếp tục bị oxy hóa tạo thành salicyandehyd, salicylic axit và atechol, tiếp đó cắt các vòng khác theo hướng –octhor hay –metha phụ thuộc vào chủng vi khuẩn. Cũng có trường hợp xúc tác để oxy hóa naphtanen là enzyme monooxygenaza và cuối cùng cho ra cis-1,2 - dihydroxyl 1,2- dihydronaphtalen. Nấm mốc là nhóm vi sinh vật chiếm ưu thế về chủng loại có khả năng phân hủy naphtalen. 18
  20. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Như vậy, naphtalen dần dần sẽ chuyển hóa thành phân tử có khối lượng bé hơn nhờ vi sinh vật làm cho độ nhớt của dầu sẽ giảm đi. [8] 1.3. Tổng quan về chất hoạt động bề mặt Các chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) được tạo ra từ con đường lên men vi sinh vật. Đó là một hợp chất lưỡng tính gồm 2 phần: phần kị nước (hydrophobic moiety) và phần ưa nước (hydrophilic moiety), có khả năng làm giảm sức căng bề mặt của các phân tử. Phần ưa nước thường là các nhóm: axit amin, peptit, sacarit đơn, đôi, polysacrarit. Phần kị nước là các axit béo, axit no, không no. Các CHĐBMSH có cấu tạo rất khác nhau về cấu trúc hóa học lẫn kích thước phân tử từ rất đơn giản như các axit béo đến mức phức tạp như các hợp chất polymer. Các CHĐBMSH thường tiết ra bên ngoài tế bào như các chất glucolipid, axit béo, photpholipid, polysacarit lipid, lipopetic-lipoprotein, hay chính bản thân bề mặt tế bào vi sinh vật. Ngoài đặc tính làm giảm sức căng bề mặt nó còn có đặt tính kháng sinh như chất gramicidin S hay polymicin. Các CHĐBMSH được tạo ra cả ở trên các cơ chất không tan trong nước lẫn tan trong nước lẫn tan trong nước. Nó được tạo ra do phản ứng thích nghi với môi trường không thuận lợi, độc hại và có xu hướng tạo ra nhiều trên các cơ chất không hòa tan trong nước. Các CHĐBMSH do các gen trên nhiễm sắc thể lẫn các gen ở plasmid tổng hợp và điều khiển. Các gen này dễ mất đi chức năng qua một thời gian dài do bị đột biến và chọn lọc nếu gặp môi trường không thuận lợi cho chúng biểu hiện. Điều này giải thích vì sao chúng ta bắt gặp các loài có khả năng sử dụng dầu ở cả những nơi không bị ô nhiễm dầu và khi đó hoạt tính tạo CHĐBMSH rất thấp. Các CHĐBMSH tạo ra trong suốt quá trình phát triển của vi sinh vật, sản lượng và hoạt tính về sau có thể bị giảm do môi trường 19
  21. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền hết nguồn cơ chất dinh dưỡng, vi sinh vật sử dụng chúng làm nguồn thức ăn hay các vi sinh vật chết đi. [7][9][12] 1.4. Tổng quan về dầu tràn 1.4.1. Định nghĩa Dầu tràn là việc phát tán một lượng lớn xăng dầu hydrocarbon vào môi trường do các hoạt động của con người, là một hình thức gây ô nhiễm. Thuật ngữ này thường được dùng để chỉ dầu được phát tán vào đại dương hoặc vùng nước ven biển. Dầu có thể là một loạt các chất khác nhau, bao gồm cả dầu thô, các sản phẩm dầu tinh chế (như xăng hoặc nhiên liệu diesel), dầu nhờn hoặc dầu trộn lẫn trong chất thải Số lượng dầu tràn ra ngoài tự nhiên khoảng vài trăm lít trở lên có thể coi là sự cố tràn dầu hay gọi là thủy triều đen. 1.4.2. Nguyên nhân tràn dầu Gồm có 3 nguyên nhân chính: Thứ nhất, trên mặt biển. Rò rỉ từ các tàu thuyền hoạt động ngoài biển: chiếm 50% nguồn ô nhiễm dầu trên biển. Do tàu chở dầu trong vùng ảnh hưởng bị sự cố ngoài ý muốn hoặc sự cố ý súc rửa, xả dầu xuống biển Thứ hai, trong lòng biển. Do rò rỉ các ống dẫn dầu, các bể chứa dầu Thứ ba, dưới đáy biển. Do khoan thăm dò, khoan khai thác, túi dầu bị rách do địa chấn hay do nguyên nhân khác Trong tự nhiên có những túi dầu nằm rất sâu dưới đáy biển nên việc khoan dò gặp nhiều khó khăn. Mặt khác rất nhiều vi sinh vật yếm khí khả năng sản xuất axit làm bào mòn các lớp trầm tích nằm phía trong hoặc ngoài các túi dầu, làm cho các túi dầu bị phá hủy tràn ra ngoài. Ngoài các nguyên nhân khách quan nói trên còn phải nói đến các nguyên nhân chủ quan do hành động thiếu ý thức của con người đã trực tiếp hay gián tiếp khiến dầu tràn ra biển. Các tàu thuyền không đảm bảo chất 20
  22. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền lượng lưu hành trên biển là nguyên nhân chính dẫn tới rò rĩ dầu từ các tàu thuyền (tàu của ngư dân và các tàu trở dầu), đắm tàu do va vào đá ngầm. Các cơ sở hạ tầng phục vụ khai thác và lưu trữ dầu khí không đảm bảo tiêu chuẩn nên dẫn tới tràn dầu, thậm chí các nhà sản xuất còn thải cả nước lẫn dầu và các chất hóa học nguy hiểm ra biển. [11] Hình 1.1: Chìm tàu trên sông Sài Gòn (Nguồn: Báo khoa học và xã hội) 1.4.3. Các quá trình biến đổi dầu trên biển Khi tràn dầu xảy ra, dầu nhanh chóng lan tỏa trên mặt biển. Với các điều kiện về sóng, gió, dòng chảy sẽ trải qua các quá trình biến đổi. [10] 1.4.3.1. Quá trình lan tỏa Dầu thô và sản phẩm dầu thô là chất lỏng có độ hòa tan rất thấp trong nước, đặc biệt là nước biển. Do đó, khi khối dầu rơi vào nước sẽ xảy ra hiện tượng chảy lan trên bề mặt nước. Phân phối dầu tràn trên mặt biển diễn ra dưới ảnh hưởng của lực hấp dẫn, được kiểm soát bằng độ nhớt của dầu và sức căng bề mặt. Quá trình này được chú ý đặc biệt nhằm ứng cứu sự cố tràn dầu hiệu quả. Trong điều kiện tĩnh, một tấn dầu có thể lan phủ kín 12km2 mặt nước, một giọt dầu có trọng lượng nửa gam tạo ra một màng dầu 20m2 với độ dày 0,001 mm có khả năng làm bẩn 1 tấn nước. Đầu tiên, dầu lan từ nguồn ra phía 21
  23. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền có bề mặt lớn nhất, sau đó thì tiếp tục lan chảy vô hướng. Khi tạo thành màng đủ mỏng, màng sẽ bị vỡ dần ra thành những màng có diện tích nhỏ hơn và trên bề mặt dầu xuất hiện các vệt không có dầu. Do các quá trình bốc hơi, hòa tan mà mật độ, độ nhớt tăng, sức căng bề mặt giảm dần cho đến khi độ dày của lớp dầu đạt cực tiểu thì quá trình chảy lan chấm dứt. Trong thực tế quá trình chảy lan trên biển chịu tác động lớn bởi các yếu tố sóng, gió và thủy triều. [10] 1.4.3.2. Quá trình bay hơi Song song với quá trình lan tỏa, dầu sẽ bốc hơi tùy thuộc vào nhiệt độ sôi và áp suất riêng phần của hydro và carbon trong dầu mỏ cũng như các điều kiện bên ngoài: nhiệt độ, sóng, tốc độ gió và diện tích tiếp xúc giữa dầu với không khí. Các hydro và carbon có nhiệt độ sôi càng thấp thì có tốc độ bay hơi càng cao. Ở điều kiện bình thường thì các thành phần của dầu với nhiệt độ sôi thấp hơn 200oC sẽ bay hơi trong vòng 24 giờ. Các sản phẩm nhẹ như dầu hỏa, gasolil có thể bay hơi hết trong vài giờ. Các loại dầu nhẹ bay hơi khoảng 40%, còn dầu thô nặng hoặc dầu nặng thì ít bay hơi, thậm chí không bay hơi. Tốc độ bay hơi giảm dần theo thời gian, làm giảm khối lượng dầu, giảm khả năng bốc cháy và tính độc hại, đồng thời quá trình bay hơi cũng làm tăng độ nhớt và tỉ trọng của phần dầu còn lại, làm cho tốc độ lan tỏa giảm. 1.4.3.3. Quá trình khuếch tán Đây là quá trình xảy ra sự xáo trộn giữ nước và dầu. Các vệt dầu chụi tác động của sóng, gió, dòng chảy tạo thành các hạt dầu có kích thướt khác nhau, trong đó có các hạt đủ nhỏ và đủ bền có thể trọng tương đối bền vào khối nước. Điều này làm diện tích bề mặt hạt dầu tăng lên, kích thước sự lắng đọng dầu xuống đáy hoặc giúp cho khả năng tiếp xúc của hạt dầu với các tác nhân oxi hóa, phân hủy dầu tăng, thúc đẩy quá trình phân hủy dầu.[10] 22
  24. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Hiện tượng trên thường xảy ra ở những nơi sóng vỗ và phụ thuộc vào bản chất dầu, độ dày lớp dầu cũng như tình trạng biển. Tại điều kiện thường các hạt dầu nhẹ có độ nhớt nhỏ có thể phân tán hết trong một vài ngày, trong khi đó các loại có độ nhớt lớn hoặc loại nhũ tương dầu nước ít bị phân tán. 1.4.3.4. Quá trình hòa tan Sự hoà tan của dầu trong nước chỉ giới hạn ở những thành phần nhẹ. Tốc độ hoà tan phụ thuộc vào thành phần dầu, mức độ lan truyền, nhiệt độ cũng như khả năng khuếch tán dầu. Dầu FO ít hòa tan trong nước. Dễ hòa tan nhất trong nước là xăng và kerosen. Tuy nhiên trong mọi trường hợp, hàm lượng dầu hòa tan trong nước luôn không vượt quá 1 phần triệu tức 1 mg/l. Quá trình hoà tan cũng làm tăng khả năng phân huỷ sinh học của dầu. Song đây chính là yếu tố làm tăng tính độc của dầu đối với nước, gây mùi, đầu độc hệ sinh thái động thực vật trong nước, đặc biệt đối với động vật, dầu thấm trực tiếp và từ từ vào cơ thể sinh vật dẫn đến sự suy giảm chất lượng thực phẩm.[10] 1.4.3.5. Quá trình nhũ tương hóa Đây là quá trình tạo thành các hạt keo giữa dầu và nước hoặc nước và dầu. Có 2 loại hạt và keo dầu nước và keo nước dầu. Keo dầu nước: là hạt keo có vỏ là dầu, nhân là nước; là các hạt dầu ngậm nước làm tăng thể tích khối dầu 3 - 4 lần. Các hạt khá bền, khó vỡ ra để tách lại nước. Loại keo này có độ nhớt rất lớn, khả năng bám dính cao, gây cản trở cho công tác thu gom, khó làm sạch bờ biển. Keo nước dầu: hạt keo có vỏ là nước, nhân là dầu, được tạo ra do các hạt dầu có độ nhớt cao dưới tác động lâu của sóng biển, nhất là các loại sóng vỡ. Loại keo này kém bền vững hơn và dễ tách nước hơn. Nhũ tương hóa phụ thuộc vào thành phần dầu và chế độ hỗn loạn của nước biển. Gió cấp 3, 4 sau 1 – 2 giờ tạo ra khá nhiều các hạt nhũ tương dầu 23
  25. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền nước. Dầu có độ nhớt cao thì dễ tạo ra nhũ tương dầu nước. Các nhũ tương ổn định nhất chứa từ 30 – 80% nước. Nhũ tương hóa làm giảm tốc độ phân hủy và phong hóa dầu, và làm tăng khối lượng chất ô nhiễm. [10] 1.4.3.6. Quá trình lắng kết Dầu thô và các sản phẩm của dầu thô có tỉ trọng nhỏ hơn 1 thường nổi lên mặt nước mà không tự chìm xuống đáy. Các loại nhũ tương sau khi hấp thụ các vật chất hoặc cơ thể sinh vật có thể trở nên nặng hơn nước rồi chìm dần. Cũng có một số hạt lơ lửng, hấp thụ tiếp các hạt phân tán rồi chìm dần lắng đọng xuống đáy. Trong đó cũng xảy ra quá trình đóng vón tức là quá trình tích tụ nhiều hạt nhỏ thành màng lớn. Quá trình lắng đọng là giảm hàm lượng dầu có trong nước. Nhưng nó làm hại hệ sinh thái đáy. Hơn nữa, sau lắng đọng, dầu vẫn có thể lại nổi lên mặt nước do tác động của các yếu tố đáy, gây ra ô nhiễm lâu dài cho vùng nước. [10] 1.4.3.7. Quá trình oxy hóa Nhìn chung, các hydrocarbon trong dầu khá bền vững với oxy. Nhưng trong thực tế dầu tồn tại trong nước hoặc không khí vẫn bị oxi hoá một phần rất nhỏ, khoảng 1% khối lượng. Các quá trình này xảy ra do oxy, ánh sáng mặt trời và được xúc tác bằng một số nguyên tố như vanidi. Mặt khác lại ức chế của các hợp chất lưu huỳnh tạo thành các rồi thành hydroperoxides và các sản phẩm khác như: axit, andehit, xeton, peroxit, superoxit, phenol, axit cacboxylic thường có tính hòa tan trong nước. [10] 1.4.4. Phương pháp xử lý tràn dầu 1.4.4.1. Phương pháp cơ học Khi xảy ra sự cố tràn dầu thì biện pháp cơ học được xem là tiên quyết cho công tác ứng phó sự cố tràn dầu tại các sông, cảng biển nhằm ngăn chặn, khống chế và thu gom nhanh chóng lượng dầu tràn tại hiện trường. Biện pháp 24
  26. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền cơ học bao gồm quây gom, dồn dầu vào một vị trí nhất định để tránh dầu lan trên diện rộng bằng cách sau. Dùng phao quây dầu Sử dụng phao ngăn dầu để quây khu vực dầu tràn, hạn chế ô nhiễm lan rộng và để thu gom xử lý. Bảng 1.4: Các loại phao quây dầu Loại phao Đặc điểm Khu vực có thể sử dụng Sông, cảng sông, cảng Phao ngăn dầu Gọn nhẹ, chuyển khai biển Nơi có dòng chảy tự phồng nhanh và dễ dàng nhất. trung bình hoặc mạnh. Gọn nhẹ, dễ dàng bảo Cửa sông, cảng biển, ngoài Phao quây dầu quản và triển khai. Được biển Nơi có dòng chảy bơm khí bơm khí bởi các loại khí mạnh. nén. Chịu được mưa nắng Phao quây cố Các khu vực cảng đi vào suốt ngày đêm. Cố định định 24/24 khu sinh sinh thái trên mặt nước. Phao quây dầu Sông, cảng sông, biển Rất gọn nhẹ, dễ bảo quản tự nổi dạng Nơi có dòng chảy trung và triển khai. tròn bình hoặc mạnh. Phao quây dầu Gọn nhẹ, dễ dàng bảo Sông, cảng sông. Nơi có tự nổi dạng quản và triển khai dòng chảy yếu, nước tĩnh. dẹp Phao quây dầu Gọn nhẹ, dễ bảo quản và Bãi sông, bờ sông. Nơi thủy trên bãi biển triển khai. triều thường hay lên xuống. (Nguồn: Báo cáo chuyên đề CNSH – MT, trường đại học Nông Lâm Tp.HCM) 25
  27. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền a) Phao quây dầu tự phòng b) Phao quây dầu bơm khí c) Phao quây dầu 24/24 d) Phao quây dầu tự nổi dạng tròn e) Phao quây dầu tự nổi dạng dẹp f) Phao quây dầu tự nổi dạng tròn Hình 1.2: Các loại phao quây dầu. ( Nguồn: Báo cáo chuyên đề CNSH – MT, trường đại học Nông Lâm Tp.HCM) 26
  28. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Bơm hút dầu Bơm hút dầu: Khi dầu được cố định bằng phao, bước tiếp theo là cần phải gỡ bỏ dầu ra khỏi mặt nước bằng cách dùng máy hút dầu lên khỏi mặt nước vào bồn chứa và dầu có thể được phục hồi lại. Bơm hút dầu tràn: Được sử dụng để hút dầu loang trên mặt nước. Tỷ lệ dầu thu gom và công suất của bơm hút dầu tùy thuộc vào loại dầu tràn và loại bơm hút. Bảng 1.5: Các loại máy hút dầu Loại máy hút dầu Đặc điểm Tốt với các loại dầu nhẹ, phù hợp Loại Disk cho nơi có sóng. Loại Drum Tốt cho các loại dầu nhẹ. Loại Brush Tốt cho các loại dầu nặng. Tốt cho cả dầu nặng và nhẹ. Kết Loại Mult hợp giữa Drum và Brush. Tốt cho các loại dầu, nhưng dầu Loại Weir nhẹ hiệu quả hơn. Tốt cho tất cả loại dầu, phù hợp Loại băng truyền cho nơi có sóng không quá lớn và gom cả rác trên mặt nước. (Nguồn: Báo cáo chuyên đề CNSH – MT, trường đại học Nông Lâm Tp.HCM) 27
  29. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền a) Loại Disk b) Loại Drum c) Loại Brush d) Loại Mult e) Loại Weir f) Loại băng truyền Hình 1.3: Các loại máy hút dầu (Nguồn: Báo cáo chuyên đề CNSH – MT, trường đại học Nông Lâm Tp.HCM) 28
  30. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền 1.4.4.2. Phương pháp hóa học Phương pháp hóa học được dùng khi có hoặc không có sự làm sạch cơ học và tràn dầu trong một thời gian dài. Phương pháp này sử dụng các chất phân tán, các chất phá nhũ tương dầu - nước, các chất keo tụ và hấp thụ dầu Chất phân tán Mục đích của việc sử dụng chất tăng độ phân tán dầu là để loại bỏ dầu trên bề mặt của biển và chuyển nó vào trong cột nước làm pha loãng nồng độ độc hại của dầu và làm cho dầu bị xuống cấp, giảm sự vận động của dầu. Những chất tăng độ phân tán với thành phần chính là những chất hoạt động bề mặt. Đây là những hóa chất đặt biệt bao gồm phần ưu nước – hydrophilic và olephilic – phần ưu dầu. Có khả năng hoạt động như một chất tẩy rửa. Những chất này làm giảm bớt lực căng mặt phân cắt giữa dầu và nước tạo ra những giọt dầu nhỏ tạo điều kiện để diễn ra việc phân hủy sinh học và phân tán. Chất hoạt động Chất hoạt động bề bề mặt mặt ổn định dầu Dầu ưu nước Dầu Nước Dầu ưu nước Hình 1.4: Sự hoạt động của chất phân tán Những chất tăng độ phân tán lên dầu tràn bao gồm ba nhóm chinh: Những chất hoạt động bề mặt. Dung môi (hydrocarbon và nước) Chất ổn định. 29
  31. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Nguyên tắc chung của chất phân tán: Phun chất tăng độ phân tán lên dầu khi dầu vừa tràn ra vẫn còn trên biển có thể là hiệu quả nhất, nhanh chóng và cơ động có ý nghĩa trong việc loại bỏ dầu từ bề mặt nước biển. Chất tăng độ phân tán có hiệu quả đối với đa số dầu. Việc sử dụng chất phân tán làm giảm thiệt hại gây ra bởi dầu nổi trên mặt biển cho một số tài nguyên, cho loài chim biển. Tuy nhiên lại lại gây ảnh hưởng xấu đến những sinh vật tiếp xúc với dầu phân tán: san hô, hệ sinh thái biển và sinh vật. [9][10] Chất hấp thụ Chất hấp thụ có thể là những chất hữu cơ tự nhiên, vô cơ tự nhiên, hoặc tổng hợp. Chất hấp thụ bằng hữu cơ bao gồm mùn cưa, lông và một số vật liệu tự nhiên khác chứa carbon. Chất hấp thụ bằng vô cơ tự nhiên như đất sét, cát, tro núi lửa. Chất hấp thụ tổng hợp như polyethylene và polyester xốp hoặc polystyrene. Dầu sẽ hình thành một lớp chất lỏng trên bề mặt của chất hấp thụ. Chất hấp thụ này hấp thụ các hỗn hợp dầu tràn ở mọi dạng nguyên, nhũ hóa từng phần hay bị phân tán trên bề mặt nước. Đặc biệt chúng chỉ hút dầu chứ không hút nước. [10] 1.5. Tổng quan về tình trạng ô nhiễm dầu tràn tại Cần Giờ 1.5.1. Giới thiệu về Cần Giờ Cần Giờ là một huyện ven biển nằm ở phía Đông Nam của thành phố Hồ Chí Minh, cách trung tâm khoảng 50 km. Vào năm 2010, diện tích tự nhiên của huyện Cần Giờ là 714 km2 chiếm trên 30% diện tích của toàn thành phố, trong đó có 31% diện tích mặt nước, 46,6% là đất rừng. Dân số năm 2010 có khoảng 68.213 người. Huyện Cần Giờ bao gồm thị trấn Cần Thanh và 6 xã: Bình Khánh, An Thới Đông, Lý Nhơn, Tam Thôn Hiệp, Long Hòa và Thạnh An. 30
  32. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Cần Giờ có bờ biển dài 13 km từ mũi Cần Giờ đến mũi Đồng Tranh. Mũi Cần Giờ cách mũi Nghinh Phong Vũng Tàu 10 km đường biển băng qua vịnh Ghềnh Rái. Từ bờ biển nhìn ra là một bãi triều rộng hàng cây số khi thủy triều thấp với khoảng cách từ bờ trên 4 km ở phía mũi Cần Giờ và trên 1 km ở phía mũi Đồng Tranh. Nhìn chung toàn bãi Cần Giờ là một bãi bồi rộng đến trên 100 km2. Tiềm năng về quần thể động – thực vật rất phong phú, đa dạng cùng với khả năng khôi phục, chăm sóc kỳ diệu của con người đã và đang hồi sinh Cần Giờ - vùng đất hoang hóa một thời do chất độc hóa học trong chiến tranh thành khu bảo tồn thiên nhiên, một điểm du lịch hấp dẫn khách trong và ngoài nước. [5][12] 1.5.2. Tình trạng ô nhiễm dầu ở Cần Giờ Trong tất cả các nguyên nhân gây tràn dầu thì những nguyên nhân liên quan đến hoạt động tàu thuyền là rất lớn. Ngày 20/03/2003, tàu Hồng Anh thuộc công ty Trọng Nghĩa, chở 600 tấn dầu FO từ Cát Lái tới Vũng Tàu, nhưng tới phao số 8 (Vũng Tàu) thì bị sóng lớn đánh chìm. Dầu bắt đầu loang rộng ra vùng biển Cần Giờ. Ngày 06/04/2005, tàu chở hàng Hồ Tây 1 thuộc Công ty Thương mại – vận tải biển An Lạc điều khiển từ ngoài cửa sông Lòng Tàu của cảng Sài Gòn đã đụng vào tàu chở dầu Hàm Lương 5 trọng lượng 558 tấn chở đầy 6 khoang dầu, thuộc công ty vận tải xăng dầu Vitaco tại khu vực tiếp giáp Cần Giờ. Vụ tai nạn trên đã làm một khoang chứa dầu bị xé rách, gây tràn nhiều tấn dầu DO ra sông Lòng Tàu. Ngày 26/11/2008, tàu Gia Định chở 700 tấn dầu DO từ Tp.HCM đi Vũng Tàu. Khi ra đến khu vực biển Cần Giờ thì đâm vào tàu Imextrand 16 chở 1.800 tấn dầu DO. Sự cố khiến 100 tấn dầu DO tràn ra biển. 31
  33. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Gần đây nhất, vào ngày 25/03/2011, một vụ va chạm giữa 2 tàu xảy ra trên sông Lòng Tàu huyện Cần Giờ làm tàu Hải Vân 06 bị chìm kéo theo khoảng 3.000 lít dầu DO và có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường nếu số dầu này thoát ra bên ngoài.[11] 1.5.3. Tình hình khắc phục nhiễm dầu ở Cần Giờ Thời gian qua, tràn dầu đã trở thành một trong những sự cố môi trường xảy ra tại Cần Giờ. Đã có một số nghiên cứu khắc phục tình trạng ô nhiễm dầu tại đây như: Đề tài nghiên cứu làm sạch dầu DO ở huyện Nhà Bè và Cần Giờ do GS.Hoàng Anh Tuấn chủ nhiệm tiến hành vào năm 1995. Tác giả đã nghiên cứu thành công chế phẩm RDN – oil + Micromix làm giảm lượng dầu trong các ruộng lúa và ao nuôi trồng thủy sản và đưa ra các quy trình xử lý cải tạo môi trường ở các ruộng lúa và ao nuôi thủy sản khu vực này. [3] Luận văn tiến sĩ của Bùi Trọng Vinh thực hiện vào tháng 12/2003 nghiên cứu về khả năng xử lý vật liệu bờ biển bị nhiễm dầu bằng phương pháp kích hoạt các vi sinh vật phân hủy dầu trong khu vực từ Vũng Tàu đến Cần Giờ chỉ dừng lại ở mức xác định tổng vi khuẩn hiếu khí và nghiên cứu phương pháp kích hoạt vi sinh vât với các chất dinh dưỡng đơn giản để làm tăng khả năng tự làm sạch của các vật liệu đường bờ. [1] Ngoài ra, còn sử dụng các chế phẩm Oicleanser1, Oicleanser2, Oicleanser3 của Viện Công Nghệ Sinh Học sản xuất để xử lý kè đa bị tràn dầu khi xảy ra sự cố tràn dầu tại Cần Giờ. [4] 32
  34. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Thời gian - địa điểm 2.1.1. Thời gian Đồ án được thực hiện từ ngày 01/04/2011 đến tháng 06/2011. 2.1.2. Địa điểm Địa điểm lấy mẫu: Mẫu nước biển được lấy về từ khu vực ô nhiễm dầu thô dọc bờ biển Cần Giờ. Hình 2.1: Địa điểm lấy mẫu tại khu vực biển Cần Giờ. Địa điểm tiến hành thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Khoa Môi trường và Công nghệ sinh học, trường đại học Kỹ Thuật - Công Nghệ Tp. HCM. 2.2. Dụng cụ - hóa chất 2.2.1. Dụng cụ Ống nghiệm Đĩa petri Erlen Pipet các loại Micropipettes Que cấy các loại 33
  35. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Lame, lamelle Đèn cồn Autoclave (nồi hấp) Cân phân tích Máy đo pH Kính hiển vi quang học Máy ly tâm Sorwal 2.2.2. Hóa chất  Môi trường tăng sinh (M1) Na2HPO4 : 2,13g KH2PO4 : 1,3g NH4Cl : 1g MgSO4 : 0.2g NaCl% : 0,5g Vitamin% : 0.2g Nước cất : 1 lít Khoáng vi lượng : 2,5g Thành phần vi lượng: MnCl2.2H2O, MnCl4.H2O, H3BO3, CoCl2.6H2O, CuCl2.2H2O, NiCl2.6H2O, Na2MoO4.2H2O, ZnCl2  Môi trường khoáng Gost (M2) Na2HPO4 : 0.7g KH2PO4 : 0,3g KNO3 : 3g MgSO4 : 0,4g Nước cất : 1 lít 34
  36. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền 2.3. Phƣơng pháp tiến hành Bố trí thí nghiệm xử lý mẫu nước ô nhiễm dầu thô với các chủng vi sinh vật. Được trình bày ở sơ đồ 2.1. Mẫu nước ô 10 chủng vi sinh nhiễm dầu vật Tăng sinh trong 3 – 5 ngày 1ml dịch tăng sinh + 50ml dịch m ẫu Lắc 200 v/p, nhiệt độ phòng Quan sát trong, 0, 7 ngày, 14 ngày Cảm quan Sức căng bề Xác định mật mặt độ tế bào Độ đục, cặn Độ nhũ Đếm Đo mật độ màu sắc tương khuẩn lạc quang Sơ đồ 2.1: Bố trí thí nghiệm 35
  37. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu Mẫu được lấy tại khu vực biển có nhiễm dầu, nước khi lấy phải có lớp ván dầu phía trên. Trực tiếp lấy mẫu một cách cẩn thận bằng cách dùng các dụng cụ như: thao, cốc, ca vớt lớp nước có chứa dầu cho vào chai vô trùng. Đối với mẫu vận chuyển xa nên chừa 1% dung tích bình cho quá trình giản nở nhiệt và làm thoáng. Mẫu lấy xong mang về đặt trong phòng thí nghiệm trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thí nghiệm trong vòng 24 giờ. 2.3.2. Nguồn vi sinh vật Các chủng vi sinh vật được phân lập từ nguồn nước nhiễm dầu tại Cần Giờ từ đồ án: “Bước đầu phân lập các vi sinh vật có khả năng phân hủy dầu từ nước nhiễm dầu” của Sinh viên Lê Thị Thu Hằng thực hiện vào tháng 2 năm 2011. 10 chủng vi sinh vật phân lập được tuyển chọn là: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10. 2.3.3. Phương pháp tăng sinh Nguyên tắc Tăng sinh là cung cấp nguồn dinh dưỡng giúp vi sinh vật mạnh hơn làm tăng số lượng tế bào của vi sinh vật. Các chủng vi sinh vật sau phân lập được bảo quản trên môi trường thạch nghiêng ở 40C trong 1 tháng. Vì vậy, cân tăng sinh để hoạt hóa lại giống trước khi ứng dụng thí nghiệm. Phương pháp thực hiện Chuẩn bị 5ml dịch môi trường M1 cho vào ống nghiệm đem hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút và để nguội 30 phút. Dùng que cấy lấy các khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật cho vào ống nghiệm, lắc đều. Ủ 3 – 5 ngày ở nhiệt độ 28 – 300C. Kiểm tra sự phát triển của các giống trong ống nghiệm và trên môi trường thạch agar. 36
  38. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền 2.3.4. Bố trí thí nghiệm xử lý dầu Nguyên tắc Khi vi sinh vật phát triển trong môi trường chúng sử dụng nguồn carbon, nitơ trong môi trường để tăng sinh về mặt số lượng và chuyển hóa các chất. Khi đó, thành phần dinh dưỡng trong môi trường sẽ giảm, đồng thời sinh khối chết sau chuyển hóa tăng. Phương pháp thực hiện Khả năng phân hủy dầu của các chủng phân lập được trong các bình erlen. Với tỷ lệ 1ml thể tích vi sinh vật : 50 ml thể tích môi trường ô nhiễm dầu. Đem lắc ở nhiệt độ phòng. Quan sát các yếu tố ghi nhận sự phân hủy dầu bao gồm: Cảm quan: Sự thay đổi độ đục, màu sắc, cặn và hiện tượng nhũ tương hóa của dầu. Xác định sự phát triển của vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và đo mật độ quang. Xác định sức căng bề mặt. Mẫu đối chứng được lắc ở cùng điều kiện nhưng chỉ là mẫu nước biển ban đầu, không bổ sung chủng vi sinh vật. 2.3.5. Phương pháp xác định mật độ tế bào 2.3.5.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc Nguyên tắc Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Phương pháp thực hiện Bước 1: Pha loãng mẫu 37
  39. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Lấy 1ml mẫu pha loãng với 9ml nước cất vô trùng hay nước muối sinh lý 1 hay 0,85%. Sau đó pha loãng mẫu theo nồng độ thập phân giảm dần đến một nồng độ thích hợp cho phân tích mẫu. Bước 2: Định lượng Sử dụng phương pháp trãi đĩa trên môi trường M2 có bổ sung 2% agar. Hút 50µl dung dịch mẫu pha loãng bằng pipetman vào thạch đĩa, trãi mẫu khắp mặt thạch cho đến khi khô mặt thạch. Ủ 280C – 300C trong 24 – 72 giờ và đếm các khuẩn lạc riêng rẽ quan sát được. Cách tính kết quả: Số khuẩn lạc phát triển trên môi trường và tính mật độ vi khuẩn theo công thức: N A(cfu/ml) = i n v f Trong đó: A: Số lượng vi khuẩn trong một gam mẫu (cfu/ml) N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i v: Thể tích dịch mẫu cấy vào đĩa (ml) f: Độ pha loãng tương ứng 2.3.5.2. Phương pháp đo mật độ quang Nguyên tắc Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dựa trên sự hấp thụ ánh sáng của sinh khối có trong dung dịch. Sinh khối vi sinh vật càng nhiều, giá trị OD càng lớn. Thông qua giá trị OD có thể xác định được tăng sinh khối, phát triển của vi sinh vật trong môi trường. 38
  40. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Phương pháp thực hiện Hút 10ml dịch môi trường có vi sinh vật trong quá trình thử khả năng phân hủy dầu vào ống ly tâm. Ly tâm dịch trên trong 15 phút với vận tốc 2000 vòng. Sau đó tách bỏ lớp nước phía trên chỉ giữ lại lớp sinh khối phía dưới mang sinh khối ly tâm được hòa với 5ml nước cất vô trùng. Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch có sinh khối ở bước sóng 610 nm. Rồi ghi nhận kết quả hiển thị trên máy đo quang. 2.3.6. Phương pháp xác định sức căng bề mặt Nguyên tắc Sức căng bề mặt là lực tiếp xúc với bề mặt tác dụng của các vi sinh vật phân hủy dầu, làm giảm bề mặt dầu trong quá trình phân hủy đến mức tối đa. Phương pháp thực hiện Sử dụng thiết bị: Máy DuNouy Tensiomerters. Thiết bị đo chính xác sức căng bề mặt của phần tiếp giáp giữa hai môi trường và sức căng bề mặt của chất lỏng dựa trên phương pháp vòng chuẩn (vòng DuNouy), độ chính xác: ±0,05 mN/m. Nhiệt độ phòng là 260C - 270C. 39
  41. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tuyển chọn chủng vi sinh vật Từ kết quả phân lập được thực hiện với các mẫu nước nhiễm dầu từ Cần Giờ, chúng tôi tuyển chọn được 10 chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường M1. Kết quả hình thái và đặc điểm của 10 chủng được trình bày ở 3.1 và 3.2. Bảng 3.1: Hình thái khuẩn lạc Hình thái khuẩn lạc STT Chủng Màu sắc Hình dạng 1 R1 Trắng trong Tròn, hơi nhăn 2 R2 Trắng đục Tròn, lồi 3 R3 Trắng đục Tròn, nhỏ li ti Tròn, nhỏ li ti mọc thành 4 R4 Trắng đục chùm 5 R5 Trắng, hơi vàng Vệt dài, hơi nhớt 6 R6 Trắng trong Tròn 7 R7 Vàng Tròn, trơn 8 R8 Trắng đục Tròn lớn, lồi Trắng đục, bên ngoài 9 R9 Tròn lớn, hơi lồi và nhăn khuẩn lạc có màu vàng 10 R10 Trắng trong, có tâm vàng Tròn, lồi 40
  42. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Bảng 3.2: Kết quả nhuộm gram STT Chủng Gram Hình dạng Hình nhuộm gram Trực khuẩn 1 R1 ( - ) ngắn Trực khuẩn 2 R2 ( + ) ngắn, hình cầu Trực khuẩn 3 R3 ( + ) ngắn Trực khuẩn 4 R4 ( - ) ngắn Trực khuẩn 5 R5 ( - ) ngắn 41
  43. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền 6 R6 ( + ) Hình que Trực khuẩn 7 R7 ( + ) ngắn Trực khuẩn 8 R8 ( + ) ngắn Trực khuẩn 9 R9 ( + ) ngắn Trực khuẩn 10 R10 ( - ) ngắn 42
  44. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Trên môi trường M1 thành phần chủ yếu là khoáng đa lượng và vi lượng. Nguồn carbon duy nhất được cung cấp từ dầu diesel với 1% thể tích. Ngoài ra chúng tôi cũng bổ sung vitamin nhằm kích hoạt bước đầu và cung cấp một số thành axit amin thiết yếu cho vi khuẩn phát triển. Mười chủng (R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10) khi phát triển trên môi trường M1 điều có dạng khuẩn lạc màu trắng trong và đục, hình dạng tròn. Trong đó có 4 chủng gram âm (R1, R4, R5, R10) và 6 chủng gram dương (R2, R3, R6, R7, R8, R9). 3.2. Kết quả quả thí nghiệm khả năng xử lý dầu tràn Để khảo sát khả năng xử lý dầu của 10 chủng tuyển chọn được, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên môi trường nước biển Cần Giờ lấy từ khu vực có ô nhiễm dầu. Theo nghiên cứu của Lại Thúy Hiền năm 2010, một đặc điểm quan trọng của các vi sinh vật phân hủy dầu là khả năng thích nghi tối ưu theo địa phương. Mặt khác, mỗi vùng biển có đặc điểm về thành phần, nồng độ muối, tính chất về dòng chảy, Do đó với 10 chủng này, chúng tôi tiến hành xử lý thử nghiệm trên chính môi trường nước biển ô nhiễm đã phân lập ban đầu. 3.2.1. Kết quả cảm quan Bằng cảm quan có thể nhận thấy các chủng vi khuẩn có thể phân hủy dầu thông qua độ đục, sự thay đổi màu sắc từ vàng nhạt đến nâu đậm khác nhau và trong dung dịch có cặn so với mẫu đối chứng, lớp dầu phía trên có sự góp mặt của CHĐBMSH thì tạo nhũ tương, được trình bày ở bảng 3.3 và 3.4. Các mẫu ở thời điểm 0 ngày chưa lắc, môi trường có màu trắng trong, phía trên có lớp ván dầu mỏng. 43
  45. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Bảng 3.3: Độ đục, màu sắc, cặn Độ đục Màu sắc Cặn Chủng 7 ngày 14 ngày 7 ngày 14 ngày 7 ngày 14 ngày ĐC + + + + + + + + R1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + R2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + R3 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + R4 + + + + + + + + + + + + + + + + R5 + + + + + + + + + + R6 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + R7 + + + + + + + + + + + + + + + + + R8 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + R9 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + R10 + + + + + + + + + + + Ghi chú: Độ đục: (+ + + +): rất mạnh, (+ + +): mạnh, (+ +): trung bình, (+): không thay đổi. Màu sắc: (+ + + +): nâu đậm, (+ + +): vàng đậm, (+ +): vàng nhạt, (+): không thay đổi Cặn: (+ + + +): cặn rất nhiều, (+ + +) cặn nhiều, (+ +): cặn ít, (+): không thay đổi. 44
  46. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Bảng 3.4: Độ nhũ tương Chủng 7 ngày 14 ngày ĐC + + + R1 + + + + R2 + + + + + + R3 + + + + + + + + R4 + + + + + + R5 + + + + + R6 + + + + + + + + R7 + + + + + R8 + + + + + + R9 + + + + + + + + R10 + + + + + + + Ghi chú: (+ + + +): độ nhũ tương cao nhất, (+ + +): độ nhũ tương khá, (+ +): độ nhũ tương trung bình, (+): độ nhũ tương yếu. Từ kết quả ở 2 bảng 3.3 và 3.4 cho thấy: So với bình đối chứng hầu hết các chủng đều trở nên đục, tạo cặn môi trường, chuyển đổi màu sắc rất rõ rệt từ vàng nhạt đến nâu đậm, cho thấy chủng có sự phát triển vi sinh vật trong mẫu. Đồng thời lớp dầu trên bề mặt có hiện tượng nhũ tương hóa nhỏ dần kích thước các hạt dầu. Đây là hiện tượng phân hóa kích thước ban đầu của các hạt dầu là bước đầu cho quá trình phân cắt các hydrocarbon trong dầu. So sánh giữa các chủng, 3 chủng R3, R6, R9, có độ đục và quá trình nhũ tương hóa cao nhất. Các chủng R2, R4, R1, R5, R7, R8 tuy phát triển kém hơn ở 7 ngày nhưng về sau 14 ngày thì độ đục và nhũ tương cũng mạnh 45
  47. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền lên dần. Trong đó chỉ R10 không làm thay đổi màu môi trường trong quá trình lắc nhưng mức độ đục và nhũ tương hóa cũng rất cao. Một số hình ảnh của các chủng trong quá trình phân hủy dầu từ lúc 0 ngày đến 14 ngày (Hình 3.1) ĐC R1 ĐC R2 ĐC R3 ĐC R4 ĐC R5 ĐC R6 46
  48. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền ĐC R8 ĐC R7 ĐC R10 ĐC R9 0 ngày ĐC R8 R9 R1 R2 R4 R3 R6 R7 R5 R10 7 ngày R3 ĐC R1 R2 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 14 ngày Hình 3.1: Các chủng vi sinh vật trong quá trình phân hủy 47
  49. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền 3.2.2. Kết quả xác định mật độ tế bào Để kiểm tra sự phát triển của vi sinh vật trong mẫu sau các khoảng thời gian, bên các dấu hiệu cảm quan như làm đục môi trường, chúng tôi tiến hành xác định mật độ tế bào vào các thời điểm để khẳng định mức tăng trưởng của quần thể vi sinh vật trong mẫu. Song song đó tiến hành xác định giá trị OD. OD là khả năng hấp thụ ánh sáng của các sinh khối vi sinh vật có trong dung dịch với một bước sóng xác định. Giá trị OD cao chứng tỏ mật độ vi sinh vật trong mẫu càng cao. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5. Bảng 3.5: Mật độ tế bào của 10 chủng sau các khoảng thời gian 0 ngày 7 ngày 14 ngày Chủng Cfu/ml OD cfu/ml OD cfu/ml OD ĐC 13,3.103 0,353 16,5.103 0,406 19,5.103 0,427 R1 8,3.103 0,255 15,4.103 0,428 52,6.103 0,553 R2 21.103 0,420 56,7.103 0,633 69,5.103 0,746 R3 39,7.103 0,573 105,3.103 >2 122.103 >2 R4 19,4.103 0,533 63,2.103 1,120 90,8.103 1,320 R5 39,8.103 0,626 42.103 0,640 67.103 0,772 R6 43,9.103 0,946 81.103 1,180 110,4.103 1,600 R7 50,2.103 0,562 73.103 0,633 99,5.103 0,820 R8 41,8.103 0,453 49,6.103 0,840 64.103 1,266 R9 40,5.103 0,666 93,8.103 >2 113,5.103 >2 R10 6,3.103 0,106 40,1.103 0,533 89,9.103 1,466 GTTB 32.103 0,514 62.103 >1,001 78.103 >1,128 Ghi chú: Giá trị trung bình trong bàng 3.5 không có mẫu đối chứng. Sự tương quan mật độ tế bào giữa 3 thời điểm theo phương pháp đếm khuẩn lạc và đo OD của từng chủng ở đồ thị 3.1, biểu đồ 3.1 và 3.2. 48
  50. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền ĐC R1 R2 R3 R4 49
  51. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền R5 R6 R7 R8 R9 R10 Đồ thị 3.1: Kết quả mật độ tế bào của 10 chủng vi khuẩn 50
  52. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Nhìn chung đồ thị 3.1. cho thấy hầu hết các chủng đều có sự gia tăng mật độ tế bào sau các thời gian nuôi cấy. Ở mẫu đối chứng, thời điểm 0 ngày mật độ tế bào là 13,3.103 cfu/ml, đã tăng lên 16,5.103 cfu/ml sau 7 ngày và 19,5.103 cfu/ml sau 14 ngày. Giá trị OD cũng tăng lên từ 0,353 ở 0 ngày lên 0,406 ở 7 ngày và 0,427 sau 14 ngày. Tỷ lệ tăng của mật độ đếm khuẩn lạc là 31% và mật độ quang là 17,3% từ 0 ngày đến 14 ngày. Đối với 10 chủng thí nghiệm, mật độ trung bình lúc 0 ngày là 32.103 cfu/ml, OD là 0,514, tăng lên 78.103 cfu/ml và OD 1,128 sau 14 ngày nuôi cấy. Trong đó, chủng tăng mạnh nhất là R10, từ 6,3.103 cfu/ml, OD là 0,106 ở 0 ngày lên 89,9.103 cfu/ml, OD 1,466 , R10 tăng 92,9% mật độ đếm khuẩn lạc và 92,7% đo quang. Chủng có mật độ tế bào tăng thấp nhất là R5 với tỷ lệ cfu là 40,5% và OD là 18,9%, nhưng R5 cũng đạt cao hơn so với đối chứng. Thời gian đầu từ 0 đến 7 ngày dựa vào mật độ đếm khuẩn lạc có 6 chủng tăng cao như: R2, R3, R4, R6, R7, R9 còn 4 chủng R1, R5, R8, R10 thì thấp hơn. Ngược lại thời gian sau từ 7 đến 14 ngày chủng R1, R5, R8, R10 và R6 lại tăng cao hơn những chủng có tăng nhưng thấp hơn lúc ban đầu. Riêng R6 trong 2 thời điểm đều tăng cao giống nhau. Mật độ đo quang ở thời gian 7 ngày đầu có R1, R2, R4 gia tăng mạnh, R5, R6, R7, R8, R10 gia tăng thấp hơn. Nhưng sau 14 ngày thì ngược lại hoàn toàn những chủng ban đầu tăng lại gia tăng thấp hơn các chủng còn lại. Trong đó R3 và R9 ở cả 2 thời điểm lại có mật độ tế bào rất mạnh đã vượt qua mức giá trị đo OD là lớn hơn 2. Riêng 2 chủng R1, R8, R5 mật độ đo quang tăng nhưng mật độ đếm khuẩn lạc không tăng đáng kể ở thời gian 7 ngày đầu là vì có thể do sai sót trong quá trình đếm mẫu, số lần lặp lại chưa đủ số liệu thống kê, Tuy nhiên, đến thời điểm 14 ngày cả 2 giá trị này điều có sự tăng cao rõ rệt. 51
  53. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Biểu đồ 3.1: Kết quả mật độ đếm khuẩn lạc Biểu đồ 3.2: Kết quả đo mật độ quang Từ biểu đồ 3.1 và 3.2 cho thấy 4 chủng R3, R6, R9, R10 đều có sự tăng của mật độ tế bào cao nhất ở 2 giá trị đếm khuẩn lạc và mật độ quang. Xét về tỷ lệ gia tăng mật độ tế bào chủng R10 có tỷ lệ tăng cao nhất (cfu tăng 92,9%, OD 92,7%). 52
  54. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Tổng hợp từ các kết quả phát triển của từng chủng và sự tương quan trong 10 thì có thể nhận định rằng chủng R3, R6, R9, R10 có phân hủy dầu mạnh nhất khoảng hơn 67% vì theo kết quả cảm quan các chủng trên có sự chuyển hóa màu sắc môi trường, gia tăng độ đục và tốc độ nhũ tương hóa lại cao và sinh ra nhiều cặn trong quá trình phân hủy vi sinh vật, một số vi sinh vật chết do hết chất dinh dưỡng trong nước nhiễm dầu. 3.2.3. Kết quả sức căng bề mặt Vào các thời điểm 7 ngày và 14 ngày, chúng tôi tiến hành gửi mẫu xác định sức căng bề mặt tại Công ty Bách Việt. Bảng 3.4: Kết quả đo sức căng bề mặt (đơn vị: mN/m) Sức căng bề mặt Chủng 7 ngày 14 ngày ĐC 36,7 32,6 R1 30,6 28,3 R2 22,0 20,0 R3 0,58 0,16 R4 25,1 20,0 R5 31,8 30,8 R6 0,78 0,26 R7 29,7 25,2 R8 21,5 18,5 R9 20,0 15,6 R10 24,2 20,2 GTTB 20,6 17,9 53
  55. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Biểu đồ 3.3: Sức căng bề mặt của 10 chủng và đối chứng Theo Lại Thị Hiền (2010) và Lê Phi Nga (2005) để có thể phân cắt các liên kết hydrocarbon trong dầu đầu tiên, bản thân các chủng vi sinh vật phải tổng hợp và tiết vào môi trường các hợp chất hoạt động bề mặt sinh học, hoặc chúng phải được hỗ trợ bước đầu bằng các chất hoạt động bề mặt bằng hóa học hoặc từ các chủng vi sinh vật khác nhằm giảm sức căng bề mặt các hạt dầu. Sau đó mới tiến hành phân cắt các liên kết bên trong bằng hệ enzym chuyên biệt. CHĐBMSH là một hợp chất lưỡng tính gồm hai phần: phần kị nước và phần ưu nước có khả năng làm giảm sức căng bề mặt trong nước nhiễm dầu. Sức căng bề mặt là một trong các bước quan trọng để xác định khả năng phân hủy dầu của các chủng vi khuẩn phân lập được. Hầu hết các loại dầu đều nhẹ hơn nước, khi các vi khuẩn bắt đầu phân hủy dầu chúng sẽ tập hợp trên bề mặt lúc đó sức căng bề mặt giảm xuống càng làm tăng chất hoạt động bề mặt thì sức căng bề mặt càng giảm đến mức tối thiểu, khi đó nhũ tương sẽ xuất hiện. 54
  56. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Dựa vào kết quả đo sức căng bề mặt thì tất cả các chủng đều giảm, trong đó có R3, R6 làm giảm nhiều nhất (Biểu đồ 3.3) vì sức căng bề mặt chỉ còn 0,16 – 0,26 mN/m sau 14 ngày so với 32,6 mN/m ở đối chứng. Đây cũng là các chủng có kết quả độ nhũ tương cao nhất (Bảng 3.2). Tiếp theo là các chủng R2, R4, R8, R9, R10 và sau cùng là các chủng R1, R5, R7 là ít giảm thấp nhất vì sức căng bề mặt vẫn còn ở khoảng 28,3 – 30,8 mN/m sau 14 ngày. Từ kết quả cảm quan bảng 3.4 độ nhũ tương ta thấy mức độ nhũ tương hóa của R3, R6, R9 suốt quá trình lắc đều nhũ hóa cao đã biến lớp ván dầu thành những hạt dầu rất rất nhỏ. Theo nghiên cứu của Trần Thị Nga, tác giả đã phân lập từ nước nhiễm dầu ở khu vực rừng ngập mặn Cần Giờ được chủng vi khuẩn mang tên SG – 7 có khả năng phân hủy dầu DO làm giảm sức căng bề mặt của môi trường nuôi cấy từ 50,8 xuống 31,2 mN/m. Như vậy, 10 chủng trong thí nghiệm của chúng tôi đã cho kết quả xử lý dầu tương đối tốt, trong đó có 2 chủng đặc biệt làm giảm hẳn sức căng bề mặt còn thấp hơn 1 mN/m. Tuy nhiên, cần có các nghiên cứu tiếp theo về xác định tổng hàm lượng dầu khoáng có trong mẫu để có thể kết luận chính xác hơn. 55
  57. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Từ nguồn nước ô nhiễm dầu ở khu vực Cần Giờ đã tuyển chọn được được 10 chủng vi sinh vật, các chủng này đều có khả năng phát triển trên môi trường có dầu thô là nguồn carbon duy nhất. Trên quy mô xử lý ở điều kiện phòng thí nghiệm, các chủng đều cho thấy khả năng tăng sinh và phân hủy lượng dầu có trong mẫu nước ô nhiễm. Mật độ tế bào đạt 78.103cfu/ml, sức căng bề mặt giảm còn 17,9 mN/m sau 14 ngày nuối cấy. Trong 10 chủng tuyển chọn 2 chủng R3, R6 có khả năng phân hủy mạnh nhất. 4.2. Đề nghị Đề tài chỉ xác định được sức căng bề mặt ảnh hưởng đến sự phân hủy dầu nên cần một số điều kiện khác để kết luận các vi khuẩn trên có phân hủy được dầu. Định danh các chủng vi khuẩn phân lập được, đặt biệt là 2 chủng R3 và R6. Xác định các CHĐBMSH vi sinh vật phân giải trong quá trình phân hủy hydrocarbon từ dầu thô. Xây dựng mô hình ứng dụng xử lý ở quy mô lớn hơn. Cần xác định hàm lượng dầu tổng sau các khoảng thời gian xử lý. 56
  58. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 1. Bùi Trọng Vinh, 2004, Nghiên cứu khả năng xử lý vật liệu bờ bằng phương pháp kích hoạt vi sinh vật phân hủy dầu. Luận Văn cao học Viện Môi trường và Tài nguyên. 2. Đinh Thị Ngọ, 2008, Giáo trình hóa học dầu khí. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, trang 1-35. 3. Hoàng Anh Tuấn và Đoàn Cảnh, 1996, Báo cáo tổng hợp chương trình làm sạch dầu DO cải tạo môi trường bị ô nhiễm, khôi phục sản xuất ở hai huyện Nhà Bè – Cần Giờ, TPHCM. Ủy ban môi trường TP.HCM. 4. Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Dương Nhã, Đặng Thị Cẩm Hà, 2003, Nấm sợi phân hủy hydrocarbon thơm đa nhân phân lập từ cặn dầu thô của giếng khai thác dầu Vũng Tàu. Tập chí Công nghệ Sinh học, trang 255-264. 5. Lâm Kim Ngọc, 2005, Nghiên cứu tiềm năng du lịch sinh thái ở huyện Cần Giờ. Khóa luận văn tốt nghiệp trường đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM. 6. Lại Thúy Hiền, 1997, Giáo trình cao học vi sinh học dầu mỏ. Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, trung tâm khoa học tự nhiên và tài nguyên quốc gia. 7. Lại Thúy Hiền, Đỗ Thu Phương, Hoàng Hải, Phạm Thị Hằng, Lê Phi Nga, Lê Thị Nhi Kiều, Kiều Hữu Ảnh, 2003, Chọn chủng vi sinh vật tạo CHĐBMSH cao ứng dụng trong công nghiệp dầu khí và xử lý môi trường. Tập chí công nghệ sinh học, Viện công nghệ sinh học Trường Đại Học Xã Hội Tự Nhiên. 8. Lê Tiến Mạnh, 2008, Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học hydrocarbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được 57
  59. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Quảng Ninh. Luận văn Thạc Sĩ, trường đại học Thái Nguyên. 9. Trần Thị Nga, 2010, Khả năng sử dụng vi khuẩn phân hủy dầu đồng thời tạo chất hoạt động bề mặt trong xử lý ô nhiễm dầu. Luận văn tốt nghiệp. 10. Báo cáo chuyên đề CNSH – MT, 2009, Ứng dụng công nghệ sinh học trong xử lý tràn dầu trên biển. Trường đại học Nông Lâm TP.HCM khoa môi trường và tài nguyên. 11. Tạp chí thông tin dầu khí thế giới số 7/2005. Một số trang wed 12. http:www.agriviet.com. 13. om/Ask_Dr_Skimmer_and_Boomer/Student_Page_301.pdf+cleanup+o il+spill+mechanical&cd=7&hl=vi&ct=clnk&gl=vn 58
  60. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền PHỤ LỤC Bảng 1: Số lượng khuẩn lạc với 2 nồng độ pha loãng 0 ngày 7 ngày 14 ngày Mẫu 10-1 10-2 10-1 10-2 10-1 10-2 ĐC 45 22 50 28 70 32 R1 36 13 87 22 131 92 R2 50 37 154 98 200 119 R3 163 63 215 98 200 119 R4 118 27 163 110 175 164 R5 163 63 169 67 219 112 R6 178 70 272 140 298 191 R7 144 86 200 126 220 177 R8 165 67 172 85 200 108 R9 110 70 280 163 300 197 R10 36 9 142 66 208 159 59
  61. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Tống Khánh Tuyền Bảng 2: Kết quả đo sức căng bề mặt 7 ngày và 14 ngày với 2 lần lặp lại (đơn vị: mN/m) 7 ngày 14 ngày Mẫu Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2 ĐC 35,7 37,7 32,5 32,7 R1 31,0 30,3 28,8 27,9 R2 22,1 22,0 20,1 20,0 R3 0,28 0,88 0,11 0,21 R4 24,5 25,6 20,5 19,6 R5 33,6 30,1 30,6 31,1 R6 0,67 0,89 0,20 0,32 R7 29,9 29,6 24,9 25,6 R8 22,8 20,2 18,8 18,2 R9 18,9 21,1 15,5 15,7 R10 24,5 23,9 20,5 19,9 60