Tóm tắt luận án Tỷ lệ nhiễm và mang gen kháng Cephalosporin thế hệ 3 và Quinolon của các chủng Klebsiella gây nhiễm khuẩn hô hấp phân lập tại Bệnh viện nhi Trung Ương, 2009 - 2010 - Bùi Thị Mùi

Nội dung text: Tóm tắt luận án Tỷ lệ nhiễm và mang gen kháng Cephalosporin thế hệ 3 và Quinolon của các chủng Klebsiella gây nhiễm khuẩn hô hấp phân lập tại Bệnh viện nhi Trung Ương, 2009 - 2010 - Bùi Thị Mùi

1. 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG  BÙI THỊ MÙI TỶ LỆ NHIỄM VÀ MANG GEN KHÁNG CEPHALOSPORIN THẾ HỆ 3 VÀ QUINOLON CỦA CÁC CHỦNG KLEBSIELLA GÂY NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG, 2009-2010 Chuyên ngành: Vi sinh y học Mã số: 62.72.01.15 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI - 2014
2. 2 CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Nguyễn Thanh Liêm 2. TS. Lê Thị Ánh Hồng Phản biện 1. Phản biện 2. Phản biện 3. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp viện tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương vào hồi giờ , ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư viện Quốc gia 2. Thư viện Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương
3. 3 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo nucleic ARN : Acid ribonucleic C3G : Cephalosporin thế hệ 3 ESBL : Extended Spectrum Beta Lactamases(Men beta- lactamase phổ rộng) HH : hô hấp HSCC : Hồi sức cấp cứu HSN : Hồi sức ngoại MIC : Minimal Inhibitory concentration(nồng độ ức chế tối thiểu) PCR : polymerase chain reaction( phản ứng chuỗi trùng hợp) PFGE : pulsed field Get Eleetrophoness( điện di ung trường) NKHHCT : nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính WHO : world heath organization(tổ chức y tế thế giới)
4. 4 ĐẶT VẤN ĐỀ Giống Klebsiella là một trong các hệ vi khuẩn có ở đường tiêu hóa, hô hấp của người, là căn nguyên của một số bệnh nhiễm khuẩn ở người, gây bệnh chủ yếu ở trẻ nhỏ. Trên thế giới loài Klebsiella là một trong những căn nguyên quan trọng gây nhiễm khuẩn ở bệnh nhi nằm điều trị tại bệnh viện đặc biệt là những trẻ sơ sinh non yếu và trẻ nhỏ. Tỷ lệ nhiễm khuẩn do Klebsiella ở trong bệnh viện đặc biệt là những đơn vị hồi sức cấp cứu rất khác nhau giữa các nước từ 10,2%-26,2% . Tình trạng kháng với hầu hết các kháng sinh đang là một mối đe doạ lớn đối với thầy thuốc và người bệnh. Với kháng sinh thông thường như Ampicillin, Cephazolin, Klebsiella spp. đã kháng cao 60%-100%. Phát hiện gen kháng kháng sinh nhóm quinolon lan truyền qua plasmid là mốc quan trọng trong nghiên cứu về gen kháng kháng sinh của vi khuẩn này. Nghiên cứu về cơ chế kháng kháng sinh được tiến hành với mục đích tìm căn nguyên của sự gia tăng tính kháng kháng sinh của Klesiella, trong đó cơ chế kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon được nghiên cứu ở nhiều nước. Ở Việt Nam, Klebsiella là căn nguyên hàng đầu gây nhiễm khuẩn hô hấp phân lập được chủ yếu ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ nằm điều trị tại bệnh viện. Tỷ lệ Klebsiella spp kháng và đa kháng kháng sinh cao với ampicillin và cephalotin kháng 97,8% và 91,7% ở trẻ em. Những nghiên cứu tìm hiểu về tình trạng mang gen mã hóa sinh men β-lactamase phổ rộng gây kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon lan truyền qua plasmid chưa được thực hiện nhiều ở Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm mục tiêu: 1- Xác định tỷ lệ chủng Klebsiella phân lập được ở đường hô hấp của các bệnh nhi từ 0 đến 6 tuổi tại Bệnh viện Nhi Trung ương năm 2009-2010. 2- Xác định tính kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella phân lập được. 3- Xác định tỷ lệ mang gen kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon của các chủng Klebsiella phân lập được. * Những đóng góp mới của luận án: Nghiên cứu đầu tiên được tiến hành trên đối tượng bệnh nhi từ 0-6 tuổi, đã phát hiện được cơ chế kháng kháng sinh của Klesiella, trong đó xác định được gen kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon của các chủng Klebsiella phân lập được tại Bệnh viện Nhi Trung ương.
5. 5 * Bố cục luận án: Luận án gồm 120 trang bao gồm: Đặt vấn đề: 2 trang; Chương 1. Tổng quan: 38 trang; Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 21 trang; Chương 3. Kết quả nghiên cứu: 38 trang; Chương 4. Bàn luận: 18 trang; Kết luận: 2 trang và kiến nghị: 1 trang. Luận án gồm: 29 bảng, 18 biểu đồ, 3 sơ đồ và 17 hình. Tài liệu tham khảo: 121 tài liệu. Chương 1 TỔNG QUAN 1.1.Các đặc điểm về giải phẫu, sinh lý và miễn dịch hệ hô hấp 1.1.1. Các đặc điểm về giải phẫu Bộ máy hô hấp bao gồm đường hô hấp trên và đường hô hấp dưới. Ranh giới phân chia là nắp thanh quản . 1.1.2. Đặc điểm sinh lý: Bộ máy hô hấp trẻ em chưa hoàn chỉnh những năm đầu đời. 1.1.3. Cơ chế miễn dịch bảo vệ đường hô hấp Hàng rào niêm mạc Các tế bào thực bào Các yếu tố thể dịch 1.2. Các căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em. 1.2.1. Các căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em - Tác nhân virus: Đa số các trường hợp NKHHCT ở trẻ em là do virus (60- 70%). - Tác nhân vi khuẩn: + Các loại vi khuẩn thường gặp trong nhiễm trùng cộng đồng: Heamophilus Influenzae, Streptococcus Pneumoniae, Moracella Catarrhalis,Staphylococcus aureus. + Các loại vi khuẩn thường gặp trong nhiễm trùng bệnh viện: S. Aureus, P. Aeruginosa, Các trực khuẩn Gram âm dễ mọc khác, Klebsiella pneumoniae 1.2.2. Klebsiella trong NKHHCT Nhiễm khuẩn do K.pneumoniae và K. oxytoka thường gặp nhất ở người. Klesiella chiếm 8% các nhiễm trùng của bệnh viện. 14% nhiễm khuẩn huyết nguyên phát do Klesiella. Trong số 145 báo cáo bùng phát nhiễm trùng bệnh viện từ 1983- 1991 có 13 báo cáo được quy kết là do Klesiella. Các trung tâm kiểm soát dịch bệnh và phòng chống chủng Klesiella cho thấy có 3% nguyên nhân bùng phát dịch bệnh do Klesiella.
6. 6 Một cuộc điều tra Klesiella pneumoniae carbamenemase (KPC) ở những bệnh nhân nhiễm khuẩn đường ruột trong năm 2011 thấy sự lan truyền rộng rãi KPC trong 4 huyện liền kề ở Ấn Độ trong 1 năm. Bùng phát nhiễm khuẩn huyết ở trẻ sơ sinh trên khắp thế giới, nhiễm trùng khác do Klesiella. cũng gặp trên toàn thế giới. Thường gặp ở các khu vực Đông Âu, Nam Á, Trung Phi và châu Mỹ la tinh. 1.3. Phương pháp chẩn đoán vi sinh trong nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính 1.3.1. Phương pháp thông thường 1.3.2. Phương pháp cấy đếm 1.4. Một số kỹ thuật xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn gây bệnh với kháng sinh 1.4.1. Kháng sinh và cơ chế kháng kháng sinh Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh lên tế bào vi khuẩn:  Kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp vách  Kháng sinh tác động trên màng nguyên tương  Kháng sinh ức chế quá trình sinh tổng hợp protein  Kháng sinh ức chế sinh tổng hợp acid nucleic  Kháng sinh ức chế quá trình sinh tổng hợp acid folic Cơ chế đề kháng kháng sinh:  Đề kháng tự nhiên  Đề kháng thu được Cơ sở di truyền học của sự đề kháng thu được:  Đề kháng thu được do đột biến trên NST: Đột biến thường xẩy ra ở giai đoạn sao chép các bazơ purin và pyrimidin trong quá trình tổng hợp của ADN, các ADN mới được tổng hợp sẽ không còn giống với phiên bản của ADN thế hệ trước.  Đề kháng thu được do nhận được gen đề kháng qua các hình thức vận chuyển di truyền: Biến nạp, tải nạp, tiếp hợp  Thành phần di truyền di động (transposons - gen nhảy)  Cơ chế lan truyền gen đề kháng 1.4.2. Các cơ chế đề kháng kháng sinh họ vi khuẩn đường ruột với kháng sinh nhóm beta - lactam  Đề kháng tự nhiên: Đề kháng tự nhiên do sinh ra enzym - lactamaza và đề kháng tự nhiên không do sinh ra enzym -lactamaza  Đề kháng thu được:  Đề kháng thu được làm cho vi khuẩn sinh ra enzym - lactamaza
7. 7  Vi khuẩn sinh ra enzym penicillinaza do nhận được gen đề kháng nằm trên plasmid  Vi khuẩn tăng cường sản xuất ra enzym penicillinaza do gen đề kháng nằm trên nhiễm sắc thể  Đề kháng thu được làm cho vi khuẩn sinh ra enzym cephalosporinaza do gen mã hóa nằm trên nhiễm sắc thể  Đề kháng thu được làm cho vi khuẩn sinh ra các enzym - lactamaza khác - Năm 1989-1990, hai tác giả Bauernfeind và Papanicolaou đã tìm thấy ở loài K. pneumoniae sinh ra enzym -lactamaza kháng lại kháng sinh cephamycin (CMY-1, MIR-1), gen mã hóa nằm trên plasmi. - Enzym immipenemaza cũng đã được tìm thấy ở các loài S. marcescens và E. cloacae bởi các tác giả Yang (1990), Lee và Raimondi (1991). - Các Beta Lactamase mới * TEM-TYPE ESBLs (Lớp A): việc thay thế amino acid ở nhiều vị trí ở TEM-1 beta-lactamase có thể được tạo ra ở phòng thí nghiệm mà không mất hoạt tính. Sự thay đổi vị trí này của ESBLs làm thay đổi hình dạng vị trí hoạt hóa của men, cho phép thâm nhập oxyimino-beta-lactam. Trên 130 men TEM đã được tìm thấy, và sự đa dạng của chúng có lợi cho việc theo dõi sự lan tràn của các gene đề kháng. * SHV-TYPE ESBLs (lớp A): SHV-1 chia 68% các amino acid của nó với TEM-1 và có cấu trúc tương tự. Cũng như TEM, SHV-type ESBLs có một hoặc nhiều sự thay thế các amino acid xung quanh vị trí hoạt hóa. Hơn 50 dạng khác nhau của SHV đã được biết. * CTX-TYPE ESBLs (lớp A): Hiện nay, có hơn 40 CTX-M đã được biết. * NHỮNG ESBLs LỚP A KHÁC: PER-1 được phân lập ở Thổ Nhĩ Kỳ, Pháp, và Ý; VEB-1 và VEB-2 tìm thấy ở Đông Nam Á; GES-1, GES-2 và IBC-2 được phân lập ở Nam Phi, Pháp và Hy Lạp. PER-1 cũng thường gặp ở dòng acinetobacter ở Hàn Quốc và Thổ Nhĩ Kỳ. Một số các men này cũng được tìm thấy ở Enterobacteriaceae, ngược lại các ESBLs ít gặp (như BES-1, IBC-1, SFO-1 và TLA-1) chỉ được tìm thấy ở Enterobacteriaceae. * OXA-TYPE ESBLs (lớp D): 12 ESBLs bắt nguồn từ OXA-10, OXA-1, hay OXA-2 bằng cách thay thế các amino acid. * MEN PLASMID-MEDIATED AmpC (lớp C): AmpC beta- lactamases, sinh ra do beta-lactam, được mã hóa ở các gene trên nhiễm sắc
8. 8 thể ở nhiều trực khuẩn gram âm. Các đột biến làm gia tăng tình trạng đề kháng cephalosporin phổ rộng ở Enterobacter cloacae. Hơn 20 AmpC beta-lactamase được tìm thấy truyền qua trung gian plasmid. * CARBAPENEMASES (LỚP A, B VÀ D): carbapenemases là một nhóm khác, hiện nay ít gặp tuy nhiên rất được quan tâm, vì chúng có hoạt tính không những chỉ chống lại oxyimino-cephalosporin và cephamycin mà còn với carbapenem. Plasmid-mediated IMP-type carbapenemases (hiện nay đã biết được 17 loại), được tìm thấy ở Nhật (1990s), ở cả gram âm đường ruột, pseudomonas và acinetobacter sp. 1.4.3. Đề kháng với kháng sinh Quinolon Sự đề kháng với nhóm kháng sinh này cho đến nay vẫn được hiểu là do đột biến trên NST. Sự đột biến này làm thay đổi đặc tính của enzym tác động vào quá trình sinh tổng hợp ADN (enzym ADN - gyrase) làm cho kháng sinh không tác động vào được nữa. Năm 1998, Martinez - Martinez và cộng sự, lần đầu tiên mô tả chủng K. pneumoniae mang gen kháng quinolon nằm trên plasmid, đồng thời các gen này còn gắn trên các Integron khác nhau. Hơn nữa, các plasmid này cũng đồng thời mang gen mã hóa enzym -lactamase phổ rộng hoặc enzyme cephalosporinase. Phát hiện này có tầm quan trọng rất lớn, bởi nó nói lên rằng gen kháng quinolon có thể được lan truyền ngang giữa các vi khuẩn. 1.5. Phương pháp xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh và các phương pháp xác định gen kháng thuốc của vi khuẩn 1.5.1. Phương pháp xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh 1.5.1.1. Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên thạch 1.5.1.2. Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (Minimum Inhibitory Concentration - MIC)  Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn trong môi trường đặc  Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn trong môi trường lỏng  Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn bằng băng giấy Etest 1.5.2.Các kỹ thuật xác định cơ chế kháng kháng sinh 1.5.2.1. Kỹ thuật tiếp hợp trên mặt thạch 1.5.2.2. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). 1.5.2.3. Phương pháp Real-Time PCR 1.5.2.4. Kỹ thuật phương pháp lai phân tử 1.5.2.5. Kỹ thuật giải trình tự gen
9. 9 1.6. Nhiễm khuẩn hô hấp và tình hình kháng kháng sinh do Klebsiella 1.6.1. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của Klebsiella spp. ở nước ngoài Nhiễm khuẩn hô hấp do Klebsiella spp. ở trong cộng đồng là hiếm gặp, thường gặp ở những người có miễn dịch kém như trẻ nhỏ, người già, người mắc bệnh mãn tính Nhiễm khuẩn do Klebsiella spp. gặp chủ yếu ở trẻ sơ sinh và sơ sinh non yếu. Tỷ lệ chủng kháng và đa kháng kháng sinh cao, nhất là chủng sinh men β-lactamase phổ rộng và KPC. Đặc biệt là những chủng Klebsiella spp. mang gen NDM-1 gây đề kháng các loại kháng sinh hiện có và làm cho Klebsiella spp. trở thành siêu vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh. Tỷ lệ nhiễm khuẩn do Klebsiella spp. khác nhau ở các nước. Tại Châu Âu, tỷ lệ Klebsiella spp. gây nhiễm khuẩn ở các bệnh viện từ 3% - 17%; ở Thổ Nhĩ Kỳ 26,2%. Các chủng Klebsiella spp. gây nhiễm khuẩn bệnh viện đề kháng cao với các kháng sinh ngoại trừ imipenem (IPM) và ciprofloxacin (CIP), tỉ lệ kháng với các kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin và quinolon ở cộng đồng là 4% và 21%, tỉ lệ này cao gấp hai lần đối với những chủng phân lập được từ nhiễm trùng bệnh viện. Các chủng phân lập được từ nhiễm trùng bệnh viện đã kháng 60%-100% đối với ampicillin (AM) và cephazolin, xuất hiện chủng kháng với nhiều loại kháng sinh, với IPM và CIP kháng 0%-12%. Các chủng sinh men β- lactamase phổ rộng (ESBLs) là yếu tố lan tràn và bùng phát nhiễm khuẩn bệnh viện đồng thời tăng tỉ lệ chủng kháng đa kháng kháng sinh. Tỉ lệ chủng có men ESBLs phân lập ở bệnh nhân viêm phổi nhiễm trùng bệnh viện là 88,9% còn phân lập từ những bệnh nhân viêm phổi không phải do nhiễm trùng bệnh viện là 11,1%. Những báo cáo mới nhất về cơ chế kháng kháng sinh nhóm quinolon của các nhà nghiên cứu cho thấy vai trò chủ yếu là do đột biến trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Năm 1998, Martinez - Martinez và cộng sự, lần đầu tiên mô tả chủng Klebsiella pneumoniae kháng nhóm kháng sinh quinolon theo cơ chế lan truyền gen P.M.G 252 trên plasmid. Sự kháng kháng sinh nhóm quinolon được xác định bởi gen qnr nằm trên các Integron khác nhau. Phát hiện này có tầm quan trọng rất lớn bởi nó nói lên rằng gen kháng quinolon có thể lan truyền ngang giữa các vi khuẩn với nhau. Thêm vào đó các integron này đồng thời mang gen kháng kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ ba (do enzym -lactmase phổ rộng hoặc do enzyme cephalosporinase).
10. 10 Tỷ lệ mang gen kháng qnr khác nhau giữa các nước và các khu vực:từ 4% đến 55% tập trung cao ở các nước Đông nam Á, đặc biệt là Hàn Quốc và Trung Quốc từ 20,3 đến 55% Sự kháng kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 (C3G) liên quan đến sự kháng quinolon theo cơ chế plasmid luôn được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Cũng giống như quinolon, chủng kháng C3G thay đổi tùy theo vùng địa lý. Những thay đổi quan trọng được báo cáo ở châu Á - Thái Bình Dương. Ở Châu Phi số liệu không nhiều, tỷ lệ kháng khoảng 40%. Đa số chủng mang gen qnr đều kèm theo mang enzym ESBL (SHV-5, SHV-7, CTX-M, Veb-1, Oxa-30) hoặc một -lactamase plasmid type AmpC (Fox-5). Đặc biệt các chủng mang gen kháng CTX-M một gen mã hóa enzym phân hủy Cefotaxime kháng sinh đang được sử dụng nhiều trong điều trị và có những loại CTX-M phân hủy ceptazidime nhanh và mạnh hơn Cefotaxime đã xuất hiện khắp các nước. 1.6.2. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của Klebsiella spp. ở trong nước: Nhiễm trùng đường hô hấp là một bệnh chiếm tỷ lệ cao trong các nhóm bệnh ở trẻ em 53,3% (nghiên cứu cơ cấu bệnh tật trong 3 năm 2005- 2008 của bệnh viện Thanh Nhàn). Nhiễm khuẩn hô hấp cấp ở trẻ em ở các bệnh viện có tỷ lệ cao : Sain-Paul 36,8%, khoa Nhi - Bệnh viện Bạch Mai 41,35%, Bệnh viện Đak lak 35,5%. Tỷ lệ nhiễm khuẩn hô hấp, nhiễm khuẩn huyết và nhiễm khuẩn tiết niệu trẻ em ở bệnh viện 27,62% - 42,12. Các chủng Klebsiella spp. thu được ở bệnh viện nhi kháng lại kháng sinh ngày một tăng cao. Các kháng sinh thông thường như Ampicilline và Cephalothine kháng 97,8% và 91,7%, nhóm quinolon (31,9%) và C3G khá cao ở nhiễm khuẩn bệnh viện ở trẻ em (42,4 - 57,2%). Những nhiễm khuẩn chung ở người lớn tỷ lệ kháng C3G từ 36,8 - 37,2% và quinolon 31,8%. Tỷ lệ chủng sinh beta-lactamases ở Klebsiella khác nhau tuỳ từng bệnh viện. Bệnh viện Chợ Rẫy 61%; Bệnh viện Việt Đức là 39,3%; Bệnh viện Nhi Trung ương 22,68%. Tỷ lệ kháng C3G cao (36,8% - 57,2%) và quinolon (31,8% - 31,9%). Cho đến nay, ở Việt Nam có nghiên cứu của Cao Thị Bảo Vân và cộng sự với công bố kết quả nghiên cứu sự phân bố gen kháng Bêta- lactam của các chủng thuộc họ Enterobacterriacea phân lập ở Việt nam cho thấy tỷ lệ CTX-M(25,5%); SHV (38,1%) ; TEM (76,3%).
11. 11 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu: Tất cả các chủng Klebsiella phân lập được từ bệnh phẩm đường hô hấp của các bệnh nhi từ 0 đến 6 tuổi nằm điều trị tại khoa Hồi sức cấp cứu, Hồi sức ngoại, Sơ sinh và khoa Hô hấp bệnh viện Nhi Trung ương từ tháng 7/2009 đến tháng 7/2010. Những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp này được thu thập từ hai nhóm : + Nhóm từ những bệnh nhi được chẩn đoán là nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp tính ngay khi nhập viện (như viêm phế quản phổi, viêm phổi, viêm tiểu phế quản phổi ) - gọi là nhóm NKHHCT + Nhóm thu thập từ những bệnh nhi được chẩn đoán những bệnh khác ngoài nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp tính khi nhập viện, mà NKHHCT là bệnh đi kèm hoặc xuất hiện sau thời gian nằm điều trị - gọi là nhóm NKHHCT kết hợp - Tiêu chuẩn lựa chọn các chủng Klebsiella vào nghiên cứu gen kháng C3G và Quinolon: Tất cả các chủng Klebsiella có sinh men β- lactamase phổ rộng được xác định theo tiêu chuẩn của CLSI đảm bảo không cùng trên một phòng bệnh trong cùng một ngày nuôi cấy. 2.2. Thiết kế nghiên cứu: Chúng tôi sử dụng thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang. Nghiên cứu đã phân tích trên 152 mẫu phân lập được Klebsiella có sinh men β-lactamase phổ rộng bằng phương pháp chọn mẫu thuận tiện. 2.3. Các biến số và chỉ số nghiên cứu: - Tỷ lệ chủng Klebsiella phân lập được ở đường hô hấp của đối tượng nghiên cứu theo các Khoa, tuổi, giới, theo các nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp - Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella phân lập được theo các Khoa, tuổi, giới, theo các nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp. - Tỷ lệ mang gen kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon (CTX- M, SHV,TEM, qnr) của các chủng Klebsiella phân lập được theo các Khoa, tuổi, giới, theo các nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp.
12. 12 2.4. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu Các kỹ thuật xét nghiệm được thực hiện tại Khoa Vi sinh, Bệnh viện Nhi Trung ương và Phòng nghiên cứu kháng kháng sinh - Khoa vi sinh thuộc labo lâm sàng bệnh viện Serveral của Đại học tổng hợp Yonsei - Hàn quốc.  Lấy bệnh phẩm, nuôi cấy phân lập  Nuôi cấy, phân lập, xác định căn nguyên vi khuẩn:  Kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán trên thạch  Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên thạch để xác định khả năng sinh men β-lactamase phổ rộng (ESBLs) của vi khuẩn (CLSI)  Xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (Minimum Inhibitory Concentration - MIC)  Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)  Kỹ thuật Southern Blot [120]: 2.5. Phân tích và xử lý số liệu: - Các số liệu thu thập được sẽ được các nghiên cứu viên kiểm tra để phát hiện những sai sót và làm sạch (xử lý thô). - Số liệu sau khi được xử lý thô được mã hóa và nhập vào máy tính bằng phần mềm Epidata 3.1. Chương trình nhập số liệu được xây dựng riêng cho nghiên cứu này bao gồm tệp CHECK nhằm hạn chế tối đa những sai số. - Số liệu nghiên cứu và kết quả được xử lý bằng phần mềm SPSS. Thống kê phân tích được thực hiện thông qua các test như khi bình phương so sánh các tỷ lệ, Mann-Whitney test đối với so sánh 2 nhóm và Kruska Wallis test đối với so sánh 3 nhóm về các đặc điểm của nhóm NKHHCT và nhóm NKHHCT kết hợp. Mức p<0,05 được sử dụng nhằm xác định ý nghĩa thống kê. 2.6. Đạo đức trong nghiên cứu: - Nghiên cứu đã được thông qua hội đồng y đức bệnh viện và hội đồng xét duyệt đề cương nghiên cứu sinh chấp thuận về mặt y đức.
13. 13 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tỷ lệ và sự phân bố tỷ lệ chủng Klebsiella phân lập từ bệnh nhi NKHHCT 0 đến 6 tuổi với một số yếu tố liên quan 3.1.1.Sự phân bố mẫu bệnh phẩm nhiễm khuần hô hấp theo nhóm bệnh và theo khoa lâm sàng Từ tháng 7/2009 đến tháng 7/2010, có tổng số 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp được nuôi cấy xác định tác nhân gây nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp tính ở các khoa Hồi sức cấp cứu, Hồi sức ngoại, Sơ sinh và khoa Hô hấp đã được đưa vào nghiên cứu. Những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp này thu thập từ bệnh nhi 0 đến 6 tuổi được phân tích chung và xem xét ở hai nhóm: NKHHCT (1.909 mẫu) và NKHHCT kết hợp (1658 mẫu). 3.1.2. Tỷ lệ nuôi cấy dương tính Từ tháng 7/2009 - 7/2010 có 1.181 mẫu bệnh phẩm phân lập được vi khuẩn trong 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp ở bệnh nhi sơ sinh đến 6 tuổi, tại các khoa Hồi sức cấp cứu, Hồi sức ngoại, Sơ sinh và khoa Hô hấp bệnh viện Nhi Trung ương, cho thấy tỷ lệ nuôi cấy dương tính với các vi khuẩn gây bệnh là 33,1%. Trong đó có 87 mẫu có 2 loài chiếm 7,4% 3.1.3. Tỷ lệ nuôi cấy dương tính ở hai nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp phân bố ở các khoa Với 1.909 mẫu bệnh phẩm nhóm NKHHCT và 1.658 mẫu bệnh phẩm NKHHCT kết hợp đã nuôi cấy tìm căn nguyên vi khuẩn gây bệnh. Tỷ lệ nuôi cấy dương tính và sự phân bố theo các khoa tỷ lệ nuôi cấy dương tính chung là 37,4% ở nhóm NKHHCT và 28,1 % ở nhóm NKHHCT kết hợp. Cao nhất ở khoa sơ sinh (48,8% và 54,7%), sau đó là khoa hô hấp (37,5%) và thấp nhất là khoa HSCC (21,1% và 22,2%), sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0,001. 3.1.4. Sự phân bố của các loài vi khuẩn phân lập được Sự phân bố của các loài vi khuẩn như sau: đứng đầu là Klebsiella pneumoniae (22,6%) sau đó là Acinetobacter spp. (19,9%), P. aeruginosa(18,4%). Các căn nguyên thường gặp ở cộng đồng không cao S. pneumoniae (5,1%), H. influenzae(5,3%) 3.1.5. Sự phân bố của các loài vi khuẩn phân lập được theo nhóm bệnh: Nuôi cấy 3567 mẫu bệnh phẩm có 1181 mẫu bệnh phẩm tìm thấy vi khuẩn gây bệnh. Tỷ lệ phân lập được K. pneumoniae là cao nhất (24,1%) ở nhóm NKHHCT và Acinetobacter spp. (29,8%) ở nhóm
14. 14 NKHHCT kết hợp, sau đó là P. aeruginosa (17,4%) ở nhóm NKHHCT và Klebsiella pneumonia (20,3%) ở nhóm NKHHCT kết hợp. Các cầu trùng gram dương có tỷ lệ từ 5,0% đến 7,8%. 3.1.6. Tỷ lệ phân bố vi khuẩn gram âm và gram dương Chủ yếu các căn nguyên vi khuẩn phân lập được là trực khuẩn gram âm chiếm 80,8%, 18% là cầu trùng Gram dương và 1,2% là song cầu Gram âm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê, với p 0,05 3.1.7. Tỷ lệ phân lập được các chủng K. pneumoniae 3.1.7.1. Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae theo tuổi:  Tỷ lệ phân lập được các chủng K. pneumoniae theo tuổi nhóm NKHHCT: Tỷ lệ nhiễm K. pneumoniae của trẻ trong độ tuổi sơ sinh ở nhóm NKHHCT là 26,6%; Của trẻ dưới 1 tuổi là 22,7% và trẻ 1 đến 6 tuổi là 15,8%. Các tỷ lệ này không có sự khác biệt với p>0,05  Tỷ lệ phân lập được các chủng K. pneumoniae theo tuổi nhóm NKHHCT kết hợp: Có 467 mẫu bệnh phẩm nhóm NKHHCT kết hợp nuôi cấy dương tính có 95 chủng K. pneumoniae được phân lập, tỷ lệ nhiễm K. pneumoniae của trẻ trong độ tuổi Sơ sinh ở nhóm NKHHCT kết hợp là 21,6%; trẻ dưới 1 tuổi là 20,3% và trẻ 1 đến 6 tuổi là 8,3%. Các tỷ lệ này không có sự khác biệt với p>0,05 3.1.7.2. Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae theo giới tính Trong 3567 mẫu bệnh phẩm đã có 267 chủng K. pneumoniae phân lập được. Sự phân bố các chủng K.pneumoniae thể hiện ở bảng 3.7 Bảng 3.7. Phân bố các chủng K. pneumoniae theo giới tính Giới tính Số lượng K. pneumoniae (+) Tỷ lệ % p Nam 2152 172 8,0 p>0,05 Nữ 1415 95 6,7 Tổng số 3567 267 7,4 Tỷ lệ K. peumoniae phân lập ở trẻ nam và nữ không có sự khác biệt,với p> 0,05. 3.1.7.3 Tỷ lệ phân lập được chủng K. pneumoniae theo các khoa lâm sàng: Bảng 3.10. Phân bố chủng K. pneumoniae phân lập được theo Khoa
15. 15 Số Tỷ lệ Khoa K.pneumoniae (+) p lượng % Sơ sinh(1) 793 106 13,7 p(1-2) 0,05 p(2-4) 0,05 Tổng số 1658 95 5,7 2-3
16. 16 Tỷ lệ phân lập được chủng K. pneumoniae ở khoa sơ sinh là cao nhất chiếm 14,3%, tiếp đến khoa Hồi sức cấp cứu 4,2% và khoa Hồi sức ngoại 4,5%. Sự khác biệt giữa khoa sơ sinh và các khoa Hồi sức cấp cứu là có ý nghĩa thống kê, với p 0,05. 3.1.7.6 Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae phân lập được theo các nhóm tuổi và theo mùa:  Tỷ lệ các chủng K pneumoniae phân lập được ở bệnh nhi sơ sinh cao nhất vào mùa hạ (54,76%), mùa thu (52,33%), mùa đông (39,39%) và mùa xuân (36,36%). Ở bệnh nhi lớn hơn độ tuổi sơ sinh tỷ lệ này cao nhất vào mùa xuân (63,64%), sau đó là mùa đông (60,61%), mùa thu (47,67%) và mùa hạ (45,24%). Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p>0,05  Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae của nhóm NKHHCT phân lập được theo nhóm tuổi và theo mùa: Tỷ lệ các chủng K pneumoniae phân lập được ở bệnh nhi sơ sinh cao nhất vào mùa hạ (54,8%), mùa đông (46,8%), mùa thu (40%) và mùa xuân (33,3%). Ở bệnh nhi lớn hơn độ tuổi sơ sinh tỷ lệ này cao nhất vào mùa xuân (66,6%), sau đó là mùa thu (60%), mùa đông (53,2%) và mùa hạ (45,3%). Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p>0,05  Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae của nhóm NKHHCT kết hợp phân lập được theo các nhóm tuổi và theo mùa: Các chủng K pneumoniae phân lập được ở bệnh nhi sơ sinh cao nhất vào mùa thu (69,4%), mùa hạ (58,6%), mùa xuân (45,5%) và mùa đông (21,1%). Ở bệnh nhi lớn hơn độ tuổi sơ sinh tỷ lệ này cao nhất vào mùa đông (79%), sau đó là mùa xuân (54,5%), mùa hạ (41,4%) và mùa thu (30,6%). Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0,01 3.2. Xác định tính nhạy cảm kháng sinh và khả năng sinh enzym β- lactamase phổ rộng (ESBLs) của chủng Klebsiella pneumoniae 3.2.1. Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng K. pnemoniae xác định bằng kỹ thuật định tính: Các chủng K. pneumoniae phân lập ở đường hô hấp đã kháng hầu hết với Ampicillin (99,2%), kháng kháng sinh nhóm Cephalosporin thế hệ 3 và 4 từ 86,8 đến 93,0%. Tỷ lệ kháng Imipenem rất thấp 0,4%. 3.2.1.1. Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng K. pnemoniae của nhóm NKHHCT xác định bằng kỹ thuật định tính :
17. 17 Các chủng K. pneumoniae phân lập ở đường hô hấp đã kháng hầu hết với Ampicillin (98,7%), kháng kháng sinh nhóm Cephalosporin thế hệ 3 và 4 từ 87,7% đến 92,3 %. Nhạy cảm 100% với Imipenem . 3.2.1.2. Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng K. pnemoniae của nhóm NKHHCT kết hợp xác định bằng kỹ thuật định tính Các chủng K. pneumoniae phân lập ở đường hô hấp của nhóm NKHHCT kết hợp đã kháng hết với Ampicillin (100%), kháng kháng sinh nhóm Cephalosporin thế hệ 3 và 4 từ 86,4% đến 94,3 %. Với Imipenem kháng 1,1%. Biều đồ 3.9. Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng K.pneumoniae ở hai nhóm Qua biểu đồ ta thấy, tỷ lệ kháng kháng sinh của K. pneumoniae cao hơn hẳn ở nhóm NKHHCT kết hợp. Ở nhóm này đã kháng hết với Ampicilline (100%); Cephalosporin thế hệ 1- cephalothin (96,6%); Cephalosporin thế hệ 2- cefuroxime (95,5%); Cephalosporin thế hệ 3 và 4 từ 86,4% đến 94,3 %; Nhóm Aminoglycozid kháng thấp hơn từ 72,7 đến 89,8%. Kháng thấp với ciprofloxacin (15,9%) và imipenem (1,1%). 3.2.1.3. Tỷ lệ kháng nhiều loại kháng sinh ở hai nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp
18. 18 Tỷ lệ kháng nhiều hơn hoặc bằng 9 kháng sinh chiếm đa số trong các chủng K. pnemoniae phân lập được (75%), kháng 6-8 kháng sinh chiếm 22%, Kháng 2-5 kháng sinh là 3% và kháng hết là 0,4%. Biểu đồ 3.11. Tỷ lệ kháng nhiều loại kháng sinh ở hai nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp Ở cả hai nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp tỷ lệ các chủng K. pneumoniae kháng từ 9 đến 12 kháng sinh là chủ yếu chiếm 70,1 đến 84,8 % số chủng, trong đó nhóm NKHHCT kết hợp có tỷ lệ cao hơn; ngược lại tỷ lệ chủng kháng 6-8 kháng sinh là 11,4% và 26%, nhóm NKHHCT chiếm tỷ lệ cao hơn. Xuất hiện một số chủng kháng hết các kháng sinh thử nghiệm trong nhóm NKHHCT kết hợp. 3.2.1.4. Các kiểu cách đề kháng kháng sinh gặp ở nhóm NKHHCT: Phân tích dưới đây thể hiện kiểu cách đề kháng kháng sinh với 13 loại kháng sinh đã được thử nghiệm trong nghiên cứu của chủng vi khuẩn K. pneumoniae phân lập thuộc nhóm NKHHCT : các chủng K. pneumoniae phân lập được có tới 38 kiểu cách đề kháng khác nhau. Kiểu cách đề kháng thường gặp nhất là kháng với các kháng sinh CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM(23,87%); CXM,AM,AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM(10,32%); CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,GM,AK,TM (9,03%) và không có chủng nào kháng hết các kháng sinh thử nghiệm. 3.2.1.5. Các kiểu đề kháng kháng sinh thử nghiệm ở nhóm NKHHCT kết hợp Phân tích dưới đây thể hiện kiểu cách đề kháng kháng sinh với 13 loại kháng sinh đã được thử nghiệm trong nghiên cứu của chủng vi khuẩn K.pneumoniae phân lập thuộc nhóm chẩn đoán khác: Các chủng K.
19. 19 pneumoniae phân lập được 24 kiểu đề kháng. Kiểu đề kháng thường gặp nhất là kháng với các kháng sinh CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM (18,18%); CXM,AM,AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM (17,05%); CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM,CIP (12,50%); CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,GM,AK,TM (11,36%) và có chủng kháng hết các kháng sinh thử nghiệm. 3.2.1.6. Tỷ lệ K. pneumoniae đa kháng phân lập được ở bệnh nhi tử vong của nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp Biểu đồ 3.12. Tỷ lệ K. pneumoniae kháng với nhiều loại kháng sinh ở hai nhóm Qua biểu đồ ta thấy, tỷ lệ bệnh nhi tử vong do K. pneumoniae kháng ≥ 9 kháng sinh chiếm tỷ lệ cao hơn ở những bệnh nhi tử vong do K. pneumoniaekháng < 9 kháng sinh. Nhóm NKHHCT kết hợp cao hơn hẳn nhóm NKHHCT. Sự Khác biệt này có ý nghĩa thống kê , với p< 0,05. 3.2.2. Xác định khả năng sinh enzym β-lactamase phổ rộng của các chủng K. pnemoniae 3.2.2.1. Tỷ lệ sinh ESBLs của các chủng K. pnemoniae chung Nghiên cứu này đã xác định được 152 chủng có khả năng sinh enzym β-lactamase phổ rộng trên tổng số 267 chủng K. pneumoniae spp., chiếm tỷ lệ 56,9% 3.2.2.2.Sự phân bố các chủng K. peumoniae sinh ESBLs phân lập được ở các khoa Bảng 3.22. Tỷ lệ sinh ESBLs của K. pnemoniae ở các khoa
20. 20 ESBLs Số chủng thử Số chủng Tỉ lệ % p Khoa nghiệm (n) ESBLs (+) Hồi sức cấp cứu 41 24 58,5 Hồi sức ngoại 39 28 71,8 Sơ sinh 106 55 51,9 p< 0,05 Hô hấp 81 45 55,6 Tổng số 267 152 56,9 Tỷ lệ chủng sinh ESBLs phân lập được ở các khoa có sự thay đổi từ 51,9 đến 71,8 %, đặc biệt tỷ lệ ở khoa Hồi sức ngoại rất cao 71,8%. Với p <0,05 Biểu đồ 3.14.Tỷ lệ chủng K. pneumoniae sinh ESBLs ở hai nhóm Qua biểu đồ ta thấy tỷ lệ sinh ESBLs của các chủng K. pneumoniae phân lập được ở khoa Hồi sức ngoại là cao nhất trong các khoa. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê, với p<0,05 3.2.3. Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng K. pnemoniae xác định bằng kỹ thuật định lượng MIC Với 60 chủng có enzym β-lactamase phổ rộng (ESBL +) để đưa vào nghiên cứu xác định nồng độ ức chế tối thiểu của các kháng sinh nhóm β-lactamin, đánh giá mức độ đề kháng trên những chủng này. Kết quả được trình bày ở bảng sau: Bảng 3.26: Nồng độ kháng sinh nhóm β-lactamin ức chế tối thiểu 50% và 90% chủng K. peumoniae Tên Nồng độ ức Điểm gãy MIC kháng chế (Theo chuẩn CLSI Kháng sinh sinh (µg/ml) -µg/ml)) viết tắt MIC50 MIC90 Nhạy Kháng
21. 21 cảm (S) (R) Cefoxitin FOX 4 >4 ≤8 ≥32 Cefoperazon CFP >128 >128 ≤8 ≥32 Astreonam AZT 32 >64 ≤4 ≥16 Cefotaxim CTX 128 >128 ≤1 ≥4 Cefotaxim/Acid CTX/CLV 2 >16 ≤1 ≥4 clavulanic Ceftazidim CAZ 16 >16 ≤4 ≥16 Ceftazidim/Acid CAZ/CLV 1 >1 ≤4 ≥16 clavulanic Piperacillin PIP >256 >256 ≤16 ≥128 Piperacillin/Acid PIP/CLV >256 >256 ≤16 ≥128 clavulanic Cefepim PEP 16 >16 ≤8 ≥32 Imipenem IPM 0,12 >0,12 ≤4 ≥16 Kết quả trên cho thấy: các chủng Klebsiella pneumoniae có ESBL (+) có mức độ kháng kháng sinh nhóm β-lactamin rất cao: nồng độ ức chế tối thiểu 50% và 90% số chủng của một số kháng sinh đã vượt lên trên giới hạn điểm gẫy MIC theo chuẩn CLSI khá cao: Piperacillin và Piperacillin/Acid clavulanic >256 µg/ml; Cefoperazon >128 µg/ml. 3.3. Xác định tỷ lệ chủng K. peumoniae mang gen mã hóa sự kháng kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 và quinolon nằm trên plasmid 3.3.1. Xác định tỷ lệ chủng K. peumoniae mang gen mã hóa sự kháng kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 nằm trên plasmid Bằng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR), với các cặp mồi đã thiết kế nhằm mục đích xác định các gen mã hóa sự kháng kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 nằm trên plasmid: CTX-M-3, CTX-M-9, SHV và TEM. Chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu trên 107 chủng K. peumoniae. Bảng 3.27. Tỉ lệ chủng K. peumoniae mang gen mã hóa sự kháng C3G nằm trên plasmid Số chủng mang gen Gen mã hóa Tỉ lệ (%) (n=10) CTX-M-3 33 30,8 CTX-M-9 79 73,8 SHV 95 88,8 TEM 86 80,4 CTX-M (CTX-M-3+ CTX-M-9) 99 92,5
22. 22 Tỷ lệ chủng mang gen mã hóa sự kháng C3G nằm trên plasmid khá cao, đặc biệt là CTX-M nói chung là 92,5%; SHV(88,8%) và thấp nhất là CTX-M 3 (30,8%). 3.3.2. Xác định tỷ lệ chủng K. pneumoniae mang gen mã hóa sự kháng kháng sinh nhóm Quinolon (qnr) nằm trên plasmid Bằng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR), nghiên cứu trên 107 chủng K. pneumoniae. Kết quả thu được có 41/107 chủng có mang gen mã hóa sự kháng kháng sinh nhóm Quinolon trên plasmid, chiếm tỷ lệ 38,3%. Kết quả cho thấy tỷ lệ chủng mang gen kháng Quinolon nằm trên plasmid trong nghiên cứu này khá cao. Tất cả 107 chủng đưa vào nghiên cứu về gen mã hóa sự kháng kháng sinh, đều đã có chứa các gen mã hóa sự kháng C3G như kết quả phần trên, nhưng kết quả này cho thấy đồng thời có 38,3% số chủng mang gen mã hóa sự kháng kháng sinh nhóm Quinolon (qnr); Trong đó chủ yếu là qnrS (80,6 %), qnrB (17 %) và gen qnrA chiếm tỉ lệ rất nhỏ (2,4 %). 3.3.3. Tỷ lệ chủng mang đồng thời nhiều gen kháng C3G và qnr Bảng 3.29. Tỉ lệ chủng mang đồng thời nhiều gen kháng C3G và Qnr Số lượng Các gen mã hóa Tỉ lệ % p (n = 107) qnr+CTX-M+SHV+TEM 24 22,4 CTX-M+SHV+TEM 91 85 p< 0,05 CTX-M-3+ CTX-M-9 11 10,3 CTX-M-3+CTX-9+SHV+TEM 9 8,4 Tỷ lệ các chủng đồng thời mang nhiều gen mã hóa kháng C3G là rất cao 85%, chủng đồng thời mang gen CTX-M-3 và CTX-M-9 là 10,3%, chủng mang tất cả các gen mã hóa kháng kháng sinh nhóm C3G là 8,4%. Trong số các chủng đồng thời mang nhiều gen mã hóa kháng kháng sinh nhóm C3G có 22,4% chủng mang cả gen mã hóa sự kháng sinh nhóm Quinolon(qnr). Chương 4 BÀN LUẬN 4.1. Đặc điểm phân bố các chủng vi khuẩn gây bệnh trong nhiễm khuẩn hô hấp ở bệnh nhi 0 đến 6 tuổi Tỷ lệ nuôi cấy dương tính chung với các vi khuẩn gây bệnh là 33,1%. Trong đó có 87 mẫu có hai loài chiếm 7,4%. Nhóm NKHHCT 37,4% và NKHHCT kết hợp 28,1 % và cao nhất ở khoa sơ sinh. Tỷ lệ
23. 23 nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính ở các nước, trong nước và nghiên cứu của chúng tôi là rất khác nhau. Sự phân bố của các tác nhân vi khuẩn phân lập được đứng đầu là Klebsiella pneumoniae (22,6%) sau đó là Acinetobacter spp. (19,9%), P. aeruginosa(18,4%). Các căn nguyên thường găp ở cộng đồng không cao S. pneumoniae (5,1%), H. influenzae(5,3%). Klebsiella pneumoniae là cao nhất (24,1%) ở nhóm bệnh NKHHCT và Acinetobacter spp.(29,8%) ở nhóm bệnh NKHHCT kết hợp. Sự phân bố này cũng gần giống các nghiên cứu trong và ngoài nước. Tỷ lệ phân bố các chủng K. pnemoniae phân lập được từ các nghiên cứu của các nước cho thấy tỷ lệ phân lập Klebsiella spp. ở bệnh viện là khác nhau tùy từng quốc gia thay đổi từ 10,2 - 32,2%. 4.2. Tính nhạy cảm kháng sinh và khả năng sinh enzym β-lactamase phổ rộng (ESBLs) của chủng Klebsiella pneumoniae 4.2.1. Tỷ lệ phân bố các chủng K. pnemoniae sinh enzym β-lactamase phổ rộng (ESBLs) phân lập được. Trên thế giới tỷ lệ sinh ESBLs của các chủng K. pnemoniae là rất khác nhau theo các vùng địa lý từ 4,9 - 77,7%. Tại Việt Nam, tỉ lệ này cũng rất khác nhau ở các bệnh viện: Bệnh viện Chợ Rẫy 61%, Bệnh viện Việt Đức 39,3%, Bệnh viện Nhi Trung ương 22,97%. Như vậy phần lớn kết quả trong nghiên cứu này tương đối phù hợp với các nghiên cứu trong và ngoài nước, khoa Hồi Sức Ngoại tỷ lệ này cao 71,8% giống nghiên cứu các tác giả nước ngoài. 4.2.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng K. pnemoniae Nghiên cứu của các nước cho thấy K. pneumoniae kháng với Cefepim (PEP) 62%, Ceftazidime (CAZ)18,4 - 99%, Tazocin (TZP) 78%, Amikacin (AK) 83%, Ciprofloxacine (CIP) 53% và Imipenem (IPM) 11%, Co- trimoxazon 64%, Gentamicin 61%. Trong nghiên cứu của chúng tôi nhận thấy tỷ lệ kháng với Ampicillin (99,2%), với Cephalosporin thế hệ 2, 3 và 4 từ 86,8 đến 93,8% là cao hơn so với kết quả nghiên cứu của các tác giả trong nước và một số nước 40,4 đến 51,2% các chủng Klebsiella spp 75,25 đến 87,29%, cao hơn nhiều so với nghiên cứu vi khuẩn từ dịch hút phế quản của Ngô Thị Thi và cộng sự 40,4 đến 51,2%. K. pneumoniae trong nghiên cứu của chúng tôi kháng với Co- trimoxazon, Gentamicin, Amikacin và Tobramycin cao gần như nghiên cứu trước tại Bệnh nhi Trung ương của tác giả Ngô Thị Thi 79,5%, 70%, 30,2% và 79,5%. Trần Thị Ngọc Anh năm 2007, nghiên cứu sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại bệnh viện Nhi đồng 2 năm 2007 cho thấy vi khuẩn Klebsiella pneumoniae kháng đa kháng sinh ở mức cao các
24. 24 Trimethoprim/sulfamethoxazol (74%), Cefuroxime(71,2%), Cefotaxime (65,3%), Gentamycine (63,6%), Ceftazidime (53,1%), Netilmycine (43,52%), Amikacin (42,9%). Tình trạng kháng kháng sinh trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn rất nhiều. Hầu hết các chủng trong nghiên cứu của chúng tôi kháng với Ampicilline, còn nhạy cảm với Imipenem và Ciprofloxacin phù hợp với nghiên cứu trước đây. Tỷ lệ kháng với nhiều loại kháng sinh cao. Kháng với 9 đến 12 kháng sinh chiếm đa số trong các chủng K. pnemoniae phân lập được (75%) nói chung. 4.2.3. Mức độ kháng kháng sinh xác định bằng kỹ thuật định lượng MIC Kết quả nghiên cứu của các tác giả nước ngoài đã thực hiện trên các chủng K. pneumoniae có ESBLs (+) có điểm gãy MIC ở nồng độ rất cao. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC50 và MIC90 , của chúng tôi đã khẳng định mức độ kháng kháng sinh nhóm β-lactam của các chủng K. pneumoniae trong nghiên cứu là rất cao, do chúng có enzym ESBL (+). 4.3. Tỷ lệ chủng K. peumoniae mang gen mã hóa sự kháng kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 (C3G) nằm trên plasmid Sự phát hiện các gen mã hóa enzym ESBLs luôn được nghiên cứu ở nhiều quốc gia trên các châu lục. Tác giả Caio Fernando de Oliveira và cộng sự nghiên cứu trên K.pneumoniae phân lập từ bệnh viện ở bang Rio Grande do Sul- Brazil thấy TEM (89,1%), SHV (79,7%), CTX (50%). Tác giả ở Tehran nghiên cứu trên các chủng K.pneumoniae phân lập từ bệnh nhân (2007) với TEM: 32,8%; SHV: 69,6%; nghiên cứu của các tác giả Pháp năm 2009 tỷ lệ mang gen kháng C3G của K. pneumoniae có tỷ lệ TEM (89,1%) cao hơn; Nhưng SHV (79,7%) và CTX-M (25%) thấp hơn nghiên cứu của chúng tôi. Đây là một sự báo động về thực trạng kháng thuốc và sử dụng kháng sinh của chúng ta Ở Việt nam, nghiên cứu của Cao Thị Bảo Vân và cộng sự cho thấy: tỷ lệ mang gen mã hóa sinh β-lactamase của các chủng thuộc họ Enterobacteriacea phân lập năm 2002 là CTX-M chiếm 25,5%, SHV chiếm 38,1%, TEM chiếm 76,3%. Như vậy, nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ mang gen mã hóa sự kháng C3G ở chủng K. pneumoniae đã tăng rất cao, đặc biệt là tỷ lệ mang gen CTX-M chiếm 92,5%), SHV chiếm 88,8% và TEM chiếm 80,4%. 4.4. Tỷ lệ chủng K. peumoniae mang gen mã hóa sự kháng kháng sinh quinolon (qnr) Tỷ lệ các gen kháng Quinolon trong nghiên cứu nàycủa chúng tôi tương đương một số nghiên cứu của một số nước: các tác giả Hyunjoo Pai và cộng sự tỷ lệ qnrB phân lập được là 40,5%, qnrA 3,8%; Myeong Hee Kim
25. 25 và cộng sự ở Hàn Quốc nghiên cứu trên các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập từ bệnh viện thấy tổng số các chủng có mang gen qnr là 40,5%. Trong đó qnr B chiếm 85,7%, qnrS 14,3% và Đài Loan, Trung Quốc từ 2,4 đến 40,5%. Với tỷ lệ 38,3% mang gen kháng qnr trong số chủng mang gen kháng C3G cũng nằm trong tỷ lệ cao so với nghiên cứu của các nước. 4.5. Xác định chủng K. peumoniae mang đồng thời gen mã hóa sự kháng kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 (C3G) và quinolon (qnr) Nghiên cứu của chúng tôi này thấy một chủng vi khuẩn mang đồng thời rất nhiều gen mã hóa sự kháng kháng sinh nhóm C3G chiếm tới 85%, điều đó đồng nghĩa với việc rất nhiều gen mã hóa sự kháng thuốc được truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác nhanh chóng trong một thời gian ngắn và rất khó kiểm soát, ngoài ra còn có tỷ lệ không nhỏ mang đồng thời cả gen mã hóa sự kháng Quinonol, chiếm tỷ lệ 22,4%. 4.6. Xác định chủng K. peumoniae mang gen mã hóa sự kháng kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 (C3G) và quinolon (qnr) nằm trên plasmid: Trong nghiên cứu của chúng tôi, kỹ thuật PCR và kỹ thuật Southern Blot đã sử dụng là hai kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy cảm và độ đặc hiệu cao một lần nữa khẳng định các gen nằm trên plasmid. KẾT LUẬN 1. Với 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp của bệnh nhi 0 đến 6 tuổi ở các khoa HSCC, Sơ sinh, HSN và khoa Hô hấp có 1.181 mẫu dương tính. Tỉ lệ nuôi cấy dương tính là 33,1%. Trong đó có 7,4% mẫu có 2 loài. Trực khuẩn gram âm chiếm đa số tỷ lệ các chủng vi khuẩn phân lập được nói chung. Trong các loài vi khuẩn phân lập được, K.pneumoniae chiếm hàng đầu 22,61%, theo sau là Acinetobacter spp 19,9% và p.aeruginosa là 18,37%. 2. Từ 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp của bệnh nhi 0 đến 6 được chia thành hai nhóm NKHHCT (1.909) và NKHHCT kết hợp (1.658). - Tỷ lệ nuôi cấy dương tính NKHHCT là 37,4%; Trực khuẩn gram âm chiếm đa số, trong đó K.pneumoniae chiếm hàng đầu 24,1%, theo sau là P.aeruginosa là 17,4%. Tỷ lệ phân lập được chủng K. pneumoniae ở khoa Sơ sinh là cao nhất chiếm 13,0%, tiếp đến khoa Hô hấp 8,7% và thấp nhất là khoa Hồi sức cấp cứu 4,2% - Tỷ lệ nuôi cấy dương tính NKHHCT kết hợp là 28,1%; Trực khuẩn gram âm chiếm đa số trong đó Acinetobacter. spp chiếm hàng đầu
26. 26 29,8%, theo sau là K.pneumoniae 20,3%. Tỷ lệ K.pneumoniae phân lập được cao nhất ở khoa Sơ sinh, sau đó là khoa HSCC và HSN. - Cầu trùng Gram dương phân lập được ở nhóm NKHHCT cao hơn nhóm NKHHCT kết hợp . 3. Các chủng Klebsiella kháng cao với kháng sinh nhóm cephacosporin thế hệ 2, 3, 4 từ 86,8% đến 95%. Các chủng K.pneumoniae kháng hầu hết kháng sinh cefuroxime: 93,8%, cephalothin 95,1% và ampicilin 99,2%- 100%, các kháng sinh nhóm aminoglycoside kháng cao với tỷ lệ 65,8% đến 79,4%. Còn nhạy đối với imipenem và ciprofloxcin. Tỷ lệ đa kháng cao, có nhiều kiểu đề kháng, chủ yếu là kiểu đề kháng 9 đến 12 loại kháng sinh(75%). Xuất hiện chủng kháng với tất cả các kháng sinh thử nghiệm. Tỷ lệ K. pneumoniae kháng ≥9 kháng sinh ở bệnh nhi tử vong chiếm tỷ lệ cao hơn ở những chủng K. pneumoniae kháng < 9 kháng sinh, tỷ lệ K. pneumoniae kháng ≥9 kháng sinh ở bệnh nhi tử vong ở nhóm NKHHCT kết hợp cao hơn hẳn nhóm NKHHCT. - Tỷ lệ sinh ESBL ở các chủng K.pneumoniae phân lập được là 56,9%, cao nhất ở khoa Hồi sức ngoại 71,8% và có sự khác biệt giữa các khoa. - MIC có điểm gẫy ở nồng độ cao, lớn hơn chuẩn đề kháng kháng sinh MIC . Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC50 và MIC90 của chúng tôi đã khẳng định mức độ kháng kháng sinh nhóm β-lactam của các chủng K. pneumoniae trong nghiên cứu là rất cao. 4. Tỷ lệ mang gen kháng C3G và qinolon trong nghiên cứu cho thấy: - Tỷ lệ mang gen kháng C3G cao: CTXM- 3; 30,8%; CTXM-9: 73,8%; SHV: 88,8%; TEM: 80,4%. Tổng họ CTXM: 92,5%, tỷ lệ chủng mang đồng thời gen CTX-M-3 và CTX-M-9 trong nghiên cứu 10,3%. Tỷ lệ đồng thời mang tất cả các gen kháng C3G là 85%. - Tỷ lệ mang gen kháng qnr là 38,3%. Trong đó qnrA: 2,4%; qnrB: 17% và chủ yếu là qnrS: 80,6%. - Tỷ lệ đồng thời mang gen kháng C3G và qnr trong nghiên cứu là 22,4% .
27. 27 CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 1. Bùi Thị Mùi, Lê Thị Ánh Hồng,Nguyễn Thanh Liêm( 2011), "Tỷ lệ sinh men beta - lactamases phổ rộng và tính nhạy cảm kháng sinh của Klebsiella pneumoniae gây nhiễm khuẩn đường hô hấp trẻ em từ sơ sinh đến 6 tuổi ở Bệnh viện Nhi Trung ương, 2009 - 2010”, Tạp chí Y học Dự phòng, XXI, tr. 83 - 89. 2. Bùi Thị Mùi, Lê Thị Ánh Hồng,Nguyễn Thanh Liêm( 2011), "Tỷ lệ mang một số gen kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon trên plasmid của Klebsiella pneumoniae gây nhiễm khuẩn đường hô hấp tại Bệnh viện Nhi Trung ương, 2009 - 2010”, Tạp chí Y học Dự phòng, XXI, tr. 201 - 209.