Luận văn Nghiên cứu quy trình tạo hạt và các điều kiện tối ưu nhằm tăng cường khả năng kháng khuẩn của Nano Chitosan

Nội dung text: Luận văn Nghiên cứu quy trình tạo hạt và các điều kiện tối ưu nhằm tăng cường khả năng kháng khuẩn của Nano Chitosan

1. i B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN  LI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là đ tài nghiên cu ca tơi. Các kt qu nghiên cu trong lun văn là trung thc và chưa đưc ai cơng b trong bt kì cơng trình nào khác. Mi s giúpTƯNG đ và các NGC thơng tin THC trích dn UYÊN đã đưc nêu rõ ngun gc. Ngưi thc hin NGHIÊN CU QUY TRÌNH TO HT VÀ CÁC ĐIU KIN TI ƯU NHM TĂNG CƯNG KH NĂNG KHÁNG KHUN CA NANO CHITOSAN Tưởng Ngọc Thục Uyên LUN VĂN THC SĨ SINH HC BUƠN MA THUT, NĂM 2010
2. ii LI CM ƠN Đ hồn thành tt lun văn này, tơi xin t lịng bit ơn sâu sc ti: PGS.TS Nguyn Anh Dũng, ngưi hưng dn khoa hc trc tip, đã tn tình hưng dn phương pháp nghiên cu và đĩng gĩp nhiu ý kin quý báu, giúp đ tơi trong sut quá trình hc tp, nghiên cu và hồn thành lun văn. Lãnh đo Trưng Đi hc Tây Nguyên, tp th các Thy Cơ giáo Phịng Sau đi hc, Khoa Khoa hc t nhiên Cơng ngh, Khoa Nơng Lâm nghip. Các Thy Cơ giáo đã tn tâm ging dy, truyn th nhng kin thc quý báu trong quá trình hc tp. Ban Giám hiu Trưng THPT chuyên Nguyn Du. Các bn bè, đng nghip và ngưi thân đã giúp đ, đng viên tơi trong quá trình hc tp và nghiên cu. Trân trng cm ơn. Ngưi thc hin Tưng Ngc Thc Uyên
3. iii MC LC Trang LI CAM ĐOAN i LI CM ƠN ii MC LC iii DANH MC CÁC KÍ HIU VÀ CH VIT TT v DANH MC CÁC BNG vi DANH MC CÁC Đ TH viii DANH MC CÁC HÌNH x PHN 1: M ĐU 1 1.1.Tính cp thit 1 1.2. Mc tiêu đ tài 2 1.3.Ý nghĩa khoa hc 3 1.4.Ý nghĩa thc tin 3 1.5.Gii hn đ tài 3 PHN 2: TNG QUAN NGHIÊN CU 4 2.1. Tng quan v chitosan . 4 2.2. Tng quan v nano chitosan 6 2.2.1. Các phương pháp to vt liu nano chitosan 6 2.3. ng dng ca chitin, chitosan và các dn sut trong y hc 14 2.3.1.Hot tính kháng ung thư 16 2.3.2.Gim cholesterol trong máu (hypocholesterolemic activity) 17 2.3.3.Đc tính chng oxi hĩa 17 2.3.4.Màng ph làm lành vt thương (would healing) 18 2.3.5.S dng trong cy ghép răng 19 2.3.6. ng dng trong ly gii chm thuc 19 2.3.7. Hot tính kháng khun 21
4. iv 2.3.8. Hot tính chng đơng máu ca dn xut sulfated chitosan 27 2.3.9.ng dng làm tá cht cho vaccin 28 2.4. Tng quan v Escherichia coli và Staphylococcus aureus 31 2.4.1 Vi khun Escherichia coli 31 2.4.2. Vi khun Staphylococcus aureus 36 PHN 3: NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 40 3.1. Ni dung nghiên cu 40 3.1.1. Nghiên cu qui trình to ht nano chitosan 40 3.1.2. Nghiên cu th nghim kh năng kháng khun ca ht nano chitosan 40 3.2. Phương pháp nghiên cu 40 3.2.1. Hĩa cht 40 3.2.2. Đa đim nghiên cu 41 3.2.3. Thi gian thc hin 41 3.2.4. Phương pháp nghiên cu qui trình to ht nano chitosan 41 3.2.5. Nghiên cu th nghim kh năng kháng khun ca ht nano Chitosan 43 PHN 4: KT QU VÀ THO LUN 50 4.1. Nghiên cu qui trình to ht nano chitosan 50 4.1.1. Nghiên cu nh hưng ca khi lưng phân t đn kích thưc ht, đin tích và tính n đnh ht nano chitosan 50 4.1.2 Nghiên cu nh hưng ca t l CS:TPP (w/w) đn kích thưc và đin th ht nano chitosan 56 4.2. Nghiên cu th nghim kh năng kháng khun ca ht nano chitosan .62 4 2.1.Nghiên cu nh hưng ca nng đ chitosan đn kh năng kháng khun 62 4.2.2. Nghiên cu nh hưng ca nng đ nano chitosan đn kh
5. v năng kháng khun 64 4.2.3.Nghiên cu nh hưng ca khi lưng phân t chitosan đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan 69 4.2.4.Nghiên cu nh hưng ca t l CS: TPP ( 4:1; 5:1; 6:1) đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan 73 4.2.5. Nghiên cu nh hưng ca pH mơi trưng đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan 76 PHN 5: KT LUN VÀ KIN NGH 79 5.1. Kt lun 79 5.2 Kin ngh 79
6. vi DANH MC CÁC KÍ HIU , CÁC CH VIT TT S th t Ch cit tt Nghĩa ca các ch vit tt 1 HPLC Sc kí lng cao áp 2 MIC Nng đ c ch ti thiu 3 DNA Deoxyribo nucleic acid 4 pDNA Plasmide deoxyribo nucleic acid 5 DEMC Diethylmethylchitosan 6 TPP Tri polyphosphate 7 PMAA Polymethacrylic axit 8 CS Chitosan 9 CMC Cacboxymethyl cellulose 10 CNP Chitosan nanoparticles 11 TEM Kính hin vi đin t truyn quang 12 SEM Kính hin vi đin t quyét 13 kDa Kilo Dalton 14 E.coli Escherichia coli 15 S.aureus Staphylococcus aureus 16 LMWC Khi lưng phân t thp
7. vii DANH MC CÁC BNG STT Tên bng Trang 2.1. nh hưng ca nng đ chitosan đn kích thưc, đin th và kh năng hp ph BSA 8 2.2. Tính cht vt lý ca chitosan oligomer/CMC nanoparticles hp ph vi pDNA 11 2.3. Các tính cht cơ bn ca chitosan liên quan đn ng dng trong sinh y hc 15 2.4. Ch s MIC (g/ml) và MBC (g/ml) ca chitosan và DEMC 24 2.5. Ch s MIC ca mt s dn sut chitosan trên mt s vi khun 25 2.6. Ch s MIC (g/ml) và MBC (g/ml) ca kháng sinh Doxycycline và Chitosan nanoparticles 27 4.1. nh hưng ca khi lưng phân t ca chitosan đn tính cht ht nano chitosan 50 4.2. nh hưng ca t l Chitosan: TPP đn tính cht ht nano chitosan (Chitosan 30kDa) 56 4.3. nh hưng ca nng đ đn kh năng kháng khun ca chitosan trên vi khun Escherichia coli và Staphylococcus aureus 62 4.4. Kh năng kháng khun ca nano chitosan (CS:TPP = 6:1) và chitosan trên vi khun Escherichia coli 65 4.5. Kh năng kháng khun ca nano chitosan (CS:TPP = 6:1) và chitosan trên vi khun Staphylococcus aureus 67 4.6. nh hưng ca khi lưng phân t đn kh năng
8. viii kháng khun ca nano chitosan trên vi khun Escherichia coli 70 4.7. nh hưng ca khi lưng phân t đn kh năng kháng khun ca nano chitosan trên vi khun Staphylococcus aureus 72 4.8. nh hưng ca t l CS:TPP đn kh năng kháng khun ca nano chitosan trên vi khun Escherichia coli 74 4.9. nh hưng ca t l CS:TPP đn kh năng kháng khun ca nano chitosan trên vi khun Staphylococcus aureus 75 4.10. nh hưng ca pH mơi trưng đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan trên vi khun Escherichia coli 76 4.11. nh hưng ca pH mơi trưng đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan trên vi khun Staphylococcus aureus 77
9. ix DANH MC CÁC Đ TH STT Tên đ th Trang 4.1. Phân b kích thưc ht ca dung dch nano chitosan vi trng lưng phân t 20 kDa 53 4.2. Phân b kích thưc ht ca dung dch nano chitosan vi trng lưng phân t 30 kDa 54 4.3. Phân b kích thưc ht ca dung dch nano chitosan vi trng lưng phân t 300 kDa 55 4.4. Phân b kích thưc ht ca dung dch nano chitosan vi t l CS:TPP là 3:1 57 4.5. Phân b kích thưc ht ca dung dch nano chitosan vi t l CS:TPP là 4:1 58 4.6. Phân b kích thưc ht ca dung dch nano chitosan vi t l CS:TPP là 5:1 59 4.7. Phân b kích thưc ht ca dung dch nano chitosan vi t l CS:TPP là 6:1 60 4.8. Phân b kích thưc ht nano chitosan vi t l CS:TPP là 7:1 61 4.9. Kh năng kháng khun ca chitosan trên vi khun Escherichia coli và Staphylococcus aureus 63 4.10. Kh năng kháng khun ca nano chitosan và chitosan trên vi khun Escherichia coli 66 4.11. Kh năng kháng khun ca nano chitosan và chitosan trên vi khun Staphylococcus aureus 67 4.12. nh hưng ca khi lưng phân t đn kh năng kháng khun ca nano chitosan trên vi khun Escherichia coli 70 4.13. nh hưng ca khi lưng phân t đn kh năng kháng
10. x khun ca nano chitosan trên vi khun Staphylococcus aureus 73 4.14. nh hưng ca t l CS : TPP đn kh năng kháng khun ca nano chitosan trên vi khun Escherichia coli 74 4.15. nh hưng ca t l CS : TPP đn kh năng kháng khun ca nano chitosan trên vi khun Staphylococcus aureus 75 4.16. nh hưng ca pH mơi trưng đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan trên vi khun Escherichia coli 77 4.17. nh hưng ca pH mơi trưng đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan trên vi khun Staphylococcus aureus 78
11. xi DANH MC CÁC HÌNH STT Tên hình nh Trang 2.1. Sơ đ phương pháp to ht nanochitosan 7 2.2. Cơ ch to ht chitosan nanoparticles vi axit methacrylic 9 2.3. TEM ca ht nanoparticles CSPMAA 10 2.4. Sơ đ to git bng phương pháp kt ta 12 2.5. Sơ đ to git bng phương pháp sy phun 13 2.6. Sơ đ to ht bng phương pháp mixel ngưc pha 14 2.7. nh hưng ca chitosan và chitosan oligomer (COS) đn t bào E.coli (Eaton,2008) 22 2.8. Cơ ch xâm nhp qua màng ca chitosan mang vaccin cĩ kích thưc nm khác nhau 29 2.9. nh hưng ca các loi adjuvant lên đáp ng min dch ca chut vi vaccin cúm H5N1 30 2.10. nh hưng ca chitosan và các tá cht khác đn đáp ng min dch ca chut vi vaccin H5N1 và hiu giá kháng th (HIU) 31 4.1. nh TEM ht nano chitosan khi tng hp vi trng lưng phân t là 20 kDa 53 4.2. nh TEM ht nano chitosan khi tng hp vi trng lưng phân t là 30 kDa 54 4.3. nh TEM ht nano chitosan khi tng hp vi trng lưng phân t là 300 kDa 55 4.4. nh TEM ht nano chitosan khi tng hp vi t l CS: TPP là 3:1 57 4.5. nh TEM ht nano chitosan khi tng hp vi t l CS: TPP là 4:1 58
12. xii 4.6. nh TEM ht nano chitosan khi tng hp vi t l CS: TPP là 5:1 59 4.7. nh TEM ht nano chitosan khi tng hp vi t l CS: TPP làà 6:1 60 4.8. nh TEM ht nano chitosan khi tng hp vi t l CS: TPP là 7:1 61
13. xiii B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN  TƯNG NGC THC UYÊN NGHIÊN CU QUY TRÌNH TO HT VÀ CÁC ĐIU KIN TI ƯU NHM TĂNG CƯNG KH NĂNG KHÁNG KHUN CA NANO CHITOSAN LUN VĂN THC SĨ SINH HC BUƠN MA THUT, NĂM 2010
14. 1 PHN 1. M ĐU 1.1.Tính cp thit Khoa hc và cơng ngh nano là mt lĩnh vc mi trong nhng năm gn đây nhưng đã và đang phát trin nhanh chĩng vì s hiu qu và nhng ng dng rng rãi ca nĩ trong nhiu ngành như sinh y hc, đin t, vt lí, hĩa hc. Vt liu nano vi kích thưc nanomet siêu nh đã th hin nhiu tính cht mi l do hiu ng kích thưc. Hin nay nhiu nưc trên th gii đang xem cơng ngh nano là mc tiêu mũi nhn đ đu tư phát trin. Vit Nam là nưc đang phát trin, v sinh an tồn thc phm mc rt thp và chu s chi phi ca nhiu yu t như: mơi trưng ơ nhim dn đn ơ nhim vào nơng sn và vt nuơi, quy trình sn xut và ch bin thc phm cịn nh l, khơng đáp ng điu kin v sinh an tồn thc phm, h tc lc hu trong ăn ung hoc vì li nhun mà s dng ph gia, bo qun ngồi danh mc b y t, kim sốt thc phm qua biên gii và trên th trưng chưa cht ch đang giĩng lên hi chuơng báo đng hơn bao gi ht. Các thuc kích thích vt nuơi, dư lưng thuc bo v thc vt, melanin trong sa và nưc mm, 3MCPD trong nưc tương, urea, chlor, cloramphenicol, dipterex trong thy hi sn , đc bit thc ăn và nưc ung nhim khun đã gây ra nhiu v ng đc tp th, nguy hi cho sc khe ca con ngưi. Khái nim thc phm sch Vit Nam vn là xa x đi vi ngưi dân, nht là dân nghèo. Đ chng li s nhim khun, hin nay vic s dng cht kháng sinh là gii pháp ph bin đ đy lùi các bnh dch do vi khun gây ra. Tuy nhiên vic s dng thuc kháng sinh cũng cĩ nhng mt trái là: do cht kháng sinh tính chn lc thp nên d dn đn hin tưng các vi khun cĩ li cũng b tiêu dit, gây ra trng thái mt cân bng khu h vi sinh vt, đc bit vic s dng rng rãi các loi thuc kháng sinh d dn đn nguy cơ kháng thuc ca vi
15. 2 khun và xa hơn na là gia tăng tính nguy him ca các triu chng lâm sàng to bi các lồi vi khun. Chính vì vy, yêu cu cp thit đc ra hin nay là phi tìm mt cht cĩ kh năng c ch sinh trưng ca vi khun mà khơng gây ra hin tưng nhn thuc, khơng phá v trng thái cân bng khu h vi sinh vt, khơng tác dng ph, khơng đc hi, khơng gây ơ nhim mơi trưng. Chitosan là mt polisaccharide t nhiên, là dn xut t quá trình kh acetyl ca chitin. Chitin là thành phn cu trúc chính v tơm, cua, là mt polimer sinh hc cĩ nhiu trong t nhiên, đc bit Vit Nam cĩ b bin dài, nhiu sơng sui. Chitosan khơng đc, cĩ kh năng t phân hy sinh hc cao, là cht ăn đưc. Chitosan mang đin tích dương, cĩ ái lc cao vi các axit mang đin tích âm, tương tác vi các thành phn polianion ca vách t bào vi sinh vt, kt hp DNA, gn kt gây đơng t, kt ta t bào vi khun. Do đĩ, chitosan cĩ tính kháng khun, kháng nm rng, làm con ngưi tr lâu, hot hĩa t bào cơ th, gia tăng kh năng min dch, gii đc , bo v gan trong cơ th. Đc bit ht nano chitosan cĩ kích thưc nano, cĩ nhiu ưu đim như din tích tip xúc và đin tích dương ln hơn chitosan, do đĩ cĩ tim năng tăng cưng hot tính sinh hc, trong đĩ cĩ hot tính kháng khun. Vì vy, vic nghiên cu to ht nano nhm tăng cưng tính kháng khun ca chitosan ng dng trong bo qun thc phm là vn đ cp thit hin nay. Vit Nam, Nguyn Anh Dũng đã s dng ch phm chitosan đ c ch sinh trưng ca vi khun Escherichia coli , nghiên cu to ht nano chitosan làm tá cht min dch cho vaccin cúm A H5N1 và xây dng mơ hình th nghim trên đng vt. Xut phát t đĩ tơi đã chn đ tài: “Nghiên cu qui trình to ht và các điu kin ti ưu nhm tăng cưng kh năng kháng khun ca nano chitosan” 1.2. Mc tiêu đ tài 1.2.1. Xây dng quy trình to ht nano chitosan bng tripolyphosphate (TPP).
16. 3 1.2.2. Xác đnh các điu kin ti ưu đ nâng cao hiu qu kháng khun ca ht nano chitosan. 1.3.Ý nghĩa khoa hc To ht nano chitosan nhm tăng cưng hot tính kháng khun là hồn tồn mi ti Vit Nam. 1.4.Ý nghĩa thc tin Thành cơng ca đ tài s đy nhanh vic s dng vt liu nano chitosan trong bo qun, phịng chng nhim khun thc phm Vit Nam. Đây là vt liu an tồn cho sc khe con ngưi và ph bin, giá thành h phù hp vi điu kin kinh t ca nhân dân. 1.5.Gii hn đ tài Do thi gian cĩ hn, thit b, hĩa cht hn ch nên tơi ch tin hành nghiên cu quy trình to ht nano chitosan, bưc đu th nghim trên hai loi vi khun Escherichia coli và Staphylococcus aureus.
17. 4 PHN 2. TNG QUAN NGHIÊN CU 2.1. Tng quan v chitosan Chitin là thành phn cu trúc nên v cơn trùng, tơm, cua, vách t bào nm. Chitin cĩ cu to tương t như cellulose, nhưng cĩ khác bit là đơn v cu to nên chitin là NacetylDglucosamine, các đơn v này ni vi nhau bng liên kt β1,4glycoside. Cơng thc cu to ca chitin và chitosan Tính cht, hot tính sinh hc ca chitin, chitosan ph thuc rt nhiu vào khi lưng phân t (Mw) và mc đ deacetyl hĩa (DD: degree of deacetylation). Mc đ deacetyl hĩa dùng đ ch % s nhĩm acetyl trong phân t chitin, chitosan b kh. Mc đ deacetyl hĩa t l thun vi mt đ ca nhĩm + NH 3 trong phân t do đĩ nh hưng đn tính cht đa đin phân và đ tan ca chitin, chitosan. Chitin cĩ mc đ deacetyl hĩa trung bình nm trong khong 1015%. Cĩ sn phm chitin deacetyl hĩa mt phn (partially deacetyl chitin) cĩ mc đ deacetyl hĩa t 3040%. Trong khi đĩ chitosan phi cĩ mc đ deacetyl hĩa > 50%, vi mc đ deacetyl hĩa này chitosan mi d tan trong
18. 5 mt s acid hu cơ lỗng như acetic, lactic. Mc đ deacetyl hĩa đưc xác đnh bng nhiu phương pháp khác nhau như: IR spectrophotometry, sc ký lc gel, UV spectrophotometry, 1H NMR, 13 C NMR, phương pháp chun đ và HPLC theo Kumar (2000) [21]. Khi lưng phân t ca chitin, chitosan cĩ th xác đnh bng HPLC. Tuy nhiên phương pháp đơn gin nht, nhanh là đo đ nht, da vào các hng s α và K trong phương trình Mark – Houwink: [η] = K.M α = 1.81 x 10 3 M0.93 . Trong đĩ: η là đ nht biu kin ca chitin (intrisic viscosity) ; M: là khi lưng phân t. Khi lưng phân t trung bình ca chitin bin đng t 1.0 – 2.5 x10 6, khi lưng phân t ca chitin s gim xung khi mc đ deacetyl hĩa tăng lên. Chitosan cĩ ng dng rt rng rãi trong các ngành cơng, nơng nghip, y dưc, thc phm nh vào nhng đc tính sau (Rinaudo, 2006) Tính cht đa đin ly mang đin tích dương (cationic polyelectrolyte) cho phép gn kt vi các thành phn sinh hc mang đin tích âm. Cĩ th tái sinh theo các con đưng sinh hc trên trái đt. Cĩ kh năng phân hy sinh hc bng enzyme trong cơ th. Cĩ kh năng tương hp sinh hc vi các cơ quan, mơ và t bào đng thc vt. Cĩ kh năng kích thích quá trình làm lành vt thương và đơng máu. Cĩ kh năng tương tác chuyên bit vi các receptor trên màng Gim chlolesterol do liên kt cĩ chn lc vi các acid béo
19. 6 Khơng gây đc do các sn phm sau thy phân đu là các cht chuyn hố t nhiên. Khơng gây đáp ng min dch trong mơ và cơ quan đng vt. Cĩ tác dng h tr trong điu hịa min dch. Cĩ th s dng dưi nhiu dng sn phm như dng ming, bt mn, ht, màng, tm xp (scaffolds), bơng, si và gel [43]. 2.2. Tng quan v nano chitosan 2.2.1. Các phương pháp to vt liu nano chitosan Chitosan nanoparticles là các ht chitosan cĩ kích thưc nanomet. Chitosan nanoparticles do cĩ kích thưc siêu nh nên d dàng đi qua màng t bào, din tích và đin tích b mt cc ln nên đưc ng dng nhiu trong sinh y hc mang thuc, vaccine, trong cơng ngh sinh hc làm vector chuyn gen. Hin nay cĩ nhiu phương pháp to nano chitosan. Theo Sulnin (2004) 5 phương pháp ch yu đ to ht nano chitosan là: Phương pháp khâu mch nhũ tương (emulsion cross linking), phương pháp to git (coacervation) trong NaOHmethanol, phương pháp sy phun (dry spraying), phương pháp to gel ionic (ionic gel) trong tripolyphosphate (TPP) và phương pháp rây (sieving method). Trong đĩ ph bin nht là phương pháp to ht gel trong tripolyphosphate[43]. 2.2.1.1. Phương pháp to chitosan nanoparticles bng liên kt cng hĩa tr Ohya đã nghiên cu to nano chitosan đ nht thuc chng ung thư 5 FU bng cách cho dung dch chitosan khâu mch cng hĩa tr vi glutaraldehyde. Nhĩm kép CHO ca glutaraldehyde s phn ng vi nhĩm – NH 2 ca chitosan đ khâu mch (crosslinking) to nano chitosan. Phương pháp này cĩ ưu đim là kích thưc và tính cht ht nano chitosan rt n đnh [11].
20. 7 2. 2.2.1.Phương pháp to gel ion Phương pháp này da trên kh năng to gel ion gia chitosan đin tích dương và TPP, polyacrylic acid, polyaspartic acid, plasmid DNA (pDNA) mang đin tích âm. Đ to nano chitosan –TPP: Dung dch chitosan đưc hn hp vi dung dch TPP và hn hp đưc khuy t trong 1060 phút s thu đưc nano chitosan. Cĩ th ly tâm 15.000 vịng /phút trong 1 gi đ thu đưc ht nano chitosan. Hình 2.1. Sơ đ phương pháp to ht nano chitosan Quan Gan (2005) nghiên cu to ht nanon chitosan trong TPP vi nng đ chitosan khác nhau, khi lưng phân t chitosan khác nhau và t l chitosan/TPP khác nhau. Kt qu cho thy khi lưng phân t và nng đ chitosan càng ln thì kích thưc ht nano chitosan càng ln [41]. Theo Quan Gan thì t l chitosan/TPP càng ln thì kích thưc ht nano chitosan càng ln. pH cũng cĩ nh hưng nht đnh đn kích thưc ht nano chitosan, pH thích hp nht đ to ht nano chitosan là 5.5.
21. 8 Quan Gan (2007) nghiên cu to nano chitosan làm cht mang protein, thuc bng phương pháp to ht nano trong TPP. Kích thưc ht nano chitosan cũng như đin tích ca ht nano chitosan ph thuc vào nng đ và khi lưng phân t ca chitosan. Nng đ càng thp thí kích thưc ht càng nh và đin tích càng dương ln[42]. Bng 2.1. nh hưng ca nng đ chitosan đn kích thưc, đin th và kh năng hp ph BSA Kích thưc ht Đin th (nm) (mV) Nng đ Khơng Phương phương Khơng Phương Phương chitosan cĩ pháp hp pháp cĩ pháp hp pháp (mg/ml) BSA nht vi vi BSA nht vi vi BSA BSA BSA BSA 3,0 222,6 338,4 691,4 + 46,3 + 46,3 + 43,2 2,5 210,5 344,5 623,7 + 47,9 + 48,3 + 46,3 2,0 191,1 292,5 540,5 + 52,0 + 50,6 + 48,8 1,5 182,7 236,1 401,2 + 53,3 + 53,2 + 52,6 1.0 175,6 203,7 136,7 + 55,7 + 54,1 + 53,2 Điu kin chun b ht: Nng đ BSA = 1,0mg/ml, t l chitosan/TPP = 3:1, T=20 ± 1 0C, pH 5,5 Bao (2008) cũng nghiên cu to nano chitosan –TPP. Nng đ chitosan s dng là 0.52 mg/ml. Kích thưc ht nano chitosan nm trong khong 100 300 nm[16].
22. 9 Marcia (2008), nghiên cu to nano chitosan s dng polymethacrylic acid (PMAA) . Cơ ch ca quá trình to ht nano chitosan tương t như vi TPP, theo sơ đ sau: Chitosan nanoparticl Hình 2.2. Cơ ch to ht nano chitosan vi acid methacrylic . CS: Chitosan. PMAA (polymethacrylic acid). Marcia cũng nghiên cu nh hưng ca pH và t l chitosan đn kích thưc ht nano chitosan. Kt qu nhn thy pH trong khong t 36 ít nh hưng đn kích thưc ht nano CSPMAA. Tuy nhiên, khi pH tăng >6 cĩ s gia tăng đt bin kích thưc ht nano CSPMAA. Khác vi phương pháp to ht nano chitosan –TPP, t l CS càng cao thì kích thưc ht càng nh trong khong pH<6 và ngưc li. Kt qu này đưc minh chng rõ ràng bng hình chp TEM ca ht nano CSPMAA. Kích thưc ht nano CSPMAA bin đng t khong 20 nm – 140 nm pH <6 [31].
23. 10 Hình 2.3. TEM ca ht nano CSPMAA; a) CS 0.2%; b) CS 0.5%. Nano chitosan cũng cĩ th thc hin bng cách to phc hp chitosan/pDNA nh kh năng to gel ion gia DNA mang đin tích âm và chitosan mang đin tích dương. Phương pháp này thưng đưc ng dng trong k thut chuyn gen, liu pháp gen. Russell Mumper (2001) đã cơng b s dng chitosan, chitosan oligomer phi hp vi carboxymethyl cellulose (CMC) vi t l khác nhau cĩ hp ph trên b mt pDNA đ to nanoparticles ng dng trong chuyn gen. Các thơng s vt lý ca chitosan oligomer/nano CMC ph pDNA cũng đưc xác đnh (bng 2.2). Yongli Zheng (2007) cũng nghiên cu to nano bng cách to phc hp gia chitosan và polyaspartic da trên nguyên lý to gel ion. Kích thưc ht nano chitosan đt t 85300 nm, s dng đ thi chm 5FU trong điu tr ung thư. Zheng s dng chitosan (45 kDa và 230 kDa) và trimethylchitosan cĩ nng đ 1mg/ml pH=5.6 sau đĩ nh vào dung dch đm phosphate cha 10 microgam pDNA (plasmide DNA). Kích thưc ht nano chitosan nh hơn 200 nm [54].
24. 11 Bng 2.2.Tính cht vt lý ca chitosan oligomer/nano CMC hp ph vi pDNA. T l pDNA Kích thưc Đin tích Hiu sut hp chitosan/CMC (g/ml) nanoparticles (mV) ph DNA (w/w) (nm) (%) 4:1 50 182 ± 3 27 99.5 100 300 ± 9 21 99.9 200 915 ± 171 12 100.0 300 299 ±53 7 96.1 400 178 ± 15 25 99.1 3:1 50 275 ± 11 20 99.9 100 949 ± 155 16 100.0 200 225 ± 31 2 99.9 300 134 ±12 24 85.7 400 162 ± 8 29 99.1 2.2.1.3. Phương pháp to git coasecva (phương pháp kt ta) Phương pháp này s dng tính cht ca chitosan là khơng tan trong dung dch cĩ pH kim tính. Bi vy, chitosan s b kt ta, to git coasecva ngay khi dung dch chitosan tip xúc vi dung dch kim. Dung dch kim cĩ th là NaOH, NaOHmethanol hoc ethandiamine. Dung dch chitosan s đưc mt thit b nén phun vào dung dch kim đ to ht nano chitosan như hình 2.4.
25. 12 Hình 2.4. Sơ đ to git bng phương pháp kt ta Phương pháp này cĩ th đưc ci tin hơn bng cách nh dung dch sodium sulfate vào dung dch chitosan (pH acid) trong điu kin khuy nh và tác đng ca sĩng siêu âm (ultrasonic). Ht nano chitosan thu bng cách ly tâm, sau đĩ tip tc bưc làm cho cng và bn hơn bng cách khâu mch vi glutaraldehyde. 2.2.1.4. Phương pháp sy phun (spraydrying) Sy phun là k thut thưng ng dng trong dưc phm, thc phm đ to bt, to ht thc phm như sa, to bt thuc vi tá dưc. K thut này da trên nguyên tc dung dch huyn phù (suspension) đưc làm khơ khi đưc phun trong dịng khơng khí nĩng. Chitosan đưc hịa tan thành dung dch, dưc phm đưc hịa tan vào dung dch chitosan, sau đĩ b sung hot cht khâu mch (crossliking agent) và đưc phun vào dịng khơng khí nĩng .
26. 13 Hình 2.5. Sơ đ to ht bng phương pháp sy phun 2.2.1.5. Phương pháp to mixel ngưc pha (reverse micella ) Trong phương pháp này, các cht hot đng b mt (surfactant) đưc hĩa tan trong dung mơi hu cơ đ to h mixel ngưc pha. Sau đĩ dung dch chitosan đưc thêm vào và đưc vortex đ tránh b đc. Tip theo, dung dch cht khâu mch đưc thêm vào. Quá trình khâu mch đưc thc hin qua đêm và khuy đu. Sau đĩ cho bay hơi dung mơi hu cơ và cht hot đng b mt cũng đưc kt ta bng mui, cui cùng hn hp đưc ly tâm và thu đưc ht nano chitosan như trong sơ đ 2.5.
27. 14 Hình 2.6. Sơ đ to ht bng phương pháp mixel ngưc pha Ngồi ra nano chitosan cịn cĩ th đưc chun b khi phi hp vi polyethylene glycon (PEG). Hoc ph bên ngồi mt lp alginate đ tăng hiu qu ca nano chitosan mang vaccin viêm gan B qua đưng ung. Kích thưc ht nano chitosan nm trong khong 100 nm. 2.3. ng dng ca chitin, chitosan và các dn sut trong y hc Nh nhng đc tính ưu vit ca chitin, chitosan là sn phm t nhiên, khơng đc, phân hy sinh hc, tương hp sinh hc cùng vi các hot tính sinh hc ca chúng như hot tính kháng nm, kháng khun, kích thích hot đng ca h thng min dch dn đn chitin, chitosan đưc ng dng rng rãi trong y dưc hc. Đã cĩ rt nhiu th nghim đã đưc tin hành đ xác nhn tính an tồn ca chitosan như: th nghim kh năng gây đt bin; kh năng gây đc cp tính, bán cp tính và mãn tính; kh năng gây st, làm tan máu và gây d ng.
28. 15 Bng 2.3. Các tính cht cơ bn ca chitosan liên quan đn ng dng trong sinh y hc (Rinaudo, 2006) [43]. Các ng dng trong sinh y hc Tính cht ca chitosan Ch khâu trong phu thut Tương hp sinh hc, phân hy sinh hc Cy ghép trong nha khoa Tương hp sinh hc, phân hy sinh hc Da nhân to Kích thích tái sinh da mi Tái to xương Kh năng to màng film Kính áp trịng To màng ưa nưc trong sut (hydrogels) Vt liu ly gii chm thuc Khơng đc, tương hp sinh hc Bao nang thuc Kháng khun, kháng nm, phân hy sinh hc S liu ghi nhn trên th, gà mái và gà giị khi đưc cho ăn chitosan vi liu lưng 0,7 0,8g/kg khi lưng cơ th/ngày trong 239 ngày là khơng cĩ triu chng bt thưng nào. Kh năng tiêu hố chitosan th là 28 38% cịn gà mái, gà giị là tiêu hĩa hồn tồn. Khi tiêm chitosan và các phân đon chitosan vào th vi liu lưng 4,5mg/kg khi lưng cơ th/ ngày trong 711 ngày, khơng phát hin đưc biu hin bt thưng nào. Trong nghiên cu kéo dài 12 tun trên ngưi, khơng cĩ triu chng lâm sàng nào đưc ghi nhn nhng ngưi ung chitosan trong so vi nhng ngưi ung thuc gi. Ch cĩ 2,6 – 5,4% đi tưng cĩ triu chng bun nơn và táo bĩn tuy nhiên rt nh và tm thi. Vi tt c các bng chng trên, vic ng dng các thuc tính quý giá ca chitosan trong lĩnh vc y sinh là hồn tồn hp lý.
29. 16 2.3.1.Hot tính kháng ung thư Chitosan oligomer kích thích đi thc bào và cho hot tính chng ung thư và đưc s dng trong cơng thc thc phm chc năng (Jeon, Shahidi, & Kim, 2000),[15]. Chitosan khi lưng phân t thp (LMWC) 20 kDa ngăn cn s tin trin ca bnh tiu đưng và biu hin cu trúc tương t lipopolysaccharid cao hơn chitosan Mw 140 kDa. Tác đng cm máu và hot tính chng ung thư (Malette & Quigley, 1984),[30]. Hot đng sinh lý mnh nht đưc biu hin bi oligosaccharide cĩ đ dài chui ln hơn pentasaccharide. HexaNacetylchitohexaose [(GlcNAc)]6 cĩ nhiu ha hn tăng cưng hot đng ca h thng min dch và hot tính chng ung thư. Ht nano chitosan cũng đang đưc nghiên cu đ chng ung thư hiu qu hơn. Mitra (2001) nghiên cu nht thuc kháng ung thư doxorubicine đ c ch khi u trên chut. Kt qu cho thy nu tiêm doxorubicine đc lp thì khi u chut vn tăng lên 900 mm 3 sau 50 ngày và cht, trong khi đĩ thí nghim ly gii chm doxorubicine trong ht nano chitosan kích thưc khi u gim ch cịn 170 mm 3 và chut vn sng khi 90 ngày thí nghim [33]. L. Qi et al. (2004) nghiên cu hot tính kháng ung thư trc tip ca ht nanochitosan da trên cơ ch polycation gây phá v màng t bào ung thư và hot tính cm ng apoptosis trên hai dịng t bào ung thư là sarcoma S180 và hepatoma H22. Kt qu cho thy hiu qu làm gim khi lưng t bào ung thư vi liu ung 2.5 mg/kg ht nano chitosan trên S 180 và H 22 là 5259% và liu 0.5mg/kg là 4353%, trong khi đĩ chitosan ch là 30% [25]. Kt qu nghiên cu cũng cho thy kích thưc ht nano càng nh thì hiu qu kháng ung thư càng cao. Kích thưc ht nano khong 350 nm. Hiu qu chng ung thư khi s dng ht nano chitosan rt cao trên t bào gây ung thư phi chut A549 đng thi làm gim đc tính ca thuc chng ung thư.
30. 17 2.3.2.Gim cholesterol trong máu (hypocholesterolemic activity) Đã cĩ rt nhiu nghiên cu chng minh kh năng gim cholesterol và m trong máu ca chitosan. Omrod (1998) thí nghim trên mơ hình chut quá dư tha cholesterol trong máu do thiu apolipoprotein E đưc tin hành trong 20 ngày. Mi ngày chut thí nghim đưc ăn 5% chitosan trong khu phn thc ăn cịn lơ đi chng thì khơng đưc cho ăn chitosan. Hàm lưng cholesterol trong máu gim đáng k sau 20 tun, ch cịn 64% so vi lơ đi chng. Ngồi ra, kh năng c ch xơ va đng mch ca chut đưc ăn chitosan đng mch ch là 42% và cung đng mch ch là 50%. Chut đưc ăn chitosan cũng ln nhanh hơn rõ rt [40] .Thí nghim này cũng m ra kh năng c ch s phát trin chng xơ va đng mch trong điu tr bnh cho ngưi quá dư tha hàm lương cholesterol trong máu. Do li ích gim nng đ cholesterol trong huyt tương, đĩng vai trị quan trng trong s gim bt và điu tr các bnh tim mch, chitosan đã tr thành mt thành phn ăn kiêng hu ích. Hot đng gim cholesterol trong máu ca chitosan đưc gii thích là nh vào gim hp th cholesterol và s can thip và hp thu acid mt, mt cơ ch tương t vi ch đ ăn kiêng các thành phn si. Hot đng gim cholesterol ca chitosan qua đưng ung đưc báo cáo nhiu (Sugano, Watanabe, Kishi, Izumi, & Ohtakara, 1988)[46] trong khi chitin, mc dù biu hin s tit triglycerides trong phân cao hơn, nhưng khơng biu th hot tính gim cholesterol. 2.3.3.Đc tính chng oxi hĩa Xu hưng hin nay s dng các phân t chng oxi hĩa cĩ ngun gc t nhiên ngày càng tăng. Chúng thuc lp chitosan và mt s dn xut ca chúng, an tồn và khơng đc hi cung cp s bo v t các gc t do, vì vy làm chm s tin trin ca nhiu bnh mãn tính. Đưc bit, tác đng chng
31. 18 oxi hĩa ca chitosan khác nhau tùy vào trng lưng phân t và đ nht ca chúng (Kamil, Jeon, & Shahidi, 2002) [17]. X lý mu cá trích vi chitosan, tuy nhiên, cho thy giá tr peroxide trong aldehyde d bay hơi thp hơn mu khơng x lý. Chitosan đ nht thp cho thy cĩ hiu lc chng oxi hĩa mnh nht. Oligochitosan (Mw 1.3 và 3.5 kDa) ngăn chn oxy hĩa trong chut . Kanatt (2008) cũng s dng dn sut chitosan gn glucose bng phn ng Maillard trong bo qun thc phm. Kt qu cho thy phc hp chitosan glucose (GCC: glucose chitosan complex) va cĩ hot tính kháng khun li va cĩ hot tính chng oxy hĩa và đây là mt phc hp ha hn làm cht bo qun thc phm [18]. 2.3.4.Màng ph làm lành vt thương (would healing) Cha các vt thương là mt quá trình thúc đy nhanh chĩng s phc hi da và làm nhanh s lành vt thương. Mt màng chitosan cĩ cu trúc xp đưc thit k cho màng ph cha vt bng, vt thương. Màng chitosan cĩ tác dng kim sốt mt nưc do bay hơi, đm bo trao đi oxy cho da hơ hp và thúc đy kh năng thốt cht lng. Ngồi ra nh hot tính kháng khun t nhiên ca chitosan nên màng ph chitosan cĩ hiu qu hn ch s xâm nhim các vi sinh vt ngoi lai. Vt thương đưc bao ph bi màng chitosan cĩ tác dng cm máu và làm lành vt thương nhanh chĩng. Thí nghim v mơ bnh hc đã xác nhn s tăng t l ph đy biu mơ cũng như t chc collagen dưi lp biu bì. Vt thương cha chitosan gim so do c ch các s hình thành si trong vt thương và nĩ đưc cm máu và hình thành lp film bao ph bo v. Là mt cơ cht cho lysozyme, sn phm phân hy chitosan đưc hp thu bên trong t bào cĩ tác dng làm tăng hot tính đi thc bào macrophage.
32. 19 Phc hp Chitosanalginate dng màng cũng cho thy kh năng lành vt thương rt tt. Hai dng màng chitosan: ChitLA và Chit –A A cho hiu qu tt trong điu tr vt thương. Kt qu cho thy vt thương lành hồn tồn và khơng hình thành so. Màng phi hp gia chitosan và cellulose cũng là mt vt liu cha vt thương hiu qu vi đc tính kháng khun cao. Chúng cĩ th bo v vt thương nh kh năng kh nưc và chng nhim trùng . 2.3.5.S dng trong cy ghép răng Trong gii phu cy ghép răng, quá trình phc hi xương s dng vt liu ghép vào xương đã tr nên cn thit. Đi vi thit k tái sinh t bào xương, mt lot các polymer chng đ như cht nn collagen loi1, cht nn xp poly(lactide/gylcolide)/ hydroxyapatite 3D polymer, chitosan đã đưc tng hp. Các kt qu cho thy s to ra xương nhân to s dng k thut mơ hình mơ là mt trin vng đ phc hi mơ xương. Lee (2002) kt qu mt th nghim sơ lưc in vitro đ ngh rng chitosan cĩ tim năng bit hĩa t bào gc ty xương và thun li hình thành xương[24]. Chitosantricalcium phosphat xp cũng ha hn là mt vt liu chng đ rt tt cho cy ghép vào các v trí phc hi xương in vivo. 2.3.6. ng dng trong ly gii chm thuc Hojo (2000) cơng b gn pentapeptide TyrIleGlySerArg cĩ hot tính kháng t bào ung thư lên chitosan đã hn ch kh năng b phân hy bi enzyme t bào thơng qua cu trung gian carbodiimide. Nghiên cu to phc hp chitosan(Gly)AlaArgSerGlyIleTyrAc, cho thy hot tính c ch rõ rt trong th nghim trên t bào khi u phi ác tính di căn B16BL6 chut. Kt qu này cao hơn so vi pentapeptide nguyên thy YIGSR. Hot tính chng khi u đưc tăng cưng là nh phc hp chitosan –petapeptide đã bo v chng li s thy phân ca enzyme in vivo.
33. 20 Shabori (2002) nghiên cu ch to ht nano chitosan đ c đnh thuc cyclosporin A đ ung, kích thưc ht nano là 150nm. Kt qu cho thy hiu sut mang thuc là 94%, nng đ cyclosporin A trong máu là 2760 ng/ml cao gp 2.5 ln so vi sodium glycolate nanoparticles. Hot tính ca cyclosporin A c đnh trong ht nano chitosan tăng 72%, gelatin nanochitosan ch tăng 18%, riêng sodium glycholate li gim ti 36% so vi đi chng [10]. Xinge Zhang (2008) cơng b nghiên cu làm tăng kh năng hp thu insulin qua niêm mc mũi bng ht nano chitosan và PEGht nano chitosan, kích thưc ht nano là 150300 nm. Hiu qu hp thu insulin qua niêm mc mũi th mu PEGht nano chitosan cao hơn so vi PEGchitosan là 30 40%. Kích thưc ht nano càng nh, din tích b mt càng ln và đin tích dương trên b mt càng cao là nguyên nhân nh hưng đn kh năng hp thu insulin vào máu qua niêm mc mũi [52]. Shedaghi (2008) nghiên cu ch to trimethyl ht nano chitosan đ làm vt liu ly gii chm insulin. Kt qu cho thy đng hc ly gii ca insulin nht trong trimethyl ht nano chitosan n đnh và kéo dài hơn [45]. Shadeghi (2008) nghiên cu hp ph insulin trên vt liu nano chitosan, diethylmethyl nano chitosan nanoparticles (DEMC) và trimethylchitosan nanoparticles (TMC). Kt qu v đng hc ly gii chm insulin khá n đnh cho c ba vt liu nanoparticle [45]. 2.3.7. Hot tính kháng khun Hot tính kháng khun ca chitosan và các dn xut ca nĩ đã nhn đưc s quan tâm đáng k trong nhng năm gn đây. Cơ ch kháng khun ca chitosan là nh mt s cơ ch sau: Chitosan là mt polycationic, chúng tương tác vi thành phn polyanion vách t bào (lipopolysaccharides và protein) ca vi sinh vt, kt
34. 21 qu là s rị r thành phn ni bào do các thay đi trong tính thm ca hàng rào (barrier); ngăn cn cht dinh dưng đi vào t bào; ngăn cn s nhp vào t bào (đc bit là chitosan cĩ khi lưng phân t thp LMWC ). Chitoan cĩ kh năng kt hp vi DNA và nh vy chitosan cĩ kh năng c ch tng hp RNA và protein. Chitosan cĩ kh năng gn kt gây đơng t, kt ta t bào vi khun và dn đn git cht t bào. Cơ ch tác đng ca chitosan và chitosan oligomer đi vi E. coli và S. aureus đưc Eaton (2008) nghiên cu bng kính hin vi AFM (atomic force microscope) như hình chp dưi đây. Kt qu thy rng sau 24h x lý, t bào b phá v màng và thm thu dch t bào ra ngồi mơi trưng [7].
35. 22 Hình 2.7. nh hưng ca chitosan và chitosan oligomer (COS) đn t bào E.coli (Eaton, 2008) Tharanathan(2004)[Chitosan cho thy mt ph kháng khun rng kháng li c nm và vi khun Gram dương và Gram âm [9]. Hong Kyoon No (2002) nghiên cu nh hưng ca sáu loi khi lưng phân t khác nhau ca chitosan, chitosan oligomer đn kh năng kháng khun trên 7 loi vi khun gram dương và 4 vi khun gram âm. Kt qu thy rng chitosan cĩ khi lưng phân t cao cĩ kh năng kháng khun tt hơn chitosan oligomer cĩ khi lưng phân t thp hơn. Hot tính kháng khun ca chitosan
36. 23 mnh hơn vi khun gram âm hơn là vi khun gram dương. Ch s MIC ca chitosan bin đng trong khong 0.050.1% tùy thuc vào khi lưng phân t và loi vi khun. Hong Kyoon No cũng khng đnh rng hot tính kháng khun ca chitosan th hin tt hơn mơi trưng pH thp [12]. Nguyn Anh Dũng (2004) cũng nghiên cu kh năng kháng E.coli ca chitosan, chitosan oligomer và chitosan oligomer ci bin bng cách gn vi salicylic aldehyde đã làm gia tăng hot tính kháng khun lên nhiu ln. MIC ca chitosan đi vi E. coli khong 250 ppm, oligoglucosamine khong 80 100 ppm và salicyden oligoglucosamine (SO) ch cịn 3040 ppm [3]. Mui ammonium bc bn ca chitosan th hin hot tính kháng khun rt cao. Ví d: diethylmethylchitosan cloride th hin hot tính kháng khun cao hơn chitosan. Hydroxypropyl chitosan ghép vi acid maleic natri c ch hơn 99% vi khun Staphylococcus aureus và E. coli trong 30 phút tip xúc vi nng đ 100 ng/ml. Avadi (2004) nghiên cu ch to dn sut diethylmethylchitosan (DEMC) đ tăng kh năng hịa tan trong dung mơi, nưc và tăng tính kháng khun gp hai ln so vi chitosan khơng ci bin (bng 2.5) [6]. Nguyen Anh Dzung, Phm Quang Anh, Pham Anh Hong (2007) nghiên cu ci bin chitosan bng cách gn to nhánh chitosan vi gc đưng glucose, glucosamine, trimethyl chitosan đ tăng hot tính kháng khun. Kt qu ghi nhn trong bng 2.6 [38].
37. 24 Bng 2.4. Ch s MIC (g/ml) và MBC (g/ml) ca chitosan và DEMC Mơi trưng Kim chng (mu Chitosan DEMC trng) MIC MBC MIC MBC MIC MBC Nưc ct 500 500 AcOH 0,25% khi 2500 2500 250 250 125 125 lưng AcOH 0,5% khi 2500 2500 225 225 110 110 lưng AcOH 0,75% khi 1250 1250 158 158 87,5 87,5 lưng AcOH 1,00% khi 1250 1250 125 125 62,5 62,5 lưng
38. 25 Bng 2.5. Ch s MIC ca mt s dn sut chitosan trên mt s vi khun MIC (ppm) Các dn sut MSSA MRSA E. faecalis E. coli P. aeruginosa Chitosan 200 560 400 200 200 Oligosaccharide 200 600 480 200 200 Glucose chitosan 80 80 80 40 40 Glucose 100 180 140 100 100 oligosaccharide Glucosamine 40 40 40 30 30 chitosan Glucosamine 50 60 50 40 40 oligosaccharide Trimethyl 10 20 20 5 10 chitosan Trimethyl 100 140 120 100 120 oligosaccharide Carboxymethyl 40 60 40 40 40 chitosan Sun (2006) nghiên cu hot tính kháng khun ca CMC (Carboxy methyl chitosan) và QC (Quarterinized chitosan). Kt qu cho thy ch s MIC ca CMC là 500ppm vi E.coli và 1500 ppm vi S. aureus; ch s MIC ca QC là 125ppm vi E.coli và 250ppm vi S. aureus [47].
39. 26 Tikhonov (2006) cũng nghiên cu hot tính kháng khun và kháng nm ca chitosan khi lưng phân t thp (4,7 kDa) và chitosan ci bin. Kt qu cho thy chitosan khi lưng phân t thp cĩ hot tính kháng khun thp. nng đ 1% chitosan (4.7 kDa) t l cht ca E.coli ch là 91.6% [49]. Vt liu ht nano chitosan cĩ din tích tip xúc và đin tích dương ln hơn chitosan thơng thưng nên cĩ hiu qu kháng khun cao hơn nhiu ln so vi chitosan. Qi et al. (2005) nghiên cu ch to ht nano chitosan đ tăng hot tính kháng khun. Ht nano chitosan đưc chun b bng phương pháp to gel trong tripolyphosphate (TPP), kích thưc ht khong 3050nm. Các th nghim hot tính kháng khun ca ht nano chitosan trên 4 loi vi khun E.coli, S. typhimurium, S. choleraesuis và S. aureus cho thy hot tính kháng khun tăng lên nhiu ln so vi chitosan. MIC (nng đ ti thiu c ch) ca ht nano chitosan là 1/81/32 microgam/ml so vi chitosan là 816 microgam/ml và kháng sinh doxycycline là 14 microgam/ml [41].
40. 27 Bng 2.6. Ch s MIC (g/ml) và MBC (g/ml) ca kháng sinh Doxycycline và Chitosan nanoparticles Vi khun Doxycyline CNP CNPCu MIC MBC MIC MBC MIC MBC E. coli K88 1 8 1/8 4 1/16 2 E. coli ATCC 25922 2 16 1/16 2 1/16 2 S. choleraesuis ATCC 4 32 1/8 4 1/16 2 50020 S. typhinurium ATCC 4 64 ¼ 8 1/8 4 50013 S. aureus ATCC 2593 ¼ 8 ¼ 8 1/8 4 CNP: chitosan nanoparticles, CNPCu: chitosan nanoparticles hp th Cu 2.3.8. Hot tính chng đơng máu ca dn xut sulfated chitosan Hin tưng đơng máu liên quan đn s hot đng liên tip ca mt lot các enzyme serine proteinases, nht là thrombin xúc tác s chuyn đi fibrinogen thành fibrin khơng tan. Kh năng ca sulfated glycosaminoglycans can thip vào quá trình đơng máu đã đưc th nghim lâm sàng rng rãi và cĩ ý nghĩa thit thc. Heparin, như là mt tác nhân chng thrombin hiu qu, đã s dng lâm sàng trong thi gian dài. Theo Doczi và Wolfrom (1953) cơng b so vi heparin, chitosan sulfate cĩ tim năng kháng đơng cao bng khong 45% nh cĩ cu trúc hĩa hc tương t heparin. Sulfat hĩa đã đưc thc hin bng cách s dng axit chlorosulfonic trong N, Ndimethylformamide nhit đ phịng đ tránh phân hy chitosan. Khơng ging heparin, sulfated chitosan khơng thy th hin hot tính chng
41. 28 đơng máu, gây chy máu quá mc bnh nhân. Mt mc đ sulfate hĩa cao hơn đưc th hin là cĩ li cho s kháng đơng, vi s đánh giá thi gian thrombin. S sp xp ca nhĩm sulfate đưc cho thy cĩ nh hưng ln quá trình kháng đơng, ví d, nhĩm C6 sulfate đã là mt chìa khĩa cn thit, vì s desulfation ca nĩ dn đn mt hot tính. S thay đi hĩa hc ca chitosan sulfate cũng đưc quan tâm nghiên cu bi vì nĩ s làm gia tăng s ging nhau v cu trúc ca chitosan sulfate và cu trúc ca heparin. Hot tính kháng đơng ca polysaccharides sulfate nĩi chung là kt qu t s tương tác gia các nhĩm sulfate tích đin âm vi chui peptid tích đin dương. Nhĩm Nacetyl cũng cho thy s ci thin hot tính kháng đơng. 2.3.9.ng dng làm tá cht cho vaccin Nh đc tính khơng đc, khơng gây phn ng ph, cĩ kh năng kích thích h thng min dch ca t bào mà chitosan và đc bit là ht nano chitosan đưc tp trung nghiên cu làm tá cht cho vaccine. Maletter (1984) [30] đã chng minh kh năng tăng cưng hot đng ca h thng min dch ca mt s dn sut chitin trong invivo. Maletter ch ra rng chitin cĩ mc đ deacetyl hĩa 70% kích thích min dch trung gian t bào và tăng cưng hình thành kháng th đc hiu trong thí nghim trên chut và heo Guinea. Shibata (1996) cũng cơng b chng minh các ht chitin và chitosan cĩ kh năng cm ng tăng tng hp interferon gamma và đi thc bào. Các tác gi cũng khng đnh kh năng kích thích h thng min dch ca cơ th ph thuc rt nhiu vào mc đ deacetyl hĩa, khi lưng phân t và nhĩm th trên chitin, chitosan. Illum (2001) nghiên cu cho thy chitosan như là mt tá cht mi cho vaccin. Kt qu đáp ng min dch lơ thí nghim kháng nguyên cúm là rt thp, ch s IgG ch là 10 2 trong khi tá cht chitosan là 10 3 ln chng th
42. 29 nht. ln nhc hai, đi chng antigen là 10 2 và tá cht chitosan là 10 5 [13].Van der Lubben (2001) nghiên cu s dng chitosan làm tá cht cho vaccin qua niêm mc mũi. Hình 2.8. Cơ ch xâm nhp qua màng ca chitosan mang vaccin cĩ kích thưc nm khác nhau (Van der Lubben ,2001) Nh cĩ kích thưc nanomet và tích đin tích dương nên chitosan d dàng đi qua t bào biu mơ vào trong t bào và thi chm vaccine đ kích thích min dch. Do cĩ kh năng thi chm (slow release) nên đáp ng min dch s kéo dài và n đnh hơn [53]. Ana Vila (2004) nghiên cu s dng ht nano chitosan đ mang vaccin tetanus qua niêm mc mũi. Kích thưc ht nano là 350 nm, đin tích là + 40mV, cĩ hiu sut mang vaccin tetanus là 5060%. Kháng th IgG thí nghim s dng ht nano chitosan cao gp 5 ln so vi s dng kháng nguyên tetanus t do sau 2 tun, tăng gp 15 ln sau 12 tun và 25 ln sau 24 tun. Kháng th đc hiu thí nghim s dng ht nano chitosan cao hơn so vi đi chng gp 2.5 ln và tăng lên theo thi gian t 224 tun [6]. Zaharoff (2007) cơng b nghiên cu cho thy dung dch chitosan tăng cưng đáp ng min dch trung gian t bào và min dch dch th. Chitosan làm tăng kháng th đc hiu kháng nguyên lên 4 ln so vi đi chng và CD4
43. 30 đc hiu kháng nguyên lên 6 ln. So sánh vi các tá cht (adjuvant) truyn thng như Freund và hydroxyt nhơm thì chitosan làm tá cht tương đương vi tá cht Freund và tt hơn nhiu so vi hydroxyt nhơm. Chitosan làm tăng s lưng t bào lympho trong hch lympho lên 67% ngày th 14 sau tiêm. Đng thi chitosan cũng làm tăng s lưng t bào NK 1.1 + và CD 11b + trong hch lympho. Trong mơ hình thí nghim ca Zaharoff chng minh antigen trong PBS ch tn ti trong mơ bào 3 gi sau tiêm, trong khi đĩ antigen hp ph trên chitosan cĩ th duy trì ti hơn 7 ngày. Trong thi gian 7 ngày lưng antigen đưc phĩng thích khong 60%. Le Van Hiep, Nguyen Anh Dung, Vo Thi Phuong Khanh (2008) nghiên cu s dng chitosan oligomer (dp=816) làm tá cht cho vaccin cúm A H5N1. Kt qu cho thy chitosan oligomer đã kích thích đáp ng min dch sm và tăng cưng kháng th đc hiu cúm cúm A H5N1. Hình 2.9. nh hưng ca các loi adjuvant lên đáp ng min dch ca chut vi vaccin cúm H5N1
44. 31 Hình 2.10. nh hưng ca chitosan và các tá cht khác đn đáp ng min dch ca chut vi vaccin H5N1(a) và hiu giá kháng th (HIU) (b). Nhĩm 1: Đi chng (kháng nguyên cúm A H5N1) Nhĩm 2: Hydroxyt nhơm + kháng nguyên cúm A H5N1. Nhĩm 3: Chitosan oligomer (1mg/ml) + kháng nguyên cúm A H5N1. Nhĩm 4: Chitosan oligomer (2mg/ml) + kháng nguyên cúm A H5N1. Nhĩm 5: Freund + kháng nguyên cúm A H5N1 [23]. 2.3. Tng quan v Escherichia coli và Staphylococcus aureus 2.3.1 Vi khun Escherichia coli 2.3.1.1. Gii thiu chung Trc khun rut già Escherichia coli cịn cĩ tên là Bacterium colicommure , Bacillus colicommunis đưc phân lp vào năm 1885 bi Eschirich t phân ca nhng tr em b viêm đưng rut, sng bình thưng trong rut ngưi và lồi vt, nhiu nht rut già (vùng hi manh tràng). Ngưi ta nhn thy rng Escherichia coli phát tán rt rng ln trong rut ca tr em, ngưi ln và nhng đng vt cĩ vú khác. Vi khun thưng theo phân ra ngồi thiên nhiên, do đĩ ta thưng thy trong nưc, đt, khơng khí. Vi khun Escherichia coli thưng sng hi sinh vi nhau, là nhng sinh vt cĩ kh năng tim tàng gây ra các bnh v đưng rut. S phân bit gia các đc t ca vi rút và các đc t vi khun Escherichia coli đưc xác đnh bng cách s dng phương pháp phân loi huyt thanh. Phương pháp này ln đu tiên đưc ng dng đ nghiên cu v dch bnh đưng rut tr em và sau đĩ đưc Kaufmann phát trin thành mt h thng huyt thanh là nn tng cho vic nghiên cu ngày nay. Trong cui nhng năm 1940, nhiu ging vi khun Escherichia coli liên quan đn bnh tiêu chy đã đưc nhn bit da trên cơ s kháng nguyên O
45. 32 soma ca chúng, và s phân chia các ging thành nhng lồi vi khun cĩ kh năng gây bnh và sng hi sinh đưc hình thành . Vai trị ca vi khun Escherichia coli nguyên nhân gây ra bnh tiêu chy ngày càng đưc tha nhn trên 25 năm qua. Nhng s nh hưng ca thú y này đưc mơ t mt cách tồn din gn đây. S vn chuyn ca vi khun Escherichia coli gây bnh tiêu chy qua đưng đng vt đưc xem là ch yu. Nĩ là mi đe do đn sc kho ca con ngưi do s nhim bn ca thc phm hoc là bng cách tip xúc trc tip. Ngồi nhng bnh v tiêu chy, các chng vi khun Escherichia coli cịn thưng gây ra các bnh lây nhim qua đưng nưc tiu và các bnh v rut tha. 2.3.1.2. Đc đim vi sinh hc Năm 1885 Escherich phát hin ra ging Esherichia . Theo phân loi ca Eving năm 1986, ging này thuc b Escherichiae, h Enterobacteriaceae , lồi đin hình là Escherichia coli. Ging Escherichia là mt phn ca b Escherichiae ,thuc gia đình vi khun Entero – bacteriaceae và bao gm cĩ 5 lồi. Các lồi gm là E.hermanii, E.fergusonii và E.vulneris tt c nhng lồi này đưc tách ra t các ngun gc khác nhau ca cơ th bao gm c rut và rut tha, lồi E.blattae là lồi ch đưc tách ra t con gián. E.coli là lồi ln nht ca ging này. 2.3.1.2.1.Hình thái Vi khun Escherichia coli là trc khun Gram âm, hình que. Kích thưc dài hay ngn tùy thuc mơi trưng nuơi cy, thưng vào khong 1 ÷ 1,5 ìm × 2 ÷6 ìm. Mt s vi khun di đng đưc nh tiên mao (lơng roi ), mt s li bt đng, mt s cĩ nang. Vi khun khơng sinh bào t. 2.3.1.2.2. Điu kin nuơi cy Vi khun Escherichia coli thuc loi k khí khơng bt buc. Nhit đ thích hp nht đ phát trin là 37 oC. Tuy nhiên cĩ th tăng trưng t 15
46. 33 ÷40 oC . Cĩ nhiu nhĩm vi khun Escherichia coli cĩ th chu đưc nhit đ cao 55 oC khong 60 phút và thm chí đn 60 oC khong 15 phút. pH phát trin ti ưu ca E.coli là 4,4. Trong mơi trưng lng, sau 45h Escherichia coli làm đc nh mơi trưng, càng đ lâu đc càng nhiu và sau vài ngày cĩ th cĩ váng mng trên b mt mơi trưng. Đ lâu vi khun lng xung đáy. Trên mơi trưng thch thưng sau 1824h to khun lc trơn, b đu, bĩng, khơng màu hay màu xám nh, đưng kính 23 mm. Trên mơi trưng phân lp, vi khun thưng làm thay đi màu ca mơi trưng vì lên men đưng lactose. Khun lc cĩ màu vàng trên mơi trưng Istrati và màu đ trên mơi trưng SS. 2.3.1.2.3. Đc đim trao đi cht Escherichia coli sng rut già ca ngưi và ca đng vt, theo phân ngưi và gia súc ra thiên nhiên. E.coli lên men đưc nhiu loi đưng glucose, lactose, sinh ra sn phm ca acid và hơi (ngoi tr mt s chng EIEC khơng lên men đưng lactose và khơng sinh hơi), cĩ kh năng kh nitrate thành nitrite. E.coli cĩ enzyme trytophanase. Nu trong mơi trưng cĩ trytophan, chúng s phân gii trytophan thành indol. Mt s hố cht ngăn chn đưc s phát trin ca E.coli như Chlorine và các dn xut, mui mt, Brillant green, Sodium deoxycholate, Sodium tetrathionate, Selenite 2.3.1.2.4.Kháng nguyên E.coli cĩ khong 150 yu t O, 100 yu t K và 50 yu t H. Da vào cơng thc kháng nguyên O, K và H ngưi ta phân bit E.coli đưc chia thành rt nhiu tuýp huyt thanh khác nhau. Kháng nguyên O là kháng nguyên ca thành t bào. Cu to bi lipopolysaccharit. Đc tính ca kháng nguyên O là :
47. 34 Chu đưc nhit, khơng b hu khi đun nĩng 100 oC trong hai gi. Kháng cn, khơng b hy khi tip xúc vi cn 50%. B hy bi focmol 5%. Rt đc, ch cn 1/20mg đ git cht chut sau 24 gi. Kháng nguyên H ( kháng nguyên tiêu hao). Chúng đưc cu to bi protein,cĩ các tính cht sau : Khơng chu nhit. B hy bi cn 50%. B hy bi các protease. Khơng b hy bi focmol 5%. Kháng nguyên K ( kháng nguyên màng t bào). Loi này ch cĩ mt s vi khun đưng rut. Đưc cu to bi polysaccharit hoc là protein. Căn c vào kháng nguyên O, K, H ngưi ta chia Escherichia coli thành nhiu nhĩm khác nhau: EPEC ( Enteropathogenic E.coli ) : gây bnh đưng rut, gây tiêu chy tr em vào mùa hè, gây dch nhà tr, EPEC bám dính vào b mt t bào rut, hu hoi t chc ti ch. ETEC ( Enterotoxigenic E.coli ) : sinh đc t rut, gây tiêu chy tr em và ngưi du lch, cĩ hai loi đc t chính : khơng chu nhit (LT) và chu nhit (ST). EIEC ( Enteroinvasive E.coli ) : E.coli xâm nhp rut, thưng gây ra các v dch do thc phm, ging như Shigella EHEC ( Enterohaemorrhagic E.coli ) : E.coli gây xut huyt đưng rut, là bnh viêm đi tràng xut huyt lây lan qua đưng ăn ung, gây hi chng tan máu, urê huyt cao, chống (HUS), thưng do E.coli O157:H7 gây ra.
48. 35 EAggEC ( Enteroaggregative E.coli ) : E.coli bám dính đưng rut ging như nhĩm EPEC. Đây là nhng chng vi khun cĩ liên quan đn bnh tiêu chy ngưi. Nhng vi khun này thưng cĩ trong nhng đng vt dùng đ sn xut thc phm. 2.3.1.2.5.Kh năng gây bnh Kh năng gây bnh rt đa dng. ph n 90% trưng hp nhim khun đưng tiu ln đu là do E.coli, khi đĩ s dn ti tiu lt nht, tiu đau, tiu ra máu, tiu ra m. Trong trưng hp cơ th yu, sc đ kháng gim E.coli s vào máu gây nhim khun máu. E.coli cĩ th gây viêm màng não (khong 40% viêm màng não tr sơ sinh). Phn ln các v tiêu chy là do E.coli gây ra. Nhng biu hin lâm sàng do nhim khn E.coli tùy thuc vào v trí mà vi khun xâm nhp, thưng thy nht là : Nhim khun đưng tiu : Khong 90% trưng hp nhim khun đưng tiu ln đu ph n là do E.coli , vi các triu chng : tiu lt nht, tiu đau, tiu ra máu, tiu ra m. Cĩ th đưa ti nhim khun bng đái, thn, cơ quan sinh dc và nhim khun huyt. Nhim khun huyt : Khi sc đ kháng ca cơ th gim , vi khun vào máu gây nhim khun máu. Gp tr sơ sinh và sau khi nhim khun đưng tiu . Viêm màng não E.coli và Streptococci nhĩm B là nhng nguyên nhân hàng đu gây viêm màng não tr em . Vi khun E.coli chim khong 40% trưng hp gây viêm màng não tr sơ sinh, trong đĩ 75% E.coli cĩ kháng nguyên K1. Nguyên nhân ti sao đc tính ca vi khun li liên h vi kháng nguyên K1 thì chưa rõ.
49. 36 Tiêu chy Trưc đây E.coli đưc xem là nhng vi khun thưng trú trong rut ngưi và đng vt, gây tiêu chy nhưng ít đưc đ cp đn. Nhưng cùng vi nhng tin b ca k thut xét nghim, càng ngày ngưi ta càng phát hin ra nhiu chng E.coli gây tiêu chy. Ngày nay, E.coli đưc xem là mt trong nhng nguyên nhân hàng đu gây tiêu chy đc bit là tr em. Bnh gp khp nơi trên th gii các nưc phát trin ln đang phát trin. 2.3.2. Vi khun Staphylococcus aureus 2.3.2.1. Gii thiu chung Staphylococcus aureus là loi vi khun gây bnh thưng hay gp nht, nĩ cĩ vai trị và ý nghĩa đi vi y hc, khong 30% ngưi khe mnh mang vi khun này trên da và trên niêm mc, khi cĩ nhng tn thương da và niêm mc hoc nhng ri lon v chc năng thí các nhim trùng do Staphylococcus aureus d dàng xut hin. Staphyloccocus aureus cũng gây nên các nhim trùng lồi gia súc nht là trong nhng cơ s chăn nuơi tp trung cĩ mt đ đàn gia súc ln gây thit hi đáng k v kinh t. Nhng nhim trùng do Staphylococcus aureus cĩ th gây nên nhiu biu hin khác nhau, như các nhim trùng ca da, ca các t chc dưi da hoc trong các cơ quan ni tng, gây mưng m đin hình, mt s trưng hp chuyn sang chng huyt nhim trùng, chng bi huyt. Staphylococcus aureus cịn cĩ kh năng hình thành đc t trong thc phm, do đĩ nĩ cĩ th gây nên chng nhim đc. 2.3.2.2. Đc đim vi sinh hc 2.3.2.2.1. Đc đim hình thái Staphylococcus aureus là mt trong ba loi thuc ging t cu khun, đưng kính 0.71m, khơng di đng, khơng sinh nha bào và thưng khơng cĩ v, khơng cĩ lơng. Khi nhum phương pháp Gram thì vi khun bt màu Gram dương.
50. 37 2.3.2.2.2. Đc đim nuơi cy Staphylococcus aureus sng hiu khí hoc k khí tùy tin, nhit đ thích hp 3237 0C, pH thích hp t 5.57.6. D mc trên các mơi trưng nuơi cy thơng thưng, sinh sc t trên mơi trưng nuơi cy. Chu đưc nng đ mui 12% và nng đ đưng 50%. Mơi trưng nưc tht (b sung NaCl 0.5%) hay mơi trưng nưc mm ( đ đm cao) và pepton : sau khi cy 56h, vi khun đã làm đc mơi trưng, sau 24h mơi trưng đc rõ ràng hơn, lng cn nhiu, khơng cĩ màng. Mơi trưng thch thưng : sau khi nuơi cy khang 24h, vi khun hình thành khun lc tương đi to dng S (Smouth), mt khun lc hơi ưt, b đu nhn, khun lc Staphyloccocus aureus cĩ màu vàng thm. Mơi trưng thch màu: vi khun mc rt mnh sau khi cy 24h, vi khun hình thành nhng khun lc dng S. 2.3.2.2.3. Đc tính sinh hĩa Staphylococcus aureus cĩ kh năng chuyn hĩa đưng glucose, lactose, saccarose, mannit, levulose và phn ng coagulase dương tính, phn ng catalase dương tính. Sc đ kháng Staphylococcus aureus cĩ sc đ kháng kém đi vi nhit đ và hĩa cht : 70 0C cht trong 1h, 80 0C cht trong 1030 phút, 100 0C cht trong vài phút. Acid phenic 35% dit vi khun trong 35 phút. Focmol 1% dit vi khun trong 1h. nơi khơ hanh và đĩng băng vi khun cĩ sc đ kháng tt. nơi khơ ráo vi khun sng đưc trên 200 ngày. 2.3.2.2.4.Cu to kháng nguyên Da vào phương pháp min dch ngưi ta phân tích đưc các loi kháng nguyên:
51. 38 Mt kháng nguyên polysaccarid vách là mt phc hp mucopeptid acid teichoic. Kháng nguyên này khi gp kháng th tương ng s gây nên phn ng ngưng kt. Mt kháng nguyên protein hay protein A là thành phn vách và phía ngồi 2.3.2.2.5.Đc t Đc t dung huyt (Haemolyzin) cĩ 4 loi chính: Dung huyt t anpha: gây dung gii hng cu th 37 0C. Dung huyt t này cũng gây hoi t da và gây cht. Đây là mt ngoi đc t, bn cht là protein, bn vi nhit đ. Là mt kháng nguyên hồn tồn, gây hình thành kháng th kt ta và kháng th trung hịa dưi tác dng focmol và nhit đ nĩ bin thành gii đc t cĩ th là vaccine. Dung huyt t beta: gây dung gii hng cu cu 40C, dung huyt t này kém đc hơn dung huyt t anpha. Dung huyt t denta: gây dung gii hng cu ngưi, th, cu, nga và gây hoi t da. Dung huyt t gamma: khác vi các loi trên, loi này khơng tác đng lên hng cu nga. Trong các loi dung huyt t trên thì dung huyt t anpha là đc đim cn thit ca các chng t cu cĩ kh năng gây bnh. Nhân t dit bch cu (Leucocidin): Dưi tác đng ca nhân t này, bch cu mt tính di đng, mt ht và nhân b phá hy, nĩ gi vai trị quan trng trong cơ ch sinh bnh ca t cu. Đc t rut (Enterotoxin) Gây bnh đưng tiêu hĩa : nhim đc do thc ăn, viêm rut cp. Đc t rut cĩ 4 loi : trong đĩ cĩ 2 loi đã bit.
52. 39 Đc t rut A : to ra do mt chng phân lp trong quá trình nhim đc thc ăn. Đc t rut B : to ra do mt chng phân lp trong các bnh nhân viêm rut. Đc t rut là nhng ngoi đc t, đc t bn vi nhit (phá hy đc t 120 0C trong 20 phút), cn, acid và khơng b phá hy bi dch v. 2.3.2.2.6.Tính gây bnh Staphylococcus aureus kí sinh trên da, niêm mc ca ngưi và gia súc. Khi sc đ kháng ca cơ th kém, hoc t chc b tn thương thì vi khun xâm nhp và gây bnh. Vi khun cĩ th gây nhng m ngồi daniêm mc. Mt s trưng hp vi khun vào máu gây nhim khun huyt, huyt nhim m. Ngồi ra, ngưi cịn thy đc t rut do vi khun tit ra gây nên nhim đc thc ăn và viêm rut cp tính. V mc đ cm nhim: gia súc, nga cm nhim nht ri đn chĩ, bị, ln, cu. Gà, vt ít cm nhim, ngưi d cm nhim vi t cu.
53. 40 PHN 3. NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 3.1. Ni dung nghiên cu 3.1.1. Nghiên cu qui trình to ht nano chitosan + Nghiên cu nh hưng ca khi lưng phân t chitosan đn kích thưc ht, đin tích và tính n đnh ht nano chitosan bng phương pháp to gel vi TPP. + Nghiên cu nh hưng ca t l chitosan và TPP đn kích thưc ht, đin tích và tính n đnh ca ht nano chitosan 3.1.2. Nghiên cu th nghim kh năng kháng khun ca ht nano chitosan + Nghiên cu nh hưng ca nng đ ht nano chitosan đn kh năng kháng khun. + Nghiên cu nh hưng ca khi lưng phân t ht nano chitosan đn kh năng kháng khun. + Nghiên cu nh hưng ca t l CS: TPP ht nano chitosan đn kh năng kháng khun. + Nghiên cu nh hưng ca pH mơi trưng đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan. 3.2. Phương pháp nghiên cu 3.2.1. Hĩa cht Chitosan trng lưng phân t khác nhau: 20 kDa (DD 85%), 30 kDa (DD 85%), 300 kDa (DD 80%) sn phm ca Keumho Chemical Products Co., Ltd, Hàn Quc. TPP (Tripolyphosphate) : Na 5P3O1 (M = 367,86 g/mol) K28313999122 Merck (Đc). NaOH là hĩa cht tinh khit.
54. 41 Acid acetic: CH 3COOH (M= 60,05 g/mol) 99,8 %, K3823463 750 Merck (Đc) Nưc kh ion. Vi khun Escherichia coli và vi khun Staphylococcus aureus t Vin v sinh dch t Tây Nguyên. + Máy mĩc và thit b: máy li tâm, máy khy, kính hin vi đin t truyn quang (Transmission electronic microscope, TEM) JEOL, JEM 1400, Nht Bn. 3.2.2. Đa đim nghiên cu Phịng thí nghim Trung tâm Cơng ngh Sinh hc, Trưng Đi hc Tây Nguyên, Thành ph Buơn Ma Thut. Chp nh TEM Ti Trưng Đi hc Bách Khoa, Thành ph H Chí Minh 3.2.3. Thi gian thc hin T tháng 10/2009 đn tháng 6/2010. 3.2.4. Phương pháp nghiên cu qui trình to ht nano chitosan 3.2.4.1. Nghiên cu nh hưng ca khi lưng phân t chitosan đn kích thưc ht, đin tích và tính n đnh ht nano chitosan bng phương pháp to gel vi TPP. Ni dung nghiên cu nh hưng ca khi lưng phân t chitosan đn kích thưc ht nano chitosan và đin th ht. Khi lưng phân t chitosan là 20 kDa , 30 kDa và 300 kDa . Chitosan cĩ các khi lưng phân t khác nhau 20kDa, 30 kDa và 300 kDa đưc pha vi nng đ 0,2% (w/v) trong dung dch acid acetic 0.35%, sau khi hịa tan chitosan, dung dch đưc điu chnh pH đn 5.5 bng NaOH 1M. TPP đưc pha vi nng đ 0,5% (w/v) trong nưc kh ion.
55. 42 Ht nano đưc to bng cách nh dung dch TPP vào dung dich chitosan vi t l Chitosan: TPP là 5:1 (w/w) trong điu kin khuy t 900 rpm, thi gian phn ng là 60 phút nhit đ phịng. Sau đĩ ly dung dch ht nano chitosan ly tâm vi tc đ 12.000 vịng/phút trong 60 phút thu cn. Ra cn lp li hai ln bng nưc kh ion ri đơng khơ. Mu đưc bo qun 50C trong t lnh. + Các ch tiêu theo dõi Kích thưc trung bình ht nano chitosan (nm). Phân b kích thưc ht (nm). Đin th ht nano chitosan (mV). +Phương pháp đo: Ht nano chitosan đưc chp và xác đnh kích thưc, phân b kích thưc bng kính hin vi đin t truyn quang (Transmission electronic microscope, TEM) JEOL, JEM 1400, Nht Bn. Phân b kích thưc ht nano chitosan đưc xác đnh bng cách đo kích thưc ngu nhiên ca 50 ht nano chitosan. 3.2.4.2. Nghiên cu nh hưng ca t l chitosan và TPP đn kích thưc ht, đin tích và tính n đnh ht nano chitosan. Ni dung này nghiên cu nh hưng ca t l chitosan: TPP đn kích thưc và đin th ht nano chitosan, vi mc đích tìm ra t l thích hp nht và hồn thin qui trình ti ưu to ht nano chitosan trong điu kin Vit Nam. Dung dch chitosan nng đ 0,2% (w/v) vi Mw là 30 kDa đưc pha trong acid acetic 0.35% (w/v). Sau khi hịa tan, điu chnh pH ca dung dich chitosan 0,2% đn 5.5 bng NaOH 1M. TPP nng đ 0,5 % (w/v) đưc pha trong nưc kh ion. Nh git TPP vào dung dch CS trong điu kin khuy t tc đ 900 vịng/phút nhit đ phịng 30 0C trong 60 phút. T l khi lưng chitosan/TPP là 3:1; 4:1; 5:1; 6:1 và 7:1. Sau đĩ ly dung dch ht nano
56. 43 chitosan ly tâm vi tc đ 12.000 vịng/phút trong 60 phút thu cn. Ra cn lp li hai ln bng nưc kh ion ri đơng khơ. Mu đưc bo qun 50C trong t lnh. + Các ch tiêu theo dõi Kích thưc trung bình ht nano chitosan (nm). Phân b kích thưc ht (nm). Đin th ht nano chitosan (mV). +Phương pháp đo vi thit b, k thut như ni dung 3.2.4.1 3.2.5. Nghiên cu th nghim kh năng kháng khun ca ht nano chitosan 3.2.5.1. Nghiên cu nh hưng ca nng đ chitosan đn kh năng kháng khun Ni dung nghiên cu nhm tìm ra nng đ ti ưu ca chitosan trong kháng khun. S dng chitosan 300kDa cho kt qu kháng khun tt nht (Nguyen Anh Dzung, 2003) [34] làm thí nghim. Chitosan hịa tan trong acid acetic đ đưc dung dch chitosan 0,2%. Đi tưng nghiên cu là vi khun E.coli và S. aureus . Thit k thí nghim gm 7 cơng thc: + Cơng thc 1: B sung dung dch chitosan vào mơi trưng đ cĩ nng đ 20ppm. + Cơng thc 2: B sung dung dch chitosan vào mơi trưng đ cĩ nng đ 40ppm. + Cơng thc 3: B sung dung dch chitosan vào mơi trưng đ cĩ nng đ 60ppm. + Cơng thc 4: B sung dung dch chitosan vào mơi trưng đ cĩ nng đ 80ppm.
57. 44 + Cơng thc 5: B sung dung dch chitosan vào mơi trưng đ cĩ nng đ 100ppm. + Cơng thc 6: B sung dung dch chitosan vào mơi trưng đ cĩ nng đ 200ppm. + Cơng thc 7: Đi chng là mơi trưng khơng cĩ chitosan ( 0ppm). Ly 50ml dung dch mi cơng thc và đi chng cho vào 1ml dung dch vi khun, đ 24 gi nhit đ phịng. Sau đĩ đm mt đ vi khun trong 1ml dung dch pha lỗng bng cách tri ra trên mơi trưng thch Nutrient Broth. + Pha lỗng dung dch: ly 9ml nưc ct cho vào các ng nghim, ly 1ml dung dch mi cơng thc và đi chng sau khi hp ph vi khun cho vào ng nghim 1, lc đu. Sau đĩ hút 1ml dung dch t ng 1 cho vào ng 2 ri lc đu và tip tc như vy sang các ng tip theo cho đn nng đ cn pha. Hút 0,1 ml dch các ng cĩ nng đ cn đm tri trên đĩa thch, nuơi trong t m sau 24 gi. Đm mt đ vi khun đưc áp dng theo cơng thc: N A ( CFU / ml ) = n1Vf 1 + n iVf i Trong đĩ: A: là s t bào ( đơn v hình thành khun lc ) vi khun trong mt g hay 1ml mu N: là tng s khun lc đm đưc trên tt c các đĩa petri đã chn ni: là s đĩa đưc gi li đ pha lỗng th i V: Th tích dch mu (ml) cy vào trong mi đĩa fi: đ pha lỗng tương ng
58. 45 Phương pháp xác đnh t l cht ca vi khun: B K I (%) = . 100% B Trong đĩ: I (%) : t l vi khun cht B: Mt đ vi khun trong mơi trưng ( 0ppm) K: Mt đ vi khun nng đ k Tt c các vt liu và dng c thí nghim đu đưc vơ trùng. Thí nghim lp li 3 ln. + Ch tiêu theo dõi Mt đ vi khun trong mi cơng thc. T l vi khun b cht. 3.2.5.2. Nghiên cu nh hưng ca nng đ nano chitosan đn kh năng kháng khun Ni dung nghiên cu nhm tìm ra nng đ ti ưu ca ht nano chitosan trong kháng khun. S dung ht nano chitosan t 300kDa, ( CS:TPP = 6:1), tc đ khuy 900 vịng/ phút trong 60 phút nhit đ 30 o C làm thí nghim. Thit k thí nghim: mi t l gm 4 cơng thc và đi chng: + Cơng thc 1: Đưa ht nano chitosan vào mơi trưng đưc nng đ 20ppm. + Cơng thc 2: Đưa ht nano chitosan vào mơi trưng đưc nng đ 40ppm. + Cơng thc 3: Đưa ht nano chitosan vào mơi trưng đưc nng đ 60ppm.
59. 46 + Cơng thc 4: Đưa ht nano chitosan vào mơi trưng đưc nng đ 80ppm + Đi chng: Mơi trưng Nutrient Broth (nng đ 0ppm), chitosan b sung vào mơi trưng vi nng đ 20ppm, 40ppm, 60ppm, 80ppm,100ppm, 200ppm. Th nghim trên đi tưng là vi khun E.coli và S.aureus. Thc hin tương t như thí nghim trên. + Ch tiêu theo dõi Mt đ vi khun trong mi cơng thc . Tính t l cht ca vi khun. Tìm nng đ kháng khun ti ưu ca ht nano chitosan 3.2.5.3. Nghiên cu nh hưng ca khi lưng phân t chitosan đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan. Ni dung nhm tìm ra khi lưng chitosan tt nht cho tính kháng khun ca ht nano chitosan Ht nano chitosan đưc to t chitosan cĩ khi lưng phân t 20kDa, 30kDa, 300kDa vi t l CS:TPP= 6:1, tc đ khuy 900 vịng/ phút trong 60 phút nhit đ 30 o C làm thí nghim. Thit k thí nghim: + Mi loi ht nano chitosan cĩ khi lưng 20kDa, 30kDa,300kDa thc hin gm 4 cơng thc: Cơng thc 1:B sung ht nano chitosan vào mơi trưng đưc nng đ 20ppm. Cơng thc 2:B sung ht nano chitosan vào mơi trưng đưc nng đ 40ppm Cơng thc 3:B sung ht nano chitosan vào mơi trưng đưc nng đ 60ppm.
60. 47 Cơng thc 4:B sung ht nano chitosan vào mơi trưng đưc nng đ 80ppm. + Mơi trưng Nutrient Broth. Th nghiêm trên đi tưng là vi khun E.coli và S.aureus. Cách làm tương t như thí nghim trên. Thí nghim lp li 3 ln. + Ch tiêu theo dõi Tính mt đ vi khun tng nhĩm cơng thc. Tính t l cht mi cơng thc. Tìm ra khi lưng ti ưu cho tính kháng khun ca ht nano chitosan. 3.2.5.4 Nghiên cu nh hưng ca t l CS: TPP ( 4:1; 5:1; 6:1) đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan. Ni dung nhm tìm ra t l CS : TPP tt nht cho tính kháng khun ca ht nano chitosan. S dng chitosan cĩ khi lưng MIC ca thí nghim trên là 300kDa to ba loi ht nano chitosan vi t l CS:TPP là 4:1; 5:1 và 6:1. Thit k thí nghim: + Mi loi ht nano chitosan trên thc hin gm 4 cơng thc: Cơng thc 1: B sung ht nano chitosan vào mơi trưng đưc nng đ 20ppm. Cơng thc 2:B sung ht nano chitosan vào mơi trưng đưc nng đ 40ppm Cơng thc 3:B sung ht nano chitosan vào mơi trưng đưc nng đ 60ppm. Cơng thc 4:B sung ht nano chitosan vào mơi trưng đưc nng đ 80ppm. + Mơi trưng Nutrient Broth
61. 48 Th nghiêm trên đi tưng là vi khun E.coli và S.aureus. Cách làm tương t như thí nghim trên. Thí nghim lp li 3 ln. + Ch tiêu theo dõi Tính mt đ vi khun tng cơng thc. Tính t l cht mi cơng thc. Tìm ra t l CS:TPP ti ưu cho kh năng kháng khun ca ht nano chitosan. 3.2.5.6 Nghiên cu nh hưng ca pH mơi trưng đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan. Ni dung này nhm tìm ra pH mơi trưng ti ưu cho tính kháng khun ca ht nano chitosan. S dng MIC ca các thí nghim trên là ht nano chitosan cĩ khi lưng phân t 300KDa , t l CS:TPP là 6:1, tc đ khuy 900 vịng/ phút nhit đ phịng 30 o C trong 60 phút, nng đ 60ppm. Các yu t thí nghim là pH mơi trưng thay đi t 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 và 7.0. Thit k thí nghim: gm 6 cơng thc và mơi trưng Nutrient Broth. + Cơng thc 1: pH mơi trưng là 4.5 + Cơng thc 2: pH mơi trưng là 5,0 + Cơng thc 3: pH mơi trưng là 5,5 + Cơng thc 4: pH mơi trưng là 6,0 + Cơng thc 5: pH mơi trưng là 6,5 + Cơng thc 6: pH mơi trưng là 7,0 Th nghim trên đi tưng là vi khun E.coli và S.aureus. Các bưc tin hành như sau:
62. 49 + Ht nano chitosan đưa vào mơi trưng Nutrient Broth cĩ nng đ 60ppm. Cho vào các bình tam giác: mi bình 50ml dung dch trên ri chun đ pH 6 cơng thc trên. + Bình 7 là 50ml mơi trưng Nutrient Broth + Đưa 1ml vi khun vào mi bình, 24 gi nhit đ phịng. + Đm mt đ vi khun sau 24 gi trong 1ml dung dch pha lỗng: cách làm như thí nghim trên. + Tính t l vi khun cht. Thí nghim lp li 3 ln, các thao tác và dng c đu vơ trùng. +Ch tiêu theo dõi Đm mt đ vi khun mi cơng thc Tính t l cht mi cơng thc đ tìm ra pH mơi trưng ti ưu cho tính kháng khun ca ht nano chitosan. 3.3. Phương pháp x lý s liu S liu đưc thu thp và x lý thng kê theo phn mm MSTATC và phân hng theo trc nghim LSD 0.05 và 0.01.
63. 50 PHN 4: KT QU VÀ THO LUN 4.1. Nghiên cu qui trình to ht nano chitosan bng phương pháp to gel ion trong TPP 4.1.1. Nghiên cu nh hưng ca khi lưng phân t đn kích thưc ht, đin tích và tính n đnh ht nano chitosan Ba khi lưng phân t ca chitosan đưc s dng cho thí nghim là 20, 30 và 300kDa. Sau khi to ht gel ion trong dung dch TPP cĩ nng đ 0,2%, pH cho phn ng to ht là 5.5, khuy vi tc đ 900 rpm nhit đ phịng trong thi gian 60 phút, ht nano chitosan đưc thu nhn bng phương pháp li tâm vi tc đ 13.000 rpm. Ht đưc chp bng kính hin vi truyn quang TEM và đo kích thưc ca 50 ht ly phân b kích thưc và giá tr trung bình. Kt qu đuc ghi nhn trong bng 4.1. Bng 4.1. nh hưng ca khi lưng phân t và mc đ deacetyl hĩa ca chitosan đn tính cht ht nano chitosan Mw chitosan 20 kDa 30 kDa 300 kDa Mc đ deacetyl hĩa DD 85% DD 85% DD 80% (DD%) Phân b kích thưc ht 33,33 – 142,86 54,42 – 112,24 73,82138,15 (nm) Kích thưc ht trung 80,90 82,83 106,77 bình (nm) Đin th (+ mV) 48 46 42 Kt qu bng 4.1 cho thy khi lưng phân t càng ln thì kích thưc ht càng ln. Phân b kích thưc ht nano chitosan khi lưng phân t
64. 51 20kDa t 33,33 đn 142,86nm, kích thưc trung bình là 80,90nm. Khi khi lưng phân t ca chitosan tăng lên 30kDa thì phân b ht nano bin thiên t 54,42 đn 112,24nm, kích thưc ht trung bình khơng cĩ sư khác bit ln so vi khi lưng phân t 30kDa là 82,83nm. Kích thưc ht trung bình tăng lên 106,77 nm khi lưng phân t 300 kDa. Đin tích ca ht nano chitosan chu nh hưng khá ln bi khi lưng phân t. Khi lưng phân t càng nh thì kích thưc ht càng nh, din tích b mt càng ln và đin tích ht càng ln. Nghiên cu ca Gupta (2007) to microspheres bng phương pháp crosslinked vi glutaraldehyde cĩ kích thưc rt ln, bin thiên t 1860 micromet [32]. Nghiên cu ca Gan (2005) to ht nano chitosan cũng bng phương pháp to gel ion vi TPP cho kích thưc ht cũng khá ln t 150nm đn 280nm, đin th ht nano chitosan là + 30mV đn +48mV. So sánh vi nghiên cu ca hai tác gi chng t chúng tơi đã thành cơng trong nghiên cu to ht nano chitosan, ht cĩ kích thưc nh hơn 23 ln và đin th ht cao và n đnh +48mV [41]. Đin tích ca ht nano chitosan chu nh hưng khá ln bi khi lưng phân t và mc đ deacetyl hĩa (DD%). Mc đ deacetyl hĩa càng ln, kích ht càng nh thì đin tích ht càng ln. Điu này cĩ th gii thích mc đ + deacetyl hĩa càng cao thì s nhĩm NH 3 t do càng ln do đĩ làm tăng đin tích ht. Kt qu này phù hp vi nghiên cu ca Maclaughlin (1998) cơng b nghiên cu s dng chitosan, chitosan oligomer làm vector chuyn gen trong in vivo. nh hưng ca khi lưng phân t ca chitosan, các thơng s như kích thưc ht nanoparticle, đ tích đin dương, đ n đnh đu cĩ nh hưng đn hiu sut chuyn gen. nh hưng ca khi lưng phân t ca chitosan đn kích thưc ht nanoparticles ca chitosan/DNA rt rõ rt. Khi lưng phân t càng nh thì kích thưc ht càng bé. Kt qu cho thy chitosan
65. 52 cĩ khi lưng 540kDa cĩ kích thưc 480nm, chitosan 102kDa cĩ kích thưc 240nm và chitosan 49kDa cĩ kích thưc khong 140nm. Kt qu cũng cho thy khi lưng phân t nh t 49kDa, 32kDa, 24kDa và 7kDa gn như khơng nh hưng đn kích thưc ht nano chitosan. nh hưng ca khi lưng phân t và mc đ deacetyl hĩa ca chitosan đn kích thưc và đin tích ht nanoparticles cũng cho kt qu khơng rõ ràng khi lưng phân t t 213kDa đn 98kDa và 49kDa. Lifeng Qi và cng s (2004) cũng nghiên cu to ht nano chitosan vi TPP [25]. Khi lưng phân t chitosan là 220kDa, kích thưc ht trung bình là 48nm, đin th ht là 51mV. Q. Gan et al. (2005) cũng nghiên cu to ht nano chitosan TPP vi 3 khi lưng phân t là cao, thp và trung bình. Kt qu cũng chng minh rng khi lưng phân t càng nh thì kích thưc ht càng nh và đin th ht càng ln. Kích thưc ht nano chitosan bin thiên t 130nm đn 260nm [41]. Qua kt qu nh TEM cho thy ht nano chitosan đã đưc tng hp thành cơng, các nghim thc đu cĩ kh năng tng hp đưc ht nano chitosan trong đĩ tt nht là nghim thc khi tng hp ht nano chitosan bng chitosan cĩ khi lưng phân t là 30 kDa, ht nano đưc to ra cĩ kích thưc nh và khong phân b kích thưc tương đi cĩ s khác bit và tp trung phân b ch yu kích thưc 64,63 – 78,23 nm (> 70%). Trong khi đĩ, hai nghim thc cịn li ht nano cĩ s phân tán ri rác khơng tp trung đc bit khi khi lưng phân t ca chitosan càng ln thì đưng kính ht nano và s kém đng nht trong kt qu thu đưc càng cao. Kt qu nghiên cu này cũng trùng vi kt qu ca Z. Tang et al (2006) cơng b thu đưc khi tng hp ht nano chitosan đ c đnh enzyme protease. Kích thưc ht nano chitosan tăng khi khi lưng phân t chitosan tham gia phn ng tăng. Hai nghim thc 20 kDa và 30 kDa cĩ s khác bit v khi lưng phân t khơng nhiu nên cĩ th
66. 53 chưa cĩ s khác bit ln như so vi nghim thc tng hp bng chitosan cĩ khi lưng phân t 300 kDa. Hình 4.1. nh TEM ht nano chitosan khi tng hp vi khi lưng phân t là 20 kDa. 25 20 15 Series2 mt đ % đ mt 10 5 0 8 2 .29 2.3 3.81 14 26.19 38.10 50.00 61.90 7 85.71 97.62 21.43 109.5 1 133.33 145.24 kích thưc ht (nm) Đ th 4.1. Phân b kích thưc ht ca dung dch nano chitosan vi khi lưng phân t 20 kDa
67. 54 Hình 4.2. nh TEM ht nano chitosan khi tng hp vi khi lưng phân t là 30 kDa 30 25 20 15 Series2 mt đ % đ mt 10 5 0 3.40 17.01 30.61 44.22 57.82 71.43 85.03 98.64 112.24 125.85 139.46 153.06 166.67 180.27 193.88 kích thưc ht (nm) Đ th 4.2. Phân b kích thưc ht ca dung dch nano chitosan vi khi lưng phân t 30 kDa
68. 55 Hình 4.3. nh TEM ht nano chitosan khi tng hp v 1 8 . 0 0 1 6 . 0 0 1 4 . 0 0 1 2 . 0 0 1 0 . 0 0 M t đ8.00 (%) 6.00 4.00 2.00 t là 300 kDa 0.00 2.38 9.52 Đ th 4.3. Phân b 1kích6.67 thưc ht ca dung dch nan 23.81 30.95 i khi lưng phân 38.10 45.24 52.38 59.52 66.67 kích thưc 73.81ht (nm) 80.95 lưng phân t 300 kDa 88.10 95.24 102.38 109.52 116.67 123.81 Series1 130.95 138.10 o chitosan vi khi
69. 56 4.1.2. Nghiên cu nh hưng ca t l CS:TPP (w/w) đn kích thưc, đin tích và tính n đnh ht nano chitosan Phn ng to ht nano chitosan là do liên kt ion gia polycation + 3 (NH 3 ) ca chitosan và polyanion PO 4 . Vì vt t l gia chitosan và TPP cĩ nh hưng đn kích thưc ca ht và đ tích đin ca ht nano chitosan. Trong thí nghim này s dng 5 t l chitosan và TPP khác nhau. Các điu kin khác như pH, tc đ khuy, thi gian to ht tuơng t như thí nghim 1. Kt qu v phân b kích thưc và kích thưc trung bình ca ht nano chitosan đưc ghi nhn trong bng 4.2. Bng 4.2. nh hưng ca t l Chitosan: TPP đn tính cht ht nano chitosan (Chitosan 30kDa) Ch tiêu theo T l Chitosan: TPP dõi 3:1 4:1 5:1 6:1 7:1 Phân b kích 65162 51 – 141 55 – 112 30 – 80 35 85 thưc (nm) Kích thưc trung 80.99 97.55 75.30 52.50 57.10 bình (nm) Đin th (+ mV) 41 43 45 47 47 Qua kt qu bng 4.2 và đ th ca thí nghim này cho thy ht nano chitosan đưc tng hp nghim thc CS:TPP vi t l 6:1 cho kt qu tt nht. Ht nano cĩ đưng kính ht nh nht 40 – 50 nm chim 50 % s dao đng v kích thưc ht rt nh khơng cĩ s khác bit nhiu so vi các ht nano các nghim thc khác. V nh hưng ca t l chitosan:TPP khơng rõ rt, khơng theo qui lut nht đnh, t l 6:1 là ti ưu nht. T l nh hơn hoc ln hơn t l này đu làm kích thưc ht tăng lên và phân b khơng tp trung. Kt qu này dưng
70. như cĩ s khác bit vi nghiên cu ca Q. Gan et al này t l chitosan:TPP càng ln thì kích thưc ht nghiên cu này to ht cĩ kích thưc khá ln t 150 57 . (2005),theo nghiên cu 260nm càng[41]. ln. Tuy nhiên, Hình 4.4. nh TEM ht nano chitosan khi tng hp v 4 0 .00 3 5 .00 3 0 .00 2 5 .00 2 0 .00 mt1 5đ .00 (%) 1 0 .00 5.00 0.00 CS: TPP là 3:1 58.62 Đ th 4.4. Phân b65.52 kích thưc ht ca dung dch na 72.41 79.31 86.21 93.10 100.00 kích thưc106. ht90 nano (nm) i t l 113.79 120.69 127.59 CS:TPP là 3:1 134.48 141.38 148.28 155.17 Series2 162.07 no chitosan vi t l
71. 58 Hình 4.5. nh TEM ht nano chitosan khi tng hp v 2 5 .00 2 0 .00 1 5 .00 mt1 đ 0 .00 (%) 5.00 CS: TPP là 4:1 0.00 37.93 Đ th 4.5. Phân b44.83 kích thưc ht ca dung dch na 51.72 58.62 65.52 72.41 79.31 i t l kích thưc86.21 ht nano (nm) 93.10 100.00 106.90 CS:TPP là 4:1 113.79 120.69 127.59 134.48 Series2 141.38 no chitosan vi t l
72. 59 Hình 4.6. nh TEM ht nano chitosan khi tng hp v 9 8 7 6 5 4 m t đ (% ) 3 2 5:1 1 0 51.02 57.82 Đ th 4.6. Phân b kích thưc ht ca dung dch na 64.63 i t l CS: TPP là 71.43 78.23 85.03 kích thưc ht (nm) 91.84 98.64 105.44 CS:TPP là 5:1 112.24 Series1 119.05 125.85 no chitosan vi t l
73. 60 CS: TPP Hình 4.7. nh TEM ht nano chitosan khi tng hp v 25 20 15 mat10 do (%) 5 là 6:1 0 0 10 20 30 Đ th 4.7. Phân b kích thưc40 ht ca dung dch na 50 i t l 60 70 80 90 100 110 kich thuoc 120 130 140 150 CS:TPP là 6:1 160 170 Series2 180 190 200 210 220 no chitosan vi t l
74. 61 Hình 4.8. nh TEM ht nano chitosan khi tng hp vi t l CS: TPP là 7:1 18.00 16.00 14.00 12.00 10.00 Series2 8.00 m t đ (%6.00 ) 4.00 2.00 0.00 30.77 33.85 36.92 40.00 43.08 46.15 49.23 52.31 55.38 58.46 61.54 64.62 67.69 70.77 73.85 76.92 80.00 83.08 86.15 89.23 92.31 kích thưc ht nano (nm) Đ th 4.8. Phân b kích thưc ht nano chitosan vi t l CS:TPP là 7:1
75. 62 4.2. Nghiên cu th nghim kh năng kháng khun ca ht nano chitosan 4 2.1.Nghiên cu nh hưng ca nng đ chitosan đn kh năng kháng khun Đ kho sát tính kháng khun ca chitosan, chitosan cĩ khi lưng phân t 300kDa, hịa tan trong acid acetic đưc nng đ 0,2%. Sau đĩ đưa vào mơi trưng Nutrient Broth đ đưc các nng đ chitosan là 20ppm, 40ppm, 60ppm, 80ppm, 100ppm, 200ppm. Kho sát kh năng kháng khun trên vi khun Escherichia coli và Staphylococcus aureus ghi đưc kt qu bng s liu 4.3. Bng.4.3. nh hưng ca nng đ đn kh năng kháng khun ca chitosan trên vi khun Escherichia coli và Staphylococcus aureus Vi Nng đ 20ppm 40ppm 60pm 80 ppm 100 ppm 200ppm 0ppm khun Mt đ 9 9 9 9 9 8 2,36.10 1,91.10 1,58.10 1,44.10 1,34. 10 9,3.10 (CFU/ml) 10 1,17.10 E. coli T l cht 79,65 c 83,57 bc 86,36 abc 87,55 ab 88,55 ab 92,02 a ( %) Mt đ 3,00.10 9 2,35.10 9 2,10.10 9 1,84.10 9 1,49.10 9 1,07. 10 9 (CFU/ml) 1,07.10 10 S. aureus T l cht 72,31 c 76,52 bc 80,24 abc 82,88 abc 86,09 ab 90,09 a ( %)
76. 63 100 95 90 85 t (%) E.coli 80 ch S.aureus l 75 T 70 65 60 20 40 60 80 100 200 Nng đ chitosan (ppm) Đ th 4.9. Kh năng kháng khun ca chitosan trên vi khun Escherichia coli và Staphylococcus aureus Kt qu bng 4.3 cho thy nng đ kháng khun cao nht ca chitosan là 200ppm. nng đ này vi khun Escherichia coli cĩ t l cht là 92% và t l cht ca vi khun Staphylococcus aureus là 90%. Tính kháng khun ca chitosan trên vi khun Escherichia coli là vi khun Gram âm cao hơn trên vi khun Staphylococcus là vi khun Gram dương . Kt qu này tương đng vi kt qu ca Nguyen Anh Dzung, Vo Thi Phuong Khanh (2003), đã s dng chitosan vi nng đ 200 300 ppm và chitosan là 80100 ppm đ c ch s sinh trưng ca vi khun Escherichia coli [34]. Theo nghiên cu ca Hirano (1988) thì liu c ch Escherichia coli ca chitosan cũng là t 200 240 ppm [11]. Chitosan là polysaccharide t nhiên, khơng đc nhưng cĩ hot tính kháng khun cao. Điu này cĩ th gii thích theo quan đim ca Rinaudo (2006) như sau: + Chitosan là mt polycationic (poly NH 3 ), chitosan cĩ kh năng tương tác vi thành phn polyanion vách t bào (lipopolysaccharides và protein) ca
77. 64 vi sinh vt, kt qu làm rị r thành phn ni bào do các thay đi trong tính thm ca hàng rào (barrier); ngăn cn cht dinh dưng đi vào t bào; ngăn cn s nhp vào t bào (đc bit là chitosan cĩ khi lưng phân t thp LMWC). Chitosan cĩ kh năng kt hp vi DNA và nh vy chitosan cĩ kh năng c ch tng hp RNA và protein. Chitosan cĩ kh năng gn kt gây đơng t, kt ta t bào vi khun và dn đn git cht t bào [43]. Chitosan cĩ ph kháng khun rng, kháng li c vi khun Gramdương, Gram âm và nm (Tharanathan, 2004) [9]. Vì vy, trong nhng thí nghim sau chitosan đưc s dng làm đi chng so sánh cho ht nano chitosan. 4.2.2. Nghiên cu nh hưng ca nng đ nano chitosan đn kh năng kháng khun 4.2.2.1 . nh hưng nng đ ht nano chitosan trên vi khun Escherichia coli Ht nano chitosan s dng trong thí nghim nghiên cu nh hưng ca nng đ đn kh năng kháng khun s dng chitosan 300kDa, t l CS:TPP là 6:1 và s dng chitosan làm đi chng. Nng đ ht nano chitosan s dng là 20, 40, 60 và 80ppm; nng đ chitosan s dng đi chng là 20, 40, 60, 80, 100 và 200ppm. Kt qu nh hưng ca nng đ nano chitosan và chitosan đn kh năng kháng khun E. coli đưc ghi nhn trong bng 4.4. Kt qu bng 4.4 cho thy kh năng kháng khun ca nano chitosan cao hơn nhiu so vi oligomer chitosan. nng đ 200ppm thì oligomer chitosan dit khong 92% vi khun, nhưng nano chitosan ch vi nng đ 20ppm đã dit khong 99,8%. Đc bit nng đ 60ppm và 80ppm đã c ch gn hồn tồn vi khun E.coli, t l vi khun cht là 99,999%. Qua x lí thng kê v kh năng dit khun ca nano chitosan nng đ t 20ppm đn 80ppm khơng
78. 65 cĩ khác bit cĩ ý nghĩa thng kê. Như vy, nng đ 20ppm nano chitosan đã c ch gn như hồn tồn vi khun E. coli. Riêng chitosan chưa ci bin thì s gia tăng nng đ chitosan t 20 đn 200ppm làm gia tăng rõ rt kh năng kháng khun E. coli. S khác bit này cĩ ý nghĩa thng kê và nng đ c ch mnh nht trong thí nghim là 200ppm. Mt s nghiên cu v kh năng kháng khun ca chitosan cũng cho kt qu tương t. Nghiên cu ca Hirano (1996) cho thy chitosan kháng vi khun trong khong nng đ t 200400ppm [11]. Hong Kyoon No (2002) nghiên cu nh hưng ca sáu loi khi lưng phân t khác nhau ca chitosan, chitosan đn kh năng kháng khun trên 7 loi vi khun gram dương và 4 vi khun gram âm. Kt qu thy rng chitosan cĩ khi lưng phân t cao cĩ kh năng kháng khun tt hơn chitosan cĩ khi lưng phân t thp hơn. Hot tính kháng khun ca chitosan mnh hơn vi khun gram âm hơn là vi khun gram dương. Ch s MIC ca chitosan bin đng trong khong 0.050.1% tùy thuc vào khi lưng phân t và loi vi khun [12]. Bng 4.4. Kh năng kháng khun ca nano chitosan và chitosan trên vi khun Escherichia coli Vt liu Nng đ 20 ppm 40ppm 60pm 80ppm 100 ppm 200 ppm 0ppm Mt đ Nano 2,39.07 1,11.10 7 1,04.10 6 1,08.10 6 (CFU/ml) chitosan T l cht 99,79 99,89 99,99 99,99 ( %) 1,17.10 10 Mt đ 2,36.10 9 1,91.10 9 1,58. 10 9 1,44.10 9 1,34.10 9 9,3.10 8 Chitosan (CFU/ml) Oligomer T l cht 79,65 c 83,57 bc 86,36 abc 87,56 ab 88,55 ab 92,02 a ( %)
79. 66 100 95 90 85 t (%) Nano chitosan 80 ch Chitosan l 75 T 70 65 60 20 40 60 80 100 200 Nng đ (ppm) Đ th 4.10. Kh năng kháng khun ca nano chitosan và chitosan trên vi khun Escherichia coli 4.2.2.2. nh hưng nng đ nano chitosan trên vi khun Staphylococus aureus Vi khun S. aureus là vi khun gram dương, vì vy đưc s dng làm đi din nghiên cu nh hưng ca ht nano chitosan đi vi vi khun gram dương, so sánh vi vi khun gram âm. Ngồi ra, S. aureus là đi tưng vi khun gây ng đc thc phm khá ph bin hin nay. Ht nano chitosan s dng trong thí nghim nghiên cu nh hưng ca nng đ đn kh năng kháng khun đưc chun b t chitosan 300kDa, t l CS:TPP là 6:1. Nng đ ht nano chitosan s dng là 20, 40, 60 và 80ppm; nng đ chitosan s dng đi chng là 20, 40, 60, 80, 100 và 200ppm. Kt qu nh hưng ca nng đ nano chitosan và chitosan đn kh năng kháng khun S. aureus đưc ghi nhn trong bng 4.5.
80. 67 Bng 4.5. Kh năng kháng khun ca nano chitosan (CS:TPP = 6:1) và chitosan trên vi khun Staphylococcus aureus Vt liu Nng đ 20 ppm 40 ppm 60ppm 80ppm 100pm 200ppm 0ppm Mt đ 3,26.10 7 2,74.10 7 1,54.10 7 1,68. 10 7 (CFU/ml) Nano T l cht chitosan 99,73 99,74 99,85 99,85 ( %) 1,07. 1010 Mt đ 9 9 9 9 9 9 Oligomer 3,00.10 2,35.10 2,10.10 1,84.10 1,49.10 1,07. 10 (CFU/ml) chitosan c T l cht 72,31 76,52 bc 80,24 abc 82,88abc 86,09 ab 90,09 a ( %) 100 95 90 85 t (%) Nano chtosan 80 ch Chitosan l 75 T 70 65 60 20 40 60 80 100 200 Nng đ (ppm) Đ th 4.11. Kh năng kháng khun ca nano chitosan và chitosan trên vi khun Staphylococcus aureus Kt qu bng 4.5 cho thy cũng tương t như trên vi khun E.coli , kh năng dit khun ca nano chitosan trên S.aureus cao hơn nhiu so vi chitosan. nng đ 200ppm thì kh năng dit ca chitosan là 90%, nano
81. 68 chitosan ch vi nng đ 20ppm đã dit khong 99,73%, đc bit nng đ 60ppm và 80ppm đã dit khong 99,85%. Qua x lí thng kê, kh năng dit khun ca nano chitosan nng đ t 20ppm đn 80ppm đu rt cĩ ý nghĩa, ngay nng đ 20ppm đã c ch 99,73% vi khun. Nguyen Anh Dzung (2007) nghiên cu kh năng kháng khun ca chitosan và chitosan ci bin trên S. aureus cho thy nng đ c ch ca chitosan là 200ppm đi vi vi khun S. aureus nhy cm methionin (MSSA) và 600ppm vi S. aureus kháng methionin (MRSA). Sau khi ci bin gn glucosamine và to dn sut chitosan t cc (aquaterinized chitosan) vào chitosan đ tăng đin tích dương đã làm tăng tính kháng khun, ch s MIC ch cịn 40ppm và 20ppm [37]. Gn đây cũng cĩ mt s nghiên cu ci bin chitosan đ tăng tính kháng khun. Sun (2006), nghiên cu hot tính kháng khun ca CMC (Carboxymethyl chitosan) và QC (Quarterinized chitosan). Kt qu cho thy ch s MIC ca CMC là 500ppm vi E.coli và 1500 ppm vi S. aureus; ch s MIC ca QC là 125ppm vi E.coli và 250ppm vi S. aureus [47]. Tikhonov (2006) cũng nghiên cu hot tính kháng khun và kháng nm ca chitosan khi lưng phân t thp (4,7 kDa) và chitosan ci bin. Kt qu cho thy chitosan khi lưng phân t thp cĩ hot tính kháng khun thp. nng đ 1% chitosan (4.7 kDa) t l cht ca E.coli ch là 91.6% [46]. Vt liu ht nano chitosan cĩ din tích tip xúc và đin tích dương ln hơn chitosan thơng thưng nên cĩ hiu qu kháng khun cao hơn nhiu ln so vi chitosan. Qi và cng s (2004) nghiên cu ch to ht nano chitosan đ tăng hot tính kháng khun. Ht nano chitosan đưc chun b bng phương pháp to gel trong tripolyphosphate (TPP), kích thưc ht khong 3050nm. Các th nghim hot tính kháng khun ca ht nano chitosan trên 4 loi vi khun E.coli, S. typhimurium, S. choleraesuis và S. aureus cho thy hot tính
82. 69 kháng khun tăng lên nhiu ln so vi chitosan. MIC (nng đ ti thiu c ch) ca ht nano chitosan là 1/81/32 microgam/ml so vi chitosan là 816 microgam/ml và kháng sinh doxycycline là 14 microgam/ml [25]. Nu như kh năng kháng khun ca chitosan cĩ s khác nhau tng đi tưng thì kh năng kháng khun ca nano chitosan là tuyt đi c vi khun Gram âm và vi khun Gram dương. S dĩ nano chitosan cĩ kh năng kháng khun cao hơn là do: Vt liu ht nano chitosan nh cĩ din tích tip xúc và đin tích dương ln hơn chitosan thơng thưng, đng thi vi kích thưc nanomet nên kh năng bám vào màng t bào cao hơn, d dàng đi qua màng vào trong t bào vi khun nên hiu qu dit khun kéo dài, n đnh và cao hơn. 4.2.3.Nghiên cu nh hưng ca khi lưng phân t chitosan đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan. Trong nghiên cu này tơi s dng 3 loi ht nano chitosan cĩ khi lưng phân t 20kDa, 30kDa, 300kDa, đu đưc to t t l CS:TPP là 6:1, tc đ khuy t 900 vịng/ phút, nhit đ phịng 30 oC, trong thi gian 60 phút. Sau đĩ cho tác dng trên vi khun E.coli và S.aureus trong 24 gi, kt qu ghi nhn bng 4.6. Kt qu bng 4.6 cho thy khi lưng phân t càng ln thì kh năng kháng khun càng cao. Nano chitosan nng đ 60ppm cĩ khi lưng phân t 20kDa cho t l cht ca vi khun E.coli là 98,66%, khi lưng phân t 30kDa là 99,08%, khi lưng phân t 300 kDa là 99,99%. Ht nano chitosan khi lưng 300kDa cĩ kh năng kháng khun cao nht. Điu này trùng vi nghiên cu ca Nguyen Anh Dzung, Vo Thi Phuong Khanh ( 2003) chitosan[34].
83. 70 Bng 4.6. nh hưng ca khi lưng phân t đn kh năng kháng khun ca nano chitosan trên vi khun Escherichia coli Khi Nng đ 20ppm 40ppm 60ppm 80ppm 0ppm lưng phân t Mt đ 2,94.10 8 2,37.10 8 1,57.10 8 1,60.10 8 20 kDa (CFU/ml) T l cht 97,43 97,95 98,66 98,62 ( %) Mt đ 2,68.10 8 2,12.10 8 1,07.10 8 1,11.10 8 30kDa 1,17.10 10 (CFU/ml) T l cht 97,71 98,18 99,08 99,04 ( %) Mt đ 2,58. 10 7 1,10. 10 7 1,11.10 6 1,20. 10 6 300kDa (CFU/ml) T l cht 99,79 99,90 99,99 99,99 ( %) 100.5 100 99.5 99 Kh i l ư ng 20kDa t (%) t 98.5 Kh i l ư ng 30kDa ch 98 l Kh i l ư ng 300kDa 97.5 T 97 96.5 96 20 40 60 80 Nng đ nano chitosan (ppm) Đ th 4.12. nh hưng ca khi lưng phân t đn kh năng kháng khun ca nano chitosan trên vi khun Escherichia coli
84. 71 Bng 4.7 cho thy kh năng kháng khun ca nano chitosan trên vi khun S. aureus chu nh hưng ln ca khi lưng phân t. nng đ 20ppm, nanochitosan cĩ khi lưng phân t 20kDa cĩ t l vi khun cht là 90,89% tăng lên 96,85% 30kDa và 98,94% khi lưng phân t 300kDa. Theo x lí thng kê thì ht nano chitosan cĩ khi lưng phân t 300kDa cho ht nano chitosan cĩ kh năng kháng khun cao nht, thp nht là ht nano chitosan cĩ khi lưng phân t 20kDa. cùng nng đ là 60ppmo thì nano chitosan 20kDa cho t l cht là 97,68%, cịn nano chitosan 30kDa là 98,16% và nano chitosan 300kDa là 99,84%. Kt qu này phù hp vi nghiên cu ca Hong Kyoon No (2002) và Fernades (2008) trên vi khun S. aureus thì khi lưng phân t càng ln thì kh năng kháng khun ca chitosan càng cao. Hong Kyoon No (2002) nghiên cu nh hưng ca sáu loi khi lưng phân t khác nhau ca chitosan, chitosan oligomer đn kh năng kháng khun trên 7 loi vi khun gram dương và 4 vi khun gram âm. Kt qu thy rng chitosan cĩ khi lưng phân t cao cĩ kh năng kháng khun tt hơn chitosan oligomer cĩ khi lưng phân t thp hơn. Hot tính kháng khun ca chitosan mnh hơn vi khun gram âm hơn là vi khun gram dương. Ch s MIC ca chitosan bin đng trong khong 0.050.1% tùy thuc vào khi lưng phân t và loi vi khun [12]. Fernandes (2008) cũng nghiên cu nh hưng ca khi lưng phân t ca chitosan (625kDa, 590kDa và 107kDa) và chitosan oligomer (1kDa, 3kDa và 5kDa) đn kh năng kháng khun E. coli và S. aureus. Kt qu cho thy vi E. coli thì khi lưng phân t càng nh, hot tính kháng khun càng cao. Ngưc li, vi S. aureus thì khi lưng phân t càng ln kháng khun càng mnh [8]. Tikhonov (2006) cũng nghiên cu hot tính kháng khun và kháng nm ca chitosan khi lưng phân t thp (4,7 kDa) và chitosan ci bin. Kt qu
85. 72 cho thy chitosan khi lưng phân t thp cĩ hot tính kháng khun thp, nng đ 1% chitosan (4.7 kDa) t l cht ca E.coli ch là 91.6% [49]. Bng 4.7. nh hưng ca khi lưng phân t đn kh năng kháng khun ca nano chitosan trên vi khun Staphylococcus aureus Khi Nng đ 20ppm 40ppm 60ppm 80ppm 0ppm lưng 8 8 8 8 Mt đ 9,85.10 2,873. 10 2,503.10 2,49.10 20 KDa (CFU/ml) T l cht 90,89 d 97,36c 97,68 bc 97,69 bc ( %) 8 8 8 8 Mt đ 3,39.10 2,51.10 1,97.10 1,98. 10 10 30Kda 1,08.10 (CFU/ml) T l cht 96,85c 97,67 b 98,16 bc 98,16 bc ( %) Mt đ 1,14.10 8 2,664.10 7 1,56.10 7 1,63.10 7 300KDa (CFU/ml) T l cht 98,94 ab 99,75 a 99,84 a 99,84 a ( %)
86. 73 102 100 98 96 Kh i l ư ng 20kDa t (%) t 94 Kh i l ư ng 30kDa ch l Kh i l ư ng 300kDa 92 T 90 88 86 20 40 60 80 Nng đ nnano chitosan (ppm) Đ th 4.13. nh hưng ca khi lưng phân t đn kh năng kháng khun ca nano chitosan trên vi khun Staphylococcus aureus 4.2.4. Nghiên cu nh hưng ca t l CS: TPP ( 4:1; 5:1; 6:1) đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan. Ht nano chitosan to thành nh phn ng to gel ion gia chitosan (polycation) và polyanion ca TPP. Vì vy t l CS:TPP s nh hưng đn kh năng to ht và đin tích dương ca ht nano. V nguyên tc, t l CS:TPP tăng thì đin tích polycation ca ht s tăng. Trong nghiên cu này s dng ba loi ht nano chitosan cĩ t l CS:TPP là 4:1, 5:1 và 6:1 cĩ khi lưng phân t 300kDa, tc đ khuy 900 vịng/ phút, nhit đ phịng 30 oC trong 60 phút. Sau thi gian tác dng trên vi khun E.coli và S.aureus là 24 gi, kt qu đưc ghi nhn 2 bng 4.8 và 4.9.
87. 74 Bng 4.8. nh hưng ca t l CS:TPP đn kh năng kháng khun ca nano chitosan trên vi khun Escherichia coli T l Nng đ 20ppm 40ppm 60pm 80ppm 0ppm CS:TPP Mt đ 2,89.10 8 2,81.10 8 1,75.10 8 1,78. 10 8 4:1 (CFU/ml) T l cht 97,50 98,12 98,49 98,45 ( %) Mt đ 2,44.10 8 1,36.10 8 1,12.10 8 1,14.10 8 5:1 (CFU/ml) 1,17.10 10 T l cht 97,89 98,82 99,03 99,01 ( %) Mt đ 2,39.10 7 1,11.10 7 1,04.10 6 1,08.10 6 6:1 (CFU/ml) T l cht 99,79 99,89 99,99 99,99 ( %) 100.5 100 99.5 99 CS:TPP = 4:1 t(%) 98.5 CS:TPP = 5:1 ch 98 l CS:TPP = 6:1 T 97.5 97 96.5 96 20 40 60 80 Nng đ nano chitosan (ppm) Đ th 4.14. nh hưng ca t l CS : TPP đn kh năng kháng khun ca nano chitosan trên vi khun Escherichia coli
88. 75 Bng 4.9. nh hưng ca t l CS:TPP đn kh năng kháng khun ca nano chitosan trên vi khun Staphylococcus aureus T l Nng đ 20ppm 40ppm 60pm 80ppm 0ppm CS: TPP Mt đ 2,74. 10 8 2,27. 10 8 2,02.10 8 2,01.10 8 4:1 (CFU/ml) T l cht 97,44 97,82 98,14 98,11 ( %) 8 8 8 8 Mt đ 1,99. 10 1,61. 10 1,07.10 1,07.10 1,07.10 10 5:1 (CFU/ml) T l cht 98,14 98,50 99,00 98,99 ( %) Mt đ 3,26. 10 7 2,74. 10 7 1,54. 10 7 1,50. 10 7 6:1 (CFU/ml) T l cht 99,73 99,74 99,84 99,85 ( %) 100.5 100 99.5 99 CS:TPP = 4:1 t(%) 98.5 CS:TPP = 5:1 ch 98 l CS:TPP = 6:1 T 97.5 97 96.5 96 20 40 60 80 Nng đ nano chitosan (ppm) Đ th 4.15. nh hưng ca t l CS : TPP đn kh năng kháng khun ca nano chitosan trên vi khun Staphylococcus aureus
89. 76 Kt qu bng 4.8 và 4.9 cho thy kh năng kháng khun ca nano chitosan ph thuc nhiu vào t l CS:TPP. Ht nano chitosan to đưc theo t l CS:TPP là 6:1 cho kh năng kháng khun cao nht. nng đ ti ưu 60ppm, trên vi khun E.coli thì t l 4:1 cĩ t l cht là 98,49%; t l 5:1 là 99,03%; t l 6:1 tăng lên là 99,99% (vi khun E. coli gn như b tiêu dit hồn tồn). vi khun S. aureus thì t l 4:1 cĩ t l cht 98,14%; t l 5:1 là 99%; t l 6:1 tăng lên là 99,84%. Trong nghiên cu to ht nano chitosan thì ht nano chitosan nghim thc CS:TPP vi t l 6:1 cho kt qu ht tt nht, kích thưc ht nh và đng đu nht và đin tích ht cũng ln nht. Đây là hai nguyên nhân ch yu làm tăng tính kháng khun ca nano chitosan t l CS:TPP 6:1. 4.2.5. Nghiên cu nh hưng ca pH mơi trưng đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan Trong nghiên cu này s dng tr s ti ưu ca các thí nghim trên là ht nano chitosan cĩ khi lưng phân t 300 kDa, t l CS:TPP là 6:1, tc đ khuy 900 vịng/ phút nhit đ phịng 30 o C trong 60 phút, nng đ 60ppm. Các yu t thí nghim là pH mơi trưng thay đi t 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 và 7,0. Sau thi gian 24h, kt qu đưc ghi nhn bng 4.10. Bng 4.10. nh hưng ca pH mơi trưng đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan trên vi khun Escherichia coli Đ pH 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 Mơi trưng Mt đ 1,61.10 6 1,58.10 6 1,00.10 8 1,29.10 8 1,41.10 8 2,29.10 8 1,17.10 10 (CFU/ml) T l cht 99,99 99,98 99,14 98,90 98,79 98,04 ( %)
90. 77 100.5 100 99.5 99 t (%) t Series2 ch 98.5 l T 98 97.5 97 4.5 5 5.5 6 6.5 7 pH mơi trưng Đ th 4.16. nh hưng ca pH mơi trưng đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan trên vi khun Escherichia coli Bng 4.11. nh hưng ca pH mơi trưng đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan trên vi khun Staphylococcus aureus Mơi Đ pH 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 trưng Mt đ 1,40.10 7 1,48.107 1,07.10 8 1,37.10 8 1,73.10 8 2,20.108 1,08.10 10 (CFU/ml) T l cht 99,86 99,86 99,00 98,74 98,38 97,95 ( %)
91. 78 100.5 100 99.5 99 t(%) 98.5 Series2 ch l 98 T 97.5 97 96.5 4.5 5 5.5 6 6.5 7 pH mơi trưng Đ th 4.17. nh hưng ca pH mơi trưng đn kh năng kháng khun ca ht nano chitosan trên vi khun Staphylococcus aureus Qua kt qu bng 4.10; 4.11và đ th 4.17; 4.18 ca thí nghim cho thy kh năng kháng khun ca ht nano chitosan ph thuc vào đ pH ca mơi trưng, pH mơi trưng càng thp thì kh năng kháng khun ca nano chitosan càng cao. Trên vi khun E.coli, pH mơi trưng 4,5 và 5,0 thì nano chitosan dit ti khong 99,99% vi khun, kh năng này gim dn khi pH mơi trưng càng cao, pH mơi trưng là 7,0 thì kh năng dit khun gim xung ch cịn khong 98%. Trên vi khun S.aureus, pH mơi trưng 4,5 và 5,0 thì nano chitosan dit ti 99,86% vi khun, kh năng này cũng gim dn khi pH mơi trưng càng cao, pH mơi trưng là 7,0 thì kh năng dit khun ch cịn khong 97,95%. Gii thích điu này là do ht nano chitosan cĩ đin tích dương cao nên mơi trưng pH càng thp thì hot tính kháng khun càng cao. Kt qu này phù hp vi nghiên cu ca No (2002) [12].