›

Luận án Tính kháng thuốc Oseltamivir của virut cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012

pdf 139 trang yendo 4290
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Tính kháng thuốc Oseltamivir của virut cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfluan_an_tinh_khang_thuoc_oseltamivir_cua_virut_cum_a_luu_han.pdf

Nội dung text: Luận án Tính kháng thuốc Oseltamivir của virut cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012

  1. i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG * HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI – 2014
  2. ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG * HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012 Chuyên ngành: Vi sinh Y học Mã số : 62.72.01.15 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Đặng Đức Anh 2. PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai HÀ NỘI – 2014
  3. iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. NGHIÊN CỨU SINH Hoàng Vũ Mai Phương
  4. iv LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin trân trọng cảm ơn: Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương. Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương. Đã tạo điều khiện tốt nhất, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến GS.TS Đặng Đức Anh, người đã tạo điều kiện cho tôi đến với chuyên ngành vi rút, cho tôi những lời khuyên hữu ích, sự động viên và lòng nhiệt tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai, người đã tận tình dìu dắt giúp đỡ tôi từ những ngày đầu tiên bước chân vào lĩnh vực vi rút học, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và luôn khuyến khích tôi bước về phía trước, tiếp cận với những kiến thức nâng cao và mở rộng để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, Ths Nguyễn Cơ Thạch, Ths Lê Thị Thanh, CN Phạm Thị Hiền cùng các bạn đồng nghiệp công tác tại Phòng thí nghiệm Cúm - Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương đã nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ của Trung tâm Cúm thuộc Viện sức khỏe Hàn Quốc (KNIH )trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn TS Mendi Jamsran, TS Aeron Hurt, chuyên viên của Tổ chức Y tế Thế giới, cho những hỗ trợ kỹ thuật ban đầu của nghiên cứu. Tôi xin gửi tặng Gia đình, bạn bè và những người thân trong gia đình đã hết lòng giúp đỡ, động viên tôi trên con đường sự nghiệp khoa học để tôi đạt được thành quả ngày hôm nay. Hà nội, ngày 22 tháng 10 năm 2013 HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG
  5. v MỤC LỤC Trang phụ bìa i Lời cam đoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình, biểu đồ, sơ đồ ix ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 4 1.1. Vi rút cúm A 4 1.1.1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A 4 1.1.2. Cơ chế nhân lên của vi rút cúm A 11 1.1.3. Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A 13 1.1.4. Sự trao đổi và tích hợp trong hệ gen của vi rút cúm A 15 1.1.5. Khả năng gây bệnh của vi rút cúm 16 1.1.6. Tiến hóa của vi rút cúm A 17 1.2. Phòng và điều trị cúm A 18 1.2.1. Văc xin phòng cúm 18 1.2.2. Thuốc điều trị vi rút cúm A 20 1.2.3. Các thuốc kháng vi rút mới 23 1.3. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút 25 1.3.1. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine 25 1.3.2. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir 26 1.4. Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A 27
  6. vi 1.4.1. Nguyên nhân của hiện tượng kháng thuốc 27 1.4.2. Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm 28 1.4.3. Kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của neuraminidase 32 1.4.4. Giám sát sự kháng thuốc vi rút cúm 34 CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1. Đối tượng nghiên cứu 37 2.2. Phương pháp nghiên cứu 37 2.3. Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm 38 2.3.1. Vật liệu 38 2.3.2. Kỹ thuật xét nghiệm 42 2.4. Phân tích số liệu 51 CHƯƠNG III – KẾT QUẢ 53 3.1. Các vi rút cúm A thu thập trong giai đoạn từ 2001 – 2012 53 3.2. Xác định giá trị IC50 ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A 54 3.3. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A 60 3.4. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng cúm A liên quan đến kháng thuốc oseltamivir 65 3.5. Tỉ lệ các chủng vi rút cúm A kháng oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam, 2001-2012 69 3.6. Sự tương đồng về gen HA và NA giữa các vi rút cúm A có biểu hiện giảm độ nhạy oseltamivir với các vi rút cùng phân típ lưu hành trong giai đoạn nghiên cứu 72
  7. vii CHƯƠNG IV – BÀN LUẬN 86 4.1. Sự lưu hành của các vi rút cúm A trong khoảng thời gian nghiên cứu 86 4.2. Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50) 88 4.3. Sự liên quan của các đột biến trên gen NAvới quá trình kháng thuốc oseltamivir của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam 94 4.4. Sự liên quan về mặt di truyền học của các chủng vi rút A mang gen đột biến và các vi rút cúm A lưu hành cùng thời gian. 98 KẾT LUẬN 101 KIẾN NGHỊ 103 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
  8. viii CHỮ VIẾT TẮT ABI Applied Biosystems Association of Public Health Laboratories APHL (Tổ chức của các PTN trong hệ thống Y tế Cộng đồng) ATSH An Toàn Sinh Học DNA Deoxiribonucleic Acid Global Influenza Surveillance and Response System GISRS (Hệ thống phản ứng và giám sát cúm toàn cầu) IC50 Inhibition Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50% vi rút) IQR Interquartile Range (Khoảng liên tứ phân vị) International Society for Influenza and other Respiratory Virus Diseases – Antiviral Group (Hiệp hội quốc tế về ISIRV-AVG cúm và các vi rút gây bệnh đường hô hấp khác – Nhóm nghiên cứu thuốc kháng vi rút) Kb Kilobase NAI Neuraminidase Inhibition (Ức chế neuraminidase) National Institute of Infectious Diseases - Japan NIID (Viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia – Nhật Bản) PCR Polymerase Chain Reaction pdm Pandemic PTN Phòng Thí Nghiệm RNA Ribonucleic Acid RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction SOP Standard Operating Procedure (Quy trình chuẩn) TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới United States- Centers for Disease Control and Prevention US-CDC (Trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)
  9. ix DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1. Các phân đoạn gen của vi rút cúm A 6 3.1. Phân bố theo năm các phân típ virut cúm A sử dụng trong nghiên cứu 53 3.2. Giá trị trung bình của các phân típ cúm A thực hiện trong nghiên cứu và giá trị IC50 của các vi rút trong bộ chứng chuẩn 56 3.3. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 kháng oseltamivir năm 2008 và 2009 60 3.4. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 kháng oseltamivir năm 2009 và 2011 61 3.5. Giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 từ năm 2003 đến 2012 62 3.6. Giá trị IC50 của các chủng A/H5N1 năm 2005 và 2008 62 3.7. Kết quả phân loại mức độ giảm độ nhạy của vi rút cúm A với oseltamivir 64 3.8. Mức độ giảm nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir và các điểm đột biến 70 3.9. Tỉ lệ kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A trong nghiên cứu dựa trên hai phương pháp (ức chế neuraminidase và giải trình tự gen) 71
  10. x DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ Hình Tên hình Trang 1.1. Cấu trúc vi rút cúm 4 1.2. Hình ảnh vi rút cúm 4 1.3. Sự tham gia của các polymerase vào quá trình sao mã của vi rút cúm 10 1.4. Cấu trúc ribonucleoprotein của vi rút cúm 10 1.5. Cơ chế nhân lên của vi rút và cơ chế tác dụng của thuốc kháng vi rút 12 1.6. Cấu trúc và cơ chế tác dụng của amantadine và rimantadine 21 1.7. Cấu trúc của oseltamivir và zanamivir 22 1.8. Cơ chế hoạt động của neuraminidase và chất ức chế neuraminidase trong quá trình giải phóng vi-rút ra khỏi tế bào 23 2.1. Thang chỉ thị phân tử chuẩn 1 kb Invitrogen 50 3.1. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1 66 3.2. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1pdm09 67 3.3. Đột biến tại vị trí 117 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1 68 3.4. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1 69 3.5. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 74 3.6. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm A/H1N1 – nhóm 2, 2001-2009 75 3.7. Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 76 3.8. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm A/H1N1- nhóm 2, 2001-2009 77 3.9. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1pdm09 79 3.10. Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1pdm09 80 3.11. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 83
  11. xi 3.12. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 clade 1 84 3.13. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 clade 2.3.4 84 Sơ đồ Tên sơ đồ Trang 2.1. Quá trình phân lập vi rút cúm 43 2.2. Quá trình xác định giá trị ức chế 50% của oseltamivir với vi rút cúm 45 Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1. Sự phân bố giá trị IC50 của toàn bộ các chủng cúm A, 2001-2012 55 3.2. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 trong nghiên cứu 57 3.3. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 trong nghiên cứu 58 3.4. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 trong nghiên cứu 58 3.5. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng H5N1 trong nghiên cứu 59 4.1. Sự lưu hành vi rút cúm tại Việt Nam 2006 – 2012 86
  12. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh truyền nhiễm trong thế kỷ XX và những năm đầu của thế kỷ XXI vẫn đang là một thách thức lớn với các nhà khoa học trong ngành y học dự phòng ở Việt Nam. Nếu như trước đây, bệnh truyền nhiễm có nguyên nhân chủ yếu từ vi khuẩn thì hiện nay căn nguyên vi rút lại là nguyên nhân chính gây ra những vụ dịch nguy hiểm, đe dọa tới sức khoẻ cũng như tính mạng của con người. Các vụ dịch điển hình xảy ra gần đây như dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông năm 1998, dịch SARS năm 2003, dịch cúm A/H1N1 năm 2009, A/H7N9 năm 2013. Bệnh cúm tại Việt Nam, theo thống kê của viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương trong quá trình giám sát các ca nhiễm cúm phối hợp với trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ (US-CDC), số người mắc cúm có xu hướng tăng lên từ 19,1% năm 2007, lên 21% năm 2008, 26,1% năm 2009 (Hệ thống giám sát cúm Quốc gia-NISS), đặc biệt đã có những trường hợp tử vong do nhiễm cúm gia cầm có độc lực cao. Các phương pháp áp dụng trong điều trị và phòng chống nhiễm vi rút cúm là tiêm văc xin và sử dụng thuốc điều trị đặc hiệu. Tuy nhiên, văc xin cúm đang lưu hành là văc xin cúm theo mùa, chỉ phát huy tác dụng khi được tiêm trước vụ dịch cúm. Hơn nữa, muốn đạt hiệu quả cao, chủng cúm trong thành phần văc xin phải có sự tương đồng kháng nguyên với chủng cúm lưu hành. Ngoài ra, đáp ứng miễn dịch khi tiêm văc xin cúm còn phụ thuộc vào cơ địa của từng cá thể và loại văc xin sử dụng (văc xin cúm bất hoạt truyền thống, văc xin cúm bán phần (split vaccine) ). Do vậy, hiện tại sử dụng thuốc kháng vi rút đặc hiệu (amantadine, oseltamivir ) là phương pháp hữu hiệu trong điều trị và dự phòng nhiễm vi rút cúm, đặc biệt là vi rút cúm A/H5N1. Tuy nhiên, sự tương tác của thuốc với vi rút có thể gây ra thay đổi trong vật liệu di truyền của vi rút mà một trong những hệ quả là xuất hiện vi rút kháng thuốc ở thế hệ sau. Hiện tượng kháng thuốc có thể ảnh hưởng đến quá trình điều trị của bệnh nhân: thời gian điều trị kéo dài, khả năng hồi phục sau điều trị chậm và tăng khả năng lây truyền chủng vi rút cúm kháng thuốc ra cộng đồng, làm tăng thêm gánh nặng bệnh tật cho bản thân bệnh nhân và xã hội [28, 81, 90, 121]. Việc tìm hiểu khả năng kháng thuốc, mức độ tiến hoá của vi rút có ý nghĩa lớn cho việc điều chỉnh phác đồ điều trị, phối hợp thuốc, hạn chế ảnh hưởng và lan
  13. 2 truyền của hiện tượng kháng thuốc trong quần thể. Đặc tính kháng thuốc cũng như mức độ tiến hoá của vi rút đã được tiến hành tại nhiều phòng thí nghiệm (PTN) trên thế giới như Mỹ, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan Các nghiên cứu tập trung vào việc phát hiện, giám sát và theo dõi các trường hợp kháng thuốc đơn lẻ hoặc theo nhóm, tìm hiểu các đột biến trên gen có liên quan đến khả năng kháng thuốc của vi rút cúm trên người và trên gia cầm [8,11,12,26,51]. Số liệu từ các nước Châu Âu, Úc, Mỹ và các nước khu vực Đông Nam Á cho thấy vi rút A/H1N1 lưu hành trước năm 2007 có tỉ lệ kháng oseltamivir thấp (0,3-2,2%), từ 2007 đến 2009 tỉ lệ kháng tăng dần (23% năm 2007, 43-60% năm 2008 và 95% năm 2009) [27, 66, 110]; các vi rút A/H3N2 được xác định kháng hoàn toàn (100%) với amantadine. Tại Việt Nam, quá trình này đã được thực hiện bước đầu từ năm 2005 dựa trên chương trình Giám sát Cúm Quốc gia và đơn vị nghiên cứu lâm sàng trường đại học Oxford thuộc bệnh viện Bệnh nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh [18,36,37]. Tại phòng thí nghiệm Cúm - viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, những trường hợp nhiễm vi rút cúm có mang gen kháng thuốc đơn lẻ đã được xác định từ những năm 2001 [56, 58, 60]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi rút cúm kháng thuốc mới chỉ hoàn thành ở mức độ ca bệnh riêng lẻ hoặc theo dõi một chùm ca bệnh, chưa có nghiên cứu hệ thống theo dõi quá trình kháng thuốc và sự tiến hoá theo thời gian của chủng vi rút cúm A mang gen kháng thuốc. Để tìm hiểu hiện tượng kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm về sự lưu hành, tần suất, mức độ và khả năng lây truyền của vi rút cúm theo thời gian, cần có một nghiên cứu hệ thống trên cơ sở giám sát và xác định cơ chế kháng với từng loại thuốc của vi rút cúm A. Với những lý do trên, chúng tôi xây dựng đề tài nghiên cứu “Tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012” với mục tiêu: - Xác định nồng độ ngưỡng của oseltamivir có khả năng ức chế 50% (IC50) vi rút cúm A tại miền Bắc Việt Nam. - Xác định mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50).
  14. 3 - Đánh giá sự tương đồng về di truyền học giữa các vi rút cúm A giảm nhạy cảm với oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A trong khu vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012.
  15. 4 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 1.1. Vi rút cúm A 1.1.1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A Cấu tạo chung Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae gồm 3 típ A, B và C, trong đó típ A và B thường gây thành dịch, típ C gây bệnh nhẹ và không lan thành dịch. Hệ gen của vi rút cúm A là Axit Ribonucleic (RNA) đơn âm, chia 8 phân đoạn mã hoá cho 11 protein. Về mặt cấu trúc, nucleocapsid được bao bọc bởi Hình 1.1. Cấu trúc vi rút cúm màng protein nền (M1), phía ngoài Nguồn: màng lại được bao bọc bởi vỏ ngoài là lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào chủ. Protein M2 đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, tạo thành các kênh ion, làm cho pH trong endosome thay đổi, có vai trò quan trọng trong việc hình thành hạt Hình 1.2. Hình ảnh vi rút cúm vi rút mới. Trên phần vỏ có 2 loại Nguồn: www.nature.com glycoprotein xuyên màng là heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Heamagglutinin có cấu trúc hình trụ, được cấu tạo bởi hai phân tử riêng biệt HA1 và HA2 nối với nhau bằng cầu disulphua, các phân tử trên HA gắn vào màng lipid bằng đầu kỵ nước. Glycoprotein quan trọng thứ hai trên bề mặt vi rút cúm là neuraminidase (NA). Cấu trúc NA có dạng hình nấm, các phân tử NA ở phần thân gắn với lớp màng qua các đầu kỵ nước. Phần lõi của vi rút bao gồm các phức hợp
  16. 5 ribonucleoprotein: các polymerase protein PB1 (polymerase basic 1), PB2 (polymerase basic 2) và PA (polymerase acidic); NP (nucleoprotein). Nucleoprotein gắn với các đoạn RNA của vi rút tạo thành nucleocapsid. Tồn tại trong thành phần của vi rút cúm còn có các RNA-RNA polymerase PB1, PB2, PA và các protein không cấu trúc NS (non structure). Cấu trúc hệ gen và các protein tương ứng của vi rút cúm A Hệ gen của vi rút cúm A Vi rút cúm A có 8 phân đoạn gen, mã hóa cho 11 protein. Các gen của vi rút cúm được đánh số theo độ dài nucleotide giảm dần (Bảng 1). Đoạn RNA 1, 3, 4, 5 và 6 chỉ mã hóa cho một protein tương ứng là PB2, PA, HA, NP và NA. Mỗi phân đoạn 2, 7 và 8 mã hóa cho 2 protein tương ứng là PB1-PB1F2, M1-M2 và NS1- NS2. Tại hai đầu mỗi phân đoạn gen có trình tự nucleotide bảo tồn gồm 13 nucleotide ở đầu 5' (5'-AGUAGAAACAAGG) và 12 nucleotide ở đầu 3' (3'UCGUUUUCGUCC), trừ phân đoạn gen 1, 2, 3 và 7 nucleotide thứ 4 C thay cho U [47]. Trình tự nucleotide này đặc trưng riêng cho vi rút cúm mà không tồn tại ở các vi rút các, có ý nghĩa lớn trong việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích trình tự gen của vi rút. Cấu trúc và chức năng của các protein của vi rút Heamagglutinin (HA): Heamagglutinin là protein trên bề mặt của vi rút được mã hóa bởi đoạn RNA số 4, có chức năng bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ và khởi đầu sự xâm nhập của vi rút cúm vào cơ thể. Protein HA được tổng hợp ở dạng tiền thân là một chuỗi polypeptide HA0. Dưới điều kiện pH axit và các enzyme phân tách protein dạng trypsin và furin, HA0 phân tách ra hai phần: HA1 và HA2, kết với nhau qua cầu nối di-sulphua [19]. Phần đầu chỏm của HA1 tại các vị trí xác định (106, 203, 222) có khả năng gắn với thụ thể axit sialic trên màng tế bào cảm nhiễm.
  17. 6 Bảng 1.1. Các phân đoạn gen của vi rút cúm A Chiều dài Protein Chiều dài protein Đoạn đoạn gen được mã được mã hóa Chức năng RNA (Nucleotide) hóa (Axit amin) 1 2341 PB2 759 Polymerase khởi đầu phiên mã Kéo dài phiên mã, hoạt hóa PB1 757 enzyme nội bào 2 2341 Thúc đẩy quá trình chết của tế PB1-F2 87 bào chủ 3 2233 PA 716 Kéo dài phiên mã Ngưng kết hồng cầu, bám gắn 4 1778 HA 550 xâm nhập vào tế bào chủ Bám gắn với RNA, điều khiển 5 1565 NP 498 quá trình nhân lên của vi rút. Giải phóng vi rút khỏi tế bảo 6 1413 NA 454 chủ Protein nền: Thành phần chính M1 252 của vi rút. 7 1027 Kênh ion, cởi áo và lắp ráp M2 97 thành phần vi rút Protein đối kháng interferon, NS1 230 điều khiển dấu ấn của vi rút trên tế bào chủ 8 890 Chuyển RNA vi rút từ nhân ra NS2 121 tế bào chất (trong tế bào chủ)
  18. 7 Trên bề mặt tế bào biểu mô đường hô hấp của người, HA gắn vào thụ thể α2,6 axit sialic; đối với gia cầm, HA gắn vào thụ thể α2,3 axit sialic; trên tế bào của lợn có mang cả hai loại thụ thể α2,3 axit sialic và α2,6 axit sialic. Ngoài ra, HA gắn vào thụ thể trên bề mặt tế bào hồng cầu người nhóm máu O, hồng cầu chuột lang, hồng cầu ngỗng, hoặc gà tây gây nên hiện tượng ngưng kết hồng cầu [118]. Năm vị trí quyết định kháng nguyên khác cũng đã được xác định trên protein HA1, tương tác với kháng thể của vật chủ. Các thay đổi có liên quan đến thay đổi đặc tính kháng nguyên xảy ra chủ yếu trên phần HA1, do vậy, HA1 được sử dụng để tìm hiểu đặc tính kháng nguyên và tiến hóa của vi rút. Neuraminidase (NA): Protein bề mặt thứ hai có chức năng là một enzyme, neuraminidase, được mã hóa bởi phân đoạn gen thứ 6. Neuraminidase sau khi được phiên mã, protein có dạng hình nấm bao gồm 4 chuỗi polypeptide. NA xúc tác cho quá trình cắt đứt mối liên kết α2,3 hoặc α2,6 ketosidic phá hủy thụ thể HA trên bề mặt tế bào, tạo điều kiện cho sự giải phóng vi rút mới ra khỏi tế bào chủ. Việc loại bỏ phần axit sialic khỏi phần HA mới được tổng hợp còn có tác dụng tránh sự tự ngưng kết giữa các hạt vi rút mới sau khi được giải phóng ra khỏi tế bào, đảm bảo vi rút mới sau khi được giải phóng có khả năng gây nhiễm. Neuraminidase cũng đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi rút cúm. Sự hoạt động của neuraminidase làm tăng hoạt động của các cytokine, thúc đẩy nhanh quá trình chết của tế bào chủ. Ngoài ra, các nhà khoa học đã chứng minh được vi khuẩn gây nhiễm trùng thứ phát như viêm phổi đặc biệt nguy hiểm cho các bệnh nhân có bệnh mạn tính, trẻ nhỏ, người già và phụ nữ có thai, có quan hệ chặt chẽ với những hoạt động của neuraminidase như nhiễm Streptococcus pneumonia, có thể làm quá trình viêm nhiễm đường hô hấp trầm trọng hơn [122]. Vi rút cúm A được chia thành các phân típ dựa trên hai kháng nguyên bề mặt heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) của vi rút. Sử dụng HA để xác định phân nhóm của vi rút cúm A, các nhà khoa học đã xác định được 17 loại hemagglutinin khác nhau, trong đó H17 được xác định từ vi rút phân lập từ dơi
  19. 8 [105]. Các phân típ NA chủ yếu gây bệnh trên người là N1 (H1N1, H5N1, H1N1 đại dịch), N2 (H3N2, H9N2) và gần đây là N9 (H7N9). Dựa vào sự khác nhau về axit amin tại vùng đầu phía ngoài, neuraminidase của vi rút cúm được chia làm 2 nhóm riêng biệt [109]: Nhóm 1 gồm N1, N4, N5 và N8 Nhóm 2 gồm N2, N3, N6, N7 và N9. Sự thay đổi axit amin tại vị trí 147-152 đã tạo nên vùng khác biệt về hình khối nằm ngay cạnh vị trí hoạt động của N1 mà không xảy ra trên N2. Vùng khác biệt này có thể được coi là vùng đích của thuốc kháng vi rút trong tương lai. Thuốc kháng vi rút oseltaminvir, zanamivir gắn vào NA, ức chế khả năng giải phóng của vi rút cúm dựa trên hiểu biết về hoạt động của neuraminidase, xúc tác quá trình cắt đứt mối liên kết α2,3 hoặc α2,6 ketosidic giữa axit sialic và thụ thể HA. Tuy nhiên, các đột biến về axit amin trên phân đoạn gen mã hóa NA tại các vị trí bám gắn với thuốc là nguyên nhân của sự kháng thuốc của vi rút, cụ thể với N1 tại vị trí I117V, I222K, S246N, H275Y và N294S; với N2 tại các vị trí E119V, Q136K, R292K và N294S. Protein màng (M-matrix): Đoạn RNA số 7 được coi là gen có tính bảo tồn cao, mã hóa cho hai protein M1 và M2. Protein M1 được mã hóa từ nucleotide vị tí 26 đến 784, protein M2 được tổng hợp qua quá trình ghép nối từ nucleotide vị trí 26- 51 và từ 740-1007 [19, 65]. Protein M1 là protein nền (matrix) nằm ngay dưới lớp vỏ của vi rút, làm cầu nối giữa các thành phần bên trong và các protein bề mặt của vi rút, có vai trò quan trọng trong việc lắp ráp các thành phần để tạo nên hạt vi rút, tạo điều kiện cho vi rút nảy chồi. M2 là một protein xuyên màng, phần ngoài tương tác với hệ miễn dịch của vật chủ [54] và phần xuyên màng hoạt động như một kênh ion có trách nhiệm bơm ion H+ từ nội bào vào trong vi rút, phá vỡ mối liên kết protein-protein trên protein nền M1 với RNP, giải phóng các RNP của vi rút vào trong nội bào của tế bào cảm nhiễm [3] [22, 56, 57].
  20. 9 Amantadine gắn vào kênh ion xuyên màng, ngăn chăn sự “cởi áo” này. Tuy nhiên, những thay đổi axit amin tại vị trí bám gắn 26, 27, 30, 31 và 34 trên kênh ion với amantadine đã tạo ra sự kháng thuốc của vi rút (vị trí gắn kết V27A Valin chuyển sang Alanin, A30T Alanin sang Threonin, S31N Serin sang Asparagin và G34E Glycin sang Axit Glutamic), trong đó vị trí 31 chuyển từ Serin sang Asparagin là vị trí có tần suất xuất hiện nhiều [47, 52]. Hiện tượng kháng amantadine xảy ra phổ biến trên gen M của vi rút cúm A/H3N2, ít gặp ở các chủng cúm A/H1N1, tuy nhiên khi chủng cúm A/H1N1pdm09 xuất hiện thì hầu hết gen M, do hiện tượng trao đổi và tích hợp gen, mang gen M của chủng vi rút cúm lợn Á Âu có đột biến kháng thuốc amantadine tại vị trí 31 (S31N) [18, 53]. Các polymerase PB1, PB2 và PA: Tồn tại trong hệ gen của vi rút cúm có các phân đoạn gen 1, 2 và 3 chịu trách nhiệm tạo ra các RNA-RNA polymerase. Phức hợp PA-PB1-PB2 ở trong nhân tế bào cảm nhiễm có nhiệm vụ khởi đầu và kích hoạt quá trình tổng hợp mRNA của vi rút [15] (hình 1.3 và hình 1.4). Trong quá trình hoạt động của vi rút cúm, đột biến xảy ra trên phân đoạn gen mã hóa PB2 có liên quan đến khả năng thích nghi của vi rút [56, 99], đặc biệt với vi rút cúm gia cầm H5N1. Đột biến E627K (Glutamin chuyển thành Lysin) trên PB2 của vi rút cúm gia cầm làm tăng khả năng thích nghi với điều kiện sống của vi rút trên vật chủ mới - người (vi rút tồn tại và nhân lên trên gia cầm tại nhiết độ tối ưu là 37oC, khi mang gen đột biến, vi rút có khả năng thích nghi và phát triển được trên tế bào đường hô hấp trên của người – với nhiệt độ tối ưu là 33oC) [99]. Đột biến này đã được xác định trên gen PB2 của chủng cúm gia cầm mới xuất hiện A/H7N9 [62, 63]. Một protein có kích thước nhỏ PB1-F2 (87 axit amin) có chức năng thúc đẩy quá trình chết của tế bào chủ mà không tìm thấy dạng tương tự trong hệ gen của vi rút cúm B và C [65, 122]. Nucleoprotein (NP): NP được mã hóa bởi phân đoạn thứ 5 trong bộ gen của vi rút cúm có tính bảo tồn cao đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên, tạo thành hạt vi rút mới [43]. Chức năng chủ yếu của NP là tham gia vào quá trình tổng hợp RNA của vi rút và quá trình tạo thành hạt vi rút mới. Ngoài ra, NP tương tác
  21. 10 với và các protein PB1 và PB2 nhưng không xảy ra với protein PA [85]. Các enzyme này khi hoạt hóa sẽ tham gia vào quá trình nhân lên và phiên mã RNA của vi rút cúm đồng thời hoạt động như một nuclease nội bào có liên hệ với ribonucleoprotein (RNP). Hình 1.3. Sự tham gia của các polymerase vào quá trình sao mã của vi rút cúm Nguồn: Hình 1.4. Cấu trúc ribonucleoprotein của vi rút cúm Nguồn: Paul Digard, Dept. Pathology, University of Cambridge. Protein không cấu trúc (NS1-NS2): NS1 và NS2 được mã hóa bởi đoạn RNA số 8. Phần NS1 có chức năng cản trở sự di chuyển của mRNA tế bào từ nhân ra tế bào chất tạo điều kiện cho RNA của vi rút được phiên mã ở ribosome của tế bào chủ. Ngoài ra, NS1 còn được cho là tham gia vào ức chế quá trình sản xuất interferon, chất có khả năng làm giảm sự nhân lên của vi rút cúm, của tế bào chủ. Phần NS2 của protein không cấu trúc này được tổng hợp sau NS1 và được biết với chức năng tạo thuận lợi cho việc vận chuyển các RNP mới được tổng hợp từ nhân ra tế bào chất tăng cường cho quá trình nhân lên của vi rút [43, 118, 122].
  22. 11 1.1.2. Cơ chế nhân lên của vi rút cúm A Sự bám dính của vi rút Vi rút cúm bám vào tế bào biểu mô đường hô hấp bằng cách dùng heamagglutinin gắn vào phần axit sialic của glucoprotein và glucolipid trên bề mặt tế bào. Tùy vào tế bào chủ là tế bào biểu mô đường hô hấp của người hay gia cầm mà vi rút cúm có thể sử dụng phần α2,3 hay α2,6 axit sialic trong protein HA để bám dính vào thụ cảm thể của tế bào chủ. Ngay khi quá trình bám dính hoàn thành, vi rút tiếp tục ngay quá trình thâm nhập vào tế bào chủ. Sự thâm nhập của vi rút Vi rút tiến vào tế bào chủ bằng quá trình thực bào, toàn bộ vi rút được bao bọc bởi màng tế bào chủ và đưa vào trong tế bào chất của tế bào chủ qua thể thực bào trong điều kiện pH thấp. Sự cởi áo của vi rút Sự hoạt động của protein M2 chấm dứt tình trạng pH thấp trong thể thực bào, đồng thời làm tăng cường sự hòa màng từng phần của protein HA trên màng sinh chất với màng của thể thực bào. Dòng ion từ nội bào tràn vào hạt vi rút dẫn đến sự mất liên kết giữa các protein của vi rút, khiến cho các RNP vi rút thoát khỏi sự kiểm soát của vỏ vi rút (vi rút cởi áo). Khi quá trình hòa màng đã hoàn thành, các RNP được giải phóng vào tế bào chất của tế bào chủ. Sự tổng hợp RNA, các protein và sự giải phóng của vi rút Khác với các vi rút mang RNA sợi đơn âm, RNA của vi rút cúm được tổng hợp và nhân lên tại nhân tế bào. Các RNP được chuyển vào nhân tế bào, phức hợp polymerase gắn vào RNA của vi rút, đồng thời cắt mRNA của tế bào chủ bằng hoạt động của nuclease nội bào. Nuclease nội bào của vi rút cắt đầu 5’ đã được gắn mũ và metyl hóa của mRNA của tế bào chủ với độ dài khoảng 13 đến 15 ba-zơ và dùng đoạn này làm mồi để tổng hợp mRNA của vi rút. Enzyme RNA polymerase của vi
  23. 12 rút thực hiện quá trình tổng hợp sợi mRNA bổ sung với RNA đơn âm. Phần intron (vùng câm) của mRNA vi rút bị cắt bởi các enzyme của tế bào để các protein M1 hay NS1 được tổng hợp mà không cần thêm một sự phân cắt nào. Một số protein mới được tổng hợp quay trở lại nhân tế bào gắn vào RNA để hình thành RNP. Các protein còn lại di chuyển tới lưới nội bào và thể Golgi thực hiện quá trình glucosyl hóa sau đó tiếp tục tới màng tế bào và gắn vào lớp lipid kép của màng. Khi quá trình gắn của các protein vào màng hoàn chỉnh, các RNP và M1 liên kết các thành phần lại để tạo nên hạt vi rút. Cuối cùng, hạt vi rút nảy chồi ra phía ngoài màng tế bào chủ rồi được tách ra khỏi tế bào nhờ hoạt động của neuraminidase (Hình 1.5). Hình 1.5. Cơ chế nhân lên của vi rút và cơ chế tác dụng của thuốc kháng vi rút Nguồn: Nature Review – Drug Discovery
  24. 13 1.1.3. Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A Những thay đổi nhỏ trên gen Polymerase của vi rút cúm và các vi rút mang RNA nói chung không có chức năng sửa chữa sai sót trong quá trình kéo dài chuỗi sau mỗi lần nhân lên (khoảng một lỗi sai sau mỗi lần nhân lên) và đã tạo ra các biến đổi trong RNA thế hệ mới. Những biến đổi này xuất hiện một cách tự nhiên trên các phân đoạn gen của vi rút cúm nhưng chỉ làm xuất hiện những thay đổi nhỏ về đặc tính kháng nguyên của vi rút. Những biến đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA và NA thường được quan tâm hơn bởi những tác động của chúng lên tính lây nhiễm của vi rút cúm thế hệ mới trong quy trình gây dịch tại các năm tiếp theo, ước tính khoảng một phần trăm khác biệt trong số axit amin của HA và NA xuất hiện trong mỗi mùa dịch [6, 43, 70]. Những biến đổi nhỏ này xảy ra còn liên quan đến sự né tránh miễn dịch của vi rút cúm với kháng thể đã được tạo ra bởi những lần nhiễm trước đó, vì vậy, các vi rút mang những biến đổi này có thể là nguyên nhân gây nên những vụ dịch cúm hàng năm. Những thay đổi nhỏ xảy ra trên protein bề mặt HA và NA được ghi nhận thường xuyên nhưng lại hiếm khi với các nucleoprotein [52]. *Những thay đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA Protein HA đóng vai trò quan trọng trong biểu hiện kháng nguyên của vi rút cúm. Vùng đầu chỏm của protein HA mang 5 vùng quyết định kháng nguyên, mỗi sự thay đổi trong những vùng này cũng có ảnh hưởng nhất định đến đặc tính kháng nguyên của vi rút [51, 94]. Protein HA của vi rút A/H3N2 có sự thay đổi sau mỗi 3 năm. Tuy nhiên, đáp ứng miễn dịch chéo giữa vi rút H3N2 lưu hành nổi trội với vi rút H3N2 lưu hành trước đó vẫn xảy ra [97]. Điều này chứng tỏ sự thay đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA chưa tạo ra được sự né tránh miễn dịch toàn bộ của vi rút cúm cho dù tần suất thay đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút A/H3N2 diễn ra nhanh (3 năm), những chủng H3N2 mới vẫn chịu ảnh hưởng của miễn dịch tồn lưu được tạo ra bởi vi rút lưu hành những năm trước đó.
  25. 14 *Những thay đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa NA Cũng giống protein HA, protein NA cũng có những thay đổi nhỏ xảy ra trong quá trình hoạt động. Các nghiên cứu đã chỉ ra sự thay đổi của axit amin xảy ra trên bề mặt của protein NA, nơi có các điểm gắn với axit sialic (vị trí 222, 329 và 344 trên gen N2) [92, 118]. Tương tự kháng nguyên bề mặt HA, kháng nguyên NA cũng có khả năng tạo kháng thể có tính bảo vệ. Các đột biến, thay đổi trên protein NA (đặc biệt tại khu vực bảo tồn) ảnh hưởng đến tính kháng nguyên của NA trong quá trình đáp ứng miễn dịch, vi rút cúm thay đổi để "tránh né" ảnh hưởng của kháng thể kháng NA, tạo nên một dòng kháng thể mới khác biệt so với dòng kháng thể thu được trước đây khi chưa xuất hiện đột biến [92]. Tuy nhiên, chỉ miễn dịch thu được khi tác dụng với phần bảo tồn của NA mới mang tính bảo vệ. *Những thay đổi nhỏ trên gen M Tìm hiểu về tiến hóa của gen M cho thấy M1 có sự thay đổi axit amin ở mức 26,4% và M2 có sự thay đổi 48,5% axit amin. Sự khác biệt này là do gen M2 chịu áp lực chọn lọc của kháng thể bảo vệ cao hơn M1. Tuy nhiên, sự thay đổi nhiều trên gen M2 chỉ quan sát thấy trên các vi rút cúm người và cúm lợn, hầu như không xảy ra với các chủng cúm gia cầm. Quan sát gen M1, hầu hết các thay đổi trên gen đều không dẫn đến thay đổi axit amin, ngoài ra, so sánh tần suất đột biến theo năm trên M1 và M2 và các gen còn lại của vi rút cho thấy tần suất này thấp hơn tần suất đột biến của gen còn lại, do vậy có thể coi gen M là gen có tính bảo tồn cao [29]. Những thay đổi lớn trên gen liên quan đến sự thay đổi về mặt kháng nguyên Những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm so sánh các vi rút phân lập được từ những vụ dịch những năm 1918, 1947-1956, 1957-1967, 1968 cho thấy những vụ dịch này cùng có một nguyên nhân là cúm A phân típ H1N1 nhưng có sự biến đổi lớn về mặt di truyền học và đặc tính kháng nguyên (không có hoặc có kết quả phản ứng chéo với hiệu giá không cao khi thực hiện phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu giữa vi rút mới xuất hiện và các kháng thể tồn lưu tạo ra bởi các phân típ vi rút cũ).
  26. 15 Như vậy, tuy cùng mang tên một phân típ vi rút (H1N1) nhưng bản chất vi rút đã có sự thay đổi hoàn toàn, vì vậy các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu sẽ không cho kết quả đáp ứng chéo bảo vệ giữa các phân típ vi rút cùng tên đã biết. Hậu quả của sự xuất hiện vi rút mới mà không có kháng thể tồn lưu có khả năng chống lại trong quần thể, sẽ là nguyên nhân một đại dịch lan rộng trên toàn thế giới (đại dịch cúm 1918, 1977, 2009 với vi rút cúm A phân típ H1N1) [51, 70, 97, 98]. Việc xuất hiện các biến đổi lớn dẫn đến sự thay đổi hoàn toàn đặc tính kháng nguyên trên cả hai phân đoạn gen mã hóa HA và NA của vi rút cúm được giải thích bằng giả thuyết của sự trao đổi và tích hợp giữa các phân típ vi rút khác nhau. 1.1.4. Sự trao đổi và tích hợp trong hệ gen của vi rút cúm A Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, với hệ gen phân đoạn như vậy, sự tái sắp xếp của vật liệu di truyền giữa các chủng vi rút cúm có khả năng xảy ra khi có sự đồng nhiễm hai hay nhiều vi rút cúm A phân típ khác nhau trên một vật chủ. Kết quả là sự tạo ra một loại vi rút mới có hệ gen là sự trộn và sắp xếp lại các phân đoạn gen của các vi rút cúm đồng nhiễm. Trên thực tế, khi phân tích gia hệ chủng vi rút cúm A/H1N1 lưu hành từ năm 1918 đến nay thấy rằng vi rút đã trải qua nhiều lần trao đổi và tích hợp gen của từng phân đoạn gen. Phân đoạn gen mã hóa PB1, NA và M xuất hiện từ đầu những 1940 vẫn lưu hành trong các vi rút của năm 1947, đặc biệt phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút gây dịch năm 1947 hoàn toàn khác so với HA của các chủng vi rút lưu hành năm 1943-1945 [12, 30, 33]. Năm 2009, chủng H1N1 gây đại dịch có sự trao đổi và tích hợp giữa vi rút cúm người, cúm gia cầm và cúm lợn, trong đó các phân đoạn gen mã hóa HA, NP, NS được tích hợp từ chủng cúm lợn, NA, M từ chủng vi rút cúm lợn Á Âu, đặc biệt PA và PB2 là 2 gen có mức trao đổi tích hợp cấp ba (2 gen này là sự trao đổi của cả 3 chủng vi rút cúm từ người, gia cầm và lợn) [5, 27]. Chủng vi rút cúm này mang bộ gen có sự trao đổi vào tích hợp với bộ gen có nguồn gốc từ vi rút gây bệnh cho người nên chủng vi rút mới hoàn toàn có khả năng nhân lên tại các tế bào biểu mô đường hô hấp ở người và dễ dàng lan truyền trong quân thể người với phạm vi lớn. Tuy nhiên, các protein bề mặt của
  27. 16 vi rút mới khác biệt hoàn toàn với các chủng vi rút cúm gây bệnh cho người lưu hành trước đó và vật chủ không được bảo vệ bởi các kháng thể tồn lưu. Vi rút cúm mới xuất hiện H7N9 cũng mang hệ gen có sự trao đổi và tích hợp cao, trong đó phân đoạn gen mã hóa HA tương tự gen H7 của gia cầm, phân đoạn gen mã hóa NA tương tự N9 của vi rút A/H11N9, các gen còn lại tương tự vi rút A/H9N2 [63]. Ngoài ra, qua sự trao đổi và tích hợp này, vi rút cúm mới có thể mang gen kháng thuốc từ chủng vi rút cúm khác, điển hình là gen M mang đột biến kháng amantadine của vi rút H1N1pdm09 và phân đoạn gen mã hóa NA mang đột biến kháng oseltamivir của vi rút H7N9 [30, 63]. Như vậy, chủng vi rút mới sẽ có thể là căn nguyên của đại dịch lan rộng toàn cầu, đe doạ sự an toàn của các quốc gia và sức khoẻ của người dân trên toàn thế giới [33, 34]. 1.1.5. Khả năng gây bệnh của vi rút cúm Cúm là một bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do vi rút cúm gây ra. Đường lây truyền chủ yếu của vi rút cúm có thể qua giọt nước bọt nhỏ mang vi rút tung ra khi người bệnh tiếp xúc trực tiếp với người lành. Thời gian ủ bệnh trung bình là 2 ngày, thường kéo dài từ 1 đến 4 ngày [43], sau đó bệnh nhân biểu hiện các triệu chứng như: sốt, mệt mỏi, đau mỏi cơ chủ yếu vùng lưng và các triệu chứng chảy mũi, chảy nước mắt . Bệnh nhân có thể hết sốt sau 5 đến 7 ngày kèm theo mệt mỏi và ho, sau khoảng 10 ngày thì hồi phục nếu không có biến chứng bội nhiễm [4]. Từ đầu thế kỷ XX đến nay, thế giới ghi nhận 4 đại dịch cúm, khởi đầu tại Tây Ban Nha năm 1918-1919 do vi rút cúm A/H1N1 gây nên là một trong những dịch cúm gây tỉ lệ tử vong cao, ước tính có khoảng 40 triệu người đã chết do nhiễm cúm [43]. Dịch cúm châu Á năm 1957-1958 có nguồn gốc từ Singapore do vi rút cúm A/H2N2 gây nên với khoảng 69.800 trường hợp tử vong. Dịch cúm xảy ra năm 1968-1969 tại Hồng Kông do vi rút cúm A/H3N2 gây nên [84]. Dịch cúm A/H1N1pdm09 xảy ra năm 2009 khởi đầu tại Mexico, sau đó nhanh chóng lan sang Hoa Kỳ, Canada, châu Âu và châu Á. Cuối tháng 5 năm 2009, Việt Nam ghi nhận
  28. 17 ca mắc cúm A/H1N1 đại dịch đầu tiên. Số ca mắc bệnh tăng nhanh, đến tháng 12 năm 2009 đã có hơn mười nghìn mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm cúm A/H1N1pdm09 được gửi đến PTN cúm, viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương [2]. Dịch cúm gia cầm đầu tiên xuất hiện tại Hồng Kong 1997-2002 gây ra bởi vi rút cúm A phân típ H5N1. Vi rút lây từ gia cầm sang người, tử vong 6/18 trường hợp mắc [95]. Năm 2003, dịch cúm gia cầm đã xuất hiện tại Việt Nam, tính đến nay đã có 125 trường hợp được khẳng định nhiễm cúm A/H5N1, có 62 trường hợp tử vong [115]. Tháng 3 năm 2013, tổ chức Y tế Thế (TCYTTG) giới nhận được thông báo các trường hợp nhiễm cúm A/H7N9 đầu tiên tại Trung Quốc, vi rút được xác định lây từ gia cầm sang người với tổng số người nhiễm là 133 và số tử vong là 34 [116]. Dựa vào các số liệu giám sát tại phòng thí nghiệm từ năm 2001 và chương trình giám sát cúm quốc gia tại Việt Nam (viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương phối hợp với US-CDC từ năm 2006), bệnh cúm ở Việt Nam xuất hiện quanh năm, có hai đỉnh rõ rệt vào mùa đông xuân với sự lưu hành của vi rút cúm B (tháng 2 – tháng 3) và mùa hạ với sự lưu hành của các chủng thuộc phân típ cúm A (tháng 7 – tháng 8) [5]. 1.1.6. Tiến hóa của vi rút cúm A Sự tiến hóa của vi rút cúm được ghi nhận đầu tiên là sự tiến hóa về di truyền học với những thay đổi nhỏ, thay đổi lớn trên gen. Những thay đổi nhỏ xảy ra thường xuyên có thể không tạo sự thay đổi về kháng nguyên nhưng tạo nên sự đa dạng trong kiểu gen của các chủng vi rút cúm. Những thay đổi lớn gây ảnh hưởng đến tính kháng nguyên, tuy xảy ra với tần suất thấp, nhưng là sự thay đổi quan trọng trong tiến hóa của vi rút cúm. Điểm đặc trưng trong tiến hóa của vi rút cúm là sự trao đổi và tích hợp các phân đoạn gen để tạo ra phân típ vi rút cúm mới. Hiệu ứng của sự tiến hóa này là sự thay đổi đặc tính kháng nguyên, sự thay đổi vật chủ, sự tăng độc lực, tăng khả năng lây truyền, kháng thuốc . Sự tiến hóa của vi rút cúm A được khẳng định là sự tiến hóa thích nghi, chỉ xảy ra rải rác trong quần thể vi rút cúm, dưới ảnh hưởng của một số hiện tượng như:
  29. 18 cùng đồng nhiễm trên một vật chủ, hoặc xuất hiện của một biến thể vi rút từ nơi khác [83]. Hai phân đoạn gen mã hóa cho glycoprotein bề mặt HA và NA chịu áp lực lớn từ khả năng trung hòa của kháng thể sinh ra trong quá trình nhiễm bệnh. Các phân đoạn gen còn lại tuy không chịu áp lực chọn lọc từ đáp ứng miễn dịch nhưng lại được cho rằng chúng đã phải trải qua quá trình chọn lọc để thích nghi với từng loài vật chủ trong đó điển hình là phân đoạn gen mã hóa PB2 [57]. Tác động của con người lên sự tiến hóa của vi rút cúm A chưa được đánh giá một cách rõ ràng nhưng những hoạt động như sử dụng gia cầm, tiêm văc xin hay sử dụng thuốc kháng vi rút cũng có khả năng ảnh hưởng đến sự tiến hóa. Ngoài ra, với việc sử dụng thuốc kháng vi rút, hiện tượng kháng thuốc đã xuất hiện, như vậy, vi rút đã bắt đầu thay đổi để thích nghi với môi trường và những thay đổi này sẽ là những bước tiến hóa tiếp theo của vi rút cúm. 1.2. Phòng và điều trị vi rút cúm A 1.2.1. Văc xin phòng cúm Văc xin phòng bệnh cúm bắt đầu được áp dụng từ năm 1945 với mục tiêu giảm tỉ lệ mắc cúm, giảm gánh nặng bệnh tật do vi rút cúm gây nên. Các loại văc xin đưa vào sử dụng được sản xuất trên trứng gà có phôi với kháng nguyên gồm hai chủng A (một chủng A/H3N2 và một chủng A/H1N1pdm09) và một chủng cúm B, được lựa chọn từ hơn 100 trung tâm cúm quốc gia từ hơn 80 quốc gia trên thế giới. Sự lựa chọn các chủng vi rút được TCYTTG thực hiện vào tháng Hai hàng năm với các nước ở Bắc Bán cầu, tháng Chín hàng năm với các nước ở Nam Bán cầu [117]. Để đạt được hiệu quả trong phòng bệnh, văc xin phải được tiêm chủng trong cộng đồng hàng năm, do khả năng biến đổi nhanh của vi rút trên phân đoạn gen mã hóa HA và NA. Tuy nhiên, tại Việt Nam, văc xin phòng cúm chưa được sử dụng rộng rãi trong toàn bộ quần thể dân cư, do đó hiệu quả phòng bệnh còn hạn chế.
  30. 19 Các loại văc xin Văc xin bất hoạt Loại văc xin này được sản xuất từ các chủng vi rút nuôi trong túi niệu của trứng gà có phôi sau đó bị bất hoạt bởi formandehyde hoặc β-propiolacton rồi tinh sạch bằng siêu ly tâm. Loại văc xin này bao gồm văc xin toàn phần và văc xin bán phần. Văc xin toàn phần an toàn và có khả năng dung nạp tốt với hiệu lực bảo vệ ở người lớn và trẻ em là 60-90%. Văc xin bán phần chỉ gồm hai thành phần là protein HA và NA, các thành phần khác của vi rút đã được loại bỏ. Loại văc xin này gây ít phản ứng phụ tuy nhiên có ý kiến cho rằng văc xin kém hiệu quả trong trường hợp có sự lưu hành của chủng vi rút mới [50]. Văc xin sống giảm độc Văc xin này được áp dụng nhằm mục đích tăng cường đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tại chỗ (tại đường hô hấp) của cơ thể đối với vi rút cúm. Khác với văc xin bất hoạt, thành phần của văc xin sống giảm độc là các chủng vi rút được thích ứng ở điều kiện nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ cơ thể (25oC) để khi được đưa vào qua đường mũi với nhiệt độ cơ thể các vi rút sẽ bị bất hoạt nhằm kích thích sinh kháng thể ngay tại đường hô hấp trên và đường hô hấp dưới đồng thời cũng tăng cường đáp ứng miễn dịch tế bào. Loại văc xin này đã được đưa vào sử dụng tại Mỹ vào năm 2003 và những năm trước đây tại Liên Xô cũ với độ an toàn khá cao [50]. Các loại văc xin thế hệ mới Việc sản xuất văc xin có thành phần là các vi rút cúm được nuôi cấy trên tế bào MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) hoặc tế bào Vero có khả năng thay thế văc xin sản xuất trên trứng gà có phôi đang được các nhà sản xuất văc xin quan tâm không chỉ vì khả năng tăng năng suất mà còn bởi tác dụng phụ của loại văc xin này được hi vọng là thấp hơn loại văc xin đang sử dụng hiện tại.
  31. 20 Văc xin được sản xuất dựa trên ứng dụng công nghệ gen (văc xin sử dụng công nghệ di truyền ngược, văc xin DNA, văc xin protein) cũng đang được nghiên cứu với hi vọng được áp dụng rộng rãi trong tương lai. Văc xin được sản xuất dựa trên sự thay đổi về cấu trúc gen của vi rút làm giảm khả năng nhân lên (gen M2 và NS2 bị loại bỏ) và mất khả năng tổng hợp chất ức chế interferon của tế bào (loại bỏ gen NS1) có khả năng gây đáp ứng miễn dịch, không theo quy trình sản xuất văc xin hiện tại [50]. 1.2.2. Thuốc điều trị vi rút cúm A Các thuốc kháng vi rút dòng ức chế sự xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm Amantadine và rimantadine là các dẫn chất của adamantane, được sử dụng từ những năm 60 của thế kỷ trước (Hình 1.6). Cơ chế tác dụng của các chất này là ức chế kênh trao đổi ion M2 xuyên màng của vi rút cúm A, ion H+ không thể đi vào bên trong vi rút, pH trong vi rút không thay đổi, hạn chế quá trình hòa màng của vi rút với tế bào chủ , ngăn cản quá trình vi rút "cởi áo" để xâm nhập vào bên trong tế bào chủ (Hình 1.6). Amatadine có hiệu quả điều trị chống lại tất cả các phân típ cúm A gây bệnh cho người trước đây (H1N1, H2N2, H3N2) nhưng không chống lại được vi rút cúm B do protein M2 chỉ có ở vi rút cúm A [31]. Hiện tượng kháng thuốc thường xảy ra với các chủng cúm A/H3N2 do xuất hiện các điểm đột biến trên gen M (phần M2) dẫn đến thay đổi các axit amin tại năm vị trí 26, 27, 30, 31 và 34, làm thay đổi vị trí tương tác của amantadine với M2. Trong đó, vị trí 31 thay đổi từ Serin (Ser-S) sang Arginine (Asn-N) là vị trí thường gặp ở các chủng vi rút trong các nghiên cứu trên thế giới [9, 42, 89].
  32. 21 Hình 1.6. Cấu trúc và cơ chế tác dụng của amantadine và rimantadine (Nguồn: và Drugs discovery approaches – Wiley 2007) Các thuốc kháng vi rút dòng ức chế neuraminidase Oseltamivir và zanamivir là hai chất ức chế chọn lọc trên enzyme bề mặt neuraminidase của vi rút cúm (Hình 1.7). Neuraminidase phân cắt axit sialic trên bề mặt tế bào chủ khỏi glycoprotein HA của hạt vi rút mới nảy chồi tại cầu nối đặc hiệu α 2,3Gal-sialic hoặc α2,6 Gal-sialic. Do vậy, neuraminidase giúp giải phóng hạt vi rút, tạo điều kiện cho hạt vi rút mới có khả năng xâm nhập vào tế bào biểu mô khác, tăng cường sự phát tán của vi rút. Ức chế quá trình này, vi rút chỉ có khả năng nhiễm và nhân lên trong tế bào nhiễm nhưng không thể phát tán xâm nhập các tế bào lành khác, ngăn chặn khả năng gây bệnh của vi rút (Hình 1.8). Neuraminidase là enzyme trên bề mặt vi rút có tính chất khá bảo tồn ở các chủng vi rút cúm, các nhà khoa học dự đoán khả năng xảy ra sự kháng thuốc của vi rút đối với oseltamivir thấp hơn amantadine [21]. Tuy nhiên, gần đây đã có những nghiên cứu trong nước và trên thế giới chỉ ra sự xuất hiện của những chủng vi rút kháng lại oseltamivir chủ yếu trên phân típ A/H1N1 và đặc biệt một chủng vi rút cúm gia cầm
  33. 22 A/H5N1 có nguồn gốc từ Việt Nam đã có biểu hiện kháng thuốc [8, 11, 26, 31]. Trong thời gian diễn ra đại dịch cúm A/H1N1pdm09, đã ghi nhận các trường hợp kháng oseltamivir [30]. Hiện tượng kháng thuốc xảy ra có liên quan đến sự thay đổi axit amin tại vùng tiếp xúc của neuraminidase và thuốc điều trị (oseltamivir) , cụ thể là các vị trí E119V, R292K, H275Y và R152K trên phân đoạn gen mã hóa NA [11, 13, 26, 36, 55, 58, 59]. Sự đột biến tại các vị trí này làm giảm hiệu quả tương tác giữa thuốc và neuraminidase. Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm gần đây cho thấy zanamivir dường như vẫn có tác dụng với các chủng đã kháng với oseltamivir [19]. Các số liệu cho thấy đột biến tại hai điểm trên phân đoạn gen mã hóa NA liên quan đến kháng oseltamivir (H275Y và I223R trên phân đoạn gen mã hóa NA của chủng vi rút A/H1N1pdm09) làm cho mức độ kháng thuốc của vi rút tăng gấp 1000 lần so với chủng vi rút nhạy cảm [40]. Các phương pháp xác định nồng độ oseltamivir bị kháng bởi vi rút đã và đang được tiến hành với mục đích xác định chính xác mức độ kháng của vi rút với thuốc [40, 41]. Hình 1.7. Cấu trúc của oseltamivir và zanamivir (Nguồn: )
  34. 23 Hình 1.8. Cơ chế hoạt động của neuraminidase và chất ức chế neuraminidase trong quá trình giải phóng vi rút ra khỏi tế bào Nguồn: Drug Discovery Approaches – Wiley 2007 1.2.3. Các thuốc kháng vi rút mới Thuốc ức chế sự xâm nhập của vi rút vào tế bào Arbidol là thuốc kháng vi rút được điều chế và sử dụng đầu tiên tại Nga từ năm 1993 và sau đó tại Trung Quốc năm 2006 [18], có khả năng ức chế sự xâm nhập của vi rút vào tế bào cảm nhiễm với khả năng phá vỡ môi trường pH thấp làm cho vi rút cúm không thể hòa màng khi xâm nhập vào tế bào và mất khả năng cởi áo giải phóng các thành phần của vi rút khi đã ở bên trong tế bào. Thuốc ức chế thụ thể trên bề mặt tế bào – DAS181 – là một loại protein tái tổ hợp bao gồm phần có tác dụng xúc tác của sialidase và phần protein gắn chặt trên bề mặt màng tế bào biểu mô đường hô hấp. Axit sialic trên bề mặt tế bào chủ, thụ thể đặc hiệu của protein HA của vi rút cúm, sẽ bị phá hủy khi cho tế bào tiếp xúc với sialidase, một loại enzyme ngoại bào có tác dụng tách axit sialic ra khỏi liên kết
  35. 24 với các glycoprotein và glycolipid. Bên cạnh đó, phần protein gắn chặt trên bề mặt màng tế bào tồn tại trên khắp bề mặt tế bào biểu mô đường hô hấp có khả năng làm tăng hiệu quả tác dụng của sialidase khi đặt thêm một phân tử bên cạnh axit sialic. Các thuốc ức chế neuraminidase Hai loại thuốc kháng vi rút mới hoạt động theo cơ chế ức chế neuraminidase đang trong quá trình thử nghiệm giai đoạn III tại Mỹ nhưng đã được cấp phép sử dụng tại Nhật và Hàn Quốc là Peramivir và Laninamivir vào các năm 2006 và 2010. Peramivir có cấu tạo tương tự axit sialic, có khả năng ức chế đặc hiệu neuraminidase, được sử dụng dạng tiêm. Laninamivir có cấu trúc tương tự như zanamivir nhưng khả năng bám gắn của laninamivir với NA được đánh giá cao, có thời gian bán thải dài (khoảng 3 ngày), được coi là sự lựa chọn tốt đối với những bệnh nhân nhiễm cúm có biến chứng nặng hoặc suy giảm miễn dịch. Các thuốc ức chế sự sao chép và nhân lên của vi rút trong tế bào Thuốc ức chế sự tái tạo vi rút của vi rút cúm - T-705 còn được biết dưới tên faviparavir, là một phân tử nonpeptide nhỏ có khả năng kháng vi rút cúm dựa trên cơ chế ức chế sự tái tạo hạt vi rút, có tác dụng chống lại cả ba phân típ cúm A, B và C. Faviparavir tác dụng ức chế lên quá trình tổng hợp RNA của vi rút nhưng không ức chế quá trình tổng hợp DNA và RNA của tế bào chủ. T-705 đã được chứng minh có tác dụng chống lại vi rút cúm gia cầm có độc lực cao A/H5N1 và đang trong quá trình thử nghiệm giai đoạn I. Tuy nhiên, cơ chế hoạt động của T-705 chưa được chứng minh một cách rõ ràng [48]. Ribarivin và viramidine là 2 hoạt chất kháng vi rút phổ rộng. Ribarivin được sử dụng điều trị viêm gan C phối hợp với interferon từ nhiều năm có cơ chế tác dụng trực tiếp lên quá trình sao chéo và nhân lên bộ gen của vi rút. Viramidine là dạng tiền hoạt động của ribavirin, có cơ chế hoạt động tương tự ribavirin nhưng ít tác dụng phụ hơn. Ribavirin được thử nghiệm điều trị nhiễm cúm nhưng kết quả điều trị kém hơn amantadine và các thuốc ức chế neuraminidase. Viramidine đã được thử
  36. 25 nghiệm với vi rút cúm A/H5N1 và cho kết quả khả quan nhưng mới chỉ dừng ở giai đoạn thử nghiệm [100]. 1.3. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút Hiện nay, các phương pháp áp dụng chủ yếu trong điều trị và phòng chống nhiễm vi rút cúm là tiêm văc xin và sử dụng thuốc đặc hiệu kháng vi rút. Văc xin phòng chống nhiễm vi rút cúm A/H5N1 hiện tại được phát triển tại một số nước, tuy nhiên vẫn chưa lưu hành trên thị trường. Văc xin cúm đang phổ biến hiện tại là văc xin cúm theo mùa và chỉ phát huy tác dụng khi được tiêm trước vụ dịch cúm và chủng vi rút cúm lưu hành trong vụ dịch tương tự chủng vi rút trong thành phần văc xin. Sau khi tiêm văc xin cúm, đáp ứng miễn dịch còn phụ thuộc rất nhiều vào cơ địa của từng cá thể và loại văc xin được sử dụng. Thuốc kháng vi rút cúm đặc hiệu đang lưu hành (amantadine, oseltamivir ) được sử dụng trong điều trị và dự phòng nhiễm vi rút, đặc biệt là vi rút A/H5N1. Tuy vậy, một trong những tương tác của thuốc với vi rút là hiện tượng đột biến xuất hiện trong vật liệu di truyền của vi rút và hệ quả là sự kháng thuốc của vi rút ở thế hệ sau [56, 58, 67]. 1.3.1. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine Amantadine và rimantadine là các dẫn chất của adamantane, được sử dụng từ những năm 60 của thế kỷ trước. Amatadine có hiệu quả điều trị chống lại tất cả các phân típ cúm A gây bệnh cho người trước đây (H1N1, H2N2, H3N2) nhưng không chống lại được vi rút cúm B do protein M2 chỉ có ở vi rút cúm A [21]. Sau 7 năm đưa vào sử dụng (1995-2002), tác dụng của adamantane trong điều trị và phòng bệnh được ghi nhận nhưng có hiệu quả không cao bởi quá trình kháng thuốc đã xuất hiện và lan truyền nhanh trong quần thể. Tỉ lệ kháng thuốc amantidine là 2% năm 2002, tăng lên 12% năm 2004 và 100% ở các chủng A/H3N2 năm 2005. Theo kết quả của các nghiên cứu về tỉ lệ kháng amantadine của vi rút cúm A cho thấy 100% các vi rút cúm A/H3N2 và A/H1N1pdm09 kháng amantadine. Tuy nhiên, một nghiên cứu tại Nhật năm 2008 đã xác định chủng cúm A/H3N2 có khả năng trở nên
  37. 26 nhạy với amantadine. Sự quay trở lại này là kết quả của quá trình trao đổi và tích hợp bộ gen giữa các chủng vi rút cúm lưu hành vào mùa cúm 2002-2003, 2004- 2005 và 2005-2006 [12]. Các nghiên cứu về vi rút cúm A/H5N1 kháng amantadine cho thấy chủng H5N1 lưu hành tại các nước Đông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan, Cambodia mang đột biến kháng thuốc chủ yếu tại vị trí S31N, đặc biệt các chủng lưu hành tại Việt Nam năm 2004 mang 2 đột biến tại vị trí 31 và 27 (V27A) trong khi các chủng lưu hành tại Trung Quốc và Indonesia lại vẫn duy trì sự nhạy cảm với thuốc amantadine [9, 15]. 1.3.2. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir Oseltamivir và zanamivir là hai chất ức chế chọn lọc trên enzyme bề mặt, neuraminidase, của vi rút cúm được đưa vào sử dụng từ năm 1999, enzyme này có tính chất khá bảo tồn ở các chủng vi rút cúm, do vậy khả năng xảy ra sự kháng thuốc của vi rút được các nhà khoa học tiên lượng là thấp hơn amantadine [21]. Tuy nhiên, gần đây các nghiên cứu trong nước và trên thế giới chỉ ra rằng những chủng vi rút kháng lại oseltamivir chủ yếu trên phân típ A/H1N1 lưu hành trước năm 2009. Tỉ lệ kháng oseltamivir của phân típ này chỉ ở mức dưới 1% [46, 59] vào những năm 2005-2006, các chủng kháng với oseltamivir đã bắt đầu xuất hiện năm 2007, sau đó tăng nhanh 43-60% năm 2008 và lan rộng trên toàn thế giới năm 2009 với tỉ lệ kháng lên đến 95% (Nhật, Mỹ, Châu Âu) [64, 110]. Chủng vi rút cúm gia cầm A/H5N1 cũng đã có biểu hiện kháng oseltamivir, trong đó có 2 trường hợp xuất hiện kháng thuốc trong quá trình điều trị tại bệnh viện [67] và một trường hợp mang chủng kháng thuốc không qua điều trị, ba chủng này có nguồn gốc từ Việt Nam [8, 11, 26, 31]. Trong thời gian diễn ra đại dịch cúm A/H1N1pdm09, đã ghi nhận các trường hợp kháng oseltamivir đơn lẻ và theo nhóm tại Việt Nam, Úc và Nauy [35, 39, 58]. Bệnh nhân nhiễm chủng vi rút A/H1N1pdm09 kháng thuốc ngoài các trường hợp có liên quan đến điều trị còn bao gồm những trường hợp có bệnh mạn tính, suy giảm hệ miễn dịch và không liên quan đến điều trị thuốc [37].
  38. 27 Ngoài ra, vi rút cúm mới xuất hiện trên người A/H7N9 tại Trung Quốc được thông báo mang đã mang sẵn phân đoạn gen mã hóa NA có điểm đột biến R292K gây kháng oseltamivir [63], gây khó khăn cho công tác phòng và điều trị. 1.4. Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A 1.4.1. Nguyên nhân và cơ chế của hiện tượng kháng thuốc Thuốc amatadine: Amantadine được đưa vào sử dụng từ những năm 1960 với mục đích phòng và điều trị cúm A. Theo khảo sát từ năm 1994, hiện tượng kháng amantadine đã xuất hiện [50]. Tìm hiểu nguồn gốc của sự kháng thuốc, phân đoạn gen mã hóa M đã được phân tích trình tự nucleotide để xác định sự thay đổi có liên quan đến kháng thuốc. Theo các nghiên cứu, hiện tượng kháng amantadine thường xảy ra với các chủng cúm A/H3N2 có xuất hiện các điểm đột biến trên phân đoạn gen mã hóa M (phần M2) dẫn đến thay đổi các axit amin tại các vị trí gắn kết. Năm vị trí axit amin liên quan đến việc kháng amatadine là 26, 27, 30, 31 và 34, trong đó, vị trí 31, thay đổi từ Serin (Ser-S) sang Arginine (Asn-N), là vị trí thường gặp [9, 42, 89]. Các đột biến này làm vị trí tiếp xúc với thuốc được "nới rộng", không còn tương ứng với kích thước của thuốc, amantadine không gắn được vào đúng vị trí trên protein M2 [82]. Do đó, vi rút không bị ức chế, vẫn tiếp tục quá trình hòa màng, "cởi áo", đưa các RNP và tế bào cảm nhiễm của vật chủ. Ngoài ra, sự kháng thuốc có thể xảy ra không liên quan đến hiện tượng đột biến mà do sự trao đổi và tích hợp bộ gen (trường hợp vi rút H1N1pdm09 khi xuất hiện kháng 100% với amantadine). Thuốc oseltamivir: Nguồn gốc của hiện tượng kháng oseltamivir là do có sự thay đổi axit amin tại vùng tiếp xúc của neuraminidase với thuốc, cụ thể là các vị trí I117V, H275Y, N294S trên N1 và E119V, R152K, R292K, N294S trên phân đoạn gen mã hóa N2 [24, 101, 104]. Sự đột biến tại các vị trí này gây giảm hiệu quả tương tác giữa thuốc và neuraminidase dẫn đến sự giảm độ nhạy hoặc kháng của vi
  39. 28 rút với thuốc. Tuy nhiên, theo dõi sự kháng thuốc của vi rút với zanamivir, dường như zanamivir vẫn có hiệu quả trên các chủng vi rút đã kháng với oseltamivir và đây có thể do sự khác nhau về cấu trúc không gian của hai loại thuốc này [79]. Tương tự như trường hợp vi rút H1N1pdm09 kháng amantadine, phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm mới xuất hiện trên người A/H7N9 cũng đã mang đột biến tại vị trí R292K liên quan đến kháng oseltamivir thông qua quá trình trao đổi và tích hợp đoạn gen [62]. Như vậy, sự kháng thuốc của vi rút cúm A qua thời gian tập trung vào các nguyên nhân sau: đột biến tại các vị trí liên quan đến sự bám gắn của thuốc trên phân đoạn gen mã hóa NA và M; áp lực duy trì nòi giống của vi rút mà biểu hiện chính là sự trao đổi và tích hợp bộ gen, do đó vi rút hoàn toàn có khả năng mang gen kháng thuốc từ khi mới xuất hiện; sự thích nghi với nhiều loại vật chủ của vi rút cúm A tạo điều kiện thuận lợi cho sự kháng thuốc xuất hiện (vi rút cúm B có tỉ lệ kháng thuốc thấp hợp vi rút cúm A). 1.4.2. Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm Kỹ thuật giải trình tự gen thông thường (phương pháp Sanger) Việc xác định chủng vi rút có mang gen kháng thuốc sử dụng phương pháp giải trình tự gen thông thường đã được thực hiện từ những năm 90, qua đó có thể theo dõi được sự xuất hiện hiện tượng kháng thuốc của vi rút cúm [93]. Điển hình là sự xuất hiện của hiện tượng kháng amantadine của vi rút A/H3N2, hiện tượng kháng oseltamivir của vi rút A/H1N1 và là phương pháp chủ yếu được lựa chọn để xác định chủng vi rút cúm A kháng amantadine. *Ưu điểm Ưu điểm của kỹ thuật là khả năng ứng dụng rộng rãi, có thể giải trình tự nucleotide cho toàn bộ gen đích hoặc từng phần gen có mang vị trí đột biến liên
  40. 29 quan đến kháng thuốc. Sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen này cũng có thể xác định được hiện tượng kháng thuốc không hoàn toàn, hoặc nhiều đột biến liên quan đến kháng thuốc. Chủng vi rút mang nhiều đột biến tại các vị trí khác nhau trên gen đích cùng có tác dụng gây kháng thuốc có thể phát hiện được nhờ khả năng giải trình tự đoạn nucleotide dài. Ngoài ra, các đột biến khác không liên quan đến kháng thuốc nhưng có liên quan đến sự tiến hóa, thay đổi đặc tính kháng nguyên của vi rút cũng được xác định [93]. *Nhược điểm Kỹ thuật phải thực hiện trên các gen đích khuếch đại từ các chủng vi rút cúm phân lập, thời gian thực hiện dài và chi phí để thực hiện còn cao. Kỹ thuật đa hình độ dài đoạn giới hạn (RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism) Đa hình độ dài đoạn giới hạn là kỹ thuật thường được sử dụng phối hợp cùng kỹ thuật PCR [33]. Sử dụng enzyme giới hạn phân tích đoạn gen của vi rút cúm có thể xác định được chủng vi rút có mang đột biến liên quan đến kháng thuốc sau khi thu được sản phẩm PCR. Để thực hiện kỹ thuật này, phản ứng PCR được thực hiện với đoạn mồi đặc hiệu (mồi ngược) được thiết kế mang vị trí cắt của enzyme giới hạn xác định (ví dụ BspHI ) [78]. Sản phẩm PCR thu được sẽ được xử lý bằng enzyme giới hạn tương ứng với mồi thiết kế. Enzyme giới hạn BspHI [33] hoặc BclI [78] sẽ cắt sản phẩm PCR tại với vị trí xác định có trình tự tương ứng với vi rút không mang đột biến kháng thuốc (vi rút nhạy cảm với thuốc), trong trường hợp vi rút mang gen kháng thuốc, sản phẩm PCR sẽ không được cắt bởi enzyme giới hạn. *Ưu điểm Kỹ thuật này có thể thực hiện được với số lượng mẫu lớn, giá thành thấp và có thể thực hiện trên bệnh phẩm lâm sàng và vi rút phân lập. *Nhược điểm
  41. 30 Việc lựa chọn enzyme thích hợp để thiết kế mồi và phân tích sản phẩm PCR không dễ, đặc biệt với các đột biến trên protein neuraminidase (NA) khi bản chất của protein này cũng là một enzyme, vì vậy hiện tượng cắt tại các vị trí không mong muốn (dương tình giả) , hoặc không tạo sản phẩm PCR tương thích là các vấn đề hay gặp, ảnh hưởng tới độ tin cậy của phương pháp, cần sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen để xác định lại kết quả. Kỹ thuật giải trình tự đoạn gen ngắn thực hiện với từng nucleotide xác định (pyro- sequencing) Pyrosequencing là kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới, được ứng dụng lần đầu tiên năm 1996 tại Thụy Điển, đến năm 2001 phương pháp bắt đầu được áp dụng trên thế giới. Pyrosequencing đáp ứng được yêu cầu muốn xác định trình tự gen cho một đoạn DNA nhỏ và có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn. Mục tiêu chính của phương pháp là xác định các điểm đột biến, ngoài ra có thể sử dụng phương pháp này trong định típ vi sinh vật và được coi là một phương pháp xét nghiệm khẳng định kết quả [88] *Ưu điểm Kỹ thuật này mang ưu điểm có thể rút ngắn thời gian giải trình tự khi so sánh với giải trình tự thông thường, có thể áp dụng cho nhiều loại mẫu khác nhau như bệnh phẩm lâm sàng, vi rút đã nuôi cấy và có thể thực hiện với số lượng bệnh phẩm lâm sàng lớn, phù hợp với tính chất giám sát học [25, 26]. Ngoài ra, phương pháp này còn được ứng dụng trong việc định loại vi sinh vật (tuy không thông dụng) và xác định cá thể mang gen dị hợp, hỗ trợ cho quá trình chẩn đoán trong phòng thí nghiệm [10, 88] *Nhược điểm Pyrosequencing có nhược điểm là chỉ thực hiện trên đoạn DNA ngắn và phát hiện được các đột biến được chỉ định, nên phạm vi ứng dụng còn hạn chế và chỉ tập
  42. 31 trung vào các nghiên cứu, giám sát cụ thể [25, 88]. Việc phát hiện đột biến liên quan đến kháng oseltamivir bằng phương pháp pyrosequencing chỉ cho phép nhận diện sơ bộ khả năng kháng thuốc của vi rút, các xét nghiệm tiếp theo để khẳng định khả năng, mức độ kháng thuốc cần được bổ sung. Kỹ thuật realtime RT-PCR Nhằm mục đích có thể phát hiện nhanh vi rút mang gen đột biến trên số lượng bệnh phẩm lớn, kỹ thuật realtime RT-PCR được phát triển và áp dụng. Kỹ thuật này được đưa vào thử nghiệm lần đầu tiên năm 2008 [16] với ứng dụng ban đầu là tìm điểm đột biến H275Y trên phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm A/H1N1. Từ năm 2012, tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo có thể sử dụng kỹ thuật realtime RT-PCR để xác định ban đầu bệnh phẩm nhiễm cúm nghi ngờ có mang gen kháng thuốc. *Ưu điểm Kỹ thuật này có thể áp dụng cho bệnh phẩm lâm sàng, có thể thực hiện với số lượng bệnh phẩm lớn, cho kết quả sàng lọc sớm trong vòng 3 giờ [16, 35]. Hơn nữa, realtime RT-PCR có giá thành thấp hơn so với giải trình tự gen cổ điển và pyrosequencing, do đó có thể sử dụng như một biện pháp sàng lọc bệnh phẩm mang vi rút kháng thuốc góp phần phát hiện sớm những trường hợp kháng thuốc trong cộng đồng. *Nhược điểm Với kỹ thuật này, đột biến liên quan đến kháng thuốc chỉ được xác định tại một điểm nhất định (H275Y) trên phân đoạn gen mã hóa NA trong đó với kỹ thuật giải trình tự gen cổ điển có thể phát hiện đột biến trên toàn bộ đoạn gen.
  43. 32 1.4.3. Kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của neuraminidase Đây là quá trình cần thiết để xác định mức độ kháng oseltamivir của vi rút cúm đươc thực hiện dựa trên nguyên lý hoạt động của neuraminidase chứng minh cho việc phát hiện đột biến liên quan đến kháng thuốc trên gen là chính xác. Kỹ thuật bao gồm hai bước chính: xác định hoạt động của neuraminidase và xác định mức độ kháng thuốc oseltamivir hoặc zanamivir. Xác định hoạt động của neuraminidase Mục đích của việc xác định hoạt động của neuraminidase là đánh giá hoạt động của enzyme trong quá trình nhân lên của vi rút và chuẩn hóa nồng độ vi rút trước khi thực hiện việc xác định mức độ kháng thuốc của vi rút. Xác định mức độ kháng oseltamivir/zanamivir *Dựa trên hoạt động của neuraminidase với chất phát quang có nguồn gốc hóa học Việc nhận định mức độ kháng thuốc oseltamivir/zanamivir của vi rút cúm dựa vào sự phát quang của chất có nguồn gốc hóa học (chemiluminesence). Kết quả thu được từ kỹ thuật này được đánh giá có đủ độ tin cậy và được sử dụng tại nhiều phòng thí nghiệm (PTN) chuẩn thức trên thế giới như PTN tại trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ (US-CDC), PTN tại Viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia Nhật Bản (NIID) [73, 104]. Các bộ kit xác định mức độ kháng thuốc có chất phát quang có nguồn gốc quang học được Tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo sử dụng là NA- Star và NA-XTD hãng Applied Biosystem, Mỹ [111]. Ưu điểm Đây là kỹ thuật xác định mức độ kháng thuốc có độ nhạy cao, có thể sử dụng với các vi rút có nồng độ thấp, cùng một lúc có thể thử nghiệm với nhiều loại thuốc khác nhau và là kỹ thuật hỗ trợ khẳng định sự kháng thuốc của vi rút cúm.
  44. 33 Nhược điểm Do có độ nhạy cao nên kỹ thuật không nhận định được rõ ràng kết quả nếu mẫu thử nghiệm là vi rút không đột biến hoàn toàn . Hơn nữa, để sử dụng hiệu quả cần phương tiện hỗ trợ đặc biệt (bộ phận chứa phiến 96 giếng, bộ phận chia dung dịch dừng phản ứng tự động gắn liền với máy) cho máy đọc kết quả do chất phát sáng có nguồn gốc hóa học này dễ bị phân hủy khi gặp ánh sáng và giá thành tương đối cao so với kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của neuraminidase với chất phát huỳnh quang. *Dựa trên hoạt động của neuraminidase với chất phát quang là huỳnh quang Đây là kỹ thuật xác định độ nhạy cảm của neuraminidase với thuốc ức chế hoạt động của enzyme (oseltamivir, zanamivir ) có sử dụng chất huỳnh quang trong thành phần của phản ứng. Kết quả của thử nghiệm xác định được nồng độ thuốc ức chế 50% hoạt động của vi rút. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong các PTN do khả năng ứng dụng linh hoạt trong sử dụng hóa chất sinh phẩm và được tổ chức y tế thế giới khuyến cáo sử dụng xác định mức độ kháng thuốc của các chủng vi rút [111]. Ưu điểm Ưu điểm của kỹ thuật là thời gian tiến hành nhanh, kết quả có thể phân định được rõ ràng chủng nhạy cảm và chủng kháng thuốc [14]. Ngoài ra, không giống kỹ thuật NAI dựa vào sự phát quang của chất có nguồn gốc hóa học đề cập ở trên, kỹ thuật này cho phép sử dụng sinh phẩm là bộ kit thương mại, NA Fluor kit, Applied Biosystem hoặc các hóa chất sinh phẩm có sẵn tại phòng thí nghiệm sử dụng chất phát quang MUNANA của hãng Sigma. Nhược điểm Độ nhạy của kỹ thuật không được đánh giá cao như kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir/zanamivir dựa trên hoạt động của neuraminidase với chất phát
  45. 34 quang có nguồn gốc hóa học [111]. Do đó, để khẳng định lại những chủng vi rút nghi ngờ về khả năng kháng thuốc, cần sử dụng kỹ thuật NAI sử dụng chất phát quang có nguồn gốc hóa học. 1.4.4. Giám sát sự kháng thuốc vi rút cúm Quá trình giám sát kháng thuốc của vi rút cúm đã được thực hiện tại các nước phát triển ở châu Âu và châu Mỹ. Các trường hợp nghi ngờ có liên quan đến kháng thuốc đều được kiểm tra kỹ lưỡng và ghi nhận. Hiện nay, tại Việt Nam phòng thí nghiệm cúm đang tiến hành triển khai giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm dựa trên giám sát sự thay đổi trên phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút với sự giúp đỡ của TCYTTG. Giám sát được sự kháng thuốc của vi rút cúm góp phần tăng cường năng lực đáp ứng với sự xuất hiện của đại dịch cúm trong tương lai, chủ động trong quá trình phòng và điều trị bệnh cúm trong đó việc sử dụng thuốc đóng vai trò quan trọng. Xây dựng quy trình giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm Tại Việt Nam, ba trong số các kỹ thuật xét nghiệm trình bày ở phần trên đã được thực hiện tại phòng thí nghiệm cúm viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương là giải trình tự gen, realtime RT-PCR và xác định mức độ kháng thuốc bằng chất màu huỳnh quang. Hiện tại, các phương pháp đều đã được xây dựng quy trình chuẩn (SOP) nhằm tạo tiền đề cho việc thực hiện xét nghiệm giám sát thường xuyên sự kháng thuốc của vi rút cúm tại phòng thí nghiệm. Chiến lược thực hiện giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm tại phòng thí nghiệm Giám sát vi rút cúm kháng thuốc tại Việt Nam được bắt đầu từ những năm 2005, tuy nhiên cũng chỉ dừng lại ở những trường hợp đơn lẻ của vi rút cúm A/H1N1, A/H5N1. Những kết quả tìm hiểu sự kháng thuốc của vi rút cúm thu được từ đại dịch cúm A/H1N1pdm09 là tiền đề để phát triển chương trình giám sát kháng thuốc trong tương lai.
  46. 35 Giám sát sự kháng thuốc của vi rút bao gồm sự giám sát sự thay đổi, đột biến liên quan đến kháng thuốc, trên gen của vi rút và sự thay đổi trên kiểu hình tương ứng với kiểu gen. Tại Viện các bệnh truyền nhiễm (NIID)-Nhật Bản, khoảng 5-10% chủng vi rút được lựa chọn ngẫu nhiên để xét nghiệm xác định mức độ kháng thuốc của vi rút [69] bằng phương pháp ức chế neuraminidase. Sự thay đổi trên kiểu gen có thể được giám sát qua phương pháp giải trình tự gen cổ điển (Sanger sequence) trên các vi rút đã được xác định mức độ kháng thuốc. Các trường hợp nghi ngờ có biểu hiện kháng thuốc nhưng chưa xác định được mức độ kháng thuốc có thể áp dụng phương pháp giải trình tự pyrosequencing thực hiện trên bệnh phẩm lâm sàng [25, 36, 104]. Quy trình giám sát vi rút cúm kháng thuốc được tổ chức giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm (ISIRV) khuyến cáo thực hiện bao gồm quá trình xác định biểu hiện kháng thuốc của các chủng vi rút thông qua kỹ thuật NAI với cơ chất huỳnh quang, sau đó các chủng có biểu hiện kháng thuốc sẽ được xác định vị trí đột biến liên quan đến kháng thuốc trên gen NA bằng các phương pháp như giải trình tự gen thông thường hoặc realtime RT-PCR. Quy trình này hiện nay đang được áp dụng tại các phòng thí nghiệm tham chiếu của TCYTTG tại CDC-Altanta, Melbourne và NIID-Nhật Bản. Những kết quả có thể thu được khi thực hiện giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm Sự kháng thuốc của vi rút nếu được phát hiện sớm tại các bệnh viện sẽ tạo điều kiện cho bác sĩ lâm sàng thay đổi phác đồ điều trị phù hợp, rút ngắn thời gian nằm viện của bệnh nhân. Hơn nữa, việc phát hiện sớm rất có ý nghĩa trong công tác phòng chống dịch khi các trường hợp kháng thuốc được xác định trong thời điểm bùng phát dịch, đặc biệt với các trường hợp là nhóm ca bệnh có liên quan đến kháng thuốc, từ đó có thể áp dụng các biện pháp can thiệp phòng chống vi rút mang gen kháng thuốc lan truyền trong quần thể. Mỗi vi rút mang gen kháng thuốc có biểu hiện về mức kháng thuốc khác nhau, mức kháng thuốc tăng cao đặc biệt ở vi rút mang đồng thời cả hai loại đột biến liên
  47. 36 quan đến kháng thuốc [38, 74], do vậy, giám sát kháng thuốc để tăng cường khả năng phát hiện và theo dõi được tình trạng kháng thuốc của vi rút và sự tương tác của vi rút với môi trường. Xu hướng lưu hành vi rút cúm tại Việt Nam khác với các nước ở vùng khí hậu hàn đới, nơi có mùa cúm rõ ràng, khi có hai đỉnh dịch cúm B vào tháng 2-3 và cúm A vào tháng 7-8 [1] . Nghiên cứu về đặc điểm kháng nguyên của vi rút cúm cho thấy dường như vi rút cúm lưu hành tại Việt Nam có đặc điểm gần giống với các chủng vi rút cúm lưu hành tại Nam bán cầu [106]. Do đó với các chủng mang đột biến kháng thuốc sẽ được giám sát sự tiến hóa trong quá trình tiến hóa chung của vi rút cúm, từ đó có thể xác định được kiểu gen và kiểu hình đặc thù của vi rút cúm lưu hành tại Việt Nam.
  48. 37 CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Các chủng cúm A bao gồm các phân típ A/H1N1, A/H1N1pdm09, A/H3N2 và A/H5N1 phân lập được tại PTN Cúm, viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương từ năm 2001 đến 2012 từ các nguồn sau: - Giám sát phòng thí nghiệm 2001 – 2005: Vi rút phân lập từ các bệnh nhân có hội chứng cúm theo giám sát của phòng thí nghiệm (sốt trên 38oC, ho và/hoặc đau họng) - Chương trình giám sát cúm quốc gia 2006 – 2012: Vi rút phân lập từ các bệnh nhân có hội chứng cúm trong chương trình giám sát cúm Quốc gia phối hợp với US-CDC với tiêu chuẩn: sốt trên 38oC, ho và hoặc đau họng và không có chẩn đoán nào khác. - Giám sát viêm phổi nặng 2003 – 2012 (vi rút A/H5N1): Vi rút phân lập từ các bệnh nhân viêm phổi nặng khi có đầy đủ triệu chứng của hội chứng cúm kèm theo khó thở, có chỉ định áp dụng hỗ trợ hô hấp, hình ảnh X-quang phổi có tổn thương đặc hiệu cho viêm phổi do vi rút và không hướng đến căn nguyên nào khác ngoải vi rút. Các chủng cúm A được thu thập tại các tỉnh phía Bắc gồm Lạng Sơn, Hòa Bình, Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Bắc Ninh, Ninh Bình, Hưng Yên, Thái Bình và Thanh Hóa. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Toàn bộ các vi rút cúm mùa A/H1N1, A/H1N1pdm09, A/H3N2 và A/H5N1 sau khi phân lập được xác định mức độ kháng thuốc bằng phương pháp ức chế neuraminidase, các vi rút có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir sẽ được giải trình tự phân đoạn gen mã hóa NA để xác định điểm đột biến liên quan đến
  49. 38 kháng thuốc và phân đoạn gen mã hóa HA để xác định sự tiến hóa của vi rút [46, 112, 113]. Tuy nhiên, để thực hiện mục tiêu của nghiên cứu về sự tiến hóa của vi rút, toàn bộ chủng cúm A trong nghiên cứu được giải trình tự hai phân đoạn gen mã hóa HA và NA. 2.3. Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm 2.3.1. Vật liệu 2.3.1.1. Chủng vi rút Cỡ mẫu trong nghiên cứu được xác định là cỡ mẫu toàn bộ 342 chủng bao gồm: 42 chủng H1N1 thu thập từ năm 2001 đến 2009; 157 chủng H1N1pdm09 thu thập từ tháng 6 năm 2009 đến 2012; 115 chủng H3N2 thu thập từ năm 2003 đến 2012 và 28 chủng H5N1 thu thập từ năm 2004 đến 2012 Các chủng cúm thu thập theo năm được sử dụng trong nghiên cứu Số lượng chủng Năm A/H1N1 A/H1N1 A/H3N2 A/H5N1 pdm09 2001 8 - 0 - 2002 4 - 0 - 2003 14 - 4 1 2004 - - 13 4 2005 - - 2 3 2006 3 - 0 - 2007 - - 16 8 2008 7 - 1 5 2009 6 86 36 4 2010 - 13 12 3 2011 - 58 1 - 2012 - - 30 - 42 157 115 28 Tổng 342
  50. 39 2.3.1.2. Tế bào Tế bào thường trực thận chó MDCK (Madin – Darby Canine Kidney) có nguồn gốc từ trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ (US-CDC) 2.3.1.3. Sinh phẩm Sinh phẩm cho phương pháp phân lập vi rút Sinh phẩm Xuất xứ Tế bào Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) US-CDC Chai nuôi cấy tế bào T-75 Corning Cat.No. 430720 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) GIBCO Cat.No. 11965-092 Penicillin-Streptomycin, dạng dung dịch đặc GIBCO Cat.No. 15140-023 (10,000 U/ml penicillin G; 10,000 μg/ml streptomycin sulfate) Dung dịch Bovine serum albumin fraction V, 7.5% GIBCO Cat.No. 15260-011 Fetal bovine serum, 40 nm filtered HyClone Laboratories, Inc Cat.No. A-1111-L Trypsin-EDTA GIBCO Cat.No. 25300-054 (0.05% trypsin; 0.53 mM EDTA.4Na) Trypsin, TPCK Sigma Cat.No. T-8642 Gentamicin reagent dạng dung dịch GIBCO Cat.No 15750-011 (50mg gentamicin sulfate/ml) Cồn (96-100%) Merck Cat.No.1.00983.1000 Sinh phẩm cho phương pháp giải trình tự gen * Tạo đoạn DNA bổ sung - Mồi Universal 12 (Invitrogen)
  51. 40 - Enzyme Superscript III reverse transcriptase – Invitrogen (Mã catalog 18080085). * PCR - PCR kit - Qiagen HotStar Hifidelity (Mã catalog 202602) - Qiagen One step RT-PCR (Mã catalog 210212) - Mồi cho PCR và giải trình tự phân đoạn gen mã hóa NA Mồi Trình tự Hướng Ba-NA-1F AGCGAAAGCAGGAGT Xuôi Ba-NA-1413R AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT Ngược N1-780F GGGGAAGATTGTYAAATCAGTYGA Xuôi N1-1273R CWACCCAGAARCAAGGYCTTATG Ngược - Mồi cho PCR và giải trình tự phân đoạn gen mã hóa HA Phân típ cúm Mồi Trình tự Hướng H5-3F CTC GGA AAC CCA ATG TGT GAC Xuôi H5-R1 GAC AGT ATT TGG TAA ATT CC Ngược H5HA H5-5R GGA CTC AAG AAT TAT GAA AAG TG Xuôi H5-3R CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG Ngược H1HA và Bm-HA-1F AGCGAAAGCAGGGG Xuôi H1pdm09 HA Bm-NS-890R AGTAGAAACAAGGGTGTTTT Ngược * Tinh sạch sản phẩm - Kit làm tinh sạch sản phẩm PCR (khi sản phẩm PCR thu được một băng đặc hiệu) của hãng Qiagen: Purification kit Qiaquick (250) Mã catalog 28106
  52. 41 - Kit làm tinh sạch sản phẩm PCR (khi sản phẩm PCR thu được một gồm nhiều băng không đặc hiệu, trong số đó có băng là sản phẩm mong muốn) của hãng Qiagen: Qiaquick Gel Extraction kit (250) Mã catalog 28706 - Kit làm tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide của hãng Qiagen: DyeEx 2.0 Spin kit Qiagen Mã catalog 63206 * Giải trình tự gen - Kit BigDye Terminator v3.1 ABI. Mã catalog 4336917 - Polymer: POP 7 ABI. Mã catalog 4352759 Sinh phẩm cho phương pháp xác định nồng độ oseltamivir ức chế neuraminidase - 2-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) (Sigma-Aldrich Mã catalog M3671) - Oseltamivir Carboxylate (Roche. GS4071) - Zanamivir (Glaxo-Smithkline. GR121167X) - MUNANA [2’ 2’-(4-Methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid sodium salt hydrate] (Sigma - Aldrich Mã catalog M8639) 2.3.1.4. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị Thiết bị Xuất xứ Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 3 Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Tủ an toàn sinh học cấp 2 Bioquell – Anh Máy khuếch đại gen Biorad – Mỹ Máy giải trình tự gen ABI3130 Hitachi – Nhật Máy đọc tín hiệu huỳnh quang Perkin Elmer – Mỹ Máy ly tâm Beckman Coulter – Mỹ Votex IKA – Malaysia
  53. 42 Dụng cụ Dụng cụ sử dụng trong các thí nghiệm bao gồm: - Pipet vi lượng 10µl - 1000µl - Đầu côn có lọc vô trùng 10µl - 1000µl - Phiến nuôi cấy tế bào 25cm2, 75 cm2 - Phiến 96 giếng màu đen đáy phẳng - Tuýp Eppendorf 1,5ml – 2ml Và các dụng cụ khác. 2.3.2. Kỹ thuật xét nghiệm 2.3.2.1. Phân lập vi rút Chuẩn bị - Tế bào MDCK mọc đẹp thành một lớp trong tuýp nuôi cấy tế bào. - Dung dịch phát triển gồm: D-MEM x10, Fetal Bovine Serum 7,5%, Penicillin 100 U/ml và Streptomycin 100 µg/ml , NaHCO3 và nước cất hai lần vô trùng. - Dung dịch môi trường nuôi cấy vi rút gồm:D-MEM x10, Bovine serum albumine 2%, Penicillin 100 U/ml và Streptomycin 100 µg/ml , TPCK- treated trypsin và nước cất hai lần vô trùng. Các vi rút cúm A/H1N1, A/H1N1pdm09 và A/H3N2 được phân lập tại PTN ATSH cấp 2, vi rút A/H5N1 được phân lập tại PTN ATSH cấp 3 Tiến hành - Cho 250 µl bệnh phẩm vào phiến nuôi cấy có tế bào MDCK, ủ 60 phút tại nhiệt độ 33oC, thêm 1,5ml môi trường nuôi cấy, quan sát sự huỷ hoại tế bào (CPE) qua kính hiển vi lộn ngược trong vòng 1-2 tuần.
  54. 43 - Xác định típ và phân típ của chủng vi rút bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HAI) có sử dụng các kháng huyết thanh chuẩn của tổ chức y tế thế giới. - Phương pháp RT-PCR với các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng thêm để xác định típ và phân típ của chủng vi rút cúm A Bệnh phẩm dịch họng thu thập từ bệnh nhân RT-PCR với các mồi đặc hiệu Dương tính Âm tính Nuôi cấy trên tế CPE dương tính bào MDCK CPE âm tính Giá trị HA ≤ 8 Giá trị HA ≥ 8 Cấy chuyển 3 lần, nếu CPE Kiểm tra lại Định týp bằng âm tính, bệnh phẩm âm tính bằng RT-PCR phản ứng HAI Sơ đồ 2.1. Quá trình phân lập vi-rút cúm 2.3.2.2. Xác định mức độ kháng thuốc của vi rút cúm với oseltamivir Nguyên lý Kỹ thuật xác định mức độ nhạy cảm với oseltamivir bao gồm 2 bước: xác định mức độ hoạt động của neuraminidase và xác định độ nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir bằng phản ứng ức chế neuraminidase (NA). Kỹ thuật này dựa trên
  55. 44 nguyên lý hoạt động của NA. Dưới tác dụng của NA, axit sialic phân tách với nhóm đường, giải phóng vi rút cúm khỏi bề mặt tế bào cảm nhiễm. Do vậy, ức chế sự phân tách này sẽ cản trở quá trình giải phóng vi rút cúm, ngăn chặn sự phát tán của vi rút trong cơ thể. MUNANA [2’ 2’-(4-Methylumbelliferyl)-α-D-N- acetylneuraminic acid sodium salt hydrate] là chất nền huỳnh quang được sử dụng trong thử nghiệm xác định mức độ nhạy cảm với oseltamivir và mức độ hoạt động của neuraminidase của vi rút cúm. Trong phản ứng này, MUNANA sẽ bị phân tách bởi NA, giải phóng phân tử phát huỳnh quang 4-Methylumbelliferyl (4-MU) và được đọc bởi máy đọc tín hiệu huỳnh quang. Xác định mức độ hoạt động của neuraminidase Đây là bước xác định mức độ hoạt động của neuraminidase mà qua đó có thể xác định được mức phát quang chuẩn, từ đó có thể dựa vào để xác định độ pha loãng của vi rút trong phản ứng ức chế neuraminidase tiếp theo. Chất nền MUNANA được đưa vào dung dịch chứa vi rút đã được pha loãng bậc hai bằng dung dịch đệm. Ủ hỗn hợp tại 37oC trong 60 phút, thêm chất dừng phản ứng, đọc bằng máy đọc tín hiệu huỳnh quang. Kỹ thuật được thực hiện 3 lần trong cùng một thời điểm để hạn chế sai số. Phản ứng ức chế neuraminidase Độ nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir được xác định bởi giá trị IC50 của vi rút. Giá trị thể hiện nồng độ oseltamivir mà tại đó ức chế được 50% vi rút cúm. Oseltamivir được pha loãng theo các nồng độ từ 40000nM đến 0.04nM rồi cho vào dung dịch vi rút đã pha loãng dựa trên các giá trị thu được từ phản ứng xác định mức độ hoạt động neuraminidase nói trên, ủ 37oC/30 phút trong tủ ấm. Sau đó cho MUNANA vào hỗn dịch, ủ 37oC/60 phút trong tủ ấm. Đọc tín hiệu huỳnh quang trên máy VICTOR X2 trong vòng 20 phút sau khi dừng phản ứng (Sơ đồ 2.2).
  56. 45 Thí nghiệm được thực hiện 3 lần tại cùng một thời điểm để hạn chế sai số. Với các chủng A/H5N1 thí nghiệm sẽ được thực hiện tại phòng thí nghiệm an toàn sinh học (ATSH) cấp 3. Các chủng cúm A/H1N1, A/H1Npdm09 được thực hiện tại phòng thí nghiệm ATSH cấp 2. Chủng cúm A phân típ H1N1, H1N1pdm09, H3N2 và H5N1 Xác định hoạt động của neuraminidase Ủ 37oC/60 phút + 50µl vi rút được pha loãng Dừng phản ứng bậc hai bằng dung dịch đệm + 50µl dung dịch MUNANA Đọc kêt quả tại bước sóng 355/460nm Xác định độ pha loãng của từng vi rút o Ủ 37 C/45 phút + 25µl vi rút đã được pha + 50µl dung dịch loãng bằng dung dịch đệm MUNANA + 25µl oseltamivir pha o Ủ 37 C/60 phút loãng theo nồng độ 0- Dừng phản ứng 40.000nM Đọc kêt quả tại bước sóng 355/460nm Xác định giá trị IC50 bằng phần mềm JASPR
  57. 46 Sơ đồ 2.2. Quá trình thực hiện xác định mức độ kháng oseltamivir của vi-rút cúm Chủng chuẩn làm chứng - Bộ chứng chuẩn được cung cấp bởi phòng thí nghiệm tham chiếu của TCYTTG tại Melbourne –Úc Vi rút Phân típ Giá trị IC50 (nM) A/Mississippi/03/2001 A(H1N1) 0,5 A/Mississippi/03/2001 A(H1N1) 3455 A/Perth/265/2009 A(H1N1pdm09) 0,6 A/Perth/261/2009 A(H1N1pdm09) 2179 A/Fukui/20/2004 A(H3N2) 0,2 A/Fukui/45/2004 A(H3N2) 42,3 Nhận định kết quả Kết quả sau khi xác định giá trị IC50 được nhận định dựa theo bảng nhận định kết quả của Tổ chức Y tế Thế giới. Nhận định giá trị IC50 của vi rút cúm Kết quả Cúm A Cúm B Từ ngưỡng ức chế bình thường Thuốc ức chế vi rút mức bình thường < 10 lần < 5 lần Giảm hiệu quả ức chế vi rút của thuốc kháng vi 10-100 lần 5 - 50 lần rút
  58. 47 Giảm mạnh hiệu quả ức chế vi rút của thuốc >100 lần > 50 lần kháng vi rút Nguồn: WHO Weekly epidemiological record, Sep 2012 Ngưỡng ức chế bình thường của thuốc kháng vi rút (oseltamivir) được xác định trong quá trình thực hiện dựa trên các giá trị IC50 của các vi rút cúm. Mỗi típ/phân típ vi rút cúm khác nhau có ngưỡng ức chế bình thường khác nhau. 2.3.2.3. Giải trình tự gen sử dụng phương pháp thông thường (Sanger) Nguyên lý Sự xuất hiện của các di-deoxynucleotide (các nucleotide mất gốc -OH ở vị trí Cac-bon 3' và được thay bằng -H, đã được đánh dấu huỳnh quang với các màu khác nhau) trong quá trình tổng hợp DNA bổ sung (mẫu gen cần giải trình tự ở dạng DNA sợi đơn) tạo ra những đoạn DNA có độ dài khác nhau. Khi nucleotide gắn huỳnh quang được gắn vào đoạn DNA bổ sung, quá trình tổng hợp DNA bổ sung sẽ bị dừng lại.Mỗi đoạn DNA mang một nucleotide gắn huỳnh quang ở điểm cuối. này được điện di qua mao quản từ kích thước nhỏ đến lớn và các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser. Trình tự gen của mẫu chính là trình tự bổ sung các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser. Quá trình thực hiện nói chung bao gồm: - Tạo sản phẩm PCR - Tinh sạch sản phẩm PCR - Chu trình nhiệt tạo đoạn DNA đơn gắn các dideoxynucleotide - Tinh sạch sản phẩm đã gắn các dideoxynucleotide - Điện di qua mao quản và đọc trình tự bởi đầu đọc laser. Tạo đoạn DNA bổ sung * Các bước tiến hành Tạo hỗn hợp 1
  59. 48 Sinh phẩm 1 1 phản ứng Mồi Uni 12 (10nM) 5µl dNTPs 1µl RNA 10µl Ủ 65oC/ 5phút, giữ lạnh Tạo hỗn hợp 2 Sinh phẩm 1 phản ứng Đệm x5 5µl DTT 1µl RNase inhibitor 1µl SuperscriptIII RT enzyme 1µl Giữ lạnh Trộn hỗn hợp 1 và 2 ủ tại nhiệt độ 50oC/45phút và 70oC/15 phút; sau đó lưu giữ tại -20oC làm mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại phân đoạn gen mã hóa NA. Khuếch đại phân đoạn gen mã hóa NA *Tạo hỗn hợp sinh phẩm cho phản ứng PCR Sinh phẩm 1 phản ứng Đệm 10x 10 µl Mồi xuôi (100nM) 0.5 µl Mồi ngược (100 nM) 0.5 µl HotStar Taq 2 µl Nước tinh sạch 29µl cDNA 8 µl Tổng 50 µl Mồi sử dụng cho phân đoạn gen mã hóa NA: Ba-NA-1F, Ba-NA-1413 R * Chu trình chạy Nhiệt độ/ Thời gian Chu kỳ 95oC/5phút 1 vòng
  60. 49 94oC/15 giây 48oC/1 phút 35 vòng 68oC/2 phút 68oC/10 phút 1 vòng 4oC Giữ cho tới bước tinh sạch tiếp theo Tinh sạch sản phẩm PCR Mục đích: Loại bỏ những đoạn mồi thừa và sinh phẩm sẽ gây nhiễu trong quá trình giải trình tự phân đoạn gen mã hóa HA và NA. Sản phẩm PCR sau khi điện di cho nhiều băng, trong đó có băng sản phẩm cần giải trình tự gen, cần tiến hành tinh sạch sản phẩm trên thạch. * Các bước tiến hành: - Cắt băng DNA đặc hiệu trên thạch. Cho thạch vào tuýp 1,5ml hoặc 4,5ml. - Xác định trọng lượng của miếng thạch. Trộn 3 thể tích đệm QG với 1 thể tích miếng thạch chứa DNA có độ dài từ 70bp - 10kb. Ủ tại 50oC trong 10 phút cho tới khi thạch hoà tan hết. Lắc tuýp mỗi 2 phút trong quá trình ủ. Kiểm tra dung dịch có màu vàng trong trước khi tiến hành bước tiếp theo. - Nhỏ dung dịch nói trên vào cột lọc. Ly tâm 13.000vòng/1 phút. Loại bỏ nước thu được. Quá trình được lặp lại cho tới khi hết dung dịch. - Lần ly tâm cuối cùng cho 500µl QG vào cột lọc, ly tâm 13.000vòng/1 phút. - Rửa DNA bằng 750µl đệm PE, ly tâm 13.000vòng/1 phút. Ly tâm thêm 1 lần nữa sau khi loại bỏ nước thu được. - Chuyển cột lọc sang tuýp 1,5ml sạch, cho 30µl đệm EB vào chính giữa cột, ủ tại nhiệt độ phòng trong vòng 1 phút sau đó ly tâm 13.000vòng/1 phút. - DNA tinh sạch giữ ở -20oC đến -80oC. Chu trình nhiệt tạo đoạn DNA gắn các dideoxynucleotide * Tạo hỗn hợp sinh phẩm cho phản ứng Sinh phẩm Thể tích
  61. 50 Terminator Ready Reaction Mix 8µl Tuỳ theo chất lượng mà lấy thể tích Mẫu khác nhau Mồi (3,2 pmol) xuôi hoặc ngược 1µl Nước tinh sạch X µl Tổng 20µl * Xác định hàm lượng DNA trong mẫu * Lượng DNA được tính theo bảng sau: theo thang DNA chuẩn Mẫu Số lượng (sản phẩm PCR) 100-200bp 1-3ng 200-500bp 3-10ng 500-1000bp 10-40ng >2000bp 20-50ng Hình 2.1. Thang chỉ thị phân tử chuẩn 1 kb Invitrogen * Chu trình nhiệt: Nhiệt độ/ Thời gian Chu kỳ 96oC/ 1 phút 1 vòng 96 oC/ 10giây 25 vòng
  62. 51 50 oC/ 5 giây 60 oC/ 4 phút 4 oC Giữ cho tới bước tinh sạch tiếp theo Sinh phẩm được trộn trong từng tuýp 0,2 ml riêng rẽ, ly tâm ngắn trước khi cho vào máy. Tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide Mục đích: Loại bỏ những dideoxynucleotide thừa và sinh phẩm sẽ gây nhiễu trong quá trình giải trình tự phân đoạn gen mã hóa NA. * Các bước tiến hành: - Lắc nhẹ nhàng cột DyeEx 2.0 Spin - Nới lỏng nắp cột - Loại bỏ phần dưới cột DyeEx 2.0 Spin, đặt cột vào tuýp thu 2ml - Ly tâm 8000 vòng / 2- 3 phút loại bỏ dung dịch bảo quản gel - Chuyển cột DyeEx 2.0 Spin sang tuýp 1,5ml sạch. - Dùng pipet cho toàn bộ sản phẩm vào cột gel - Ly tâm 8000 vòng / 2-3 phút - Loại bỏ cột DyeEx 2.0 Spin - Làm khô và chuẩn bị đưa vào máy giải trình tự gen. Trong trường hợp không đưa vào máy ngay, có thể giữ mẫu đã làm khô ở -20oC không quá 24h. Điện di qua mao quản và đọc trình tự bởi đầu đọc laser * Chuẩn bị mẫu điện di: - Cho 10µl HiDi Formamide vào tuýp 1,5ml chứa DNA sau khi tinh sạch ở bước 2 (khi cho vào trộn nhẹ nhàng bằng pipet) * Chuyển mẫu vào máy: - Chuyển toàn bộ sản phẩm sang đĩa 96 giếng (dành riêng cho máy ABI 3130) - Ủ tại nhiệt 96oC/5 phút
  63. 52 - Sau đó chuyển ngay vào giá giữ lạnh. - Chuyển đĩa 96 giếng vào máy ABI 3130 2.4. Phân tích số liệu 2.4.1. Phân tích kết quả, xác định ngưỡng và mức độ kháng oseltamivir của vi rút cúm Các giá trị IC50 thu được sau khi thực hiện thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm JASPR được cung cấp bởi CDC-Altanta Hoa Kỳ. Giá trị ngưỡng và mức độ kháng oseltamivir của vi rút cúm được xác định và phân tích thông qua phần mềm Graphpad Prism 6.0.2, Hoa Kỳ. 2.4.2. Phân tích kết quả giải trình tự gen Trình tự nucleotide phân đoạn gen mã hóa NA và HA của các vi rút sau khi được giải trình tự được phân tích sự tương đồng và các điểm đột biến liên quan đến kháng thuốc bởi phần mềm DNASTAR, Winscosin, USA, Bioedit phiên bản 7.2.3; cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA và NA được xây dựng bằng phần mềm MEGA5 sử dụng phương pháp Maximum Likelihood [59]. Các trình tự phân đoạn gen HA và NA tham chiếu thuộc các phân típ vi rút tương ứng được thu thập từ ngân hàng dữ liệu DNA (www.ncbi.com).
  64. 53 CHƯƠNG III - KẾT QUẢ 3.1. Các vi rút cúm A thu thập trong giai đoạn từ 2001 - 2012 Từ năm 2001 đến 2012, tổng số 342 vi rút cúm A được thu thập với các phân típ A/H1N1, A/H1N1 đại dịch 09 (A/H1N1pdm09), A/H3N2 và A/H5N1. Số lượng và tỷ lệ của các phân típ vi rút cúm A thay đổi theo từng năm và phụ thuộc vào sự lưu hành của vi rút cúm trong giai đoạn nghiên cứu [1, 5]. Trong các năm 2001, 2002 và 2006, chỉ thu thập được vi rút cúm thuộc phân típ A/H1N1; năm 2012 chỉ thu thập được vi rút A/H3N2. Trong khi năm 2003, có cả 3 phân típ vi rút cúm bao gồm H1N1 (74%), H3N2 (21%) và H5N1 (5%) được thu thập. Tương tự, phân típ H3N2 và H5N1 là hai phân típ cúm thu được trong năm 2004, 2005và 2007. Bảng 3.1. Phân bố theo năm các phân típ vi rút cúm A sử dụng trong nghiên cứu A/H1N1 A/H1N1pdm09 A/H3N2 A/H5N1 Tổng Năm N (n/N)% n (n/N)% n (n/N)% n (n/N)% (N) 2001 8 100 - - - - - - 8 2002 4 100 - - - - - - 4 2003 14 74 - - 4 21 1 5 19 2004 - - - - 13 76,4 4 23,6 17 2005 - - - - 2 40 3 60 5 2006 3 100 - - - - - - 3 2007 - - - - 16 66,7 8 33,3 24 2008 7 54 - - 1 7,7 5 38,3 13 2009 6 4,5 86 65,1 36 27,3 4 3,1 132 2010 - - 13 46,4 12 42,9 3 10,7 28 2011 - - 58 98,3 1 1,7 - - 59 2012 - - 0 0 30 100 - - 30 Tổng 42 157 115 28 342 n: Số lượng vi rút thu được theo từng năm của mỗi phân típ N:Số lượng vi rút thu được theo năm
  65. 54 Năm 2008, vi rút H1N1 có mặt với chủng đại diện chiếm 54% số chủng trong năm, 38,3% thuộc vi rút H5N1 và 7,7% là vi rút H3N2. Với sự có mặt của H1N1pdm09 từ cuối tháng 5 năm 2009, năm 2009 có số chủng thu được thuộc bốn phân típ tương đương bốn phân típ cúm lưu hành với tỉ lệ 4,5% H1N1, 65,1%H1N1pdm09, 27,3% H3N2 và 3,1% H5N1. Số chủng thu được năm 2010 bao gồm ba phân típ 46,4% H1N1pdm09, 42,9% H3N2 và 10,7% H5N1. Với sự vắng mặt của H5N1 năm 2011, số chủng cúm thu được trong năm này chỉ gồm hai phân típ H1N1pdm09 với tỉ lệ 98,3% và 1,7% H3N2 (Bảng 3.1). Theo thời gian thực hiện nghiên cứu, số lượng các vi rút lưu hành trong năm cũng như ưu thế của từng phân típ vi rút thể hiện sự khác nhau. Phân típ vi rút A/H1N1 chiếm tỷ lệ tuyệt đối (100%) trong các năm 2001, 2002 và 2006, và giảm trong năm 2003 (74%), 2008 (54%). 2009 (4,5%) và hoàn toàn không xuất hiện trong các năm sau (Bảng 3.1). Sự xuất hiện lần đầu tiên của phân típ A/H1N1pdm09 vào năm 2009 với tỷ lệ 65,1% (2009), 46,4% năm 2010, 98,3% năm 2011 và không phát hiện trong năm 2012. Phân típ A/H3N2 không có đại diện trong nghiên cứu tại các năm 2001, 2002, 2006 (0%) nhưng là phân típ vi rút có mặt hầu hết trong các năm nghiên cứu (9/12 năm) với tỷ lệ dao động từ 1,7% (2011) đến 100% (2012). Với vi rút cúm gia cầm A/H5N1, lần đầu tiên được ghi nhận gây bệnh cho người vào năm 2003 [115] cũng có mặt trong nghiên cứu (5%) và tiếp tục xuất hiện với tỷ lệ dao động từ 3,1% (2009) đến 60% (2005). Vi rút A/H5N1 không xuất hiện tại miền Bắc Việt Nam vào các năm 2006, 2011 và 2012 (Bảng 3.1) 3.2. Xác định giá trị IC50 ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A Sử dụng phần mềm JASPR và Graphpad prism chúng tôi xác định giá trị IC50 trung bình và sự phân bố của các giá trị qua biểu đồ hình hộp và tia (box&whiskers), biểu đồ phân bố độ tập trung. Biểu đồ 1 dạng box&whiskers thể hiện giá trị nhỏ nhất, giá trị lớn nhất và khoảng liên tứ phân vị của các giá trị IC50 được quy ra log10. Toàn bộ vi rút sử dụng trong nghiên cứu được sử dụng để xác định giá trị ngưỡng cho từng phân típ, tuy nhiên phần mềm Graphad prism tự động
  66. 55 loại bỏ các cá thể có những giá trị vượt ngoài khoảng liên tứ phân vị (IQR) vì vậy số vi rút sử dụng trong xây dựng giá trị ngưỡng không tương đồng với tổng số vi rút sử dụng trong nghiên cứu, cụ thể: số vi rút cúm A/H1N1 sử dụng là 30/42 vi rút; A/H1N1pdm09 là 152/157 vi rút; riêng vi rút A/H5N1 số lượng là 21/28 vi rút do có 4 chủng không đủ điều kiện thực hiện thử nghiệm ức chế neuraminidase và 3 chủng có giá trị IC50 vượt ngoài khoảng liên tứ phân vị (Bảng 3.2). Quan sát biểu đồ cho thấy phần lớn các giá trị IC50 của các vi rút tập trung trong khoảng giữa tứ phân vị thứ 1 (Q1) và tứ phân vị thứ 3 (Q3). Giá tr ln nht Q3 Trung vị (Q2) Q1 Giá tr nh nht Biểu đồ 3.1. Sự phân bố giá trị IC50 của toàn bộ các chủng cúm A, 2001-2012 (biểu đồ box and whiskers - giá trị trung vị và 2 giá trị lớn nhất, nhỏ nhất - GraphPad Prism)
  67. 56 Cho dù có sự phân tán lẻ tẻ của giá trị IC50 trong mỗi biểu đồ của từng phân típ vi rút nhưng độ tập trung của số đông vẫn được ghi nhận, vì vậy, kết hợp với phân tích tứ phân vị, chúng tôi có thể xác định được giá trị IC50 ngưỡng của các vi rút tương đương với giá trị trung bình IC50 và giá trị trung vị (Q2). Bảng 3.2. Giá trị IC50 trung bình của các phân típ cúm A thực hiện trong nghiên cứu và giá trị IC50 của các vi rút trong bộ chứng chuẩn [114]. Giá trị IC Vi rút Số vi rút 50 trung bình (nM) A/H1N1 30/42 0,413 A/H1N1pdm09 152/157 0,334 A/H3N2 115/115 0,164 A/H5N1 21/28 2,947 Vi rút chứng Giá trị IC50 (nM) A/Mississippi/03/2001 0,5 (A/H1N1) A/Perth/265/2009 0,6 (A/H1N1pdm09) A/Fukui/20/2004 0,2 (A/H3N2) A/Vietnam/1194/2004# 1,3 (A/H5N1) # : Bộ chứng chuẩn không bao gồm H5N1, chủng chứng được sử dụng là chủng nằm trong nghiên cứu
  68. 57 3.2.1. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H1N1 Giá trị ức chế 50% (IC50) của 30 chủng vi rút cúm A/H1N1 trong nghiên cứu có giá trị trung bình dao động trong khoảng 0,061 – 0,765nM. Độ tập trung của giá trị IC50 được biểu thị qua biểu đồ 3.2 với log10 giá trị IC50 cho thấy tổng số 30/42 cá thể có giá trị IC50 nằm dưới giá trị IC50 trung bình (0,413nM) và 12 cá thể còn lại có IC50 lớn hơn giá trị trung bình. Toàn bộ số cá thể này đều nằm trong trong khoảng giữa tứ phân vị thứ 1 (Q1) và tứ phân vị thứ 3 (Q3). So sánh với vi rút chuẩn A/Mississippi/03/2001 (A/H1N1) có giá trị IC50 là 0,5nM cũng nằm trong nhóm đông của vi rút nghiên cứu, vì vậy giá trị IC50 ngưỡng được xác định cho phân típ vi rút A/H1N1 trong nghiên cứu này chính là giá trị IC50 trung bình đã được xác định là 0,413 ± 0.352 nM (Biểu đồ 3.2) Giá trị trung bình Biểu đồ 3.2. Độ tập trung các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 trong nghiên cứu 3.2.2. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H1N1pdm09 Với các chủng A/H1N1pdm09, sự dao động giá trị IC50 trong tổng số 152 vi rút được phân tích không nhiều, độ tập trung cao của 147/ 152 vi rút xung quanh giá trị IC50 trung bình 0,334nM được ghi nhận tại biểu đồ 3.3, tương tự giá trị IC50 của vi rút tham chiếu chuẩn A/Perth/265/2009 (A/H1N1pdm09) là 0,6nM, vì vậy giá trị ngưỡng của vi rút được xác định là 0,334 ± 0,286 nM.(Biểu đồ 3.3.)
  69. 58 Giá trị trung bình Biểu đồ 3.3. Độ tập trung các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 trong nghiên cứu 3.2.3. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H3N2 Tổng số 115 chủng vi rút thuộc phân típ A/H3N2 có giá trị IC50 vi rút trung bình dao động từ 0,04 đến 0,29 nM . Biểu đồ 4 cho thấy sự tập trung cao xung quanh giá trị IC50 trung bình 0,164 nM , tương đương với giá trị IC50 0,2 nM của vi rút tham chiếu chuẩn A/Fukui/20/2004 (A/H3N2), vì vậy giá trị IC50 ngưỡng của phân típ vi rút cúm A/H3N2 được xác định là 0,164 ± 0,126 nM. (Biểu đồ 3.4.) Giá trị trung bình Biểu đồ 3.4. Độ tập trung các giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 trong nghiên cứu
  70. 59 3.2.4. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H5N1 Tổng số 21/28 chủng vi rút cúm A/H5N1 được chấp nhận phân tích kết quả theo chương trình Graphpad prism. Phân tích cụ thể theo từng cá thể cho thấy giá trị IC50 nhỏ nhất là 0,13 nM, giá trị lớn nhất là 8,98 nM đã được ghi nhận. Khoảng cách giữa các giá trị IC50 đã được biểu hiện trên biểu đồ 3.5 cho thấy số vi rút A/H5N1 có giá trị IC50 tập trung gần hoặc dưới giá trị IC50 trung bình 2,947 nM chiếm đa số (17/21), giá trị IC50 của chủng vi rút tham chiếu chuẩn A/Vietnam/1194/2003 (A/H5N1) là 1,3 nM, thấp hơn giá trị trung bình của các vi rút trong nghiên cứu. Giá trị ngưỡng của phân típ cúm A/H5N1 được xác định sẽ là 2,947 ± 2,539 nM (Biểu đồ 3.5) Biểu đồ 3.5. Độ tập trung các giá trị IC50 của các chủng A/H5N1 trong nghiên cứu Như vậy, chúng tôi đã xác định được giá trị ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A trong nghiên cứu là: Phân típ vi rút cúm Giá trị IC50 ngưỡng Vi rút A/H1N1 0,413 ± 0.352 nM Vi rút A/H1N1pdm09 0,334 ± 0,286 nM Vi rút A/H3N2 0,164 ± 0,126nM Vi rút A/H5N1 2,947 ± 2,539 nM
  71. 60 3.3. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A 3.3.1. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H1N1 Tổng số 42 vi rút A/H1N1 lưu hành từ năm 2001 đến 2009 được thu thập, sử dụng thử nghiệm ức chế neuraminidase (NAI), chúng tôi đã xác định được 12 vi rút A/H1N1 có giá trị IC50 cao hơn giá trị ngưỡng trong nghiên cứu. Toàn bộ các vi rút này được xác định là vi rút lưu hành trong năm 2008 và 2009 (Bảng 3.3). Bảng 3.3. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 kháng oseltamivir năm 2008 và 2009 Giá trị Giá trị IC50 Giá trị IC50/ Giá Năm Tên chủng/Số chủng IC50 (nM)±SD trị IC50 ngưỡng ngưỡng 2001 8 0,28 ± 0,09 0,68 2002 4 0,51 ± 0,32 1,23 2003 14 0,33 ± 0,14 0,79 2006 3 1,06 ± 0,09 2,57 A/Vietnam/TX285/08 534,23 ± 3,58 1294 A/Vietnam/TB289/08 1624,44 ± 4,52 3933 A/Vietnam/TX200/08 456,11 ± 5,38 1104 2008 A/Vietnam/TX233/08 453,28 ± 9,39 1097 A/Vietnam/BT241/08 678,45 ± 6,12 0,413 1643 A/Vietnam/LS324/08 59,98 ± 2,35 145 A/Vietnam/32036/09 704,20 ± 4,80 1705 A/Vietnam/EL197/09 581,24 ± 4,78 1407 A/Vietnam/Q271/09 464,86 ± 6,49 1126 2009 A/Vietnam/31808/09 527,95 ± 15,75 1278 A/Vietnam/34381/09 575,72 ± 5,81 1273 A/Vietnam/N116/09 565,95 ± 11,17 1370 Chứng A/Mississippi/03/2001 458,2 1109
  72. 61 Các năm trước đó, vi rút cúm A/H1N1 được xác định là nhạy cảm với oseltamivir, khi các giá trị IC50 nằm trong giới hạn ngưỡng ức chế bình thường của oseltamivir đối với vi rút H1N1. Đối với số vi rút cúm A/H1N1 (11 vi rút) trong năm 2008 và 2009 có giá trị IC50 cao hơn giá trị IC50 ngưỡng trên 1000 lần, đặc biệt một chủng A/Vietnam/TB289/08 có giá trị IC50 1624,44 nM cao gấp 3933 lần giá trị ngưỡng. Tuy cũng có biểu hiện kháng nhưng A/Vietnam/LS324/08 có giá trị IC50 59,98nM tương đương gấp hơn 100 lần giá trị ngưỡng. 3.3.2. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H1N1pdm09 Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi xác định được hai chủng cúm A/H1N1pdm09 là A/Vietnam/33419/09 có giá trị IC50 125.99nM năm 2009 và A/Vietnam/36530/11 127.91nM năm 2011 có giá trị IC50 tăng từ 350 – 400 lần so với giá trị IC50 ngưỡng của vi rút H1N1pdm09 (Bảng 3.4). Ngoài ra, số liệu trong bảng 3.4 còn thể hiện giá trị IC50 của ba chủng H1N1pdm09 đã được thực hiện năm 2009 [58]. So với giá trị IC50 ngưỡng, ba chủng H1N1pdm09 này đều có giá trị IC50 cao trên 1000 lần. Bảng 3.4. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 kháng oseltamivir năm 2009 và 2011 Giá trị IC50/ Giá trị IC50 Giá trị IC50 Năm Tên chủng Giá trị IC50 (nM)±SD ngưỡng ngưỡng A/Vietnam/32043/09 429,5 ± 10,25 1422 A/Vietnam/32060/09 323,66 ± 12,68 1072 2009 A/Vietnam/32067/09 889,2 ± 9,73 2944 0,334 A/Vietnam/33419/09 125,99 ± 13,44 417 2011 A/Vietnam/36530/11 127,91 ± 9,84 356 Chứng A/Perth/261/2009 191,2 572
  73. 62 3.3.3. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H3N2 Kết quả thử nghiệm NAI thực hiện trên 157 chủng vi rút A/H3N2 cho thấy giá trị IC50 của các chủng H3N2 dao động trong khoảng 0,038 – 0,29nM, không phát hiện vi rút nào có giá trị nào vượt giá trị ngưỡng (0,164nM) từ 10 lần trở lên (theo bảng nhận định kết quả). Bảng 3.5 cho thấy giá trị IC50 theo từng năm của vi rút H3N2. Kết quả này cho phép khẳng định trong nghiên cứu này vi rút cúm A/H3N2 lưu hành tại Việt Nam giai đoạn 2003 -2012 có đáp ứng tốt với thuốc kháng vi rút oseltamivir. Bảng 3.5. Giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 từ năm 2003 đến 2012 Giá trị IC Giá trị IC trung Năm 50 SD (nM) 50 trung bình (nM) bình ± SD (nM) 2003 0,302 0,299 2004 0,169 0,139 2007 0,323 0,254 0,164 ± 0,126 2009 0,055 0,040 2010 0,093 0,076 2012 0,190 0,099 3.3.4. Mức độ giảm độ nhạy, kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A/H5N1 Số chủng vi rút cúm A/H5N1 thực hiện trong nghiên cứu là 28 vi rút phân lập trên bệnh nhân nhiễm vi rút cúm A/H5N1 trong giai đoạn từ 2004-2010. Kết quả nghiên
  74. 63 Bảng 3.6. Giá trị IC50 các chủng A/H5N1 năm 2005 và 2008 Giá trị IC50/ Giá trị IC50 Giá trị IC50 Năm Tên chủng Giá trị IC50 (nM)±SD ngưỡng ngưỡng 2005 A/Vietnam/HN30408/05 90 ± 5,82 30 A/Vietnam/HN31412/08 19,04 ± 2,34 6 2008 2,947 A/Vietnam/HN31413/08 14,48 ± 2,09 5 Chứng A/Vietnam/HN30408/05 90 30 cứu đã xác định được 2 vi rút A/Vietnam/HN31412/08 và A/Vietnam/HN31413/08 lưu hành năm 2008 có giá trị IC50 đạt 19,04nM (19,04 ± 2,34nM) và 14,48nM (14,48 ± 2,09nM). Hai vi rút này có giá trị IC50 cao hơn giá trị ngưỡng lần lượt là 6 lần và 5 lần. Ngoài ra, chủng A/Vietnam/HN30408/05 lưu hành năm 2005 có giá trị IC50 đã được xác định năm 2005 tăng 30 lần so với giá trị ngưỡng (Bảng 3.6). 3.3.5. Nhận định kết quả kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A lưu hành 2001 – 2012 Theo phân loại của TCYTTG về sự tương tác của oseltamivir tới các vi rút cúm liên quan đến hiện tượng giảm độ nhạy hoặc kháng thuốc [114], kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy có 20 vi rút thuộc các phân típ A/H1N1; A/H1N1pdm09 và A/H5N1 có giá trị IC50 cao hơn giá trị ngưỡng được xác định đều có thể xếp loại vào các mức độ giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir (Bảng 3.7).