Khóa luận Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

86 trang thiennha21 13/04/2022 8001

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_toi_uu_hoa_moi_truong_nuoi_cay_chung_lactobacillus.pdf

Nội dung text: Khóa luận Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: TỐI ƯU HỐ MƠI TRƯỜNG NUƠI CẤY CHỦNG Lactobacillus plantarum NT1.5 BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH SVTH : TRẦN THỊ KIỀU MSSV : 1053012348 KHỐ: 2010 – 2014 Tp.Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2014
LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Cơ Dương Nhật Linh và thầy Nguyễn Văn Minh – giảng viên khoa Cơng nghệ Sinh học Trường Đại Học Mở Tp Hồ chí Minh, cơ thầy là người đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện, truyền đạt kiến thức để em cĩ thể hồn thành tốt đề tài. Chân thành cảm ơn các thầy, cơ khoa Cơng nghệ Sinh học trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức cơ bản làm nền tảng để em cĩ thể hồn thành đề tài. Thầy Đan Duy Pháp, chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Phạm Thị Minh Trang, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh, anh Nguyễn Đạt Phi là người đã truyền đạt những kinh nghiệm, động viên giúp đỡ em vượt qua những khĩ khăn trong thời gian thực hiện đề tài. Xin cảm ơn đến các anh/ chị, các bạn và các em Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh đã giúp đỡ, động viên em trong thời gian qua. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến Ba, Mẹ, gia đình đã luơn bên cạnh ủng hộ tạo điều kiện tốt nhất cho con hồn thành tốt việc học tập của mình. Chân thành cảm ơn! Bình Dương, ngày tháng năm 2014 TRẦN THỊ KIỀU SVTH: TRẦN THỊ KIỀU i
TỔNG QUAN TÀI LIỆU MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC 5 1.1.1. Giới thiệu 5 1.1.2. Con đường biến dưỡng của vi khuẩn lactic 7 1.1.3. Tổng quan về Lactobacillus plantarum 8 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC VỀ LACTOBACILLUS 10 1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới 10 1.2.2. Các nghiên cứu trong nước 11 1.3. QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM 12 1.3.1. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 12 1.3.2. Thí nghiệm sàng lọc 14 1.3.3. Thí nghiệm tối ưu hĩa 16 1.4. PHẦN MỀM QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM MINITAB 16.2.0 20 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGIÊN CỨU 24 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 24 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 24 2.2.2. Mơi trường – hĩa chất 24 2.2.3. Dụng cụ 24 2.2.4. Trang thiết bị 24 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.3.1. Hoạt hĩa chủng 25 2.3.3. Xây dựng đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 26 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU i
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.3.4. Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp cho sự tăng trưởng của L. plantarum NT1.5 27 2.3.5. Sàng lọc các yếu tố dinh dưỡng 28 2.3.6. Thiết kế thí nghiệm tìm yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tăng sinh khối theo thiết kế Plackett- Burman 30 2.3.7. Thí nghiệm khởi đầu 32 2.3.8. Tìm khoảng tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính bằng phương pháp leo dốc 32 2.3.9. Thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu xác định giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính. 33 2.3.10. Xác định thời gian tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5 trên mơi trường tối ưu 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN GIỮA MẬT ĐỘ TẾ BÀO VI KHUẨN VÀ GIÁ TRỊ OD610 35 3.2 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT 1.5 36 3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ, pH THÍCH HỢP CHO SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT1.5. 38 3.4 KẾT QUẢ SÀNG LỌC YẾU TỐ DINH DƯỠNG 39 3.4.1. Nguồn nitơ 39 3.4.2. Nguồn cacbon 41 3.4.3. Nguồn khống 42 3.5 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CHÍNH THEO THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM PLACKETT- BURMAN 44 3.6 KẾT QUẢ THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM KHỞI ĐẦU 48 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU ii
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.7 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM LEO DỐC 50 3.8 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM BOX-BEHNKEN 52 3.9. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT1.5 TRÊN MƠI TRƯỜNG TỐI ƯU 57 4.1 KẾT LUẬN 61 4.2 KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 68 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU iii
TỔNG QUAN TÀI LIỆU DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA One-way analysis of variance CFU Colony forming unit Cs. Cộng sự L. plantarum Lactobacillus plantarum MRS Deman, Rogosa and Sharpe Nm nanomet OD Optical Density P-B Plackett-Burman WHO World Health Organization BSH Bile salt hydrolase SVTH: TRẦN THỊ KIỀU iv
TỔNG QUAN TÀI LIỆU DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Streptococcus 6 Hình 1.2 Lactobacillus 6 Hình 1.3 Lactobacillus plantarum dưới kính hiển vi điện tử (Reichelt J., 2013) 9 Hình 1.6 Hộp đen trong hệ thống điều khiển một quá trình. 13 Hình 1.8 Ma trận bố trí thí nghiệm theo thiết kế Box – Behnken (Box và Behnken, 1960) 20 Hình 1.9 Giao diện phần mềm Minitab 16.2.0 22 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU v
TỔNG QUAN TÀI LIỆU DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các nguồn nitơ khảo sát 28 Bảng 2.2. Các nguồn cacbon khảo sát 29 Bảng 2.3. Các nguồn khống khảo sát 30 Bảng 3.1: Giá trị đo OD610 và mật độ tế bào (Log(N/mL) 35 Bảng 3.2. Giá trị OD610 theo thời gian 36 Bảng 3.3. Mật độ tế bào Lactobacillus plantarum NT1.5 (Log (N/ mL)) tại mỗi giá trị nhiệt độ và độ pH khảo sát 38 Bảng 3.4. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn nitơ khảo sát 40 Bảng 3.5. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn cacbon khảo sát 41 Bảng 3.6. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn muối khống khảo sát 43 Bảng 3.7. Mức ảnh hưởng của từng yếu tố 44 Bảng 3.8: Kết quả thí nghiệm Plackett- Burman 45 Bảng 3.10 Bảng tính tốn bước chuyển động của các yếu tố ảnh hưởng chính 50 Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm leo dốc 51 Bảng 3.12 Bảng giá trị các biến số thí nghiệm Box-Behnken 53 Bảng 3.13 Bảng biến số các giá trị thí nghiệm Box-Behnken 53 Bảng 3.14 Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố 56 Bảng 3.15 Giá trị OD theo thời gian 57 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU i
TỔNG QUAN TÀI LIỆU DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.4. Kết quả khảo sát nguồn nitơ 40 Đồ thị 3.5. Kết quả khảo sát nguồn Cacbon 42 Đồ thị 3.6. Kết quả khảo sát nguồn muối khống 43 Đồ thị 3.7. Đồ thị các ảnh hưởng chính (Main Effects Plot) 47 Đồ thị 3.1 Đồ thị đường mức biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các cặp biến khác nhau 55 Đồ thị 3.2 Đồ thị bề mặt biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các cặp biến khác nhau 56 Đồ thị 3.9 Đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 theo thời gian trên mơi trường tối ưu 58 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU ii
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU Cholesterol trong máu tăng làm tăng nguy cơ bệnh tim và đột quỵ, một phần ba bệnh tim thiếu máu cục bộ là do cholesterol cao. Nhìn chung, cholesterol tăng ước tính gây ra 2,6 triệu ca tử vong (4,5% của tổng số) và 29,7 triệu người gánh hậu quả. Tổng số cholesterol trong máu cao là nguyên nhân chính gây bệnh tật ở cả các nước phát triển và đang phát triển như là một yếu tố nguy cơ bệnh tim thiếu máu cục bộ và đột quỵ (WHO, 2013). Việc giảm cholesterol là vấn đề rất quan trọng để ngăn ngừa bệnh tim mạch (Lim và cs., 2004). Một trong những giải pháp đĩ là nghiên cứu vi khuẩn lactic vừa cĩ hoạt tính probiotic và vừa cĩ hoạt tính làm giảm cholesterol là vấn đề thiết thực, được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu. Trong những năm gần đây cĩ nhiều nghiên cứu chứng minh enzym thủy phân muối mật (BSH) từ vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Biﬁdobacterium, Enterococcus ) cĩ tác dụng làm giảm cholesterol (Lim, 2004; Liong, 2005). Ngồi ra, vi khuẩn lactic cịn cĩ khả năng giảm cholesterol bằng cách hấp thu trực tiếp vào màng tế bào (Ziarno, 2007). Ngày nay việc sản xuất thực phẩm chức năng chứa vi khuẩn probiotic như Lactobacilli cĩ tầm quan trọng ngày càng tăng. Những vi khuẩn này cĩ tác dụng kháng khuẩn, làm tăng giá trị cảm quan, dinh dưỡng và mang lại lợi ích sức khỏe cho người tiêu dùng (Shahravy, 2012). Vi khuẩn Lactobacillus plantarum NT1.5 đã được chứng minh cĩ khả năng làm giảm cholesterol thơng qua việc hấp thụ cholesterol qua màng tế bào và khả năng sinh enzym BSH đồng thời cĩ hoạt tính probiotic như: khả năng chịu pH dạ dày, kháng muối mật, kháng khuẩn, (Dương Nhật Linh, 2013). Vì vậy Lactobacillus plantarum NT1.5 cĩ thể được ứng dụng để sản xuất các chế phẩm probiotic cĩ hoạt tính làm giảm cholesterol. Ngày nay, nhu cầu sử dụng thực phẩm lên men kết hợp với chế phẩm sinh học ngày càng tăng. Để đáp ứng nhu cầu này, việc sản xuất lượng lớn sinh khối vi sinh vật đang được quan tâm. Do đĩ, nghiên cứu phát triển mơi trường nuơi cấy mới để tăng SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU cường sản xuất sinh khối cĩ thể dẫn đến việc sản xuất probiotic cĩ hiệu quả kinh tế hơn (Shahravy, 2012). Vì vậy chúng tơi thực hiện đề tài “Tối ưu hĩa mơi trường nuơi cấy chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm”. Nội dung thực hiện: Xây dựng được biểu đồ thể hiện mối tương quan giữa giá trị OD và nồng độ tế bào tương ứng với từng giá trị OD. Xây dựng đường cong tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5, xác định thời gian tăng trưởng tối ưu của vi khuẩn. Khảo sát nhiệt độ, pH tối ưu cho sự phát triển của chủng L. plantarum NT1.5 Chọn lựa nguồn cacbon, nitơ và các nguồn khống. Xác định các yếu tố ảnh hưởng chính đến quá trình tăng sinh khối của Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng thiết kế Plackett – Burman (P - B). Xác định giá trị tối ưu của các thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuơi cấy bằng phương pháp Box-Behnken. Nuơi cấy thử nghiệm. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC 1.1.1. Giới thiệu Vi khuẩn lactic acid (LAB) là nhĩm vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên được ứng dụng trong nhiều ngành cơng nghiệp, là một chế phẩm sinh học an tồn cho con người (David, 2013). Theo khĩa phân loại Bergey (2001), vi khuẩn lactic được sắp xếp: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ I: Lactobacillaceae Giống I: Lactobacillus Giống II: Pediococcus Họ II: Enterococceae Giống: Enterococcus Họ III: Leuconoscaceae Giống: Leuconostoc Họ IV: Streptococcaceae Giống I: Streptococcus Giống II: Lactococcus Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, thường khơng di động, khơng sinh bào tử, các phản ứng catalase âm, oxydase âm, nitratreductase âm. Những vi khuẩn này cĩ khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống rất yếu, cho nên chúng là những vi sinh vật khuyết dưỡng đối với nhiều loại acid amin, base nucleotic, nhiều loại vitamin , bình thường chúng khơng cĩ cytochrome. Vì vậy, chúng được xếp vào nhĩm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, hoặc gọi là vi hiếu khí, cĩ khả năng lên men trong điều kiện vi hiếu khí cũng như kỵ khí. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 5
TỔNG QUAN TÀI LIỆU LAB cĩ liên kết chặt chẽ với vi khuẩn cĩ lợi trên niêm mạc ruột của người và động vật. LAB bao gồm khoảng 20 chi trong đĩ chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pedicoccus và Streptococcus là những chi điển hình (Marcel, 2005). Trong đĩ tế bào của chúng cĩ dạng hình cầu như Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus. a b Hình 1.1 Streptococcus a: Streptococcus dưới kính hiển vi điện tử b: Streptococcus nhuộm Gram b a Hình 1.2 Lactobacillus a: Lactobacillus dưới KHV điện tử b:Lactobacillus nhuộm Gram SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 6
TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bifidobacteria cũng được xem là một chi của lactic acid bacteria do cĩ cùng đặc điểm tiêu biểu và cách thức lên men đường. 1.1.2. Con đường biến dưỡng của vi khuẩn lactic Sự phân loại giữa các chi của vi khuẩn lactic dựa trên hình thái, cách thức lên men đường, sự phát triển ở những nhiệt độ khác nhau, cấu trúc của sản phẩm acid lactic, khả năng chịu muối, chịu acid hoặc kiềm (Mascel, 2005). LAB cĩ hai con đường lên men đường chính (Mascel, 2005): Glycolysis (Embden- Meyerhof- Parnas pathway): sản phẩm cuối cùng là acid lactic hay cịn gọi là con đường lên men lactic đồng hình. Con đường 6- phosphogluconate/ phosphoketolase: sản phẩm của quá trình lên men này ngồi acid lactic cịn cĩ ethanol, acetate và CO2 hay cịn gọi là quá trình lên men dị hình. Dựa vào khả năng lên men đường người ta chia LAB thành LAB đồng hình và LAB dị hình. 1.1.2.1 Lên men đồng hình Vi khuẩn lactic lên men đồng hình gần như chuyển hĩa hồn tồn đường chúng sử dụng thành acid lactic. Trong điều kiện thừa glucose và oxy hạn chế lên men đồng hình 1 mol glucose theo con đường chuyển hĩa EMB (Embden – Meyerhoff – Parnas) tạo 2 mol pyruvate. Sự cân bằng oxi hĩa khử trong tế bào được duy trì thơng qua các quá trình oxi hĩa của NADH, song song đĩ là sự khử pyruvat thành acid lactic. Các phản ứng diễn ra trong phần nền tế bào chất. Các enzym đặc trưng trong quá trình này là aldolase và triozophosphateisomerase. Glucose khơng phải là đường duy nhất cĩ thể được sử dụng. Với hệ thống enzym thích hợp, các loại đường khác cĩ thể được chuyển đổi thành glucose hoặc một trong những chất trung gian trong quá trình như glucose- 6-phosphate (hoặc trong trường hợp đường pentose, ribulose-5-phosphate). Khả năng sử dụng các loại đường khác nhau ở vi khuẩn lactic thay đổi theo lồi. Đại diện cho SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 7
TỔNG QUAN TÀI LIỆU kiểu lên men này là các giống Lactococcus, Streptococcus,Petiococcus và Lactobacillus nhĩm I. (Desantis và cs., 1989) 1.1.2.2 Lên men dị hình Lên men dị hình sử dụng con đường pentose phosphate, cách gọi khác là con đường phosphoketolase pentose. Một phân tử glucose-6-phosphate ban đầu bị khử hydro thành 6- phosphogloconate và sau đĩ khử nhĩm carboxyl hình thành một phân tử CO2. Kết quả là pentose -5- phosphate bị chia ra thành một glyceraldehyde phosphate (GAP) và một phân tử acetyl phosphate. GAP sau đĩ được chuyển hĩa thành lactate như trong lên men đồng hình, với acetyl phosphate bị biến đổi thành ethanol qua chất trung gian là acetyl – CoA và acetaldehyde. Về mặt lý thuyết, sản phẩm cuối cùng (bao gồm ATP) được sản xuất cĩ số lượng bằng với sản phẩm từ quá trình dị hĩa một phân tử glucose. Hai enzyme đặc trưng trong quá trình này là transketolase xúc tác chuyển hĩa nhĩm ketol-2C và transaldolase xúc tác chuyển hĩa nhĩm 3C. Quá trình này xảy ra trong cytosol. Các LAB lên men dị hình bắt buộc gồm Leuconostoc oenococcus, Weissella và Lactobacillus nhĩm III. (Desantis và cs., 1989) 1.1.3. Tổng quan về Lactobacillus plantarum 1.1.3.1. Phân loại Theo Bergey và cộng sự, (1923) Lactobacillus plntarum được phân loại: Giới (Kingdom): bacteria Ngành (Division): Firmicutes Lớp (Class): Bacilli Bộ (Order): Lactobacillales Họ (Family): Lactobacillaceae Giống (Genus): Lactobacillus Lồi: L. Plantarum 1.1.3.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn Lactobaciillus plantarum Lactobacillus plantarum là một trong hơn 50 lồi Lactobacillus. Lactobacillus plantarum là vi khuẩn gram dương, catalase âm (Bujalence, 2006), hình trực khơng SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 8
TỔNG QUAN TÀI LIỆU sinh bào tử được tìm thấy trong hệ tiêu hĩa của người và động vật. Vi khuẩn này lần đầu tiên được tìm thấy trong nước bọt của con người. (Waugh và cs., 2009) Lactobacillus plantarum là một loại vi khuẩn cĩ khả năng thích nghi cao, nĩ cĩ thể tồn tại ở phạm vi nhiệt độ rộng lớn (từ 1-600C) (Natural New, 2010), kị khí tùy nghi. Trong chi Lactobacillus, L. Plantarum được xếp vào nhĩm vi khuẩn lên men dị hình, cĩ thể sống trong nhiều mơi trường như thịt, cá, sữa, các quá trình lên men thực vật, thực vật và trong nhiều loại pho mát. (Kohajdová, 2012). L. plantarum cĩ nhiều điểm khác biệt so với các lồi lactobacillus khác ở những điểm sau: - Cĩ bộ gen tương đối lớn nên cĩ thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau (Kleerebezem và cs., 2003) - Cĩ thể lên men nhiều loại đường. -Thích nghi cao với điều kiện acid, chịu pH thấp (Daeschel và Nes 1995). - Cĩ thể chuyển hĩa acid phenolic (Barthelmebs và cs., 2000; Barthelmebs và cs., 2001), phân giải muối tanat nhờ hoạt động của enzyme tannase (Vaquero và cs., 2004). Hình 1.3 Lactobacillus plantarum dưới kính hiển vi điện tử (Reichelt J., 2013) 1.1.3.3. Lợi ích của vi khuẩn L. plantarum Lactobacillus plantarum cĩ nhiều trong nước bọt và đường tiêu hĩa của con người. Nĩ thường được sử dụng trong các quá trình lên men thực phẩm và làm probiotic. Các chế phẩm sinh học sử dụng L. plantarum ngày càng được cơng nhận trên thị trường. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 9
TỔNG QUAN TÀI LIỆU L. plantarum cĩ thể nâng cao tính tồn vẹn ruột, hoạt động trao đổi chất của các tế bào đường ruột, kích thích phản ứng miễn dịch (Nissen và cs., 2009). Giảm thiểu một số triệu chứng rối loạn tiêu hĩa khi điều trị bằng kháng sinh (Lonnermark và cs., 2009). Theo nghiên cứu của nhĩm Karlsson và cộng sự (2009) được tiến hành ở Thụy Điển cho thấy uống trực tiếp L. plantarum cĩ thể tăng tính đa dạng của hệ vi sinh vật ở ruột kết. Bảo vệ tế bào biểu mơ khỏi sự gây hại của E. coli bằng cách thay đổi hình thái tế bào chủ, giảm hình thành tổn thương, tăng sức đề kháng và khả năng thẩm thấu đơn lớp phân tử (Qin và cs., 2009). 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC VỀ LACTOBACILLUS Các nghiên cứu về vi khuẩn lactic đã và đang được triển khai rộng rãi trên tồn thế giới, trong đĩ đã cĩ rất nhiều cơng trình nghiên cứu về Lactobacillus. Tuy nhiên ở Việt Nam, số lượng các nghiên cứu về vi khuẩn lactic cịn quá khiêm tốn và cĩ rất ít cơng trình nghiên cứu về tối ưu hĩa mơi trường nuơi cấy Lactobacillus. Phần lớn các nghiên cứu về Lactobacillus ở trong nước chỉ là nghiên cứu cơ bản về nhĩm vi khuẩn này như ở mức phân lập và định danh, tuyển chọn giống cĩ hoạt tính tốt để làm probiotic. 1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới Năm 2012, Hu và cộng sự đã cơng bố nghiên cứu về tối ưu hĩa mơi trường nuơi cấy Lactobacillus plantarum YSQ khi sử dụng các sản phẩm nơng nghiệp cĩ giá thành thấp như bột đậu nành, bột ngơ, lúa mì và nước ép cà chua làm nguồn dinh dưỡng, từ đĩ làm giảm giá thành sản phẩm khi lên men theo quy mơ lớn. Năm 2010, Magdalena và cộng sự đã cơng bố nghiên cứu về tối ưu hĩa các yếu tố dinh dưỡng như nguồn cacbon, nitơ, muối khống và các yếu tố tăng trưởng (vitamin B, axit amin) khi dùng phương pháp bề mặt đáp ứng để tăng sinh khối vi khuẩn Lactobacillus rhamnosus PEN. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 10
TỔNG QUAN TÀI LIỆU Năm 2006, Altaf và cộng sự đã tối ưu hĩa mơi trường thu acid lactic cho chủng Lactobacillus amylophilus GV6 bằng cách sử dụng các nguồn cacbon, nitơ rẻ tiền như: bột bắp, bột đậu lăng đỏ thay thế cho pepton, glucose trong mơi trường MRS bằng phương pháp Plackett-Burman và đáp ứng bề mặt (RSM). Kết quả cho thấy Lactobacillus amylophilus GV6 đạt được hiệu suất 78,4% và năng suất 96% (g acid lactic/ g tinh bột được sử dụng). Farooq và cộng sự (2012) đã sử dụng mật rỉ đường (phụ phẩm của quá trình sản xuất đường mía) làm nguồn cacbon trong mơi trường tối ưu thu sinh khối của vi khuẩn Lactobacillus delbrueckii. Năm 1995, Oh và cộng sự đã cơng bố nghiên cứu về các giá trị tối ưu của trypton, cao nấm men, glucose, nhiệt độ nuơi cấy cho sự tăng trưởng của Lactobacillus casei YIT 9018. Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của L.casei YIT 9018 như sau: trypton, 3,04%; cao nấm men, 0,892%; glucose, 1,58%; nhiệt độ nuơi cấy là 35oC. Năm 2006, Zhong đã cơng bố nghiên cứu về tối ưu hĩa mơi trường nuơi cấy Lactobacillus casei LC2W bằng phương pháp bề mặt đáp ứng để tăng cường sản xuất exopolysaccharid. Kết quả tối ưu các điều kiện nuơi cấy để sản xuất exopolysaccharid: nhiệt độ nuơi cấy là 32,5°C và thời gian nuơi là 26 giờ. 1.2.2. Các nghiên cứu trong nước Năm 1996, Nguyễn Đăng Diệp và cộng sự đã cơng bố nghiên cứu về mơi trường nuơi vi khuẩn lactic tốt nhất. Mơi trường đĩ là sữa gầy hồn nguyên với thời gian lên men tốt nhất là 18-20 giờ, bổ sung giống 2-3%. Trong cơng bố nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Hà và cộng sự năm 2003 đã sử dụng hai chủng Bifidobacteria bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic. Tìm ra được ba mơi trường thích hợp nuơi cấy vi khuẩn Bifidobacteria bifidum là mơi trường thyoglycolat, mơi trường nước chiết gan, mơi trường nước chiết thịt bị ở điều kiện nuơi cấy kỵ khí. Mơi trường thích hợp cho L. acidophilus là mơi SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 11
TỔNG QUAN TÀI LIỆU trường MRS, mơi trường nước chiết cà chua, mơi trường nước chiết giá, mơi trường nước thải của Cơng ty sữa Vinamilk. 1.3. QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM Quy hoạch thực nghiệm là dạng nghiên cứu về mối quan hệ nguyên nhân – kết quả. Trước hết, nhà nghiên cứu cần xác định các thơng số (hay các biến) cần và cĩ thể quan tâm rồi đưa ra các chiến thuật làm thực nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình nghiên cứu đối tượng (từ nhận thơng tin mơ phỏng đến việc tạo ra mơ hình tốn, xác định các điều kiện tối ưu), trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết đầy đủ về cơ chế của đối tượng. (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011). 1.3.1. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm Quy hoạch thực nghiệm là cơ sở phương pháp luận của nghiên cứu thực nghiệm hiện đại. Đĩ là phương pháp nghiên cứu mới, trong đĩ cơng cụ tốn học giữ vai trị tích cực. Cơ sở tốn học nền tảng của lý thuyết qui hoạch thực nghiệm là tốn học xác suất thống kê với hai lĩnh vực quan trọng là phân tích phương sai và phân tích hồi qui (Giang Thị Kim Liên, 2009). 1.3.1.1. Khái niệm Quy hoạch thực nghiệm là tập hợp các tác động nhằm đưa ra chiến thuật làm thực nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình nghiên cứu đối tượng (từ nhận thơng tin mơ phỏng đến việc tạo ra mơ hình tốn, xác định các điều kiện tối ưu), trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết đầy đủ về cơ chế của đối tượng (Giang Thị Kim Liên, 2009). 1.3.1.2. Đối tượng Là một quá trình hoặc hiện tượng nào đĩ cĩ những tính chất, đặc điểm chưa biết cần nghiên cứu. Người nghiên cứu cĩ thể chưa hiểu biết đầy đủ về đối tượng, nhưng đã cĩ một số thơng tin tiên nghiệm dù chỉ là sự liệt kê sơ lược những thơng tin biến đổi, ảnh hưởng đến tính chất đối tượng. Cĩ thể hình dung chúng như một “hộp đen” trong hệ thống điều khiển gồm các tín hiệu đầu vào và đầu ra (Giang Thị Kim Liên, 2009). SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 12
TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hình 1.6 Hộp đen trong hệ thống điều khiển một quá trình. Các tín hiệu đầu vào được chia thành ba nhĩm: (Giang Thị Kim Liên, 2009) 1) Các biến kiểm tra được và điều khiển được, mà người nghiên cứu cĩ thể điều chỉnh theo dự định, biểu diễn bằng vectơ: Z = [Z1, Z2, , Zk] 2) Các biến kiểm tra được nhưng khơng điều khiển được, biểu diễn bằng vectơ: T = [T1, T2, , Th] 3) Các biến khơng kiểm tra được và khơng điều khiển được, biểu diễn bằng vectơ: E = [E1, E2, , Ef] Các tín hiệu đầu ra dùng để đánh giá đối tượng là vectơ Y = (y1, y2, , yq). Chúng thường được gọi là các hàm mục tiêu. Biểu diễn hình học của hàm mục tiêu được gọi là mặt đáp ứng (bề mặt biểu diễn). Phương pháp tốn học trong xử lý số liệu từ kế hoạch thực nghiệm là phương pháp thống kê. Vì vậy các mơ hình biểu diễn hàm mục tiêu chính là các mơ hình thống kê thực nghiệm. Các mơ hình này nhận được khi cĩ cơng tính nhiễu ngẫu nhiên. 1.3.1.3. Ưu điểm về quy hoạch thực nghiệm Quy hoạch thực nghiệm đĩng vai trị quan trọng trong khoa học kỹ thuật. Các mơ hình lý thuyết, giải thuật, quá trình mới luơn được kiểm nghiệm thực trước khi đem ra SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 13
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ứng dụng. Hơn nữa, quy hoạch thực nghiệm cịn cĩ ý nghĩa bổ sung, hồn chỉnh các kết quả nghiên cứu sáng tạo lý thuyết đã được phát triển (Giang Thị Kim Liên, 2009). Cĩ thể nĩi, lý thuyết quy hoạch thực nghiệm từ khi ra đời đã thu hút sự quan tâm và nhận được nhiều đĩng gĩp hồn thiện của các nhà khoa học. Những ưu điểm rõ rệt của phương pháp này so với các thực nghiệm cổ điển là: (Giang Thị Kim Liên, 2009) − Giảm đáng kể số lượng thí nghiệm cần thiết. − Hàm lượng thơng tin nhiều hơn rõ rệt, nhờ đánh giá được vai trị qua lại giữa các yếu tố và ảnh hưởng của chúng đến hàm mục tiêu. Nhận được mơ hình tốn học thống kê thực nghiệm theo các tiêu chuẩn thống kê, đánh giá được sai số của quá trình thực nghiệm theo các tiêu chuẩn thống kê cho phép xét ảnh hưởng của các yếu tố với mức độ tin cậy cần thiết. − Cho phép xác định được điều kiện tối ưu đa yếu tố của đối tượng nghiên cứu một cách khá chính xác bằng các cơng cụ tốn học, thay cho cách giải gần đúng, tìm tối ưu cục bộ như các thực nghiệm thụ động. 1.3.2. Thí nghiệm sàng lọc Thí nghiệm sàng lọc là thí nghiệm được tiến hành nhằm các mục đích sau: Xác định đâu là yếu tố ảnh hưởng chính đến đối tượng hay quá trình cần khảo sát. Đáng giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố. Đánh giá mức độ ảnh hưởng tương tác giữa các yếu tố. Thí nghiệm sàng lọc thường khai thác các dạng thí nghiệm tồn phần 2 mức khi số yếu tố thí nghiệm khơng lớn hoặc thiết kế thí nghiệm riêng phần hay thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman (P-B). 1.3.2.1. Sơ lược về thết kế thí nghiệm tìm các yếu tố ảnh hưởng của Plackett- Burman Mục đích của thiết kế Xác định các “yếu tố quan trọng” ảnh hưởng đến quá trình mục tiêu.  Đặc điểm của thiết kế SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 14
TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bắt nguồn từ ma trận đầy đủ (full - factorial matrices), sử dụng giả định rằng tất cả các tương tác khơng cĩ dấu hiệu liên quan đáng kể so với các yếu tố chính, thiết kế Plackett – Burman dựa trên ma trận hai cấp cho mỗi yếu tố và sửa đổi nĩ để giảm thất bại (Plackett và Burman, 1946). Yếu tố tác động chính trong thiết kế Plackett - Burman thay thế tất cả các tương tác của một ma trận đầy đủ. Tuy nhiên, điều này khơng cĩ nghĩa là thơng tin về sự tương tác khơng thể được xác định từ thiết kế Plackett-Burman (Plackett và Burman, 1946). Với một thiết kế Plackett - Burman gồm n thí nghiệm (với n là bội số của 4, n ≤ 100, ngoại trừ n = 92 là chưa thể xác định) với số yếu tố k ≤ (n - 1). Như vậy thiết kế Plackett – Burman là thiết kế tiết kiệm thời gian và số thí nghiệm nhất với số yếu tố cần khảo sát là cao nhất. Thiết kế Plackett – Burman là một thiết kế khơng thể thiếu khi đối tượng đang nghiên cứu chưa cĩ nhiều thơng tin về các yếu tố cĩ khả năng ảnh hưởng chính đã được khảo sát (Plackett và Burman, 1946). Việc chọn các ma trận mà sẽ phụ thuộc vào số yếu tố thí nghiệm trên cộng với các phương pháp lựa chọn để xác định sai số thí nghiệm. Cĩ nhiều cách để xác định sai số thí nghiệm như (Plackett và Burman, 1946): - Chọn điểm trung tâm và cho một số thí nghiệm tại điểm đĩ. - Lặp lại tồn bộ ma trận thí nghiệm. - Thực hiện nhiều phép đo độc lập trong tổ hợp.  Phân tích kết quả thí nghiệm Sau khi thử nghiệm được tiến hành, dữ liệu từ thí nghiệm được sử dụng để tính tốn các hiệu ứng và để xác định ý nghĩa thống kê của những hiệu ứng (Plackett và Burman, 1946). Để tính tốn các hiệu ứng, nhập các giá trị trung bình vào ma trận. Sau đĩ, so sánh sự khác biệt giữa các đáp ứng trung bình ở mức cao và đáp ứng trung bình ở mức thấp. Các ảnh hưởng của yếu tố luơn luơn thay đổi trong các phản ứng khi đi từ cấp độ thấp đến cấp độ cao. (Plackett và Burman, 1946) SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 15
TỔNG QUAN TÀI LIỆU Xác định được mức độ để thiết lập các yếu tố phụ thuộc vào mục tiêu thử nghiệm (Plackett và Burman, 1946): Nếu mục đích là để tối đa hĩa một phản ứng, tất cả các yếu tố cĩ tác động tích cực sẽ được thiết lập để hoạt động ở mức độ cao và tất cả các yếu tố cĩ tác động tiêu cực sẽ được thiết lập để hoạt động ở mức thấp. Nếu mục tiêu là để giảm thiểu các phản ứng, tất cả các yếu tố cĩ tác động tích cực sẽ được thiết lập ở mức thấp và tất cả đều cĩ một tác động tiêu cực sẽ được thiết lập ở mức cao. Nếu như ảnh hưởng của các yếu tố được kiểm tra cĩ ý nghĩa thống kê thì yếu tố đĩ là 1 yếu tố quan trọng 1.3.3. Thí nghiệm tối ưu hĩa Một trong những mục đích chính của nghiên cứu thực nghiệm trong kĩ thuật là tìm giá trị cực trị hay tìm vùng tối ưu cho một quá trình hay các điều kiện tối ưu để vận hàng một hệ thống. Lớp các bài tốn nghiên cứu thực nghiệm về vấn đề tối ưu thường được biết đến với tên gọi “phương pháp bề mặt chỉ tiêu” (Response Surface Method – RSM) nhằm mục đích (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011): Chỉ ra tập giá trị các biến đầu vào (điều kiện vận hành, thực thi) sao cho tạo ra ứng xử của đối tượng nghiên cứu là tốt nhất. Tìm kiếm các giá trị biến đầu vào nhằm đạt được các yêu cầu cụ thể về ứng xử của đối tượng nghiên cứu. Xác định các điều kiện vận hành mới nhằm đảm bảo cải thiện chất lượng hoạt động của đối tượng so với tình trạng cũ. Mơ hình hĩa quan hệ giữa đối tượng đầu vào và ứng xử của đối tượng nghiên cứu, dùng làm cơ sở dự đốn hay điều khiển quá trình hay hệ thống. Tiến trình tối ưu hĩa RSM thường gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn : Thí nghiệm khởi đầu. Giai đoạn 2: Leo dố tìm vùng cực trị. Giai đoạn 3: Thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 16
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.3.3.1. Thí nghiệm khởi đầu Sau khi tiến hành các thí nghiệm sàng lọc, ta cần loại bỏ bớt các biến cĩ ảnh hưởng khơng đáng kể đến hàm mục tiêu. Tiếp tục tiến hành một số thí nghiệm với các biến cịn lại, đồng thời bổ sung thêm một số điểm thí nghiệm trung tâm nhằm đánh giá mức độ phù hợp (Lack-of-fit) của mơ hình hồi quy bậc nhất đã xây dựng cho hàm mục tiêu. Việc đánh giá như vậy được gọi là “kiểm định mức độ khơng phù hợp của mơ hình”. Giả thuyết thống kê được phát biểu như sau: Giả thuyết đảo: Mơ hình khớp với dữ liệu. Giả thuyết chính: Mơ hình khơng khớp với dữ liệu. Để kiểm định về mức dộ phù hợp của mơ hình mỗi biến trong một kế hoạch cần nhận 3 mức giá trị. Cũng như các phép kiểm định thống kê khác thơng số quan trọng để chấp nhận hay loại bỏ giả thuyết đảo là giá trị p (p-value). Lý thuyết tính tốn thống kê chỉ ra như sau: Nếu giá trị p nhỏ hơn mức ý nghĩa α, ta loại bỏ giả thuyết đảo. Nghĩa là mơ hình xây dựng khơng khớp với dữ liệu. Nếu giá trị p lớn hơn mức ý nghĩa α, mơ hình đã dựng là phù hợp để mơ tả dữ liệu. 1.3.3.2. Leo dốc tìm vùng cực trị Nếu kết quả thí nghiệm khởi đầu cho thấy cĩ thể mơ tả hàm mục tiêu bằng một hàm hồi quy bậc nhất, điều đĩ chứng tỏ vùng thí nghiệm của ta cịn ở xa vùng chứa cực trị. (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011). Để tìm được vùng chứa cực trị, ta cần thay đổi giá trị các biến thí nghiệm và thực hiện một chuỗi các thí nghiệm liên tiếp ứng với các giá trị mới của biến thí nghiệm để theo dõi sự thay đổi của hàm mục tiêu. Các thí nghiệm này gọi là các thí nghiệm leo dốc/ xuống dốc. Để tiến nhanh đến vùng chứa cực trị của hàm mục tiêu, ta cần xác định đúng hướng điều chỉnh giá trị các bước thí nghiệm. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 17
TỔNG QUAN TÀI LIỆU Các bước xác định các thơng số leo dốc: Bước 1: Chọn trước một giá trị gia số cho một biến thí nghiệm xj nào đĩ. Thơng thường ta chọn biến dễ điều khiển nhất hoặc biến ứng với hệ số hồi quy cĩ giá trị tuyệt đối lớn nhất. Bước 2: Xác định gia số các biến cịn lại theo cơng thức: Trong đĩ: – bước chuyển động được chọn của yếu tố – bước chuyển động của yếu tố , – những hệ số hồi quy của các yếu tố tương ứng , – khoảng biến thiên của các yếu tố tương ứng Bước 3: Tiến hành thí nghiệm. Cĩ thể tiến hành các thí nghiệm đơn hoặc lặp để giảm sai số, theo dõi kết quả thay đổi của hàm mục tiêu. Giá trị hàm mục tiêu sẽ thể hiện sự cải thiện (tăng khi leo dốc, giảm khi xuống dốc). Tiến hành các thí nghiệm cho đến khi hàm mục tiêu đổi chiều. 1.3.3.3. Thí nghiệm bề mặt đáp ứng Khi cần mơ tả chính xác quan hệ giữa hàm mục tiêu và các biến thí nghiệm, ta tiến hành kế hoạch thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu. Mục đích của kế hoạch này là bổ sung các điểm thí nghiệm nhằm cĩ thể xây dựng mơ hình bậc 2 mơ tả hàm mục tiêu. (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011) Mơ hình bậc hai cĩ dạng: Với: Y: Hàm mục tiêu β0: Hệ số hồi quy SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 18
TỔNG QUAN TÀI LIỆU βi: Hệ số hồi quy bậc 1 mơ tả ảnh hưởng của yếu tố Xi đối với Y βii: Hệ số quy bậc 2 mơ tả ảnh hưởng của yếu tố Xi đối với Y βij: Hệ số hồi quy tương tác mơ tả ảnh hưởng đồng thời hai nhân tố Xi và Xj đối với Y.  Các bước tiến hành: - Xây dựng kế hoạch thí nghiệm. - Tiến hành các thí nghiệm và thu thập kết quả. - Phân tích số liệu thí nghiệm; xây dựng mơ hình hồi quy. - Xác định điều kiện tối ưu hĩa. - Thực hiện các thí nghiệm kiểm định. Cĩ hai dạng kế hoạch thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu: thiết kế dạng hỗn hợp tâm xoay (CCD – Central Composite Design) và thiết kế Box – Behnken (Box – Behnken Design). Thiết kế Box-Behnken Thiết kế Box-Behnken được hai tác giả Box và Behnken đề xuất năm 1960 với mục đích thiết kế các thí nghiệm 3 mức nhằm xây dựng bề mặt chỉ tiêu. Thiết kế này cĩ tính chất tâm xoay hoặc gần như cĩ tâm xoay. (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011) Số thí nghiệm được tính theo cơng thức: (Giang Thị Kim Liên., 2009) k N = 2 + 2k + n0 Trong đĩ: N: số thí nghiệm. k: số yếu tố thí nghiệm. n: số thí nghiệm tại tâm. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 19
TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hình 1.8 Ma trận bố trí thí nghiệm theo thiết kế Box – Behnken (Box và Behnken, 1960) Thiết kế Box-Behnken cĩ những ưu điểm: - Số lần thí nghiệm cho mỗi lần lặp ít. - Khơng cĩ điểm thí nghiệm nào vượt ra ngồi khoảng giữa 2 mức đã thiết lập cho mỗi biến. 1.4. PHẦN MỀM QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM MINITAB 16.2.0 Các kết quả nghiên cứu cần được phân tích và xử lí để thơng qua đĩ, chỉ ra các ý nghĩa của bảng kết quả. Với sự trợ giúp của máy tính và các phần mềm chuyên dụng, thiết kế thí nghiệm và xử lí số liệu thực nghiệm đã trở nên nhẹ nhàng và đơn giản hơn rất nhiều (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011). Minitab là một phần mềm máy tính giúp ta hiểu biết thêm về thống kê và tiết kiệm thời gian tính tốn. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 20
TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần mềm này ban đầu được thiết kế để phục vụ giảng dạy mơn thống kê, sau đĩ đã được phát triển thành cơng cụ phân tích và trình bày dữ liệu rất hiệu quả. Giao diện của Minitab ở dạng đồ họa, với các menu và hộp thoại rất đơn giản và dễ dùng, vận hành như một hộp đen, nhận dữ liệu đầu vào và phân tích, xử lý theo yêu cầu của người sử dụng sau đĩ hiển thị kết quả thơng qua các các cửa sổ (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011). − Dữ liệu nhập vào cĩ thể được nhận thơng qua nhập liệu trực tiếp vào các cửa sổ bảng tính hoặc lấy file dữ liệu của Minitab hoặc từ các ứng dụng bảng tính khác như Excel hay Lotus thơng qua chức năng sao chép – dán. Ngồi ra Minitab cũng nhận nhấp liệu từ Session Window thơng qua các ngơn ngữ nhập lệnh của Minitab. − Kết quả sẽ là các kết quả bằng số, chữ và hình ảnh đồ thị thơng qua các cửa sổ Minitab. − Các đồ thị mơ tả thống kê của Minitab cĩ hình thức trình bày rất rõ ràng, cĩ thể dễ dàng hiệu chỉnh theo ý muốn. Các đồ thị này cũng cĩ thể kết xuất ra nhiều dạng ảnh hiệu chỉnh được SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 21
TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hình 1.9 Giao diện phần mềm Minitab 16.2.0 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 22
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 23
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGIÊN CỨU - Thời gian: Từ tháng 11/2013 đến tháng 5/2014 - Địa điểm: Phịng thí nghiệm Cơng Nghệ Vi Sinh-Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum NT1.5 được cung cấp từ Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh–Trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh đã được chứng minh cĩ khả năng làm giảm cholesterol và khả năng làm probiotic (Dương Nhật Linh và cs., 2013) 2.2.2. Mơi trường – hĩa chất Mơi trường MRS (Deman, Rogosa and Sharpe). Mơi trường MRSA. o o Cồn 96 , cồn 70 , H2SO4, NaOH, HCl. Các loại đường: glucose, sucrose, maltose, mật rỉ đường, xylose, manitol. Cao nấm men, pepton, bột đậu nành, bột bắp, amonium sulfate ((NH4)2SO4), urê (H2NCONH2) Các muối khống: NaCl, K2HPO4.3H2O, KH2SO4, MgSO4.7H2O, CaCl2, MnSO4.4H2O, CaCO3, Nước cất, nước muối sinh lý 0,85 %. 2.2.3. Dụng cụ Đĩa petri, ống nghiệm, erlen, becher, pipette, pipettman, đầu típ các loại, , que cấy, lam, lamer, đèn cồn, kính hiển vi, giấy đo pH. 2.2.4. Trang thiết bị - Tủ cấy - Kính hiển vi - Tủ ấm CO2 - Cân kỹ thuật - Nồi hấp tiệt trùng - Cân phân tích SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 24
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Tủ sấy - Máy đo pH - Lị viba - Máy đo mật độ quang 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Hoạt hĩa chủng Từ ống giữ chủng 20% glycerol/ -20o C, tiến hành hoạt hĩa chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 trên 5mL mơi trường MRS (DeMan Rogosa and Sharpe) ủ ở 37oC / 24-48 giờ. Từ ống mơi trường lỏng đã hoạt hĩa 24-48 giờ chúng tơi tiến hành cấy ria trên o mơi trường MRSA (DeMan Rogosa and Sharpe agar), ủ ở 37 C, 5%CO2, 48 giờ. Sau 48 giờ chọn những khuẩn lạc riêng lẻ, điển hình cấy trên mơi trường thạch đứng MRSA giữ chủng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.3.2. Xây dựng biểu đồ tương quan giữa giá trị OD và nồng độ tế bào. 2.3.2.1. Định lượng tế bào bằng phương pháp đo OD Nguyên tắc Khi một pha lỏng cĩ nhiều phân tử khơng tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và cĩ độ đục bởi các phần tử hiện diện trong mơi trường lỏng làm cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong mơi trường cũng làm mơi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Trong một giới hạn của độ đục và mật độ tế bào, cĩ thể xác lập được quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục. Do đĩ, cĩ thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thơng qua đo độ đục bằng cách so màu ở các bước sĩng từ 550 – 610 nm (Trần Linh Thước và cs., 2001). Thực hiện  Tiến hành pha lỗng huyền dịch vi khuẩn bằng mơi trường MRS sao cho thu được các huyền dịch cĩ giá trị OD610: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5.  Thực hiện định lượng tế bào bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc.  Các giá trị OD610 tương ứng được pha lỗng và trải trên đĩa mơi trường MRSA ở các nồng độ đếm được. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 25
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Xây dựng đường tương quan giữa OD610 và mật độ tế bào tương ứng với các huyền phù bằng phần mềm Excel của Microsoft. 2.3.2.2. Định lượng tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Phương pháp định lượng tế bào bằng cách đếm khuẩn lạc được tiến hành với các bước sau: (Trần Linh Thước và cs., 2001) -1 -2 -3 -4 -  Tại các nồng độ OD tến hành pha lỗng bậc 10 như: 10 , 10 , 10 , 10 , 10 5,  Trải 0,1 mL huyền phù sau pha lỗng lên đĩa mơi trường MRSA, mỗi nồng độ pha lỗng trải 3 đĩa. o  Ủ 37 C/5% CO2, 24 -48 giờ.  Nhận diện khuẩn lạc đặc trưng và đếm số khuẩn lạc của chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum NT 1.5 tại mỗi độ pha lỗng: chọn độ pha lỗng cĩ số khuẩn lạc phân bố hợp lý nhất và trong khoảng 25 – 250 khuẩn lạc/ đĩa, đếm số khuẩn lạc trên cả 3 đĩa lặp lại trên cùng độ pha lỗng.  Tính số lượng tế bào cĩ trong 1 mL mẫu theo cơng thức sau: Trong đĩ: A: Mật độ tế bào (CFU/ mL) N: Tổng số khuẩn lạc đếm được ni: Số đĩa được đếm ở nồng độ pha lỗng i V: Số mL dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa. fi: nồng độ pha lỗng cĩ số khuẩn lạc được chọn đếm. 2.3.3. Xây dựng đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 2.3.3.1. Nguyên tắc Sự tăng trưởng của vi sinh vật là sự gia tăng số lượng tế bào vi sinh vật trong quần thể và tốc độ tăng trưởng là sự tăng trưởng của vi sinh vật trong một đơn vị thời SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 26
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU gian. Một quần thể vi sinh vật thường cĩ những đặc trưng tăng trưởng riêng khi được nuơi cấy trong một mơi trường và điều kiện nhất định. Động thái tăng trưởng của vi sinh vật bắt đầu từ một pha tiềm tàng (lag phase). Sau đĩ, sự tăng trưởng bắt đầu và số lượng tế bào tăng lũy tiến, giai đoạn này gọi là pha log (log phase). Theo thời gian, nguồn dinh dưỡng trong mơi trường trở nên cạn kiệt cùng với sự tích lũy của độc chất. Sự tăng trưởng dừng lại và đi vào pha ổn định (stationary phase). Nếu tiếp tục nuơi cấy, các tế bào bắt đầu chết và đi vào pha suy tàn (death phase). Mỗi loại vi khuẩn lại cĩ đường cong tăng trưởng riêng, do đĩ cần phải khảo sát đường cong tăng trưởng của chủng vi khuẩn đang quan tâm để xác định được thời gian thu nhận sản phẩm thích hợp (Nguyễn Thành Đạt, 2011). 2.3.3.2. Thực hiện 8 Điều chỉnh dịch khuẩn đã hoạt hố đạt giá trị OD610 tương đương 10 tế bào/mL, sau đĩ hút 2 mL dịch khuẩn cho vào erlen chứa 18 mL mơi trường MRS. Nuơi o dịch khuẩn ở 37 C/5% CO2. Theo dõi sự tăng trưởng của vi sinh vật ở các mốc 0 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ, 15 giờ, 18 giờ, 21 giờ, 24 giờ, 27 giờ, 30 giờ, 33 giờ, 36 giờ, 39 giờ, 42 giờ, 48 giờ bằng cách đo OD610 để xác định mật độ tế bào sau mỗi thời gian nuơi cấy. Sử dụng đường tương quan giữa mật độ tế bào và OD610 để xác định mật độ tế bào tại các giá trị OD610 tương ứng tại mỗi thời điểm khảo sát. Dựa vào những mốc thời gian và mật độ tế bào, xây dựng đường cong tăng trưởng của vi sinh vật bằng phần mềm Excel của Microsoft. 2.3.4. Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp cho sự tăng trưởng của L. plantarum NT1.5  Mục đích Xác định được nhiệt độ và pH thích hợp thu được nhiều sinh khối vi khuẩn nhất.  Nguyên tắc SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 27
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật là kết quả của các phản ứng hĩa học. Các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ, do đĩ yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Vùng sinh trưởng của vi sinh vật là vùng giới hạn giữa nhiệt độ cực đại và nhiệt độ cực tiểu mà vùng này khác nhau giữa các lồi. pH là đại lượng dùng để đo độ hoạt tính của ion H+ trong mơi trường. pH ảnh hưởng đến hoạt động của vi sinh vật là do sự tác động qua lại giữa ion H+ và các enzyme chứa trong thành tế bào và màng tế bào chất. Mỗi lồi vi sinh vật chỉ thích hợp sống trong khoảng pH nhất định. (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2000)  Tiến hành Điều chỉnh dịch khuẩn đã hoạt hố đạt giá trị OD tương đương 108 tế bào/mL, sau đĩ hút 1 mL dịch khuẩn vào 9 mL mơi trường MRS được điều chỉnh ở các giá trị pH lần lượt như sau: 4, 5, 6, 7, 8 (Bevilacqua và cs., 2008). Nuơi ở các nhiệt độ: 30oC, 37oC, 40oC. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Sau thời gian nuơi cấy, dịch khuẩn được đo OD610 và dựa vào đường tương quan để xác định mật độ tế bào.  Kết quả  Số liệu được xử lý thống kê ANOVA bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0 và Excel của Microsoft.  Kết quả được trình bày dưới dạng: trung bình sai số chuẩn. 2.3.5. Sàng lọc các yếu tố dinh dưỡng 2.3.5.1. Nguồn nitơ Các nguồn nitơ được khảo sát là: bột bắp, bột đậu nành, pepton, (NH4)2SO4, urê với nồng độ khảo sát được thể hiện trong bảng 2.1. (Han và cs., 2011; Altaf và cs., 2006) Bảng 2.1. Các nguồn nitơ khảo sát SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 28
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thành phần Nồng độ (g/L) Pepton 10 Bột bắp 15 Bột đậu nành 8 (NH4)2SO4 5 H2NCONH2 3 Mơi trường chọn lọc nguồn Nitơ tối ưu gồm cĩ nguồn nitơ cần khảo sát, glucose 20 g/L và các thành phần cịn lại của mơi trường MRS như: tween 80, K2HPO4, CH3CO2Na, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O. 2.3.5.2. Nguồn cacbon Các nguồn cacbon được khảo sát là: succrose, maltose, lactose, glucose, mật rỉ đường, bột bắp với khối lượng khảo sát được trình bày trong bảng 2.2. (Altaf và cs., 2006; Farooq và cs., 2012; Han và cs., 2011; Magdalena và cs., 2010) Bảng 2.2. Các nguồn cacbon khảo sát Thành phần Khối lượng (g/L) Bột bắp 30 Glucose 20 Maltose 20 Succrose 20 Mật rỉ đường 40 Lactose 20 Mơi trường chọn lọc nguồn cacbon tối ưu gồm cĩ nguồn nitơ tối ưu, nguồn cacbon cần khảo sát và các thành phần cịn lại của mơi trường MRS: tween 80, MgSO4, K2HPO4, CH3COONa, MnSO4. 2.3.5.3. Nguồn khống SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 29
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Khảo sát các nguồn khống: CaCl2, NaCl, CaCO3, MgSO4.7H2O, K2HPO4, KH2PO4 với khối lượng được trình bày trong bảng 2.3.(Han và cs., 2011; Altaf và cs., 2006) Bảng 2.3. Các nguồn khống khảo sát Thành phần Khối lượng (g/L) K2HPO4 0.5 KH2PO4 0.5 CaCO3 0.5 NaCl 0.5 CaCl2 0.5 MgSO4.7H2O 0.5 Mơi trường chọn lọc nguồn khống tối ưu bao gồm nguồn nitơ tối ưu (10 g/L), nguồn cacbon tối ưu (20 g/L), và nguồn khống cần khảo sát.  Tiến hành Chủng L. plantarum NT 1.5 được tăng sinh trên mơi trường MRS ở 37oC, 5% CO2, 24 giờ. Điều chỉnh dịch khuẩn về 108 tế bào/ mL sau đĩ bổ sung 1mL dịch khuẩn vào 20 mL mơi trường khảo (pH, nhiệt độ theo kết quả mục 2.3.4.) trong khoảng thời gian (theo kết quả mục 2.3.3), 5% CO2. Sau thời gian nuơi cấy đo mật độ tế bào L. plantarum NT 1.5 bằng phương pháp đo độ đục ở bước sĩng 610 nm. Các thử nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả được xử lý thống kê ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0 và phần mềm Excel. Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± sai số. 2.3.6. Thiết kế thí nghiệm tìm yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tăng sinh khối theo thiết kế Plackett- Burman SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 30
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mục đích Xác định các yếu tố quan trọng ảnh hưởng chính đến quá trình lên men thu sinh khối của chủng vi khuẩn L. plantarum NT 1.5. Thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman Thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett – Burman với các yếu tố gồm cĩ: nguồn nitơ, cacbon và các nguồn khống đã được chọn ở mục 2.4. Mỗi yếu tố được khảo sát ở 2 mức độ: mức độ cao (+1) và mức độ thấp (-1). Thiết kế được bố trí dựa theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm bằng phần mềm thống kê Minitab 16.2.0 của Minitab Inc., USA để ước tính các giá trị t-value, p- value và mức độ tin cậy. Thực hiện : Tăng sinh chủng L. plantarum trên 20 mL mơi trường MRS ủ ở 37oC, 24-48 giờ. 8 Điều chỉnh dịch khuẩn đạt giá trị OD610 cĩ mật độ tế bào khoảng 10 tế bào/mL. Bổ sung 1 mL dịch khuẩn vào 20 mL mơi trường khảo sát. Nuơi vi khuẩn ở nhiệt độ khảo sát theo mục 2.3.4., 5% CO2. Sau thời gian nuơi cấy dịch khuẩn được đo OD610 để xác định mật độ tế bào. Mỗi nghiệm thức của thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại. Kết quả . Số liệu kết quả thí nghiệm được thống kê bằng phần mềm Minitab 16.2.0 . Ảnh hưởng của các yếu tố đến sinh khối chủng vi khuẩn được mơ tả qua phương trình hồi quy bậc nhất: Y   X 0  i i . Dựa vào phân tích hồi quy, nếu mức ý nghĩa đạt trên 95% (p < 0,05), thì yếu tố đĩ được cho là cĩ ảnh hưởng chính đến sự tăng sinh khối tế bào và với kết quả thu tiếp tục thực hiện các thí nghiệm tiếp theo để xác định giá trị tối ưu cho sự gia tăng sinh khối. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 31
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.7. Thí nghiệm khởi đầu Thiết kế thí nghiệm dạng đầy đủ 22, cĩ bổ sung thêm điểm thí nghiệm trung tâm. Mỗi yếu tố được khảo sát ở 3 cấp độ: mức độ cao (+1) và mức độ thấp (-1) và mức trung tâm (0). Thiết kế được bố trí dựa theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bằng phần mềm thống kê Minitab 16.2.0 của Minitab Inc., USA. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Tiến hành Tương tự mục 2.3.6 2.3.8. Tìm khoảng tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính bằng phương pháp leo dốc 2.3.8.1. Thiết kế thí nghiệm Nếu kết quả của bước khởi đầu cho thấy cĩ thể mơ tả hàm mục tiêu bằng một hàm hồi quy bậc nhất, điều đĩ chứng tỏ vùng thí nghiệm khảo sát cịn ở xa vùng cực trị. Tiến hành các thí nghiệm leo dốc nhằm xác định vùng cực trị. Các thơng số cho phương pháp này được tính tốn thơng qua hệ số hồi quy từ phương trình hồi quy của thí nghiệm khởi đầu. Từ mức cơ sở của các yếu tố này và các hệ số hồi quy, các bước chuyển động sẽ được tính như sau: Chọn bước chuyển động ứng với yếu tố cĩ giá trị tuyệt đối của hệ số hồi qui lớn nhất và tính tốn các bước chuyển động cịn lại bằng các cơng thức: Trong đĩ: : Khoảng biến thiên. : Hệ số hồi qui của yếu tố x1. : Bước chuyển động của yếu tố x1. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 32
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Từ kết quả tính tốn bước chuyển động của từng yếu tố ảnh hưởng, thí nghiệm bắt đầu từ mức trung tâm của các yếu tố ảnh hưởng chính. (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011) 2.3.8.2. Tiến hành Tương tự mục 2.3.6. 2.3.9. Thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu xác định giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính. Từ kết quả thí nghiêm leo dốc, tiến hành thiết kế thí nghiệm Box-Behnken để tìm giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính. 2.3.9.1. Thiết kế thí nghiệm Mỗi yếu tố được khảo sát ở 3 mức độ: mức độ cao (+1), mức độ thấp (-1) và mức độ trung tâm (0) dựa theo kết quả ở mục 2.3.8. Thiết kế được bố trí dựa theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bằng phần mềm thống kê Minitab 16.2.0 của Minitab Inc., USA. 2.3.9.2. Tiến hành Tương tự mục 2.3.6. 2.3.10. Xác định thời gian tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5 trên mơi trường tối ưu Sau khi xác định được mơi trường và điều kiện nuơi cấy tối ưu cho sinh khối cao nhất chúng tơi tiến hành kiểm định kết quả và khảo sát lại thời gian tăng trưởng tối ưu nhất của chủng vi khuẩn trên mơi tường khảo sát ở nhiệt độ theo mục 2.3.4, 5% CO2. Phương pháp thực hiện tương tự mục 2.2.3. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 33
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN GIỮA MẬT ĐỘ TẾ BÀO VI KHUẨN VÀ GIÁ TRỊ OD610 Để cĩ được đường tương quan tuyến tính giữa OD610 và mật độ tế bào Lactobacillus plantarum NT 1.5 trên mơi trường MRS, chúng tơi tiến xác định mật độ vi khuẩn ở những giá trị đo OD610 tương ứng. Kết quả xây dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào vi khuẩn và giá trị OD610 được trình bày trong bảng 3.1 và đồ thị 3.1. Bảng 3.1: Giá trị đo OD610 và mật độ tế bào (Log(N/mL) OD610nm 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Số khuẩn lạc bình 7,2.106 1,31.107 1,98.107 2,5.107 3,3.107 quân (CFU/ mL) Log (N/ mL) 6,857 7,117 7,297 7,398 7,519 7.600 7.500 7.400 7.300 7.200 y = 1.603x + 6.7566 7.100 R² = 0.9617 log(N/mL) 7.000 log (N/mL) log 6.900 6.800 0 0.2 0.4 0.6 Giá trị OD610 Đồ thị 3.1. Đường tương quan tuyến tính giữa OD610 và mật độ tế bào Lactobacillus plantarum NT 1.5 trên mơi trường MRS Qua khảo sát quá trình nuơi cấy của chủng L. plantarum NT 1.5 trong 24 giờ được trình bày trên bảng và biểu đồ chúng tơi nhận thấy rằng mật độ tế bào của vi khuẩn L. plantarum NT1.5 trong huyền phù tế bào tương quan tuyến tính với các SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ giá trị OD610nm từ 0,1 – 0,5 theo phương trình y = 1,603x + 6,7566 với mức độ tin cậy 96,17%. 3.2 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT 1.5 Dựa vào kết quả xây dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào vi khuẩn và giá trị OD610 chúng tơi tiến hành xây dựng đường cong tăng trưởng trưởng của chủng Lactobacillus plantarum NT1.5. Sự tăng trưởng của chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 được theo dõi tại các thời điểm khảo sát bằng cách đo OD610 theo những mốc thời gian nuơi cấy. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 và đồ thị 3.2. Bảng 3.2. Giá trị OD610 theo thời gian Thời gian (giờ) Giá trị OD610 Log (N/mL) 0 0,023 ± 0,001 6,800 3 0,145 ± 0,000 6,990 6 0,369 ± 0,000 7349 9 0,625 ± 0,000 7,758 12 1,556 ± 0,003 9,250 15 1,944 ± 0,000 9,873 18 2,111 ± 0,000 10,141 21 2,084 ± 0,000 10,097 24 2,078 ± 0,000 10,088 27 2,070 ± 0,000 10,075 30 2,049 ± 0,000 10,041 33 2,036 ± 0,000 10,021 36 2,035 ± 0,000 10,019 39 2,013 ± 0,000 9,983 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 1,994 ± 0,000 9,952 45 1,993 ± 0,000 9,954 48 1,988 ± 0,000 9,944 51 1,971 ± 0,000 9,916 54 1,967 ± 0,000 9,910 57 1,935 ± 0,002 9,859 60 1,848 ± 0,000 9,719 63 1,806 ± 0,005 9,652 66 1,703 ± 0,000 9,486 69 1,615 ± 0,000 9,345 72 1,470 ± 0,016 9,114 12.000 10.000 8.000 6.000 Log (N/ mL) (N/ Log 4.000 2.000 0.000 0h 3h 6h 9h 27h 60h 66h 15h 18h 21h 24h 30h 33h 36h 39h 42h 45h 48h 51h 54h 57h 63h 69h 72h 12h Đồ thị 3.2. Đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 theo thời gian trên mơi trường MRS Dựa vào bảng kết quả giá trị OD (bảng 3.2) và đồ thị đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 trên mơi trường MRS (đồ thị 3.2) chúng tơi nhận thấy rằng thời gian từ 0 giờ đến 6 giờ là thời gian vi khuẩn bước vào pha tiềm tàng (pha Lag) thời gian này vi khuẩn tăng sinh rất ít (log cĩ giá trị từ 6,800 đến 7,349). Từ 6 giờ đến 18 giờ vi khuẩn tăng sinh mạnh nhất (log cĩ giá trị từ 7,349 đến 10,141) đây là SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ thời gian thu được nhiều sinh khối vi khuẩn nhất. Vi khuẩn bước vào pha cân bằng trong thời gian 18 đến 60 giờ (log cĩ giá trị từ 10,141 đến 9,719). Sau 60 giờ vi khuẩn rơi vào pha suy tàn. Từ kết quả trên chúng tơi chọn 18 giờ (log = 10,141 N/ mL) là thời gian thích hợp nhất để thu nhận sinh khối của L. plantarum NT 1.5. 3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ, pH THÍCH HỢP CHO SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT1.5. Từ kết quả xây dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào vi khuẩn và giá trị OD610, đường cong tăng trưởng trưởng chủng Lactobacillus plantarum NT 1.5, chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuơi cấy và pH mơi trường đến sự tăng trưởng của L. plantarum NT1.5. Kết quả được thể hiện bằng giá trị Log (N/ mL) của mỗi nhiệt độ tại pH tương ứng. Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.3 và đồ thị 3.3. Bảng 3.3. Mật độ tế bào Lactobacillus plantarum NT1.5 (Log (N/ mL)) tại mỗi giá trị nhiệt độ và độ pH khảo sát pH = 4 pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8 30oC 7,605± 0,027 8,724± 0,174 9,782± 0,034 9,990 ± 0,025 9,352± 0,129 37oC 8,588± 0,167 9,389± 0,136 9,942± 0,020 10,011 ± 0,014 9,677± 0,007 40oC 7,173± 0,126 8,522± 0,061 8,821± 0,102 9,183 ± 0,028 7,423± 0,114 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 12 10 8 30oC 6 37oC 40oC Log (N/ mL) (N/ Log 4 2 0 pH = 4 pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8 Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ pH lên sự tăng trưởng của Lactobacillus plantarum NT1.5 Dựa vào bảng 3.3 và đồ thị 3.3 chúng tơi thấy rằng tại pH=4 và 40oC Lactobacillus plantarum NT1.5 tăng trưởng thấp nhất (Log =7,605±0,027) và cao nhất ở 37oC và pH 7 (log (N/mL) = 10,011 ± 0,001). Như vậy chúng tơi chọn pH=7 và nhiệt độ 37oC là điều kiện nuơi cấy thích hợp cho L.pantarum NT1.5 cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.4 KẾT QUẢ SÀNG LỌC YẾU TỐ DINH DƯỠNG Từ những kết quả cĩ được ở các thí nghiệm trước (xây dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào vi khuẩn và giá trị OD610, đường cong tăng trưởng trưởng , kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự tăng trưởng của L. plantarum), chúng tơi tiến đến bước sàng lọc các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chủng L. plantarum. Các nguồn dinh dưỡng khảo sát gồm cĩ: nguồn nitơ, nguồn cacbon, nguồn khống. 3.4.1. Nguồn nitơ Chúng tơi tiến hành khảo sát các nguồn nitơ: pepton, bột đậu nành, bột bắp, (NH4)2SO4, Urê với khĩi lượng mỗi nguồn được thể hiện trong bảng 2.1 (mục 2.3.5.1). SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Ảnh hưởng của các nguồn nitơ khảo sát đến sinh trưởng của L. plantarum NT1.5 được xác định thơng qua giá trị Log (N/ mL). Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3.4 và đồ thị 3.4. Bảng 3.4. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn nitơ khảo sát Nguồn Nitơ Log (N/ mL) Mật độ (CFU/ mL) Bột bắp 7,193 ± 0,051c 1,5.107 Pepton 8,721 ± 0,164a 5,2.108 Bột đậu nành 7,644 ± 0,164b 4,4.107 (NH4)2SO4 7,265 ± 0,021c 1,107 Urê 7,381 ± 0,012c 1.8.107 Trong cùng một cột các chỉ số cĩ cùng mẫu tự khơng cĩ sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan. 10 9 8 7 6 5 4 Log (M/ mL) (M/ Log 3 2 1 0 bot bap pepton bột đậu nành (NH4)2SO4 URE Đồ thị 3.4. Kết quả khảo sát nguồn nitơ Theo kết quả thí nghiệm bảng 3.4 và biểu đồ 3.4 chúng tơi nhận thấy rằng: Giữa các số liệu cĩ sự khác biệt ý nghĩa với độ tin cậy p < 0,05 (phụ lục 2). Trong các nguồn nitơ (hữu cơ và vơ cơ) thì nguồn nitơ hữu cơ ảnh hưởng đến mật độ vi khuẩn cao hơn các nguồn nitơ vơ cơ. Pepton cho mật độ vi khuẩn cao nhất (Log (N/ mL) = 8,721 ± 0,081), thấp nhất là bột bắp (Log (N/ mL) = 7,193 ± SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 40
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 0,008. Vì vậy, pepton được chọn là nguồn nitơ tốt nhất cho sản xuất sinh khối của L. plantarum NT1.5. 3.4.2. Nguồn cacbon Từ kết quả mục 3.4.1 chúng tơi tiếp tục khảo sát các nguồn cacbon. Mơi trường khảo sát gồm cĩ pepton, các nguồn khống của mơi trường MRS và các nguồn cacbon cần khảo sat. Các nguồn cacbon cần khảo sát là: succrose, maltose, glucose, lactose, mật rỉ đường, bột bắp với khối lượng mỗi nguồn được trình bày trong bảng 2.2 (mục 2.5.3.2). Ảnh hưởng của các nguồn cacbon khảo sát đến sự sinh trưởng của L.plantarun NT1.5 được xác định thơng qua giá trị Log (N/ mL). Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.5 và biểu đồ 3.5. Bảng 3.5. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn cacbon khảo sát Nguồn Cacbon Log (N/ mL) Mật độ (CFU/ mL) Succrose 8,586 ± 0,057c 3,9.108 Maltose 9,519 ± 0,007a 3,0.109 Glucose 9,155 ± 0,014b 10,5.109 Lactose 7,198 ± 0,020d 1,6.107 Mật rỉ đường 9,252 ± 0,093b 1.8.109 Bột bắp 6,912 ± 0,012e 8,2.106 Trong cùng một cột các chỉ số cĩ cùng mẫu tự khơng cĩ sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 10,000 9,000 8,000 7,000 6,000 5,000 4,000 Log (N/ mL) (N/ Log 3,000 2,000 1,000 0 succrose maltose glucose lactose mật rỉ bột bắp đường Đồ thị 3.5. Kết quả khảo sát nguồn Cacbon Theo kết quả thí nghiệm bảng 3.5 và biểu đồ 3.5, chúng tơi thấy rằng: - Giữa các số liệu cĩ sự khác biệt ý nghĩa với độ tin cậy p < 0,05 (phụ lục 2). - Các nguồn cacbon đều ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi khuẩn L.plantarum NT1.5. Trong các nguồn cacbon thì maltose cho mật độ vi khuẩn cao nhất (Log (N/ mL) = 9,519 ± 0,000). Glucose và mật rỉ đường ảnh hưởng đến khả năng tăng trưởng của vi khuẩn ngang nhau (với giá trị Log (N/ mL) tương ứng là 9,155 ± 0,001 và 9,252 ± 0,026). Thấp nhất là bột bắp Log (N/ mL) = 6,912 ± 0,000. Các nguồn cacbon maltose, glucose, mật rỉ đường đều cĩ ảnh hưởng cao đến khả năng tăng trưởng của vi khuẩn. Mặc dù maltose cĩ ảnh hưởng cao hơn tuy nhiên, xét về giá thành mật rỉ đường giúp tiết kiệm chi phí sản xuất hơn maltose và glucose rất nhiều lần. Vì vậy, chúng tơi chọn mật rỉ đường là nguồn cacbon tốt nhất cho sản xuất sinh khối L. plantarum NT1.5. 3.4.3. Nguồn khống Từ kết quả mục 3.4.1 và 3.4.2 chúng tơi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cacbon đến khă năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn. Các nguồn khống được khảo sát là: CaCO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl, KH2PO4 với khối lượng mỗi nguồn được thể hiện trong bảng 2.3 (mục 2.3.5.3). SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Ảnh hưởng của các nguồn muối khống khảo sát đến sự sinh trưởng của L.plantarum NT1.5 được xác định thơng qua giá trị Log (N/ mL). Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.6 và biểu đồ 3.6. Bảng 3.6. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn muối khống khảo sát Nguồn khống Log (N/ mL) Mật độ (CFU/ mL) CaCO3 8,648 ± 0,305a 4,4.108 K2HPO4 7,665 ± 0,121b 4,6.107 MgSO4 9,348 ± 0,299a 2,0.109 CaCl2 8,659 ± 0,374a 4,6.108 NaCl 9,070 ± 0,111a 1,2.109 KH2PO4 7,163 ± 0,152b 1,3.107 Trong cùng một cột các chỉ số cĩ cùng mẫu tự khơng cĩ sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan. 12 10 8 6 Log(N/ mL) Log(N/ 4 2 0 CaCO3 K2HPO4 MgSO4 CaCl2 NaCl KH2PO4 Đồ thị 3.6. Kết quả khảo sát nguồn muối khống Theo bảng kết quả 3.5 và biểu đồ 3.5, chúng tơi nhận thấy rằng: Giữa các số liệu cĩ sự khác biệt ý nghĩa với độ tin cậy p < 0,05. Tất cả các nguồn khống khảo sát đều cĩ ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng của vi khuẩn. Trong đĩ, ảnh hưởng của CaCO3, MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl đến mật độ tế vi khuẩn L. plantarum NT1.5 khơng cĩ sự khác biệt ý nghĩa, giá trị SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 43
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Log (N/ mL) của CaCO3, MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl lần lượt là 8,648 ± 0,279; 9,348 ± 0,269; 8,659 ± 0,420; 9.07 ± 0,037. KH2PO4 và K2HPO4 cho mật độ tế bào thấp hơn với giá trị Log (N/ mL) = 7,163 ± 0,070; 7,665 ± 0,044. Như vậy, CaCO3, MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl là các nguồn khống tốt nhất cho sinh trưởng của L. plantarum NT1.5. 3.5 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CHÍNH THEO THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM PLACKETT- BURMAN Từ kết quả mục khảo sát các nguồn dinh dưỡng, chúng tơi xác định được các yếu tố: pepton, mật rỉ đường, CaCO3, MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl cĩ ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của chủng L. plantarum NT1.5. Để xác định được các yếu tố cĩ ảnh hưởng chính đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn chúng tơi tiến hành thí nghiệm xác định các yếu tố ảnh hưởng chính theo thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman (P-B). Thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman được thiết kế với 6 yếu tố (bảng 2.1) gồm 20 thí nghiệm, lặp lại 3 lần được bố trí dựa theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bằng phần mềm thống kê Minitab 16.2.0 của Minitab Inc., USA (bảng 3.7). Mỗi yếu tố được xem xét ở 2 mức độ: (-1) cho mức độ thấp và (+1) cho mức độ cao. Mức giá trị của các yếu tố khảo sát và kết quả phân tích hồi quy được trình bày ở bảng 3.8. Bảng 3.7. Mức ảnh hưởng của từng yếu tố Giá trị mức yếu tố Kí Mức ảnh Yếu tố (g/ L) Giá trị cao Giá trị thấp P hiệu hưởng (+1) (-1) A Pepton 15 5 0,8905 0,000 B Mật rỉ đường 20 10 1,1509 0,000 C NaCl 1,5 1 0,3968 0,000 D CaCl2 1,5 1 0,5219 0,000 E CaCO3 1,5 1 0,0506 0,554 F MgSO4.7H2O 0,2 0 0,7621 0,000 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 44
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Bảng 3.8: Kết quả thí nghiệm Plackett- Burman Pepton Mật rỉ NaCl CaCl2 CaCO3 MgSO4. P-B Mật độ đường 7H2O (CFU/mL) 1 -1 -1 -1 -1 1 6,344 2,2.106 1 1 -1 1 1 -1 8,702 5,0.108 -1 -1 -1 1 -1 1 5,734 5,4.105 1 -1 1 1 -1 -1 7,869 7,4.107 -1 -1 1 -1 1 -1 6,392 2,5.106 -1 -1 -1 -1 1 -1 5,943 8,8.105 -1 1 -1 1 1 1 7,055 1,1.107 -1 -1 1 1 -1 1 6,221 1,7.106 1 1 -1 -1 -1 -1 8,286 1,9.108 -1 -1 1 -1 1 -1 6,408 2,6.106 -1 1 -1 1 1 1 7,061 1,2.107 -1 1 1 -1 -1 -1 7,686 4,9.107 1 -1 1 -1 1 1 6,808 6,4.106 1 -1 -1 1 1 -1 7,408 2,6.107 -1 -1 -1 -1 -1 -1 5,952 9,0.105 -1 -1 -1 1 -1 1 5,739 5,5.105 -1 -1 -1 -1 -1 -1 5,943 8,8.105 1 1 1 1 -1 -1 9,157 1,4.109 -1 1 1 -1 1 1 7,055 1,1.107 -1 1 1 -1 -1 -1 7,664 4,6.107 1 -1 1 -1 1 1 6,808 6,4.106 1 -1 1 1 -1 -1 7,864 7,3.107 1 -1 1 -1 1 1 6,815 6,5.106 1 1 -1 -1 -1 -1 8,254 1,8.108 1 1 -1 1 1 -1 8,739 5,5.108 -1 -1 -1 1 -1 1 5,764 5,8.105 1 -1 -1 1 1 -1 7,446 2,8.107 -1 1 -1 1 -1 1 7,061 1,2.107 1 -1 1 1 1 1 7,238 1,7.107 1 1 -1 1 1 -1 8,719 5,2.108 1 -1 1 1 -1 -1 7,879 7,6.107 1 -1 -1 -1 -1 1 6,350 2,2.106 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1 1 -1 -1 -1 -1 8,284 1,9.108 -1 1 1 -1 1 1 7,061 1,2.107 1 1 -1 -1 1 1 7,640 4,4.107 1 1 1 1 -1 -1 9,135 1,4.109 1 1 1 1 -1 -1 9,173 1,5.109 -1 1 -1 1 -1 1 7,055 1,1.107 1 -1 1 1 1 1 7,240 1,7.107 -1 1 1 -1 -1 -1 7,685 4,8.107 1 1 1 -1 -1 1 8,157 1,4.108 -1 -1 -1 -1 -1 -1 5,933 8,6.105 -1 1 1 1 1 -1 8,119 1,3.108 -1 1 1 1 1 -1 8,135 1,4.108 -1 -1 -1 -1 1 -1 5,943 8,8.105 -1 1 -1 1 1 1 7,093 1,2.107 -1 1 1 1 1 -1 8,120 1,3.108 1 -1 1 1 1 1 7,254 1,8.107 1 -1 -1 1 1 -1 7,425 2,7.107 1 -1 -1 -1 -1 1 6,408 2,6.106 -1 -1 1 1 -1 1 6,203 1,6.106 -1 1 -1 1 -1 1 7,119 1,3.107 1 1 1 -1 -1 1 8,093 1,2.108 -1 -1 1 -1 1 -1 6,391 2,5.106 1 1 -1 -1 1 1 7,661 4,6.107 -1 1 1 -1 1 1 7,093 1,2.107 -1 -1 1 1 -1 1 6,238 1,7.106 1 1 -1 -1 1 1 7,410 2,6.107 1 1 1 -1 -1 1 6,135 1,4.106 -1 -1 -1 -1 1 -1 6,921 8,3.106 Theo kết quả thí nghiệm (bảng 3.7), các yếu tố pepton, mật rỉ đường, NaCl, CaCl2, MgSO4.7H2O cĩ mức độ ảnh hưởng cao vì vậy các yếu tố này ảnh hưởng chính tới khả năng tăng sinh khối của L. plantarum NT 1.5. Trong đĩ, yếu tố mật rỉ đường cĩ mức ảnh hưởng cao nhất (mức ảnh hưởng là 1,1905) tiếp đến là pepton (mức ảnh hưởng là 0,9305) đồng thời cĩ p<0,05. Yếu tố MgSO4.7H2O cĩ p<0,05 và SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 46
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ cĩ mức ảnh hưởng (effect) âm cĩ nghĩa là các yếu tố này làm tăng khả năng tạo sinh khối khi ở nồng độ thấp và giảm khả năng tạo sinh khối khi ở nồng độ cao. Yếu tố CaCO3 cĩ p=0,214 (>0,05) vì vậy yếu tố này cĩ mức ảnh hưởng rất yếu cĩ thể loại bỏ. Đồng thời, với kết quả đánh giá mức độ ảnh hưởng của từng biến thí nghiệm ở đồ thị các ảnh hưởng chính (đồ thị 3.7), đồ thị ứng với yếu tố mật rỉ đường và pepton cĩ độ dốc rất lớn chứng tỏ các biến này cĩ ảnh hưởng mạnh nhất đến khả năng tạo sinh khối của chủng L. plantarum NT1.5. Đồ thị 3.7. Đồ thị các ảnh hưởng chính (Main Effects Plot) Dựa theo đồ thị các ảnh hưởng được chuẩn hĩa (Normal Plot of the Standardized Effects) và đồ thị Pareto của các ảnh hưởng (Pareto Chart of the Standardized Effects) (phụ lục 2) cũng cho thấy các yếu tố Pepton, Mật rỉ đường, NaCl, CaCl2, MgSO4.7H2O nằm xa đường chuẩn nên các yếu tố này cĩ ảnh hưởng lớn đến khả năng tạo sinh khối của chủng L. plantarum NT 1.5. Tương tự ở biểu đồ Pareto của các ảnh hưởng, các yếu tố này nằm bên phải đường giới hạn nên nĩ cĩ ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo sinh khối của chủng vi khuẩn thử nghiệm. Điều này phù hợp với kết luận rút ra từ việc phân tích đồ thị các ảnh hưởng chính và đồ thị ảnh hưởng chuẩn hĩa. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 47
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Bảng 3.8 cho thấy khả năng tạo sinh khối của chủng L. plantarum NT 1.5 dao động từ 5,734 – 9,173 N/ mL khi các yếu tố thay đổi. Dựa vào bảng 2.4 (phụ lục 2) suy ra phương trình hồi quy mơ tả ảnh hưởng của các yếu tố cĩ dạng: Y = 7,2248 + 0,4652X1 + 0,5954X2 + 0,1784X3 + 0,2407X4 + 0,0453X5 - 0,3610X6 Trong đĩ, Y là hàm mục tiêu (CFU/mL), X1, X2, X3, X4, X5, X6 lần lượt là các yếu tố pepton, mật rỉ đường, NaCl, CaCl2, CaCO3, MgSO4.7H2O. Theo mơ hình hồi quy, các biến pepton, mật rỉ đường, NaCl, CaCl2, MgSO4.7H2O cĩ giá trị P 0,05 do vậy cĩ thể loại bỏ trong phương trình hồi quy. Suy ra phương rình hồi quy cĩ dạng: Y = 7,2248 + 0,4652X1 + 0,5954X2 + 0,1784X3 + 0,2407X4 - 0,3610X6 Phân tích phương sai cho thấy, giá trị xác suất p ứng với ảnh hưởng chính (Main Effects) <0,01 được thể hiện ở cột p cĩ giá trị là 0,00 do đĩ ảnh hưởng của các yếu tố cĩ ý nghĩa thống kê. Nĩi cách khác các ảnh hưởng của các biến là đáng kể. 3.6 KẾT QUẢ THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM KHỞI ĐẦU Từ kết quả thí nghiệm P-B, thí nghiệm khởi đầu được thiết kế với các yếu tố ảnh hưởng chính: pepton, mật rỉ đường, CaCl2, NaCl, MgSO4.7H2O để đánh giá mức độ phù hợp của mơ hình hồi quy bậc nhất nhằm xác định giá trị khảo sát ở gần vùng cực trị hay chưa. Mỗi yếu tố ảnh hưởng được khảo xác ở 3 mức độ: mức độ thấp (-1), mức độ cao (+1), và mức độ trung tâm (0). Thí nghiệm được thiết kế dạng đầy đủ với 37 thí nghiệm trong đĩ cĩ 5 thí nghiệm trung tâm được bố trí theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bằng chương trình thống kê Minitab 16.2.0 của Minitab Inc., USA. Kết quả thiết kế thí nghiệm và thực nghiệm được trình bày trong bảng 3.9. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 48
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Bảng 3.9 Thiết kế thí nghiệm khởi đầu và kết quả thí nghiệm TT Pepton Mật rỉ CaCl2 NaCl MgSO4.7H2O Log Mật độ đường 1 1 -1 -1 1 -1 8,270 1,9.108 2 1 1 -1 1 1 9,110 1,3.109 3 1 -1 1 -1 1 8,366 2,3.108 4 -1 -1 1 -1 1 7,199 1,3.107 5 0 0 0 0 0 9,778 6,0.109 6 0 0 0 0 0 9,658 5,5.109 7 0 0 0 0 0 9,613 5,6.109 8 -1 1 -1 -1 1 8,254 1,8.108 9 1 -1 -1 1 1 7,655 4,5.107 10 -1 1 1 1 1 8,711 5,1.108 11 1 1 -1 -1 -1 9,847 7,0.109 12 1 1 -1 -1 1 9,173 1,5.109 13 1 -1 1 1 -1 8,964 9,2.108 14 1 1 1 -1 1 9,678 4,8.109 15 -1 -1 1 1 -1 7,997 1,0.108 16 -1 1 -1 1 -1 8,998 1,1.109 17 1 -1 1 1 1 8,156 1,4.108 18 -1 -1 -1 -1 1 6,654 4,5.106 19 -1 -1 -1 1 1 6,526 3,3.106 20 1 1 -1 1 -1 9,997 9,9.109 21 0 0 0 0 0 9,750 5,6.109 22 -1 -1 -1 1 -1 7,446 2,8.107 23 1 1 1 1 1 9,670 4,7.109 24 -1 -1 -1 -1 -1 7,486 3,1.107 25 -1 1 1 1 -1 9,509 3,2.109 26 -1 -1 1 -1 -1 7,991 9,8.107 27 -1 -1 1 1 1 7,199 1,6.107 28 -1 1 1 -1 1 8,702 5,0.108 29 1 1 1 1 -1 10,382 2,4.1010 30 1 -1 -1 -1 -1 8,453 2,8.108 31 1 1 1 -1 -1 10,456 2,9.1010 32 1 -1 -1 -1 1 7,655 4,5.107 33 -1 1 -1 1 1 8,270 1,9.108 34 -1 1 -1 -1 -1 8,998 1,0.109 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 49
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 0 0 0 0 0 9,578 3,8.109 36 -1 1 1 -1 -1 9,446 2,8.109 37 1 -1 1 -1 -1 8,964 9,2.108 Từ bảng kết quả thu được (bảng 3.9) cho thấy giá trị Log (N/ mL) tăng lên so với thí nghiệm P-B, thay đổi từ 7,199 đến 10,456 (N/ mL). Theo kết quả mơ hình phân tích hồi (phụ lục 2) quy ta thấy các yếu tố pepton, mật rỉ đường, CaCl2, MgSO4.7H2O cĩ giá trị p 0,05) chứng tỏ sự cĩ mặt của NaCl là khơng cĩ ý nghĩa. Suy ra phương trình hối quy cĩ dạng: y = 8,5692 + 0,4825x1 + 0,7578x2 + 0,2677x3 – 0,3811x5. Trong đĩ y là hàm mục tiêu Log (N/ mL), x1,x2,x3,x5 lần lượt là các yếu tố pepton, mật rỉ đường, CaCl2, MgSO4.7H2O. Giá trị “Lack-of-fit” cĩ p=0,822 (>0,05) Điều này cĩ nghĩa là mơ hình hồi quy là phù hợp, giá trị vùng khảo sát cịn ở xa vùng cực trị. Do đĩ tiếp tục chuyển sang bước leo dốc tìm vùng chứa cực trị. 3.7 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM LEO DỐC Dựa vào kết quả thực nghiệm và mơ hình hồi quy nhận được từ thí nghiệm khởi đầu, những yếu tố cĩ hệ số hồi quy âm, chứng tỏ khi nồng độ của các yếu tố này ở mức cao trong vùng khảo sát thì sinh khối sẽ giảm. Vì vậy, cần giảm giá trị khảo sát của các biến này cho mỗi bước leo dốc. Từ đĩ, bước chuyển động của các yếu tố ảnh hưởng chính sẽ được tính tốn và trình bày trong bảng 3.10. Bảng 3.10 Bảng tính tốn bước chuyển động của các yếu tố ảnh hưởng chính Pepton Mật rỉ CaCl2 MgSO4.7H2O Các chỉ tiêu (A) đường(B) (C) (G) Gốc 5 20 1,5 0,25 Khoảng biến thiên 7,5 7,5 1 0,05 Hệ số 0,4825 0,7578 0,2677 -0.3811 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 50
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 3,61875 5,6835 0,2677 -0,019055 Bước chuyển động 0,6367 1 0,0455 -0,00335 Làm trịn bước chuyển 0,6 1 0,05 -0,003 động Chọn bước chuyển động δB = 1và tính tốn các bước chuyển động cịn lại: Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm leo dốc STT Kí hiệu Yếu tố Log Mật độ Pepton Mật rỉ CaCl2 MgSO4. (N/ mL) (CFU/ đường 7H2O mL) 1 Gốc 5 20 1,5 0,25 7,553 ± 0,380 3,6.107 2 Gốc + 1δ 5,6 21 1,55 0,247 7,861 ± 0,024 7,3.107 3 Gốc + 2δ 6,2 22 1,6 0,244 7,941 ± 0,024 8,7.107 4 Gốc + 3δ 6,8 23 1,65 0,241 7,957 ± 0,024 9,1.107 5 Gốc + 4δ 7,4 24 1,7 0,238 8,021 ± 0,104 1,0.108 6 Gốc + 5δ 8 25 1,75 0,235 8,075 ± 0,078 1,2.108 7 Gốc + 6δ 8,6 26 1,8 0,232 8,109 ± 0,016 1,3.108 8 Gốc + 7δ 9,2 27 1,85 0,229 8,165 ± 0,104 1,5.108 9 Gốc + 8δ 9,8 28 1,9 0,226 8,189 ± 0,000 1,5.108 10 Gốc + 9δ 10,4 29 1,95 0,223 8.213 ± 0,184 1,6.108 11 Gốc+10δ 11 30 2 0,22 8.262 ± 0,056 1,8.108 12 Gốc+11δ 11,6 31 2,05 0,217 8,390 ± 0,008 2,5.108 13 Gốc+12δ 12,2 32 2,1 0,214 8,406 ± 0,345 2,5.108 14 Gốc+13δ 12,8 33 2,15 0,211 8,414 ± 0,240 2,6.108 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 51
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 15 Gốc+14δ 13,4 34 2,2 0,208 8,917 ± 0,000 8,3.108 16 Gốc+15δ 14 35 2,25 0,205 9,037 ± 0,404 1,1.109 17 Gốc+16δ 14,6 36 2,3 0,202 10,574 ±0,449 3,7.1010 18 Gốc+17δ 15,2 37 2,35 0,199 11,672 ± 0,120 4,7.1011 19 Gốc+18δ 15,8 38 2,4 0,196 11,691 ± 0,139 4,9.1011 20 Gốc+19δ 16,4 39 2,45 0,193 11,488 ± 0,192 3,1.1011 21 Gốc+20δ 17 40 2,5 0,19 10,263 ± 0,112 1,8.1010 22 Gốc+21δ 17,6 41 2,55 0,187 9,489 ± 0,412 3,1.109 23 Gốc+22δ 18,2 42 2,6 0,184 8,949 ± 0,112 8,9.108 Dựa vào giá trị Log (N/ ml) ở bảng 3.11 ta thấy giá trị log tăng dần từ thí nghiệm 1 (Log = 7,553 ± 0,380) đến thí nghiệm 19 (Log = 11,691 ± 0,139) và bắt đầu giảm ở thí nghiệm 20 (Log = 11,488 ± 0,192). Vì vậy khoảng giá trị tối ưu của các yếu tố cho thí nghiệm tiếp theo là: Pepton: 14,6 – 17 (g/ L). Mật rỉ đường: 36- 40 (g/ L). CaCl2: 2,3 – 2,5 (g/ L). MgSO4.7H2O: 0,19 – 0, 202 (g/ L). 3.8 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM BOX-BEHNKEN Từ kết quả thí nghiệm khởi đầu và thí nghiệm leo dốc 4 yếu tố ảnh hưởng chính đến khả năng sinh trưởng của chung L. plantarum NT1.5 là: pepton, mật rỉ đường, CaCl2, MgSO4.7H2O sẽ được tiếp tục khảo sát để xác định giá trị tối ưu bằng thí nghiệm Box-Behken. Mỗi yếu tố được khảo sát ở 3 mức độ: cao (+1), thấp (-1) và mức độ trung tâm (0). Ma trận được thiết kế với 30 thí nghiệm trong đĩ cĩ 6 thí nghiệm tại tâm. Mỗi thí nghiệm được thiết kế theo nguyên tắc giữ 2 yếu tố tại tâm, thay đổi đồng thời 2 yếu tố cịn lại. Các yếu tố được giữ tại tâm được thay đổi lần lượt để tạo ra 1 ma SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 52
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ trận khơng trùng nhau (ngoại trừ 6 thí nghiệm trung tâm). Giá trị các biến được xác định dựa trên kết quả thí nghiệm leo dốc. Giá trị các mức độ của các yếu tố và kết quả bố trí thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.12 và 3.13. Bảng 3.12 Bảng giá trị các biến số thí nghiệm Box-Behnken Giá trị từng mức độ (g/ L) Yếu tố -1 0 +1 A Pepton 14,6 15,8 17 B Mật rỉ đường 36 38 40 C CaCl2 2,3 2,4 2,5 G MgSO4.7H2O 0,202 0,196 0,19 Bảng 3.13 Bảng biến số các giá trị thí nghiệm Box-Behnken STT Pepton Mật rỉ CaCl2 MgSO4.7H2O Log Mật độ đường (N/mL) (CFU/ mL) 1 1 0 0 1 9,895 7,8.109 2 0 1 -1 0 9,941 8,7.109 3 1 -1 0 0 8,732 5,4.108 4 0 -1 0 1 7,958 9,0.107 5 0 0 -1 -1 9,735 5,4.109 6 1 1 0 0 10,801 6,3.1010 7 -1 0 0 1 7,937 8,6.107 8 0 0 0 0 12,113 1,2.1012 9 0 1 0 1 10,079 1,2.1010 10 0 1 0 -1 10,771 5,9.1010 11 0 -1 1 0 8,561 3,6.108 12 0 0 1 1 9,733 5,4.109 13 1 0 0 -1 10,594 3,9.1010 14 0 1 1 0 10,636 4,3.1010 15 0 0 0 0 12,073 1,2.1012 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 53
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 16 0 0 1 -1 10,424 2,7.1010 17 -1 0 -1 0 7,799 6,3.107 18 0 0 0 0 12,039 1,1.1012 19 0 -1 -1 0 7,785 6,1.107 20 -1 0 0 -1 8,623 4,2.108 21 0 -1 0 -1 8,698 5,0.108 22 0 0 0 0 12,117 1,3.1012 23 0 0 -1 1 9,045 1,1.109 24 0 0 0 0 12,039 1,1.1012 25 -1 0 1 0 8,486 3,1.108 26 -1 -1 0 0 6,758 3,8.106 27 0 0 0 0 11,764 5,8.1011 28 -1 1 0 0 8,834 6,8.108 29 1 0 1 0 10,459 2,9.1010 30 1 0 -1 0 9,773 5,9.109 Phân tích kết quả hồi quy phương sai của mơ hình ta thấy tất cả các yếu tố đều cĩ giá trị p<0,05. Trong đĩ yếu tố MgSO4.7H2O cĩ hệ số hồi quy âm chứng tỏ sự cĩ mặt của yếu tố với khối lượng cao sẽ làm giảm khả năng tăng trưởng của vi khuẩn và ngược lại với khối lượng thấp sẽ làm tăng khả năng tăng trưởng của vi khuẩn. Phương trình hồi quy của mơ hình: Y = 12,0242 + 0,9847A + 1,0475B + 0,3518D – 0,3498D – 1,6781A2 – 1,5702B2 – 1,2173C2 – 1,0780D2. Trong đĩ A, B, C, D lần lượt là các yếu tố: pepton, mật rỉ đường, CaCl2, MgSO4.7H2O. Theo giá trị Lack-of-fit cĩ p lớn hơn rất nhiều so với mức ý nghĩa α điều này cĩ nghĩa dạng mơ hình rất khớp với dữ liêu. Để biểu diễn trực quan về mối quan hệ giữa hàm mục tiêu với từng cặp biến thí nghiệm cĩ thể sử dụng đồ thị bề mặt chỉ tiêu (đồ thị bề mặt hoặc đồ thị đường mức) được thể hiện ở đồ thị 3.1 và 3.2. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 54
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Đồ thị 3.1 Đồ thị đường mức biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các cặp biến khác nhau SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 55
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Đồ thị 3.2 Đồ thị bề mặt biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các cặp biến khác nhau Kết quả giá trị tối ưu hĩa của mơi trường được trình bày trong bảng 3.7.3 Bảng 3.14 Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố Theo bảng 3.14 giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng lần lượt là: Pepton: 16,1515 g/ L. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 56
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Mật rỉ đường: 38,6667 g/ L. CaCl2: 2,41515 g/ L. MgSO4.7H2O: 0,195091 g/ L. Như vậy, chúng tơi xác định được mơi trường tối ưu để tăng sinh khối chủng L.plantarum NT1.5 bao gồm các thành phần và cĩ giá trị như sau: Pepton: 16,15 g/ L Mật rỉ đường 38,7 g/ L CaCl2: 2,42 g/ L MgSO4.7H2O: 0,2 g/ L NaCl: 0,05 g/ L Nhiệt độ nuơi cấy: 37oC, pH=7. 3.9. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT1.5 TRÊN MƠI TRƯỜNG TỐI ƯU Sự tăng trưởng của chủng vi khuẩn L. plantarum NT1.5 trên mơi trường tối ưu được theo dõi dựa vào OD610 và giá trị Log (N/ mL). Kết quả được trình bày trong bảng 3.15 và đồ thị 3.16. Bảng 3.15 Giá trị OD theo thời gian Thời gian (giờ) Giá trị OD Log (N/ mL) Mật độ (CFU/ mL) 0 0.023 6,793 ± 0,007 6,2.106 3 0.074 6,875 ± 0,021 7,5.106 6 0.165 7,021 ± 0,011 1,1.107 9 0.321 7,271 ± 0,038 1,9.107 12 0.477 7,521 ± 0,042 3,3.107 15 0.804 8,045 ± 0,089 1,0.108 18 1.252 8,764 ± 0,062 6,0.108 21 1.364 8,943 ± 0,018 8,5.108 24 1.674 9,439 ± 0,087 2,7.109 27 1.697 9,477 ± 0,031 2,9.109 30 1.828 9,686 ± 0,031 4,9.109 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 57
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 2.028 10,007 ± 0,077 1,0.1010 36 1.9 9,802 ± 0,021 6,3.109 39 1.834 9,697 ± 0,094 5,0.109 42 1.24 8,744 ± 0.363 5,5.108 45 1.212 8,699 ± 0,455 5,0.108 48 0.912 8,219 ± 0,035 1,7.108 12.000 10.000 ) 8.000 6.000 Log (N/ Log mL 4.000 2.000 0.000 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 Thời gian (giờ) Đồ thị 3.9 Đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 theo thời gian trên mơi trường tối ưu Từ kết quả khảo sát khả năng tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5, nhận thấy trên mơi trường tối ưu vi khuẩn cho sinh khối cao nhất tại 33 giờ, sinh khối đạt được Log = 10,007 ± 0,077 (N/ mL) khoảng 1.1010 tế bào / mL. Trên mơi trường MRS chủng đạt được sinh khối cao nhất tại 18 giờ, nồng độ sinh khối đạt được khoảng 1,3.1010 tế bào / mL (tương ứng với log (N/ mL)=10,141) (theo bảng 3.2, mục 3.2). Trên mơi trường tối ưu chủng L. plantarum NT1.5 đạt được mật độ sinh khối cao nhất chậm hơn 15 giờ so với mơi trường MRS với mật độ tế bào tương đương. Điều này cho thấy các yếu tố trong thành phần mơi trường tối ưu đã xác định được SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 58
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ cĩ ảnh hưởng tích cực đến khả năng tăng trưởng của chủng Lactobacillus plantarum NT 1.5. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 59
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 60
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện đề tài, với những kết quả thu được chúng tơi cĩ kết luận như sau: Sự tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610 và mật độ tế bào trên mơi trường MRS theo phương trình y = 1,603x + 6,7566 với mức độ tin cậy 96,17%. Dựa vào đường cong tăng trưởng, xác định được thời gian thu sinh khối của L. plantarum NT 1.5 trên mơi trường MRS nhiều nhất là 24 giờ. pH=7, 37oC là pH mơi trường và nhiệt độ nuơi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng của L. plantarum NT1.5. Từ các nguồn nitơ, cacbon, khống chọn được các yếu tố: pepton, mật rỉ đường, CaCO3, MgSO4, CaCl2, NaCl ảnh hưởng đến khả năng tăng trưởng của vi khuẩn Thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng chính P-B, xác định được các yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng tạo sinh khối của chủng là: Pepton, Mật rỉ đường, MgSO4, CaCl2. Xác định được khoảng tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính bằng thí nghiệm leo dốc tìm vùng cực trị là: Pepton: 14,6 – 17 (g/ L), Mật rỉ đường: 36- 40 (g/ L), CaCl2: 2,3 – 2,5 (g/ L), MgSO4.7H2O: 0,19 – 0, 202 (g/ L). Xác định được giá tri tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính bằng phương pháp Box-Behnken: Pepton: 16,1515 g/ L Mật rỉ đường: 38,6667 g/ L CaCl2: 2,41515 g/ L MgSO4.7H2O: 0,195091 g/ L Xác định được thời gian tạo sinh khối nhiều nhất của chủng trên mơi trường tối ưu là 33 giờ. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 61
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.2 KIẾN NGHỊ Với mục đích tối ưu hĩa mơi trường lên men L. plantarum NT 1.5 để thu được sinh khối vi khuẩn nhiều nhất và cĩ hiệu quả kinh tế cao. Chúng tơi đề nghị thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo sau: - Khảo sát các nguồn dinh dưỡng rẻ tiền thay thế các nguồn dinh dưỡng hiện tại. - Thử nghiệm mơi trường tối ưu trên quy mơ lớn. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1]. Nguyễn Tú Anh, Lê Thị Mỹ Linh, Nguyễn Văn Thanh (2003), “Khảo sát điều kiện nuơi cấy thích hợp cho vi khuẩn Lactobacillus casei”, Tạp chí Y học TP. HCM, Chuyên đề Dược, 7(4), Tr. 195-197. [2]. Nguyễn Đăng Diệp, Bùi Hà Thanh, (1994-1996), "Nghiên cứu các thơng số thích hợp trong qui trình cơng nghệ lên men sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic", Tuyển tập cơng tác nghiên cứu Viện Sinh Học Nhiệt Đới, NXB Nơng Nghiệp. [3]. Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập Vi sinh vật học, NXB Đại học & Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. [4]. Nguyễn Văn Dự, Nguyễn Đăng Bình (2011), ” Quy hoạch thực nghiệm trong kỹ thuật”, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, Tr.9-26, 138-216. [5]. Nguyễn Thành Đạt (2011), Cơ sở sinh học vi sinh vật tập 1, NXB Đại học Sư Phạm [6]. Nguyễn Thị Hồng Hà, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu (2003), “Nghiên cứu cơng nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic probiotic”, Tuyển tập báo cáo tại Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc năm 2003, Tr. 251-255. [7]. Giang Thị Kim Liên (2009), Bài giảng Qui hoạch thực nghiệm (các phương pháp thống kê và xử lý số liệu thực nghiệm), Trường Đại Học Đà Nẵng. [8]. Mai Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh, Nguyễn Thị Giang (2008), “Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn thành phố Hà Nội”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Cơng nghệ, 24, Tr.221-226. [9]. Dương Nhật Linh, Nguyễn Văn Minh, Lê Thị Anh Thiện, Phạm Trần Phương Dung, Phạm Thị Minh Trang, Trần Cát Đơng (2013), “Sàng lọc vi khuẩn lactic cĩ hoạt tính giảm cholesterol”, Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc khu vực phía Nam lần III “Cơng nghệ sinh học vì cuộc sống”, Tr. 151. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO [10]. Nguyễn Đức Lượng và Cao Cường (2003), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học tập 1- thí nghiệm hĩa sinh học, Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh. [11]. Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai (2012), phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp. cĩ khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ và đốm đỏ trên cá tra”, Tạp chí Khoa học, Pp. 224-234 [12]. Trần Linh Thước, Nguyễn Đức Hồng, Phan Thị Phương Trang, Phạm Thị Hồng Tươi (2001), Thực tập vi sinh vật, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP.HCM, Tr.15, 37, 39, 43. [13]. Trần Linh Thước, Đặng Thị Phương Thảo, Đỗ Anh Tuấn, Cao Thị Ngọc Phượng, Võ Cẩm Quy (2011), Thực tập vi sinh vật, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh. Tiếng Anh [14]. Barthelmebs L., Divies C., and Cavin J. F. (2000), “Knockout of the p-coumarate decarboxylase gene from Lactobacillus plantarum reveals the existence of two othe inducible enzymatic activities involved in phenolic acid metabolism”, Appl. Environ. Microbiol, 66: Pp. 3368-3375. [15]. Barthelmebs, L., Divies, C. and Cavin, J-F. (2001), “Molecular characterization of the phenolic acid metabolism in the lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum”, Lait, 81:Pp. 161-171. [16]. Bevilacqua A., Corbo M. R., Mastromatteo M. and Sinigaglia M. (2008), “Combined effects of pH, yeast extract, carbohydrates and di-ammonium hydrogen citrate on the biomass production and acidifying ability of a probiotic Lactobacillus plantarum strain, isolated from table olives, in a batch system”, World J Microbiol Biotechnol, 24:Pp. 1721–1729. [17]. Daeschel M. A. and Nes I. F. (1995), Lactobacillus plantarum: physiology, genetics and applications in foods, in Food Biotechnology Microorganisms, New York, chap. 21, Pp. 721-743. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO [18]. David M. I., Weinert E., Kim C.S., Joseph M. M. and Sherri A. M. (2013), “Natural Farming: Lactic Acid Bacteria”, College of Tropical Agriculture and Human Resources”, [19]. David D., Tryon V. V. and Dennis J. P. (1989), “Metabolism of Mollicutes: the Embden-Meyerhof-Parnas Pathway and the Hexose Monophosphate Shunt”, Journal of General Microbiology, Vol. 135, Pp.683-691. [20]. FAO/WHO(2001), “Report of a joint FAO/WHO expert consultation on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria”, Co´rdoba, Argentina. [21]. Farooq U., Anjum F. M., Zahoor T., Rahman S. U., Randhawa A., Ahmed A. and Akram K. (2012), “Optimization of lactic acid production from cheap raw material: sugarcane molasses”, Pak. J. Bot., 44(1):Pp.333-338. [22]. Han B., Yu Z., Liu B., Ma Q. and Zhang R. (2011), “Optimization of bacteriocin production by Lactobacillus plantarum YJG, isolated from the mucosa of the gut of healthy chickens”, African Journal of Microbiology Research, Pp. 1147-1155. [23]. Karlsson C., Ahrne S. and Molin G. ( 2009), “Probiotic therapy to men with incipient arteriosclerosis initiates increased bacterial diversity in colon: a randomized controlled trial”, Atherosclerosis [24]. Kleerebezem M., Boekhorst J., Kranenburg R. V., Molenaar D., Kuipers O. P., Leer R., Tarchini R., Peters S. A., Sandbrink H. M., Fiers M. W. E. J., Stiekema W., Lankhorst R. M. K., Bron P. A., Hoffer S. M., Groot M. N. N., Kerkhoven R., Vries M., Ursing B., Vos W. M. and Siezen R. J. (2003), “Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 100:Pp. 1990-1995. [25]. Lim H. J., Kim S. Y. and Lee W. K. (2004), “Isolation of cholesterol-lowering lactic acid bacteria from human intestine for probiotic use”, Veterinary Science. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO [26]. Lonnermark E., Friman V. and Lappas G. (2009), “Intake of Lactobacillus plantarum reduces certain gastrointestinal symptoms during treatment with antibiotics”, J Clin Gastroenterol. [27]. Marcel D. (2005), “Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects, Third Edition (Food Science and Technology)”, Library of congress Cataloging-in- publication Data, ISBN 0-203- 02673 X Master e-book ISBN. [28]. Nagarjun P. A., Rao R. S., Rajesham S. and Rao L. V. (2005), “Optimization of Lactic Acid Production in SSF by Lactobacillus amylovorus NRRL B-4542 Using Taguchi Methodology”, The Journal of icrobiology, Pp. 38-43. [29]. Muhamad Nor N., Mohamad R., Ling Foo H. and Rahim R. A. (2010), Improvement of Folate Biosynthesis by Lactic Acid Bacteria Using Response Surface Methodology”, Food Technol. Biotechnol, 48(2):Pp. 243–250. [30]. Nissen L., Chingwaru W. and Sgorbati B. (2009 ), “Gut health promoting activity of new putative probiotic/protective Lactobacillus spp. Strains: a functional study in the small intestinal cell model”, Int J Food Microbiol, Pp. 288-94. [31]. Ooi L. G. and Liong M. T. (2010), “Cholesterol-Lowering Effects of Probiotics and Prebiotics: A Review of in Vivo and in Vitro Findings”, International Journal of Molecular Sciences. [32]. Plackett R. L. and Burman J. P. (1946), “The Design of Optimum Multifactorial Experiments”, Biometrika, Pp. 305-325. [33]. Qin H., Zhang Z. and Hang X. (2009), “L.plantarum prevents enteroinvasive Escherichia coli-induced tight junction protein changes in intestinal epithelial cells”, BMC MicrobioJ, Pp. 31;9;63. [34]. Reichelt J. L. (2013), “The impact of Technical Exellence in Microbiology on the results obtained with Silage Inoculants and Bacterial Biopesticcides”, Bacterial Fermentation Pty Ltd. [35]. Shahravy A., Tababdeh F., Bambai B., Zamanizadeh H. R. and Mizani M. (2012), “Optimization of probiotiic Lactobicillus casei ATCC 334 production using date SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO powder as cacbon source”, Chemical Industry & Chemical Engineering Quarterl, Pp. 273−282. [36]. Tanaka H., Doesburg K., Iwasaki T. and Mierau I. (2006), “Bile salt hydrolase and cholesterol removal effect by Bifidobacterium bifidum NRRL 1976”, World Journal of Microbiology & Biotechnology. [37]. Vamanu E. và cs. (2009), “Studies regarding the production of probiotic biomass from Lactobacillus plantarum strains”, Archiva Zootechnica, Pp. 92-101. [38]. Vaquero, I., Marcobal, A. and Muđoz, R. (2004), “Tannase activity by lactic acid bacteria isolated from grape must and wine”, International Journal of Food Microbiology , 96: Pp. 199-204. [39]. Waugh A. W. G., Foshaug R., Macfarlane S., Doyle J., Churchili T. A., Sydora B. C. and Fedorakr R. N. (2009), “Effect of Lactobacillus plantarum 299v treatment in an animal model of irritable bowel syndrome”, Microbial Ecology in Health and Disease, Pp. 33-37. [40]. Ziarno M., Sekul E. and Lafraya A. A. (2007), “Cholesterol assimilation by commercial yoghurt starter cultures”, Acta Sci. Pol., Technol. Aliment, Pp. 83-94. Tài liệu web [41]. Learn about the Importance of Good Bacteria, Part II: Lactobacillus Plantarum (2010) [42].WHO(2013), SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 67
PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: MƠI TRƯỜNG  Thành phần mơi trường MRS: − Peptone 10 g − Cao thịt 10 g − Cao nấm men 5 g − Glucose 20 g − K2HPO4 2 g − Natri acetate 5 g − MgSO4.7H2O 0,2 g − MnSO4.4H2O 0,2 g − Tween 80 1 mL − (NH4)citrate 2 g − Nước 1000 mL  Thành phần mơi trường MRSA: giống thành phần mơi trường MRS nhưng bổ sung thêm 20g agar. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 68
PHỤ LỤC PHỤ LỤC 2: BẢNG KẾT QUẢ Bảng 2.1. Kết quả xử lí thống kê ANOVA một yếu tố khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ đến khả năng tăng trưởng của L. plantarum NT1.5 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 69
PHỤ LỤC Bảng 2.1. Kết quả xử lí thống kê ANOVA một yếu tố của các nguồn Nitơ khảo sát SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 70
PHỤ LỤC Bảng 2.2.Kkết quả xử lí thống kê ANOVA một yếu tố của các nguồn Cacbon khảo sát SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 71
PHỤ LỤC Bảng 2.3. Kết quả xử lí thống kê ANOVA một yếu tố của các nguồn muối khống khảo sát SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 72
PHỤ LỤC Đồ thị 2.1: Đồ thị ảnh hưởng chuẩn hĩa SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 73
PHỤ LỤC Đồ thị 2.2. Pareto của các yếu tố ảnh hưởng SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 74
PHỤ LỤC Bảng 2.4 Kết quả phân tích hồi quy phương sai cho thí nghiệm P-B SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 75
PHỤ LỤC Bảng 2.5 Kết quả phân tích hồi quy phương sai của thí nghiệm khởi đầu. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 76
PHỤ LỤC Bảng 2.6 Kết quả phân tích hồi quy phương sai của thí nghiệm Box-Behnken SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 77