Khóa luận Phân lập, tuyển chọn vi nấm phân hủy xenlulo dưới tán rừng Thông tại Đại Lải Vĩnh Phúc

52 trang thiennha21 20/04/2022 3610

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Phân lập, tuyển chọn vi nấm phân hủy xenlulo dưới tán rừng Thông tại Đại Lải Vĩnh Phúc", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_phan_lap_tuyen_chon_vi_nam_phan_huy_xenlulo_duoi_t.pdf

Nội dung text: Khóa luận Phân lập, tuyển chọn vi nấm phân hủy xenlulo dưới tán rừng Thông tại Đại Lải Vĩnh Phúc

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  SẦM VĂN ĐÔNG PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI NẤM PHÂN HỦY XENLULO DƯỚI TÁN RỪNG THÔNG TẠI ĐẠI LẢI, VĨNH PHÚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên nghành : Quản lý tài nguyên rừng Khoa : Lâm nghiệp Khóa học : 2015 - 2019 Thái Nguyên, năm 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  SẦM VĂN ĐÔNG PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI NẤM PHÂN HỦY XENLULO DƯỚI TÁN RỪNG THÔNG TẠI ĐẠI LẢI, VĨNH PHÚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên nghành : Quản lý tài nguyên rừng Lớp : K46 - QLTNR Khoa : Lâm nghiệp Khóa học : 2015 - 2019 Giảng viên hướng dẫn: TS. Vũ Văn Định ThS. Phạm Thu Hà Thái Nguyên, năm 2019
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của riêng tôi, những số liệu và kết quả trong khóa luận tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực, chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trình bày trong luận văn này đã được chỉ rõ nguồn gốc. Thái nguyên, tháng 5 năm 2019 Xác nhận của GVHD Người viết cam đoan Đồng ý cho bảo vệ kết quả trước hội đồng khoa học Sầm Văn Đông
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Lâm nghiệp, cảm ơn các thầy cô giáo đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Tôi đặc biệt xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tận tình, sự quan tâm sâu sắc của thầy giáo TS. Vũ Văn Định, cô giáo ThS. Phạm Thu Hà đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Cuối cùng tôi xin bày tỏ sự biết ơn tới gia đình, bạn bè và những người thân đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập. Trong quá trình nghiên cứu do có những chủ quan và khách quan nên khóa luận không tránh khỏi những thiếu xót và hạn chế. Tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô giáo và các sinh viên để tôi hoàn thành khóa luận được tốt hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019 Sinh viên Sầm Văn Đông
iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Một số VSV sản xuất cellulase 9 Bảng 4.1. Kết quả điều tra tầng cây cao rừng Thông khu vực Đại Lải, Vĩnh Phúc 27 Bảng 4.2.Thành phần lớp cây bụi, thảm tươi khu vực Đại Lải Vĩnh Phúc 28 Bảng 4.3. Thành phần và khối lượng vật liệu cháy dưới rừng Thông ở Đại Lải, Vĩnh Phúc 29 Bảng 4.4: Các mẫu đất được thu thập tại các OTC ở Đại Lải 30 Bảng 4.5: Số chủng nấm phân lập được từ các mẫu đất 31 Bảng 4.6. Đặc điểm hình thái một số chủng Vi nấm phân lập được 33 Bảng 4.7: Mức độ phân giải xenlulo của các chủng nấm 34 Bảng 4.8. Kết quả độ giảm khối lượng VLC 37
iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Cơ chế tác dụng của xenlulo tới cellulose. 6 Hình 3.1: Tủ đổ môi trường 23 Hình 3.2: Kính hiển vi và Tủ định ôn 26 Hình 4.1. Vật liệu cháy trong rừng Thông tại Đại Lải 29 Hình 4.2: Một số chủng vi nấm phân lập được tại khu vực nghiên cứu 32 Hình 4.3: Tỷ lệ các Vi nấm phân giải môi trường CMC. 35 Hình 4.4: Khả năng phân giải môi trường CMC của các chủng Vi nấm 36 Hình 4.5: Một số chủng Nấm phân giải mạnh CMC 36 Hình 4.6: Khả năng phân giải môi trường CMC của 1 số chủng Vi nấm. 37 Hình 4.7: Chủng Vi nấm SSN 9 38 Hình 4.8: Chủng Vi nấm HN18 38
v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv MỤC LỤC v PHẦN I. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3. Ý nghĩa của đề tài 3 1.3.1. Ý nghĩa khoa học 3 1.3.2. Ý nghĩa trong học tập, thực tiễn 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 4 2.1. Cơ sở khoa học 4 2.1.1. Tổng quan về Emzym celluase 4 2.1.2.Khả năng phân hủy các chất tự nhiên của vi sinh vật. 8 2.1.3. Nấm phân giải xenlulo 9 2.2. Tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 13 2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về vi sinh vật phân giải xenlulo 13 2.2.2. Nghiên cứu ở Việt Nam về vi sinh vật phân giải xenlulo 15 2.3. Tổng quan về khu vực nghiên cứu 18 PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 19 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 19 3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19 3.2. Nội dung nghiên cứu 19 3.2.1. Điều tra một số đặc điểm cấu trúc rừng Thông nơi tiến hành thu mẫu 19 3.2.2. Phân lập các chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo. 19 3.2.3. Tuyển chọn các chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo. 19
vi 3.2.4. Mô tả đặc điểm một số chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo cao 20 3.3. Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1. Điều tra một số đặc điểm cấu trúc rừng Thông nơi tiến hành thu mẫu 20 3.3.2 Phân lập các chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo 20 3.3.3. Tuyển chọn các chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo 23 PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 4.1. Điều tra một số đặc điểm cấu trúc rừng Thông nơi tiến hành thu mẫu 27 4.1.1. Kết quả điều tra tầng cây cao 27 4.1.2. Kết quả nghiên cứu độ che phủ của tầng cây bụi, thảm tươi dưới tán rừng Thông tại khu vựcnghiên cứu. 27 4.1.3. Thành phần vật liệu cháy dưới tán rừng Thông ở khu vực 28 4.2. Phân lập các chủng vi nấm từ mẫu đất 30 4.2.1. Kết quảthu thập mẫu 30 4.2.2 Phân lập chủng nấm từ các mẫu đất thu được 31 4.3. Kết quả tuyển chọn chủng vi nấm có khả năng phân giải xenlulo 34 4.3.1 Kết quả xác định hoạt tính phân giải xenlulo của các chủng nấm 34 4.3.2. Kết quả thí nghiệm đối với vật liệu cháy 37 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2. Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC
1 PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong những năm gần đây, hiện tượng sa mạc hóa và cháy rừng ngày càng tăng rõ rệt. Một trong những nguyên nhân cháy rừng đó là do biến đổi khí hậu như rét đậm, rét hại làm gia tăng nhanh cành khô, lá rụng nằm trên mặt đất dưới tán rừng lớn, mặt khácdo khô hạn kéo dài dẫn đến gia tăng nhanh vật liệu cháy. Sử dụng vi sinh vật phân giải xenlulo có sẵn trong đất có khả năng phân giải cành khô lá rụng trên mặt đất dưới tán rừng, làm giảm nguy cơ cháy rừng và tăng độ phì cho đất.Vi sinh vật phân giải xenlulo có nhiều loại khác nhau như vi khuẩn, xạ khuẩn, các loại nấm lớn và vi nấm. Trên trái đất đa phần các vi nấm đều không thể nhìn thấy được bằng mắt thường, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất mùn xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc ký sinh trên cơ thể động thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các chất hữu cơ và trong chu trình chuyển hóa, trao đổi vật chất. Nấm, vi nấm được ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất, nhiều loài vi nấm phân hủy xenlulo mạnh như: Aspergilluschaetomium, Aspergillusfumigatus, Aspergillusflavus, Curvularia, Fusarium, Memoniella, Phomo, Thielavia và Trichoderma chúng có tác dụng phân giải các chất hữu cơ dưới lớp thảm mục làm tăng các chất hữu cơ, mùn khoáng trong đất có tác động tích cực đến thảm thực vật rừng. Ngoài ra một số loài nấm có khả năng hạn chế một số loại bệnh trên cây trồng, kích thích sinh trưởng cho cây tiêu biểu Trichoderma reesei, Trichoderma viride. Nấm và vi khuẩn là những sinh vật phân hủy chính có vai trọng đối với hệ sinh thái cạn trên toàn thế giới. Dựa theo tỉ lệ giữa số nấm và số loài thực vật ở trong cùng một môi trường người ta ước tính giới Nấm có khoảng 1,5 triệu loài. Khoảng 100.000 đã được nhà khoa học phát hiện và
2 miêu tả, tuy nhiên kích cỡ thực sự của tính đa dạng của giới nấm vẫn còn nhiều bí ẩn. Mỗi chất hữu cơ đều bị một nhóm vi sinh vật tương ứng phân huỷ một phần hay toàn bộ, các sản phẩm phân huỷ này lại được các loài khác phân huỷ tiếp, cứ như thế đến tận các chất vô cơ. Như vậy, vật chất luôn luôn được tuần hoàn bởi hai loại quá trình đối lập nhau: sự tổng hợp chất hữu cơ từ chất vô cơ, và phân huỷ chất hữu cơ thành chất vô cơ. Các quá trình phân huỷ này chủ yếu do vi sinh vật thực hiện (nấm chiếm 50%) ở bất kỳ đâu có sự hiện diện của chúng: trong đất, trong nước, trong cơ thể các sinh vật khác. Có rất nhiều loại vi nấm khác nhau, mức độ và khả năng phân hủy xenlulo cũng khác nhau, mỗi loại vi nấm đều có lợi ích và tác hại riêng của mình, vi nấm rất phong phú nên việc nghiên cứu các loại vi nấm này là rất quan trọng, việc tìm ra các vi nấm này sẽ giúp quá trình phân hủy xenlulo trong tự nhiên diễn ra nhanh hơn góp phần phân hủy các chất thảm mục, tạo chất dinh dưỡng cho cây rừng cũng như làm giảm thiểu một phần khả năng cháy rừng. Để nhận biết, phân lập và tuyển chọn được các loại vi nấm phân hủy xenlulo cao dưới tán rừng thông nhằm phục vụ công tác nghiên cứu phát triển những lợi ích của các loại vi nấm này tôi thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển chọn vi nấm phân hủy xenlulo dưới tán rừng Thông tại Đại Lải Vĩnh Phúc”. Trên cơ sở phân tích các mẫu, số liệu thu được tiến hành nhận biết và tuyển chọn được một số chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo dưới tán rừng Thông. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn được một số chủng vi nấm có khả năng phân giải xenlulo dưới tán rừng Thông.
3 - Khảo sát một số đặc tính sinh học để phục vụ nuôi cấy vi nấm có hiệu lực cao tạo ra các chế phẩm sinh học phân hủy nhanh xenlulo dưới rừng thông 1.3. Ý nghĩa của đề tài 1.3.1. Ý nghĩa khoa học - Là cơ sở khoa học để tạo chế phẩm sinh học từ một số chủng vi nấm nhằm phân hủy nhanh xenlulo dưới tán rừng Thông. 1.3.2. Ý nghĩa trong học tập, thực tiễn - Góp phần xây dựng cơ sở khoa học tạo ra các chế phẩm sinh học từ các chủng vi sinh vật phân hủy nhanh xenlulo làm giảm nguy cơ cháy rừng cho các diện tích rừng thông ở Đại Lải nói riêng và Việt Nam nói chung. - Giúp sinh viên làm quen với công tác nghiên cứu khoa học và tăng các kỹ năng thực hành trong phòng thí nghiệm và ngoài hiện trường. - Giúp chúng ta hiểu thêm được tầm quan trọng của vi nấm nói riêng cũng như vi sinh vật nói chung. - Trang bị cho sinh viên những kiến thức thực tế, những kinh nghiệm và ý thức làm việc trước khi ra trường, là cơ sở để sinh viên thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp.
4 PHẦN 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1. Cơ sở khoa học Vi nấm phân giải xenlulo để sản xuất chế phẩm ứng dụng có hiệu quả cao đối với một số loại cây trồng trong lĩnh vực nông lâm nghiệp, giúp cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt, hiệu quả về mặt kinh tế và bảo vệ được môi trường sinh thái và tăng hàm lượng dinh dưỡng (N, P, K). Sử dụng chế phẩm sinh học phân hủy Xenlulo, giúp quá trình phân giải xenlulo diễn ra nhanh hơn. Do vậy đề tài thực hiệnrất cần thiết có ý nghĩa cả về lý luận và thực tiễn. 2.1.1. Tổng quan về Emzym celluase Xenlulo là hợp chất cao phân tử được trùng hợp (polyme hóa) từ các gốc β-Dglucose bằng cầu nối β-1,4-glycosid nhờ vào khả năng tự dưỡng dưới ánh sáng của thực vật. Vì vậy, xenlulo là hợp chất phổ biến nhất trong tự nhiên. Xenlulo có cấu trúc mạch thẳng dạng sợi rất bền, khó bị phân hủy. Xenlulo là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân hủy xenlulo thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase (Trịnh Đình khả và cộng sự, 2007) [ 9] Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân xenlulo tạo thành các phân tử đường β-glucose. Theo nghiên cứu của một số tác giả, xenlulo bị phân hủy dưới tác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β- (1,4)-glucanase hay enzyme C1, Endo-β-glucanase hay endocellulase còn gọi là enzyme CMC–ase hay Cx và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase: Exo-1,4-gluconase giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên xenlulo và
5 định hình hoặc xenlulo đã bị phân giải một phần. Tác dụng lên xenlulo kết tinh không rõ ràng nhưng khi có một endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose. β-1,4-glucosidase thủy phân cellobiose và các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tinh thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. 2.1.1.1 Phân loại cellulase Cellulase là phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân xenlulo thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4-glycoside tạo thành các phân tử đường β- glucose. Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase được chia thành ba loại: - 1,4-  -D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) - 1,4-  -D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) -  -D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) Các enzyme này được tìm thấy trong vi khuẩn sống trong dạ dày cỏ bò và mối và trong một số nấm như Trichoderma, Aspergillus Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết ß- 1,4-glucoside và tác động vào chuỗi xenlulo một cách tùy tiện, sản phẩm của quá trình thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc xenlulo theo kiểu tùy tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi xenlulo và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose. Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên xenlulo vô định hình hoặc xenlulo đã bị phân
6 giải một phần. Tác dụng lên xenlulo kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt. ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiose và các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của cellulase. 2.1.1.2. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân xenlulo thành cellobiose và cuối cùng thành glucose. Sự phân giải xenlulo dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3 giai đoạn chủ yếu sau: Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C1, xenlulo bị thủy phân thành xenlulo hòa tan. Trong giai đoạn thứ hai, xenlulo hòa tan sẽ bị thủy phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme Cx tạo thành đường cellobiose. Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose. Hình 2.1. Cơ chế tác dụng của xenlulo tới cellulose.
7 Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy xenlulo trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm. 2.1.1.3. Ứng dụng của emzym cellulose Hiện nay, enzyme cellulase được ứng dụng mạnh mẽ trong các ngành công nghiệp khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất bia rượu, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, sản xuất bột giặt, sản xuất giấy, trong nông nghiệp Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Nguyên liệu ban đầu chứa hàm lượng cao các chất khó tan là lignin và một phần hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn. Trong công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất chế phẩm vi sinh. Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn tới mất cân bằng sinh thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống con người. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả. Enzyme này có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các hợp chất kiểu lignoxenlulo và xenlulo trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giàu năng lượng khác. Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học. Trước khi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin. Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và
8 hemicellulase đã được dùng để tẩy trắng mực in trên giấy. Enzyme cellulase được bổ sung vào nhiều giai đoạn khác nhau trong quá trình sản xuất giấy. Trong công nghiệp dệt, người ta sử dụng enzyme cellulase để giữ màu vải sáng, bền và không bị sờn cũ. Đối với vải jean, cellulase được dùng để làm mềm vải jean và tạo ra các vệt “stone washed”. Trước đây các vệt “stone washed” được làm thủ công bằng cách dùng đá bọt chà lên vải jean, làm mất lớp kiềm trên bề mặt vải và tạo ra những sợi chỉ trắng. Hiện nay người ta sử dụng enzyme cellulase trong giai đoạn giặt vải jean thay cho việc sử dụng đá bọt. Enzyme cellulase chỉ phân hủy theo các vết kiềm trên vải jean đã nhuộm màu để tạo ra các vệt “stone washed”. Các vệt “stone washed” được tạo ra bằng phương pháp này bền hơn bằng cách dùng đá bọt. Ngoài ra, người ta có thể tăng độ đậm nhạt của các vệt này bằng cách tăng hay giảm hàm lượng cellulase sử dụng trong giai đoạn giặt. Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu và sản xuất. 2.1.2.Khả năng phân hủy các chất tự nhiên của vi sinh vật. Các chất hữu cơ sơ cấp - do thực vật tổng hợp từ CO2 liên tục hàng triệu năm nay, và các chất hữu cơ thứ cấp bắt nguồn từ đó, luôn luôn được phân huỷ song song và gần như cân bằng với sự tạo ra chúng, nên không bị tích tụ trên trái đất. Chỉ một phần nhỏ của sinh khối thực vật còn được giữ lại dưới dạng các hợp chất cacbon có tính khử mạnh như dầu mỏ, khí mỏ và than đá, trong điều kiện kị khí. Còn trong điều kiện có không khí thì mọi chất được các cơ thể sống tổng hợp nên đều có khả năng bị phân huỷ nhờ vi sinh vật. Mỗi chất hữu cơ đều bị một nhóm vi sinh vật tương ứng phân huỷ một phần hay toàn bộ, các sản phẩm phân huỷ này lại được các loài khác phân huỷ tiếp, cứ như thế đến tận các chất vô cơ. Như vậy vật chất luôn luôn được tuần hoàn bởi hai loại quá trình đối lập nhau: sự tổng hợp chất hữu cơ từ chất vô cơ, và phân huỷ chất hữu cơ thành chất vô cơ. Các quá trình phân huỷ này chủ yếu do vi sinh vật thực hiện, ở bất kỳ đâu có sự hiện diện của chúng: trong đất, trong nước, trong cơ thể các sinh vật khác. Riêng trong đất, sự phân huỷ
9 chất hữu cơ rơi vào đó do nhiều nhóm vi sinh vật và nhiều động vật nhỏ tham gia, tạo thành các mạng lưới dinh dưỡng. Vi sinh vật phân huỷ các chất hữu cơ tự nhiên để thu nhận vật chất (nguồn cacbon, nguồn nitơ ) và năng lượng, cho sinh trưởng của chúng. Trải qua quá trình tiến hoá nhiều tỷ năm, chúng đã hoàn thiện được nhiều con đường phân huỷ đối với nhiều loại chất khác nhau.Vi sinh vật phân giải xenlulo có khả năng phân giải cành khô lá rụng trên mặt đất dưới tán rừng, làm giảm nguy cơ cháy rừng, tăng độ phì cho đất. Kết quả là ngày nay, không có một chất tự nhiên hữu cơ nào không bị vi sinh vật phân huỷ tạo nên một chu trình tuần hoàn khép kín. 2.1.3. Nấm phân giải xenlulo Một số VSV đã được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều về khả năng phân giải xenlulo được thể hiện bảng 2.1 . Bảng 2.1. Một số VSV sản xuất cellulase Nấm sợi Xạ khuẩn Vi khuẩn Aspergillus niger Actinomyces aureus Preudomonas A.oryzae Act.cellulose Fluorescens A.terreus Act.diastaticus B.megaterium A.syndovii Act. roseus B.mensenteroides A. flavus Act.griseus Clostridium sp. Fusarium culmorum Act.melamocylas Acetobacter xylinum Fusarium oxysporum Act.coelicolor Vi khuẩn dạ cỏ Mucor pusilus Act.candidus Ruminoccus albus Pen. notatum Act.chromogenes Ruminobacter parum Penicillium spp Act. hygroscopicus Bacteroides Trichoderma lignorum Act.griseofulvin Amylophillus sp. Trichoderma reesei Act.ochroleucus Clos.butiricum Trichoderma viride Act.thermofulcus Clos.locheheadil Trichoderma konongi Act.xanthostrums Cellulosemonas Thermonospora curvata
10 Xenlulo là một polime hữu cơ phổ biến nhất, tương ứng khoảng 1,5x1012 tấn trên tổng số sinh khối thực vật được sản xuất ra hàng năm thông qua quang hợp đặc biệt đặc biệt là ở những vùng nhiệt đới và chúng được coi là nguồn vật liệu vô tận cho các nghành sản xuất khác nhau như công nghiệp chế biến giấy,công nghiệp chế biến thực phẩm, nhiên liệu sinh học cũng như ứng dụng trong lĩnh vực Nông-Lâm nghiệp. Hệ VSV có khả năng phân hủy xenlulo bao gồm nấm,vi khuẩn và xạ khuẩn Giới Nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn dị dưỡng có thành tế bào bằng kitin (chitin). Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các sợi đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium), một số nấm khác lại phát triển dưới dạng đơn bào. Quá trình sinh sản (hữu tính hoặc vô tính) của nấm thường qua bào tử, được tạo ra trên những cấu trúc đặc biệt hay quả thể.Một số loài lại mất khả năng tạo nên những cấu trúc sinh sản đặc biệt và nhân lên qua hình thức sinh sản sinh dưỡng. Vậy những loài nấm nào là Vi nấm (Microfungi)? Đó là tất cả các nấm không có mũ nấm (quả thể, fruit-body) có thể thấy rõ bằng mắt thường.Người ta gọi những nấm có mũ nấm là các nấm bậc cao. Tuy nhiên khi nuôi cấy sợi nấm của các nấm bậc cao để nghiên cứu hoặc để sản xuất sinh khối thì chúng cũng được coi như vi nấm và là đối tượng nghiên cứu của ngành vi sinh vật (giống như các loài vi nấm khác). Để nghiên cứu vi nấm bắt buộc phải quan sát dưới kính hiển vi và phải nuôi cấy trong các điều kiện vô khuẩn. Căn cứ vào hình thái người ta chia vi nấm thành hai nhóm khác nhau: nhóm Nấm men (Yeast) và nhóm Nấm sợi (Filamentous fungi). Chúng chỉ khác nhau về hình thái chứ không phải là những taxon phân loại riêng biệt.Nhiều nấm men cũng có dạng sợi và rất khó phân biệt với nấm sợi. Các loài nấm mốc có khả năng sinh nhiều xenlulo thuộc các giống Allernaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Penicillium Chúng được tách ra từ đất xung quanh vùng rễ cây, từ các mẫu thực vật, từ than bùn
11 và các nguồn tự nhiên khác có quá trình phân hủy cellulose. Ngoài ra các chủng nấm lớn thuộc lớp Basidomycetes cũng được đánh giá có khả năng sinh xenlulo mạnh. Có rất nhiều loài nấm phân giải xenlulo mạnh trong đó nấm có hoạt tính phân giải xenlulo đáng chú ý Trichoderma bao gồm hầu hết các loại sống hoại sinh trong đất, những đại diện tiêu biểu Trichoderma reesei, Trichoderma viride chúng phân hủy tàn dư thực vật trong đất góp phần chuyển hóa lượng hữu cơ khổng lỗ thành các chất dễ tiêu có lợi cho thực vật và tạo lớp mùn cho đất. Một số loài nấm khác cũng có hoạt tính phân giải xenlulo khá cao là Aspergillus niger, A.oryzae, Fusarium solani, Penicillium pinophinum và Sclerotium rolfsii. Các loài nấm khác nhau thì khả năng phân giải xenlulo mạnh yếu khác nhau. Để cho quá trình phân hủy xenlulo diễn ra nhanh hơn người ta thường bổ sung thêm các chất dễ đồng hóa như glucoza, xenlobioza vào môi trường nuôi cấy có thể làm cho pH của môi trường giảm nhanh chóng và do đó hoạt tính xenlulaza của các chủng nấm Trichoderma giảm. Thường các loài nấm phân giải xenlulo ở độ ẩm cao và nhiệt độ: 20- 300C, pH trong khoảng 3,5-3,6. Các loài nấm ưa nhiệt sinh trưởng và phân giải nhanh nhưng có hoạt tính xenlulo trong dịch nuôi cấy lại thấp. Nấm không có khả năng ăn các chất dinh dưỡng nhưng lại tiết ra enzym vào môi trường xung quanh để phân hủy các phân tử phức tạp thành các chất hòa tan để nấm có thể hấp thu được. Nhiều nấm sống hoại sinh, có nghĩa là chúng dinh dưỡng trên phần còn lại của chất hữu cơ đã chết. Số khác là những sinh vật ký sinh và kiếm thức ăn trực tiếp từ các cơ thể sống trong các mô của vật chủ sống, nấm ký sinh tùy ý có khả năng sống hoại sinh và thường gây chất các vật chủ của chúng và gồm nhiều nấm bệnh quan trọng của thực vật.
12 Vi nấm đóng vai trò rất quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các vật chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật chất. Một số loài nấm có thể nhận thấy được khi ở dạng quả thể như nấm lớn và nấm mốc. Nấm được ứng dụng rất rộng rãi trong đời sống lẫn sản xuất. Nhiều loài được sử dụng trong công nghệ thực phẩm, sử dụng làm thức ăn hoặc trong quá trình lên men. Nấm còn được dùng để sản xuất chất kháng sinh, hoóc môn trong y học và nhiều loại enzym.Tuy vậy, nhiều loại nấm lại có chứa các chất hoạt động sinh học được gọi là mycotoxin, như ancaloit và polyketit-là những chất độc đối với động vật lẫn con người. Một số loại nấm được sử dụng để kích thích hoặc dùng trong các nghi lễ truyền thống với vai trò tác động lên trí tuệ và hành vi của con người. Vài loại nấm có thể gây ra các chứng bệnh cho con người và động vật, cũng như bệnh dịch cho cây trồng, mùa màng và có thể gây tác động lớn lên an ninh lương thực và kinh tế. Tất cả những sinh vật nhỏ như vi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn tạo thành thế giới vi sinh vật vô cùng phong phú, chúng phân bố ở khắp mọi nơi trên hành tinh chúng ta. Chúng tham gia vào các quá trình chuyển hoá vật chất, khép kín các vòng tuần hoàn vật chất trong thiên nhiên, làm cho sự cân bằng vật chất được ổn định và từ đó bảo vệ sự cân bằng sinh thái. Người ta có thể sử dụng nhiều nhóm vi sinh vật vào mục đích bảo vệ môi trường. Ví dụ như nhóm vi sinh vật phân huỷ chất hữu cơ trong rác thải, nhóm vi sinh vật phân huỷ các chất độc hại thành chất không độc. Trong công nghệ xử lý chất thải bằng phương pháp sinh học có sử dụng rất nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau. Vi sinh vật còn được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất như chế tạo phân bón sinh học, thuốc bảo vệ thực vật sinh học nhằm mục đích thay thế các chất hoá học độc hại với môi trường. Sự phân bố rộng rãi của vi sinh vật trong các môi trường tự nhiên đóng vai trò quyết định vào khả năng tự làm sạch môi trường đó, cùng với những yếu tố lý học, hoá học và sinh học khác. Vi
13 sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc làm nên khả năng chịu tải của môi trường, đó chính là khả năng tự làm sạch môi trường, giữ cho môi trường tự nhiên không bị ô nhiễm. 2.2. Tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về vi sinh vật phân giải xenlulo Nghiên cứu và ứng dụng của xenlulo bắt đầu từ năm 1950. Cuối thế kỉ XIX đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tổng hợp xenlulo từ VSV, một số nghiên cứu xenlulo từ nấm của một số tác giả như Trichoderma reseii (Ogaw, và cộng sự 1991) [18], Schizophillum commune (wilick & Seligy 1985) [21]. Năm 2000 Mazadza và cộng sự [17], đã nghiên cứu khả năng tổng hợp xenlulo từ các loại nấm có tính đặc hiệu cao bao gồm: phức hệ 3 ezim endoglucanase, cellobihydrolase và β-glucosidase thủy phân hoàn toàn xenlulose. Do xenlulo có nhiều ứng dụng cho nên có rất nhiều nghiên cứu về xenlulo như: nghiên cứu về các tính chất hóa lí của chúng như xác định khố lượng phân tử của Macarron cộng sự, (1993) [14], Henrikasson và cộng sự (1999) [11], xác định nhiệt độ tối ưu của Isabel và cộng sự (1992) [12] Theo Sivakumaran (2014) [20], phân lập được 21 chủng từ các nguồn vật liệu khác nhau như mùn cưa, lá rụng . Trong đó lựa chọn loài nấm có khả năng phân giải xenlulo bằng phương pháp giấy lọc và phương pháp dùng thuốc thử DNS.Kết quả cho thấy Helminthosporium sp. và Cladosporium sp. là hai loài có khả năng phân giải mạnh nhất sau đó là Trichoderma sp và Aspergillus sp. Trong một nghiên cứu khác trên rơm rạ, thu được 25 loài khác nhau thuộc ngành Ascomycetes và Basidiomycetes, trong đó loài Trichoderma harzianum có khả năng phân giải xenlulo tốt nhất . Nấm phân giải xenlulo mạnh như các loài Aspergilluschaetomium, Aspergillusfumigatus, Aspergillusflavus, Curvularia, Fusarium, Memoniella, Phomo, Thielavia và Trichoderma. Những chủng này đã được nghiên cứu
14 rộng rãi để sản xuất các enzyme ngoại bào có khả năng phân giải xenlulo đó là endoglucanases, exoglucanases và cellobiase là những chất có thể chuyển đổi xenlulo thành gluco (Maheshwari DK, Gohade S và Jahan H (1990) [15]. Theo nghiên cứu của Makeshkumar và P.U. Mahalingam (2011) [16], 6 loại nấm bệnh có khả năng phân giải xenlulo (Fusarium sp., Aspergillusfumigatus, Cladosporium sp., Aspergillusflavus, Pyricularia sp. và Nigrospora sp.) đã được phân lập và thử nghiệm các chủng nấm phân giải xenlulo chiếu qua tia UV kết quả cho thấy nấm Fusarium phát triển tốt nhất và có quá trình phân giải xenlulo hiệu quả nhất. Do đó nghiên cứu đã đề xuất sử dụng dòng nấm đột biến này để ủ chất thải hữu cơ khác nhau. Bên cạnh đó một số nhóm nấm khác như Trichoderma koningii, Sporotrichum thermophila, Myceliophthora thermophila cũng được nghiên cứu cho thấy có khả năng phân giải xenlulo tốt Reddy.BR, Narasimha G và Babu GVAK (1998) [19]. Lamot, Voets (1978) [13] đã dùng 7 chủng vi sinh vật phân giải xenluloza để phân hủy xenlophan như: Aspergillus.sp, Penicillium.sp, 2 loài Chaetomium, 1 loài Sclerotium rolfsii, 2 loài xạ khuẩn Streptomyces. Tác giả nhận thấy nếu để riêng rẽ từng loại vi sinh vật tác dụng thì sự phân giải hầu như không diễn ra, còn khi dùng hỗn hợp các chủng nói trên thì sự phận giả xenlophan bị phân hủy. Sau khi dùng 7 chủng trong thời gian 100 ngày 85% xenlophan bị phân hủy sản phẩm cuối cùng được dùng làm phân bón bao gồm: 30% protein, 60% đường hòa tan, 10% các gốc còn lại. Tại New Delhi- Ấn Độ Gaur và Bhardwaj (1987) [10] đã phân lập và tuyển chọn được rất nhiều chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy xenluloza. Sau đó tác giả đã sử dụng chủng nấm Trichurus spiralis, Trichoderma viride, Paecilomyces fusisporus, Aspergillus. sp để đưa vào đống ủ (rơm rạ, lá khô) kết quả cho thấy: hàm lượng C hữu cơ giảm từ 48% xuống 25% trong vòng 1 tháng đầu tiên của quá trình ủ và chỉ trong vòng 8-10 tuần rơm rạ đã phân hủy
15 hoàn toàn thành một loại phân hữu cơ có chất lượng tốt. Trong phân chứa khoáng 1,7%N và tỷ lệ C/N là 12:3. Ở Trung Quốc có nhiều nghiên cứu về việc phân lập và ứng dụng chúng trong việc phân giải xenlulo. Wen-Jing Lu và cộng sự (2005) [22] đã phân lập được 5 chủng vi khuẩn ưa ẩm phân giải xenluloza cao từ phế thải rau quả và thân lá hoa thuộc giống Bacillus, Halobacillus, Aeromicrobium, Brevibacterium. Bổ sung 1% sinh khối các chủng vi sinh vật này để ủ phế phụ phẩm rau quả và thân lá hoa đã làm tăng quá trình phân hủy sinh học các nguyên liệu lên 23,64% so với đống ủ không bổ sung thêm vi sinh vật, do đó rút ngắn thời gian ủ và tăng chất lượng của phân ủ. 2.2.2. Nghiên cứu ở Việt Nam về vi sinh vật phân giải xenlulo Trong những năm gần đây Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về VSV phân hủy xenlulose và xenlulazeĐặng Minh Hằng (1999) [2]. Hoàng Quốc Khánh và cộng sự (2003) [3].Trịnh Đình Khá và cộng sự (2007) [9]. Những nghiên cứu này chủ yếu đề cập vấn đề phân lập các chủng VSV và đánh giá ảnh hưởng một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp xenlulose như: tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp xenlulose và tinh sạch, đánh giá tính chất hóa lý của xenlulose từ chủng penicillium sp. DTQ-HK1 Trịnh Đình Khá và cộng sự (2007) [9] Hoàng Quốc Khánh và cộng sự(2003)Tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp xenlulose của chủng penicilium SP DTQ-HK1[3]. Nghiên cứu từ các mẫu rác thải, đất, rơm, mục, giấy ăn và rác thải nhà máy giấy đã phân lập được 49 chủng VSV trong đó có 36 chủng có hoạt tính xenlulase. Ba chủng nấm sợi RM1.1, RM1.5, và HK1 có khả năng phân hủy xenlulose mạnh nhất đã được tuyển chọn để xác định tên loài. So sánh trình tự 28s rRNA chủng RM1.1 có độ tương đồng 100% so với Aspergillus fumigatus ATCC 16907. Chủng RM1.5 và HK1 lần
16 lượt có độ tương đồng so với 1 số đại diện củ chi Emericella (99,8%) và chi Penicillium (99,6%). Trình tự 28s RNA của các chủng này đã được đăng kí trong Genbak với mã số EFO12766 (Aspergillus fumigatus DTQR-M1.1). EFO25927 (Emericella sp DTQ-RM1.5) và EFO87978 (Penecilium sp TDQ- HK1). Chủng penicilium sp TDQ-HK1 sinh tổng hợp xenlulose mạnh nhất (1,58 U/ml) sau 120h lên men chìm ở pH tối ưu 5,5 nhiệt độ tối ưu 30°C, nuôi lắc 200 vòng/phút trong môi trường CPy với nồng cơ chất cảm ứng bột giấy tối ưu 0,5%. Nguồn nitrogen và cacrbon làm tăng khả năng sinh tổng hợp xenlulose của chủng TDQ-HK1 là bột đậu tương và rơm. Trịnh Đình Khá và cộng sự (2007) [9] “Nghiên cứu phân lập tuyển chọn một số chủng VSV có khả năng phân hủy xenluose từ rong giấy tại Hòn Chồng- Nha Trang” để tuyển chọn các chủng VSV có khả năng sinh xenlulase thủy phân xenlulose, họ tiến hành phân lập VSV từ các mẫu rong giấy đã mục thu tại bãi biển Hòn Chồng- Nha Trang, sử dụng môi trường thạch thường để phân lập vi khuẩn, môi trường capek để phân lập nấm mốc và môi trường ISP4 để phân lập xạ khuẩn, sơ tuyển VSV bằng phương pháp đặt thỏi thạch trên môi trường CMC và xác định hoạt tính xenlulose bằng cách đo vòng thủy phân trên CMC. Kết quả phân lập được 16 chủng VSV có khả năng phân giải xenlulose, trong đó 14 VSV hoạt tính xenlulose cao bao gồm: 7 chủng vi khuẩn, 4 chủng nấm mốc, và 4 chủng xạ khuẩn. Với 4 chủng VSV có vòng thủy phân xenlulose mạnh nhất là: VK4, N3, N4, và XK4; 2 chủng nấm sợi N3 và N4 là hai chủng phân lập được từ rong giấy đã ủ mục tại bãi biển Hòn Chông- Nha Trang là những chủng VSV tổng hợp xenlulose mạnh nhất. Theo Nguyễn Thị Thúy Nga (2010) [6]. Từ 30 mẫu đất thu thập từ đất trống đồi núi trọc đã phân lập được 25 chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenlulo, trong đó có 10 chủng vi sinh vật có khả nănng phân giải xenlulo mạnh, có đường kính vòng phân giải >15 mm. Có 5 chủng có khả năng phân
17 giải xenlulo mạnh gồm chủng ĐT2, ĐV2 XN1, PV1 và ĐT1 có đường kính vòng phân giải lớn hơn 20mm. Từ các chủng có hiệu lực mạnh đã chọn được 2 chủng ĐT2 và ĐV2 có hiệu lực phân giải xenlulo rất mạnh với đường kính vòng phân giải ≥ 25mm. Đây là những kết quả ban đầu có cơ sở để ứng dụng 2 chủng này làm phân bón vi sinh hỗn hợp để phân giải cành khô lá rụng trên mặt đất dưới tán rừng, làm giải nguy cơ cháy rừng và tăng độ phì cho đất. Đã phân lập,xác định tên khoa học và tuyển chọn được 4 chủng vi sinh vật có ích thuộc các loài: Pseudomonas fluorescens và Bacillus subtilis (vi khuẩn nội sinh sinh tổng hợp IAA), đối kháng nấm gây bệnh và Burkholderia cenocepacia và Azotobacter beijerinskii (vi khuẩn phân giải phốt phát, cố định nitơ). Trần Thị Ngọc Sơn và cộng sự (2010) [8]. Kết quả đã phân lập được 40 chủng nấm Trichoderma sp từ các mẫu đất đại diện cho hệ thống canh tác lúa 2 vụ, lúa 3 vụ, lúa mía ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) bao gồm Cần Thơ, Hậu Giang, Kiên Giang và An Giang từ vụ đông xuân 2008-2009 để nghiên cứu khả năng phân hủy rơm rạ. Các tác giả đã chọn được 9 chủng nấm có chỉ số phân hủy xenlulo cao thông qua sự phát triển đường kính tăng trưởng của nấm sau hai ngày ủ ở điều kiện 280C và đã tuyển chọn được 3 chủng nấm Trichoderma sp có chỉ số phân hủy xenlulo (K3, V1, HG2) để sản xuất 2 chế phẩm phân hủy rơm bao gồm dạng chế phẩmTrichoderma sp hòa tan trong nước và dạng chế phẩm Trichoderma sp không hòa tan trong nước. Hiệu quả xử lý rơm ra của 2 dạng chế phẩm này. Sau 4 tuần xử lý rơm rạ tươi bằng chế phẩm chế phẩm Trichoderma sp dạng bột đã làm giảm tỷ số C/N xuống chỉ còn 17,93 và dạng bột không hòa tan C/N chỉ còn 20,53 so với rơm rạ tươi có C/N là rất cao là 75,5 đến 78,25. Đồng thời tăng N, P2O5, K2O tổng số so với trước khi xử lý từ 67,8% N tổng số; 79,7% P2O5 tổng số và 68,2% K2O tổng số (chế phẩm dạng bột hòa tan) và N, P2O5, K2O tổng số lần lượt
18 tăng 71,6%; 109,6% và 72,7% (chế phẩm dạng bột không hòa tan) so với N, P2O5, K2O tổng số trong rơm rạ trước khi ủ. Lưu Hồng Mẫn và cộng sự (2006) [4] ứng dụng chế phẩm sinh học Trichoderma để sản xuất phân hữu cơ vi sinh phục vụ cho thâm canh lúa ở Đồng bằng Sông Cửu Long kết quả cho thấy sau 5 tuần xử lý chế phẩm sinh học tỷ lệ C/N giảm nhanh từ 36,95 xuống còn 16,97%. 2.3. Tổng quan về khu vực nghiên cứu Đại Lải nằm ở phía đông bắc của thị xã Phúc Yên cách thủ đô Hà Nội khoảng 40 km với diện tích tự nhiên là 1.500ha, diện tích mặt nước 525 ha nằm gần chân dãy núi Tam Đảo thuộc xã Ngọc Thanh và xã Cao Minh với trung tâm là hồ Đại Lải Đại Lải nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ bình quân năm là 23 °C, có nét đặc trưng nóng ẩm, mưa nhiều về mùa hè, hanh khô và lạnh kéo dài về mùa đông. Khí hậu tương đối thuận lợi cho phát triển nông nghiệp đa dạng. Nhiệt độ không khí có các đặc trưng sau: Cực đại trung bình năm là 20,5 °C Cực đại tuyệt đối 41,6 °C Cực tiểu tuyệt đối 3,1 °C Độ ẩm không khí tương đối trung bình năm là 83%, độ ẩm cực tiểu tuyệt đối là 16%. Hướng gió chủ đạo về mùa đông là Đông – Bắc, về mùa hè là Đông – Nam, vận tốc gió trung bình năm là 2,4 m/s. Vận tốc gió cực đại có thể xảy ra theo chu kỳ thời gian 5 năm là 25 m/s; 10 năm là 32 m/s, 20 năm là 32 m
19 PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu - Đề tài chỉ tập trung phân lập, tuyển chọn một số chủng vi nấm có khả năng phân giải xenlulo cao dưới tán rừng Thông mã vĩ, Thông nhựa trên địa bàn Đại Lải- Vĩnh Phúc 3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Địa điểm nghiên cứu: + Tiến hành điều tra và thu mẫu tại Đại Lải, Vĩnh Phúc + Phân lập tuyển chọn vi nấm được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam (Phường Đức Thắng, quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội). - Thời gian nghiên cứu: + Đề tài được tiến hành từ tháng 1/1/2019 đến tháng 30/5/2019. 3.2. Nội dung nghiên cứu 3.2.1. Điều tra một số đặc điểm cấu trúc rừng Thông nơi tiến hành thu mẫu 3.2.2. Phân lập các chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo. - Tiến hành thu mẫu. - Phân lập chủng vi nấm từ các mẫu đã thu thập được. 3.2.3. Tuyển chọn các chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo. - Xác định hoạt tính phân giải xenlulo của các chủng - Thí nghiệm các chủng rất mạnh với vật liệu cháy (trong bình thí nghiệm).
20 3.2.4. Mô tả đặc điểm một số chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo cao 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Điều tra một số đặc điểm cấu trúc rừng Thông nơi tiến hành thu mẫu Tại Đại Lải – Vĩnh Phúc tiến hành lập ô tiêu chuẩn (OTC) điển hình, hình chữ nhật có diện tích 500 m2 (25x20) cho 2 loài Thông chủ yếu có điện tích lớn (Thông mã vĩ, Thông nhựa) đại diện về cấp tuổi và thực bì mỗi loài thông lập 3 OTC (mỗi vị trí chân, sườn và đỉnh lập 1 OTC). Để xác định được khối lượng, thành phần và đặc điểm của vật liệu cháy theo từng độ tuổi loài cây. Tại Đại Lải – Vĩnh Phúc: 6 OTC/loài x 2 loài thông (Thông nhựa, Thông mã vĩ) x 1 độ tuổi trên 20 = 12 OTC. Trong mỗi OTC tiến hành thống kê tổng số cây, điều tra các chỉ tiêu bao gồm: - Đường kính 1,3m (D1.3) được đo bằng thước kẹp kính/thước dây - Chiều cao vút ngọn (Hvn) được đo bằng sào có khắc vạch đến dm - Độ tàn che được xác định bằng phương pháp cho điểm - Xác định thành phần cây bụi thảm tươi - Điều tra tầng cây cao, nghiên cứu một số chỉ tiêu cơ bản: Mật độ, chiều cao, đường kính thân cây, đường kính tán lá, độ tàn che ở các giai đoạn khác nhau. - Đối với tầng cây bụi, thảm tươi và cây tái sinh, xác định thành phần loài chủ yếu, chiều cao trung bình, độ che phủ . - Các đặc điểm vật liệu cháy được nghiên cứu bao gồm: Khối lượng, phân bố và thành phần theo 2 loại thảm tươi, thảm khô. 3.3.2 Phân lập các chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo 3.3.2.1 Phương phápthu mẫu - Phương pháp thu mẫu Tại địa điểm nghiên cứu đã khảo sát (Đại Lải – Vĩnh Phúc) tiến hành lập ô tiêu chuẩn (OTC) điển hình, hình chữ nhật có diện tích 500 m2
21 (25x20) trong mỗi OTC lập 5 ô dạng bản 1 m2 (1mx1m) 4 ô dạng bản ở 4 góc của OTC và 1 ở giữa để xác định khối lượng, thành phần và đặc điểm của vật liệu cháy. Sau đó mỗi ô dạng bản đặt đại diện 01 khung 1 m2 (1mx1m) có căng lưới để thu vật liệu rơi rụng có đường kính nhỏ hơn 1 cm ở các thời điểm khác nhau, 1 tháng thu số liệu 1 lần, thời gian theo dõi trong vòng 12 tháng cho 2 loài thông chủ yếu có điện tích lớn tại Việt Nam (Thông mã vĩ, Thông nhựa) ở độ tuổi (<10, và 10-20), mỗi loài thông lập 3 OTC (mỗi vị trí chân, sườn và đỉnh lập 1 OTC) để xác định được khối lượng, thành phần và đặc điểm của vật liệu cháy theo từng độ tuổi loài cây trong từng OTC. Thu thập các mẫu đất khác nhau tại các ô tiêu chuẩn khác nhau trên địa bàn Đại Lải - Vĩnh Phúc. Các mẫu được để riêng trong các túi khác nhau, mang về phòng thí nghiệm tiến hành phân lập. 3.3.1.2 Phương pháp phân lập các chủng nấm từ mẫu đất - Môi trường PDA để phân lập và nuôi cấy nấm phân hủy xenlulo: +200g khoai tây +20g D-glucose +1000ml nước +18g Agar Khoai tây rửa sạch để cả vỏ, cắt thành khúc có kích thước 1x1x1 cm, cho vào đun cùng 1000ml nước, đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nước trong, cho thêm nước để đủ 1000 ml. Sau đó cho D- Glucose,Agar vào khuấy tan, cho vào 6 bình tam giác loại 250ml nút bông và giấy bạc ở miệng bình, hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. Phương pháp cụ thể: Cân 10 g mẫu (đất/thảm mục), sau đó cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lý đã được khử trùng. Lắc trên máy lắc trong thời gian 30 phút, để lắng, ta được dung dịch mẫu pha loãng 10-1 lần. Dùng pipetman hút 1ml dịch huyền phù ở độ pha loãng 10-1 đưa vào ống
22 nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều ta dịch pha loãng 10-2 lần. Hút 1ml dịch huyền phù ở độ pha loãng 10-2 đưa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng, trộn đều ta dịch pha loãng 10-3 lần. Tiếp tục làm như trên cho đến khi nồng độ pha loãng đến 10-6 lần. Lấy 0,1 ml dịch ở các nồng độ 10-4 - 10-6 nhỏ và trang đều trên đĩa petri chứa môi trường PDA. Để trong tủ ấm ở nhiệt độ 280C trong 24 -48 giờ sao cho có thể thấy rõ các khuẩn lạc riêng biệt. Các khuẩn lạc có màu sắc, hình dạng khác nhau được tách riêng, làm thuần và giữ trong ống nghiệm. Theo dõi sự xuất hiện của các vi nấm đếm số lượng vi nấm có trong đĩa Petri. Dùng que cấy tách từng chủng vi nấm khác nhau ra các đĩa Petri có chứa môi trường PDA (mỗi đĩa một chủng vi nấm), mỗi chủng vi nấm cấy trên 2 đĩa thạch, ghi rõ ký hiệu. Bước đầu nhận diện các chủng vi nấm khác nhau dựa trên đặc điểm hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc. Theo dõi sự phát triển của vi nấm, đánh giá khả năng sinh trưởng, mô tả đặc điểm từng chủng vi nấm. Tiến hành cấy tách vi nấm sang hộp lồng mới để theo dõi - Khử trùng đầu que cấy vòng, làm nguội trong không khí khoảng 15s. Tay trái hé mở nắp hộp thạch, đặt đầu que cấy vào đoạn có nấm cắt 1 đoạn thạch nhỏ chứa nấm để cấy sang hộp lồng mới, tiến hành cấy trên 3 điểm ở hộp lồng mới để theo dõi. Đậy nắp hộp dùng băng dính quấn quanh hộp thạch mới, khử trùng que cấy trước khi cắm vào giá các thao tác phải nhanh tay và làm trên ngọn lửa đèn cồn đặt trong tủ cấy, đảm bảo khử trùng. Các nấm sau khi cấy xong phải ghi rõ tên chủng để tránh bị nhầm lẫn
23 Hình 3.1: Tủ đổ môi trường 3.3.3. Tuyển chọn các chủng vi nấm có khả năng phân hủy xenlulo 3.3.3.1 phương pháp xác định phân giải hoạt tính xenlulo của các chủng + Môi trường CMC đặc để xác định hoạt tính phân hủy xellulo 1g CMC; 18g Agar, nước luộc lá thông 1000 ml + Dung dịch nước muối sinh lý: 0,85g NaCl; Nước 1000 ml Phương pháp tuyển chọn bằng cách xác định hoạt tính CMC-aza (Williams, 1983) Sinh khối các chủng vi nấm vật sau khi nuôi cấy 48 giờ được li tâm, gạn bỏ phần cặn lắng và nhỏ 1ml vào các lỗ thạch đã được chuẩn bị sẵn trên các đĩa petri chứa môi trường CMC đặc. Giữ đĩa thạch trong tủ ấm 24 giờ, sau đó lấy ra và tráng bề mặt thạch bằng dung dịch lugol, cấy dịch vi khuẩn đã pha loãng trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng (1,5-2% thạch hay còn gọi là aga) nuôi dưỡng trong điều kiện thích hợp cho mọc các khuẩn lạc tách biệt nhau cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch nghiêng để thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết cân, đong chính
24 xác từng thành phần môi trườnghòa tan các chất vào nước, đun và khấy cho tan làm trong môi trường, kiểm tra thể tích và pH, rót môi trường vào dụng cụ (ống nghiệm, hộp petri, bình tam giác). Làm nút bông, bao gói bằng giấy hoặc báokhử trùng ở nồi hấp áp lực hơi nước (0,8- 1,0 atm/30 phút) tùy loại môi trường chế môi trường ra thạch đĩa (để nguội môi trường trong bình tam giác khoảng 40-50°C và đổ ra petri) và nghiêng thạch trong ống nghiệm. Tiến hành cấy các chủng nấm lên các đĩa petri (10mm) chứa môi trường này, tiến hành cấy trên 2 đĩa để quan sát. Hoạt tính sinh học được xác định bằng kích thước vòng phân hủy (vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch chính là hiệu số giữa đường kính vòng tròn trong suốt (D) và đường kính lỗ thạch (d). + Đánh giá khả năng phân hủy xenlulo của vi nấm Phương pháp đánh giá khả năng phân hủy xenlulo của vi nấm. Đánh giá khả năng phân hủy xenlulo của vi nấm bằng phương pháp nuôi cấy trên cùng đĩa Petri giữa các vi nấm đã được phân lập. Cấy vi nấm sau khi phân lập vào giữa đĩa thạch CMC. Hiệu lực được xác định dựa vào đường kính của vùng ức chế (D) được tính bằng mm. Dùng thước đo để xác định vòng phân giải của nấm. Căn cứ vào trị số D, xác định được khả năng phân hủy xenlulo của vi nấm. Chủng nào có trị số D càng lớn thì chủng đó càng có khả năng phân hủy xenlulo mạnh, và ngược lại trị số D càng nhỏ thì khả năng phân hủy xenlulo càng yếu. Khả năng phân hủy xenlulo của vi nấm được tính theo 5 cấp như sau: D> 70: Hiệu lực ức chế rất mạnh (Rm) 70 ≥ D> 50: Hiệu lực ức chế mạnh (M) 50 ≥ D> 20: Hiệu lực ức chế trung bình (Tb) 20 ≥ D> 10: Hiệu lực ức chế yếu (Y) D ≤ 1 Không có hiệu lực (O)
25 3.3.3.2 Thí nghiệm các chủng rất mạnh đối với vật liệu cháy (trong bình thí nghiệm) Từ một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy xenlulo tiếp tục thí nghiệm với vật liệu cháy trong phòng thí nghiệm sau đó nhân sinh khối riêng rẽ trên môi trường lỏng phù hợp để tiến hành thí nghiệm xác định khả năng giảm trọng lượng cơ chất xenlulo tự nhiên. Mỗi chủng xạ khuẩn được thí nghiệm với 3 bình được lặp lại 3 lần và 1 công thức đối chứng. Phương pháp tiến hành: - Bước 1: Vật liệu cháy cắt nhỏ và điều chỉnh độ ẩm đạt 50 -60%. Mẫu vật liệu sau khi sấy khô kiệt có độ ẩm coi như bằng không. Để tạo độ ẩm mong muốn phải thêm một lượng nước vào mẫu vật liệu đã khô kiệt. Lượng nước thêm vào được tính theo công thức sau: Mn = Wct.Pm/100 (trong đó: Mn - lượng nước cần thêm vào (g); Wct - độ ẩm tuyệt đối cần tạo (%); Pm- trọng lượng vật cháy đã sấy khô kiệt. Cân 5g vật liệu cháy cho vào bình tam giác 500ml. - Bước 2: bổ sung vào mỗi bình 10ml dịch nuôi cấy lắc vi sinh vật, bình đối chứng bổ sung nước cất. - Bước 3: Theo dõi bình ở điều kiện nhiệt độ phòng trong vòng 60 ngày. Sau đó rửa sạch, loại bỏ tạp chất hòa tan và sấy khô phần còn lại chưa phân hủy. Tỷ lệ giảm trọng lượng của mẫu thí nghiệm so với mẫu đối chứng được tính theo công thức: X% = (mo-mt)/mo.100 Trong đó: - X: là % độ giảm trọng lượng của mẫu thí nghiệm - mt trọng lượng khô còn lại của mẫu thí nghiệm - mo trọng lượng khô còn lại của mẫu đối chứng
26 Hình 3.2: Kính hiển vi và Tủ định ôn
27 PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Điều tra một số đặc điểm cấu trúc rừng Thông nơi tiến hành thu mẫu 4.1.1. Kết quả điều tra tầng cây cao Rừng Thông tại Đại Lải – Vĩnh Phúc đã được trồng từ khá lâu, theo điều tra thì 2 loài Thông được trồng phổ biến ở đây là Thông nhựa và Thông mã vĩ. Kết quả điều tra tầng cây cao được tổng hợp tại bảng 4.1: Bảng 4.1. Kết quả điều tra tầng cây cao rừng Thông khu vực Đại Lải, Vĩnh Phúc Đối tượng N Độ tàn TB TB TB TB nghiên (cây/ha) che(%) Hvn (m) HDC (m) D1.3(cm) DT (m) cứu Thông nhựa16 840 0,46 7,1 5,4 15,4 2,8 tuổi Thông mã vĩ 24 760 0,52 8.7 6.6 18,9 3 tuổi Thông nhựa đã trồng được 16 năm với mật độ cao 840 cây/ha, chiều cao vút ngọn đạt 7,1m, đường kính 1.3m đạt 15,5cm, đường kính tán đạt 2,8m; Thông mã vĩ trồng được 24 năm với mật độ thấp hơn 760 cây/ha, chiều cao vút ngọn đạt 8,7m, đường kính 1.3m đạt 18,9cm, đường kính tán đạt 3m Thổ nhưỡng và khí hậu ở đâu rất thuận lợi cho cây Thông sinh trưởng và phát triển nên các chỉ tiêu sinh trưởng của cây là tương đối tốt. 4.1.2. Kết quả nghiên cứu độ che phủ của tầng cây bụi, thảm tươi dưới tán rừng Thông tại khu vựcnghiên cứu. Bằng phương pháp quan sát giá và cho điểm về mức độ che phủ mặt đất của tầng cây bụi thảm tươi thấy rằng độ che phủ trung bình của tầng cây
28 bụi thảm tươi ở các rừng Thông khác nhau là không giống nhau. Kết quả độ che phủ của tầng cây bụi lớp thảm tươi dưới tán rừng Thông ở Đại Lải được thể hiện ở bảng 4.2. Bảng 4.2.Thành phần lớp cây bụi, thảm tươi khu vực Đại Lải Vĩnh Phúc Độ che phủ Đối tượng trung bình Loài cây chủ yếu nghiên cứu (%) Cây thông tái sinh, cây tế, cây guột, cây sim, cây mua, cây sầm, cây mẫu đơn Thông nhựa 80 rừng, cây sẻ ba, cây cỏ lào, cây ba xoi, 16 tuổi cây lấu, cây cách, cây hương bài, cây bọt ếch, cây thành ngạnh,cây thao kén. Cây thông tái sinh, cây tế, cây guột, cây sim, cây mua, cây sầm, cây mẫu đơn Thông mã vĩ 85 rừng, cây sẻ ba, cây cỏ lào, cây ba xoi, 24 tuổi cây lấu, cây cách, cây hương bài, cây bọt ếch, cây thành ngạnh,cây thao kén. Kết quả bảng 4.2 cho thấy thành phần sinh của lớp thực vật dưới tán rừng thông ở khu vực Đại Lải rất đa dạng và phong phú với nhiều loài thực vật đặc trưng dưới tán rừng Thông như: cây Thông tái sinh, cây tế, guột, sim, mua, sầm, mẫu đơn rừng 4.1.3. Thành phần vật liệu cháy dưới tán rừng Thông ở khu vực Vật liệu cháy dưới tán rừng Thông bao gồm thảm tươi và thảm khô. Thảm tươi bao gồm các loại cây bụi, cỏ còn tươi, cây tái sinh. Thảm khô gồm: Lớp cành khô lá rụng, cỏ khô. Kết quả về khối lượng vật liệu cháy được trình bày qua bảng 4.3:
29 Bảng 4.3. Thành phần và khối lượng vật liệu cháy dưới rừng Thông ở Đại Lải, Vĩnh Phúc Thành Độ dày Khối lượng Đối tượng Ghi Stt phần vật trung bình trung bình nghiên cứu chú liệu cháy (cm) (tấn/ha) Tổng 9,2 22 1 Thông nhựa Thảm mục 2.4 7.1 16 tuổi Thảm khô 6.8 14.9 Tổng 9,8 28,1 2 Thông mã vĩ Thảm mục 2.7 10.7 24 tuổi Thảm khô 7.1 17.4 Qua số liệu bảng 4.3 cho thấy khối lượng vật liệu cháy (VLC) ở các địa điểm khác nhau là khác nhau, VLC ở rừng Thông nhựa 16 tuổi có độ dày trung bình là 9,2cm với khối lượng trung bình là 22 tấn/ha, rừng Thông mã vĩ 24 tuổi VLC có độ dày trung bình là 9,8cm với khối lượng trung bình là 28,1 tấn/ha. Hình 4.1. Vật liệu cháy trong rừng Thông tại Đại Lải
30 4.2. Phân lập các chủng vi nấm từ mẫu đất 4.2.1. Kết quảthu thập mẫu Kết quả thu thập mẫu đất thu thập tại các OTC trong rừng Thông ở Đại Lải được tổng hợp tại bảng 4.4: Bảng 4.4: Các mẫu đất được thu thập tại các OTC ở Đại Lải STT Kí hiệu mẫu Đất rừng OTC 1 DL1 OTC1 2 DL2 3 DL3 Thông nhựa OTC2 4 DL4 5 DL5 OTC3 6 DL6 7 DL7 OTC4 8 DL8 9 DL9 Thông mã vĩ OTC5 10 DL10 11 DL11 OTC6 12 DL12 13 DL13 OTC7 14 DL14 15 DL15 Thông nhựa OTC8 16 DL16 17 DL17 OTC9 18 DL18 19 DL19 OTC10 20 DL20 21 DL21 Thông mã vĩ OTC11 22 DL22 23 DL23 OTC12 24 DL24 Trên mỗi OTC, tiến hành lấy 2 mẫu đất tại các vị trí khác nhau ở chiều sâu 30 cm. Với 12 OTC, thu được 24 mẫu đất tiến hành phân lập tuyển chọn vi nấm phân giải xenlulo.
31 4.2.2 Phân lập chủng nấm từ các mẫu đất thu được Kết quả phân lập chủng nấm từ các mẫu đất thu được tại rừng Thông Đại Lải được tổng hợp tại bảng 4.5: Bảng 4.5: Số chủng nấm phân lập được từ các mẫu đất STT Ký hiệu chủng Ô TIÊU CHUẨN 1 LSN 3.2 DL1 2 LSN 3.3 DL1 3 LSN 3.5 DL1 4 LSN13.1 DL2 5 LSN12.5 DL2 6 SSN 9 DL3 7 LSN 7.1 DL7 8 LSN 7.3 DL7 9 LSN 6.2 DL6 10 LSN 6.1 DL6 11 LSN 8.2 DL10 12 THN 4.1 DL11 13 THN 5.1 DL 11 14 HN 18 DL9 15 SSN 5.1 DL8 16 HBN 2.2 DL12 17 HBN 1.2 DL12 18 HBN 1.4 DL12 19 LSN 13.5 DL14 20 HBN 1.3 DL18 21 HBN 2.2 DL20 22 IPN 3 DL 21 23 LSN 9.4 DL22
32 Với 24 mẫu đất thu thập được trên 12 OTC khu vực nghiên cứu, tiến hành phân lập được 23 mẫu Vi nấm. Từ bảng số liệu 4.2 cho thấy với mỗi mấu đất thu được ở địa điểm OTC khác nhau, số lượng vi nấm phân lập được cũng khác nhau. Với 2 mẫu đất DL1 và DL12 tiến hành phân lập đều thu 3 chủng Vi nấm điển hình, khác nhau. Một số mẫu đất khi tiến hành phân lập chỉ thu được các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn. Mẫu đất DL2, DL6, DL7, DL11 cũng thu được 2 chủng vi nấm. LSN 12.5 SSN9 IPN3 LSN 13.1 SSN 5.1 LSN 3.5 Hình 4.2: Một số chủng vi nấm phân lập được tại khu vực nghiên cứu Các chủng vi nấm sẽ được nuôi cấy, làm thuần. Quan sát đặc điểm hình thái của các chủng Vi nấm.
33 Bảng 4.6. Đặc điểm hình thái một số chủng Vi nấm phân lập được STT Ký hiệu chủng Cây chủ Đặc điểm Nấm màu trắng, phát triển nhanh, 1 HN 18 Thông mã vĩ hình thành các bông. 2 LSN 8.2 Thông mã vĩ Nấm sợi màu xanh đen. Nấm sợi viền trắng, sau một thời 3 LSN 3.2 Thông nhựa gian chuyển hồng. Nấm trắng, phát triển nhanh, sợi 4 LSN 13.5 Thông nhựa bông xen kẽ 5 HBN 2.2 Thông mã vĩ Nấm sợi màu nâu nhạt. Nấm sợi màu xám nhạt, vòng 6 IPN 3 Thông mã vĩ phóng xạ. Nấm có màu trắng xám, nấm mọc 7 SSN9 Thông nhựa phát triển thưa đều ra hai bên. Màu xám mịn, viền ngoài màu 8 SSN 5.1 Thông mã vĩ vàng cam nấm mọc không theo một chiều cụ thể. Nấm màu trắng bông, xù nhẹ, nấm 9 LSN 3.5 Thông nhựa mọc nhanh, các sợi lan đều ra các bên. Nấm mọc phân tán, màu hồng nhạt, 10 THN 3.1 Thông mã vĩ phóng xạ. Kết quả bảng 4.6 cho thấy các chủng nấm được phân lập khá phong phú với các loại đặc điểm, màu sắc khác nhau như xanh, vàng, xám, đen, vòng phóng xạ . Đây là cơ sở để ta tiếp tục tuyển chọn những chủng nấm có khả năng phân giải xenlulo.
34 4.3. Kết quả tuyển chọn chủng vi nấm có khả năng phân giải xenlulo Sau khi tiến hành phân lập được 21 chủng vi nấm từ khu vực nghiên cứu, tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng phân giải môi trường CMC, trên cơ sở đó đánh giá khả năng phân giải xenlulo của các chủng Vi nấm. 4.3.1 Kết quả xác định hoạt tính phân giải xenlulo của các chủng nấm Kết quả xác định hoạt tính phân giải xenlulo của các chủng nấm được tổng hợp tại bảng 4.7: Bảng 4.7: Mức độ phân giải xenlulo của các chủng nấm Đường kính vòng phân giải tính Ký hiệu STT theo thời gian (mm) Đánh giá chủng 4 ngày 8 ngày 12 ngày 1 LSN 3.2 26.5 44 65 ++++ 2 LSN 3.3 14 21.5 34 ++ 3 LSN 3.5 28 35 45.5 +++ 4 LSN13.1 0 0 0 - 5 LSN12.5 0 0 0 - 6 SSN 9 18.5 28 40 +++ 7 LSN 7.1 11.5 14.5 18.5 ++ 8 LSN 7.3 0,9 6,5 9,5 + 9 LSN 6.2 0 0 0 - 10 LSN 6.1 31.5 40.5 54 +++ 11 LSN 8.2 39 48.5 62.5 ++++ 12 THN 5.1 9.5 19 31 ++ 13 THN 4.1 30.5 43,5 65 ++++ 14 HN 18 34 55.5 62 ++++ 15 SSN 5.1 0 0 0 - 16 HBN 2.2 10.5 15 16 ++ 17 HBN 1.2 10 12 14.5 ++ 18 HBN 1.4 18 25 35 +++ 19 LSN 13.5 11 17.5 26 ++ 20 HBN 1.3 15 25.5 36 +++ 21 HBN 2.2 41.5 52.5 60 ++++ 22 IPN 3 16 18 19 ++ 23 LSN 9.4 0 0 0 -
35 Chú thích: - Không có khả năng phân giải xenlulo + Phân giải xenlulo yếu ++ Phân giải xenlulo trung binh +++ Phân giải xenluo mạnh ++++ Phân giải xenlulo rất mạnh Qua bảng số liệu 4.7 nhận thấy với 23 chủng Vi nấm thí nghiệm có 18 chủng Vi nấm có khả năng phân giải môi trường CMC. Có 5 chủng Vi nấm phân giải môi trường CMC rất mạnh là: LSN 3.2;LSN 8.2; THN 4.1; HBN 2.2; HN 18 đều có đường kính vòng phân giải CMC trên 60 mm. Có 5 chủng Vi nấm phân giải mạnh môi trường CMC với đường kính vòng phân giải lớn hơn 35 mm là:LSN 3.5; SSN 9; LSN 6.1; HBN 1.4; HBN 1.3. Có 7 chủng Vi nấm có khả năng phân giải CMC trung bình là: LSN 3.3; LSN 7.1; THN 5.1; HBN 2.1; HBN 1.2; LSN 13.5; IPN 3. Có 1 chủng Vi nấm phân giải CMC yếu là: LSN 7.3. Có 5 chủng Vi nấm không phân giải môi trường CMC là: LSN 13.1; LSN 12.5; LSN 6.2; SSN5.1; LSN9.4. Phân giải rất mạnh Phân giải mạnh Phân giải trung bình Phân giải yêu Không phân giải Hình 4.3: Tỷ lệ các Vi nấm phân giải môi trường CMC.
36 Từ kết quả trên ta thấy trên cùng mẫu đất và môi trường nhưng khả năng phân giải môi trường CMC của các chủng nấm là khác nhau không đồng nhất, có chủng có khả năng phân giải rất mạnh nhưng cũng có chủng phân giải yếu, dưới đây là biểu đồ minh họa chung cho khả năng phân giải xenlulo của các chủng nấm đã được phân lập. (mm) 70 60 50 40 4 ngày 30 8 ngày 20 12 ngày 10 0 (mm) IPN3 SSN9 HN18 LSN3.2 LSN3.3 LSN3.5 LSN7.1 LSN7.3 LSN6.2 LSN6.1 LSN8.2 LSN9.4 SSN5.1 THN5.1 LSN13.1 LSN12.5 HBN 2.2 HBN 1.2 HBN 1.4 HBN 1.3 HBN 2.2 THN 4.1 LSN 13.5 Hình 4.4: Khả năng phân giải môi trường CMC của các chủng Vi nấm LSN 3.2 LSN 8.2 HN18 THN 3.1 HBN 2.2 Hình 4.5: Một số chủng Nấm phân giải mạnh CMC
37 Phân giải rất mạnh Phân giải rất mạnh Phân giải mạnh Phân giải trung bình Phân giải yếu Không phân giải Hình 4.6: Khả năng phân giải môi trường CMC của 1 số chủng Vi nấm. 4.3.2. Kết quả thí nghiệm đối với vật liệu cháy Sau khi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng phân giải môi trường CMC, đã tuyển chọn được 5 chủng Vi nấm có khả năng phân giải môi trường mạnh nhất: LSN 3.2; LSN 8.2; THN 4.1; HBN 2.2; HN 18. Sử dụng 5 chủng Vi nấm tiến hành thí nghiệm chậu vại, đánh giá khả năng phân giải xenlulo trong chậu vại. Kết quả độ giảm khối lượng VLC sau khi tiến hành thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.8: Bảng 4.8. Kết quả độ giảm khối lượng VLC Chủng Vi M M X (%) nấm o LSN 3.2 10.000 8.170 18.3 LSN 8.2 10.000 8.350 16.5 HN 18 10.000 7.500 25 THN 3.1 10.000 9.000 10 HBN 2.2 10.000 7.800 22
38 Kết quả bảng 4.8 cho thấy các chủng Vi nấm khác nhau cho kết quả giảm khối lượng vật liệu cháy là khác nhau, trong đó chủng HN 18cho kết quả giảm nhiều khối lượng VLC nhất là 25%, tiếp theo là chủng HBN 2.2giảm 22% khối lượng VLC,thấp nhất là chủng giảm 16,5% khối lượng VLC. Hình 4.7: Chủng Vi nấm SSN 9 Hình 4.8: Chủng Vi nấm HN18
39 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau khi hoàn thành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn vi nấm phân hủy xenlulo dưới tán rừng Thông tại Đại Lải Vĩnh Phúc” tôi có một số kết luận như sau: Đại Lải – Vĩnh Phúc có điều kiện thổ nhưỡng và khí hậu ở đâu rất thuận lợi cho cây Thông sinh trưởng và phát triển nên các chỉ tiêu sinh trưởng của cây là tương đối tốt. Thành phần sinh của lớp thực vật dưới tán rừng Thông ở khu vực Đại Lải rất đa dạng và phong phú với nhiều loài thực vật đặc trưng dưới tán rừng Thông như: cây Thông tái sinh, tế, guột, sim, mua, sầm, mẫu đơn rừng có mức độ che phủ cao từ 80-85%. Khối lượng VLC ở rừng Thông Đại Lải là tương đối lớn, VLC ở rừng Thông nhựa 16 tuổi có độ dày trung bình là 9,2cm với khối lượng trung bình là 22 tấn/ha, rừng Thông mã vĩ 24 tuổi VLC có độ dày trung bình là 9,8cm với khối lượng trung bình là 28,1 tấn/ha. Kết quả phân lập: với 24 mẫu đất thu thập được trên 12 OTC khu vực nghiên cứu, tiến hành phân lập được 23 mẫu Vi nấm, các chủng nấm được phân lập khá phong phú với các loại đặc điểm, màu sắc khác nhau như xanh, vàng, xám, đen, vòng phóng xạ . Trong số 23 chủng Vi nấm thí nghiệm có 18 chủng Vi nấm có khả năng phân giải môi trường CMC: Có 5 chủng Vi nấm phân giải môi trường CMC rất mạnh là: LSN 3.2; LSN 8.2; THN 4.1; HBN 2.2; HN 18 đều có đường kính vòng phân giải CMC trên 60 mm. Có 5 chủng Vi nấm phân giải mạnh môi trường CMC với đường kính vòng phân giải lớn hơn 35 mm là:LSN 3.5; SSN 9; LSN 6.1; HBN 1.4; HBN 1.3.
40 Có 7 chủng Vi nấm có khả năng phân giải CMC trung bình là: LSN 3.3; LSN 7.1; THN 5.1; HBN 2.1; HBN 1.2; LSN 13.5; IPN 3. Có 1 chủng Vi nấm phân giải CMC yếu là: LSN 7.3. Có 5 chủng Vi nấm không phân giải môi trường CMC là: LSN 13.1; LSN 12.5; LSN 6.2; SSN5.1; LSN9.4. Các chủng Vi nấm khác nhau cho kết quả giảm khối lượng vật liệu cháy là khác nhau, trong đó chủng HN 18 cho kết quả giảm nhiều khối lượng VLC nhất là 25%, thấp nhất là chủng giảm 16,5% khối lượng VLC 5.2. Kiến nghị Cần thực hiện nghiên cứu ở nhiều địa điểm khác nhau để kiểm tra xem vị trí địa lý có ảnh hưởng đến kết quả phân lập nấm hay không Tiến hành nghiên cứu vào các mùa khác nhau trong năm để xác định các chủng nấm khác nhau ở các thời điểm trong năm Những kết quả nghiên cứu của đề tài bước đầu cho thấy tiềm năng phân giải xenlulo của các chủng nấm đối với vật liệu cháy là rất khả thi. Cần tiếp tục nghiên cứu nhiều lần để tạo ra các chế phẩm sinh vật phân giải xenlulo ứng dụng trong công tác phòng cháy chữa cháy rừng
41 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn quyết định số 4110 QĐ/BNN- KHCN ngày 31 tháng 12 năm 2007 về việc quy phạm phòng cháy, chữa cháy rừng thông. 2. Đặng Minh Hằng,(1999), Nghiên cứu một số giải pháp kỹ thuật lâm sinh làm cơ sở đề xuất biện pháp nâng cao sản lượng rừng tràm (Melaleuca cajuputi powell) trên vùng Tứ giác Long Xuyên, Luận án PTS Khoa học Nông Nghiệp, Hà Nội. 3. Hoàng Quốc Khánh và cộng sự 2003 (Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Đại học Thái Nguyên Viện Công Nghệ sinh học) Tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp xenlulose của chủng penicilium SP DTQ-HK1. 4. Lưu Hồng Mẫn (2010), Ứng dụng chế phẩm sinh học để sản xuất phân rơm rạ hữu cơ tại chỗ và cải thiện độ phì của đất canh tác lúa, Hội thảo, Ứng dụng các biện pháp sinh học trong lĩnh vực trồng trọt theo hướng phát triển nông nghiệp bền vững, An Giang. 5. Lưu Hồng Mẫn, Vũ Tiến Khang, Nguyễn Ngọc Hà (2006), “Ứng dụng chế phẩm sinh học để sản xuất phân hữu cơ vi sinh Phục vụ thâm canh lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long”. Tạp chí Nông nghiệp & PTNT số 84 kỳ 2 tháng 5 năm 2006. 6. Nguyễn Thị Thúy Nga và cộng sự (2015). “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn phân giải xenlulo sản xuất phân hữu cơ sinh học”. Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam số 3/2015. 7. Nguyễn Thị Thúy Nga (2010). “Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật có khả năng phân giải xenlulo hiệu lực cao, phù hợp với điều kiện đất bạc màu và đặc điểm sinh học của chúng để sản xuất phân vi sinh cho cây lâm
42 nghiệp”. Tạp chí khoa học lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam số 4/2010. 8. Trần Thị Ngọc Sơn, Lưu Hồng Mẫn, Vũ Tiến Khang, Nguyễn Ngọc Hà, Nguyễn Thị Ngọc Hân, Trần Thị Anh Thư và Nguyễn Ngọc Nam (2010), Đánh giá hiệu quả xử lý rơm rạ của nấm Trichoderma sp bản địa ở Đồng bằng Sông Cửu Long. 9. Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007 “Nghiên cứu phân lập tuyển chọn một số chủng VSV có khả năng phân hủy xenluose từ rong giấy tại Hòn Chồng- Nha Trang” TÀI LIỆU TIẾNG ANH 10. Bashir Ahmad, Sahar Nigar, S. Sadaf Ali Shah, Shumaila Bashir, Javid Ali, Saeeda Yousaf an Javid Abbas Bangash (2013), “Isolation and Identification of Xenlulo Degrading Bacteria from Municipal Waste and their Scereening for potenital Antimicrobitial Activity”, World applied sciences Journal 27 (11): 1420-1426, 2013 11. Herikasson., 1999. “Plot designs for the analysis of species interactions in mixed stands, Common. For. Rev. 74, 322–332.Volume 2, Issue 8 January 2014: 458 12. Isaber, Kalpana Samant, and Avinash Sahu (2012), “Isolation of Cellulose-Degrading Bacteria and Determination of Their Cellulolytic Potential”, Hindawi Publishing Corporation International Journal of Microbiology Volume 2012, Article ID 578925, 5 pages Yugal Kishore. 13. Lamot E.L and Voets J.P. (1978), “Microbial bio - degradation of cellophane”, Zeitschrift fur allgemeine.18, pp.183-188. 14. Macarron, (1993), “Microbial bio - degradation of cellophane”, Zeitschrift fur allgemeine.18, pp.183-188. 15. Maheshwari DK, Gohade S and Jahan H (1990), “Production of Cellulase by a new isolate of Trichoderma pseudokoningii”,J. Indian Bot. Soc.,
43 69:63-66. 16. Makeshkumar.,PU Mahasimgam(2011), "Growth and cellulase production by Trichoderma", In Symposium on Enzymatic Hydrolysis of Cellulose, ed. Bailey M., Enari T. & Linko M, pp. 81-110, Finland Technical Research Centre. 17. Mazadza (2000), “Evaluation of cellulose degrading efficiency of some fungi and bacteria and their biofilms”. J.Natn.Sci.Foundation Sri Lanka 2013 41(2):155-163. 18. Ogaw, (1991), “Awful Splendour – A History of Fire in Canada”, University of British Columbia Press, Vancouver, BC. 19. Reddy.BR., Narashimha G., Babu GVAK.(1998), “Cellulase Production Potentials of the Microbial Profle of Some Sugarcane Bagasse Dumping Sites in Ilorin”, Nigeria Print ISSN 2067-3205; Electronic 2067-3264, Not Sci Biol, 2013, 5(4):445-449. 20. Sivakumaran Sivaramanan (2014), “Isolation of Cellulolytic Fungi and their Degradation on". 21. Wilick,Segili(1985), “Bush fie in Australia”, Canberra, pp.142-359 22. Wen-Jing Lu, Hong-Tao Wang, Shi-Jian Yang, Zhi-Chao Wang, Yong- Feng Nie (2005), “Isolation and characterization of mesophilic cullulose- degrading bacteria from flower stalks-vegetable waste co-composting system”, Journal of General and Applied Microbiology. 51, pp. 353-360
PHỤ LỤC HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH LÀM THÍ NGHIỆM