Khóa luận Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 và bắc thơm số 7

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 và bắc thơm số 7

1. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HOA Tên đề tài: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO GIỐNG LÚA J02 VÀ BẮC THƠM SỐ 7 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K48 CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2016 - 2020 Người hướng dẫn : 1. TS. Bùi Tri Thức 2. TS. Nguyễn Tiến Dũng THÁI NGUYÊN – NĂM 2020
2. i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tậptốt nghiệp em đã thực hiện đềtài: “Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 và BắcThơm số 7”. Trước hết em xin gửi tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa lời chúc sức khỏe và lời cảm ơn sâu sắc, với sự chỉ bảo, quan tâm và đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS. Bùi Tri Thức, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã chỉ bảo, quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn em hoàn thành tốt trong quá trình thực hiện đề tài. Đồng thời, em xin cảm ơn thầy giáo TS. Nguyễn Tiến Dũng, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã hướng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn làchỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ và đồng hành với tôi trong suốt thời gian qua. Trong quá trình thực tập, cũng như làm báo cáo thực tập với điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế không thể tránh được những sai sót. Em rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn để em có điều kiện bổ sung, nâng cao ý thức của mình để đề tài được hoàn thiện hơn và phục vụ tốt hơn công tác thực tế sau này. Sau cùng, em xin kính chúc quý thầy, cô trong nhà trường, trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nhệ Thực phẩm dồi dào sức khỏe, tiếp tục sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ sau. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng .năm 2020 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Hoa
3. ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii Phần 1. MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu của đề tài 2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 3 1.3 Ý nghĩa khoa học 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Giới thiệu về cây lúa 4 2.1.1 Vai trò của lúa gạo 4 2.1.2 Giá trị kinh tế và chất lượng dinh dưỡng của cây lúa 5 2.1.3 Cây trồng biến đổi gen 7 2.1.4 Các phương pháp - kỹ thuật biến đổi gen (chuyển gen) cây trồng 8 2.1.5 Chỉ thị chọn lọc trong chuyển gen vào thực vật 13 2.2 Tổng quan tình hình trong nước và trên thế giới 14 2.2.1 Tình hình trong nước 14 2.2.2 Tình hình thế giới 18 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 23 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu 24
4. iii 3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 24 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chủng vi khuẩn Agrobacterium 25 3.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen 26 3.3.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy 26 3.3.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc 27 3.3.6. Phương pháp nhuộm GUS 28 3.3.7. Hoàn thiện quy trình chuyển gen 28 3.4 Các phương pháp xử lý số liệu 28 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chủng khuẩn Agrobacterium 29 4.1.1 Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa JO2 29 4.1.2 Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa Bắc Thơm 30 4.2. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen 31 4.2.1 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa JO2 31 4.2.2 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa Bắc thơm 7 32 4.3. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy hiệu quả chuyển gen 33 4.3.1. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của giống J02 33 4.3.2. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của giống Bắc Thơm số 7 34 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen 35
5. iv 4.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen của giống lúa J02 35 4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen đến giống lúa Bắc Thơm số 7. 36 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 5.1 Kết luận 38 5.2. Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHẦN PHỤ LỤC
6. v DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ viết tắt (cả tiếng Anh và tiếng Việt) CRISPER/Cas Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat GMO Genetically Modified Organisms NST Nhiễm sắc thể CT Công thức GM Genetically Modified 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
7. vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 23 Bảng 4.1. Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống J02. 29 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa Bắc thơm 7 30 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa JO2 31 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống Bắc Thơm số 7. 32 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của thời gian đồng lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen của giống lúa J02 33 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời gian đồng lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen của giống lúa Bắc Thơm số 7 34 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen của giống lúa J02 35 Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen đến giống lúa Bắc Thơm số 7. 36
8. vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật (tumour inducing plasmid- Ti plasmid), plasmid này chứa các gen vir và vùng gene cần chuyển (T-DNA). Gen quan tâm được chèn vào vùng T-DNA. Các tế bào tổn thương thực vật tiết ra hợp chất bảo vệ, hợp chất này kích thích sự biểu hiện gen vir ở Agrobacterium. Vir protein tạo ra T-strand và một số protein vir chuyển vaoftees bào thực vật qua kênh vận chuyển. Trong tế bào thực vật, các protein vir tương tác với T-trand tạo ra phức hệ (T-complex). Phức hệ này vào nhân tế bào thực vật, T-DNA chèn vào bộ gen thực vật và biểu hiện gen quan tâm. 12 Hình 2.2: Sản lượng lúa gạo của Việt Nam từ năm 2013-2018 15 Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chuyển gen ở lúa [6] 24
9. 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Để đáp ứng nhu cầu lương thực ngày càng tăng và hạn chế các tác nhân làm giảm năng suất và chất lượng lúa gạo, hiện nay xu hướng sử dụng các giống lúa biến đổi gen đang được các nhà nghiên cứu khoa học đặc biệt quan tâm. Một số các nhà nghiên cứu cũng đã thành công trong tạo giống lúa biến đổi gen như: Daisuke Tokuhara và cộng sự đã tạo ra giống lúa chuyển gen MucoRice-ARP1có khả năng cung cấp kháng thể chống Rotavirus [7]; nhóm nghiên cứu tại Viện Di truyền Nông nghiệp đã chuyển gen thành công vào giống lúa IR64 [13]; Phan Tố Phượng và cộng sự đã thành công trong việc chuyển gen Xa21 kháng bệnh bạc lá vào cây lúa thông qua A.tumerfaciens [17]. Trên thực tế hiệu quả chuyển gen ở lúa còn gặp nhiều hạn chế: tỷ lệ tạo mô sẹo, tỷ lệ nhân nhanh và hiệu quả tái sinh còn thấp, còn phụ thuộc khả năng xâm nhiễm của A.tumerfaciens dẫn tới hiệu quả biến nạp gen còn thấp (chỉ khoảng 11%). Ngoài ra, các nghiên cứu tạo giống truyền thống chủ yếu dựa trên các phương pháp lai tạo, chọn giống truyền thống nên hiệu quả đạt được không thực sự cao. Hơn thế nữa, giống lúa Việt Nam còn có những hạn chế như: chịu hạn kém, hạt ngắn đem lại năng suất và chất lượng kém. Sử dụng một số phương pháp tạo giống mới như: Chỉnh sửa vector, dùng chỉ thị phân tử, gây đột biến, lai tạo chọn giống truyền thống, còn tồn đọng một số hạn chế nhất định. Một số ứng dụng mới trong chọn giống cây trồng nhờ dùng chỉ thị phân tử, gây đột biến tuy đã đạt được một số kết quả nhất định nhưng vẫn có những hạn chế. Thách thức đặt ra không riêng gì Việt Nam mà là vấn đề chung của các quốc gia trên toàn thế giới, đặc biệt là các nước nông nghiệp là phải tạo ra nguồn lương thực lớn mà chỉ sản xuất và canh tác trên một diện tích không thay đổi và có nguy cơ bị thu hẹp. Phương pháp chuyển gen ra đời được ví như “chìa khóa đa năng” để mở những nút thắt vốn gây rất nhiều khó khăn cho các nhà chọn tạo giống truyền thống nhằm
10. 2 tạo ra một giống cây trồng “hoàn hảo” hơn khi chúng được kết hợp với nhau. Với hướng nghiên cứu này, các gen quy định những tính trạng quan tâm được chủ động chuyển vào lúa, từ đó tạo ra các giống lúa mang các đặc tính như mong muốn của con người. Vì vậy phương pháp chuẩn gen bằng vi khuẩn Agrobacterium bằng nuôi cấy phôi non biến nạp gen vào lúa đang được nghiên cứu giải pháp mới trong chọn tạo các giống lúa. Giải pháp sử dụng các kĩ thuật chuyển gen để cải tạo giống lúa mới có chứa hàm lượng các vi chất dinh dưỡng cao hơn, hạt dài hơn, năng suất và hiệu quả cao. Hơn thế nữa, quy trình chuyển gen vào giống lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium có những ưu điểm như: gen ít bị đào thải; số lượng bản sao ít hơn do đó tránh được hiện tượng ức chế lẫn nhau; tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do sự phụ thuộc chặt chẽ vào hệ thống protein Vir, còn ở những phương pháp khác gen mục tiêu được tái tổ hợp chuyên biệt nhờ hai trình tự IS hai đầu nhưng dễ dàng bị tách ra ngay sau đó. Tuy nhiên vẫn còn một số những hạn chế như: có phổ tấn công giới hạn; gây khối u cho cây hai lá mầm ( do cây một lá mầm là cây thuộc nhóm tiến hóa nhất, nó tích lũy nhiều cơ chế kháng bệnh hơn cây hai lá ầm m như khi bị thương các tế bào có xu hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiếp hợp chất phenol như cây hai lá ầm m ) [10]. Do vậy, tôi tiếp tục nghiên cứu về quy trình chuyển gen vào giống lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium. Với mục tiêu góp phần trong nghiên cứu tạo giống lúa có kích thước hạt dài, đáp ứng nhu cầu thị trường gạo thế giới, tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7”. 1.2 Mục tiêu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
11. 3 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Xác định ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen - Nghiên cứu ảnh hưởng của chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen. - Xây dựng quy trình chuyển gene tối ưu cho giống lúa Việt Nam. 1.3 Ý nghĩa khoa học - Xây dựng và hoàn thiện được quy trình nghiên cứu chuyển gen của hai giống lúa Việt Nam là J02 và Bắc Thơm số 7. - Giúp sinh viên tiếp cận với nghiên cứu khoa học, ứng dụng lý thuyết vào thực tiễn, nâng cao năng lực nghiên cứu và kỹ năng thực hành trong phòng thí nghiệm - Giúp sinh viên tiếp cận với nghiên cứu khoa học, ứng dụng lý thuyết vào thực tiễn, nâng cao năng lực nghiên cứu và kỹ năng thực hành trong phòng thí nghiệm. - Đề tài hoàn thiện quy trình chuyển gene trên hai giống lúa J02 và Bắc thơm số 7 góp phần tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về chuyển gene vào giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7 Việt Nam, phục vụ công tác cải tạo năng xuất, chất lượng giống lúa Việt Nam.
12. 4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây lúa 2.1.1 Vai trò của lúa gạo Lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu nuôi sống hàng tỷ người trên thế giới. Sản lượng lúa gia tăng trong thời gian qua đã mang lại sự an sinh cho con nguời, đặc biệt đối với dân nghèo: gạo là nguồn cung cấp thức ăn chủ yếu. Các nước nghèo thường dùng gạo là nguồn lương thực chính, khi thu nhập tăng lên mức tiêu thụ gạo có xu hướng giảm xuống, thay thế bằng các loại thức ăn cung cấp nhiều protein và vitamin hơn là năng lượng. Bangladesh và Thái Lan có mức tiêu thụ gạo cao nhất vào những năm 1960 (tương đương 180 kg/người/năm), đến năm 1988 giảm xuống còn khoảng 150 kg. Ở Việt Nam hiện nay mức tiêu thụ gạo bình quân vẫn còn ở mức cao, khoảng 120 kg/người/năm. Tuy nhiên có thể nói, trên khắp thế giới, ở đâu cũng có dùng ếđ n lúa gạo hoặc các sản phẩm từ lúa gạo. Khoảng 40% dân số trên thế giới lấy lúa gạo làm nguồn lương thực chính. Trên thế giới có hơn 110 quốc gia có sản xuất và tiêu thụ gạo với các mức độ khác nhau. Lượng lúa được sản xuất ra và mức tiêu thụ gạo cao tập trung ở khu vực Châu Á. Năm 1980, chỉ riêng ở Châu Á đã có hơn 1,5 tỷ dân sống nhờ lúa gạo, chiếm trên 2/3 dân số Châu Á. Con số này theo ước đoán đã tăng lên gần gấp đôi [6]. Như vậy bên cạnh sự thu hút về nguồn lực con người thì sự thu hút nguồn lực đất đai cũng lại khẳng định rõ vị trí của lúa gạo trong nền kinh tế quốc dân. Trong những năm gần đây, Việt Nam có tổng sản lượng lúa hàng năm đứng thứ 5 trên thế giới, nhưng lại là nước xuất khẩu gạo đứng hàng thứ 2 thế giới hiện nay với sản lượng gạo xuất khẩu bình quân trên dưới 4 triệu tấn/năm. Thái Lan luôn là nước xuất khẩu gạo dẫn đầu thế giới, hơn hẳn Việt Nam (thứ 2) cả về số lượng và giá trị, do có thị trường truyền thống rộng hơn và chất lượng gạo cao hơn. Mỹ, Ấn Độ, Pakistan cũng là những nước xuất khẩu gạo quan trọng, sau Việt Nam.
13. 5 2.1.2 Giá trị kinh tế và chất lượng dinh dưỡng của cây lúa Giá trị kinh tế Trên thế giới cơ cấu sản xuất lương thực, lúa gạo chiếm 26,5%. Sản lượng lúa đã vượt lên đứng thứ nhất trong các cây lương thực với tổng sản lượng là 650 triệu tấn/năm. Mặc dù diện tích trồng lúa gạo đứng sau lúa mì nhưng sản lượng lúa năm 1993 đã đứng vị trí thứ nhất với tổng sản lượng là 573 triệu tấn/năm. Đặc biệt trong những năm gần đây với sự phát triển của khoa học kỹ thuật trong công tác chọn tạo giống và canh tác, phân bón thì năng xuất và chất lượng lúa gạo không ngừng tăng lên [7]. Trên thế giới khoảng 40% dân số coi lúa gạo là cây lương thực chính, tới 25% dân số sử dụng lúa gạo trên 1/3 khẩu phần ăn hàng ngày. Ở Việt Nam 100% dân số sử dụng gạo làm lương thực chính. Trong lúa gạo chứa đầy đủ các thành phần dinh dưỡng như tinh bột (62,5%), protein (7-10%), lipit (1-3%), xenlulo (10,9%), nước 11% [22]. Ngoài ra gạo còn chứa một số chất khoáng và vitamin nhóm B, các axit amin thiết yếu như: lizin, triptophan, threonin chất lượng gạo thay đổi theo thành phần axit amin, điều này phụ thuộc vào từng giống. Do thành phần các chất dinh dưỡng tương đối ổn định và cân ốđ i nên lúa gạo đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Chất lượng dinh dưỡng của lúa Theo Yoshida (1981) [12], tinh bột là thành phần chủ yếu chiếm trên 80% trong hạt gạo, nó được hình thành từ hai đại phân tử là amylose và amylopectin. Hàm lượng amylose có thể được coi là tính trạng quan trọng nhất trong phẩm chất cơm vì nó có tính chất quyết định tới việc cơm dẻo, mềm hay cứng. Hàm lượng amylose càng thấp thì cơm càngề m m. Hàm lượng tinh bột trong hạt gạo thường có mối tương quan nghịch với hàm lượng đạm. Nếu hàm lượng đạm trong hạt tăng thì hàm lượng tinh bột trong hạt gạo thường giảm. Liều lượng phân bón thích hợp không những làm giảm hàm lượng đạm mà còn làm tăng hàm lượng tinh bột. Theo IRRI (2013), hàm lượng amylose khác nhau ở các giống lúa, hàm lượng này càng thấp thì cơm càng mềm dẻo. Các giống lúa nếp thường có hàm lượng
14. 6 amylose nhỏ hơn 2%, các giống lúa tẻ thường có hàm lượng amylose cao hơn. Các giống lúa thuộc nhóm Japonica có hàm lượng amylose thấp hơn các giống thuộc nhóm Indica. Hàm lượng amylose cũng tham gia quyết định tới độ bạc của hạt gạo. Những giống có hàm lượng amylopectin cao thường có cấu trúc phân tử khá lỏng lẻo vì thế đã tạo ra rất nhiều lỗ nhỏ trên bề mặt tinh bột và kết quả là toàn bộ nội nhũ có màu trắng đục, do đó hàm lượng amylose tỷ lệ nghịch với độ bạc của hạt gạo. Vì vậy, hướng nghiên cứu trong thời gian tới là phải dung hòa được cả hai yếu tố tỷ lệ trắng trong và độ dẻo [4]. Japonica, nhiệt độ tăng vào thời gian này làm giảm hàm lượng amylose trong hạt gạo. Hàm lượng amylose cũng biến động trong cùng một giống lúa; Tuy nhiên, mức biến động thường chỉ dưới 2%. Các chân đất khác nhau cũng tạo ra sự biến động hàm lượng amylose trên cùng một giống lúa, lúa trồng ở vùng đất phèn thường có hàm lượng amylose cao hơn các vùng đất khác. Ngoài ra, lúa trồng ở vụ Mùa cũng cho hàm lượng amylose cao hơn vụ Xuân. Nhìn chung, sự biến động hàm lượng amylose của một số giống lúa dưới tác động của môi trường chỉ dao động trong khoảng 6%. Amylose có cấu tạo mạch thẳng không phân nhánh tạo thành từ 300 - 1000 gốc glucose nhờ vào liên kết α-(1-4) glucose. Amylose phân bố bên trong hạt tinh bột nên tan trong nước nóng, nhưng độ nhớt không cao, dễ lắng cặn, gây phản ứng tủa với butanol và pentanol, bị nhiệt hóa hồ. Ở lúa, amylose có trọng lượng phân tử là 100-200 kDa, chuỗi amylose tạo thành có dạng xoắn lò xo với 6 gốc glucose trên một vòng, mỗi vòng xoắn hấp thụ một phân tử iodine vào bên trong tạo thành dung dịch màu xanh, khi đun nóng thì iodine tách ra làm mất màu xanh. Người ta đã dựa vào đặc tính này để xác định hàm lượng amylose có trong tinh bột. Mặc dù hàm lượng protein trong gạo chỉ dao động khoảng 7%, nhưng protein trong lúa gạo vẫn được coi là protein có phẩm chất cao, do nó có hàm lượng lysine cao. Với các nước coi lúa gạo là thức ăn chính thì hàm lượng protein cao trong lúa gạo là nguồn bổ sung protein cực kỳ quan trọng [13]. Theo Vũ Tiên Hoàng và cs (1988) [9], hàm lượng protein không giống nhau ở các giống lúa. Thông thường, các giống lúa nếp có hàm lượng protein cao hơn các
15. 7 giống lúa tẻ. Trong thời gian qua, các nhà chọn tạo giống trên Thế giới và Việt Nam đã có nhiều thành công trong việc chọn tạo ra giống lúa có hàm lượng protein cao. Gần đây nhất, các nhà chọn tạo giống của Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm đã tạo ra các giống lúa P4, P6 có hàm lượng protein trên 10%. Hàm lượng protein là tính trạng có cơ chế di truyền rất phức tạp và chịu tác động mạnh mẽ của môi trường. Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ không khí và nhiệt độ nước trong ruộng đến hàm lượng protein. Nguyễn Trọng Khanh (2016) [10] đã kết luận: nhiệt độ không khí hoặc nhiệt độ nước trong ruộng cao sau khi lúa trỗ sẽ làm tăng hàm lượng protein và tỷ lệ hạt chắc. Qua đó làm tăng năng suất hạt và năng suất protein trên một đơn vị diện tích. Bên cạnh đó, hàm lượng protein cũng có quan hệ chặt chẽ với lượng phân bón đặc biệt là phân đạm. Phân đạm có tác dụng tăng cường quá trình tổng hợp protein mà không thay đổi đặc tính, phẩm chất của giống. 2.1.3 Cây trồng biến đổi gen Một loài cây điển hình có từ 20.000 đến 40.000 gen. Các gen này chứa thông tin chuyên biệt và cần thiết để cây hình thành lá, rể, hoa và hạt; nẩy mầm và sinh trưởng; tiến hành quá trình quang hợp và hô hấp; sản sinh ra các loại hợp chất dự trữ và hợp chất giúp cây chống chọi lại bệnh hại và sâu bọ; và giúp cây thích nghi với các điều kiện môi trường như nóng, lạnh hoặc khô hạn [4]. Toàn bộ thông tin chứa trong DNA của cây lúa, nếu được thể hiện đầy đủ các nucleotide (ATGC) sẽ có độ dài của khoảng 40.000 trang giấy. Mỗi gen trung bình ít hơn một trang. Từ xa xưa, việc gen cây trồng được “chuyển đổi”, “biến đổi” đã xảy ra trong tự nhiên thông qua các hình thức như chọn lọc tự nhiên; thuần hóa cây trồng, lai tạo giống, ghép cây Sinh học hiện đại gần đây đã bổ sung phương thức “biến đổi gen” một cách chủ động bằng các kỹ thuật sinh học có kiểm soát. Cây trồng chuyển gen (Genetically Modified Crop - GMC) là một trong các loại sinh vật biến đổi gen. Cũng như sinh vật biến đổi gen, cây chuyển gen là một thực vật
16. 8 mang một hoặc nhiều gen “lạ” được đưa vào bằng công nghệ hiện đại. Những gen được tạo đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những loài thực vật có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn với vật chủ [4]. 2.1.4 Các phương pháp - kỹ thuật biến đổi gen (chuyển gen) cây trồng Kỹ thuật chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một thực vật những gen mong muốn từ những sinh vật sống khác nhau, không chỉ giữa các loài cây lương thực hay những loài có họ gần. Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. Chuyển gen cụ thể trên từng đối tượng sinh vật có phương pháp kỹ thuật đặc trưng, gọi chung là kỹ thuật di truyền. 2.1.4.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp - Kỹ thuật siêu âm - Kỹ thuật điện xung - Kỹ thuật PEG - Kỹ thuật vi tiêm - Kỹ thuật bắn gen - Kỹ thuật chuyển gen bằng sốc nhiệt 2.1.4.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp a) Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium - Vi khuẩn Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes là hai loài vi khuẩn gây bệnh cho thực vật được sử dụng như các vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật. A. tumefaciens có chứa một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây. Khi cây bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện bệnh rõ nhất là các khối u được hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm. Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn. Khả năng này có được do A. tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid (T-DNA) xâm nhập vào hệ gen của cây bị bệnh [11].
17. 9 - Plasmid Trong thế giới động-thực vật đều tồn tại các thể plasmid, đó là các vòng DNA tự sinh sản độc lập. Ở vi khuẩn và động-thực vật, plasmid liên quan tới yếu tố giới tính của tế bào, đến khả năng chống chịu các loại kháng sinh Đặc điểm quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập. Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng vào công nghệ gen thực vật ở hai dạng vector cis và trans. Đây là hai dạng vector rất thuận lợi để tái tổ hợp gen ngoại lai và chuyển vào tế bào thực vật. Dạng cis chỉ sử dụng Ti-plasmid và tế bào vật chủ là Agrobacterium tumefaciens mà không có sự tham gia của plasmid và vi khuẩn khác. Vùng T-DNA của Ti-plasmid được thiết kế lại để gắn những gen ngoại lai mong muốn, các phần còn lại của Ti-plasmid vẫn được giữ nguyên. Agrobacterium tumefaciens được dùng làm tế bào vật chủ để nhân lên nhiều bản sao của Ti-plasmid và chuyển gen. Dạng trans hay binary là dạng sử dụng hai hay nhiều loại plasmid và vi khuẩn cùng lúc, ví dụ: vi khuẩn E. coli và Agrobacterium, plasmid trong trường hợp này thích ứng với cả E. coli và Agrobacterium. Trước tiên, plasmid của E. coli chứa đoạn T-DNA được giới hạn bởi bờ phải (right border-RB) và bờ trái (left border-LB) mang gen ngoại lai được thiết kế và nhân lên trong vi khuẩn E. coli. Tiếp đến plasmid mang gen ngoại lai được chuyển nạp vào vi khuẩn Agrobacterium nhờ một helper plasmid (quá trình triparental matting). Vi khuẩn Agrobacterium đã mang sẵn một loại plasmid khác chứa vùng vir (virulence region) có chức năng quan trọng trong quá trình chuyển gen ngoại lai. Sự tồn tại song song hai plasmid này đã tương tác lẫn nhau trong việc chuyển gen vào tế bào thực vật. Như vậy, gen ngoại lai và vùng DNA giúp quá trình chuyển gen (vùng vir) không nằm trên cùng một plasmid nên hệ chuyển gen này được gọi là hệ trans [11]. - Vùng T-DNA Vùng T-DNA được nghiên cứu rất kỹ. Đó là ộm t đoạn DNA có kích thước 25 kb trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u (oncogenes). Trong Ti-plasmid, vị trí của T-DNA được giới hạn bằng RB
18. 10 và LB. Ngoài T-DNA, trên Ti-plasmid còn có các vùng DNA mã hóa cho việc tái sinh plasmid (replication), cho khả năng lây nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine (opine catabolism) [9]. Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA, được nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là ộm t loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD, virD2, virC1 Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-DNA, bao bọc che chở các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn [8]. Khi cây nhiễm A. tumefaciens, do T-DNA nạp vào trong hệ gen của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại “thức ăn”. Nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmid. Cơ chế lây nhiễm của A. rhizogenes đối với cây hai lá mầm cũng tương tự, nhưng trong vùng T-DNA của A. rhizogenes chỉ có gen sản sinh ra auxin, vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tơ (hairy roots) khi bị nhiễm bệnh [8]. Trên thực tế bệnh cây, Agrobacterium chỉ gây hại ở cây hai lá mầm, vì vậy người ta cho rằng chúng chỉ có thể đưa T-DNA vào hệ gen các cây hai lá mầm. Gần đây, nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn, các cây một lá mầm cũng có thể sản xuất opine và có thể khai thác khả năng biến nạp gen của Agrobacterium vào cây một lá mầm. - Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào và mô thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u (trường hợp A. tumefaciens) hoặc rễ tơ (trường hợp A. rhizogenes). Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn.
19. 11 Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A. tumefaciens phải tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này được thực hiện nhờ các gen chvA và chvB. Gen chvB mã hoá một protein liên quan đến hình thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất. β-1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA [8]. Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi Ti-plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào genome của cây chủ. Thực chất chỉ riêng T-DNA của Ti-plasmid được chuyển vào genome tế bào thực vật, mà không còn phần nào khác. Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của các gen vir (vùng vir) và gen chv quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên T-DNA. Tuy nhiên, chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, ặđ c biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật. Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền. Trước hết gen virA trong tổ hợp gen vùng vir được phosphoryl hoá nhờ tác ộđ ng của các hợp chất phenol như acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật tổn thương. Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG. Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và virE. Trước đó, khi gen virD được hoạt hoá, sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết RB và LB của T-DNA và làmứ đ t phần T-DNA ra khỏi DNA của Ti-plasmid thành các sợi đơn [8]. Đồng thời quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi thẩm xuất màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng. Các sợi đơn T-DNA được gắn vào protein do gen virE tổng hợp và dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn. Ngay sau đó, sợi T-DNA được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cầu nối chính là sự
20. 12 tiếp hợp (conjugation) giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành. Khi T- DNA đã được chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng xâm nhập vào genome tế bào thực vật (integration) được ổn định và di truyền như các gen bình thường khác [8]. Hình 2.1: Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật (tumour inducing plasmid- Ti plasmid), plasmid này chứa các gen vir và vùng gene cần chuyển (T- DNA). Gen quan tâm được chèn vào vùng T-DNA. Các tế bào tổn thương thực vật tiết ra hợp chất bảo vệ, hợp chất này kích thích sự biểu hiện gen vir ở Agrobacterium. Vir protein tạo ra T-strand và một số protein vir chuyển vaoftees bào thực vật qua kênh vận chuyển. Trong tế bào thực vật, các protein vir tương tác với T-trand tạo ra phức hệ (T-complex). Phức hệ này vào nhân tế bào thực vật, T- DNA chèn vào bộ gen thực vật và biểu hiện gen quan tâm. b) Chuyển gen nhờ virus và phage Kỹ thuật làm biến đổi gen cho cây trồng (chuyển gen) là một số trong các kỹ thuật di truyền trong sinh học, dùng để gắn một gen mới, quy định cho một đặc tính (tính trạng) có lợi (ví dụ như tính kháng bệnh hoặc sâu bọ). Kỹ thuật chính trong chuyển gen gồm có: DNA tái tổ hợp/Biến nạp; Gắn DNA thành các cấu trúc tái tổ hợp mới và đưa DNA vàoộ m t sinh vật mới.
21. 13 Vì vậy kỹ thuật chuyển gen được cho là công cụ hữu hiệu trong việc tạo giống mới và đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới ở nhiều loại cây trồng trong đó có lúa. 2.1.5 Chỉ thị chọn lọc trong chuyển gen vào thực vật Các gen chỉ thị chọn lọc chung nhất mã hóa các protein khử độc các nhân tố ức chế trao đổi chất như các kháng sinh hoặc chất diệt cỏ (herbicide). Các gen chỉ thị sàng lọc thường được sử dụng là các gen β-glucuronidase (gusA) [8]. Bằng các phương pháp sinh học phân tử có thể tạo ra các cấu trúc DNA plasmid, trong đó ngoài các gen khởi động (promoter gene), các gen của vi khuẩn Agrobacterium giúp cho DNA plasmid gắn được vào bộ gen thực vật, gen ngoại lai cần chuyển vào còn có các gen giúp phân lập ra tế bào hoặc mô thí nghiệm. Lắp ghép vào DNA plasmid với mục đích này được gọi là gen chỉ thị chọn lọc hay gen chỉ thị sàng lọc [8]. Gen chỉ thị chọn lọc thường dùng nhất là các gen mã hóa cho một số enzyme chỉ có trong vi khuẩn ở điều kiện tự nhiên mà không có trong giới thực vật. Sau khi chuyển gen, nếu thấy enzyme vi khuẩn hoạt động thì có thể suy ra là toàn bộ DNA plasmid đã được gắn vào bộ gen của thực vật và gen ngoại lai mà ta cần chuyển đã trở thành một bộ phận của bộ máy di truyền thực vật [8]. Các gen chỉ thị thường dùng nhất là các gen: gus A, npt II, lux, cat, nos và bar. - Gen npt II. Gen mã hóa cho neomycin phosphotransferase, đây làmột enzyme vi sinh vật có trọng lượng phân tử khoảng 25 kD, xúc tác cho phản ứng phosphoryl hóa một số kháng sinh gốc aminoglycoside như neomycin, kanamycin và G148. Trong phản ứng này, nhóm γ phosphate của ATP được gắn vào phân tử chất kháng sinh làm nó trở nên bất hoạt do ngăn trở sự liên kết của kháng sinh với ribosome [8]. - Gen bar. Gen bar là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyltransferase (PAT), có tác dụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT), là hoạt chất chính của thuốc trừ cỏ như Bialaphos và Basta. Gen bar được tạo dòng đầu tiên từ một dòng vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus. Phương pháp đơn giản nhất để kiểm tra sự có mặt của gen bar là phương pháp trực tiếp. Mô, tế bào hoặc cây
22. 14 chuyển gen được đặt trên môi trường có các nồng độ phosphinothricin khác nhau (hoặc các thuốc trừ cỏ tương ứng) và so sánh sinh trưởng của mô, tế bào hoặc cây đối chứng đặt trên cùng môi trường [8]. - Gen gus A. Gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β- glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-Gluc (5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm [8]. - Gen lacZ. Gen mã hóa cho enzyme β-galactosidase có trọng lượng phân tử 116 kD. Gen lacZ ở E. coli được dùng rất phổ biến trong công nghệ gen và đã có sẵn các hệ thống phương pháp kiểm tra rất nhạy với thuốc thử X-Gal. Sự tồn tại hoạt động của lacZ trong tế bào thực vật đã được khẳng định. Vì vậy trước khi kiểm tra sự có mặt của gen lacZ ngoại lai, cần phải bất hoạt gen lacZ nội sinh bằng glutaraldehyde [8]. - Gen cat. Được phân lập và tạo dòng từ dòng vi khuẩn Tn9, là gen gây khả năng kháng chloramphenicol ở vi khuẩn nói chung. Gen cat đã được dùng rộng rãi trong công nghệ gen động vật và thực vật vì gen cat mã hóa cho enzyme chloramphenicol acetyltransferase (CAT). Enzyme này xúc tác phản ứng acetyl hóa hai vị trí trên phân tử chloramphenicol và làm nó bất hoạt [8]. 2.2 Tổng quan tình hình trong nước và trên thế giới 2.2.1 Tình hình trong nước Việt Nam là một trong những nước có nghề truyền thống trồng lúa nước cổ xưa nhất thế giới. Nông nghiệp trồng lúa vừa đảm bảo an ninh lương thực quốc gia, vừa là cơ sở kinh tế sống còn của đất nước. Dân số nước ta đến nay hơn 90 triệu người, trong đó dân số ở nông thôn chiếm gần 80% và lực lượng lao động trong nghề trồng lúa chiếm khoảng 70% lực lượng lao động cả nước. Điều đó cho thấy lĩnh vực nông nghiệp trồng lúa thu hút đại bộ phận lực lượng lao động cả nước, đóng vai trò rất lớn
23. 15 trong nền kinh tế quốc dân. Bên cạnh đó, ưu thế lớn của nghề trồng lúa còn thể hiện rõ ở diện tích canh tác trong tổng diện tích đất nông nghiệp cũng như tổng diện tích trồng cây lương thực. Ngành trồng trọt chiếm 4/5 diện tích đất canh tác trong khi đó lúa giữ vị trí độc tôn, gần 85% diện tích lương thực. Theo báo cáo của Tổng cục thống kê, sản lượng lúa cả năm 2013 ước tính đạt 55,7 (Tạ/ha), sản lượng năm 2014 ước tính đạt 57,5 (Tạ/ha), sản lượng năm 2015 ước tính đạt 55,6 (Tạ/ha), năm 2016 sản lượng lúa gạo đạt 55,8 (Tạ/ha), sản lượng năm 2017 đạt 55,5 ( Tạ/ha) và năm 2018 đạt 58,1 (Tạ/ha) [11]. Nguồn: Tổng cục thống kê năm 2018 Hình 2.2: Sản lượng lúa gạo của Việt Nam từ năm 2013-2018 Việt Nam là nước nông nghiệp, trong đó nghề trồng lúa đóng vai trò chủ đạo trong cơ cấu cây trồng, nên lúa có ý nghĩa quan trong trong ền n kinh tế, xã hội nước ta. Cùng với việc áp dụng các biện pháp chọn, tạo giống mới có năng suất, chất lượng cao và khả năng chống chịu tốt nên sản lượng lúa gạo nước ta không ngừng tăng lên, đã góp phần quan trọng đưa bình quân lương thực đầu người tăng lên. Cùng một số thành tựu cũng như mốc quan trọng trong chọn tạo giống cây trồng như: - Năm 1980: Lần đầu tiên thực hiện chuyển AND ngoại lai vào cây nhờ Agrobacterium.
24. 16 - Năm 1093: Tạo marker chọn lọc như chỉ thị màu sắc, chỉ thị với kháng sinh, thiết kế lại plasmid Ti (loại bỏ gen gây khối u, cải gen mong muốn vào plasmid Ti). - Năm 1984: Thực hiện chuyển gen trực tiếp và gián tiếp vòa tế bào protoplast. - Năm 1992: chuyển gen cho lúa mì - Năm 1999: Chuyển gen tạo giống lúa có giá trị dinh dưỡng và hàm lượng vitamin A cao. - Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm với phương pháp thu thập nguồn vật liệu giống lúa cạn chịu hạn địa phương và các dòng lúa cải tiến nhập nội từ Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) với phương pháp lai hữu tính kết hợp với gây đột biến để tạo ra các tổ hợp lai có khả năng chịu hạn khá và năng suất cao như CH2, CH3, CH 133, CH5, HD8, P6, XH8 trồng rộng rãi ở vùng Trung du miền núi phía Bắc, Trung bộ, Đông Nam Bộ và Tây Nguyên. - Viện Di truyền Nông nghiệp tạo ra hàng loạt giống lúa nổi tiếng như DT10, DT11, A20, DT33, DT122, DT22, DT37, ĐS1,VS1, Khang Dân đột biến, DT68 có năng suất cao chống chịu sâu bệnh tốt, thích ứng rộng là những giống chủ lực của miền Bắc vào những thập niên 90 của thế kỉ trước và tiếp tục phát huy ở thời gian hiện nay. - Việt Nam cũng đã làm chủ được công nghệ sản xuất lúa lai hai và ba dòng như Việt Lai 20,TH3-3,TH3- 4, TH3-5 của Trường Đại học Nông Nghiệp 1 Hà Nội, các giống HYT 100, HYT 103, HYT 108, của Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm. Hiện nay, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm vẫn tiếp tục đẩy mạnh công tác nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu hạn và cho ra giống lúa chịu hạn mới đã được công nhận là giống được phép sản xuất thử. Từ năm 2000, Viện công nghệ sinh học đã tạo được 2 giống lúa DR1, DR2 có khả năng chịu hạn khá và cho năng suất ổn định ở vùng khó khăn về nước, hai giống lúa này được gieo trồng rộng rãi ở các tỉnh miền núi phía Bắc, rất thích hợp cho chân đất bạc màu nghèo dinh dưỡng và không chủ động tưới nước [9].
25. 17 Một số kết quả nghiên cứu chọn tạo giống lúa ở Việt Nam những năm gần đây: - Thu thập đánh giá nguồn vật liệu giống lúa địa phương phục vụ chọn tạo giống lúa cho vùng canh tác nhờ nước trời vùng núi Tây Bắc Việt Nam của Trường Đại học nông nghiệp 1 Hà Nội để làm vật liệu di truyền lai tạo giống lúa cho vùng núi phía Bắc Việt Nam như G4, G6, G10, G13, G14, G19, G22, G24 [9]. - Chọn giống lúa lai hai dòng Việt Lai 20 của Trường Đại học nông nghiệp 1 Hà Nội có thời gian sinh trưởng 110-115 ngày, tiềm năng năng suất 8-10 tấn/ha, chất lượng dinh dưỡng cao, thích hợp cho hệ thống canh tác 3-4 vụ/năm ở các tỉnh phía Bắc. - Nghiên cứu các giống lúa phẩm chất cao phục vụ đồng bằng sông Cửu Long của Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long với phương pháp ứng dụng công nghệ sinh học hợp với khảo nghiệm đồng ruộng để chọn tạo giống lúa ngắn ngày, năng suất cao, chất lượng gạo tốt như OM1490, OM2517, OM3536, OM2717, OM2718, OM3405, OM4495, OM4498, OM2514 trồng rộng rãi ở vùng sản xuất ngập lũ Đồng bằng sông Cửu Long [7]. - Tạo giống lúa biến đổi gen giàu chất vi dinh dưỡng của Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long dùng phương pháp Agrobacterium và hệ thống chọn lọc manose chuyển gen với vector pCaCar, pEun3 mang gen psy, crtI vào giống lúa IR6, MTL250, Tapei309 tạo ra các dòng lúa giàu Vitamine A giúp giảm suy dinh dưỡng của cộng đồng dân cư nghèo với gạo là thực phẩm chính [6]. - Hiện nay, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm vẫn tiếp tục đẩy mạnh công tác nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu hạn và cho ra giống lúa chịu hạn mới đã được công nhận là giống được phép sản xuất thử. - Từ năm 2000, Viện công nghệ sinh học đã ạt o được 2 giống lúa DR1, DR2 có khả năng chịu hạn khá và cho năng suất ổn định ở vùng khó khăn về nước, hai giống lúa này được gieo trồng rộng rãi ở các tỉnh miền núi phía Bắc, rất thích hợp cho chân đất bạc màu nghèo dinh dưỡng và không chủ động tưới nước [6]. Như vậy, ở Việt Nam mới chỉ có một số nghiên cứu sử dụng các phương pháp lai truyền thống nhằm chọn tạo các giống lúa phục vụ cho các tỉnh khu vực
26. 18 Đồng bằng sông Cửu Long. Các nghiên nghiên cứu tạo giống lúa có năng suất cao, chất lượng tốt phục vụ cho sự phát triển kinh tế xã hội khu vực Trung du Miền núi phía Bắc Việt Nam còn khá hạn chế. Đặc biệt việc sử dụng các phương pháp hiện đại ứng dụng công nghệ chỉnh sửa hệ gen để tạo giống lúa năng suất cao phù hợp với Khu vực Trung du, miền núi phía Bắc còn chưa được quan tâm nghiên cứu. Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen nhằm tạo ra các dòng giống lúa có năng suất cao có ý nghĩa rất quan trọng, góp phần xóa đói, giảm nghèo cho các đồng bào khu vực miền núi [4]. 2.2.2 Tình hình thế giới a) Công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 trên cây lúa Vấn đề quan tâm lớn nhất của công nghệ CRISPR/Cas là khả năng di truyền của các gen đột biến và sự có mặt của các gen chuyển trong cây. Nhiều báo cáo đã chứng minh rằng các đột biến một hay nhiều điểm đều có thể di truyền một cách ổn định ở các thế hệ (Yan et al., 2016; Wang et al., 2014; Ji et al. 2015; Pan et al. 2016). Pan và cộng sự (2016) [20], [17] đã chứng minh tính di truyền của các đột biến gen PDS ở loài Solanum lycopersicum. Tương tự, Fauser và cộng sự (2014) cũng chứng minh CRISPR/Cas tạo ra các dòng cà chua đột biến di truyền qua các thế hệ T0, T1 và T2. Liang và cộng sự (2017) đã tạo ra 5 dòng lúa mì đột biến không mang gen ngoại lai từ 100 phôi non bằng công cụ CRISPR/Cas9 RNPs [17]. Phương pháp chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 đã được áp dụng ở gần 20 loài cây trồng cho đến nay (Ricroch et al., 2017) [19], trong đó cây lúa đã và đang được quan tâm với mục đích cải thiện các đặc tính nông sinh học liên quan đến năng suất, khả năng chống chịu stress sinh học và phi sinh học [19]. Cải thiện năng suất và chất lượng Zhou và cộng sự (2016) [16] ứng dụng kỹ thuật CRISPR/Cas9 tạo ra các đột biến đặc hiệu gen TMS5 để tạo ra 11 dòng lúa indica TGMS mới. Trong một thí nghiệm tương tự, công nghệ CRISPR/Cas9 đã được sử dụng để huớng đến gen mục tiêu Carbon Starved Anther (CSA) giúp cây có khả năng thụ phấn trong điều kiện ngày ngắn và ngày dài ở lúa japonica để phát triển lúa lai hai dòng PGMS 9522csa
27. 19 và JY5Bcsa và một dòng rP(T)GMS145 (Li và cs., 2016) [20]. Các kết quả trên cho thấy, CRISPR/Cas9 có tiềm năng ứng dụng để tạo các dòng TGMS trong nhân giống lúa lai hai dòng [20]. Sự hư hỏng hạt trong quá trình bảo quản làm giảm chất lượng và khả năng nảy mầm gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Khả năng lưu trữ hạt giống lúa bị chi phối chủ yếu bởi các enzyme lipoxygenase (LOX) xúc tác quá trình khử oxy của axit béo để tạo thành hydroperoxit. Ba trong số 14 protein LOX (LOX1, LOX2 và LOX3) có chức năng riêng biệt trong cây lúa có tác động bất lợi đến thời gian bảo quản hạt giống. Ma và cộng sự (2015) [23] ứng dụng công nghệ TALEN để tạo đột biến hiệu quả cho gen LOX3 sử dụng một cặp monome. Kết quả cho thấy hạt của các dòng đột biến có khả năng lưu trữ được cải thiện [23]. Cải thiện khả năng chống chịu stress sinh học Wang và cộng sự (2016) [18] đã sử dụng công nghệ CRISPR/Cas9 SSN để chỉnh sửa gen mục tiêu sERF922 tại một và nhiều vị trí. Trong số 21 dòng đột biến được tạo ra tất cả đều mang các allele đột biến tăng khả năng kháng bệnh và di truyền sang các thế hệ T0, T1 và T2 [18]. Cải thiện kháng stress phi sinh học Gần đây, đột biến dựa trên chỉnh sửa bộ gen đã được ứng dụng để tạo ra các giống lúa chịu thuốc diệt cỏ (Li và cs, 2016; Sun và cs, 2016) [20]. Theo Li và cộng sự (2016) đã thay thế gen bằng kỹ thuật TALEN dựa trên tái tổ hợp tương đồng (HR) trên cây lúa và tạo ra đột biến điểm kép gen OsALS tăng khả năng chống chịu thuốc diệt cỏ. Hiệu suất đột biến là 6,3% và ổn định cho khả năng chịu thuốc diệt cỏ mạnh. Trong một thí nghiệm tương tự, HR qua trung gian CRISPR/Cas9 đã được thực hiện để tạo nhiều đột biến điểm riêng lẻ trong gen ALS ở lúa (Sun và cs, 2016) [20]. Sàng lọc kiểu hình cho thấy cây dại mọc sau 36 ngày phun bispyribac natri (BS) trong khi các dòng đột biến chỉnh sửa gen có khả năng chịu đựng với BS và sinh trưởng bình thường. Do đó, công nghệ chỉnh sửa bộ gen có thể là công cụ hiệu quả để tạo ra cây lúa kháng thuốc diệt cỏ đồng hợp tử [20].
28. 20 Cây lúa nhạy cảm với nhiệt độ thấp, đặc biệt là ở giai đoạn cây con. Do đó, cải thiện khả năng chịu lạnh có thể tăng cường đáng kể năng suất lúa. TIFY1b, một yếu tố phiên mã, là một trong những yếu tố chịu lạnh liên quan đến gen được phát hiện trên cây lúa. Công nghệ CRISPR/Cas9 đã được sử dụng để chỉnh sửa TIFY1b và gen tương đồng TIFY1a (Huang và cs, 2017) [21]. Các đột biến điểm đăc hiệu đã được quan sát thấy ở cây lúa T0. Nghiên cứu chỉ ra rằng các dòng đột biến TIFY1 có thể được tiếp tục sử dụng để nghiên cứu vai trò của gen TIFY1 trong sự thích nghi của cây lúa với nhiệt độ thấp [21]. Cải thiện dinh dưỡng cây trồng Chỉnh sửa bộ gen cũng có thể được sử dụng để sửa đổi gen lúa dẫn đến các giống không độc hại và lành mạnh hơn. Cadmium (Cd) là một kim loại nặng có độc tính cao, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe ở những người tiêu thụ gạo như một loại lương thực chính. Hàm lượng Cd trong các giống indica tương đối nhiều hơn so với các giống lúa japonica và cần được kiểm soát về an toàn thực phẩm (Arao và Ishikawa, 2006; Grant và cs, 2008) [21]. Một số biện pháp như xử lý đất, xử lý ô nhiễm, ngập đồng ruộng và sử dụng than đã được thực hiện để giảm mức Cd nhưng chúng chỉ có hiệu quả ở một mức độ nào đó. Các cách tiếp cận thông thường để phát triển các giống lúa Cd thấp là một thách thức rất lớn và các chiến lược mới cho các dòng lúa hấp thu ít Cd là bắt buộc đối với sức khỏe cộng đồng. Hệ thống chỉnh sửa CRISPR/Cas9 gần đây đã được sử dụng để phát triển các dòng lúa indica với mức tích lũy Cd thấp bằng cách loại bỏ gen vận chuyển kim loại OsNramp5 (Tang và cs, 2017) [22]. Thử nghiệm thực địa các dòng lúa indica đột biến cho thấy nồng độ Cd trong hạt OsNramp5 luôn thấp [22]. hơn 0,05 mg/kg, so với nồng độ Cd cao từ 0,33 đến 2,90 mg/kg trong hạt gạo indica loại hoang dại mà không ảnh hưởng đến năng suất cây trồng. Hệ thống chỉnh sửa bộ gen dự kiến sẽ được sử dụng trong tương lai gần để giảm thiểu nhiều rủi ro ô nhiễm kim loại nặng trong hạt gạo [22]. b) Chuyển gen trên cây lúa
29. 21 Một trong những công trình nghiên cứu đánh dấu bước tiến bộ quan trọng trong kỹ thuật chuyển gen lúa sử dụng A. tumefaciens là công trình của Hiei et al. (1994) [11]. Nhóm nghiên cứu này đã xây dựng được quy trình chuyển gen hiệu quả cho một số giống lúa nhóm Japonica như Tsukinohikari, Asanohikari và Koshihikari. Từ đó, kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi và cải tiến ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới [11]. Hiện nay, trên thế giới việc xác định chức năng gen ở cây lúa rất được chú trọng và giữ một vai trò quan trọng trong nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu ứng dụng. Bằng phương pháp nghiên cứu chức năng gen có thể khám phá ra được các gen kiểm soát những đặc điểm nông sinh học quan trọng như năng suất, chất lượng hạt, tính chống chịu stress sinh học và phi sinh học, hiệu quả sử dụng dinh dưỡng. Thành công trong kỹ thuật chuyển gen lúa mở đường cho việc nghiên cứu chức năng gen theo các hướng: gây bất hoạt gen, gây siêu biểu hiện gen và đánh giá mức độ hoạt động của promoter thông qua biểu hiện của gen chỉ thị [11]. Vì vậy chọn giống lúa đột biến được bắt đầu từ những năm 1960 và cho đến năm 2006 đã có rất nhiều giống lúa đột biến được đưa ra sản xuất trên thế giới. Năm 1966, Nhật Bản đã đưa ra sản xuất giống lúa Remei - là một giống đột biến của từ giống lúa địa phương chịu lạnh Fujiminori - có đặc điểm thấp cây, chống đổ, được ưa chuộng và thường được sử dụng trong việc lai tạo với các giống lúa khác. Hiện nay đã có hơn 60 giống lai tạo từ giống Remei được trồng ở Nhật Bản và đặc biệt là giống lúa Ikuhikari được tạo ra bằng cách lai giữa Remei và giống lúa đặc sản Koshihikari để đưa gen chống đổ sd1 vào giống lúa Koshihikari. Giống lúa đột biến từ giống Pandawangi là một giống lúa địa phương nổi tiếng về hương thơm, vị ngon và có thêm đặc tính kháng bệnh rầy nâu BHP type 1. Một trong những công trình nghiên cứu đánh dấu bước tiến bộ quan trọng trong kỹ thuật chuyển gen lúa sử dụng A. tumefaciens là công trình của Hiei et al. (1994) [11]. Từ đó, kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi và cải tiến ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới [11]. Tại Ấn Độ, ba giống lúa chất lượng là Basmati 370, Pusa Basmati 1 và Pakistan Basmati được sử dụng làm vật liệu cho chọn giống đột biến. Các giống này
30. 22 được xử lý chiếu xạ bằng tia gamma với liều chiếu 100, 150 và 200 Gray. Qua thế hệ M7 đã chọn lọc được 15 dòng đột biến từ giống Basmati 370, 07 dòng đột biến từ giống Pusa Basmati 1 và 10 dòng đột biến từ giống lúa Pakistan Basmati. Trong số các dòng đột biến nhận được, thấy xuất hiện một dòng đột biến triển vọng là CR2007, có nguồn gốc từ Basmati 370. Dòng CR2007 có chất lượng tương tự như giống Basmati gốc, nhưng có năng suất vượt trội so với giống gốc và còn có đặc tính kháng đạo ôn cổ bông, bệnh đốm nâu [11].
31. 23 Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Giống lúa: Giống lúa J02 và giống lúa thuần Bắc Thơm số 7 Vi khuẩn : chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen ở cây lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Thiết bị sử dụng và dụng cụ nghiên cứu Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu Thiết bị Dụng cụ Cân phân tích Pank Máy khuấy từ Đèn cồn Máy đo PH Cốc đong, ống đong Lò vi sóng Đĩa (hạt đậu, peptri) Nồi hấp vô trùng Bình tam giác Tủ sấy Màng bọc Hệ thống giàn đèn Chun nịt Máy cất nước Túi nilon Box cấy vô trùng Giấy thấm Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Thí nghiệm Khoa CNSH&CNTP. 3.2 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chủng khuẩn vi Agrobacterium đến hiệu quả chuyển gen. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen.
32. 24 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen. Nội dung 5: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển gen. 3.3 Phương pháp nghiên cứu Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chuyển gen ở lúa [6] 3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm a. Phương pháp bố trí thí nghiệm - Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học thực vật (Khoa CNSH & CNTP) trong điều kiện nhiệt độ phòng (25ºC ± 2, độ ẩm 60 - 65%, thời gian chiếu sáng 16h/ngày, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux. - Bố trí thí nghiệm: Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại100 mẫu. b. Khử trùng hạtvà tạo mô sẹo
33. 25 Hạt lúa chín được tách bỏ vỏ trấu, sau đó khử trùng bằng viên khử trùng EFFERVESCENT (không độc hại) nồng độ 5g/200ml nước trong thời gian 20 phút. Tiếp đến, hạt được khử trùng bằng cồn 70% trong thời gian 3 phút. Hạt được tráng sạch với nước cất khử trùng 3-4 lần, sau đó thấm khô bằng giấy thấm trước khi đưa vào nuôi cấy. Hạt được nuôi cấy tạo môi sẹo trên môi trường N6+2mg/l 2,4D ở điều kiện nhiệt độ 25OC, thời gian chiếu sáng 16h/ngày. Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành 100 mẫu. 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chủng vi khuẩn Agrobacterium Vi khuẩn A. tumefaciens được cất giữ trong glycerol ở -80OC được cấy trải trên đĩa peptri chứa môi trường LB (Yeast Extract Powder 5g/L, pepton hoặc trypton 10g/L, agar 12g/L) nuôi cấy trong 3 ngày ở 28oC. Chuyển vi khuẩn A. tumefaciens từ đĩa nuôi cấy (lấy đầy một loop kim cấy) vào ống falcon 50 mL đã khử trùng có chứa 40 mL môi trường lây nhiễm AAM+AS. Bốn chủng vi khuẩn A.tumfaciens AGL1, EHA105, GV3101 và LBA4404 được sử dụng để chuyển gen cho giống lúa Bắc Thơm số 7 trong nghiên cứu này. Thí nghiệm được tiến hành như sau: mô sẹo và hạt lúa 5 ngày tuổi sẽ được xử lý với 50 ml các chủng khuẩn A. tumefaciens khác nhau đã được chuẩn bị sẵn trong môi trường AAM trước khi cấy lên môi trường đồng nuôi cấy N6D-AS và nuôi cấy trong 3 ngày. Tiếp đó, chuyển lên môi trường N6D để sàng lọc và kiểm tra hiệu quả chuyển gen. Các chủng khuẩn này cùng mang một cấu trúc vector có chứa gen chọn lọc kháng Glufocinate. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 công thức và 3 lần nhắc lại, 100 mẫu/ lần nhắc lại. Thí nghiệm gồm các công thức như sau: Công thức 1: Không dùng vi khuẩn (đối chứng) Công thức 2: Chủng vi khuẩn AGL1 Công thức 3: Chủng vi khuẩn EHA105 Công thức 4: Chủng vi khuẩn GV3101 Công thức 5: chủng vi khuẩn LBA4404 Các chỉ tiêu theo dõi gồm số mẫu cấy, số mẫu nhiễm, số mẫu chết, số mẫu sống trên môi trường chọn lọc được theo dõi sau 7, 14 ngày; số mẫu nhuộm GUS.
34. 26 3.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen được tiến hành với hai giống lúa J02, giống Bắc Thơm số 7. Nghiên cứu sử dụng chủng vi khuẩn A. tumefacien EHA105, chủng vi khuẩn được sử dụng rất nhiều trong chuyển gen vào cây lúa trên thế giới. Mô sẹo và hạt lúa 5 ngày tuổi sẽ được xử lý với 50 ml vi khuẩn EHA105 mang gen chọn lọc đã được chuẩn bị sẵn trong môi trường AAM trước khi cấy lên môi trường đồng nuôi cấy N6D-AS và nuôi cấy trong 3 ngày. Tiếp đó, mẫu chuyển lên trên môi trường N6D-GA để kiểm tra hiệu quả chuyển gen. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn gồm 6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 100 mẫu. Công thức 1: 0 phút (đ/c) Công thức 2: 1 phút Công thức 3: 2 phút Công thức 4: 3 phút Công thức 5: 4 phút Công thức 6: 5 phút Các chỉ tiêu theo dõi gồm số mẫu cấy, số mẫu nhiễm, số mẫu sống, số mẫu chết trên môi trường chọn lọc được theo dõi sau 7, 14 ngày; số mẫu nhuộm GUS. 3.3.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy Thời gian đồng nuôi cấy ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả chuyển gen. Xác định được thời gian đồng nuôi cấy thích hợp góp phần làm tăng hiệu quả khi chuyển các gen khác vào cây trồng. Thí nghiệm được tiến hành như sau: hạt gạo và mô sẹo 5 ngày tuổi trên môi trường N6D được ngâm trong dung dịch AAM có chứa vi khuẩn EHA105 trong 3 phút. Sau đó, mẫu lúa được chuyển lên môi trường N6D-AS nuôi cấy với 4 mốc thời gian khác nhau . Sau đó, các mẫu này được chuyển sang môi trường N6D-GA và theo dõi trong 20 ngày. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn
35. 27 toàn với 4 công thức, 3 lần nhắc lại, 100 mẫu cho mỗi lần nhắc lại. Các công thức được bố trí như sau: Công thức 1: 0 ngày (đ/c) Công thức 2: 1 ngày Công thức 3: 2 ngày Công thức 4: 3 ngày Công thức 5: 4 ngày Công thức 6: 5 ngày Các chỉ tiêu theo dõi gồm số mẫu cấy, số mẫu nhiễm, số mẫu chết, số mẫu sống trên môi trường chọn lọc được theo dõi sau 7, 14 ngày; số mẫu nhuộm GUS. 3.3.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc Glufocinate là thuốc trừ cỏ tự nhiên, nó có khả năng tiêu diệt những tế bào thực vật thông thường. Chỉ có những tế bào mang gen kháng lại Glufocinate- ammonium mới có khả năng sống sót trên môi trường có chứa Glufocinate ammonium. Nồng độ chất chọn lọc này ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả chuyển gen. Nồng độ chất chọn lọc quá thấpsẽ thu được nhiều cây sau chuyển gen, tuy nhiên số lượng cây dương tính sẽ thấp và ngược lại, nồng độ chất chọn lọc cao, số cây sống sẽ rất thấp, nhưng tỷ lệ cây chuyển gen cao. Nếu quá cao sẽ làm chết cả những tế bào chuyển gen. Do vậy, có nồng độ chất chọn lọc thích hợp sẽ góp phần nâng cao hiệu quả chuyển gen. Thí nghiệm tiến hành trên môi trường N6D-GA với 7 mức nồng độ chất chọn lọc glufosinate ammonium khác nhau từ 0 – 11 mg/l môi trường. Thí nghiệm được tiến hành như sau: hạt gạo và mô sẹo 5 ngày tuổi trên môi trường N6D được ngâm trong dung dịch AAM có chứa vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 trong 3 phút. Sau đó, mẫu lúa được chuyển lên N6D-AS trong 3 ngày và nuôi cấy trong 3 ngày ở 250C. Sau đó, các mẫu này được chuyển sang môi trường chọn lọc N6D-GA có chứa Glufocinate ammonium và cefotacim và theo dõi trong 21 ngày. Các chỉ tiêu theo dõi gồm số mẫu cấy, số mẫu nhiễm, số mẫu sống, số mẫu chết, số mẫu tái sinh trên môi trường chọn lọc được theo dõi sau 7, 14 ngày; số mẫu nhuộm GUS. Các công thức thí nghiệm được bố trí như sau:
36. 28 Công thức 1: 1 mg/l Công thức 2: 3 mg/l Công thức 3: 5 mg/l Công thức 4: 7 mg/l Công thức 5: 9 mg/l Công thức 6: 11mg/l 3.3.6. Phương pháp nhuộm GUS Để kiểm tế bào chuyển gen có mang gen GUS hay không, tế bào chuyển gen được nhuộm với dung dịch 5-Br-4-Cl-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohezylamine trong 48 giờ. Mẫu chuyển gen được rửa bằng dung dịch Ethanol 70% trước khi quan sát bằng kính lúp soi nổi. 3.3.7. Hoàn thiện quy trình chuyển gen Kết quả nghiên cứu sẽ được thu thập, tổng hợp so sánh từ đó rút ra quy trình chuyển gene có hiệu quả chuyển gene cao phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.4 Các phương pháp xử lý số liệu Số liệu của các thí nghiệm được thu thập hàng tuần. Số liệu tinh được phân tích sự sai khác theo phương pháp so sánh cặp đôi One-way ANOVA with post-hoc Tukey HSD (Honestly Significant Difference) trên phần mềm Excel. TổngTổng sốchồi mẫu thu sống được (mẫu) TỷHệ lệ số mẫunhân sống chồi =(%) = 100% 100% TổngTổng số chồi mẫu nuôi đưa cấyvào (mẫu) Các chỉ tiêu theo dõi sẽ được tính toán theo các công thức sau: Tổng số mẫu chết (mẫu) Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
37. 29 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chủng khuẩn Agrobacterium Chủng vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng cũng ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả chuyển gen. Để lựa chọn được những chủng khuẩn có hiệu quả chuyển gen cao vào giống lúa Việt Nam , nhóm nghiên cứu đã tiên hành thí nghiệm về khả năng chuyển gen của các chủng vi khuẩn khác nhau trên giống lúa giống lúa Bắc thơm số 7. 4.1.1 Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa JO2 Kết quả thử nghiệm khả năng chuyển gen của các chủng vi khuẩn A. tumefaciens trên giống lúa J02 thu được trong bảng 4.1. Bảng 4.1. Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống J02. Số mẫu Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày lây Số mẫu Số mẫu Tỷ lệ Công thức nhiễm sống chết mẫu Số bắt màu trung trung trung sống GUS (mẫu) bình bình bình (%) 0 dùng vi khuẩn (đ/c) 300 0,0 300,0 0,0c 0 Chủng AGL1 300 70,0 230,0 23,3d 57 Chủng EHA105 300 100,7 199,3 33,6a 83 Chủng GV3101 300 73,0 227,0 24,3c 60 Chủng LBA4404 300 89,7 210,3 29,9b 74 LSD0,05 1,27 CV% 8,09 (Ghi chú:a, b, c và d là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD, mức ý nghĩa = 0,05) Số liệu ở bảng 4.1 chỉ ra rằng, các chủng khuẩn khác nhau có khả năng chuyển gene khác nhau vào cây lúa JO2. Hiệu quả chuyển gen+ thông qua tỷ lệ mẫu sống dao động từ 23,3% đến 33,6%. So sánh hiệu quả chuyển gen có thể phân chúng thành 02 nhóm. Nhóm có hiệu quả chuyển gen cao nhất là chủng A. tumefaciens EHA105 với tỷ lệ sống lên đến 33,6%. Tiếp đó là nhóm của chủng LBA4404 cho hiệu quả chuyển gen đạt 29,9%. Đứng sau là nhóm gồm chủng AGL1 và chủng GV301 có
38. 30 hiệu quả chuyển gen thấp hơn lần lượt đạt tỷ lệ sống là 23,3 và 24,3%. Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen cũng đã được kiểm tra trên giống lúa Bắc thơm 7. 4.1.2 Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa Bắc Thơm Bảng 4.2. Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa Bắc thơm 7 Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày Số mẫu Số Số Tỷ lệ lây nhiễm mẫu mẫu Số bắt Công thức mẫu trung sống chết màu GUS sống bình trung Trung (mẫu) (%) bình bình 0 dùng vi khuẩn(đ/c) 300 0,0 300,0 0,0e 0 Chủng vi AGL1 300 56,7 243,3 18,9d 46 Chủng EHA105 300 94,0 206,0 31,3a 77 Chủng GV3101 300 61,7 238,3 20,6c 51 Chủng LBA4404 300 84 216,0 28,0b 69 LSD0,05 1,21 CV% 5,81 (Ghi chú:a, b, c, d và e là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD, mức ý nghĩa = 0,05) Số liệu trong bảng 4.2 chỉ ra rằng ảnh hưởng của các chủng khuẩn nêu trên trên giống Bắc thơm 7. Tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc dao động từ 18,9 đến 31,3 %. Theo tỷ lệ mẫu sống và số lượng mẫu bắt màu GUS có thể chia các chủng khuẩn thành 2 nhóm. Nhóm gồm chủng AGL1 và chủng GV3101 cho tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc thấp hơn lần lượt là 18,9 và 20,6%. Trong khi đó, chủng EHA105 và chủng LBA4404 cho hiệu quả cao hơn. Tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc lần lượt là 28,0 và 31,3%. Từ kết quả thử nghiệm về tác động của các chủng khuẩn trên giống lúa Bắc thơm số 7 có thể rút ra rằng chủng EHA105 và chủng LBA4404 cho hiệu quả chuyển gen cao hơn. EHA105 có phần tốt hơn hẳn sẽ tiếp tục được sử dụng cho các nghiên
39. 31 cứu tiếp theo. Nhóm nghiên cứu tiếp tục xác định ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy chủng EHA105 đến hiệu quả chuyển gen. 4.2. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen Thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả được thực hiện trên hai giống lúa JO2 và Bắc thơm 7 được trồng khá phổ biến ở Việt Nam. 4.2.1 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa JO2 Để xác định ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen giống lúa JO2, mô sẹo 5 ngày tuổi từ hạt gạo được lây nhiễm với chủng khuẩn A. tumefaciens EHA105. Kết quả chỉ ra ở bảng 4.3. Bảng 4.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa JO2 Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày Số mẫu lây Số mẫu Số mẫu Tỷ lệ Công thức nhiễm sống chết mẫu Số bắt màu trung bình trung trung sống GUS (mẫu) bình bình (%) 0 phút (đ/c) 300 0,0 300,0 0,0f 0 1 phút 300 58,7 241,3 19,6e 48 2 phút 300 64,7 235,3 21,6d 53 3 phút 300 101,7 198,3 33,9c 81 4 phút 300 105,7 194,3 35,2 a 83 5 phút 300 105,3 194,7 35,1b 84 LSD0,05 1,32 CV% 3,28 (Ghi chú:a ,b, c, d, e và f là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD, mức ý nghĩa = 0,05) Qua bảng số liệu cho thấy thay đổi thời gian lây nhiễm làm ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen. Tăng thời gian lây nhiễm từ 0 phút đến 3 phút hiệu quả chuyển gen tăng. Tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc tăng từ 0,0% lên 33,9%. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian lây nhiễm lên 4 phút hoặc 5 phút, hiệu quả chuyển gen không thay đổi. Tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc lần lượt là 35,3% và 35,1% không khác biệt so với công thức lây nhiễm trong 3 phút. Kết quả này có thể lý giải như sau: khi thời gian
40. 32 tiếp súc không đủ lâu, vi khuẩn dễ dàng bị tách ra khỏi khối mô sẹo khi ta nhấc mẫu ra khỏi dung dịch. Khi mẫu để trong dung dịch khoảng 3 phút sẽ đảm bảo đủ thời gian cho vi khuẩn kịp bám ổn định trên khối mô sẹo. Từ đó hiệu quả chuyển gen được cải thiện. Tuy nhiên khi tăng thời gian lên 4 hoặc 5 phút không làm thay đổi sự tiếp súc của vi khuẩn A. tumefaciens với khối mô sẹo. Từ đó không gây lên sự khác biệt giữa công thức lây nhiễm trong 3 phút với các công thức lây nhiễm lâu hơn trong 4 phút và 5 phút. Thí nghiệm cũng được tiến hành tương tự với giống lúa Bắc thơm số 7. 4.2.2 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống lúa Bắc thơm 7 Thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả được thực hiện trên giống lúa Bắc thơm 7 được trồng khá phổ biến ở Việt Nam. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.4 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen trên giống Bắc Thơm số 7. Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày Số mẫu lây Số mẫu Số mẫu Tỷ lệ Công thức nhiễm trung sống chết mẫu Số bắt màu bình trung trung sống GUS (mẫu) bình bình (%) 0 phút (đ/c) 300 0,0 300,0 0,0f 0 1 phút 300 52,0 248,0 17,3e 43 2 phút 300 53,0 247,0 17,7d 43 3 phút 300 83,7 216,3 27,9b 69 4 phút 300 82,0 218,0 27,3 c 67 5 phút 300 86,7 213,3 28,9a 69 LSD0,05 0,32 CV% 1,44 (Ghi chú: a, b, c, d, e và f là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD ,có mức ý nghĩa = 0,05). Kết quả chuyển gen trên giống lúa Bắc thơm 7 có phần thấp hơn so với kết quả thu được ở giống JO2 ở cùng một mốc thời gian. Mặc dù vậy, số liệu ở bảng 4.2 chỉ ra kết qủa tương tự như kết quả thử nghiệm trên giống lúa JO2 về ảnh hưởng của
41. 33 thời gian lây nhiễm. Khi tăng thời gian lây nhiễm từ 0 phút đến 3 phút, tỷ lệ sống tăng từ 0,0% lên đến 27,9%. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian lây nhiễm không làm tăng hiệu quả chuyển gene số mẫu chuyển gen ở các công thức này không có sự sai khác ý nghĩa. Từ kết quả này chỉ ra rằng thời gian lây nhiễm 3 phút là phù hợp cho chuyển gen vào cây lúa JO2 và Bắc thơm 7. Thời gian lây nhiễm này sẽ được sử dụng vào các thí nghiệm sau. 4.3. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy hiệu quả chuyển gen Thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen được tiến hành trên hai giống lúa JO2 và Bắc thơm 7 sử dụng chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105. 4.3.1. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của giống J02 Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của giống lúa JO2 được thể hiện trong bảng 4.5 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của giống lúa J02 Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày Số mẫu lây Số mẫu Số mẫu Tỷ lệ Công thức nhiễm sống chết Số bắt màu mẫu trung bình trung trung GUS (mẫu) sống (%) bình bình 0 ngày (đ/c) 300 0,0 300,0 0,0f 0 1 ngày 300 32,0 268,0 10,7e 26 2 ngày 300 59,0 241,0 19,7d 48 3 ngày 300 97,0 203,0 32,3a 80 4 ngày 300 92,0 208,0 30,7b 75 5 ngày 300 69,3 230,7 23,1c 57 LSD0,05 1,08 CV% 7,64 (Ghi chú: a, b, c, d, e và f là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD ,có mức ý nghĩa = 0,05). Kết quả trong bảng 4.4 chỉ ra rằng việc thay đổi thời gian đồng nuôi cấy sẽ làm thay đổi hiệu quả chuyển gen thông qua tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc. Khi tăng
42. 34 thời gian đồng nuôi cấy từ 0 ngày lên 3 ngày, hiệu quả chuyển gen cũng tăng lên từ 0 đến 32,3%. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian đồng nuôi cấy lên 4 hoặc 5 ngày không làm tăng hiệu quả chuyển gen. Ngược lại, hiệu quả chuyển gen có phần giảm đi. Thí nghiệm cũng được thử nghiệm trên giống lúa Bắc thơm 7. 4.3.2. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của giống Bắc Thơm số 7 Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của giống Bắc thơm 7 được thể hiện trong bảng 4.6. Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen của giống lúa Bắc Thơm số 7 Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày Số mẫu đồng Công thức nuôi cấy Số mẫu Số mẫu Tỷ lệ mẫu Số bắt trung bình sống trung chết sống trung màu GUS bình trung bình bình (%) (mẫu) 0 ngày (đ/c) 300 0,0 300,0 0,0f 0 1 ngày 300 29,0 271,0 9,7e 24 2 ngày 300 52,7 247,3 17,6d 43 3 ngày 300 90,3 209,7 30,1a 74 4 ngày 300 85,0 215,0 28,3b 70 5 ngày 300 67,0 233,0 22,3c 55 LSD0,05 1,32 CV% 3,95 (Ghi chú: a, b, c, d, e và f là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD ,có mức ý nghĩa = 0,05). Kết quả bảng 4.6 chỉ ra tương tự như kết quả thu được trên giống lúa JO2. Tăng thời gian đồng nuôi cấy từ 1 đến 3 ngày góp phần tăng tỷ lệ mẫu sống từ 9,7% lên 30,1%. Tiếp tục tăng thời gian đồng nuôi cấy lên 4 ngày không làm thay đổi hiệu quả chuyển gen. Tuy nhiên, khi tăng thời gian đồng nuôi cấy lên 5 ngày hiệu quả chuyển gen bắt đầu giảm đi. Kết quả này có thể giải thích như sau: tăng thời gian đồng nuôi cấy từ 1-3 ngày sẽ làm số lượng vi khuẩn tăng số lượng lên rất nhiêu. Từ đó, góp phần làm tăng cơ hội để vi khuẩn A. tumefaciens thực hiện quá trình đưa gene
43. 35 vào vật chủ. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng thời gian lên thì số lượng vi khuẩn sẽ dần chết đi và sinh ra độc tố làm ảnh hưởng tiêu cực đến chủng vi khuẩn còn sống, đồng thời ảnh hưởng đến cả tế bào chuyển gen. Từ đó làm giảm hiệu quả chuyển gen. Kết hợp kết quả thu được từ thử nghiệm về thời gian đồng nuôi cấy trên hai giống lúa trên, rút ra thời gian đồng nuôi cấy thích hợp là 3 ngày. 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen Nồng độ chất chọn lọc ảnh hưởng rất nhiều đến sự sàng lọc tế bào chuyển gen cũng sự tái sinh của chúng. Nếu nồng độ chất chọn lọc thấp ta sẽ thu được nhiều tế bào sau chuyển gen. Tuy nhiên sẽ rất khó để phân biệt đâu là tế bào mang gen chuyển, đâu là tế bào không mang gen vì tất cả chúng đều sinh trưởng được trên môi trường đó. Ngược lại, nếu nồng độ chất chọn lọc quá cao có thể tiêu diệt cả tế bào mang gen chuyển, từ đó gây khó khăn cho việc tái sinh cây sau chuyển gen. Thí nghiệm về ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc được tiến hành trên hai giống lúa JO2 và Bắc thơm 7. 4.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen của giống lúa J02 Kế quả thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến tỷ lệ tái sinh của giống lúa JO2 được thể hiện trong bảng 4.6. Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen của giống lúa J02 Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày Số mẫu lây Số mẫu Số mẫu Tỷ lệ mẫu Số bắt Công thức nhiễm trung sống trung chết sống trung màu GUS bình bình trung bình bình (%) (mẫu) 0 mg/l (đ/c) 300 300,0 0,0 100,0a 0 1 mg/l 300 258,3 41,7 86,1b 4,6 3 mg/l 300 142,3 157,7 47,4c 39,3 5 mg/l 300 112,3 187,7 37,4d 80,1 7 mg/l 300 68,0 232,0 22,7e 95,6 9 mg/l 300 43,0 257,0 14,3f 95,3 11 mg/l 300 36,0 264,0 12,0g 94,4 LSD0,05 0,61 CV% 2,94
44. 36 (Ghi chú: a, b, c, d, e, f và g là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD ,có mức ý nghĩa = 0,05). Kết quả bảng 4.7 chỉ ra rằng khi tăng nồng độ chất chọn lọc sẽ làm giảm tỷ lệ sống của mẫu sau chuyển gen từ 100% xuống còn 12%. Đồng thời làm tăng tỷ lệ mẫu bắt màu GUS từ 0% đến 95.6%. Công thức không bổ sung glufocinat-ammonium cho số mẫu sống cao nhất 100%. Tuy nhiên tỷ lệ bắt màu GUS lại là thấp nhất 0%. Trong khi đó, công thức 5mg glufocinat-ammonium/l môi trường cho số mẫu sống chỉ đạt 37,4% nhưng số mẫu bắt màu GUS đạt cao nhất 80,1 %. Ở các công thức có nồng độ chất chọn lọc cao hơn, tỷ lệ mẫu sống giảm đi một cách đáng kể từ đó làm cho số mẫu bắt màu GUS cũng giảm đi theo lần lượt là 65, 41, và 34 mẫu. Thí nghiệm cũng được tiến hành với giống lúa Bắc thơm 7. 4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen đến giống lúa Bắc Thơm số 7. Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến tỷ lệ tái sinh cây chuyển gen giống lúa Bắc thơm 7 được thể hiện ở bảng 4.8. Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen đến giống lúa Bắc Thơm số 7. Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày Số mẫu lây Số mẫu Số mẫu Tỷ lệ Số bắt Công thức nhiễm trung sống chết mẫu sống màu GUS bình trung trung trung (mẫu) bình bình bình (%) 0 mg/l (đ/c) 300 300,0 0,0 100,0a 0 1 mg/l 300 265,3 34,7 88,4b 4,9 3 mg/l 300 150,7 149,3 50,2c 39,8 5 mg/l 300 108,3 191,7 36,1d 79,4 7 mg/l 300 74,0 226,0 24,7e 94,6 9 mg/l 300 45,0 255,0 15,0f 93,3 11 mg/l 300 35,7 264,3 11,9g 95,4 LSD0,05 0,64 CV% 2,88 (Ghi chú: a, b, c, d, e, f và g là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA của Tukey HSD ,có mức ý nghĩa = 0,05).
45. 37 Kết quả ở bảng 4.8 chỉ ra tương tự như kết quả thu được với giống lúa JO2. Khi tăng nồng độ chất chọn lọc làm giám tỷ lệ mẫu sống đồng thời làm tăng tỷ lệ mẫu nhuộm GUS. Công thức sử dụng 5mg Glufocinate/ lit môi trường cho số mẫu bắt màu GUS cao nhất 76,4%. Mẫu sống trên môi trường chọn lọc tiếp tục được theo dõi ếđ n 28 ngày. Kết quả chỉ ra không có sự khác biệt về tỷ lệ mẫu tái sinh. Kết quả này có thể giải thích như sau: Glufocinate là một loại thuốc trừ cỏ tự nhiên, nó tác động chính lên sự sàng lọc tế bào thực vật có chứa gen kháng Glufocinate. Tuy nhiên không ảnh hưởng đến khả năng tái sinh sư các chất kích thích sinh trưởng.
46. 38 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Trong khuôn khổ các thí nghiệm nghiên cứu chúng tôi đưa ra một số kết luận nghiên cứu sau: - Hai chủng khuẩn A.tumefaciens EHA105 và LBA4404 cho hiệu quả chuyển gen cao ở cả hai giống lúa thử nghiệm. Tỷ lệ sống sau chọn lọc đạt 33,6 và 29,9 cho giống lúa J02 và 31,3 và 28,0% 28,0% cho giống lúa Bắc Thơm. - Thời gian lây nhiễm hiệu quả là 3 phút, khi đó hiệu quả chuyển gen thông qua môi trường chọn lọc của giống J02 và Bắc Thơm lần lượt là 33,9 và 27,9% - Thời gian đồng nuôi cấy vi khuẩn A.tumefaciens với tế bào mô sẹo trong 3 ngày cho tỷ lệ chuyển gen cao. Tỷ lệ sống sau chọn lọc lần lượt cho giống J02 và Bắc Thơm số 7 khi thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày đạt lần lượt là 32,3% và 30,1%. - Nồng độ chất chọn lọc không gây ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen của cả hai giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7. Nó góp phần làm tăng hiệu quả sàng lọc tế bào chuyển gen trên môi trường chọn lọc. - Nghiên cứu thành công quy trình chuyển gen ở hai giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7. 5.2. Kiến nghị - Nghiên cứu thêm ảnh hưởng của một số chủng vi khuẩn khác đến khả năng lây nhiễm của hai giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7. - Nghiên cứu thêm về thời gian đồng nuôi cấy để cho hiệu quả tốt nhất đạt tỉ lệ thành công cao. - Nghiên cứu về điều kiện ngoại cảnh( ẩm độ, nhiệt độ,ánh sáng, dinh dưỡng) đến khả năng sinh trưởng và phát triển của hai giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7. - Nghiên cứu thêm về nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen của hai giống lúa J02 và Bắc Thơm số 7.
47. 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 1. Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử, Nxb Đại học Sư phạm. 2. Lê Trần Bình (2008), Phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt Nam Nxb Khoa học tự nhiên và công nghệ. 3. Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dũng (2006), Giáo trình công nghệ gen trong nông nghiệp, Huế . 4. Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen vào thực vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 5. Hoàng Thị Giang, Mai Đức Chung, Nguyễn Thị Huế, Jérémy Lavarenne, Mathieu Gonin, Nguyễn Thanh Hải, Đỗ Năng Vịnh, Pascal Gantet (2015) “Hoàn thiện quy trình chuyển gen cho giống lúa Taichung 65 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, tạp chí Khoa học và Phát triển. 6. Vũ Tuyên Hoàng, Trương Văn Kính, Nguyễn Thị Then (1988), “ Kết quả xây dựng quỹ gen và chọn tạo giống lúa mới”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, (số 11). 7. Nguyễn Trọng Khanh (2016), “Nghiên cứu chọn tạo giống lúa chất lượng tốt cho vùng đồng bằng sông Hồng”, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp. 8. Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Theo nhập môn công nghệ sinh học, Nhà xuất bản Đại học Huế. 9. Phan Thị Thu Hiền (2012), "Khả năng tạo callus và tái sinh cây của tập đoàn 31 giống lúa nương miền Bắc Việt Nam phục vụ công tác chuyển gen", Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập 10 (số 4: 567-575). 10. Trịnh Đình Đạt (2006), Công Nghệ Sinh Học Tập 4-Công Nghệ Di Truyền 173 Trang.
48. 40 Tiếng Anh 11. Chan M.T., Lee T.M., Chang H.H. (1992). Transformation of indica rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Physiol., 33: 577-583. 12. Yoshida (1981), Fundamentals of rice crop science, The International rice research institute, Los Banos, Philippines. 13. Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T. (1994). Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T- DNA. PlantJ.,6:271-282. 14. Jenning P.R, W.R Coffmen and H.E Kauffman (1979), Rice improvement, IRRI, Los Bnaros, Philippines, pp. 101-102 15. P.D. Hsu, D.A. Scott, J.A.Weinstein, F.A. Ran, S. Konermann, V. Agarwala, Y. Li, E.J. Fine, X. Wu, O. Shalem (2013), “DNA targeting specificity of RNA- guided Cas9 nucleases”, Nat. Biotechnol. 16. Koornneef, M., Bade, J., Hanhart, C., Horsman, K., Schel, J., Soppe, W., Verkerk, R. & Zabel, P, (1993) Plant J. 3 , 131-141. 17. Cheng M. Fry J.E., S. Pang, I. Zhou, T.W.L. Conner, Y. Wang (1992). “Genetic transfomation of the wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens”. Plant. Physiol, 115, pp. 971-980. 18. Zhou H, He M, Li J, Chen L, Huang Z, Zheng S, (2016), Development of commercial thermo-sensitive genic male sterile rice accelerates hybrid rice breeding using the CRISPR/Cas9-mediated TMS5 editing system. Sci. Rep. 6:37395. 19. Wang, Y., Cheng, X., Shan, Q., Zhang, Y., Liu, J., Gao, C. et al, (2014) Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nat. Biotechnol. 32, 947–951. 20. Wang F, Wang C, Liu P, Lei P, Hao W, Gao Y, et al. (2016), Enhanced rice blast resistance by CRISPR/ Cas9-targeted mutagenesis of the ERF transcription factor gene OsERF922. PLoS One 11:e0154027.
49. 41 21. Ricroch A, Clairand P, Harwood W, (2017), Use of CRISPR systems in plant genome editing: toward new opportunities in agriculture. Emerg. Top. Life Sci.1, 169–182. 22. Li Q, Zhang D, Chen M, Liang W, Wei J, Qi Y, et al (2016), Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. J. Genet. Genomics 43, 415–419. 23. Huang X.Z, Zeng X.F, Li J.R., Zhao D.G, (2017), Construction and analysis of tify1a and tify1b mutants in rice (Oryza sativa) based on CRISPR/Cas9 technology. J. Agric. Biotechnol. 25, 1003–1012. 24. Shao G, Xie L, Jiao G, Wei X, Sheng Z, Tang S, et al. (2017), CRISPR/CAS9- mediated editing of the fragrant gene Badh2 in Rice. Chin. J. Rice Sci. 31, 216–222.
50. PHẦN PHỤ LỤC: HÌNH ẢNH Ảnh hưởng vi khuẩn LBA4404 Ảnh hưởng của vi khuẩn EHA105 giống J02) sau 03 ngày (giống Bắc Thơm số 7) sau 03 ngày Lây nhiễm 3 phút Lây nhiễm 3 phút (giống J02) sau 07 ngày (giống Bắc Thơm số 7) sau 07 ngày Đồng lây nhiễm 3 ngày Đồng lây nhiễm 3 ngày (giống J02) (giống Bắc Thơm số 7)