Khóa luận Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro

70 trang thiennha21 13/04/2022 7770

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_nghien_cuu_kha_nang_nhan_nhanh_lan_hai_tran_lien_p.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o ĐỖ NGỌC HÀ Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI TRẦN LIÊN (Paphiopedilum tranlienianum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K48 - CNSH Khoa : CNSH – CNTP Khoá học : 2015 – 2020 Giảng viên HD : ThS. Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên, năm 2020
i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoaCông nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) bằng phương phápin vitro”. Lời đầu tiên trong khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh họcvà Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho emhoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơnchân thành tới cô giáo ThS. Nguyễn Thị Tình giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn emtrong thời gian thực hiện đề tài. Đồng thời, em xin cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên trên phòng cấy mô tế bào thực vật Khoa CNSH-CNTP đã tạo điều kiện giúp đỡ và hướng dẫn cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hếtlòng động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập. Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làmthực báocáo tập thời gian có hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em đượchoàn thiện hơn Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
ii Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn sinh viên cósức khoẻ, thành công trong cuộc sống. Thái Nguyên, ngày tháng năm Sinh viên thực hiện Đỗ Ngọc Hà
iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Cácnhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) 8 Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 14 ngày nuôi cấy) . 34 Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh phôi lan 36 Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh phôi Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy) 38 Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh phôi của lan Hài Trần liên 40 Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin vàTDZ đến khả năng nhân nhanh giống (sau 30 ngày nuôi cấy) 42 Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng rarễ cây lan hàiTr ần liên (sau 6 tuần nuôi cấy) 45 Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây lan hàiTr ần liên (sau 6 tuổi nuôi cấy) 47 Bảng 4.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan Trần liên 49
iv DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình 2.1: Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum tranlienianum 13 Hình 3.1. Quả lan Hài Trần Liên 23 Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu nhân giống loài lan HàiTr ần liên 26 Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) lan Hài Trần Liên 35 Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ tái sinh phôi lan (%) 37 Biểu đồ 4.3. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA 39 Biểu đồ 4.4. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin 41 Biểu đồ 4.5. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin và TDZ 43 Biểu đồ 4.6. Tỷ lệ mẫu ra rễ lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA 45 Biểu đồ 4.7. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với than hoạt tính 47 Biểu đồ 4.8. Tỷ lệ sống lan ảnh hưởng của giá thể 49
v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT B5 : Gamborg cs, 1976 BAP : 6-Benzyl amino purine CS : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation – Hệ số biến động Đ/C : Đối chứng LSD : Least Singnificant DifferenceTest MS : Murashighe và Skoog, 1962 MT : Môi trường GA3 : Gibberellic acid NAA : α-Napthalene acetic acid IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid IUCN : International Union for Conservation of Nature and Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế P. : Paphiopedilum tranlienuanum tranlienuanum P. malipoens : Paphiopedilum malipones WPM : Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980
vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v MỤC LỤC vi PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đíchnghiên cứu 1 1.3 Yêu cầu của đề tài 2 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Tổng quan về Lan Hài 3 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc 3 2.1.2. Đặc điểm hình thái 4 2.1.3. Sinh thái 6 2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam 7 2.2 Tổng quan về Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) 11 2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố của Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) ở Việt Nam 11 2.2.2 Hình Thái 12 2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng loài lan Hài Trần Liên 13 2.3.4. Tổng quan về môi trường nuôi cấy và các thành phần dinh dưỡng sử dụng trong nghiên cứu môi trường nhân nhanh lan Hài Trần Liên 14 2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan hài trên thế giớirong vàt nước 19
vii 2.4.1. Trên thế giới 19 2.4.2. Trong nước 21 PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 23 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 23 3.1.2. Hoá chất sử dụng 23 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 24 3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 24 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu 24 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu 24 3.2.3. Thời gian nghiên cứu 25 3.3. Nội dung nghiên cứu 25 3.4. Phương pháp nghiên cứu 25 3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 25 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống 26 3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 31 3.5. Phương pháp thu thập, xử lý số liệu và chỉ tiêu đánh giá 31 3.5.1. Thu thập số liệu 31 3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi 31 PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng 34 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh phôi lan Hài Trần Liên 36 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khả năng nhân nhanh cây lan Hài Trần Liên 38
viii 4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan Hài Trần Liên 38 4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh phôi lan hài Trần Liên 40 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine, TDZ đến khả năng nhân nhanh giống cây 42 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây lan 44 4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễcủa cây lan 44 4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khảnăng ra rễ của cây lan hàiTr ần liên 46 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan 48 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 5.1. Kết luận 51 5.2. Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52
1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Lan Hài là loài hoa đẹp có giá trị thẩm mĩ và kinh tế cao. Được người yêu hoa trong và ngoài nước tìm kiếm, điều này đã dẫn đến hầu hết các loài lan hài trên thế giới cũng như của Việt Nam rơi vào ứm c báo động nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên. Hài Trần Liên (hài Bắc Thái) là một trong số loài lan hài đặc hữu của Việt Nam, có khu phân bố hẹp (khu vực Bắc Kạn và Thái Nguyên), hiện lan hài Trần Liên được tìm thấy ở khu vực đệm của Hồ Ba Bể - nơi xuất hiện nhiều loài phong lan, địa lan có giá trị thẩm mỹ. Hài Trần Liên được nhiều nhà sưu tầm lan quan tâm bởi kiểu dáng độc đáo ớv i điểm nhấn cánh môi của hoa uốn cong giống hình chiếc hài và hai cánh bên lượn sóng, màu đỏ thẫm, hấp dẫn người chơi lan. Hài Trần Liên tái sinh bằng phôi nếu kết hợp được với loài nấm cộng sinh, do đó khả năng tái sinh trong tự nhiên thấp, đây là nguyên nhân thứ 2 khiến loài hoa có giá trị này được liệt kê vào phụ lục 1 của công ước CITES và danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ –CP ngày 30/3/2006. Xuất phát từ thực tiễn trên em tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) bằng phương phápin vitro”. 1.2 Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống lan hài trần liên từ phôi bằng phương phápin vitro.
2 1.3 Yêu cầu của đề tài - Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng. - Xác định đượcảnh hưởng củaloại môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh phôi của cây Hài Trần Liên - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khảnăng nhân nhanh Hài Trần Liên - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạttính đến khả năng ra rễ cây Hài Trần Liên. - Xác định ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống củacâyHài Trần Liên. 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài * Ý nghĩa khoa học của đề tài - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã ọh c và bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn - Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho công tác sau này. * Ý nghĩa thực tiễn Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống lan hài Trần Liên (paphiopedilum tranlienianum) bằng phương phán nuôi cấyin vitro, góp phần bảo tồn giống hoa quý hiếm trước nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồnvật liệu cho nghiên cứu khoa học.
3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về Lan Hài 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc 2.1.1.1. Phân loại Lan Hài là một nhóm rất khác biệt trong họ lan. Chúng dễ dàng được nhận ra bởi cấu trúc hoa khác thường vớicánh một hoa giữa hình túi sâu trông giống một chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa. Chiếc môi đặc sắc và hìnhdạng khác thường của hoa tạo nên vẻ bề ngoài dễ dàng phân biệt lan Hài với cácloài lan khác. Vì vậy nó trở thành tên chung của loài lan này. Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5chilà: - Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là hài Vệ nữ, phân bố ở các vùng ôn đới và núi của bán cầubắc. - Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ. - Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea vàQuần đảo Solomon. Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt kín(Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae).[1] 2.1.1.2. Nguồn gốc Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này được tìm thấy chủ yếuở
4 Trung Quốc và Bắc Việt Nam, mỗi loại trong chi này đều có khu phân bốrất hạn chế. Hầu như tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis có sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnhbao vòng trong gọi là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài vàba nhịđực ở vòng trong). Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhịđực và sự dính liền giữa nhị đực hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa cơbảnnhất dẫn đến sự tiến hoá của họ Lan. Sự giảmliên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhóm lan có ba, hai hay một nhị đực tồn tại trong hoa. Trong họ Lan, chi lan Hài (thuộc tông Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồn tại trong hoa 2.1.2. Đặc điểm hình thái Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên ngoài rất đa dạng tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái: - Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò. Tất cả các loài đều có thân rễ nhưng đa số rất ngắn[1] - Lá: thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc,dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên thân. Độ dài của lá có thể từ3- 50 cm. Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gânmàu xanh lá nổi rõ. Mặt dưới lá có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấyrõ ở gần gốc lá. Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô đều dày,mọng nước và cứng[1] - Cụm hoa: thường thẳng đứng hay cong. Một số loài có cuống hoa nằm ngang, một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, nhưng hầu hầu các loài đềucó cuống hoa dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ. Tuy nhiên
5 cũng có loài có cụm hoa mang hai hoa, song rất hiếm. Trục cụm hoa có lông tơ dầy và ngắn hay có lông nhung hoặc nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác nhau tùy từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng vàcó chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá hoa thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có lông ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoanhẵn.[1] - Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợpvàba cánh hoa ở vòng trong.Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường nổi bật với các vạch hay chấm ở mặt trong. Lá đài lưng nằm đối diện với láđài hợp ở vị trí thấp hơn và hướng xuống phía dưới. Lá đài hợp nằm phía saucủa môi thường có một màu tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng. Cả hai lá đều thường có lông tơ dày ở mặt ngoài[1] Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xoè xuống dưới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn. Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lênđến đỉnh. Cánh hoa giữa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao hoặc hình chiếc hài. Môi dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy, có lông ởmặt trong và nhẵn ở mặt ngoài.[1] Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cộtnhị- nhuỵ. Hai nhị đực hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵvà hai bên cuốn cột. Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng củachi này. Hầu hết các loài lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn[1] - Qủa: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp. Qủa mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Qủa thường chín trong điều kiên tựnhiên sau khi thụ phấn từ sáu đến mười tháng [1]
6 - Hạt: Có hình bầu dục, hình con suốt chỉ ngắn,dạng thuôn dài hay hẹpvà thường có chiều dìa từ 0,4– 1,1 mm. Phôi nhỏ, dài từ 0,3– 0,4 mm. Hạt không có nội nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên [1] - Rễ: Rễ chùm, có một lớp mô xốp bọc xung quanh các rễ thật, lớp màng xốp này có vai trò trong việc giữ nước và ngăn chặn ánh sáng gaygắt. Sau khi rễ trưởng thành thì có dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnh vàkhôngcó các búi nấm xung quanh rễ[1] . 2.1.3. Sinh thái Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng. Một nhóm phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lênđến 1600m, nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở độ cao từ 700-2200m. Ngoài ra, có một vài cá thể trong nhóm này còn mọc bám ở các khe nứt hay rìa của các vách núi dựng đứng đágranit. Lan Hài của Việt Nam có thể sống trên đất, bám đá và phụ sinh mùn. Các loài sống trên đất thường mọc ở nơi có ít ánh sáng của tán cây rừng, ở nơisườn núi dốc, các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn.Các loài lan Hài mọc trên đá thường mọc dưới bóng cây của kiểu rừng ít khép tán, chủ yếu là các mỏm đá và ngay bên dưới các đường đỉnh. Các loài phụsinh mùn chủ yếu sống bám trên vỏ cây gỗ trong các vùng rừng mây mù ẩm độcao 1200-1500m. Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bốở vùng có lượng mưa lớn, ẩm độ cao. Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng thường phải trải qua một giai đoạn khô hạn. Sự xuất hiện lá dày, dai vàmọng nước là hướng thích nghi tốt để cây cóthể sống sót được qua đợt khô hạn định kỳ và chúng sẽ nhanh chóng phục hồi khi mùa mưa trở lại. Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cườngđộ
7 ánh sáng là các nhân tố quan trọng trong sự hình thành và phát triển của quần thể lan Hài. Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều nhau ở các hướng của sườn núi. Nhưng trong các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng phát triển ở các sườn núi phía Bắc, đông Bắc và tây Bắc của núi. Ngày nay, thường chỉ tìm thấy lan Hài mọc thành từng đám nhỏ. Các nơi sống tựnhiên bị phá huỷ bởi con người,sự thay đổi các điều kiện môi trường và việc thuhái lan để bán là những nguyên nhân chính gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của lan Hài trên khắp các vùng của Việt Nam.[1] 2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam Hiện nay, nhu cầu về hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế giới cũng như trong nước đang ngày càng gia tăng. Vì vậy việc trồng lan đãtrở thành một ngành kinh tế của nhiều nước trên thế giới và nhiều nước đangphát triển khu vực Đông Nam Á. Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được yêu chuộng, sưu tầm, tìm kiếm nhiều nhất thế giới. Với sự hiện hữu của hơn20 loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là một trong các quốc gia có nguồn lan Hài tự nhiên phong phú nhất. Không những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giớiưa chuộng. Điều này đã tạo nên tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài mộtcách ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tựnhiên. Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt nhưhiện nay, lan Hài càng biến mất nhanh chóng[2] Lan Hài và các loài thuộc bộ Lan là những loài thực vật bị đe dọa biến mất trước tiên khi môi trường sống tự nhiên bị suy thoái. Nền kinh tế phát triển nhanh chóng dẫn đến ô nhiễm môi trường cùng với diện tích rừng nguyên sinh bị suy giảm
8 nhanh chóng do hoạt động khai thác làm giảm đi nơi sống tự nhiên của lan Hài gây ra nguy cơ tuyệt chủng nhiều loài lan Hài ở Việt Nam hiện nay [1]. Dựa trên những nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài lan Hài trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độđedoạ tuyệt chủng của tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ởbảng 2.1. Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) Tên loài Tên loài Tình trạng (tiếng Latinh) (tiếng Việt) Đã bị tuyệt chủng P. vietnamense Hài Việt ngoài thiên nhiên Đang bị tuyệt chủng p. delenatii Hài Đỏ trầm trọng P.  aspersum Chưa rõ tên gọi P. barbigerum var. lokianum Hài Lộc P. callosum Hài Vân P. dianthum Hài Xoắn P. emersonii Hài Hương Lan P. gratrixianum Hài Đuôi công Đang bị tuyệt chủng P. hangiannum Hài Hằng P. helenae Hài hê len P. henryanum Hài Henry P.  herrmannii Hài Herman P. malipoense var. jackii Hài Jack P. malipoense Hài Giáp P. micranthum Hài Mốc Hồng
9 Tên loài Tên loài Tình trạng (tiếng Latinh) (tiếng Việt) P. purpuratum Hìa Tía P. tralienianum Hài Trầnliên P. appletonianum Hài CánhSen P. concolor Hài Gia Định P. hirsutissimum var. Sắp bị tuyệt chủng Hài Tiên biến dị chiwuawnum Hài Tiên P. hirsutissimum var. esquirolai Hài Lông P. villosun var. annamense P.  affine Hài Hoà Thiếu dẫn liệu P.  datalanse Chưa rõ tên gọi P. villosum var. boxalli Chưa rõ tên gọi Trên thực tế, mức độ đe doạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lanHài Việt Nam được chỉ ra ở bảng trên đây đã bị thay đổi nhiều trong thời giangần đây do sự suy giảm nhanh các quần thể được biết. Trong những năm gần đây, qua các đợt điều tra thực địa đã phát hiện ra tốc độ phá huỷ mạnh mẽ trêndiện rộng của những khu rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu trên các đỉnhnúi đá vôi[12],[13],[14] Sự thay đổi môi trường sống do con người gây nên và việc thu mua với số lượng lớn để buôn bán hiện nay là nhân tố chính làm suy giảm nhanh chóngsố lượng các loài lan Hài. Tất nhiên, việc phá huỷ nơi sống tự nhiên của chúng có liên quan đến tốc độ phát triển kinh tế và sự gia tăng dân số của Việt Nam.Các loài lan Hài rất nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường nên bị đe doạ tuyệt chủng nhiều hơn và sẽ biến mất trước tiên sau khi nơi sống tự nhiên của chúng bị suy thoái.
10 Yếu tố thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài lan Hài ởViệtNam trong những năm gần đây là việc thu hái trên diện rộng của người dân địa phương để bán và xuất khẩu một lượng lớn các loài lan Hài mọc trong tự nhiên ra nước ngoài. Do không có biện pháp quản lý có hiệu quả việc thu mẫucác loài thực vật hoang dã với sự giàu có nổi bật của lan Hài đặc hữu của ViệtNam đã khuyến khích việc thu thập các loài lan từ thiên nhiên với số lượng lớn trên toàn bộ lãnh thổ.[1] Nếu không có các biện pháp bảo vệ các khu rừng nguyên sinh khẩn cấp và hiệu quả thì chắc chắn các sinh vật sẽ phải đối mặt với nguy cơ tuyệtchủng trong tương lai gần. Điều này sẽ kéo theo sự tuyệt chủng của một số lượng lớn các loài hiếm và đặc hữu. Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã đượctriển khai,chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tựnhiên của chúng. Một công trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả cácgiống lan Hài ở Việt Nam của nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004[1] Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở ViệtNam. Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lanHàinhư: - Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắc Lắc), Núi Bà (Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum. - Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn loài P. callosum. - Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn P.dalatensis.
11 - Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò (Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P.micranthum. - Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P. emersoii, P.hangianum, P. malipoense varijackii. - Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài P.gratrixianum. - Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae. - Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha đang bảo tồn loài P. malipoense Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài. Đầu tiên phải kế đến PGS. TS.Dương Tấn Nhựt, người đầu tiên nuôi cấy thành công lan hài Hồng năm 2005. Sau đó đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã nuôi cấy in vitro thành công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằng, hài Tam Đảo bằng các phương pháp nuôi cấy mô khác nhau, Khoa CNSH – CNTP trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên bước đầu đã thành công nhân giống bằng phương pháp in vitro ộm t số loài lan Hài như: Hài Vệ Nữ, Hài Hằng, Hài Helen. 2.2 Tổng quan về Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) 2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố của Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) ở Việt Nam 2.2.1.1 Nguồn gôc Lan hài Trần liên - Paphiopedilum Tranlienianum là một loài lan hài nhỏ, là dài khoảng 8-15cm màu xanh bóng. Loài này có hoa tao nhã với lá đài lưng trắng có sọc tía nâu, cánh hoa tía nâu lượn sóng rất mạnh ởmép, môi nâu tía và nhị lép vàngtươi. Hài Trần Liên là loài đặc hữu hẹp ở Việt Nam, cây ưa râm mát, nở hoa khoảng tháng 9-12, độ bền của hoa khá dài 25-30 ngày. Lan Hài Trần Liên được mô tả chính thống năm 1988 dựa trên một cây sống
12 được nhập khẩu từ Việt Nam và được đặt theo tên người Việt Nam đã xuất khẩu nó, bà Trần Ngô Liên. 2.2.1.2 Phân bố Lan Hài Trần Liên được phân bố ở việt nam ở các tỉnh : Cao Bằng, Bắc Kạn, Tuyên Quang (Na Hang) và Thái Nguyên (Đồng Hỷ): Mỏ Ba 2.2.2 Hình Thái - Lan Hài Trần Liên là loài lan đất, cây mọc thành khối. Cây mọc trên tầng đá vôi, lớp lá mục và trên rêu. 2.2.2.1. Dạng lá - Hình dải cỡ 18*1.7 cm, mặt trên màu lục bóng với mép nhạt hơn, mặt dưới màu lục nhạt với nhiều chấm màu tím ở gốc. Lá bắc hình trứng, cỡ 1.7- 2.5*1.6cm, lông ngắn ở gân giữa và mép tận cùng. 2.2.2.2. Dạng hoa Cụm hoa: có cuống dài 7-15cm, thường mang 1 hoa. Hoa : Rộng 5.5-6cm - Lá đài có lông ngắn ở mặt ngoài, lá đài gắn trục hoa màu trắng.Gân tròn cỡ 3*3-3.5cm.Lá đài kia màu lục nhạt, hình trứng, cỡ 2.5*1.1-1.8cm.Cánh hoa màu tía- nâu với chóp màu lục,hình khuôn,cỡ 3-3.4*0.7-0.9 cm, bóng. Mép lượn sóng, có lông trắng,gốc có nhiều lông nâu- tía nhạt. Môi màu đỏ- nâu thẫm,cỡ 3.7-3.9*1.6cm, - Nhị lép, hình trứng ngược, 8-10*7-9 mm, có mủ bóng. Bầu dài 3-4 cm, phủ đầy lông ngắn nâu nhạt. Bông 5-6cm rộng,6-7cm cao. 2.2.2.3. Dạng quả - Dạng quả nang dài, 3 gờ, hình trụ, mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Quả chín trong điều kiện tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6 đến 10 tháng. 2.2.2.4. Dạng gốc - Gốc chuyển thành màu lục so với màu tía - nâu với chóp màu lục 2.2.2.5. Rễ
13 Rễ chùm, màu nâu, có lớp mô xốp bọc xung quanh các rễ thật, lớp màng xốp này có vai trò trong việc giữ nước và ngăn chặn ánh sáng gay gắt. Saukhi rễ trưởng thành thì có dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnh vàkhôngcó các búi nấm xung quanh .rễ Hình 2.1: Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum tranlienianum 2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng loài lan Hài Trần Liên 2.2.3.1. Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng - Nhiệt độ: Lan Hài được phân chia thành 2 nhóm chính, theo quy luật chung, những cây có lá màu xanh thường thích sống ở nơi có nhiệt đôlạnh đến trung bình, ban đêm là từ 13-16°C, ban ngày là 18-24°C. Các loài Hài có lá vằn thích hợp với điều kiện nhiệt từ trung bình đến ấm, ban đêm là16-18°C, ban ngày là -21 25°C. - Ánh sáng: Lan Hài không cần ánh sáng mặt trời đầy đủ. Hầu hết lan Hài ưa ánh sáng yếu, điều kiện ánh sáng nhân tạo cho các loài lan từ11.000-22.000 lux. Nếu lá bị vàng hoặc phát hoa ngắn chứng tỏ chúng đang dư ánh sáng,nếu lá màu xanh đậm và mềm hoặc phát hoa dài, yếu, chúng đang thiếu ánh sáng.
14 - Độ ẩm không khí: Không khí ẩm và lưu thông tốt là rất cần thiết, nhấtlà trong mùa hè, giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm nấm bệnh và giữ cho cây không bị khô quá nhanh. Độ ẩm có thể được nâng lên bằng cách đặt chậu cây lên trên các khay sỏi nhẹ với 50% độ ẩm là lý tưởng. 2.2.3.2. Nhu cầu bón phân Phân bón: Có thể bón phân NPK với tỉ lệ 20:20:20 hoặc 14:14:14, bổ sung khoáng Ca2+ 40mg/l và Mg2+ 20-30mg/l. Tưới nước đậm trước và sau khi bón phân, nếu thấy đầu lá bị nâu khô thì nên dừng hẳn việc tưới phân. Sang chậu khi giá thể trồng có dấu hiệu mục nát.[4] 2.2.3.3. Giá thể trồng Trần liên có thể trồng trên giá thể gồm đá vôi trộn thêm chất lá mục, than củi, xỉ than tổ ong,, sơ dừa, vỏ thông và có thể tưới thêm phân bón 2 lần/ tuần trong suốt mùa sinh trưởng của cây lan 2.3.4. Tổng quan về môi trường nuôi cấy và các thành phần dinh dưỡng sử dụng trong nghiên cứu môi trường nhân nhanh lan Hài Trần Liên Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ phận, các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫu cấy vàmục đích nuôi cấy như duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh[5] Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm các thành phần chính sau: 2.3.4.1. Nguồn Cacbon Mô cấy trong môi trường nuôi cấyin vitro khôngcón khả năng tự dưỡng do không tiến hành quang hợp đầy đủ. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn Cacbon cung cấp cho môi trường nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là saccharose với hàm lượng từ 20-30 g/l. Ngoài ra còn có thể sử dụng các loại đường khác như
15 fructose, rafinose, sorbitol, glucose, maltose, lactose, những loại đường này chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt. 2.3.4.2. Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng Các chất vô cơ bao gồm thành phần khoáng đa lượng và khoáng vi lượng có trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng như là thành phần cơ bản để tổng hợp chất hữu cơ. Các dạng ion của muối khoáng đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hoà áp suất thẩm thấu và điện thế màng. - Nguyên tố đa lượng: Quan trọng nhất là các nguyên tố: N, P, K, Mg, Ca, Na, S[11] + Nitơ: Thường được sử dụng ở dạng NO3 - hoặc NH4+, hầu hết các loại thực vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hoá và tổng hớp nên các sảnphẩm hữu cơ. + Phospho: Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có tác dụng như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường. + Kali: Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O + Canxi: Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O + Magie : Sử dụng chủ yếu làSO Mg 4 + Lưu huỳnh: Chủ yếu là4 SO - Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni các nguyên tố vi lượng bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế bào nuôi cấy. 2.3.4.3. Vitamin Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Đại đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết, nhưng số lượng thấp, có thể không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó. Các
16 vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin (vitamin B1), nicotinic acid, pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol. Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy. - Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid. - Vitamin B6 (Pyridocinen): Là coenzzyme quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất. - Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp. - Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hyđratcacbon. 2.3.4.4. Các chất hữu cơ tự nhiên - Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin. - Dịch thuỷ phân casein: Chứa nhiều amino acid. - Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B. - Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh 2.3.4.5. Các thành phần khác - Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm một số chất hữu cơ như acid hữu cơ, acid béo, cùng một số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấp một số chất dinh dưỡng cho tế bào, mô nuôi cấy. - Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức chế sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Ngoài ra, có thể sử dụng một số chất chống oxy hoá khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic.
17 2.3.4.6. pH của môi trường Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡng của mẫu từ môi trường nuôi cấy. Đa số pH của môi trường được điều chỉnh trong khoảng từ 5,5-6,0. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm do mẫu nuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ. 2.3.4.7. Các chất điều hoà sinh trưởng Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật. Hiệu quả của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điều hoà sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫucấy. Dựa vào hoạt tính sinh lý có thể phân chất điều hoà sinh trưởng làm2 nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm ức chế sinh trưởng. Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng. - Nhóm Auxin: Được phát hiệ lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch, Sau đó, nhiều nhà khoa họv đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhómchất này. Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạtnảy mầm, trong phấn hoa. Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật. Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất. Auxingây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách). Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích thích sựphân chia của tế bào trụ bì – nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ biểu bì, Ngoài ra, auxin còn tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quảvàlàm chậm sự rụng lá.
18 Các auxin thường được sử dụng là: NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA (các auxin tự nhiên). Hoạt tính bcuat các chất nàyxếp được theo thứu tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA, 2,4D. IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân huỷ trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy môi, NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus. - Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích. Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ của hạt ngô non. Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim. Zeain có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một sốvi khuẩn. Trong thực vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh. Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất. Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thành chồi. Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu thế đỉnh. Quátrình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin. Ngoàira cytokinin còn làm chậm sự già hoá.[7] Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng phổ biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin vơi tỷ lệ thích hợp có khả năng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea [7] - Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu từ dịch tiết của nâm bởi các nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Giberellin được tổng hợp trong các ôm đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Giberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hoá phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài
19 lóng cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kich thước củachồi nuôi cấy. GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất [7]. 2.4. Tình hình hiênng cứu về nuôi cấy mô lanài h trên thế giới và trong nước 2.4.1. Trên thế giới Thông thườngPaphiopedilum có thể được nhân giống bằng gieo trồng hạt hay tách cây con đã trưởng thành ra khỏi cây mẹ. Tuy nhiên, các phương pháp này cho hiệu quả nhân giống thấp nên không đáp ứng nhu cầu của thị trường. Vì vậy, phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tạo ra một lượng lớn cây con trong thời gian ngắn đã trở thành một giả pháp lý tưởng đểbảovệ lan Hài thoát khỏi nguy cơ tuyệt chủng. Các nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy mô lan Hài được thực hiện bởi Bubeck năm 1973. Kể từ đó nhiều nhà nghiên cứu đã cố gắng nhân giống lan Hài bằng nhiều phương pháp nuôi cấy sử dụng các bộ phận khác nhau của cây. Một số nghiên cứu đã thành công: Năm 1975, Stewart và cs tiến hành cảm ứng chồi bên để tạo ra mô sẹo, đôi khi có sự hình thành một vài cây con trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các mô sẹo rất khó tái sinh, sau một thời gian nuôi cấy những mô sẹo này sẽ chết. Vì lý do này, hầu hết các nghiên cứu về nuôi cấymôPaphiopedilum đều sử dụng nguồn vật liệu ban đầu từ hạt.[29] Năm 1980, Nieman đã tiến hành nuôi cấy chồi bên và cây con [24]và phương pháp này cũng được Sampolinski sử dụng cho nghiên cứu năm 1983.[28] Năm 1988, Huang đã tiến hành nuôi cấy kéo dài cây in vitro, sau đó cảm ứng tạo chồi từ chồi nách của câyin vitro được nuôi cấy kéo dài. Năm 2000, Lin và cs đã ếnti hành nuôi cấy mô sẹo từ nguồn protocorm của hạt một loài lan Hài lai và đã thu được một vài cây con trong ống. nghiệm [23]
20 Năm 2001, Huang đã tiến hành nhân nhanh hạt giống lan Hài laigiữa P. philippinese và P. susan trong môi trường MS bổ sung với BAP 13 mM.[20] Năm 2002 và 2004, Chen và các cộng sự cũng báo cáo rằng có thể cảm ứng tạo chồi từ thân và lá của lan Hài P. philippinese khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4D 4,52mM và TDZ 4,5mM.[16][17] Năm 2005, Dương Tấn Nhựt đã nghiên cứu thành công phương pháp nhân nhanh giống lan Hài P. delenatii bằng phương pháp sử dụng hạt nảy mầm in vitro. Từ cây con in vitro, các mô sẹo được cảm ứng từ protocorm có nguồn gốc từ hạt, được nuôi cấy trên môi trường có chứa 2,4D và TDZ với nồng độ cao, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua bước hình thành PLB. Một phần mô sẹo có thể tái sinh được 3-7 chồi trong 3 tháng và chúng có thể tồn tại trên môi trường nuôi cấy trong 3 năm mà không mất đi khả năng tái sinh[32] . Ngoài ra, Dương Tấn Nhựt còn nghiên cứu thành công một phương pháp mới cho phép nhân nhanh giống lan P. delenatii là phương pháp gâyvết thương trên phần gốc thân của cây con in vitro. Phần gốc sau khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung thêm TDZ, NAA, 2,4D sẽ hình thành mô sẹo và một số ít xuất hiện protocorm. Năm 2007, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã nghiên cứu nhân giống thành công lan Hài Hồng qua các chồi tái sinh từ các đoạn thân của cây non được nuôi cấy kéo dàiin vitro khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung TDZ 1,5 mg/l, BA 2 mg/l, NAA 0,5 mg/l, than hoạt tính 1 g/l, đường 30 g/l, agar 9 g/l. [25]Khi nuôi cấy trong bóng tối sẽ thu được chồi dài, màu vàng, yếu, còn khi nuôi cấy dưới ánh sáng đỏ có cường độ thấp sẽ thu được chồi có sự giãn cách giữa các lá dọc trên thân cây. Năm 2008, Hong và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của cây con giống P. alma Gavaert khi nuôi cấy trên môi trường MS có Kinetin 4,65mM[18]
21 Năm 2011, Liao và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của cây con hoàn chỉnh từ nụ hoa của P. deperle và P. armeni. Tuy nhiên, cần rất nhiều thời gian để cho cây lan Hài ra hoa vì vậy phương pháp này kém hiệu quả hơn các phương pháp khác.[22] Người ta cũng tiến hành phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào từ những dòng mô sẹo có nguồn gốc từ protocorm và nuôi cấy mô sẹo từ những loại mô khác củaPaphiopedilum. 2.4.2. Trong nước * Vềnghiên cứu kỹ thuật trồng và nhân giống lan Hài Lan Hài ỏđ (Hài hồng - P.delenatii) của Phân Viện Sinh học Đà ạL t được nhân giống thành công bằng phương pháp ứng dụng công nghệ tế bào thực vật. Sau nhiều lần thử nghiệm nhân giống, từ hai năm qua, những nhà khoa học ở Phân viện sinh học Đà ạL t đã ápụ d ng phương pháp ớm i trong nhân giống hoa lan Hài đỏ. Các cây sau khi được kéo dài đoạn thân bằng cách sử ánh sáng trắng của đèn huỳnh quang và ánh sángỏ đ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi môi trường có bổ sung 2,0mg/l BA, còn trên môi trường có bổ sung 1,5mg Zeotin hoặc 1,5mgTDZ thì cho chất lượng chồi tốt nhất. Khi dùnhg phương pháp này, khả năng tạo chồi rất nhanh,,mặt khác cũng tìm được điều kiện sinh thái cho lan Hài nở hoa. Qua đây, người ta cũng chứng minh rằng lan Hài ỏđ cũng có thể sản xuất vô tính. Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2005, 2007), đã nhân giống được loài lan Hài đỏ- một loài Lan đặc hữu của Việt Nam (Paphiopedilum delenatii) bằng kỹ thuật gây vết thương cơ giới, nuôi cấy lỏng và kéo dài đốt thân có chứa mắt để tái sinh chồi từ việc sử dụng các hạt lan sáu tháng tuổi được nuôi cấy trên môi trường Knudson C kết hợp với việc gây vết thương và nuôi cấy trên môi trường lỏng đã thu được 5,2 chồi/mẫu ban đầu khi nuôi cấy trên môi trường
22 MS có bổ sung 1,0mg/l TDZ. Còn các cây sau khi được kéo dài đoạn thân bằng cách sử dụng ánh sang trắng của đèn huỳnh quang và ánh sáng đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất diều tiết sinh trưởng khác nhau. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi môi trường có bổ xung 2,0mg/l BA, còn trên môi trường có bổ sung 1,5mg Zeatin hoặc 1,5mg/l TDZ thì cho chất lượng chồi tốt nhất.[25] Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2017) đã thành công trong nhân nhanh cây lan Hài gấm (P. concolor) từ phôi trên môi trường MS cải tiến có bổ sung BA 2mg/l và TDZ 1,0mg/l. Cho hệ số nhân chồi đạt 2,9 lần. Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) nhân giống thành công loài lan hài giáp P. malipoense trên môi trường MS có bổ sung BA 2mg/l và NAA 0,3mg/l cho hệ số nhân chồi 3,28 lần. Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) nhân giống thành công loài lan hài Xuân Cảnh Paphiopedilum Canhii) trong môi trường MS có bổ sung BA với nồng độ 2mg/l + Kinetine 1mg/l + TDZ 1mg/l cho hệ số nhân chồi đạt 2,93 lần.
23 PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Loài Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) khỏe mạnh, sạch bệnh lưu giữ tại nhà lưới khoa CNSH - CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm. - Vật liệu nghiên cứu: + Phôi lan Hài Trần Liên 8 tháng tuổi sau khi thụ phấn tại Khoa CNSH – CNTP. + Một số chất kích thích sinh trưởng Hình 3.1. Quả lan Hài Trần Liên 3.1.2. Hoá chất sử dụng - Hoá chất khử trùng: cồn 70°, Ôxy già (H2O2). - Môi trường MS, B5, WPM, đường sacharose, agar, - Một số chất kích thích sinh trưởng ở thực vật thuộc nhóm auxin(NAA, ), nhóm cytokinin (BA,.Kinitine, TDZ)
24 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu Thiết bị Dụng cụ Cân phân tích Pank cấy Máy khuấy từ Dao kéo Máy đo PH Đèn cồn Lò vi sóng Cốc đong, ống đong Nồi hấp vô trùng Bình tam giác Tủ sấy Đĩa (hạt đậu, peptri) Hệ thống giàn đèn Chun nịt Box cấy vô trùng Giấy thấm Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm 3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu + Nghiên cứu nồng độ và thời gian khử trùng mẫu quả trong dung dịch H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng. + Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh phôi cây Hài Trần Liên từ quả + Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ cây Hài Trần Liên + Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Hài Trần Liên 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu - Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm.
25 3.2.3. Thời gian nghiên cứu - Thời gian: từ tháng 12/2019 – tháng 7/2020 3.3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu nồng độ và thời gian khử trùngtrong mẫu dung dịchH2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng. - Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh phôi Hài Trần liên từ quả - Nghiên cứu ảnh hưởngcủa nồng độ Cytokine đến khả năngnhân nhanh của lan HàiTr ần liên + Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Trần liên + Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAkết hợp với Kinetine đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan hàiTr ần liên. + Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA,Kinetine, TDZ đến khả năng nhân nhanh của chồi lan Hài Trần Liên. + Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính (THT) đến khả năng ra rễ của cây lan Trần Liên. + Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễcủa cây lan hài Trần Liên + Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đếnkhả năng ra rễ của cây lan hàiTr ần Liên. - Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan Hài Trần Liên giai đoạn vườn ươm. 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro - Sử dụng môi trường MS, B5, WPM bổ sung Agar 5,5 g/l, Đường 30g/l, nước dừa 150ml/l, Inositol 100mg/l, pH: 5,6-5,8.
26 - Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi cấy có hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm. - Môi trường hấp khử trùng ở nhiệt độo 121 C, áp suất 1,0 atm trong20 phút - Sau khi cấy xong đưa mẫu vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ phòng từ 22oC – 25oC, độ ẩm: 60 – 65% quang chu kì 14h sáng 10h tối. Tiến hành theo dõi mẫu. 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống Quả Khử trùng (cồn 70º,xà phòng,H O ) 2 2 Tái sinh phôi Nhân nhanh chồi Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Vườn ươm Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu nhân giống loài lan HàiTr ần liên
27 3.4.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch H2O2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng. Các bước tiến hành vô trùng mẫu như sau: - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu: Mẫu lấyquả là của cây lan HàiTrần liên đem rửa sạch dưới vòi nước, loại bỏ hết phần đất bẩn, dùng xà phòng để rửa,sau đó tráng lại bằng nước cất. - Khử trùng mẫu: Tiến hành trong box cấy vô trùng, khử trùng sơ bộ bằng cồn 70° trong 30 giây, tráng lại 3 - 5 lần bằng nước cất vô trùng, sau đó khử trùng tiếp bằng dung dịch H2O2 để tiêu diệt nấm, vi khuẩn. Sau đó tráng lại bằng nước. Đặt mẫu lên giấy thấm và để khô tự nhiên trong box. Sau đó dùng pank, dao, kéo cắt bỏ phần mẫu ngấm hoá chất trên mẫu và cấy vào môi trường nuôi cấy.Tiến hành theo dõi mẫu. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng cuả nồng độ, thời giancủa chất khử trùng của2 H O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cây lan HàiTrần liên Các công thức được bố trí như sau: Hóa chất Công thức Thời gian (phút) CT1 (Đ/C) 0 CT2 10 H2O2 1% CT3 15 CT4 20 CT5 10 H2O22% CT6 15 CT7 20 CT8 10 H2O2 3 % CT9 15 CT10 20
28 3.4.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh phôi lan Hài Trần Liên Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh phôi lan HàiTr ần Liên - Mẫu sau khi khử trùng, được cấy sang các môi trường nuôi cấy khác nhau Các môi trường nuôi cấy được bổ sung thêmĐường 30g/L + Agar 5,5g/L + Nước dừa 150 ml/L + Inositol 100mg/l, để nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh phôi lan Hài Trần Liên. Công thức thí nghiệm được bố trí như sau: CT Môi trường Chất bổ sung 1 Muashige & Skoog (MS) Đường 30g/L + Agar 5,5g/L + 2 Woody Plant Medium (WPM) Nước dừa 150 ml/L + Inositol, 3 Gamborg’s (B5) pH 5,6 – 5,8. - Mẫu có kích thước tương đồng sau khi khử trùng được đưa vào môi trường tái sinh, sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp. Tiến hành theo dõi, quan sát phôi tái sinh và chất lượngphôi tái sinh. 3.4.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Cytokinine đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Trần Liên Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Trần Liên - Phôi tái sinh được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền (Môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường MS bổ sung: Đường 30 g/l + Nước dừa 150 ml/l + Agar 5,5 g/l + Inositol 100mg/l, pH 5,6 – 5,8.), có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (BA) để theo dõi khả năng nhân phôi của mẫu. - Theo dõi, quan sát số chồi chất lượngch ồi Thí nghiệm được bố trí như sau:
29 CT 1(Đ/c): MT nền + BA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + BA 1,0 mg/l CT 3: MT nền + BA 2,0 mg/l CT 4: MT nền + BA 3,0 mg/l CT 5: MT nền + BA 4,0 mg/l Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với kinitine đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Trần Liên từ phôi - Các phôi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra vàcấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A(nồng độ BA thích hợp nhất ở thí nghiệm 3) + kinetine ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền +A+ 0,0 mg/l Kinetine CT 2: MT nền + A +0,3 mg/l Kinetine CT 3: MT nền + A +0,5 mg/l Kinetine CT 4: MT nền + A +1,0 mg/l Kinetine CT 5: MT nền + A 2,0+ mg/l Kinetine Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnhhưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi của câyHài Trần Liên. Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A + B (nồng độ Kinetin thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi đã xác định ở thí nghiệm 4) + TDZ ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + A + B + TDZ 0,0 mg/l CT 2: MT nền + A + B + TDZ 0,5 mg/l CT 3: MT nền + A + B + TDZ 1,0 mg/l CT 4: MT nền + A + B + TDZ 1,5 mg/l
30 CT 5: MT nền + A + B + TDZ 2,0 mg/l 3.4.3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của cây lan Hài Trần Liên Thí nghiệm 6:Nghiên cứu ảnh hưởng củaNAA đến khả năng ra rễ của cây lan Hài Trần iênL - Chồi sinh trưởng và có từ 2-3 lá, cây cao 2-3 cm thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm: MT nền có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau đểtheo dõi khả năng tạo rễ của mẫu. - Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ. Thí nghiệm được bố nhưtrí sau: CT 1 (Đ/c): MT nền +0,0 NAA mg/l CT 2: MT nền +0,5 NAA mg/l CT 3: MT nền +1,0 NAA mg/l CT 4: MT nền +1,5 NAA mg/l CT 5: MT nền +2,0 NAA mg/l Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ của cây lan Hài Trầniên L - Chồi sinh trưởng và có từ- 2 3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm: MT nền + B (nồng độ NAAthích hợp nhất cho ra rễ đã được xác định ở thí nghiệm 7) + THT ở các nồng độ khác nhauể đ theo dõi khả năng ra rễ của mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + B + THT 0,0 g/l CT 2: MT nền + B + THT 0,5 g/l CT 3: MT nền + B + THT 1,0 /lg CT 4: MT nền + B + THT 1,5 g /l CT 5: MT nền + B + THT 2,0 g/l
31 3.4.3.5. Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan Hài Trần Liên Công thức thí nghiệm được bố trí như sau: Công Thức(CT) Giá thể CT1 Đất CT2 Than CT3 Sơ dừa CT4 Dớn CT5 Vỏ thông 3.4.3. Phương phápbố trí thí nghiệm - Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Côngnghệ sinh học thực vật (Khoa CNSH - CNTP) trong điều kiện nhiệt độ phòng (25ºC ± 2, độ ẩm 60 - 65%, thời gian chiếu sáng 14h sáng, 10h tối cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux. - Bố trí thí nghiệm: Tất cả các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần lặp lại, mỗi lần cấy trong 30 bình thủy tinh thể tích 250ml, 500 ml) có chứa 70 ml môi trường, mỗi bình cấy 1 mẫu.). Điều chỉnh giá trị pH = 5,6 – 5,8 và bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng trước khi hấp khử trùng ở 121oC, trong 15 - 20 phút. 3.5. Phương pháp thu thập, xử lý số liệu và chỉ tiêu đánh giá 3.5.1. Thu thập số liệu - Đếm số mẫu không nhiễm, mẫu sống nhiễm, mẫu chết. - Đếm số chồi: đếm tổng số phôi và nhánh trên một mẫu nuôi cấy ban. đầu - Đếm số lượng rễ, độ dài của rễ. 3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi - Chỉ tiêu theo dõi khử trùng mẫu
32 + Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm: Tổng số mẫu sống không nhiễm (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) + Tỷ lệ mẫu sống nhiễm: Tổng số mẫu sống bị nhiễm (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) +Tỷ lệ mẫu chết: Tổng số mẫu chết (mẫu) Tỷ lệ mẫu chết (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Chỉ tiêu theo dõi phôi: Tổng số mẫu nảy phôi (mẫu) Tỷ lệ tái sinh phôi (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) Tổng chồi thu được Hệ số nhân chồi = × 100% Tổng chồi nuôi cấy Chất lượng chồi: + Sinh trưởng tốt: Chồi mập, khỏe, xanh + Sinh trưởng trung bình: Chồi mập, khỏe, xanh nhạt + Sinh trưởng kém: Chồi nhỏ, yếu, trắng vàng - Chỉ tiêu theo dõi ra rễ: Tổng số chồi ra rễ (chồi) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = × 100% Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu)
33 Chất lượng rễ,màu sắc + Rễ tốt: Rễ khỏe, dài,có màu trắng,nhiều lông hút. + Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn.có màu trắng hơi vàng + Rễ kém: Rễ ngắn, nhỏ.vàng hoặc màu đen.
34 PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng Trong quá trình nuôi cấyin vitro, vô trùng mẫu cấy là giai đoạn khởi đầu và quyết định sự thành công của quá trình nuôi cấy.Để có được vật liệu khởi đầu sạch nấm và vi khuẩn, việc lựa chọn chất khử trùng, nồng độ, thời gian rất quan trọng. Qua quá trình nghiên cứu và tìm hiểu khả năng tạo mô sạch trong nuôi cấy in vitro trên đối tượng Phong lan nói chung và lan Hài nói riêng, chúng tôi nhận thấy có nhiều nhất chất hóa học có hoạt tính diệt nấm và vi khuẩn mạnh như Calcium hypochlorid Ca(OCl)2, thuỷ ngân clorua (HgCl2), hydroxid (H2O2), Tuy nhiên HgCl2 được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng bởi chúng có hoạt tính khử trùng tốt, cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao,nhưng lại gây ô nhiễm môi trường, độc hại, dễ gây bệnh hiểm nghèo cho con người nên không sử dụng. Hydroxid (H2O2) có hiệu quả khử trùng kém hơn nhưng lại không gây hại cho môi trường và con người nên được chọn sử dụng cho các nghiên cứu lien quan trong thí nghiệm Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H2O2 đến khả năng tạo vậtệ li u vô trùng (sau 14 ngày nuôi cấy) Chỉ tiêu đánh giá Số Thời Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ Nồng độ gian sống mẫu Công thức đưa mẫu (%) không sống vào chết (phút) nhiễm nhiễm (mẫu) (%) (%) (%) Nước cất CT1(Đ/c) 15 30 0,00 100 0,00 vô trùng CT2 10 30 15,33 73,44 11,23 H2O2 1% CT3 15 30 27,67 35,55 36,78
35 Chỉ tiêu đánh giá Số Thời Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ Nồng độ gian sống mẫu Công thức đưa mẫu (%) không sống vào chết (phút) nhiễm nhiễm (mẫu) (%) (%) (%) CT4 20 30 41,00 38,89 20,11 CT5 10 30 52,22 36,14 11,64 CT6 15 30 58,55 24,12 19,33 H2O2 2% CT7 20 30 46,33 9,22 40,45 CT8 10 30 59,96 1,25 28,79 CT9 15 30 65,55 17,24 17,21 H2O2 3% CT10 20 30 31,45 2,56 65,99 LSD05 5,8 CV (%) 7,9 70 65.55 58.55 59.96 60 52.22 50 46.33 41 40 31.45 30 27.67 20 15.33 10 0 0 CT1(Đ/c) CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 CT10 tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) lan Hài Trần Liên Từ kết quả nghiên cứu cho thấy: Khi khử trùng mẫu ở nồng độ H2O2 1% trong 15 phút cho thấy tỷ lệ mẫu sông không nhiễm đạt ở mức cao nhất là 65,55%, tỷ lệ mẫu chết ở mức 17,21%.
36 Ở nồng độ H2O2 2% thì mẫu được khử trùng trong 20phút cho ra tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt ở mức cao nhất là 46,33%, tỷ lệ mẫu chết ở mức là 40,45%.Trong 20 phút khử trùng mẫu bằng 1% H2O2 cho ra tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt ở mức cao nhất lầ 41,00% và tỷ lệ mẫu chết ở mức 20,11%. Kết quả thí nghiệm cho thấy dung dịch H2O2 ở nồng độ thấp nhất 1% ít ảnh hưởng đến mẫu, tỷ lệ mẫu chết cao nhất ở mức 20,11% nhưng hiệu quả khử trùng thấp. Khi nồng độ H2O2 tăng lên 2% thì hiệu quả của khử trùng khá cao đạt mức 65,55% khử trùng trong 15 phút nhưng khi tăng lên theo thời gian khử trùng lên 20 phút thì tỷ lệ mẫu sống không nhiễm giảm mạnh xuống 43,33% và tỷ lệ mẫu chết khá cao 40,45%. Cho thấy nếu nồng độ và thời gian không phù hợp thì sẽ không đạt hiệu quả khử trùng tốt nhất. Như vậy, nồng độ H2O2 3% và thời gian khử trùng 15 phút là phù hợp và tốt nhất trong thí nghiệm cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 65,55% và tỷ lệ mẫu chết ở mức tương đối thấp 17,21%. 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh phôi lan Hài Trần Liên Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh phôi lan Tổng mẫu Tổng mẫu Chất Môi tái sinh Tỷ lệ tái Công thức nuôi cấy lượng trường phôi sinh (%) (mẫu ) phôi (mẫu) Xanh đậm, CT1 MS 30 20 66,67 mập Xanh nhạt, CT2 WPM 30 14 46,67 mập Xanh nhạt, CT3 B5 30 8 26,67 gầy LSD.05 6,8 CV 6,5
37 Tỷ lệ tái sinh (%) 80 70 66.67 60 50 46.67 40 Tỷ lệ tái sinh (%) 30 26.67 20 10 0 CT1 CT2 CT3 Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ tái sinh phôi lan (%) Từ kết quả nghiên cứu cho thấy : Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy: giá trị CV(%): 6, % và LSD.05 đạt 6,5%; các công thức đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy là 95%. Ở CT1 (MS) cho tỷ lệ phôi tái sinh cao nhất 66,67 %, thu được phôi có màu xanh, mập. Tiếp theo CT2 (WPR) tỷ lệ tái sinh phôi là 47,67 % phôi thu được màu xanh nhạt, mập. CT3 cho tỷ lệ tái sinh phôi thấp nhất 26,67% phôi thu được màu xanh nhạt, gầy. Kết quả thí nghiệm cho thấy phôi lan có thể tái sinh tốt trên nền môi trường giàu dinh dưỡng Từ kết quả trên, chúng tôi chọn môi trường MS làm môi trường cơ bản cho quá trình nghiên cứu sau của cây lan .
38 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khả năng nhân nhanh cây lan Hài Trần Liên 4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan Hài Trần Liên BA (6-Benzylaminopurine) là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong môi trường nuôi cấy mô nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ. Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh phôi Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy) Tổng số Tổng Hệ số nhân Nồng độ BA chồi tạo CT mẫu cấy chồi Chất lượng chồi (mg/l) thành (mẫu) (lần) (chồi) Trắng vàng, 1 0 30 5 0,17 nhỏ, yếu Trắng vàng, 2 1 30 21 0,7 nhỏ, yếu 3 2 30 30 1,8 Xanh, mập, khỏe Xanh nhạt, 4 3 30 47 1,56 khỏe, mập Trắng vàng, 5 5 30 20 0,68 nhỏ, yếu LSD05 0,12 CV(%) 8,7
39 2 1.8 1.8 1.56 1.6 1.4 1.2 1 hệ số nhân chồi ( lần) 0.8 0.7 0.68 0.6 0.4 0.17 0.2 0 1 2 3 4 5 Biểu đồ 4.3. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA Từ kết quả nghiên cứu cho thấy: Giá trị CV (%): 8,7% và 05LSD đạt 0,12 % thì các công thức thí nghiệm đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Điều này cho thấy BA có sựảnh hưởng tích ccự tới khả năng nhanh nhanh chồi lan HàiTrần liên. Từ CT2 đến CT5 tương ứng với bổ sung BA ở các nồng độ- từ1,0 5,0 mg/l, sau 40 ngày nuôi cấy thì tổng số chồi thu được nhiều hơn so với công thức đối chứng (CT1). Khi sử dụng BA ở nồngđộ 3,0 mg/l (CT4) cho tổng chồi thu được cao nhất (47chồi) với hệ số nhân chồi làlần 1,56 . Ỏ CT2 (nồng độ BA 1,0 mg/l) thu được (21 chồi) cho hình thái chồi tốt (chồi xanh đậm vàmập). CT2 và CT4 cho tỷ lệ tái sinh chồi aoc nhất chồi xanhđậm và mập. Khi tăng dần nồng độ BA trong môi trường (0 – 2,0 mg/l) thì tỷ lệ chồi táih sin tăng đáng kể. Nồng độ ,0BA 4 mg/l đối với cây lan HàiP. Trần liên cho tổng chồi thu được cao nhất đạt 47chồi. Khi tăng nồng độ BA lên, tỷ lệ tái sinh có xu hướng giảm dần, điều này có thể giải thích là nồng độBA thích hợp kích thích cây sinh trưởng, tuy nhiên khi nồng độ BA tăng cao vượt quá ngưỡng cần thiết có thể gây ức chế khả năng tạo chồi.
40 4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh phôi lan hài Trần Liên Cũng như BA, Kinetin (6-furfurolaminopurrine) là một chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong nuôi cấy mô- tế bào nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ. Do vậy, chúng tôi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung kinetin vào môi trường nuôi đến khả năng nhân nhanh cây lan Hài Trần liên. Kết quả thí nghiệm sau 12 tuần theo dõi được trình bày trong bảng 4.4 Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh phôi của lan Hài Trần liên (sau 6 tuần nuôi cấy). Kinetin (6-furfurolaminopurrine) là một chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong nuôi cấy mô- tế bào nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ [3]. Nồng Nồng độ Tổng phôi Tổng Hệ số Công Chất lượng độ BA Kinetin nuôi cấy chồi thu nhân chồi thức chồi (mg/l) (mg/l) (phôi) được (lần) Nhỏ,yếu, CT1 0,0 30 21 0,7 trắng Mập, xanh CT2 0,5 30 46 1,53 nhạt, Xanh khỏe, CT3 1,0 30 65 2,17 mập 2 Xanh nhạt CT4 1,5 30 57 1,9 khỏe, mập Nhỏ yếu CT5 2 30 50 0,89 trắng vàng , LSD05 0,16 CV(%) 5,8
41 hệ số nhân chồi (lần) 2.5 2.17 2 1.9 1.53 1.5 hệ số nhân (lần) 1 0.89 0.7 0.5 0 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Biểu đồ 4.4. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin Từ kết quả nghiên cứu cho thấy : Ở chỉ tiêu hệ số nhân chồi với giá trị LSD05 đạt 0,16, cặp CT2 và CT4 có sự sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, các công thức khác có sự sai kháccó ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Khi bổ sung BA 2,0 mg/l, Kinetin từ 0-2mg/l vào môi trường nuôi cấy ta thấy có ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh chồi lan . Khi tăng nồng độ Kinetin từ 0-1 mg/l hệ số nhân chồi có xu hướng tăng, cụ thể làhệ số nhân chồi tăng từ 0,7 (CT1) đến 2,17(CT3). Trong thí nghiệm này nồng độ Kinetin 1,0 mg/l cho tổng số chồi thu được là 65 chồi và hệ số nhân cao nhất là 2,17 lần. Nồng độ Kinetin từ 1,5– 2,0 mg/l thu được tổng số chồi và hệ số nhân giảm dần với CT4, CT5 lần lượt là 57 chồi, 50 chồitương ứng vợi hệ số nhân là 1,9 ; 0,89 lần. Chất lượng chồi ở thí nghiệm được đánh giá từ mức kém đến mứctốt. Với CT đối chứng (Kinetin 0,0 mg/l) cho chất lượng chồi thu được kém. Khi tăng dần nồng độ Kinetin từ 0,5- 1,0 mg/l thì chất lượng chồi cải thiện từ kém lên tốt, trong thí nghiệm này CT bổ sung Kinetin từ 1-1,5 mg/l cho chất lượng chồi tốt nhất. Tăng
42 nồng độ Kinetin từ 1,5-2 mg/l thì chất lượng chồi thấp xuống, chồi thu được chất lượng trung bình. Vì vậy ở thí nghiệm nàyđể nhân nhanh chồi lan cần bổ sung 2mg/l BA + 1mg/l Kinetin. 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA,K inetine, TDZ đến khả năng nhân nhanh giống cây Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống (sau 30 ngày nuôi cấy) Tổng số Hệ số Nồng độ Nồng độ Số mẫu Công Nồng độ chồi thu nhân Chât lượng Kinetin TDZ nuôi cấy thức BA(mg/l) được chồi chồi (mg/l) (mg/l) (mẫu) (chồi) (lần) Xanh CT 1 0,0 30 56 1,87 nhạt,mập, khỏe CT 2 0,5 30 62 2,06 Xanh đậm,gầy Xanh,khỏe, CT 3 2,0 1,0 1,0 30 85 2,83 mập Xanh,khỏe, CT 4 1,5 30 74 2,46 mập Xanh nhạt CT 5 2,0 30 65 2,16 khỏe, mập LSD05 0,14 CV (%) 4,4
43 3 2.83 2.46 2.5 2.16 2.06 2 1.87 1.5 Hệ số nhân chồi(lân) 1 0.5 0 CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 Biểu đồ 4.5. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin và TDZ Từ kết quả nghiên cứu cho thấy : Ở chỉ tiêu hệ số nhân chồi với giá trị LSD05 đạt 0,14, cặp CT2 và CT5 có sự sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, các công thức khác có sự sai kháccó ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Khi bổ sung BA 2,0 mg/l, Kinetin 1,0 mg/l và TDZ từ 0,0-2,0 mg/l vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến khả năng nhân chồi cây lan hài Trần Liên. Các công thức có bổ sung TDZ đều cho hệ số nhân chồi cao hơn công thức đối chứng không bổ sung TDZ (công thức đối chứng có hệ số nhân chồi đạt 1,87 lần). Khi tăng nồng độ TDZ từ 0,0-1,0 mg/l tổng số chồi thu được và hệ số nhân chồi có xu hướng tăng lên, cụ thể ở công thức đối chứng TDZ nồng độ 0,0 mg/l cho tổng số chồi thu được là 56 chồi và hệ số nhân là 1,87 lần., Nồng độ TDZ 1,0 mg/l cho tổng số chồi thu được là 85 chồi và hệ số nhân cao nhất là 2,83 lần. Nồng độ TDZ từ 1,5- 2,0 mg/l thu được tổng số chồi và hệ số nhân giảm dần với CT4, CT5 lần lượt là 74 chồi, 65 chồi chồi tương ứng với hệ số nhân là 2,46 ; 2,16 lần.
44 Với CT đối chứng (TDZ 0,0 mg/l) cho chất lượng chồi thu được xanh nhạt, mập khỏe. Khi tăng dần nồng độ TDZ từ 0,5-1,0 mg/l thì chất lượng chồi cũng cải thiện từ chồi xanh nhạt, mập, khỏe lên chồi xanh khỏe mập, trog khuôn khổ thí nghiệm này, CT bổ sung TDZ từ 1-1,5 mg/l cho chất lượng chồi tốt nhất. Tăng nồng độ TDZ từ 1,5-2,0 mg/l thì chất lượng chồi thấp xuống, chồi thu được nhỏ,yếu, trắng vàng. Như vậy TDZ là chất kích thích sinh trưởng có tác dụngkích thích tế bào phân chia hình thành chồi mới. Ở công thức đối chứng không có TDZ trong môi trường nuôi cấy nên khả năng tạo chồi thấp hơn các công thức bổ sung TDZ. Ở CT2 với nồng độ TDZ 0,5 mg/l có tác dụng kích thích phát triển chồi mới nhưng do nồng độ TDZ thấp nên mẫu ít chịu tác động kích thích phân chiatế bào của chất này. Ở CT 3 cho hệ số nhân chồi cao nhất là do TDZ 1,0 mg/l kích thích mẫu sinh trưởng và phát triển tốt nhất, đồng thời tế bào phân chia mạnh mẽ nhất. Khi nồng độ TDZ tăng dần từ 1,5 – 2,0 mg/l ứng với CT4, CT5 có sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài hoặc bị biến dạng, nồng độ TDZ càng cao thì hệ số nhân chồi càng giảm dần. 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính ếđ n khả năng ra rễ cây lan 4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây lan Ra rễ là khâu cuối cùng của qúa trình nuôi cấy in vitro. Chất kích thích sinh trưởng được dùng chủ yếu ở giai đoạn này thuộc nhóm auxin. Trong đó, IBA và NAA là những chất kích thích đượng dùng phổ biến trong nuôi cấy mô nhằm thúc đẩy quá trình phân bào và kích thích sự hình thành rễ.
45 Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ cây lan hàiTr ần liên (sau 6 tuần nuôi cấy) Nồng độ Số mẫu Số mẫu Tỷ lệ mẫu Công thức NAA nuôi cấy ra rễ Chất lượng rễ ra rễ (%) (mg/l) (mẫu) (mẫu) CT1(Đ/c) 0,0 30 3 10 Ngắn nhỏ CT 2 0,5 30 22 73,33 Ngắn, mập CT 3 1,0 30 18 60 Ngắn, nhỏ CT 4 1,5 30 12 40 Ngắn, nhỏ CT 5 2,0 30 7 23,33 Ngắn, nhỏ LSD05 6,5 CV(%) 8,7 80 73.33 70 60 60 50 40 40 30 Tỷ lệ mãu ra rễ (%) 23.33 20 10 10 0 CT1(Đ/c) CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 Biểu đồ 4.6. Tỷ lệ mẫu ra rễ lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA Từ kết quả nghiên cứu cho thấy :
46 Với giá trị LSD.05 đạt 6,5 các công thức khác nhau có sự sai khác có ý nghĩaở mức độ tin cậy 95%. Tỷ lệ mẫu ra rễ cao nhất đạt được ở CT 2 là 73,33%, chất lượng rễ thu được ngắn, mập. Tiếp theo là CT3 đạt 60%, CT4 đạt 40%, CT5 đạt 23,33%, rễ thu được ngắn, nhỏ. Kết quả trên được giả thích như sau: NAAcó dụng kích thích chồi tạo rễ. Ở CT đối chứng (CT1) vì không bổ sung NAA nên số mẫu ỏtạ ra thấp và ít rễ. Nồng độ NAA 0,5 mg/l (CT2) cho nhiều cây ra rễ và có số rễ lớn nhất là do NAA ở nồng độ này có tác dụng kích thích chồilan ra rễ mạnh nhất đồng thời tạo điều kiện cho cây sinh trưởng và phát triển tốt nhất. Ở CT3, CT4, CT5, nồng độ NAA lần lượt là 1,0 mg/l, 1,5 mg/l, 2,0 mg/l cho thấy tỷ lệ ra rễ và số rễ giảm dần, bởi vì NAA ở nồng độ cao gây ứcchế chồi phát triển, chồi yếu nên số lượng rễ hình thành cũng giảm, rễ sinhradài và nhỏ. 4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ của cây lan hàiTr ần liên Than hoạt tính là một hợp chất vô cơ thường được sử dụng trong giai đoạn ra rễ trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. THT có vai trò là tạo điều kiện tối cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinhtrưởng thực vật. Ngoài ra, THT còn có khả năng làm giảm hiện tượng thuỷ tinh thểở một số loài thực vật. Để số mẫu nuôi cấy có thể ra nhiều rễ với chất lượngrễ tốt, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng nồng độ NAA0,4 mg/l thích hợp nhất cho quá trình ra rễ kết hợp với THT ở các hàm lượng khác nhau đểthử nghiệm khả năng ra rễ của cây lan .
47 Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ cây lan hài Trần liên (sau 6 tuổi nuôi cấy) Nồng độ Số mẫu Tổng số Công Nồng độ Tỷ lệ mẫu Chất lượng NAA nuôi cấy chồi ra rễ thức THT (g/l) ra rễ (%) rễ (mg/l) (mẫu) (chồi) CT 1 0,0 30 20 73,33 Ngắn, mập CT 2 0,5 30 24 80 Ngắn mập 0,5 CT 3 1,0 30 27 90 Dài mập CT 4 1,5 30 26 86,67 Dài nhỏ CT 5 2,0 30 23 78 Dài nhỏ LSD05 5,5 CV (%) 6,2 100 90 90 86.67 80 78 80 73.33 70 60 50 Tỷ lệ mẫu ra rễ (%) 40 30 20 10 0 CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 Biểu đồ 4.7. Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với than hoạt tính Từ kết quả nghiên cứu cho thấy : Ở chỉ tiêu số lượng rễ: Với giá trị LSD05 đạt 5,5% các công thức thí nghiệm có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Số lượng rễ thấpnhất ở công thức đối chứng với 20 rễ, số lượng rễ cao nhất khi bổsung THT 1,0 g/l (CT3) với 27 rễ. Khi tăng dần hàm lượng THT thì đồng thời số lượng rễgiảm
48 dần xuống. Nguyên nhân là do THT 1 g/l tạo điều kiện cho cây sinh trưởng tốt nhất nên tạo nhiều rễ nhất, tuy nhiên hàm lượng THT tăng cao vượt quá ngưỡng cần thiết sẽ ức chế cây sinh trưởng và phát triển nên số lượng rễ sinh rathấp. Tỷ lệ cây ra rễ với giá trị LSD05 đạt 5,, Cặp CT2 và CT5 có sự sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, các công thức khác trong thí nghiệm đều có sự sai khác nhau có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Các công thứccó bổ sung than hoạt tính đều có tỷ lệ mẫu ra rễ cao hơn công thức đối chứng không bổ sung than hoạt tính (CT 1). Ở CT3 với hàm lượng than hoạt tính 1,0 g/l cho tỷ lệ mẫu rễ cao nhất là 90%. Tăng dần hàm lượng than hoạt tính từ 1,5 – 2,0 g/l tương ứng với CT4, CT5 thì tỷ lệ mẫu ra rễ có xu hướng giảm dần. Ở chỉ tiêu chất lượng rễ: Các CT1, CT2, CT5 cho chất lượng rễ ngắn, mập. Ở CT3 và CT4 tương ứng với hàm lượng than hoạt tính 1,0 ; 1,5 g/l cho rễdài và mập. Ở công thức đối chứng không bổ sung than hoạt tính có số mẫu ra rễít nhất. Ở các công thức có bổ sung than hoạt tính, hàm lượng than hoạt tính tăng thì khả năng ra rễ cùa cây cũng tăng, số lượng rễ tăng. THT 0,5 g/l (CT2) tạo điều kiện tối kích thích chồi ra rễ nhiều hơn CT1 (công thức Đ/c). Ở CT3môi trường nuôi cấy có THT 1,0 g/l, ở hàm lượng này, THT thúc đẩy cây ra rễ nhanh và mạnh nhất. Tuy nhiên khi tăng dần hàm lượng THT lên 1,5 g/l (CT4) và 2 g/l (CT5) thì ánh sáng không thể chiếu tới rễ mọc trong các bình nuôicấy nên sẽ hạn chế sự phát triển của rễ, đồng thời THT ở hàm lượng cao sẽ ngăn cản quá trình trao đổi chất của chồi nên cũng hạn chếsự hình thành rễ của chồi. 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan Đưa cây ra ngoài vườn ươm là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích nghi với điều kiện thay đổi của nhiệt độ, độ ẩm, sự ấm t nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn. Việc lựa chọn giá thể phù hợp để ra cây ngoài vườn ươm là ộm t khâu phải thực hiện tỉ mỉ và thận trọng. Giá thể phù hợp là giá thể cho tỉ lệ cây sống cao, cây sinh
49 trưởng, phát triển tốt.Vì vậy, thành công của giai đoạn này có ý nghĩa quan trọng quyết định tới hiệu quả nhân giống Để nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan , chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên trên các loại giá thể khác nhau: sơ dừa, dớn, đất, than, vỏ thông. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.8: Bảng 4.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan Trần liên Tỷ lệ Chiều Công Số cây Số cây Số cây Tỷ lệ Loại cây cao thức ra sống chết cây chết giá thể sống cây (CT) (cây) (cây) (cây) (%) (%) (cm) CT 1 Đất 30 7 7 18 23,33 4 CT 2 Than 30 28 28 2 70 5 CT 3 Sơ dừa 30 21 16 4 93,33 5,5 CT 4 Dớn 30 16 21 7 53,33 4 CT5 Vỏ thông 30 13 13 17 43,33 4 LSD05 7,5 CV% 9,1 30 28 25 21 20 16 15 13 10 7 5 0 CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT5 Tỷ lệ cây sống (%) Biểu đồ 4.8. Tỷ lệ sống lan ảnh hưởng của giá thể
50 Bảng kết quả ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng vàphát triển của cây con: Với giá trị LSD05 đạt 7,5% các công thức thí nghiệm có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Giá thể sơ dừa cho tỷ lệ cây sống đạt 93,33%, chiều cao cây là 5,5 cm; các giá thể còn lại cho tỷ lệ cây sống là 53,33%, 43,33%, 70%, 23,33%; chiều cao cây đạt 4 cm từ đó thấy giá thể sơ dừa ảnh hưởng đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây conin vitro ngoài vườn ươm thì chỉ tiêu tỷ lệ cây sống là quan trọng nhất.
51 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kếtlu ận Sau một thời gian nghiên cứu và thử nghiệm nuôi cấy lanhài Trần Liên. Trong khuôn khổ thí nghiệm chúng tôi đưa ra một số kết quả sau: - Dung dịch H2O2 25%, thời gian ngâm mẫu 15 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt cao nhất là 65,55%. - Môi trường tốt nhất cho tái sinh phôi lan là môi trường MS với tỷ lệ tái sinh là 66,67%. - Hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng tốt nhất cho giai đoạn nhân nhanh chồi lan hài TrầnLiên là: 2,0 mg/l BA + 1,0 mg/lKinetin+1,0mg/l TDZ bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho hệ số nhân đạt 2,83 lần. - Hàm lượng NAA và THT tốt nhất cho giai đoạn ra rễ là 0,5mg/l NAA+ 1g/l THT tỷ lệ ra rễ là 90%, chất lượng rễ dài và mập. - Gíá thể thích hợp nhất để đưa ra vườn ươm là giá thể sơ dưà 93,33% với chiều cao cây là 5,5cm. 5.2. Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu hợp chất hữu cơ và hàm lượng đường, agar và một số thành phần khác đến khả năng tái sinh, nhân nhanh lan
52 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng việt 1. Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp(2008), Lan Hài Việt Nam, Nxb Giao thông Vận tải TP Hồ Chí Minh. 2. Nguyễn Công Nghiệp (2006), Trồng hoa lan, Nxb Trẻ. 3. Nguyễn Đức Thành (2000),Nuôi cấy mô tế bào thực vật– Nghiên cứu và ứng dụng, Nxb Nông nghiệp. II. Dịch từ tiếng nước ngoài 4. Nguyễn Tiến Hiệp, Phan Kế Lộc và Averyanov L. V. (1999),”Một vài số liệu mới về loài Pinopsida ở dải Bắc Trường Sơn, Hội thảo về đa dạng sinh học phía Bắc Trường Sơn, Đại học Quốc gia Hài Nội, trang 104-108. 5. Phan Kế Lộc, Averyanov L. V., Nguyễn Tiến Hiệp và NguyễnQuốc Bình,(1999),”Số liệu mới về hệ thực vật trong khu vực Ngọc Lĩnh và cácvùng lân cận ở huyện Đắk Glei, tỉnh Kon Tum”, Tạp chí Lâm nghiệp Việt Nam (Hà Nội), số 12, trang 35-37. 6. Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp và Averyanov L. V. (1999a),“ Một số loài và quần xã thực vật bị đe doạ trong dãy núi đá vôi của tỉnh Cao Bằng cầnđược bảo vệ trong khu bảo tồn mới được đề xuất”, Tạp chí Lâm nghiệp Việt Nam (Hà Nội), số 12, trang 35-36. III. Tiếng Anh 7. Bubeck S.K. (1973), A suty of Paphiopedilum meristem culture. Ph.D Thesis, Rutgers University Microfilm International, Ann Arbor, Mivhigan, The USA, p.109. 8. Chen T. Y., Chen J. T., Chang W. C. (2002), “Multiple shoot formation and plant regeneration from stem nodal explants of Paphiopedilum orchids”, In vitro Cell, Dev. Biol. Plant 38, p. 595-597.
53 9. Chen T. Y., Chen J. T., Chang W. C. (2004), “Plant regeneration through direct shoot bud formation from leaf culture of Paphiopedilum orchids”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 76, p. 11-15. 10. Hong P. I., Chen J. T., Chang W. C. (2008), “ Plant regeneration via protocorm-like body formation and shoot multiplication from seed-derived callus of a maudiae type slipper orchid”, Acta Physiol. Pant 30, p. 755-759 11. Huang L. C. (1988), “A procedure for asexual multiplication of Paphiopedilum in vtro, American Orchid Society Bulletin 57, p. 274-278. 12. Huang L. C., Lin C. J., Kou C. I., Huang B. L., Murashige T. (2001), “Paphiopedilum cloning in vitro”, Scientia Horticulturae 91, p. 111-121. 13. Koopowitz H., Hasegawa N. (1987), “An introduction to slipper orchids, in Koopowitz H., Hasegawa N (Eds), Novelty slipper orchids, breeding and cultivating Paphiopedilum hybirds”, Harper & Colloins publisher, Inc, New York, the USA, p. 19-31. 14. Liao Y. J., Tsai Y. C., Sun Y. W., Lin R. S., Wu F. S. (2011), “In vitro shoot induction and plant regeneration from flower buds in Paphiopedilum orchids”, In vitro Cell, Dev. Biol. plant 47, p 702-709. 15. Lin Y.H., Chang c., Chang W.C. (2000), “Plant regeneration from callus culture of a Paphiopedilum hybird”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 62, P.21-25. 16. Nieman D. (1980), “Plantlet formation of Paphiopedilum flower stem”, American Orchid Society Bulletin 49, p. 372-373. 17. Nhut D. T, Thuy D. T. T., Don N. T., Luan V. Q., Hai N. T., Tran Thanh Van K., Chinnappa C. C. (2007), “In vitro stem elongation of Paphiopedilum delenatiii Guillaumin and shoot regeneration via stem node culture”, Propagation of Ornamental Plants 7, p. 29-36. 18. Nhut D. T, Thuy D. T. T., Luan V. Q., Don N. T., Khiem D. V., Tran Thanh Van K. (2005), “ Micropropagation of Paphiopedilum delenatii via stem node
54 culture”, Vietnam – Korea International Symposium, Bio-Technology & Bio- System Engineering, p. 184-190. 19. Nhut D. T., Trang P. T. T., Vu N. H., Thuy D. T. T., Khiem D. V., Binh N. V., Tran Thanh Van K. (2005), “ A wounding method and liquid culture in Paphiopedilum delenatiii propagation”, Propagation of Ornamental Plants 5(3), p.156-161. 20. Sampolinski J. (1983), “Formation of plantlets on Paphiopedilum flower stem”, Orchid Review 91, p. 229. 21. Stewart J., Button J. (1975), “Tissue culture studies in Paphiopedilum”, American Orchid Society Bulletin 44, p. 591-599. 22. Van Staden J, stewart J (1975), “Cytokinins in banana fruit”, Zpflanzenphysiol, 76: 280-283 23. phụ lục 1 của công ước CITES và danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ –CP ngày 30/3/2006.
PHỤ LỤC 1 MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN HÀI TRẦN LIÊN (paphiopedilum tranlienuanum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO Hình ảnh tạo vật liệu vô trùng
Hình ảnh tái sinh phôi lan sau 6 tuần nuôi cấy Ảnh nhân nhanh chồi lan hài Trần Liên sau 6 tuần nuôi cấy
Ảnh ra rễ lan hài Trần liên sau 6 tuần nuôi cấy Cây lan Hài Trần Liên
PHỤ LỤC 2: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Bảng 1: Môi trường MS Amount to Stock Final take Bottle Component Solution concentratic preparation (g/l) (mg/l) (ml) NH4NO3 82,5 1.650,0 I 20 KNO3 95 1.900,0 MgSO4.7H2O 37 370,0 MnSO4.4H2O 2,23 22,3 II 10 ZnSO4.7H2O 1,058 10,6 CuSO4.5H2O 0,0025 0,025 CaCl2.2H2O 44 440,0 III KI 0,083 10 0,83 CoCl2.6H2O 0,0025 0,025 KH2PO4 17 170,0 IV H3BO4 0,62 10 6,2 Na2MoO4.2H2O 0,025 0,25 FeSO4.7H2O 2,784 27,85 V 10 Na2EDTA.2H2O 3,724 37,25 mg/100ml Nicotinic acid 100 0,5 0,5 Glycine 100 2,0 2,0 Vitamin Thiamine acid 100 0,1 0,1 Pyridocine HCl 100 0,5 0,5 Sucrose 30.0000,0 Agar 5.500,0 pH 5,6-5,8
Bảng 2: Thành phần cơ bản của môi trường B5 (Gamborg cs, 1976) Muối khoáng Nồng dộ (mg/l) (NH4)2SO4 134 CaCl .2H O 150 2 2 MgSO4.7H2O 246 KNO3 2.258 Đa lượng MnSO4.2H2O 10 KI 0.75 Na2MoO4.2H2O 0.25 Na2H2PO4.2H2O 150 ZnSO4.7H2O 2.0 Na2EDTA.2H2O 37.2 H3BO3 3 CoCl .6H O 0.025 Vi lượng 2 2 CuSO4.5H2O 0.025 FeSO4.7H2O 27.8 Myo- inositol 100 Nicotinic acid 1 Pyrodoxine HCl 1 Các chất hữu cơ Thiamine 10 Đường 30
Bảng 3: Thành phần cơ bản của môi trường WPM (Woody Plant Medium Lioyd và Mc Cown, 1980) Muối khoáng Nồng độ (mg/l) CuSO4.5H2O 0.25 Na2EDTA.2H2O 37.2 Vi lượng H3BO3 6.20 MnSO4.H2O 22.30 FeSO4.7H2O 27.8 ZnSO4.7H2O 8.6 CaCl2.2H2O 96 Ca(NO3)2.4H2O 556 Đa lượng KH2PO4 170 K2SO4 990 MgSO4.7H2O 370 NH4NO3 400 NaMoO4.2H2O 0.25 Myo – inositol 100 Pyridoxine HCl 0.5 Glycine 2.0 Các chất hữa cơ Nicotinic acid 0.5 Thiamine HCl 1.0 Agar 6 Đường 30