Khóa luận Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro

80 trang thiennha21 13/04/2022 7420

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_nghien_cuu_kha_nang_nhan_nhanh_lan_hai_moc_hong_pa.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ THU HOÀI Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀIM ỐC HỒNG (PAPHIOPEDILUM MICRANTHUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁPIN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khoá học : 2015-2019 Thái Nguyên, năm 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ THU HOÀI Tên đề tài “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI MỐC HỒNG (PAPHIOPEDILUM MICRANTHUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K47 - CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khoá học : 2015-2019 Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên, năm 2019
i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoaCông nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro ”. Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Bangiám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thànhđề tài nghiên cứu này. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo ThS. Nguyễn Thị Tình, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thờigian thực hiện đề tài. Đồng thời, em xin cám ơn ThS. Ma Thị Hoàn đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn làchỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Trong quá trình thực tập, cũng như là quá trình làm báo cáo thực tậpthời gian có hạn không tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiệnhơn. Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạnđồng nghiệp sức khoẻ, thành công trong cuộc sống. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 03 tháng 6 năm 2019 Sinh viên thực hiện Dương Thị Thu Hoài
ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảotồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1] 8 Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 25 Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng củadung dịch HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) 35 Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng củamột số môi trường đến khả năng tái sinh chồi lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) 37 Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanhchồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). 39 Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh lanHài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) 41 Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy ) 44 Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng củadịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) 47 Bảng 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P.micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) 49 Bảng 4.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) 51
iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum micranthum tại nhà lưới khoa CNSH-CNTP 11 Hình 2.2. Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật Error! Bookmark not defined. Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ của cây lan Hài P.micranthum 28 Hình 4.1. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7ngày nuôi cấy) 36 Hình 4.2. Một số hình ảnh tạo vật liệu vô trùng. 37 Hình 4.3. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum 38 Hình 4.4. Hình ảnh ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) 39 Hình 4.5. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). 40 Hình 4.6. Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). 41 Hình 4.7. Biêu đồ ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh lan HàiP. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) 42 Hình 4.8. Hình ảnh ảnh nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy ). 43 Hình 4.9. Biểu đồ ảnh hưởng của BA tốt nhất kết hợp với Giberellin đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) 45 Hình 4.10. Hình ảnh ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy ) 46 Hình 4.11. Biểu đồ ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum(sau 20 ngày nuôi cấy ) 47
iv Hình 4.12. Hình ảnh ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) 48 Hình 4.13. Biểu đồ ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) 50 Hình 4.14. Hình ảnh ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) 51 Hình 4.15. Biểu đồ ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum(sau 40 ngày nuôi cấy ) 52 Hình 4.16. Hình ảnh ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) 53
v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT B5 : Gamborg cs, 1976 BAP : 6-Benzyl amino purine CS : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation – Hệ số biến động Đ/C : Đối chứng LSD : Least Singnificant DifferenceTest MS : Murashighe và Skoog, 1962 MT : Môi trường GA3 : Gibberellic acid NAA : α-Napthalene acetic acid IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid IUCN : International Union for Conservation of Nature and Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế P. micranthum : Paphiopedilum micranthum P. malipoens : Paphiopedilum malipones WPM : Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980
vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v MỤC LỤC vi Phần 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích nghiên cứu 2 1.3. Yêu cầu của đề tài 3 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài 3 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Giới thiệu về lan Hài (Paphiopedilum) 4 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc 4 2.1.2. Đặc điểm hình thái 5 2.1.3. Sinh thái 6 2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam 7 2.2. Tổng quan về lan Hài P. micranthum 10 2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bốlan Hài P. micranthum ở Việt Nam 10 2.2.2. Hình thái 10 2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng giống lan hàiP. micranthum 11 2.2.4. Các phương pháp nhân giống vô tính lan Hài Mốc Hồng 12 2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật Error! Bookmark not defined. 2.3.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Error! Bookmark not defined. 2.3.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Error! Bookmark not defined. 2.3.3. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 13
vii 2.3.4. Môi trường dinh dưỡng 14 2.3.5. Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào 18 2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước 19 2.4.1. Trên thế giới 19 2.4.2. Trong nước 21 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 25 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 25 3.1.2. Hoá chất sử dụng 25 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 25 3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 26 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu 26 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu 26 3.2.3. Thời gian nghiên cứu 26 3.3. Nội dung nghiên cứu 26 3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian cuả dung dịch khử trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. 26 3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh mầm ngủ lan Hài P. micranthum. 26 3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ đoạn thân mang mầm ngủ. 26 3.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan Hài P. micranthum. 27 3.4. Phương pháp nghiên cứu 27 3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 27 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống 28 3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 28 3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 33
viii 3.5.1. Thu thập số liệu 33 3.5.3. Phương pháp sử lý số liệu 34 Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của dungdịch khử trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng 35 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum 37 4.3. Kết qủa nghiên cứu của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ đoạn thân mang mầm ngủ 39 4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng cuả NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum 39 4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum 41 4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum 43 4.3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum 46 4.4 .Kết quả nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ 48 4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum. 49 4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P.micranthum 51 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 5.1. Kết luận 54 5.2. Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Việt Nam là một trong các quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất trên thế giới, được công nhận là một quốc gia ưu tiên cao cho bảo tồn toàn cầu. Hệ sinh thái của Việt Nam giàu có và đa dạng với nhiều kiểu rừng, nhiều loài động, thực vật độc đáo không có ở nơi nào trên thế giới [14]. Phong lan mọc khắp nơi trên thế giới tuy nhiên tập trung những loài phong lan đẹp nhất phải kể đến hai khu vực là Châu Mỹ và Châu Á nhiệt đới. Việt Nam nằm trong khu vực châu Á nhiệt đới - nơi phát sinh một trong nhiều loài phong lan đẹp. Theo đánh giá của giáo sư Averyanov, Việt Nam có 158 chi và khoảng 900 loài. Theo tác giả Trần Duy Quý và cs đã thống kê và phát hiện, ở Việt Nam có 160 chi và 1004 loài lan. Đây là quốc gia có nguồn tài nguyên thực vật và đặc biệt là họ Lan phong phú bậc nhất trong khu vực Châu Á. Trong các loài phong lan Việt Nam phải kể đến lan hài, lan hài Việt Nam không chỉ đẹp -phong phú mà đặc hữu hẹp chỉ có ở Việt Nam. Theo Tác giả Trần Duy Quý không có nơi nào mà sự đa dạng của các loài lan hài lại cao hơn ở Việt Nam Có thể thấy 22 loài lan hài thuộc chi Paphiopedilum cùng với vô số các dạng lai tự nhiên của chúng đã tạo lên sự đa dạng cho các loài lan hài Việt Nam. Các loài lan hài Việt Nam đa dạng về màu sắc và kiểu dáng không chỉ thu hút người chơi lan trong nước mà còn hấp dẫn khách chơi lan ngoại quốc do vậy những người đi săn lan hài sẵn sàng trèo lên những vỉa đá dốc ở những vùng xa xôi hẻo lánh để khai thác. Việc thu hái như vậy đã gây nên những tác động tàn phá thiên nhiên nghiêm trọng. Điều này đã đẩy các loài lan hài của Việt Nam rơi vào nguy cơ tuyệt chủng, hoặc mức độ cực kỳ nguy cấp [18]. Hài Mốc Hồng hay Hài ngọc nữ(Paphiopedilum micranthum) là một trông số loài lan có hoa to, màu sắc sặc sỡ, kiểu dáng đặc biệt với hình dáng của cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống như một chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa vàmôilà điều hấp dẫn nhất đối với những người trồng và lai tạo LanHài. Hoa thường nở vào dịp tết. Vùng phân bố của loài hẹp hiện chỉ tìm thấy ở miềnBắc Việt Nam (tập trung tại các tỉnh Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Thái Nguyên) và vùng Quảng Tây,
2 Quý Châu, Vân Nam (Trung Quốc). Là loài Hài rất quý mới được phát hiện và được ưa chuộng ở thị trường trong và ngoài nước [30]. Giống như thực trạng các loài lan Hài khác loài lan HàiP.micranthum cũng bị khai thác ồ ạt, cộng với phá nương rẫy khiếnchngs mất nơi sinh sống vì vậy lan Hài Mốc Hồng cũng bị đe dọa tiêu diệt và đang biến mất nhanh chóng khỏi nơi sống tự nhiên của chúng. Trước thực trạng bị đe doạ nghiêm trọng như vậy việc bảo tồn, phát triển loài lan này hết sức cần thiết. Đặc thù riêng của lan Hài P. micranthum là cây sinh trưởng chậm, tỷ lệ nảy mầm của hạt trong tự nhiên thấp người dân khai thác ồ ạt đã đẩylan Hài Mốc Hồng có nguy cơ rơi vào danh mục các loài nguy cấp cần phải bảo tồn. Vì vậy việc nghiên cứu nhân giống lan Hài rất được chú trọng nhằm mục đích thương mại và bảo tồnnguồn gen thực vật quý hiếm. Trước đây, các nhà nghiên cứu đã tiến hành nhângiống các loài lan Hài bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như chất lượng cây không đồng đều, chất lượng cây thấp và số lượng cây ít Để khắc phục được điều này, phương phápnhân giống in vitro đã ra đời nhằm khắc phục những hạn chế trên. Phương pháp này cho số lượng cây lớn, chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh. Đây là điều mà phương pháp truyền thống không thực hiện được. Hiện nay, nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đang phát triển mạnh mẽ có thể tạo ra số lượng cây con lớn, sạch bệnh, ổnđịnh về mặt di truyền trong một thời gian ngắn và đáp ứng được giá cả phải chẳng củathị trường được coi là một giải pháp lý tưởng để bảo tồn loài lan Hài khỏi nguy cơbịtuyệt chủng. Trước thực trạng đó chúng tôi tiến hành thực hiện đềtài: “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro ”. 1.2. Mục đích nghiên cứu Nhân giống thành công chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro.
3 1.3. Yêu cầu của đề tài - Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch HgCl2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng. - Xác định ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng tái sinh mầm ngủ lan Hài P. micranthum. - Xác định môi trường nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum tái sinh từ mầm ngủ. - Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan HàiP . micranthum. 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đềtài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổsungvào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn. - Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thựctế cũng như tác phonglàm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này. - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học mới vềnhân giống cây lan Hài P. micranthum bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống lan HàiP. micranthum bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, tạo ra số lượng lớn cây lan Hài P. micranthum góp phần bảo tồn giống hoa quý hiếm trước nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật liệucho nghiên cứu khoa học.
4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về lan Hài (Paphiopedilum) 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc 2.1.1.1. Phân loại Lan Hài (Paphiopedium) là một nhánh của họ Lan (Orchidaceae) thuộc bộ Lan (Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), nghành hạt kín (Angiospermatophyta). Lan Hài là một nhóm rất đặc trưng trong họ lan. Chúng dễ dàng nhận ra bởi cấu trúc hoa đặc biệt khác thường với một cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống như một chiếc Hài, nằm ở vị trí thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ ngoài ặđ c sắc có thể dễ dàng phân biệt với các loại lan khác. Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5chilà: - Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là Hài Vệ nữ, phân bốở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc. - Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ. - Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Átừ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon. Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông, Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ Lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae) [1]. 2.1.1.2. Nguồn gốc Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này được tìm thấy chủ yếu ở Trung Quốcvà miền Bắc Việt Nam, mỗi loại trong chi này đều có khu phân bố rất hạnchế. Hầu như tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis cósáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao vòng tronggọi
5 là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài vàbanhị đực ở vòng trong). Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực và sự dính liền giữanhịđực hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa cơ bản nhất dẫn đến sự tiến hoá của họLan.Sự giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhóm lan có ba, hai haymột nhị đực tồn tại trong hoa. Trong họ Lan, chi lan Hài (thuộc tôngCypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồn tại trong hoa [1], [19]. 2.1.2. Đặc điểm hình thái Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên ngoài rất đa dạng tuy nhiên chúng đều mang những đặc điểm hình thái: - Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò. Tất cả các loàiđều có hânt rễ nhưng đa số rất ngắn [1]. - Lá: Thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lênnhautrên thân. Độ dài của lá có thể từ3- 50 cm. Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nổi rõ.Mặt dưới lá có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gốc lá. Lá của cácloàiđiển hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng nước và cứng [1]. - Cụm hoa: Thường thẳng đứng hay cong. Một số loài có cuống hoanằm ngang, một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, nhưng hầu hầu các loài đều cócuống hoa dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ. Tuy nhiên cũng cóloài có cụm hoa mang hai hoa, xong rất hiếm. Trục cụm hoa có lông tơ dầy và ngắn haycó lông nhung hoặc nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác nhautùy từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hìnhbầudục tròn. Lá hoa thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có lông ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoanhẵn. - Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một láđàihợp và ba cánh hoa ở vòng trong. Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường nổi bậtvới các vạch hay chấm ở mặt trong. Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vịtríthấp
6 hơn và hướng xuống phía dưới. Láđài hợp nằm phía sau của môi thường có một màu tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng. Cả hai lá đều thườngcó lông tơ dày ở mặt ngoài [1]. Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xoè xuống dưới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng haytròn. Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh. Cánh hoa giữathứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao hoặchình chiếc hài. Môi dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy, có lông ở mặt trong và nhẵn ở mặt ngoài. Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cộtnhị- nhuỵ. Hai nhị đực hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và hai bên cuốn cột. Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi này. Hầu hết cácloài lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn [1]. - Quả: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp. Quả mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Quả thường chín trong điều kiên tự nhiên sau khi thụ phấn từ sáu đến mười tháng [1]. - Hạt: Có hình bầu dục, hình con suốt chỉ ngắndạng thuôn dài hay hẹp và thường có chiều dìa từ 0,4 – 1,1 mm. Phôi nhỏ, dài từ 0,3 – 0,4 mm. Hạt không có nội nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên [1]. 2.1.3. Sinh thái Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng. Một nhóm phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lên đến1600m, nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở độcaotừ700- 2200m. Ngoài ra, có một vài cá thể trong nhóm này còn mọc bám ở các khe nứthay rìa của các vách núi dựng đứng đá granit. Lan Hài của Việt Nam có thể sống trên đất, bám đá và phụ sinh mùn. Cácloài sống trên đất thường mọc ở nơi có ít ánhsáng của tán cây rừng, ở nơi sườn núi dốc, các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn. Các loài lanHàimọc trên đá thường mọc dưới bóng cây của kiểu rừng ít khép tán, chủ yếu là cácmỏmđá và ngay bên dưới các đường đỉnh. Các loài phụ sinh mùn chủ yếu sống bám trênvỏ
7 cây gỗ trong các vùng rừng mây mù ẩm độ cao 1200-1500m. Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, ẩm độcao. Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng thường phải trải qua một giai đoạn khô hạn. Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng nước là hướng thíchnghi tốt để cây có thể sống sót được qua đợt khô hạn định kỳ và chúngsẽ nhanh chóng phục hồi khi mùa mưa trở lại. Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sự cómặtcủa các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ ánh sáng là các nhân tố quan trọng trongsự hình thành và phát triển của quần thể lan Hài. Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều nhau ở các hướng của sườn núi. Nhưng trong các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng phát triển ởcác sườn núi phía Bắc, đông Bắc và tây Bắc của núi. Ngày nay, thường chỉ tìm thấy lan Hài mọc thành từng đám nhỏ. Các nơi sống tự nhiên bị phá huỷ bởi con người,sự thay đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái lan để bán là những nguyên nhân chính gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của lan Hài trên khắp các vùng của Việt Nam [1]. 2.1.4. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam Hiện nay, nhu cầu về hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế giới cũng như trong nước đang ngày càng gia tăng. Vì vậy, việc trồng lan đã trở thành một ngành kinh tế của nhiều nước trên thế giới và nhiều nước đang phát triển khuvực Đông Nam Á. Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được yêu chuộng, sưutầm, tìm kiếm nhiều nhất thế giới. Với sự hiện hữu của hơn 22 loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là một trong các quốc gia cónguồn lan Hài tự nhiên phong phú nhất. Không những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trịthẩm mĩ ao,c được thế giới ưa chuộng [5]. Điều này đã tạo nên tình trạng thu thập và uxuất khẩ lan Hài một cách ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trongtự nhiên. Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay,lan Hài càng biến mất nhanh chóng[ 6]. Dựa trên những nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài lanHài trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe doạ tuyệt chủng của tổchức
8 bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1] Tình trạng Tên loài (tiếng Latinh) Tên loài (tiếng Việt) Đã bị tuyệt chủng P. vietnamense Hài Việt ngoài thiên nhiên Đang bị tuyệt p. delenatii Hài Đỏ chủng trầm trọng P.  aspersum Chưa rõ tên gọi P. barbigerum var. lokianum Hài Lộc P. callosum Hài Vân P. dianthum Hài Xoắn P. emersonii Hài Hương Lan P. gratrixianum Hài Đuôi công P. hangiannum Hài Hằng Đang bị tuyệt P. helenae Hài hê len chủng P. henryanum Hài Henry P.  herrmannii Hài Herman P. malipoense var. jackii Hài Jack P. malipoense Hài Giáp P. micranthum Hài Mốc Hồng P. purpuratum Hài Tía P. tralienianum Hài Trần liên P. appletonianum Hài Cánh Sen P. concolor Hài Gia Định Sắp bị tuyệt chủng P. hirsutissimum var. chiwuawnum Hài Tiên biến dị P. hirsutissimum var. esquirolai Hài Tiên P. villosun var. annamense Hài Lông P.  affine Hài Hoà Thiếu dẫn liệu P.  datalanse Chưa rõ tên gọi P. villosum var. boxalli Chưa rõ tên gọi Trên thực tế, mức độ đe doạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lan HàiViệt Nam được chỉ ra ở bảng trên đây đã bị thay đổi nhiều trongthời gian gần đây do sự suy giảm nhanh các quần thể được biết. Trong những năm gần đây, qua các đợt điều tra thực địa đã phát hiện ra tốc độ phá huỷ mạnh mẽ trên diện rộng của nhữngkhu rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu trên các đỉnh núi đá vôi [17], [18], [19]. Sự thay đổi môi trường sống do con người gây nên và việc thu muavớisố lượng lớn để buôn bán hiện nay là nhân tố chính làm suy giảm nhanh chóng sốlượng
9 các loài lan Hài. Tất nhiên, việc phá huỷ nơi sống tự nhiên của chúng có liên quan đến tốc độ phát triển kinh tế và sự gia tăng dân số của Việt Nam. Các loài lan Hài rấtnhạy cảm với sự thay đổi của môi trường nên bị đe doạ tuyệt chủng nhiềuhơn và sẽ biến mất trước tiên sau khi nơi sống tự nhiên của chúng bị suy thoái. Yếu tố thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài lan Hài ở Việt Namtrong những năm gần đây là việc thu hái trên diện rộng của người dân địaphương để bán và xuất khẩu một lượng lớn các loài lan Hài mọc trong tự nhiên ra nước ngoài. Dokhông có biện pháp quản lý có hiệu quả việc thu mẫu các loài thực vật hoang dã vớisựgiàu có nổi bật của lan Hài đặc hữu của Việt Nam đã khuyến khích việc thu thập các loài lan từ thiên nhiên với số lượng lớn trên toàn bộ lãnh thổ [1]. Nếu không có các biện pháp bảo vệ các khu rừng nguyên sinh khẩn cấp vàhiệu quả thì chắc chắn các sinh vật sẽ phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng trong tương lai gần. Điều này sẽ kéo theo sự tuyệt chủng của một số lượng lớn các loài hiếmvàđặc hữu. Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trìnhquốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng. Một côngtrình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này làmô tả các giống lan Hài ở Việt Nam của nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004 [1]. Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam.Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đãđang bảo tồn các loài lan Hài như: - Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắk Lắk), Núi Bà (Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum. - Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn loài P. callosum. - Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn P. dalatensis. - Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò (Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P. micranthum.
10 - Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P. emersoii, P. hangianum, P. malipoense varijackii. - Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài P.gratrixianum. - Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae. - Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha đang bảo tồn loài P. malipoense. Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài. Đầu tiên phải kế đến PGS. TS. Dương Tấn Nhựt, người đầu tiên nuôi cấy thành công lan hài Hồng năm 2005 [27, 28]. Sau đó đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã nuôi cấyin vitro thành công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằng, hài Tam Đảo bằng các phương pháp nuôi cấy mô khác nhau. 2.2. Tổng quan về lan Hài P. micranthum 2.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố lan Hài P. micranthum ở Việt Nam 2.2.1.1. Nguồn gốc Paphiopedilum micranthum được tìm thấy từ miền bắc Việt Nam đến phía tây và bắc Quảng Tây, đông nam Vân Nam và phía tây Quý Châu (Trung Quốc), ở độ cao 360 - 1600 m. Cây được tìm thấy trên các vách đá, kẽ nứt bao gồm xác lá mục, đá vôi và đất sét. Khu vực này chịu sương mù vào mùa đông và mưa lớn từ cuối mùa xuân đến mùa hè. 2.2.1.2 Phân bố Lan Hài P.micranthum chủ yếu ở miền Bắc Việt Nam (tập trung tại các tỉnh Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Bắc Kạn) và vùng Quảng Tây, Quý Châu, Vân Nam (Trung Quốc)[20]. 2.2.2. Hình thái - Dạng thân: Thân cỏ mọc trên đất hay đá, có thân rễ ít nhiều kéo dài với đường kính 2-3 mm. - Dạng lá: Có 3 - 5 lá xếp thành 2 dãy; thân rễ có đường kính 2 - 3 mm, dài đến 25 cm. Lá thường hình thuôn - bầu dục, dài 5 – 12, rộng 1,5 - 2 cm, mặt trên màu lục với các đốm to màu lục thẫm, mặt dưới có nhiều chấm màu tím - tía.
11 - Dạng hoa: Cụm hoa có cuống dài 9 - 25 cm, mang 1 hoa. Hoa không có mùi, thường màu hồng hay vàng nhạt, thẫm hơn về chóp, rộng 3 cm, dò hoa dài 9 - 25 cm, hoa như một chiếc muôi lớn dài 10 cm, rộng 5 - 6 cm có mạng gân màu đỏ tía thẫm. Lá đài hình trứng dài 1,5 - 3,6 cm, rộng 1,7 - 3 cm, hơi uốn ngược lại ở mép bên, từ hình bầu dục tới hình trứng ngược, nhọn và có rãnh tới chóp. Cánh hoa hình trứng ngược rộng, chóp tròn dài 1,9 - 4,3cm, rộng 2,3 - 4,4 cm, có lông mép và nhiều lông dài màu trắng ở mặt trong. Môi hình trứng rộng, lõm sâu, mép cuốn vào trong dài 5 – 10, rộng 3,4 - 5,6 cm. Nhị lép lồi, hình thuôn rộng hay hình bầu dục, dài 5 - 10 mm. - Dạng quả: Dạng quả nang dài, 3 gờ, hình trụ, mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnhnứt. Quả chín trong điều kiện tự nhiên sau khi thụphấn từ 6 đến 10 tháng. - Dạng rễ: Rễ chùm, màu nâu. Hình 2.1. Hình ảnh về cây lan Hài Paphiopedilum micranthum tại nhà lưới khoa CNSH-CNTP 2.2.3. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng giống lan hài P. micranthum 2.2.3.1. Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng - Nhiệt độ: Lan Hài được phân chia thành 2 nhóm chính, theo quy luật chung, những cây có lá màu xanh thường thích sống ở nơi có nhiệt đô lạnh đến trung bình, ban đêm là từ 13-16°C, ban ngày là 18-24°C. Các loài Hài có lá vằn thích hợp với điều kiện nhiệt từ trung bình đến ấm, ban đêm là16-18°C, ban ngày là 21-25°C. - Ánh sáng: Lan Hài không cần ánh sáng mặt trời đầy đủ. Hầu hết lanHàiưa
12 ánh sáng yếu, điều kiện ánh sáng nhân tạo cho cácloài lan từ 11.000-22.000 lux [25]. Nếu lá bị vàng hoặc phát hoa ngắn chứng tỏ chúng đang dư ánh sáng, nếu lámàuxanh đậm và mềm hoặc phát hoa dài, yếu, chúng đang thiếu ánh sáng - Độ ẩm không khí: Không khí ẩm và lưu thông tốt làrất cần thiết, nhất là trong mùa hè, giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm nấm bệnh và giữ cho cây không bị khôquá nhanh. Độ ẩm có thể được nâng lên bằng cách đặt chậu cây lên trên các khay sỏinhẹ với 50% độ ẩm là lý tưởng. 2.2.3.2. Nhu cầu bón phân Phân bón: Có thể bón phân NPK với tỉ lệ 20:20:20 hoặc 14:14:14, bổsung khoáng Ca2+ 40mg/l và Mg2+ 20-30mg/l. Tưới nước đậm trước và sau khi bón phân, nếu thấy đầu lá bị nâu khô thì nên dừng hẳn việc tướiphân. Sang chậu khi giá thể trồng có dấu hiệu mục nát [6]. 2.2.3.3. Giá thể trồng P. micranthum có thể trồng trên giá thể gồm đá vôitrộn thêm chất lá mục, than củi, xỉ than tổ ong, sỏi, vỏ thông và có thể tưới thêm phân bón 2 lần/ tuần trong suốt mùa sinh trưởng của cây lan [8]. 2.2.4. Các phương pháp nhân giống vô tính lan Hài Mốc Hồng - Phương pháp tách chiết thông thường: Lan Hài Mốc Hồng là loài đơn thân nên chỉ có thể tách chồi non rakhỏi cây mẹ, trồng vào chính giữa chậu mới. Cần cột chặt cây vào chậu bằng một cây tựa sau đó phun một dung dịch NAA0,1ppmvà vitamin B1 và treo cây vào nơi ẩm mát, thoáng. Sau khi cây bén rễ thì bổ sung thêm chất trồng vào chậu sau đó đặt cây vào nơi có điều kiện ánh sáng thích hợp chosựphát triển lâu dài của cây [6]. - Phương pháp cấy mô: Đây là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống lan Hài trên quy mô công nghiệp, cây con được sản xuất hoàn toàn giống nhau từ một cây bố mẹ. So với phương pháp tách chiết thông thường có tốc độ phát triển 1cây/năm thì phương pháp nuôi cấy mô sẽ sản xuất được khoảng 4 triệu cây/năm. Các loài lanHài thường được nuôi cấy trên môi trường Murashige & Skoog 1962, Heller, Vacin & Went có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng như NAA, 2,4D, BA, TDZ, Kinetin trong điều
13 kiện vô trùng hoàn toàn. Nhờ tiến bộ khoa học, ngày nay người ta có thể cấy nhiềubộ phận khác nhau của cây lan để hình thành các thể giống protocorm như đỉnh sinh trưởng hay chồi bên, cọng hoa, lá, đốt thân hoặcrễ [6]. 2.3. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy. Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy giữ một vị trí quan trọng trong lịch sửphát triển nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Vào thời kì Haberlandt tiến hành các thínghiệm nuôi cấy tế bào biệt lập, hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng khoáng còn hạn chế, đặc biệt là vai trò của các chất kích thích sinh trưởng hầu như chưa đượckhámphá. Chính vì vậy mà Haberlandt đã không thành công. 2.3.1. Vật liệu nuôi cấy Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô– tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quanhay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá ), các cấu trúc của phôi (lá mầm,trụlá mầm ), các cơ quan dự trữ (củ, thân, rễ ) [16]. Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau, trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vìvậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu,chất lượng cây lấy mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu,mụcđích và khả năng nuôi cấy [16]. Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương pháp phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hoá chất có khả năng tiêu diệtvi sinh vật. Hoá chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện: Cókhả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu. Hiệu 1quả vô trùngtuỳ thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật củahoá chất. Một số hoá chất thường được sử dụng hiện nay để vôtrùng mẫu là: Ca(OCl)2- hypoclorit canxi, NaClO-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2- thuỷ ngân clorua, chất kháng sinh(gentamicin, ampixilin ) [16].
14 2.3.2. Điều kiện nuôi cấy - Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấy được tiến hành trong điều kiện vô trùng gồm buồng cấy vô trùng, các dụngcụ cấy vô trùng và môi trường cấy vô trùng nhằm đảm bảo mẫu cấy sẽkhông bị nhiễm vi sinh vật. Điều kiện vô trùng có ý nghĩaế quy t định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro. Để tạo điều kiện vô trùng, buồng cấy phải dùng đèn tử ngoại chiếu trong 30phút sau đó được lau sạch bằng cồn 90°, dụng cụ và môi trường nuôi cấy thường đượckhử trùng ở 121°C trong 25-30 phút có khả năng diệt nấm và vi khuẩn [6]. - Ánh sáng: Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12- 18h/ngày. Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy [13]. Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo. Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000(lux), ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500(lux) người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 – 40(cm). - Nhiệt độ: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây. Tuỳ thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±20C [13]. 2.3.3. Môi trường dinh dưỡng Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ phận, các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫu cấy và mục đích nuôi cấynhư duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh [11].
15 Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thựcvật bao gồm các thành phần chính sau: 2.3.3.1. Nguồn Cacbon Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro không cón khả năng tự dưỡng do không tiến hành quang hợp đầy đủ. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôicấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn Cacbon cung cấp cho môi trường nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là saccharose với hàm lượngtừ20- 30 g/l. Ngoài ra còn có thể sử dụng các loại đường khác như fructose, rafinose, sorbitol, glucose, maltose, lactose, những loại đường này chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt [13]. 2.3.3.2. Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng Các chất vô cơ bao gồm thành phần khoáng đa lượng và khoáng vi lượng có trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng như là thành phầncơbản để tổng hợp chất hữu cơ [11]. Các dạng ion của muối khoáng đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hoà ápsuất thẩm thấu và điện thế màng [15]. - Nguyên tố đa lượng: Quan trọng nhất là các nguyên tố: N, P, K, Mg, Ca, Na, S [14] + Nitơ: Thường được sử dụng ở dạng- NO3 hoặc NH4+, hầu hết các loại thực vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hoá và tổng hớp nên các sản phẩm hữucơ. + Phospho: Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P cótác dụng như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường. + Kali: Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O + Canxi: Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O + Magie: Sử dụng chủ yếu là MgSO4 + Lưu huỳnh: Chủ yếu là SO4 - Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni các nguyên tố vi lượng bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế bào nuôicấy.
16 2.3.3.3. Vitamin Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Đại đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết, nhưng số lượng thấp, có thể không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin (vitamin B1), nicotinic acid, pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol. Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy [8]. - Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid [16]. - Vitamin B6 (Pyridocinen): Là coenzzyme quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất [16]. - Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp [16]. - Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hyđratcacbon [16]. 2.3.3.4. Các chất hữu cơ tự nhiên - Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin [16]. - Dịch thuỷ phân casein: Chứa nhiều amino acid [16]. - Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B [16]. - Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh [16 ] 2.3.3.5. Các thành phần khác - Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm một số chất hữucơ như acid hữu cơ, acid béo, cùng một số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấp một số chất dinh dưỡng cho tếbào, mô nuôi cấy [8]. - Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứcấp gây ức chế sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Ngoài ra, có thể sử dụng một số chất chống oxyhoá khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic [16].
17 2.3.3.6. pH của môi trường Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡng của mẫu từ môi trường nuôi cấy. Đa số pH của môi trường được điều chỉnh trong khoảng từ 5,5-6,0. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm do mẫu nuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ. 2.3.3.7. Các chất điều hoà sinh trưởng Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật. Hiệuquả của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điều hoà sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy [16]. Dựa vào hoạt tính sinh lý có thể phân chất điều hoà sinh trưởng làm 2nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm ức chế sinh trưởng. Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởngnhóm là thường được sử dụng [16]. - Nhóm Auxin: Được phát hiệ lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch, Sau đó, nhiều nhà khoa họv đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này. Auxin trongcơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong phấn hoa.Auxincó nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật.Cụthể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tínhhướng sáng và hướng đất. Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách). Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích thích sự phân chia của tế bào trụ bì– nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ biểu bì, Ngoài ra, auxin còn tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển củaquả và làm chậm sự rụng lá [16]. Các auxin thường được sử dụng là: NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA (các auxin tự nhiên). Hoạt tính bcuat các chất này được xếp theo thứu tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA, 2,4D. IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân huỷ trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy môi, NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ gây
18 độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus [6]. - Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích. Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ của hạt ngô non. Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim. Zeain có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn.Trongthực vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh. Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất. Cùng với auxin, cytokinin điều khiểnsự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thành chồi. Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ứcchếưu thế đỉnh. Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin. Ngoài ra cytokinin còn làm chậm sự già hoá [10]. Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sửdụngphổ biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin vơi tỷ lệ thích hợp có khảnăng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền nhiệt), ngoài ra có thểsử dụng TDZ, Diphenylurea [10]. - Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu từ dịch tiết của nâm bởi cácnhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Giberellin được tổng hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Giberellin cótácdụngchính trong việc hoạt hoá phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kich thước của chồi nuôi cấy. GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất [10]. 2.3.4. Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào Một qui trình nhân giống in vitro cơ bản gồm các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây mẹ. Cây mẹ cần phải sạch bệnhvà đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất thì khi nhân giống mới cho hiệu quả cao. Giai đoạn 2: Khử trùng mẩu cấy, ở giai đoạn này một phần thích hợp củathực vật được khử trùng và chuyển vào môi trường nuôi cấy trong điều kiện vôtrùng. Những mẫu cấy còn sống sau khi khử trùng sẽ được chuyển sang giai đoạn 3. Giai đoạn 3: Tăng sinh. Mục tiêu của giai đoạn này là tăng nhanh số lượng cá
19 thể bằng sự tự sinh phôi soma, tăng số lượng chồi bên, tạo chồi bất định. Các chồităng trưởng mạnh, đạt chiều cao thích hợp sẽ được chuyển sang giai đoạn 4. Giai đoạn 4: Ra rễ in vitro. Ở giai đoạn này những chồi đạt chiều cao thích hợp sẽ được chuyển sang môi trường kích thích rễ. Trong môi trường này cần phải bổsung auxin để cảm ứng rễ và nồng độ khoáng thường giảm sovới môi trường tăng sinh. Giai đoạn 5: Giai đoạn ra rễ in vitro, với những cây không ra rễ in vitro thì sẽ được chuyển ra vườn ươm để ra rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh. 2.4. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước 2.4.1. Trên thế giới Thông thường Paphiopedilum có thể được nhân giống bằng gieo trồng hạt hay tách cây con đã trưởng thành ra khỏi cây mẹ. Tuy nhiên, các phương pháp này cho hiệu quả nhân giống thấp nên không đáp ứng nhu cầu của thị trường. Vì vậy, phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tạo ra một lượng lớn cây con trong thời gian ngắn đã trở thành một giả pháp lý tưởng để bảo vệ lan Hài thoát khỏinguycơ tuyệt chủng. Các nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy mô lan Hài được thựchiện bởi Bubeck năm 1973. Kể từ đó nhiều nhà nghiên cứu đã cố gắng nhân giống lan Hài bằng nhiều phương pháp nuôi cấy sử dụng các bộ phận khác nhau của cây. Một số nghiên cứu đã thành công: Năm 1975, Stewart và cs tiến hành cảm ứng chồi bên để tạo ra mô sẹo, đôi khi có sự hình thành một vài cây con trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các mô sẹorất khó tái sinh, sau một thời gian nuôi cấy những mô sẹo này sẽ chết. Vì lý do này, hầu hết các nghiên cứu về nuôi cấy mô Paphiopedilum đều sử dụng nguồn vật liệu ban đầu từ hạt [24]. Năm 1980, Nieman đã tiến hành nuôi cấy chồi bên và cây con [26] và phương pháp này cũng được Sampolinski sử dụng cho nghiên cứu năm 1983 [21]. Năm 1988, Huang đã tiến hành nuôi cấy kéo dài câyin vitro, sau đó cảm ứng tạo chồi từ chồi nách của câyin vitro được nuôi cấy kéo dài [22]. Năm 2000, Lin và cs đã tiến hành nuôi cấy mô sẹo từ nguồn protocorm của hạt
20 một loài lan Hài lai và đã thu được một vài cây con trong ống nghiệm [25]. Năm 2001, Huang đã tiến hành nhân nhanh hạt giống lan Hàilai giữa P. philippinese và P. susan trong môi trường MS bổ sung với BAP 13 mM [23]. Năm 2002 và 2004, Chen và các cộng sự cũng báo cáo rằng có thể cảm ứngtạo chồi từ thân và lá của lan Hài P. philippinese khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4D 4,52mM và TDZ 4,5mM [20]. Năm 2005, Dương Tấn Nhựt đã nghiên cứu thành công gphươn pháp nhân nhanh giống lan Hài P. delenatii bằng phương pháp sử dụng hạt nảy mầmin vitro. Từ cây con in vitro, các mô sẹo được cảm ứng từ protocorm có nguồn gốc từ hạt, được nuôi cấy trên môi trường có chứa 2,4D và TDZ với nồng độ cao, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua bước hình thành PLB. Một phần mô sẹo có thểtái sinh được 3-7 chồi trong 3 tháng và chúng có thể tồn tại trên môi trường nuôi cấy trong 3 năm mà không mất đi khả năng tái sinh [26]. Ngoài ra, Dương Tấn Nhựt còn nghiên cứu thành công một phương pháp mới cho phép nhân nhanh giống lanP. delenatii là phương pháp gây vết thương trên phần gốc thân của cây conin vitro. Phần gốc sau khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung thêm TDZ, NAA, 2,4D sẽ hình thành mô sẹo và một số ít xuất hiện protocorm [27]. Năm 2007, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã nghiên cứu nhân giống thành công lan Hài Hồng qua các chồi tái sinh từ các đoạn thân của cây non được nuôi cấy kéo dài in vitro khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung TDZ 1,5 mg/l, BA 2 mg/l, NAA 0,5 mg/l, than hoạt tính 1 g/l, đường 30 g/l, agar 9 g/l [22]. Khi nuôi cấy trong bóng tối sẽ thu được chồi dài, màu vàng, yếu, còn khi nuôi cấy dưới ánh sáng đỏ có cườngđộ thấp sẽ thu được chồi có sự giãn cách giữa các lá dọc trên thâncây. Năm 2008, Hong và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của câycon giống P. alma Gavaert khi nuôi cấy trên môi trường MS có Kinetin 4,65mM [21] Năm 2011, Liao và các cộng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô sẹo của câycon hoàn chỉnh từ nụ hoa của P. deperle và P. armeni. Tuy nhiên, cần rất nhiều thời gian để cho cây lan Hài ra hoa vì vậy phương pháp này kém hiệu quả hơn các phương pháp khác [24].
21 Người ta cũng tiến hành phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào từ những dòng mô sẹo có nguồn gốc từ protocorm và nuôi cấy mô sẹo từ những loại mô khác của Paphiopedilum. 2.4.2. Trong nước * Về các nghiên cứu điều tra, sưu tập, lưu giữ, bảo tồn lan. - Đề tài “Điều tra tài nguyên di truyền các loài lan rừng Vườn quốc gia Cát Tiên (VQGCT) và nghiên cứu các biện pháp nhân nhanh để bảo tồn” của Tiến sỹ Nguyễn Văn Kết. - Khoa Nông Lâm thuộc trường Đại học Đà Lạt. VQGCT là nơi có sự tập trung với mật độ khá dày các loại lan rừng quý hiếm tại Việt Nam (ở đây có tới 100 chi và gần 400 loài trên tổng số 152 chi và 897 loài lan của cả nước). Được biết, tình trạng khai thác bừa bãi diễn ra liên tục trong thời gian dài và không có kế hoạch gây trồng đã làm cho nhiều loài lan đứng trước nguy cơ tuyệt chủng ngay tại VQGCT. Sau hơn 01 năm nghiên cứu, đã nhân giống thành công bằng biện pháp nuôi cấy mô gần 30 giống lan đặc hữu của Vườn Quốc gia Cát Tiên (VQGCT). Trong số các giống lan đã được nhân giống thành công tại Khoa Nông lâm Đại học Đà Lạt có nhiều loài rất quý được nước ngoài đặt mua với số lượng lớn như kim hài, vân hài, lan P. concolor, (trong đó cóộ m t số loài còn có tác dụng làm thuốc chữa bệnh như Ludisia discolor, Kim tuyến ). Việc nhân giống thành công các loài lan đặc hữu không chỉ cho phép bảo tồn các nguồn gen quý hiếm bằng cách di thực các giống lan này trở lại trồng tại VQGCT mà còn tạo điều kiện để nhân rộng các giống phong lan quý ở các địa bàn khác (nhất là trồng tại vùng trồng hoa nổi tiếng Đà Lạt). - Đề tài “Nghiên cứu chọn lọc và phát triển một số loài lan rừng có triển vọng phục vụ cho công tác nhân giống, lai tạo và bảo tồn nguồn gien đặc hữu, quý hiếm của Lâm Đồng” của Viện Sinh học Tây Nguyên công bố tháng 10/2008. Kết quả đã xác định được 73 loài lan rừng có hoa to, lâu tàn, màu sắc đẹp, có giá trị kinh tế và được nhiều người ưa chuộng có thể đưa vào nhân giống phục vụ sản xuất kinh doanh. Ngoài ra đã xác định được tên khoa học của 189/209 loài lan rừng phân bố trên địa bàn Lâm Đồng mà đơn vị đã thu thập, khảo sát. Trong đó có 3 loài mới và 37 loài đặc hữu thuộc
22 loại quý hiếm của Việt Nam như lan Hài hồng, Huyết nhung trơn, Hài vân, Hài Đà Lạt Hiện các loài lan thu thập được ngoài tự nhiên đều đang phát triển tốt, có khả năng ra hoa ở điều kiện của khí hậu Đà Lạt. - Đề tài: “Điều tra, thu thập đánh giá, bảo tồn nguồn gen cây hoa cảnh khu vực miền Bắc Việt nam do Trung tâm Hoa cây cảnh - Viện Di truyền nông nghiệp chủ trì. Kết quả của đề tài đã chỉ ra khu vực Tây bắc có trên 18 chi lan khác nhau, trong đó phải kể đến các chi Hoàng thảo (Dendrobium), Dáng Hương (Aerides), Ngọc điểm (Rhynchostylis), Kiếm (Cymbidium), Hài (Paphiopedilum), v.v, - Đề tài: “Thu thập đánh giá nguồn gen hoa lan Việt Nam và lưu giữ chúng ở 2 vùng: miền núi phía Bắc và đồng bằng Bắc bộ” do GS. TSKH. Trần Duy Quý – Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam làm chủ nhiệm, từ năm 2007 – 2009. Kết quả đã điều tra, thu thập, định danh và lưu giữ nguồn gen cho nhiều loài lan rừng thuộc 10 chi khác nhau (Hài vệ nữ, Hồ điệp, lan Kiếm, Hoàng thảo, Quế lan hương, Vanđa, Catlan, Phượng vĩ, Hạc đính và Đai châu) và lưu giữ chúng ở 2 nơi: Vùng núi Tam đảo và vùng ồđ ng bằng Hà nội với quy mô 2.000 dò (chậu)/ 1.500m2 vườn nuôi trồng * Về nghiên cứu kỹ thuật trồng và nhân giống lan Hài Lan Hài đỏ (Hài hồng - P. delenatii) của Phân Viện Sinh học Đà Lạt được nhân giống thành công bằng phương pháp ứng dụng công nghệ tế bào thực vật. Sau nhiều lần thử nghiệm nhân giống, từ hai năm qua, những nhà khoa học ở Phân viện sinh học Đà Lạt đã áp dụng phương pháp mới trong nhân giống hoa lan Hài đỏ. Các cây sau khi được kéo dài đoạn thân bằng cách sử ánh sáng trắng của đèn huỳnh quang và ánh sáng đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi môi trường có bổ sung 2,0mg/l BA, còn trên môi trường có bổ sung 1,5mg Zeotin hoặc 1,5mgTDZ thì cho chất lượng chồi tốt nhất. Khi dùnhg phương pháp này, khả năng tạo chồi rất nhanh, ,mặt khác cũng tìm được điều kiện sinh thái cho lan Hài nở hoa. Qua đây, người ta cũng chứng minh rằng lan Hài đỏ cũng có thể sản xuất vô tính [9]. Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2005, 2007), đã nhân giống được loài lan Hài đỏ- một loài Lan đặc hữu của Việt Nam (Paphiopedilum delenatii) bằng kỹ thuật gây vết
23 thương cơ giới, nuôi cấy lỏng và kéo dài đốt thân có chứa mắt để tái sinh chồi từ việc sử dụng các hạt lan sáu tháng tuổi được nuôi cấy trên môi trường Knudson C kết hợp với việc gây vết thương và nuôi cấy trên môi trường lỏng đã thu được 5,2 chồi/mẫu ban đầu khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1,0mg/l TDZ. Còn các cây sau khi được kéo dài đoạn thân bằng cách sử dụng ánh sang trắng của đèn huỳnh quang và ánh sáng đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất diều tiết sinh trưởng khác nhau. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi môi trường có bổ xung 2,0mg/l BA, còn trên môi trường có bổ sung 1,5mg Zeatin hoặc 1,5mg/l TDZ thì cho chất lượng chồi tốt nhất [7], [27]. Năm 2006, tác giả Đặng Xuyến Như và cộng sự đã thành công trong việc tạo ra các cây con của hai loài lan Hài Hằng (P. hangianum) và Hài Tam Đảo (P. gratrixianum) bằng kỹ thuật gieo hạt trong ống nghiệm và kỹ thuật gây vết thương trên cây con trong ống nghiệm. Hai loài lan này nhân giống rất khó vì hạt nhỏ, dài chừng 1 – 2mm, rộng chừng 1mm, chứa rất ít và hầu như không có chất dinh dưỡng để tạo điều kiện cho hạt nảy mầm. Do đó nếu gieo hạt trong môi trường đất hạt rất dễ bị mất mát và khó nảy mầm. Từ những kết quả đạt được, nhóm nghiên cứu do PGS-TS Đặng Xuyến Như phụ trách đã xây dựng được quy trình nhân giống hai loài lan Hài quý trên bằng phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm. Đồng thời họ cũng tìm ra phương pháp tách mầm như một biện pháp bổ sung để nhân giống Hài Hằng và Hài Tam Đảo. Không dừng tại đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành công việc nuôi trồng những cây con nói trên trong vườn ươm [12]. Hoàng thị Giang và cộng sự (2010) đã nghiên cứu nhân giống in vitro giống lan hài Hằng (P.hangganumperner gurss) từ nguồn nguyên liệu ban đầu là hạt lấy từ quả 6-10 tháng tuổi. Môi trường nuôi cấy là RE cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao nhất (58-67%). Môi trường nhân nhanh là môi trường RE có bổ sung 150ml/l nước dừa và 100mg/l chuối cho hệ số nhân cao nhất đạt 4,3 lần và cùng trên nền môi trường RE có bổ sung 0,4 – 0,6 mg/l NAA cho khả năng ra rễ tốt nhất [5]. Trong nghiên cứu của Vũ Quốc Luận và cộng sự (2014) về lan Hài Hồng cho thấy các chồi non lan Hài Hồng có 4 lá được cấy vào môi trường SH có bổ sung 0,5
24 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/l đường sucrose, 9,0 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính và được nuôi trong điều kiện che tối hoàn toàn trong 4 tháng nhằm kéo dài các đốt thân, sau đó được đưa ra điều kiện chiếu sáng thêm 2 tháng để lá tổng hợp diệp lục tố và các năng lượng cần thiết cho cây. Kết quả cho thấy, các chồi non được kéo dài trung bình 10.5 cm, với số lá mới hình thành trung bình 5 lá/chồi, tương ứng với 5 đốt/chồi thu được sau 120 ngày nuôi trong điều kiện tối. Sau đó, các chồi được đưa sang điều kiện chiếu sáng 60 ngày, các chồi non tiếp tục hình thành lá mới, tuy nhiên không nhận thấy có sự phân đốt. Sau 180 ngày nuôi cấy, các chồi được cắt thành 5 đốt riêng biệt với 1 lá và 1 rễ, riêng phần đỉnh chồi được giữ nguyên với 3 lá và 2 rễ. Cuối cùng, các đốt thân được trồng trên giá thể dớn Đài Loan thu được kết quả cao nhất ở vị trí đốt thân số 1 với tỷ lệ sống sót (100%) sau 12 tháng [7; 9]. Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2017) đã thành công trong nhân nhanh cây lan Hài gấm (P. concolor) từ phôi trên môi trường MS cải tiến có bổ sung BA 2mg/l và TDZ 1,0mg/l. Cho hệ số nhân chồi đạt 2,9 lần. Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) nhân giống thành công loài lan hài giáp P. malipoense trên môi trường MS có bổ sung BA 2mg/l và NAA 0,3mg/l cho hệ số nhân chồi 3,28 lần. Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) nhân giống thành công loài lan hài Xuân Cảnh Paphiopedilum Canhii) trong môi trường MS có bổ sung BA với nồng độ 2mg/l + Kinetine 1mg/l + TDZ 1mg/l cho hệ số nhân chồi đạt 2,93 lần.
25 Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Loài lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) được thu thập tại Khu bảo tồn thiên nhiên Thần Sa - Thái Nguyên và được lưu giữ tại nhà lưới khoa CNSH&CNTP. - Vật liệu nghiên cứu: + Một số chất kích thích sinh trưởng . + Một số thành phần dinh dưỡng hữu cơ (nước dừa, dịch chiết chuối ). + Đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài Mốc Hồng. 3.1.2. Hoá chất sử dụng - Hoá chất khử trùng: cồn 70°, thuỷ ngân clorua (HgCl2). - Môi trường MS, B5, WPM đường sacharose, agar, - Một số chất kích thích sinh trưởng ở thực vật thuộc nhóm auxin (IAA ,IBA, NAA, ), nhóm cytokinin (BA, ), nhóm gibberellin (GA3) 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu Thiết bị Dụng cụ Cân phân tích Pank Máy khuấy từ Dao kéo Máy đo PH Đèn cồn Lò vi sóng Cốc đong, ống đong Nồi hấp vô trùng Bình tam giác Tủ sấy Đĩa (hạt đậu, peptri) Hệ thống giàn đèn Chun nịt Máy cất nước Túi nilon Box cấy vô trùng Giấy thấm
26 Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứucủaPhòngThí nghiệm Khoa CNSH&CNTP. 3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.2.1. Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của dung dịch khử trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. - Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng tái sinh mầm ngủ lan Hài P. micranthum. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi và ra rễ từ mầm ngủ lan Hài P. micranthum. 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu - Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa CNSH&CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên. 3.2.3. Thời gian nghiên cứu - Thời gian: từ tháng 1/2019 – tháng 5/2019 3.3. Nội dung nghiên cứu 3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian cuả dung dịch khử trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của dung dịch khử trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng đoạn thân mang mầm ngủ, lan Hài P. micranthum. 3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh mầm ngủ lan Hài P. micranthum. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh mầm ngủ lan Hài P. micranthum. 3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ đoạn thân mang mầm ngủ. - Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ.
27 - Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ. - Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với GA3 đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ. - Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ. 3.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan Hài P. micranthum. - Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan Hài P. micranthum. - Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan Hài P. micranthum. 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro - Sử dụng môi trường MS, B5, WPM bổ sung Agar 5,5 g/l, Đường 30g/l, Nước dừa 150ml/l, Inositol 100mg/l, pH: 5,6 - 5,8. - Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi cấycó hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm. - Môi trường hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,0 atm trong 15 phút. - Sau khi cấy xong đưa mẫu vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ phòng từ 220C – 25oC, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux, độ ẩm: 60 – 65% quang chu kì 16h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu.
28 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giống Đoạn thân mang chồi ngủ Khử trùng (cồn 70º, HgCl2) Tái sinh chồi Nhân nhanh chồi Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chấtích k thích sinh trưởng đến khả năng itá sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ của cây lan Hài P.micranthum 3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm - Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học thực vật (Khoa CNSH-CNTP) trong điều kiện nhiệt độ phòng (25ºC ± 2, độ ẩm 60 - 65%, thời gian chiếu sáng 16h/ngày, cường độ chiếu sáng2000 – 2500 lux. - Bố trí thí nghiệm: Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 30 bình, mỗi bình 1 mẫu. 3.4.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu nồng độ và thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch HgCl2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng. Các bước tiến hành vô trùng mẫu như sau: - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu: Mẫu lấy là các đoạn thân củacâylanHài P.micranthum có mang chồi ngủ, chồi nách đem rửa sạch dưới vòi nước, loại bỏ hết phần đất bẩn, cắt bỏ phần thừa, dùng xà phòng loãng để rửa, sau đó tráng lạibằng nước cất.
29 - Khử trùng mẫu: Tiến hành trong box cấy vô trùng, khử trùng sơ bộ bằng cồn 70° trong 30 giây, tráng lại 3 - 5 lần bằng nước cất vô trùng, sau đó khử trùng tiếp bằng dung dịch HgCl2 để tiêu diệt nấm, vi khuẩn. Sau đó tráng lại bằng nước. Đặt mẫu lên giấy thấm và để khô tự nhiên trong box. Sau đó dùng pank, dao, kéo cắt bỏ phần mẫu ngấm hoá chất trên mẫu và cấy vào môi trường nuôi cấy. - Sau khi cấy xong đưa mẫu vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ phòng từ 220C – 25oC, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux, độ ẩm: 60 – 65% quang chu kì 16h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng cuả nồng độ, thời gian khử trùng mẫu trong dung dịch HgCl2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng. Các công thức được bố trí nhưsau: Hóa chất Công thức Thời gian (phút) CT1 (Đ/C) 0 CT2 5 HgCl2 0.1% CT3 10 CT4 15 CT5 5 HgCl2 0.15% CT6 10 CT7 15 CT8 5 HgCl2 0.2 % CT9 10 CT10 15 3.4.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan HàiP. micranthum. - Mẫu vô trùng, được cấy chuyển sang các môi trường dinh dưỡng có chứa các thành phần khoáng khác nhau với chất bổ sung Đường 30g/L + Agar 5,5g/L + Nước dừa 150 ml/L + Inositol 100mg/l, để nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi lan Hài P. micranthum Công thức thí nghiệm được bố trí như sau:
30 CT Môi trường Chất bổ sung 1 Muashige & Skoog (MS) Đường 30g/L + Agar 5,5g/L 2 Gamborg’s (B5) + Nước dừa 150 ml/L + 3 Woody Plant Medium (WPM) Inositol, pH 5,6 – 5,8. - Mẫu có kích thước tương đồng sau khi khử trùng được đưa vàomôi trường tái sinh, sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp. Tiến hành theodõi, quan sát chồi tái sinh và chất lượng chồi tái sinh. 3.4.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ đoạn thân mang mầm ngủ. - Chồi tái sinh được tách và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền (Môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường MS bổ sung: Đường 30 g/l + Nước dừa 150 ml/l + Agar 5,5 g/l + Inositol 100mg/l , pH 5,6 – 5,8.), có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (NAA) để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu. - Theo dõi, quan sát số chồi, chất lượng chồi. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan P.micranthum từ mầm ngủ. Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽđược tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + NAA ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + NAA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + NAA 0,5 mg/l CT 3: MT nền + NAA 1,0 mg/l CT 4: MT nền + NAA 1,5 mg/l CT 5: MT nền + NAA 2,0 mg/l Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan P.micranthum từ mầm ngủ.
31 Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra vàcấychuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + BA ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1(Đ/c): MT nền + BA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + BA 0,5 mg/l CT 3: MT nền + BA 1,0 mg/l CT 4: MT nền + BA 1,5 mg/l CT 5: MT nền + BA 2,0 mg/l Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với GA3 đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum từ mầm ngủ. Môi trường tái sinh sẽ được cấy chuyển sang môi trường nhânnhanh gồm: Môi trường nền + A (nồng độ BA thích hợp nhất cho quá trình tái sinh chồi ở thí nghiệm3) + GA3 ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi củamẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1(Đ/c): MT nền + A + GA3 0,0 mg/l CT 2: MT nền + A + GA3 0,1 mg/l CT 3: MT nền + A + GA3 0,3 mg/l CT 4: MT nền + A + GA3 0,5 mg/l CT 5: MT nền + A + GA3 1,0 mg/l Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ. Môi trường tái sinh sẽ được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + nồng độ dịch chiết chuối để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + dịch chiết chuối 0 g/l CT 2: MT nền + dịch chiết chuối 100 g/l CT 3: MT nền + dịch chiết chuối 120 g/l CT 4: MT nền + dịch chiết chuối 150 g/l CT 5: MT nền + dịch chiết chuối 180 g/l
32 3.4.3.4.Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ. Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum. - Chồi sinh trưởng và có từ 2-3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm: MT nền có bổ sungI AA ở cácnồng độ khác nhau để theo dõi khả năng tạo rễ của mẫu. - Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + IAA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + IAA 0,3 mg/l CT 3: MT nền + IAA 0,5 mg/l CT 4: MT nền + IAA 1,0 mg/l CT 5: MT nền + IAA 2,0 mg/l Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum. - Chồi sinh trưởng và có từ- 2 3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm : MT nền có bổ sungI AA ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng tạo rễ củamẫu. - Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ. Thí nghiệm được bố trí nhưsau: CT 1 (Đ/c): MT nền + IBA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + IBA 0,3 mg/l CT 3: MT nền + IBA 0,5 mg/l CT 4: MT nền + IBA 1,0 mg/l CT 5: MT nền + IBA 2,0 mg/l
33 3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 3.5.1. Thu thập số liệu - Đếm số mẫu sống, mẫu nhiễm, mẫu chết. - Đếm số chồi: Đếm tổng số chồi và nhánh trên một mẫu nuôi cấy banđầu. - Đếm số lượng rễ, độ dài của rễ. 3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi - Chỉ tiêu theo dõi khử trùng mẫu + Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm: Tổng số mẫu sống không nhiễm (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = × 100 Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) + Tỷ lệ mẫu sống nhiễm: Tổng số mẫu sống bị nhiễm (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) +Tỷ lệ mẫu chết: Tổng số mẫu chết (mẫu) Tỷ lệ mẫu chết (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Chỉ tiêu theo dõi chồi: Tổng số mẫu nảy chồi (mẫu) Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) Tổng chồi thu được Hệ số nhân chồi (lần) = × 100% Tổng chồi nuôi cấy
34 Hình thái chồi: + Sinh trưởng tốt: Chồi mập, khỏe, xanh + Sinh trưởng trung bình: Chồi mập, khỏe, xanh nhạt + Sinh trưởng kém: Chồi nhỏ, yếu, trắng vàng - Chỉ tiêu theo dõi ra rễ: Tổng số chồi ra rễ (chồi) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = × 100% Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu) Hình thái rễ: + Rễ tốt: Rễ khỏe, dài. + Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn. + Rễ kém: Rễ ngắn, nhỏ. 3.5.3. Phương pháp sử lý số liệu Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kêtoán học bằng phần mềm Microsoft office Excel 2010 và phần mềm IRRISTAT 5.0.
35 Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của dung dịch khử trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng Trong quá trình nuôi cấy in vitro, vô trùng mẫu cấy là giai đoạn khởi đầu và quyết định sự thành công của quá trình nuôi cấy.Để có được vật liệu khởi đầu sạch nấm và vi khuẩn, việc lựa chọn chất khử trùng, nồng độ, thời gian rất quan trọng. Qua quá trình nghiên cứu và tìm hiểu khả năng tạo mô sạch trong nuôi cấy in vitro trên đối tượng Phong lan nói chung và lan Hài nói riêng, chúng tôi nhận thấy có nhiều chất hóa học có hoạt tính diệt nấm và vi khuẩn mạnh như Calcium hypochlorid Ca(OCl)2, thuỷ ngân clorua (HgCl2), hydroxid (H2O2), Tuy nhiên HgCl2 được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng bởi chúng có hoạt lực cao trong việc tiêu diệt nấm và vi khuẩn, cho tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao [12]. Vì vậy, cần lựa chọn được nồng độ, thời gian khử trùng thích hợp nhất để loại bỏ hoàn toàn mầm bệnh khỏi mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy tạo vật liệu ban đầu sạch nấm, sạch vi khuẩn. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm HgCl2 ở các nồng độ và thời gian khác nhau. Sau 7 ngày theo dõi kết quả thu được trình bày ở bảng sau: Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của dung dịch HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) Chỉ tiêu đánh giá Thời Số mẫu Công Nồng độ gian đưa vào Tỷ lệ mẫu sống Tỷ lệ mẫu sống Tỷ lệ mẫu thức (%) (phút) (mẫu) không nhiễm (%) nhiễm (%) chết (%) Nước cất vô CT1(Đ/c) 15 30 0,00 100 0,00 trùng CT2 5 30 13,33 86,67 0,00 CT3 HgCl20,1% 10 30 24,33 63,34 12,33 CT4 15 30 46,66 36,66 17,68 CT5 5 30 30,00 51,00 19,00 CT6 HgCl 0,15% 10 30 60,00 20,00 20,00 CT7 2 15 30 49,00 13,33 37,67 CT8 5 30 66,66 20,50 12,84 CT9 HgCl2 0,2% 10 30 50,21 6,67 43,12 CT10 15 303 35,00 0,00 65,00 LSD05 5,4 CV (%) 8,2
36 Kết quả thí nghiệm đươc thể hiện quahình 4.1: Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) 70 66.66 60 60 49 50,21 50 46.66 40 35 30 30 Tỷ lệ mẫu 24,33 sống không 20 nhiễm (%) 13.33 10 0 0 Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 CT10 Hình 4.1. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) Xét tỷ lệ mẫu sống không nhiễm: Từ kết quả ở bảng 4.1 và hình 4.1 cho thấy: Các công thức thí nghiệm đều cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao hơn công thức đối chứng (0,00%), từ đó cho thấy nồng độ HgCl2 và thời gian khử trùng có ảnh hưởng tích cực đến khả năng tiêu diệt nấm, vi khuẩn. Ở chỉ tiêu mẫu sống không nhiễm, LSD05 đạt 5,4 và giá trị CV(%): 8,2%; cặp CT7 và CT9 có sự sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, các cặp CTkhác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Ở chỉ tiêu mẫu sống không nhiễm từ CT2 đến CT10 cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao nhất là CT8 (66,66%) và thấp nhất là CT2 (13,33%). Ở chỉ tiêu mẫu chết từ CT2 đến CT10 cho tỷ lệ mẫu chết cao nhất là CT10 (65%) và thấp nhất là CT2 (0,00%). Điều này có thể giải thích rẳng khi khử trùng mẫu bằng HgCl2 ở một nồng độ càng cao, thời gian khử trùng kéo dài thì khả năng tiêu diệt vi khuẩn, nấm tăng, do đó
37 tỷ lệ mẫu nhiễm giảm. Tuy nhiên HgCl2 là loại hoá chất có khả năng gây độc và làm chết mẫu nên thời gian khử trùng mẫu kéo dài và nồng độ chất khử trùng cao dẫn đến sự xâm nhập hoá chất khử trùng vào mẫu gây tỉ lệ mẫu chết. Hình 4.2. Một số hình ảnh tạo vật liệu vô trùng. 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum Mẫu sau khi xử lí vô trùng, cấy chuyển sang các môi trường dinh dưỡng có chứa các thành phần khoáng khác nhau để đánh giá khả năng tái sinh chồi lan chồi lan Hài P.micranthum. Chúng tôi thu được kết qủa ở bảng sau: Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) Công Môi Số mẫu đưa Tổng số mẫu bật Tỷ lệ tái sinh Hình thái thức trường vào (mẫu) chồi (chồi) chồi (%) chồi Xanh đậm, 1 MS 30 20 66,6 mập Xanh nhạt, 2 B5 30 17 56,6 mập Xanh nhạt, 3 WPM 30 8 26,6 gầy LSD05 8,72 CV% 7,7
38 Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua biểu đồ hình 4.3: Tỉ lệ tái sinh chồi(%) 70 66.6 60 56.6 50 40 Tỉ lệ tái sinh chồi (%) 30 26.6 20 10 0 MS B5 WPM Hình 4.3. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P. micranthum Từ bảng 4.2 và biểu đồ hình 4.3 cho thấy: Ở chỉ tiêu tỷ lệ tái sinh chồi: giá trị LSD05 đạt 8,72 và CV (%): 7,7%.; Các công thức đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy là95%. CT1 (MS) cho tỷ lệ chồi tái sinh cao nhất 66,6%. Tiếp theo CT2 (B5) tỷ lệ tái sinh chồi là 56,6%. CT3 cho tỷ lệ tái sinh chồi thấp nhất 26,6%. Ở chỉ tiêu hình thái chồi, CT3 (WPM) chồi thu được có màu xanh nhạt và gầy. Trên môi trường MS cho tỷ lệ tái sinh cao nhất trong thí nghiệm trên quan sát và thu được chồi có màu xanh đậm và mập. CT2 là môi trường B5 chồi thu được có màu xanh nhạt và mâp. Kết quả thí nghiệm cho thấy chồi lan Hài P. micranthum có thể tái sinh tốt trên nền môi trường chứa hàm lượng dinh dưỡng từ trung bình ếđ n giàu dinh dưỡng. Còn ốđ i với môi trường nghèo dinh dưỡng hạn chế cho sự tái sinh trưởng và phát triển chồi cây lan Hài P. micranthum. Từ kết quả trên, chúng tôi chọn môi trường MS làm môi trường cơ bản cho quá trình nghiên cứu sau của cây lan Hài P.micranthum
39 MS: 66,6% B5: 56,6% WPM: 26,6% (Xanh đậm, mập) (Xanh nhạt, mập) (Xanh nhạt, gầy) Hình 4.4. Hình ảnh ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi lan Hài P. micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) 4.3. Kết qủa nghiên cứu của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum từ đoạn thân mang mầm ngủ 4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng cuả NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum Nhân nhanh chồi là giai đoạn gia tăng số lượng chồi trong một thời gian ngắn. Hệ số nhân nhanh phụ thuộc vào thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, ánh sáng). Thảo luận ở phần này, lấy từ kết quả nghiên cứu của các tác giả trong phần tổng quan, nhất là bổ sung các chất kích thích sinh trưởng. Với mục đích nhân nhanh lan Hài P. micranthum tái sinh, chúng tôi tiến hành thí nghiệm: mẫu nuôi cấy được thử nghiệm khả năng nhân nhanh chồi trong sau môi trường có bổ sung NAA với nồng độ khác nhau. Thí nghiệm được theo dõi trong 20 ngày: Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). Nồng độ Số mẫu nuôi cấy Tổng số chồi thu Hệ số nhân Công thức NAA Hình thái chồi (mẫu) được (chồi) chồi (lần) (mg/l) CT1(Đ/c) 0,0 30 5 1,0 Xanh nhạt, gầy CT 2 0,5 30 55 1,83 Xanh đậm, mập CT 3 1,0 30 21 0,7 Xanh nhạt, gầy CT 4 1,5 30 47 1,56 Xanh nhạt, mập CT 5 2,0 30 23 0,76 Xanh nhạt, gầy LSD05 0,14 CV% 7,7 Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua hình 4.5:
40 Hệ số nhân chồi (lần) 2 1.83 1.8 1.56 1.6 1.4 1.2 1,0 Hệ số nhân chồi 1 (lần) 0.76 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 0 0 0.5 1 1.5 2 Hình 4.5. Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). Kết quả bảng 4.3 và hình 4.5 cho thấy: Ở chỉ tiêu nhân nhanh chồi: giá trị LSD05 đạt 0,14 và CV (%): 7,7%. Cặp CT3 và CT5 có sự sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Điều này cho thấy NAA có sự ảnh hưởng tích cực tới khả năng tái sinh chồilan Hài P. micranthum. Từ CT2 đến CT5 tương ứng với bổ sung NAA ở các nồng độ từ 0,5-2,0 mg/l, sau 20 ngày nuôi cấy thì tổng số chồi thu được nhiều hơn so với công thức đối chứng (5 chồi). Trong thí nghiệm này, khi sử dụng NAA ở nồng độ 0,5mg/l (CT2) cho tổng chồi thu được cao nhất (55 chồi) với hệ số nhân chồi là 1,83 lần. Ở chỉ tiêu hình thái chồi: khi không bổ sung NAA (CT đối chứng) hệ số nhân chồi thấp và chồi nhạt màu. CT2 (nồng độ NAA 0,5 mg/l) cho hình thái chồi tốt nhất (chồi xanh đậm và mập). CT3 cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất nhưng chồi xanh nhạt và gầy. Hình thái chồi giảm khi tăng dần nồng độ NAA. Kết quả trên được giải thích như sau: NAA là chất điều tiết sinh trưởng thực vật có tác dụng thúc đẩy sự phân bào và nhân nhanh, kích chồi. Ở CT đối chứng (CT1) vì không bổ sung NAA nên số mẫu tạo chồi không lớn và ít chồi. Nồng độ NAA 0,5g/l m (CT2) cho nhiều chồi và có số chồi lớn nhất là do NAA ở nồng độ này có tác dụng kích thích sự nhân nhanh chồi lan mạnh nhất đồng thời tạo điều kiện cho cây sinh
41 trưởng và phát triển tốt nhất. Ở CT3; CT4; CT5; nồng độ NAA lần lượt là 1,0mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l cho thấy tỷ lệ ra chồi và số chồi giảm dần. , bởi vì NAA ở nồng độ cao gây ức chế chồi phát triển, số lượng chồi hình thành cũng giảm, chồi sinh ra xanh nhạt và gầy. Nồng độ NAA 0,5 mg/l được lựa chọn để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Xanh nhạt, gầy) (Xanh đậm,mập) (Xanh nhạt, gầy) (Xanh nhạt, mập) (Xanh nhạt, gầy) Hình 4.6. Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy). CT1: 0 mg/l NAA; CT2: 0,5 mg/l NAA; CT3: 1 mg/l NAA; CT4: 1,5 mg/l NAA; CT5: 2 mg/l NAA. 4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài P. micranthum BA (6-Benzyl amino purine) là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật thuộc nhóm Cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong môi trường nuôi cấy mô nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, kích thích tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ.Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng nồng độ BA từ 0 - 4mg/l để đánh giá sự ảnh hưởng nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi .Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh với nồng độ BA thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khảnăng nhân chồi của mẫu. Sau 20 ngày nuôi cấy kết quả được trình bày ở bảng 4.4. Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) Nồng độ Số mẫu Tổng số Hệ số nhân Công thức Hình thái chồi BA(mg/l) nuôi cấy chồi thu chồi
42 (mẫu) được (lần) (chồi) CT 1(Đ/c) 0,0 30 20 1,0 Xanh nhạt, mập CT 2 0,5 30 45 1,5 Xanh nhạt, mập CT 3 1 30 47 1,56 Xanh nhạt, mập CT 4 1,5 30 57 1,9 Xanh đậm, mập CT 5 2,0 30 65 2,16 Xanh đậm, mập LSD05 0,16 CV% 5,7 Kết quả thí nghiệm được thể hiện quahình 4.7: Hệ số nhân chồi (lần) 2.5 2.16 2 1.9 1.5 1.56 1.5 1 Hệ số nhân chồi(lần) 1 0.5 0 0 0.5 1 1.5 2 Hình 4.7. Biêu đồ ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) Kết quả bảng 4.4 và hình 4.7 cho thấy: Ở chỉ tiêu nhân nhanh chồi: LSD05 đạt 0,16 và giá trị CV (%): 5,7%. Các công thức thí nghiệm đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Điềunày cho thấy BA có sự ảnh hưởng tích cực tới khả năng tái sinhchồilanHài P.micranthum. Từ CT2 đến CT5 tương ứng với bổ sung BA ở các nồng độ từ 0,5 - 2,0 mg/l, sau 20 ngày nuôi cấy thì tổng số chồi thu được nhiều hơn hẳn so với công thức
43 đối chứng (20 chồi). ở các CT2, CT3, CT4 thì hệ số nhân chồi tăng dần lần lượt là:1,5 lần; 1,56 lần và 1,9 lần. CT5 với nồng độ 2,0 mg/l BA cho tổng chồi thu được cao nhất (65 chồi) với hệ số nhân chồi là 2,16 lần và khác bệt rõ rệt so vs CT (Đ/c) và các CT2, CT3, CT4. Ở chỉ tiêu hình thái chồi, khi không bổ sung BA (CT1 - CT Đ/c) và CT2 cho hình thái chồi tái sinh thấp và chồi nhạt màu, mập. Khi tăng dần nồng độ BA lên 1,0 mg/l (CT3); 1,5 mg/l (CT4) và 2,0 mg/l (CT5) thì hình thái chồi tốt lên đáng kể (chồi xanh đậm, mập). Kết quả trên được giải thích như sau: BA là cytokinin có vai trò trong việc hoạt hóa quá trình phân bào, nhờ đó ẽs có tác dụng cảm ứng cho việc hình thành chồi và phân hóa chồi. Khi tăng dần nồng độ BA trong môi trường (0– 2,0 mg/l) thì tỷ lệ chồi tái sinh tăng đáng kể. Nồng độA B 2,0 mg/l đối với cây lan Hài P. micranthum cho tổng chồi thu được cao nhất đạt6 5 chồi với hệ số nhân chồi đạt 2,16 lần. Nồng độ BA 2,0 mg/l, cho kết quả tốt nhất sẽ được sử dụng nghiên cứu kết hợp với chất kích thích sinh trưởng khác ở các thí nghiệm tiếp theo. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Xanh nhạt, mập) (Xanh nhạt, mập) (Xanh nhạt, mập) (Xanh đậm, mập) (Xanh đậm,mập) Hình 4.8. Hình ảnh ảnh nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy ) CT1: 0 mg/l BA; CT2: 0,5 mg/l BA; CT3: 1 mg/l BA; CT4: 1,5 mg/l BA; CT5: 2 mg/l BA. 4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum Gibberellin (GA3) kích thích sự nảy mầm, nảy chồi của các mầm ngủ, do đó nó
44 có tác dụng trong việc phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của chúng. Hàm lượng gibberellin thường tăng lên lúc chồi cây, củ, căn hành hết thời kỳ nghỉ, lúc hạt nảy mầm.Trong trường hợp này của gibberellin kích thích sự tổng hợp của các enzyme amilaza và các enzyme thuỷ phân khác như protease, photphatase và làm tăng hoạt tính của các enzyme này, vì vậy mà xúc tiến quá trình phân hủy tinh bột thành đường cũng như phân hủy các polime thành monome khác, tạo điều kiện về nguyên liệu và năng lượng cho quá trình nảy mầm. Trên cơ sở đó, nếu xử lý gibberellin ngoại sinh thì có thể phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của hạt, củ, căn hành kể cả trạng thái nghỉ sâu. Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh với nồng độ BA thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi + giberellin ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.Sau20 ngày nuôi cấy kết quả được trình bày ở bảng 4.5. Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với GA3 đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy ) Tổng số Số mẫu Hệ số nhân Nồng độ chồi thu Công thức Nồng độ nuôi cấy chồi Hình thái chồi GA3 (mg/l) được BA(mg/l) (mẫu) (lần) (chồi) CT 1(Đ/c) 0,0 30 56 1,86 Xanh nhạt, mập CT 2 0,1 30 62 2,06 Xanh đậm, mập CT 3 2,0 0,3 30 86 2,87 Xanh đậm, mập CT 4 0,5 30 74 2,46 Xanh đậm, gầy CT 5 1,0 30 64 2,13 Xanh nhạt, gầy LSD05 0,47 CV% 3,6 Kết quả thí nghiệm được thể hiện quahình 4.9:
45 Hệ số nhân chồi (lần ) 3.5 3 2.87 2.46 2.5 2.06 2.13 2 1.86 Hệ số nhân chồi (lần)2 1.5 1 0.5 0 0 0.1 0.3 0.5 1 Hình 4.9. Biểu đồ ảnh hưởng của BA tốt nhất kết hợp với Giberellin đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) Kết quả thu được ở bảng 4.5 và hình 4.9 cho thấy: Ở chỉ tiêu hệ số nhân nhanh chồi: LSD0.5 đạt 0,47 và giá trị CV (%): 3,6%. Các cặp CT2 và CT5 có sự saikhác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, các cặp công thức khác có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy95%. Khi bổ sung nồng độ BA 2,0 mg/l vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tích cực tới việc nhân nhanh chồi lan Hài P.micranthum. CT3 khi bổ sung BA 2,0 mg/l, GA3 0,3 mg/l (CT3) vào môi trường nuôi cấy thì cho tổng số chồi thu được là 86 chồi và hệ số nhân cao nhất là 2,87 lần. Ở chỉ tiêu hình thái chồi: CT3 (BA 2,0 mg/l + GA3 0,3 mg/l) cho chất lượng chồi thu được xanh đậm, mập. Vậy trong khuôn khổ thí nghiệm này, để nâng cao hệ số nhân chồi cần bổsung BA 2,0 mg/l, GA3 0,3 mg/l, sẽ thu được tổng số chồi là 86 với hệ số nhân chồi là 2,87 lần.
46 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Xanh nhạt, mập) (Xanh đậm, mập) (Xanh đậm, mập) (Xanh đậm, gầy) (Xanh đậm, gầy) Hình 4.10. Hình ảnh ảnh hưởng của BA kết hợp với GA3 đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy ) CT1: 2,0mg/l BA + 0,0mg/l GA3; CT2: 2,0mg/l BA + 0,1mg/l GA3; CT3: 2,0mg/l BA + 0,3mg/l GA3;CT4: 2,0mg/l BA + 0,5mg/l GA3;CT5: 2,0mg/l BA + 1,0mg/l GA3. 4.3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năngnhân nhanh chồi lan P. micranthum Theo Van Staden và cs (1975), dịch chiết chuối chứa nhiều thành phần dinh dưỡng quan trọng về mặt sinh lý là serotonin, norepinephrine cùng với dopamine và một số catechomaline chưa xác định [34]. Việc bổ sung dịch nghiền chuối vào môi trường nuôi cấy hoa lan thường kích thích sự sinh trưởng bởi dịch chuối có hàm lượng fructose, glucose và nitrat cao, khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy làm tăng hàm lượng đường cũng như hàm lượng khoáng của môi trường. Tác dụng kích thích của dịch chiết chuối hiệu quả do khả năng ổn định pH của môi trường nuôi cấy. Bổ sung dịch chiết chuối vào môi trường đóng vai trò như một chất kháng acid và trung hòa nồng độ acid. Ngoài ra, dịch chiết chuối có chứa một hàm lượng lớn như sắt, kali, vitamin B6, B12 và trypthophan thúc đẩy PLBs tăng trưởng [25].Việc bổ sung dịch chiết dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy đa số loài lan đều đem lại các hiệu quả khác nhau. Việc bổ sung dịch chiết chuối có tác dụng kích thích đối với khả năng tạo protocorm và sinh trưởng chồi [16]. Do đó chúng tôi tiến hành bổ sung dịch chiết chuối vào môi trường nuôi cấy để khảo sát khả năng nhân nhanh chồi loài lan Hài P. micranthum.
47 Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng củadịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh lan Hài P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) Nồng độ Tổng số dịch Số mẫu Hệ số Chiều Công chồi thu chiết nuôi cấy nhân chồi cao cây Hình thái chồi thức được chuối (mẫu) (lần) (cm) (chồi) (g) CT1(Đ/c) 0 30 67 2,23 2,5 Xanh đậm, mập CT 2 100 30 58 1,93 2,2 Xanh nhạt, gầy CT 3 120 30 55 1,84 2,1 Xanh nhạt, gầy CT 4 150 30 50 1,66 2 Xanh nhạt, gầy CT 5 180 30 43 1,43 1,7 Xanh nhạt, gầy LSD05 0,15 CV (%) 4,6 Kết quả thí nghiệm được thể hiện quahình 4.11: Hệ số nhân chồi (lần) 2.5 2.23 1.93 2 1.84 1.66 1.5 1.43 Hệ số nhân chồi (lần) 1 0.5 0 0 100 120 150 180 Hình 4.11. Biểu đồ ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. Micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy )
48 Kết quả thu được ở bảng 4.6 và hình 4.11 cho thấy: Ở chỉ tiêu hệ số nhân chồi: LSD0.5 đạt 0,15 và giá trị CV (%): 4,6 % . Có thể thấy rằng việc bổ sung dịch chiết đậu chuối vào môi trường nuôi cấy không có hiệu quả tác động đến khả năng nhân nhanh của chồi lan Hài P.micranthum. CT1 khi không bổ sung dịch chuối thì cho hệ số nhân chồi cao nhất là 2,23 lần Ở chỉ tiêu hình thái chồi: CT2, CT3, CT3, CT4, CT5 đều cho chất lượng chồi xanh nhạt, gầy. Nồng độ dịch chiết chuối là100, 120, 150, 180 ml cùng với chiều cao chồi đạt được lần lượt là 2,2 cm; 2,1cm; 2cm; 1,7cm. Cho thấy hệ số nhân chồi và chiều cao cây giảm dần, bởi vì ở nồng độ dịch chiết chuối cao gây ức chế chồiphát triển, chồi yếu nên hệ số nhân chồi giảm, chất lượng chồi sinh ra xanh nhạt và gầy. Vậy trong khuôn khổ thí nghiệm này, để nâng cao hệ số nhân chồikhông cần bổ sung dịch chiết chuối, thu được số chồi lớn nhất là 67chồi với hệ số nhân chồi là 2,23 và cho chồi xanh đậm, mập. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Xanh đậm, mập) (Xanh nhạt, gầy) (Xanh nhạt, gầy) ( Xanh nhạt, gầy) (Xanh nhạt, gầy) Hình 4.12. Biểu đồ ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả năng nhân nhanh chồi lan P. micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) CT1: 0g/l DCC; CT2: 100g/l DCC; CT3: 120g/l DCC; CT4: 150g/l DCC; CT5: 180g/l DCC. 4.4 .Kết quả nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum từ mầm ngủ Bộ rễ là cơ quan quan trọng đối với tất cả các loài thực vật. Trong nuôi cấymô, sau khi nhân chồi với số lượng lớn, giai đoạn tiếp theo là tạo cây hoàn chỉnh đểđưara ngoài vườn ươm. Một cây khi được chuyển ra môi trường tự nhiên cần phải có bộ rễ
49 khỏe mạnh, hoàn chỉnh giúp cây có khả năng hút nước và dinh dưỡng khoáng tốt, làm tiền đề cho sự sinh trưởng và phát triển sau này. Vì vậy, giai đoạn kích thích tạo rễ của các chồi là giai đoạn quan trọng và không thể thiếu. Sau khi kết thúc giai đoạn nhân nhanh tạo ra số lượng chồi lan Hài P.micranthum đồng nhất và khỏe mạnh, các chồi tạo thành đạt tiêu chuẩn sẽ được tách ra đưa vàoỗ m i trường kích thích ra rễ. Chất kích thích sinh trưởng được dùng chủ yếu ở giai đoạn này thuộc nhóm auxin. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng IAA và IBA (có dụng kích thích chồi tạo rễ ) với các nồng độ khác nhau trong từng công thức thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IAA và IBA đến khả năng ra rễ của cây lan Hài P.micranthum. 4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P. micranthum. Bảng 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của lan Hài P.micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) Số chồi Nồng độ IAA Số mẫu nuôi Tỷ lệ chồi Hình thái Công thức ra (mg/l) cấy (mẫu) ra rễ (%) rễ rễ (mẫu) CT1(Đ/c) 0,0 30 4 13,3 Ngắn, nhỏ CT 2 0,3 30 12 40 Ngắn, nhỏ CT 3 0,5 30 17 56,6 Ngắn, mập CT 4 1,0 30 24 80 Ngắn, mập CT 5 2,0 30 8 26,6 Ngắn, nhỏ LSD05 11,6 CV (%) 14,3 Kết quả thí nghiệm được thể hiện quahình 4.13: