Khóa luận Nghiên cứu DNA barcode cho một số vật nuôi của Việt Nam

64 trang thiennha21 13/04/2022 6380

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu DNA barcode cho một số vật nuôi của Việt Nam", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_nghien_cuu_dna_barcode_cho_mot_so_vat_nuoi_cua_vie.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu DNA barcode cho một số vật nuôi của Việt Nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUỲNH THỊ THIỆP Tên đề tài: NGHIÊN CỨU DNA BARCODE CHO MỘT SỐ VẬT NUÔI CỦA VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2014 - 2019 Thái Nguyên, năm 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUỲNH THỊ THIỆP Tên đề tài: NGHIÊN CỨU DNA BARCODE CHO MỘT SỐ VẬT NUÔI CỦA VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Lớp: K47- CNSH Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2014 - 2019 Giảng viên hướng dẫn: TS. Phạm Bằng Phương Thái Nguyên, năm 2019
i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực Phẩm, cùng toàn thể quý thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực Phẩm đã giảng dạy, hướng dẫn em cho tới ngày hôm nay. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Phạm Bằng Phương người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ em, cùng toàn thể các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã động viên giúp đỡ chúng em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị và các bạn làm việc tại Viện khoa học sự sống – ĐH Thái Nguyên đã giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm, kỹ năng và tạo điều kiện để đề tài “Nghiên cứu xây dựng DNA barcode cho một số vật nuôi của Việt Nam” được hoàn thành đúng tiến độ và có kết quả tốt. Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thiện tốt nhất luận văn tốt nghiệp, nhưng trong quá trình thực hiện không thể tránh được những thiếu sót nhất định. Vì vậy, em rất mong được sự góp ý của các thầy, cô giáo và các bạn để khóa luận của em được hoàn chỉnh hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 04 tháng 06 năm 2019 Sinh viên Huỳnh Thị Thiệp
ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Các mẫu thí nghiệm phục vụ quá trình nghiên cứu 20 Bảng 3.2. Trình tự mồi cho phản ứng PCR 21 Bảng 3.3. Danh mục các thiết bị được sử dụng 21 Bảng 3.4. Danh mục các loại hóa chất được sử dụng 22 Bảng 3.5. Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 4.1: Kết quả đo độ tinh sạch DNA 26 Bảng 4.2. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của 4 mẫu nghiên cứu và 3 mẫu đã được công bố trên NCBI 32 Bảng 4.3. Hệ số tương đồng khi phân tích trình tự gen COI của 4 mẫu dê nghiên cứu với 3 trình tự đã được công bố trên NCBI 33 Bảng 4.4. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu và 6 mẫu đã được công bố trên NCBI 36 Bảng 4.5. Hệ số tương đồng khi phân tích trình tự gen COI của mẫu nghiên cứu với 6 trình tự đã được công bố trên NCBI 37 Bảng 4.6. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của mẫu B nghiên cứu và 3 mẫu đã được công bố trên NCBI 40 Bảng 4.7. Hệ số tương đồng khi phân tích trình tự gen COI của mẫu nghiên cứu với 3 trình tự đã được công bố trên NCBI 41
iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Lợn Landrace 5 Hình 2.2. Bò Vàng 6 Hình 2.3: Dê Cỏ Ninh Bình 8 Hình 4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số mẫu mô tai 26 Hình 4.2a. Kết quả PCR chỉ thị COI của các mẫu DH1, DH2,DN1, DN2 27 Hình 4.2b. Kết quả PCR chỉ thị COI của các mẫu B, L 27 Hình 4.3: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI các mẫu nghiên cứu theo giái trị QV 29 Hình 4.4: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu DH1 với chỉ thị COI của Capra hircus đã công bố trên NCBI 30 Hình 4.5. So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của 4 mẫu nghiên cứu với 3 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI 31 Hình 4.6: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu DH1 với chỉ thị COI của Gallus gallus đã công bố trên NCBI 34 Hình 4.7: Kết quả BLAST chỉ thị COI của mẫu L với chỉ thị COI của Sus scrofa đã công bố trên NCBI 35 Hình 4.8. So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của mẫu L nghiên cứu với 6 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI 36 Hình 4.9. Kết quả so sánh khác loài 38 Hình 4.10: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu B với chỉ thị COI của Bos taurus đã công bố trên NCBI 39 Hình 4.11. So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của mẫu B nghiên cứu với 3 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI 40 Hình 4.12: Kết quả so sánh trình tự khác loài 42
iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ viết tắt Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ BLAST Basic Local Alignment Search Tool Bp Base pair – cặp bazơ nitơ COI Cytochrome C oxidase Subutnit I Cytb Cytochrome b dATP DeoxyAdenine Triphosphate dCTP DeoxyCytosine Triphosphate ddATP DideoxyAdenine Triphosphate ddCTP DideoxyCytosine Triphosphate ddGTP DideoxyGuanine Triphosphate ddNTP Dideoxynucleotide Triphosphate ddTTP DideoxyThymine Triphosphate dGTP DeoxyGuanine Triphosphate DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate dTTP DeoxyThymine Triphosphate EDTA Etilendiamin tetraaxetic acit GPS Global Positioning System ITS Internal Transcribed Spacer Kb Kilo base – Kilo bazo nito matK Maturase K NCBI Nation Cetrer for Biotechnology Information (trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học) PCR Polymerase Chain Recation QV Quality value RPM Revolutions Per Minute SDS Sodium Dodecyl Sulfate
v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v Phần 1 MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu của đề tài 2 1.2.1. Mục tiêu tổng quát 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài 2 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Một số đối tượng vật nuôi phổ biến ở Việt Nam 4 2.1.1. Tổng quan về lợn 4 2.1.2. Tổng quan về bò vàng 6 2.1.3 Tổng quan về dê 7 2.2. Cơ sở khoa học của đề tài 9 2.2.1. Công nghệ mã vạch DNA 9 2.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số 11
vi 2.4. Phương pháp điện di DNA trong gel agarose 12 2.5. Kỹ thuật PCR 13 2.6. Phương pháp xác định các trình tự nucleotide 14 2.7. Tình hình nghiên cứu DNA mã vạch trong và ngoài nước 15 2.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15 2.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 17 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 20 3.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 21 3.2.1. Thiết bị nghiên cứu 21 3.2.2. Hóa chất 22 3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22 3.4. Nội dung nghiên cứu 23 3.5. Phương pháp nghiên cứu 23 3.5.1. Phương pháp lấy mẫu 23 3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số 23 3.5.3. Phương pháp PCR 24 3.5.4. Phương pháp xác định trình tự các nucleotide 25 3.5.5. Phân tích dữ liệu 25 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1. Kết quả tách DNA tổng số 26
vii 4.2 Kết quả PCR khuếch đại chỉ thị COI 27 4.3. Kết quả phân tích các chỉ thị DNA bacoding 28 4.3.1. Kết quả phân tích chất lượng giải trình tự 28 4.4. Kết quả so sánh, phân tích chỉ thị COI các mẫu nghiên cứu 30 4.4.1. Chỉ thị COI của mẫu dê 30 4.4.2. Chỉ thị COI của mẫu lợn 34 4.4.3. Chỉ thị COI của mẫu bò 38 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1. Kết luận 43 5.2. Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngành chăn nuôi ở Việt Nam là một bộ phận quan trọng cấu thành của nền nông nghiệp cũng như một bộ phận quan trọng của nền kinh tế Việt Nam. Tình hình chăn nuôi phản ánh thực trạng sử dụng, khai thác, chế biến và tiêu thụ các sản phẩm động vật. Các sản phẩm từ vật nuôi là một nguồn cung cấp thực phẩm với tỷ trọng cao, chất lượng tốt và giá trị dinh dưỡng lớn cho con người, các sản phẩm phụ như da, mỡ, thịt là nguồn cung cấp cho các ngành công nghiệp chế biến khác. Đồng thời phụ phẩm của ngành chăn nuôi là một nguồn cung cấp phân bón hữu cơ cho trồng trọt. Để phục vụ các nhu cầu ngày càng lớn của xã hội, việc chọn lọc và phát triển các giống vật nuôi ngày càng được chú trọng. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về việc chọn lọc, xác định giống vật nuôi bằng chỉ thị phân tử, trong đó có các nghiên cứu về phương pháp “DNA barcode” (mã vạch DNA). Đây là phương pháp xác định nhanh chóng cho một cơ thể sinh vật tới cấp độ loài. Về nguyên tắc mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong genome của sinh vật như là một chuỗi ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau. Phương pháp này đã được ví tương tự như máy quét trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm khác nhau mà nhìn bên ngoài chúng rất giống nhau. Như vậy, phương pháp mã vạch DNA là một phương pháp định danh có thể xác định giống vật nuôi tới cấp độ loài. Những nghiên cứu mã vạch DNA là cơ sở vững chắc đáng tin cậy cho những nghiên cứu phân loại dựa trên hình thái, là sự phát triển tất yếu và có tính kế thừa từ các nghiên cứu phân loại học trước đây.
2 Một trong những gen được sử dụng để xác định loài ở động vật có vú là gen COI. Gen COI có thể đóng vai trò là trình tự dùng để phân biệt các loài vật nuôi có quan hệ gần và đây cũng là trình tự bảo thủ giữa các thành viên của loài. Điều này gợi ý rằng sử dụng phương pháp mã vạch DNA sẽ có hiệu quả trên nhiều loài sinh vật. Xuất phát từ những giá trị khoa học và thực tiễn, dựa trên những cơ sở khoa học về trình tự gen đã biết, nhằm đóng ghóp, bổ sung những trình tự DNA phục vụ cho mục đích xác định loài vật nuôi, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu DNA barcode cho một số vật nuôi của Việt Nam”. 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Xây dựng DNA barcode cho một số vật nuôi tại Việt Nam 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Nhân gen COI của một số vật nuôi: Bò, lợn, dê - Giải trình tự gen COI - Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA barcode cho một số vật nuôi của Việt Nam - Đánh giá và so sánh cơ sở dữ liệu DNA barcode của vật nuôi Việt Nam với cơ sở dữ liệu quốc tế 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài - Xây dựng được cơ sở dữ liệu DNA barcode cho một số giống vật nuôi như bò, lợn, dê của Việt Nam.
3 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Có ý nghĩa quan trọng trong công tác bảo tồn nguồn gen động vật nuôi có giá trị của Việt Nam. - Tạo cơ sở dữ liệu cho các các nghiên cứu khoa học sau này.
4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Một số đối tượng vật nuôi phổ biến ở Việt Nam Ở Việt Nam, nghề chăn nuôi có vai trò rất quan trọng. Ở nhiều địa phương, đây là nghề đem lại thu nhập chính cho nhiều hộ gia đình. Một số giống vật nuôi được người dân chăn nuôi trên các quy mô lớn, đem lại thu nhập ổn định cho người dân. Trong thời gian thực hiện đề tài, một số giống vật nuôi như: Lợn, bò, dê được lựa chọn để xây dựng DNA barcode (mã vạch DNA). 2.1.1. Tổng quan về lợn Lợn thuộc lớp thú (Mammalia), bộ guốc chẵn (Artiodactyla), họ lợn (Suidae), thuộc chi lợn (Sus), loài lợn rừng (Sus scrofa). Một trong các giống lợn được nuôi nhiều nhất ở Việt Nam là lợn Landrace. Lợn Landrace có nguồn gốc từ Đan Mạch được hình thành vào khoảng 1924–1925 do quá trình tạp giao giữa các giống lợn đến từ Anh, Tây Ban Nha, Ý, Bồ Đào Nha, Trung Quốc tạo thành. Theo nhiều tài liệu, chúng được tạo thành bởi quá trình lai tạo chính giữa giống lợn Youtland có nguồn gốc từ Đức với lợn Yorkshire có nguồn gốc từ Anh. Giống lợn này chủ yếu được nuôi nhiều ở Đan Mạch. Sau năm 1990, chúng được chọn lọc và có năng suất cao nên được nuôi nhiều ở các nước Châu Âu. Hiện nay giống lợn này được xuất đi khắp nơi để cải thiện giống lợn của nhiều nước và trở thành các giống “Lợn Landrace Mỹ”, “Lợn Landrace Anh”, “Lợn Landrace Pháp”, “Lợn Landrace Canada”, giống này cũng đã được nhập vào Việt Nam và nuôi trên diện rộng. Lợn Landrace được coi là giống lợn tốt nhất trên thế giới hiện nay và được nuôi rất phổ biến ở nhiều nơi, giống lợn này vừa có tỷ lệ nạc cao vừa có
5 thể để nái, rất thích hợp cho hộ chăn nuôi và trang trại. Giống lợn này được nhập vào Việt Nam vào khoảng năm 1970 qua Cuba. Giống lợn Landrace là một trong những giống tốt để thực hiên chương trình nạc hóa đàn lợn của Vệt Nam.[20] Ngoại hình lợn Landrace có màu trắng tuyền, đầu nhỏ, dài, tai to rủ xuống kín mặt, tai cúp về phía trước, cổ nhỏ và dài, vai-lưng-mông-đùi rất phát triển, mông đùi to, mõm thẳng, mông nở, ngoại hình thể chất vững chắc. Toàn thân có dáng hình thoi nhọn, do chúng nhiều hơn các giống lợn khác 1- 2 đôi xương sường nên thân hình rất dài. Đây là giống lợn tiêu biểu cho hướng nạc. Lợn có khả năng tăng trọng từ 750 – 800 g/ngày, 6 tháng tuổi lợn thịt có thể đạt 105 – 125 kg. Khi trưởng thành con được nặng tới 400 kg, con cái 280 – 300 kg. Lợn Landrace có khả năng sinh sản cao, mắn đẻ và đẻ nhiều trung bình đạt 1,8 – 2 lứa/năm. Mỗi lứa đẻ 10 – 12 con, trọng lượng sơ sinh (Pss) trung bình đạt 1,2 – 1,3 kg, trọng lượng cai sữa (Pcs) từ 12 – 15 kg. Sức tiết sữa từ 5 – 9 kg/ngày. Khả năng sinh trưởng của lợn rất tốt. Giống lợn này kén ăn và đòi hỏi nhu cầu dinh dưỡng cao và cũng đòi hỏi điều kiện chăm sóc tốt.[21] Hình 2.1. Lợn Landrace
6 2.1.2. Tổng quan về bò vàng Bò vàng là một giống bò u da lông vàng được tìm thấy ở Nam Trung Quốc, Việt Nam và Đài Loan. Chúng được tạo ra trong quá trình lai tạo giữa hai giống bò Bos taurus và Bos indicus. Chúng có tên là bò vàng vì màu sắc lông màu vàng. Đây là giống bò gốc làm nền để tạo ra rất nhiều giống bò khác nhau ở Trung Quốc, Việt Nam. Về phân loại động vật học, bò thuộc giới động vật (Animalia), ngành động vật có dây sống (Chordata),lớp thú (Mammalia), bộ guốc chẵn (Artiodactyla), họ trâu bò (Bovidae), phân họ trâu bò (Bovinae), thuộc chi bò (Bos), loài Bos primigenius, phân loài (B.p.taurus, B.p.indicus). Bò vàng có một số ưu điểm nổi bật chịu đựng tốt với điều kiện nhiệt đới nóng ẩm, chịu đựng kham khổ tốt, thích nghi với nhiều vùng khí hậu, thích nghi được với phương thức chăn nuôi tận dụng, đầu tư ít. Bò có nhược điểm lớn nhất là tầm vóc nhỏ, không đáp ứng với yêu cầu chăn nuôi thâm canh, năng suất thịt và sữa rất thấp. Năng suất thịt không cao, tỉ lệ thịt xẻ 40- 44%. Tuổi phối giống lần đầu vào khoảng 20-24 tháng. Hình 2.2. Bò Vàng Bò vàng có khả năng sinh sản tốt, 18-24 tháng tuổi bò đã động dục và có khả năng phối giống, 30-34 tháng tuổi đẻ lứa đầu, nhịp đẻ năm một (1 năm
7 1 lứa) và 3 năm 2 lứa là phổ biến. Khả năng sinh sản tốt là đặc điểm có ích lớn nhất của bò vàng. 2.1.3 Tổng quan về dê Nhiều nhà khoa học ở các nước khác nhau đã nghiên cứu về nguồn gốc của dê nhà, tuy còn nhiều ý kiến khác nhau nhưng đại đa số các nhà khoa học cho rằng dê là một trong những loại vật nuôi được thuần hóa sớm nhất. Người ta cho rằng dê nhà ngày nay (Capra hircus) có nhiều nguồn gốc khác nhau. Tổ tiên trực tiếp của dê nhà gồm 2 nhóm dê rừng chính: + Dê rừng Bezoar (Capra aegagrus) được tìm thấy ở Iran và các nước vùng tiểu Á, là tổ tiên của phần lớn dê nhà đang được nuôi ở châu Á và châu Âu. Nó được coi là nhóm tổ tiên thứ nhất của dê nhà. Dê thuộc nhóm này có sừng thẳng nhưng xoắn vặn. + Dê rừng Markhor (Capra Falconeri), nhóm này có sừng cong vặn về phía sau và được coi là nhóm tổ tiên thứ 2 của dê nhà, còn thấy ở vùng núi Hymalaya và đang được nuôi nhiều ở hai bên sườn phía Đông và Tây của dãy núi này. Nhóm Markhor phân bố ở Afghanistan và vùng Kashimir – Karakorum. Hiện nay, người ta thấy rằng khu vực nuôi dê lâu đời nhất là các nước Trung Đông, sau đó đến Ấn Độ và Ai Cập, tiếp đến là các nước châu Âu, châu Á và châu Phi. Khu vực nuôi dê mới nhất là Đông Nam Á. Về phân loại động vật học, dê thuộc giới động vật (Animalia), ngành động vật có dây sống (Chordata), phân ngành động vật có xương sống (Vertebrata), lớp động vật có vú (Mammalia), bộ guốc chẵn (Artiodactyla), họ trâu bò (bovidae), họ phụ dê cừu (capra rovanae), thuộc loài dê (Capra). Dê có đặc điểm màu lông không thuần nhất, có nhiều màu lông khác nhau nhưng tập trung chủ yếu ở một số màu lông chính như: Màu vàng (vàng
8 tro, vàng cánh gián, vàng nâu), màu đen (đen tuyền, xám đen), khoang trắng đen, trắng xám. Dê đực và dê cái đều có sừng và râu, tai nhỏ và hướng về phía trước hoặc sang ngang, đầu nhỏ, mình ngắn, bụng to, tầm vóc nhỏ. Khối lượng sơ sinh bình quân đạt từ 1,6 - 1,8kg, khối lượng trưởng thành của dê cái khoảng 25 - 30kg và dê đực là 30 - 45kg, con cái cao khoảng 50 - 54cm và con đực cao khoảng 55 - 58cm. Dê cỏ có khả năng sinh sản tốt, tuổi phối giống lần đầu là 6-7 tháng, đẻ 1,7 lứa/năm và 1,5 con/lứa, khoảng 2 năm đẻ 3 lứa, mỗi lứa 1-2 con. Dê cái mang thai trung bình từ 145 - 155 ngày là đẻ. Dê con lúc mới đẻ đến khi cai sữa mất khoảng 3 tháng. Dê cái non phải đạt 7 tháng tuổi và có trọng lượng xấp xỉ 24 kg mới cho phối giống lần đầu[7]. Hình 2.3: Dê Cỏ Ninh Bình
9 2.2. Cơ sở khoa học của đề tài 2.2.1. Công nghệ mã vạch DNA Năm 2003, Paul Hebert – nhà nghiên cứu đại học Guelph, Canada, sáng lập ra phương pháp “mã vạch DNA” dùng để nhận diện các loài [15]. Theo định nghĩa thông thường, mã vạch là phương pháp lưu trữ và truyền tải thông tin bằng một loại ký hiệu chuyên biệt, có quy ước. Khi nhìn vào dãy ký hiệu này người ta sẽ biết được nguồn gốc xuất xứ của sản phẩm. Tương tự, mã vạch DNA sử dụng trình tự nucleotide ngắn lấy từ một phần thích hợp trong hệ gen của sinh vật như một chuỗi ký tự duy nhất giúp nhận diện và phân biệt các loài sinh vật với nhau [22]. Ông đề xuất sử dụng một trình tự ngắn của gen Cytochrome c oxidase 1 (COI) có chiều dài khoảng 650 bp, đây là trình tự DNA có trong tất cả các loài động vật. Tuy nhiên trình tự các nucleotide của đoạn DNA này khác nhau giữa các loài. Hệ gen ty thể của động vật thích hợp để phân tích hơn là sử dụng bộ gen nhân vì không chứa các đoạn intron, 13 gen mã hóa protein trong ty thể động vật là những vùng gen có nhiều tiềm năng dùng để làm mã vạch DNA bởi vì sự thêm và mất các trình tự dẫn đến sự thay đổi trong khung đọc rất hiếm xảy ra. Gen COI có đủ các yếu tố quan trọng để có thể sử dụng làm mã vạch DNA [16]. Một mã vạch DNA điển hình cần đáp ứng được các yêu cầu sau: (1) Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài. (2) Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất tái bản cao. (3) Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài. Có năm bước chính liên quan đến xác định loài bằng trình tự mã vạch DNA. Đầu tiên, mẫu vật phải được thu nhận và xác định bởi các nhà phân loại. Một mẫu mô được lấy từ cơ thể vật nuôi và tiến hành tách chiết thu DNA tổng số, sau đó trình tự DNA đích được khuếch đại bằng phản ứng PCR
10 (Polymerase chain reaction) và được giải trình tự để tạo ra một “mã vạch”. Cuối cùng, các mã vạch được nhập vào hệ thống các ngân hàng dữ liệu Barcode (BOLD). Nó là một hệ thống trực tuyến để giúp các nhà nghiên cứu thu thập, quản lý và phân tích mã vạch DNA. Mỗi mục được tổ chức trong BOLD có các thông tin như tên phân loại, hình ảnh của loài, GPS tọa độ nơi mà loài đó đã được tìm thấy và trình tự mã vạch quy ước cho đối tượng. Thông tin này có thể được cung cấp cho bất cứ ai có nhu cầu thông qua BOLD và bất cứ nơi đâu trên thế giới [10]. Ví dụ, mã vạch DNA sẽ giúp định danh nhanh chóng các loài gây bệnh ở giai đoạn tiềm ẩn (giai đoạn ấu trùng), hỗ trợ chương trình kiểm soát sâu bệnh bảo vệ cây trồng. Gen COI có thể dùng để xác định động vật có xương sống và côn trùng. Gen COI của bọt biển và san hô rất bảo thủ, nhưng ở các loài lưỡng cư và giáp xác lại có sự biến đổi quá cao, trong khi ở các loài như giun tròn, sán lá và nhóm động vật cổ xưa “tardigrades” (gấu nước) thì vùng gen này có sự tái sắp xếp lớn nên sẽ là trở ngại cho việc sử dụng các cặp mồi phổ biến trong phản ứng PCR. Ngoài locut gen COI, các đoạn gen khác trong ty thể Cytb (Cytochrome b), gen ribosome 12S, 16S cũng được dùng như DNA mã vạch trong nhận dạng ở động vật. [17] Với hàng triệu loài động vật luôn biến đổi không ngừng theo từng giai đoạn sống, việc phân loại và định danh các loài luôn gặp các thách thức không nhỏ. Nhiều sinh vật nhỏ hiện nay có thể vẫn chưa được biết đến. Tuy nhiên, ngay cả những loài động vật lớn hơn vẫn có những tranh luận về nhận dạng giữa các loài. Việc định danh loài thông qua các đặc điểm hình thái không còn thuyết phục. Vì vậy việc tìm ra phương pháp mã vạch DNA như một giải pháp mới và hữu ích cho việc phân loại là sự kiện quan trọng và có ý nghĩa thực tiễn.
11 2.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số Tách chiết DNA từ mẫu thí nghiệm là việc cần thiết bởi các thí nghiệm của công nghệ gen đều tiến hành với DNA. Cho đến nay đã có rất nhiều quy trình tách chiết thành công DNA được công bố và báo cáo bởi nhiều nhà nghiên cứu. Đối với mỗi loại mô hay tế bào, quy trình tách chiết có thể sẽ khác nhau. Dù vậy thì nguyên lý tách chiết ADN từ tế bào vẫn gồm các bước cơ bản gồm: 1) Phá màng tế bào; 2) Loại bỏ protein; 3) Tủa và thu DNA. Nguyên lý tách chiết DNA cụ thể như sau: Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote). Thông thường tế bào, mô được nghiền trong nitơ lỏng -1960C hoặc dùng hỗn hợp chất tẩy rửa (SDS, Sarcosyl) và proteinase K. Khi đó màng tế bào, màng nhân sẽ bị phá vỡ và giải phóng DNA ra môi trường và phân hủy các protein liên kết với DNA. Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein, mẫu được lắc mạnh trong một dung dịch phenol và chloroform, dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan DNA, sau khi li tâm sẽ tủa thành lớp nằm giữa hai lớp là nước và phenol/chloroform. Nước có chứa DNA được thu nhận lại. Bước 3: Tủa DNA nhằm thu nhận DNA dưới dạng cô đặc, một phần để bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy các enzyme, mặt khác có thể hòa tan lại chúng trong dung dịch có nồng độ mong muốn. Có thể tủa DNA trong ethanol, môi trường có nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp, tuy nhiên cũng có thể tủa trong isopropanol (không cần muối). Sau khi thu nhận DNA, cặn tủa cần phải rửa trong ethanol 70% để loại bỏ muối hoặc isopropanol dính vào.
12 Bước 4: Kết tủa DNA sau khi rửa bằng cồn và để khô tự nhiên hòa tan trong TE hoặc nước cất để bảo quản DNA phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. 2.4. Phương pháp điện di DNA trong gel agarose Phương pháp điện di DNA dựa vào đặc tính của các nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác dụng của lực điện trường với điện thế và cường độ thích hợp chúng sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường. Phương pháp điện di được thực hiện phụ thuộc vào khích thước, cấu hình của DNA, loại gel, nồng độ gel và cường độ dòng điện. Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển về phía cực dương nhanh hơn các phân tử có kích thước lớn. Đây cũng chính là cơ sở để có thể sàng lọc các dòng DNA tái tổ hợp bằng phương pháp so sánh kích thước. Các bước của phương pháp điện di được tiến hành như sau: Chuẩn bị gel + Cân 1gam agarose cho vào 99 ml dung dịch TAE 1X, đun sôi sao cho agarose tan hoàn toàn. + Để gel nguội đến 600C, đổ gel vào khuôn đã cài sẵn lược và đợi cho gel đông lại. + Nhấc lược khỏi bản gel và đặt bản gel vào bể điện di. + Đổ dung dịch đệmTAE vào bể điện di sao cho ngập bản gel. Tra mẫu điện di + Tỷ lệ tra: Trộn theo tỷ lệ 1µl “loading dye” với 5 µl mẫu. + Cài đặt trương trình điện di ở 100-110V, 100-200mA, trong 30 phút (khi vị trí vạch mẫu chạy được khoảng 2/3 gel). Nhuộm gel
13 + Bản gel được lấy ra khỏi bể điện di và nhuộm với ethidium bromide (nồng độ 30 µl/l) trong 15 phút. + Soi và chụp ảnh bản gel bằng máy chụp ảnh gel. 2.5. Kỹ thuật PCR Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985. Phản ứng PCR cho phép khuếch đại, tạo ra số lượng lớn bản sao của gen trong một thời gian ngắn. Cơ sở của phản ứng PCR dựa trên tính chất biến tính, hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA. Trên cở sở trình tự của đoạn DNA khuôn, đoạn mồi, các nucleotide tự do và enzyme DNA polymerase có thể tổng hợp được đoạn DNA đích mong muốn. Từ thời điểm DNA biến tính cho tới khi sợi DNA mới được tổng hợp gọi là một chu kỳ [3]. Phản ứng PCR khuếch đại gen đích mong muốn được lặp lại nhiều lần các chu kỳ nhân gen, trong một thời gian ngắn số lượng bản sao DNA tạo thành sẽ tăng theo cấp số nhân. Các bước chủ yếu của một chu kỳ PCR như sau: Bước biến tính: Hai mạch đơn của phân tử DNA tách đôi dưới tác dụng của nhiệt độ. Bước này thường được tiến hành ở 94 – 950C sẽ làm đứt các liên kết hydro của phân tử DNA, hay mạch DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn, làm khuôn cho quá trình tổng hợp, giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Bước gắn mồi: Nhiệt độ của phản ứng được hạ thấp. Trong hỗn hợp phản ứng lúc này có mặt hai mạch đơn DNAvừa tách khỏi nhau và hai loại mồi. Mỗi loại mồi sẽ nhận biết và bám vào một sợi DNA mạch đơn theo nguyên tắc bổ sung. Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào độ dài trình thự mồi, thông thường nằm trong khoảng 45 – 600C và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
14 Bước kéo dài: Nhiệt độ 720C là nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động của enzyme DNA polymerase. Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp các nucleotide tự do vào cuối đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung tổng hợp nên sợi DNA mới. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ liên tục, thông thường thực hiện khoảng 20 – 40 chu kỳ [2]. 2.6. Phương pháp xác định các trình tự nucleotide Giải trình tự là phương pháp xác định thứ tự sắp xếp của 4 nucleotide (adenine, guanine, cytosine và thymine) trên một phân tử DNA. Với việc phát triển phương pháp giải tình tự tự động việc xác định trình tự DNA của hệ gen sinh vật đã trở nên không thể thiếu cho các quá trình nghiên cứu sinh học cơ bản, cũng như trong các lĩnh vự chuẩn đoán hoặc pháp y. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc của phương pháp dideoxynucleotide cải tiến của Sanger; đó là sử dụng các phân tử triphosphate dideoxynucleotide (ddNTPs) như là các điểm kết thúc trong trong quá trình tổng hợp chuỗi DNA. Các thành phần sử dụng trong phương pháp này đó là: Mẫu DNA sợi đơn, DNA mồi, Enzyme taq-DNA polymerase, bốn loại dNTPs, dung dịch đệm và có thêm một lượng nhỏ ddNTP (trong đó có một loại đánh dấu bằng cách gắn với một phân tử huỳnh quang). Mẫu DNA được chia thành bốn phản ứng riêng biệt có chứa tất cả bốn deoxynucleotides chuẩn (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) và polymerase DNA. Mỗi phản ứng chỉ được thêm vào một trong bốn dideoxynucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP), các dideoxynucleotide này bị mất 2 nguyên tử oxy ở vị trí carbon số 3 và carbon số 4. Do đó khi mạch DNA đang tổng hợp bị gắn một ddNTP thì không có nhóm 3’- OH ở nucleotide cuối cùng nên mạch đang tổng hợp không được tiếp tục kéo dài vì vậy phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại [8]. Mỗi ddNTP sử dụng được gắn với một phân tử huỳnh quang và mỗi nucleotide
15 cho một màu khác nhau. Các đoạn DNA thu được phân tách theo kích thước bằng điện di trên cùng một ống mao quản. Các đoạn DNA khác nhau sẽ phân tách trên gel mao quản và xuất hiện dưới dạng các đỉnh và các màu đi kèm. Các đỉnh được phát hiện bằng cách sử dụng nguồn laser. Đọc trình tự DNA bằng cách xác định màu của đỉnh khi chúng đi qua thiết bị phát hiện và thông tin này sẽ đượcchuyển trực tiếp đến một máy tính và sẽ xác định được trình tự của đoạn DNA [15]. 2.7. Tình hình nghiên cứu DNA mã vạch trong và ngoài nước 2.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Năm 2010, Locke SA và cộng sự đã sử dụng mã vạch COI để phân biệt Diplostomum spp (ấu trùng ký sinh trong mắt cá). Tiến hành thu thập được 497 mẫu ấu trùng từ mắt các loài cá của sông St. Lawrence ở Canada. Sử dụng chỉ thị mã vạch ITS và COI để phân loại các loài gây bệnh nghiêm trọng. Tuy nhiên kết quả cho thấy chỉ thị COI cho kết quả tốt hơn [13]. Năm 2012, Emre Keskin và cộng sự đã sử dụng tiểu đơn vị COI ty thể để làm sáng tỏ tính đa dạng di truyền của các loài cá nước ngọt không phải bản địa. Thông qua toàn bộ dữ liệu tìm thấy có 145 chuỗi COI, sự khác biệt về mã vạch COI giữa các quần thể cùng loài thấp, đặc biệt đối với quần thể C. gibelio, G. holbrooki và L. gibbsus lần lượt là 0,5%, 0,6% và 0,3%. Từ kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp mã vạch DNA giúp nhận dạng ở cấp độ loài và cho thấy sự khác biệt giữa các quần thể, có thể được sử dụng để quản lý hiệu quả các loài xâm lấn và các chiến lược bảo tồn với các loài bản địa và đặc hữu [9]. Năm 2015, Joana Costa và cộng sự nghiên cứu hai mã vạch DNA là ITS1 và matK để nhận biết 2 loài H. perforatum và H. androsaemum. Hypericum perforatum nổi tiếng với các đặc tính chống viêm, chống trầm cảm và chống virut, cũng như một chất chữa bệnh. Hypericum androsaemum
16 được sử dụng chủ yếu cho tính chất bảo vệ gan và lợi tiểu. Các kết quả phân tích từ ITS1 và matK là cơ sở để phát triển các thử nghiệm PCR đặc hiệu cho từng loài, kết hợp kỹ thuật HRM (High Resolution Melt analysis) góp phần xây dựng cách tiếp cận đơn giản để phân biệt hai loài một cách đáng tin cậy. Các vùng mã vạch đã thành công trong việc nhận dạng từng nhóm đối tượng [11]. Năm 2015, Locke SA, và cộng sự sử dụng mã vạch DNA nghiên cứu tính đa dạng của ấu trùng Diplostomidae (Platyhelminthes: Digenea) trong mắt cá nước ngọt. Những nghiên cứu hình thái học rất khó có thể có ích trong việc xác định loài của loại ấu trùng này. Nghiên cứu được thực hiện cho hơn 2000 ấu trùng Diplostomidae từ Châu Phi, Trung Đông, Châu Âu, Châu Á và châu Mỹ. Hai mươi hai loài Diplostomum, Tylodelphys và Austrodiplostomum được phân biệt. Các mối liên kết vòng đời mới, hồ sơ địa lý, lưu trữ, và dữ liệu di truyền đã được ghi nhận cho một số loài, bao gồm Tylodelphys jenynsiae, Tylodelphys immer và Diplostomum ardeae [18]. Năm 2016, Mariana L. Lyra đã tiến hành nghiên cứu mã vạch DNA trong đánh giá tính đa dạng di truyền và ước tính độ phong phú của các loài lưỡng cư. Sử dụng vùng 5' của tiểu đơn vị oxidase (COI) để thu thập mã vạch DNA. Các tác giả đã nghiên cứu điều kiện PCR mới và thử nghiệm mồi mới (AnF1 + AnR1). Kết quả thấy nhiệt độ gia tăng trong phản ứng PCR cải thiện đáng kể hiệu quả khuếch đại. Có thể khôi phục chuỗi COI đối với 100% loài được phân tích. Đó là một cải tiến quan trọng đối với các nghiên cứu trước đây. Kết luận chỉ ra rằng mã vạch DNA là một phương pháp hiệu quả, đơn giản và được chuẩn hóa để xác định sự đa dạng bí ẩn ở động vật lưỡng cư và sử dụng nó trong kiểm kê đa dạng sinh học và trên khắp quần thể rộng khắp các loài đã biết [14].
17 2.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Năm 2014 Dương Văn Tăng và cộng sự thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tiến hành đề tài “Đánh giá khả năng sử dụng mã vạch COI trong việc định loại động vật tại bảo tàng thiên nhiên Việt Nam”, tiến hành với ba mẫu có tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam ký hiệu GN.bttnvn, GC.bttnvn, BHM.bttnvn được giám định hình thái ban đầu và có tên là Gấu ngựa (Ursus thibetanus), Gấu chó (Helarctos malayanus hoặc tên đồng nghĩa: Ursus malayanus) và Báo hoa mai (Panthera pardus) được sử dụng cho phân tích này. Kết quả đã khuyếch đại được vùng gen COI ở Gấu chó, Gấu ngựa có cùng kích thước 623 bp còn ở Báo hoa mai là 653 bp. Phân tích bằng phần mềm máy tính Mega 5.2.2 và chương trình BLAST trên ngân hàng gen quốc tế cho thấy các mẫu vật Gấu ngựa, Gấu chó, Báo hoa mai có tên chính xác như đã xác định loài bằng hình thái. Kết quả mẫu nghiên cứu GN.bttnvn, GC.bttnvn, BHM.bttnvn đã đăng ký thành công vơi Genbank với các mã số công bố KF986481, KF986482 và KF986483. Mức độ tương đồng của các trình tự từ các mẫu nghiên cứu Gấu ngựa, Gấu chó và Báo hoa mai so với dữ liệu công bố trên GenBank lần lượt là 99%, 99,5% và 99,85%. Với kết quả thu được như trên, vùng gen COI có thể được sử dụng để giám định các mẫu động vật quý hiếm không nguyên vẹn [1]. Năm 2014, Dương Thúy Yên thuộc Đại học Cần Thơ tiến hành nghiên cứu “So sánh trình tự một số gen mã vạch của cá rô đầu vuông và cá rô đồng tự nhiên” thu ở xã Vĩnh Thuận Tây, huyện Vị Thủy, tỉnh Hậu Giang, nơi phát hiện cá rô đầu vuông với mẫu cá rô tự nhiên được thu ở 3 nơi, gồm Rừng U Minh Hạ - Cà Mau, vườn quốc gia Tràm Chim, Tam Nông – Đồng Tháp và Châu Thành A – Hậu Giang. Số mẫu thu của mỗi dòng cá là 40 mẫu. Nghiên cứu này nhằm kiểm tra giả thuyết trên dựa vào sự so sánh trình tự 3 gen mã vạch trong ty thể (gen Cytochrom C oxidase subunit 1- COI và Cytochorome
18 b-Cyt b) và trong nhân (Gen Rhodopsin – Rho) giữa cá rô đầu vuông và cá rô tự nhiên thu ở 3 tỉnh. Kết quả tìm thấy 3 dạng trình tự của gen COI (trong 15 mẫu), 3 dạng của gen Cyt b (21 mẫu) và 1 dạng gen Rho (7 mẫu) trong các mẫu nghiên cứu. So sánh trình tự gen COI và Cyt b của cá rô trong nghiên cứu này tương đồng trên 99% với cá rô Anabas testudineus có sẵn ở cơ sở dữ liệu của GenBank và hệ thống BOLD [5]. Năm 2015, Nguyễn Phương Thảo và Dương Thúy Yên tiến hành nghiên cứu đề tài “So sánh đặc điểm hình thái và DNA mã vạch của hai loài cá bống trân Butis butis và Butis humeralis”. Đề tài so sánh đặc điểm hình thái và trình tự gen cytochrome C oxidase subutnit I (COI) của hai “loài” cá bống trân Butis butis và Butis humeralis đã được công bố trong các nghiên cứu trước để kiểm chứng việc định danh hai loài. Kết quả về hình thái, chúng giống nhau ở hình dạng thân, mõm, màu sắc và cấu tạo cơ gốc vi ngực và một số chỉ tiêu đo. Tuy nhiên, chúng khác nhau ở vạch và màu sắc của mắt, vị trí bắt đầu của vi lưng và vi hậu môn, tỉ lệ dài đầu/khoảng cách hai mắt và cao thân/cao cuống đuôi. Về trình tự gen COI, các mẫu của hai loài giống nhau ở mức 99-100%. Khoảng cách di truyền giữa 2 loài (0,003±0,001) tương đương với khoảng cách di truyền trong cùng một loài. Như vậy, 2 nhóm cá bống trân là cùng một loài. Loài này khác với loài B. butis ở Genbank (giống trình tự gen COI ở mức 86%), chứng tỏ việc phân loại loài của cá B. butis trên thế giới chưa rõ ràng và cần tiếp tục được nghiên cứu [4]. Năm 2015, Trần Thị Việt Thanh và cộng sự đã tiến hành đề tài “Sử dụng mã vạch DNA (DNAbarcodes) trong việc xác định mẫu chim tại bảo tàng thiên nhiên Việt Nam”. Đề tài thực hiện giám định tên loài cho 4 mẫu chim thuộc họ Khướu (Timaliidae): 005_BTTNVN (Khướu mào cổ trắng), 028_BTTNVN (Lách tách đầu đốm), 045_BTTNVN (Lách tách mày trắng) và 055_BTTNVN (Khướu mặt đên). DNA được tách từ mẫu máu, sau đó tiến
19 hành phản ứng PCR, tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự vùng gen Barcode (COI) với kích thước khoảng 650bp cho mỗi mẫu. Kết quả giải trình tự cho thấy mước độ tương đồng di truyền cao, 99,7% (028_ BTTNVN/Alcippe castaneceps), 99,8% (045_BTTNVN/ Alcippe vinipectus), 99,28% (99,2-99,5%; 055_BTTNVN/ Garrulax affinis) và mẫu 005_BTTNVN thuộc giống Ynhina, được xác định tên loài Y. diademata trên GenBank. Các thông tin di truyền thu được trên mỗi mẫu đều tương đồng với phân loại bằng hình thái. Bốn trình tự trên đã được đăng ký trên GenBank với mã số là: KP768404, KP768406, KP708406, KP768407 [6].
20 Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu Một số giống vật nuôi phổ biến ở Việt Nam như bò, lợn, dê được thu thập mẫu phục vụ cho nghiên cứu. Mẫu mô tai bò, lợn, dê được thu nhận trên địa bàn các huyện Sơn Dương - Tuyên Quang, huyện Đại Từ - Thái Nguyên, huyện Tam Điệp – Ninh Bình và huyện Lương Sơn – Hòa Bình. Các mẫu mô được thu nhận trong thời gian ngắn, cất giữ trong dung dịch bảo quản thích hợp và vận chuyển nhanh chóng về phòng thí nghiệm. DNA của từng mẫu được thu nhận độc lập, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.1: Các mẫu thí nghiệm phục vụ quá trình nghiên cứu STT Tên mẫu Địa chỉ thu mẫu Ký hiệu 1 Tai bò Phúc Ứng - Sơn Dương - Tuyên Quang B 2 Tai lợn Ký Phú - Đại Từ - Thái Nguyên L 3 Tai dê Hoa Lư –Tam Điệp – Ninh Binh DN1 4 Tai dê Hoa Lư –Tam Điệp – Ninh Binh DN2 5 Tai dê Cao Dương –Lương Sơn –Hòa Bình DH1 6 Tai dê Cao Dương –Lương Sơn –Hòa Bình DH2 Mồi thực hiện phản ứng khuếch đại đoạn gen COI được cung cấp bởi viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. Thông tin của các cặp mồi được liệt kê trong bảng 3.2.
21 Bảng 3.2. Trình tự mồi cho phản ứng PCR Kích Ta Stt Mồi Mẫu Trình tự mồi (5’->3’) thước (oC) (bp) CF1d TTC TCA ACC AAC CAC AAR GAY ATY GG 1 Dê 51 750 CR1d TAG ACT TCT GGG TGG CCR AAR AAY CA CF1l CAT TGG AGT AGT CCT ACT 2 Lợn 56 250 CR1l GTG CAG GAA TAG GAG ATG CF1b AAT GAT ATT TGT CCT CA 3 Bò 56 250 CR1b ACA GGC CTA TTC CAT GCA Ghi chú: Y là nucleotide T hoặc C, R là nucleotide G hoặc A 3.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 3.2.1. Thiết bị nghiên cứu Bảng 3.3. Danh mục các thiết bị được sử dụng STT Tên thiết bị Nguồn gốc xuất xứ 1 Bộ điện di Scie – plas Ltd – UK 2 Bể ổ nhiệt Techne – OSI 3 Cân điện tử TE 214S – Startorius Germany 4 Máy cất nước Canada Bio Water system – Pall Co.UK 5 Máy chụp gel Gel Logic 1500 – Kodal – USD 6 Máy đo pH F – 51 BW – Horiba – Japan 7 Máy ly tâm Eppen dorf – CHLB Đức 8 Máy PCR Amplied Biosystems USD/Singapore 9 Máy spindown E-centrifuge – Wealtex – TaiWan/USA 10 Máy vortex Vortex Genius 3 – IKA Genmany/China 11 Nồi hấp khử trùng HV – 110 – Hirayama – Japan 12 Tủ an toàn sinh học cấp2 Nu – 425 – 400E – Nuaire – USA 13 Tủ lạnh40C, -200C Super freezer Eco 130 – Ficchetti – Italy 14 Máy đo quang phổ kế
22 3.2.2. Hóa chất Các hóa chất chuyên dụng sử dụng cho phân tích sinh học phân tử được trình bày trong bảng 3.3. Bảng 3.4. Danh mục các loại hóa chất được sử dụng STT Tên hóa chất Hãng sản xuất 1 Tris HCl Merck 2 EDTA Merck 3 2-mercaptoethanol Merck 4 Protein K Thermo scientific 5 Rnase Thermo scientific 6 Chloroform Merck 7 Isoamin alcohol Merck 8 Tris Base Merck 9 Acid Acetic Merck 10 Loading Dye Merck 11 Agarose Bio neer 12 Ethidium Bromide Merck 13 Ba cặp mồi nhân gen COI Thermo scientific 14 Master Mix Thermo scientific 15 H20 Thermo scientific 16 Isopropanol Merck 17 Elution Buffer Merck 18 Ethanol Merck 3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm: Bộ môn sinh học phân tử và Công nghệ gen – Viện Khoa học sự sống – Đại học Thái Nguyên – Tổ 10 – Xã Quyết Thắng – TP Thái Nguyên.
23 Thời gian: Đề tài được thực hiện từ ngày 01/01/2019 đến ngày 30/05/2019. 3.4. Nội dung nghiên cứu - Tách chiết DNA genome của bò, lợn, dê. - Nhân gen COI của một số vật nuôi: bò, lợn, dê. - Giải trình tự gen COI. - So sánh, đánh giá DNA barcode của bò với cơ sở dữ liệu. - So sánh, đánh giá DNA barcode của lợn với cơ sở dữ liệu. - So sánh, đánh giá DNA barcode của dê với cơ sở dữ liệu. - Đánh giá DNA barcode đặc hiệu giữa các loài trong nghiên cứu. 3.5. Phương pháp nghiên cứu 3.5.1. Phương pháp lấy mẫu Phương pháp lấy mẫu mô tai được tiến hành như sau: Dùng kìm chuyên dụng lấy một mẩu mô tai đưa vào ống eppendorf chứa cồn 70% bảo quản lạnh ở 40C trong khoảng 24h. Sau đó dùng nước rửa sạch, thấm khô trên giấy thấm rồi đưa vào ống eppendorf chứa cồn 70% khác đembảo quản lạnh ở -200C cho đến khi sử dụng. 3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số Quy trình tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô tai được tiến hành theo các bước sau. Bước 1: Dùng kẹp lấy mẫu ra và thấm khô cồn, sử dụng dao loại bỏ sạch lông cùng các chất bẩn màu đen bám trên mẫu sau đó nghiền nhỏ mẫu. Bước 2: Cho phần mẫu đã nghiền nhỏ vào ống eppendorf 1,5 ml, bổ sung thêm 500µl buffer lysis. Sau đó cho vào máy vortex, rung trong khoảng 15 giây và ủ ở 500C trong 1 giờ (15 phút đảo trộn một lần). Bước 3: Thêm 5 µl Proteinase K vào ống eppendorf , ủ qua đêm ở 500C.
24 Bước 4: Thêm 5 µl Rnase vào ống eppendorf , ủ ở 370C trong 1 giờ. Bước 5: Bổ sung thêm 500 µl CIAA, lắc đều nhẹ bằng tay cho đến khi thấy dung dịch có màu trắng sữa đồng nhất, ủ ở -200C trong 1 giờ. Bước 6: Ly tâm 12000 rpm trong 15 phút, dùng pipette hút và chuyển pha trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới (khoảng 400 µl). Bước 7: Bổ sung thêm isopropanol với tỉ lệ 2:1 với mẫu. Sau khi đảo trộn đều thì ủ ở - 200C trong 2 giờ. Bước 8: Ly tâm 13000 rpm trong 15 phút. Loại bỏ dịch nổi và thu căn DNA. Bước 9: Bổ sung 500µl cồn 70% vào ống eppendorf . Ly tâm 8000rpm trong 5 phút. Bước 10: Đổ hết cồn, “spindow” rồi dùng pipette hút hết cồn dư. Sau đó để khô tự nhiên đến khi cặn DNA trong suốt. Bước 11: Thêm 50 µl dung dịch đệm Elution Buffer. Bảo quản trong tủ -200C. 3.5.3. Phương pháp PCR DNA tổng số được tách chiết sẽ được sử dụng làm khuôn cho phản ứng khuếch đại chỉ thị COI. Bảng 3.5. Thành phần phản ứng PCR Hóa chất Thể tích (µl) Master mix 5 Primer F 0,4 Primer R 0,4 H2O 3,2 DNA khuôn 1 Tổng thể tích 10
25 Trộn đều các thành phần sau đó đặt vào máy PCR, chu trình nhiệt của phản ứng PCR được thực hiện như sau: Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân gen COI ở dê: Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân gen COI ở gà, lợn, bò, chó: 3.5.4. Phương pháp xác định trình tự các nucleotide Các sản phẩm PCR sau khi được khuếch đại sẽ được giải trình tự ở công ty VNDAT tại Malaysia. 3.5.5. Phân tích dữ liệu Trình tự chỉ thị COI của các mẫu nghiên cứu sau khi giải trình tự được so sánh với trình tự các chỉ thị COI đã được công bố trên thư viện mã vạch BOLD và NCBI thông qua phần mềm vecter NTI phiên bản 11.5, phần mềm MEGA 7.0, DNAstar 5.0 và BioEdit.
26 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả tách DNA tổng số Sản phẩm DNA sau khi tách chiết từ các mẫu mô tai và mẫu máu được điện di kiểm tra trên gel agrarose 1%. Kết quả tách chiết DNA tổng số các mẫu mô tai được thể hiện trong hình 4.1. 1 2 3 4 5 6 Hình 4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số mẫu mô tai (Đường chạy số 1 đến số 6 lần lượt là các mẫu L(lợn), B(bò), DH1(dê), DH2(dê), DN1(dê), DN2(dê) Từ kết quả trên có thể thấy, sản phẩm DNA tổng số thu được tương đối đồng đều các băng sáng rõ nét, ít bị đứt gẫy. DNA tổng số được tiến hành xác định độ tinh sạch và hàm lượng DNA bằng máy đo quang phổ kế. kết quả được thể hiện ở bảng 4.1. Bảng 4.1: Kết quả đo độ tinh sạch DNA Mẫu L B DH1 DH2 DH3 DH4 OD260/OD280 1,87 1,89 1,97 1,99 1,93 1,90
27 Từ kết quả trên cho thấy tỉ số OD260/OD280 ở các mẫu nghiên cứu tương đối đồng đều. Kết quả dao động nằm trong khoảng 1,8 đến 2 cho thấy các mẫu DNA tổng số không lẫn tạp nhiều protein hay RNA. Dựa vào kết quả điện di hình 4.1 và kết quả đo độ tinh sạch và nồng độ DNA ở bảng 4.1 cho thấy các mẫu DNA thu được hoàn toàn đủ điều kiện cho phản ứng PCR và các nghiên cứu tiếp theo. 4.2 Kết quả PCR khuếch đại chỉ thị COI Hình 4.2a. Kết quả PCR chỉ thị COI Hình 4.2b. Kết quả PCR chỉ thị COI của của các mẫu DH1, DH2,DN1, DN2 các mẫu B, L (Giếng L: Lader GeneRuler 1kb, đường (Giếng L: Lader GeneRuler 1kb, đường chạy từ 1 đến 4 lần lượt là các mẫu DH1, chạy từ 1 đến 2 lần lượt là các mẫu B, L) DH2 , DN1, DN2) Sản phẩm khuếch đại chỉ thị COI được thể hiện trên hình 4.2a và hình 4.2b. Từ kết quả trên cho thấy các chỉ thị đều được khuếch đại thành công. Sản phẩm PCR chỉ cho một băng sáng duy nhất, không xuất hiện sản phẩm phụ. Đối chiếu với DNA chuẩn của hãng Thermo Scientific, kích thước sản phẩm khuếch đại chỉ thị COI đều có kích thước đúng như dự kiến ~750bp và 250bp. Như vậy, sản phẩm PCR đủ điều kiện để có thể giải trình tự.
28 4.3. Kết quả phân tích các chỉ thị DNA bacoding Các sản phẩm PCR đủ tiêu chuẩn được gửi tới công ty VNDAT tại Malaysia, tại đây các sản phẩm PCR được tinh sạch trước khi giải trình tự. Trình tự được xác định trên máy đọc trình tự tự động theo nguyên lý của Sanger. 4.3.1. Kết quả phân tích chất lượng giải trình tự Chất lượng của kết quả giải trình tự được xác định bằng chỉ số QV (Quality Value) dựa trên phần mềm Seqscanner v1.0 và được chia theo ba cấp độ: Chất lượng thấp, QV nằm trong khoảng từ 0 – 19 (biểu thị màu đỏ); chất lượng trung bình, QV nằm trong khoảng 20 – 30 (biểu thị màu vàng) và chất lượng cao, tương ứng với giá trị QV lớn hơn 30 (biểu thị bàng màu xanh lam) [23]. Giá trị của QV phụ thuộc vào cường độ tín hiệu giải trình tự. Chất lượng các mẫu giải trình tự như sau: DH1 DH2
29 DN1 DN2 L B Hình 4.3: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI các mẫu nghiên cứu theo giái trị QV Qua kết quả kiểm tra chất lượng tín hiệu giải trình tự thể hiện trên hình 4.3 cho thấy đoạn 20 -25 bp đầu tiên và 20 -25 bp cuối (màu đỏ, vàng) của chỉ thị chất lượng thấp, phần màu xanh cho chất lượng tín hiệu giải trình tự cao. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết giải trình tự, do đoạn đầu và cuối phản ứng giải trình tự không ổn định dẫn tới tín hiệu thấp, khi phản ưng ổn định cường độ tín hiệu cao và chính xác.
30 4.4. Kết quả so sánh, phân tích chỉ thị COI các mẫu nghiên cứu 4.4.1. Chỉ thị COI của mẫu dê 4.4.1.1. Kết quả so sánh, phân tích cùng loài Để khẳng định chỉ thị COI đã được khuếch đại là chỉ thị COI của loài Capra hircus (dê). Chúng tôi tiến hành BLAST trình tự COI của 4 mẫu dê nghiên cứu trên (NCBI). Kết quả được thể hiện đại diện trên hình 4.4. Hình 4.4: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu DH1 với chỉ thị COI của Capra hircus đã công bố trên NCBI Kết quả BLAST cho thấy chỉ thị COI của 4 mẫu dê nghiên cứu có sự tương đồng cao là 99% so với các chỉ thị của loài Capra hircus đã được công bố trên GenBank. Từ kết quả trên cho thấy, 4 chỉ thị COI đã được khuếch đại và giải trình tự là chỉ thị của loài Capra hircus. Chúng tôi lựa chọn 3 chỉ thị có mã số LS992610.1, LS992606.1 và LS992662.1 để tiến hành các phân tích và đánh giá tiếp theo (hình 4.5).
31 Hình 4.5. So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của 4 mẫu nghiên cứu với 3 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI
32 So sánh trình tự DNA chỉ thị COI của 4 mẫu nghiên cứu với 3 chỉ thị COI của loài Capra hircus đã được công bố trên NCBI có mã số lần lượt là LS992610.1, LS992606.1 và LS992662.1 bằng phần mềm Bioedit. Từ hình 4.5 ta thu được vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của 4 mẫu nghiên cứu và 3 mâu đã được công bố trên NCBI được thể hiện qua bảng 4.2. Bảng 4.2. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của 4 mẫu nghiên cứu và 3 mẫu đã được công bố trên NCBI Vị trí nucleotide 13 215 323 556 559 Kí hiệu mẫu LS992606.1 C C C T A LS992610.1 C C C T A LS992662.1 C T C T A DH1 - C C C C DH2 - T C C C DN1 - C C C C DN2 - T T C C Từ kết quả thể hiện trên bảng 4.2 và hình 4.5 cho ta thấy chiều dài vùng gen COI của 4 mẫu nghiên cứu và 3 mẫu trên ngân hàng gen khoảng 559 đến 663 bp, tỷ lệ GC nằm trong vùng này khoảng 42,69% đến 43,29% và có 5 điểm sai khác giữa các trình tự so sánh chiếm 0,75%. Như vậy có thể thấy vùng gen COI có sự sai khác về trình tự nucleotide. Sự sai khác này có thể do đột biến mất nucleotide hoặc thay thế nucleotide ở các vị trí khác nhau trong vùng gen COI của các mẫu. Từ đây 4 mẫu dê nghiên cứu và 3 mẫu đã được công bố trên NCBI tiếp tục được phân tích mức độ tương đồng và mức độ sai khác bằng phần mềm MEGAX phiên bản 7.0 (bảng 4.3).
33 Bảng 4.3. Hệ số tương đồng khi phân tích trình tự gen COI của 4 mẫu dê nghiên cứu với 3 trình tự đã được công bố trên NCBI Từ bảng hệ số tương đồng trên cho thấy, vùng gen COI có tính bảo thủ rất cao. Hệ số tương đồng giữa 4 mẫu nghiên cứu và 3 mẫu đã công bố trên NCBI dao động từ 99,987-100% và hệ số sai khác dao động trong khoảng từ 0-0,013%. Hệ số tương đồng cao nhất giữa 2 mẫu đã được công bố trên NCBI là LS992606.1 và LS992610.1 với 2 mẫu nghiên cứu là DH1 và DN1 là 99,997%. Hệ số tương đồng thấp nhất là 99,987% giữa hai mẫu nghiên cứu là DN1 và DN2. 4.4.1.2. Kết quả so sánh, phân tích khác loài Để khẳng định chỉ thị COI của 4 mẫu dê đã được khuếch đại chỉ có ở loài Capra hircus. Chúng tôi tiến hành BLAST trình tự COI của 4 mẫu dê nghiên cứu với trình tự của một số loài khác như Gallus gallus, Sus scrofa , Bos taurus, Canis familiaris trên (NCBI). Kết quả đại diện thể hiện trên (hình 4.6).
34 Hình 4.6: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu DH1 với chỉ thị COI của Gallus gallus đã công bố trên NCBI Kết quả BLAST cho thấy chỉ thị COI của 4 mẫu dê nghiên cứu có sự tương đồng thấp chỉ đạt khoảng 80% so với chỉ thị của loài Gallus gallus, khoảng 91% so với chỉ thị của loài Bos taurus, khoảng 81% so với chỉ thị của loài Canis familiaris và đạt khoảng 82% so với chỉ thị của loài Sus scrofa đã được công bố trên GenBank. Từ kết quả trên cho thấy, 4 chỉ thị COI đã được khuếch đại và giải trình tự chỉ có ở loài Capra hircus mà không có ở bất kỳ một loài nào khác. Như vậy, có thể khẳng định rằng đoạn gen COI của loài Capra hircus có tính đặc hiệu loài cao và có độ tương đồng thấp khi so sánh với các loài khác. Đặc điểm này hoàn toàn phù hợp với đặc điểm của mã vạch DNA và có thể khẳng định rằng cặp mồi “Primer CF1d, Primer CR1d” chỉ nhân thành công chỉ thị COI của loài Capra hircus. 4.4.2. Chỉ thị COI của mẫu lợn 4.4.2.1. Kết quả so sánh, phân tích cùng loài
35 Để khẳng định chỉ thị COI đã được khuếch đại là chỉ thị COI của Sus scrofa (lợn). Chúng tôi tiến hành BLAST chỉ thị COI của mẫu nghiên với các chỉ thị COI của loài Sus scrofa đã công bố trên GenBank (NCBI) (hình 4.7). Hình 4.7: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu L với chỉ thị COI của Sus scrofa đã công bố trên NCBI Từ kết quả trong hình 4.7 cho thấy chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu có độ tương đồng cao lên tới 100% so với loài Sus scrofa đã được công bố trên NCBI. Kết quả trên cho thấy, trình tự COI đã được khuếch đại và giải trình tự là chỉ thị của loài Sus scrofa. Sáu chỉ thị có mã số MG250542.1, KC493612.1, EF545573.1, MH319786.1, MG837549.1 và GU135762.1 được lựa chọn để tiến hành các phân tích và đánh giá tiếp theo.  Phân tích sự sai khác di truyền chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu: So sánh trình tự DNA chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu với 6 chỉ thị COI của loài Sus scrofa đã được công bố trên NCBI có mã số lần lượt là MG250542.1, KC493612.1, EF545573.1, MH319786.1, MG837549.1 và GU135762.1 bằng phần mềm Bioedit (Hình 4.8). Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu và 6 mẫu đã được công bố trên NCBI được thể hiện qua (bảng 4.4).
36 Hình 4.8. So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu với 6 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI Bảng 4.4. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu và 6 mẫu đã được công bố trên NCBI Vị trí nucleotide 41 Kí hiệu mẫu MG250542.1 T KC493612.1 T EF545573.1 T GU135762.1 T L T MH319786.1 C MG837549.1 C Từ kết quả thể hiện trên bảng 4.4 và hình 4.8 cho ta thấy chiều dài vùng gen COI của mẫu nghiên cứu và 6 mẫu trên ngân hàng gen dài khoảng 224bp,
37 tỷ lệ GC nằm trong vùng này khoảng 48,02% đến 48,66% và có 1 điểm sai khác giữa các trình tự so sánh chiếm 0,45%. Như vậy có thể thấy vùng gen COI có sự sai khác về trịnh tự nucleotide, sự sai khác này có thể do đột biến thay thế nucleotide ở các vị trí khác nhau trong vùng gen COI của các mẫu. Từ đây mẫu lợn nghiên cứu và 6 mẫu đã được công bố trên NCBI được phân tích mức độ tương đồng và mức độ sai khác bằng phần mềm MEGAX phiên bản 7.0 (bảng 4.5). Bảng 4.5. Hệ số tương đồng khi phân tích trình tự gen COI của mẫu nghiên cứu với 6 trình tự đã được công bố trên NCBI Từ bảng hệ số tương đồng trên cho thấy, vùng gen COI có tính bảo thủ rất cao. Hệ số tương đồng giữa 1 mẫu nghiên cứu và 6 mẫu đã công bố trên NCBI dao động từ 99,99-100% và hệ số sai khác dao động trong khoảng từ 0- 0,01%. Hệ số tương đồng cao nhât là 100% giữa 4 mẫu đã công bố trên NCBI là EF545573.1, GU135762.1, KC493612.1, MG250542.1 và 1 mẫu nghiên cứu là mẫu L. Hai mẫu có hệ số tương đồng thấp hơn đạt 99,99% so với mẫu nghiên cứu là mẫu MG837549.1 và MH319786.1. 4.4.2.2. Kết quả so sánh, phân tích khác loài Để khẳng định chỉ thị COI của mẫu L đã được khuếch đại chỉ có ở loài Sus scrofa. Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự COI của mẫu lợn nghiên cứu
38 với trình tự của một số loài khác như Gallus gallus, Bos taurus, Canis familiaris đã công bố trên NCBI. Hình 4.9. Kết quả so sánh khác loài Kết quả cho thấy không có trình tự khác loài có mức độ tương đồng đáng kể được tìm thấy trong cơ sở dữ liệu. Điều này có thể do hai lý do: Trình tự quá ngắn hoặc trình tự có mức độ phức tạp thấp (đa số là các nucleotide cùng loại trong trình tự). Tuy nhiên, chiều dài trình tự tra cứu gồm 227 nucleotide vẫn cho kết quả tốt khi so sánh với trình tự cùng loài và các nucleotide không đơn thuần cùng một loại. Vì vậy có thể kết luận trình tự đoạn gen COI của mẫu giải trình tự chỉ có ở loài Sus scrofa mà không có ở bất kỳ một loài nào khác. Như vậy, cặp mồi “Primer CF1l” và “Primer CR1l” đặc hiệu với đoạn gen COI của loài Sus scrofa mà không đặc hiệu cho bất kỳ một trình tự khác loài nào. 4.4.3. Chỉ thị COI của mẫu bò 4.4.1.1. Kết quả so sánh, phân tích cùng loài
39 Để khẳng định chỉ thị COI đã được khuếch đại là chỉ thị COI của Bos taurus. Chúng tôi tiến hành BLAST chỉ thị COI của mẫu nghiên với các chỉ thị COI của loài Bos taurus đã công bố trên GenBank (NCBI). Kết quả được thể hiện đại diện trên hình 4.9. Hình 4.10: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu B với chỉ thị COI của Bos taurus đã công bố trên NCBI Từ kết quả trong hình 4.9 cho thấy chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu có độ tương đồng cao lên tới 99% so với trình tự đã được công bố trên NCBI. Kết quả trên cho thấy chỉ thị COI đã được khuếch đại và giải trình tự là chỉ thị của loài Bos taurus. Chúng tôi lựa chọn 3 chỉ thị có mã số MG847595.1, KT151961.1 và KT260195.1 trong cơ sở dữ liệu để tiến hành các phân tích và đánh giá tiếp theo.  Phân tích sự sai khác di truyền chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu: So sánh trình tự DNA chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu với 3 chỉ thị COI của loài Sus scrofa đã được công bố trên NCBI có mã số lần lượt là MG847595.1, KT151961.1 và KT260195.1 bằng phần mềm Bioedit (hình 4.11, bảng 4.5). Kết quả cho thấy chiều dài vùng gen COI của mẫu nghiên cứu và 6 mẫu trên ngân hàng gen dài khoảng 240bp, tỷ lệ GC nằm trong vùng này khoảng 39,09% đến 40,42% và có 2 điểm sai khác giữa các trình tự so sánh chiếm 0,83% . Như vậy có thể thấy vùng gen COI có sự sai khác về trình
40 tự nucleotide, sự sai khác này có thể do đột biến thay thế nucleotide ở các vị trí khác nhau trong vùng gen COI của các mẫu. Hình 4.11. So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của mẫu B nghiên cứu với 3 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI Bảng 4.6. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của mẫu B nghiên cứu và 3 mẫu đã được công bố trên NCBI Vị trí nucleotide 3 184 Kí hiệu mẫu MG847595.1 C C KT151961.1 C C KT260195.1 C C B A T
41 Tiếp tục tiến hành phân tích mức độ tương đồng và mức độ sai khác giữa mẫu bò nghiên cứu và 3 mẫu đã được công bố trên NCBI bằng phần mềm MEGAX phiên bản 7.0 (bảng 4.6) Bảng 4.7. Hệ số tương đồng khi phân tích trình tự gen COI của mẫu nghiên cứu với 3 trình tự đã được công bố trên NCBI Từ bảng hệ số tương đồng trên cho thấy, vùng gen COI của bò có tính bảo thủ rất cao. Hệ số tương đồng giữa mẫu nghiên cứu và 3 mẫu đã công bố trên NCBI dao động từ 99,99-100% và hệ số sai khác dao động trong khoảng từ 0-0,01%. 4.4.1.2. Kết quả so sánh, phân tích khác loài Để khẳng định chỉ thị COI của mẫu B đã được khuếch đại chỉ có ở loài Bos taurus. Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự COI của mẫu bò nghiên cứu với trình tự của một số loài khác như Gallus gallus, Sus scrofa, Canis familiaris đã công bố trên NCBI .
42 Hình 4.12: Kết quả so sánh trình tự khác loài Kết quả cho thấy không có trình tự khác loài có mức độ tương đồng đáng kể được tìm thấy trong cơ sở dữ liệu. Biết rằng chiều dài trình tự tra cứu gồm 253 nucleotide, cho kết quả BLAST tốt khi so sánh với trình tự cùng loài và các nucleotide có thành phần không đồng nhất. Vì vậy có thể kết luận trình tự đoạn gen COI của mẫu giải trình tự chỉ có ở loài Bos taurus mà không có ở bất kỳ một loài nào khác. Cặp mồi “Primer CF1b” và “Primer CR1b” là cặp đặc hiệu với đoạn gen COI của loài Bos taurus .
43 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận - Đã tách chiết được DNA tổng số của 6 mẫu nghiên cứu gồm: Mẫu tai bò, mẫu tai lợn và 04 mẫu tai dê. - Đã khuếch đại được chỉ thị COI của các mẫu mô bò, lợn, dê bằng phương pháp PCR . - Đã giải trình tự thành công gen COI của 03 loài vật nuôi phổ biến ở Việt Nam là bò, lợn, dê. - Đã có cơ sở khẳng đị`được trình tự gen COI nghiên cứu có tình đặc hiệu loài, là DNA barcode cho các loài vật nuôi bò, lợn, dê của Việt Nam. - Đã so sánh, đánh giá được tính tương đồng rất cao của trình tự DNA barcode đang nghiên cứu với trình tự cùng loài trên cơ sở dữ liệu. - Khẳng định được DNA barcode của bò và lợn không có sự tương đồng đáng kể với các trình tự khác loài. DNA barcode của dê có mức tương đồng thấp với trình tự gen của các loài khác trên cơ sở dữ liệu. 5.2. Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu xây dựng DNA barcode cho tất cả các loài động thực vật của Việt Nam. Xây dựng DNA barcode cho những loài động vật quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng. Xây dựng DNA barcode cho những loài gây bệnh ở cây trồng.
44 TÀI LIỆU THAM KHẢO I.Tài liệu tham khảo tiếng việt 1. Dương Văn Tăng ,Vũ Đình Duy, Trần Thị Việt Thanh(2014). “Đánh giá khả năng sử dụng mã vạch COI trong việc định loại động vật tại bảo tàng thiên nhiên Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 12(4): 631-638. 2. Khuất Hữu Thanh (2006), Cơ sở kỹ thuật di truyền và kỹ thuật gen, NXB khoa học và kĩ thuật Hà Nội, Hà Nội. 3. Khuất Hữu Thanh (2012), Cơ sở Di Truyền Phân Tử và Kỹ Thuật Gen, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. 4. Nguyễn Phương Thảo và Dương Thúy Yên (2015), “So sánh đặc điểm hình thái và DNA mã vạch của hai loài cá bống trân Butis butis và Butis humeralis”, Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ. 5. Phạm Thị Trang Nhung và Dương Thúy Yên (2014), “Đánh giá sự đa dạng di truyền của các dòng cá rô đồng bằng các chỉ thị phân tử RAPD và ISSR”, Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ. 6. Trần Thị Việt Thanh, Vũ Đình Duy, Nguyễn Minh Tâm (2015), "Sử dụng mã vạch DNA (DNA barcodes) trong việc xác định mẫu chim tại bảo tàng thiên nhiên việt Nam", Tạp chí sinh học, 37(4), 429-436. 7. Trần Trang Nhung (2005), Giáo trình nuôi dê, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. II.Tài liệu tham khảo tiếng anh 8. Aron J. Fazekas Maria L. Kuzmina, Steven G. Newmaster, Peter M. Hollingsworth (2012), "DNA barcoding Methods for Land Plant". 9. Emre Keskin, Sevan Agdamar, Ali Serhan Tarkan (2012), “DNA barcoding common non-native freshwater fish species in Turkey: Low genetic diversity but high population structuring”, Mitochondrial DNA.
45 10. Hugo J. de Boer, Abderrahim Ouarghidi, Gary Martin, Abdelaziz Abbad, Anneleen Kool (2014), “DNA Barcoding Reveals Limited Accuracy of Identifications Based on Folk Taxonomy”, Plos one 9(1):e84291. 11. Joana Costa et al Bruna Campos, Joana S. Amaral, M.Eugénia Nunes, M.Beatriz P.P. Oliveira, Isabel Mafra (2015), " HRM analysis targeting ITS1 and matK loci as potential DNA mini-barcodes for the authentication of Hypericum perforatum and Hypericum androsaemum in herbal infusions ", Food control. 12. Locke SA, Al-Nasiri FS, Caffara M, Drago F, Kalbe M, Lapierre AR, McLauhlin JD, Nie P, Overstreet RM, Souza GT, Takemoto RM, Marcogliese DJ (2015), “Diversity, specificity and speciation in larval Diplostomiidae (Platyhelminthes: Digenea) in the eyes of freshwater fish, as revealed by DNA barcodes”, Int J Parasitol, 45(13):841-55. 13. Locke SA, McLaughlin JD, Dayanandan S, Marcogliese DJ (2010), “Diversity and specificity in Diplostomum spp, metacercariae in freshwater fishes revealed by cytochrome c oxidase I and internal transcribed spacer sequences”, Int J Parasitol, 40(3): 333-343. 14. Mariana L. Lyra, Célio F. B. Haddad, Ana Maria L. de Azeredo-Espin (2016), “Meeting the challenge of DNA barcoding Neotropical amphibians: polymerase chain reaction optimization and new COI primers”, Molecular Ecology Resources. 15. Paul D. N. Hebert, Alina Cywinska, Shelley L. Balland Jeremy R. deWaard (2003), “Biological identifications through DNA barcodes”, The Royal Society 270. 313-321. 16. R. N. Mishra and D. Joshi "Jiao Gu Lan (2011), "Gynostemma pentaphyllum: The Chinese Rasayan- Current Research Scenario",
46 International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences: 470228. 17. Shilin Chen, et al (2010), “Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA Barcode for Identifying Medicinal Plant Species”, PloS One 5(1):e8613. 18. Techen, Parveen, Pan, Khan (2014) "DNA barcoding of medicinal plant material for identification", Curr Opin Biotechnol 25: 103-110. III. Tài liệu trang web 19. nong/chuyen-giao-tbkt/giai-phap-phat-trien-chan-nuoi-gia-suc-o-cac- tinh-mien-nui-phia-bac-mo-rong-dien-tich-trong-co_t114c30n12928. 20. 21. post203680.html 22. cuu-ung-dung-o-viet-nam/
PHỤ LỤC
Hình 1: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI mẫu DH1
Hình 2: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI mẫu DH2
Hình 3: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI mẫu DN1
Hình 4: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI mẫu DN2 Hình 5: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI mẫu B
Hình 6: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI mẫu L