Khóa luận Nghiên cứu bảo tồn và phát triển lan hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) đặc hữu bằng nhân giống In vitro tại khu vực Thái Nguyên

89 trang thiennha21 20/04/2022 3560

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Nghiên cứu bảo tồn và phát triển lan hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) đặc hữu bằng nhân giống In vitro tại khu vực Thái Nguyên", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

khoa_luan_nghien_cuu_bao_ton_va_phat_trien_lan_hai_tran_lien.pdf

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu bảo tồn và phát triển lan hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) đặc hữu bằng nhân giống In vitro tại khu vực Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN CÔNG MINH NGHIÊN CỨU BẢO TỒN VÀ PHÁT TRIỂN LOÀI LAN HÀI TRẦN LIÊN (PAPHIOPEDILUM TRANLIENIANUM) ĐẶC HỮU BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG IN VITRO TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Lâm nghiệp Khoa : Lâm nghiệp Khóa học : 2016 - 2020 Thái Nguyên - Năm 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN CÔNG MINH NGHIÊN CỨU BẢO TỒN VÀ PHÁT TRIỂN LOÀI LAN HÀI TRẦN LIÊN (PAPHIOPEDILUM TRANLIENIANUM) ĐẶC HỮU BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG IN VITRO TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành đào tạo : Lâm nghiệp Lớp : K48 - Lâm sinh Khoa : Lâm nghiệp Khóa học : 2016 - 2020 Thầy giáo hướng dẫn : Ths. Nguyễn Văn Mạn Thái Nguyên - Năm 2020
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu bảo tồn và phát triển loài lan hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) đặc hữu bằng phương pháp nhân giống In vitro tại tỉnh Thái Nguyên” là công trình nghiên cứu của bản thân, công trình được thực hiện dưới sự hướng dẫn của Ths. Nguyễn Văn Mạn và cô Ths. Nguyễn Thị Tình (khoa CNSH&CNTP). Những phần sử dụng tài liệu tham khảo trong khóa luận đã được nêu rõ trong phần tài liệu tham khảo. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong khóa luận là quá trình theo dõi hoàn toàn trung thực, nếu có sai sót gì tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm và chịu mọi hình thức kỷ luật của khoa và nhà trường đề ra. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Xác nhận GV hướng dẫn Người viết cam đoan THS. NGUYỄN VĂN MẠN TRẦN CÔNG MINH Xác nhận của GV phản biện
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành chương trình đào tạo, mỗi sinh viên đều phải thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Xuất phát từ nguyện vọng của bản thân, được sự đồng ý của giáo viên hướng dẫn, Ban chủ nhiệm khoa Lâm nghiệp, Ban giám hiệu trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bảo tồn và phát triển loài lan hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) đặc hữu bằng phương pháp nhân giống In vitro tại tỉnh Thái Nguyên” Trong quá trình thực hiện, tôi nhận được sự hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo trong khoa Lâm nghiệp, đặc biệt thầy giáo Ths. Nguyễn Văn Mạn (khoa Lâm nghiệp) là người trực tiếp hướng dẫn, cô giáo Ths. Nguyễn Thị Tình (Khoa CNSH&CNTP) đã chỉ bảo, hướng dẫn điều tra, thí nghiệm thu thập số liệu; Cùng các bạn sinh viên khóa 48 (CNSH) trong nhóm nghiên cứu về lan hài giúp tôi thực hiện đề tài. Cùng với sự nỗ lực, cố gắng của bản thân và sự giúp đỡ của các quý thầy cô giáo, đến nay tôi hoàn thành khóa luận. Cũng nhân dịp này cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới tất cả sự giúp đỡ đó. Do điều kiện và thời gian có hạn, trình độ bản thân còn hạn chế nên khóa luận không tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy, tôi kính mong nhận được sự góp ý của các thầy cô giáo và các bạn sinh viên để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên,ngày tháng năm 2020 Sinh viên Trần Công Minh
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN vi DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG KHÓA LUẬN vii Phần 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2 1.2.1. Mục tiêu cụ thể của đề tài 2 1.2.2 Yêu cầu của đề tài 3 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 1.3.1. Ý nghĩa khoa học 3 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn 3 Phần 2: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4 2.1. Cơ sở khoa học của vấn đề nghiên cứu 4 2.1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm của lan Hài 4 2.1.2. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam 8 2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam 10 2.2.1 Tình hình nghiên cứu về lan Hài trên thế giới 10 2.2.2. Tình hình nghiên cứu lan hài ở Việt Nam 13 2.3. Tổng quan khu vực nghiên cứu 15 2.3.1. Điều kiện tự nhiên của tỉnh Thái Nguyên 15 2.3.2. Điều kiện kinh tế - xã hội của Thái Nguyên 19 Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 21 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 21 3.3. Nội dung 21
iv 3.4. Phương pháp nghiên cứu 22 3.4.1 Phương pháp tiếp cận 22 3.4.2 Điều tra thực địa 22 3.4.3. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 27 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 4.1. Đặc điểm nông sinh học lan hài Trần Liên ở tỉnh Thái Nguyên 30 4.1.1. Đặc điểm phân bố của lan hài Trần Liên ở Thái Nguyên 30 4.1.2 Đặc điểm hình thái của lan hài Trần Liên 34 4.1.3 Đặc điểm sinh thái của hai loài lan hài Trần Liên 41 4.2. Kỹ thuật nhân giống lan hài Trần Liên 45 4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng 45 4.2.2 Nhân nhanh protocorm và chồi lan hài Trần liên ở phòng nuôi cấy mô khoa CNSH & CNTP trường ĐHNL Thái Nguyên 46 4.2.3. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng ra rễ của cây lan hài Trần Liên 50 4.3 Đề xuất mọt số giải pháp chủ yếu trong bảo tồn và nhân giống lan hài Trần Liên 52 4.3.1Các giải pháp chủ yếu về bảo tồn loài lan hài Trần Liên 52 4.3.2 Các biện pháp chủ yếu về nhân giống bằng phương pháp in-vitro loài lan hài Trần Liên 55 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 5.1. Kết luận 58 5.2. Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 65
v DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT B5 : Gambrorg’s BA : 6-Benzyladenine BT : Bình thường Cs : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation Đ/C : Đối chứng Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LED : Light emitting diodes LSD : Least Singnificant Difference Test MS : Murashige & Skoog’s, 1962 MT : Môi trường NAA : α-Naphthalene acetic acid ND : Nước dừa PLB : Protocorm like body RE : Robert Ernst TN : Thí nghiệm
vi DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN Bảng 4.1. Sinh trưởng trung bình của lan hài Trần Liên theo vùng sinh thái 30 Bảng 4.2. Phân bố mật độ giống lan Trần Liên theo vùng sinh thái 32 Bảng 4.3. Mật độ và sinh trưởng hài Trần Liên theo vị trí địa hình 33 Bảng 4.4 Đường kính gốc (Dtb) lan hài Trần Liên các địa điểm khác nhau 36 Bảng 4.5 Chiều dài (Hlá) và bề rộng (Rlá) của lá lan hài Trần Liên ở các địa điểm khác nhau 37 Bảng 4.6 Phân bố lan hài Trần Liên ở các độ tàn che rừng khác nhau 41 Bảng 4.7 Chỉ tiêu hóa học của đất nơi lan hài Trần Liên phân bố ở vùng nghiên cứu 44 Bảng 4.8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 6 tuần nuôi cấy) 45 Bảng 4.9 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi lan Trần Liên (sau 40 ngày nuôi cấy) 46 Bảng 4.10. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Trần Liên (sau 6 tuần nuôi cấy) 47 Bảng 4.11 Kết quả ảnh hưởng của BA (2,0 mg/l) kết hợp NAA đến khả năng nhân nhanh giống lan Trần Liên (sau 30 ngày nuôi cấy) 49 Bảng 4.12 Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng ra rễ của cây lan hài Trần Liên 51
vii DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG KHÓA LUẬN Hình 4.1 Phân bố tự nhiên của lan hài Trần Liên trên vách đã khu vực thôn Mỏ Ba, xã Tân Long, huyện Đồng Hỷ 31 Hình 4.2: Biểu đồ biểu thị số khóm lan hài Trần Liên điều tra tại hai huyện Võ Nhai và Đồng Hỷ 32 Hình 4.3 Lan hài Trần Liên được sưu tập giống tại Vườn lan, đằng sau khu nhà làm việc của khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên 35 Hình 4.4. Hình thái là của cây lan hài Trần Liên ở địa bàn nghiên cứu 37 Hình 4.5 Hình thái rễ của cây lan hài Trần Liên ở khu vực nghiên cứu 38 Hình 4.6 Hình thái hoa của lan hài Trần Liên đươc mô tả và vẽ tay 39 Hình 4.7 Lan Hài Trần Liên ở ngoài tự nhiên ở xã Thượng Nung, huyện Võ Nhai (Nguyễn Thị Tình, 2019) 40 Hình 4.8 Biểu đồ thể hiện phân bố số khóm và số cây lan hài Trần Liên theo độ tàn che của rừng 41 Hình 4.9 Khả năng tái sinh nảy chồi cây con từ gốc mẹ của lan hài Trần Liên 43 Hình 4.11. Ảnh hưởng của BA (2,0 mg/l) kết hợp NAA đến khả năng nhân nhanh giống lan Trần Liên (sau 30 ngày nuôi cấy) 50 Hình 4.12. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng ra rễ của lan hài Trần Liên 51 Hình 4.13. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng ra rễ lan hài Trần Liên 52
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Châu Á có trên 60 loài lan hài khác nhau, do có giá trị kinh tế cao nên rất nhiều nhà buôn lan trên thế giới đã tìm mọi cách kiếm lan hài ở Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Cămpuchia để tung ra thị trường kiếm lời, bất chấp sự tàn phá hệ thực vật ở các nước có nguồn lan phong phú, nhiều loài lan do khai thác quá mức đã dẫn đến sự tuyệt chủng hoàn toàn trong tự nhiên như loài lan hài Bóng (Paphiopedilum vietnamense) một loài đặc hữu của Việt Nam, gây mất cân bằng sinh thái và môi trường bị đe dọa. Hiện tổ chức CITES (Công ước về buôn bán quốc tế các loài động vật hoang dã nguy cấp) đã nghiêm cấm việc nhập khẩu các giống lan hài Paphiopedilum sang các quốc gia khác. Với sự hiện hữu của hơn 20 loài lan hài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là một trong các quốc gia có nguồn lan hài tự nhiên phong phú nhất, không chỉ về chủng loại mà còn có nhiều loài đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa chuộng. Điều này đã tạo nên tình trạng khai thác và xuất khẩu một cách ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan hài ngày càng hiếm và mất dần trong tự nhiên, gây ran guy cơ tuyệt chủng cho nhiều loài lan hài Việt Nam như P.vitnamense, P.delenatii P.callosum, P.dianthum, nhưng cho tới nay mới chỉ có 14 loài được đưa vào sách đỏ Việt Nam 2007. Trong điều kiện của Việt Nam, việc nhân giống và sản xuất lan hài vẫn chưa phát triển rộng rãi, việc xuất khẩu lan hài trái phép chủ yếu được người dân khai thác từ rừng tự nhiên về. Trước đây lan hài bán theo cân, hiện nay do khai thác ngày càng cạn kiệt. Lan hài Trần Liên (lan hài Chân tím), loài lan hài được mô tả, đặt tên một người phụ nữ Việt Nam bà Trần Ngô Liên đã xuất khẩu loài lan này. Loài lan hài Trần Liên có kích thước nhỏ, cánh hoa màu tía - nâu (hài Chân tím)
2 với chóp màu lục, hình thuôn, bóng, mép lượn sóng, có lông trắng. Lan hài Trần Liên là loài lan hài đặc hữu, phân bố rất hẹp ở Bắc Việt Nam, như ở các tỉnh: Cao Bằng, Bắc Kạn, Tuyên Quang (Na Hang) và Thái Nguyên (Đồng Hỷ: Mỏ Ba; Võ Nhai: Thượng Lung, Thần Sa ). Lan hài Trần Liên được phân hạng: EN A1a,c,d, B1+2e. Đã liệt kê vào Phụ lục 1 của công ước CITES và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) Nghị định số 06/2019/NĐ-CP, Nghị định của Chính phủ, ngày 22/01/2019, về: Quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý, hiếm và thực thi Công ước về buôn bán quốc tế các loài động vật, thực vật hoang dã nguy cấp. [8] Lan hài Trần Liên trong Nghị số:06/2019/NĐ-CP còn gọi là lan hài Chân tím, loài lan này cần được nhân rộng việc gieo ươm để vừa tạo nguồn cây làm cảnh, đồng thời bảo vệ nguồn gen. Như vậy để bảo tồn và nhân nhanh lan hài và tìm ra mối quan hệ đa dạng di truyền giữa chúng tạo nền tảng cho việc chọn lọc cặp bố mẹ làm vật liệu lai tạo là cần thiết không chỉ tạo lên sự đa dạng của các loài lan hài mà còn hướng tới bảo tồn và phát triển bền vững các loài lan hài của Việt Nam. Trước tình hình đó chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu: “Nghiên cứu bảo tồn và phát triển lan hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) đặc hữu bằng nhân giống In vitro tại khu vực Thái Nguyên. 1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu cụ thể của đề tài - Đánh giá được đặc điểm sinh học và sinh thái học (Phân bố, hình thái, sinh thái, sinh trưởng, tái sinh) loài lan hài Trần Liên tại tỉnh Thái Nguyên; - Nghiên cứu nhân nhanh loài lan hài Trần Liên đặc hữu bằng phương pháp nuôi cấy In vitro;
3 - Đề xuất được giải pháp chủ yếu bảo tồn và nhân giống lan hài Trần Liên bằng phương pháp nhân giống In vitro. 1.2.2 Yêu cầu của đề tài Đề tài thu thập số liệu về đặc điểm phân bố, hình thái, sinh thái, tái sinh, sinh trưởng, ra hoa loài lan hài Trần Liên tại tỉnh Thái Nguyên Thu thập mẫu và nhân giống In vitro loài lan hài Trần Liên tại phòng nuôi cấy mô của khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về đặc điểm lâm sinh học, nguồn gen loài lan hài khu vực Đông Bắc. Kết quả của đề tài là tài liệu tham khảo tốt cho công tác nghiên cứu, đào tạo, bảo tồn và phát triển nguồn gen loài lan hài khu vực Đông Bắc Việt Nam. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về đặc điểm sinh học và sinh thái học, phân nhóm theo tính trạng đặc trưng và mức độ đa dạng di truyền của nguồn gen loài lan hài khu vực miền núi phía Bắc. Đây là nghiên cứu đầu tiên về nhân giống một số loài lan hài đặc hữu khu vực miền núi phía Bắc nhằm duy trì, bảo tồn và khai thác có hiệu quả loài lan hài quý của khu vực. Đề xuất được hướng dẫn nhân nhanh hai loài lan hài hài Trần Liên đặc hữu bằng phương pháp nuôi cấy In vitro, góp phần bảo tồn giống hoa quý hiếm trước nguy cơ tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học. Thực tế hai giống lan hài Trần Liên đang bị khai thác mạnh và có nguy cơ tuyệt chủng.
4 Phần 2 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1. Cơ sở khoa học của vấn đề nghiên cứu 2.1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm của lan Hài 2.1.1.1 Nguồn gốc của lan Hài Theo Nguyễn Tiến Bân (1990), Khu phân bố của Paphipeodilum kéo dài từ vùng nhiệt đới ở chân núi Himalaya chạy ngang sang phía đông qua Trung Quốc đến Philippin, xuống đông nam đến hầu hết khắp vùng Đông Nam Á và quần đảo solomon. Paphiopedilum chắc chắn có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á. Sự mở rộng khu phân bố của nó về phía nam và phía đông đến vùng Malaixia và tây nam Thái Bình Dương là do kết quả di cư liên tục của các loài tổ tiên và sự phân ly tỏa tròn thành nhiều loài đặc hữu địa phương và thường có khu phân bố xa nhau. [1] Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, Việt Nam là quốc gia được đánh giá có sự đa dạng sinh học phong phú và là cái nôi của rất nhiều loại lan đặc trưng trong đó có lan Hài. Theo sự thống kê, Việt Nam có khoảng hơn 20 loài lan Hài như: trước tiên phải kể đến lan Hài đỏ (P. delenatii); lan Hài vàng (P. villosum); lan Hài tía (P. purpurathum); lan Hài trắng (P. emersonii); lan Hài vân (P. callosum); lan Hài vân duyên (P. amabile); lan Hài đốm (P. concolor), lan Hài lông (P. hirsutissimum); lan Hài râu (P. parishii) [ Theo Nguyễn Tến Bân (1990),]. [1] 2.1.1.2. Phân loại loài lan hài Phân loại lan hài Theo Nguyễn Tiến Bân (1990) [1] như sau: Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là: - Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là hài Vệ Nữ, phân bố ở các vùng ôn đới. - Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ.
5 - Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon. Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ Lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae).[1] 2.1.1.3. Đặc điểm hình thái của lan hài Theo Trần Hợp (1990) [12], các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có hình dạng bên ngoài rất đa dạng, chúng mang những đặc điểm hình thái: - Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, đôi khi có dạng thân bò. Tất cả các loài đều có thân rễ nhưng đa số rất ngắn. - Lá: Thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên thân. Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm. Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nổi rõ. Mặt dưới lá có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gốc lá. Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng nước và cứng. - Cụm hoa: Thường thẳng đứng hay cong. Một số loài có cuống hoa nằm ngang, một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, nhưng hầu hầu các loài đều có cuống hoa dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ. Tuy nhiên cũng có loài có cụm hoa mang hai hoa, song rất hiếm. Trục cụm hoa có lông tơ dầy và ngắn hay có lông nhung hoặc nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác nhau tùy từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá hoa thường có ít lông
6 tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có lông ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoa nhẵn. - Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và ba cánh hoa ở vòng trong. Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường nổi bật với các vạch hay chấm ở mặt trong. Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấp hơn và hướng xuống phía dưới. Lá đài hợp nằm phía sau của môi thường có một màu tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng. Cả hai lá đều thường có lông tơ dày ở mặt ngoài. Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xoè xuống dưới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn. Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh. Cánh hoa giữa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao hoặc hình chiếc hài. Môi dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy, có lông ở mặt trong và nhẵn ở mặt ngoài. Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị- nhuỵ. Hai nhị đực hữu thụ của vòng trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và hai bên cuốn cột. Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi này. Hầu hết các loài lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn. - Quả: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp. Qủa mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Qủa thường chín trong điều kiên tự nhiên sau khi thụ phấn từ sáu đến mười tháng. - Hạt: Có hình bầu dục, hình con suốt chỉ ngắn,dạng thuôn dài hay hẹp và thường có chiều dìa từ 0,4 - 1,1 mm. Phôi nhỏ, dài từ 0,3 - 0,4 mm. Hạt không có nội nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên. - Rễ: Rễ chùm, có một lớp mô xốp bọc xung quanh các rễ thật, lớp màng xốp này có vai trò trong việc giữ nước và ngăn chặn ánh sáng gay gắt. Sau khi rễ trưởng thành thì có dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnh và không có các búi nấm xung quanh rễ [12].
7 2.1.14. Đặc điểm sinh thái của lan hài Theo Nguyễn Thiện Tịch và các cs (1987), Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng. Một nhóm phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lên đến 1600m, nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở độ cao từ 700m - 2200m. Ngoài ra có một vài cá thể trong nhóm này còn mọc bám ở các khe nứt hay rìa của các vách núi dựng đứng đá granit [16]. Lan Hài của Việt Nam có thể sống trên đất, bám đá và phụ sinh mùn. Các loài sống trên đất thường mọc ở nơi có ít ánh sáng của tán cây rừng, ở nơi sườn núi dốc, các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn. Các loài lan Hài mọc trên đá thường mọc dưới bóng cây của kiểu rừng ít khép tán, chủ yếu là các mỏm đá và ngay bên dưới các đường đỉnh. Các loài phụ sinh mùn chủ yếu sống bám trên vỏ cây gỗ trong các vùng rừng mây mù ẩm độ cao 1200-1500m [16]. Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, ẩm độ cao. Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng thường phải trải qua một giai đoạn khô hạn. Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng nước là hướng thích nghi tốt để cây có thể sống sót được qua đợt khô hạn định kỳ và chúng sẽ nhanh chóng phục hồi khi mùa mưa trở lại. Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ ánh sáng là các nhân tố quan trọng trong sự hình thành và phát triển của quần thể lan Hài.[13] Võ Văn Chi, Dương Tiến Đức (1978) [7] cùng quan điểm với Nguyễn Thiện Tích và cs (1978) [16]: Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều nhau ở các hướng của sườn núi. Nhưng trong các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng phát triển ở các sườn núi phía Bắc, đông Bắc và tây Bắc của núi. Ngày nay, thường chỉ tìm thấy lan Hài mọc thành từng đám nhỏ. Các nơi sống tự nhiên bị phá huỷ bởi con người, sự thay đổi các
8 điều kiện môi trường và việc thu hái lan để bán là những nguyên nhân chính gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của lan Hài trên khắp các vùng của Việt Nam. 2.1.2. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam Theo Nguyễn Công Nghiệp (2006) [15], Lan Hài là một loài cây không những có giá trị thẩm mỹ, giá trị khoa học mà còn có giá trị kinh tế rất cao. Hoa Lan Hài có một nét đẹp kiêu sa, quyến rũ và mềm mại, mang dáng vẻ sang trọng và huyền bí. Hiện nay cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, đời sống con người ngày càng được nâng cao nhu cầu về thưởng thức cái đẹp càng gia tăng. Nghề trồng hoa cây cảnh nói chung và đặc biệt chọn tạo giống hoa lan xuất khẩu nói riêng, đã và đang trở thành một ngành kinh tế thu nhiều lợi nhuận. Cùng quan điểm với Nguyên Công Nghiệp (2006)[15], có Liomid Averynov và Cs (2004) [13], Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao, được sưu tầm và tìm kiếm rất nhiều. Với sự hiện hữu của hơn 20 loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là một trong các quốc gia có nguồn lan Hài tự nhiên phong phú. Không những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa chuộng. Vì vậy tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài một cách ồ ạt, không kiểm soát dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong tự nhiên. Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan Hài càng biến mất nhanh chóng. Bộ Khoa học & Công nghệ (1996) trong Sách đỏ Việt Nam [3]: Lan Hài và các loài thuộc bộ Lan là những loài thực vật bị đe dọa biến mất trước tiên khi môi trường sống tự nhiên bị suy thoái. Nền kinh tế phát triển nhanh chóng dẫn đến ô nhiễm môi trường cùng với diện tích rừng nguyên sinh bị suy giảm nhanh chóng do hoạt động khai thác làm giảm đi nơi sống tự nhiên của lan Hài gây ra nguy cơ tuyệt chủng nhiều loài lan Hài ở Việt Nam hiện nay.
9 Trên thực tế, mức độ đe doạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lan Hài Việt Nam được chỉ ra ở bảng trên đây đã bị thay đổi nhiều trong thời gian gần đây do sự suy giảm nhanh các quần thể được biết. Trong những năm gần đây, qua các đợt điều tra thực địa đã phát hiện ra tốc độ phá huỷ mạnh mẽ trên diện rộng của những khu rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu trên các đỉnh núi đá vôi [1; 13, 16]. Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng. Một công trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài ở Việt Nam của nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004 [1&8]. Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam. Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hài như: - Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắc Lắc), Núi Bà (Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum. - Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn loài P. callosum. - Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn P.dalatensis. - Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò (Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P.micranthum. - Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P.emersoii, P.hangianum, P. malipoense varijackii. - Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài P.gratrixianum. - Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae.
10 - Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha đang bảo tồn loài P. Malipoense. Theo Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật In vitro nhằm nhân nhanh số lượng lớn lan Hài. Đầu tiên phải kể đến Dương Tấn Nhựt, người đầu tiên nuôi cấy thành công lan hài Hồng năm 2005. Sau đó đã có nhiều nhà nghiên cứu khác đã nuôi cấy In vitro thành công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằng, hài Tam Đảo bằng các phương pháp nuôi cấy mô khác nhau {Dẫn theo Hoàng Thị Hạnh (2017) [11]}. 2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam 2.2.1 Tình hình nghiên cứu về lan Hài trên thế giới Tại Ấn Độ, các tác giả L. C. DE, R. P. MEDHI [23] đã nghiên cứu về tính đa dạng và các phương pháp bảo tồn các loài lan quý hiếm vùng Đông Bắc Ấn Độ, các tác giả đã khẳng định trên toàn Ấn Độ có khoảng 1.331 loài hoa lan, thuộc 186 chi, trong đó vùng Đông Bắc Ấn Độ duy trì số lượng cao nhất với khoảng 856 loài. Trong số đó có 34 loài có nguy cơ tuyệt chủng cần bảo tồn, bao gồm loài P. hirsutissimum. Các tác giả đã khẳng định vấn đề ô nhiễm môi trường, sự nóng lên toàn cầu, thương mại hóa nông nghiệp và lâm nghiệp, trồng trọt và khai thác quá mức là những nguyên nhân chính cho sự mất đa dạng. Ấn Độ đã tăng cường về bảo tồn đa dạng sinh học bằng cách thực hiện một loạt các hành vi, quy tắc, luật lệ, quy định, thỏa thuận và mạng lưới phát triển các khu bảo tồn. Các tác giả D. Barman và R. Devadas thuộc Trung tâm nghiên cứu phong lan Quốc gia Ấn Độ cho rằng, biến đổi khí hậu hiện đang là một trong các nguyên nhân chính dẫn đến nguy cơ giảm số lượng và tuyệt chủng của các loài phong lan quý hiếm. Từ đó, tác giả cũng đưa ra một số biện pháp khắc phục như: cần phục hồi và duy trì các hệ sinh thái bản địa, quản lý chặt sinh cảnh của các loài quý, hiếm, có nguy cơ tuyệt chủng, xếp hạng các mức độ dễ tổn thương của các loài và theo dõi, nghiên cứu dài hạn các loài sinh vật giao phấn. {Dẫn theo Hoàng Thị Hạnh (2017) [11]}
11 Tại Iran, bất chấp lệnh cấm khai thác, vấn đề khai thác hoa lan hoang dã nhằm xuất khẩu mỗi năm lên tới 40-50 triệu cây, nhiều loài phong lan trở nên khan hiếm. Lan hài (Paphiopedilum Pritz) là một chi lan đẹp trong họ lan (Orchidaceae Juss) thuộc họ phụ Cypripedioideae. Hơn 2 thập kỷ trở lại đây, lan hài ngày càng được chú ý nhiều hơn ở trên thế giới không chỉ trong việc nuôi trồng, lai tạo mà còn cả trong việc sưu tầm phát hiện những loài lan hài mới. Chính vì vậy chỉ trong một thời gian ngắn, thế giới đã có một loạt các loài lan hài mới được phát hiện và ghi nhận như Paph. armeniacum Chen et Liu (1982); Paph. malipoense Chen et Tsi (1984); Paph. Emersonii Koopowitz et Cribb (1986); Paph. Henryanum Braem (1987); Paph. Malipoense var jackii Hua (1995); Paph.herrmannii Fuchs et Reisinger (1995); Paph. Helenae Aver (1996); Paph. Hiepii Aver (1998); Paph. tranlienianum Gruss & Perner (1998) và Paph.hangianum Perner & Gruss (1999). {Dẫn theo Hoàng Thị Giang và Cs (2010)[9]} Để tạo điều kiện sống tốt nhất cho các giống lan hài được thuần hóa. Koopowitz và Hasegawa (1991) [27] đã xác định điều kiện ánh sáng nhân tạo cho hầu hết các loài lan hài là từ 11.000 - 22.000 lux. Nếu lá bị vàng hoặc phát hoa ngắn là cây quá thừa ánh sáng, còn nếu lá mềm, màu xanh đậm hoặc phát hoa dài, yếu, là bởi do thiếu ánh sáng. Cây từ rừng về không ra hoa nguyên nhân chính là ánh sáng và nhiệt độ không phù hợp. Ngoài ra, ánh sáng có vai trò quan trọng trong sự nảy mầm của hạt giống, sự tiếp xúc với ánh sáng sẽ ức chế sự nảy mầm và có thể dẫn dến hiện tượng ngủ của hạt gây khó khăn cho quá trình nhân giống. Trong chương trình cải tiến giống của chi lan Hài (Paphiopedilum) theo Huang L. C., Lin C. J., Kou C. I., Huang B. L., Murashige T. (2001), [20] đã nhận thấy phương pháp nuôi cấy vô trùng trong nhân giống lan hài khó thực hiện thành công vì mẫu nuôi cấy của loài này rất khó bảo quản. Nhiều thử nghiệm về mẫu cấy như chồi đỉnh, chồi lấy từ cây con nẩy mầm trong ống nghiệm hoặc môi trường nuôi cấy mô sẹo từ protocorm, tái sinh lan hài thông
12 qua sự hình thành chồi từ nuôi cấy lá . đã được thực hiện nhưng tỉ lệ hình thành mô sẹo và khả năng tái sinh còn rất thấp. Theo Hong P. I., Chen J. T., Chang W. C. (2008) [89] và Liao Y. J., Tsai Y. C., Sun Y. W., Lin R. S., Wu F. S. (2011) [28]: Một phương pháp khác được ứng dụng là sử dụng hạt lan hài nẩy mầm In vitro để sản xuất cây con. Từ cây con In vitro, các mô sẹo được cảm ứng từ protocorm có nguồn gốc từ hạt, được cấy chuyền trên môi trường có chứa nồng độ 2,4-D và TDZ cao, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua bước trung gian hình thành PLB. Một mảnh nhỏ mô sẹo này có thể tái sinh từ 3-7 chồi trong 3 tháng và chúng có thể được giữ trên môi trường nuôi cấy trong 3 năm mà không mất đi khả năng tái sinh. Tuy nhiên vẫn còn một số vấn đề chưa được giải quyết như tính bền vững về mặt di truyền của những cây được tái sinh Các tác giả cũng đã tiến hành phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào từ những dòng mô sẹo có nguồn gốc từ protocorm và nuôi cấy mô sẹo có tính toàn thể từ những loại mô khác của Paphiopedilum. Ở Ấn Độ theo Indian Journal of Hill Farming 27(1) [23], đã nghiên cứu nhân giống Paphiopedilum trong In vitro thông qua phương pháp hình thành các thể protocorm thứ cấp từ thể protocorm sơ cấp được phát triển từ callus có nguồn gốc từ thân. Các thể protocorm được nuôi cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung các nồng độ BA và Kinetin khác nhau (1.0, 2.0, 3.0, và 4.0 μM) để cảm ứng các PLB thứ cấp. Số lượng PLB thứ cấp được hình thành nhiều nhất trên môi trường ½ MS có bổ sung 4.0 μM Kinetin, trung bình có 4.1 PLB được hình thành trên mỗi mẫu sau 8 tuần nuôi cấy. Các PLB thứ cấp được nhân lên từ 9,5-12,1 PLBs mới. Mỗi PLB thứ cấp sau khi được cấy chuyển trên môi trường ½ MS không có chất điều hòa sinh trưởng và được bổ sung 60 g/l dịch chiết chuối. Các PLB thành thục này sẽ được nuôi cấy trên môi trường có chứa các chất hữu cơ khác nhau như nước dừa, dịch chiết chuối, khoai tây, cà chua để tái sinh hình thành cây con. Trong số các chất hữu cơ được thử nghiệm, việc bổ sung 20% CW trên
13 môi trường ½ MS có kết quảtỷ lệ tái sinh trung bình là 67,9% PLBs, sau 8 tuần nuôi cấy. 2.2.2 Tình hình nghiên cứu lan hài ở Việt Nam Hiện nay, hầu hết các nghiên cứu về lan hài ở Việt Nam mới chỉ tập trung vào công tác điều tra, khảo sát và thu thập bảo tồn. Các nghiên cứu về chọn tạo, kỹ thuật sản xuất còn ít chỉ tập trung ở một số Viện, trường và Trung tâm ứng dụng kỹ thuật. Các nghiên cứu ở trong nước Trần Hợp (1990) [12], Nguyễn Thiện Tịch và Cs.(1987) [16] đã cho thấy Việt Nam là nước nằm trong vùng Đông Nam Á, thuộc châu Á nhiệt đới - một trong hai khu vực tập trung nhiều loài lan đẹp nhất thế giới. Riêng về lan hài, Việt Nam nằm trọn bộ ở một trong hai khu vực có phân bố lan hài của thế giới, cho nên trong khoảng 70 loài lan hài nguyên chủng được công bố trên thế giới, Việt Nam đã có khoảng 23 loài và có những loài đặc hữu, chỉ Việt Nam mới có như Paph.delenatii (hài đỏ hay hài hồng), Paph.vietnamense (Lan hài Trần Liên), Paph.hangianum (Hài hằng) được cả thế giới ưa chuộng. Lan hài và Hoàng thảo Việt Nam được phát hiện nhiều nhất ở khu vực Hoàng Liên Sơn, khu vực biên giới các tỉnh Bắc Trung bộ, khu vực núi Ngọc Linh và khu cao nguyên Lâm Viên. Bên cạnh sự đa dạng, phong phú về chủng loại, các loài lan hài ở Việt Nam còn được cả thế giới đánh giá rất cao bởi cả 3 loài lan hài có hương thơm duy nhất của thế giới (Paph.delenatii, Paph.emersonii, Paph.hangianum) đều có ở Việt Nam và 2 trong 3 loài được coi là đặc hữu (Paph.delenatii, Paph.hangianum). Việc phát hiện và ghi nhận những loài lan hài mới vẫn còn tiếp tục, điều đó đã khẳng định sự ưu đãi của thiên nhiên đối với Việt Nam, cần phải bảo vệ và phát triển các loài lan rừng nói chung và lan hài nói riêng. [13] Trần Hợp (1990) [12], Lan hài đỏ của Việt Nam (Paphiopedilum delenatii) đã được phát hiện vào năm 1993 tại Bác Ái, Ninh Sơn, Khánh Hòa
14 bởi Peter Schwott (Đại học Praha, Tiệp Khắc) và Phân viện Sinh học Đà Lạt. Đây là loài thực vật đặc hữu của Việt Nam, được CITES công nhận và bảo vệ. Các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật gây vết thương trong nhân giống loại lan này. Kết quả cho thấy phương pháp gây vết thương kết hợp với nuôi cấy trên môi trường lỏng bổ sung nồng độ thích hợp chất điều hòa tăng trưởng TDZ và NAA đã đem lại một kết quả khả quan trong việc tìm ra phương pháp nhân giống In vitro trên lan hài đỏ. Hệ số nhân được thiết lập thông qua phương pháp gây vết thương và nuôi cấy trên môi trường lỏng là 52, cho hiệu quả hơn gấp 25 lần so với phương pháp nhân giống bằng cách gieo hạt In vitro đơn thuần. Để góp phần bảo tồn nguồn gen hài quý, Viện sinh học NN - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã nghiên cứu quy trình nhân giống 3 loài lan hài là Paphiopedilum.sp.laichau A2, Paphiopedilum.hangianum perner Gurss (hài Hằng)và Paphiopedilum.sp. 720. Kết quả nghiên cứu đã tìm ra môi trường thích hợp nhất để gieo hạt giống là môi trường RE, môi trường thích hợp để tạo chồi protocorm và nhân nhanh là RE + 100g/l dịch chiết chuối +150ml/l nước dừa. Môi trường ra rễ cho hài hằng là RE + 100g/l dịch chiết chuối + 0,4ppm α-NAA, cho giống P.sp.laichauA2và P.sp.720 là RE + 100g/l dịch chiết chuối + 0,6ppm α-NAA. Ở giai đoạn vườn ươm, giá thể thích hợp là dớn cho tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt (hài Hằng là 80%, P.sp.720 là 86.,67%). Phân bón thích hợp ở giai đoạn cây con là NPK (30:10:10) với lượng bón là 1g/l và phun 2 lần/tuần. {Dẫn theo Hoàng Thị Giang và cs (2010) [9]}. Năm 2007, Trần Phạm Anh Tuấn (Đà Lạt, Lâm Đồng) bước đầu đã tạo ra được nhiều dòng lan hài bằng phương pháp lai tạo từ các giống lan hài rừng, trong đó có dòng hài mới với nhiều đặc điểm khác lạ như lá màu đốm trắng, hoa có mùi thơm, cánh hoa màu đỏ tím với nhiều vân sọc sẫm, lưỡi hoa có màu
15 chấm tím, đã bổ sung thêm vào tập đoàn lan hài của Đà Lạt. {Dẫn theo: Hoàng Thị Hạnh (2017)[11]} Để phát triển một số loài lan hài bản địa của Sapa - Lào Cai, trong những năm qua Viện Di truyền Nông nghiệp cũng đã tiến hành nghiên cứu, xây dựng một số biện pháp kỹ thuật như giá thể trồng là hỗn hợp xơ dừa hoặc dớn sợi, than gỗ vụn, lá khô vụn, phân gia súc khô. Nước tưới có pH từ 6,2- 6,6.Phân bón NPK với tỉ lệ 20:20:20 hoặc 14:14:14, bổ sung 30-40mg/l Ca và 20-30mg/l Mg để làm tăng khả năng sinh trưởng của cây. Ở Việt Nam việc chơi và tiêu thụ lan hài, chủ yếu là sử dụng nguồn lan tự nhiên, khai thác từ rừng đã làm cho nguồn tài nguyên này bị suy kiệt nhanh chóng, nên rất cần thiết phải có công tác nghiên cứu, tuyển chọn và xây dựng quy trình kỹ thuật sản xuất, đặc biệt là quy trình nhân giống không chỉ đáp ứng nhu cầu tiêu dùng mà còn để bảo vệ nguồn gen quý hiếm, bảo vệ tính đa dạng sinh học của các loài lan hài đã được ghi nhận trong sách đỏ Việt Nam.[10] 2.3. Tổng quan khu vực nghiên cứu 2.3.1. Điều kiện tự nhiên của tỉnh Thái Nguyên 2.3.1.1 Vị trí địa lý Thái Nguyên là tỉnh thuộc vùng miền núi phía Bắc, cách thủ đô Hà Nội 80,4 km về phía Bắc, có toạ độ địa lý như sau: - Từ 20020' đến 22003' vĩ tuyến Bắc; - Từ 105028' đến 106014' kinh tuyến Ðông. Về mặt địa giới hành chính, Thái Nguyên giáp các tỉnh sau: - Phía Bắc tiếp giáp tỉnh Bắc Kạn; - Phía Tây giáp các tỉnh Vĩnh Phúc, Tuyên Quang; - Phía Đông giáp các tỉnh Lạng Sơn, Bắc Giang; - Phía Nam tiếp giáp với Thủ đô Hà Nội.
16 Tổng diện tích tự nhiên tỉnh Thái Nguyên là 3.562,82 km². Thái Nguyên được coi là trung tâm chính trị, kinh tế của khu Việt Bắc nói riêng và của vùng trung du miền núi phía Bắc nói chung, là cửa ngõ giao lưu kinh tế - xã hội giữa vùng trung du miền núi với vùng đồng bằng Bắc Bộ (theo cổng thông tin điện tử- UBND tỉnh Thái Nguyên). 2.3.1.2 Ðịa hình, địa thế của Thái Nguyên Mặc dù là một tỉnh trung du miền núi, nhưng địa hình tỉnh Thái Nguyên lại không phức tạp lắm so với các tỉnh trung du, miền núi khác. Đây là một thuận lợi của tỉnh cho việc canh tác nông, lâm nghiệp và phát triển kinh tế - xã hội. Diện tích vùng núi chiếm khoảng 90,73%; diện tích vùng trung du là chiếm 9,27%. Ðịa hình chủ yếu là đồi núi thấp. Thái Nguyên có nhiều dãy núi cao chạy theo hướng Bắc Nam và thấp dần xuống phía Nam. Cấu trúc vùng núi phía Bắc chủ yếu là đá phong hóa mạnh, tạo thành khá nhiều hang động và thung lũng nhỏ. Phía Tây Nam có dãy Tam Đảo (với đỉnh cao nhất là 1.590 m), các vách núi dựng đứng và kéo dài theo hướng Tây Bắc - Đông Nam. Ngoài ra, dãy núi Ngân Sơn bắt đầu từ Bắc Kạn chạy theo hướng Đông Bắc - Tây Nam đến Võ Nhai và dãy núi Bắc Sơn chạy theo hướng Tây Bắc - Đông Nam. Cả ba dãy núi Tam Đảo, Ngân Sơn và Bắc Sơn đều là những dãy núi cao che chắn gió mùa Đông Bắc. 2.3.1.3 Khí hậu, thuỷ văn của Thái Nguyên * Đặc điểm khí hậu Theo số liệu hàng năm của Trung tâm Khí tượng thủy văn tỉnh Thái Nguyên, nhiệt độ trung bình hàng năm trên địa bàn tỉnh là 22,50C - 23,20C, biên độ nhiệt độ ngày và đêm khá cao từ 7,00C - 7,30C. Nhiệt độ trung bình tối đa là 370C (tháng 7, 8), cao tuyệt đối là 40,30C, trung bình tối thấp là 70C (tháng 1). Nhiệt độ trung bình tháng cao nhất tập trung vào các tháng 6, 7, 8, nhiệt độ tháng thấp nhất từ tháng 12 đến tháng 2 năm sau. Điều đáng lưu ý là nhiệt độ trung bình hàng năm ở phía Bắc và phía Nam của tỉnh chỉ chênh
17 nhau khoảng 0,50C - 1,00C, song nhiệt độ thấp tuyệt đối trong mùa đông chênh lệch nhau khá nhiều (ở Định Hóa là 0,40C còn ở thành phố Thái Nguyên là 30C). Tổng số giờ nắng trong năm dao động từ 1.300 đến 1.750 giờ và phân phối tương đối đều cho các tháng trong năm. Mùa đông thường chia thành 3 vùng rõ rệt: Vùng lạnh nhiều (ở huyện Võ Nhai); vùng lạnh vừa (gồm các huyện Định Hóa, Phú Lương và phía nam huyện Võ Nhai); vùng ấm (gồm các huyện Đại Từ, thành phố Thái Nguyên, Đồng Hỷ, Phú Bình, Phổ Yên và thị xã Sông Công). Lượng mưa trung bình hàng năm đạt khoảng 2.000 - 2.500 mm (cao nhất vào tháng 8 và thấp nhất vào tháng 1). Mưa thường tập trung từ tháng 5 đến tháng 10, lượng mưa trong thời gian này đạt 1.471 mm ở Định Hóa và 1.726 mm ở thành phố Thái Nguyên, chiếm khoảng 85 - 87% tổng lượng mưa cả năm. Tần suất sương muối thường xảy ra vào cuối tháng 12 và tháng 1 hàng năm. Khu vực thường hay xuất hiện thời tiết sương muối là Võ Nhai, Phú Bình. Độ ẩm không khí trung bình từ 80 - 85%. * Chế độ thủy văn Thái Nguyên có hai sông chính chảy qua là sông Công và sông Cầu. Hai sông này là nguồn cấp nước chính cho nền kinh tế, dân sinh của tỉnh. Sông Công có lưu vực 951 km2, bắt nguồn từ vùng núi Ba Lá huyện Định Hoá, chạy dọc theo chân núi Tam Đảo. Dòng sông đã được ngăn lại ở Đại Từ, tạo thành Hồ Núi Cốc có mặt nước rộng khoảng 25 km2. Hồ này chứa được 175 triệu m3 nước, chủ động tưới tiêu cho 12.000 ha lúa 2 vụ, hoa màu, cây công nghiệp và cung cấp nước sinh hoạt cho thành phố Thái Nguyên và thị xã sông Công. Sông Cầu nằm trong hệ thống sông Thái Bình, có lưu vực 3.480 km2, bắt nguồn từ Chợ Đồn chảy theo hướng Bắc - Đông Nam. Lưu lượng nước mùa mưa là 3500 m3/s, mùa kiệt là 7,5 m3/s. Trên sông này có hệ thống thuỷ nông Sông Cầu (trong đó có đập dâng thác Huống) tưới cho 24.000 ha lúa 2 vụ của huyện Phú Bình (Thái Nguyên) và Hiệp Hoà, Tân Yên (Bắc Giang).
18 Mùa lũ trên các sông trong tỉnh bắt đầu từ tháng 5 và kết thúc vào cuối tháng 10, đầu tháng 11, tỷ lệ xuất hiện lũ nhiều vào các tháng 6 - 9. Số trận lũ trung bình/năm từ 1,5 - 2,0 trận, năm nhiều có tới 4 trận lũ. Mùa khô bắt đầu vào tháng 11 và kết thúc vào cuối tháng 4. Lượng nước trên sông trong các tháng này bình quân mỗi tháng chỉ bằng 0,5 - 2,0% tổng lượng nước trên sông cả năm. 2.3.1.4 Địa chất, thổ nhưỡng Theo tài liệu thổ nhưỡng và kết quả điều tra bổ sung những năm gần đây cho thấy tỉnh Thái Nguyên có nhiều loại đất khác nhau được hình thành bởi quá trình feralit. - Đất feralit núi chiếm 48,1 % diện tích tự nhiên, phân bố ở độ cao trên 200m. - Đất feralit đồi chiếm 31,1 % diện tích tự nhiên. - Đất dốc tụ và đất đồng bằng trên thềm phù sa cổ, phù sa sông suối chiếm 12,4% diện tích tự nhiên. Điều này cho thấy tài nguyên đất của tỉnh Thái Nguyên khá đa dạng, phần lớn đất đai thích hợp cho phát triển nông, lâm nghiệp. 2.3.1.5 Hiện trạng đất đai và tài nguyên rừng của Thái Nguyên Tổng diện tích đất tự nhiên toàn tỉnh là 3.562,82 km2, trong đó diện tích đất cho sản xuất nông nghiệp chiếm khoảng 23%, diện tích đất có rừng chiếm gần 48%, còn lại là diện tích đất phi nông nghiệp (đất ở, đất chuyên dùng, ). Theo Chương trình Bảo vệ và phát triển rừng, năm 2018, tỉnh Thái Nguyên đã trồng mới 3.040 ha rừng tập trung. Trong đó trồng 2.920 ha rừng sản xuất, 100 ha rừng trồng thay thế và 20 ha rừng phòng hộ. Năm 2019, tỉnh Thái Nguyên tập trung nhiều giải pháp bảo đảm mục tiêu trồng mới 2.554 ha rừng. Tập trung chỉ đạo trồng mới, trồng lại rừng 5.000 ha (Trồng theo Chương trình phát triển lâm nghiệp bền vững 2.500 ha; trồng rừng thay thế 90 ha còn lại do người dân tự bỏ vốn trồng lại rừng và nguồn vốn khác); chăm sóc rừng trồng
19 5.000 ha; khoán bảo vệ rừng 26.000 ha; khai thác gỗ rừng trồng 210.000 m3; tăng cường kiểm tra, giám sát hoạt động khai thác, tiêu thụ gỗ và lâm sản ngoài gỗ; thống kê đầy đủ các chỉ số đưa vào tính giá trị sản xuất ngành Lâm nghiệp trong đó cần thống kê đầy đủ, chính xác sản lượng gỗ khai thác trên địa bàn và bổ sung nguồn thu từ dịch vụ môi trường rừng vào giá trị sản xuất lâm nghiệp; duy trì tỷ lệ che phủ rừng ổn định trên 50% Phấn đấu tăng trưởng giá trị sản xuất lâm nghiệp năm 2019 vượt kế hoạch, đạt 10% trở lên. 2.3.2. Điều kiện kinh tế - xã hội của Thái Nguyên Tỉnh Thái Nguyên có 9 đơn vị hành chính: Thành phố Thái Nguyên; Thị xã Sông Công và 7 huyện: Phổ Yên, Phú Bình, Đồng Hỷ, Võ Nhai, Định Hóa, Đại Từ, Phú Lương. 2.3.2.1. Dân tộc, dân số và lao động Theo điều tra dân số 01/04/2019, năm 2018 dân số tỉnh Thái Nguyên là 1.123.116 người thuộc 325.680 hộ gia đình, trong đó nam có 555.371 người chiếm 49,45% và nữ là 567.745 người chiếm 50,55%, tỉ số giới tính nam/nữ là 97,8/100. Tổng dân số đô thị là 287.265 người (25,6%) thuộc 97.300 hộ và tổng dân cư nông thôn là 835.851 người (74,4%) thuộc 228.380 hộ. Cũng như toàn quốc, Thái Nguyên có một dân số trẻ với nhóm tuổi lao động từ 15 đến 60 là 779.261 người, chiếm 69,38% tổng dân số. Nhóm tuổi dưới 15 có 249.001 người, chiếm 22,17% tổng dân số; Nhóm người trên 60 tuổi có 94.854 người, tức chiếm 8,45%. 2.3.2.2. Giáo dục, y tế * Giáo dục: Thái Nguyên được cả nước biết đến là một trung tâm đào tạo nguồn nhân lực lớn thứ 3 sau Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh với 7 trường Đại học, 11 trường Cao đẳng và trung học chuyên nghiệp, 9 trung tâm dạy nghề, mỗi năm đào tạo được khoảng gần 100.000 lao động. * Y tế: Thái Nguyên được coi là một Trung tâm y tế của vùng Đông Bắc với 01 Bệnh viện Đa khoa TW, 9 Bệnh viện cấp tỉnh và 14 Trung tâm y tế cấp
20 huyện, với hệ thống khá hiện đại và hoàn chỉnh. Hoạt động y tế được duy trì thường xuyên, liên tục, đan xen với các chương trình quốc gia, từ tuyến tỉnh đến các trạm y tế cơ sở đã đẩy lùi nhiều bệnh tật, tăng cường chăm sóc sức khỏe người dân, tạo được niềm tin trong đồng bào dân tộc. 2.3.2.3. Cơ sở hạ tầng * Giao thông: Thái Nguyên có vị trí rất thuận lợi về giao thông, cách sân bay quốc tế nội bài 50 km, cách biên giới Trung Quốc 200 km, cách trung tâm Hà Nội 75 km. Thái Nguyên còn là điểm nút giao lưu thông qua hệ thống đường bộ, đường sắt, đường sông hình rẻ quạt kết nối với các tỉnh thành, đường quốc lộ 3 nối Hà Nội đi Bắc Kạn; Cao Bằng và cửa khẩu Việt Nam - Trung Quốc; quốc lộ 1B Lạng Sơn; quốc lộ 37 Bắc Ninh, Bắc Giang. Hệ thống đường sông Đa Phúc - Hải Phòng; đường sắt Thái Nguyên - Hà Nội - Lạng Sơn. * Mạng lưới điện: Thái Nguyên là tỉnh có lưới điện tương đối hoàn chỉnh. Toàn bộ các huyện trong tỉnh đều có lưới điện quốc gia, trong đó thành phố Thái Nguyên, thị xã Sông Công và các thị trấn, huyện có lưới điện hoàn chỉnh, đáp ứng tốt cho nhu cầu sinh hoạt và sản xuất. * Hệ thống nước sạch và tưới tiêu: Thái Nguyên có 2 nhà máy nước là Thành phố Thái Nguyên và Thị xã Sông Công (công suất của Nhà máy nước Thái Nguyên đạt 30.000 m3/ngày đêm; nhà máy nước thị xã Sông Công với công suất thiết kế 30.000 m3/ngày đêm). Một số thị trấn huyện lỵ của tỉnh đã có hệ thống cấp nước sạch. Toàn tỉnh có 1.146 công trình thuỷ lợi, hơn 1.400 km kênh mương được kiên cố, bảo đảm tưới tiêu ổn định cho 23.000 ha lúa xuân, 34.000 ha lúa vụ mùa, 5.000 ha ngô đông,
21 Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Loài lan hài Trần Liên được điều tra và thu thập mẫu lấy giống từ rừng tự nhiên tại Thái Nguyên. 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu Chỉ nghiên cứu loài lan hài Trần Liên được điều tra tại hai huyện: Huyện Đồng Hỷ: Xã Tân Long (2.534,5 ha rừng tự nhiên) và xã Văn Lăng (2.775,56 ha rừng tự nhiên); Huyện Võ Nhai: Xã Thần Sa (8.209,6 ha rừng tự nhiên) và xã Thượng Nung (3.866,0 ha rừng tự nhiên); Các xã này có tỷ lệ đất nâu đỏ trên núi đá vôi thấp <500 m, phù hợp với lan hài Trần Liên phân bố. Mẫu giống lấy từ rừng tự nhiên, nhân giống bằng phương pháp nhân giống In vitro. 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2020 đến tháng 07 năm 2020. Địa điểm nghiên cứu: Khảo sát phân bố, đặc điểm sinh học và sinh thái học, lấy giống từ rừng tự nhiên các huyện: Võ Nhai; Đồng Hỷ của tỉnh Thái Nguyên; Nhân giống tại Khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. 3.3. Nội dung - Nội dung 1: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và sinh thái học loài lan hài Trần Liên (Đặc điểm hình thái, sinh học, sinh trưởng, tái sinh) tại tỉnh Thái Nguyên. - Nội dung 2: Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống lan hài Trần Liên bằng phương pháp nhân giống In-vitro. - Nội dung 3. Nghiên cứu và đề xuất giải pháp chủ yếu bảo tồn và nhân giống lan hài Trần Liên bằng phương pháp nhân giống In vitro.
22 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Phương pháp tiếp cận Để đạt được mục tiêu đề ra, đề tài sử dụng cách tiếp cận như sau: - Tiếp cận lịch sử và logic: Kế thừa các tài liệu, kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước, học hỏi kinh nghiệm gây trồng của người dân địa phương, điều tra đặc điểm sinh học và sinh thái học để lựa chọn địa điểm và kỹ thuật nhân giống loài lan hài Trần Liên; - Tiếp cận định tính và định lượng: Thông qua điều tra lựa chọn các khóm lan hài có chất lượng tốt ở ngoài hiện trường, để xây dựng vườn sưu tập giống lan hài Trần Liên; - Tiếp cận hệ thống và tiếp cận phân tích và tổng hợp: Thông qua tham khảo các công trình nghiên cứu, kinh nghiệm của người dân địa phương và kết quả nghiên cứu kỹ thuật nhân giống bằng phương pháp nhân giống In vitro để đề xuất giải pháp kỹ thuật nhân giống lan hài Trần liên. 3.4.2 Điều tra thực địa 3.4.2.1 Phương pháp điều tra đặc điểm sinh học và sinh thái học lan hài Trần Liên ở tỉnh Thái Nguyên Sử dụng phương pháp chuyên gia, tham khảo ý kiến của lãnh đạo địa phương (Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn; Chi cục kiểm lâm tỉnh, Phòng NN&PTNT và Hạt kiểm lâm các huyện, các xã, các nông hộ) nơi xuất hiện lan hài Trần Liên để tìm hiểu nơi lan hài Trần Liên còn phân bố trong tự nhiên, hay các nông hộ hiện trồng và phát triển loài cây lan hài Trần Liên. Xác định địa bàn nghiên cứu cụ thể đến thôn, xã, (huyện Huyện Đồng Hỷ chọn: xã Tân Long và Văn Lăng; Huyện Võ Nhai chọn: xã Thượng Lung và xã Thần Xa), các xã có rừng tự nhiên tương đối lớn. Đặc điểm nhận dạng, ý kiến chỉ đạo trong công tác bảo tồn và phát triển loài lan hài này. Điều tra theo tuyến ngẫu nhiên với dụng cụ đi rừng và làm việc gồm: Các đoàn thu thập số liệu phải có đủ các dụng cụ vật tư cơ bản phục vụ cho
23 công tác thu thập (Gồm: Bản đồ, máy đo độ cao, máy ảnh, máy GPS, cưa, dao, bút chì, túi nylon, giấy báo và dụng cụ để đựng và sổ tay ghi chép các đặc điểm hình thái, đặc tính sinh học (màu sắc hoa, mùi hương) và môi trường sống của chúng. Sau khi xác đinh được sơ bộ vùng phân bố cây lan hài Trần Liên, tiến hành điều tra theo tuyến, khảo sát bằng phương pháp lập OTC điển hình tạm thời ở nơi gặp cây lan hài Trần Liên, với diện tích 1.000 m2/OTC và khi gặp cây lan hài Trần Liên mở rộng tuyến từ 10 – 20 m tùy theo hiện trạng; Đã điều tra 02 huyện, mỗi xã điều tra 6 tuyến (24 tuyến/tỉnh), mỗi tuyến sẽ lập 3 OTC khi gặp loài lan Trần Liên, tổng số OTC điều tra 72 OTC/tỉnh. + Phương pháp điều tra kiến thức bản địa kỹ thuật gây trồng và giá trị sử dụng: Lập phiếu điều tra phỏng vấn mỗi xã 12 hộ, tổng 4 xã điều tra 48 hộ gia đình/hai huyện theo dạng câu hỏi bán định hướng, chủ yếu về: đặc điểm hình thái kích thước cây, màu sắc, lá, hoa, về sinh trưởng, đặc điểm tái sinh (hạt, thân) địa điểm phân bố hoặc gây trồng, kỹ thuật trồng (trồng, chăm sóc, bón phân), sinh trưởng, đặc điểm hình thái, đặc điểm tái sinh, ra hoa và giá trị sử dụng hai giống lan hài Trần Liên. Điều tra các hộ dưới sự tư vấn của các trưởng thôn, cán bộ xã về: Hộ có người hay đi rừng, hộ có diện tích rừng tự nhiên lớn, có hộ thích sưu tầm lan v.v Mẫu phiếu điều tra được lập với 30 - 40 chỉ tiêu phiếu điều tra về sinh thái loài, có sự tham vấn của các chuyên gia. + Điều tra nguồn cây giống: Tổng diện tích hiện còn từ rừng tự nhiên (khóm/ha); Số lượng nông hộ hiện đang nuôi trồng, nguồn gốc cây giống nông hộ đã trồng; Kiến thức bản địa của nông hộ về lấy giống, trồng và chăm sóc, giá trị sử dụng và thị trường thực tế về cây lan hài Trần Liên tại địa phương. + Phương pháp điều tra trên OTC khi gặp lan hài Trần Liên với những nội dung sau: - Điều tra đặc điểm hình thái: Số khóm/OTC; Số cây/khóm; Chiều dài đường kính trung bình thân cây; Số lá (kích thước lá); thời kỳ và đặc điểm ra
24 chồi (chồi gốc, chồi ngọn); Thời kỳ ra hoa, đặc điểm hoa (mọc kép; chùm, đơn, màu sắc hoa, mùi thơm ) - Xác định một số nhân tố theo địa hình: Độ cao so với mực nước biển, vị trí phân bố hoặc gây trồng (chân, sườn, đỉnh, khe), độ dốc, hướng dốc. - Xác định các loài cây rừng nơi có lan hài Trần Liên phân bố: Điều tra thành phân cây gỗ tầng cao, thành phân cây bụi; thành phần thảm tươi và thành phân cây dây leo. - Điều tra tái sinh: Đo đếm thống kê tái sinh hạt (nếu có), mỗi ô tiêu chuẩn đánh giá tái sinh chồi của 2/3 số khóm để xác định hệ số mọc chồi nhưng không quá 35 khóm/OTC. Mỗi dạng lập địa có hai giống lan hài Trần Liên đào 01 phẫu diện đất, mô tả ngoài thực địa, lấy 3 mẫu tại độ sâu (0-30 cm; 30-60 cm) xác định các chỉ tiêu thành phần cơ giới, pH, Chất hữu cơ, Đạm, P2O5, K2O, Ca, Mg, độ ẩm, dung trọng theo phương pháp thông dụng, dự kiến đào 24 phẫu diện. Tổng số phẫu diện được đào để mô tả và lấy mẫu đầu là 8 phẫu diện. Cụ thể như sau: + Độ ẩm, Dung trọng đất: TCVN 6860: 2001 + Thành phần cơ giới: TCVN 8567: 2010. + Chất hữu cơ: TCVN 4050-85 + Đạm tổng số: TCVN 6498 + Đạm dễ tiêu: TCVN 5255: 2009 + pH của đất: TCVN 5979: 2007 + + P2O5 dễ tiêu: 10TCN 373-1999 + K2O dễ tiêu: TCVN 8662: 2011 3.4.2.2 Phương pháp nhân giống In vitro lan hài Trần Liên Khi xác định được giống lan hài Trần Liên ở khu vực nghiên cứu, tiến hành thu thập mẫu giống bằng phương pháp tách thân ngày từ rừng (phương trâm là không lấy hết cả bụi), nên chỉ tách một phần bụi lan, giống lan được bảo quản trong túi vải ẩm, nhưng không để quá một ngày. Mang về một phần
25 được trồng vào các giá thể khác nhau, một phần làm vật liệu nuối cấy mô bằng phương pháp In vitro. a. Phương pháp khử trùng mẫu - Khử trùng mẫu: Tiến hành trong box cấy vô trùng, khử trùng sơ bộ bằng cồn 70° trong 30 giây, tráng lại 3-5 lần bằng nước cất vô trùng, khử trùng tiếp bằng dung dịch HgCl2 để tiêu diệt nấm, vi khuẩn. Sau đó tráng lại 3-5 lần bằng nước cất vô trùng. Đặt mẫu lên giấy thấm và để khô tự nhiên trong box. Sau đó dùng pank, dao, kéo cắt bỏ phần mẫu ngấm hoá chất trên mẫu và cấy vào môi trường nuôi cấy. - Sau khi cấy xong đưa mẫu vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ phòng từ 220C - 25oC, cường độ chiếu sáng 2000 - 2500 lux, độ ẩm: 60 - 65% quang chu kì 16h sang/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng của HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng của lan hài Trần Liên Các công thức được bố trí như sau: Hóa chất Công thức Thời gian (phút) Nước cất vô trùng CT1 (Đ/C) 15 Cồn 700 CT2 5 CT3 10 CT4 15 HgCl2 0.1% CT5 5 CT6 10 CT7 15 HgCl2 0.2 % CT8 5 CT9 10 CT10 15 Phương pháp nghiên cứu khả năng tái sinh chồi lan hài Trần Liên Mẫu sau khi được khử trùng, sau 1 tuần theo dõi không bị nhiễm được cấy chuyển sang nuôi cấy trên các môi trường nuôi cấy khác nhau, sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp. Tiến hành theo dõi, quan sát
26 chồi tái sinh và chất lượng chồi tái sinh. Môi trường thích hợp nhất sẽ dùng làm môi trường nền cho các thí nghiệm tiếp theo. Để sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng hợp lý, chúng tôi tham khảo theo Lê Văn Chi (2009) [6], cụ thể: Thí nghiệm2 : Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi của của hài Trần Liên Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm môi trường nền bổ sung BA với các nồng độ khác nhau trong từng công thức thí nghiệm để theo dõi khả năng nhân nhanh của mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + 0,0 mg/l BA CT 2: MT nền + 0,5 mg/l BA CT 3: MT nền + 1,0 mg/l BA CT 4: MT nền + 1,5 mg/l BA CT 5: MT nền + 2,0 mg/l BA CT6: MT nền + 3,0 mg/l BA Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetine đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Trần Liên. - Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A (nồng độ BA thích hợp nhất ở thí nghiệm 2) + Nồng độ Kinetin ở các nồng độ khác nhau trong từng công thức thí nghiệm để theo dõi khả năng nhân nhanh của mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + BA+ 0,0 mg/l Kinetine CT 2: MT nền + BA + 1 mg/l Kinetine CT 3: MT nền + BA + 2 mg/l Kinetine CT 4: MT nền + BA + 3 mg/l Kinetine CT 5: MT nền + BA +5 mg/l Kinetine c) Phương pháp ra rễ lan hài
27 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của hài Trần Liên - Chồi sinh trưởng và có từ 2-3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm: MT nền có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng tạo rễ của mẫu. - Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ. Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + NAA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + NAA 0,5 mg/l CT 3: MT nền + NAA 1,0 mg/l CT 4: MT nền + NAA 1,5 mg/l CT 5: MT nền + NAA 2,0 mg/l 3.4.3. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu Từ số liệu thu thập được trên các OTC và cây lan hài điều tra, xử lý số liệu chỉnh lý và tính toán trên cơ sở những công thức toán học thống kê, như: Sử dụng phần mềm Excel tính toán và so sánh các chỉ tiêu về đặc điểm sinh học và sinh thái học của loài lan hài Trần Liên. Sử dụng phần mềm IRRISTAT 5.0 để xử lý số liệu về nhân giống cây lan hài Trần Liên. Cụ thể: - Sử dụng tiêu chuẩn Levene để kiểm tra sự bằng nhau của các phương sai mẫu, tiêu chuẩn này thích hợp với trường hợp mẫu không có phân bố chuẩn. - Sử dụng tiêu chuẩn Bonferroni hoặc tiêu chuẩn Duncan để so sánh cặp đôi các công thức trong trường hợp các phương sai là bằng nhau trong tổng thể 1 n - Xác định số trung bình mẫu: x =  xi (2.1) n 1 n 1 2 - Sai tiêu chuẩn : S = (xi x) (2.2) n 1 i 1
28 Trong đó: xi là trị số giữa cỡ thứ i về đường kính (Di) và chiều cao (Hvn). x là trị số bình quân được tính theo công thức S - Hệ số biến động : S% = x100 (2.3) x Trong đó: S là sai tiêu chuẩn được tính theo công thức (2.2) được tính theo công thức (2.1) - Xác định mật độ: nk .10000 + Số khóm/ha sử dụng công thức : Nk = (2.4) S nc .10000 + Số cây/ha sử dụng công thức: Nc= (2.5) S Trong đó: Nk là số khóm/ ha; Nc là số cây/ha nk là số khóm trung bình trong ô tiêu chuẩn nc là số cây trung bình trong ô tiêu chuẩn S là diện tích ô tiêu chuẩn Các chỉ tiêu theo dõi sẽ được tính toán theo các công thức sau: Tổng số mẫu chết (mẫu) Tỷ lệ mẫu chết = 100 Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) Tổng số mẫu nhiễm (mẫu) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu đưa vào 100 (mẫu) Tổng số mẫu sống (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống (%) = 100 Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Chỉ tiêu theo dõi chồi: Tổng số mẫu nảy chồi (mẫu) Tỷ lệ tái sinh chồi = 100 Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) Tổng chồi thu được Hệ số nhân chồi = 100 Tổng chồi nuôi cấy
29 Chỉ tiêu theo dõi rễ: Tổng sỗ mẫu ra rễ (mẫu) Tỷ lệ mẫu ra rễ (%) = X 100 Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kê toán học bằng phần mềm Excel và phần mềm IRRISTAT 5.0.
30 Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đặc điểm sinh học và sinh thái học lan hài Trần Liên ở tỉnh Thái Nguyên 4.1.1. Đặc điểm phân bố của lan hài Trần Liên 4.1.1.1. Sinh trưởng và phân bố theo vùng sinh thái lan hài Trần Liên a) Sinh trưởng của lan hài Trần Liên theo vùng sinh thái Kết quả điều tra về sinh trưởng của lan hài Trần Liên theo vùng sinh thái được đánh giá thông qua chiều cao (từ mặt đất đến lá cao nhất) và chiều rộng khóm, khi cây sinh trưởng tốt thể hiện số lá nhiều, là dài và to tổng hợp thể hiện qua bảng 4.1: Bảng 4.1. Sinh trưởng trung bình của lan hài Trần Liên theo vùng sinh thái Độ Nhiệt Lượng Rtb Vùng sinh ẩm S Htb S độ TB mưa TB khóm thái TB (%) (cm) (%) (oC) (mm/năm) (cm) (%) Võ Nhai 22,4 1941,5 80-87 18,2 19,0 55,0 25,0 Đồng Hỷ 22,1 2050,0 81-84 19,3 19,5 (Nguồn: Số liệu điều tra thực tế năm 2020) Số liệu bảng trên cho thấy: Về phân bố theo khu vực sinh thái: Điều kiện phân bố của lan hài Trần Liên là: Tái sinh và sinh trưởng tốt ở rừng tự nhiên, dưới bóng râm nhẹ (độ tàn che khoảng 40 - 60%), nhiệt độ giao động từ 12 - 250C, đất mùn trên núi đá vôi; Huyện Võ Nhai và Đồng Hỷ có khí hậu và đất tương đối phù hợp với phân bố và sinh trưởng phát triển của cây lan hài Trần Liên. Đôi khi lan hài Trần Liên mọc ở chỗ nứt của kẽ đá có lượng mùn tích tụ (ảnh dưới).
31 Hình 4.1 Phân bố tự nhiên của lan hài Trần Liên trên vách đã khu vực thôn Mỏ Ba, xã Tân Long, huyệnĐồng Hỷ Về sinh trưởng trung bình ở huyện Võ Nhai với bề rộng trung bình khóm (Rtb) là 18,2 cm, chiều cao trung bình (Htb) của khóm là 19 cm; huyện Đồng Hỷ có chiều rộng trung bình khóm (Rtb)là 19,3 cm, chiều cao trung bình (Htb) của khóm là 19,5 cm; Nếu so sánh sinh trưởng bằng hai chỉ tiêu trên bằng hệ số biến động thì chiều rộng của khóm có sự khác biệt tương đối lớn với hệ số biến động 55%, tức là chênh lệch bề rộng 1,2 cm; Chiều cao của khóm có sự biến động thấp 25%, tức là chênh lệch chiều cao nhỏ. b) Phân bố mật độ loài lan hài Trần Liên theo vùng sinh thái Đối với lan hài mật độ được tính số khóm lan phân bố trên OTC đã xác định và quy chuẩn trên ha. Ở các vùng khác nhau sự xuất hiện là khác nhau, nguyên nhân sự khác nhau là gì giữa các vùng sinh thái .
32 Bảng 4.2. Phân bố mật độ giống lan Trần Liên theo vùng sinh thái Mật độ Mật độ cao Mật độ cây TB Vùng sinh Mật độ TB thấp nhất nhất theo khóm thái (khóm/ha) (khóm/ha) (khóm/ha) (cây/khóm) Võ Nhai 15 28 21,5 2,4 Đồng Hỷ 18 37 27,5 3,2 (Nguồn: Số liệu điều tra tại thực địa) 40 37 35 28 27.5 30 25 21.5 18 20 15 15 10 5 0 Số khóm thấp nhất Số khóm cao nhất Số khóm trung bình (khóm/ha) (khóm/ha) (khóm/ha) Võ Nhai Đồng Hỷ Hình 4.2: Biểu đồ biểu thị số khóm lan hài Trần Liên điều tra tại hai huyện Võ Nhai và Đồng Hỷ Số liệu bảng và hình 4.2 trên cho thấy: Phân bố theo mật độ thể hiện số khóm/ha và số cây trung bình trên khóm ở hai huyện Võ Nhai và Đồng Hỷ, mật độ số khóm ít nhất 15 khóm/ha ở Huyện Võ Nhai (chỉ thấy xuất hiện 01- 03 khóm/OTC); Xuất hiện nhiều nhất, khu vực rừng ở thôn Mỏ Ba, xã Tân Long, huyện Đổng Hỷ có 37 khóm/ha (2-5 khóm/OTC). Mật độ trung bình huyện Võ Nhai là 21,5 khóm/ha; Huyện Đồng Hỷ 27,5 khóm/ha.
33 Nếu thống kê số cây trên khóm, thì huyện Đồng Hỷ trung bình 3,2 cây/khóm (khoảng 2-5 cây/khóm) nhiều hơn huyện Võ Nhai chỉ 2,4 cây/khóm (có 1-3 cây/khóm). Như vậy, mật độ số khóm và số cây/ha cho thấy sự xuất hiện của cây lan hài Trần Liên thực tế còn rất ít, rất khó khăn cho việc thu thập mẫu để nhân giống, vì vậy chúng tôi phải cân nhắc khi lấy mẫu cây, chỉ lấy 01-02 cây/khóm cố số cây 3-5 cây/khóm, và tách khéo để không ảnh hưởng đến khả năng sống và sinh trưởng của cây lan hài Trần Liên. 4.1.1.2. Phân bố lan hài Trần Liên theo vị trí địa hình Địa hình khác nhau sẽ hình thành nên các điều kiện tiểu khí hậu khác nhau, địa hình ảnh hưởng tới chế độ nhiệt, chế độ ẩm của đất, nước mưa từ khí quyển, nước ngầm, các chất bám dính vào các hạt đất, sự biến đổi thành phần và độ dày tầng đất, năng lượng nhiệt . Tất cả những đặc điểm đó sẽ được tích lũy và biểu hiện ở quần xã thực vật rừng và hệ sinh thái rừng. Kết quả nghiên cứu về địa hình các OTC điều tra lan hài Trần Liên được tổng hợp ở bảng 4.3: Bảng 4.3. Mật độ và sinh trưởng hài Trần Liên theo vị trí địa hình Mật độ Rtbkhóm SRkhóm Hkhóm SHkhóm Khu vực Vị trí TB (cm) (%) (cm) (%) (khóm/ha) Chân 3 22,2 21,5 Võ Nhai Sườn 2 18,4 27,3 19,2 18,0 Đỉnh 1 14,2 16,3 Chân 6 23,1 22,6 Đồng Hỷ Sườn 4 20,3 30,0 19,4 20,67 Đỉnh 2 14,5 16,5
34 Số liệu bảng 4.3 cho thấy: Huyện võ Nhai, chiều rộng khóm trung bình là 18,2 cm/khóm, ở đỉnh đồi độ rộng khóm nhỏ nhất 15,2 cm, chân đồi có độ mùn cao độ rộng khóm đath 22,2 cm/khóm, hệ số biến động 27,3% cho thấy chênh lệnh độ rộng khóm ở độ cao địa hình không nhiều; Chiều cao của khóm tương tự như vậy, chân đồi có sinh trưởng chiều cao tất nhất đạt 21,5 cm; thấp nhất đỉnh đồi đạt 16,3 cm, hệ số biến động 18,0% cho thấy chênh lệnh chiều cao khóm cây lan ở các độ cao khác nhau không nhiều; Ở Huyện Đồng Hỷ, Độ rộng và chiều cao của khóm lan hái Trần Liên không chênh lệnh nhau lớn theo độ cao của địa hình. Nếu so sánh hai huyện với nhau thì huyện Đồng Hỷ cây lan sinh trưởng tốt hơn huyện Võ Nhai. 4.1.2 Đặc điểm hình thái của lan hài Trần Liên Tên Việt Nam: Lan hài Trần Liên hay còn gọi là lan hài Chân tím Tên Latin: Paphiopedilum tranlienianum Họ: Phong lan Orchidaceae Bộ: Phong lan Orchidales Lớp (nhóm): Lan đất Lan hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) là một loài lan hài nhỏ, lá dài khoảng 8 - 19 cm màu xanh bóng. Loài này có hoa tao nhã với lá đài lưng trắng có sọc tía nâu, cánh hoa tía nâu lượn sóng rất mạnh ở mép, môi nâu tía và nhị lép vàng tươi. Hài Trần Liên là loài đặc hữu hẹp ở Việt Nam, cây ưa râm mát, nở hoa khoảng tháng 9-12, độ bền của hoa khá dài 25-30 ngày. Lan hài Trần Liên được mô tả chính thống năm 1988 dựa trên một cây sống được nhập khẩu từ Việt Nam và được đặt theo tên người Việt Nam đã xuất khẩu nó, bà Trần Ngô Liên. Tình trạng loài lan Trần Liên vốn có khu phân bố rất hẹp và nơi cư trú rải rác với số lượng cá thể rất ít ỏi, trong vài năm gần đây lại bị tận thu để
35 xuất khẩu lậu qua biên giới nên đang bị tuyệt chủng. Hiện nay chỉ còn sót lại rất rải rác một số cây ở các khe núi khuất và cao khó thu hái, nhưng số phận của chúng cũng rất mong manh do môi trường sống là rừng bị chặt và đốt và do vẫn tiếp tục bị tận thu. Phân hạng: EN A1a,c,d, B1+2e. Biện pháp bảo vệ: Đã liệt kê vào Phụ lục 1 của công ước CITES và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 06/2019/NĐ - CP ngày 22/01/2019 của Chính phủ về: Quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý, hiếm và thực thi Công ước về buôn bán quốc tế các loài động vật, thực vật hoang dã nguy cấp. Phân bố ở khu Bảo tồn thiên nhiên Thần Sa - Phượng Hoàng; một địa phương có rừng tự nhiên, kiểu thảm thực vật cây lá rộng trên núi đá vôi, địa hình thấp <500m. 4.1.2.1 Đặc điểm hình thái thân Thân của giống hài Trần Liên (Paphiopedilum Tranlienianum) là bộ phận nhỏ nhất trong cơ cấu thực vật của chúng và được phân chia thành 2 cấu trúc cũng như chức năng. Thân chính là loại thân rễ nằm ngang, và thông thường thì chúng nằm ở dưới lớp đất mặt. Đó là thân chính, đỡ cho các lá, từ đó các rễ phát triển theo nhiều ngang và dọc. Hình 4.3 Lan hài Trần Liên được sưu tập giống tại Vườn lan, đằng sau khu nhà làm việc của khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên
36 Thân theo chiều đứng của loài lan hài Trần Liên là tương đối ngắn và người ta ví thân cây lan hài Trần Liên như thân cây rau diếp vì chúng có cái lõi. Những lóng của nó thì như bị nén chặt lại, vì thế mà lá mới hình thành lúc nào cũng như ở trên đỉnh ngọn. Thân thường mang trên nó một số lượng lá không đổi, sau khi đã đạt đến độ trưởng thành và sẽ hình thành một chồi hoa. Trong một số loài lan và loài lan hài, chồi non xuất hiện ở phần dưới của cây mẹ. Những cây con mọc từ mẹ sẽ có sức phát triển rất nhanh, người ta thu nhận được khá nhiều cây mới. Đặc điểm này là một lý do cho những nhà trồng lan hài nhân rộng chúng ra. Thực tế tại hai huyện Đồng Hỷ và Võ Nhai cho thấy hình thái thân (đường kính gốc cây lan hài Trần Liên) có sự khác nhau, thể hiện ở bảng 4.4 sau: Bảng 4.4 Đường kính gốc (Dtb) lan hài Trần Liên các địa điểm khác nhau Đường kính Khu vực Số OTC điều Số khóm Số cây điều gốc TB (Dtb) tra (khóm) tra (cây) (cm) Thượng Nung 12 21 42 0,95 Thần Sa 12 17 36 0,78 Tân Long 12 36 108 1,18 Văn Lăng 12 29 87 1,06 (Nguồn: Số liệu tra tại các OTC trên địa bàn 04 xã) Số liệu bảng trên cho thấy: Đường kính gốc là chỉ tiêu quan trọng trong đánh giá sinh trưởng của cây lan hài Trần Liên, nếu đường kính gốc lớn, sẽ cho lá dài, đường kính lá lớn và tiềm năng sẽ cho hoa nhiều và to. Ở các xã các nhau đường kính gốc (Dtb) (Trung bình của đo Đông Tây, Nam Bắc) là khác nhau; Đường kính gốc của lan hài Trần Liên lớn nhất ở xã Tân Long, huyện Đồng Hỷ bằng 1,18 cm, đường kính gốc trung bình ở xã Thần Sa, huyện Võ Nhai, đạt 0,78 cm.
37 4.1.2.1 Đặc điểm hình thái lá Lá của loài lan hài Trần Liên (Paphiopedilum Tranlienianum) chiều dài của chúng tương đối ngắn, lá dầy có gấp nếp, loài cũng có thể nhận ra giữa những cây mọc ở hoang dã với những cây ở nơi trồng trong vườn được cách ly. Lá lan hài Trần liên được trồng thường to và dài hơn lá cây ở ngoài tự nhiên, nhưng lá được trồng lại mỏng hơn lá lan hài ở ngoài tự nhiên. Lá có màu xanh phừ hợp cơ chế quang hợp của cây lan hài, tầm quan trọng của lá thì không cần phải bàn. Ngoài ra, lá còn một bộ phận có tính thẩm mỹ và cũng đáng để chiêm ngưỡng lắm. Mặc dù có những sự biến đổi lớn về kết cấu và hình dạng, lá vẫn giúp ta phân biệt giữa giống này với giống khác, thậm chí giữa loài này với loài khác. Nhìn vào lá còn giúp ta biết rõ tình trạng sức khỏe của cây lan hài. Hình 4.4. Hình thái là của cây lan hài Trần Liên ở địa bàn nghiên cứu Qua điều tra đo đếm chiếu dài và bề rộng của lá ở các xã khác nhau, chúng tôi thấy có sự khác nhau, cụ thể ở bảng số liệu sau: Bảng 4.5 Chiều dài (Hlá) và bề rộng (Rlá) của lá lan hài Trần Liên ở các địa điểm khác nhau Số cây Chiều dài Bề rộng Khu vực Số OTC Số khóm điều tra lá TB lá TB điều tra (khóm) (cây) (cm) (cm) Thượng Nung 12 21 42 15,6 1,76 Thần Sa 12 17 36 13,8 1,39 Tân Long 12 36 108 19,4 2,22 Văn Lăng 12 29 87 18,9 1,97 (Nguồn: Số liệu điều tra tại thực địa)
38 Số liệu bảng trên cho thấy trung bình kích cơ của lá lna hài Trần Liên ở khu vực nghiên cứu khoảng 18 cm x 1,7 cm; Nơi có kích thước của lá lớn nhất là xã Tân Long, huyện Đồng Hỷ với 19,4 cm x 2,22 cm; nơi lá lan hài Trần Liên nhỏ nhất là xã Thần Sa với kích thước 13,8 cm x 1,39 cm (như hình 4.3). 4.1.2.3 Hình thái rễ Những cái rễ của lan hài Trần Liên cứng và dầy, đường kính khoảng 1- 3 mm. Chúng cũng có phân nhánh một cách thưa thớt, nếu tính theo chiều dài tổng cộng khoảng 10-30 cm, đối với những cây khỏe mạnh thì rễ của chúng nhiều hơn. Đầu rễ non của cây lan hài Trần liên có màu từ hồng nhạt đến trắng ngà, trong khi đó màu của những rễ già trở nên sậm và nhiều lông hơn. Rễ bắt đầu từ thân dưới đất, tức là ở phần gốc của cái quạt (do lá tạo thành giống cái quạt), chúng bắt đầu từ cái trục của lá dưới thấp hơn. Những cây non có thể còn phụ thuộc vào cây mẹ trong thời gian khoảng hơn một năm trước khi chúng có đủ rễ để chuyển thành một cây trưởng thành. Hình 4.5 Hình thái rễ của cây lan hài Trần Liên ở khu vực nghiên cứu Vì độ quý hiếm của lan hài Trần Liên, nhất là khi chúng tôi bứng cây trong các khóm lan cũng phải cẩn thận nên không đo được rễ cụ thể của các
39 cây lan ở các địa bàn nghiên cứu khác nhau, chỉ khi bứng cây rễ chìa ra thì đo, vì vậy kết quả chỉ là ttương đối. 4.1.2.4 Hình thái hoa, quả và hạt Loài Do thời gian điều tra OTC và điều tra đặc điểm hình thái loài lan hài Trần Liên khác với Vụ ra hoa của cây (tháng 9 - 12); Nên khóa luận tham khảo từ đề tài của Ths Nguyễn Thị Tình (Khoa CNSH&CNTP trường ĐHNL Thái Nguyên) đã điều tra từ năm 2019. Điểm đặc trưng của lan hài Trần Liên là hoa có tuổi thọ cao từ 4 - 6 tuần, hoa lan hài Trần Liên thường nở nhiều vào tháng 9 - 10, Hoa rộng 5,5 - 6 cm; lá đài có lông ngắn ở mặt ngoài; lá đài gần trục hoa màu trắng, gốc chuyển thành màu lục với sọc màu tía - nâu, gân tròn, cỡ 3 x 3 - 3,5 cm; lá đài kia màu lục nhạt, hình trứng, cỡ 2,5 x 1,1 - 1,8 cm; cánh hoa màu tía - nâu với chóp màu lục, hình thuôn, cỡ 3 - 3,4 x 0,7 - 0,9 cm, bóng, mép lượn sóng, có lông trắng, gốc có nhiều lông nâu - tía nhạt; môi màu đỏ - nâu thẫm, cỡ 3,7 - 3,9 x 1,6 cm; nhị lép, hình trứng ngược, cỡ 8 - 10 x 7 - 9 mm, có mủ bóng; bầu dài 3 - 4 cm, phủ đầy lông ngắn nâu nhạt. Hình 4.6 Hình thái hoa của lan hài Trần Liên đươc mô tả và vẽ tay
40 Cũng như bao loài lan hài khác, thì lan hài Trần Liên cũng được các nhà sưa tập chơi lan sưu tầm và thuần dưỡng trong bộ sưu tập hoa lan của mình, nhưng cho đến nay thì lan hài vẫn được những người yêu lan đánh giá là loài khó thuần dưỡng trong môi trường đồng bằng và thành phố. Hình 4.7 Lan Hài Trần Liên ở ngoài tự nhiên ở xã Thượng Nung, huyện Võ Nhai (Nguyễn Thị Tình, 2019) Sau khi bầu hoa phát triển to dần và tạo quả. Tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và đặc điểm của từng loài mà vỏ hạt trưởng thành trong khoảng 9 - 12 tháng. Cách tốt nhất để quan sát sự trưởng thành của vỏ hạt là khi phát hiện có sự thay đổi màu từ xanh sang vàng. Khi sự thay đổi này xảy ra, là thời gian để cắt vỏ hạt và di chuyển chúng đến phòng thí nghiệm để gieo hạt. Trong trường hợp chưa thể gieo cấy hạt ngay, cần bảo quản hạt trong giấy nhôm và lưu trữ ở nhiệt độ 4oC. Có thể bảo quản hạt trong vòng 12 tháng, tuy nhiên sau thời gian này tỷ lệ nảy mầm sẽ giảm đáng kể.
41 4.1.3 Đặc điểm sinh thái của lan hài Trần Liên 4.1.3.1 Đặc điểm phân bố loài lan hài Trần Liên ở các độ tàn che của rừng Kết quả điều tra về độ tàn che ở những nơi có hài Trần Liên phân bố cho thấy, độ tàn che nơi có lan hài Trần Liên phân bố từ 30 - 60% độ che phủ. Kết quả cụ thể như sau: Bảng 4.6 Phân bố lan hài Trần Liên ở các độ tàn che rừng khác nhau Độ tàn che Số khóm phân bố Số cây phân bố Tỷ lệ STT (%) (khóm) (Cây) (%) 1 60 23,7 67,5 24,72 S% 27,5 122,5 Tổng 103 273 100 (Nguồn: Số liệu điều tra) 100 88.9 90 80 72.1 67.5 70 60 50 44.5 40 27.4 29.6 30 22.3 23.7 20 10 0 60 Số khóm (Khóm) Số cây (cây) Hình 4.8 Biểu đồ thể hiện phân bố số khóm và số cây lan hài Trần Liên theo độ tàn che của rừng
42 Số liệu bảng 4.6 và hình 4.6 cho thấy: Ở các độ tàn che khác nhau trong khu vực thì lan hài Trần Liên phân bố là khác nhau. Độ tàn che của rừng tốt nhất cho lan hài Trần Liên tái sinh và sinh trưởng là từ 45 - 10m có tán khép kín với độ tàn che ít nhất trên 40%. Cấu trúc rừng gồm có tầng cây gỗ, tầng cây bụi cao 3-4 m và thảm tươi. Trong tầng cây gỗ, thành phần loài cây phức tạp, nhưng thường tạo thành những quần thể rừng với 1-2 loài cây chiếm ưu thế như: Nghiến (Excentrodendron tonkinense), Mạy tèo (Streblus macrophyllus). Kiểu rừng này phân bố chủ yếu ở các xã Thượng Nung và Thần Sa (Võ Nhai), Tân Long và Văn Lăng (Đồng Hỷ). Tầng cây bụi thưa gồm chủ yếu các loài: Đom đóm (Alchornea rugosa), Chòi mòi hải nam (Antidesma hainanense), Dương giác đằng (Morinda umbellate), Bướm bạc miên (Mussaenda cambodiana), Thần linh lá to (Kibatalia macrophylla), Ngang thiên liên (Abroma augusta), Thảm tươi: gồm các loài thân thảo mọc trên đất hay sống bám trên đá: Bóng nước (Impatiens yerrucifer), Thu hải đường (Begonia balansaeana), Ri ta tim (Chirita lavandulacea), Rau tai voi (Lysionotus), các loại Ráy
43 Dây leo thường gặp các loài: Giảo cổ lam (Gynostemma pentapyllum), Dây gắm (Gnetum latifolium), Dây dất (Fissistigma latifolium), Sống rắn (Acacia pennata), Trắc leo (Dalbergia stipulacea), Dây mật (Derris marginata), Dây cóc (Derris tonkinensis), Phân quần hệ này có mật độ trung bình là 460 cây/ha, trữ lượng rừng khoảng 122m3/ha. 4.1.3.3 Đặc điểm tái sinh của hai loài lan hài Trần Liên Mùa hoa tháng 9 - 11, quả chín sau 2 - 4 tháng sau, từ tháng 12 đến tháng 01 năm sau, quả lan hài Trần Liên thuộc dạng quả nang, khi chín và khô hạt nứt dọc có 4 khe. Hạt nhỏ li ti, mỗi quả có rất nhiều hạt, kích thước khoảng 1/30 - 1/80 mg, có thể bị gió cuốn đi khắp nơi; phần lớn hạt của lan hài Trần Liên bị chết vì hạt không chứa chất dinh dưỡng, vì vậy khả năng nảy mầm của cây là rất hiếm; Lan hài Trần Liên có thể tái sinh bằng hạt nếu gặp thời tiết và độ ẩm đất thuận lợi. Mọc dưới tán rừng nguyên sinh rậm thường xanh nhiệt đới mưa mùa cây lá rộng ưu thế Nghiến trên núi đá vôi, ở độ cao 400 - 650 m, rất rải rác trong các khe nứt, ít đất của các vách dựng đứng ở sườn núi. Hình 4.9 Khả năng tái sinh nảy chồi cây con từ gốc mẹ của lan hài Trần Liên
44 4.1.3.4 Đặc điểm của điều kiện đất đai nơi có lan hài Trần Liên phân bố Dưới phần gốc khoảng 1,0 - 2,0 cm nằm dưới đất, mỗi lá mọc lên từ một đốt thân, trên các mắt đốt đều có mắt ngủ của mầm cây con; cây mẹ thường được 01 - 02 năm tuổi sẽ đẻ kkhoảng từ 01- 02 cây con, ra hoa già chết. Kết quả điều tra hầu như chúng tôi không gặp cây con tái sinh từ hạt, chỉ thấy tái sinh từ gốc mẹ đẻ con ở khóm lan hài Trần Liên. Đất ở khu vực nghiên cứu chủ yếu là đất đỏ nâu trên đá vôi ở các vùng địa hình thấp thường có tầng dày hơn; ở vùng núi cao đất đá vôi bị phong hoá và rửa trôi mạnh nên tầng đất mỏng hơn. Cụ thể về chất lượng đất ở vùng nghiên cứu được phân tích và tổng hợp vào bảng sau: Bảng 4.7 Chỉ tiêu hóa học của đất nơi lan hài Trần Liên phân bố ở vùng nghiên cứu P205 tổng Địa điểm lấy Số N tổng OM K20 pH số mẫu (xã) OTC số (%) (%) (%) (kcl) (%) Thượng 01 0,17 0,24 3,54 0,72 7,48 Nung 02 0,19 0,26 3,16 0,82 7,57 03 0,17 0,22 3,12 0,75 7,55 Thần Sa 04 0,16 0,23 3,64 0,74 7,52 05 0,19 0,38 3,85 0,92 7,59 Tân Long 06 0,24 0,39 3,95 0,91 7,64 07 0,21 0,38 3,89 0,93 7,62 Văn Lăng 08 0,22 0,44 4,10 0,88 7,46 (Nguồn: Số liệu phân tích tại Viện Khoa học sự sống, trường ĐHNL Thái Nguyên) Kết quả phân tích mẫu đất từ các OTC của các xã nghiên cứu cho thấy hàm lượng một số chỉ tiêu: N tổng số, P205 tổng số, K20 tổng số, OM trong đất có sự sai khác tương đối rõ theo nơi đào phẫu diện và địa điểm nghiên cứu. Tuy nhiên, đây là rừng rự nhiên, nên sẽ hạn chế xói mòn cho đất điều đó cũng đồng nghĩa với việc duy trì độ phì cho đất như hàm lượng đạm, lân, kali, mùn,
45 Tuy nhiên, phần lớn đất đá vôi ở khu vực nghiên cứu có độ dày tầng đất khá thường trên 40 cm, độ phì ở đất đá vôi khá, mùn từ 3,2 ÷ 4,1%; đạm trên 0,16 - 0,24%. Đặc điểm của đất phát triển trên núi đá vôi là đất hơi kiềm và kiềm vừa phải có pH từ 7,46 - 7,64. Các chỉ tiêu hóa học của đất cho thấy, tính chất đất ở vùng nghiên cứu hoàn toàn phù hợp cho sự xuất hiện và sinh trưởng phát triển cây lan hài Trần Liên. 4.2. Kỹ thuật nhân giống lan hài Trần Liên 4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng Thí nghiệm sử dụng môi trường nuôi cấy là RE + 10 g/l saccharose + 5.3 g/l agar + 0.5 g/l THT + 100 ml/l nước dừa. Trong các công thức đều sử dụng 30 mẫu thí nghiệm, được thể hiện ở bảng 4.8. Bảng 4.8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 6 tuần nuôi cấy) Các chỉ tiêu theo dõi Số mẫu Mẫu sạch (phát Mẫu nhiễm bệnh Công Thời đưa sinh protocorm và chết Hóa chất thức gian vào cấy và chồi) TN (phút) (mẫu) Số mẫu Tỷ lệ Số mẫu Tỷ lệ (Mẫu) (%) (Mẫu) (%) CT1 10 30 23 76,67 7 23,33 Cồn 700 CT2 15 30 19 63,33 11 36,67 CT3 20 30 17 56,67 13 43,33 CT1 10 30 6 20,00 24 80,00 HgCl2 CT2 15 30 11 36,67 19 63,33 0,1% CT3 20 30 12 40,00 18 60,00 CT1 10 30 11 36,67 19 63,33 HgCl2 CT2 15 30 13 43,33 17 56,67 0,2% CT3 20 30 14 46,47 16 53,33
46 Kết quả bảng 4.8 cho thấy: Mẫu thí nghiệm đạt 6 tuần theo dõi được khử 0 trùng bằng các chất khử trùng khác nhau (Cồn 70 , Ca(OCl)2 5% và Johnson1%), ở 03 công thức có thời gian (10, 15 và 20 phút) có tỷ lệ sạch bệnh là khác nhau; Các mẫu đưa vào thí nghiệm khử trùng đều có tỷ lệ nhiễm bệnh và chết cao; Cao nhất là khử trung bằng HgCl2 0,1% ở CT1 tỷ lệ nhiễm và chết là 80,0%; Như vậy, khi tiến hành khử trùng cho các mẫu lan hài Trần Liên đưa vào thí nghiệm khử trùng bằng cồn 700 trong 10 phút, sau đó đốt qua đèn cồn (CT1) thì hiệu quả khử trùng tốt nhất, tỉ lệ mẫu sạch (mẫu phát sinh chồi và protocorm) đạt 76,67%; Không nên khử trung bằng HgCl2 0,1%. 4.2.2 Nhân nhanh protocorm và chồi lan hài Trần liên 4.2.2.1 Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng BA đến khả năng nhân nhanh của protocorm và chồi lan hài Trần Liên Qua 40 ngày thí nghiệm bằng chất điều hòa sinh trưởng BA (Kinetin Benzyl adenin) đến khả năng sinh Protocorm và khả năng bật chồi của các mẫu thì nghiệm, kết quả cụ thể: Bảng 4.9 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi lan Trần Liên (sau 40 ngày nuôi cấy) Hệ số nhân Nhân chồi Nồng độ Số mẫu Protocorm Công BA đưa vào Số mẫu bật Số mẫu Hệ số thức Hệ số (mg/l) (mẫu) Protocorm bật chồi nhân chồi (lần) (cái) (chồi) (lần) CT1: ĐC 0,0 30 27 0,90 26 0,87 CT2 0,5 30 35 1,17 33 1,10 CT3 1,0 30 37 1,23 31 1,03 CT4 1,5 30 42 1,40 39 1,30 CT5 2,0 30 64 2,13 61 2,03 CT6 3,0 30 50 1,67 45 1,50 LSD05 0,77 0,75 CV% 2,9 2,9
47 Số liệu bảng trên cho thấy: Sau 40 ngày theo dõi chúng tôi thấy khả năng sinh Protocorm và khả năng bật chồi của các công thức thì nghiệm là ít thành công; trong 6 công thức thí nghiệm có thì công thức 5 với chất BA nồng độ 2,0 mg/l là có khả năng sinh Protocorm đạt 2,13 lần (64 protocorm) và khả năng bật chồi đạt 2.03 lần (có 61chồi) đây là công thức tốt nhất, chất lượng protocorm và chồi đều xanh đậm và mập. Con đối chứng khi không có chất điều hòa sinh trưởng có 27 protocorm và 26 chồi, nhưng theo như quan sát đều rất yếu, có màu xanh và gầy. 4.2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh của protocorm và chồi lan hài Trần Liên Chất điều hòa sinh trưởng Kinetin được sử dụng ở các nồng độ khác nhau, còn chất BA ở nồng độ 2,0 mg/l (như thí nghiệm trên là tốt nhất trong nhân nhanh lan hài Trần Liên). Kết quả thí nghiệm như sau: Bảng 4.10. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Trần Liên (sau 6 tuần nuôi cấy) Nồng Tổng Tổng Hệ số Tổng chồi Hệ số Công độ mẫu protocorm nhân thu được nhân thức Kinetin nuôi cấy thu được ( lần) ( lần) (mg/l) ( mẫu) CT1 0,0 30 34 1,13 56 1,86 CT2 0,5 30 65 2,17 62 2,06 CT3 1,0 30 73 2,43 85 2,83 CT4 1,5 30 71 2,37 74 2,46 CT5 2,0 30 63 2,10 64 2,13 LSD05 0,83 0,85 CV(%) 2,05 2,10
48 Từ kết quả ở bảng 4.10 và hình 4.8 cho thấy: Chỉ tiêu Potocorm thu được với giá trị CV% là 2,05 và LSD05 là 0,83 nghĩa là các cặp công thức khác có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Xét chỉ tiêu hệ số nhân chồi: Giá trị CV (%): 2,1%; LSD05 đạt 0,85, các cặp công thức khác nhau là có sự sai khác, có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, Khi bổ sung BA 2,0 mg/l, Kinetin từ 0 - 2,0 mg/l vào môi trường nuôi cấy ta thấy có ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh chồi lan hài Trần Liên. Khi tăng nồng độ Kinetin từ 0-1,0 mg/l hệ số tăng Potocorm và hệ số nhân chồi có xu hướng tăng, nhưng lại có xu hướng giảm khi tăng nồng độ Kinetin từ 1,0- 2,0 mg/l, cụ thể: Tăng nồng độ Kinetin từ 0-1,0 mg/l hệ số tăng Potocorm từ 1,13 lần đến 2,43 lần ở công thức 03, nhưng lại có xu hướng giảm số lượng Potocorm từ 3,43 lần xuống còn 2,10 khi tăng nồng độ Kinetin > 1,0 - 2,0 mg/l; Tương tự, thì hệ số nhân chồi tăng từ 1,86 (CT1) đến 2,85 (CT3). Đặc biệt ở CT3 cho tổng số chồi thu được là 85 chồi và hệ số nhân cao nhất là 2,83 lần. Tuy nhiên, nồng độ Kinetin từ 1,5 - 2,0 mg/l thu được tổng số chồi và hệ số nhân giảm dần với CT4, CT5 lần lượt là 74 chồi, 64 chồi tương ứng với CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Xanh nhạt, gầy) (Xanh nhạt, mập) (Xanh đậm, mập)( Xanh Đậm, mập) (Xanh nhạt, gầy) Hình 4.10: Một số hình ảnh ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetine đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Trần Liên (sau 6 tuần nuôi cấy) CT1: 2mg/l BA + 0mg/Kinetin; CT2: 2mg/l BA + 0,5mg/Kinetin; CT3: 2mg/l BA + 1mg/Kinetin; CT4: 2mg/l BA + 1,5mg/Kinetin; CT5: 2mg/l BA + 2mg/Kinetin
49 Xét về chỉ tiêu chất lượng Potocorm và chồi thì CT3 cho chất lượng chồi tốt nhất là xanh đậm, mập. Khi tăng nồng độ Kinetin từ 1 - 2,0 mg/l vào môi trường nuôi cấy ta thấy chất lượng chồi giảm dần còn xanh nhạt, gầy. Vì vậy trong khuôn khổ thí nghiệm này để nhân nhanh chồi lan hài Trần Liên cần bổ sung 2,0 mg/l BA + 1,0 mg/l Kinetin là thích hợp nhất. 4.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh giống lan Trần Liên Như đã nghiên cứu ở trên, nồng độ BA là 2,0 mg/l cho bật Protocorm và chồi lan hài Trần Liên là tốt nhất. Kết hợp giữa BA được cấy trên môi trường ½ VW (Hoàng Thị Nga và cộng sự, 2014) có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng BA kết hợp α - NAA. Kết quả của nghiên cứu được trình bày ở bảng 4.11 và hình 4.11. Bảng 4.11 Kết quả ảnh hưởng của BA (2,0 mg/l) kết hợp NAA đến khả năng nhân nhanh giống lan Trần Liên (sau 30 ngày nuôi cấy) Công Nồng độ Số mẫu Protocorm Phát triển chồi thức NAA nuôi Số lượng Hệ số nhân Số lượng Hệ số nhân (mg/l) cấy Protocorm (lần) (cái) chồi (lần) (mẫu) CT1: ĐC 0,0 30 28 0,933 26 0,867 CT2 0,1 30 61 2,033 59 1,967 CT3 0,3 30 65 2,167 62 2,067 CT4 0,5 30 74 2,467 63 2,100 CT5 0,7 30 68 2,267 55 1,833 CT6 1,0 30 64 2,133 49 1,633 LSD05 0,14 0,27 CV (%) 3,76 2,92 Số liệu bảng trên 4.11 và hình 4.11 cho thấy: Khi bổ sung BA 2,0 mg/l, và chất NAA ở các nồng độ khác nhau vào môi trường nuôi cấy ta thấy có ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh chồi lan hài Trần Liên. Khi tăng nồng độ nông độ NAA từ 0-0,5 mg/l hệ số tăng
50 Potocorm và hệ số nhân chồi có xu hướng tăng, nhưng lại có xu hướng giảm khi tăng nồng độ NAA từ 0,5-1,0 mg/l, cụ thể: Hình 4.11. Ảnh hưởng của BA (2,0 mg/l) kết hợp NAA đến khả năng nhân nhanh giống lan Trần Liên (sau 30 ngày nuôi cấy) Tăng nồng độ Kinetin từ 0-0,5 mg/l hệ số tăng Potocorm từ 0,933 lần đến 2,467 lần ở công thức 04, nhưng lại có xu hướng giảm số lượng Potocorm từ 3,467 lần xuống còn 2,133 khi tăng nồng độ NAA > 0,5 - 1,0 mg/l; Tương tự, thì hệ số nhân chồi tăng từ 0,867 (CT1) đến 2,10 (CT4). Đặc biệt ở CT04 cho tổng số chồi thu được là 63 chồi và hệ số nhân cao nhất là 2,10 lần. Tuy nhiên, tăng nồng độ NAA từ 0,5 - 1,0 mg/l thu thì hệ số nhân chồi giảm dần với CT5 (55 chồi tương ứng với hệ số nhân là 1,833 lần) và CT6 (49 chồi tương ứng với hệ số nhân là 1,633 lần). Xét về chỉ tiêu chất lượng Potocorm và nhân chồi thì CT4 cho chất lượng chồi tốt nhất là dài, xanh đậm, mập. Khi tăng nồng độ Kinetin từ 1 - 2,0 mg/l vào môi trường nuôi cấy chất lượng chồi giảm dần (ngắn, xanh nhạt, gầy). Vì vậy trong khuôn khổ thí nghiệm này để nhân nhanh chồi lan hài Trần Liên cần bổ sung 2,0 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA là thích hợp nhất. 4.2.3. Ảnh hưởng củaα - NAA đến khả năng ra rễ của cây lan hài Trần Liên Ra rễ là khâu cuối cùng của qúa trình nuôi cấy In vitro. Chất kích thích sinh trưởng được dùng chủ yếu ở giai đoạn này thuộc nhóm auxin. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng α - NAA với các nồng độ khác nhau trong
51 từng công thức thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây lan hài Trần Liên. Qua thí nghiệm ta thấy việc bổ sung α - NAA vào môi trường ½ MS + 10 g/l saccharose + 0.5 g/l THT + 5.3 g/l agar + 100 ml/l nước dừa có hiệu quả khá cao trong việc kích thích sự ra rễ của lan hài Trần liên (Bảng 4.11). Bảng 4.12 Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng ra rễ của cây lan hài Trần Liên Tỷ lệ ra rễ theo thời Chiều Nồng độ gian (%) Số lá Số rễ Công cao α - NAA 2 3 4 (lá/cây) (rễ/cây) thức TN (cm) tuần tuần tuần CT1: Đ/C 0,0 0 23,33 50,00 2,82 2,57 1,80 CT2 0,3 5,33 30,00 96,67 3,32 3,20 1,97 CT3 0,5 26,67 46,67 96,67 3,40 3,33 2,47 CT4 0,7 29,33 53,33 100 3,45 3,37 2,67 CT5 1,0 30,00 53,33 93,33 3,43 3,30 2,60 LSD0.05 0,17 0,179 0,13 CV% 2,89 3,12 3,11 (Nguồn: Số liệu theo dõi, đo đếm thí nghiệm) 100 74 80 78 54 59 50 1.8 1.97 2.47 2.57 2.6 0 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Tổng số rễ (rễ/30 mẫu) Số rễ ra (rễ/cây) Hình 4.12. Ảnh hưởng củaα - NAA đến khả năng ra rễ của lan hài Trần Liên Xét tỷ lệ mẫu ra rễ: giá trị CV (%): 3,11; LSD0.05 đạt 0,13 lớn hơn 0,05 các công thức thí nghiệm có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%.
52 Ở CT 1 không bổ sung α - NAA, sự tăng trưởng về chiều cao, số lá, số rễ là thấp nhất trong 5 CT. Khi bổ sung và tăng nồng độ α - NAA (0,3mg/l; 0,5mg/l; 0,7mg/l) ở các công thức CT2, CT3, CT4 thì sự sinh trưởng và phát triển của cây tăng lên. Cao nhất ở CT4 (0,7 mg/l) với chiều cao 3,45 cm; số lá 3,37 lá/cây và 2,67 rễ/cây (tổng số rễ ra của 30 mẫu TN là 80 rễ), đến tuần thứ 4 thì ở công thức 4 có 100% số mẫu thí nghiệm đã ra rễ. Khi tăng nồng độ α - NAA lên 1,0 mg/l ở CT5 thì các chỉ tiêu sinh trưởng phát triển của cây giảm. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 (Ngắn,nh ỏ) (Ngắn, mập) (Ngắn, mập) (Dài, mập) (Ngắn, nhỏ) Hình 4.13. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng ra rễ lan hài Trần Liên Tuy nhiên, qua xử lý thống kê với độ tin cậy sai khác 95%, khi bổ sung α - NAA với hàm lượng 0,3 - 1,0 mg/l vào môi trường, ta nhận thấy không có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm. Do đó, xét về mặt kinh tế ta có thể sử dụng môi trường ½ MS + 10 g/l saccharose + 0.5 g/l THT + 5.3 g/l agar + 100 ml/l nước dừa có bổ sung 0,5 mg/l α - NAA làm môi trường ra rễ cho loài lan hài này. 4.3 Đề xuất một số giải pháp chủ yếu trong bảo tồn và nhân giống lan hài Trần Liên 4.3.1 Các giải pháp chủ yếu về bảo tồn loài lan hài Trần Liên a) Nhóm giải pháp về quản lý, bảo vệ rừng nói chung và quản lý bảo vệ các loài lan rừng nói riêng Giữ gìn, bảo vệ nguyên vẹn các kiểu thảm thực vật tự nhiên là yêu cầu cấp bách. Từng bước làm tăng độ che phủ của rừng bằng các biện pháp
53 khoanh nuôi xúc tiến tái sinh và trồng rừng mới. Mặc dù trong những năm qua, Ban quản lý Khu bảo tồn thiên nhiên Thần Sa - Phượng Hoàng, huyện Võ Nhai và các xã Tân Long, Văn Lăng, huyện Đồng Hỷ có thể phối hợp với các cơ quan, tổ chức trong tỉnh, trong nước, tổ chức phi chính phủ để thực hiện tốt công tác quản lý bảo vệ rừng nói chung và bảo vệ các loài lan rừng nói riêng; Để làm tốt được nên thực hiện một số hoạt động sau: - Tổ chức xác định ranh giới của Khu bảo tồn, phân chia ranh giới các loại rừng ngoài thực địa, đóng mốc để phân định ranh giới giữa đất giành cho nông nghiệp, đất giành cho rừng sản xuất, rừng phòng hộ, đất rừng đặc dụng để nhân dân nhận biết được cùng hợp tác quản lý bảo vệ. - Điều tra, quy hoạch, chụp ảnh các loài lan rừng (trong đó có lan Trần Liên), chỉ ra tính nguy cấp, giá trị bảo tồn và phát triển các loài lan rừng để nhân dân biết cùng tham gia quản lý và bảo vệ tài nguyên rừng. - Khoán bảo vệ rừng cho các hộ gia đình đang sinh sống trong phân khu phục hồi sinh thái, khu có rừng tự nhiên phân bố theo các quy định hiện hành của Nhà nước. - Xây dựng các biển cảnh báo cháy rừng, biển nội quy bảo vệ rừng, biển cấm lửa. Xây dựng và phổ biến nội qui bảo vệ rừng. - Xây dựng và hoàn thiện bản đồ hiện trạng rừng cho Khu bảo tồn, cho các xã có rừng tự nhiên, chạy trên phần mềm MapInfor. Tại Ban quản lý và các Trạm bảo vệ rừng, tại các xã nên treo các bản đồ này. - Vận động nhân dân sử dụng tiết kiệm gỗ, củi vì đây cũng là một giải pháp nhằm hạn chế khai thác rừng, làm mất nơi cư trú của các loài thực vật nguy cấp. Hỗ trợ những hộ gia đình sử dụng năng lượng khác thay thế củi như làm hầm biogas, chuyển giao kỹ thuật xây dựng bếp tiết kiệm củi theo mô hình bếp lâm nghiệp của Viện Khoa học Lâm nghiệp. - Phối hợp cùng chính quyền địa phương các cấp tổ chức kiểm tra và thu giữ các loại súng săn, cưa máy ở các hộ gia đình sống trong khu bảo tồn,
54 và các xã có rừng tự nhiên lớn. Nghiêm cấm việc khai thác các loài lan rừng, có hình thức xử phạt nghiệm minh những trường hợp cố ý khai thác lan rừng bán với mục đích thương mại; Khuyến khích, hỗ trợ các gia đình có rừng tự nhiên, rừng có các loài lan phân bố bảo tồn và phát triển. b) Các giải pháp trong giám sát và bảo tồn loài lan hài Trần Liên Trên cơ sở quản lý, bảo vệ tốt tài nguyên rừng hiện có, việc bảo tồn và phát triển loài lan hài Trần Liên yêu câu: Ban quản lý Khu bảo tồn thiên nhiên Thần Sa - Phượng Hoàng, huyện Võ Nhai và các xã Tân Long, Văn Lăng, huyện Đồng Hỷ có thể phối hợp với các cơ quan, tổ chức trong tỉnh, trong nước, tổ chức phi chính phủ để thực hiện tốt công tác giám sát và bảo tồn đa dạng sinh học. Một số hoạt động cần triển khai thực hiện là: - Tiếp tục điều tra xác định phân bố loài lan hài Trần Liên ở một số xã, địa phương có rừng tự nhiên. Xác định được được đầy đủ thành phần loài, đặc điểm phân bố của khu hệ thực vật rừng nới có hái Trần Liên phấn bố. - Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái và giám sát một số loài thực vật bị đe doạ là chỗ dựa che bóng cho hài Trần Liên, cùng như các loài lan khác phân bố, sinh trưởng và phát triển; Tầng cây cao, như: Nghiến (Excentrodendron tonkinense), Mạy tèo Streblus ( macrophyllus); Thiên tuế (Cycas collina), Trai (Garcinia fagraeoides), Chò đãi (Annamocarya sinensis), v.v. Tầng cây bụi thưa gồm các loài: Đom đóm (Alchornea rugosa), Chòi mòi hải nam (Antidesma hainanense), Dương giác đằng (Morinda umbellate),v.v Thảm tươi, gồm: Các loài thân thảo mọc trên đất hay sống bám trên đá: Bóng nước (Impatiens yerrucifer), Thu hải đường (Begonia balansaeana), Ri ta tim (Chirita lavandulacea), Rau tai voi (Lysionotus), các loại Ráy - Điều tra xác định thành phần loài và phân bố của các loài lan rừng, trong đó có lan hài Trần Liên ở các xã, huyện có diều kiện tương tự như địa bàn nghiên cứu. Nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm nông sinh học, sinh thái, kỹ
55 thuật nhân giống, gây trồng, sử dụng của một số loài lan rừng có giá trị làm cảnh, giá trị kinh tế cao và bị đe dọa tuyệt chủng như: Lan kim tuyến (Anoectochilus spp); Hài (Paphiopedilum spp), v.v. Nghiên cứu tri thức bản địa của cộng đồng địa phương trong quản lý bảo vệ, nhân giống, nuôi trồng các loài lan rừng. - Nghiên cứu sinh thái, cấu trúc, diễn thế của các kiểu thảm thực vật rừng của Khu bảo tồn thiên nhiên Thần Sa - Phượng Hoàng và đặc biệt kiểu rừng nguyên sinh rậm thường xanh nhiệt đới mưa mùa có 01, 02 loài cây lá rộng chiếm ưu thế, như: Nghiến (Excentrodendron tonkinense), Trai (Garcinia fagraeoides) trên núi đá vôi, ở độ cao 400 - 650 m. - Nâng cao nhận thức cho cộng đồng địa phương về bảo tồn đa dạng sinh học, bảo tồn các loài lan rừng thông qua các chương trình, dự án có sự tham gia của người dân; tổ chức các chương trình giáo dục bảo tồn đa dạng sinh học cho cộng đồng địa phương và học sinh; tổ chức các lớp tập huấn cho cán bộ địa phương và cán bộ Ban quản lý về giáo dục môi trường và bảo tồn đa dạng sinh học thông qua các chương trình dự án ở khu vực. 4.3.2 Các biện pháp chủ yếu về nhân giống bằng phương pháp In-vitro loài lan hài Trần Liên * Chọn giống Nếu lấy hạt: Do điều kiện chưa nuôi cấy được lan hài Trần liên, nên trong quá trình điều tra khoảng tháng 03, chúng tôi chỉ thu được 02 quả đã già, vỏ quả bắt đầu chuyển màu nâu nhạt, chưa tách vỏ ở Thôn Mỏ Đá, xã Tân Long, huyện Đồng hỷ. Sau khi lấy về chưa thể gieo cấy hạt ngay, đã bảo quản hạt trong giấy nhôm và lưu trữ ở nhiệt độ 40C. Tháng 04 bắt đầu tách lấy hạt và thí nghiệm. Lấy mẫu từ cây: Chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở các địa điểm khác nhau; trên các khóm lựa chọn những khóm có từ 3-5 cây, tách lấy 01hoặc 02 cây làm mẫu, tránh không để ảnh hưởng đến khóm mẹ. Huyện Đồng Hỷ lấy
56 250 mẫu; huyện Võ Nhai lấy được 220 mẫu, dùng làm mẫu thí nghiệm và trồng tại vườn lan khoa CNSH & CNTP. * Chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy: Các mẫu cây lấy về được tách các vảy hành ra từ cây, bóc lần các lá già cho đến khi xuất hiện các mầm chồi bên mang đỉnh sinh trưởng. Cắt bỏ gốc của mỗi mầm, sau đó khử trùng bằng cách ngâm trong cồn 70° trong 30 giây, rửa sạch bằng nước cất vô trùng ngâm trong dung dịch Ca(OCl)2 2% trong 25 phút, việc khử trùng được tiến hành trong tủ cấy. Mô được rửa lại với nước cất vô trùng 4 - 5 lần. Mỗi mầm được đặt trong đĩa petri vô trùng và cẩn thận tách các lá non. Sau mỗi lần tách, nhúng mầm vào cồn 70° trong 1 giây và rửa với nước cất vô trùng. Chuyển sang một đĩa petri vô trùng khác, tách các lá mầm bằng dao nhọn vô trùng. Dùng kìm nhọn tách các lớp lá, cắt đỉnh sinh trưởng ra khỏi mô và cấy vào môi trường nhân giống ban đầu. * Nhân giống Môi trường nhân giống thường là môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) có bổ sung các chất điều hoà tăng trưởng (auxin, cytokinin, ) với tỷ lệ phù hợp tùy loài nhằm tạo điều kiện cho quá trình nhân chồi (Phụ 01). Nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng nên giảm dần trong các lần cấy chuyền sau đó. Các chất chiết trái cây cũng được đề nghị dùng như nước cốt cà chua, nước dừa, nước chuối, nước khoai tây nhưng chúng chỉ có hiệu quả trong các lần cấy chuyền và thể tích cũng không quá 10% thể tích môi trường. Nhiệt độ lý tưởng để nhân giống Lan hài Trần Liên là 22°C - 26°C và tuỳ vào mỗi loài. Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn gọi là thể chồi. Thể chồi được lấy ra khỏi môi trường cấy ban đầu, dùng dao nhọn cắt làm 4-6 miếng tuỳ kích thước của chồi. Lát cắt được chuyển vào môi trường duy trì (môi trường phát triển chồi). Mỗi đỉnh sinh
57 trưởng sẽ phát triển ra một thể chồi mới sau khoảng 4 tuần, có thể cắt tiếp và cấy chuyền sang môi trường mới. Do thời gian và phóng tránh dịch bệnh Covid 19, nên đề tài chỉ nghiên cứu được 04 thí nghiệm như đã trình bày tại phần kết quả, nên chưa có cơ sở đầy đủ để đưa ra bản hướng dẫn kỹ thuật nuôi cấy lan hài Trần Liên bằng phương pháp In-Vitro.
58 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Từ kết quả của đề tài, khóa luận có một số kết luận nghiên cứu như sau: Hài Trần Liên là loài đặc hữu hẹp ở Việt Nam, cây ưa râm mát, nở hoa khoảng tháng 9-12, độ bền của hoa khá dài 25-30 ngày. Lan hài Trần Liên đặt theo tên người Việt Nam đã xuất khẩu nó, bà Trần Ngô Liên. Phân hạng: EN A1a,c,d, B1+2e. Đã liệt kê vào Phụ lục 01 của công ước CITES và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 01) của Nghị định số 306/2019/NĐ - CP ngày 22/01/2019 của Chính phủ về: Quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý, hiếm và thực thi Công ước về buôn bán quốc tế các loài động vật, thực vật hoang dã nguy cấp. Vì vậy, cần nhân rộng từ việc gieo ươm để vừa tạo nguồn cây làm cảnh, đồng thời bảo vệ nguồn gen. (1) Nghiên cứu đặc điểm sinh học và sinh thái học loài lan hài Trần Liên tại tỉnh Thái Nguyên Điều kiện phân bố của lan hài Trần Liên tái sinh và sinh trưởng tốt ở rừng tự nhiên, dưới bóng râm nhẹ (độ tàn che khoảng 30 - 60%), nhiệt độ giao động từ 12-250C, đất mùn trên núi đá vôi; Huyện Võ Nhai và Đồng Hỷ có rừng tự nhiên nhiều, dưới tán rừng tự nhiên khí hậu và đất đai tương đối phù hợp với phân bố và sinh trưởng phát triển của cây lan hài Trần Liên. Chỉ phân bố ở độ cao 300 - 600m so với mực nước biển; Ở chân đồi thường xuất hiện nhiều hơn ở sườn và đỉnh đồi, đôi khi mọc cheo leo ở các kẽ nứt của tường đá trong rừng, nới có lượng mùn tích lũy. Mật độ số khóm và số cây/ha cho thấy sự xuất hiện của cây lan hài Trần Liên thực tế còn rất ít, rất khó khăn cho việc thu thập mẫu để nhân giống, phải cân nhắc khi lấy mẫu cây, chỉ lấy 01-03 cây/khóm cố số cây 3-5 cây/khóm cây lan hài Trần Liên. Chỉ phân bố ở độ cao 300 - 600m so với mực nước biển.
59 Về đặc điểm hình thái: Cây lâu năm, có 3 - 6 lá xếp thành 2 dãy, lá hình dải, cỡ 19 x 1,7 cm, mặt trên màu lục bóng với mép nhạt hơn, mặt dưới màu lục nhạt với nhiều chấm màu tím ở gốc. Cụm hoa có cuống dài 7 - 15 cm, thường mang 1 hoa; Lá bắc hình trứng, cỡ 1,7 - 2,5 x 1,6 cm, lông ngắn ở gân giữa và mép tận cùng. Hoa rộng 5,5 - 6,0 cm; Lá đài có lông ngắn ở mặt ngoài; lá đài gần trục hoa màu trắng, gốc chuyển thành màu lục với sọc màu tía - nâu, gân tròn, cỡ 3 x 3 - 3,5 cm; lá đài kia màu lục nhạt, hình trứng, cỡ 2,5 x 1,1 - 1,8 cm; cánh hoa màu tía - nâu với chóp màu lục, hình thuôn, cỡ 3 - 3,4 x 0,7 - 0,9 cm, bóng, mép lượn sóng, có lông trắng, gốc có nhiều lông nâu - tía nhạt; môi màu đỏ - nâu thẫm, cỡ 3,7 - 3,9 x 1,6 cm; nhị lép, hình trứng ngược, cỡ 8 - 10 x 7 - 9 mm, có mủ bóng; bầu dài 3 - 4 cm, phủ đầy lông ngắn nâu nhạt. (2) Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống lan hài Trần Liên bằng phương pháp nhân giống In vitro. Nguồn vật liệu ban đầu là quả lan hài Trần Liên đạt 8 - 10 tháng tuổi. Khử trùng tối ưu là lắc trong cồn 700 trong 10 phút, sau đó đốt qua đèn cồn, tỷ lệ mầu sạch bệnh đạt 76,67%. Hạt được gieo trên môi trường RE + 10 g/l saccharose + 5.3 g/l agar + 0.5 g/l THT + 100 ml/l nước dừa. Môi trường nhân nhanh protocorm và môi trường nhân nhanh chồi tốt nhất là: ½ VW + 10 g/l saccharose + 0.5 g/l THT + 5.3 g/l agar + 100 ml/l nước dừa + 2 mg/l BA + 0.5 mg/l α - NAA. Môi trường: ½ MS + 10 g/l saccharose + 0.5 g/l THT + 5.3 g/l agar + 100 ml/l nước dừa + 0.5 mg/l α - NAA là môi trường tối ưu để tạo cây hoàn chỉnh. Ảnh hưởng của nồng độ BA (0,00; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 3,0): Sau 40 ngày theo dõi 6 CT thí nghiệm đều thành công thấp; Trong đó, công thức 5 với chất BA nồng độ 2,0 mg/l là có khả năng sinh Protocorm đạt 2,13 lần (64 protocorm) và khả năng bật chồi đạt 2,03 lần (có 61chồi) đây là công thức tốt nhất, chất lượng protocorm và chồi đều xanh đậm và mập.
60 Ảnh hưởng của nồng độ BA (nồng độ 2,0 mg/l) kết hợp với Kinetin ở các nồng độ khác nhau (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0) đến khả năng nhân nhanh của protocorm và chồi lan hài Trần Liên thì để nhân nhanh chồi lan hài Trần Liên cần bổ sung 2,0 mg/l BA + 1,0 mg/l Kinetin là thích hợp nhất. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA (2,0 mg/l) kết hợp với NAA ở các nông độ khác nhau (0,0; 0,3; 0,5; 0,7 & 1,0 mg/l) đến khả năng ra rễ giống lan Trần Liên cho kết quả tương đối tốt. Cao nhất ở CT4 (0,7 mg/l) với chiều cao 3,45 cm; số lá 3,37 lá/cây và 2,67 rễ/cây (tổng số rễ ra của 30 mẫu TN là 80 rễ), đến tuần thứ 4 thì ở CT 4 có 100% số mẫu thí nghiệm đã ra rễ. Nghiên cứu và đề xuất giải pháp chủ yếu bảo tồn và nhân giống lan hài Trần Liên bằng phương pháp nhân giống In vitro. 5.2. Kiến nghị Đề tài đã đạt được những kết quả nhất định so với mục tiêu và nội dung của đề tài đặt ra, tuy nhiên trong thực tế do trình độ hạn chế; Thời gian tiến hành hạn hẹp, cách quãng khi tiến hành nghiên cứu nhóm đề tài đã không tiến hành được theo như kế hoạch đề ra khi điều tra thực địa do quy định về phòng chống dịch bênh Covid 19, vì vậy đề tài có một số kiến nghị sau: Tiếp tục mở rộng diện tích và khu vực điều tra ở nhiều xã, huyện và tỉnh để như các đề tài đã nghiên cứu về lan hài Trần Liên nhận định (Cao Bằng, Bắc Kạn; Tuyên Quang và các huyện còn lại của Thái Nguyên) để xác định đúng vùng phân bố, xác định đúng có độ tin cậy cao về đặc điểm nông sinh học của cây lan hài Trần Liên. Nghiên cứu điều kiện ngoại cảnh (giá thể, ẩm độ, nhiệt độ, dinh dưỡng) đến sinh trưởng và phát triển lan hài Trần Liên giai đoạn vườn ươm để hoàn thiện công nghệ nhân giống In vitro đối với loài lan hài quý và có giá trị này. Nghiên cứu thêm ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng khác như: IBA, IAA, Giberellin dịch chiết suất từ Chuối, Khoai tây; than hoạt tính đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Trần Liên.