›

Khóa luận Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA và dịch chiết đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya (Cattleya sp.) in vitro

pdf 121 trang thiennha21 20/04/2022 5731
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA và dịch chiết đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya (Cattleya sp.) in vitro", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfkhoa_luan_anh_huong_cua_cac_chat_dieu_hoa_sinh_truong_ba_naa.pdf

Nội dung text: Khóa luận Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA và dịch chiết đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya (Cattleya sp.) in vitro

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA NÔNG HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ẢNH HƯỞNG CỦA BA, NAA VÀ DỊCH CHIẾT ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA LAN CATTLEYA (Cattleya sp.) IN VITRO NGÀNH : NÔNG HỌC KHÓA : 2012 - 2016 SINH VIÊN THỰC HIỆN : NGUYỄN CAO KIỆT Tp. Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2016
  2. ẢNH HƯỞNG CỦA BA, NAA VÀ DỊCH CHIẾT ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA LAN CATTLEYA (Cattleya sp.) IN VITRO Tác giả NGUYỄN CAO KIỆT Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng kỹ sư ngành Nông học NGƯỜI HƯỚNG DẪN: ThS. Nguyễn Thị Thanh Duyên Tp. Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2016 i
  3. LỜI CẢM ƠN Con xin thành kính khắc ghi công ơn bố mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng và dạy dỗ con nên người, anh chị em và những người thân trong gia đình đã hết lòng yêu thương, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con có được ngày hôm nay. Em xin trân trọng cảm ơn cô Nguyễn Thị Thanh Duyên – khoa Nông học trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn:  Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.  Các thầy cô giáo đã truyền đạt kiến thức trong những năm đầu học tập.  Văn phòng khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM đã giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập.  Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô khoa Nông học trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian học tập tại trường.  Quý thầy cô trong bộ môn Di truyền – Giống, khoa Nông học đã tạo điều kiện cho em trong thời gian thực hiện đề tài.  Các anh, chị và các bạn trong và ngoài lớp đã luôn động viên và tận tình giúp đỡ trong thời gian tiến hành khóa luận. Xin chân thành cảm ơn! TP. Hồ Chí Minh, tháng 3 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Cao Kiệt ii
  4. TÓM TẮT Đề tài “Ảnh hưởng của BA, NAA và dịch chiết đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya (Cattleya sp.) in vitro” đã được tiến hành tại bộ môn Di truyền – Giống, khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh từ tháng 10/2015 đến tháng 3/2016. Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố và hai yếu tố với ba lần lặp lại bao gồm thí nghiệm khảo sát nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya, thí nghiệm khảo sát liều lượng dịch chiết khoai tây, cà rốt, nước dừa đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya và thí nghiệm khảo sát nồng độ NAA lên sự tạo rễ của lan Cattleya nhằm mục tiêu nhân nhanh số lượng chồi, kích thích sự ra rễ của giống Cattleya sp. in vitro. Kết quả thu được như sau: Xác định được môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường 30 g/l có bổ sung (0,1 mg NAA + 4 mg BA)/lít thích hợp cho việc nhân chồi lan Cattleya nhất. Kết quả cho thấy số chồi hình thành nhiều nhất (19,03 chồi ở giai đoạn 90 NSC). Xác định được môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường 30 g/l có bổ sung 20% nước dừa thích hợp cho sự sinh trưởng lan Cattleya nhất. Kết quả cho thấy số chồi hình thành nhiều nhất (14,06 chồi ở giai đoạn 90 NSC), khối lượng lớn nhất (0,77 g ở giai đoạn 90 NSC). Xác định được môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường 30 g/l có bổ sung 5 mg NAA trên lít thích hợp nhất cho sự hình thành rễ lan Cattleya. Kết quả cho thấy số rễ hình thành nhiều nhất (3,27 rễ/cây ở giai đoạn 80 NSC). iii
  5. MỤC LỤC Trang tựa i Lời cảm ơn ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách từ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix GIỚI THIỆU 1 Đặt vấn đề 1 Mục tiêu – Yêu cầu 2 Mục tiêu 2 Yêu cầu 2 Giới hạn 2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật 3 1.1.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật 3 1.1.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam 6 1.1.3 Lợi ích của phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô 8 1.1.4 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 8 1.1.5 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 9 1.1.5.1 Auxin 10 1.1.5.2 Cytokinin 11 1.1.6 Dịch chiết sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 1.1.6.1 Khoai tây 12 1.1.6.2 Cà rốt 12 1.1.6.3 Nước dừa 12 1.1.7 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm 12 1.2 Một số hình ảnh về hoa Cattleya 14 iv
  6. 1.3 Giới thiệu về lan Cattleya 15 1.3.1 Danh pháp khoa học 15 1.3.2 Nguồn gốc 15 1.3.3 Đặc điểm thực vật học và phân loại 16 1.3.4 Yêu cầu sinh thái 16 1.3.5 Kỹ thuật chăm sóc 17 1.4 Sơ đồ quy trình nhân giống hoa lan in vitro 18 1.5 Một số kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô phong lan 19 1.5.1 Thế giới 19 1.5.2 Việt Nam 20 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 22 2.2 Nội dung 22 2.3 Vật liệu thí nghiệm 22 2.3.1 Giống 22 2.3.2 Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm 23 2.3.2.1 Phòng thí nghiệm 23 2.3.2.2 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm 24 2.3.2.3 Các hóa chất 24 2.4 Phương pháp thí nghiệm 25 2.4.1 Thí nghiệm 1: khảo sát nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya 25 2.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát liều lượng dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya 26 2.4.3 Thí nghiệm 3: khảo sát nồng độ NAA lên sự tạo rễ của lan Cattleya 28 2.5 Xử lý số liệu 29 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya 30 3.2 Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya 38 3.3 Ảnh hưởng của NAA lên sự tạo rễ của lan Cattleya 46 v
  7. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 Kết luận 50 Đề nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 55 Phụ lục 1 Hình ảnh thí nghiệm 55 Phụ lục 2 Kết quả xử lý thống kê 58 vi
  8. DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Đầy đủ ( Nghĩa) BA 6-Benzyladenine BAP 6-Benzylaminopurin CTV Cộng tác viên KC Knudson C Lux Đơn vị tính cường độ ánh sáng MS Murashige và Skoog NAA -Naphthalene acetic acid NCM Nuôi cấy mô ND Nước dừa NSC Ngày sau cấy PLBs Protocorm-like bodies PPFD Photosynthetic photon flux density (Mật độ dòng photon hữu hiệu cho quang hợp) TN Thí nghiệm VW Vacin & Went RE Robert Ernst RPM Revolutions Per Minute (Vòng trên phút) vii
  9. DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi 26 Bảng 2.2 Ảnh hưởng của các dịch chiết đến khả năng nhân chồi 27 Bảng 3.1a Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến chiều cao chồi giai đoạn 10 – 40 NSC (cm) 31 Bảng 3.1b Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến chiều cao chồi giai đoạn 50 – 90 NSC (cm) 32 Bảng 3.2a Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến số chồi giai đoạn 30 – 60 NSC (chồi) 33 Bảng 3.2b Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến số chồi giai đoạn 70 – 90 NSC (chồi) 35 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến đường kính (cm) và khối lượng (g) cụm chồi giai đoạn 90 NSC 37 Bảng 3.4a Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến chiều cao chồi giai đoạn 10 – 40 NSC (cm) 38 Bảng 3.4b Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến chiều cao chồi giai đoạn 50 – 90 NSC (cm) 40 Bảng 3.5a Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến số chồi giai đoạn 10 – 60 NSC (chồi) 42 Bảng 3.5b Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến số chồi giai đoạn 70 – 90 NSC (chồi) 44 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến đường kính (cm) và khối lượng (g) cụm chồi giai đoạn 90 NSC 45 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự tạo rễ của Cattleya giai đoạn 20 – 80 NSC (rễ/cây) 46 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ ra rễ của Cattleya giai đoạn 10 – 80 NSC (rễ/cây/10 ngày) 48 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến chiều dài rễ của Cattleya giai đoạn 80 NSC (cm) 49 viii
  10. DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1.1 Một số hình ảnh lan Cattleya 14 Hình 1.2 Loại lan Cattleya dùng trong TN 15 Hình 1.3 Quy trình kỹ thuật cơ bản nhân giống hoa lan bằng phương pháp NCM tế bào 18 Hình 1.4 Mẫu cụm chồi lan Cattleya được sử dụng trong thí nghiệm 55 Hình 1.5 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 1 giai đoạn 90 NSC 55 Hình 1.6 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 2 giai đoạn 90 NSC 56 Hình 1.7 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 3 giai đoạn 80 NSC 56 Hình 1.8 Cân trọng lượng cụm chồi tươi 57 Hình 1.9 Đo đường kính cụm chồi 57 ix
  11. GIỚI THIỆU Đặt vấn đề Ngày nay, khi đời sống được nâng cao thì hoa là một nhu cầu không thể thiếu của con người. Với hương thơm, màu sắc và ý nghĩa riêng của mình, mỗi loài hoa góp phần làm đẹp thiên nhiên, làm đẹp cho cuộc sống và là biểu tượng cho cái đẹp, hạnh phúc và sức sống cho con người. Trong muôn ngàn loài hoa, hiếm có loài hoa nào lại phong phú, tập hợp nhiều họ, nhiều chủng loại, màu sắc, dáng nét và giàu sức quyến rũ bằng hoa lan. Hoa lan không chỉ mang vẻ đẹp đài các, sang trọng mà còn ấm áp, gần gũi và chất chứa trong mình những giá trị tiềm ẩn, mới lạ, hấp dẫn. Đặc biệt, lan Cattleya rất được ưa thích về màu sắc, kiểu dáng trang nhã nhưng cũng không kém phần kiêu sa. Chính vì vậy, việc trồng lan Cattleya không chỉ dừng lại ở quy mô gia đình mà đã nhanh chóng được mở rộng và trở thành lĩnh vực quan trọng trong nông nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhiều nước trên thế giới như Đài Loan, Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ. Trong đó, Việt Nam cũng là một nước có nhiều tiềm năng trở thành một nước sản xuất hoa phong lan lớn trong khu vực, có khí hậu thích hợp và nhiều nguyên liệu làm giá thể tốt cho cây lan sinh trưởng. Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu hoa trong nước cũng như xuất khẩu đòi hỏi phải có một số lượng lớn cây giống đồng đều trong khi Cattleya lại là một loài lan rất khó nhân giống, thường cho hệ số nhân thấp trong điều kiện nhân vô tính tự nhiên. Do đó việc nghiên cứu để tìm ra phương pháp nhân giống tối ưu cho lan Cattleya là hết sức cần thiết. Trong các phương pháp nhân giống lan Cattleya hiện nay thì nuôi cấy mô là phương pháp thích hợp để nhân nhanh giống lan trong một thời gian ngắn, tạo ra các dòng cây con đồng nhất, sạch bệnh, ổn định về mặt di truyền nhưng không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết. Phương pháp này có thể tạo ra số lượng hoa lan lớn mà vẫn đáp ứng được yêu cầu ngày càng khắt khe hơn của người chơi hoa lan về màu sắc, kiểu dáng phải mới 1
  12. lạ, độc đáo, cây sinh trưởng phát triển tốt, khả năng thích ứng với môi trường cao, ít nhiễm sâu bệnh, hoa tươi lâu, có độ bền, đẹp về màu sắc. Hiện nay, có rất nhiều chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô. Đặc biệt, các chất BA, NAA và dịch chiết là các chất phổ biến trên thị trường bởi vì tính không độc, an toàn với môi trường, dễ tìm, giá cả hợp lý và tác động nhanh đến quá trình nhân chồi, tạo rễ. Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài “Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA và dịch chiết đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya (Cattleya sp.) in vitro” được tiến hành. Mục tiêu – Yêu cầu Mục tiêu - Xác định liều lượng của BA và NAA thích hợp để nhân chồi lan Cattleya. - Xác định liều lượng dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa thích hợp cho sự sinh trưởng chồi lan Cattleya. - Xác định liều lượng NAA thích hợp cho sự tạo rễ lan Cattleya. Yêu cầu - Tìm hiểu và đánh giá sự tác động của các chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA và một số dịch chiết đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya. - Theo dõi sự sinh trưởng của lan Cattleya thông qua chỉ tiêu số chồi, chiều cao của chồi và chiều dài rễ, số rễ. - Đánh giá ảnh hưởng của NAA đến sự tạo rễ lan Cattleya. Giới hạn Đề tài được tiến hành trong 4 tháng nên chỉ giới hạn vào việc thực hiện các thí nghiệm ở giai đoạn nhân chồi và tạo rễ của lan Cattleya tại phòng nuôi cấy mô bộ môn Di truyền – Giống, khoa Nông học. 2
  13. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật Theo Nguyễn Đức Lượng (2006), lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật gắn liền với các sự kiện nổi bật như sau: Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết về tính toàn năng của tế bào vào thực nghiệm. Theo ông, tất cả tế bào thực vật đều có tính toàn năng, mỗi tế bào đều mang một lượng thông tin di truyền đầy đủ của cơ thể và khi gặp điều kiện thuận lợi thì có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Tuy nhiên, ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công. Năm 1922, Kotte và Robbins thực hiện lại thí nghiệm của Haberlandt và đã thành công trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ đầu rễ một cây hòa thảo. Năm 1934, White (Hoa Kỳ) đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cây cà chua trên môi trường lỏng có chứa muối khoáng, đường và dịch chiết nấm men. Ở các thí nghiệm tiếp theo, White chứng minh có thể thay thế dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinic acid. Từ đó, việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau. Sau đó ít lâu, Went và Thimann phát hiện ra chất điều hòa sinh trưởng đầu tiên là IAA (Indol acetic acid). Năm 1939, cùng với Nobercourt, Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng trong thời gian dài của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trên môi trường rắn bằng thạch. 3
  14. Năm 1941, Overbeck (Hoa Kỳ), chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi họ cà (Datura). Trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo đã được nghiên cứu và tổng hợp thành công, như Napthyl acetic acid (NAA), 2,4 Dichlorphenoxy acetic acid (2,4D). Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4D đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy. Năm 1955, Skoog và tìm ra chất điều hòa sinh trưởng trong tinh dịch cá bẹ là 6- Furfurylaminopurine và đặt tên là Kinetin, có tác dụng kích thích sự phân bào. Việc phát hiện vai trò của NAA, IAA, 2,4D và Kinetin cùng với phát hiện vai trò của các vitamin và nước dừa là một bước tiến quan trọng, đây là tiền đề kỹ thuật cho việc xây dựng các môi trường xác định về mặt hoá học, cho việc làm các thí nghiệm ổn định và dẫn đến những thành công tiếp theo của ngành khoa học này. Năm 1957, Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá. Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ. Ngược lại thì dẫn đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo. Hiện tượng này được xác nhận trên nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào sự điều khiển sinh trưởng, phát triển của mô tế bào trong nuôi cấy. Từ 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển. Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành các tế bào đơn bằng cách sử dụng máy lắc. Năm 1960, Bergman công bố có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để thu được hầu hết là tế bào đơn mà không phải là dính cụm. Các tế bào đơn có thể gieo trên môi trường, tiếp tục phân chia và tái tạo lại mô sẹo. Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả khác đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từ tế bào, chứng minh được tính toàn thế của tế bào. 4
  15. Năm 1960, Cooking (Anh) công bố có thể dùng men cellulose để phân huỷ vỏ cellulose của tế bào thực vật, kết quả thu được các tế bào tròn, không vỏ bọc, gọi là protoplast. Đầu những năm 1970, Nagata và Takebe (Nhật) thành công trong việc làm cho các protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia, tạo nên một quần thể tế bào trong môi trường lỏng. Do các protoplast có khả năng dung hợp với nhau trong các điều kiện nhất định và hấp thu các phân tử lớn hoặc thậm chí từ các cơ quan tử từ bên ngoài. Các nhà nuôi cấy mô thực vật đặt hy vọng lớn vào kỹ thuật protoplast để chọn giống có kết quả hơn. Năm 1965, Ledoux và cộng tác viên đề xướng về vấn đề biến tính của tế bào. Ông cho rằng các tế bào có khả năng hấp thụ DNA ngoại lai vào, gây nên sự biến tính ở thực vật. Từ 1980 đến 1992, có nhiều các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gene thực vật được công bố, hàng loạt các công trình chuyển gene ngoại lai vào nhiều họ thực vật. Khả năng nhân giống và phục tráng cây trồng được thể hiện rõ rệt trong những ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật. Morel (1960), đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng của các loài địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm. Khi chia cắt các protocorm và nuôi cấy tiếp thì thu được các protocorm mới. Khi để trong các điều kiện thích hợp nhất định thì protocorm có thể phát triển thành cây lan con. Do đó, có thể phục tráng, tạo ra các dòng vô tính không bị nhiễm virus. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị đối với các cây như: khoai tây, cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính khác. Hiện nay, đang bước vào giai đoạn nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng và phát triển mạnh mẽ trong việc nhân giống, chọn tạo giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. Nuôi cấy mô thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương trình chọn giống, nhân giống hiện đại (Nguyễn Văn Uyển, 1993). 5
  16. 1.1.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam Theo Trần Văn Minh (2005), sau năm 1975, nước ta mới bắt đầu chú trọng đến kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật. Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học, Viện Khoa Học Việt Nam do Lê Thị Muội khởi xướng. Bước đầu phòng tập trung nghiên cứu các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong điều kiện Việt Nam, như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo và protoplast. Và đã thành công khi nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội và ctv, 1978; Lê Thị Xuân và ctv, 1978). Tiếp đó là thành công nuôi cấy protoplast khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội, 1980, 1981). Phòng thí nghiệm tiếp theo được đặt tại phân viện Khoa Học Việt Nam ở TP. Hồ Chí Minh, sau đó là Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội và Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam, chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây. Đến nay, đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô không những ở các Viện nghiên cứu (Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Rau Quả Trung ương, các trường Đại học), mà có cả ở một số tỉnh và cơ sở sản xuất (Đà Lạt, Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Cần Thơ, Nghệ Tĩnh). Từ giữa 1980 đến nay, hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển mạnh. Những kết quả đáng khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giống khoai tây (Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Lâm Nghiệp). Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào kháng bệnh (Lê Bích Thủy và ctv, 1994), chọn dòng chịu muối, chịu mất nước (Nguyễn Tường Vân và ctv, 1994; Định Thị Tòng và ctv, 1994). Các kết quả về dung hợp tế bào trần, chuyển gen lục lạp cũng thu được kết quả lý thú (Nguyễn Đức Thành và ctv, 1993, 1997). Nuôi cấy bao phấn để tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Di Truyền Giống Nông Nghiệp. Nuôi cấy các cây dược liệu quí để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàm lượng sinh học quan trọng cũng đã và đang được phát triển (Phan Huy Bảo và Lê Thị Xuân, 1998; Phan Thị Bảy và ctv, 1995; Bùi Bá Bổng, 1995). Không dừng lại ở đó, các công trình nghiên cứu ngày càng đạt được những bước tiến vượt bậc. Cụ thể: 6
  17. - Tại Viện sinh học Nhiệt đới, từ đầu những năm 2000, đã tập trung vào công nghệ nuôi cấy mô các cây công nghiệp như cà phê, hồ tiêu và nhóm cây lâm nghiệp thân gỗ như Paulownia, dó bầu, Neem Hoàn chỉnh công nghệ nhân nhanh, phục tráng giống, tạo các giống cây trồng nông lâm nghiệp sạch bệnh. Nghiên cứu cải thiện điều kiện nuôi cấy invitro, biorector cho các cây có giá trị như cây thuốc, cây lấy dầu, hoa lan, cây cảnh Lần đầu tiên trong nước, các nhà nghiên cứu đã nuôi cấy thành công mô phôi vô tính (soma), mô chồi sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường lỏng tạo điều kiện rất thuận lợi cho việc nhân sinh khối quy mô lớn tạo sản phẩm có khả năng thương mại hóa. Tạo và nuôi nhân rễ bất định sâm Ngọc Linh và bước đầu ghi nhận được sự hình thành rễ tơ (hairy root) sâm Ngọc Linh nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, tạo điều kiện cho việc nuôi nhân quy mô lớn sinh khối nhằm thu hoạt chất phục vụ ngành mỹ phẩm và y dược. Tạo thành công mô sẹo/rễ bất định hai cây dược liệu quý là Xạ đen và Tam thất nhằm nhân nhanh sinh khối phục vụ sản xuất hợp chất thứ cấp. Đã nhân giống thành công giống lan đặc hữu Việt Nam (Dendrobium farinatum Schildh. et Schraut) (Bích Diệp, 2014). - Các công trình nghiên cứu tại Lâm Đồng đạt được nhiều thành tựu: Dương Tấn Nhựt thu được nhiều kết quả trong nuôi cấy các loài hoa cúc, lyli, salem, hồng môn, hoa hồng, và đặc biệt ứng dụng hệ chiếu sáng đơn sắc của công nghệ đèn LED vào luận án tại Đại học Kagawa, Nhật Bản (2002). Mới đây tác giả đã đạt được nhiều kết quả mới về công nghệ sinh khối sâm K5 Panax vietnamensis, thông đỏ Taxus wallichiana, công nghệ phôi vô tính các loài Hồ điệp (Phalaenopsis spp.), mở ra hướng công nghệ tạo giống chủ động và sinh khối chất lượng cao với những công trình phong phú cùng những đề tài tiềm năng lớn; Nguyễn Văn Kết và ctv triển khai khá thành công nuôi cấy các loài lan rừng Cát Tiên - Lâm Đồng - Đồng Nai, và đặc biệt là đưa từng bước công nghệ nuôi cấy mô hiện đại với các hệ thống Bioreactor vào thực tiễn nhân giống, xuất phát từ luận án tiến sĩ tại Đại học Chungbuk, Hàn Quốc (2005); Phạm Xuân Tùng đã phát triển công nghệ tạo giống khoai tây kết hợp nuôi cấy in vitro (củ bi và siêu bi - microtuber) với công nghệ gieo hạt. Hiện nay tác giả cùng các cộng sự tiếp tục triển khai kết quả công nghệ lai tạo và chọn lọc các dòng hoa quý: cúc, đồng tiền, cẩm chướng có giá trị thương mại cao (Lê Xuân Thám, n.d.). 7
  18. 1.1.3 Lợi ích của phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô Tạo ra các cây con đồng nhất và giống như cây mẹ. Nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong một thời gian ngắn. Tạo ra các cây con sạch bệnh. Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất. Việc trao đổi giống quốc tế các nguồn gen sạch bệnh nuôi trong ống nghiệm được thực hiện dễ dàng. Thông qua nuôi cấy mô có thể ứng dụng việc chuyển gen cho những thực vật bậc cao để chọn tạo giống mới theo yêu cầu sản xuất (Bùi Bá Bổng, 1995). 1.1.4 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Theo Dương Công Kiên (2002), nuôi cấy mô thực vật có một số phương pháp như sau: Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên. Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Sau một thời gian, từ đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển, vươn thân, ra lá, rễ, để trở thành một cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có bổ sung auxin. Trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo, khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. 8
  19. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống cây mẹ, từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn. Nuôi cấy tế bào đơn Khối mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường lỏng và đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp, sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ, gọi là tế bào đơn. Sau đó, tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường thích hợp để phát triển, tăng sinh khối. Nuôi cấy protoplast Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và phát triển thành cây hoàn chỉnh. Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Nuôi cấy hạt phấn đơn bội Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo. Mô sẹo này được phát triển thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội. 1.1.5 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Trong đời sống thực vật, ngoài các chất dinh dưỡng như glucid, protein, lipid, cây còn nhiều chất hoạt tính sinh lý như các vitamine, enzyme, các chất điều hòa sinh trưởng (phytohormon). Trong công nghệ nuôi cấy mô thực vật, các phytphormon rất quan trọng trong quá trình thay đổi các đặc trưng hình thái sinh lý của cây trồng, đặc biệt là trong tạo mô sẹo và hình thành cây hoàn chỉnh (Lê Văn Tri, 1997). Một số đặc tính và cơ chế tác dụng của nhóm chất như auxin, cytokinin. 9
  20. 1.1.5.1 Auxin Auxin là một chất có nhân Idol, có công thức hóa học là C10H9O2N. Auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol acetic acid (IAA). IAA có dẫn xuất là 1- naphthalene acetic acid (NAA) và 2,4-dichlorophenoxyl acetic acid (2,4-D). NAA được Went và Thimann phát hiện năm 1937 và là một auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA. Trong cây IAA tập trung nhiều trong các mô non (chồi, lá đang phát triển), trong hạt, trong hạt nảy mầm (Trịnh Xuân Vũ và ctv, 1976). Tác động sinh lý của auxin Auxin có vai trò điều hòa quan trọng trong việc kìm hãm sự phát triển của chồi bên (duy trì hiện tượng ưu thế ngọn). Auxin gây tính hướng động của cây (hướng quang và hướng địa). Auxin kích thích quá trình tăng trưởng nhờ tác dụng kéo giãn tế bào. Sự kéo tế bào diễn ra đồng thời trên hai trục (trục ngang và trục dọc). Nhờ vào tác dụng này mà auxin giúp tăng diện tích lá, tăng đường kính và chiều dài cành, thân, rễ; làm củ, quả phình to ra. Auxin kích thích sự tăng trưởng của quả, ngăn ngừa hiện tượng rụng lá, quả, kích thích sự ra rễ (Nguyễn Văn Uyển, 1989). Ứng dụng Auxin kích thích sự ra rễ đặc biệt là rễ bất định trên cành giâm, cành chiết và trên mô nuôi cấy. Trong nuôi cấy mô, auxin (IBA, NAA) cũng có tác dụng tạo rễ tốt. Để tăng đậu quả, tăng sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt, người ta xử lý auxin dưới dạng NAA 20 ppm, 2,4-dichlorophenoxyl acetic acid (2,4-D) 10 ppm cho một số cây trồng như cà chua, cam, chanh. Để kéo dài sự chín của quả và dùng bảo quản quả lâu, sử dụng dung dịch NAA (10 – 20 ppm) (Nguyễn Văn Uyển, 1989). 10
  21. 1.1.5.2 Cytokinin Năm 1955, Skoog và Miller tách ra từ 500g DNA (deoxyribo nucleic acid) của tinh dịch cá trích một chất kết tinh và có hoạt tính đối với mô tủy cây thuốc lá và đặt tên là kinetin. Cytokinin là chất điều hòa tăng trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào. Cytokinin thường gặp là kinetin và 6-benzyl aminopurin (BA). Cytokinin được vận chuyển từ mô phân sinh đỉnh rễ (là nơi tổng hợp nhiều cytokinin trong cây). Do đó, cytokinin có hàm lượng cao nhất ở phôi, quả non, rễ (Trịnh Xuân Vũ và ctv, 1976). Vai trò sinh học và ứng dụng Trong giai đoạn đầu của phát sinh phôi soma, sự có mặt của auxin là rất cần thiết để kích thích sự phân bào, nhưng giai đoạn sau phôi phải được nuôi cấy trên môi trường có cytokinin để biệt hóa chồi (Vũ Văn Vụ, 1999). Cytokinin cùng auxin điều tiết chu trình tế bào, kích thích sự phân chia tế bào một cách mạnh mẽ. Nếu auxin/cytokinin >1: kích thích ra rễ; auxin/cytokinin <1: kích thích hình thành chồi; auxin/cytokinin =1: kích thích hình thành mô sẹo (Nguyễn Văn Uyển và ctv, 1993). Cytokinin kích thích sự phát triển mầm hoa. Cytokinin cảm ứng hình thành chồi cây từ mô sẹo nuôi cấy, duy trì sự trẻ hóa của các cơ quan và loại bỏ ưu thế ngọn cũng như hạn chế sự phát triển của rễ. Cytokinin được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy mô thực vật: TDZ (Thiazuron), BA (6- Benzylaminopurine), kinetin (6- Furfuryl amino purine) và cytokinin tự nhiên trong nước dừa được ứng dụng rộng rãi trong môi trường tạo chồi in vitro. (Nguyễn Văn Uyển, 1989). 1.1.6 Dịch chiết sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Dịch chiết hữu cơ có thể kích thích có hiệu quả qua việc cung cấp các thành phần dinh dưỡng acid hữu cơ không xác định và các thành phần có tác dụng như chất kích thích sinh trưởng (Trần Văn Minh, 2005). 11
  22. Các nghiên cứu của Pierik và ctv (1988), Li và ctv (2001), Chyuam và ctv (2010), Songjun và ctv (2012, 2013) đều cho thấy, khi bổ sung các hợp chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy, tỷ lệ tái sinh cây, hệ số nhân chồi của một số loài lan hài cao hơn hẳn môi trường không bổ sung các chất này. Các hợp chất hữu cơ được dùng phổ biến trong nuôi cấy in vitro như nước dừa, dịch chiết chuối, cà rốt, khoai tây, peptone và triptone, đây là những nhân tố đóng vai trò không kém phần quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Cúc và ctv, 2013). 1.1.6.1 Khoai tây Củ khoai tây chứa carbohydrate, protein, chất béo, một vài vitamin, phenolic và một ít amino acid, acid béo (Phạm Hữu Nguyên, 2007). Theo Trần Văn Minh (2005), dịch chiết khoai tây có tác dụng làm tăng sự sinh trưởng của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy. 1.1.6.2 Cà rốt Cà rốt chứa nhiều loại vitamin, chứa Beta-carotenoid và carotenoid (Lê Vân, 2015). Bổ sung vào môi trường MS giúp chồi sinh trưởng. 1.1.6.3 Nước dừa Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng cytokinin được tìm thấy trong nước dừa. Bên cạnh đó trong nước dừa có chứa acid lauric, dồi dào vitamin, khoáng chất và chất dinh dưỡng, ít đường và Natri nhưng lại có nhiều kali, canxi và chloride (Hoa Phạm, 2015). Nước dừa giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật khó nuôi cấy (Trần Văn Minh, 2005). 1.1.7 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm Môi trường dùng trong thí nghiệm là môi trường nền MS (Murashige và Skoog, 1962). Môi trường nền MS là một trong những loại môi trường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, đặc biệt ở những môi trường tái sinh. 12
  23. Môi trường nền MS là môi trường khởi đầu cho mọi quá trình nuôi cấy mô đối với mọi đối tượng nuôi cấy. Môi trường nền MS là môi trường thích hợp với nhiều loại cây do giàu và cân bằng về chất dinh dưỡng (Trần Văn Minh, 2005). Môi trường cơ bản MS gồm các thành phần như sau: Các nguyên tố đa lượng (mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 Các nguyên tố vi lượng (mg/l) MnSO4.4H2O 16,9 ZnSO4.4H2O 8,6 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Na2MO4 0,25 H3BO3 6,2 KI 0,83 Fe-EDTA 36,7 FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA 37,3 Vitamin (mg/l) Glycin e 2 Myo-Inositol 100 Thiamine HCl 0,1 Pyridoxine HCl 0,5 Nicotine acid 0,5 13
  24. 1.2 Một số hình ảnh về hoa Cattleya Hình 1.1 Một số hình ảnh lan Cattleya (Nguồn: Những bức ảnh Đẹp Nhất Thế Giới về Lan Cattleya – The World’s Best Photos Of Cattleya, 2012) 14
  25. 1.3 Giới thiệu về lan Cattleya 1.3.1 Danh pháp khoa học Cattleya là một chi trong họ lan có phả hệ Họ: Orchidaceae Họ phụ: Epidendreae Tông phụ: Laeliinae Chi: Cattleya Hình 1.2 Loại lan Cattleya dùng trong TN (trích dẫn bởi Hà Thị Tuyết Phượng, 2008) (Nguồn: Guilherme Corigliano, 2012) 1.3.2 Nguồn gốc Guilherme Corigliano Năm 1818, William Cattley, một nhà chuyên nghiên cứu thực vật nhiệt đới người Anh, lúc bấy giờ đang làm việc ở Barnett, nhận được một kiện hàng toàn các loại thực vật được gởi về nước từ Brazil. Tác giả thấy một loại cây có lá lạ dùng để bọc và chèn các cây cỏ trong kiện hàng. Tác giả đem trồng các cây lạ đó trong vườn ươm. Đến tháng 11 cùng năm, các cây lạ đó trổ hoa. Những đoá hoa đã gây sửng sốt cho giới quý tộc Anh vì vẻ đẹp rực rỡ, mê hồn cùng mùi hương thật quyến rũ. Rất nhanh chóng người ta đã đặt cho chúng cái tên nữ hoàng của các loài hoa – The Queen of Flowers. Đến năm 1821, John Lindley, một nhà phân loại thực vật được William Cattley nhận vào làm việc để thay thế Sir Joseph Banks, đã qua đời, tiếp tục công trình nghiên cứu mô tả và phân loại thực vật trong bộ sưu tập của Cattley; và Lindley đã lấy tên của Cattley đặt cho cây nữ hoàng của các loài hoa là Cattleya labiata (labiata tiếng Latin có nghĩa là Cánh môi hoa tuyệt diệu) để vinh danh người đầu tiên ở châu Âu trồng Cattleya ra hoa (trích dẫn bởi Hà Thị Tuyết Phượng, 2008). 15
  26. 1.3.3 Đặc điểm thực vật học và phân loại Theo Huỳnh Văn Thới (1996), cũng giống như Dendrobium, Cattleya là cây đa thân, có giả hành mập và lùn hơn, phát triển theo chiều ngang. Lúc còn non có bẹ màu xanh bọc lại, lúc lớn các bẹ khô lại và rụng đi. Thường trên đỉnh giả hành có một hoặc hai lá to, chính giữa có một lưỡi mèo bao lấy phát hoa, phát hoa vượt lên và xuyên qua lưỡi mèo để trổ hoa. Mỗi hoa có ba lá đài hình thuôn, hai cánh ở hai bên, to hơn đài. Cánh thứ ba biến thành môi xòe rộng màu sắc rất đẹp, có khi nhăn nheo, giữa có trụ nhụy khá cao với bốn phấn khối hình dĩa màu vàng. Cattleya được phân ra hai nhóm: - Nhóm 1 lá: giả hành chỉ có một lá và chỉ ra có một, hai hoa rất to, rất đẹp. - Nhóm 2 lá: mỗi giả hành có hai lá, có hoa chùm năm, bảy hoa nhưng hoa nhỏ hơn. 1.3.4 Yêu cầu sinh thái Theo Huỳnh Văn Thới (1996), lan Cattleya thích hợp với điều kiện sinh thái như sau: Nhiệt độ: nhiệt độ lý tưởng của loài lan Cattleya là 210C nhưng cũng có nhiều loài chịu được nhiệt độ cao đến 300C. Vì vậy, Cattleya ở TP. Hồ Chí Minh phát triển rất tốt. Ẩm độ: ẩm độ thích hợp cho lan phát triển dao động trong khoảng từ 40 – 70%, vì vậy mỗi ngày nên tưới nước 2 lần, trừ những ngày mưa. Giả hành Cattleya mập, có khả năng giữ nước tốt, do đó nếu tưới quá ẩm sẽ làm thối đọt non. Ở Đà Lạt có nhiều sương mù nên mỗi ngày chỉ cần tưới một lần, cây lan vẫn tươi tốt, ra hoa to, màu sắc tươi đẹp và lâu tàn. Với điều kiện thời tiết ở thành phố Hồ Chí Minh nên làm giàn che nắng 50%, nếu ở sân thượng phải che 60% và nên treo chậu hơi sát vào nhau để cản bớt gió. Cây lan Cattleya khi thấy lá bị cháy hay vàng là hiện tượng dư nắng, cây lùn, mập và cứng cáp. Thiếu nắng, cây ốm yếu, lá màu xanh đậm, dễ gãy, khó ra hoa và có ra hoa thì hoa mềm hay gục xuống. Cattleya có lá màu xanh lợt hoặc ửng vàng là cây có đủ nắng, đủ nước, mập mạp, dễ ra hoa, hoa to, màu sắc đẹp, cứng cáp, không lắc lư và ra hoa quanh năm. 16
  27. 1.3.5 Kỹ thuật chăm sóc Về phân bón: phun lên lá, lên thân, lên rễ và có bình phun sương vào sáng sớm hoặc chiều mát. Sử dụng phân hỗn hợp N – P – K tùy thuộc vào giai đoạn của cây. Lan con với công thức 30 – 10 – 10 cộng thêm vi lượng. Đối với cây lan trưởng thành sử dụng công thức 10 – 30 – 10 cộng phân vi lượng, lan có lưỡi mèo thì tưới theo công thức 10 – 10 – 30 cộng vi lượng. Không nên tưới lên hoa kể cả nước, vì tưới trực tiếp lên hoa làm cho hoa sẽ mau tàn. Không tưới lên đầu giả hành non lúc lá còn đang ở dạng hình phễu. Tưới như vậy, nước sẽ đọng lại trong phễu làm thối lá và lưỡi mèo. Khi cây Cattleya mới ra chồi non, tưới phân cân đối giữa các hàm lượng N – P – K (10 – 30 – 10) thì đảm bảo 3 tháng sau sẽ ra hoa và khi hoa tàn thì tưới trở lại theo công thức 30 – 10 – 10 cộng vi lượng. Có thể dùng phân hữu cơ như bánh dầu sẽ cho kết quả tốt kết hợp thuốc sát trùng vì phân hữu cơ có thể có nhiều vi khuẩn. Thay chậu: muốn thay chậu thì ngâm giò lan vào xô nước có pha thuốc trừ nấm. Đợi 15 phút sau lấy ra, gỡ nhẹ bộ rễ, dùng kéo bén cắt ra mỗi đơn vị 3 giả hành trở lên, trong đó có một hướng có cây con. Cắt bỏ hết rễ hư thối và trồng lại vào chậu mới, cột vô cây ti cho chặt, tưới phun thuốc kích thích ra rễ rồi để vào chỗ râm mát, chờ khi nào cây lan ra rễ mới để giá thể vào. Nhớ phải thật thoáng, có thể gác hai cây nẹp tre ngay giữa chậu. Cũng có thể cắt trước rồi để yên trong chậu, khi thấy cây ra chồi mới, ra rễ mạnh thì chiết ra trồng (Huỳnh Văn Thới, 1996). 17
  28. 1.4 Sơ đồ quy trình nhân giống hoa lan in vitro Quy trình kỹ thuật cơ bản nhân giống hoa lan bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào trải qua các giai đoạn: Giai đoạn chọn mẫu lan Khử trùng mẫu cấy Nhân giống lan (Nhân nhanh) Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro (tạo rễ) Chuyển cây ra vườn ươm Hình 1.3 Quy trình kỹ thuật cơ bản nhân giống hoa lan bằng phương pháp NCM tế bào (Nguồn: Kỹ thuật nhân giống lan căn bản và nâng cao, 2012) Theo đó, trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, nội dung hướng đến hai giai đoạn bao gồm: - Nhân giống lan (nhân nhanh) nhằm mục tiêu tạo chồi, nhân nhanh số lượng cá thể, đồng đều về sinh trưởng. - Tạo cây hoàn chỉnh nhằm tạo rễ chuẩn bị cho quá trình ra vườn ươm sau này. 18
  29. 1.5 Một số kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô phong lan 1.5.1 Thế giới Theo Ricardo Tadeu de Faria và ctv (2002) khi nghiên về lan Cattleya walkeriana Gardner Brazil in vitro ở môi trường ½ MS có kết hợp than hoạt tính ở các mức 1 mg/l , 2 mg/l, 4 mg/l, 6 mg/l cho thấy bổ sung 2 mg than hoạt tính/lít giúp mẫu ít bị hóa nâu, có lợi trong quá trình cấy chuyền. Khi nghiên cứu nảy mầm và phát triển trong ống nghiệm của Cattleya bicolor Lindley (Orchidaceae) cho thấy Vacin & Went là môi trường nuôi cấy lý tưởng cho hạt nảy mầm và phát triển cây giống ban đầu của Cattleya bicolor Lindley trong ống nghiệm (Rogério Mamoru Suzuki và ctv, 2010). Kết quả của Yaser Hassan Dewir và ctv (2014) khi nghiên cứu vi nhân giống Cattleya, cải thiện quá trình tạo rễ in vitro và tạo sự thích nghi cho thấy cảm ứng tối ưu cho rễ là môi trường ½ MS kết hợp 2,4 mg IBA/lít, 3% sucrose và 60 μmol/m2/s PPFD. Ngoài ra, đều là cây đa thân như Cattleya, có nhiều đặc điểm tương tự, lan Dendrobium đã có một số công trình nghiên cứu: Kết quả nghiên cứu giống lan Dendrobium của Daneshwar Puchooa (2004) cho thấy số lượng tối đa của PLBs đã đạt được hình thành trong môi trường lỏng Murashige và Skoog (MS), dao động ở 80 rpm và có bổ sung (0,1 mg BA + 1mg NAA + 15% nước dừa)/lít; chồi tái sinh đã đạt được hình thành khi PLBs được chuyển lên môi trường MS rắn có bổ sung (0,1 mg BA + 1 mg NAA + 15% nước dừa + 10 g củ khoai tây)/lít, các chồi phát triển hệ rễ sau 4 tuần. Chuyển vào môi trường chứa than hoạt tính để cây con phát triển. Khi nghiên cứu về giống Dendrobium lai cho thấy trên môi trường MS có bổ sung than hoạt tính, trọng lượng tối đa của PLBs (5,123 g) thu được từ sự kết hợp của (1 mg BAP + 1 mg IBA)/lít ; chiều cao chồi cao nhất (3,239 cm) và số lượng tối đa của rễ cây con (4,473) thu được từ (1 mg BAP + 1 mg NAA)/lít kết hợp; các số lượng tối đa của lá (3,490) và chiều dài tối đa của lá (1,946 cm) đã thu được từ (1 mg BAP + 1 mg IBA)/lít 19
  30. và chiều rộng lá cao nhất (1,166 cm) được thu thập từ (0,5 mg BAP + 1 mg IBA)/lít; các chiều dài rễ cao nhất thu được từ (0,5 mg BAP + 0,5 mg IAA)/lít và số lượng tối đa của cây con tái sinh (20) được thu được từ (0,5 mg IAA + 1 mg IBA)/lít. Tuy nhiên, trọng lượng chồi tươi tối đa (0,219 g) và số lượng rễ tối đa trên cây non (6,300) là thu được từ (1 mg IAA + 1 mg IBA)/lít (H. Khatun và ctv, 2010). 1.5.2 Việt Nam Theo Hà Thị Tuyết Phượng (2005) khi nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống cây lan Cattleya (Cattleya sp.) để khử trùng, vào mẫu lan dùng Calci Hypochlorite 3% trong thời gian 15 phút cho kết quả tốt nhất. Ở giai đoạn nhân chồi, tạo cây con, kích thích tố BA có tác dụng thúc đẩy quá trình tạo chồi; có thể nhân giống lan Cattleya in vitro bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh trên môi trường MS + (20 g đường + 150 ml nước dừa + 2 mg BA+ 7g agar)/lít; cụm chồi có 10 chồi đến 15 chồi thích hợp cho quá trình vi nhân giống; lan Cattleya in vitro cũng có khả năng tạo chồi trên môi trường MS khi nuôi cấy mô từ chồi đơn; lượng đường và hàm lượng nước dừa thích hợp cho lan Cattleya in vitro sinh trưởng tốt là (30 g đường và 200 ml nước dừa)/lít. Ở giai đoạn tạo rễ, lan Cattleya có khả năng ra rễ trong điều kiện in vitro; bổ sung NAA ở nồng độ 2 mg/l là thích hợp cho sự tạo rễ; bổ sung chuối hay tấm gạo có tác dụng thúc đẩy sự hình rễ cho cây lan Cattleya in vitro; môi trường ra rễ và tạo cây lan Cattleya in vitro hoàn chỉnh là MS + (20 g đường + 150 ml nước dừa + 2 mg NAA + 30 g chuối + 1 g than hoạt tính + 7 g agar)/lít. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật và phụ gia đến lan Cattleya nuôi cấy mô (in vitro) cho thấy ở giai đoạn nhân chồi, nồng độ BA thích hợp cho khả năng ra chồi lan Cattleya nuôi cấy mô là 2 mg/l không phụ thuộc vào điều kiện có hoặc không có nước dừa; nồng độ Kinitine thích hợp nhất cho khả năng ra chồi lan Cattleya nuôi cấy mô là 3 mg/l; chất điều hòa sinh trưởng tốt cho khả năng ra chồi lan Cattleya nuôi cấy mô là BA với nồng độ 2 mg/l có bổ sung nước dừa; nồng độ NAA thích hợp cho khả năng ra chồi lan Cattleya nuôi cấy mô là 0,1 mg/l. Ở giai đoạn tạo rễ, nồng độ NAA thích hợp nhất để kích thích ra rễ lan Cattleya nuôi cấy mô là 3 mg/l; chất phụ gia tốt để kích thích rễ lan Cattleya nuôi cấy mô là khoai tây với liều lượng 60g/l. 20
  31. Ở giai đoạn ra cây, giá thể thích hợp cho lan Cattleya nuôi cấy mô trồng ngoài vườn ươm là rễ lục bình (Lưu Thị Vân Thư, 2006). Bên cạnh Cattleya, lan Dendrobium là loài cây cùng họ có những đặc điểm tương đồng đã có các nghiên cứu: Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan bản địa Dendrobium nobile lindl của Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh (2013) cho thấy ở giai đoạn khử trùng, vào mẫu, nguyên liệu sử dụng thích hợp là quả lan 5 tháng tuổi và môi trường gieo hạt là MS + (100ml ND + 10g saccharose + 6,0g agar)/lít. Ở giai đoạn nhân protocorm, nhân chồi và tạo cây, trong nhân in vitro kinh điển, môi trường nhân nhanh protocorm tối ưu là KC + (100ml ND + 10g saccharose + 6,0g agar)/lít; nhân nhanh cụm chồi tốt nhất là MS + (100ml ND + 10g saccharose + 6,0g agar)/lít; trong nhân in vitro cải tiến: nuôi cấy lỏng lắc nút bông và lỏng lắc màng thoáng khí đã tăng hệ số nhân protocorm đạt 1,9 và 2,3 lần so với nhân in vitro kinh điển; nuôi cấy đặc thoáng khí giúp giảm 25% lượng saccharose bổ sung vào môi trường và tăng hệ số nhân protocorm lên gấp 1,4 lần so với nuôi cấy kinh điển; nhân nhanh cụm chồi bằng kỹ thuật bioreactor giảm ½ thời gian nhân giống; môi trường tối ưu tạo cây hoàn chỉnh là RE+ (10g saccharozase + 0,5g than hoạt tính)/lít, cường độ ánh sáng 2300 lux. Khi nghiên cứu nhân giống in vitro lan Dendrobium officinale Kimura et Migo (thạch hộc thiết bè) cho thấy ở giai đoạn khử trùng, vào mẫu, nhân giống bằng gieo hạt trên môi trường VW+ (10g sucrose + 6g agar + 100ml nước dừa (ND)/lít là tốt nhất. Ở giai đoạn nhân chồi, tái sinh chồi và tạo cây hoàn chỉnh, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + (100ml ND + 20g sucrose + 6g agar + 60g chuối chín)/lít; nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ sử dụng đoạn thân in vitro mang 2 mắt ngủ và nuôi cấy trên môi trường MS + (20g sucrose + 10% ND + 0,5 mg BA + 0,5mg α-NAA + 6g agar)/lít là tốt nhất; môi trường tốt nhất tạo cây hoàn chỉnh là RE + (10g sucrose + 6g agar + 0,3g THT + 0,5 mg α-NAA)/lít (Nguyễn Thị Sơn và ctv, 2014). Nhìn chung, các nghiên cứu về phong lan đã được tiến hành khá nhiều. Tuy nhiên, các nghiên cứu về dịch chiết ít được đề cập và cần được mở rộng phạm vi nghiên cứu. 21
  32. Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm Thời gian: 10/2015 – 03/2016 Địa điểm: phòng nuôi cấy mô, bộ môn Di truyền – Giống, khoa Nông Học, trường ĐH Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 2.2 Nội dung Thí nghiệm 1: khảo sát nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya Thí nghiệm 2: khảo sát liều lượng dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya Thí nghiệm 3: khảo sát nồng độ NAA lên sự tạo rễ của lan Cattleya 2.3 Vật liệu thí nghiệm 2.3.1 Giống Cụm chồi và cây con lan Cattleya in vitro được lấy từ vườn lan Nam Anh. 22
  33. 2.3.2. Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm 2.3.2.1 Phòng thí nghiệm Khu vực rửa Khu vực riêng dùng để rửa mẫu, rửa chai lọ và dụng cụ nuôi cấy. Phòng pha - Là phòng được sử dụng đầu tiên trong nuôi cấy mô, phòng phải đảm bảo vệ sinh, thoáng mát và vô trùng. Phòng này dùng để cân pha hoá chất, nấu hấp môi trường. - Trang thiết bị cần có trong phòng: bàn, bồn rửa, kệ để hoá chất và dụng cụ, tủ lạnh, tủ sấy, máy đo pH, nồi hấp vô trùng, cân điện tử, máy lắc. Phòng cấy - Thường phòng cấy có diện tích nhỏ khoảng 10 – 15 m2, kín gió, có 2 lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Để tăng hiệu suất khi làm việc, phòng cấy phải được trang bị máy lạnh. Phòng cấy đòi hỏi phải vô trùng tuyệt đối do đó phải thường xuyên khử trùng bằng formol, thuốc tím hoặc đèn UV (ultra violet). - Tiến hành tiệt trùng bằng: + Dung dịch formol phun thành sương mù + Chiếu tia UV trong 3 – 4 giờ đủ để thao tác 2 – 3 giờ - Trang thiết bị cần có trong phòng: bàn để tủ cấy, tủ cấy vô trùng, kệ để môi trường đã hấp và vô trùng, đèn, đèn cồn, đèn đốt bằng gas, dao, kéo, kẹp, dĩa petri, bút viết trên dụng cụ thuỷ tinh. 23
  34. Phòng nuôi cây (phòng sáng) - Sau khi cấy xong, cây được đưa vào phòng nuôi cây. Phòng nuôi cây phải đảm bảo đầy đủ ánh sáng, đủ lạnh để cây phát triển, khoảng 18 – 250C, thường 1 máy điều hoà có công suất 1,5 KW giữ mát cho 15 m2 – 30 m2 phòng nuôi cây. - Theo chế độ chiếu sáng ta chia thành: + Buồng tối liên tục (nuôi tạo mô sẹo, giữ mô sẹo). + Buồng sáng theo chu kỳ 8 – 12 giờ/ngày. + Buồng sáng liên tục. - Trang thiết bị cần có trong phòng: kệ, đèn neon, máy lạnh, dụng cụ đo ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ. 2.3.2.2 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm Môi trường cơ bản là môi trường MS có bổ sung thêm: Đường mía (sacharose) 30g/l Agar 8,5 g/l Than hoạt tính 0,5 g/l Môi trường được điều chỉnh bằng NaOH và HCl để đạt pH = 5,8 và được khử trùng bằng Autoclave ở áp suất 1atm, nhiệt độ 1210 trong thời gian 20 phút. 2.3.2.3 Các hóa chất - Nước cất. - Cồn 700, cồn 960. - NAA (1-Naphthalene acetic acid). - BA (6-Benzyladenine). 24
  35. 2.4 Phương pháp thí nghiệm Thí nghiệm đơn yếu tố và hai yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Điều kiện nuôi cấy Cường độ chiếu sáng: 2000 – 3000 lux Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày Nhiệt độ phòng nuôi cấy là: 18 – 250 C Ẩm độ trung bình: 70 – 80% 2.4.1 Thí nghiệm 1: khảo sát nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya Mục tiêu: xác định nồng độ BA và NAA thích hợp đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya. Vật liệu: cụm chồi lan Cattleya in vitro đường kính 0,4 – 0,5 cm. Phương pháp thí nghiệm: thí nghiệm 2 yếu tố, được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Yếu tố A: 3 mức nồng độ NAA: 0,1 mg/l, 0,2 mg/l, 0,3 mg/l Yếu tố B: 4 mức nồng độ BA: 1 mg/l, 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l - Số nghiệm thức: 12 - Số lần lặp lại của một nghiệm thức: 3 - Số chai cho mỗi lần lặp lại: 5 - Số mẫu/chai: 4 - Tổng số chai cho mỗi nghiệm thức trong 3 lần lặp lại: 5 x 3 = 15 25
  36. - Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 15 x 4 = 60 - Tổng số mẫu: 60 x 12 = 720 - Môi trường nền: môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường 30 g/l Bố trí thí nghiệm: Bảng 2.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi Nồng độ BA Nồng độ NAA (mg/l) (mg/l) 0,1 0,2 0,3 1 NT1 NT5 NT9 2 NT2 NT6 NT10 3 NT3 NT7 NT11 4 NT4 NT8 NT12 Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi định kỳ 10 ngày/lần đến 90 ngày sau cấy - Chiều cao chồi (cm): đo từ mặt thạch lên đỉnh cụm chồi - Số chồi (chồi): đếm số chồi hình thành trung bình của các cụm trong 5 chai - Trọng lượng tươi cụm chồi 90 ngày sau cấy (g): cân và tính trung bình 4 cụm chồi trong một chai. - Đường kính cụm chồi 90 ngày sau cấy (cm): đo và tính trung bình 4 cụm chồi trong một chai. 2.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát liều lượng dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya Mục tiêu: xác định liều lượng và loại dịch chiết thích hợp đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya. Vật liệu: cụm chồi lan Cattleya in vitro đường kính 0,3 – 0,4 cm. 26
  37. Phương pháp thí nghiệm: thí nghiệm 2 yếu tố, được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Yếu tố A: 3 mức nồng độ: 10%, 20%, 30% Yếu tố B: 3 loại dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa - Số nghiệm thức: 9 - Số lần lặp lại của một nghiệm thức: 3 - Số chai cho mỗi lần lặp lại: 5 - Số mẫu/chai: 4 - Tổng số chai cho mỗi nghiệm thức trong 3 lần lặp lại: 5 x 3 = 15 - Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 15 x 4 = 60 - Tổng số mẫu: 60 x 9 = 540 - Môi trường nền: môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường 30 g/l Bố trí thí nghiệm: Bảng 2.2 Ảnh hưởng của các dịch chiết đến khả năng nhân chồi Phần trăm dịch chiết (%) Dịch chiết 10% 20% 30% Dịch chiết khoai tây NT1 NT4 NT7 Dịch chiết cà rốt NT2 NT5 NT8 Nước dừa NT3 NT6 NT9 Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi định kỳ 10 ngày/lần đến 90 ngày sau cấy - Chiều cao chồi (cm): đo từ mặt thạch lên đỉnh cụm chồi - Số chồi (chồi): đếm số chồi hình thành trung bình của các cụm trong 5 chai 27
  38. - Trọng lượng tươi cụm chồi 90 ngày sau cấy (g): cân và tính trung bình 4 cụm chồi trong một chai. - Đường kính cụm chồi 90 ngày sau cấy (cm): đo và tính trung bình 4 cụm chồi trong một chai. 2.4.3 Thí nghiệm 3: khảo sát nồng độ NAA lên sự tạo rễ của lan Cattleya Mục đích: xác định nồng độ NAA thích hợp đến khả năng tạo rễ của lan Cattleya. Vật liệu: cây con lan Cattleya in vitro cao 1,5 – 2 cm. Phương pháp thí nghiệm: thí nghiệm đơn yếu tố, được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. - Số nghiệm thức: 6 - Số lần lặp lại của một nghiệm thức: 3 - Số chai cho mỗi lần lặp lại: 5 - Số mẫu/chai: 4 - Tổng số chai cho mỗi nghiệm thức trong 3 lần lặp lại: 5 x 3 = 15 - Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 15 x 4 = 60 - Tổng số mẫu: 60 x 6 = 360 - Môi trường nền: môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường 30 g/l Bố trí thí nghiệm: NT1: 0 mg/l NAA NT2: 1 mg/l NAA NT3: 2 mg/l NAA 28
  39. NT4: 3 mg/l NAA NT5: 4 mg/l NAA NT6: 5 mg/l NAA Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi định kỳ 10 ngày/lần đến 80 ngày sau cấy - Số rễ (rễ): đếm số rễ hình thành trung bình các cây trong 5 chai - Tốc độ ra rễ (rễ/cây/số ngày): rễ/cây/10 - Chiều dài rễ (cm): đo từ cổ rễ đến đỉnh rễ ở 80 ngày sau cấy. 2.5 Xử lý số liệu Số liệu được lưu trữ và xử lý thô bằng phần mềm Excel. Phân tích ANOVA bằng phần mềm SAS 9.1 (Statistical Analysis System - USA, 1999). Trắc nghiệm phân hạng các trung bình nghiệm thức ở mức α = 0,01 hoặc α = 0,05. 29
  40. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya Nhằm kích thích quá trình sinh trưởng số chồi và chiều cao chồi, việc bổ sung BA và NAA vào môi trường nuôi cấy là rất cần thiết. Để tìm nồng độ thích hợp cho lan Cattleya, thí nghiệm được thực hiện với nồng độ BA được thay đổi từ 1, 2, 3, 4 mg/l và nồng độ NAA từ 0,1; 0,2; 0,3 mg/l. Theo Nguyễn Văn Uyển và ctv (1993), cho rằng cytokinin cùng auxin điều tiết chu trình tế bào, kích thích sự phân chia tế bào một cách mạnh mẽ. Vì vậy khi bổ sung vào môi trường các chất NAA và BA sẽ giúp chồi sinh trưởng về chiều cao. Kết quả về chiều cao chồi được thể hiện ở bảng 3.1a cho thấy: Nhìn chung, ở giai đoạn 10 – 40 NSC, chiều cao chồi có tăng nhưng không đáng kể. Sự khác biệt giữa các nghiệm thức không có ý nghĩa về mặt thống kê. Đến giai đoạn 40 NSC, chiều cao chồi dao động từ 0,74 – 0,92 cm. 30
  41. Bảng 3.1a Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến chiều cao chồi giai đoạn 10 – 40 NSC (cm) Nồng độ NAA (mg/l) NSC TB 0,1 0,2 0,3 1 0,49 0,50 0,51 0,50 2 0,47 0,52 0,51 0,50 3 0,49 0,53 0,62 0,55 10 4 0,53 0,56 0,55 0,55 TB 0,49 0,53 0,55 ns CV = 10,25% Ftính (A) = 3,01 ns ns Ftính (B) = 2,34 Ftính (A x B) = 0,82 1 0,55 0,55 0,56 0,55 2 0,53 0,58 0,54 0,55 3 0,56 0,60 0,65 0,60 20 4 0,55 0,60 0,61 0,59 TB 0,55 0,58 0,59 Nồng ns CV = 8,83% Ftính (A) = 2,42 độ BA ns ns Ftính (B) = 2,25 Ftính (A x B) = 0,73 (mg/l) 1 0,68 0,78 0,63 0,70 2 0,65 0,72 0,64 0,67 3 0,70 0,71 0,69 0,70 30 4 0,67 0,71 0,65 0,67 TB 0,68 0,73 0,65 ns CV = 13,91% Ftính (A) = 1,97 ns ns Ftính (B) = 0,26 Ftính (A x B) = 0,26 1 0,79 0,92 0,74 0,82 2 0,82 0,83 0,76 0,80 3 0,83 0,84 0,78 0,82 40 4 0,90 0,82 0,77 0,83 TB 0,84 0,85 0,76 ns CV = 14,48% Ftính (A) = 1,91 ns ns Ftính (B) = 0,08 Ftính (A x B) = 0,43 Ghi chú: (ns): không có ý nghĩa 31
  42. Bảng 3.1b Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến chiều cao chồi giai đoạn 50 – 90 NSC (cm) Nồng độ NAA (mg/l) NSC TB 0,1 0,2 0,3 1 0,94 0,97 0,81 0,91 2 0,89 0,89 0,84 0,87 3 0,95 0,87 0,86 0,89 50 4 0,95 0,86 0,88 0,90 TB 0,93 0,90 0,85 ns CV = 14,37% Ftính (A) = 1,36 ns ns Ftính (B) = 0,11 Ftính (A x B) = 0,31 1 1,01 1,14 0,95 1,03 2 0,97 1,03 0,92 0,98 3 1,05 1,07 1,02 1,05 60 4 1,06 0,94 1,05 1,02 TB 1,03 1,04 0,98 ns CV = 11,77% Ftính (A) = 0,79 ns ns Ftính (B) = 0,58 Ftính (A x B) = 0,97 1 1,07 1,22 1,12 1,14 2 1,09 1,15 1,08 1,11 Nồng 3 1,09 1,14 1,08 1,10 độ BA 70 4 1,17 1,04 1,13 1,11 (mg/l) TB 1,11 1,14 1,10 ns CV = 14,53% Ftính (A) = 0,16 ns ns Ftính (B) = 0,08 Ftính (A x B) = 0,40 1 1,13 1,32 1,20 1,22 2 1,28 1,23 1,20 1,24 3 1,21 1,19 1,17 1,19 80 4 1,28 1,14 1,24 1,22 TB 1,23 1,22 1,20 ns CV = 13,30% Ftính (A) = 0,08 ns ns Ftính (B) = 0,12 Ftính (A x B) = 0,61 1 1,31 1,40 1,30 1,34 2 1,43 1,34 1,31 1,36 3 1,32 1,22 1,28 1,27 90 4 1,41 1,25 1,38 1,35 TB 1,37 1,30 1,32 ns CV = 10,26% Ftính (A) = 0,79 ns ns Ftính (B) = 0,75 Ftính (A x B) = 0,63 Ghi chú: (ns): không có ý nghĩa 32
  43. Ở giai đoạn 50 – 90 NSC, chiều cao chồi tiếp tục tăng cao. Tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê. Điều này cho thấy, khi thay đổi các mức nồng độ, sự tác động của BA kết hợp NAA đến chiều cao chồi là không có ý nghĩa. Bảng 3.2a Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến số chồi giai đoạn 30 – 60 NSC (chồi) Nồng độ NAA (mg/l) NSC TB 0,1 0,2 0,3 1 3,66abc 3,65abc 3,47abc 3,59B 2 3,19bc 3,25abc 4,17ab 3,53B 3 2,96c 4,33a 4,00abc 3,76AB 30 4 4,29a 3,96abc 4,17ab 4,14A TB 3,52 3,80 3,95 ns CV = 11,03% Ftính (A) = 3,28 * Ftính (B) = 3,84 Ftính (A x B) = 3,85 1 6,43 4,12 6,36 5,64 2 5,96 4,82 5,78 5,52 3 5,32 5,56 7,67 6,18 40 4 6,91 6,66 8,14 7,23 TB 6,16 5,29 6,99 Nồng ns CV = 27,19% Ftính (A) = 3,11 độ BA ns ns Ftính (B) = 1,97 Ftính (A x B) = 0,54 (mg/l) 1 8,02 5,06 7,41 6,83 2 6,59 5,68 6,50 6,26 3 6,49 6,33 9,18 7,33 50 4 7,98 7,07 9,13 8,06 TB 7,27 6,04 8,06 ns CV = 28,28% Ftính (A) = 3,07 ns ns Ftính (B) = 1,30 Ftính (A x B) = 0,54 1 8,76 5,42 9,97 8,05 2 7,79 6,19 7,51 7,17 3 6,99 8,13 10,52 8,55 60 4 9,55 7,42 10,53 9,17 TB 8,27AB 6,79B 9,64A * CV = 29,60% Ftính (A) = 4,10 ns ns Ftính (B) = 1,08 Ftính (A x B) = 0,67 Ghi chú: Các giá trị không cùng mẫu tự theo sau có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (( ): rất có ý nghĩa; (*): có ý nghĩa; (ns): không có ý nghĩa) 33
  44. Theo Nguyễn Văn Uyển và ctv, (1993): tỷ lệ auxin/cytokinin > 1 sẽ kích thích ra rễ, auxin/cytokinin < 1 sẽ kích thích hình thành chồi, auxin/cytokinin = 1 sẽ kích thích hình thành mô sẹo. Trong thí nghiệm sử dụng auxin (NAA)/cytokinin (BA) đều có tỷ lệ < 1 sẽ kích thích sự tạo chồi của lan Cattleya. Kết quả về số chồi được thể hiện ở bảng 3.2a cho thấy: Giai đoạn 10 – 20 NSC, số chồi chưa hình thành do thời gian ngắn. Giai đoạn 30 NSC cho thấy ở yếu tố nồng độ BA, với 4 mg/l cho số chồi cao nhất (4,14 chồi) tuy không khác biệt với nồng độ 3 mg/l (3,76 chồi) nhưng có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nồng độ khác. Khi thay đổi nồng độ NAA, số chồi không có ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên, sự khác biệt giữa các yếu tố khi kết hợp BA và NAA rất có ý nghĩa trong thống kê. Trong đó, số chồi cao nhất ở nồng độ (0,2 mg NAA + 3 mg BA)/l đạt 4,33 chồi, rất có ý nghĩa thống kê so với các nồng độ (0,1 mg NAA + 2 mg BA)/l đạt 3,19 chồi và (0,1 mg NAA + 3 mg BA)/l đạt 2,96 chồi nhưng không khác biệt so với các nồng độ còn lại. Giai đoạn 40 – 50 NSC, số chồi có tăng nhưng không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức, dao động từ 4,12 – 8,14 chồi (40 NSC) và 5,06 – 9,18 chồi (50 NSC). Qua kết quả phân tích thống kê cho thấy ở giai đoạn 60 NSC, ở các mức NAA khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức. Trong đó, bổ sung 0,3 mg/l cho số chồi cao nhất đạt 9,64 chồi tuy không khác biệt so với nghiệm thức bổ sung 0,1 mg/l đạt 8,27 chồi nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức bổ sung 0,2 mg/l đạt 6,79 chồi. 34
  45. Bảng 3.2b Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến số chồi giai đoạn 70 – 90 NSC (chồi) Nồng độ NAA (mg/l) NSC TB 0,1 0,2 0,3 1 9,66bcd 7,54d 10,69bc 9,30B 2 9,06bcd 9,63bcd 7,71cd 8,80B 3 9,60bcd 11,53ab 11,89ab 11,00A 70 4 13,97a 9,08bcd 10,77bc 11,27A TB 10,57 9,45 10,27 ns CV = 11,76% Ftính (A) = 2,88 Ftính (B) = 9,63 Ftính (A x B) = 7,01 1 12,07cde 9,64e 13,00bcd 11,57B 2 10,84de 9,82e 11,22cde 10,63B Nồng 3 10,53de 15,24ab 14,05bc 13,27A độ BA 80 4 17,28a 10,38de 13,83bc 13,83A (mg/l) TB 12,68A 11,27B 13,03A CV = 9,21% Ftính (A) = 8,04 Ftính (B) = 15,44 Ftính (A x B) = 13,94 1 12,10ef 9,89f 17,29ab 13,09B 2 12,63de 10,54ef 11,47ef 11,55C 3 10,78ef 16,11bc 14,53cd 13,81AB 90 4 19,03a 10,51ef 14,21cd 14,58A TB 13,64A 11,76B 14,38A CV = 6,62% Ftính (A) = 28,28 Ftính (B) = 19,55 Ftính (A x B) = 44,20 Ghi chú: Các giá trị không cùng mẫu tự theo sau có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (( ): rất có ý nghĩa; (ns): không có ý nghĩa) Giai đoạn 70 NSC cho thấy, ở yếu tố nồng độ BA, khi bổ sung 3 mg/l và 4 mg/l cho số chồi cao nhất (11,00 chồi và 11,27 chồi) rất có ý nghĩa thống kê so với các nồng độ còn lại. Sự kết hợp của (0,1 mg NAA + 4 mg BA)/lít cho số chồi cao nhất (13,97 chồi) tuy không khác biệt nồng độ (0,2 mg NAA + 3 mg BA)/lít (11,53 chồi) và (0,3 mg NAA + 3 mg BA)/lít (11,89 chồi) nhưng khác biệt rất có ý về mặt nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. 35
  46. Ở giai đoạn 80 NSC, đối với nồng độ chất điều hòa sinh trưởng NAA, khi bổ sung 0,3 mg/l cho số chồi cao nhất (13,03 chồi) tuy không khác biệt so với nghiệm thức bổ sung 0,1 mg/l (12,68 chồi) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa so với nghiệm thức bổ sung 0,2 mg/l (11,27 chồi). Khi thay đổi các mức nồng độ BA, nghiệm thức bổ sung 3 mg/l và 4 mg/l cho số chồi cao nhất (13,27 chồi và 13,83 chồi) khác biệt rất có ý nghĩa so với các nồng độ còn lại. Sự kết hợp của (0,1 mg NAA + 4 mg BA)/lít cho số chồi cao nhất (17,28 chồi) tuy không khác biệt nồng độ (0,2 mg NAA + 3 mg BA)/lít (15,24 chồi) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các các nghiệm thức còn lại. Qua kết quả phân tích thống kê cho thấy ở giai đoạn 90 NSC, ở yếu tố nồng độ NAA, khi bổ sung 0,3 mg/l cho số chồi cao nhất (14,38 chồi) tuy không khác biệt so với nghiệm thức bổ sung 0,1 mg/l (13,64 chồi) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa so với nghiệm thức bổ sung 0,2 mg/l (11,76 chồi). Đối với nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA, bổ sung 4 mg/l cho số chồi cao nhất (14,58 chồi) tuy không khác biệt so với nghiệm thức bổ sung 3 mg/l (13,81 chồi) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa so với các nồng độ còn lại. Khi kết hợp (0,1 mg NAA + 4 mg BA)/lít cho số chồi cao nhất (19,03 chồi) tuy không khác biệt so với nghiệm thức bổ sung (0,3 mg NAA + 1 mg BA)/lít (17,29 chồi) nhưng rất có ý nghĩa thống kê so với các nồng độ còn lại. Như vậy, môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi là môi trường có bổ sung 0,1 mg/l NAA + 4 mg/l BA. 36
  47. Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến đường kính (cm) và khối lượng (g) cụm chồi giai đoạn 90 NSC Nồng độ NAA (mg/l) Chỉ tiêu TB 0,1 0,2 0,3 1 0,86f 0,97ef 1,42ab 1,08C 2 1,01def 1,17cde 1,57a 1,25B Đường 3 1,00def 1,32bc 1,40ab 1,24B kính 4 1,35abc 1,20bcd 1,56a 1,37A (cm) TB 1,06C 1,17B 1,49A Nồng CV = 7,31% Ftính (A) = 72,97 độ BA Ftính (B) = 15,31 Ftính (A x B) = 5,67 (mg/l) 1 0,70e 0,85cde 1,51a 1,02AB 2 1,02bc 0,69e 1,15b 0,95B Khối 3 0,83cde 1,01bc 1,04bc 0,96B lượng 4 0,77de 0,98bcd 1,44a 1,06A (g) TB 0,83B 0,88B 1,28A CV = 9,12% Ftính (A) = 88,45 * Ftính (B) = 3,17 Ftính (A x B) = 14,93 Ghi chú: Các giá trị không cùng mẫu tự theo sau có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (( ): rất có ý nghĩa; (*): có ý nghĩa) Qua phân tích thống kê về đường kính và khối lượng cụm chồi được thể hiện ở bảng 3.3 cho thấy: Khi bổ sung 0,3 mg NAA trên lít vào môi trường MS cho đường kính và khối lượng lớn nhất (1,49 cm và 1,28 g) rất có ý nghĩa thống kê. Trong khi đó ở yếu tố nồng độ BA, bổ sung 4 mg/l vào môi trường cho đường kính cụm chồi lớn nhất (1,37 cm) rất có ý nghĩa thống kê. Đồng thời về khối lượng, việc bổ sung 4 mg BA trên lít vào môi trường đạt kết quả cao nhất (1,06 g) tuy không khác biệt so với việc bổ sung 1 mg BA trên lít (1,02 g) nhưng có ý nghĩa về mặt thống kê. Đường kính cụm chồi đạt kết quả tốt nhất khi kết hợp (0,3 mg NAA + 2 mg BA)/lít (1,57 cm), rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Sự kết hợp của (0,3 mg NAA + 1 mg BA)/lít cho kết quả khối lượng cao nhất (1,51 g), rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Điều này cho thấy, sự kết hợp BA và NAA tác động đến đường kính và khối lượng cụm chồi là rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Sự kết hợp của (0,3 mg NAA + 2 mg BA)/lít 37
  48. cho kết quả tốt nhất về đường kính cụm chồi và khối lượng cụm chồi đạt cao nhất khi kết hợp (0,3 mg NAA + 1 mg BA)/lít. Qua thí nghiệm cho thấy, môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi lan Cattleya là môi trường có bổ sung 0,1 mg/l NAA + 4 mg/l BA. 3.2 Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya Bảng 3.4a Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến chiều cao chồi giai đoạn 10 – 40 NSC (cm) Nồng độ (%) NSC TB 10 20 30 Khoai tây 0,36 0,34 0,36 0,35B Cà rốt 0,36 0,36 0,35 0,36B Nước dừa 0,41 0,45 0,38 0,41A 10 TB 0,38 0,38 0,36 ns CV = 11,04% Ftính (A) = 0,53 * ns Ftính (B) = 5,88 Ftính (A x B) = 0,87 Khoai tây 0,54 0,40 0,45 0,46B Cà rốt 0,51 0,49 0,43 0,48B Nước dừa 0,56 0,63 0,52 0,57A 20 Loại TB 0,53 0,51 0,47 ns dịch CV = 11,07% Ftính (A) = 3,28 ns chiết Ftính (B) = 9,70 Ftính (A x B) = 2,87 Khoai tây 0,79 0,48 0,58 0,61B Cà rốt 0,69 0,63 0,55 0,62B Nước dừa 0,83 0,84 0,64 0,77A 30 TB 0,77A 0,65AB 0,59B CV = 15,34% Ftính (A) = 7,38 ns Ftính (B) = 6,38 Ftính (A x B) = 2,45 Khoai tây 0,86 0,54 0,62 0,67B Cà rốt 0,74 0,69 0,61 0,68B Nước dừa 0,96 0,90 0,72 0,86A 40 TB 0,85A 0,71AB 0,65B CV = 16,44% Ftính (A) = 6,45 ns Ftính (B) = 7,02 Ftính (A x B) = 1,60 Ghi chú: Các giá trị không cùng mẫu tự theo sau có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (( ): rất có ý nghĩa; (*): có ý nghĩa; (ns): không có ý nghĩa) 38
  49. Dịch chiết khoai tây được dùng phổ biến trong nuôi cấy mô. Đồng thời nhằm thử nghiệm một số loại dịch chiết khác đến sinh trưởng lan Cattleya nên đã tiến hành thêm các đối tượng phổ biến ở Việt Nam là cà rốt và nước dừa.Trong các dịch chiết đó có hàm lượng đạm cao, là nguồn thực phẩm có giá trị cung cấp protein, khoáng và nhiều loại sinh tố khác nhau. Kết quả chiều cao khi bổ sung các dịch chiết này vào môi trường nuôi cấy ở bảng 3.4a cho thấy: Giai đoạn 10 – 20 NSC, ở yếu tố loại dịch chiết, nước dừa cho kết quả tốt nhất về chiều cao, có ý nghĩa về mặt thống kê, lần lượt là 0,41 cm (10 NSC) và 0,57 cm (20 NSC) nhưng ở các mức nồng độ khác nhau, sự khác biệt về chiều cao chồi là không có ý nghĩa về mặt thống kê. Giai đoạn 30 NSC, khi thay đổi các mức nồng độ dịch chiết, sử dụng 10% dịch chiết cho kết quả tốt nhất về chiều cao (0,77 cm) tuy không khác biệt so với nghiệm thức bổ sung 20% dịch chiết (0,65 cm) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với nghiệm thức bổ sung 30% dịch chiết (0,59 cm). Đối với loại dịch chiết, nước dừa cho kết quả tốt nhất về chiều cao (0,77 cm), rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Đến giai đoạn 40 NSC, ở yếu tố nồng độ dịch chiết, khi sử dụng 10% dịch chiết cho kết quả tốt nhất về chiều cao (0,85 cm) tuy không khác biệt so với nghiệm thức bổ sung 20% dịch chiết (0,71 cm) nhưng rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với nghiệm thức bổ sung 30% dịch chiết (0,65 cm). Khi thay đổi loại dịch chiết, nước dừa cho kết quả tốt nhất về chiều cao (0,86 cm), rất có ý nghĩa về mặt thống kê. 39
  50. Bảng 3.4b Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến chiều cao chồi giai đoạn 50 – 90 NSC (cm) Nồng độ (%) NSC TB 10 20 30 Khoai tây 0,97 0,55 0,66 0,73B Cà rốt 0,88 0,77 0,71 0,79B Nước dừa 1,10 1,09 0,87 1,02A 50 TB 0,98A 0,80B 0,75B * CV = 17,76% Ftính (A) = 6,01 ns Ftính (B) = 9,78 Ftính (A x B) = 1,17 Khoai tây 1,11 0,63 0,70 0,81B Cà rốt 0,95 0,86 0,82 0,88B Nước dừa 1,31 1,30 1,10 1,24A 60 TB 1,12A 0,93B 0,87B * CV = 19,80% Ftính (A) = 4,01 ns Ftính (B) = 12,78 Ftính (A x B) = 1,91 Loại Khoai tây 1,19 0,70 0,79 0,89B dịch Cà rốt 1,03 0,94 0,86 0,94B chiết Nước dừa 1,36 1,42 1,21 1,33A 70 TB 1,19A 1,02B 0,95B * CV = 15,59% Ftính (A) = 4,94 ns Ftính (B) = 18,90 Ftính (A x B) = 2,29 Khoai tây 1,37 0,84 0,86 1,02B Cà rốt 1,21 1,07 0,88 1,05B Nước dừa 1,63 1,53 1,37 1,51A 80 TB 1,41A 1,15B 1,04B CV = 11,39% Ftính (A) = 17,35 ns Ftính (B) = 36,54 Ftính (A x B) =2,41 Khoai tây 1,42 0,96 0,97 1,12B Cà rốt 1,31 1,15 0,92 1,13B Nước dừa 1,78 1,66 1,47 1,64A 90 TB 1,51A 1,26B 1,12B CV = 13,29% Ftính (A) = 11,63 ns Ftính (B) = 26,80 Ftính (A x B) = 0,92 Ghi chú: Các giá trị không cùng mẫu tự theo sau có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (( ): rất có ý nghĩa; (*): có ý nghĩa; (ns): không có ý nghĩa) 40
  51. Giai đoạn 50 NSC, ở yếu tố nồng độ, sử dụng 10% dịch chiết cho kết quả tốt nhất về chiều cao (0,98 cm), có ý nghĩa về mặt thống kê. Trong khi đó ở yếu tố loại dịch chiết, nước dừa cho kết quả tốt nhất về chiều cao (1,02 cm), rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Đến giai đoạn 60 NSC, khi thay đổi nồng độ dịch chiết, sử dụng 10% dịch chiết cho kết quả tốt nhất về chiều cao (1,12 cm), có ý nghĩa về mặt thống kê. Ở yếu tố loại dịch chiết, nước dừa cho kết quả tốt nhất về chiều cao (1,24 cm), rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Ở giai đoạn 70 NSC, khi thay đổi mức nồng độ, sử dụng 10% dịch chiết cho kết quả tốt nhất về chiều cao (1,19 cm), có ý nghĩa về mặt thống kê. Trong khi thay đổi loại dịch chiết, nước dừa cho kết quả tốt nhất về chiều cao (1,33 cm), rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Giai đoạn 80 NSC, ở yếu tố nồng độ, sử dụng 10% dịch chiết cho kết quả tốt nhất về chiều cao (1,41 cm), rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Đối với yếu tố loại dịch chiết, nước dừa cho kết quả tốt nhất về chiều cao (1,51 cm), rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Sự sinh trưởng của chiều cao chồi tiếp tục gia tăng ở giai đoạn ở giai đoạn 90 NSC, đối với yếu tố nồng độ, sử dụng 10% dịch chiết cho kết quả tốt nhất về chiều cao (1,51 cm), rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Trong khi đó ở yếu tố loại dịch chiết, nước dừa cho kết quả tốt nhất về chiều cao (1,64 cm), rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Kết quả cho thấy, sự tác động đến chiều cao rất rõ rệt ở 10% dịch chiết. Bên cạnh đó, nước dừa cũng ảnh hưởng đến chiều cao rất mạnh mẽ. Tuy nhiên, sự tương tác của nồng độ dịch chiết và loại dịch chiết đối với chiều cao chồi là không có ý nghĩa về mặt thống kê. 41
  52. Bảng 3.5a Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến số chồi giai đoạn 30 – 60 NSC (chồi) Nồng độ (%) NSC TB 10 20 30 Khoai tây 2,38cd 0,86e 1,72d 1,66C Cà rốt 2,86bc 2,57cd 1,98cd 2,47B Nước dừa 2,70bc 4,02a 3,57ab 3,43A 30 TB 2,65 2,48 2,42 ns CV = 14,35% Ftính (A) = 0,92 Ftính (B) = 54,22 Ftính (A x B) = 13,73 Khoai tây 2,64de 0,97f 1,94ef 1,85C Cà rốt 4,34b 3,15cd 2,77de 3,42B Nước dừa 4,00bc 5,99a 4,92b 4,97A 40 Loại TB 3,66 3,37 3,21 chất ns CV = 12,92% Ftính (A) = 2,46 hữu Ftính (B) = 112,66 Ftính (A x B) = 17,08 cơ cde f ef C Khoai tây 3,27 1,20 2,12 2,19 Cà rốt 4,77bc 3,98cd 2,97de 3,91B Nước dừa 4,44bcd 8,49a 5,73b 6,22A 50 TB 4,16AB 4,56A 3,60B * CV = 14,81% Ftính (A) = 5,57 * Ftính (B) = 99,30 Ftính (A x B) = 22,21 Khoai tây 3,42de 1,39f 2,20ef 2,34C Cà rốt 5,37bc 4,52cd 3,26de 4,38B Nước dừa 5,36bc 10,27a 7,02b 7,55A 60 TB 4,72AB 5,39A 4,16B CV = 15,71% Ftính (A) = 6,13 Ftính (B) = 111,20 Ftính (A x B) = 19,57 Ghi chú: Các giá trị không cùng mẫu tự theo sau có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (( ): rất có ý nghĩa; (*): có ý nghĩa; (ns): không có ý nghĩa) Giai đoạn 10 – 20 NSC, số chồi chưa hình thành do thời gian ngắn. Giai đoạn 30 NSC, ở yếu tố loại dịch chiết, nước dừa cho kết quả tốt nhất về số chồi (3,43 chồi), rất có ý nghĩa thống kê. Trong khi đó, nồng độ 20% nước dừa cho kết quả tốt nhất về số chồi (4,02 chồi) tuy không khác biệt so với nghiệm thức bổ sung 30% nước dừa (3,57 chồi) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. 42
  53. Đến giai đoạn 40 NSC, ở các loại dịch chiết, nước dừa cho kết quả tốt nhất về số chồi (4,97 chồi), rất có ý nghĩa thống kê. Bên cạnh đó, nồng độ 20% nước dừa cho kết quả tốt nhất về số chồi (5,99 chồi) rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Ở giai đoạn 50 NSC, số chồi tiếp tục gia tăng. Khi thay đổi nồng độ dịch chiết, nồng độ 20% cho kết quả tốt nhất về số chồi (4,56 chồi), có ý nghĩa thống kê. Ở yếu tố loại dịch chiết, nước dừa cho kết quả tốt nhất về số chồi (6,22 chồi), rất có ý nghĩa thống kê. Trong khi đó, nồng độ 20% nước dừa cho kết quả tốt nhất về số chồi (8,49 chồi) rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Kết quả phân tích thống kê ở giai đoạn 60 NSC, đối với nồng độ dịch chiết, nồng độ 20% cho kết quả tốt nhất về số chồi (5,39 chồi), rất có ý nghĩa thống kê. Trong khi đó, ở yếu tố loại dịch chiết, nước dừa cho kết quả tốt nhất về số chồi (7,55 chồi), rất có ý nghĩa thống kê. Bên cạnh đó, nồng độ 20% nước dừa cho kết quả tốt nhất về số chồi (10,27 chồi) rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Kết quả chiều cao khi bổ sung các dịch chiết vào môi trường nuôi cấy ở bảng 3.5b cho thấy: Giai đoạn 70 NSC, khi thay đổi nồng độ dịch chiết, nồng độ 20% cho kết quả tốt nhất về số chồi (6,52 chồi), rất có ý nghĩa thống kê. Bên cạnh đó, ở yếu tố loại dịch chiết, nước dừa cho kết quả tốt nhất về số chồi (8,69 chồi), rất có ý nghĩa thống kê. Trong khi đó, nồng độ 20% nước dừa cho kết quả tốt nhất về số chồi (12,18 chồi) rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Đến giai đoạn 80 NSC, ở yếu tố nồng độ dịch chiết, nồng độ 20% cho kết quả tốt nhất về số chồi (7,19 chồi), rất có ý nghĩa thống kê. Đối với yếu tố loại dịch chiết, nước dừa cho kết quả tốt nhất về số chồi (9,66 chồi), rất có ý nghĩa thống kê. Trong khi đó, nồng độ 20% nước dừa cho kết quả tốt nhất về số chồi (13,22 chồi) rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. 43
  54. Bảng 3.5b Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến số chồi giai đoạn 70 – 90 NSC (chồi) Nồng độ (%) NSC TB 10 20 30 Khoai tây 3,72c 1,40d 2,55cd 2,56C Cà rốt 6,33b 5,98b 3,56c 5,29B Nước dừa 6,44b 12,18a 7,45b 8,69A 70 TB 5,50B 6,52A 4,52B CV = 13,18% Ftính (A) = 17,10 Ftính (B) = 160,98 Ftính (A x B) = 28,46 Loại Khoai tây 4,20c 1,93d 2,73cd 2,95C chất Cà rốt 6,57b 6,41b 3,94cd 5,64B hữu Nước dừa 7,98b 13,22a 7,80b 9,66A 80 cơ TB 6,25A 7,19A 4,82B CV = 14,75% Ftính (A) = 15,80 Ftính (B) = 127,43 Ftính (A x B) = 16,23 Khoai tây 4,55c 2,14d 2,87cd 3,19C Cà rốt 7,04b 7,47b 4,03cd 6,18B Nước dừa 8,11b 14,06a 7,89b 10,02A 90 TB 6,57B 7,89A 4,93C CV = 13,08% Ftính (A) = 27,69 Ftính (B) = 147,66 Ftính (A x B) = 22,48 Ghi chú: Các giá trị không cùng mẫu tự theo sau có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (( ): rất có ý nghĩa; (ns): không có ý nghĩa) Qua phân tích kết quả thống kê ở giai đoạn 90 NSC, khi thay đổi yếu tố nồng độ dịch chiết, nồng độ 20% cho kết quả tốt nhất về số chồi (7,89 chồi), rất có ý nghĩa thống kê. Bên cạnh đó ở yếu tố loại dịch chiết, nước dừa cho kết quả tốt nhất về số chồi (10,02 chồi), rất có ý nghĩa thống kê. Trong khi đó, nồng độ 20% nước dừa cho kết quả tốt nhất về số chồi (14,06 chồi), rất có ý nghĩa thống kê so với các nồng độ còn lại. Với nồng độ thích hợp, việc bổ sung dịch chiết vào môi trường tạo điều kiện cho lan Cattleya sinh trưởng tốt hơn. Kết quả cho thấy, nồng độ 20% nước dừa cho số chồi cao nhất. 44
  55. Bảng 3.6 Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến đường kính (cm) và khối lượng (g) cụm chồi giai đoạn 90 NSC Nồng độ (%) NSC TB 10 20 30 Khoai tây 0,91 0,56 0,60 0,69B Cà rốt 1,08 0,98 0,75 0,94B Đường Nước dừa 1,31 1,56 1,13 1,34A kính Loại TB 1,10 1,03 0,82 (cm) chất ns CV = 24,02% Ftính (A) = 3,26 hữu ns Ftính (B) = 17,10 Ftính (A x B) = 1,35 cơ Khoai tây 0,23c 0,10c 0,10c 0,14C Cà rốt 0,44b 0,26c 0,17c 0,29B Khối Nước dừa 0,54b 0,77a 0,46b 0,59A lượng TB 0,40A 0,38A 0,24B (g) CV = 19,76% Ftính (A) = 14,31 Ftính (B) = 100,75 Ftính (A x B) = 9,41 Ghi chú: Các giá trị không cùng mẫu tự theo sau có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (( ): rất có ý nghĩa; (ns): không có ý nghĩa) Qua phân tích thống kê về đường kính và khối lượng cụm chồi được thể hiện ở bảng 3.6 cho thấy: Về đường kính: khi thay đổi loại dịch chiết, nước dừa cho đường kính lớn nhất (1,34 cm), rất có ý nghĩa thống kê so với các nồng độ còn lại. Về khối lượng: đối với yếu tố nồng độ dịch chiết, nồng độ 10% và 20% cho kết quả khối lượng tốt nhất (0,40 g và 0,38 g) rất có ý nghĩa thống kê. Bên cạnh đó, ở yếu tố loại dịch chiết, nước dừa cho kết quả khối lượng lớn nhất (0,59 g), rất có ý nghĩa thống kê. Trong khi đó, nồng độ nước dừa 20% cho khối lượng lớn nhất (0,77 g), rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Như vậy, nước dừa tác động mạnh mẽ đến đường kính cụm chồi lan Cattleya. Đồng thời, sự tương tác giữa nồng độ dịch chiết và loại dịch chiết đối với khối lượng cụm chồi là rất có ý nghĩa. Nồng độ nước dừa 20% cho kết quả khối lượng cụm chồi là tốt nhất. Qua thí nghiệm cho thấy, nồng độ nước dừa 20% thích hợp nhất đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya. 45
  56. 3.3 Ảnh hưởng của NAA lên sự tạo rễ của lan Cattleya Đối với cây con hoàn chỉnh, trước khi mang ra vườn ươm yêu cầu cây phải đủ thân, lá đòi hỏi phải cây phải có hệ rễ phát triển mạnh, đủ khả năng hút chất dinh dưỡng cho cây. Theo Nguyễn Văn Uyển (1989), auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào hình thành rễ. Trong thí nghiệm này, chất điều hòa sinh trưởng NAA được sử dụng ở các nồng độ khác nhau để bổ sung vào môi trường MS nhằm đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy kết hợp với nồng độ NAA thay đổi lên quá trình hình thành rễ lan Cattleya. Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự tạo rễ của Cattleya giai đoạn 20 – 80 NSC (rễ/cây) NAA Ngày sau cấy (mg/l) 20 30 40 50 60 70 80 0 0,00 0,00 0,00b 0,31c 0,92c 1,25c 1,62b 1 0,22 0,25 0,71a 1,09b 1,51b 1,67bc 2,02ab 2 0,08 0,08 0,22ab 0,63c 0,84c 1,37c 1,53b 3 0,05 0,08 0,78a 1,34ab 2,14a 2,38ab 2,95ab 4 0,10 0,17 0,64a 1,57a 2,26a 2,56ab 3,13a 5 0,22 0,37 0,68a 1,65a 2,23a 2,81a 3,27a CV 10,49% 14,20% 15,59% 14,43% 14,08% 18,85% 22,40% ns ns * Ftính 1,27 1,35 3,56 33,94 23,93 9,12 6,34 Ghi chú: Các giá trị không cùng mẫu tự theo sau có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (( ): rất có ý nghĩa; (*): có ý nghĩa; (ns): không có ý nghĩa) Ở giai đoạn 20 – 40 NSC, số liệu được chuyển đổi theo công thức (x+0,5)1/2 Ở bảng 3.7 cho thấy: Giai đoạn 10 NSC, rễ chưa hình thành do thời gian ngắn. Ở giai đoạn 20 – 30 NSC, rễ bắt đầu hình thành nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê, dao động từ 0 – 0,22 rễ/cây (20 NSC) và từ 0 – 0,37 rễ/cây (30 NSC). 46
  57. Đến giai đoạn 40 NSC, nồng độ 5 mg NAA trên lít cho số rễ cao nhất (0,68 rễ/cây), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nồng độ 0 mg NAA trên lít (0,00 rễ/cây) nhưng không có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Ở giai đoạn 50 NSC, nồng độ 5 mg NAA trên lít cho số rễ cao nhất (1,65 rễ/cây), tuy không khác biệt so với nồng độ 3 mg và 4 mg NAA trên lít (1,34 rễ/cây và 1,57 rễ/cây) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Đối với nghiệm thức không bổ sung NAA, hầu như rễ chậm hình thành và bắt đầu hình thành ở 50 NSC (0,31 rễ/cây). Giai đoạn 60 NSC, nồng độ 4 mg NAA trên lít cho số rễ cao nhất (2,26 rễ/cây tuy không khác biệt so với nồng độ 3 mg và 5 mg NAA trên lít (2,14 rễ/cây và 2,23 rễ/cây) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nồng độ còn lại. Đến giai đoạn 70 NSC, nồng độ 5 mg NAA trên lít cho số rễ cao nhất (2,81 rễ/cây), tuy không khác biệt so với nồng độ 3 mg và 4 mg NAA trên lít (2,38 rễ/cây và 2,56 rễ/cây) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nồng độ còn lại. Số rễ tiếp tục gia tăng số lượng. Ở giai đoạn 80 NSC, nồng độ 5 mg NAA trên lít cho số rễ cao nhất (3,27 rễ/cây), rất có ý nghĩa thống kê so với nồng độ 0 mg và 2 mg NAA trên lít (1,62 rễ/cây và 1,53 rễ/cây) nhưng không có ý nghĩa thống kê so với các nồng độ còn lại. Qua đó cho thấy, nồng độ 5 mg NAA trên lít thích hợp cho sự tạo rễ lan Cattleya nhất. Tốc độ ra rễ được trình bày trong bảng 3.8 cho thấy: Giai đoạn 10 – 40 NSC, tốc độ ra rễ tăng giảm không đều. Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Đến giai đoạn 30 – 40 NSC, tốc độ ra rễ dao động từ 0,00 – 0,70 rễ/cây/10 ngày. 47
  58. Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ ra rễ của Cattleya giai đoạn 10 – 80 NSC (rễ/cây/10 ngày) NAA Ngày sau cấy (mg/l) 10 – 20 20 – 30 30 – 40 40 – 50 50 – 60 60 – 70 70 – 80 0 0,00 0,00 0,00 0,31c 0,61ab 0,34ab 0,40a 1 0,22 0,03 0,46 0,39c 0,42bc 0,16b 0,38a 2 0,08 0,00 0,13 0,42bc 0,28c 0,53a 0,16b 3 0,05 0,03 0,70 0,56b 0,80a 0,24b 0,60a 4 0,10 0,07 0,47 0,87a 0,68ab 0,30ab 0,51a 5 0,22 0,15 0,32 0,96a 0,57ab 0,50a 0,45a CV 10,49% 6,89% 12,43% 10,67% 19,87% 26,83% 19,61% ns ns ns Ftính 1,27 1,34 4,48 56,92 8,51 7,26 9,92 Ghi chú: Các giá trị không cùng mẫu tự theo sau có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (( ): rất có ý nghĩa; (ns): không có ý nghĩa) Ở giai đoạn 10 – 20 NSC, 20 – 30 NSC và 30 – 40 NSC, số liệu được chuyển đổi theo công thức (x+0,5)1/2 Qua kết quả trắc nghiệm phân hạng ở giai đoạn 40 – 50 NSC, nồng độ 5 mg NAA trên lít cho kết quả tốc độ ra rễ cao nhất (0,96 rễ/cây/10 ngày), tuy không khác biệt nồng độ 4 mg NAA trên lít (0,87 rễ/cây/10 ngày) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa so với các nồng độ còn lại. Giai đoạn 50 – 60 NSC, nồng độ 3 mg NAA trên lít cho kết quả tốc độ ra rễ cao nhất (0,80 rễ/cây/10 ngày) rất có ý nghĩa so với nồng độ 1 mg và 2 mg NAA trên lít (0,42 rễ/cây/10 ngày và 0,28 rễ/cây/10 ngày) nhưng không khác biệt so với các nồng độ còn lại. Ở giai đoạn 60 – 70 NSC, nồng độ 2 mg NAA trên lít cho kết quả tốc độ ra rễ cao nhất (0,53 rễ/cây/10 ngày) rất có ý nghĩa so với nghiệm thức 1 mg và 3 mg NAA trên lít (0,16 rễ/cây/10 ngày và 0,24 rễ/cây/10 ngày) nhưng không khác biệt so với các nồng độ còn lại. Qua kết quả phân tích thống kê ở giai đoạn 70 – 80 NSC, nồng độ 3 mg NAA trên lít cho kết quả tốc độ ra rễ cao nhất (0,60 rễ/cây/10 ngày) rất có ý nghĩa so với nồng độ 2 mg NAA trên lít (0,16 rễ/cây/10 ngày) nhưng không khác biệt so với các nồng độ còn lại. 48
  59. Kết quả cho thấy, nồng độ 3 mg NAA tác động mạnh mẽ nhất đến tốc độ ra rễ của lan Cattleya. Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến chiều dài rễ của Cattleya giai đoạn 80 NSC (cm) NAA (mg/l) 0 1 2 3 4 5 Chiều dài rễ 1,67a 1,48ab 1,44ab 1,30bc 1,25bc 1,08c CV = 7,21% Ftính = 13,06 Ghi chú: Các giá trị không cùng mẫu tự theo sau có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (( ): rất có ý nghĩa) Chiều dài rễ dài nhất ở nồng độ 0 mg NAA trên lít (1,67 cm) tuy không khác biệt so với nghiệm thức bổ sung 1 mg và 2 mg NAA trên lít (1,48 cm và 1,44 cm) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nồng độ còn lại. Chiều dài rễ tuy dài nhất trong các nghiệm thức nhưng số lượng rễ tạo thành ở nghiệm thức lại ít nhất (1,62 rễ/cây). Hệ rễ chưa phát triển mạnh, không có khả năng hấp thu tốt các chất dinh dưỡng. Đối với mức nồng độ 5 mg/l cho chiều dài rễ ngắn nhất (1,08 cm) nhưng số lượng rễ đạt nhiều nhất (3,27 rễ/cây). Hệ rễ phát triển đầy đủ, có khả năng hấp thu tốt các chất dinh dưỡng. Qua đó cho thấy, nồng độ NAA tác động mạnh mẽ đến quá trình hình thành rễ lan Cattleya, khi càng tăng nồng độ thì chiều dài rễ lan Cattleya càng giảm nhưng số lượng rễ lại càng tăng, tạo nên hệ rễ phát triển đầy đủ. Đây là điều kiện thuận lợi cho cây sinh trưởng và phát triển khi đem cây ra ngoài vườn ươm sau này. Kết quả từ thí nghiệm cho thấy, nồng độ 5 mg NAA trên lít thích hợp nhất cho sự tạo rễ của lan Cattleya. 49
  60. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết quả nghiên cứu đạt được, có thể rút ra một số kết luận: Về tác động của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya Nồng độ (0,1 mg NAA + 4 mg BA)/lít cho số chồi cao nhất (19,03 chồi ở giai đoạn 90 NSC), rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Trong khi đó, nồng độ (0,3 mg NAA + 2 mg BA)/lít cho kết quả đường kính cao nhất (1,57 cm ở giai đoạn 90 NSC), rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Ngoài ra, sự kết hợp (0,3 mg NAA + 1 mg BA)/lít cho kết quả khối lượng cao nhất (1,51 g ở giai đoạn 90 NSC), rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Về ảnh hưởng của dịch chiết đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya Nồng độ nước dừa 20% cho kết quả tốt nhất về số chồi (14,06 chồi ở giai đoạn 90 NSC) rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Đồng thời, nồng độ nước dừa 20% cho khối lượng lớn nhất (0,77 g ở giai đoạn 90 NSC), rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Về ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ lan Cattleya Nồng độ 5 mg NAA trên lít cho số rễ cao nhất (3,27 rễ/cây ở giai đoạn 80 NSC). Trong khi đó, nồng độ 3 mg NAA trên lít cho kết quả tốt nhất về tốc độ ra rễ (0,60 rễ/cây/10 ngày ở giai đoạn 70 – 80 NSC). Mặt khác, chiều dài rễ dài nhất ở nồng độ 0 mg NAA trên lít (1,67 cm ở giai đoạn 80 NSC). 50
  61. Đề nghị Sử dụng môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường 30 g/l có bổ sung (0,1 mg NAA + 4 mg BA)/lít cho việc nhân chồi lan Cattleya. Sử dụng môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường 30 g/l có bổ sung nước dừa với nồng độ 20% cho quá trình sinh trưởng lan Cattleya. Sử dụng môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường 30 g/l có bổ sung 5 mg NAA trên lít cho sự tạo rễ lan Cattleya. Tiếp tục nghiên cứu tìm kiếm môi trường thích hợp hơn cho sự sinh trưởng và phát triển của lan Cattleya. Nghiên cứu các loại giá thể thích hợp như xơ dừa, dương xỉ, rễ lục bình cho cây để đem ra vườn ươm. 51
  62. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bích Diệp, 2014. Thành tựu nghiên cứu khoa học nổi bật của Viện Sinh học nhiệt đới. Truy cập từ ngày 05.10.2015. 2. Bùi Bá Bổng, 1995. Nhân giống cây bằng nuôi cấy mô. Sở khoa học công nghệ và môi trường An Giang, 86 trang. 3. Daneshwar Puchooa, 2004. Comparison of Different Culture Media for the In Vitro Culture of Dendrobium (Orchidaceae). International Journal of Agriculture and Biology, trang 884 – 888. 4. Dương Công Kiên, 2002. Nuôi cấy mô thực vật. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh, 199 trang. 5. Guilherme Corigliano, 2012. Cattleya labiata var. rubra. Truy cập từ ngày 01.10.2015. 6. H. Khatun, M. M. Khatun, M. S. Biswas, M. R. Kabir và M. Al-amin, 2010. In vitro growth and development of dendrobium hybrid orchid, trang 507 – 514. 7. Hà Thị Tuyết Phượng, 2005. Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống cây lan Cattleya (Cattleya sp). Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 8. Hoa Phạm, 2015. Lợi ích tuyệt vời của nước dừa. Truy cập từ ngày 28.09.2015. 9. Huỳnh Văn Thới, 1996. Cẩm nang nuôi trồng và kinh doanh phong lan. Nhà xuất bản trẻ 1996, 218 trang. 52
  63. 10. Kỹ thuật nhân giống lan căn bản và nâng cao, 2012. Truy cập từ ngày 01.10.2015. 11. Lê Văn Tri, 1997. Các chế phẩm điều hòa sinh trưởng tăng năng suất cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội, trang 84. 12. Lê Vân, 2015. Những lợi ích bất ngờ của nước ép cà rốt. Truy cập từ ngày 02.10.2015. 13. Lê Xuân Thám, n.d. Một số đóng góp của các nhà khoa học trong nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học tại Lâm Đồng. Truy cập từ ngày 04.10.2015. 14. Lưu Thị Vân Thư, 2006. Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật và phụ gia đến lan Cattleya nuôi cấy mô (in vitro). Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 15. Nguyễn Đức Lượng, 2006. Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia, 378 trang. 16. Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Văn Kết, Dương Tấn Nhật và Nguyễn Thị Kim Lý, 2013. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ lên quá trình sinh trưởng và phát triển cây lan hài hồng (paphiopedilum delenatii) in vitro. Tạp chí sinh học 2014, trang 250 – 256. 17. Nguyễn Thị Sơn, Từ Bích Thủy, Đặng Thị Nhàn, Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga và Nguyễn Quang Thạch, 2014. Nhân giống in vitro lan Dendrobium officinale kimura et migo (thạch hộc thiết bè). Tạp chí Khoa học và Phát triển 2014, trang 1274 – 1282. 18. Nguyễn Văn Uyển, 1989. Các chất sinh trưởng trong nông nghiệp. Nhà xuất bản Tp. Hồ Chí Minh, trang 50 – 60. 19. Nguyễn Văn Uyển, Đoàn Thị Ái Thuyền, Nguyễn Thị Quỳnh, Trần Văn Minh, Nguyễn Đức Minh Hùng, 1993. Nhân giống chuối bằng phương pháp cấy mô, 53
  64. Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội, 90 trang. 20. Những bức ảnh Đẹp Nhất Thế Giới về Lan Cattleya – The World’s Best Photos Of Cattleya, 2012. Truy cập từ ngày 08.10.2015. 21. Phạm Hữu Nguyên, 2007. Bài giảng Môn học cây rau. Trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh, 124 trang. 22. Ricardo Tadeu de Faria, Débora Cristina Santiago, Dennis Panayotes Saridakis, Ulisses Brigatto Albino và Ricardo Araújo, 2002. Preservation of the brazilian orchid Cattleya walkeriana Gardner using in vitro propagation. Crop Breeding and Applied Biotechnology, trang 489 – 492. 23. Rogério Mamoru Suzuki, Vanessa de Almeida, Rosete Pescador và Wagner de Melo Ferreira, 2010. Germinação e crescimento in vitro de Cattleya bicolor Lindley (Orchidaceae), trang 731 – 742. 24. Trần Văn Minh, 2005. Giáo trình công nghệ sinh học thực vật. Viện sinh học nhiệt đới, trang 1 – 172. 25. Trịnh Xuân Vũ, Lê Doãn Diên và Nguyễn Đình Huyên, 1976. Giáo trình sinh lý thực vật. Nhà xuất bản nông thôn, trang 287 – 292. 26. Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh, 2013. Nhân giống in vitro loài lan bản địa Dendrobium nobile lindl. Tạp chí Khoa học và Phát triển 2013, trang 917 - 925. 27. Vũ Văn Vụ, 1999. Sinh lý thực vật ứng dụng. Nhà xuất bản Giáo Dục, 148 trang. 28. Yaser Hassan Dewir và ctv, 2014. Micropropagation of Cattleya: Improved in vitro rooting and acclimatization. Research Report Tissue Culture/Biotechnology, trang 89 – 93. 54
  65. PHỤ LỤC Phụ lục 1 Hình ảnh thí nghiệm Hình 1.4 Mẫu cụm chồi lan Cattleya được sử dụng trong thí nghiệm NT2 NT1 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10 NT11 NT12 Hình 1.5 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 1 giai đoạn 90 NSC 55
  66. NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 Hình 1.6 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 2 giai đoạn 90 NSC NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 Hình 1.7 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 3 giai đoạn 80 NSC 56
  67. Hình 1.8 Cân trọng lượng cụm chồi tươi Hình 1.9 Đo đường kính cụm chồi 57
  68. Phụ lục 2 Kết quả xử lý thống kê 1. Thí nghiệm 1: khảo sát nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya a. Chiều cao chồi Kết quả chiều cao chồi 10 NSC The GLM Procedure Dependent Variable: CCC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 0.05147500 0.00467955 1.63 0.1524 Error 24 0.06880000 0.00286667 Corrected Total 35 0.12027500 R-Square Coeff Var Root MSE CCC Mean 0.427978 10.24713 0.053541 0.522500 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 2 0.01726667 0.00863333 3.01 0.0681 B 3 0.02009722 0.00669907 2.34 0.0990 A*B 6 0.01411111 0.00235185 0.82 0.5651 Kết quả chiều cao chồi 20 NSC The GLM Procedure Dependent Variable: CCC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 0.04080833 0.00370985 1.45 0.2135 Error 24 0.06126667 0.00255278 Corrected Total 35 0.10207500 R-Square Coeff Var Root MSE CCC Mean 0.399788 8.825331 0.050525 0.572500 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 2 0.01235000 0.00617500 2.42 0.1104 B 3 0.01723056 0.00574352 2.25 0.1084 A*B 6 0.01122778 0.00187130 0.73 0.6278 Kết quả chiều cao chồi 30 NSC The GLM Procedure Dependent Variable: CCC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 0.05702222 0.00518384 0.57 0.8339 58
  69. Error 24 0.21826667 0.00909444 Corrected Total 35 0.27528889 R-Square Coeff Var Root MSE CCC Mean 0.207136 13.91059 0.095365 0.685556 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 2 0.03575556 0.01787778 1.97 0.1620 B 3 0.00713333 0.00237778 0.26 0.8524 A*B 6 0.01413333 0.00235556 0.26 0.9506 Kết quả chiều cao chồi 40 NSC The GLM Procedure Dependent Variable: CCC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 0.09292222 0.00844747 0.60 0.8066 Error 24 0.33533333 0.01397222 Corrected Total 35 0.42825556 R-Square Coeff Var Root MSE CCC Mean 0.216978 14.48383 0.118204 0.816111 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 2 0.05323889 0.02661944 1.91 0.1706 B 3 0.00330000 0.00110000 0.08 0.9709 A*B 6 0.03638333 0.00606389 0.43 0.8488 Kết quả chiều cao chồi 50 NSC The GLM Procedure Dependent Variable: CCC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 0.08054167 0.00732197 0.44 0.9187 Error 24 0.39493333 0.01645556 Corrected Total 35 0.47547500 R-Square Coeff Var Root MSE CCC Mean 0.169392 14.37302 0.128279 0.892500 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 2 0.04481667 0.02240833 1.36 0.2753 B 3 0.00520833 0.00173611 0.11 0.9561 A*B 6 0.03051667 0.00508611 0.31 0.9260 59
  70. Kết quả chiều cao chồi 60 NSC The GLM Procedure Dependent Variable: CCC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 0.13163056 0.01196641 0.83 0.6102 Error 24 0.34453333 0.01435556 Corrected Total 35 0.47616389 R-Square Coeff Var Root MSE CCC Mean 0.276440 11.76897 0.119815 1.018056 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 2 0.02268889 0.01134444 0.79 0.4652 B 3 0.02516389 0.00838796 0.58 0.6311 A*B 6 0.08377778 0.01396296 0.97 0.4647 Kết quả chiều cao chồi 70 NSC The GLM Procedure Dependent Variable: CCC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 0.07696389 0.00699672 0.27 0.9869 Error 24 0.63033333 0.02626389 Corrected Total 35 0.70729722 R-Square Coeff Var Root MSE CCC Mean 0.108814 14.53103 0.162061 1.115278 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 2 0.00833889 0.00416944 0.16 0.8541 B 3 0.00603056 0.00201019 0.08 0.9721 A*B 6 0.06259444 0.01043241 0.40 0.8734 Kết quả chiều cao chồi 80 NSC The GLM Procedure Dependent Variable: CCC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 0.10885556 0.00989596 0.38 0.9522 Error 24 0.62800000 0.02616667 Corrected Total 35 0.73685556 R-Square Coeff Var Root MSE CCC Mean 60
  71. 0.147730 13.30151 0.161761 1.216111 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 2 0.00402222 0.00201111 0.08 0.9262 B 3 0.00938889 0.00312963 0.12 0.9477 A*B 6 0.09544444 0.01590741 0.61 0.7215 Kết quả chiều cao chồi 90 NSC The GLM Procedure Dependent Variable: CCC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 0.14149722 0.01286338 0.69 0.7344 Error 24 0.44700000 0.01862500 Corrected Total 35 0.58849722 R-Square Coeff Var Root MSE CCC Mean 0.240438 10.26330 0.136473 1.329722 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 2 0.02935556 0.01467778 0.79 0.4661 B 3 0.04167500 0.01389167 0.75 0.5353 A*B 6 0.07046667 0.01174444 0.63 0.7044 b. Số chồi Ở giai đoạn 10 – 20 NSC số chồi chưa được hình thành do thời gian ngắn. Kết quả số chồi 30 NSC The GLM Procedure Dependent Variable: SC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 7.07956667 0.64359697 3.74 0.0033 Error 24 4.12733333 0.17197222 Corrected Total 35 11.20690000 R-Square Coeff Var Root MSE SC Mean 0.631715 11.03402 0.414695 3.758333 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 2 1.12655000 0.56327500 3.28 0.0552 B 3 1.98010000 0.66003333 3.84 0.0224 A*B 6 3.97291667 0.66215278 3.85 0.0079 61
  72. + Trắc nghiệm phân hạng nồng độ BA The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for SC NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 0.171972 Number of Means 2 3 4 Critical Range .4035 .4238 .4368 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N B A 4.1378 9 4 B A 3.7644 9 3 B 3.5944 9 1 B 3.5367 9 2 + Trắc nghiệm phân hạng nồng độ NAA x nồng độ BA The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for SC NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 0.171972 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Critical Range 0.947 0.988 1.015 1.035 1.050 1.062 1.073 1.081 1.089 1.095 1.100 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N AB A 4.3333 3 2 3 A 4.2867 3 1 4 B A 4.1667 3 3 2 B A 4.1667 3 3 4 B A C 4.0000 3 3 3 B A C 3.9600 3 2 4 B A C 3.6567 3 1 1 B A C 3.6533 3 2 1 B A C 3.4733 3 3 1 62
  73. B A C 3.2500 3 2 2 B C 3.1933 3 1 2 C 2.9600 3 1 3 Kết quả số chồi 40 NSC The GLM Procedure Dependent Variable: SC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 42.9534222 3.9048566 1.40 0.2364 Error 24 67.0116667 2.7921528 Corrected Total 35 109.9650889 R-Square Coeff Var Root MSE SC Mean 0.390610 27.19487 1.670974 6.144444 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 2 17.35933889 8.67966944 3.11 0.0630 B 3 16.50135556 5.50045185 1.97 0.1454 A*B 6 9.09272778 1.51545463 0.54 0.7705 Kết quả số chồi 50 NSC The GLM Procedure Dependent Variable: SC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 53.7733222 4.8884838 1.21 0.3349 Error 24 97.2822667 4.0534278 Corrected Total 35 151.0555889 R-Square Coeff Var Root MSE SC Mean 0.355984 28.27907 2.013313 7.119444 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 2 24.87253889 12.43626944 3.07 0.0651 B 3 15.82547778 5.27515926 1.30 0.2969 A*B 6 13.07530556 2.17921759 0.54 0.7743 Kết quả số chồi 60 NSC The GLM Procedure Dependent Variable: SC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 91.8270333 8.3479121 1.41 0.2333 63
  74. Error 24 142.5322667 5.9388444 Corrected Total 35 234.3593000 R-Square Coeff Var Root MSE SC Mean 0.391822 29.60487 2.436974 8.231667 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 2 48.64986667 24.32493333 4.10 0.0295 B 3 19.30714444 6.43571481 1.08 0.3749 A*B 6 23.87002222 3.97833704 0.67 0.6748 +Trắc nghiệm phân hạng yếu tố nồng độ NAA The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for SC NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 5.938844 Number of Means 2 3 Critical Range 2.053 2.157 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N A A 9.6350 12 3 B A 8.2717 12 1 B 6.7883 12 2 Kết quả số chồi 70 NSC The GLM Procedure Dependent Variable: SC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 108.0784889 9.8253172 6.97 F A 2 8.11055556 4.05527778 2.88 0.0758 B 3 40.70613333 13.56871111 9.63 0.0002 A*B 6 59.26180000 9.87696667 7.01 0.0002 64
  75. + Trắc nghiệm phân hạng yếu tố nồng độ BA The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for SC NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 1.40925 Number of Means 2 3 4 Critical Range 1.565 1.633 1.677 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N B A 11.2733 9 4 A 11.0067 9 3 B 9.3000 9 1 B 8.8022 9 2 + Trắc nghiệm phân hạng nồng độ NAA x nồng độ BA The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for SC NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 1.40925 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Critical Range 2.711 2.828 2.905 2.962 3.006 3.041 3.070 3.095 3.116 3.134 3.150 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N AB A 13.9700 3 1 4 B A 11.8867 3 3 3 B A 11.5333 3 2 3 B C 10.7667 3 3 4 B C 10.6933 3 3 1 B C D 9.6633 3 1 1 B C D 9.6333 3 2 2 B C D 9.6000 3 1 3 B C D 9.0833 3 2 4 65
  76. B C D 9.0600 3 1 2 C D 7.7133 3 3 2 D 7.5433 3 2 1 Kết quả số chồi 80 NSC The GLM Procedure Dependent Variable: SC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 188.2659417 17.1150856 13.28 F A 2 20.7204167 10.3602083 8.04 0.0021 B 3 59.7118306 19.9039435 15.44 <.0001 A*B 6 107.8336944 17.9722824 13.94 <.0001 + Trắc nghiệm phân hạng yếu tố nồng độ NAA The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for SC NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 1.289139 Number of Means 2 3 Critical Range 1.297 1.352 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N A A 13.0258 12 3 A 12.6800 12 1 B 11.2717 12 2 + Trắc nghiệm phân hạng yếu tố nồng độ NAA The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for SC NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. 66
  77. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 1.289139 Number of Means 2 3 4 Critical Range 1.497 1.561 1.604 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N B A 13.8333 9 4 A 13.2744 9 3 B 11.5700 9 1 B 10.6256 9 2 + Trắc nghiệm phân hạng nồng độ NAA x nồng độ BA The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for SC NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 1.289139 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Critical Range 2.593 2.704 2.779 2.833 2.875 2.909 2.937 2.960 2.980 2.998 3.013 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N AB A 17.2833 3 1 4 B A 15.2433 3 2 3 B C 14.0467 3 3 3 B C 13.8333 3 3 4 B C D 13.0000 3 3 1 E C D 12.0667 3 1 1 E C D 11.2233 3 3 2 E D 10.8367 3 1 2 E D 10.5333 3 1 3 E D 10.3833 3 2 4 E 9.8167 3 2 2 E 9.6433 3 2 1 67
  78. Kết quả số chồi 90 NSC The GLM Procedure Dependent Variable: SC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 292.9652889 26.6332081 34.58 F A 2 43.5607722 21.7803861 28.28 <.0001 B 3 45.1761111 15.0587037 19.55 <.0001 A*B 6 204.2284056 34.0380676 44.20 <.0001 + Trắc nghiệm phân hạng yếu tố nồng độ NAA The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for SC NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 0.770094 Number of Means 2 3 Critical Range 1.002 1.045 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N A A 14.3775 12 3 A 13.6358 12 1 B 11.7633 12 2 + Trắc nghiệm phân hạng yếu tố nồng độ BA The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for SC NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 0.770094 Number of Means 2 3 4 Critical Range 1.157 1.207 1.240 68