Đồ án Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (Stachys affinis)

88 trang thiennha21 13/04/2022 4000

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (Stachys affinis)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_xay_dung_quy_trinh_nhan_giong_in_vitro_cay_sung_thao_s.pdf

Nội dung text: Đồ án Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (Stachys affinis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY SÙNG THẢO (STACHYS AFFINIS) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Hoàng Quân Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Thanh Hằng MSSV: 1311100026 Lớp: 13DSH01 TP. Hồ Chí Minh, năm 2017
Đồ án tốt nghiêp̣ LỜ I CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nôị dung trong đồ án tốt nghiêp̣ là công trình nghiên cứ u thưc̣ sư ̣ của tôi dưới sư ̣ hướng dẫn của ThS. Nguyễn Hoàng Quân – cán bộ kỹ thuật tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM. Đề tài đươc̣ tiến hành nghiên cứ u thưc̣ nghiêṃ taị phòng Thực nghiêṃ Cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh Hoc̣ Tp. HCM. Các số liêụ và kết quả có trong nghiên cứ u là hoàn toàn trung thưc.Tôị xin hoàn toàn chiụ trách nhiêṃ về lời cam đoan này. Tp. HCM, ngà y 20 thá ng 07 năm 2017 Sinh viên thưc̣ hiêṇ Nguyễn Thị Thanh Hằng
Đồ án tốt nghiêp̣ LỜ I CẢM ƠN Qua thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại Trung tâm, em xin gửi lời cám ơn đến Trung Tâm Công nghệ Sinh Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và hỗ trợ trang thiết bị giúp em hoàn thành đề tài. Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là gửi lời cám ơn đến tất cả các thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Môi trường – Thực phẩm đã tạo điều kiện tốt nhất cũng như dạy bảo và truyền đạt nhiều kiến thức bổ ích giúp em hoàn thành khóa học cùa mình. Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến TS. Hà Thị Loan – Phó Giám đốc Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. HCM và ThS. Nguyễn Hoàng Quân đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo kiến thức cho em trong suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp. Em xin cảm ơn toàn thể anh chị đang làm việc tại Trung tâm và các bạn sinh viên cùng làm đề tài tại Trung tâm đã giúp đỡ em trong suốt quá trình làm đề tài. Con xin cám ơn ba mẹ đã có công sinh thành và nuôi dưỡng con khôn lớn. Cám ơn anh chị em và người thân trong gia đình cùng bạn bè đã luôn ở bên cạnh giúp đỡ và luôn cổ vũ tinh thần cho em. Em xin chân thành cảm ơn. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 7 năm 2017 Sinh viện thực hiện Nguyễn Thị Thanh Hằng
Đồ án tốt nghiêp̣ MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC BIỂU ĐỒ iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Ý nghĩa của đề tài 1 3. Đối tương̣ và phaṃ vi nghiên cứ u 2 4. Mục đích nghiên cứu 2 5. Nội dung nghiên cứu 2 6. Phương pháp nghiên cứu 3 7. Kết quả đạt được 3 8. Bố cục đồ án 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Sơ lược về nuôi cấy mô và tế bào thực vật 4 1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật 4 1.1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 5 1.1.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro 8 1.1.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật 9 1.2. Giới thiệu về chi Stachys 17 1.3. Giới thiệu về cây sùng thảo (Stachys affinis) 19 1.3.1. Phân loại 19
Đồ án tốt nghiêp̣ 1.3.2. Đặc điểm sinh học và công dụng 19 1.3.4. Thành phần hóa học 21 1.3.5. Giá trị dinh dưỡng 22 1.4. Một số nghiên cứu về chi Stachys 23 1.4.1. Kháng viêm và giảm đau 24 1.4.2. Chống oxy hóa 24 1.4.3. Chống lo âu 25 1.4.4. Kháng khuẩn 26 1.5. Các nghiên cứu nhân giống in vitro chi Stachys 27 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29 2.2. Vật liệu và phương pháp 29 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu 29 2.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất 29 2.2.3. Môi trường nghiên cứu 30 2.2.4. Điều kiện phòng nuôi cấy 30 2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu 30 2.3. Nội dung nghiên cứu 30 2.4. Phương pháp nghiên cứu 31 2.4.1. Pha môi trường nuôi cấy 31 2.4.2. Các thao tác trong phòng cấy 32 2.4.3. Bố trí thí nghiệm 32
Đồ án tốt nghiêp̣ 2.4.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo. 32 2.4.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo 33 2.4.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của gía thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo ngoài vườn ươm 35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo. 37 3.2. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo 42 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm 47 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 4.1. Kết luận 52 4.2. Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 1. Tài liệu Tiếng Việt 53 2. Tài liệu Tiếng Anh 53 PHỤ LỤC 1 Phu ̣luc̣ A: Thành phần môi trường MS 1 Phụ lục B: Quy trình nhân giống cây sùng thảo (Stachys affinis) 2 Phụ lục C: Bảng số liệu được xử lí thống kệ bằng phần mềm SAS 9.4 3
Đồ án tốt nghiêp̣ DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây sùng thảo 19 Hình 1.2. Củ sùng thảo 20 Hình 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy 39 Hình 3.2. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy. 46 Hình 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm sau 4 tuần trồng 51 i
Đồ án tốt nghiêp̣ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian sử dụng của một số chất khử trùng 10 Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi 33 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ 34 Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm 35 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy. 38 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy. 43 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm sau 4 tuần trồng 48 ii
Đồ án tốt nghiêp̣ DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến tỷ lệ tạo mẫu tạo chồi sau 4 tuần nuôi cấy 39 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy 39 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy 44 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm sau 4 tuần trồng 48 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm sau 4 tuần trồng 49 iii
Đồ án tốt nghiêp̣ DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T Trichlorophenoxyacetic acid ABA Abscisic acid BA Benzyl Adenine CNSH Công Nghệ Sinh Học ĐC Đối chứng GA Gibberellin IAA 3-Indole acetic acid IBA 3-Indole butyric acid MS Murashige – Skoog NAA Napthalene Acetic Acid PhG Phenylpropanoid Glycosides TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh iv
Đồ án tốt nghiêp̣ MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam có một tiềm năng lớn về tài nguyên cây dược liệu, trong số hơn 12.000 loài thực vật tại Việt Nam thì có gần 4.000 loài có công dụng làm thuốc với vùng phân bố rộng khắp cả nước, có nhiều loài dược liệu được xếp vào loài quý hiếm trên thế giới như: Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang, Bách hợp, Thông đỏ, Vàng đắng, Hoàng liên ô rô, Hoàng liên gai, Thanh thiên quỳ, Ba gạc Vĩnh Phú, Theo kết quả điều tra và đánh giá tại một số vùng, trồng cây dược liệu đem lại giá trị kinh tế to lớn hơn bất kỳ loại cây lương thực, thực phẩm nào (có thể thu nhập trên 100 triệu đồng/ha). Tuy nhiên theo báo cáo tháng 9/2016 của Cục Quản lý Y, Dược cổ truyền (Bộ Y tế) cho biết hàng năm, ngành dược Việt Nam sử dụng khoảng 60.000 tấn dược liệu các loại, nhưng Việt Nam mới chỉ tự cung cấp được khoảng 20% nguyên liệu để phục vụ việc sản xuất thuốc trong nước, còn khoảng 80 - 85% vẫn phải nhập khẩu từ nước ngoài (chủ yếu nhập từ Trung Quốc) và mới chỉ có 1.400 tấn dược liệu nhập khẩu có nguồn gốc rõ ràng, rất ít so với nhu cầu sử dụng dược liệu hiện nay. Cây sùng thảo là một loại cây đã được trồng làm thực phẩm ở nhiều nơi trên thế giới như Trung Quốc, Nhật Bản, Pháp . Củ sùng thảo giàu dinh dưỡng và chứa nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe. Các bộ phận của cây và các chiết xuất từ cây sùng thảo đã được sử dụng như một phương thuốc cổ truyền điều trị nhiễm trùng, cảm lạnh, bệnh tim, bệnh lao và viêm phổi ở Trung Quốc. Các nghiên cứu về các loài cùng chi và nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của Stachys affinnis đã chứng minh chúng chứa nhiều hoạt chất thứ cấp có nhiều công dụng như kháng viêm, chống oxy hóa, ngừa loãng xương, điều trị ung thư, bệnh tiểu đường, . Nắm bắt những cơ sở khoa học thực tiễn và nhu cầu của thị trường, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thực hiện đề tài: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (Stachys affinnis). 2. Ý nghĩa của đề tài 1
Đồ án tốt nghiêp̣ • Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên củng cố lại kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học. - Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học nhằm bổ sung thông tin về cây sùng thảo, kỹ thuật nhân giống in vitro cây sùng thảo. - Kết quả nghiên cứu có thể là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo của cùng đối tượng hoặc một số giống cây có giá trị khác. - Biết được phương pháp nghiên cứu một số vấn đề khoa học, xử lý và phân tích số liệu, biết cách trình bài một bài báo khoa học. • Ý nghĩa thực tiễn - Xây dựng quy trình nhân giống cây sùng thảo, tạo ra cây giống có chất lượng cao đáp ứng nhu cầu sản xuất tại Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM. 3. Đối tương̣ và phaṃ vi nghiên cứ u Đối tương̣ nghiên cứ u đươc̣ sử dung̣ trong đề tài này là cây sùng thảo vitro đươc̣ cung cấp từ phòng nuôi cấy mô taị phòng Thực nghiêṃ cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. HCM. Phaṃ vi nghiên cứ u trong đề tài này là tâp̣ trung khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA, IBA lên quá trình nhân chồi, tạo rễ của cây sùng thảo và khảo sát ảnh hưởng của các loại giá thể: mụn xơ dừa, tro trấu, đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo. 4. Mục đích nghiên cứu - Đánh giá sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng nhân chồi và tạo rễ nhằm thiết lập môi trường thích hợp để nhân nhanh cây sùng thảo trong vi nhân giống in vitro. - Đánh giá sự ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo ở giai đoạn vườn ươm. 5. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo. 2
Đồ án tốt nghiêp̣ - Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo. - Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm. 6. Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiêṃ đươc̣ bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Mỗi thí nghiêṃ gồm 3 – 5 nghiêṃ thứ c, các nghiêṃ thứ c thí nghiêṃ đươc̣ lăp̣ laị ba lần. Các số liêụ thu thâp̣ đươc̣ xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.4 và chương trình MicroSoft Excel 2016®. 7. Kết quả đạt được - Xác định được nồng độ BA thích hợp kết hợp với NAA cho quá trình nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo. - Xác định được nồng độ IBA thích hợp cho quá trình tạo rễ cây sùng thảo. - Xác định được loại giá thể thích hợp để trồng cây sùng thảo khi trồng cây con in vitro ngoài vườn ươm. 8. Bố cục đồ án Kết cấu của đồ án gồm 4 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 3
Đồ án tốt nghiêp̣ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược về nuôi cấy mô và tế bào thực vật 1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật Nuôi cấy mô và tế bào đã trả qua một lịch sử phát triển lâu dài và được đánh dấu bằng những sự kiện chính sau: Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào. Năm 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào. Năm 1883, Wilhelm Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm nhiễm ở cơ quan sinh dục. Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng không thành công. Năm 1904, Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ Cải Crucifers. Năm 1922, Knudson và Bot. Gaz. Cho hạt phong lan nảy mầm in vitro. Năm 1924, Blumenthal và cộng sự tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy hình thành callus tử rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic. Năm 1925, Knudson L, Bot. Gaz làm hạt phong lan nảy mầm in vitro. Năm 1929, Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hoà hợp khi lai ở Linum spp. Năm 1934, Kogl và cộng sự lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một phytohormone thực vật đầu tiên thuộc có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Năm 1936, LaRue và Bull đã nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau. Năm 1939, Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá. 4
Đồ án tốt nghiêp̣ Năm 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở cà rốt. Năm 1942, Gautheret lần đầu theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ cấp trong nuôi cấy mô sẹo thực vật. Năm 1944, Skoog lần đầu tiên nghiên cứu sự hình thành chồi phụ từ nuôi cấy mô thuốc lá in vitro. Năm 1950, Morel lần đầu tiên nuôi cấy thành công cây một lá mầm bằng nước dừa. Năm 1951, Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh cơ quan. Năm 1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công. Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin - một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy. Năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi). Năm 1962, Murashige và Skoog phát minh ra môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật – môi trường MS. Năm 1964 – 1998, hàng loạt các công trình thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật như cải tiến môi trường và phương pháp nuôi cấy, chuyển gen để lai tạo giống mới, thương mại hóa sản phẩm nuôi cây mô (Dương Tấn Nhựt, 2011). 1.1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Theo Dương Công Kiên (2003), có một số phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật như: 1.1.2.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Phương pháp thuận lợi có thể đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh bên). 5
Đồ án tốt nghiêp̣ Sau khi vô trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy nhất định phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Sau đó chồi tiếp tục vươn dài hình thành thân, lá, ra rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh. Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức nhân giống thông thường khác. 1.1.2.2. Nuôi cấy mô sẹo Trong điều kiện môi trường nuôi cấy có chứa nhiều auxin, mô sẹo được hình thành. Mô sẹo là một khối tế bào phát triển không có định hướng, thường có màu trắng. Trong môi trường phù hợp, mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với những loài thực vật không có khả năng nhân giống đỉnh sinh trưởng, hoặc với các loại mẫu nuôi cấy không thể trực tiếp hình thành chồi. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ và từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma rất cao trong quá trình nuôi cấy để tạo mô sẹo. 1.1.2.3. Nuôi cấy tế bào đơn Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt tên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp. Khối mô sẹo dưới tác dụng của cơ học và các hóa chất hỗ trợ tách ra nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối. Hệ thống nuôi cấy tế bào đơn giống như hệ thống nuôi cấy vi sinh. Với các cơ chất phù hợp được bổ sung môi trường, tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học (alkloid, steoid, ). Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch, tế bào đơn được phát triển thành từng cụm tế bào mô sẹo khi môi trường có auxin hoặc có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên môi trường có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp. Sử dụng các tế bào đơn để xử lý đột biến bằng tia phóng xạ, hóa chất, có ý nghĩa lớn trong chọn tạo giống cây trồng. 6
Đồ án tốt nghiêp̣ 1.1.2.4. Nuôi cấy tế bào trần Tế bào trần thực chất là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có. Tế bào trần có thể tách trực tiếp từ các bộ phận của thực vật (lá, rễ) bằng cơ học (nghiền mẫu và enzyme) trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, tế bào trần có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn năng di truyền). Khi mất thành tế bào, hai tế bào trần có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện cây trồng. quá trình dung hợp tế bào trần có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hoặc khác loài (khoai tây, cà chua). Ở trạng thái không có màng tế bào bao bọc, tế bào trần dễ dàng hấp thu các AND ngoại lai mang các đặc điểm di truyền khác nhau: cải thiện đặc tính kháng bệnh, năng suất và chất lượng cây trồng. Hiện nay kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào trần đang được nghiên cứu và hoàn thiện . 1.1.2.5. Nuôi cấy hạt phấn Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Bao phấn chứa các bào tử hoặc hạt phấn chưa chín nuôi trong môi trường dinh dưỡng xác định nhằm mục đích tạo cây đơn bội. Sau đó dùng colchicin lưỡng bội hóa tạo thành cây lưỡng bội. Nuôi cấy bao phấn được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc tạo ra các dòng, giống thuần ở các cây tự thụ phấn vì đã rút ngắn được thời gian tạo ra giống mới. Nuôi cấy bao phấn tạo giống mới được ứng dụng thành công ở một số loài cây như: lúa mì, lúa nước, thuốc lá, ngô, 1.1.2.6. Nuôi cấy protoplast Nagata và Takebe (1930) đã thành công trong việc làm cho các protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một huyền phù tế bào trong môi trường lỏng. Những năm gần đây kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần đang mở ra nhiều triển vọng trong nghiên cứu di truyền soma, cải tạo, phục tráng và tạo giống cây mới ở thực vật bậc cao nói chung. Phương pháp này được ứng dụng thành công trên nhiều đối tượng khác nhau. Năm 1971, Takebe đã nhận được cây Thuốc lá nhị bội từ tế bào trần, sau đó Ohiama và Nitch nhận được cây thuốc lá đơn bội từ tế bào trần đơn bội. 7
Đồ án tốt nghiêp̣ Đến nay, kỹ thuật nuôi cấy và tái sinh protoplast đã hoàn thiện đối với cây hai lá mầm cũng như nhiều loại cây một lá mầm và trở thành một trong những công cụ quan trọng trong nghiên cứu di truyền nói chung và di truyền tế bào chất nói riêng cũng như trong công tác giống cây trồng . 1.1.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro Cho tới nay việc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro đã được áp dụng cho nhiều loại cây trồng (trên 400 loài). Giáo sư Murashige (1974) đã chia quy trình nhân giống in vitro làm ba giai đoạn và một giai đoạn tiếp sau in vitro: 1.1.3.1. Tạo vật liệu nuôi cấy khởi đầu in vitro Giai đoạn này là bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy. Các mẫu đã được khử trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để tạo ra các chồi mới. Giảm tỷ lệ mẫu nhiễm bệnh, tăng khả năng tái sinh có vai trò quan trọng ở giai đoạn này. Theo Yildiz (2012), mô lấy từ cây non có khả năng tái sinh cao hơn từ cây trưởng thành. Giai đoạn này thường kéo dài từ 4 – 6 tuần. 1.1.3.2. Nhân nhanh chồi, cụm chồi in vitro Là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhằm tạo ra hệ số nhân cao nhất. Ở giai đoạn này các chồi được kích thích phát sinh thành nhiều chồi, mầm nhằm cung cấp cho các lần cấy chuyển tiếp theo. Hệ số nhân phụ thuộc nhiều vào vai trò của các loại phytohoocmon (thường là cytokynin). 1.1.3.3. Tạo cây hoàn chỉnh, huấn luyện cây con Tạo cây hoàn chỉnh: Các chồi in vitro đủ tiêu chuẩn được chuyển sang môi trường tạo rễ để tạo ra cây giống in vitro hoàn chỉnh với đầy đủ thân, lá, rễ. Trong giai đoạn này, nồng độ cytokynin được giảm xuống và tăng nồng đô auxin nhằm kích thích sự hình thành rễ. Huấn luyện cây con: Là giai đoạn chuấn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô trùng khi đã đạt kích thước nhất định. 1.1.3.4. Chuyển cây ra trồng ngoài điều kiện tự nhiên Đây là giai đoạn chuyển cây in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng và thích nghi với điều kiện tự nhiên (Hazarika, 2003). Sự biến 8
Đồ án tốt nghiêp̣ động của các yếu tố như: thời tiết, đất đai, sâu bệnh, gây nhiều khó khăn trong việc đưa cây in vitro ra trồng ngoài tự nhiên. Như vậy, cả bốn giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro đều có vai trò quyết định đến khả năng ứng dụng thành công các quy trình nhân giống in vitro vào thực tiễn. Tuy nhiên, đối với cây hoa chuông do toàn thân được phủ một lớp lông tơ dày, thân lá chứa nhiều nước nên giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu gặp nhiều khó khăn (số lượng mẫu nhiễm và chết rất cao). Vì vậy, để tăng hiệu quả của giai đoạn này cần lựa chọn được hóa chất khử trùng, thời gian khử trùng và cơ quan sinh dưỡng đưa vào nuôi cấy. 1.1.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật 1.1.4.1. Sự lựa chọn mẫu cấy Theo Mantell và cộng sự (1985) mẫu cấy thích hợp nhất cho nuôi cấy mô phải có mô phân sinh hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn năng. Mô non như đỉnh chồi nách, chồi ngọn hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn mô già của cùng một cây (Nguyễn Quang Thạch, 2001). Thời vụ và giai đoạn sinh trưởng của cây mẹ có ảnh hưởng hoàn toàn khác nhau tới khả năng tái sinh, phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Mamaril và Lopez, 1997). 1.1.4.2. Khử trùng mô thực vật Các mô cấy hầu hết là các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, lá, rễ, thân, củ, tùy theo sự tiếp xúc của môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa ít hay nhiều vi khuẩn và nấm. Để chuyển mô thực vật từ môi trường tự nhiên vào môi trường nuôi cấy in vitro, các mô thực vật phải trải qua giai đoạn khử trùng để loại bỏ hết các nguồn tạp nhiễm (Bhojwani và Razdan, 1996) Khử trùng mẫu cấy là một việc làm khó vì mẫu sống không thể khử trùng bằng nhiệt độ cao mà phải giữ được bản chất sinh học của nó. Do đó mẫu cấy thực vật phải được khử trùng bằng dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường dùng là hypochlorite calcium, hypochlorite sodium, oxy già, Các mẫu cấy sau khi chọn phải rửa phải ngâm rửa mẫu bằng xà phòng dưới dòng chảy rồi mới cho vào ngâm trong dung dịch khử trùng. Hiệu quả xử lý các chất phụ thuộc vào thời gian, nồng độ 9
Đồ án tốt nghiêp̣ và khả năng xâm nhập vào các khe của tế bào và khả năng đẩy hết bọt khí trên bề mặt các mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng hoạt động của các chất khử trùng trước tiên người ta thường ngâm tế bào mô thực vật trong cồn 70o trong 30 giây, sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn. Việc xử lý thành công nguồn gây nhiễm phần lớn phụ thuộc vào kỹ thuật xử lý trong nuôi cấy vô trùng. Các nguồn gây nhiễm phần lớn là bụi tóc, tay, quần áo vì vậy trong khi cấy phải rửa tay bằng xà phòng, lau cồn 70o tới khuỷa tay, Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian sử dụng của một số chất khử trùng Chất khử trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả Hypochorite calcium 9 – 10 5 – 30 Rất tốt Hypochorite sodium 0,5 - 5 5 – 50 Rất tốt Hydro peroxide 10 – 12 5 – 15 Tốt Nước bromie 1 – 2 2 – 10 Rất tốt HgCl2 0,1 – 1 2 – 10 Trung bình Chất kháng sinh 4 – 50 mg/l 30 – 60 Khá tốt 1.1.4.3. Carbon và nguồn năng lượng Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, vì vậy cần phải bổ sung nguồn carbon vào môi trường nuôi cấy để cung cấp năng lượng (Nguyễn Quang Thạch, 2001). Hai loại đường thường được sử dụng là sucrose và glucose nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn. Nồng độ sucrose thay đổi từ 2 – 3 % hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống, tuổi mẫu cấy, giai đoạn sinh trưởng và yêu cầu thí nghiệm (Laneri; Franconi; Altavista, 1990). 10
Đồ án tốt nghiêp̣ 1.1.4.4. Các khoáng đa lượng Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng gồm N, P, K, S, Ca và Mg được bổ sung vào môi trường nhằm cung cấp chất khoáng để cấu tạo tế bào, mô thực vật được sử dung với nồng độ trên 30 ppm (Torres, 1989). - Nguồn Nitơ (N): mô tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng các dạng nitơ khoáng như amon và nitrat, đồng thời có thể sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như amino acid. Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc NH4NO3. Amonium được cung cấp dưới dạng (NH4)2SO4 hoặc NH4NO3. Trong một số ít trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urea. Tổng nồng độ của NO3+ và NH4+ trong môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy và mục đích nghiên cứu. - Nguồn Phospho (P): Phospho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật. Nó tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, nucleic acid và tham gia cấu trúc màng. Hai dạng P thường được dùng nhất là Na2H2PO4.7H2O và KH2PO4 (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2011). - Nguồn Kali (K): K giúp tăng khả năng thẩm thấu qua màng tế bào, điều chỉnh pH và lương̣ nướ c ở khí khổng, hoaṭ hoá enzyme, có liên quan đến quang hơp̣ và tổng hơp̣ hydrate carbon, giúp vâṇ chuyển hydrate carbon, tổng hơp̣ protein, cải thiêṇ khả năng sử dung̣ ánh sáng khi găp̣ điều kiêṇ bất lơi.̣ K thường được cung cấp cho môi trường nuôi cấy ở dạng kali nitrat (KNO3), kali clorua (KCl2), kali phosphat( KH2PO4) (Dương Công Kiên, 2003). - Nguồn Canxi (Ca): Canxi có thể liên kết các phân tử sinh học lại với nhau do đó nó góp phần vào trong cấu trúc và hoạt động sinh lí của màng tế bào và ở phiến giữa của thành tế bào (Trần Văn Minh, 1997). Sự hoạt động của nhiều enzyme của thực vật cũng phụ thuộc vào Ca2+ vì canxi là đồng yếu tố với những enzyme phân giải ATP. Trong nuôi cấy tế bào, Ca2+ có vai trò trong sự phát sinh hình thái đồng thời với sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng đặc biệt là auxin và cytokinin. Ca2+ là thành phần quan trọng của thành tế bào và màng tế bào. Số lượng lớn Ca2+ 11
Đồ án tốt nghiêp̣ gắn trên thành tế bào đóng vai trò chủ yếu trong củng cố độ vững chắc cho thành tế bào và điều hoà cấu trúc màng tế bào.Canxi được cung cấp dưới dạng muối canxi nitrat Ca(NO3)2. 4H2O, canxi clorua CaCl2. 6H2O (Dương Tấn Nhựt, 2009). - Nguồn Magie (Mg): Magie là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tổng hợp diệp lục tố và nó cũng tham gia vào cấu trúc của một số enzyme vận chuyển phosphate. Ion Mg+ là một ion linh động, có thể khuyếch tán vào trong tế bào như K+ vì vậy có vai trò như một cation trung hòa các cation và các acid hữu cơ. Magie được cung cấp dưới dạng magie sulphat MgSO4.7H2O (Dương Tấn Nhựt, 2011). 1.1.4.5. Các khoáng vi lượng Các nguyên tố vô cơ cần một lượng nhỏ nhưng không thể thiếu cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật còn được gọi là các nguyên tố vi lượng. Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp là: Fe,Zn, B, Mn, Cu, I, Mo, Ni, (Torres, 1989). 1.1.4.6. Vitamin Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng (White, 1943). Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol. Thiamin là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào. Thiamin thường được sử dụng với nồng độ biến thiên từ 0,1 – 10 mg/l. Acid nicotinic thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ 0,1 – 5 mg/l, pyridoxine được sử dụng với nồng độ 0,1 – 10 mg/l. Myo-inositol có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp tế bào, thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật ở nồng độ cao 50 - 100 mg/l (Dương Công Kiên, 2003). 1.1.4.7. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức (Torres, 1989). Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này 12
Đồ án tốt nghiêp̣ thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính sau đây. a. Auxin Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật thường gặp trong tự nhiên, có ở mô phân sinh chồi, lá mầm và rễ do Went và Thimann (1937) phát hiện ra. Auxin vận chuyển hướng cực: từ đỉnh chồi ngọn tới cơ quan khác. Auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và giãn nở của tế bào đặc biệt theo chiều ngang làm tế bào phình ra. Bên cạnh đó auxin còn kích thích sự phân chia và kéo dài tế bào. Tuy nhiên các ảnh hưởng đến sự giãn nở và phân chia tế bào trong tác động hỗ trợ với các phytohoocmon khác (Skoog và Miller, 1957). Auxin cũng gây ra tính hướng động của cây (hướng sáng và hướng đất), gây ra hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự hình thành rễ, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt. Ngoài ra auxin còn kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả; ảnh hưởng đến sự vận động của chất nguyên sinh; ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất. Những auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là: IBA (3-indolebutiric acid), IAA (3-indole acetic axid), NAA (Napthaleneaxetic acid), 2,4-D (2,4-D- dichlorophenoxyaxetic acid) và 2,4,5-T (Trichlorophenoxyacetic acid). Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi. 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối với môi trường tạo và phát triển callus (Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, 1993). b. Cytokinin Cytokinin là nhóm phytohormone có mặt ở tất các các loại cây trồng, hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ. Cytokinin vận chuyển không hướng cực, có thể hướng ngọn hoặc hướng gốc. Cytokinin có ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Trong môi trường nuôi cấy tỷ lệ auxin/cytokinin có ý nghĩa quyết định trong sự phân hóa của tế bào theo hướng tạo mô sẹo, tạo rễ, tạo 13
Đồ án tốt nghiêp̣ chồi hay tạo phôi vô tính. Cytokinin cũng có ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất như quá trình sinh tổng hợp nucleic acid, protein, chlorophyll và ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý của cây. Có ba loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là BA, kinetin và zeatin (Trần Văn Minh, 1997). Kinetin đươc̣ Skoog (1957) phát hiêṇ ngẫu nhiên trong khi chiết xuất acid nucleic, kinetin hình thành và phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao từ chế phẩm DNA có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi. Zeatin thực chất là một dẫn xuất của adenine có tác dụng kích thích sự tạo chồi nhưng giá thành cao nên ít sử dụng. BA tuy là cytokinin tổng hơp̣ nhân taọ nhưng có hoaṭ tính manḥ hơn kinetin và bền nhiệt với độ cao hơn zeatin. c. Gibberellin (GA) Gibberellin được phát hiện vào những năm 1930. Lịch sử phát hiện nhóm hormone này bắt đầu từ 1895 khi người Nhật nói về bệnh lúa von. Năm 1926, xác định được bệnh đó là do loài nấm Gibberella fujikuroi gây ra. Đến những năm 30, mới phân lập và tinh chế được hoạt chất, được gọi là gibberellin. Mãi sau chiến tranh thế giới thứ II năm 1950, người Anh và người Mỹ mới biết đến công trình này của người Nhật. Tới nay, người ta đã phát hiện được trên 60 loại thuộc nhóm gibberellic acid. Loại gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô thực vật là GA3. Hiệu quả sinh lý rỏ rệt nhất của gibberellin là kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng kéo dài của thân bằng cách kích thích sự phân cắt tế bào và sự tăng dài của tế bào. Gebberellin cũng kích thích sự nảy mầm của hạt và củ, do đó nó có tác dụng đặc trưng trong việc phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của chúng. Trong nhiều trường hợp gibberellin kích thích sự ra hoa rõ rệt. Ảnh hưởng đặc trưng của gibberellin lên sự ra hoa là kích thích sự sinh trường kéo dài và nhanh chóng của cụm hoa. Đối với sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt thì gibberellin có vai trò gần giống với auxin, nó làm tăng kích thước quả và tạo nên quả không hạt (Hoàng Minh Tấn; Nguyễn Quang Thạch, 1993). 14
Đồ án tốt nghiêp̣ Trong nuôi cấy mô thực vật, tác dụng của gibberellin chưa thực sự rõ ràng. Nhiều tác giả đã sử dụng và coi đó là thành phần không thể thiếu của một số loại môi trường chuyên dụng. d. Abscisic acid (ABA) Abscisic acid thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ nghỉ của chồi; làm chậm sự ra hoa và sự nảy mầm của hạt; tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả; ức chế sự kéo dài thân và gây ra hiện tượng đóng khí khổng. Abscisic acid còn được xem là một hoocmon của “stress” vì nó được hình thành mạnh để phản ứng với các stress hoặc điều kiện bất thuận cảu môi trường và làm cho cây biến đổi để thích ứng với điều kiện môi trường (Hoàng Minh Tấn; Nguyễn Quang Thạch, 1993). Trong nuôi cấy mô và tế bào, abscisic acid có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy abscisic acid được đưa vào môi trường nuôi cấy và mang lại hiệu quả nhất định. e. Ethylene Ethylen thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng thực vật được tổng hợp trong các mô đang xảy ra sự lão hóa hay sắp chín như ở trái. Ethylene gia tăng sự rụng lá và trái, sự lão hóa; phá vỡ sự ngủ của chồi và hạt của một số loài; kích thích trổ hoa ở một số loài thực vật không xác định (Lê Văn Hoàng, 2008). 1.1.4.8. Các chất hữu cơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro a. Nước dừa Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van Overbreek và cộng sự (Van Ovebreek và cộng sự, 1941). Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận.Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất kích thích sinh trưởng (George, 1993). Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây với nồng độ 5 – 20 % thể tích môi trường. b. Dịch chiết khoai tây 15
Đồ án tốt nghiêp̣ Dịch chiết khoai tây có chứa cacbohydrat, acid amin, các vitamin B, C và các khoáng vi lượng cần thiết như kaili, sắt, magie, rất tốt cho sự sinh trưởng và phát triển của mô, tế bào. Chiết xuất khoai tây được bổ sung vào môi trường nuôi cấy lan, bao phấn lúa và một số cây ngũ cốc khác. Nồng độ khoai tây thường sử dụng là 20 mg/l (Horst, 1990). c. Dịch chiết nấm men Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với nồng độ thích hợp, có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào, lượng thường dùng là 1 g/l (Horst, 1990). Ngoài ra, có thể sử dụng dung dịch thủy phân casein hydrolylase (0,1 – 1 %) hoặc bột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100 g/l (chuối xanh) nhằm tăng cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy. 1.1.4.9. Độ pH môi trường và agar Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị môi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá trị cần thiết của thí nghiệm bằng NaOH hoặc HCl. pH của môi trường nuôi cấy thích hợp cho đa số các loại cây trồng dao động từ 5,5 - 6,0. Nếu pH cao hơn thì sẽ làm môi trường rất rắn trong khi pH thấp hơn lại giảm khả năng đông đặc của agar (Dương Tấn Nhựt, 2009). Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hóa môi trường. Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6 – 1 %, đây là loại tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu oxi nếu môi tường lỏng và tĩnh. Nếu sử dụng với nồng độ quá cao sẽ làm môi trường quá cứng và ảnh hưởng tới sự khuyếch tán cũng như hấp thu dinh dưỡng của mô, tế bào (Collin, 1998; Bhojwani & Razan, 1983). Nếu như agar không được tinh sạch có thể làm đục màu môi trường do các chất cặn trong agar gây nên. Agar có thể ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm bởi vì agar là một sản phẩm lấy từ tảo biển, nó có thể có những tác động sinh lý trên mô thực vật (Griffis và cộng sự, 1991; Debergh, 1983; Halquist và cộng sự, 1983) 16
Đồ án tốt nghiêp̣ 1.1.4.10. Than hoạt tính Khi bổ sung than hoạt tính vào môi trường sẽ kích thích sự tăng trưởng của mô thực vật do than hoạt tính kết hợp với các hoạt chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy. Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 0,5 – 3 %. 1.1.4.11. Điều kiện nuôi cấy Ánh sáng là nhân tố ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Các yếu tố ảnh hưởng như: cường độ chiếu sáng, chu kỳ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng. Kết quả nghiên cứu của Vince-Pure (1994), Teresa và cộng sự (2007) đã chỉ ra nguồn ánh sáng và cường độ ánh sáng có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy và chất lượng cây giống. Để mô cấy phát triển tốt thì phòng nuôi cấy phải thông thoáng và có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường được giữ ở 25 – 28oC (Nguyễn Đức Thành, 2000). 1.2. Giới thiệu về chi Stachys Chi Stachys là một trong những chi lớn nhất trong họ Lamiaceae, bao gồm khoảng 300 loài xuất hiện ở vùng ôn đới và nhiệt đới. Chi này phân bố khắp thế giới nhưng phổ biến nhất ở châu Âu và Đông Á. Sự đa dạng loài lớn nhất ở Đông Nam Á (khoảng 154 loài). Chiết xuất từ các loài Stachys đã được sử dụng trong y học truyền thống ở châu Âu để tiêu đờm, giảm ho, giảm các triệu chứng hen suyễn và đau tai. Tại Liên bang Nga, có 37 loài Stachys sinh trưởng, trong đó có 12 loài được sử dụng trong y học dân gian, một số loài được trồng làm cây cảnh. Phần thân trên của một số loài được sử dụng để điều trị các vấn đề như rối loạn da, đau dạ dày, ung nhọt, hen suyễn, viêm thấp khớp và ung thư (Gören, 2014). Các loài Stachys cũng được sử dụng trong y học dân gian Bulgaria, Đức, Afghanistan, và Trung Quốc. Loài S. recta đã được đưa vào sản xuất dược phẩm tại Pháp và Mêhicô và được sử dụng trong liệu pháp vi lượng đồng căn. Nhiều loài thuộc chi Stachys còn được sử dụng như một loại trà gọi là “trà núi”, có tác dụng an thần, chống co thắt, lợi tiểu và tuần hoàn (Gören, 2014). Ngoài ra, các chế phẩm của 17
Đồ án tốt nghiêp̣ Stachys còn được sử dụng làm thuốc chống viêm, làm lành vết thương, thuốc an thần, kích thích sự co tử cung trong khi sinh và được sử dụng như một loại thuốc cầm máu. Tác dụng an thần của các chế phẩm thuốc thu được từ Stachys mạnh hơn so với các chế phẩm thu được từ Leonurus cardiaca. Thành phần hóa học của chi Stachys bao gồm các loại tinh dầu, alkaloid, flavonoid, tannin, iridoid, glycosides, choline, betaine, allantoin, turicine, các loại đường (bao gồm tetrasaccharide stachyose có hoạt tính giống insulin) và nhiều thành phần khác. Chúng có mặt trong tất cả các bộ phận của cây, bao gồm lá, thân, rễ và củ. Các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã chứng minh rằng nuôi cấy tế bào S. sieboldii có thể tạo ra glycosid verbascoside có đặc tính chống miễn dịch. Hạt của các loài S. balansae, S. lanata, S. sylvatica, S. annua, S. palustris, S. betoniciflora chứa 24 – 44 % chất béo. Các loại axit béo trong hạt của các loài thuộc chi Stachys chứa triacylglycerols có nguồn gốc từ acid panmitic, stearic, oleic, linoleic và linolenic. Triaeylglycerols của axit linoleic chiếm 60 – 70 % (trong tổng số) - và của axit oleic chiếm 20 – 30 %, chiếm ưu thế trong chất béo của các loài Stachys nghiên cứu, trong khi đó lượng triacylglycerols chủ yếu chứa axit béo no chiếm từ 5 đến 10 %. Đã có nhiều nghiên cứu về các loài thuộc chi Stachys cho thấy chúng có khả năng điều trị các loại bệnh như tiểu đường, kháng viêm, an thần, chống oxi hóa, gây độc với các tế bào ung thư, 18
Đồ án tốt nghiêp̣ 1.3. Giới thiệu về cây sùng thảo (Stachys affinis) 1.3.1. Phân loại Giới (regnum): Plantae (không phân hạng): Angiospermae (không phân hạng) : Eudicots Bộ (ordo): Lamiales Họ (familia): Lamiaceae Chi (genus): Stachys Loài (species): Stachys affinis Hình 1.1. Cây sùng thảo 1.3.2. Đặc điểm sinh học và công dụng Cây sùng thảo – Stachys affinis (Stachys sieboldii, Stachys tuberifera) còn được gọi với tên khác là atisô Trung Quốc, là một loại cây thân thảo lâu năm có nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản, nơi chúng được trồng rộng rãi và lấy củ làm thực phẩm. Cây có chiều cao từ 30 đến 50 cm, lá có lông mọc đối xứng nhau và mép lá có răng cưa, hoa nhỏ màu trắng hoặc màu hồng tím nở vào mùa hè. Vào cuối mùa thu, dưới mặt đất hình thành các củ nhỏ giống như một chuỗi hạt ngọc trai màu trắng. Củ sùng thảo có hình dạng giống sâu bướm, dài từ 2,5 đến 5,5 cm hoặc dài hơn, dày 1,3 đến 2,5 cm. Khi ăn củ có vị man mát giống như atiso đỏ và thường được chế biến bằng cách ngâm, xào, nấu súp hoặc ăn sống. Tại Trung Quốc và Nhật Bản, củ sùng thảo còn được ngâm rượu làm thuốc chữa bệnh có tác dụng thanh nhiệt, chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống viêm và tăng cường hệ tiêu hóa. Atisô Trung Quốc đã được sử dụng như một loại rau củ ở Trung Quốc từ thế kỷ thứ tư. Kể từ thế kỷ XIX, cây sùng thảo được trồng ở châu Âu (Łuczaj và cộng sự, 2011), ở Pháp cây sùng thảo được gọi là “Crosnes”, chỉ thành phố Crosne, thuộc tỉnh Essonne, nơi nó được trồng lần đầu tiên vào năm 1882. 19
Đồ án tốt nghiêp̣ Hình 1.2. Củ sùng thảo Ở Trung Quốc, S. affinis được sử dụng như một phương thuốc truyền cổ truyền điều trị nhiễm trùng, cảm lạnh, bệnh tim, bệnh lao và viêm phổi (Yamahara, Kitani, Kobayashi & Kawahara, 1990; Feng và cộng sự, năm 2015). Có một số nghiên cứu chỉ ra rằng dịch chiết xuất từ củ sùng thảo giúp giảm bớt sự rối loạn trí nhớ liên quan đến chứng mất trí và bệnh Alzheimer ở chuột thông qua cơ chế chống oxy hóa (Harada, Tsujita, Ono, Miyagi, Mori & Tokuyama, 2015). Chiết xuất methanolic từ S. affinis cũng đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ chuột khỏi tác động gây tử vong của kali cyanide (Yamahara và cộng sự, 1990) và ức chế hoạt động của enzyme hyaluronidase (Takeda, Fujita, Satoh & Kakegawa, 1985). Trong một nghiên cứu khác, một đoạn polysaccharide chiết xuất từ củ của S. affinis có khả năng thu hồi cao các anion superoxide, hydroxyl và các gốc tự do (Feng và cộng sự, 2015). Theo những nghiên cứu của chúng tôi, các glycosides phenylethanoid như acteoside và stachysoside C là những hoạt chất thứ cấp chính đặc trưng trong củ của S.affinis (Yamahara và cộng sự, 1990). Đặc biệt, acteoside được xem là một ức chế di căn ung thư hiệu quả (Hayashi, Nagamatsu, Ito, Yagita & Suzuki, 1996). Củ của S. affinis còn có một nguồn stachyose phong phú (Łuczaj và cộng sự, 2011), người ta đã chứng minh rằng stachyose có tác dụng hạ đường huyết đáng chú ý ở chuột nhắt (Zhang và cộng sự, 2004). 20
Đồ án tốt nghiêp̣ 1.3.4. Thành phần hóa học Phân tích các hóa chất thực vật từ chiết xuất ethanol của atisô Trung Quốc thông qua sử dụng sắc ký cột (tách các hợp chất) cùng với dữ liệu NMR và MS (xác định và mô tả cấu trúc) cho phép xác định 9 hợp chất, cụ thể là verbascoside (1), leucosceptoside A (2), martynoside (3), harpagide (4), 8-O- acetyl-harpagide (5), melittoside (6), 5- O-allosyloxy-aucubin (7), acid succinic (8), và stachyose (9). Các hợp chất này thuộc bốn loại chất chuyển hóa tự nhiên khác nhau, cụ thể là các phenylethanoid glycosides (PhG) (các hợp chất 1-3), iridoids (các hợp chất 4- 7), axit dicarboxylic (hợp chất 8) và oligosaccharides (hợp chất 9). Sự hiện diện của PhG và các iridoid glycoside trong chiết xuất ethanol của atisô Trung Quốc hoàn toàn phù hợp với sự phân loại thực vật hiện tại của loài. Verbascoside (1) là một PhG phổ biến đã được tìm thấy ở S. affinis (Hayashi và cộng sự, 1994) cũng như các thành viên khác của chi như: S. anisochila, S. beckeana, S. plumosa, S. Alpina subsp. Dinarica, S. germanica subsp. Salviifolia và S. tymphaea (Venditti và cộng sự, 2014). Từ khía cạnh sức khoẻ, verbascoside có một số đặc điểm dược lý đáng chú ý, trong đó quan trọng nhất là kháng viêm, giảm đau, chống oxy hóa và chống ung thư (Funes và cộng sự, 2009; Speranza và cộng sự, 2010). Leucosceptoside A (2) và martynoside (3) cũng là PhGs, trước đây nó được tìm thấy trong lá của S.affinis và các thành viên khác trong họ Lamiaceae (Nishimura và cộng sự, 1991). Các hợp chất này có tính chất tương tự estrogen và khả năng chống oxy hoá quan trọng (Papoutsi và cộng sự, 2006; Wang và cộng sự, 1996). Harpagide (4), 8-O-acetyl-harpagide (5), melittoside (6) và 5-O-allosyloxy- aucubin (7) đại diện cho tất cả các hợp chất mới của loài, trong khi chúng đã được tìm thấy ở một số thành viên của chi Stachys trước đây và các chi liên quan của họ Lamiaceae (Venditti và cộng sự, 2013a, 2013b). Cần lưu ý rằng harpagide (4) và 8- O-acetyl-harpagide (5) được xem là các dấu hiệu hóa học của họ Lamiaceae, cũng như các iridoids diglycosidic melittoside (6) và 5-O-allosyloxy-aucubin (7), đã được phát hiện ở một số chi của họ Lamiaceae với mức độ gần gũi và phân loại chặt chẽ 21
Đồ án tốt nghiêp̣ (Venditti và cộng sự, 2013a, 2013b). Từ quan điểm dược lý, tất cả những iridoid này đều có những đặc tính sinh học quan trọng. Harpagide (4) có thể sử dụng để ngừa loãng xương (Chung và cộng sự, 2016), và dẫn xuất acetyl của nó cũng cho thấy tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, chống ung thư, kháng virus và giảm đau (Xie, Tần & Fang, 2005). Melittoside (6) và 5-O-allosyloxy-aucubin (7) có khả năng chống oxy hoá ở mức trung bình nhưng chúng có tác dụng kháng viêm (Samuelsen, 2000). Axit succinic (8) là một hợp chất chuyển hóa thứ cấp đóng một vai trò như một chất trung gian trong chu trình tế bào của axit citric ở cả thực vật và động vật. Axit succinic có vai trò quan trọng trong y học và làm thực phẩm chức năng vì nó có tác dụng chống co giật trong trường hợp oxy cao áp (Sanders, Currie & Woodhall, 1969), nó cũng có tác dụng giảm đau và an thần (Chen, Xin, Kong, Min & Li, 2003). Axit hữu cơ này còn có tác dụng làm giảm lượng đường và cholesterol trong máu, nó đã được chứng minh có ích trong điều trị bệnh đái tháo đường và các rối loạn chuyển hóa khác (Vengerovskii, Khazanov, Eskina & Vasilyev, 2007). Stachyose (9) là hợp chất dấu hiệu để nhận biết atisô Trung Quốc (Łuczaj và cộng sự, 2011). Nó là một oligosaccharide được tìm thấy trong một số loại rau, đặc biệt là ở trong hạt đậu, thường được sử dụng làm chất tạo ngọt thay thế cho sucrose trong đồ uống (Nakakuki, 2002), cần lưu ý rằng đường này không tiêu hoá hoàn toàn bằng enzyme trong cơ thể người, và có thể gây đầy bụng nghiêm trọng ở những người nhạy cảm (Hu, 2005). Tuy nhiên, những nhược điểm nhỏ này không đáng kể so với lợi ích của nó. Stachyose có tiềm năng cao trở thành chất tiền sinh học trong thực phẩm chức năng (Yildiz, 2010), và nó có khả năng hạn chế sự gia tăng một số vi khuẩn có hại (Smith, Roche, Trombe, Briles & Håkansson, 2002) cũng như làm giảm nồng độ glucose huyết tương (Zhang và cộng sự, 2004). 1.3.5. Giá trị dinh dưỡng S. affinis giàu protein, carbohydrate và vitamin. Có thể ăn sống, nấu, ngâm rượu, làm salad, chế biến súp, làm gia vị (Mercier & Perennes, 1982), hoặc mài thành bột và sử dụng để chế biến bánh quy. Củ của S. affinis rất giàu Fe2+, do đó củ sùng 22
Đồ án tốt nghiêp̣ thảo là thực phẩm lý tưởng cho các bệnh nhân thiếu máu (Instituto Botanico Boreali- Occidentali Academiae Sinicae, 1983). Phân tích giá trị năng lượng của củ sùng thảo cho thấy cứ 100 g củ cung cấp 195 kcal. Carbohydrate (36,94 %) là chất dinh dưỡng đa lượng phổ biến nhất, trong đó đường chiếm một phần quan trọng (14,07 %). Stachyose là thành phần chiếm tỷ lệ lớn nhất trong phần đường. Củ có 10,64 % protein, 0,53 % chất béo. Đáng chú ý là trong củ có một nguồn chất xơ dồi dào (35 %), đây thành phần thực phẩm có tác dụng tốt với sức khoẻ. Hàm lượng tro cao (8.44 %) do sự hiện diện của nhiều yếu tố đa lượng và vi lượng. Về mặt này, atisô Trung Quốc cho thấy nồng độ K (2,36 %), P (0,41 %), Ca (0,38 %) và Mg (0,22 %) và nồng độ Na thấp (0,008 %) (Stanley & Stephen, 2008). Như đã biết khẩu phần ăn có chứa hàm lượng kali cao có thể bảo vệ khỏi nguy cơ mắc bệnh tim mạch (Khaw & Barrett-Connor, 1987). Trên cơ sở này, việc sử dụng atisô Trung Quốc không chỉ có lợi cho bệnh nhân bị tiểu đường (vì hàm lượng stachyose cao) mà còn ở những người có vấn đề về tim. Hàm lượng kali cao phát hiện trong củ có thể giải thích về truyền thống sử dụng củ sùng thảo ở Trung Quốc để điều trị các bệnh về tim (Phong và cộng sự, 2015). 1.4. Một số nghiên cứu về chi Stachys Các loài thực vật thuộc chi Stachys đã được sử dụng trong y học cổ truyền ở một số quốc gia để làm thuốc khử trùng, chống co thắt, tiêu đờm, giảm ho, làm dịu các triệu chứng hen suyễn và đau tai, ức chế sự phát triển của khối u sinh dục và ung thư lở loét. Các loại thảo mộc được sử dụng bên ngoài để điều trị vết thương và sắc thuốc uống điều trị đau bụng dưới, chuột rút, chóng mặt, sốt, bệnh gout và rối loạn kinh nguyệt. Các nghiên cứu dược phẩm đã chứng minh rằng các chiết xuất hoặc các thành phần của cây thuộc chi Stachys có hoạt động kháng khuẩn và kháng nấm, các hoạt tính chống oxy hoá, giảm lo âu, kháng viêm, hạ huyết áp, hyaluronidase và chống viêm thận. 23
Đồ án tốt nghiêp̣ 1.4.1. Kháng viêm và giảm đau Hoạt tính kháng viêm của dung dịch chiết xuất thu được từ các bộ phận trên mặt đất của mười loài Stachys Hungary đã được nghiên cứu thử nghiệm ở cơ thể chuột bị gây phù nề bằng carrageenan sau khi tiêm vào ổ bụng và cho chuột uống (Háznagy-Radnai và cộng sự, 2012). Chiết xuất acetone và methanol của S. byzantina đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong việc ức chế cơn đau và quá trình viêm trong thí nghiệm sử dụng hai mô hình viêm nhiễm: thử nghiệm formalin và thử nghiệm chứng phù nề do carrageenan (Khanavi và cộng sự, 2005). Cả ba liều của acetone và methanol chiết xuất từ S. byzantina (50, 100 và 200 mg/kg) đã ức chế đáng kể cơn đau trong giai đoạn thứ hai của thử nghiệm formalin và tác dụng của liều thấp cao hơn. Cả hai chiết xuất của S. byzanthina đều giảm phản ứng đau đớn hiệu quả hơn indomethacin - một thuốc chống viêm không steroid (NSAID). 1.4.2. Chống oxy hóa Có nhiều nghiên cứu cho thấy các loài thực vật thuộc chi Stachys là một nguồn chất chống oxy hoá tự nhiên dồi dào. Hoạt tính chống oxy hoá ở điều kiện in vitro của chiết xuất methanol thu được từ các bộ phận trên mặt đất của S. spruneri đã được nghiên cứu cùng với 20 loài thực vật khác thuộc họ Lamiaceae và cho thấy có tác dụng tương tự vitamin E (Couladis và cộng sự, 2003). Dung dịch chiết xuất từ S. iberica có hoạt tính chống oxy hoá trong điều kiện in vitro khác nhau (Tepe và cộng sự, 2011). S. iberica có thành phần chất chống oxy hoá tốt với khả năng ức chế acid linoleic là 88,14 % ở nồng độ 2 mg/ml, nhưng hoạt tính loại bỏ tạp chất và hiệu ứng tạo phức chelate ở mức vừa phải (lần lượt là 46,63% ở 1,0 mg/ml và 33,14 % ở 2 mg/ml). Chiết xuất methanol từ các bộ phận trên mặt đất của bốn loài Stachys như S. alpina, S. anisochila, S. beckeana và S. plumosa đã được nghiên cứu về tác dụng chống oxy hoá của chúng (Kukic và cộng sự, 2006). Các chiết xuất được nghiên cứu về khả năng chống oxy hoá tổng hợp (TAC), cùng với khả năng thu hồi gốc tự do và 24
Đồ án tốt nghiêp̣ OH, và oxy hóa lipid. Sự tương quan cao giữa hàm lượng phenol tổng, TAC và thu gốc tự do chỉ ra rằng polyphenol là chất chống oxy hoá chính. Tất cả các chiết xuất Stachys, ngoại trừ S. plumosa, đều có hoạt tính chống gốc tự do với giá trị IC50 <50 lg/ml. Trong nồng độ từ 6,25 đến 50 lg/ml tất cả các chiết xuất thu được gốc OH có tỷ lệ trên 40 %, với sự ức chế tối đa của chiết xuất S. beckeana là 64,97 %. Chiết xuất S. plumosa đạt hoạt độ tối đa là 60,67 % ở 100 mg/ml. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh sự hiện diện của phenylethanoid glycosides như acteoside, martinoside và forsithoside B là thành phần chính của S. plumosa (Bankova và cộng sự, 1999). Các hợp chất này được chứng minh là các chất chống oxy hoá mạnh (Aligianis và cộng sự, 2003). Sáu loài Stachys là S. cretica, S. germanica, S. hydrophila, Stachys nivea, S. palustris, và S. spinosa đều có khả năng thu gốc DPPH (Conforti và cộng sự, 2009). S. palustris cho thấy hiệu quả chống gốc tự do cao nhất với giá trị IC50 là 0,482 mg/ml. Các hợp chất carbonylic (25,4 %), axit béo và este (24,2 %), sesquiterpenes đã bị oxy hoá (10,6 %) là ba nhóm thành phần cấu thành dầu tinh dầu này. Các hợp chất có nhiều nhất là caryophyllene oxide, hexahydrofarnesyl acetone, hexadecanoic acid, (Z)-phytol, thymol và p-methoxyacetophenone. Những hợp chất này hoạt động như chất chống oxy hoá (Ruberto và Baratta, 2000). 1.4.3. Chống lo âu Trong một nghiên cứu gần đây đã chứng minh tác dụng an thần của tinh dầu Stachys tibetica khi tiến hành thí nghiệm mô hình chữ thập nâng cao, thí nghiệm lỗ hổng và thí nghiệm khu vực sáng/tối ở chuột (Kumar và cộng sự, 2012). Ở chuột cống, tinh dầu của S. tibetica (liều 25 và 50 mg/kg) làm tăng cả thời gian và số lần ra vùng cánh tay mở, giảm tỷ lệ quay lại vùng cánh tay đóng, điều đó cho thấy tác dụng chống lo âu đáng kể. Chiết xuất của S. alpina, S. anisochila, S. beckeana và S. plumosa được tiêm dưới da những con chuột Wistar đực trưởng thành với liều lượng 100 - 400 mg/kg và đem thí nghiệm trong thí nghiệm mô hình chữ thập nâng cao (EPM - Elevated Plus Maze), thử nghiệm Grip và các hoạt động vận động tự nhiên, mục đích chính là để 25
Đồ án tốt nghiêp̣ dự tính khả năng giảm lo lắng, giảm đau và giảm giãn cơ (Savic' và cộng sự, 2010). S. beckeana ở liều 400 mg/kg gây ra hiệu ứng giống như bị ngộ độc ở bệnh nhân cao áp (EPM), trong khi các thông số hoạt động có liên quan ở cùng một thử nghiệm cho thấy hoạt tính an thần của S. alpina subsp. dinarica và S. plumosa. Sự có mặt của chrysoeriol và các glycosides apigenin trong S. plumosa thể hiện hoạt tính đặc trưng. Chrysoeriol 4’-O-α-D-glucopyranoside và chrysoeriol 7-O- α-D glucopyranoside cho thấy hoạt tính bảo vệ thần kinh trong điều kiện in vitro (Ma và cộng sự, 2005). Apigenin được mô tả là chất có hiệu quả giảm lo lắng rõ ràng ở chuột, không gây dị ứng hoặc làm giãn cơ, phù hợp để trở thành một chất đối kháng với benzodiazepine (Dekermendjian và cộng sự, 1999; Viola và cộng sự, 1995). Axit chlorogenic, được tìm thấy trong cả bốn chất chiết xuất cũng cho thấy hiệu quả chống lo âu trong các mô hình thí nghiệm lo lắng ở chuột, bao gồm thử nghiệm khu vực sáng/tối, mô hình chữ thập nâng cao và thử nghiệm khám phá tự do (Bouayed và cộng sự, 2007). Linalool có mặt trong chiết xuất từ các loài Stachys được tiêm vào ổ bụng chuột cũng cho thấy tác dụng an thần rõ rệt (bao gồm thôi miên, hạ nhiệt và chống co giật) đã được chứng minh có hiệu quả an thần ở người (Linck và cộng sự, 2010). 1.4.4. Kháng khuẩn Koutsaviti và cộng sự (2011) đã đánh giá khả năng ức chế sự tăng trưởng vi khuẩn của tinh dầu S. spruneri đối với vi khuẩn Gram dương như: B. subtilis, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, S. aureus, Staphylococcus epidermidis; các vi khuẩn Gram âm như E. coli , Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa và hai chủng nấm Candida albicans phát hiện thấy tinh dầu có tác dụng ức chế đáng kể với tất cả các vi sinh vật được thử nghiệm. Tinh dầu thu được từ các bộ phận trên mặt đất của S. officinalis ở Serbia đã được tiến hành thử nghiệm chống lại các vi khuẩn Gram dương như Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus, các vi khuẩn Gram âm như Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhimurium, tạo ra các giá trị MIC (nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi sinh vật) trong khoảng 0,31 - 20,00 mg/ml 26
Đồ án tốt nghiêp̣ (Lazarevìc và cộng sự, 2013). Tác dụng của chúng với vi khuẩn Gram dương cao hơn các chủng Gram âm. Trong một nghiên cứu trước, tinh dầu của S. officinalis cho thấy giá trị MIC là 1,0 mg/ml đối với S. aureus (Grujic-Jovanovic và cộng sự, 2004). Các dung dịch chiết xuất, methanolic và dichloromethane của S. nivea thể hiện tác dụng kháng Leishmania ở hình dạng ký sinh trùng nội bào không có roi (Di Giorgio và cộng sự, 2008). Hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất methanol từ hoa khô của S. byzantina, S. inflata, S. lavandulifolia và S. laxa được thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và xác định các giá trị ức chế tối thiểu (MIC) đối với S. aureus , Streptococcus sanguis, E. coli, P. aeroginosa, K. pneumoniae, A. niger và C. albicans (Saeedi và cộng sự, 2008). Các chiết xuất cá tác dụng hiệu quả hơn với vi khuẩn Gram dương và không có hoạt tính kháng nấm. Hoạt tính có thể liên quan đến sự có mặt của flavonoids như là thành phần chính. Nhiều nghiên cứu đã xác định flavonoid có khả năng chống nấm, kháng vi trùng và kháng khuẩn (Cushnie and Lamb, 2005). 1.5. Các nghiên cứu nhân giống in vitro chi Stachys Nhân giống bằng nuôi cấy mô và tế bào là biện pháp nhân giống hiện đại và ngày càng phổ biến, cho phép nhân nhanh nhiều loại cây trồng với quy mô lớn. Một số loài thuộc chi Stachys đã được nghiên cứu và xác định các điều kiện môi trường nhân giống in vitro thích hợp, có thể kể đến một số loài như Stachys thracica, Stachys pubescens, Khử trùng 100 hạt giống Stachys thracica bằng cồn 70 %, sau đó rửa với cồn 96%. Hạt sau khi khử trùng được chia đều cấy vào môi tường ½ MS và môi trường lỏng chứa 0,07% agar. Sau 14 ngày, 10 % trong số 50 hạt cấy vào môi trường lỏng chứa 0,07% agar nảy mầm, trong khi ở môi trường ½ MS không cáo dấu hiệu nảy mầm. Cây con được cấy truyền sang môi trường MS cơ bản bổ sung 3 % sucrose và 0,7 % agar và được trồng trong điều kiện môi trường được kiểm soát (ánh sáng và nhiệt độ). Các cây tái sinh có chỉ số tăng trưởng cao, hệ thống rễ phát triển và số lượng lá nhiều (Desislava Mantovska và cộng sự, 2016). 27
Đồ án tốt nghiêp̣ Môi trường tạo mô sẹo tốt nhất của Stachys pubescens là môi trường MS bồ sung 100 mg/l myo inositol, 2 mg/l glycine, 0,5 mg/l nicotinic, 0,5 mg/l pyridoxine, 0,1 mg/l thymine, 30 g/l sucrose, 15 % nước dừa, 0,8 % agar, 1 mg/l IAA, 1 mg/l 2,4- D và 0,2 mg/l kinetin. Độ pH của môi trường được điều chỉnh về 5,8. Môi trường đã cấy mẫu được để ở nhiệt độ 250C trong bóng tối (Masoume Sabokbari và cộng sự, 2013). 28
Đồ án tốt nghiêp̣ CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: Dự kiến thực hiện đề tài từ tháng 1/2017 đến tháng 7/2017. - Địa điểm: Phòng Thực nghiệm cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, số 2374, Quốc lộ 1, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây, quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu và phương pháp 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu được sử dụng trong đề tài là cây sùng thảo in vitro được cung cấp từ phòng Thực nghiệm cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. HCM. 2.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.2.2.1. Trang thiết bị - dụng cụ - Tủ cấy vô trùng - Tủ lạnh - Máy đo pH - Bếp từ - Cân điện tử - Dao cấy, kẹp cấy. - Ống đong 100 ml, ống đong 100 ml, pipet 10 ml. - Chai thủy tinh 500 ml. - Đèn cồn, đĩa cấy, bông thấm. - Máy đo pH, cân điện tử. - Máy nước cất 2 lần. - Tủ sấy. - Nồi hấp tiệt trùng. 2.2.2.2. Hóa chất - Cồn 96o, 70o 29
Đồ án tốt nghiêp̣ - Môi trường MS cơ bản - Saccharose - Agar - Các chất kích thích sinh trưởng: NAA, BA, IBA 2.2.3. Môi trường nghiên cứu Môi trường nuôi cấy sử dung̣ là môi trường khoáng cơ bản của Murashige và Skoog (1962) gồm: khoáng đa lương,̣ khoáng vi lương,̣ vitamin. Môi trường đươc̣ bổ sung thêm 30 g/l đường sucrose, 8,5 g/l agar. Sau khi bổ sung đầy đủ các chất cần thiết thi ̀ cần điều chỉnh pH = 5,7 – 5,8. Môi trường nuôi cấy đươc̣ đong vào chai thuỷ tinh với thể tích mỗi chai là 60 ml rồi tiến hành hấp khử trùng ở điều kiêṇ áp suất 1atm, nhiêṭ đô ̣ 121oC trong 20 phút. 2.2.4. Điều kiện phòng nuôi cấy Để đảm bảo điều kiêṇ vô trùng, các thí nghiêṃ đươc̣ thưc̣ hiêṇ trong môṭ phòng nuôi cấy riêng biêṭ với các điều kiêṇ sau: - Cường độ chiếu sáng ánh sáng 2000 ± 500 lux. - Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày. - Nhiệt độ: 25oC ± 2. - Độ ẩm: 50%. Thời gian chiếu sáng và độ ẩm môi trường cũng có thể thay đổi tùy thuộc vào mục đích và điều kiện thí nghiệm. 2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm SARS 9.4 và Microsoft Excel 2016. 2.3. Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo. - Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo. 30
Đồ án tốt nghiêp̣ - Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Pha môi trường nuôi cấy 2.4.1.1. Chuẩn bị dung dịch mẹ Hiện nay, môi trường MS được xem là môi trường thích hợp với nhiều loại cây do giàu và cân bằng chất dinh dưỡng. Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy người ta không cần cân nhiều loại hóa chất thay vào đó là việc chuẩn bị trước các dung dịch mẹ (dung dịch Stock), sau đó pha loãng ra để sử dụng. Thường pha các dung dịch mẹ: Khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, Fe – EDTA, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng. Dung dịch mẹ được pha với độ đậm đặc từ X10 – X200 (10 lần đến 200 lần). Khi sử dụng chỉ cần pha với nước cất 2 lần theo tỉ lệ thích hợp. Bảo quản dung dịch Stock trong tủ lạnh và thời gian sử dụng khoảng nửa tháng. 2.4.1.2. Quy trình pha môi trường - Chuẩn bị dụng cụ và các hóa chất cần thiết. - Tiến hành cân, đong và hòa tan các chất cần thiết tương ứng với thể tích cần pha. - Bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật. - Thêm nước cất vào môi trường đến khi đạt thể tích cần thiết, khuấy đều hỗn hợp. - Chuẩn pH 5,8 ± 0,05 bằng NaOH 1 N và HCl 1 N, bổ sung agar và than hoạt tính (nếu cần). - Tiến hành chiết môi trường vào chai (thể tích tùy vào mục đích), bịt miệng chai hoặc đóng nắp (không đóng nắp quá chặt hay cột chặt miệng chai vì dễ gây nổ và tràn môi trường do áp suất thay đổi trong khi hấp). - Ghi rõ ngày tháng và tên (ký hiệu) môi trường để tránh nhầm lẫn. 31
Đồ án tốt nghiêp̣ - Hấp khử trùng môi trường ở 121oC trong 20 phút, áp suất 1 atm. Sau khi hấp xong lấy môi trường ra và chuyển môi trường đã hấp khử trùng vào phòng bảo quản môi trường. Giữ 2 ngày ở 25oC để kiểm tra. 2.4.2. Các thao tác trong phòng cấy - Rửa tay kỹ bằng xà phòng, mặc áo blouse, đeo găng tay, khẩu trang trước khi vào phòng cấy. - Dùng khăn lau tủ cấy bằng cồn 70o. - Bật đèn UV để khử trùng tủ cấy trong 30 phút, xịt cồn bộ dụng cụ cần cấy và cho vào tủ trước. - Sau khi bật UV xong bật quạt khoảng 15 phút và lau tủ cấy lại bằng cồn 70o. - Môi trường và chai mẫu phải lau cồn trước khi đưa vào tủ cấy. - Khi cấy cần tránh quơ tay ngang qua các dụng cụ và mẫu cấy. Hạn chế đi lại trong suốt quá trình cấy. - Hơ miệng chai cấy thật kỹ trước và sau khi cấy. - Dụng cụ sau mỗi lần cấy phải được đốt lại bằng cồn 90o. - Hạn chế nói chuyện trong quá trình làm thí nghiệm. - Sau khi cấy ghi lại ngày tháng, tên giống, để thuận tiện cho việc theo dõi. - Sau khi chấm dứt cấy, cần phải tắt đèn cồn, tắt tủ cấy, làm vệ sinh sạch sẽ. Ngoài ra cần chú ý trong quá trình làm việc, cồn 96o rất dễ cháy do đó phải tuyệt đối thật cẩn thận. 2.4.3. Bố trí thí nghiệm Nghiên cứu gồm 3 thí nghiệm 2.4.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân của cây sùng thảo. Mục đích: Xác định được nồng độ BA thích hợp kết hợp với NAA cho qúa trình nhân chồi cây sùng thảo. Mẫu cấy: Đoạn thân cây sùng thảo in vitro. Tiến hành: Chọn những cây sùng thảo in vitro khỏe mạnh, không bị dị dạng và sinh trưởng bình thường làm vật liệu cấy chuyền vào môi trường nhân chồi. Tiến 32
Đồ án tốt nghiêp̣ hành cắt thân cây thành từng đoạn ngắn rồi cấy trực tiếp vào môi trường MS bổ sung 30 g/l đường sucrose, 8,5 g agar/l, 0,1 mg/l NAA và bổ sung BA với các nồng độ đã bố trí trong bảng 2.1. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố gồm 4 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức lặp lại 12 mẫu cấy. Bảng 2.1. Khảo sát hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) 0,0 A0 (ĐC) 1,0 A1 2,0 A2 3,0 A3 Chỉ tiêu theo dõi: - Tỷ lệ tạo chồi (%). - Khối lượng cụm chồi (g) - Số chồi/mẫu. - Chiều cao chồi hoặc cụm chồi (cm). Đánh giá thí nghiệm sau 4 tuần và số liệu được theo dõi 7 ngày/lần. 2.4.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo Mục đích: Xác định được nồng độ IBA thích hợp cho quá trình tạo rễ của cây sùng thảo in vitro. Mẫu cấy: Các chồi in vitro được tạo ra từ thí nghiệm 1. 33
Đồ án tốt nghiêp̣ Các bước tiến hành: Tách các chồi thu được từ thí nghiệm 1 ra thành từng chồi riêng biệt và đều nhau. Chọn những chồi khỏe mạnh, sinh trưởng bình thường và không bị dị dạng cấy trực tiếp vào bình thủy tinh chứa sẵn môi trường MS bổ sung 30 g/l đường sucrose, 8,5 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính và bổ sung IBA với các nồng độ như bảng 2.2. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 15 mẫu cấy. Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA ảnh hưởng đến quá trình tạo rễ Nghiệm thức Nồng độ IBA (mg/l) B0 (ĐC) 0 B1 0,5 B2 1,0 B3 1,5 B4 2,0 Chỉ tiêu theo dõi: - Số rễ/mẫu. - Chiều dài của rễ (cm). - Số lá của cây. - Chiều cao cây (cm). Đánh giá thí nghiệm sau 4 tuần và số liệu được theo dõi 7 ngày/lần. 34
Đồ án tốt nghiêp̣ 2.4.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của gía thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm Mẫu: Cây con in vitro đã tạo rễ hoàn chỉnh ở thí nghiệm 2. Phương pháp ra cây: Trước khi đưa cây con ra trồng ngoài tự nhiên cần tiến hành huấn luyện cây con quen dần với điều kiện môi trường bên ngoài. Thời gian huấn luyện kéo dài 7 ngày và tăng dần cường độ vào những ngày cuối để tăng nhanh khả năng thích nghi của cây. Sau thời gian huấn luyện, tiến hành ra cây con in vitro cây sùng thảo bằng kẹp, rửa sạch phần thạch còn bám vào cây vì chúng thường là môi trường thích hợp cho nấm bệnh phát triển hoặc côn trùng tấn công. Lựa chọn những cây con khỏe mạnh, sinh trưởng bình thường đem trồng trên các loại giá thể đã bố trí như trong bảng 2.3. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nghiệm thức và 3 lần lặp lại. Mỗi lần lặp lại trồng 30 cây con. Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm Nghiệm thức Giá thể C1 Tro trấu C2 Mụn xơ dừa Tro trấu : Mụn xơ dừa C3 (tỷ lệ 1:1) Chỉ tiêu theo dõi: - Tỷ lệ sống (%). - Tỷ lệ chết (%). - Chiều cao cây (cm). - Số lá/cây. 35
Đồ án tốt nghiêp̣ Đánh giá thí nghiệm sau 4 tuần và số liệu được theo dõi 7 ngày/lần. 36
Đồ án tốt nghiêp̣ CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo Trong nuôi cấy mô thực vật thì quá trình nhân chồi có vai trò quan trọng trong nhân giống in vitro. Nếu tìm ra môi trường nhân chồi thích hợp có thể tạo ra số lượng chồi lớn làm nguyên liệu cho quá trình nhân giống tiếp theo. Nhờ đó mà nhân giống vô tính in vitro có thể đáp ứng nhu cầu về lượng lớn giống cây trồng. Để tăng hệ số nhân chồi, trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích tạo chồi. Auxin và cytokinin là hai nhóm chất kích thích sinh trưởng của thực vật thường có mặt ở tất cả các loại cây trồng, auxin có ở mô phân sinh chồi, lá mầm và rễ còn cytokinin hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ. Theo Sakakibara (2006), cytokinin có vai trò quan trọng và rất đặc trưng trong sự chia tế bào và kích thích sự hình thành chồi. Từ lâu đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng sự cân bằng tỷ lệ giữa auxin và cytokinin có ý nghĩa quyết định dạng phân hóa cơ quan của tế bào thực vật trong quá trình phát sinh hình thái của cây trong nuôi cấy mô in vitro. Nếu tỷ lệ auxin cao hơn cytokinin sẽ kích thích ra rễ, còn tỷ lệ cytokine cao hơn auxin sẽ kích thích sự xuất hiện và phát triển của chồi. BA là một cytokinin có tác dụng tạo chồi mạnh, kích thích sự phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và hạn chế sự già hóa của tế bào. Ngoài ra nó còn có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, tăng cường sự hoạt động của một số enzyme được sử dụng rộng rãi trong các môi trường nhân chồi. Trong nhân giống in vitro, BA có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc kích thích mạnh mẽ sự hình thành chồi non, quyết định hệ số nhân chồi và chất lượng chồi hình thành. Việc kết hợp auxin (NAA) với cytokinin (BA) sẽ giúp tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Mục tiêu của thí nghiệm này là tìm ra nồng 37
Đồ án tốt nghiêp̣ độ BA thích hợp kết hợp với NAA để nhân nhanh chồi với số lượng lớn và đảm bảo sự tương đồng về mặt di truyền. Trong thí nghiệm này, nhóm nghiên cứu chọn lọc những cây sùng thảo in vitro sinh trưởng bình thường, không bị dị dạng và tiến hành cắt phần thân của những cây sùng thảo in vitro thành những đoạn ngắn có kích thước 0,5 – 1 cm, cấy vào môi trường MS bổ sung 30 g/l đường sucose; 8,5 g/l agar; bổ sung NAA cố định ở nồng độ 0,1 ml/l và BA ở các nồng độ 0, 1, 2, 3 ml/l vào môi trường nuôi cấy. Quan sát sau 1 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy đã có sự nảy chồi nhưng không có sự khác biệt về mặt số lượng và hình thái. Đến tuần thứ 4, mẫu cấy phát triển vượt trội, giữa các nghiệm thức có sự khác biệt về số lượng chồi hình thành và hình thái của chồi. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy. Nghiệm Nồng độ Tỷ lệ tạo Số Khối lượng Chiều cao thức BA (mg/l) chồi (%) chồi/mẫu cụm chồi (g) chồi (cm) A0 0 94,5a 1,45d 0,21d 3,47a A1 1 97,47a 10,69b 2,31b 2,11b A2 2 100a 14,59a 3,16a 1,47c A3 3 60,2b 4,8c 1,63c 1,09c CV 3,59 8,21 8,74 8,46 LSD 8,68 1,77 0,59 0,47 Ghi chú: Các ký tự khác nhau theo sau các số liệu trên cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,01. 38
Đồ án tốt nghiêp̣ 100 80 60 % 40 20 0 A0 A1 A2 A3 Tỷ lệ mẫu tạo chồi Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến tỷ lệ tạo mẫu tạo chồi sau 4 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3 tương ứng với nồng độ BA là 0; 1; 2; 3 mg/l) 16 14 12 10 8 6 4 2 0 A0 A1 A2 A3 Khối lượng chồi (g) Chiều cao chồi (cm) Số chồi Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 1; 2; 3 mg/l) 39
Đồ án tốt nghiêp̣ Số liệu thống kê bảng 3.1 và biểu đồ 3.1, biểu đồ 3.2 cho thấy môi trường nuôi cấy khi bổ sung BA thì có sự khác biệt đáng kể giữa các nghiệm thức. Tỷ lệ tạo chồi và số chồi hình thành tăng dần khi tăng nồng độ BA từ 0 đến 2. Đặc biệt là khi bổ sung BA với nồng độ 2 mg/l, mẫu cấy hình thành cụm chồi có kích thước lớn với số lượng chồi nhiều nhất. Ở nghiệm thức A0, trong môi trường không bổ sung BA, sau 4 tuần nuôi cấy mẫu chỉ hình thành chồi đơn với khối lượng trung bình 0,21g, số chồi trung bình là 1,45 chồi/mẫu/ Chồi mọc nhiều lá, lá có kích thước lớn màu xanh thẫm, chồi phát triển khỏe mạnh. Ở nghiệm thức A1, trong môi trường nuôi cấy bổ sung BA với nồng độ 1 mg/l, sau 4 tuần nuôi cấy, mẫu tạo thành cụm chồi có khối lượng trung bình 2,31 g, số chồi hình thành trung bình 10,96 chồi/mẫu. Các chồi có nhiều lá, lá có màu xanh nhạt, chồi phát triển tốt. Ở nghiệm thức A2, khi bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy với nồng độ 2 mg/l cho tỷ lệ tạo chồi đạt 100%. Sau 4 tuần nuôi cấy, hình thành cụm chồi có kích thước lớn, khối lượng cụm chồi trung bình là 3,16 g với số chồi tạo thành nhiều, trung bình 14,59 chồi/mẫu, các chồi có kích thước đồng đều, thân mập và phát triển khỏe mạnh. Ở nghiệm thức A3, khi tăng nồng độ BA bổ sung vào môi trường nuôi cấy lên 3 mg/l cho tỷ lệ mẫu tạo chồi thấp (60,2%). Điều đó cho thấy khi bổ sung BA ở nồng độ cao (3 mg/l) đã ức chế sự hình thành và phát triển nhân chồi của mẫu cấy. Sau 4 tuần nuôi cấy, mẫu chỉ hình thành cụm chồi nhỏ với khối lượng trung bình 1,63 g, số chồi hình thành ít (4,8 chồi/mẫu). Các chồi bé, có chiều cao thấp, lá có màu xanh nhạt, một số lá bị biến dạng. Chồi phát triển chậm. Wei Li và cộng sự (2002) đã nghiên cứu nhân chồi cây sùng thảo trên môi trường MS bồ sung BA với các nồng độ 0; 0,1; 0,5 và 1 mg/l và phát hiện môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA kích thích hình thành và tạo cụm chồi với số chồi trung bình 6,6 chồi/mẫu. 40
Đồ án tốt nghiêp̣ A0 A1 A2 A3 Hình 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo (A0; A1; A2; A3 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 1; 2; 3 mg/l) BA là loại cytokinin có hiệu quả trong việc tạo chồi, nhưng nồng độ sử dụng tùy vào từng bộ phận nuôi cấy và các loại cây khác nhau. Mỗi loại cây cần một nồng độ BA tối ưu để tạo chồi. Nếu sử dụng nồng độ BA cao thì sẽ tạo ra những chồi không bình thường, hay có hiện tượng thủy tinh thể. Còn nếu sự dụng BA ở nồng độ thấp thì hiệu quả nhân chồi không cao. Hu và Wang (1983) cho rằng nồng độ cytokinin cao sẽ làm giảm số lượng chồi sinh sản, khi sử dụng nồng độ BA cao sẽ cho chất lượng chồi không tốt, chồi hình thành dạng hoa thị hoặc có những nốt nhỏ ở cuối gốc. Theo kết quả nghiên cứu của M. P. Legkobit và N. V. Khadeeva (2003) về ảnh hưởng của các phytohormon đến sự biến đổi và đặc tính hình thái của các loài Stachys khác nhau trong quá trình nhân giống in vitro đã chứng minh rằng bổ sung hàm lượng 41
Đồ án tốt nghiêp̣ cytokinin thấp sẽ gây ra ít biến đổi di truyền hơn so với tái sinh từng bước hoặc bổ sung hàm lượng BA cao. Tóm lại: BA kết hợp với NAA có ảnh hưởng tốt đến sự hình thành và nhân chồi in vitro cây sùng thảo. Nồng độ BA phù hợp nhất bổ sung vào môi trường nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo in vitro là 2 mg/l. 3.2. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo in vitro Rễ là một bộ phận quan trọng của cây. Rễ có tác dụng hút nước, muối khoáng và chất dinh dưỡng cung cấp cho cây sinh trưởng và phát triển. Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh nhưng số lượng rễ ít và chất lượng rễ không tốt. Sau khi nhân đủ số lượng chồi cần thiết điều quan trọng là cần phải chuyển chồi sang môi trường ra rễ để tái sinh cây hoàn chỉnh. Quá trình hình thành rễ là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh, có đủ thân, lá và rễ chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao được sức sống khi ra môi trường bình thường do khi di chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm, cây con chịu sự tác động của nhiều yếu tố như: độ ẩm, ánh sáng, nhiệt độ, . Trong quá trình tạo rễ, các chất kích thích tạo chồi sẽ được thay thế bằng các chất kích thích tạo rễ thuộc nhóm auxin. Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng của thực vật thường gặp trong thiên nhiên, có ở mô phân sinh chồi, lá mầm và rễ. Auxin đóng vai trò quan trọng trong trong quá trình hình thành rễ của nhiều loại cây cũng như trong nhân giống in vitro. IBA là chất kích thích sinh trưởng thực vật tổng hợp đầu tiên thuộc nhóm heteroauxin, có nhiều ứng dụng trọng nông nghiệp, lâm nghiệp. IBA có tác dụng kích thích hình thành rễ với nhiều loại cây và được sử dụng rộng rãi nhân giống vô tính. Trong thí nghiệm này, nhóm nghiên cứu tiến hành lựa chọn và tách các chồi nhân được từ thí nghiệm nhân chồi thành các chồi riêng biệt và có kích thước đồng đều cấy vào môi trường MS có bổ sung 30 g đường sucrose; 8,5 g agar/l; 1 mg/l than hoạt tính và bổ sung IBA ở các nồng độ 0; 0,5; 1; 1,5; 2 mg/l. 42
Đồ án tốt nghiêp̣ Mục tiêu của thí nghiệm này nhằm xác định được nồng độ IBA thích hợp cho quá trình tạo rễ của cây sùng thảo in vitro. Theo dõi ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ của chồi in vitro sau 4 tuần nuôi cấy, các kết quả thu được trình bày ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.3. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến quá trình ra rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy. Nghiệm Nồng độ Chiều dài Chiều cao Số rễ/chồi Số lá thức IBA (mg/l) rễ (cm) cây (cm) B0 0 5,59d 4,68d 10,06d 4,19d B1 0,5 9,84bc 10,24bc 13,3c 5,1bc B2 1 11,44ab 12,28b 15,65b 5,57ab B3 1,5 13,63a 15,63a 18,06a 6,18a B4 2 8,23cd 9,4c 9,36d 4,6cd CV 11,13 8,48 5,77 6,11 LSD 2,80 2,29 1,99 0,81 Chú ý: Các ký tự khác nhau theo sau các số liệu trên cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,01. 43
Đồ án tốt nghiêp̣ 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 B0 B1 B2 B3 B4 Số rễ Chiều dài rễ (cm) Số lá Chiều cao cây Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4 tương ứng với nồng độ IBA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2 mg/l) Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.3 cho thấy khi bổ sung IBA vào môi trường nuôi cấy ở các nồng độ khác nhau có ảnh hưởng lớn đến quá trình ra rễ, sự hình thành số lá, chiều cao cây và chiều dài của rễ của chồi in vitro cây sùng thảo. 44
Đồ án tốt nghiêp̣ Ở nghiệm thức B0 (nghiệm thức đối chứng), trong môi trường không bổ sung IBA, các chồi in vitro vẫn có khả năng ra rễ, tuy nhiên số rễ hình thành còn rất ít với số rễ trung bình là 5,59 rễ/chồi và có chiều dải trung bình là 4,68 cm. Rễ có màu trắng, kích thước không đồng đều, rễ ngắn và mảnh. Ở nghiệm thức B1, trong môi trường bổ sung 0,5 mg/l IBA, sau 4 tuần nuôi cấy chồi ra rễ với số rễ hình thành trung bình là 9,84 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình đạt 9,5 cm. Rễ có màu trắng và mảnh. Ở nghiệm thức B2, khi bổ sung vào môi trường 1 mg/l IBA, sau 4 tuần nuôi cấy số rễ hình thành trung bình là 11,44 rễ/ chồi, rễ có chiều dài trung bình 12,28 cm. Rễ có màu trắng, mọc nhiều, có kích thước đồng đều. Ở nghiệm thức B3, trong môi trường bổ sung 1,5 mg/l IBA, sau 4 tuần nuôi cấy, IBA kích thích sự ra rễ từ chồi với số rễ hình thành trung bình 13,63 rễ/chồi, rễ có chiều dài trung bình 15,63 cm. Rễ mọc nhiều, có màu trắng, có kích thước đồng đều và khỏe mạnh. Ở nghiệm thức B4, khi tăng nồng độ IBA bổ sung vào môi trường lên 2 mg/l, quá trình ra rễ của chồi bắt đầu bị ức chế, số rễ hình thành giảm trung bình 8,23 rễ/chồi, rễ mảnh và phát triển không đồng đều với chiều dài trung bình là 10,71 cm. Về sự phát triển chiều cao và số lá của cây con ở từng nghiệm thức cũng có sự khác biệt rõ rệt trong đó ở nồng độ 1,5 mg/l, cây có sự phát triển vượt trội về chiều cao với chiều cao trung bình 6,18 cm và số lá trung bình 18,6 lá/cây. Ngoài vai trò kích thích sự tao rễ auxin còn có tác dụng kích thích phân chia và kéo dài tế bào, giúp tăng trưởng chiều dài thân, lóng và tạo ưu thế ngọn. Tuy nhiên khi bổ sung nồng nồng độ auxin quá cao sẽ gây ức chế sinh trưởng và sự hình thành rễ, làm rễ có khuynh hướng ngắn lại. Tóm lại trong thí nghiệm này, nghiệm thức B3 (môi trường nuôi cấy có bổ sung 1,5 mg/l IBA) là môi trường cho kết quả tạo rễ tốt nhất. 45
Đồ án tốt nghiêp̣ B0 B1 B2 Hình 3.2. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy. (B0; B1; B2; B3; B4 tương ứng với nồng độ IBA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2 mg/l) B3 B4 46
Đồ án tốt nghiêp̣ 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm Giai đoạn chuyển cây in vitro từ phòng thí nghiệm (điều kiện nhân tạo) ra vườn ươm (điều kiện tự nhiên thường gặp rất nhiều khó khăn như: Tỷ lệ cây sống rất thấp, cây sinh trưởng kém và sâu bệnh tấn công . Nguyên nhân do trong giai đoạn nuôi cấy mô, cây con được cung cấp đều đủ chất dinh dưỡng đảm bào cho quá trình sinh trưởng và phát triển bình thường. Vì vậy, khi đưa cây in vitro ra vườn ươm, cây rất mẫn cảm với môi trường và sẽ bị sốc mạnh khi được chuyển qua giai đoạn nuôi trồng ngoài vườn ươm. Trước khi ra ngoài vườn ươm, cần phải tạo cho cây sinh trưởng và thích nghi với điều kiện tự nhiên. Giá thể không chỉ là nơi cây tiếp xúc đầu tiên để cây quen dần với môi trường tự nhiên mà còn là nơi giúp cây bám rễ, đừng vững, dự trữ nước và chất dinh dưỡng để cung cấp dần cho cây sau này. Khi đưa cây ra vườn ươm, giá thể trồng là một trong những yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ sống, thời gian ra lá và sinh trưởng của cây. Vì vậy, giá thể trồng phù hợp có ý nghĩa quyết định đến sự thành công của quy trình nhân giống in vitro. Thí nghiệm sử dụng các cây sùng thảo in vitro đã tạo rễ hoàn chỉnh ở thí nghiệm 2, lựa chọn những cây con in vitro có kích thước tương đồng (chiều cao 5 – 6 cm, có 15 – 18 lá) đem trồng trên 3 loại giá thể khác nhau. Sau 4 tuần theo dõi kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3.3, biểu đồ 3.3 và biểu đồ 3.4. 47
Đồ án tốt nghiêp̣ Bảng 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn ngoài vườn ươm Tỷ lệ Nghiệm Số cây Tỷ lệ Chiều cao Giá thể chết Số lá thức trồng sống (%) cây (cm) (%) C1 Tro trấu 90 10,74c 90,67a 5,5c 14,86c C2 Mụn xơ dừa 90 94,01a 6,30c 7,80a 23,55a Mụn xơ dừa + C3 90 59,26b 40,74b 6,72b 19,59b Tro trấu (1:1) CV 8,78 10,49 4,93 5,12 LSD 14,54 14,58 0,99 2,99 Chú ý: Các ký tự khác nhau theo sau các số liệu trên cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,01. 100 90 80 70 60 % 50 40 30 20 10 0 C1 C2 C3 Tỷ lệ sống Tỷ lệ chết Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm 48
Đồ án tốt nghiêp̣ 25 20 15 10 5 0 C1 C2 C3 Chiều cao cây Số lá Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm Kết quả bảng 3.3 và biểu đồ 3.4, biểu đồ 3.5 cho thấy các loại giá thể khác nhau sử dụng để ươm cây có ảnh hưởng rất lớn đến tỷ lệ sống và khả năng sinh trưởng của cây in vitro trong giai đoạn vườn ươm. Trong 3 loại giá thể nghiên cứu thì giá thể mụn xơ dừa cho tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây sùng thảo vượt trội hơn hẳn so với các giá thể khác. Trên giá thể này, tỷ lệ cây sống đạt cao nhất 94,01 %, sau khi trồng một tuần cây bắt đầu bén rễ và thích ứng với điều kiện sống bên ngoài. Sau 4 tuần trồng, cây phát triển nhanh chóng, cây có sức sống tốt. Khi phối trộn giá thể mụn xơ dừa và tro trấu với nhau theo tỷ lệ 1: 1 chỉ cho tỷ lệ cây sống ở mức trung bình 59,26 %, cây bắt đầu có dấu hiệu chết dần sau một tuần ươm cây. Sau 4 tuần trồng, những cây còn sống có sức sống yếu, cây còi cọc và chậm phát triển. Sử dụng giá thể trấu hun để ươm cây giống sùng thảo 49
Đồ án tốt nghiêp̣ in vitro tỏ ra không phù hợp. Tỷ lệ sống thấp 10,74 %, sau khi trồng 2 - 3 ngày, cây bắt đầu chết dần, những cây còn sống có sức sống kém và chậm phát triển. Theo dõi về chỉ tiêu sinh trưởng của cây sùng thảo in vitro trên các loại giá thể cũng có sự khác biệt. Trồng cây con in vitro trên giá thể mụn xơ dừa, chỉ tiêu sinh trưởng của cây đạt giá trị cao nhất với chiều cao trung bình 7,80 cm và số lá trung bình 23,55 lá/ cây. Thân cây khỏe mạnh và cao ráo, lá màu xanh đậm và có kích thước lớn, cây phát triển tốt. Trên giá thể tro trấu, sự tăng trưởng của cây sùng thảo in vitro rất kém với chiều cao cây trung bình 5,5 cm, số lá trung bình 14,86 lá/ cây. Thân cây còi cọc, chậm lớn, lá có màu vàng xanh. Khi phối hợp giá thể tro trấu và mụn xơ dừa với nhau theo tỷ lệ 1: 1, các chỉ tiêu sinh trưởng của cây in vitro đạt mức trung bình với chiều cao cây 6,72 cm và số lá là 19,59 lá/ cây. Kết quả thu được có sự khác biệt ở các loại giá thể trồng là do tính chất khác nhau của từng loại giá thể. Giá thể mụn xơ dừa có tính chất tơi xốp nên kích thích cây con phát triển, tránh được hiện tượng gây nghẹt rễ con. Mụn xơ dừa cũng có tính giữ ẩm tốt nên hạn chế được việc mất nước, nhất là lúc trưa năng, tránh cho cây con bị chết vì mất nước. Hơn nữa mụn xơ dừa khá sạch nên hạn chế được các mầm bệnh tấn công cây con. Ngoài ra trong giá thể xơ dừa còn chứa các chất hữu cơ tự nhiên tốt cho cây trồng, giúp cây tăng trưởng nhanh. Giá thể tro trấu mặc dù thoáng khí nhưng khi tưới nước, nước thường thoát đi rất nhanh vì giá thể không có khả năng giữ ẩm tốt, dễ khiến cây bị mất nước mà chết. Tro trấu còn kém chất dinh dưỡng và có tính hấp thụ nhiệt vì có hàm lượng carbon cao, không tốt cho rễ cây vào những ngày nắng nóng. Mặt khác, trong giai đoạn đầu ở vườn ươm, cây giống in vitro không có nhu cầu cần nhiều chất dinh dưỡng mà yếu tố quyết định là độ ẩm, nhiệt độ và ánh sáng để cây có thể thích nghi và ra rễ mới. 50
Đồ án tốt nghiêp̣ C1 C2 C3 Hình 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm (C1; C2; C3 tương ứng với các loại giá thể: tro trấu, mụn xơ dừa, tro trấu + mụn xơ dừa tỷ lệ 1:1) Tóm lại, trong 3 loại giá thể thí nghiệm, giá thể phù hợp nhất để ươm cây sùng thảo in vitro là giá thể mụn xơ dừa. Giá thể tro trấu tỏ ra không phù hợp vì tỷ lệ cây chết cao, cây có sức sống yếu và chậm phát triển. 51
Đồ án tốt nghiêp̣ CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Từ kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo, đưa ra một số kết luận sau: - Khi khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo, môi trường MS bổ sung 30 g/l đường sucrose, 8,5 g/l agar, 0,1 mg/l NAA kết hợp với 2 mg/l BA là thích hợp nhất để nhân chồi. Tỷ lệ mẫu tạo chồi và số chồi/mẫu cao nhất lần lượt là 100 % và 14,59 chồi/mẫu. - Khi khảo sát ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây sùng thảo, môi trường MS bổ sung 30 g/l đường sucrose, 8,5 g/l agar, 1 mg/l than hoạt tính và 1,5 mg/l IBA là thích hợp nhất để tạo rễ. Số rễ hình thành cao nhất là 13,63 rễ/chồi. - Khi khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo in vitro ngoài vườn ươm, mụn xơ dừa là giá thể phù hợp nhất để ươm cây. Tỷ lệ cây sống đạt cao nhất 94,01 %. Cây có sức sống tốt, phát triển nhanh và đồng đều. 4.2. Kiến nghị Do thời gian thực hiện đồ án có hạn nên chưa thể thực hiện thêm nhiều nghiên cứu sâu hơn, vì vậy chúng tôi có những kiến nghị sau: - Khảo sát ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác để tăng số lượng chồi và số rễ hình thành. - Khảo sát các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, ảnh hưởng đến khả năng tạo chồi, nhân chồi và tạo rễ. - Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như thời vụ, phân bón, đến sự sinh trưởng và phát triển của cây sùng thảo ngoài vườn ươm. 52
Đồ án tốt nghiêp̣ TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu Tiếng Việt [1]. Dương Công Kiên, (2003), Nuôi cấy mô thực vật II, NXB Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh. [2]. Dương Tấn Nhựt (2007), Công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông Nghiệp. [3]. Dương Tấn Nhựt (2009), Công nghệ sinh học thực vật (Tập 2), NXB Nông Nghiệp. [4]. Dương Tấn Nhựt (2011), Công nghệ sinh học thực vật: Nghiên cứu cơ bản và ứng dụng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. [5]. Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch (1993), Chất điều hòa sinh trưởng đối với cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. [6]. Lê Văn Hoàng (2008), Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật, NXB Đà Nẵng. [7]. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2011), Công nghệ tế bào, NXB Đại học Quốc gia TP. HCM. [8]. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu ứng dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. [9]. Nguyễn Quang Thạch (2001), Công nghệ sinh học trong trồng trọt – Giáo trình sau Đại học. [10]. Trần Văn Minh (1997), Nuôi cấy mô thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 2. Tài liệu Tiếng Anh [1]. Anulov, O.V., Shcherbukhin, V.D., and Kononkov, P.F., Characterization of the Mono- and Oligosaccharide Compositions for Tubers of Stachys sieboldii Miq., Tezisy dokladov II Mezhdunarodnogo Simpoziuma “Novye i netraditsionnye rasteniya i perspektivy ikh ispol’zovaniya” (Proc. II Int. Symp. “New and Unusual Plants and Prospects of Their Use”), Pushchino, 1997, vol. 2, pp. 16–17. 53
Đồ án tốt nghiêp̣ [2]. Bhojwani S. S., and M. K. Razdan. (1996), Plant Tissue Culture: Theory and Practice, Elsevier science B.V, Amsterdam, The Neitherlands, pp. 766. [3]. Cakir, A., Duru, M.E., Harmandar, M., Izumi, S, Hirata, T., 1997. The volatile constituents of Stachys recta L. and Stachys balansae L. from Turkey. Flavour Frag. J. 12, 215–218. [4]. Conforti, F., Menichini, F., Formisano, C., Rigano, D., Senatore, F., Arnold, N.A., Piozzi, F., 2009. Comparative chemical composition, free radical- scavenging and cytotoxic properties of essential oils of six Stachys species from different regions of the Mediterranean Area. Food Chem. 116, 898–905. [5]. Derkach, A.I., 1998. Biologically active substances of some species of the genus Stachys L. of the flora of the Ukraine. Rastitel’nye Resursy 34, 57–61. [6]. Fazio, C., Passannanti, S., Paternostro, M.P., Piozzi, F., 1992. Neo-clerodane diterpenoids from Stachys rosea. Phytochemistry 31, 3147–3149. [7]. Flamini, G., Cioni, P.L., Morelli, I., Celik, S., Gokturk, R.S., Unal, O., 2005. Essential oil of Stachys aleurites from Turkey. Biochem. Syst. Ecol. 33, 61–66. [8]. Goren, A.C., Akçicek, E., Dirmenci, T., Kilic, T., Moziog˘lu, E., Yilmaz, H., 2012. Fatty acid composition and chemotaxonomic evaluation of species of Stachys. Nat. Prod. Res. 26, 84–90. [9]. Goren, A.C., Piozzi, F., Akçicek, E., Kilic, T., Carikc, S., Moziog˘lu, E., Setzer, W.N., 2011. Essential oil composition of twenty-two Stachys species (mountain tea) and their biological activities. Phytochem. Lett. 4, 448–453. [10]. Hayashi K, Nagamatsu T, Ito M, Hattori T, Suzuki Y. 1994. Acteoside, a component of Stachys sieboldii Miq, may be a promising antinephritic agent (2): Effect of acteoside on leukocyte accumulation in the glomeruli of nephritic rats. Jpn J Pharmacol 66: 47–52. [11]. Hazarika B. N. (2003), Acclimatization of tissue culture plants, Devision of Horticulture, ICAR Research complex, uniam 793 103, India, pp 1704 - 1712. [12]. Horst R.K. (1990), Handbook of plant cell culture, Vol5, New York, pp. 215 - 217. 54
Đồ án tốt nghiêp̣ [13]. Kai Feng, Wei Chen, Liwei Sun, Jianzeng Liu, YangxinZhao, Luxi Ki, Yuxing Wang, WenjingZhang (2014), Optimization extraction, preliminary characterization and antioxidantactivity in vitro of polysaccharides from Stachys sieboldii Miq. Tubers. Carbohydrate Polymers 125 (2015) 45–52. [14]. Kartsev, V.G., Stepanichenko, N.N., and Auelbekov, S.A., Chemical Composition and Pharmacological Properties of Plants of the Genus Stachys, Khim. Prirod. Soed., 1994, vol. 30, no. 6, pp. 699–709. [15]. Khadeeva, N.V., Degtyarenko, L.V., Gordon, N.Yu., and Yakovleva, E.Yu., Introduction of Stachys sieboldii Miq. in an in Vitro Culture, Fiziol. Rast. (Moscow), 1995, vol. 42, no. 6, pp. 923–928. [16]. Keller F (1992) Transport of stachyose and sucrose by vacuole of Japanese artichoke (Stachys sieboldii). Plant Physiol 98: 442 – 445. [17]. .Kostyuchenko, O.I., Chemical Composition and Pharmacological Properties of Stachys L. Species, Rast. Resursy, 1983, vol. 19, no. 3, pp. 407–413. [18]. Lee, H.J., Kim, K.W., 2012. Anti-inflammatory effects of arbutin in lipopolysaccharide - stimulated BV2 microglial cells. Inflamm. Res. 61, 817– 825. [19]. Legault, J., Pichette, A., 2007. Potentiating effect of beta-caryophyllene on anticancer activity of alpha-humulene, isocaryophyllene and paclitaxel. J. Pharm. Pharmacol. 59, 1643–1647. [20]. Mamaril J. C., A. M. Lopez. (1997), Comparative effect of coconut water growth hormone extracts on the growth of reflasked Vanda, Phalaenopsis (grandiflora) and Dendrobium protocorms, Philippine journal of coconut studies, 23. [21]. Mantell S. H., J. A. Mathews, and R. A. McKee. (1985), Principles of Plant Biotechnology, Blackwell Scientific Publications, Oxford. [22]. M. P. Legkobit and N. V. Khadeeva (2004), M. P. Legkobit and N. V. Khadeeva. (2004), Variation and Morphogenetic Characteristics of Different 55
Đồ án tốt nghiêp̣ Stachys Species during Microclonal Propagation, Russian Journal of Genetics, Vol. 40, No. 7, pp 916 – 924. [23]. Murashige T. and F. Skoog. (1962), A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures, Physiol. Plant, 15, pp. 473-497. [24]. Murashige T. (1974), Plant propagation through tissue culture, Annu. Rev. Plant Phys, 25, pp. 135-166. [25]. Nishimura, H. Sasaki, H. Inagaki, N., et al., Nine Phenethyl Alcohol Glycosides from Stachys sieboldii, Phytochemistry, 1991, vol. 30, no. 3, pp. 965–969. [26]. Salmaki, Y., Zarre, S., Ryding, O., Lindqvist, C., Bräuchler, C., Heubl, G., et al. (2013). Molecular phylogeny of tribe Stachydeae (Lamiaceae subfamily Lamioideae). Molecular Phylogenetics and Evolution, 69, 535–551. [27]. Skoog F., and C.O. Miller. (1957), Chemical regulation of growth and organ formation plant tissue cultured in vitro, Symp. Soc. London, 114, pp. 317-339. [28]. Takeda Y, Fujita T, Satoh T, Kakegawa H. 1985. On the glycosidic constituents of Stachys sieboldi Miq. and their effects on hyaluronidase activity. Yakugaku Zasshi 105: 955–959. [29]. Tundis, R., Peruzzi, L., & Menichini, F. (2014). Phytochemical and biological studiesof Stachys species in relation to chemotaxonomy: A review. Phytochemistry, 102, 7–39. [30]. Vince-Pure D. (1994), Photomorphogenesis and plant development. In: Lumsden PJ, Nicholas JR and Davies WJ [eds.], Physiology, growth and development of plants in culture, 19-30, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. [31]. White P. R. (1943), Nutrient deficiency studies and improved inorganic nutrients for cultivation of excised tomato roots, Growth, 7, pp. 53 - 65. [32]. Yamahara J, Kitani T, Kobayashi H, Kawahara Y. 1990. Studies on Stachys sieboldii Miq. II. Anti-anoxia action and the active constituents. Yakugaku Zasshi 110: 932–935 56
Đồ án tốt nghiêp̣ [33]. Yin, J., Yang, G., Wang, S., Chen, Y., 2006. Purification and determination of stachyose in Chinese artichoke (Stachys Sieboldii Miq.) by high-performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection. Talanta 70, 208–212. [34]. Yildiz M. (2012), The Prerequisite of the Success in Plant Tissue Culture: High Frequency Shoot Regeneration In Recent Advances in Plant in vitro Culture, in the book "Recent Advances in Plant in vitro Culture", edited by Annarita Leva and Laura M. R. Rinaldi, ISBN 978-953-51-0787-3. [35]. Ueno Y, T. Ikami, R. Yamauchi, and K. Kato: Purification and some properties of a-galactosidase from tubers of Stachys affinis. Agric. BioI. Chern. 44, 2623- 2629 (1980). 57
Đồ án tốt nghiêp̣ PHỤ LỤC Phu ̣luc̣ A: Thành phần môi trường MS Bảng 1. Thà nh phần khoá ng cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) Khoá ng đa lương̣ mg/l mM NH4NO3 1.650 20,6 KNO3 1.900 18,8 CaCl2.2H2O 440 3,0 MgSO4.7H2O 370 1,5 KH2PO4 170 1,25 Khoá ng vi lương̣ mg/l µM KI 0,83 5,0 H3BO3 6,2 100 MnSO4.4H2O 22.3 100 ZnSO4.7H2O 8,6 30 Na2MoO4.2H2O 0,25 1,0 CuSO4.5H2O 0,025 0,1 CoCl2.6H2O 0,025 0,1 Na2.EDTA 37,3 100 FeSO4.7H2O 27,8 100 Bảng 2. Thà nh phần vitamin của Morel Vitamin mg/l µM Pyridoxine HCl (B6) 1,0 2,5 Biotin (H) 0,01 0,5 Myo-Inositol 100 555 Nicotinic acid (PP) 1,0 4 Thiamine HCl) 1,0 0,3 Pantotheate 1,0 3,2 1
Đồ án tốt nghiêp̣ Phụ lục B: Quy trình nhân giống cây sùng thảo (Stachys affinis) HgCl2 0,1 % + môi trường MS MS + 2 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA MS + 1,5 mg/l IBA + 1 mg/l than hoạt tính 100 % giá thể mụn xơ dừa 2
Đồ án tốt nghiêp̣ Phụ lục C: Bảng số liệu được xử lí thống kệ bằng phần mềm SAS 9.4 1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo a. Tỷ lệ tạo chồi TY LE TAO CHOI THE ANOVA Procedure 2. Class Level Information Class Levels Values NTHUC 4 A0 A1 A2 A3 Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 TY LE TAO CHOI THE ANOVA Procedure Dependent Variable: TYLETAOCHOI Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 3146.102500 1048.700833 104.60 F NTHUC 3 3146.1025 1048.700833 104.60 <.0001 00 3
Đồ án tốt nghiêp̣ TY LE TAO CHOI The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TYLETAOCHOI Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 10.02573 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 8.6747 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NTHUC A 100.000 3 A2 A A 97.467 3 A1 A A 94.500 3 A0 B 60.200 3 A3 b. Số chồi SO CHOI THE ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NTHUC 4 A0 A1 A2 A3 Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 4
Đồ án tốt nghiêp̣ SO CHOI THE ANOVA Procedure Dependent Variable: SOCHOI Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 311.2038667 103.7346222 247.41 F NTHUC 3 311.2038667 103.7346222 247.41 <.0001 SO CHOI The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SO CHOI Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.419275 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 1.774 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NTHUC A 14.5933 3 A2 B 10.6867 3 A1 C 4.8000 3 A3 D 1.4533 3 A0 5
Đồ án tốt nghiêp̣ c. Khối lượng chồi SO CHOI THE ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NTHUC 4 A0 A1 A2 A3 Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 KHOI LUONG CHOI THE ANOVA Procedure Dependent Variable: KHOILUONGCHOI Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 29.96206667 9.98735556 215.48 F NTHUC 3 29.96206667 9.98735556 215.48 <.0001 KHOI LUONG CHOI The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for KHOILUONGCHOI Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.04635 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 0.5898 6
Đồ án tốt nghiêp̣ Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NTHUC A 3.1633 3 NT2 B 2.3067 3 NT1 C 1.6333 3 NT3 D 0.2100 3 DC d. Chiều cao chồi CHIEU CAO CHOI THE ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NTHUC 4 A0 A1 A2 A3 Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 CHIEU CAO CHOI THE ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUCAOCHOI Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 9.79136667 3.26378889 109.62 <.0001 Error 8 0.23820000 0.02977500 Corrected Total 11 10.02956667 R-Square Coeff Var Root MSE CHIEUCAOCHOI Mean 0.976250 8.465462 0.172554 2.038333 7
Đồ án tốt nghiêp̣ Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NTHUC 3 9.79136667 3.26378889 109.62 <.0001 CHIEU CAO CHOI The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for CHIEUCAOCHOI Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.029775 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 0.4727 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NTHUC A 3.4700 3 A0 B 2.1133 3 A1 C 1.4767 3 A2 C C 1.0933 3 A3 2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ cây sùng thảo a. Số rễ SO RE THE ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NTHUC 5 B0 B1 B2 B3 B4 8
Đồ án tốt nghiêp̣ Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 SO RE THE ANOVA Procedure Dependent Variable: SORE Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 112.4428267 28.1107067 23.89 F NTHUC 4 112.4428267 28.1107067 23.89 <.0001 SO RE The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SORE Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 1.176813 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 2.8072 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NTHUC A 13.6267 3 B3 A B A 11.4400 3 B2 B B C 9.8400 3 B1 9