›

Đồ án Tổng quan về các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nhân tạo lan hồ điệp (Phalaenopsis sp.)

pdf 60 trang thiennha21 12/04/2022 7370
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Tổng quan về các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nhân tạo lan hồ điệp (Phalaenopsis sp.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_tong_quan_ve_cac_yeu_to_anh_huong_den_qua_trinh_tao_ha.pdf

Nội dung text: Đồ án Tổng quan về các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nhân tạo lan hồ điệp (Phalaenopsis sp.)

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN VỀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TẠO HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis sp.) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Sinh viên thực hiện : QUÁCH VĂN HẢO MSSV: 106111004 Lớp: 07DSH1 TP. Hồ Chí Minh, 2014
  2. LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập ở trường, có những khó khăn em gặp phải mà tự bản thân em thấy gần như mình sụp đổ. Khi đó, bên cạnh sự bao bọc của gia đình còn có sự hướng dẫn và giúp đỡ tận tình của nhà trường, các thầy cô đã giúp em vượt qua được những khó khăn để hoàn thành khóa học ngày hôm nay. Em xin chân thành biết ơn sâu sắc đến tất cả mọi người và sẽ cố gắng để đạt được những thành công trong cuộc sống của mình. Cảm ơn cha mẹ - người đã sinh thành, nuôi nấng và hi sinh cho con được ăn học dù cho con có vấp ngã cha mẹ vẫn luôn bao dung trở che cho con được bước tiếp trên con đường học vấn và trên trường đời. Cảm ơn ban lãnh đạo nhà trường đã tạo điều kiện giúp đỡ cho e được có cơ hội sửa sai và hoàn thành khóa học của mình. Cảm ơn các thầy cô phòng tư vấn và giải quyết học vụ đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong các thủ tục học vụ. Cảm ơn ban lãnh đạo khoa, các thầy cô khoa CNSH – TP – MT cùng các thầy cô bộ môn liên quan khác trong nỗ lực giảng dạy và giúp đỡ chúng em học tốt, tiếp thu những kiến thức để trang bị cho bản thân khi ra đời và đi làm việc. Em cảm ơn rất nhiều sự giúp đỡ tận tình của hai cô thư ký khoa : cô Yến Ly và cô Vân đã hướng dẫn và giúp đỡ em cách giải quyết khi em gặp phải những khó khăn trong việc học của mình. Cảm ơn cô Nguyễn Thị Thu Hương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong việc chọn đề tài và làm đồ án tốt nghiệp. Cảm ơn những người bạn, những người anh em đã giúp đỡ, động viên và tiếp thêm sức mạnh tinh thần để em có thể tự tin hơn về bản thân về cuộc sống để tiếp tục học tập. TP.HCM, ngày 28 tháng 07 năm 2014 Sinh viên Quách Văn Hảo
  3. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN Trang MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi PHẦN I: MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Đối tượng nghiên cứu 2 3. Phạm vi nghiên cứu 5 4. Mục tiêu nghiên cứu 5 5. Phương pháp nghiên cứu 5 6. Các kết quả đạt được của đề tài 5 7. Kết cấu của ĐATN (Đồ án tốt nghiệp) 5 PHẦN II: NỘI DUNG 7 CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÝ THUYẾT 7 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 7 1.1.1. Tổng quan về cây lan Hồ Điệp 7 1.1.1.1. Vị trí phân loại 7 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái - sinh lý 9 1.1.1.3. Các điều kiện thích hợp cho cây lan Hồ Điệp 10 1.1.2. Tình hình sản xuất lan Hồ Điệp trên thế giới và ở Việt Nam 11 1.1.2.1. Tình hình sản xuất hoa Lan trên thế giới 11 1.1.2.2. Tình hình sản xuất hoa Lan ở Việt Nam 12 1.2. Tổng quan về các vấn đề nghiên cứu 13 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu về hạt nhân tạo 13 i
  4. Đồ án tốt nghiệp 1.2.1.1. Trên thế giới 13 1.2.1.2. Trong nước 14 1.2.2. Tình hình nghiên cứu về hạt nhân tạo 14 1.2.3. Tổng quan về quy trình tạo hạt nhân tạo 16 1.2.3.1. Các nguồn mẫu làm hạt nhân tạo 16 1.2.3.2. Vật liệu làm vỏ bọc cho hạt nhân tạo 18 1.2.4. Ưu nhược điểm của hạt nhân tạo 19 1.2.5. Ứng dụng của hạt nhân tạo 20 1.2.6. Giới thiệu một số công nghệ vi nhân giống khác 20 1.2.6.1. Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng 21 1.2.6.2. Công nghệ nuôi cấy lỏng lắc 21 1.2.6.3. Hệ thống bình nuôi cấy Bioreactor 22 1.2.6.4. Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời TIS (Temporary Immersion System) 23 CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH TẠO HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP 25 2.1. Kỹ thuật phát sinh phôi soma, PLB chuẩn bị mẫu cho tạo hạt nhân tạo 25 2.1.1. Kỹ thuật phát sinh phôi soma 25 2.1.1.1. Phát sinh và tăng sinh mô sẹo 25 2.1.1.2. Phát sinh phôi soma 27 2.1.2. Kỹ thuật phát sinh PLB 28 2.2. Quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp 30 2.2.1. Sơ đồ quy trình 30 2.2.2. Thuyết minh quy trình 31 2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình tạo hạt nhân tạo 35 CHƯƠNG 3: CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ ĐẾN QUY TRÌNH TẠO HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP 36 3.1. Các kết quả nghiên cứu về tạo mô sẹo và tạo phôi vô tính 36 3.2. Các kết quả nghiên cứu về tạo PLB 42 3.3. Các kết quả nghiên cứu về tạo chồi 42 ii
  5. Đồ án tốt nghiệp 3.4. Các kết quả nghiên cứu về tạo hạt nhân tạo 44 PHẦN III: KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 47 1. Kết luận về quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp 47 2. Những nhân tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp 48 3. Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 iii
  6. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxyacetic. BAP (BA): 6-benzylaminopurine hoặc benzyladenine. ĐHST: Chất điều hòa sinh trưởng thực vật. GA3: Giberellin. Kinetin: 6-furfurylaminopurine hoặc N-(2-furanylmethyl)-1H-purine-6-amine . MS: (Murashige và Skoog, 1962). NAA: α-Naphthaleneacetic acid . NSC: Thời gian hình thành mô sẹo, tính từ ngày cấy chuyền đến khi có 50% mẫu cấy xuất hiện mô sẹo. PLB: Protocorm like body. TDZ: (Thidiazuron [1-phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)urea]). VW: (Vacin và Went, 1949). Zeatin: 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine hoặc 6-(4-hydro-3- methylbut-2-enyl)-aminopurine hoặc 2-methyl-4(-1H-purine-6-ylamino)-2-buten-1- ol). iv
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thành phần khoáng cơ bản của môi trường MS 29 Bảng 2.2: Thành phần khoáng cơ bản của môi trường VW 29 v
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1: Một số hình ảnh về các loài hoa lan Hồ Điệp 4 Hình 1.1: Một số loài hoa lan Hồ Điệp 9 Hình 1.2: Cấu tạo của hạt nhân tạo 16 Hình 1.3: Phôi hình cầu, hình tim, hình thủy lôi 17 Hình 1.4: Hình dạng của PLB quan sát dưới kính hiển vi soi nổi 18 Hình 1.5: Công thức hóa học của alginate 19 Hình 1.6: Hệ thống vi nhân giống quang tự dưỡng 21 Hình 1.7: Hệ thống Bioreactor 23 Hình 2.1: Quy trình nhân giống lan Hồ Điệp bằng nuôi cấy phát hoa 25 Hình 2.2: Sơ đồ quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp 30 Hình 2.3: Mô sẹo lan Hồ Điệp 31 Hình 2.4: Phôi vô tình hình thành từ mô sẹo lan Hồ Điệp 32 Hình 2.5: PLB lan Hồ Điệp 32 Hình 2.6: Mẫu và alginate được hút đồng thời vào pipette 33 Hình 2.7: Cho alginate nhỏ giọt rồi thêm mẫu vào 34 Hình 2.8: Hạt nhân tạo 34 Hình 3.1: Màu sắc mô sẹo trên môi trường có 2,4-D và BA 37 Hình 3.2: Mô sẹo lan Hồ Điệp trên môi trường TDZ 2mg/l 38 Hình 3.3: Phôi lan Hồ Điệp hình thành trên môi trường đặc ½VW 39 Hình 3.4: Chồi hình thành từ PLB lan Hồ Điệp 43 Hình 3.5: Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ mô sẹo 43 Hình 3.6: Hạt nhân tạo lan Hồ Điệp ở các nồng độ alginate 44 Hình 3.7: Hạt nhân tạo nảy mầm 45 vi
  9. Đồ án tốt nghiệp PHẦN I: MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Từ lâu hoa Lan đã được tôn vinh là “Mỹ Nữ Sơn Lâm” của các loài hoa. Hoa Lan đẹp trang nhã bởi màu sắc, kiểu dáng, sức sống và độ bền của hoa. Có lẽ cũng chính vì thế mà hoa Lan đã trở thành biểu tượng của sự cao quý, lịch lãm, phong lưu của cái đẹp và sự thuần khiết. Trong dân gian đã lưu truyền nhiều câu chuyện có liên quan đến loài hoa này. Người đầu tiên ca ngợi hoa Lan là đức Khổng Phu Tử (Trung Quốc - 551 B.C), ví hoa Lan là loài hoa quân tử Tương truyền nước ta cũng có kể rằng: khi vua Trần Nhân Tông rời kinh thành về Yên Tử, Quảng Ninh trong đêm ngủ mộng ngài thấy có người đến yết kiến và dâng tặng một giò hoa rất đẹp. Sáng ra nghi nghi hoặc hoặc nhà vua đi sâu vào trong núi thì bắt gặp tại một khe sâu có một loài hoa lạ, đẹp và vô cùng thuần khiết. Đời sau người ta gọi loài hoa này là lan Trần Mộng (giấc mộng của vua Trần) để chỉ điển tích rũ sạch bụi trần bước vào cõi thuần khiết của ngài. Khi đời sống kinh tế của người dân dần được nâng cao, việc chăm sóc cho đời sống tinh thần cũng được quan tâm hơn. Đối với những gia đình, cá nhân ở nơi đô thị chật hẹp mong muốn được đưa một chút màu xanh, một chút không khí của thiên nhiên cũng như việc trưng bày trang trí vào không gian sống của mình thì lựa chọn trồng hoa Lan rất được quan tâm. Ngày nay, chúng ta có thể thấy hoa Lan ở khắp mọi nơi và dễ bị choáng ngợp trước vẻ đẹp quyến rũ, biến hóa muôn màu muôn vẻ của các loài hoa Lan như: Hồ Điệp, Mokara, Vanda, Cymbidium, Oncidium, Địa Lan, Vũ nữ Ở Việt Nam nghề trồng Lan phát triển chậm hơn so với các nước khác rất nhiều. Việc trồng Lan lâu nay chủ yếu là do tự phát nên diện tích trồng còn nhỏ và trình độ tay nghề của người nông dân chưa đồng đều, ngoài ra người trồng Lan vẫn chưa chủ động được nguồn giống vì vậy việc trồng Lan gặp rất nhiều khó khăn đặc biệt là trồng lan Hồ Điệp. Loại Lan này trồng rất khó và phải đầu tư lớn, từ việc 1
  10. Đồ án tốt nghiệp cung cấp dưỡng chất và giữ ẩm cho cây đến thiết bị nhà ươm, chăm sóc đều phải nhập ngoại và chịu thuế cao. Đặc biệt, cây lan Hồ Điệp cần ít nhất hai năm mới cho thu hoạch. Trước xu hướng phát triển của thị trường và các nước trồng Lan thì sản phẩm hoa Lan được sản xuất ra ngày càng nhiều dẫn đến bão hòa thị trường và vì thế lợi nhuận thu được không tương xứng với công sức bỏ ra. Trước tình hình đó, trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, ngành vi nhân giống cây đặc biệt trên đối tượng cây hoa Lan cũng từng bước được phát triển. Nhiều đơn vị nhà nước cũng như tư nhân đã mạnh dạn đầu tư để sản xuất cây giống phục vụ cho nông dân. Đã có nhiều công trình nghiên cứu nuôi cấy in vitro lan Hồ Điệp nhằm tạo ra nguồn hoa mới ổn định. Từ nuôi cấy mô, nguồn gene từ các dòng Lan sưu tập sẽ được lưu giữ lại để nâng cao chất lượng giống đồng thời tổ chức nhân nhanh để cung cấp giống cho nhu cầu thị trường trong và ngoài nước. Quy trình nuôi cấy in vitro từ đỉnh sinh trưởng hay điểm sinh trưởng tạo ra những cây con đồng tính trạng, có sự tăng trưởng và chất lượng hoa đồng đều. Tuy đã có một số thành tựu đáng kể nhưng thực tế vẫn còn nhiều hạn chế như không thể thực hiện trên quy mô lớn, việc vận chuyển tới tay người nông dân và nơi gieo trồng còn nhiều khó khăn. Các nghiên cứu về “Kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.)” có thể khắc phục một số hạn chế của nuôi cấy in vitro nói trên. Đề tài “Tổng quan về các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.)” với mong muốn hoàn thiện hơn cho quy trình tạo hạt nhân tạo, góp một phần vào nền công nghiệp sản xuất hoa lan Hồ Điệp. 2. Đối tượng nghiên cứu Hoa Lan là một món quà của tạo hóa, nó không chỉ là một loài hoa đẹp có giá trị về mặt tinh thần mà còn có giá trị kinh tế cao và hiện đang có thị trường tiêu thụ mạnh trong nước cũng như xuất khẩu. Trong đó lan Hồ Điệp rất được ưa chuộng và được trồng khá phổ biến bởi các đặc điểm về màu sắc hoa, cấu trúc hoa, nhánh hoa, vòi hoa và gần đây là các giống có hương thơm. Đặc biệt, hoa lan Hồ Điệp có độ bền cao nên có thể thu hoạch ở dạng cắt cành, việc này đã đóng góp một 2
  11. Đồ án tốt nghiệp phần đáng kể vào nền công nghiệp sản xuất hoa Lan cắt cành cũng như sản xuất cây cảnh nói chung. Hiện nay trên thế giới, các công trình nghiên cứu về phôi soma đã đạt được những thành công nhất định trên thực vật hai lá mầm, trong khi ở những cây một lá mầm vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Từ kết quả thu nhận được trong việc tạo phôi soma cây lan Hồ Điệp chúng ta đi xa hơn nữa bằng cách sử dụng các phôi soma đó để tạo hạt nhân tạo. Công nghệ tạo hạt nhân tạo là phương pháp tạo một dạng hạt mô phỏng hạt tự nhiên, có một phôi sinh dưỡng hoặc chồi ngủ được bọc trong một lớp dung dịch alginate (một chất có tác dụng tạo lớp vỏ cứng bên ngoài cho mầm hạt) có chứa chất dinh dưỡng, phôi này sau đó nảy mầm thành cây con hoàn chỉnh. Đây là một vấn đề đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm trong ứng dụng bảo quản phôi vô tính, chất mầm thực vật dài hạn. Đồng thời mở ra một hướng đi mới cho việc sử dụng những hạt vô tính thay cho các hạt hữu tính có khả năng nảy mầm thấp và không đồng đều. Công nghệ tạo hạt nhân tạo mang đến những hiểu biết mới về quá trình hình thành phôi vô tính trên cây lan Hồ Điệp nói riêng và hoa Lan nói chung, nó là bước ứng dụng kế tiếp thiết thực cho ngành nuôi cấy mô thực vật. 3
  12. Đồ án tốt nghiệp Hình 1: Một số hình ảnh về các loài hoa lan Hồ Điệp 4
  13. Đồ án tốt nghiệp 3. Phạm vi nghiên cứu Quy trình sản xuất hạt nhân tạo lan Hồ Điệp từ phôi vô tính hoặc PLB (Protocorm-like-body). Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nhân tạo. 4. Mục tiêu nghiên cứu Tổng quan về quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp. Tổng quan các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nhân tạo. Nhằm tạo ra nguồn giống ổn định, những cây con có kiểu gene và kiểu hình đồng nhất với nguồn mẫu ban đầu. Tạo ra số lượng lớn cây con có chất lượng tốt, đồng thời làm giảm giá thành cây giống. 5. Phương pháp nghiên cứu Nuôi cấy phát sinh mô sẹo, phát sinh PLB, tăng sinh mô sẹo, phát sinh phôi soma và tái sinh chồi cây lan Hồ Điệp trên môi trường rắn trên đĩa petri, bình tam giác. Thử nghiệm nuôi cấy tăng sinh mô sẹo trong môi trường lỏng lắc và ghi nhận kết quả cảm biến tạo phôi soma từ phương pháp tăng sinh mô sẹo này. 6. Các kết quả đạt được của đề tài Biết được các yếu tố cần thiết và ảnh hưởng đến quá trình phát sinh phôi soma, quá trình tạo hạt nhân tạo trên cây lan Hồ Điệp. Từ đó tìm ra phương pháp tốt nhất, tối ưu nhất cho việc tạo hạt nhân tạo cây lan Hồ Điệp. Tạo ra số lượng lớn các hạt nhân tạo có chất lượng tốt, đồng đều có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt. Việc tạo ra hạt nhân tạo thành công, hạt nhân tạo có khả năng nảy mầm và cây con phát triển tốt giúp tạo ra nguồn giống ổn định với số lượng lớn và cũng góp phần làm giảm giá thành cây giống. Quá trình tạo hạt nhân tạo cây lan Hồ Điệp đạt kết quả tốt mở ra triển vọng cho việc nghiên cứu tạo hạt nhân tạo trên các giống Lan và các loại cây trồng khác có giá trị kinh tế cao. 7. Kết cấu của ĐATN (Đồ án tốt nghiệp) Gồm 3 chương: 5
  14. Đồ án tốt nghiệp Chương 1: Cơ sở lý thuyết Tìm hiểu tổng quan về cây lan Hồ Điệp. Tình hình sản xuất hoa Lan nói chung và lan Hồ Điệp nói riêng. Tình hình nghiên cứu tạo hạt nhân tạo. Cấu tạo và ý nghĩa của hạt nhân tạo. Chương 2: Quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp Tìm hiểu về các kỹ thuật nuôi cấy phát sinh mô sẹo, phát sinh phôi soma, phát sinh PLB và tái sinh chồi cùa cây lan Hồ Điệp. Sơ đồ quy trình và thuyết minh quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp. Chương 3: Các kết quả nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp Các kết quả nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình phát sinh và tăng sinh mô sẹo, phát sinh phôi soma, phát sinh PLB và tái sinh chồi của cây lan Hồ Điệp. 6
  15. Đồ án tốt nghiệp PHẦN II: NỘI DUNG CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÝ THUYẾT 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 1.1.1. Tổng quan về cây lan Hồ Điệp [3], [8], [24] 1.1.1.1. Vị trí phân loại Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Hạt kín (Angiospermae) Lớp: Một lá mầm (Monocotyledoneae) Bộ: Lan (Orchidales) Họ: Phong lan (Orchidaceae) Chi: Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis) Loài: Một số loài như: Hồ Điệp, Mãn Thiên Hồng, P.Amabilis blume, P.Gigantean, P.Mannii Lan Hồ Điệp là một trong những loài hoa Lan quý phái lộng lẫy và rất lâu tàn. Nếu được chăm sóc tốt thì một chậu lan Hồ Điệp có thể trưng bày từ 3 đến 4 tháng. P.Viridis P.Amabilis blume 7
  16. Đồ án tốt nghiệp Hồ điệp Mãn thiên hồng P.Gigantean P.Javalin 8
  17. Đồ án tốt nghiệp Hồ điệp ấn (P.Mannii) P.Stuartiana Hình 1.1: Một số loài hoa lan Hồ Điệp 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái - sinh lý Lan Hồ Điệp là cây đơn thân, ngắn, lá to, dày, mọc sát vào nhau. Hoa nở luôn phiên hết cái này đến cái khác, thời kỳ nở hoa thay đổi theo loài và thường nở trong vài tháng. Phát hoa mọc từ nách lá, dài, chùm hoa nở từng cái, ba đài to tròn, hai cánh xòe rộng, màu sắc đẹp. Môi hoa cong dẹp có hai râu dài nên cả đóa hoa trông giống như con bươm bướm. Trụ có hình bán nguyệt với hai phân khối u lên chứa đầy phấn hoa. Lan có rễ khí sinh phát triển mạnh, màu lục, phía ngoài có lớp mô xốp dày có tác dụng dự trữ nước và bảo vệ rễ khỏi bị khô. Lá đơn nguyên, dày, không cuống và có bẹ. Cây lan Hồ Điệp sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu Việt Nam. Đây là loài thực vật có hoa đẹp và đa dạng, màu sắc phong phú, trung bình mỗi cây có từ 7 - 15 hoa, thời gian để hoa lớn mất đến 3 hoặc 4 tháng. Đó cũng là 9
  18. Đồ án tốt nghiệp tính chất làm cho cây lan Hồ Điệp có giá trị kinh tế cao. Khả năng tự sinh ra cây con trong môi trường tự nhiên là rất thấp, bởi vì ảnh hưởng của nhiều lý do khác nhau. Quả của lan Hồ Điệp thuộc loại quả nang, mở bằng các khe nứt dọc theo hai bên đường của giá noãn. Phần lớn hạt bị chết không nảy mầm được vì chứa phôi chưa phân hóa. 1.1.1.3. Các điều kiện thích hợp cho cây lan Hồ Điệp ✓ Nhiệt độ: Cây lan Hồ Điệp là loại lan thích hợp với môi trường khí hậu nóng ấm. Trung bình khoảng 17 - 21oC ở ban đêm và khoảng 22 - 26oC ở ban ngày. Nhiệt độ lý tưởng để phát triển tốt là 25 - 27oC, khoảng nhiệt độ này là thích hợp với cây lan Hồ Điệp, giúp cây phát triển tốt. ✓ Ánh sáng: Cây lan Hồ Điệp không cần quá nhiều ánh sáng, ánh sáng với cường độ 1200 – 2000 lux là thích hợp cho cây. Để một cây Lan được phát triển tốt cần đặt cây trong bóng râm, hạn chế để cây dưới ánh nắng mặt trời trực tiếp. Làm giàn che phải che khoảng 70% nắng. Khoảng thời gian tốt nhất để cây Lan phát triển là từ đầu tháng 12 cho đến giữa tháng 3. ✓ Nước: Nên dùng vòi phun sương để tưới và nên tưới nước cho cây lan Hồ Điệp vào buổi sáng. Vào mùa nắng có thể tưới 3 lần/ngày. Không sử dụng nước cứng để tưới cho cây, bởi vì có thể làm cho cây không hấp thu được chất dinh dưỡng. Đối với vườn lan trồng trong nhà kính thì tưới nước rất ít khoảng 3 - 5 ngày/lần. ✓ Độ ẩm: Lan Hồ Điệp là loài thực vật không có túi chứa nước, do đó không thể giúp cây chứa hơi nước đọng lại. Vì vậy, độ ẩm là rất cần thiết, độ ẩm từ 50 – 70% là thích hợp cho cây. ✓ Dinh dưỡng: Cây lan Hồ Điệp cần dinh dưỡng thường xuyên, quanh năm. Hồ Điệp cần phân bón tưới với nồng độ loãng và có thể tưới nhiều lần trong tuần. 10
  19. Đồ án tốt nghiệp ✓ Thời gian ra hoa: Lan Hồ Điệp là một trong những giống hoa có thời gian ra hoa kéo dài nhất từ 2 đến 6 tháng và có thể ra hoa 2 đến 3 lần trong một năm khi cây đã đạt đến kích thước trưởng thành. 1.1.2. Tình hình sản xuất lan Hồ Điệp trên thế giới và ở Việt Nam [3], [9] Hoa Lan được mệnh danh là nữ hoàng của các loài hoa, trong đó hoa lan Hồ Điệp không chỉ đẹp mà còn có một lợi thế rất lớn bởi độ bền của hoa rất lâu, nhánh hoa to nên có thể thu hoạch ở dạng cắt cành và xuất khẩu. Trước đây hoa lan Hồ Điệp có giá trị khá cao bởi các đặc điểm của hoa và thời gian sinh trưởng của cây (phải mất khoảng từ 18 - 20 tháng cây mới cho thu hoạch), nên được xem là một loại mặt hàng cao cấp trên thị trường. Trong 20 năm trở lại đây, cùng với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học đã giúp cho loại sản phẩm này trở nên phổ biến với người tiêu dùng đặc biệt là trong các ngày lễ, tết. Công nghệ lai giống và gieo hạt ngày càng tạo ra nhiều chủng loại giống mới, nổi bật về màu sắc và kích thước hoa 1.1.2.1. Tình hình sản xuất hoa Lan trên thế giới Thị trường tiêu thụ hoa Lan của khối Châu Âu rất lớn bao gồm cả xuất khẩu và nhập khẩu. Năm 2006 khối EU có sản lượng xuất khẩu hoa Lan trên thế giới đạt 55 tỉ sản phẩm, mang lại giá trị kim ngạch xuất khẩu hoa Lan là 73 tỉ EUR. Sản lượng nhập khẩu hoa Lan từ các nước là trên 155 tỉ sản phẩm, giá trị kim ngạch nhập khẩu đạt gần 90 tỉ EUR. Trong đó, Hà Lan là một quốc gia duy nhất ở Châu Âu có công nghệ trồng Lan xuất khẩu, do trồng trong nhà kính nên Hà Lan có thể xuất khẩu hoa quanh năm, đồng thời là đầu mối trung gian nhập khẩu hoa Lan từ các nước khác trên thế giới (37%). Năm 2006, Hà Lan xuất khẩu hoa Lan chiếm 95% (52.049 ngàn sản phẩm) tổng sản lượng hoa Lan trong khối EU (trích dẫn bởi Đào Thị Lý, 2009). Hiện tại, Thái Lan là nước đứng đầu trên thế giới về hoa Lan và xuất khẩu chủ yếu là hoa Lan nhiệt đới, đặc biệt là Dendrobium, phổ biến nhất là Dendrobium Sonia và Jumbo white. Ngoài ra cũng còn một số loài khác như: Aranda, Mokara, Oncidium và Vanda. Chỉ với loại hoa Lan chủ lực là Dendrobium, Thái Lan đạt 11
  20. Đồ án tốt nghiệp doanh thu mỗi năm gần 600 triệu USD từ giá trị xuất khẩu loại hoa này. Lan Dendrobium được chọn là mặt hàng chủ lực vì sản phẩm của nó có thể xuất khẩu liên tục trong năm. Thái Lan có khoảng 24 triệu m2 trang trại trồng hoa Lan (trích dẫn bởi Đào Thị Lý, 2009). Hoa Lan của Thái Lan hiện đang chiếm lĩnh rộng trên thị trường thế giới: Bắc Mỹ, hợp chủng quốc Hoa Kỳ, Canada, Tây Ban Nha, Thụy Điển, Ba Lan, Nhật, Hàn Quốc, Trung Quốc, một số nước Trung Đông và Châu Phi. Thị trường chính là Nhật, Ý và Mỹ. Đài Loan là nước đứng đầu trên thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan Hồ Điệp bằng quy trình công nghệ cao, giá trị doanh thu từ xuất khẩu loại hoa này hàng năm khoảng 43 triệu USD. Trên thị trường thế giới, sản phẩm chủ yếu của hoa lan Hồ Điệp là hoa chậu, sản phẩm này có giá trị kinh tế cao gấp nhiều lần so với hoa Hồ Điệp cắt cành. 1.1.2.2. Tình hình sản xuất hoa Lan ở Việt Nam Diện tích trồng hoa ở Việt Nam hiện nay khoảng 2.500 ha nhưng hoa Lan chỉ chiếm 5 - 6%. Nước ta chỉ mới bắt đầu sản xuất và thương mại hoa Lan tập trung khoảng mấy năm trở lại đây nhưng tốc độ phát triển khá nhanh. Chỉ riêng tp.HCM diện tích vườn Lan tới nay đã gần 80 ha, hoa Lan đang mang lại thu nhập cao cho nhiều hộ nông dân. Tuy nhiên hiện nay cây giống trong nước không đủ cung cấp cho sản xuất, các nhà vườn nhập cây giống ồ ạt từ nước ngoài như: Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc (trích dẫn bởi Đào Thị Lý, 2009). Theo thống kê của Sở NN & PTNT tp.HCM trong năm 2003 doanh số kinh doanh hoa Lan cây kiểng chỉ đạt 200 - 300 tỉ đồng nhưng năm 2005 đã tăng lên 600 - 700 tỉ đồng và ngay từ đầu năm 2006 doanh số đạt được là 400 tỉ đồng. Theo TS. Dương Hoa Xô - trung tâm công nghệ sinh học, đến nay đã hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cho 7 nhóm giống hoa Lan, có khả năng cung cấp 200.000 cây con hoa Lan cấy mô thuộc nhóm Mokara, Dendrobium, Phalaenopsis, Carlleya. Năm 2007 đã cung cấp cho các nhà vườn khoảng 50.000 cây hoa Lan cấy 12
  21. Đồ án tốt nghiệp mô các loại. Năm 2008 sản xuất 100.000 cây giống hoa Lan cấy mô, tập trung vào nhóm hoa Lan cắt cành Mokara, Dendrobium và một số giống Lan rừng quý. Đến năm 2009, chiếm lĩnh thị trường hoa tết là những loại hoa mới, lạ và cao cấp: Tiểu Quỳnh, Lily, Tulip, Địa Lan, Hồ Điệp Nhân giống bằng công nghệ in vitro. Hiện nay rất nhiều loại hoa được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô tại Việt Nam như: Dendrobium, Hồ Điệp, Vanda, Carlleya, Vũ Nữ và một số giống hoa khác. Thị trường tiêu thụ hoa trong nước ngày càng mở rộng, mỗi năm tiêu thụ hàng triệu cây hoa các loại, riêng cây Lan cũng gần 2 triệu cây. Đặc biệt Đà Lạt là nơi sản xuất hoa Lan sớm nhất cả nước. Năm 1980 Đà Lạt đã xuất khẩu số lượng lớn cành hoa sang các nước Đông Âu. Những năm gần đây, cùng với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học, các kỹ thuật tiên tiến được áp dụng vào sản xuất đã giúp làm giảm chi phí trồng từ 40.000 - 70.000 đồng/gốc Lan trước đây xuống còn 4.000 - 7.000 đồng/gốc. Lan Đà Lạt đã và đang mở rộng thị trường ra nhiều châu lục, trong đó có những thị trường khó tính như: Mỹ, Nhật, Đài Loan Nhiều doanh nghiệp trong và ngoài nước đang tiến hành khảo sát lập trang trại sản xuất hoa Lan quy mô lớn tại Đà Lạt bởi các lợi thế tự nhiên của nơi này. 1.2. Tổng quan về các vấn đề nghiên cứu 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu về hạt nhân tạo 1.2.1.1. Trên thế giới [8] ✓ Năm 1978 Murashige phát hiện đầu tiên về kỹ thuật hạt nhân tạo. ✓ Năm 1985 Kitto và Janick bọc hạt nhân tạo cà rốt bằng polyxyethylene đạt tỉ lệ sống 3%. ✓ Năm 1987 Redenbaugh và cộng sự đã phát triển thành công kỹ thuật tạo hạt nhân tạo. ✓ Năm 1987 Gray tạo thành công trên nho và cây cỏ nón. ✓ Năm 1988 McKersie và cộng sự đã tạo thành công hạt nhân tạo cây cỏ đinh lăng, 65% hạt biến đổi sau bước làm khô. 13
  22. Đồ án tốt nghiệp ✓ Năm 1988 Janick tạo hạt nhân tạo thành công trên cần tây. ✓ Năm 1988 lúa mì được tạo hạt nhân tạo thành công bởi Carmana và cộng sự. 1.2.1.2. Trong nước [6], [7], [8] ✓ Năm 1992 Viện Sinh Học Nhiệt Đới cũng đã thực hiện việc sản xuất hạt nhân tạo trên cây cà phê. ✓ Liêu Hồng Phú (2005) đã tiến hành nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.). Môi trường ½MS là môi trường thích hợp nhất để làm vỏ bao hạt nhân tạo ở lan Hồ Điệp, tỉ lệ nảy mầm cao nhất 77,78% (60NSC). ✓ Nguyễn Hoàng Quân (2007) đã nghiên cứu tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda. Nồng độ của sodium alginate là 30 g/l cho vỏ hạt nhân tạo tròn, đều, đẹp và tỉ lệ nảy mầm cao. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu về hạt nhân tạo [8] Hầu hết các loài thực vật được nhân giống bằng hạt: lúa, bắp, rau, cà phê, điều, cao su đó là những hạt giống hữu tính được tạo ra từ quá trình thụ phấn ở cây trồng. Tuy nhiên, phương pháp nhân giống từ hạt không hiệu quả do tỉ lệ nảy mầm thấp, không đảm bảo độ đồng đều và không đảm bảo về mặt di truyền. Vì vậy, nhân giống vô tính hiện được xem là một phương pháp hiệu quả để tạo ra một lượng lớn cây giống đạt chất lượng phục vụ cho sản xuất. Để đẩy nhanh quá trình nhân giống cũng như sản xuất, hạt giống có thể được trồng trọt nhanh với các thiết bị cơ giới. Xuất phát từ ý tưởng này. Các nhà nghiên cứu tại Việt Nam đã tiến hành nhiều thí nghiệm tạo hạt nhân tạo trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau bằng công nghệ sinh học. “Khái niệm công nghệ về hạt nhân tạo là một khái niệm rất mới và hiện nay các nhà khoa học ở nước ngoài, ở các nước phát triển và đang phát triển, người ta cũng mong muốn trong tương lai, có một kỹ nghệ về công nghiệp hạt giống vô tính khác với hạt hữu tính mà chúng ta thường hay gặp trong tự nhiên. Ý nghĩa khoa học của hạt vô tính là nó tạo nên những cá thể đồng nhất về mặt di truyền, tính ổn định 14
  23. Đồ án tốt nghiệp cũng như chất lượng cây giống. Kỹ thuật về hạt nhân tạo thì hiện nay người ta đã công bố nhiều trên các sách, tạp trí khoa học. Tuy nhiên, có thể chuyển hạt nhân tạo thành hạt đem gieo trồng bên ngoài thì hiện nay rất ít công trình nói về tính khả thi của việc thương mại hóa hạt nhân tạo. Tính đến thời điểm này, có một vài công trình người ta thành công trên đối tượng hạt nhân tạo mà có thể chuyển hạt đó ra bên ngoài trong những điều kiện đặc biệt có thể nảy mầm như những hạt tự nhiên, như là hạt nhân tạo của cây mía, cây dâu Mới đây, chúng tôi cũng thành công trong việc nghiên cứu hạt nhân tạo trên đối tượng cây Địa Lan. Và công trình này đã được chấp nhận đăng trên tạp chí khoa học quốc tế ở Bungari và cũng là một trong những công trình được bầu chọn là có ý nghĩa trong việc chuyển hạt vô tính ra bên ngoài sinh trưởng và phát triển thành một cây hoàn chỉnh” (Dương Tấn Nhựt, 2007). Đây là một thành công không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học mà còn có ý nghĩa về mặt kinh tế. Hiện nay, các nhà khoa học đang tìm cách nhân nhanh giống lan Hồ Điệp - một loài lan đẹp có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam. Trước đây, các nhà vườn ươm trồng lan Hồ Điệp tự nhân giống bằng tách chồi. Sau này khi kỹ thuật nuôi cấy mô phát triển, người ta chuộng cây giống Lan từ nuôi cấy mô hơn vì tạo ra được số lượng lớn, độ sạch bệnh cao nhưng cây giống được tạo ra từ nuôi cấy mô vẫn chưa đủ để đáp ứng nhu cầu thị trường. Muốn có cây giống lan Hồ Điệp từ nuôi cấy mô thường các nhà vườn phải đặt trước tại các cơ sở nhân giống nuôi cấy mô từ 6 tháng cho đến cả một năm trước đó. Ngày nay với phương pháp nhân gống bằng hạt nhân tạo sẽ mở ra triển vọng mới cho ngành trồng Lan tại Việt Nam. Hạt nhân tạo của cây lan Hồ Điệp được bọc bằng dung dịch sodium alginate với nhiều nồng độ khác nhau. Tỷ lệ hạt sống sót của các hạt nhân tạo trong điều kiện in vitro là 100% và khả năng tái sinh cũng khá cao. Hạt nhân tạo không bị giảm khả năng sống sót sau khi được bảo quản một năm trong môi trường lỏng không chứa đường. Cây con được tạo ra từ những hạt nhân tạo này đều sống sót sau 6 tháng ngoài nhà kính. 15
  24. Đồ án tốt nghiệp 1.2.3. Tổng quan về quy trình tạo hạt nhân tạo [4], [6], [8], [16] Hạt nhân tạo là một dạng hạt mô phỏng hạt tự nhiên, hạt nhân tạo chứa phôi vô tính được bọc trong một lớp alginate có chứa chất dinh dưỡng, sau đó, các phôi vô tính có thể nảy mầm thành cây con hoàn chỉnh (Redenbaugh et al, 1987; Saiprasad, 2001). Về cơ bản, hạt nhân tạo giống hạt tự nhiên, điểm khác biệt là hạt nhân tạo được tạo thành từ tế bào sinh dưỡng và không có lớp nội nhũ bao quanh. Hình 1.2: Cấu tạo của hạt nhân tạo 1.2.3.1. Các nguồn mẫu làm hạt nhân tạo ➢ Mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi hoặc phôi để có thể hình thành nên cây hoàn chỉnh. Mô sẹo được hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây (Esau, 1977). Mô sẹo là nguồn nguyên liệu cơ bản sử dụng cho nuôi cấy mô thực vật in vitro. Đặc điểm sinh trưởng của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy. ➢ Phôi vô tính (Phôi soma) Phôi vô tính hay phôi soma là các thể nhân giống có tính lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ bắt nguồn từ các tế bào sinh dưỡng, bao gồm cả phần mô phân sinh ngọn và mô phân sinh gốc. 16
  25. Đồ án tốt nghiệp Sự phát triển của phôi vô tính trải qua 4 giai đoạn hình thái: hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và hình lá mầm. Dưới các điều kiện thích hợp thì phôi vô tính có thể phát sinh thành một cơ thể có chức năng hoàn chỉnh. Không giống các tế bào nhân thật (Eukaryote), hầu hết các tế bào thực vật đều có khả năng phát triển thành phôi dưới những điều kiện thích hợp. Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái và sinh lý nhưng không có tái tổ hợp di truyền, do đó tất cả những cây con tái sinh bằng con đường này thì có vật chất di truyền y hệt các tế bào sinh dưỡng đã sinh ra chúng. Hình 1.3: Phôi hình cầu, hình tim, hình thủy lôi 17
  26. Đồ án tốt nghiệp ➢ Protocorm-like-body (PLB) Protocorm là một cơ quan dự trữ rất nhỏ, được hình thành từ phôi đang nảy mầm. Protocorm-like-body (PLB) là một cấu trúc rất đặc biệt tương ứng với giai đoạn chuyển tiếp và sự phát triển mạnh mẽ của phôi thành cây con. Điểm sinh trưởng của PLB có cấu trúc chưa đầy đủ, các tế bào bề mặt duy trì tiềm năng của các tế bào phôi, từ đây chúng dễ dàng phát khởi tạo nhiều điểm sinh trưởng bất định. Đặc điểm quan trọng nhất của PLB là chúng có sự phân chia rất mạnh mẽ nên chỉ cần những kích thích thích hợp thì chúng sẽ phát sinh phôi, chồi, cơ quan phù hợp với điều kiện kích thích. Hình 1.4: Hình dạng của PLB quan sát dưới kính hiển vi soi nổi 1.2.3.2. Vật liệu làm vỏ bọc cho hạt nhân tạo ➢ Tác nhân tạo gel Có rất nhiều tác nhân tạo gel được sử dụng làm vỏ bọc nhân tạo cho phôi. Đó có thể là agar, alginate, polyco2133, carboxyl methyl cellulose Hợp chất được sử dụng rộng rãi đó là chất nền sodium alginate. Hợp chất này sẽ đông lại thành gel khi được cho vào môi trường có muối kim loại như CuSO4 hoặc CaCl2. 18
  27. Đồ án tốt nghiệp Alginate là một hợp chất hữu cơ mạch thẳng, kỵ nước, là muối của acid alginic. Các đặc tính thuận lợi của alginate: tính dính vừa phải, không gây độc cho phôi, có các đặc tính tương hợp sinh học, khả năng tạo gel nhanh, để lâu được, rẻ tiền, độ cứng của gel vừa phải để có thể vừa tạo thuận lợi cho sự hô hấp của phôi vừa bảo vệ cho phôi khỏi những tổn thương từ bên ngoài. Hình 1.5: Công thức hóa học của alginate ➢ Nội nhũ nhân tạo Không như phôi hợp tử, phôi vô tính không có lớp nội nhũ chứa chất dinh dưỡng để nuôi phôi, vì vậy cần tạo lớp nội nhũ nhân tạo bằng cách thêm chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng, carbohydrate vào vật liệu làm vỏ bọc để nâng cao khả năng tăng trưởng và sống sót cho phôi. 1.2.4. Ưu, nhược điểm của hạt nhân tạo [6], [7], [8] ✓ Ưu điểm So với các phôi vô tính được tạo thành in vitro thiếu lớp vỏ bao ngoài và có khuynh hướng nảy mầm ngay tức khắc, hạt nhân tạo bảo quản được lâu hơn nhờ có lớp vỏ bọc và cũng là lớp nội nhũ nhân tạo giúp tăng khả năng sống sót cho phôi. Hạt nhân tạo với lớp vỏ bọc nhân tạo giúp tăng khả năng chịu đựng các tác động vật lý, các điều kiện môi trường và thuận lợi cho việc vận chuyển. 19
  28. Đồ án tốt nghiệp Việc tạo hạt nhân tạo đơn giản, dễ thực hiện, chi phí sản xuất thấp nên có thể sản xuất được với số lượng lớn giúp tạo ra một lượng giống lớn cung cấp cho thị trường. Hạt nhân tạo có khả năng nảy mầm cao, chất lượng cây con đồng đều, sạch bệnh và đồng nhất các đặc tính di truyền với cây mẹ hơn so với hạt tự nhiên. ✓ Nhược điểm Khả năng tái sinh cây của một số loài thực vật từ phôi vô tính và sự thích hợp khí hậu sau đó của cây là một trong những yếu tố khó khăn nhất nhằm đạt đến thành công trong việc tạo hạt này. Việc gieo trồng trực tiếp hạt nhân tạo lên đất trồng còn gặp phải một số những khó khăn bởi các điều kiện về môi trường, côn trùng và vi sinh vật. 1.2.5. Ứng dụng của hạt nhân tạo [6], [8] Công nghệ hạt nhân tạo sử dụng phôi vô tính có vai trò rất quan trọng trong việc trồng trọt ở những loài thực vật: · Không tạo được hạt. · Hạt được tạo thành với một số lượng thấp. · Khả năng hạt sống sót thấp. · Việc nhân giống thực vật khó khăn và chất mầm không thể bảo quản được. Nhân nhanh nhiều giống cây trồng với số lượng lớn. Tạo cây con khỏe mạnh, sạch bệnh, chất lượng đồng đều và giữ được các đặc tính tốt của cây mẹ. 1.2.6. Giới thiệu một số công nghệ vi nhân giống khác [1], [3], [20] Một số công nghệ vi nhân giống đang được các nước có ngành công nghệ sinh học phát triển ứng dụng. Ở nước ta, những công nghệ này mới chỉ được thực hiện trong phòng thí nghiệm ở một số trường Đại Học hay các Viện nghiên cứu trong mấy năm gần đây. 20
  29. Đồ án tốt nghiệp 1.2.6.1. Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng Nghiên cứu tập trung vào vấn đề nuôi cấy mô trên môi trường không có đường nhưng được điều khiển chủ động chế độ ánh sáng và cung cấp CO2. ✓ Ưu điểm · Tốc độ sinh trưởng, chất lượng và tỉ lệ sống của mô thực vật được nâng cao. · Thiệt hại do sự nhiễm mẫu được hạn chế do sử dụng môi trường không có đường. · Tự động hóa nên giảm chi phí lao động. ✓ Nhược điểm · Chi phí cao cho việc điều khiển môi trường. · Chi phí cao cho hệ thống bình nuôi chuyên dụng và chuẩn bị giá thể. Hình 1.6: Hệ thống vi nhân giống quang tự dưỡng 1.2.6.2 Công nghệ nuôi cấy lỏng lắc Đây là phương pháp nuôi cấy mô thực vật bằng môi trường lỏng, bình nuôi cấy được đặt trên máy lắc, tùy vào mục đích nuôi cấy và đối tượng nuôi cấy mà số vòng quay của máy lắc được điều chỉnh khác nhau (từ 90 - 180 vòng/phút). ✓ Ưu điểm · Tiết kiệm không gian, mẫu cấy hấp thụ hết dinh dưỡng trong bình nuôi cấy. Tăng cường được sự thoáng khí nên kích thích mẫu cấy phát triển nhanh. · Môi trường lỏng và lắc, mẫu cấy di chuyển tự do nên hiệu ứng ưu thế ngọn bị biến mất và các chồi phát triển tương đối đồng đều. 21
  30. Đồ án tốt nghiệp · Giảm chi phí sản xuất do nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc giúp hấp thụ tối đa dinh dưỡng trong bình nuôi cấy, tiết kiệm được môi trường dinh dưỡng. ✓ Nhược điểm · Mẫu mô nuôi cấy có thể bị tổn thương do quá trình lắc. · Những khối mô hay cơ quan mới hình thành còn non yếu nếu bị va đập mạnh sẽ làm dập nát chúng. · Phương pháp này chỉ thích hợp cho nuôi cấy từ giai đoạn tái sinh đến giai đoạn tăng sinh khối. · Môi trường nuôi cấy lỏng thường dẫn đến sự phát sinh hình thái bất thường chẳng hạn như hiện tượng thủy tinh thể. 1.2.6.3. Hệ thống bình nuôi cấy Bioreactor Takayama và Miasawa là những người đầu tiên sử dụng Bioreactor vào nhân giống cây trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ hoa ly Bioreactor là một hệ lên men hay nồi phản ứng sinh học. Là thiết bị mà trong đó sự biến đổi hóa sinh được tiến hành bởi các tế bào sống hoặc các thành phần tế bào in vitro. Thường dùng để lên men liên tục, bán liên tục hay gián đoạn. Có thể dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào thu sinh khối. Cũng có thể dùng trong nuôi cấy mô để nhân nhanh các giống cây. Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiết bị Bioreactor hoàn toàn tự động hóa. ✓ Ưu điểm · Thể tích nuôi cấy lớn. · Hầu hết các bình Bioreactor được thiết kế với cơ chế khuấy bằng cơ học hay thổi khí giúp mẫu cấy phát triển tốt, đồng đều. · Trong quá trình nuôi cấy hoặc nuôi cấy liên tục, môi trường và các điều kiện nuôi cấy có thể được kiểm soát và duy trì dễ dàng giúp mẫu cấy phát triển tốt. Điều này không thể thực hiện với nuôi cấy trong bình tam giác. 22
  31. Đồ án tốt nghiệp ✓ Nhược điểm · Đòi hỏi thiết bị đắt tiền, vận hành phức tạp đặc biệt là khâu chống nhiễm cho huyền phù nuôi cấy. ✓ Ứng dụng · Tạo chồi: chuối, dứa, hoa lan · Tạo củ in vitro: khoai tây, lily · Tạo phôi soma: cà phê, cao su Hình 1.7: Hệ thống Bioreactor 1.2.6.4. Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời TIS (Temporary Immersion System) Nguyên lý hoạt động của hệ thống này khá đơn giản. Trong bình kín, chồi cây được ngập trong dung dịch dinh dưỡng khoảng vài phút, dung dịch này sau đó được rút cạn đi một cách tự động. Những chu kỳ như vậy được lặp lại sau mỗi 6 giờ nhờ một chiếc máy bơm không khí đã được lập trình từ trước. Toàn bộ hệ thống hoạt động khép kín và được khử trùng, tránh được sự ngoại nhiễm trong quá trình thao tác. 23
  32. Đồ án tốt nghiệp Sử dụng phương pháp bơm không khí vào hệ thống nên có thể điều tiết thành phần không khí, tạo nên môi trường tối ưu cho mầm cây. ✓ Ưu điểm · Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời TIS có tác động tích cực lên tất cả các giai đoạn từ nhân nhanh chồi cho tới phát sinh phôi soma trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau. · Sự sinh trưởng và hệ số nhân nhanh chồi của cây được nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời luôn cao hơn so với những cây nuôi cấy trong hệ thống thông thường trên môi trường rắn hay trong hệ thống Bioreactor thông thường. · Cây tái sinh và phôi soma thu được từ hệ thống nuôi cấy này luôn có chất lượng tốt hơn, tỉ lệ sống sót cao, cây con sinh trưởng khỏe mạnh trong quá trình thuần hóa ngoài vườn ươm. · Có thể nói, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời TIS là sự kết hợp thành công những ưu điểm của hệ thống nuôi cấy rắn thoáng khí và hệ thống nuôi cấy lỏng giúp cây tránh được những hiện tượng bất lợi như: sự thiếu thông thoáng khí của môi trường lỏng ngập liên tục hay trong hệ thống kín trên môi trường rắn, hiện tượng thủy tinh thể trong môi trường lỏng liên tục, giúp gia tăng sự hấp thụ chất dinh dưỡng so với nuôi cấy trên môi trường rắn. · Hệ thống TIS tiết kiệm được nhân công lao động, không gian phòng nuôi cấy và giảm được chi phí sản xuất. ✓ Nhược điểm · Mật độ nuôi cấy ảnh hưởng đến chất lượng nuôi cấy. · Thời gian ngập tối ưu phải được điều chỉnh cho phù hợp với từng giai đoạn phát triển của mẫu cấy, từng loại cây để có kết quả tốt. 24
  33. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH TẠO HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP 2.1. Kỹ thuật phát sinh phôi soma, PLB chuẩn bị mẫu cho tạo hạt nhân tạo [1], [2], [5], [6], [8], [9], [18], [19] Nguồn mẫu khởi đầu cho quá trình nuôi cấy in vitro có thể được sử dụng là: thân, lá, rễ, đỉnh sinh trưởng, chồi nách Tuy nhiên, để việc nuôi cấy đạt hiệu quả cao và vì lan Hồ Điệp là loài thực vật đơn thân nên việc nuôi cấy bằng đỉnh sinh trưởng sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến cây mẹ, số lượng mẫu bị hạn chế. Việc nuôi cấy từ phát hoa có thể khắc phục được những hạn chế này. Hình 2.1: Quy trình nhân giống lan Hồ Điệp bằng nuôi cấy phát hoa 2.1.1. Kỹ thuật phát sinh phôi soma Quá trình này gồm 2 giai đoạn: 2.1.1.1. Phát sinh và tăng sinh mô sẹo ➢ Khái quát Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi hoặc phôi để có thể hình thành nên cây hoàn chỉnh. Mô sẹo được hình 25
  34. Đồ án tốt nghiệp thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây (Esau, 1977). Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt (Street, 1969). Đặc điểm sinh trưởng của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy. Nhiều nhà khoa học cho rằng, mô sẹo được tạo ra từ những mô hay cơ quan có chứa diệp lục có khả năng quang tự dưỡng (Street, 1969). Hildebrandt và csv, (1963) cho rằng, mô sẹo có chứa diệp lục phụ thuộc vào lượng đường bổ sung trong môi trường và cường độ ánh sáng. Để tạo mô sẹo, trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung chất kích thích sinh trưởng, đôi khi là dịch chiết. Tùy thuộc vào từng loại mô nuôi cấy mà chất kích thích sinh trưởng thêm vào có thể khác nhau (Trần Văn Minh, 2003). ➢ Phát sinh và tăng sinh mô sẹo ✓ Nuôi cấy phát sinh mô sẹo Có thể sử dụng nhiều nguồn mẫu khác nhau như: đỉnh sinh trưởng, chồi nách, lá, rễ để làm nguồn mẫu nuôi cấy ban đầu. Ở đây ta sử dụng phát hoa của cây. Tách phát hoa làm nguồn mẫu khi cây bắt đầu nở hoa. Cắt phát hoa thành đoạn nhỏ có chứa chồi ngủ. Nuôi cấy các đoạn phát hoa này trên môi trường VW bổ sung 2,5 mg/l BA ở 20 - 28oC ta thu được các chồi nảy ra từ các chồi ngủ của phát hoa. Lá non của chồi sinh dưỡng phát triển in vitro này được cắt thành các đoạn nhỏ và nuôi cấy để thu PLB. Các PLB này được cắt nhỏ và cấy chuyền sang môi trường mới. Trên môi trường có bổ sung sucrose có rất nhiều mô sẹo được hình thành từ PLB. Trên môi trường có bổ sung nước dừa hoặc bổ sung kết hợp 2,4-D và BA ở tỉ lệ thích hợp thì mô sẹo tạo thành có kích thước rất lớn, có màu vàng xanh. 26
  35. Đồ án tốt nghiệp ✓ Tăng sinh mô sẹo Môi trường nuôi cấy tăng sinh mô sẹo là môi trường giàu dinh dưỡng (có thể được bổ sung đường và nước dừa), các chất khoáng và cần được bổ sung chất kích thích sinh trưởng là auxin. Auxin giúp kích thích phân chia tế bào mạnh mẽ, tạo ra lượng lớn mô sẹo khi nuôi cấy. Nguồn mẫu sử dụng nuôi cấy có thể là các mô sẹo sẵn có, các PLB. Mô sẹo từ nuôi cấy trên được cấy chuyền sang môi trường có sucrose và bổ sung chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin để tăng sinh mô sẹo. Môi trường đặc cho kết quả tăng sinh mô sẹo tốt hơn. Môi trường lỏng kết hợp lắc cho kết quả tăng sinh mô sẹo ít hơn môi trường đặc nhưng mô sẹo có kết cấu khá chắc và khi cảm biến tạo phôi thì lượng phôi được tạo ra nhiều hơn. Vậy mô sẹo được tăng sinh trong môi trường lỏng lắc thích hợp để cảm biến tạo phôi soma. 2.1.1.2. Phát sinh phôi soma Môi trường nuôi cấy có rất ít hoặc không có auxin nhưng được bổ sung thêm vào đó là cytokinin, môi trường này cũng được hạn chế bớt các chất dinh dưỡng. Với điều kiện các chất dinh dưỡng bị hạn chế và sự có mặt của cytokinin đã cảm ứng các mô sẹo hình thành phôi soma. Cytokinin kích thích sự hình thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Cytokinin còn có mối quan hệ tương tác với auxin, cytokinin làm yếu hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều. Các mô sẹo được tách thành những cụm nhỏ và cấy chuyền sang môi trường đặc ½VW bổ sung 2 mg/l TDZ để cảm biến tạo phôi soma. Các phôi này được sử dụng cho mục đích làm hạt nhân tạo hoặc nuôi cấy tiếp để phát triển thành cây hoàn chỉnh. Mô sẹo nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc cho kết quả cảm biến tạo phôi tốt hơn so với mô sẹo nuôi cấy trên môi trường đặc. 27
  36. Đồ án tốt nghiệp 2.1.2. Kỹ thuật phát sinh PLB Môi trường nuôi cấy cần được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thuộc 2 nhóm cytokinin và auxin với tỉ lệ thích hợp để tạo ra số lượng PLB nhiều nhất. Các auxin có vai trò tăng độ rộng và kéo dài tế bào thúc đẩy phân bào trong nuôi cấy (Krokorian, 1995) kích thích tế bào khử biệt hóa trở thành không phân hóa và có các đặc tính phân chia mạnh. Trong khi đó, với sự hiện diện đồng thời của cytokinin sẽ làm giảm hoạt tính phân chia mạnh ở các tế bào chịu tác động của auxin, dẫn đến các tế bào này tạo thành khối u và đó chính là tiền củ (Lê Văn Hướng, 2005). PLB có đặc điểm phân chia rất mạnh mẽ nên chỉ cần nuôi cấy trên môi trường có các chất kích thích thích hợp thì chúng dễ dàng phát triển thành phôi, cơ quan hoặc cây con. PLB có thể được tạo ra từ nhiều nguồn mô khác nhau. Nhiều quy trình nhân giống đã sử dụng các phần mô của cây con tạo ra từ phát hoa làm vật liệu nuôi cấy (Fu, 1979; Kushnir và Budak, 1980). Zimmer và cộng sự tiến hành nuôi cấy toàn bộ cây con từ chồi in vitro để thu nhận PLB, nghiên cứu được thực hiện tại trường đại học kỹ thuật Hannover (Đức) và thu được kết quả khả quan (Zimmer và Pieper, 1976, 1978, 1979). ➢ Phát sinh PLB Có thể sử dụng nhiều nguồn mẫu khác nhau như: đỉnh sinh trưởng, chồi nách, lá, rễ hoặc từ mô sẹo sẵn có để làm nguồn mẫu nuôi cấy ban đầu. Ở đây ta sử dụng phát hoa của cây. Tách phát hoa làm nguồn mẫu khi cây bắt đầu nở hoa. Cắt phát hoa thành đoạn nhỏ có chứa chồi ngủ. Nuôi cấy các đoạn phát hoa này trên môi trường VW bổ sung 2,5 mg/l BA ở 20 - 28oC ta thu được các chồi nảy ra từ các chồi ngủ của phát hoa. Lá non của chồi sinh dưỡng phát triển in vitro này được cắt thành các đoạn nhỏ và nuôi cấy để thu PLB. 28
  37. Đồ án tốt nghiệp Các mô sẹo cảm ứng từ PLB hay từ lá được nuôi trên môi trường VW có bổ sung nước dừa hay chất kích thích sinh trưởng để tái thu nhận PLB. Mô sẹo được nuôi trên môi trường không có sucrose có bổ sung nước dừa hay sự kết hợp 2 chất kích thích sinh trưởng 2,4-D và BA ở tỉ lệ thích hợp thì mô sẹo chuyển sang màu xanh và tạo ra nhiều PLB. Quan sát mô không thấy có sự liên kết mạch giữa mỗi PLB và các mô khác. Như vậy PLB có nguồn gốc từ mô sẹo có thể được xem như phôi vô tính. Ghi chú: Các môi trường nuôi cấy cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) ; VW (Vacin và Went, 1949). Bảng 2.1: Thành phần khoáng cơ bản của môi trường MS Bảng 2.2: Thành phần khoáng cơ bản của môi trường VW 29
  38. Đồ án tốt nghiệp 2.2. Quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp 2.2.1. Sơ đồ quy trình [4], [8] Môi trường sodium alginate (được bổ sung dinh dưỡng, chất ĐHST, than hoạt tính ) Nguồn mẫu làm hạt nhân tạo: mô sẹo, phôi vô tính, PLB. Dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM (15 phút) Nước cất vô trùng (5 phút) Hạt nhân tạo Hình 2.2: Sơ đồ quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp 30
  39. Đồ án tốt nghiệp 2.2.2. Thuyết minh quy trình [4], [6], [8] Bước 1: Chuẩn bị nguồn mẫu làm hạt nhân tạo. Mẫu là mô sẹo: Mô sẹo được tạo ra từ nuôi cấy các nguồn mẫu ban đầu hoặc từ PLB. Dưới tác động của các chất kích thích thích hợp, các mô sẹo hình thành chồi, rễ và hình thành cây con hoàn chỉnh. Sử dụng các mô sẹo có kích thước đủ lớn, riêng rẽ không bị dính chùm, có màu vàng xanh rắn chắc. Việc sử dụng mô sẹo làm mẫu có những hạn chế như: kích thước quá nhỏ, khả năng dính cụm mô sẹo là khá cao dẫn đến có nhiều cây con nảy mầm trên cùng một hạt. Hình 2.3: Mô sẹo lan Hồ Điệp Mẫu là phôi vô tính: Được tạo từ mô sẹo cây lan Hồ Điệp. Đầu tiên, tạo các mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp bằng các chất điều hòa sinh trưởng, sau đó tiếp tục dùng các chất điều hòa sinh trưởng để tạo phôi vô tính từ các mô sẹo này. Lựa chọn các phôi hình tim hoặc hình thủy lôi để tạo hạt nhân tạo. 31
  40. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4: Phôi vô tính hình thành từ mô sẹo lan Hồ Điệp Mẫu là PLB: Các PLB có thể được tạo ra từ nuôi cấy các nguồn mẫu ban đầu (đỉnh sinh trưởng, lá non in vitro bằng phương pháp vết thương) hoặc PLB được tái sinh từ mô sẹo. Tuy nhiên, các PLB có nguồn gốc từ mô sẹo là tốt nhất. Các PLB được tạo ra từ mô sẹo có sự tách biệt rõ ràng giữa các PLB với nhau hơn, các PLB phát triển đồng đều hơn. Sử dụng các PLB ở giai đoạn 3 (giai đoạn chuẩn bị phát sinh chồi) để làm hạt nhân tạo. Hình 2.5: PLB lan Hồ Điệp Theo Dương Tấn Nhựt và csv (2007), phôi vô tính là nguồn nguyên liệu lý tưởng nhất để tạo hạt nhân tạo trên đối tượng cây lan Hồ Điệp. 32
  41. Đồ án tốt nghiệp Bước 2: Chuẩn bị môi trường sodium alginate. Không như phôi hợp tử, phôi vô tính hoặc chồi không có lớp nội nhũ chứa chất dinh dưỡng bên ngoài để nuôi phôi. Do đó cần bổ sung thêm chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng, carbohydrate để tạo một nội nhũ nhân tạo nhằm hỗ trợ sự tăng trưởng và tăng tỉ lệ sống sót cho phôi. Ngoài ra còn có thể bổ sung thêm chất kháng sinh, thuốc trừ nấm, than hoạt tính để tăng sức đề kháng, tăng cường khả năng hô hấp và nâng cao sức sống cho phôi. Bước 3: Đưa mẫu và môi trường alginate vào dung dịch CaCl2.2H2O. Có 2 cách thực hiện: Cách 1: Cho mẫu vào môi trường alginate, sau đó dùng pipette hút môi trường alginate có chứa mẫu nhỏ vào dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM và để trong 15 phút. Hình 2.6: Mẫu và alginate được hút đồng thời vào pipette Cách 2: Dùng pipette hay ống tiêm hút môi trường alginate rồi cho nhỏ từng giọt rơi xuống, cùng lúc đó dùng pince gắp mẫu đưa vào trong giọt alginate đang được nhỏ xuống dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM và để trong 15 phút. 33
  42. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.7: Cho alginate nhỏ giọt rồi thêm mẫu vào Bước 4: Dùng pince gắp hạt cho vào đĩa petri có chứa nước vô trùng trong 5 phút để rửa sạch lượng CaCl2.2H2O còn sót lại. Hình 2.8: Hạt nhân tạo 34
  43. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình tạo hạt nhân tạo [6] Những nhân tố cần thiết ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nhân tạo Quá trình tổng hợp hạt nhân tạo từ phôi vô tính là một công việc được thực hiện với nhiều bước nhưng ít tốn kém. Để việc tổng hợp hạt thành công thì đòi hỏi một yêu cầu cơ bản đó là phải có một số lượng lớn các phôi vô tính chất lượng cao, có sức sống tốt và các phôi vô tính này phải phát triển đồng bộ. Yêu cầu về một chất lượng tốt toàn diện của các phôi vô tính là yếu tố quan trọng hơn cả để đạt được tần suất biến đổi từ phôi đến cây con cao. Không như phôi hợp tử, phôi vô tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh dưỡng bên ngoài nuôi phôi, do đó bằng việc thêm vào chất nền gel những chất dinh dưỡng, chất điều hòa tăng trưởng, carbohydrate sẽ tạo một nội nhũ nhân tạo thích hợp tối đa cho tăng trưởng và sống sót của phôi (Gray, 1990; Gray và Purohit, 1991; Redenbaugh và Walker, 1990). Ngoài ra, để tăng sức đề kháng cho phôi người ta có thể cho thêm vào chất nền gel chất kháng sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật. Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phôi vô tính bằng sodium alginate cho thấy có một số thành công nhất định trong việc tái sinh cây con, xong vẫn còn nhiều vấn đề khó khăn khi sử dụng vỏ bao alginate này, chất dinh dưỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ bao (Redenbaugh và csv, 1987), sự trao đổi khí kém (Redenbaugh và csv, 1993) Việc thêm vào than hoạt tính giúp tăng cường khả năng hô hấp của phôi, nó giữ lại các chất dinh dưỡng nhiều hơn trong vỏ bọc và phóng thích chúng rất chậm dùng cho sự phát triển của phôi. Nâng cao khả năng sống sót, phát triển của phôi hơn. 35
  44. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ ĐẾN QUY TRÌNH TẠO HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP 3.1. Các kết quả nghiên cứu về tạo mô sẹo và tạo phôi vô tính ➢ Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D và BAP đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) (Liêu Hồng Phú, 2005). 2,4-D là chất kích sinh trưởng thuộc nhóm auxin còn BA là chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin. Sự kết hợp giữa 2 chất này ở 1 tỉ lệ thích hợp sẽ giúp cho mẫu cấy có hiệu quả tạo mô sẹo cao nhất. Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D cao hơn BA thì từ Protocorm sẽ phát triển thành mô sẹo nhiều hơn và mô sẹo có màu trắng xốp, dễ vỡ. Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D thấp hơn BA thì khả năng hình thành mô sẹo sẽ thấp còn khả năng tăng sinh Protocorm và tái sinh chồi tăng lên. Do đó mô sẹo thường có màu vàng xanh và khá chắc. Ở môi trường mà tỉ lệ 2,4-D và BA quá cao thì mẫu rất dễ chết, khả năng tạo mô sẹo thấp. Ở môi trường VW bổ sung 0,1 mg/l 2,4-D kết hợp 0,01 mg/l BA là môi trường có tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo cao nhất (80%) và đây cũng là môi trường có tỉ lệ mẫu chết và không phản ứng thấp nhất (4,44%) thích hợp để tạo mô sẹo lan Hồ Điệp từ PLB. 36
  45. Đồ án tốt nghiệp Mô sẹo trắng xốp Mô sẹo vàng xanh Hình 3.1: Màu sắc mô sẹo trên môi trường có 2,4-D và BA ➢ Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) (Liêu Hồng Phú, 2005). Đường đóng vai trò quan trọng trong nuôi cây mô, đây là nguồn cung cấp carbohydrate chủ yếu giúp cây có khả năng sinh trưởng trong điều kiện in vitro. Bên cạnh đó nước dừa cũng được sử dụng khá phổ biến do nước dừa có chứa Myo- Inositol, Riboflavin, Acid folic có tác dụng cung cấp chất dinh dưỡng cho mẫu cấy trong quá trình tạo mô sẹo cũng như tái sinh cây. Khi ta thay đổi nồng độ đường (0 - 80 g/l) và nước dừa (0 - 200 ml/l) thì tỉ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo cũng thay đổi. Chứng tỏ nồng độ đường và nước dừa có ảnh hưởng lớn đến khả năng tạo mô sẹo của Protocorm lan Hồ Điệp, có tác dụng kích thích khả năng tạo mô sẹo khi tăng nồng độ. Trong đó môi trường VW bổ sung 40 g/l đường và 200 ml/l nước dừa cho tỉ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo cao nhất (80% mẫu) nên được khuyến khích sử dụng. 37
  46. Đồ án tốt nghiệp ➢ Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng TDZ trong điều kiện môi trường đặc, lỏng lắc đến khả năng hình thành phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) (Liêu Hồng Phú, 2005). TDZ là chất kích thích sinh trưởng đặc biệt thuộc nhóm cytokinin. Ngoài tính chất tạo chồi của một cytokinin nó còn có khả năng tăng sinh mô sẹo của một auxin. TDZ được dùng thay thế cho auxin hoặc tổ hợp auxin và cytokinin trong sự hình thành phôi ở nhiều loài cây khác nhau. Quá trình này trải qua 2 bước: Bước 1: Tăng sinh mô sẹo ✓ Nuôi cấy trên môi trường đặc. Sau 30 - 45 ngày, mô sẹo nuôi cấy trên môi trường đặc phát triển tốt, sinh khối tăng nhanh và sự phát triển mô sẹo ở các nghiệm thức khá đều nhau. ✓ Nuôi cấy trên môi trường lỏng và lắc (100 vòng/phút). Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc, lượng sinh khối tạo ra ít hơn so với nuôi cấy trên môi trường đặc, phần lớn có màu tối và khá chắc. Trong đó, môi trường VW bổ sung 2 mg/l TDZ có lượng sinh khối cao nhất và màu sáng hơn các môi trường còn lại, đặc biệt xuất hiện một số mô sẹo có màu xanh. Môi trường đặc Môi trường lỏng lắc Hình 3.2: Mô sẹo lan Hồ Điệp trên môi trường TDZ 2 mg/l 38
  47. Đồ án tốt nghiệp Bước 2: Phát sinh phôi soma Mô sẹo từ các bình nuôi cấy tăng sinh trên được tách thành những cụm nhỏ và cấy chuyền sang môi trường đặc ½VW. Sự phát sinh phôi vô tính này có sự khác biệt đáng kể giữa các mẫu cấy chuyền từ những bình nuôi cấy tăng sinh trên. Mô sẹo từ các bình nuôi cấy đặc ban đầu tiếp tục gia tăng sinh khối, chỉ có một số ít phôi vô tính xuất hiện. Mô sẹo từ các bình nuôi cấy lỏng lắc có kết cấu khá chắc và tạo ra lượng phôi vô tính khá nhiều. Số phôi được hình thành từ những mẫu cấy được cảm ứng trên môi trường lỏng lắc với nồng độ TDZ 2 mg/l là nhiều nhất (39,67 phôi). Vậy việc thêm vào môi trường nuôi cấy TDZ nồng độ 2 mg/l là thích hợp nhất cho việc cảm ứng tạo phôi vô tính trên lan Hồ Điệp. Thêm vào đó, giai đoạn nuôi cấy mô sẹo trong điều kiện lỏng lắc là rất cần thiết cho việc cảm ứng tạo phôi, phôi vô tính hình thành nhiều hơn và dễ nhận biết hơn. Môi trường nuôi cấy đặc ban đầu cũng tạo được phôi vô tính, tuy nhiên tỉ lệ phôi vô tính tạo thành không cao nên phương pháp này không cho được kết quả tốt nhất. A: Từ mô sẹo nuôi ở môi trường đặc bổ sung 2 mg/l TDZ. B: Từ mô sẹo nuôi ở môi trường lỏng lắc bổ sung 2 mg/l TDZ. Hình 3.3: Phôi lan Hồ Điệp hình thành trên môi trường đặc ½VW 39
  48. Đồ án tốt nghiệp ➢ Phương pháp nuôi cấy tạo phôi lan Hồ Điệp từ mô sẹo (Nguyễn Bá Hùng, Hồng Ngọc Trâm, 2005). Phôi vô tính sẽ hình thành khi nuôi cấy mô sẹo trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l + BA 2 mg/l + đường 30 g/l sau 11 tuần nuôi cấy. ➢ Tạo phôi thông qua nuôi cấy Protocorm lan Hồ Điệp (Jen Tsung Chen và Wei Chin Chang, Đài Loan). Jen-Tsung Chen và Wei-Chin Chang là hai nhà nghiên cứu Lan nổi tiếng ở Châu Á. Hai ông tiến hành nuôi cấy Protocorm lan Hồ Điệp trên môi trường ½MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng. Sau 45 ngày nuôi cấy (45NSC), 28,1% mẫu nuôi cấy hình thành phôi, trung bình 1 mẫu hình thành 1 phôi. Khi nuôi cấy thử nghiệm Protocorm lan Hồ Điệp trên môi trường MS bổ sung TDZ (Thidiazuron) (0,45M; 4,54M; 13.62M), hai ông thấy rằng TDZ có ảnh hưởng trực tiếp đến sự hình thành phôi vô tính. Trong đó, môi trường bổ sung TDZ nồng độ 13.62M cho hiệu quả tạo phôi cao nhất: gần 100% mẫu Protocorm hình thành phôi (45NSC). Trung bình 13.5 phôi/mẫu cấy Ngược lại, khi bổ sung thêm NAA (nồng độ 0,54M và 57,37M) sẽ ức chế sự tạo phôi. ➢ Ảnh hưởng của nước dừa và sucroza lên sự tăng sinh mô sẹo và sự hình thành phôi vô tính lan Hồ Điệp [Phalaenopsis Amabilis (L.) Blume] (Dương Tấn Nhựt và csv, 2009). Môi trường nuôi cấy cơ bản: môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BA, kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 1 g/l than hoạt tính. ✓ Sự tăng sinh của mô sẹo lan Hồ Điệp • Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng sinh của mô sẹo lan Hồ Điệp Trong nước dừa có chứa các chất dinh dưỡng như: acid amin, acid hữu cơ, glucoza, fructoza, sucroza và một số chất điều hòa sinh trưởng được biết đến nhiều nhất là Zeatin. Nước dừa được bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô sẹo ở nồng độ 20% (v/v), giúp tăng sinh mô sẹo hiệu quả nhất: từ 70 mg mô sẹo ban đầu tạo được 1286 mg sau 4 tuần nuôi cấy. 40
  49. Đồ án tốt nghiệp Khi không bổ sung nước dừa vào môi trường, mô sẹo của lan Hồ Điệp tăng sinh chậm, một số hóa nâu và chết. • Ảnh hưởng của sucroza lên sự tăng sinh và biệt hóa mô sẹo của lan Hồ Điệp Trong nuôi cấy mô thực vật, khi bổ sung nguồn cacbon dưới dạng đường vào môi trường, sẽ giúp mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia và tăng sinh khối mà không cần quang hợp. Trên môi trường có bổ sung 30 g/l sucroza, mô sẹo có khả năng tăng sinh tốt nhất: từ 70 mg mô sẹo ban đầu thu được 1455 mg sau 5 tuần nuôi cấy. Trọng lượng tươi của mô sẹo tiếp tục tăng sau 11 tuần, mô sẹo trên môi trường tơi xốp có màu vàng sáng, xuất hiện nhiều cụm lông. Trên môi trường bổ sung 60 g/l sucroza, mô sẹo tăng sinh yếu, nhiều mô sẹo thâm tím hóa đen và chết. Nguyên nhân do nồng độ sucroza cao đã làm tăng áp suất thẩm thấu của môi trường. ✓ Sự phát sinh phôi vô tính của mô sẹo lan Hồ Điệp • Ảnh hưởng của nước dừa lên sự phát sinh phôi vô tính của mô sẹo lan Hồ Điệp Nguồn đạm có ảnh hưởng đặc biệt đến sự phát sinh phôi, khi nồng độ đạm trong môi trường giảm, phôi vô tính sẽ hình thành. Nguồn đạm thường được sử dụng là nước dừa vì trong nước dừa rất giàu các acid amin. Trên môi trường bổ sung 40% (v/v) nước dừa, mô sẹo tăng sinh chậm và không chuyển thành phôi sau 15 tuần nuôi cấy. Trên môi trường không bổ sung nước dừa, phôi hình thành sau 11 tuần nuôi cấy. Còn với môi trường bổ sung 20% (v/v) nước dừa thì phải mất 15 tuần phôi mới hình thành. • Ảnh hưởng của sucroza lên sự phát sinh phôi vô tính của mô sẹo lan Hồ Điệp Trên môi trường không bổ sung sucroza toàn bộ mô sẹo chuyển thành màu xanh và hình thành PLB sau 5 tuần nuôi cấy. 41
  50. Đồ án tốt nghiệp Trên các môi trường chứa 30 g/l sucroza và 60 g/l sucroza, mô sẹo có màu vàng sáng và không phát sinh hình thái. Phải mất 11 tuần nuôi cấy một số mô sẹo phía ngoài khối mô sẹo trên môi trường chứa 30 g/l sucroza mới chuyển màu xanh. Trong nhiều trường hợp, sucroza có tác dụng ức chế sự tổng hợp diệp lục tố của mô nuôi cấy. 3.2. Các kết quả nghiên cứu về tạo PLB ➢ Tái sinh PLB từ mắt ngủ của phát hoa lan Hồ Điệp (Nguyễn Thanh Phong, 2010). Sự tái sinh PLB đòi hỏi trong môi trường nuôi cấy phải có cytokinin và auxin. Môi trường MS bổ sung Kinetin 2,2 mg/l, IAA 2 mg/l. Các cấu trúc tương tự PLB được hình thành từ mắt ngủ trên đoạn phát hoa trong vòng 50 ngày nuôi cấy. ➢ Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB lan hồ điệp Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) (Trần Xuân Ngọc Huy, 2010). Trên môi trường ½MS bổ sung 6 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA cho kết quả tăng trọng lượng PLB cao nhất. Môi trường ½MS bổ sung 8 mg/l BA và 0,3 mg/l NAA cho kết quả tạo ra số lượng PLB nhiều nhất. 3.3. Các kết quả nghiên cứu về tạo chồi ➢ Xác định môi trường thích hợp tạo chồi từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (Lê Tấn Thành và csv, 2013). Môi trường tạo chồi từ PLB thích hợp cho giống lan Hồ Điệp là môi trường ½MS có bổ sung 1,5 mg/l kinetin. Môi trường này cho tỉ lệ tạo chồi cao, chất lượng chồi tốt. Như vậy, cytokinin có vai trò rất quan trọng trong sự hình thành và phát triển chồi của cây lan Hồ Điệp. 42
  51. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.4: Chồi hình thành từ PLB lan Hồ Điệp ➢ Tái sinh chồi từ mô sẹo: Theo Thomas và Davey (1975) (trích dẫn bởi Trần Văn Minh, 2003) sự hình thành chồi từ mô sẹo được kích thích bởi: · Các chất điều hòa sinh trưởng đưa vào môi trường. · Chất được sản sinh ra trong nuôi cấy mô sẹo. · Các chất có chứa sẵn trong mẫu nuôi cấy. Khả năng hình thành chồi từ mô sẹo phụ thuộc vào số lần cấy chuyền mà các chất có trong mẫu không có khả năng tổng hợp trong thời gian dài (Gautheret, 1959) và sự hình thành tế bào xốp (Trần Văn Minh, 2003). Hình 3.5: Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ mô sẹo 43
  52. Đồ án tốt nghiệp 3.4. Các kết quả nghiên cứu về tạo hạt nhân tạo ➢ Khảo sát nồng độ sodium alginate đến sự hình thành của hạt nhân tạo (Nguyễn Hoàng Quân, 2007; Lê Tấn Thành và csv, 2013). Ở nồng độ 20 g/l vỏ hạt nhân tạo mềm, dễ vỡ, không hình thành vỏ hạt rõ ràng. Ở các nồng độ 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l vỏ hạt nhân tạo cứng và bọc toàn bộ phôi. Trong đó, nồng độ 30 g/l làm cho hạt nhân tạo tròn và đẹp. A: Nồng độ alginate 20 g/l B: Nồng độ alginate 30 g/l C: Nồng độ alginate 40 g/l D: Nồng độ alginate 50 g/l Hình 3.6: Hạt nhân tạo lan Hồ Điệp ở các nồng độ alginate Ở nồng độ alginate 20 g/l và 30 g/l, tỉ lệ hạt nhân tạo sống sót và nảy mầm cao hơn so với 40 g/l và 50 g/l. Vậy nên sử dụng nồng độ alginate 30 g/l để tạo hạt nhân tạo, để hạt vừa có hình thái đẹp vừa có tỉ lệ sống sót và nảy mầm cao. 44
  53. Đồ án tốt nghiệp ➢ Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tạo hạt nhân tạo (Nguyễn Hoàng Quân, 2007; Lê Tấn Thành và csv, 2013). Hạt nhân tạo có vỏ bọc môi trường MS, ½MS có tỉ lệ sống sót cao hơn các môi trường ¼MS và 1/8MS. Ở môi trường ½MS tỉ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo là cao nhất (>71%), thích hợp nhất cho việc tạo hạt nhân tạo. Vậy nên bổ sung môi trường dinh dưỡng ½MS khi tiến hành tạo hạt nhân tạo để nâng cao tỉ lệ sống và tỉ lệ nảy mầm của hạt. Hình 3.7: Hạt nhân tạo nảy mầm ➢ Khảo sát môi trường bảo quản hạt nhân tạo (Nguyễn Hoàng Quân, 2007; Lê Tấn Thành và csv, 2013). Trong môi trường lỏng (nước cất và nước đường), vỏ hạt bị thẩm thấu mềm và vỡ ra, không bao được phôi. Trong môi trường khô, vỏ hạt bị khô và bám chặt vào phôi. Trong môi trường agar và agar có đường, hạt bị chuyển sang màu vàng hoặc nâu đen. Trong môi trường MS, hạt vẫn giữ nguyên được hình thái ban đầu, màu sắc và hình dạng đều không đổi. Hạt nhân tạo sau khi bảo quản trong 3 tuần được đem cấy nảy mầm trên môi trường MS. 45
  54. Đồ án tốt nghiệp Kết quả cho thấy hạt nhân tạo được bảo quản trên môi trường MS có tỉ lệ nảy mầm cao hơn. Vậy môi trường MS là môi trường tốt nhất cho việc bảo quản hạt nhân tạo. Hạt nhân tạo vẫn giữ được hình dạng, màu sắc ban đầu và tỉ lệ nảy mầm của hạt là cao nhất. ➢ Khảo sát môi trường bảo quản hạt nhân tạo lan Phalaenopsis Amabilis (Dương Tấn Nhựt, 2007). Hạt nhân tạo từ PLB chứa 30 g/l sodium alginate trong vỏ hạt trên môi trường SA (3 g/l Hyponex, 5 ml/l vitamin MS, 30 g/l khoai tây nấu chín) với hàm lượng khoáng đa lượng, vi lượng giảm đi ½ và có bổ sung đường. Hạt được bảo quản ở điều kiện phòng trong thời gian 2 tháng, hạt vẫn có tỉ lệ sống sót 100%. Hạt nhân tạo từ mô sẹo chứa 30 g/l sodium alginate trong vỏ hạt trên môi trường SA với hàm lượng khoáng đa lượng, vi lượng giảm đi ½ và không bổ sung đường. Hạt dược bảo quản trong điều kiện phòng trong thời gian 2 tháng vẫn có tỉ lệ sống sót là 100%. Thời gian bảo quản hạt nhân tạo lâu có ý nghĩa quan trọng trong nhân giống và bảo quản hạt nhân tạo cũng như giảm chi phí nhân công. ➢ Khảo sát sự nảy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau (Nguyễn Hoàng Quân, 2007; Lê Tấn Thành và csv, 2013). Trên giá thể bông gòn hạt nhân tạo có tỉ lệ nảy mầm cao nhất (88,63) so với cầu giấy là (68,64) và môi trường MS đặc là (53,65). 46
  55. Đồ án tốt nghiệp PHẦN III: KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 1. Kết luận về quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp ✓ Nguồn mẫu làm hạt nhân tạo Theo Dương Tấn Nhựt và csv (2007), với các nguồn mẫu (mô sẹo, phôi vô tính, PLB) thì phôi vô tính là nguồn mẫu lý tưởng nhất cho tạo hạt nhân tạo trên đối tượng cây lan Hồ Điệp. Mẫu là mô sẹo: Mô sẹo có thể được tạo ra từ nuôi cấy các nguồn mẫu ban đầu hoặc từ PLB cây lan Hồ Điệp. Sử dụng các mô sẹo có kích thước đủ lớn, riêng rẽ không bị dính chùm, có màu vàng xanh rắn chắc. Việc sử dụng mô sẹo làm mẫu có những hạn chế như: kích thước quá nhỏ, khả năng dính cụm mô sẹo là khá cao dẫn đến có nhiều cây con nảy mầm trên cùng một hạt. Mẫu là phôi vô tính: Phôi vô tính được tạo ra từ các mô sẹo cây lan Hồ Điệp. Sử dụng các phôi hình tim hoặc phôi hình thủy lôi để làm hạt nhân tạo. Mẫu là PLB: Các PLB có thể được tạo ra từ nuôi cấy các nguồn mẫu ban đầu (đỉnh sinh trưởng, lá non in vitro bằng phương pháp vết thương) hoặc PLB được tái sinh từ mô sẹo. Tuy nhiên, các PLB có nguồn gốc từ mô sẹo là tốt nhất. Sử dụng các PLB ở giai đoạn 3 (giai đoạn chuẩn bị phát sinh chồi) để làm hạt nhân tạo. ✓ Môi trường tạo vỏ hạt nhân tạo Môi trường được sử dụng phổ biến là dung dịch sodium alginate. Hạt nhân tạo có hình dạng đẹp, tỉ lệ sống sót và nảy mầm cao khi nồng độ alginate là 30 g/l và bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng ½MS. ✓ Môi trường bảo quản hạt nhân tạo Môi trường bảo quản hạt nhân tạo tốt nhất là môi trường MS so với các môi trường ½MS, ¼MS, 1/8MS và nước cất (Nguyễn Hoàng Quân, 2007). Theo Dương Tấn Nhựt (2007), hạt nhân tạo từ PLB bảo quản trên môi trường SA với hàm lượng khoáng đa lượng, vi lượng giảm đi ½, có bổ sung đường ở điều kiện phòng trong thời gian 2 tháng, hạt vẫn có tỉ lệ sống sót 100%. Hạt nhân tạo từ mô sẹo bảo quản trên môi trường SA với hàm lượng khoáng đa lượng, vi 47
  56. Đồ án tốt nghiệp lượng giảm đi ½, không có đường ở điều kiện phòng trong thời gian 2 tháng, hạt vẫn có tỉ lệ sống sót là 100%. ✓ Giá thể cho hạt nhân tạo nảy mầm Trên giá thể bông gòn hạt nhân tạo có tỉ lệ nảy mầm cao nhất (88,63) so với cầu giấy là (68,64) và môi trường MS đặc là (53,65). 2. Những nhân tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp Nguồn mẫu để làm hạt nhân tạo (mô sẹo, phôi vô tính, PLB) chất lượng tốt, đồng đều là yếu tố quyết định chất lượng của hạt nhân tạo được tạo ra có chất lượng cao. Nồng độ chất làm vỏ bọc cho hạt nhân tạo sodium alginate ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tạo vỏ bọc, tỉ lệ sống sót và nảy mầm của hạt nhân tạo. Nồng độ thích hợp nhất khảo sát được là nồng độ alginate 30 g/l cho ra hạt nhân tạo vừa có hình thái đẹp vừa có tỉ lệ sống sót và nảy mầm cao. Do phôi vô tính không có lớp nội nhũ như phôi hữu tính nên việc bổ sung môi trường dinh dưỡng vào dung dịch chất tạo vỏ hạt nhân tạo giúp nâng cao tỉ lệ sống sót và tỉ lệ nảy mầm cho hạt nhân tạo. Môi trường tạo vỏ có bổ sung môi trường dinh dưỡng ½MS là môi trường thích hợp nhất để tạo ra những hạt nhân tạo có tỉ lệ sống sót và tỉ lệ nảy mầm cao. Chất điều hòa sinh trưởng giúp kích thích sinh trưởng và nảy mầm của phôi, than hoạt tính giúp tăng khả năng hô hấp và giữ lại chất dinh dưỡng vì thế cũng được bổ sung vào môi trường dùng làm vỏ bọc cho hạt nhân tạo. 3. Kiến nghị Thử nghiệm nuôi cấy phát sinh mô sẹo từ nhiều nguồn mẫu khác nhau như: thân, lá, rễ của cây lan Hồ Điệp ở các môi trường, các nồng độ và các chất kích thích sinh trưởng khác nhau nhằm tạo ra số lượng mô sẹo lớn, chất lượng tốt trong thời gian ngắn nhất. Nuôi cấy tăng sinh mô sẹo trên các môi trường khác nhau với các chất kích thích sinh trưởng khác nhau và với các nồng độ khác nhau để tìm ra phương pháp 48
  57. Đồ án tốt nghiệp tốt nhất cho từng mục đích như: tạo ra được nhiều mô sẹo, mô sẹo tạo ra có khả năng cảm biến tạo phôi soma cho kết quả tốt nhất. Thử nghiệm nuôi cấy mô sẹo trên các môi trường khác nhau với các nồng độ TDZ khác nhau hoặc bổ sung thêm NAA (như đã thực hiện trên cây chuối, hoa lily ) để tìm ra phương pháp cảm ứng tạo phôi soma hiệu quả nhất. Thử nghiệm nuôi cấy và phát sinh phôi soma từ hệ thống bình nuôi cấy Bioreactor với công nghệ hiện đại và tự động hóa cho năng suất cao. Nghiên cứu tìm ra môi trường thích hợp nhất cho hạt nhân tạo nảy mầm. Đặc biệt, nghiên cứu tạo ra những hạt nhân tạo có khả năng nảy mầm tốt ngay cả khi được gieo trực tiếp trên đất trồng. Tiếp tục mở rộng và hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro, phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo cho những giống Lan hay các loại cây khác có giá trị kinh tế cao. 49
  58. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Trần Xuân Ngọc Huy (2010). Nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) trong một số hệ thống nuôi cấy khác nhau, Đồ án tốt nghiệp, Đại Học Công Nghệ, tp.HCM. 2. Lê Văn Hướng (2005). Tạo phôi từ vài cơ quan của Phalaenopsis sp. trong nuôi cấy in vitro, Luận văn thạc sĩ, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, tp.HCM. 3. Đào Thị Lý (2009). Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khoáng đa lượng đến sự hình thành và phát triển chồi lan Hổ Điệp (Phalaenopsis Yubidan) và lan Dendrobium Sonia trong hệ thống nuôi cấy ngập tạm thời TIS (Temporary Immersion System), Đồ án tốt nghiệp, Đại Học Công Nghệ, tp.HCM. 4. Dương Tấn Nhựt và csv (2007). Tái sinh và bảo quản hạt nhân tạo của cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis Amabilis), Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5 (1), 85 - 95. 5. Dương Tấn Nhựt và csv (2009). Ảnh hưởng của nước dừa và sucroza lên sự tăng sinh mô sẹo và sự hình thành phôi vô tính ở loài lan Hồ Điệp [Phalaenopsis Amabilis (L.) Blume], tạp chí Sinh Học, 31 (1), 77 - 84. 6. Liêu Hồng Phú (2005). Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.), Khóa luận tốt nghiệp, Đại Học Nông Lâm, tp.HCM. 7. Nguyễn Hoàng Quân (2007). Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda., Khóa luận tốt nghiệp, Đại Học Nông Lâm, tp.HCM. 8. Lê Tấn Thành, Huỳnh Minh Trí, Phan Hồng Thảo, Trần Quang Khương, Phạm Minh Tấn, Trần Phan Nhân (2013). Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo từ cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.), Đồ án thực vật, Đại Học Công Nghệ, tp.HCM. 9. Ưng Thị Mỹ Tiên (2011). Nhân giống lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp. bằng kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS - Temporary Immersion System), Khóa luận tốt nghiệp, Đại Học Công Nghệ, tp.HCM. 50
  59. Đồ án tốt nghiệp TIẾNG NƯỚC NGOÀI 10. Broly H (1982). Contribution a la multiplication clonale des Orchidées: Phalaenopsis, Paphiopedilum et Cymbidium, Thèse Docteur Inggenieur en Biologie et Physiologie végétale, Université de sciences et techniques de Lille. 11. De Vries J.T (1953). On the flowering of Phalaenopsis schilleranna, Rchb. Ann. Bogor, 1, 61 - 67. 12. Grossmann K (1991). Induction of leaf abscission in cotton is a common effect of urea and adenin type cytokinins, Plant Physiol, 95, 234 - 237. 13. Hare, P.D.; Staden, J. (1994). Inhibitory effect of TDZ on the activity of cytokinin oxidase isolated from soybean callus, Plant cell Physiol, 35, 1121 - 1125. 14. Hackett W.P. et al (1973). Adventitious bud formation on Phalaenopsis nodes as a propagation method, Univ. Calif. Ext. Serv. Floer Rep. March, 4 - 5. 15. Young So Park, H. N Murthy & Paek Kee Yoeup. (2000). Mass Multiplication of protocorm - like bodies using Bioreactor system and subsequent plant regeneration in Phalaenopsis, Chungbuk National University, Korea. INTERNET 16. Nguyễn Phan Thị Hoàng Kim, Nguyễn Thị Thùy Linh, Phạm Thị Điểm. Phương pháp tạo hạt nhân tạo, 7/2014, 17. Nguyễn Hiền Nhơn. Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB và tạo chồi từ PLB giống lan Phalaenopsis amabilis Yubidan phục vụ sản xuất cây giống, 7/2014, nhan-plb-va-tao-choi-tu-plb-giong-lan-phalaenopsis-amabilis-yubidan-phuc- 52384/ 18. TS. Dương Tấn Nhựt. Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong việc nhân nhanh lan Hài và lan Hồ Điệp, Phân viện sinh học Đà Lạt, 7/2014, 51
  60. Đồ án tốt nghiệp VN/a/book/Pages/books/TonghopHoiThaoNam2004/ung%20dung%20cn%20 ncm%20te%20bao%20thuc%20vat%20torng%20viec%20nhan%20nhanh%20 lan%20hai%20va%20hai%20hodiep.htm 19. Nguyễn Thanh Phong. Rút ngắn thời gian vi nhân giống lan Hồ Điệp, Trung tâm công nghệ sinh học TP. HCM, 7/2014, 20. Nguyễn Thị Tân, Nông Kim Ngọc, Phạm Thị Lan Hương, Nông Thị Quỳnh Anh, Nguyễn Văn Du. Nhân giống vô tính in vitro, 7/2014, 21. Truy cập tháng 7/2014, 573763.html 22. Truy cập tháng 7/2014, 23. Truy cập tháng 7/2014, %E1%BB%93_%C4%91i%E1%BB%87p 24. Truy cập tháng 7/2014, 52