›

Đồ án Thực nghiệm công nghệ tổng hợp Double Stranded rna vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879)

pdf 53 trang thiennha21 12/04/2022 5360
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Thực nghiệm công nghệ tổng hợp Double Stranded rna vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_thuc_nghiem_cong_nghe_tong_hop_double_stranded_rna_vao.pdf

Nội dung text: Đồ án Thực nghiệm công nghệ tổng hợp Double Stranded rna vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879)

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỰC NGHIỆM CÔNG NGHỆ TỔNG HỢP DOUBLE STRANDED RNA VÀO NGHIÊN CỨU CHUYỂN ĐỔI GIỚI TÍNH TÔM CÀNG XANH Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Cán bộ hướng dẫn : Th.S BÙI THỊ LIÊN HÀ Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KIM HOÀNG MSSV: 0851110091 Lớp: 08DSH4 TP. Hồ Chí Minh, 2012
  2. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) (De Man, 1879) là một trong những loài giáp xác thương mại rất quan trọng, được đánh bắt và nuôi trồng rộng rãi và phân bố tự nhiên trong các ruộng lúa (New, 2005). Năm 1987, sản lượng M. rosenbergii toàn cầu ước tính đạt khoảng 27000 tấn mỗi năm (New, 1990). Một số lượng lớn được sản xuất ở Trung Quốc và mở rộng nhanh chóng ra Ấn Độ và Bangladesh (New, 2005). Ngày nay, nó được nuôi rộng rãi ở các nước trên thế giới. Trong thập kỷ qua, sản lượng trung bình mỗi năm của M. rosenbergii tăng 9-35,5% về giá trị. Năm 1993, tổng sản lượng là 17,164 tấn, trị giá 116,799,000 USD và năm 2005 đạt 205,033 tấn với trị giá 896,263,000 USD. Việc nuôi trồng tôm càng xanh đóng góp lớn vào ngành nuôi trồng thủy sản toàn cầu, cả về số lượng và giá trị. M. rosenbergii được nuôi nhiều ở Châu Á và một số khu vực khác như Châu Phi, Israel, Trung và Nam Mỹ (Nhan, 2009). Tại Việt Nam, tôm càng xanh là đối tượng nuôi bản địa được nông dân ưa thích, được nhiều địa phương xác định là đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cao, đặc biệt là những khu vực nuôi tôm thương mại ở lưu vực sông Mê Kông. Do đó nhu cầu về con giống cho việc nuôi đại trà là rất lớn. Tuy nhiên, trong quá trình tăng trưởng, con đực thường lớn nhanh hơn con cái. Khi chiều dài cơ thể đạt trung bình 8-14 cm và trọng lượng 10-20 g, tốc độ phát triển của con đực và con cái tương đương nhau. Nhưng khi chiều dài cơ thể vượt quá 14 cm, con đực thường lớn nhanh hơn con cái (Lê Quang Khôi, 2009). Do ở giai đoạn này con cái ngưng phát triển và tập trung dưỡng chất cho việc sinh sản (Ra`anan và Cohen, 1984). Tôm đực lớn nhất có thể đạt 110 g, trong khi tôm cái lớn nhất chỉ đạt 50 g sau 7 tháng nuôi (Lê Quang Khôi, 2009). Đây là một vấn đề gây trở ngại lớn cho nghề nuôi tôm càng xanh thương phẩm vì con có kích thước càng lớn thì giá thành càng cao và sản lượng thu hoạch cũng sẽ tăng cao. Nghiên cứu của Sagi và Ra`anan trong năm 1988 đã chứng minh rằng việc nuôi tôm càng xanh toàn đực đạt sản lượng cao hơn việc nuôi toàn cái hay đực và cái trong cùng quần thể. Khối lượng trung bình của mỗi quần thể lần lượt là 473 1
  3. Đồ án tốt nghiệp g/m2, 248 g/m2 và 260 g/m2. Những nhà khoa học Ả Rập Xê Út cũng đã báo cáo những kết quả tương tự khi tiến hành thí nghiệm nuôi tôm toàn đực, toàn cái và hỗn hợp cả đực và cái (Siddiqui, 1997). Điều này thể hiện rằng việc nuôi tôm càng xanh toàn đực đã làm tăng sản lượng một cách đáng kể và mang lại lợi nhuận cao hơn việc nuôi toàn cái hay hỗn hợp đực và cái. Do đó, sự phát triển những kỹ thuật cho việc sản xuất quần thể toàn đực là nhu cầu cần thiết cho việc nuôi tôm càng xanh. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh chức năng làm bất hoạt gene của iRNA trong tế bào tôm (Estrada và ctv, 2007). Và đây là một trong những công cụ có tiềm năng đáp ứng cho việc sản xuất ra tôm càng xanh toàn đực. Kỹ thuật bất hoạt RNA (Guo và Kempheus, 1995) đã được sử dụng như một công cụ hiệu quả để làm bất hoạt các sản phẩm gene bằng cách tiêm RNA mạch đôi vào trong cơ thể của nhiều loài giáp xác (Tiu, 2007; Hiu, 2008). Ý tưởng tạo ra con cái giả bằng cách làm bất hoạt RNA thông tin mã hóa gene tuyến đực insuline-like của tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii insuline-like androgenic gland, Mr-IAG) bằng RNA mạch đôi (dsRNA) đã được thực hiện thành công tại quy mô phòng thí nghiệm (Ventura và ctv, 2009). Kể từ đó, kỹ thuật bất hoạt RNA hứa hẹn như là một hướng tiếp cận mới để tạo ra quần thể tôm toàn đực cho việc nuôi tôm càng xanh thương mại. Xuất phát từ những nhu cầu con giống tôm càng xanh đực từ thị trường thì đề tài “Thực nghiệm công nghệ tổng hợp double stranded RNA vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879)” là cần thiết và đang được nhiều mong đợi. Mục tiêu đề tài là ứng dụng dsRNA để tạo ra tôm càng xanh cái giả, từ con cái giả này sẽ sản xuất ra tôm càng xanh toàn đực để đáp ứng nhu cầu cho việc nuôi tôm càng xanh thương phẩm. Những nội dung cần thực hiện là: + Tổng hợp Mr-IAG RNA mạch đôi cho kỹ thuật bất hoạt RNA. + Kiểm tra hiệu quả của Mr-IAG RNA mạch đôi đối với việc chuyển đổi giới tính của tôm càng xanh với các nồng độ và tần suất tiêm khác nhau. 2
  4. Đồ án tốt nghiệp + Kiểm tra ảnh hưởng của thời gian tiêm Mr-IAG RNA mạch đôi lên sự tạo thành tôm càng xanh cái giả. Phương pháp nghiên cứu của đề tài là thu thập thông tin từ các bài báo khoa học đã công bố, các nghiên cứu trong và ngoài nước, thu thập các số liệu thực nghiệm và xử lý bằng phần mềm excel. Các kết quả đạt được của đề tài: + Tổng hợp thành công dsRNA bằng bộ kit Promega. + Khảo sát được nồng độ tiêm dsRNA 1,25 µg/g, tần suất tiêm 1 lần/tuần là có thể làm bất hoạt gene mã hóa cho hormone tuyến đực ở tôm PL25 để tạo ra tôm càng xanh cái giả. + Thời gian tiêm dsRNA phải kéo dài đến khi con cái giả thành thục sinh sản. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương: + Chương 1. Tổng quan: giới thiệu sơ lược về tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii, tổng quan về tuyến đực, cơ chế làm bất hoạt gene của iRNA. + Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: vật liệu sinh học là tôm PL25, phương pháp tổng hợp dsRNA theo bộ kit Promega, thí nghiệm tiêm được thực hiện với 3 nồng độ tiêm là 5 µg/g; 2,5 µg/g và 1,25 µg/g và các tần suất tiêm là 3 lần/ tuần, 2 lần/tuần và 1 lần/tuần. Thí nghiệm thời gian tiêm được thực hiện trong vào 4 tháng với nồng độ tiêm là 1,25 µg/g và tần suất tiêm là 1 lần/tuần. + Chương 3. Kết quả và thảo luận: nêu lên các kết quả đạt được là tổng hợp được dsRNA, nồng độ và tần suất tiêm dsRNA tốt nhất, tạo được con cái giả đến tháng thứ 4 của thí nghiệm. + Chương 4. Kết luận và đề nghị: một số kết quả mà đề tài đã đạt được và đưa ra một số kiến nghị để làm hướng nghiên cứu trong tương lai. 3
  5. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Phân loại (New, 2002) Tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1897), là loài đầu tiên được biết đến trong giống Macrobrachium và được công nhận lần đầu tiên vào năm 1705. Quá trình đặt tên cho tôm càng xanh cả giống và loài đã gặp khá nhiều khó khăn trong lịch sử. Trong quá khứ tên của giống bao gồm cả Cancer (Astacus) và Palaemon. Trước kia, tên M. rosenbergii bao gồm Palaemon carcinus, P. dacqueti, và P. rosenbergii và đến năm 1959 tên khoa học Macrobracchium rosenbergii xuất hiện và được chấp nhận phổ biến ở hầu hết các nước. Giới: Animalia Ngành: Arthropoda Ngành phụ: Crustacea Lớp: Malacostraca Bộ: Decapoda Bộ phụ: Pleocyemata Phân bộ: Caridea Họ: Palaemonidae Họ phụ: Palaemoninae Giống: Macrobrachium Loài: M. rosenbergii (De Man, 1879) Tên tiếng anh: Giant freshwater prawn. 1.2. Đặc điểm sinh học của tôm càng xanh 1.2.1. Phân bố Tôm càng xanh M. rosenbergii phân bố tự nhiên ở Đông Nam Á, các nước ở Nam Thái Bình Dương, phía Bắc châu Đại Dương và phía Tây của các đảo Thái Bình Dương (New và Singholka, 1982; New, 2002). Tôm càng xanh phân bố ở tất cả các thủy vực nước ngọt và các thủy vực nước lợ của nhiều vùng trên thế giới (Nguyễn Việt Thắng, 2003). Môi trường sống 4
  6. Đồ án tốt nghiệp của tôm càng xanh đa dạng trong thủy vực nước trong cũng như nước đục. Ở Việt Nam, tôm càng xanh phân bố chủ yếu ở các tỉnh Nam Bộ đặc biệt ở vùng đồng bằng sông Cửu Long (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2002). 1.2.2. Vòng đời và tập tính sống Vòng đời của tôm càng xanh được chia làm 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, hậu ấu trùng và tôm trưởng thành. Khi tôm đã trưởng thành, chúng thường sống trong môi trường nước ngọt như: sông, rạch, ao, hồ. Cũng chính nơi đây xảy ra quá trình thành thục, phát dục và giao vĩ đẻ trứng. Nhưng khi ôm trứng chúng có xu thế 0 bơi ra vùng nước lợ từ 6-18 /00, ở đó ấu trùng được nở ra và sống trôi nổi theo kiểu phù du. Sau 11 lần lột xác với 12 giai đoạn biến thái ấu trùng (Nauplii) biến thành hậu ấu trùng (Postlarvae-PL) lúc này tôm con di cư về vùng nước ngọt, sống và lớn lên ở đây (Ling và Omerica, 1962; Nguyễn Thanh Phương, 2003). Ấu trùng có tính hướng quang mạnh, vận động trôi nổi trong nước. Sang thời kỳ hậu ấu trùng và giai đoạn trưởng thành, tôm có tập tính sống ở đáy, bám vào cây cỏ; giá thể Tôm trưởng thành ít hoạt động và thường ẩn náo vào ban ngày và tích cực hoạt động vào ban đêm. Tôm càng xanh có tập tính ăn thịt lẫn nhau, vì vậy việc dùng giá thể tăng chổ ẩn nắp, hạn chế hiện tượng ăn thịt lẫn nhau để nâng cao tỷ lệ sống của tôm (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008). 1.2.3. Hình thái và tăng trưởng Dựa vào hình dạng và màu sắc để phân biệt giữa tôm càng và các nhóm tôm khác. Tôm càng xanh có cơ thể thon dài, đối xứng 2 bên. Con trưởng thành thường có màu xanh dễ nhận, đôi khi có màu nâu nhạt (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008). Tôm càng xanh ở nước ta có trọng lượng cá thể khá lớn, con đực đạt tới 450 g/cá thể, thân tương đối tròn, cá thể trưởng thành có màu xanh dương đậm. Chủy phát triển nhọn và cong lên ½ bề dài tận cùng của chủy, phía trên mắt chủy có 11- 15 răng và 3-4 răng sau hốc mắt. Mặt dưới thường có 12-15 răng. Chiều dài chủy của con cái khi trưởng thành thường bằng hoặc ngắn hơn vỏ đầu ngực, còn chủy của con đực dài hơn chiều dài ở đầu ngực (Lê Quang Khôi, 2009). 5
  7. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1. Tôm càng xanh M. rosenbergii Chân thứ 2 luôn phát triển hơn các chân khác, nhất là con đực trưởng thành, đôi chân bò thứ 2 có hình dạng và kích thước giống nhau ở 2 phía (trái và phải); (Lê Quang Khôi, 2009). Đặc điểm về kích cỡ, hình dạng, màu sắc và các gai trên đôi càng sẽ thay đổi theo giai đoạn thành thục của tôm, nhất là ở tôm đực. Khi tôm còn nhỏ, đôi càng có màu trong, sau chuyển thành vàng cam (còn gọi là càng lửa), chưa có gai hay có gai rất mịn trên càng, chưa có hay rất ít lông tơ. Khi tôm lớn, đôi càng có màu xanh đậm, xuất hiện nhiều gai nhọn và lông tơ trên càng. Quá trình thay đổi trên được thể hiện qua các giai đoạn như: tôm nhỏ, tôm càng lửa nhạt, tôm càng lửa đậm, tôm càng lửa đậm chuyển tiếp càng xanh, tôm càng xanh nhạt, tôm càng xanh đậm và tôm già (Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2009). Trong quá trình tăng trưởng, con đực thường lớn nhanh hơn con cái. Khi chiều dài cơ thể đạt trung bình 8-14 cm và trọng lượng 10-20 g, tốc độ phát triển 6
  8. Đồ án tốt nghiệp của con đực và con cái tương đương nhau. Nhưng khi chiều dài cơ thể vượt quá 14 cm, con đực thường lớn nhanh hơn con cái (Lê Quang Khôi, 2009). 1.3. Đặc điểm sinh sản của tôm càng xanh 1.3.1. Phân biệt tôm đực và tôm cái Tôm càng xanh trưởng thành không những dễ dàng phân biệt đực và cái qua đôi chân bò thứ 2 (càng) mà còn qua cơ quan sinh dục như lỗ sinh dục đực nằm ở gốc chân bò thứ 5, lỗ sinh dục cái nằm ở gốc chân bò thứ 3 (Nguyễn Việt Thắng, 1993). Tôm đực có kích cỡ lớn hơn tôm cái cùng tuổi. Đầu ngực tôm đực to hơn và khoang bụng hẹp hơn tôm cái. Đôi càng thứ 2 to, dài và thô. Cơ quan sinh dục trong của con đực gồm một đôi tinh sào, một đôi ống dẫn tinh và đầu mút. Đôi tinh sào ngoằn ngèo nằm giữa mặt lưng của giáp đầu ngực nối với ống dẫn tinh chạy từ trước tim dọc sang 2 bên viềng sau của giáp đầu ngực và đổ vào đầu mút nằm ở đốt gốc của chân ngực thứ năm. Túi tinh hình thành trong quá trình phóng tinh. Túi tinh chứa khối tinh trùng không di động. Ở con cái, buồng trứng nằm trên mặt lưng của phần đầu ngực, giữa dạ dày và gan tụy. Khi buồng trứng thành thục sẽ có màu vàng có thể nhìn thấy qua giáp đầu ngực, trải dài từ sau mắt đến đốt đầu của phần bụng. Ống dẫn trứng nối từ buồng trứng ở trước tim chạy dọc 2 bên về phía bụng đổ về túi chứa tinh ở đốt gốc của chân ngực thứ ba (Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2009). 7
  9. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1. Tóm tắt đặc điểm của tôm đực và tôm cái Đặc điểm Tôm đực Tôm cái Kích cỡ Lớn hơn và đầu ngực to Nhỏ hơn và đầu ngực nhỏ hơn tôm cái hơn tôm đực Càng Đôi càng thứ 2 rất to, ghồ Nhỏ hơn và nhẵn hơn ghề, nhiều gai càng của tôm đực Lỗ sinh dục Hiện diện dưới gốc của Hiện diện dưới gốc của chân ngực thứ năm và có chân ngực thứ ba, có nắp đậy màng mỏng bao phủ. Bụng Mặt bụng có đốt thứ nhất Tôm cái thành thục có có điểm cứng ở giữa tấm bụng thứ nhất, thứ 2, thứ ba dài và nở rộng, hình thành buồng ấp trứng. Lông tơ sinh dục Không có Xuất hiện nhiều trên chân ngực và chân bụng của tôm trưởng thành Tuyến androgenic Dãy tế bào dính vào vùng Không có cuối của ống dẫn tinh Chiều dài và kích cỡ thành Chiều dài 17,5 cm, trọng Chiều dài 15 cm, trọng thục lượng trung bình 35 g lượng trung bình 25 g. Phụ bộ giao vĩ Xuất hiện những nhánh Không có trong và nhánh phụ trong của chân bụng thứ 2 (Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2009). 1.3.2. Thành thục, giao vĩ, đẻ trứng và ấp trứng của tôm càng xanh Trong tự nhiên cũng như trong điều kiện nhân tạo, tôm thành thục và giao vĩ xảy ra hầu như quanh năm. Mùa đẻ rộ của tôm càng xanh ở đồng bằng Nam Bộ tập trung từ tháng 4-6 và từ tháng 8-10 (Nguyễn Việt Thắng, 1993; Nguyễn Thị Thanh 8
  10. Đồ án tốt nghiệp Thủy, 2005). Tôm cái thành thục lần đầu tiên ở khoảng 3-3,5 tháng kể từ hậu ấu trùng 10-15 ngày (PL10-15). Kích cở tôm nhỏ nhất đạt thành thục từ 10-13 cm và 7,5 g (Nguyễn Việt Thắng, 1993). Quá trình lột xác tiền giao vĩ của tôm cái sẽ tiết ra chất dẫn dụ có tác dụng kích thích tôm đực tìm đến. Sau khi tôm lột xác 1-22 giờ, thường 3-6 giờ, tôm bắt đầu giao vĩ. Toàn bộ quá trình tiếp xúc và giao vĩ xảy ra trong vòng 20-35 phút. Sau khi giao vĩ 2-5 giờ, có khi 6-24 giờ, tôm cái bắt đầu đẻ trứng (Nguyễn Thanh Phương, 2003). Tôm thường đẻ trứng vào ban đêm. Tôm cái thường di chuyển từ tầng đáy lên tầng giữa hay tầng mặt để đẻ. Trong quá trình đẻ trứng, trứng được thụ tinh khi đi ngang túi chứa tinh. Trứng sẽ lần lượt dính từng chùm vào các lông tơ của các đôi chân bụng thứ tư, thứ ba, thứ hai, thứ nhất. Thời gian đẻ trứng khoảng 10-60 phút và thông thường từ 15-25 phút. Những tôm cái thành thục chín muồi nhưng không được giao vĩ vẫn đẻ trứng trong vòng 24 giờ sau khi lột xác. Những trứng này do không được thụ tinh nên sẽ rụng sau 1-2 ngày (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2002). Trong quá trình ấp trứng, tôm cái thường dùng chân bụng quạt nước, tạo dòng nước, cung cấp dưỡng khí cho trứng. Thời gian ấp trứng đến trứng nở có thể từ 15-23 ngày phụ thuộc vào nhiệt độ nước (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008). 1.4. Tổng quan về tuyến đực Hệ thống nội tiết của nhóm giáp xác gồm một phần của tuyến sinus và cơ quan X nằm trong cuống mắt. Cơ quan X sản xuất gonal-inhibiting hormone (GIH) và molt-inhibiting hormone được giữ trong tuyến sinus trước khi được lưu thông trong cơ thể. Ở giáp xác cơ quan Y nằm trong trung tâm phần đầu ngực và sản xuất ra gonal-stimulating hormone (GSH) và ecdysone. GIH và GSH tác động trực tiếp vào buồng trứng và gián tiếp vào tinh hoàn thông qua sự tiết hormone từ tuyến androgenic (AGH). Giáp xác có các cơ quan thuộc hàm dưới, các cơ quan neurohemal, đây là những vị trí tổng hợp và tiết ra methyl farnosoate, một loại hormone có vai trò quan trọng trong sự trưởng thành sinh dục ở con đực và con cái, phát triển hệ thống sinh sản rõ 9
  11. Đồ án tốt nghiệp ràng, tạo noãn hoàn, khác biệt hình thái và hành vi giao phối (Ohs và ctv, 2006). 1.4.1. Phụ bộ đực Phụ bộ đực là cơ quan giao cấu ở tôm càng xanh đực nó xuất hiện ở chân bơi thứ 2. Chồi của phụ bộ đực bắt đầu xuất hiện vào giai đoạn khoảng 70 ngày tuổi sau giai đoạn postlarve (trọng lượng 0,38 g, tổng chiều dài 3,7 cm) đến giai đoạn 94 ngày tuổi thì phụ bộ đực phát triển đầy đủ (Chung Quang Trí, 2006). Hình 1.2. Chân bơi thứ 2 của tôm càng xanh đực (Chung Quang Trí, 2006) 1.4.2. Tuyến đực Những tế bào thuộc tuyến đực được quan sát đầu tiên bởi Faxon (1884) trong tôm nước ngọt Cambarus montanus. Tuyến hormone đã được xác định sau đó ở giáp xác Orchestia gammarellus vào 1953, và mô đó được gọi là tuyến đực (Charniaux - Cotton, 1953). Những nghiên cứu sau này đã cho thấy rõ hơn về tuyến đực, nó là một lớp mô mỏng gắn ở phần cuối ống dẫn tinh của tôm nước ngọt Procambarus blandingii, P. viae - viridis, Camb. bartonni và Camb. diogenees, có chiều dài vài milimet. Những cấu trúc tương tự cũng đã được quan sát ở cua Callinectes sapidus (King, 1964). Theo Sagi (2001) “Ở giáp xác, tinh sào là nơi tạo tinh trùng còn cơ quan tạo hormone là tuyến đực. Nếu ở con đực động vật có xương sống, tuyến sinh dục đực (tinh sào) có 2 chức năng căn bản là tạo tinh trùng và nội tiết như testosterone thì ở 10
  12. Đồ án tốt nghiệp tôm càng xanh 2 chức năng này thực hiện bởi 2 cơ quan riêng lẻ. Tinh sào ở tôm càng xanh chuyên tạo tinh, còn tuyến đực (androgenic gland) - một cơ quan biệt lập khác có chức năng tiết ra hormone, tham gia vào sự biệt hóa giới tính và phát triển những đặc điểm sinh dục thứ cấp, ảnh hưởng lên kích thước và sự tăng trưởng”. Ở những tôm lớn người ta có thể thấy được tuyến đực tương đối rõ. Đó là một khối tế bào có hình kim tự tháp, dính với phần sau ống phóng tinh (Chung Quang Trí, 2006). 1.4.3. Hormone tuyến đực Hormone tuyến đực đã được tìm ra trên nhóm giáp xác chân đều Armadilidium vulgare là một protein gồm có 3 chuổi peptide A (chứa 29 aa), B (44 aa), và C (45 aa), ngoài ra trên chuổi A ở aa thứ 18 còn có thêm một nhóm carboxyl (Martin và ctv, 1999). 1.5. Hoạt động của tuyến AG (Androgenic gland) Tuyến androgenic có nhiều nhất là ở tôm đực càng xanh, chứa trong mạng lưới nội chất sần sùi của tế bào chất. Hoạt động của tuyến androgenic đóng vai trò kiểm soát hoạt động phát dục của M. rosenbergii (Okumura và Hara, 2004). Tuyến androgenic là hormone tuyến đực được xác định đầu tiên ở cua Callinectes sapidus bởi Cronin (1947). Ở giáp xác 10 chân tuyến androgenic nằm ở tận cùng của ống dẫn tinh. Các tế bào được sắp xếp thành các lớp mỏng, song song và nối nhau hay ở cấu trúc dạng thùy. Ở M. rosenbergii tuyến androgenic là sự kết hợp của 2 cấu trúc trên (Sagi, 1995). Tuyến androgenic có vai trò trong điều khiển giới tính của giáp xác bộ mười chân. Nó làm xuất hiện những đặc điểm hình thể bên ngoài của con đực (Taketomi và ctv, 1990). Tuyến androgenic cũng là hormone chịu trách nhiệm biệt hóa giới tính đực ở giáp xác (Charniaux-Cotton và Payen, 1985; Katakura, 1989). Gần đây hormone tuyến androgenic đã được xác định là hormone peptide và trình tự cDNA của nó đã được phát hiện ở Armadillidium vulgare (Martin và ctv, 1999; Okuno và ctv, 1999). Tuyến androgenic có chức năng điều khiển giới tính đực khác nhau, tuyến sinh dục khác nhau và sự phát triển của các phần phụ sinh dục ở tôm càng xanh M. 11
  13. Đồ án tốt nghiệp rosenbergii (Nagamine và ctv, 1980). Sự phát triển của mạng lưới nội chất sần sùi trong tế bào chất của tuyến androgenic có liên quan đến hoạt động sinh sản của con đực ở một vài loài giáp xác mười chân (King, 1964; Taketomi và ctv, 1990). Ở tôm đực M. rosenbergii, phân biệt 3 kiểu hình thái nhờ vào màu sắc và chiều dài càng và hoạt động sinh sản: con đực nhỏ, con đực càng vàng và con đực càng xanh (Ra’anan và Sagi, 1985; Kuris và ctv, 1987). Mỗi kiểu hình thái được mô tả để phân biệt hoạt động sinh sản khác nhau. Con đực nhỏ có đôi càng ngắn, chưa có hoạt động giao phối và phát triển thành con đực càng cam. Con đực càng cam cơ thể phát triển nhanh chóng và không giao phối. Con đực càng cam phát triển thành con đực càng xanh, con đực càng xanh có hoạt động giao phối với con cái trưởng thành. Hoạt động sinh tinh thay đổi theo hình thái khác nhau; cao ở con đực nhỏ và con đực càng cam, nhưng thấp ở con đực càng xanh, tinh hoàn tôm đực càng xanh thì đầy tinh trùng chín và được sử dụng để dự trữ (Sagi và ctv, 1988). Sự khác biệt của các kiểu hình thái này chịu tác động kiểm soát của tuyến androgenic, đây là nền tảng cho thí nghiệm cắt bỏ tuyến androgenic (Sagi và ctv, 1990). Theo Fingerman (1997), AGH là hormone điều khiển biệt hóa giới tính thành con đực và phát triển các đặc điểm sinh dục đực thứ cấp. Sự tiết GSH và GIH được cho là do quy định của một số chất dẫn truyền thần kinh và tác động trực tiếp vào buồng trứng của con cái. Ở con đực, GIH tác động lên tinh hoàn gián tiếp bởi sự điều khiển AG và sau đó giảm tiết AGH. Hormone kích thích tuyến sinh dục là cần thiết để có sự sinh tinh xảy ra trong tinh hoàn. AG tham gia vào quá trình biệt hóa giới tính ở con đực thông qua việc tiết hormone. AGH là tín hiệu ban đầu của tất cả các bước cần thiết trong quá trình biệt hóa giới tính và phát triển đặc điểm của con đực (Ohs và ctv, 2006). Nếu không có AG hoặc sự tiết AGH không đủ thì tuyến sinh dục sẽ biệt hóa thành tuyến sinh dục cái (Sagi và ctv, 1995). Việc loại bỏ tuyến androgenic trong giai đoạn sớm của sự phát triển dẫn đến sự phát triển ngược thành con cái (Malecha và ctv, 1992). 1.6. Bất hoạt gene bằng iRNA (RNA interference) 1.6.1. Sơ lược về iRNA 12
  14. Đồ án tốt nghiệp iRNA là hiện tượng sợi kép RNA (dsRNA) có khả năng bắt cặp đặc hiệu với trình tự gene đích, thúc đẩy sự phân hủy gene đích và ngăn chặn sự biểu hiện của nó. dsRNA can thiệp gián tiếp vào quá trình phiên mã gene làm bất hoạt gene (PTGS-bất hoạt gene hậu phiên mã), kéo dài trong suốt quá trình tiến hóa. Nó cũng được mô tả ở mức độ phiên mã và dịch mã, từ đó có thể can thiệp vào suốt quá trình hoặc dịch mã tạo ra gene nội sinh; và ở mức độ chất nhiễm sắc, bằng cách hình thành nhiễm sắc thể ở nhân (Estrada và ctv, 2007; Đỗ NăngVịnh, 2007). iRNA là một hệ thống bên trong các tế bào sống, giúp kiểm soát được các gene đang hoạt động. Đó là những đoạn RNA ngắn có thể ức chế sự biểu hiện của các gene có trình tự tương đồng với nó. Các phân tử iRNA này có thể gây nên các hiệu ứng: ức chế quá trình dịch mã của mRNA, ức chế sự phiên mã của gene ở trong nhân, phân giải mRNA. Quá trình iRNA xảy ra ở mức độ sau phiên mã và được kích hoạt bởi các đoạn dsRNA-còn được gọi là siRNA, đây là những đoạn được tạo ra từ các dsRNA dài nhờ sự phân cắt của enzyme RNase III Dicer hoặc được đưa vào từ bên ngoài. Sau khi được đưa vào phức hợp RNA-inducing silencing (RISC) trong tế bào chất, siRNA sẽ làm mất các trình tự đặc hiệu tương đồng với trình tự mRNA của nó. iRNA được khám phá đầu tiên bởi Andrew Fire và Craig Mello ở tuyến trùng Caenorhabditis elegans và sau đó được tìm thấy trong các loài sinh vật khác, bao gồm cả động vật có vú (Fire và ctv, 1998). 1.6.2. Lịch sử nghiên cứu iRNA. Đến những năm đầu thập niên 1990 một số nhà khoa học công bố kết quả nghiên cứu iRNA trên các tạp chí quốc tế (Napoli và ctv, 1990). Năm 1992, Romano và Macino đã phát hiện ra hiện tượng bất hoạt gene hậu phiên mã (PTGS) ở nấm men Neurospora crassa (Romano và Macino, 1992). Năm 1995 trên tạp chí Cell số 81, nhóm nghiên cứu của Guo và Kemphues đã đưa ra bằng chứng đầu tiên trên tuyến trùng Caenorhabditis elegans rằng: Phân tử sense RNA cũng gây ra sự ức chế gene (Guo và Kemphues, 1995). 13
  15. Đồ án tốt nghiệp Đến năm 1998, nhóm nghiên cứu Fire đã giải thích được điều nghịch lý này bằng những thí nghiệm trên tuyến trùng C. elegans (Fire và Mello, 1998). Năm 2000, Zamore PD và ctv đã công bố việc phát hiện hiện tượng dsRNA dài bị phân cắt thành các đoạn ngắn khoảng 21-23 nucleotide bởi Rnase III (Dicer) trên ruồi giấm Drosophila (Zamore PD và ctv, 2000). Năm 2001, lần đầu tiên iRNA được mô tả trong các tế bào động vật có vú (Tuschl và ctv, 2001). Năm 2006 giải thưởng Nobel sinh lý và y học cho việc phát hiện cơ chế iRNA của 2 nhà bác học Mỹ là Andrew Fire (Đại học Stanford) và Craig Mello (Đại học Massachusetts) (Won Noble Prize, 2006). Năm 2010, lần đầu tiên chứng minh được rằng siRNA có thể sản xuất các gene ức chế đặc hiệu (giảm mRNA và protein) ở người hoạt động theo cơ chế iRNA (Davis ME và ctv, 2010). 1.6.3. Vai trò của iRNA trong điều khiển hoạt hóa gene, (Fire và Mello, 1998). Chỉ có RNA sợi kép (dsRNA) có khả năng bất hoạt gene một cách hiệu quả, RNA sợi đơn (sense hoặc antisense) chỉ có khả năng gây bất hoạt yếu hoặc không có khả năng gây bất hoạt gene. dsRNA gây bất hoạt một cách rất đặc thù, nó chỉ phân hủy một phân tử mRNA có các trình tự tương đồng với nó, các phân tử mRNA khác không bị ảnh hưởng. Các sợi dsRNA chỉ có khả năng gây bất hoạt gene khi có trình tự tương đồng với mRNA đã trưởng thành (mature RNA) (tức là mRNA đã ở ngoài tế bào chất và không còn mang các trình tự intron); Các trình tự tương đồng với intron hoặc promoter đều không có tác dụng. Điều này cho thấy dsRNA gây bất hoạt gene ở giai đoạn sau phiên mã (post transcriptional gene silencing - PTGS) và xảy ra ở tế bào chất. Chỉ cần vài phân tử dsRNA trong một tế bào là đủ để hoàn thành quá trình phân hủy mRNA. Điều này chứng tỏ dsRNA đã được nhân bản và tác dụng như một tác nhân xúc tác. 14
  16. Đồ án tốt nghiệp Tác động của dsRNA có thể được lan rộng từ mô này sang mô khác và di chuyển giữa các tế bào. 1.6.4. Cơ chế hoạt động của iRNA Nghiên cứu hóa sinh iRNA ở ruồi giấm cho thấy RNA sợi kép (dsRNA) đã được phân cắt thành các đoạn dsRNA ngắn gồm 21-23 nucleotide (Tuschl và ctv, 1999). Họ cho rằng các phân tử dsRNA ngắn (siRNA-small interference RNA) đóng vai trò phân hủy mRNA. Sau đó nhóm Fire và Mello đã xác định rằng dsRNA dài đã được cắt thành đoạn RNA ngắn (khoảng 25 nucleotide) và tiếp theo siRNA gây ra sự phân hủy mRNA thông qua việc bắt cặp với mRNA (Parrish và ctv, 2000). 15
  17. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của iRNA ( 16
  18. Đồ án tốt nghiệp A. Sao chép nội sinh hoặc đưa các sợi ngoại sinh vào tế bào, dsRNA kích hoạt quá trình iRNA. B. Quá trình đầu tiên được thực hiện bởi RNase III enzyme Dicer, phản ứng phụ thuộc vào năng lượng ATP. C. Quá trình Dicer các dsRNA dài thành các siRNA 21-23 nucleotide. siRNA cũng có thể được tổng hợp ở bên ngoài tế bào và sau đó được đưa vào tế bào thông qua quá trình truyền nhiễm hoặc xung điện. D. Các siRNA được kết hợp vào các phức hợp RISC, bao gồm protein Argonaute (Ago) như là thành phần chính. Ago tách ra và loại bỏ các thành phần không có tác dụng (sense) của siRNA có ảnh hưởng đến hoạt động của RISC. E và F. Các sợi antisense của siRNA vẫn tồn tại và đóng vai trò như là sợi dẫn đường để các RISC tác động vào các mRNA tương đồng với nó, dẫn đến sự phân cắt các endonucleotide của mRNA đích (Fire và ctv, 1998). 1.6.5. Ứng dụng của iRNA trên động vật thủy sản Cơ chế của iRNA là làm bất hoạt gene sau phiên mã, chức năng này của nó trong tự nhiên chịu trách nhiệm chống lại sự nhiễm trùng virut ở đa số loài. Kết quả là làm bất hoạt gene của Dicer-1 của virut trong tôm sú (Penaeus mondon) làm tăng tỷ lệ chết của virut, cơ chế iRNA hoạt động mạnh mẽ và có chức năng miễn dịch tốt trên tôm. Mức cao hơn là các Dicer ở tế bào bạch cầu nó đóng vai trò làm miễn dịch tự nhiên ở trong tôm (Kitagishi, 2012). Ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) Dicer-2 bao gồm các miễn dịch không đặc hiệu chống lại virut. Dicer-2 góp phần vào chức năng miễn dịch không đặc hiệu ở tôm bằng cách nâng cao hiệu lực của iRNA (Kitagishi, 2012). Làm bất hoạt gene đích và có hiệu lực cao, miễn dịch đặc hiệu chống lại virut đốm trắng (WSSV) hoặc virut Taura ở tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (Penaeus vannamei) bằng cách tiêm dsRNAs sợi dài có trình tự mã hóa cấu trúc protein của virut. Sử dụng dsRNA tác động vào gene mục tiêu của virut đầu vàng (YHV) sẽ thu được hiệu quả miễn dịch đặc hiệu giống như ở virut trên tôm sú Penaeus monodon (Sarathi, 2010). 17
  19. Đồ án tốt nghiệp dsRNA can thiệp gián tiếp vào hầu hết các quá trình phiên mã gene, làm bất hoạt gene. Chức năng của gene có thể được nghiên cứu trong các sinh vật dưới nước bằng cách sử dụng iRNA. Kỹ thuật iRNA đã được ứng dụng trong 2 sinh vật ở dưới nước: cá ngựa vằn (Danio rerio) và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus schimitti) Đại Tây Dương. Kết quả đã chứng minh iRNA được sử dụng như là công cụ để nghiên cứu chức năng sinh học của các gene có liên quan đến sự phát triển của cá ngựa vằn. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh tính hữu ích của dsRNA trong cơ thể tôm trưởng thành. Hơn nữa, khả năng dsRNA ức chế chức năng của hormone hyperglycemic (CHH) trong tôm Đại Tây Dương cũng đã được nghiên cứu (Estrada và ctv, 2007). Ảnh hưởng iRNA trong tôm được giải thích bằng các thí nghiệm in vivo bằng cách tiêm dsRNA có trình tự tương đồng với gene mã hóa gonal inhibiting hormone (GIH) trong tôm cát Metapenaeus ensis. dsRNA làm giảm sự biểu hiện của GIH (Guan và ctv, 2004). Công nghệ iRNA đã được nghiên cứu trên động vật thân mềm 2 mảnh, nó quyết định chức năng của gene ở sò Crassostrea gigas. Việc tiêm dsRNA tương ứng với gene Oyster vasa-like gene (Oyvlg) vào trong tuyến sinh dục sẽ làm ức chế quá trình giảm phân và làm bất hoạt sự sản sinh các tế bào phôi ở sò Crassostrea gigas (Fabioux và ctv, 2009). iRNA có ảnh hưởng đến các yếu tố tạo cơ ở các tua khác nhau trên loài bạch tuộc Sepia oficinalis (Grimaldi và ctv, 2004). 1.7. Các phương pháp chuyển đổi giới tính tôm càng xanh 1.7.1. Cơ sở lý thuyết Cặp nhiễm sắc thể giới tính ở tôm càng xanh đực là đồng giao tử (ZZ) và con cái là dị giao tử (WZ). Để tạo dòng đơn tính toàn đực (100% tôm đực ZZ) thì cần có tôm bố và tôm mẹ có cùng NST ZZ. Sơ đồ tạo dòng đơn tính đực: 18
  20. Đồ án tốt nghiệp ♂ (ZZ) X ♀ (ZZ) 100% ♂ (ZZ) Để tạo dòng toàn đực việc cần thiết là phải tạo tôm cái giả mang NST ZZ (Ra’anan và Cohen, 1984). 1.7.2. Kỹ thuật chuyển giới tính Sử dụng hormone đực hóa trộn vào thức ăn cho tôm ăn, hoặc hòa tan thành dịch để ngâm, tắm tôm trong những khoảng thời gian nhất định. Đàn tôm toàn đực được tạo ra gồm các cá thể tôm đực có kiểu di truyền ZZ và tôm đực có kiểu di truyền WZ chuyển giới tính. Kết quả sử dụng hormone chuyển giới tính tôm phụ thuộc vào một số yếu tố như loại hormone, thời gian, liều lượng sử dụng, giai đoạn phát triển của tôm khi đưa vào xử lý (Phạm Anh Tuấn, 2002). 1.7.3. Tạo tôm cái giả ZZ bằng hormone Hiện nay, steroid được sử dụng để thay đổi kiểu hình giới tính cá khi ngâm hoặc tiêm hoặc qua chế độ ăn trước khi biệt hóa giới tính. Điều này mang lại hy vọng trong việc sử dụng hormone để điều khiển giới tính ở động vật giáp xác. Điều khiển chế độ ăn chứa hormone được xem là phương pháp thiết thực nhất trong quy mô thương mại. Tuy nhiên, phương pháp này mang lại những thách thức do khả năng mất các hormone do sự rò rỉ từ các viên thức ăn hoặc từ sự cố tiêu hóa, đặc biệt là mất do sự thay đổi của thức ăn chế biến trước khi tiêu thụ (Ohs và ctv, 2006). Năm 2006, Dewi và ctv đã dùng hormone 17β-estradiol bổ sung vào thức ăn để điều khiển giới tính tôm càng xanh. Kết quả thu được là 17β-estradiol không ảnh hưởng đến tỷ lệ đực cái ở tôm càng xanh (Dewi và ctv, 2006). Năm 2004, Baghel và ctv đã nghiên cứu ảnh hưởng chuyển đổi giới tính khi cho ấu trùng tôm càng xanh ăn artemia đã làm giàu với 17α-methyltestosterone, dạng steroid của động vật có xương sống, kết quả cho thấy 17α-methyltestosterone có tác dụng chuyển đổi giới tính của tôm càng xanh từ cái thành đực. Nhưng năm 2006, Ohs và ctv dùng 17α-methyltestosterone bổ sung vào thức ăn để chuyển giới tính tôm càng xanh, tuy nhiên kết quả lại cho thấy 17α-methyltestosterone không có 19
  21. Đồ án tốt nghiệp tác dụng trong việc chuyển đổi giới tính tôm càng xanh (Ohs và ctv, 2006). Như vậy, 17α-methyltestosterone có tác dụng chuyển đổi giới tính ở tôm càng xanh là chưa xác định. Năm 2006, Ohs và ctv cho hậu ấu trùng của tôm càng xanh thường (50 % đực, 50 % cái) ăn thức ăn có bổ sung dopamine với 3 nồng độ 0,15; 1,5; và 15 ppm trong vòng 60 ngày. Kết quả ở nhóm đối chứng có tỷ lệ tôm cái là 62,6 %, trong khi đó 3 nghiệm thức cho tôm ăn thức ăn bổ sung dopamine với nồng độ 0,15; 1,5 và 15 mg/kg có tỷ lệ tôm cái lần lượt là: 80,9 %; 88 %; và 71 %. Kết quả cho thấy có sự chênh lệch đáng kể giữa nhóm không và có cho ăn thức ăn có bổ sung dopamine. Thử nghiệm đã tạo ra một tiềm năng sử dụng dopamine để tạo ra tôm càng xanh toàn đực phục vụ cho sản xuất. 1.7.4. Kỹ thuật cắt tuyến androgenic tạo tôm cái giả ZZ Việc cắt bỏ tuyến hormone androgenic trong tôm M. rosenbergii (nằm ở phần sau của ống phóng tinh) sẽ ảnh hưởng lên các đặc điểm giới tính chính và phụ của con đực tạo nên sự chuyển giới để sản xuất ra “con cái giả”, dẫn đến sự tạo trứng, sự phát triển của vòi trứng và lỗ sinh sản của con cái trong con đực đã chuyển giới trong giai đoạn phát triển còn non nhất. Sự tạo trứng chỉ bắt đầu khi trong con đực đã được chuyển giới trong thời kỳ phát triển rất non, nếu tác động vào các con đực trong giai đoạn phát triển muộn hơn thì nó chỉ chuyển giới không hoàn toàn hoặc không hề chuyển giới (Nagamine và ctv, 1980) . Việc loại bỏ AG ở con đực, làm mất AGH gây nên hiện tượng: con đực thành con cái mang NST ZZ. Kỹ thuật vi phẫu loại bỏ tuyến androgenic được thực hiện lần đầu tiên bởi Sagi và ctv năm 1990. Ở Việt Nam kỹ thuật vi phẫu đã được thực hiện và thành công năm 2004 (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2004). Sagi và Cohen vào năm 1990 đã cho biết “Khi cho những con cái chuyển giới khoẻ mạnh lai với con đực thông thường sẽ cho ra một dòng con toàn đực. Điều này mở ra tiềm năng của công nghệ tạo con cái để có thể sản xuất ra quần thể hoàn toàn đơn tính đực đối với tôm càng xanh M. rosenbergii. Hiện nay, Israel và 20
  22. Đồ án tốt nghiệp Thái Lan đang nghiên cứu sâu công nghệ tạo con cái mới để sản xuất dòng con toàn đực và đã áp dụng thực địa thành công ở Ấn Độ và Việt Nam”. Kỹ thuật vi phẫu là kỹ thuật tạo ra tôm cái giả để sản xuất tôm toàn đực phổ biến hiện nay. Tuy nhiên kỹ thuật này cần có kỹ thuật viên có tay nghề cao, cần nhiều người để sản xuất một số lượng tôm cái giả lớn, chi phí sản xuất lớn, tỷ lệ tôm vi phẫu thành tôm cái giả có thể sinh sản được thì không ổn định. Vì vậy, cần tìm ra các phương pháp mới để cải thiện các hạn chế của kỹ thuật vi phẫu nhằm tạo nguồn tôm toàn đực để tăng sản lượng cho người nuôi. 1.7.5. Cấy tuyến đực vào tôm cái Trong một thí nghiệm người ta đã cấy mô tuyến đực từ tôm càng xanh đực trưởng thành cho những tôm giả định là cái còn non. Những con cái với kích thước vỏ đầu ngực 6,5-7,5 mm đã chuyển đổi giới tính thành đực gần như 100 %. Người ta đã phối giống những con đực chuyển giới từ cái với những con cái bình thường. Kết quả thu được 1 đực/3,2 cái, phù hợp với giả thuyết cơ chế NST định đoạt giới tính ở tôm càng xanh là ZW (Malecha và ctv, 1992) . 21
  23. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm Thí nghiệm được thực hiện từ ngày 01 tháng 02 năm 2012 đến ngày 21 tháng 07 năm 2012 tại phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2 (116 Nguyễn Đình Chiểu, phường Đakao, quận 01, Thành Phố Hồ Chí Minh). 2.2. Vật liệu thí nghiệm 2.2.1. Vật liệu sinh học Tôm PL25: dùng cho các thí nghiệm thực nghiệm tiêm dsRNA. 2.2.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 2.2.2.1. Hóa chất thí nghiệm - pGEM-Mr-IAG. - Mr-IAG sense-(T7P)F. - Mr-IAG antisense-(T7P)R. - Colorless Buffer 5X. - dNTPs 10 mM. - MgCl2 25 mM. - Flexi Taq 5 U/µl. - H2O-DEPC. - Agarose. - RiboMAXTM Express T7 2X Buffer. - Nuclease-free water. - Enzyme Mix T7 Express. - TURBO DNase. - Enzyme RNase A. - Enzyme RNase III. - TBE 0,5X. - Gel red. - 6X DNA Loading Dye (Promega). 22
  24. Đồ án tốt nghiệp - Thang DNA ladder. 2.2.2.2. Dụng cụ thí nghiệm - Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml. - Máy hút và tủ cấy vô trùng (Astec Microflow). - Micropipet các loại (Bio - rad). - Đầu tip các loại. - Máy luân nhiệt iCycle (Bio - rad). - Máy điện di (Bio - rad). - Máy chụp ảnh điện di GeldocX (Bio - rad). - Bồn ủ nhiệt. - Block nhiệt. - Lò viba (Electrolux - Thụy Điển). - Tủ mát, tủ âm (Sanyo - Nhật). - Kính hiển vi CH40:OLYMPUS (Japan). - Kim tiêm Exmire Microsyringe (Fuji, Japan). - Hệ thống tuần hoàn nước. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Quy trình tổng hợp Mr-IAG dsRNA ở phòng thí nghiệm Mr-IAG dsRNA được tổng hợp bằng bộ kit Promega. Vector tái tổ hợp pGEM-Mr-IAG được sử dụng từ phần nghiên cứu “Phát triển phương pháp tạo tôm càng xanh cái giả Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1897) bằng phương pháp bất hoạt gene” của nghiên cứu viên tập sự Lê Chính, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2. Trong phương pháp tổng hợp này cDNA mạch khuôn sẽ mang T7 promoter ở 2 đầu mạch bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu có T7 promoter ở đầu 5’ (Ongvarrasopone và ctv, 2007). dsRNA sẽ được tổng hợp trực tiếp từ cDNA mạch khuôn mang T7 promoter ở 2 đầu sau phản ứng PCR khuếch đại DNA. Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại đoạn mạch khuôn mang T7 ở 2 đầu, chuẩn bị 2 hỗn hợp phản ứng PCR dùng để tổng hợp và một hỗn hợp dùng để làm 23
  25. Đồ án tốt nghiệp chứng âm. Mẫu chứng âm thì không cho pGEM-Mr-IAG, còn mẫu tổng hợp thì cho 2 µl pGEM-Mr-IAG. Trình tự mồi của hỗn hợp phản ứng: Mr-IAG sense-(T7P)F: 5’- T7PATGGGATACTGGAATGCCGAG-3' Mr-IAG antisense-(T7P)R: 5'-T7PCTGGAACTGCAGGTGTTAACG-3' Bảng 2.1. Thành phần mix của phản ứng PCR để tổng hợp cDNA mạch khuôn mang T7 promoter ở 2 đầu Thành phần V (µl) /50 µl Nồng độ Colorless Buffer 5X 10 dNTPs 10 mM 1 10 mM MgCl2 25 mM 3 25 mM Flexi Taq 5 U/µl 0,25 5 U/µl H2O-DEPC 32,75 Mr-IAG sense-(T7P)F 0,5 Mr-IAG antisense-(T7)R 0,5 pGEM-Mr-IAG 2 µl Total 50 24
  26. Đồ án tốt nghiệp Thực hiện phản ứng PCR với chu trình nhiệt như sau: 0 0 94 94 720 0 3’ 30’’ 72 0 57 1’ 10’ 30’’ 40 x1 x35 x1 ∞ Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR để tổng hợp cDNA mạch khuôn mang T7 promoter ở 2 đầu Khi phản ứng PCR kết thúc, tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR bằng cách điện di trên gel agarose 1,5 % chứa sẵn gel red (5 µl gel red/100 ml). Chạy điện di trong dung dịch đệm TBE 0,5X, 100 V trong thời gian 45 phút. Sau thời gian điện di gel được chuyển vào máy GeldocX, chỉnh gel ngay ngắn và đóng cửa an toàn, sau đó bật đèn UV. Camera sẽ tự động chụp ảnh và hiển thị sản phẩm trên màn hình máy tính. Sản phẩm PCR được dùng làm mạch khuôn để tổng hợp dsRNA bằng cách sử dụng T7 Express RiboMax RNAi system kit (Promega, Mỹ). Đầu tiên, pha hỗn hợp phản ứng để tổng hợp dsRNA gồm: 10 μl RiboMAXTM Express T7 2X Buffer, 4 μl Nuclease-free water, 4 μl cDNA mạch khuôn có T7 promoter ở 2 đầu và 2 μl Enzyme Mix T7 Express. Sau đó ủ trong bể ủ nhiệt ở 370C, qua đêm. Sau khi ủ, chuyển eppendorf tổng hợp dsRNA vào heater ở 700C trong vòng 10 phút để lai các mạch ssRNA lại với nhau. Cho vào tủ lạnh để làm mát dung dịch (40C). Tiếp theo, thêm 1 μl TURBO DNase để phân hủy cDNA mạch khuôn, ủ 370C trong 15 phút. Làm sạch sản phẩm Mr-IAG dsRNA bằng RNase A có nồng độ 10 ng/μl để loại bỏ hết những RNA mạch đơn nếu được tạo ra 25
  27. Đồ án tốt nghiệp trong quá trình tổng hợp dsRNA. Chuyển eppendorf vào heater ở 700C trong 10 phút để bất hoạt enzyme. Lấy 1 lượng nhỏ Mr-IAG dsRNA chạy điện di trên gel agarose 1,5 % để xác định nồng độ. Bảo quản ở -250C. Điện di sản phẩm bằng cách trộn đều 2 µl sản phẩm Mr-IAG dsRNA đã pha loãng 1:50 và 1:100 với 1 µl dung dịch nạp mẫu loading dye. Chạy điện di trên gel agarose 1,5 %, 100 V trong thời gian 45 phút và chụp hình trên máy GelDocX. Sau khi có kết quả chạy điện di, Mr-IAG dsRNA sẽ được kiểm tra lại bằng cách xử lý với RNase A, RNase III và DNase. Sản phẩm Mr-IAG dsRNA sẽ được chia làm 3 ống, một ống xử lý với RNase A, một ống xử lý với RNase III, ống còn lại xử lý với DNase, ủ 3 ống ở 370C trong 15 phút. Sau đó cũng lấy một lượng nhỏ để kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1,5 %. 2.3.2. Kỹ thuật tiêm dsRNA vào tôm càng xanh Tôm càng xanh đực có 2 lỗ sinh đực nằm ở bên cạnh đốt gốc của đôi chân ngực thứ 5, còn lỗ sinh dục của con cái thì nằm ở phần ức ngay gốc chân ngực thứ 3 và có dạng hình tam giác (Nguyễn Thanh Phương, 2003). Tiêm dsRNA vào tôm nhằm mục đích là phân hủy mRNA tổng hợp nên hormone tuyến đực AG, để tạo ra tôm cái giả. Vì khi vào trong cơ thể các dsRNA sẽ bị cắt thành các đoạn RNA ngắn (siRNA) khoảng 21-23 nucleotide, các siRNA này sẽ bắt cặp với mRNA có trình tự bổ sung với nó, làm các mRNA này biến mất dẫn đến gene tương ứng của nó bị bất hoạt. Do đó, không có protein nào do gene đó mã hóa được tạo thành. Kết quả là protein tuyến đực không được tổng hợp, nên con đực mất tính đực để chuyển thành con cái. Vì vậy, vị trí tiêm dsRNA vào tôm là ngay vị trí xoang của gốc chân bò thứ 5 (Ventura và ctv, 2009; Sagi, 2010). dsRNA được tiêm vào tôm bằng kim tiêm Exmire Microsyringe (Fuji, Japan) thể tích tối đa của kim là 10 µl, thể tích tiêm dsRNA vào tôm là tùy vào từng thí nghiệm và tùy theo trọng lượng của từng con. 26
  28. Đồ án tốt nghiệp 2.3.3. Kỹ thuật kiểm tra tôm Việc phân biệt tôm đực, tôm cái là dựa vào đặc điểm hình thái của nó, đối với những con trưởng thành thì việc phân biệt khá dễ dàng còn đối với những con còn nhỏ thì việc phân biệt khá khó khăn, phải nhờ đến những kỹ thuật viên có kinh nghiệm. Thông thường đối với con đực thì các gốc chân ngực xếp khít nhau hơn so với con cái, đặc biệt ở giai đoạn tôm nhỏ PL25 thì sự phân biệt đực cái phụ thuộc chủ yếu vào nhú lồi sinh dục đực ở gốc chân ngực số 5. Ngoài ra tôm đực còn có nhánh phụ đực nằm kế nhánh trong của chân bụng thứ 2 (chỉ có chân bụng thứ 2 mới có nhánh phụ đực còn các chân khác thì không có), ở con cái thì không có nhánh này (Nguyễn Thanh Phương, 2003). Có thể quan sát nhánh phụ đực này dưới kính hiển vi khi tôm đã biệt hóa giới tính. Dựa vào đặc điểm này các con tôm thí nghiệm PL25 sẽ được quan sát xem các chân ngực phải nằm khít nhau và có nhú lồi sinh dục đực (công việc này được thực hiện bởi các kỹ thuật viên có kinh nghiệm của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II). Sau thời gian tiêm dsRNA một tháng để kiểm tra sự tạo thành tôm cái giả, tôm thí nghiệm phải được cắt chân bơi thứ 2, đem soi dưới kính hiển vi CH40:OLYPUS (Japan) vật kính 10X, nếu chân bơi thứ 2 có 2 nhánh chứng tỏ con đó là con đực, nếu có một nhánh thì đó là con cái. Thời gian kiểm tra cách nhau khoảng 1 tháng, vì sau khoảng thời gian đó chân bụng thứ 2 của tôm mới mọc lại. 2.3.4. Bố trí thí nghiệm 2.3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dsRNA lên sự tạo thành tôm cái giả Tôm càng xanh sử dụng cho thí nghiệm tiêm dsRNA là tôm PL25 toàn đực, tôm được cung cấp từ Trung Tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nước Ngọt Nam Bộ (Cái Bè, Tiền Giang). Thí nghiệm sẽ được thực hiện tại phòng thí nghiệm ướt (Wetlab) ở lầu 1 thuộc phòng Sinh Học Thực Nghiệm-Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2. Toàn bộ tôm dùng cho thí nghiệm sẽ được cắt chân bơi thứ 2 ở bên phải và chân bơi này sẽ được soi trên kính hiển vi xem có gai sinh dục phụ đực hay không để đảm bảo chất lượng. Nếu chân bơi thứ 2 của tôm đã xuất hiện gai sinh 27
  29. Đồ án tốt nghiệp dục phụ đực thì phải loại bỏ. Vì tôm đực lúc này đã biệt hóa giới tính nên không sử dụng được. Hình 2.2. Tôm PL25 dùng cho thí nghiệm tiêm dsRNA Tôm sẽ được nuôi trong hệ thống nước hoàn lưu, nước dùng để nuôi tôm là nước máy, sau khi xả ra thì sục khí 3-4 giờ để loại bỏ hết clo rồi mới cung cấp vào hệ thống hoàn lưu. Trong bồn nước lớn của hệ thống nuôi sẽ có những hạt nhựa kích thước khoảng 0,7 cm, bên trong những hạt nhựa này có hình mạng lưới, mục đích là để cho vi sinh vật, cặn bả bám vào và làm sạch nước. Định kỳ khoảng 2 tuần sẽ siphon các bể một lần để loại bỏ bớt cặn bả. Hình 2.3. Hệ thống nước hoàn lưu dùng để nuôi tôm 28
  30. Đồ án tốt nghiệp Tôm được cho ăn thức ăn thương mại dạng viên với tên thương mại là TONG WEI 983S của Công ty TNHH TONG WEI VIỆT NAM, mỗi ngày cho ăn 2 lần vào buổi sáng và chiều. Trong thí nghiệm này tôm sẽ được tiêm dsRNA với 3 nồng độ khác nhau: 1,25; 2,5 và 5 μg/g trọng lượng tôm và 1 lô đối chứng chỉ tiêm nước muối sinh lý 9 ‰, tần suất tiêm là 3 lần/tuần. Mỗi nồng độ gồm 20 tôm PL25, trọng lượng mỗi con khoảng 0,2 g đến 0,4 g được nuôi trong các thùng của hệ thống nuôi hoàn lưu, một thùng sẽ nuôi khoảng 5 con, diện tích mỗi thùng khoảng 0,2 m2. Trong từng thùng sẽ bỏ vào một ít đá san hô và dây mũ mục đích là làm chổ ẩn náo cho tôm và san hô cũng có tác dụng trong việc lọc nước. Tiến hành tiêm dsRNA cho tôm trong khoảng thời gian là một tháng. Sau một tháng tất cả tôm (kể cả lô đối chứng) được cắt chân bơi thứ 2 bên phải đem lên kính hiển vi để kiểm tra xem gai sinh dục phụ đực có mọc lại hay không. Sau đó tính toán tỷ lệ chuyển cái của tôm, tỷ lệ sống của tôm và suy ra nồng độ dsRNA thích hợp. Bảng 2.2. Tiêm dsRNA cho tôm ở 3 nồng độ 5 µg/g; 2,5 µg/g và 1,25 µg/g Lô thí nghiệm 1 2 3 Đối chứng Số lượng (con) 20 20 20 20 Tần suất tiêm 3 3 3 3 (lần/tuần) Nồng độ Mr-IAG 5 2,5 1,25 Nước muối dsRNA (µg/g) sinh lý 9 ‰ Thời gian (ngày) 30 30 30 30 2.3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của tần suất tiêm lên sự tạo thành tôm cái giả Sau một tháng, kiểm tra sự tạo tôm cái giả của thí nghiệm 2.3.4.1, sẽ thu được nồng độ dsRNA thích hợp nhất cho sự tạo tôm cái giả. Khi đó sẽ sử dụng nồng độ đó để tiếp tục thực hiện thí nghiệm “Khảo sát ảnh hưởng của tần suất tiêm lên sự tạo thành tôm cái giả”. 29
  31. Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm được bố trí như sau: thí nghiệm sẽ được phân làm 3 lô, mỗi lô 20 con. Tôm sẽ được tiêm dsRNA ở nồng độ tối ưu của thí nghiệm 2.3.4.1. Tần suất tiêm là 3 lần/tuần; 2 lần/tuần và 1 lần/ tuần. Lô đối chứng cũng chia làm 3 lô nhỏ, mỗi lô nhỏ là 20 con, cũng thực hiện tiêm với tần suất 3 lần/tuần; 2 lần/tuần và 1 o lần/ tuần nhưng tiêm với nước muối sinh lý 9 /oo. Nguồn tôm cung cấp, cách chăm sóc, cho ăn, nguồn nước, cách kiểm tra, vị trí tiêm, thể tích tiêm và nơi thực hiện thí nghiệm cũng giống như thí nghiệm 2.3.4.1. Bảng 2.3. Thí nghiệm tiêm dsRNA cho tôm với tần suất tiêm 3 lần/tuần; 2 lần/tuần và 1 lần/tuần Lô thí nghiệm 1 2 3 Đối chứng Số lượng (con) 20 20 20 60 Tần suất tiêm 3 2 1 3 lần; 2 lần; 1 (lần/tuần) lần Nồng độ Mr-IAG Tốt nhất của Tốt nhất của Tốt nhất của Nước muối dsRNA (µg/g) thí nghiệm thí nghiệm thí nghiệm sinh lý 9 ‰ 2.3.4.1 2.3.4.1 2.3.4.1 Thời gian (ngày) 30 30 30 30 Thí nghiệm sẽ được thực hiện trong vòng một tháng. Sau một tháng tất cả tôm (kể cả lô đối chứng) được cắt chân bơi thứ 2 bên phải đem lên kính hiển vi để kiểm tra xem gai sinh dục phụ đực có mọc lại hay không. Sau đó tính toán tỷ lệ chuyển cái của tôm, tỷ lệ sống của tôm và suy ra tần suất tiêm thích hợp. 2.3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tiêm lên sự tạo thành tôm cái giả Sau khi thực hiện thí nghiệm 2.3.4.1 và 2.3.4.2 thu được nồng độ dsRNA và tần suất tiêm tốt nhất. Sẽ sử dụng kết quả này làm tiền đề để thực hiện thí nghiệm tiếp theo. Trong thí nghiệm này bố trí 5 lô tôm: 4 lô thí nghiệm và một lô đối chứng. Mỗi lô thí nghiệm gồm 20 tôm PL25, tiêm với nồng độ dsRNA và tần suất tiêm tốt 30
  32. Đồ án tốt nghiệp nhất ở 2 thí nghiệm trên. 4 lô thí nghiệm tiến hành tiêm đồng loạt cùng nồng độ và tần suất tiêm. Sau thời gian tiêm một tháng kiểm tra sự tạo thành tôm cái giả. Sau đó tiêm tiếp tục nhưng lô thí nghiệm thứ nhất thì không tiêm dsRNA nữa, các lô còn lại thì vẫn tiêm bình thường. Đến hết tháng thứ 2 thì kiểm tra sự tạo thành tôm cái giả của tất cả các lô thí nghiệm. Tiếp theo tháng thứ 3 vẫn tiếp tục tiêm dsRNA cho lô thí nghiệm thứ 3 và 4 còn lô thí nghiệm 1 và 2 thì không tiêm. Tiêm đến hết tháng thứ 3 kiểm tra sự tạo thành tôm cái giả của cả 4 lô thí nghiệm. Sang tháng thứ 4 chỉ còn tiêm dsRNA cho tôm ở lô thí nghiệm thứ 4 còn 3 lô thí nghiệm 1, 2, 3 thì không tiêm nữa. Đến cuối tháng thứ 4 tiến hành kiểm tra sự tạo tôm cái giả của cả 4 lô thí nghiệm. Lô đối chứng với 20 tôm PL25, tiêm với nước muối sinh lý 9 ‰, nồng độ, tần suất tiêm và số lần kiểm tra cũng thực hiện tương tự như lô thí nghiệm. Mục đích của thí nghiệm này là xem sau khoảng thời tiêm bao lâu thì có thể ngừng tiêm (tức là tôm cái giả tạo thành sau khoảng bao nhiêu tháng thì không bị lại đực và có thể sinh sản). Nguồn tôm cung cấp, cách chăm sóc, cho ăn, nguồn nước, cách kiểm tra, vị trí tiêm, thể tích tiêm và nơi thực hiện thí nghiệm cũng giống như 2 thí nghiệm trên. Bảng 2.4. Ảnh hưởng của thời gian tiêm lên sự tạo thành tôm cái giả Lô 1 2 3 4 Đối chứng Số lượng 20 20 20 20 20 Tháng 1 + + + + Nước muối sinh lý 9 ‰ Tháng 2 _ + + + Nước muối sinh lý 9 ‰ Tháng 3 _ _ + + Nước muối sinh lý 9 ‰ Tháng 4 _ _ _ + Nước muối sinh lý 9 ‰ (+) Tiêm dsRNA; (-) Không tiêm dsRNA 31
  33. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tổng hợp Mr-IAG dsRNA bằng bộ kit Promega. 500 bp 50 bp Hình 3.1. Kiểm tra sản phẩm PCR của cDNA mạch khuôn mang T7 promoter ở 2 đầu. Giếng số 1 là mẫu chứng âm, giếng 2 là sản phẩm PCR kích thước khoảng 550 bp, giếng M là thang DNA 50 bp. Sản phẩm PCR sau khi chạy điện di trên gel agarose 1,5 % cho kết quả vạch điện di như hình 3.1. Vạch điện di có kích thước khoảng 550 bp, chứng tỏ sau phản ứng PCR có sản phẩm cDNA mạch khuôn mang T7 promoter ở 2 đầu. Vạch điện di sáng nên sản phẩm cDNA mạch khuôn tổng hợp được khá thành công. Tuy nhiên, trong giếng điện di có băng sáng đó có thể là các mồi bắt cặp còn dư hoặc độ đặc hiệu không cao. Vector tái tổ hợp pGEM-Mr-IAG là mạch khuôn để chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu có T7 promoter ở đầu 5’, mục đích là nhằm tạo ra cDNA khuôn cho phản 32
  34. Đồ án tốt nghiệp ứng tổng hợp dsRNA. Sản phẩm PCR sẽ là cDNA mang T7 promoter ở cả 2 đầu và sản phẩm này sẽ được dùng làm mạch khuôn để tổng hợp dsRNA. 500 bp 50 bp Hình 3.2. Tổng hợp Mr-IAG dsRNA theo bộ kit Promega. Giếng 50X là Mr- IAG dsRNA pha loãng 1:50, giếng 100X là Mr-IAG dsRNA pha loãng 1:100. Giếng M là thang DNA 50 bp, (-) mẫu đối chứng âm. Dựa vào kết quả hình 3.2 cho thấy dsRNA đã được tổng hợp thành công, ở độ pha loãng 50 lần và 100 lần 2 vạch điện di đều cho kết quả ở kích thước khoảng 550 bp. Độ pha loãng 50 lần thì vạch điện di sáng hơn ở độ pha loãng 100 lần. Kết quả kiểm tra lại Mr-IAG dsRNA sau khi xử lý với 3 enzyme RNase A, RNase III và DNase được thể hiện trong hình 3.3. 33
  35. Đồ án tốt nghiệp 500 bp 50 bp Hình 3.3. Kiểm tra sản phẩm Mr-IAG dsRNA. Giếng số 1 là Mr-IAG dsRNA xử lý với RNase A, giếng số 2 là Mr-IAG dsRNA xử lý với DNase, giếng số 3 là Mr-IAG dsRNA xử lý với RNase III. Giếng M là thang DNA 50 bp. Ở giếng số 1 khi xử lý Mr-IAG dsRNA bằng enzyme RNase A (enzyme phân hủy mạch đơn RNA) thì vẫn xuất hiện vạch điện di ở kích thước khoảng 550 bp, chứng tỏ dsRNA là mạch đôi nên không bị phân hủy bởi RNase A. Và ở giếng số 2 sản phẩm vẫn có ở vạch điện di kích thước khoảng 550 bp sau khi xử lý Mr- IAG dsRNA với DNase (enzyme phân hủy DNA). Ở giếng số 3 sau khi xử lý Mr- IAG dsRNA với RNase III (enzyme phân hủy RNA mạch đôi) thì không xuất hiện vạch điện di, chứng tỏ sản phẩm đã bị enzyme này phân hủy hết. Qua việc xử lý bằng 3 enzyme này cho thấy sản phẩm Mr-IAG dsRNA tổng hợp được là RNA 34
  36. Đồ án tốt nghiệp mạch đôi, vì nó không bị phân hủy bởi enzyme phân hủy RNA mạch đơn cũng như enzyme phân hủy DNA mà chỉ bị phân hủy bởi enzyme phân hủy RNA mạch đôi. 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dsRNA lên sự tạo thành tôm cái giả Bảng 3.1. Số lượng tôm sống và chuyển cái sau 1 tháng thí nghiệm tiêm dsRNA ở 3 nồng độ 5 µg/g; 2,5 µg/g và 1,25 µg/g Lô thí nghiệm 1 2 3 Đối chứng Số lượng (con) 20 20 20 20 Nồng độ Mr- 5 2,5 1,25 Nước muối IAG dsRNA sinh lý 9 ‰ (µg/g) Số lượng tôm 10 13 9 15 sống (con) Số lượng tôm 10 12 9 0 chuyển cái (con) 35
  37. Đồ án tốt nghiệp Tỷ lệ sống và chuyển cái (%) 120 100 80 Tỷ lệ sống (%) 60 Tỷ lệ chuyển cái (%) 40 20 0 5 µg/g 2.5 µg/g 1.25µg/g Đối chứng Hình 3.4. Tỷ lệ sống và chuyển cái của tôm sau một tháng tiêm dsRNA ở 3 nồng độ 5 µg/g; 2,5 µg/g và 1,25 µg/g. Sau 1 tháng thí nghiệm, tỷ lệ tôm sống ở các lô thí nghiệm tương đối thấp cụ thể là ở nồng độ 1,25 µg/g là 45 %, nồng độ 2,5 µg/g là 65 %, nồng độ 5 µg/g là 50 % và nồng độ đối chứng là 75 % (hình 3.4). Nguyên nhân tôm chết có thể là do mật độ nuôi quá cao nên chúng ăn thịt lẫn nhau, trong thời gian nuôi tôm lột xác lúc này tôm yếu nên dễ bị các con khác tấn công và ăn thịt. Trong quá trình nuôi có thời điểm tôm bị đen đuôi và chết nghi ngờ là do bị vi khuẩn tấn công. Ngoài ra còn các nguyên nhân khác có thể làm cho tỷ lệ chết của tôm cao như do bị bệnh, ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi (ánh sáng, nhiệt độ ) không thích hợp cho tôm, kinh nghiệm nuôi còn hạn chế Ngoài ra tỷ lệ tôm chết cao có thể là do kỷ thuật tiêm dsRNA chưa tốt, tiêm trúng đường phần gan hay đường ruột của tôm nên dẫn đến tôm chết. Kết thúc 1 tháng tiêm, tất cả tôm sẽ được cắt chân bơi thứ 2 bên phải để kiểm tra gai sinh dục phụ đực dưới kính hiển vi. A1 trong hình 3.5 là hình thái của chân 36
  38. Đồ án tốt nghiệp bơi thứ 2 bên phải của tôm dùng để tiêm Mr-IAG dsRNA trước khi tiến hành thí nghiệm. Đến ngày thứ 30 của thí nghiệm, không có gai sinh dục phụ đực của hầu hết tôm tiêm Mr-IAG dsRNA (1 con ở nồng độ 2,5 µg/g còn gai) thể hiện qua hình A2, A3, A4 có mũi tên đen. Trong khi đó ở hình B1 có mũi tên trắng kiểm tra tôm đối chứng thì mọc lại gai sinh dục phụ đực. Điều này khẳng định hiệu quả và thành công bước đầu của Mr-IAG dsRNA đối với việc biểu hiện gene Mr-IAG của M. rosenbergii ở giai đoạn ấu trùng nhỏ. A1 B1 A2 B2 A3 Hình 3.5. Hiệu quả của tiêm Mr-IAG dsRNA vào việc không mọc lại gai sinh dục phụ đực của M. rosenbergii đực giai đoạn PL. A1: Kiểm tra chân bơi thứ 2 bên phải của tôm dùng để tiêm Mr-IAG dsRNA trước khi bắt đầu thí nghiệm. A2, A3: kiểm tra tôm của các nồng độ 1,25 µg/g, 2,5 µg/g, 5 µg/g sau 30 ngày thí nghiệm. B1: tôm đối chứng sau 30 ngày thí nghiệm. B2: tôm trở đực sau 30 ngày thí nghiệm. 37
  39. Đồ án tốt nghiệp Mũi tên trắng là gai sinh dục phụ đực, mũi tên đen là không có gai sinh dục phụ đực, mũi tên màu đỏ là nhú lồi của gai sinh dục phụ đực. Kiểm tra tôm thì thấy hầu hết tôm thí nghiệm đều chuyển cái chỉ có 1 con chiếm 7,7 % ở nồng độ 2,5 µg/g vẫn còn là con đực. Nguyên nhân có thể là do trong lúc chọn tôm PL25 cho thí nghiệm có lẫn vào tôm quá ngày tuổi, lúc này tôm đã biệt hóa giới tính nên Mr-IAG dsRNA không còn tác dụng ức chế Mr-IAG của chúng. Ở lô đối chứng thì 100 % tôm vẫn là đực. Theo thí nghiệm của Ventura và ctv (năm 2009), nồng độ 5 µg Mr-IAG dsRNA/g trọng lượng tôm có tác dụng ức chế hình thành gai sinh dục phụ đực. Nhưng theo kết quả của thí nghiệm này cho thấy ở nồng độ Mr-IAG dsRNA 1,25 µg/g khối lượng cơ thể là đã có thể làm bất hoạt gene Mr-IAG ngăn chặn việc mọc lại gai sinh dục phụ đực. Từ những kết quả trên cho thấy ở nồng độ 1,25 µg Mr- IAG dsRNA/g đủ để kích hoạt quá trình iRNA xảy ra trong cơ thể tôm PL. Và nồng độ này được sử dụng để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Do nồng độ thấp sẽ làm giảm chi phí tổng hợp dsRNA trong thí nghiệm sử dụng. 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của tần suất tiêm lên sự tạo thành tôm cái giả Bảng 3.2. Số lượng tôm sống và chuyển cái sau 1 tháng thí nghiệm tiêm dsRNA với 3 tần suất tiêm 3 lần/tuần, 2 lần/tuần, 1 lần/tuần Lô thí nghiệm 1 2 3 Đối chứng Số lượng (con) 20 20 20 60 Tần suất 3 2 1 3 lần; 2 lần; 1 tiêm(lần/tuần) lần Số lượng tôm 17 19 16 57 sống (con) Số lượng tôm 17 19 16 0 chuyển cái (con) 38
  40. Đồ án tốt nghiệp Tỷ lê sống và chuyển cái (%) 120 100 80 Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chuyển cái (%) 60 40 20 0 3 lần/tuần 2 lần/tuần 1 lần/tuần Đối chứng Hình 3.6. Tỷ lệ sống và chuyển cái của tôm sau một tháng tiêm dsRNA với 3 tần suất tiêm 3 lần/tuần, 2 lần/tuần, 1 lần/tuần. Sau 30 ngày thí nghiệm, tỷ lệ tôm sống khá cao, cao hơn thí nghiệm trên. Ở tần suất tiêm 3 lần/tuần là 85 %, 2 lần/tuần là 95 %, 1 lần/tuần là 80 %, đối chứng là 95 %, tỷ lệ sống của tôm tương đối ổn định và cao có thể là do trong thí nghiệm này đã có kinh nghiệm trong quá trình nuôi, theo dõi tôm hàng ngày và nếu có con lột xác thì vớt ra nuôi riêng nên hạn chế được số tôm chết do lột xác. Thêm các vật ẩn nấp vào mỗi thùng để tôm ẩn náo và không ăn thịt lẫn nhau, kiểm tra lượng thức ăn để không cho ăn thiếu cũng như thừa nhằm không làm ô nhiễm nước và thiếu thức ăn. Ánh sáng cũng được chú ý nếu thấy quá sáng thì đóng bớt cửa sổ lại nếu thấy thiếu ánh sáng thì bật đèn. Nhờ có kinh nghiệm hơn trong lần thí nghiệm đầu tiên nên tôm của đợt thí nghiệm này số lượng con sống tương đối cao. 39
  41. Đồ án tốt nghiệp Thực hiện tiêm tôm với kết quả có được ở thí nghiệm trên là tiêm với nồng độ 1,25 µg/g với tần suất tiêm là tiêm 3 lần/tuần, 2 lần/tuần, 1 lần/tuần. Sau thời gian thí nghiệm tiến hành cắt chân bơi thứ 2 và kiểm tra gai sinh dục phụ đực. Kết quả kiểm tra cho thấy 100 % tôm thí nghiệm đều chuyển cái, lô đối chứng thì toàn đực. Điều này chứng tỏ ở tần suất tiêm 3 lần/tuần và 2 lần/tuần lượng Mr-IAG dsRNA đưa vào cơ thể tôm không những đủ để bất hoạt Mr-IAG mà thẩm chí còn dư, vì ở tần suất tiêm 1 lần/tuần đã đủ làm tôm chuyển cái với tỷ lệ 100 %. Qua 2 thí nghiệm nồng độ và tần suất tiêm cho thấy ở nồng độ 1,25 µg/g và tần suất tiêm 1 lần/tuần là đã đủ làm tôm PL25 chuyển cái. Kết quả của 2 thí nghiệm này được sử dụng để làm thí nghiệm tiếp theo nhằm xác định thời gian tiêm. 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tiêm lên sự tạo thành tôm cái giả. Bảng 3.3. Số lượng tôm sống và chuyển cái sau 4 tháng thí nghiệm Lô 1 2 3 4 Đối chứng Thả 20 20 20 20 20 Sống Cái Sống Cái Sống Cái Sống Cái Sống Cái Tháng 1 18 18 17 16 18 18 19 17 19 0 Tháng 2 15 0 15 15 17 16 16 16 19 0 Tháng 3 15 0 16 10 14 7 19 0 Tháng 4 14 0 13 5 19 0 Số lượng sống của tôm ở từng tháng thí nghiệm ở cả 4 lô thí nghiệm và lô đối chứng tương đối đều, tuy tỷ lệ sống có thấp hơn các thí nghiệm trên nhưng sự chênh lệch không cao. Nguyên nhân có thể là do thời gian thí nghiệm kéo dài lúc này tôm đã lớn nhưng vẫn còn nuôi trong các thùng có diện tích nhỏ nên chúng ăn thịt lẫn nhau dẫn đến lượng tôm sống không cao như mong muốn. 40
  42. Đồ án tốt nghiệp Tỷ lệ chuyển cái (%) 120 100 Tháng 1 80 Tháng 2 Tháng 3 60 Tháng 4 40 20 0 1 2 3 4 Đối chứng Hình 3.7. Tỷ lệ chuyển cái sau 4 tháng tiêm Mr-IAG dsRNA Tiến hành tiêm cho tôm với nồng độ 1,25 µg/g, tần suất tiêm là 1 lần/tuần. Thực hiện thí nghiệm tiêm như mô tả ở phần 3.3.4.3. Khi kết thúc thí nghiệm thu được tỷ lệ chuyển cái của các lô thí nghiệm như sau: - Lô thí nghiệm thứ nhất tháng đầu tiên tiêm thì chuyển cái 100 % nhưng sau khi ngừng tiêm 1 tháng đến hết tháng thứ 2 kiểm tra thì các con chuyển cái ở tháng đầu tiên bị lại đực. - Ở lô thứ 2, tiêm liên tiếp 2 tháng ở tháng đầu tiên thì chỉ có 94,1 % tôm chuyển cái so với số tôm sống, nguyên nhân có thể là do tôm PL25 cung cấp cho thí nghiệm quá tuổi và cũng có thể là do sai sót trong quá trình tiêm. Đến tháng thứ 2 thì có 100 % chuyển cái so với số con sống chứng tỏ hiệu quả tiêm đạt tốt. Nhưng sau khi ngưng không tiêm thì chỉ sau một tháng tức là hết tháng thứ 3 của thí nghiệm thì 100 % trở đực, chứng tỏ tôm cái giả tạo thành sau 2 tháng tiêm dsRNA vẫn chưa thể ngừng tiêm được. 41
  43. Đồ án tốt nghiệp - Lô thứ 3, tiêm liên tục 3 tháng, tháng thứ nhất cắt chân bơi thứ 2 kiểm tra thì có 100 % chuyển cái, sang tháng thứ 2 chỉ có 94,1 % số con chuyển cái so với số con sống, đến tháng thứ 3 có 62,5 % chuyển cái so với số tôm sống. Sau khi ngưng không tiêm 1 tháng thì 100 % lại trở đực. - Lô thứ 4, tiêm liên tục 4 tháng, khi kiểm tra tháng đầu tiên có 89,4 % là con cái giả, đến tháng thứ 2 có 100 % chuyển cái, tháng thứ 3 là 50 %, tháng thứ 4 chỉ có 38,4 % số con chuyển cái, phần trăm tôm chuyển cái là so với số tôm sống. Đến đây thì thời gian không cho phép nên thí nghiệm được kết thúc. - Ở lô đối chứng kiểm tra từng tháng như các lô thí nghiệm, kết quả kiểm tra từng tháng là 100 % đực. Nguyên nhân tỷ lệ tôm chuyển cái ở tháng thứ 3 và thứ 4 của thí nghiệm thấp hơn so với tháng thứ 1 và thứ 2 là do lúc này tôm đã lớn, lượng mRNA thông tin mã hóa cho tuyến đực lúc này tạo ra nhiều. Vì vậy, nếu chỉ tiêm dsRNA với hàm lượng ít như lúc tôm còn nhỏ thì sẽ không đủ làm bất hoạt hormone tuyến đực, nên tôm cái giả sẽ bị trở đực. Do đó, tôm càng lớn thì lượng dsRNA tiêm vào tôm phải càng cao. Qua kết quả thí nghiệm này cho thấy tôm tiêm với dsRNA sau 4 tháng liên tiếp vẫn không thể ngừng tiêm được nếu ngừng tiêm thì tôm sẽ trở đực. Từ những số liệu thu thập được có thể kết luận rằng có thể thời gian tiêm dsRNA cho tôm để cho ra tôm cái giả là đến khi tôm thành thục sinh sản và lượng dsRNA tiêm vào cho tôm phải tăng lên cùng với sự phát triển của tôm. 42
  44. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Quy trình tổng hợp dsRNA đã được thực hiện khá thành công với bộ kit Promega, tạo được dsRNA có nồng độ như mong muốn (2,5 mg/ml). Kết quả thực nghiệm cho thấy hiệu quả của việc tiêm dsRNA vào tôm PL25 để tạo tôm cái giả là rất khả quan, chỉ cần ở nồng độ tiêm 1,25 µg/g và tần suất tiêm là 1 lần/tuần là có thể làm bất hoạt mRNA tổng hợp nên tuyến đực. Thời gian tiêm dsRNA để duy trì sự tạo tôm cái giả của tôm đến khi chúng sinh sản cũng đã được thực hiện và kết quả cho thấy là thời gian tiêm phải kéo dài đến khi tôm thành thục và mang trứng. Tuy thí nghiệm không được lặp lại nhưng nó có ý nghĩa khoa học rất lớn vì đã khẳng định được khả năng chuyển đổi giới tính tôm càng xanh M. rosenbergii của dsRNA. Từ những kết quả đạt được đã mở ra một hướng mới cho công nghệ chuyển giới tính tôm càng xanh và dsRNA được xem là một công cụ khá hiệu quả và kinh tế. Vì khi tạo được một con tôm cái giả thì sẽ sản suất ra hàng loạt tôm đực giống phục vụ cho sản xuất và đem lại giá trị kinh tế rất lớn. Tuy nhiên, muốn có kết quả cao hơn và có thể áp dụng vào sản xuất thực tế thì cần phải đầu tư nghiên cứu và phát triển các phương pháp mới để tổng hợp dsRNA với hiệu quả cao hơn. Nghiên cứu tổng hợp dsRNA trong cơ thể vi khuẩn, nghĩa là vi khuẩn sẽ tự tổng hợp dsRNA chứ không phải dùng bộ kit để tổng hợp. Thử nghiệm tiêm tôm với nồng độ dsRNA thấp hơn, nếu thành công thì sẽ có hiệu quả rất cao. Tìm kiếm con đường khác để đưa dsRNA vào tôm ví dụ như trộn vào thức ăn. Thử nghiệm việc tiêm dsRNA có ảnh hưởng đến sức lớn và khả năng mang trứng của con cái giả không. 43
  45. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước: [1] Tiến sĩ Trần Ngọc Hải, Tiến sĩ Nguyễn Thanh Phương (2009). Giáo trình kỹ thuật sản xuất giống và nuôi giáp xác, Trường Đại học Cần Thơ, Cần Thơ. [2] Nguễn Thị Hồng Hạnh (2008). Đặc điểm sinh học, ảnh hưởng của nguồn tôm mẹ lên sức sinh sản và chất lượng ấu trùng tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii, Luận văn Thạc sĩ Động vật học, Trường Đại Học Sư Phạm Huế (Đại Học Huế), Huế. [3] Nguyễn Văn Hảo (2003). Sổ tay thực hành nuôi tôm càng xanh luân canh với trồng lúa, NXB Nông Nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. [4] Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Tuần, Hoàng Thị Thủy Tiên, Lâm Quyền, Nguyễn Đức Minh, Nguyễn Nhứt và Huỳnh Thị Hồng Châu (2004). Kết quả bước đầu sản xuất giống tôm càng xanh toàn đực,Tuyển tập nghề cá Đồng Bằng Sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, trang 159 - 177. [5] Tiến sĩ Lê Quang Khôi (2009). Kỹ thuật sản xuất giống và nuôi tôm càng xanh thương phẩm, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. [6] Nguyễn Thanh Phương, Trần Ngọc Hải, Trần Thị Thanh Hiền và Marcy N. Wilder (2003), Nguyên lý và kỹ thuật sản xuất giống tôm càng xanh (Macrobrachium rosengbergii). NXB Nông Nghiệp, trang 127. [7] Nguyễn Việt Thắng (1993). Một số đặc điểm sinh học và sản xuất giống tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879). Luận án Phó Tiến Sĩ. [8] Chung Quang Trí (2006). Thử nghiệm dùng hormone đực ở giáp xác thuộc bộ mười chân Decapoda để đực hóa hậu ấu trùng tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii de Man. Khóa luận cử nhân khoa học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên (ĐHQG Thành Phố Hồ Chí Minh), Hồ Chí Minh. 44
  46. Đồ án tốt nghiệp [9] Phạm Anh Tuấn (2002). Nghiên cứu sản xuất tôm càng xanh toàn đực. Tạp chí Thủy Sản, số 1+2/2002. [10] Nguyễn Thị Thanh Thủy (2002). Kỹ thuật sản xuất giống tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii, NXB Nông Nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. [11] Đỗ Năng Vịnh (2007). Công nghệ can thiệp RNA (RNAi) gây bất hoạt gene và tiềm năng ứng dụng to lớn. Tạp chí Công Nghệ Sinh Học, 5 (3), 265-275. Tài liệu nước ngoài: [12] Charniaux-Cotton H (1954). Descouverte chezun crustacen (Orchestia gammarella) d’une glande endocrine responsable de la differenciation des caracteres sexuels primaires et secondaires males. C. R. Acad. Sci. Paris. 239: 780-782. [13] Charniaux-Cotton, H., and G. Payen (1985). Sex differentiati. In The biology of Crustacea. Edited by D. E. Bliss and L. H. Mantel, vol. 9, pp. 147-215. New York: Academic Press. [14] Davis ME, et al (2010). Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature 15; 464 (7291): 1067-1070. [15] Dewi R, Ikhsan Khasani, Sularto and Wahyu Pamungkas (2006). Production of female giant freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) through hormonal induction, Indonesian Aquaculture Jounal, 1(1), pp 35 - 38. [16] Doré-Savard Louis, Geneeviève Roussy, Marc-André Dansereau, Michael A Collingwood, Kim A Lennox, Scott D Rose, Nicolas Beaudet, Mark A Behlke and Philippe Sarret (2008). Central delivery of Dicer-substrate siRNA: A direct application for pain research. Molecular Therapy vol. 16 no. 7, 1331-1339. [17] Estrada P, Juana M Lugo, Jannel Acosta, Yamila Carpio, Ingrid Borroto, Yuliet Morera, Osmany Gonzalez, Tania Rodriguez, Laida Ramos, Alberto Huberman (2007). Effect of RNA interference on genee functions of aquatic organisms. Biotecnologia Aplicada, Vol. 24, No. 2. 45
  47. Đồ án tốt nghiệp [18] Fabioux C , Charlotte Corporeau, Virgile Quillien, Pascal Favrel and Arnaud Huvet (2009). In vivo RNA interference in oyster-vasa silencing inhibits germ cell development. FEBS Journal 276, 2566-2573. [19] Fingerman M (1997), Role of neurotransmitters in regulating reproductive hormone release and gonadal maturation in decapods crustaceans, Invertebrate Reproduction and Development, 31, pp 47- 74. [20] Fire, A and Timmons, L (1998). Specific interference by ingested dsRNA. Nature 395, 854. [21] Fire A et al (1998). Potent and specific geneetic interference by double- stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 19:391 (6669):806-11. [22] George L. Sen and Helen M. Blau (2006). A brief history of RNAi: the silence of the genees. The FASEB Journal, vol. 20. [23] Grimaldi A, Tettamanti G, Rinaldi L, Brivio MF, Castellani D and de Eguileor M (2004). Muscle differentiation in tentacles of Sepia officinalis (Mollusca) is regulated by muscle regulatory factors (MRF) related proteins. Dev Growth Differ 46, 83-95. [24] Guan H., Mak C. H. and Chan S. M (2004). Double-stranded RNA induce genee silencing of CHH/MIH/GIH neuropeptide genee family in sand shirmp, Metapenaeus. Abstract Book of the Keystone Symposia on siRNAs and miRNAs, p. 108. Keystone, CO, USA. [25] Guo S and Kemphues KJ (1995). par-1, a genee required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell 81, 611-620. [26] Hui JHL, Tobe SS and Chan SM (2008). Characterization of the putative farnesoic acid O-methyltransferase (LvFAMeT) cDNA from white shrimp, Litopenaeus vannamei: evidence for its role in molting. Peptides 29: 252- 260. [27] Hutvagner G and Zamore PD (2002). RNAi: nature abhors a double-strand. Curr Opin Geneetics & Development 12: 225-232. 46
  48. Đồ án tốt nghiệp [28] Katakura, Y (1989). Endocrin and geneetic control of sex differenciation in the malacostracan Crustacea. Invert. Reprod. Development., 16, 177-182. [29] Kitagishi Y, Satoru Matsuda, Yuri Nishimura, Naoko Okumura, Chika Tateishi, Hitomi Yoshida (2012). Dicer functions in aquatic species, SAGE Hindawi Access to Research, Journal of Amino Acids, Volume 2012 Article ID 782187, 5 pages, doi:10.4061/2012/782187. [30] King D. S (1964). Fine structure of the androgeneic gland of the crab, Pachygrapsus crassipes. Geneeral and Comparative Endocrinology, vol. 4, no. 5, pp. 533-544. [31] Kuris A. M, Z. Ra’anan, A. Sagi, and D. Cohen (1987). Morphotypic differentiation of male Malaysian giant prawn, Macrobrachium rosenbergii. Journal of Crustacean Biology, vol. 7, pp. 219-237. [32] Li. Y. X, Michael J. Farrell, Ruiping Liu, Nita Mohanty, Margaret L. Kirby (2000). Double-Stranded RNA injection produces null phenotypes in Zebrafish.DevelopmentalBiology217, 394-405. doi:10.1008/dbio.1999.9540. [33] Ling, S. W (1969). The geneeral biology and development of Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879). FAO Fisheries Report, S7: 589-606. [34] Ling, S. W (1962). Studies on the rearing of larvae and juveniles and culturing of adults of Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879). Indo- Pacific Fisheries Council. Current Affairs Bulletin, 35: 1-11. [35] Lu, L. et al (2006). Suppression of porcine arterivirus replication by baculovirus delivered shRNA targeting nucleoprotein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 340, 1178-1183. [36] Malecha S. R, P. A. Nevin, P. Ha et al (1992). Sex-ratios and sex- determination in progeney from crosses of surgically sex-reversed freshwater prawns, Macrobrachium rosenbergii. Aquaculture, vol. 105, no. 3-4, pp. 201-218. [37] Martin G, O. Sorokine, M. Moniatte, P. Bulet, C. Hetru, and A. van Dorsselaer (1999). The structure of a glycosylated protein hormone responsible for sex 47
  49. Đồ án tốt nghiệp determination in the isopod, Armadillidium vulgare. European journal of Biochemistry, vol. 262, no. 3, pp. 727-736. [38] Napoli C, Lemieux C and Jorgenesen R (1990). Introduction of a chimeric chalcone synthase genee into petunia results in reversible co-suppression of homologous genees in trans. Plant Cell 2, 279-289. [39] Nagamine C, Allen W. Knight, Armand Maggeneti and Gaylen Paxman (1980). Masculinization of female Macrobrachium rosenbergii(de Man) (Decapoda, Palaemonidae) by androgeneic gland implantation, Geneeral and comparative endrocrinology, 31(4), pp 442-457. [40] Naldini, L. et al (1996). Efficient transfer, integration, and sustained long- term expression of the transgenee in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11382-11388. [41] New, M. B (2002). Farming Freshwater Prawns: A manual for the culture of the giant river prawn (Macrobrachium rosernbergii). FAO Fisheries Technical Paper 212. [42] New, M. B (2005). Freshwater Prawn Framing: Global Status, Recent Research and a Glance at the future. 36: 210-230. [43] New, M. B. and Singholka, S (1982). Freshwater prawn farming. A manual for the culture of Macrobrachium rosenbergii. FAO Fisheries Technical PaperNo. 225. Rome, FAO. 116 pp. [44] Nhan, D.T (2009). Optimization of hatchery protocols for Macrobrachium rosenbergii culture in Vietnam. PhD thesis, Ghent University, Belgium, pp.265. [45] Ohs CL, D`abramo LR and Kelly AM (2006). Effect of dietary administration of 17α-methyltestosterone on the sex ratio of postlarval freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, during the nursery stage of culture. Journal of the World Aquaculture Society 37: 34-46. [46] Ohs CL, D`abramo LR, Hanson LP and Kelly AM (2006). Apparent control of sexual differentiation of freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, 48
  50. Đồ án tốt nghiệp through dietary administration of dopamine hydrochloride. Journal of Applied Aquaculture. 18(3) :19-32. [47] Okuno A., Y. Hasegawa, T. Ohira, Y. Katakura, and H. Nagasawa (1999). Characterization and cDNA cloning of androgeneic gland hormone of the terrestrial isopod Armadillidium vulgare. Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 264, no. 2, pp. 419-423. [48] Okumura T and Motoyuki Hara (2004). Androgeneic gland cell structure and spematogeneesis during the molt cycle and correlation morphotypic differentiation in the giant fresshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. Zoological science 21: 621-628. [49] Ongvarrasopone C, Roshorm Y and Panyim S (2007). A Simple and Cost Effective Method to Geneerate dsRNA for RNAi Studies in Invertebrates. ScienceAsia 33: 35-39. [50] Parrish S, Fleenor J, Xu S, Mello C and Fire A (2000). Functional anatomy of a dsRNA trigger: Differential requirements for the two trigger stranded in RNA interference. Molec. Cell 6, 1077-1087. [51] Ra’anan. Z and D. Cohen (1984). Ontogeney of social structure and population dynamics in the fresh water prawn Macrobrachium rosenbergii (de Man), p. 277-311. In F.M. Schrum and A. Wener (eds.) Crustacean issue II: Crustacean growth. A.A. Balkema, Rotterdam. [52] Romano N and Macino G (1992). Quelling: Transient inactivation of genee expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol. Microbiol. 6, 3343-3353. [53] Rosen O, Rivka Manor, Simy Weil, Ohad Gafni, Assaf Linial, Eliahu D. Aflalo, Tomer Ventura, Amir Sagi (2010). A sexual shift induced by silencing of a single insulin-like genee in Crayfish: Ovarian upregulation and testicular degeneeration. PLoS ONE, Volume 5, issue 12, e15281. [54] Sagi A, Dan Cohen, and Yoram Milner (1989). Effect of androgene gland ablation on morphotypic differentiation and sexual characteristics of male 49
  51. Đồ án tốt nghiệp Freshwater Prawn, Macrobrachium rosenbergii, Geneeral and comparative endocrinology, 77, pp 15 - 22. [55] Sagi A, Eviatar Snir and Isam Khalaila (1995). Sexual differentiation in decapods crustaceans: role of the androgeneic gland, Invertenrate Reproduction an Development, 31(1-3), pp 55 - 61. [56] Sagi A, Milstein A, Eran Y, Joseph D, K2la I, Abdu U, Harpaz S and Karplis I (1997a). Culture of the Australian redclaw crayfish (Cherax quadricarinatus) in Israel, II. Second growout season of overwintered populations. Israelli Journal of Aquaculture-Bamidgeh. 59:222-229. [57] Sagi A and Afalo ED (2005). The androgeneic gland and monosex culture of freshwater prawn Macrobrachium Rosenbergii (De Man):a biotechnological perspective. Aquaculture Research.36: 231-237. [58] Sagi A and Ra`ana Z (1988). Morphotypic differentiation of males of freshwater prawn Macrobrachium rosengergii: changes in the midgut glands and the reproductive system. Journal of crustacean biology. 8: 43-47. [59] Sagi A and Khalaila I (2001). The crustacean androgene: A Hormone in an Isopod and androgeneic activity in Decapods. Amer. Zool. 41 (3): 477-484. doi: 10.1093/icb/41.3.477. [60] Sarathi M, M C Simon, C Venkatesan, J Thomas, M Ravi, N Madan, S Thiyagarajan and A S Sahul Hameed (2010). Efficacy of bacterially expressed dsRNA specific to different structural genees of white spot syndrome virus (WSSV) in protection of shrimp from WSSV infection. Journal of Fish Diseases, 33, 603-607. [61] Siddiqui M.A. and Adamek, Z (1997). Reproduction parameters in a natural population of topmouth gudgeon, Pseudorasbora parva, and its condition and food characteristics with respect to sex dissimilarities. Polskie Archiwum Hydrobiologii 44(1-2):145-152. [62] Suzuki S (1999). Androgeneic gland hormone is a sex-reversing factor but cannot be a sex-determining factor in the female Crustacean 50
  52. Đồ án tốt nghiệp Isopods Armadillidium vulgare, Geneeral and comparartive endrocrinology, 115(3), pp 370-378. [63] Taketomi Y, M. Murata, and M. Miyawaki (1990). Androgeneic gland and secondary sexual characters in the crayfish Procambarus clarkii. Journal of Crustacean Biology, vol. 10, pp. 492-497. [64] Teerapong Ho, Pratchayapong Yasri, Sakol Panyim, Apinunt Udomkit (2011). Double-stranded RNA confers both preventive and therapeutic effects against Penaeus stylirostris densovirus (PstDNV) in Litopenaeus vannamei. Virus Research 155, 131-136. [65] The Nobel Assembly at Karolinska Institutet (2006). RNA interference. Advanced information on The Nobel Prize in Physiology or Medicin. [66] Tiu SH and Chan SM (2007). The use of recombinant protein and RNA interference approaches to study the reproductive functions of a gonad- stimulating hormone from the shrimp Metapenaeus ensis. T. FEBS J 274: 4385-4395. [67] Ventura T, Manor R, Aflalo ED, Weil S, Raviv S, Glazer L and Sagi A (2009). Temporal silencing of an androgeneic gland-specific insulin-like genee affecting phenotypical geneder differences and spermatogeneesis. Department of Life. Geneeral Endocrinology 150: 1278-1286. [68] Ventura T, ED Aflalo, S Weil, K Kashkush and A Sagi (2011). Isolation and characterization of a female-specific DNA marker in the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii. Heredity, 1-6. [69] Zamore PD, et al (2000). RNAi: double-stranded RNA directs the ATP- dependent cleavage of mRNA at 21-23 nucleotide intervals. Cell 31; 101 (1): 25-33. 51
  53. Đồ án tốt nghiệp 52