Đồ án Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia Marcescens SH1

97 trang thiennha21 12/04/2022 5390

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia Marcescens SH1", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_tao_che_pham_diet_sau_khoang_spodoptera_litura_tu_dich.pdf

Nội dung text: Đồ án Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia Marcescens SH1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẠO CHẾ PHẨM DIỆT SÂU KHOANG Spodoptera litura TỪ DỊCH NUƠI CẤY VI KHUẨN Serratia marcescens SH1 Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN HỒI HƢƠNG Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ NGỌC DUNG MSSV: 1211100056 Lớp: 12DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2016
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác. Tơi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cám ơn và các thơng tin trích dẫn trong Luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện luận văn Lê Thị Ngọc Dung
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trong suốt quãng đời con đi học, chƣa một ngày nào bố mẹ thơi lo lắng và chăm sĩc cho con, nhƣng con khơng mấy khi biểu hiện hay đơn giản là câu nĩi “con thƣơng bố mẹ”. Nhân lúc này đây, con xin đƣợc ghi khắc cơng ơn dƣỡng dục của bố mẹ, cĩ những lúc con vơ tình làm bố mẹ buồn, nhƣng cả hai đã khơng bỏ mặc con với khĩ khăn mà đã luơn dõi theo, giúp đỡ và sát cánh bên con để con đƣợc trƣởng thành đến ngày hơm nay. Bố mẹ là chỗ dựa tinh thần vững chắc mỗi khi con gặp phải vấn đề khĩ khăn; là động lực để con đứng dậy sau mỗi lần vấp ngã; là bách khoa tồn thƣ giúp con giải quyết mọi vấn đề. Và sẽ luơn là nhƣ vậy cho đến mãi sau này. Với lịng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn tồn thể quý thầy cơ trƣờng đại học Cơng nghệ Tp.Hồ Chí Minh đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kiến thức quý giá ngay từ những ngày đầu em bƣớc vào giảng đƣờng đại học. Đặc biệt, em xin đƣợc chân thành biết ơn cơ Nguyễn Hồi Hƣơng, ngƣời thầy đáng kính, luơn quan tâm và tận tình chỉ dạy để em cĩ thể hồn thành đồ án. Và quan trọng hơn là cơ đƣa ra những lời khuyên và chỉ dạy em cách đối mặt với những va chạm trong cuộc sống, và đĩ sẽ là những trang vàng trong hành trang sau này của em. Em cũng xin chân thành cảm ơn cơ Nguyễn Thị Hai đã quan tâm và cĩ những hƣớng dẫn đúng lúc khi em đang tập nuơi sâu khoang và cơ là ngƣời cho con nguồn nấm bệnh trong phịng thí nghiệm. Em cũng xin chân thành cảm ơn cơ Đỗ Thị Tuyến đã hết lịng giúp đỡ, hỗ trợ em về địa điểm quét phổ UV – vis. Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành, thầy Nguyễn Trung Dũng, cơ Nguyễn Trần Thái Khanh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phịng thí nghiệm. Cảm ơn tất cả các bạn lớp 12DSH01 và 12DSH02 đã luơn động viên, giúp đỡ mình trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Cảm ơn anh Nguyễn Hồng Anh Kha, anh Lê Quốc Vũ, bạn Vũ Hồng Minh Ngọc, bạn Kiều Nguyễn Phƣơng Vy, bạn Phan Thị Gìn cùng các em Trƣơng Hồi Nguyên lớp 13DSH03, em Nguyễn Thị
Đồ án tốt nghiệp Băng Khanh, em Nguyễn Trung Hậu, em Lê Thị Ngọc Hân đã cùng đồng hành và sát cánh trong suốt những ngày làm đồ án tố nghiệp. Xin chân thành cảm ơn! Tp.Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2016 SVTH: Lê Thị Ngọc Dung
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học 4 1.1.1 Khái niệm về thuốc trừ sâu sinh học 4 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học hiện nay 4 1.1.3 Những mặt ƣu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học 5 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens. 7 1.2.1 Lịch sử phát hiện 7 1.2.2 Phân loại khoa học của Serratia marcescens. 8 1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens. 8 1.2.3.1 Đặc điểm sinh lí 9 1.2.3.2 Đặc điểm sinh hĩa 9 1.2.3.3 Đặc điểm phân bố 11 1.3 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens. 11 1.3.1 Sắc tố 11 1.3.2 Biosurfactants 12 1.3.3 Acid béo 13 1.3.4 Enzyme 13 1.3.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens. 13 1.4 Giới thiệu về Prodigiosin 14 1.4.1 Khái niệm về prodigiosin 14 1.4.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin 15 1.4.3 Hoạt động sinh học của prodigiosin 18 ___i___
Đồ án tốt nghiệp 1.5 Tiềm năng tạo chế phẩm trừ sâu từ prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens. 19 1.6 Cơ chế tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens 20 1.7 Một số nghiên cứu trên thế giới 25 1.7.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens 25 1.7.2 Tình hình nghiên cứu prodigiosin 25 1.8 Khái quát về sâu khoang Spodoptera litura 27 1.8.1 Đặc điểm hình thái 27 1.8.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái 28 1.8.3 Thiên địch 29 1.8.4 Biện pháp phịng trừ 29 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Thời gian, địa điểm 30 2.1.1 Thời gian 30 2.1.2 Địa điểm 30 2.2 Vật liệu – thiết bị – hĩa chất 30 2.2.1 Nguồn vi sinh vật 30 2.2.1.1 Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens 30 2.2.1.2 Nguồn vi khuẩn chỉ thị 30 2.2.1.3 Nguồn nấm bệnh 31 2.2.1.4 Nguồn sâu khoang Spodoptera litura 31 2.2.2 Mơi trƣờng nuơi cấy và hĩa chất 31 2.2.3 Dụng cụ, thiết bị 31 2.3 Bố trí thí nghiệm 33 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm 37 2.4.1 Phƣơng pháp nuơi sâu trong phịng thí nghiệm 37 2.4.2 Phƣơng pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens 37 2.4.2.1 Phƣơng pháp xử lí acid 37 2.4.2.2 Phƣơng pháp xử lí nhiệt 38 ___ii___
Đồ án tốt nghiệp 2.4.3 Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính sinh học 39 2.4.3.1 Phƣơng pháp định tính enzyme 39 2.4.3.2 Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn 43 2.4.3.3 Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng nấm 46 2.4.3.4 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phƣơng pháp quét lá 48 2.4.4 Khảo sát thời gian bảo quản canh trƣờng lên men sau xử lí 49 2.4.5 Khảo sát hiệu lực diệt sâu invivo 50 2.4.6 Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm 51 Chƣơng 3. KẾT QUẢ, THẢO LUẬN 53 3.1 Xác định thời gian, độ pH tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn Serratia marcescens từ phƣơng pháp xử lí acid HCl 1N 53 3.2 Xác định thời gian, nhiệt độ tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn Serratia marcescens từ phƣơng pháp xử lí nhiệt độ 60 3.3 Khả năng tiết enzyme ngoại bào 62 3.3.1 Khả năng giữ lại enzyme ngoại bào từ phƣơng pháp xử lí acid 62 3.3.2 Khả năng giữ lại enzyme ngoại bào từ phƣơng pháp xử lí nhiệt độ 66 3.4 Khả năng kháng khuẩn 68 3.4.1 Khả năng kháng khuẩn của dịch canh trƣờng đã xử lí bằng phƣơng pháp xử lí acid 68 3.5 Hoạt tính kháng nấm 69 3.5.1 Khả năng kháng nấm của dịch canh trƣờng đã xử lí bằng phƣơng pháp xử lí acid 69 3.6 Hiệu lực diệt sâu 71 3.6.1 Hiệu lực diệt sâu từ canh trƣờng lên men đã qua xử lí 71 3.6.2 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm 73 3.7. Xác định thời gian bảo quan canh trƣờng đã xử lí 75 3.8. Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm 79 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO 85 ___iii___
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số đặc điểm sinh hĩa của Serratia marcescens 10 Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) 17 Bảng 1.3. Một số bằng sáng chế về prodigiosin 26 Bảng 3.1 Prodigiosin unit/tế bào của chủng SH1. 60 Bảng 3.2. Khả năng bảo tồn các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng đƣợc xử lí bằng phƣơng pháp xử lí acid. 64 Bảng 3.3. Khả năng bảo tồn các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng đƣợc xử lí bằng phƣơng pháp xử lí nhiệt 66 Bảng 3.4. Khả năng kháng khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus của hoạt chất prodigiosin trong canh trƣờng đã xử lí. 68 Bảng 3.5. Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp. của canh trƣờng đã xử lí 70 Bảng 3.6. Tỉ lệ tử vong của sâu khoang tuổi 3. 73 Bảng 3.7 Tỉ lệ tử vong của sâu khoang tuổi 3 75 Bảng 3.8. Tỉ lệ prodigiosin cịn lại sau 7 ngày bảo quản (%) 82 ___iv___
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens 8 Hình 1.2 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) 9 Hình 1.3. Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất prodigiosin (Krishna, 2008) 16 Hình 1.4. Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 17 Hình 1.5. Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira,2009) 19 Hình 1.6. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) 22 Hình 1.7. Quá trình sinh tổng hợp prodigiosin (Caspi R, 2014) 24 Hình 1.8. Vịng đời của sâu khoang Spodoptera litura 28 Hình 2.1 Quy trình khảo sát khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn S.mercescens và hoạt tính diệt sâu của prodigiosin trong canh trƣờng đã xử lí. 34 Hình 2.2 Quy trình thử nghiệm khảo sát thời gian tiêu diệt tế bào vi khuẩn S.mercescens 35 Hình 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học của canh trƣờng vi khuẩn sau khi xử lí acid 36 Hình 2.4 Quy trình khảo sát chế phẩm diệt sâu từ prodigiosin 36 Hình 2.5 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch mơi trƣờng Lipit 40 Hình 2.6 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch mơi trƣờng Casein 41 Hình 2.7 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch mơi trƣờng huyền phù chitin 1%. 43 Hình 2.8 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức kháng khuẩn trên đĩa thạch mơi trƣờng NA. 45 Hình 2.9 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA 47 Hình 3.1. Khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens SH1 tại các thời điểm 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ tại pH 1 và pH 2 56 ___v___
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2. Giá trị OD499 của prodigiosin trong canh trƣờng xử lí acid tại từng nghiệm thức 57 Hình 3.3 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499) và tế bào (OD 620) trong từng nghiệm thức 59 Hình 3.4 Canh trƣờng đã xử lí acid đƣợc trang trên đĩa mơi trƣờng PGA, sau 24h ủ tối. 61 Hình 3.5. Khả năng bảo tồn các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng S.marcescens đã xử lí 64 Hình 3.6. Khả năng bảo tồn các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng lên men đã xử lí 66 Hình 3.7 Khả năng kháng khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus của hoạt chất prodigiosin trong canh trƣờng lên men đã xử lí. 68 Hình 3.8 Khả năng kháng nấm Fusarium sp. của canh trƣờng đã xử lí so với đối chứng 70 Hình 3.9. Nồng độ pha lỗng cho thí nghiệm hiệu lực diệt sâu: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. 72 Hình 3.10 Tỉ lệ sâu chết bởi canh trƣờng đã xử lí acid 72 Hình 3.11 Tỉ lệ sâu chết theo thời gian do prodigiosin trong canh trƣờng S.marcescens đã xử lí acid 73 Hình 3.12 Chế phẩm và các nồng độ pha lỗng:10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và10-6 74 Hình 3.13. Tỉ lệ sâu chết cho chế phẩm theo thời gian 75 Hình 3.14. Tỉ lệ prodigiosin cịn lại trong canh trƣờng nuơi cấy vi khuẩn S.marcescens đã xử lí ở mơi trƣờng ngồi sáng 76 Hình 3.15. Tỉ lệ prodigiosin cịn lại trong canh trƣờng đã xử lí ở mơi trƣờng tối 77 Hình 3.16. So sánh tỉ lệ prodigiosin cịn lại sau 7 ngày bảo quản, ở nhiệt độ 2oC 78 Hình 3.17. So sánh tỉ lệ prodigiosin cịn lại sau 7 ngày bảo quản, ở nhiệt độ phịng 78 Hình 3.18. So sánh tỉ lệ prodigiosin cịn lại sau 7 ngày bảo quản, ở điều kiện ngồi trời 79 ___vi___
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.19. Chế phẩm trƣớc và sau 7 ngày bảo quản. 80 Hình 3.20. Trích ly lỏng – lỏng chế phẩm 80 Hình 3.21. Tỉ lệ prodigiosin cịn lại trong chế phẩm sau 7 ngày theo dõi ở các điều kiện mơi trƣờng: -18oC, 2oC, nhiệt độ phịng, nhiệt độ ngồi trời và nhiệt độ cao (60oC) 82 ___vii___
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Các sản phẩm xuất khẩu là mặt hàng nơng nghiệp của Việt Nam đang dần cĩ chỗ đứng trên thị trƣờng quốc tế, nhƣ: Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc. Tuy nhiên, việc sản xuất và thu hoạch các loại nơng sản thiếu tính chuyên nghiệp và khoa học, lạm dụng các chất bảo vệ thực vật hĩa học gây tồn đọng dƣ lƣợng thuốc trong sản phẩm – là lí do làm sản phẩm Việt khĩ cĩ chỗ đứng ở các thị trƣờng lớn. Thêm vào đĩ là tình hình thời tiết những năm trở lại đây cĩ chuyển biến phức tạp do hiện tƣợng thời tiết El Niđo đã làm ảnh hƣởng đến sự phát triển của cây trồng và sự xuất hiện của các lồi cơn trùng gây hại. Để hạn chế sự tấn cơng của cơn trùng lên rau màu, ngƣời nơng dân đã dùng thuốc hĩa học với liều lƣợng quá mức cho phép, vơ tình tạo cho cơn trùng khả năng kháng thuốc, làm cho tình hình sâu hại trở nên nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn. Trong đĩ, sâu khoang Spodoptera litura là lồi sâu đa thực và gây hại nặng đến màu màng. Chúng cĩ thể phá hại đến 290 loại cây trồng thuộc 99 họ thực vật bao gồm các loại rau đậu, cây thực phẩm, cây cơng nghiệp, cây lƣơng thực, cây phân xanh, cĩ khả năng kháng thuốc hĩa học nếu ngƣời dùng lạm dụng quá nhiều thuốc trừ sâu hĩa học khơng đúng cách. Vì vậy, xu hƣớng sử dụng các biện pháp phịng trừ sinh học đã và đang trở nên rất hữu ích vì tiết kiệm chi phí, cĩ tác dụng phịng trừ lâu dài, an tồn cho sức khỏe con ngƣời, đồng thời khơng gây ơ nhiễm mơi trƣờng. Trong các biện pháp sinh học đƣợc sử dụng hiện nay thì các loại thuốc phịng trừ sinh học cĩ nguồn gốc từ hợp chất thứ cấp đang chiếm đƣợc sự chú ý của ngƣời dùng, vì khả năng tiêu diệt sâu bệnh mà khơng gây độc hại cho con ngƣời và mơi trƣờng xung quanh. Tuy nhiên, các sản phẩm trên chƣa thật sự nổi bật. Những năm gần đây, việc trích ly đƣợc hợp chất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens cĩ khả năng diệt sâu đã mở ra một triển vọng mới trong việc tạo chế phẩm trừ sâu sinh học là hợp chất thứ cấp của vi sinh vật. Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện nay chỉ cĩ một vài đề tài nghiên cứu về hợp chất thứ cấp này mà chƣa cĩ nghiên cứu nào về ứng dụng tạo chế ___1___
Đồ án tốt nghiệp phẩm diệt sâu từ hợp chất prodigiosin. Vì những lợi ích của hợp chất thứ cấp prodigiosin, ngƣời tiến hành đề tài đã chọn hƣớng cho đồ án tốt nghiệp là: “Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuơi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH1”. 2. Mục đích nghiên cứu Sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu chứa prodigiosin. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Xác định phƣơng pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens trong canh trƣờng lên men Sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuơi cấy Serratia marcescens SH1 phân lập từ tuyến trùng diệt sâu EPN bỏ qua quá trình trích ly prodigiosin, khơng cịn chứa tế bào sống. 4. Các kết quả cần đạt đƣợc Khảo sát đƣợc khả năng sử dụng acid để diệt tế bào (ảnh hƣởng của chế độ xử lý acid lên tế bào, prodigiosin và enzyme trong dịch nuơi cấy) Khảo sát đƣợc khả năng xử lý nhiệt để diệt tế bào (ảnh hƣởng của chế độ xử lý acid lên tế bào, prodigiosin và enzyme trong dịch nuơi cấy). Chọn chế độ xử lý thích hợp (tế bào chết, nồng độ prodigiosin cao, cịn giữ đƣợc hoạt tính enzyme). Khảo sát đƣợc hoạt tính của dịch nuơi cấy sau xử lý: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng sâu Spodoptera litura tuổi ) Khảo sát đƣợc hiệu lực diệt sâu của chế phẩm từ dịch nuơi cấy xử lý acid Khảo sát đƣợc sự ảnh hƣởng của các điều kiện bảo quản lên chế phẩm. 5. Kết cấu của đồ án Đồ án “Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH1 phân lập từ nguồn tuyến trùng EPN” đƣợc trình bày gồm 3 chƣơng: 1. Tổng quan tài liệu ___2___
Đồ án tốt nghiệp Giới thiệu về định nghĩa thuốc trừ sâu sinh học, phân loại lồi cũng nhƣ các đặc trƣng sinh hĩa của vi khuẩn Serratia marcescens, tính chất đặc trƣng của hợp chất thứ cấp prodigiosin, giới thiệu về sâu khoang. 2. Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm Giới thiệu về các phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong quá trình làm đề tài. Cách bố trí các nghiệm thức trong từng thí nghiệm. 3. Kết quả thảo luận Trình bày chi tiết các kết quả đạt đƣợc của từng thí nghiệm đƣợc tiến hành. ___3___
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học 1.1.1 Khái niệm về thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học là những chế phẩm cĩ nguồn gốc sinh học, đƣợc làm từ những nguyên liệu rất dễ kiếm nhƣ gừng, tỏi, ớt, xả, các loại lá, các chủng nấm vi sinh, hợp chất thứ cấp của vi sinh vật cĩ hiệu quả cao trong việc phịng trừ các loại sâu bệnh nhƣng lại rất an tồn với sức khỏe con ngƣời và mơi trƣờng đất. (Nguyễn Văn Tấn, 2004) 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học hiện nay trên thị trường Nhƣ chúng ta đã biết, các thuốc trừ sâu hĩa học cĩ ƣu điểm rõ rệt là hiệu quả diệt sâu nhanh nhƣng cĩ nhƣợc điểm quan trọng là cĩ độ độc cao với ngƣời và các động vật cĩ ích (trong đĩ cĩ các lồi thiên địch), gây ơ nhiễm mơi trƣờng. Vì vậy, do yêu cầu bảo vệ sức khỏe con ngƣời và sự trong sạch của mơi trƣờng, các thuốc trừ sâu hĩa học cần đƣợc hạn chế sử dụng dần và thay vào đĩ là các thuốc trừ sâu sinh học. Hiện nay, trên thị trƣờng thuốc bảo vệ thực cĩ cĩ 7 loại thuốc trừ sâu sinh học: 1. NPV là chế phẩm trừ sâu hoạt lực cao, gồm 2 loại V- Ha và V- S1. Thuốc chuyên dùng để diệt trừ sâu xanh, sâu khoang, sâu xanh đốm trắng, sâu tơ trên các loại cây rau màu, cây cơng nghiệp, cây ăn quả với hiệu quả rất cao. NPV cĩ nồng độ đặc hơn so với các loại thuốc khác, sử dụng tƣơng đối dễ dàng: chỉ cần hồ thuốc vào bình và phun bình thƣờng với liều lƣợng 1,0- 1,2 kg/ha. 2. Chế phẩm Bt: Gồm 2 loại: dạng sữa 4.000 IU/ml và dạng bột Biotox 16.000 IU/mg chuyên dùng trừ sâu tơ, sâu xanh hại rau, sâu kéo ra lá, các loại sâu thuộc họ Leptidopera. 3. Chế phẩm M&B cĩ 2 loại: Metarhizium và Beauveria. Metarhizium anisopliae 1,6- 2,5 x 109Bt/gr bọ hại dừa. Thử nghiệm tại Đà Nẵng, Phú Yên đạt hiệu quả tới 86,5%. Dạng nấm xanh đƣợc dùng để trừ rầy, bọ xít trên lúa và cây ăn quả ___4___
Đồ án tốt nghiệp đạt 70- 90%, dạng nấm trắng đạt 50- 85%. Chế phẩm Beauveria chuyên dùng để trị sâu rĩm thơng và sâu đo nâu hại bồ đề với hiệu quả tiêu diệt sâu tới gần 87%. TS. Nguyễn Văn Vấn cho biết: “Loại thuốc này cĩ thể sử dụng để tiêu diệt sâu rĩm hại thơng đang xảy ra tại Nghệ An hiện nay”. 4. Chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma 3- 3,2 x 109Bt/gr trừ bệnh hại cây trồng nhƣ bệnh lở cổ rễ bắp cải, nấm đất đạt 41,5- 60%. 5. Chế phẩm tuyến trùng EPN Biostar 15- 20 x 106 IJs trừ sâu xám hại thuốc lá, đặc biệt là mía đạt hiệu quả khá cao. Hiện những sản phẩm đầu tiên đã đƣợc đƣa vào ứng dụng để diệt trừ sâu xám hại thuốc lá tại Ba Vì (Hà Tây), bọ hung hại mía tại Thạch Thành (Thanh Hố). 6. Chế phẩm hố sinh Momosertatin (MM) 2IU/lít trừ các loại sâu hại rau màu đạt 45- 50%. 7. Chế phẩm Ditacin 8% và Ketomium 1,5 x 106 Cfu/g, trừ bệnh hại trên cây ăn quả, cây lâu năm. (Nguyễn Văn Tấn, 2004) 1.1.3 Những mặt ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học. Nhìn chung, thuốc trừ sâu cĩ nguồn gốc từ vi sinh vật cĩ nhiều ƣu điểm so với thuốc trừ sâu hĩa học, nhƣ: Ƣu điểm nổi bật nhất của thuốc trừ sâu sinh học là ít độc với ngƣời và mơi trƣờng. Các chế phẩm vi sinh vật dùng trừ sâu và dầu thực vật hầu nhƣ khơng độc với ngƣời và các sinh vật cĩ ích. Ít độc với các lồi thiên địch nên thuốc sinh học bảo vệ đƣợc sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu hại), ít gây tình trạng bùng phát sâu hại. Ít độc với ngƣời và mau phân hủy trong tự nhiên, các thuốc sinh học ít để lại dƣ lƣợng độc trên nơng sản và cĩ thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nơng sản yêu cầu cĩ độ sạch cao nhƣ các loại rau, chè Muốn cĩ nơng ___5___
Đồ án tốt nghiệp sản sạch và an tồn, một biện pháp quan trọng là sử dụng các thuốc sinh học trừ sâu. Ngồi ra, các yếu tố sinh học trừ sâu nhƣ các vi sinh vật và thực vật thƣờng cĩ sẵn và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc, vì vậy nguồn khai thác rất dễ dàng và hầu nhƣ vơ tận. Đồng thời với các chế phẩm đƣợc sản xuất theo quy mơ cơng nghiệp, hiện nay ngƣời ta vẫn cĩ thể dùng các phƣơng pháp chế biến thơ sơ để sử dụng. Cĩ thể ra đồng thu thập các sâu bị chết vì nấm bệnh, nghiền nát trong nƣớc rồi phun lên cây để trừ sâu. Các cây thuốc lá, thuốc lào, hạt xoan, rễ dây thuốc cá băm nhỏ và đập nát ngâm lọc trong nƣớc để phun cũng rất cĩ hiệu quả. Bên cạnh những ƣu điểm vƣợt trội vừa nêu ở trên đây, thuốc trừ sâu bệnh hại sinh học vẫn cịn những điểm hạn chế nhƣ: Các thuốc vi sinh thƣờng thể hiện hiệu quả diệt sâu tƣơng đối chậm hơn so với thuốc hĩa học. Sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thƣờng yêu cầu điều kiện cũng chặt chẽ hơn. Nhƣng so với các ƣu điểm to lớn thì các nhƣợc điểm trên đây của thuốc sinh học là rất nhỏ và hồn tồn cĩ thể khắc phục đƣợc. Vì vậy, thuốc trừ sâu sinh học ngày càng đƣợc khai thác sử dụng nhiều. Ở nƣớc ta, ngồi các chế phẩm Bt đã đƣợc biết đến tƣơng đối lâu, hiện nay cĩ nhiều chế phẩm mới đã đƣợc đăng ký sử dụng. Yêu cầu ngày càng cĩ nhiều nơng sản và thực phẩm an tồn phục vụ đời sống cũng là điều kiện quan trọng thúc đẩy sự phát triển của các thuốc sinh học. ___6___
Đồ án tốt nghiệp 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens 1.2.1 Lịch sử phát hiện Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm đƣợc nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6 trƣớc cơng nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đơi khi xuất hiện trên bánh mì. Sau đĩ, vào năm 332 trƣớc cơng nguyên, những ngƣời lính trong quân đội Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đơi khi dƣờng nhƣ cĩ “máu” trên đĩ. Và họ cho rằng hiện tƣợng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng. Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nĩi đến sự xuất hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969), đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đĩ, sự cố nhƣ vậy đƣợc ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch. Trong bĩng tối và sự ẩm ƣớt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh đƣợc sử dụng trong Thánh lễ thƣờng xuyên bị nhiễm Serratia marcescens, tuy nhiên, điều này lại khiến nhiều ngƣời nghĩ rằng đĩ là máu của Chúa Christ và cho đĩ là một phép lạ (Gillen và Gibbs, 2011). Bizio, một dƣợc sĩ ở Padua (Italya), là ngƣời đầu tiên phát hiện và đặt tên Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngơ sang màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đĩ để ở nơi khơ ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều đƣợc bao phủ bởi một lớp vi sinh vật màu đỏ. Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia, theo tên nhà vật lý nổi tiếng ngƣời Italya đã phát minh ra tàu hơi nƣớc là Serrati, tên lồi marcescens cĩ nguồn gốc từ tiếng Latin, cĩ nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này phân hủy rất nhanh bánh mì và polenta. Ban đầu Bizio mơ tả Serratia marcescens nhƣ một loại nấm, do ơng nhìn thấy những đốm đỏ dƣới kính hiển vi. Thời gian sau đĩ, vào những năm 1850, các nhà khoa học đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn. ___7___
Đồ án tốt nghiệp 1.2.2 Phân loại khoa học của Serratia marcescens. Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhĩm vi khuẩn cĩ liên quan với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đĩ, lồi điển hình của chi Serratia là Serratia marcescens. Theo Bizio (1823), Serratia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gramma proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Serratia Lồi: Serratia marcescens 1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia marcescens cĩ hình que, đƣờng kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40oC và cĩ thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012). Hình 1.1. Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens ___8___
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) 1.2.3.1 Đặc điểm sinh lí Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên mơi trƣờng nutrient agar đƣợc mơ tả là khuẩn lạc trịn, lồi và các khuẩn lạc này cĩ màu trắng, hồng hay đỏ, đĩ cũng chính là sắc tố thƣờng thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens thƣờng bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012). Vi khuẩn Serratia marcescens cĩ thể bám dính với nhau trên mơi trƣờng thạch, tạo thành nhĩm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này cĩ chiều dài từ 5 – 30 μl. Serratia marcescens cũng cĩ thể tạo thành một màng sinh học. 1.2.3.2 Đặc điểm sinh hĩa Serratia marcescens cĩ thể phát triển trong mơi trƣờng hiếu khí và kỵ khí. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lƣợng và nhờ cĩ các enzyme nhƣ superoxide dismutase, calatas, peroxides, bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hĩa, cho phép sống trong mơi trƣờng oxy hĩa. Serratia marcescens cĩ thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase (Giri và cộng sự, 2004). Ngồi ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào nhƣ nuclease, protease và haemolysin ___9___
Đồ án tốt nghiệp (Hejazi và Falkiner, 1997). Trong đĩ, thủy phân casein là một đặc điểm chung của Serratia marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein. Một số đặc điểm sinh hĩa của Serratia marcescens đƣợc thể hiện qua bảng 1.7. (Tariq và John, 2010). Bảng 1.1. Một số đặc điểm sinh hĩa của Serratia marcescens Đặc điểm sinh STT Kết quả hĩa 1 Di động + 2 Indole – 3 Methyl Red – 4 Voges Proskauer + 5 Citrate + 6 Dnase + 7 Catalase + 8 Oxidase – 9 Urease – 10 Gelatinase + 11 Chitinase + Mơi trƣờng chuyển sang acid, 12 Triple sugar iron khơng sinh khí và khơng sinh H2S 13 Hydrogen sulphide – 14 Lysine decarboxylase + peoduction 15 Ornithine decarboxylase + 16 Lên men glucose + 17 Lên men sucrose + 18 Lên men sorbitol + 19 Lên men fructose + 20 Lên men xylose – 21 Lên men rhaminose – 22 Lên men lactose – 23 Lên men arabinose – ___10___
Đồ án tốt nghiệp 1.2.3.3 Đặc điểm phân bố Cĩ thể dễ dàng tìm thấy Serratia marcescens trong nƣớc, trong đất, trong thực vật, cơn trùng, cũng nhƣ trong ống tiêu hĩa của ngƣời và động vật cĩ xƣơng sống. Trong nƣớc và đất: đã cĩ 150 chủng Serratia đƣợc phân lập trong nƣớc sơng và Serratia marcescens chiếm 75%. Bên cạnh đĩ, Serratia marcescens cĩ thể đĩng một vai trị quan trọng trong chu kỳ sinh học của kim loại, thơng qua việc khống hĩa hữu cơ sắt, cũng nhƣ hịa tan vàng và đồng (Parès, 1964). Trong cơn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các lồi cơn trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ƣu thế. Serratia marcescens đƣợc coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm năng đối với cơn trùng, chúng làm cơn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006). Hơn nữa, Serratia marcescens cũng đƣợc tìm thấy nhiều trong thực phẩm, nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là mơi trƣờng rất thuận lợi cho sự tăng trƣởng của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001). Gần đây, ngƣời ta cịn phát hiện sự cĩ mặt của Serratia marcescens trong các lồi Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae. 1.3 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens 1.3.1 Sắc tố Một nhĩm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998), đƣợc biết đến nhƣ là một yếu tố đặc biệt, nhƣng chỉ xuất hiện trong một số chủng. Các sắc tố thuộc nhĩm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đĩ, khả năng ức chế miễn ___11___
Đồ án tốt nghiệp dịch cĩ trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI) (Krishna, 2008). Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin đƣợc sản xuất bởi biogroup A1 và A2/6, nĩ khơng đƣợc sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8, hoặc TCT (Grimont, 1977). Bên cạnh đĩ, chủng khơng sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6 thƣờng gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC (Grimont, 1977; Williams và Qadri, 1980). Một số gene mã hĩa sinh tổng hợp prodigiosin đã đƣợc biểu hiện trong Escherichia coli (Dauenhauer và cộng sự, 1984). Các dịng đƣợc tạo thành này cĩ khả năng tổng hợp ở cả hai giai đoạn MAP và MBC, hoặc tổng hợp giai đoạn MAP ở bên ngồi (Francine và Patrick, 2006). Prodigiosin đƣợc biết đến là cĩ khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế bào T), vì vậy khi Serratia marcescens sống trong cơ thể ngƣời, cĩ thể chúng sẽ khơng tổng hợp prodigiosin và do đĩ thốt khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và Falkiner, 1997). Bên cạnh đĩ, một sắc tố vàng cĩ tên gọi là 2-hydroxy-5-carboxymethylmuconic semialdehyde acid, đƣợc sản xuất từ sự phân tách 3,4- dihydroxyphenylacetic acid (3,4-DHP) bởi enzyme 3,4-DHP 2,3-dioxygenase (Trias và cộng sự, 1988). Enzyme này đƣợc cảm ứng bởi tyrosine trong tất cả các chủng Serratia marcescens. Tuy nhiên, hiện nay chủng Serratia marcescens A8a, đã bị mất khả năng phát triển trên các hợp chất thơm, để cĩ thể sản xuất các sắc tố màu vàng (Francine và Patrick, 2006). 1.3.2 Biosurfactants Các chủng sinh sắc tố và một số chủng khơng sinh sắc tố của Serratia marcescens đều sản xuất biosurfactants cĩ thể hoạt động nhƣ một chất thấm. Chất thấm này đƣợc sản xuất với số lƣợng lớn ở 30°C nhƣng khơng đƣợc sản xuất ở 37°C trong phase cân bằng của quá trình tăng trƣởng. Ba aminolipid, từ W1 đến W3, cĩ các hoạt động thấm ƣớt và đã đƣợc tách bằng sắc ký lớp mỏng (Matsuyama và cộng sự, 1986). ___12___
Đồ án tốt nghiệp Trong đĩ, W1 đƣợc xác định là serratamolide, một cyclodepsipeptide mà trƣớc đĩ đã từng đƣợc phát hiện bởi Wasserman và cộng sự (1961). 1.3.3 Acid béo Các acid béo chủ yếu trong tồn bộ tế bào của các chủng Serratia marcescens là 3-3-hydroxytetradecanoic, n-hexadecanoic, hexadecanoic, và octadecanoic acid. Các acid béo này chiếm khoảng 50 – 80% thành phần tế bào, trong đĩ, n- tetradecanoic acid chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Bergan và cộng sự, 1983). 1.3.4 Enzyme Serratia marcescens cĩ thể tiết ra nhiều loại enzyme nhƣ protease, chitinase, DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase, Trong đĩ, enzyme chitinase cĩ nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải cĩ chứa chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đĩng gĩi, cũng nhƣ kiểm sốt sinh học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nƣớc, (Joshi và cộng sự, 1989). Một nghiên cứu đã cho thấy Serratia marcescens sản xuất ít nhất ba enzyme chitinase (ChiA, ChiB, ChiC), một chitobiase và một protein chitin-binding (CBP21) (Fuchs và cộng sự, 1986; Jones và cộng sự, 1986; Sundheim và cộng sự, 1988; Harpster và Dunsmuir, 1989; Bruberg và cộng sự, 1996; Tews và cộng sự, 1996; Watanabe và cộng sự, 1997; Gal và cộng sự, 1998, Suzuki và cộng sự, 1998), chúng cĩ khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 57, 52, 48, 36, và 21 kDa, cùng với các hoạt động chitinolytic (Fuchs và cộng sự, 1986). 1.3.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens Yếu tố độc lực là các yếu tố đĩng vai trị thúc đẩy khả năng gây bệnh của các tác nhân gây bệnh bằng cách cho phép các tác nhân gây bệnh nhập vào vật chủ, tránh sự tự bảo vệ của vật chủ và sinh trƣởng phát triển, gây ảnh hƣởng đến vật chủ, mà phổ biến là chính bản thân tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng (Weiss và Hewlett, 1986). ___13___
Đồ án tốt nghiệp Một số yếu tố độc lực của Serratia marcescens đã đƣợc nghiên cứu, bao gồm sự bám dính, tính kị nƣớc, mannose-resistant, mannose-sensitive, LipoPolySaccharide (LPS). Trong đĩ, yếu tố quan trọng đầu tiên trong quá trình tƣơng tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính. Các yếu tố bám dính của vi sinh vật đƣợc gọi là các adhesion, chúng cĩ thể cĩ bản chất polypeptide hoặc polysaccharide. Đối với các adhesin cĩ bản chất polypeptide thì đƣợc chia thành hai nhĩm là nhĩm cĩ fimbriae và nhĩm khơng cĩ fimbriae. Mà các vi khuẩn Gram âm, nhƣ là Serratia marcescens, thƣờng bám dính nhờ các fimbriae này. Các fimbriae (hay cịn gọi là các pili) là những cấu trúc phụ của vi sinh vật cĩ dạng nhƣ sợi lơng trên bề mặt vi khuẩn. Các fimbriae đƣợc cấu tạo bởi nhiều protein xếp chặt với nhau tạo nên hình dạng giống nhƣ trụ xoắn ốc. Thƣờng thì chỉ cĩ một loại protein là cấu trúc chính của một phân nhĩm fimbriae tuy nhiên các protein phụ trợ khác cũng cĩ thể tham gia vào cấu trúc của đỉnh hoặc gốc fimbriae. Đỉnh của các fimbriae cĩ chức năng gắn với tế bào vật chủ. Bên cạnh đĩ, LPS hay cịn đƣợc gọi là lipoglycan, là các phân tử lớn lƣỡng tính nằm trong lớp màng ngồi tế bào vi khuẩn, bao gồm lipid và polysaccharide liên kết với nhau nhờ liên kết cộng hĩa trị. LPS đƣợc coi nhƣ nội độc tố, bảo vệ màng tế bào khỏi các tác động từ bên ngồi. Cấu tạo của LPS gồm 3 phần: O – antigen, lõi oligosaccharide và lipid A. Mà lipid A chính là thành phần gây độc của phân tử LPS, gây bên sự giải phĩng hàng loạt các cytokine gây viêm. Ngồi ra, việc sản xuất các enzyme khác nhau bởi Serratia marcescens cũng đƣợc xem nhƣ một yếu tố độc lực, chẳng hạn enzyme chitinase, lipase, chloroperoxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997). 1.4 Giới thiệu về Prodigiosin 1.4.1 Khái niệm về prodigiosin ___14___
Đồ án tốt nghiệp Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” cĩ nguồn gốc từ “prodigious” cĩ nghĩa là một điều gì đĩ kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạng túi bên ngồi tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991). Một nhĩm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998). Các sắc tố thuộc nhĩm này bao gồm: prodigiosin,cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đĩ, khả năng ức chế miễn dịch cĩ trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI). 1.4.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)- methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) cĩ cơng thức phân tử C20H25N3O và trọng lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006; Williamson và cộng sự, 2006). Prodigiosin là một alkaloid cĩ cấu trúc hĩa học đặc biệt, với ba vịng pyrrole tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đĩ hai vịng đầu liên kết trực tiếp với nhau, cịn vịng thứ ba đƣợc gắn vào thơng qua cầu nối methene (Qadri và Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin cĩ bảy liên kết đơi và đƣợc miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008). ___15___
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008) Các sắc tố màu đỏ của S. marcescens đã đƣợc phân lập là đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902). Mãi đến năm 1960, cơng thức hĩa học chính xác của prodigiosin tổng hợp bởi S. marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến bộ nhanh chĩng trong khoa học phân tích và quang phổ trong những năm tiếp theo prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), cĩ một loạt các chất đều mang cùng pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhĩm thế alkyl khác nhau (Wasserman và cộng sự, 1969). Những nhĩm thế thƣờng gắn trở lại để tạo thành vịng trịn hoặc macrocycles, nhƣ thể hiện trong hình 1.4, Furstner (2003) cho rằng danh pháp truyền thống là rất phù hợp và do đĩ khuyến khích sử dụng “prodigiosin” để chỉ tất cả. Đƣợc phân lập là đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902). ___16___
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4. Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và khơng tan đƣợc trong nƣớc. Prodigiosin cĩ thể tan tƣơng đối trong alcohol và ether; bên cạnh đĩ, nĩ dễ tan trong chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafar và cộng sự, 2006). Hầu hết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một số bƣớc sĩng nhất định và sự biểu hiện sắc tố cĩ thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ. Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Trọng lƣợng Danh pháp Lồi Tên sắc tố phân tử và prodigiosin cơng thức Serratia marcescens Prodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 323,4 Da methoxy-prodigiosene C20H25N3O Serratia marcescens Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 309,4 Da hydroxy-prodigiosene C10H23N3O ___17___
Đồ án tốt nghiệp Serratia marcescens Dipyrrolyl- 2-(2-pyrryl)-4,6- 334,4 Da dipyrromelhenr dimethoxypy- C19H18N4O2 prodigiosin prodigiosene Nocardia Nonylprodigio sin 2-Nonly-6-methoxy- 363,5 Da (Actinomadura) prodigiosene C23H31N3O Nocardia Cyclononyl- 2,10-Nonano-6- 265,5 Da M(Acaduraetinoma dura) prodigiosin melhoxy-prodigiosene C23H33N3O Nocardia Methylcyclodc cyl- 2,10-Nonano-6- 391,5 Da M(Acaduraetinoma dura) prodigiosin Methoxy-prodigiosene C25H33N3O Streptomyces Undccyl- prodigiosin 2-Undecyl-6- Rnethoxy- 393,6 Da PLongisporusrellctieri prodigiosene C25H35N3O uber và StreplonlycesNocardia Metacyclo- 2,4-(9-Ethylnonano) 391,6 Da longisporusr(Actinomadur prodigiosin -6-methoxy- C25H33N3O ubera) pelletieri prodigiosene 1.4.3 Hoạt động sinh học của prodigiosin Prodigiosin cĩ khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số lồi vi khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng thấm qua màng ngồi tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme nhƣ DNA gyrase, topoisomerase IV, dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira,2009). ___18___
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5. Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira,2009) A. Đối kháng với Staphylococcus aureus B. Đối kháng với Echerichia Ecoli Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin cĩ thể kháng một số lồi vi khuẩn nhƣ: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Bacillus subtilus, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsielpneumoniae, Bacillus cereus. (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012). Ngồi ra, hoạt chất prodigiosin cịn cĩ khả năng chống ung thƣ (Pandey và cộng sự 2009; Pérez – Tomás và Vi ̃as, 2010) và ức chế miễn dịch (Pandey và cộng sự 2007) 1.5 Tiềm năng tạo chế phẩm trừ sâu từ prodigiosin đƣợc phân lập từ vi khuẩn Serratia marcescens Theo Grimont & Grimont, 2006, Serratia spp. là vi khuẩn gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae. Đại diện của chi Serratia là Serratia marcescens. Cĩ thể phân lập Serratia spp. từ mơi trƣờng đất và nƣớc, thực vật, cơn trùng cũng nhƣ động vật cĩ xƣơng sống. Serratia spp. cĩ khả năng tổng hợp enzymes DNase, lipase, protease và chitinase. Đặc biệt, Serratia marcenscens cĩ khả năng tổng hợp sắc tố đỏ prodigiosin, một pyrrole alkaloid (2-methyl-3- amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N3O = 323,44). Serratia marcescens Bizio từ lâu đƣợc biết cĩ khả năng diệt ___19___
Đồ án tốt nghiệp sâu Serratia entomophila đƣợc sử dụng nhƣ tác nhân diệt sâu sinh học ở New Zealand để tiêu diệt Costelytra zealandica. Prodigiosin thuộc nhĩm prodiginine đƣợc biết đến nhƣ một hợp chất thứ cấp vi sinh vật cĩ tác dụng diệt khuẩn, diệt tảo, ức chế miễn dịch và tế bào ung thƣ . Hoạt tính diệt sâu của prodigiosin đã đƣợc mơ tả bởi Wang và cộng sự., 2012 thử nghiệm trên ấu trùng Drosophila, , từ đĩ đề nghị chủng Serratia marcesens TKU011 phân lập từ đất đƣợc phát triển làm thuốc trừ sâu sinh học. Hợp chất thứ cấp prodigiosin của chủng này cĩ hoạt tính diệt sâu mạnh. Điều này cho thấy cĩ thể ứng dụng hợp chất thứ cấp prodigiosin của S.marcescens làm chế phẩm diệt sâu sinh học. Trên thực tế, cơng nghệ sản xuất và bảo quản sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật khả thi hơn sản xuất chế phẩm tuyến trùng EPN, cịn ứng dụng bản thân vi khuẩn làm tác nhân diệt sâu khĩ đƣợc chấp nhận hiện nay vì lý do an tồn sinh học. (Nguyễn Hồi Hƣơng và Nguyễn Hồng Anh Kha, 2015), (Nguyễn Hồi Hƣơng, Đinh Minh Châu, 2016). 1.6 Cơ chế tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn. Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC 39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens ATCC 274 (Sma 274) đã đƣợc báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001). Nhiều chủng Serratia marcescens sản xuất sắc tố thơng qua con đƣờng ngƣng tụ enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và enzyme 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5- carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất tripyrrole, đƣợc gọi là 2-methyl-3-amyl-6- methoxyprodigiosene hoặc prodigiosin (Williams và Qadri, 1980). Dauenhauer và cộng sự (1984) đã phân lập đƣợc một chủng Serratia marcescens cĩ khả năng tạo MAP và MBC, để hình thành prodigiosin. Tuy nhiên, khơng cĩ tài liệu nào về trình tự của dịng tế bào này đƣợc báo cáo. ___20___
Đồ án tốt nghiệp Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 đƣợc biểu hiện trong Erwinia carotovora subsp. carotovora (ECC; 25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm). Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin đƣợc quy định bởi nhiều yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thơng qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong ECC, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tín hiệu khác đã đƣợc thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000). Nhĩm sắc tố Serratia đƣợc quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và Streptomyces coelicolor và đƣợc bố trí từ pigA đến pigN, trong đĩ cĩ năm gene tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốm gene tổng hợp MAP (màu xanh), đƣợc mơ tả ở hình 2.18. Bốn gene cịn lại khơng cĩ vai trị tổng hợp, tuy nhiên, cĩ một protein cịn lại (PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp. Thứ tự gene của hai lồi Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện kích thƣớc và trình tự amino acid khác nhau giữa các lồi (Cerdeno et al, 2001). ___21___
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) Các cụm gene giữa Streptomyces coelicolor và Serratia cĩ những vị trí tƣơng đồng. Gene quy định của các cụm màu đỏ đƣợc hiển thị trong màu đen, chịu trách nhiệm tổng hợp phân nửa bipyrrole là màu đỏ và chịu trách nhiệm tổng hợp phân nửa monopyrrole là màu xanh lam. Các gene khơng cĩ chức năng tổng hợp đƣợc thể hiện qua màu trắng và những gene khơng nằm trong cụm gene sinh tổng hợp đƣợc thể hiện qua màu xám. Các mũi tên đen chỉ đơn vị phiên mã của các cụm màu đỏ. Cụm pig gene trong Serratia ATCC 39.006 cĩ chứa thêm một gene bổ sung là PigO. RT-PCR với primer extension sẽ nhận thấy cĩ sự phiên mã qua lại giữa hai gene pigN và pigO (Slater và cộng sự, 2003), điều này phù hợp với pigO là một pig operon trong chủng. Cụm pig (pigA-O) trong Serratia ATCC 39.006 đƣợc sao chép dƣới dạng polycistronic thơng tin từ một promoter upstream của pigA (Slater et al., 2003) và cụm sắc tố (pigA-pigN) của Sma 247 cũng đƣợc sao chép dƣới dạng polycistronic thơng tin. Cĩ một khoảng cách đáng kể giữa hai cụm sắc tố pigC và pigD. Khoảng cách 184 bp giữa pigC và pigD trong Serratia ATCC 39.006 cho thấy khả năng chứa hai đơn vị phiên mã. Tuy nhiên, mức độ phiên mã của các gene ở hai bên của khoảng cách này đã chứng minh là tƣơng tự nhƣ trong nghiên cứu dùng lacZ hợp với pigA và pigH (Crow, 2001). Cụm pig trong Sma 274 cĩ khoảng cách 64 bp giữa pigC và pigD, nhỏ hơn so với Serratia ATCC 39.006, khoảng cách này khơng cĩ ý nghĩa. Cụm màu đỏ (gồm 23 gene) lớn hơn cụm pig (14 – 15 gene), cĩ thể phản ánh sự phức tạp hơn về các sản phẩm undecylprodigiosin đƣợc tổng hợp bởi Streptomyces coelicolor (Harris và cộng sự, 2004). Mƣời hai gene đƣợc lƣu giữ giữa ba cụm, cĩ thể mong đợi con đƣờng tổng hợp cho ra các sản phẩm tƣơng tự. Tuy nhiên, định hƣớng và điều tiết của nĩ cĩ sự thay đổi rõ rệt (Slater và cộng sự, 2003). Việc bố trí khơng giống nhau của các gene tƣơng đồng ___22___
Đồ án tốt nghiệp trong cụm sản xuất các sản phẩm hĩa học tƣơng tự đặt ra câu hỏi về nguồn gốc và sự tiến hĩa prodigiosin trong cụm gene sinh tổng hợp ở cả vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm. Vẫn chƣa rõ liệu các lồi trong cùng một họ cĩ vai trị quan trọng ảnh hƣởng đến sự sắp xếp khơng giống nhau của các gene hay sự khác biệt đã phát sinh một cách ngẫu nhiên (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Sự khác biệt ở các gene hiện diện trong những operon cĩ thể giải thích sự khác biệt trong phƣơng thức sản xuất và con đƣờng tổng hợp sinh hĩa. PigD và pigE là hai pig gene khơng cĩ sự tƣơng đồng trong cụm màu đỏ. Tƣơng tự nhƣ vậy, pdtorfL và pdtorf thuộc một phần nhĩm gene mã hĩa tổng hợp các chất khử clo (carbon tetrachloride) nhƣ pyridine-2,6-bis (thiocarboxylic acid) bởi Pseudomonas stutzeri (Lewis và cộng sự, 2000). PdtorfL và pdtorfM nằm cạnh nhau, giống nhƣ pigD và pigE trong cụm pig. PigE tƣơng tự aminotransferase (SC6A5.18, 461 aa) từ Streptomyces coelicolor A3(2), đƣợc mã hĩa bởi một gene khơng liên kết với cụm màu đỏ (38% giống với PigE từ Serratia ATCC 39.600 và 39% giống với PigE từ Sma 274; cả hai đều là 50% tƣơng đƣơng 460 aa). Thật vậy, nĩ cĩ thể là gene mã hĩa protein tham gia vào quá trình tổng hợp prodigiosin và undecylprodigiosin cĩ thể khơng đƣợc liên kết với các cụm gene. RedR, RedQ và RedP khơng đƣợc mã hĩa tƣơng đồng bởi cụm pig, nhƣng chúng đƣợc cho là chỉ đạo tổng hợp acetate từ ba nguyên tử carbon của vịng pyrrolr và chuổi bên undecyl của undecylprodigiosin (Cerdeno và cộng sự, 2001). Các gene mã hĩa tƣơng đồng tƣơng ứng cĩ thể cĩ mặt tại một vị trí trên nhiễm sắc thể Serratia hoặc các enzyme khác cĩ thể thực hiện vai trị xúc tác cần thiết trong sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia. Tuy nhiên, prodigiosin cĩ thể tổng hợp trong sự tái tổ hợp giữa Escherichia coli và Erwinia, điều này địi hỏi hoạt động chức năng tƣơng ứng của Escherichia coli và enzyme Erwinia để bổ sung cho các hoạt động của enzyme đƣợc mã hĩa bởi các nhĩm sắc tố (Harris và cộng sự, 2004). ___23___
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7. Quá trình sinh tổng hợp prodigiosin (Caspi R, 2014) Vào năm 2004, cụm gen sinh tổng hợp prodigiosin đã đƣợc nhân bản từ trình tự gen của hai chủng Serratia sp. ATCC 39.006 và Sma 274, đƣợc biểu hiện ở 14 và 15 ORFs. Các cụm gen đƣợc thể hiện qua các vật chủ dị tƣơng đồng. Dựa vào ghi chú gen, một chƣơng trình đƣợc đề xuất cho sự sinh tổng hợp các prodigiosin. Hai tiền thân chính, 4-methoxy-2,2'-bipyrrole-5-carbaldehyde (MBC) và 2-metyl-3-n-amilic- pyrrole (MAP) đƣợc sản xuất song song tại hai nhánh gen, sau đĩ ngƣng tụ thành prodigiosin ở bƣớc cuối cùng. (Caspi R, 2014). ___24___
Đồ án tốt nghiệp Trong một dự án tiếp theo, trong khung xĩa hoặc chèn đƣợc tạo ra trong tất cả các gen sinh tổng hợp trong cụm từ Serratia sp. ATCC 39.006 , và các chất trung gian sinh tổng hợp tích lũy trong mỗi đột biến đã đƣợc phân tích bằng LC-MS, cross-cho ăn, và các nghiên cứu bổ di truyền. Dựa trên những kết quả này là một phiên bản sửa đổi của con đƣờng đã đƣợc đề xuất, nhƣ đƣợc mơ tả ở đây. Cả hai chi nhánh sử dụng hĩa học thú vị. Các chi nhánh của đài MBC bao gồm một cơ chế khơng phổ biến cho sinh tổng hợp pyrrole từ L-proline , trong đĩ bao gồm các protein cĩ tính tƣơng đồng với adenylation và peptidyl-carrier lĩnh protein của sythetases peptide khơng ribosome (cơ chế tƣơng tự cũng đƣợc tìm thấy trong sinh tổng hợp các hợp chất pyrrole chứa khác, nhƣ coumermycin A1 , pyoluteorin , và undecylprodigiosin ). Các chi nhánh MAP bao gồm PigD , một loại enzyme xúc tác cho một phản ứng Stetter assymetric.Một homolog của enzyme này đã đƣợc mơ tả trong Pseudomonas stutzeri , và đƣợc tham gia vào quá trình tổng hợp của carbon tetrachloride chất khử clo pyridin-2,6-bis (thiocarboxylate). (Caspi R, 2014). 1.7 Một số nghiên cứu trên thế giới 1.7.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens Brigida và cộng sự (2006), đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của Serratia marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng nhƣ ảnh hƣởng của Serratia marcescens lên thúc đẩy tăng trƣởng của cây thuộc chi cam chanh. Jaiganesh và cộng sự (2007), đã thực hiện thử nghiệm kiểm sốt Pyricularia oryzae gây bệnh trên cây lúa bằng cách sử dụng Serratia marcescens. Maria và cộng sự (2012), đã tiến hành thử nghiệm về quá trình lây nhiễm Serratia marcescens cùng tuyến trùng Steinernema cerpocapsae vào ấu trùng Galleria mellonella và đạt đƣợc kết quả gây chết 100% ấu trùng. 1.7.2 Tình hình nghiên cứu prodigiosin Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ƣu hĩa sản xuất prodigiosin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của prodigiosin. Kết ___25___
Đồ án tốt nghiệp quả cho thấy prodigiosin thu nhận đƣợc cĩ tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn Gram âm. Chandni và cộng sự. (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin cĩ khả năng kháng khuẩn nhƣ Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh nhƣ Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp Nghiên cứu của San và cộng sự (2012) cho thấy prodigiosin cĩ khả năng diệt cơn trùng. Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn nhƣ Alteromonas sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 g/ml và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 g/ml. Bên cạnh đĩ, Ananda và cộng sự cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50 khoảng 50 g/ml. Bảng 1.3. Một số bằng sáng chế về prodigiosin Ngày cơng Tên Patent Tĩm tắt Tác giả bố Kim Hwanmook, Han Sangbae, United States Một ứng dụng mới của prodigiosin Lee Changwoo, Patent để điều trị bệnh tiểu đƣờng mà 10/28/2003 Lee Kihoon, 6638968 khơng cĩ bất kỳ tác dụng phụ nào. Park Sehyung, Kim Youngkook. Prodigiosin từ Serratia marcescens Kim Hwanmook, United States cĩ tác dụng nhƣ một ức chế miễn Kim Youngkook, Patent 11/11/2003 dịch trong nhiều lĩnh vực khác Han Sangbae, 6645962 nhau. Yoo Sungak. United States Prodigiosin, một loại kháng sinh, Nakamura 05/05/1981 ___26___
Đồ án tốt nghiệp Patent đƣợc sản xuất một cách hiệu quả Katsumi 4266028 bằng chủng Serratia marcescens Kitamura R-2. Kumpei Kim Hwan-Mook Han Sang-Bac Lee Chang-Woo United States Sử dụng prodigiosin cho việc điều Lee Ki-Hoon Patent 07/01/2004 trị bệnh viêm thấp khớp. Park Se-Hyung 20040127547 Kim Hyoung Chin Kim Young-Kook 1.8 Khái quát về sâu khoang Spodoptera litura. Sâu khoang cịn đƣợc gọi là sâu ăn tạp gây hại trên tất cả các loại rau, là đối tƣợng gây hại nặng trên rau, đậu. Sâu non tuổi nhỏ thƣờng gây hại nghiêm trọng nhất bởi vì hàng trăm con sâu non tập trung lại ăn lá cây và nhanh chĩng làm lá cây xơ xác. Sâu non cịn cĩ thể gặm ăn vỏ quả làm giảm phẩm chất. 1.8.1 Đặc điểm hình thái Sâu khoang cĩ nhiều loại, trƣởng thành là loại ngài cĩ màu xám hoặc nâu xám, cánh trƣớc cĩ màu nâu vàng, cĩ các vân ngang bạc trắng ĩng ánh, cánh sau màu hơi trắng. Trứng hình bán cầu, mới đẻ màu vàng, sau màu tro tối xếp với nh au thành ổ, cĩ phủ một lớp lơng màu vàng rơm. ___27___
Đồ án tốt nghiệp Sâu non mới nở cĩ màu xanh sáng, Sâu tuổi lớn cĩ màu từ xám xanh đến nâu đen với những sọc vàng hoặc trắng, đốt bụng thứ nhất cĩ một vết đen to bao quanh, trên mỗi mảnh lƣng cĩ vân hình trăng khuyết. Nhộng màu đỏ sẫm, cuối bụng cĩ một đơi gai ngắn. 1.8.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái Vịng đời: 25 - 48 ngày Trứng: 3 - 7 ngày Sâu non: 12 - 27 ngày Nhộng: 8 -10 ngày Trƣởng thành: 2 – 4 ngày Hình 1.8. Vịng đời của sâu khoang Spodoptera litura Ngài hoạt động mạnh vào ban đêm, cĩ xu tính với mùi chua ngọt và ánh sáng bƣớc sĩng ngắn. Trứng đẻ thành ổ trên lá, một ổ cĩ từ 50 - 200 trứng. Một con cái cĩ thể đẻ từ 500 – 2.000 trứng. Sâu tuổi nhỏ sống tập trung ăn hết thịt lá chừa lại biểu bì và gân. Ở tuổi 3 – 4 sâu phân tán và ăn khuyết lá hoặc cĩ khi ăn trụi lá. Sâu non cĩ 6 tuổi, khi đẫy sức ở tuổi 6 ___28___
Đồ án tốt nghiệp dài từ 35 - 50 mm. Khi mật độ sâu cao cĩ thể làm cho lá rụng nhanh. Tuy nhiên sự gây hại thƣờng khơng nghiêm trọng lắm do khả năng tự đền bù của cây. Khi đẫy sức sâu chui xuống đất hố nhộng, sau khoảng 10 ngày thì vũ hố. 1.8.3 Thiên địch Các lồi ăn mồi: Bọ rùa, kiến, bọ xít ăn thịt, bọ cánh cứng. Ong kí sinh: Cotesia prodeniae, Telenomus remus. Vi khuẩn BT, virus nhân đa diện. 1.8.4 Biện pháp phịng trừ Biện pháp canh tác: Vệ sinh đồng ruộng trƣớc và sau khi trồng, cày ải phơi đất. Dẫn nƣớc ngập ruộng trƣớc khi làm đất. Biện pháp cơ giới vật lý: Diệt ổ trứng và sâu non bằng tay. Biện pháp sinh học: Hạn chế phun thuốc để bảo tồn các lồi thiên địch thƣờng xuất hiện trên ruộng nhƣ nhện, bọ rùa, ong kí sinh Dùng bẫy pheromone hoặc bẫy chua ngọt cĩ hiệu quả. Biện pháp hĩa học: Dùng các loại thuốc ít độc nhƣ nhĩm Abamectin (Abamectin; Tập kỳ 1.8 EC Abatin 1.8 EC; Silsau 3.6 EC ); các loại chế phẩm vi sinh: thuốc cĩ nguồn gốc từ Bt nhƣ V-BT; Biocin 8000 SC, Dipel 32 WP cĩ nguồn gốc NPV nhƣ Vicin- S hoặc thuốc thảo mộc nhƣ Rotenone hoặc Neem. Cĩ thể dùng thuốc gốc Cúc tổng hợp nhƣ Karate 2.5 EC, SecSaigon 5 EC /. (Phịng kỹ thuật thuộc chi cục bảo vệ thực vật Tp.HCM, 2010) ___29___
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1 Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 16/05/2016 đến ngày 07/08/2016 2.1.2 Địa điểm Phịng thí nghiệm Vi sinh thuộc khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trƣờng, trƣờng Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2 Vật liệu – thiết bị – hĩa chất 2.2.1 Nguồn vi sinh vật 2.2.1.1 Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens Chủng vi khuẩn Serratia marcessens – SH1, do anh Nguyễn Hồng Anh Kha phân lập đƣợc từ tuyến trùng Steinerma quangdosense XT (S –XT) và Heterorhabditis indica CP 16 (H – CP16) vào năm 2009. 2.2.1.2 Nguồn vi khuẩn chỉ thị Nguồn vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus do anh Lê Quốc Vũ, sinh viên khĩa 2011, khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trƣờng cung cấp. 2.2.1.3 Nguồn nấm bệnh Nguồn nấm bệnh Fusarium sp., Collectotrichum sp. do TS. Nguyễn Thị Hai phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trƣờng, trƣờng đại học Cơng nghệ thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. 2.2.1.4 Nguồn sâu khoang Spodoptera litura Sâu khoang Spodoptera litura đƣợc bắt ngồi thiên nhiên và nhân nuơi trong mơi trƣờng nhân tạo với nguồn thức ăn chính là lá thầu dầu. 2.2.2 Mơi trường nuơi cấy và hĩa chất a. Mơi trường nuơi cấy (xem ở Phụ lục A) ___30___
Đồ án tốt nghiệp Mơi trƣờng Nutrient agar (NA) Mơi trƣờng Nutrient broth (NB) Mơi trƣờng Peptone Glycerol agar (PGA) Mơi trƣờng Peptone Glycerol broth (PG) Mơi trƣờng Casein Mơi trƣờng Lipit Mơi trƣờng huyền phù Chitin 1% Mơi trƣờng Potato Dextrose agar (PDA) b. Hĩa chất, thuốc thử Cồn 70, cồn 96 HCl 1N NaOH 1N Trichloroacetic acid (TCA) 10% Thuốc thử lugol Tween 80 0,02% Rỉ đƣờng 1% Carboxymethyl cellulose (CMC) 1% 2.2.3 Dụng cụ, thiết bị a. Dụng cụ Hộp nuơi sâu Thùng nuơi bƣớm Ống nghiệm Đĩa petri Erlen 100 ml, 250 ml, 1000 ml Pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml Pipetman 100 , 1000 Đầu cơn 100 , 1000 ___31___
Đồ án tốt nghiệp Đũa thủy tinh Bao hấp, giấy gĩi, thun Đèn cồn, que cấy vịng, que cấy thẳng, que cấy trang Bơng thấm, bơng khơng thấm Kim tiêm b. Thiết bị Autolave Tủ cấy vi sinh Tủ sấy Tủ ủ vi sinh Tủ lạnh Cân phân tích Bếp từ Máy nƣớc cất Máy ly tâm Máy lắc Bể điều nhiệt 2.3 Phƣơng pháp thí nghiệm Mục đích: sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu chứa prodigiosin. Mục tiêu: sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuơi cấy Serratia marcescens SH1 phân lập từ tuyến trùng diệt sâu EPN bỏ qua quá trình trích ly prodigiosin, khơng cịn chứa tế bào sống. Nội dung i) Khảo sát khả năng sử dụng acid để diệt tế bào (ảnh hƣởng của chế độ xử lý acid lên tế bào, prodigiosin và enzyme trong dịch nuơi cấy) ___32___
Đồ án tốt nghiệp ii) Khảo sát khả năng xử lý nhiệt để diệt tế bào (ảnh hƣởng của chế độ xử lý acid lên tế bào, prodigiosin và enzyme trong dịch nuơi cấy). Chọn chế độ xử lý thích hợp (tế bào chết, nồng độ prodigiosin cao, cịn giữ đƣợc hoạt tính enzyme). iii) Khảo sát hoạt tính của dịch nuơi cấy sau xử lý: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng sâu Spodoptera litura tuổi 3 iv) Khảo sát hiệu lực diệt sâu của chế phẩm từ dịch nuơi cấy xử lý acid v) Khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện bảo quản lên chế phẩm. Phƣơng pháp luận Các nghiên cứu trƣớc đã chứng minh prodigiosin từ Serratia marcescens SH1 (phân lập từ tuyến trùng EPN) cĩ hiệu lực diệt sâu khá mạnh. Để phát triển một chế phẩm diệt sâu cần đơn giản hĩa tối đa các quá trình downtream processing đối với canh trƣờng lên men vi khuẩn. Vì vậy hai phƣơng pháp đƣợc đề nghị là xử lý acid hoặc xử lý nhiệt để tiêu diệt tế bào S. marcescens SH1 và sau đĩ làm chế phẩm. Tiêu chí của chế độ xử lý canh trƣờng lên men là tiêu diệt tế bào mà khơng ảnh hƣởng lên nồng độ prodigiosin tổng hợp cũng nhƣ ít ảnh hƣởng nhất lên enzyme ngoại bào. Để khảo sát hoạt tính dịch nuơi cấy sau xử lý, thử nghiệm kháng khuẩn, kháng nấm đƣợc sử dụng cĩ ý nghĩa thăm dị. Hoạt tính diệt sâu đƣợc thử nghiệm trên Spodoptera litura là đối tƣợng trƣớc kia đã thử nghiệm cho prodigiosin sau trích ly. Chế phẩm bƣớc đầu đƣợc sản xuất bằng cách bổ sung Tween 80 phá vỡ màng nhốt prodigiosin, CMC là tác nhân tạo độ nhớt, độ kết dính, rỉ đƣờng kích thích sâu ăn Bố trí thí nghiệm Các bƣớc bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày tĩm tắt theo sơ đồ Hình 2.1 ___33___
Đồ án tốt nghiệp Giống vi khuẩn S.mercescens Tăng sinh 48h Xử lý Xử lý với acid HCl 1N nhiệt ở 65oC Khảo sát hoạ t tính sinh học Thử nghiệm kh ả năng diệt sâu Tạo ch ế phẩm Thử nghiệm kh ả năng diệt sâu Khảo sát thời gian b ảo quản của chế phẩm Hình 2.1 Quy trình khảo sát khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn S.mercescens và hoạt tính diệt sâu của prodigiosin trong canh trƣờng đã xử lí. ___34___
Đồ án tốt nghiệp Giống vi khuẩn S.mercescens Tăng sinh 48 giờ Đo quang A = 620 nm Đo quang A = 499 nm Xử lý Xử lý o với acid HCl 1N nhiệt ở 65 C Kiểm tra khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn ở Đo quang, Đếm khuẩn lạc A = 620 nm và A = 499 nm Hình 2.2 Quy trình thử nghiệm khảo sát thời gian tiêu diệt tế bào vi khuẩn S.mercescens ___35___
Đồ án tốt nghiệp Giống vi khuẩn S.mercescens Xử lí acid Khảo sát hoạt tính sinh học Khả năng Kháng Kháng nấm Enzyme diệt sâu khuẩn Hình 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học của canh trƣờng vi khuẩn sau khi xử lí acid Giống vi khuẩn S.mercescens Xử lí acid HCl 1N, 4 giờ Tạo chế phẩm Khả năng Khảo sát Khảo sát diệt sâu thời gian bảo quản điều kiện bảo quản Hình 2.4 Quy trình khảo sát chế phẩm diệt sâu từ prodigiosin ___36___
Đồ án tốt nghiệp 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm 2.4.1 Phương pháp nuơi sâu trong phịng thí nghiệm Phịng nuơi sâu phải đảm bảo điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sâu khoang phát triển 25 ± 2oC, và ẩm độ 70 ± 5%. Sâu khoang Spodoptera litura đƣợc thu mẫu từ ruộng rau đắng tại huyện Cần Giờ, Tp.HCM, sâu khoang ngồi đồng mang về nuơi đƣợc tính là sâu thế hệ P. Thế hệ P đƣợc nuơi trong hộp nhựa và cho ăn bằng lá thầu dầu cho tới khi hĩa nhộng. Khi sâu vào giai đoạn hĩa nhộng, lĩt khăn giấy trong hộp nhựa và cho ăn bằng lá thầu dầu cho tới khi 5 - 6 ngày hĩa nhộng trong hộp. Sau khi vũ hĩa, ngài thuộc thế hệ P đƣợc ghép cặp với nhau trong các thùng giấy đƣợc lĩt giấy mềm và cung cấp thức ăn dƣới dạng lỏng là nƣớc đƣờng pha lỗng (tỉ lệ 1:10). Tiến hành kiểm tra thu trứng, thay thức ăn và vệ sinh hàng ngày. Sau 2 ngày, trứng nở ra sâu non F1, sâu non đƣợc nuơi với thức ăn là lá thầu dầu. Nhân nuơi sâu khoang Spodoptera litura cho đến khi đủ số lƣợng để tiến hành thí nghiệm. 2.4.2 Phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens 2.4.2.1 Phương pháp xử lí acid Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong Erlen cĩ chứa 300 ml mơi trƣờng peptone glycerol broth vơ trùng, với tỉ lệ cấy giống 1%. Nuơi ủ vi khuẩn ở nhiệt độ phịng, lắc 150 vịng/phút, tránh ánh sáng, 48 giờ. Sau khi tăng sinh 48 giờ, thu nhận tồn bộ canh trƣờng và đem xử lí với acid HCl 1N. Từ 300ml canh trƣờng vi khuẩn, dùng pipet vơ trùng hút 20 ml canh trƣờng lên men vi khuẩn cho vào lần lƣợt vào 13 chai tăng sinh đã vơ trùng. Với mục đích đƣa mơi trƣờng về pH = 1, tiêu diệt tế bào vi khuẩn, dùng pipetman hút 1000 dung dịch acid HCl 1N cho vào 3 chai canh trƣờng lên men. ___37___
Đồ án tốt nghiệp Lắc 150 vịng / phút, ủ trong tối. Theo dõi ở các mốc thời gian: 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ. Sau đĩ, đƣa mơi trƣờng về pH = 7 với 1000 dung dịch NaOH 1N, đem đo OD620nm 0 và OD499nm, song song đĩ tiến hành cấy trang vi khuẩn ở các nồng độ pha lỗng 10 , 10-1 và 10-2. Ủ đĩa trong tối, 24 giờ Với mục đích đƣa mơi trƣờng về pH = 2, tiêu diệt tế bào vi khuẩn, dùng pipetman hút 450 dung dịch acid HCl 1N cho vào 3 chai canh trƣờng lên men. Lắc 150 vịng / phút, ủ trong tối. Theo dõi ở các mốc thời gian: 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ. Đƣa mơi trƣờng của canh trƣờng lên men về pH = 7 với 450 dung dịch NaOH 1N, đem đo OD620 và 0 -1 OD499, song song đĩ tiến hành cấy trang vi khuẩn ở các nồng độ pha lỗng 10 , 10 và 10-2. Ủ đĩa trong tối, 24 giờ. Đối chứng dƣơng: canh trƣờng lên men 48 giờ của vi khuẩn đƣợc tiếp tục tăng sinh trên máy lắc 150 vịng / phút. Theo dõi ở các mốc thời gian: 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ kế tiếp. Thu nhận mẫu canh trƣờng lên men, đo OD620 và OD499, song song đĩ tiến hành cấy trang vi khuẩn ở các nồng độ pha lỗng 10-6, 10-7 và 10-8. Ủ đĩa trong tối, 24 giờ. Đọc kết quả: Sau 24 giờ ủ đĩa trong tối, tiến hành đếm khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serattia marcescens trên mơi trƣờng peptone glycerol agar (PGA). Tính prodigiosin unit/tế bào sau xử lí acid. 2.4.2.2 Phương pháp xử lí nhiệt Chuẩn bị vi khuẩn khảo sát: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong Erlen cĩ chứa 300 ml mơi trƣờng peptone glycerol broth vơ trùng, với tỉ lệ cấy giống 1%. Nuơi ủ vi khuẩn ở nhiệt độ phịng, lắc 150 vịng/phút, tránh ánh sáng. Sau khi tăng sinh 48 giờ, thu nhận tồn bộ canh trƣờng và đem xử lí ở nhiệt độ 65oC trong vịng 15 phút: từ 300ml canh trƣờng, dùng pipet vơ trùng hút 20 ml canh trƣờng lên men vi khuẩn cho vào lần lƣợt vào 13 chai tăng sinh đã vơ trùng. ___38___
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm thực hiện ở 3 nghiệm thức nhiệt độ: 50oC, 65oC và 80oC đƣợc xử lí trong vịng 15 phút. Sau xử lí nhiệt, tiến hành cấy trang dịch canh trƣờng lên thạch PGA ở các nồng độ pha lỗng 100,10-1 và 10-2. Ủ tối 24h, nhiệt độ phịng. Đồng thời tiến hành trích ly thơ dịch canh trƣờng ở mỗi nhiệt độ xử lí, đo OD 535nm nhằm xác định lƣợng prodigiosin đƣợc sinh ra. Đối chứng dƣơng: vi khuẩn khảo sát sau khi tăng sinh 48h tiến hành cấy trang trên đĩa PGA ở các nồng độ pha lỗng 10-3,10-4 và 10-5. Mỗi nghiệm thức nhiệt độ đƣợc lặp lại 3 lần. Đọc kết quả: Sau 24 giờ ủ đĩa trong tối, tiến hành đếm khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serattia marcescens trên mơi trƣờng peptone glycerol agar (PGA). Tính tỉ lệ tế bào vi khuẩn bị tiêu diệt. Tính tỉ lệ tế bào vi khuẩn bị tiêu diệt. Tính lƣợng prodigiosin thu đƣợc từ giá trị OD535nm 2.4.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học 2.4.3.1 Phương pháp định tính enzyme Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong mơi trƣờng PG ở nhiệt độ phịng, ủ tối trong 48 giờ. Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn đã xử lí: Sau khi tăng sinh vi khuẩn trong mơi trƣờng PG broth vơ trùng, dùng pipetman hút 450 HCl 1N cho vào canh trƣờng lên men, lắc 150 vịng/ phút, trong 4 giờ. Tiến hành thêm 450 NaOH 1N để đƣa canh trƣờng về pH = 7. Thêm vào 100 Tween 80 0,02% Chuẩn bị Tween 80 0,02%: Tween 80 đƣợc pha lỗng về nồng độ 1%, sau đĩ hút 100 l Tween 80 1% cho vào lần lƣợt các dịch canh trƣờng đƣợc pha lỗng với thể tích 5 ml. Thử nghiệm hoạt tính lipase Pha mơi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase, hấp 121oC trong 15 phút. Để mơi ___39___
Đồ án tốt nghiệp trƣờng nguội đến khoảng 65oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar mơi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d). Đối chứng dƣơng: Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm vào giữa đĩa petri mơi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 24 giờ. Đo đƣờng kính vịng tủa trên bề mặt mơi trƣờng. Các thử nghiệm: Canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 5 ml, tiến hành pha lỗng canh trƣờng lên men đã qua xử lí acid thành dãy các nồng độ pha lỗng : 2, 4, 8, 16 và 32. Dùng pipetman hút 20 ở các nồng độ pha lỗng cho vào 3 giếng thạch ở mơi trƣờng thử hoạt tính lipit, nhƣ hình 2.5 ĐC Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Hình 2.5 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch mơi trƣờng Lipit Đọc kết quả: Nếu dịch canh trƣờng cĩ enzyme lipase thì xuất hiện vịng tủa xung quanh giếng thạch. Nếu dịch canh trƣờng khơng cĩ enzyme lipase thì khơng xuất hiện vịng tủa xung quanh giếng thạch Khả năng phân giải lipit đƣợc đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme lipit sau xử lí acid càng lớn. ___40___
Đồ án tốt nghiệp Trong đĩ : D: đƣờng kính vịng phân giải (mm) d: đƣờng kính giếng thạch (mm) Thử nghiệm hoạt tính protease Pha mơi trƣờng casein agar, hấp 121 oC trong 15 phút. Để mơi trƣờng nguội đến khoảng 65 oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar mơi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d). Đối chứng dƣơng: Dùng pipetman hút 20 canh trƣờng lên men vi khuẩn thử nghiệm cho vào giếng thạch. Ủ 24 giờ, tráng TCA 10%, đo đƣờng kính vịng phân giải. Các thử nghiệm: Canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 5 ml, tiến hành pha lỗng canh trƣờng lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ pha lỗng : 2, 4, 8, 16 và 32. Dùng pipetman hút 20 ở các nồng độ pha lỗng cho vào 3 ĐC giếng thạch ở mơi trƣờng thử hoạt tính casein, nhƣ hình 2.6. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Hình 2.6 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch mơi trƣờng Casein Đọc kết quả: Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng TCA 10% lên đĩa mơi trƣờng: ___41___
Đồ án tốt nghiệp Nếu dịch canh trƣờng cĩ enzyme protease thì xuất hiện vịng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu dịch canh trƣờng khơng cĩ enzyme lipase thì khơng xuất hiện vịng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải casein đƣợc đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme protease sau xử lí acid càng lớn. Trong đĩ : D: đƣờng kính vịng phân giải (mm) d: đƣờng kính giếng thạch (mm) Thử nghiệm hoạt tính chitinase Pha mơi trƣờng thạch huyền phù chitin 1%, hấp 121oC trong 15 phút. Để mơi trƣờng nguội đến khoảng 65 oC , đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar mơi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d). Đối chứng dƣơng: Dùng pipetman hút 20 sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm vào đĩa petri mơi trƣờng thử nghiệm hoạt tính chitin. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 24 giờ. Tráng lugol, đo đƣờng kính vịng phân giải trên bề mặt mơi trƣờng. Các thử nghiệm: Canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 5 ml, tiến hành pha lỗng canh trƣờng lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ pha lỗng : 2, 4, 8, 16 và 32. Dùng pipetman hút 20 ở các nồng độ pha lỗng cho vào 3 giếng thạch ở mơi trƣờng thử hoạt tính lipit, nhƣ hình 2.7. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. ___42___
Đồ án tốt nghiệp ĐC Hình 2.7 Cách b ố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch mơi trƣờng huyền phù chitin 1%. Đọc kết quả: Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng lugol lên đĩa mơi trƣờng: Nếu dịch canh trƣờng cĩ enzyme chitinase thì xuất hiện vịng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu dịch canh trƣờng khơng cĩ enzyme chitinase thì khơng xuất hiện vịng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải chitin đƣợc đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme chitinase sau xử lí acid càng lớn. Trong đĩ : D: đƣờng kính vịng phân giải (mm) d: đƣờng kính giếng thạch (mm) 2.4.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn Theo phương pháp đục giếng thạch. ___43___
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp đục giếng thạch dựa vào khả năng khuếch tán của các hợp chất cĩ khả năng kháng khuẩn vào mơi trƣờng thạch. Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện nhƣ sau: Vi khuẩn chỉ thị - Escherichia coli, Staphylococcus aureus: Vi khuẩn chỉ thị đƣợc tăng sinh 24 giờ trong mơi trƣờng lỏng TBS vơ trùng, lắc 150 vịng/ phút. Sau 24 giờ, khử trùng que cấy vịng tiến hành ria vi khuẩn lên mơi trƣờng thạch NA, ủ 24 giờ ở nhiệt độ là 37oC. Dùng dây cấy vơ trùng lấy sinh khối vi khuẩn từ đĩa NA cho vào 9 ml nƣớc muối sinh lí vơ trùng rồi so với thang McFahrland, pha lỗng đến khi đạt mật độ 106 cfu/ml. Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong mơi trƣờng lỏng PG vơ trùng, ủ tối và lắc 150 vịng/ phút. Sau tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa về pH 2 trong 4 giờ; cho 450 HCl 1N vào canh trƣờng, để máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vịng/ phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng đã đƣợc xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450 NaOH 1N để đƣa về pH = 7. Dịch ly tâm: Sử dụng 10ml canh trƣờng vi khuẩn S.marcescens đã xử lí đem đi ly tâm 10.000 vịng/phút trong vịng 10 phút; tiếp theo tiến hành lọc dịch ly tâm để thu dịch canh trƣờng vơ khuẩn. Tiến hành pha lỗng dịch ly tâm thành dãy các nồng độ pha lỗng: 2, 4, 8, 16 và 32. Tiến hành thêm 100 Tween 80 0,02% Dịch canh trƣờng đã xử lí acid HCl 1N, tiến hành pha lỗng dịch canh trƣờng thành dãy các nồng độ pha lỗng: 2, 4, 8, 16 và 32. Tiến hành đo OD 499nm ở từng nồng độ pha lỗng. Tiến hành nhỏ 100 Tween 80 0,02 % Kháng sinh chloramphenicol 20 mg/ml để làm đối chứng đối chứng dƣơng. Mơi trƣờng PG vơ trùng đƣợc thêm Tween 80 0,02% để làm đối chứng âm. Tiến hành thí nghiệm Dùng tăm bơng vơ trùng quét đều dịch pha lỗng vi khuẩn chỉ thị lên bề mặt mơi trƣờng NA. Tiến hành đục giếng thạch 7mm nhƣ hình 2.8 ___44___
Đồ án tốt nghiệp ĐC . Hình 2.8 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức kháng khuẩn trên đĩa thạch mơi trƣờng NA. Hút 20 l dịch ly tâm ở các nồng độ pha lỗng cho vào 3 giếng thạch, và 20 l mơi trƣờng PG vơ trùng vào giếng thạch cịn lại để làm đối chứng âm. Ủ đĩa ở nhiệt độ phịng, trong tối, 24 giờ. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Hút 20 l dịch canh trƣờng đã xử lí acid ở các nồng độ pha lỗng cho vào 3 giếng thạch, và 20 l mơi trƣờng PG vơ trùng vào giếng thạch cịn lại để làm đối chứng âm. Ủ đĩa ở nhiệt độ phịng, trong tối, 24 giờ. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đối chứng dƣơng: Hút 20 l chất kháng sinh chloramphenicol 20mg/ml giếng thạch trên đĩa NA đã quét vi khuẩn. Đối chứng âm: Hút 20 l mơi trƣờng PG vơ trùng cĩ bổ sung Tween 80 đã chuẩn bị trƣớc đĩ cho vào giếng thạch ở giữa đĩa mơi trƣờng NA. Đọc kết quả thí nghiệm: ___45___
Đồ án tốt nghiệp Nếu xảy ra hiện tƣợng kháng khuẩn thì sẽ hình thành những vịng trong suốt quanh giếng thạch. Nếu khơng xảy ra hiện tƣợng kháng khuẩn thì sẽ khơng hình thành những vịng trong suốt quanh giếng thạch. Khả năng kháng khuẩn đƣợc đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng kháng khuẩn càng tốt Trong đĩ : D: đƣờng kính vịng phân giải (mm) d: đƣờng kính giếng thạch (mm) 2.4.3.3 Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm Thí nghiệm đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp đục giếng thạch dựa vào khả năng khuếch tán của các hợp chất cĩ khả năng kháng khuẩn vào mơi trƣờng thạch. Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện nhƣ sau: Nấm bệnh – Colletotrichum sp., Fusarium sp. Pha mơi trƣờng PDA bổ sung thêm kháng sinh, vơ trùng que cấy thẳng, tiến hành cấy điểm nấm bệnh từ mơi trƣờng thạch nghiêng sang mơi trƣờng PDA cĩ bổ sung kháng sinh, ủ ở nhiệt độ phịng trong 3 ngày. Sau đĩ, đục thạch cĩ đƣờng kính 5 mm cấy sinh khối nấm vào đĩa PDA khơng bổ sung kháng sinh. Nuơi ủ tơ nấm trong 7 ngày ở nhiệt độ phịng. Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong mơi trƣờng lỏng PG vơ trùng, ủ tối và lắc 150 vịng/ phút. Sau tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa về pH 2 trong 4 giờ; cho 450 HCl 1N vào canh trƣờng, để máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vịng/ phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng đã đƣợc xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450 NaOH 1N để đƣa về pH = 7. Dịch ly tâm: Sử dụng 10ml canh trƣờng vi khuẩn S.marcescens đã xử lí ly tâm 10.000 vịng/phút trong 10 phút; tiếp theo tiến hành lọc dịch ly tâm để thu dịch canh trƣờng đã ___46___
Đồ án tốt nghiệp xƣ lí đƣợc vơ khuẩn. Tiến hành pha lỗng dịch ly tâm thành dãy các nồng độ pha lỗng: 2, 4, 8, 16 và 32. Tiến hành thêm 100 Tween 80 0,02% Dịch canh trƣờng đã xử lí acid HCl 1N, tiến hành pha lỗng dịch canh trƣờng thành dãy các nồng độ pha lỗng: 2, 4, 8, 16 và 32. Tiến hành đo OD499 ở từng nồng độ pha lỗng. Tiến hành nhỏ 100 Tween 80 0,02 % Tiến hành kháng nấm: Chuẩn bị mơi trƣờng PDA vơ trùng. Tiến hành đục giếng thạch 7mm. Vơ trùng cây đục thạch và đục lấy khối thạch với đƣờng kính 5mm cĩ sinh khối nấm từ đĩa PDA phía trên và đặt vào trung tâm đĩa PDA nhƣ hình 2.8. Hút 20 l dịch ly tâm ở các nồng độ pha lỗng cho vào 3 giếng thạch. Ủ đĩa ở nhiệt độ phịng, trong tối, 72 giờ. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Nấm bệnh Hút 20 l dịch canh trƣờng đã xử lí acid ở các nồng độ pha lỗng cho vào 3 giếng thạch. Ủ đĩa ở nhiệt độ phịng, trong tối, 72 giờ. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Hình 2.9 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA Đọc kết quả thí nghiệm: ___47___
Đồ án tốt nghiệp Nếu xảy ra hiện tƣợng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ bị ức chế và đƣờng kính của khuẩn lạc ở đĩa thí nghiệm sẽ nhỏ hơn đƣờng kính của khuẩn lạc ở đĩa đối chứng Nếu khơng xảy ra hiện tƣợng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ khơng bị ức chế, phát triển bình thƣờng nhƣ nấm ở đĩa đối chứng. Tỷ lệ ức chế đƣợc đánh giá theo cơng thức sau (Pander và cộng sự, 1982) Đọc kết quả thí nghiệm: Nếu xảy ra hiện tƣợng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ bị ức chế và đƣờng kính của khuẩn lạc ở đĩa thí nghiệm sẽ nhỏ hơn đƣờng kính của khuẩn lạc ở đĩa đối chứng Nếu khơng xảy ra hiện tƣợng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ khơng bị ức chế, phát triển bình thƣờng nhƣ nấm ở đĩa đối chứng. Tỷ lệ ức chế đƣợc đánh giá theo cơng thức sau (Pander và cộng sự, 1982) ( ) Trong đĩ: đƣờng kính khuẩn lạc bằng đƣờng kính sau khi đo trừ đi đƣờng kính khối thạch 2.4.3.4 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phương pháp quét lá Sâu thí nghiệm – sâu khoang Spodoptera litura. Sâu khoang đầu tuổi 3 đƣợc chọn ra 30 con, tiến hành cân trọng lƣợng cả 30 con rồi cho vào hộp cĩ thể tích 950ml. Các hộp nuơi sâu đã đƣợc thanh trùng. Lặp lại 24 hộp Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong mơi trƣờng lỏng PG vơ trùng, ủ tối và lắc 150 vịng/ phút. Sau tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa về pH 2 trong 4 giờ; cho 450 HCl 1N vào canh trƣờng, để máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vịng/ phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng đã đƣợc xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450 ___48___
Đồ án tốt nghiệp NaOH 1N để đƣa về pH = 7. Tiến hành pha lỗng dịch canh trƣờng thành dãy các -1 -2 -3 -4 -5 -6 nồng độ pha lỗng: 10 , 10 , 10 , 10 , 10 và 10 . Tiến hành đo OD499 ở từng nồng độ pha lỗng. Tiến hành nhỏ 100 Tween 80 0,02 % Tiến hành thí nghiệm. Phƣơng pháp nhỏ giọt trên bề mặt lá (Maureen và cộng sự, 2012) Phƣơng pháp này mơ phỏng gần giống với các điều kiện phun thuốc trực tiếp ngồi đồng nhằm khảo sát khả năng diệt sâu qua đƣờng tiêu hố của hợp chất prodigiosin của chủng SH1. Lá thầu dầu đƣợc rửa sạch và để ráo nƣớc, cắt với diện tích 15 10 (cm2). Hút 100 l dịch pha lỗng lên lá, vơ trùng que cấy để tiến hành trang đều dịch ở các nồng độ pha lỗng lên lá thầu dầu. Sau đĩ cho lá vào hộp nuơi sâu. Theo dõi số lƣợng sâu chết và trọng lƣợng của sâu trong 5 ngày theo các mốc thời gian: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Ở hộp sâu đối chứng âm: tiến hành cho sâu khoang ăn lá thầu dầu đƣợc trang đều 100 canh trƣờng PG vơ trùng đƣợc bổ sung 450 HCl 1N, 450 NaOH 1N và Tween 80 0,02% Ở hộp đối chứng dƣơng: tiến hành cho sâu khoang ăn lá thầu dầu đƣợc trang đều 100 thuốc trừ sâu Reasgant với Abamectin 1,8%. Abamectin là thuốc trừ sâu sinh học thế hệ mới, là hỗn hợp của Avermectin B1a (80%) và Avermectin B1b (20%) đƣợc phân lập từ quá trình lên men của vi khuẩn Streptomycin avermitilis. Thuốc trừ sâu sinh học Reasgant 3.6EC đƣợc pha lỗng để đạt nồng độ 6 ng/cm2. Đọc kết quả kháng sâu: Dựa vào số lƣợng sâu khoang Spodoptera litura chết ở từng mốc thời gian để đánh giá hiệu quả diệt sâu của hợp chất. Tính tỉ lệ sâu chết theo cơng thức Abbott (1925). 2.4.4 Khảo sát thời gian bảo quản canh trường sau xử lí Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens ___49___
Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong mơi trƣờng PG vơ trùng, ủ tối và lắc 150 vịng/ phút. Sau tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa pH về bằng 2 trong 4 giờ; cho 450 HCl 1N vào canh trƣờng, để máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vịng/ phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng đã đƣợc xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450 NaOH 1N để đƣa về pH = 7. Tiến hành hút 5ml canh trƣờng ra các ống nghiệm vơ trùng, đặt tại các điểm mơi trƣờng khảo sát: 2oC, nhiệt độ phịng và nhiệt độ ngồi trời, tại mỗi điểm khảo sát, chia nhĩm ống nghiệm thành 2 nghiệm thức nhỏ: canh trƣờng ở điều kiện tối và canh trƣờng ở điều kiện ánh sáng, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Nhỏ thêm 100 Tween 80 1%. Tiến hành đo OD499 ở các mơi trƣờng khảo sát sau 24 giờ, theo dõi trong vịng 7 ngày. 2.4.5 Khảo sát hiệu lực diệt sâu của chế phẩm 2.4.5.1 Khảo sát hiệu lực diệt sâu invitro Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong mơi trƣờng PG vơ trùng, ủ tối và lắc 150 vịng/ phút. Sau tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa pH về bằng 2 trong 4 giờ; cho 450 HCl 1N vào canh trƣờng, để máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vịng/ phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng đã đƣợc xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450 NaOH 1N để đƣa về pH = 7. Tiến hành pha lỗng dịch canh trƣờng thành dãy các -1 -2 -3 -4 -5 -6 nồng độ pha lỗng: 10 , 10 , 10 , 10 , 10 và 10 . Tiến hành đo OD499 ở từng nồng độ pha lỗng. Sau đĩ, hút 100 Tween 80 0,02 % , 100 rỉ đƣờng 1%, 100 dịch CMC 1%. Tiến hành thí nghiệm. Phƣơng pháp nhỏ giọt trên bề mặt lá (Maureen và cộng sự, 2012) Phƣơng pháp này mơ phỏng gần giống với các điều kiện phun thuốc trực tiếp ngồi đồng nhằm khảo sát khả năng diệt sâu qua đƣờng tiêu hố của hợp chất phrodigiosin của chủng SH1 Lá thầu dầu đƣợc rửa sạch và để ráo nƣớc, cắt với diện tích 15 10 (cm2). Hút 100 l dịch pha lỗng lên lá, vơ trùng que cấy để tiến hành trang đều dịch ở các nồng ___50___
Đồ án tốt nghiệp độ pha lỗng lên lá thầu dầu. Sau đĩ cho lá vào hộp nuơi sâu. Theo dõi số lƣợng sâu chết và trọng lƣợng của sâu trong 5 ngày theo các mốc thời gian: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Ở hộp sâu đối chứng âm: tiến hành cho sâu khoang ăn lá thầu dầu đƣợc trang đều 100 canh trƣờng PG vơ trùng đƣợc bổ sung 450 HCl 1N, 450 NaOH 1N và Tween 80 0,02% và bổ sung rỉ đƣờng 1%, dịch CMC 1%. Ở hộp đối chứng dƣơng: tiến hành cho sâu khoang ăn lá thầu dầu đƣợc trang đều 100 thuốc trừ sâu Reasgant 3.6EC đã đƣợc pha lỗng đạt nồng độ 6 ng/cm2. Đọc kết quả kháng sâu: Dựa vào số lƣợng sâu khoang Spodoptera litura chết ở từng mốc thời gian để đánh giá hiệu quả diệt sâu của hợp chất. Tính tỉ lệ sâu chết theo cơng thức Abbott (1925). 2.4.6. Khảo sát điều kiện và thời gian bảo quản chế phẩm Chế phẩm diệt sâu từ prodigiosin: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong mơi trƣờng PG vơ trùng, ủ tối và lắc 150 vịng/ phút. Sau tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa pH về bằng 2 trong 4 giờ; cho 450 HCl 1N vào canh trƣờng, để máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vịng/ phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng đã đƣợc xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450 NaOH 1N để đƣa về pH = 7. Hút 5 ml canh trƣờng cho vào ống nghiệm vơ trùng. Tiến hành đo OD499 của dịch canh trƣờng. Sau đĩ, hút 100 Tween 80 1 % , 100 rỉ đƣờng đậm đặc, 5 ml dịch CMC 1%. Tiến hành thí nghiệm: Chế phẩm đƣợc chia ra ở các điều kiện: mơi trƣờng ngồi trời, mơi trƣờng nhiệt độ phịng, mơi trƣờng tủ mát, mơi trƣờng nhiệt độ cao (60oC), mơi trƣờng đơng lạnh để theo dõi khả năng bảo tồn lƣợng prodigiosin sau khi tạo chế phẩm theo thời gian. Theo dõi trong 7 ngày, tiến hành thu mẫu chế phẩm. Dùng phƣơng pháp trích ly lỏng – ___51___
Đồ án tốt nghiệp lỏng để thu hồi lƣợng prodigiosin cĩ trong chế phẩm, đo OD 535 nm trong dung mơi ethanol:HCl tỉ lệ 1:1. Ở mỗi nghiệm thức mơi trƣờng bảo quản lặp lại 3 lần. Đọc kết quả: Thay giá trị OD535 vào phƣơng trình đƣờng chuẩn prodigiosin Y = 1,1003X + 0.0041 và đƣợc tính theo cơng thức (mg/ml) (Nguyễn Hồng Anh Kha, 2012). Tính tỉ lệ prodigiosin cịn lại trong chế phẩm theo cơng thức: Trong đĩ: C1: lƣợng prodigiosin cĩ trong chế phẩm (mg/ml) C: lƣợng prodigiosin cĩ trong canh trƣờng lên men ban đầu (mg/ml) ___52___
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 Xác định thời gian, độ pH tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn Serratia marcescens từ phương pháp xử lí acid HCl 1N Prodigiosin đƣợc biết đến là sắc tố phần lớn gắn liền với màng ngồi tế bào vi khuẩn Gram âm Serratia marcescens. Dịch nuơi cấy Serratia marcescens thơng thƣờng cần trích ly lỏng rắn bằng ethanol/methanol, sau đĩ trích ly lỏng lỏng bằng dung mơi kém phân cực hơn để đƣợc prodigiosin tinh sạch một phần. Chất này thể hiện hoạt tính diệt sâu nhƣ đã trình bày trong phần tổng quan. Việc thu hồi prodigisin và tinh sạch một phần prodigiosin cho mục đích sản xuất thuốc trừ sâu rất tốn kém, vì vậy đề tài này muốn sử dụng trực tiếp dịch nuơi cấy (canh trƣờng) Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu. Tuy nhiên Serratia marcescens đƣợc báo cáo cĩ thể gây bệnh cơ hội và là vi khuẩn phát triển rất mạnh trong nhiều hệ sinh thái khác nhau, vì vậy những thí nghiệm trong mục này nhằm mục tiêu tiêu diệt tế bào mà khơng ảnh hƣởng lên hoạt tính sinh học của prodigiosin và các hoạt tính sinh học khác của tế bào nhƣ enzyme ngoại bào cĩ thể tác động hỗ trợ diệt sâu nhƣ protease, lipase, chitinase. Hai phƣơng pháp khả thi, rẻ tiền là xử lý acid hoặc xử lý nhiệt dịch nuơi cấy. Để thực hiện cho mục đích tạo chế phẩm trừ sâu, bƣớc đầu tiên phải xử lí đƣợc số tế bào sống trong canh trƣờng lên men. Vì chủng vi khuẩn Serratia marcescenns SH1 đƣợc biết là chủng vi khuẩn gây bệnh cơ hội bệnh viện cĩ khả năng gây hại cho cơ thể con ngƣời và động vật máu nĩng, với phƣơng thức lây truyền của vi khuẩn này bằng cách trực tiếp hoặc bằng ống thơng. Serratia marcescens cĩ thể gây nên bệnh viêm phổi, nhiễm trùng huyết, viêm màng não và áp xe não, nhiễm trùng đƣờng tiết niệu, nhiễm trùng mắt. Việc tìm ra biện pháp xử lí nhằm tiêu diệt 100% tế bào sống của vi khuẩn là một bƣớc quan trọng để đảm bảo tính an tồn cho chế phẩm trừ sâu. ___53___
Đồ án tốt nghiệp Dựa trên sự ảnh hƣởng của nồng độ ion H+ lên thành tế bào vi khuẩn, tiến hành xử lí acid HCl 1N đƣa mơi trƣờng về pH 1 hoặc pH 2 để tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn đồng thời chọn ra thời điểm thích hợp để thu hoạt chất prodigiosin trong canh trƣờng lên men đạt giá trị nồng độ cao nhất cĩ thể. Kết quả trang dịch canh trƣờng sau xử lí trên mơi trƣờng thạch PGA sau mỗi mốc thời gian cho thấy: Tại 2 giờ xử lí với acid HCl 1N, khơng thấy xuất hiện khuẩn lạc đặc trƣng của chủng vi khuẩn Serratia marcescens. Để khẳng định vi khuẩn khảo sát đã chết tại pH 1 trong 2 giờ xử lí hay pH mơi trƣờng chỉ tạm thời làm chậm sự phát triển của vi khuẩn. Tiến hành ủ tối các đĩa PGA thêm 24h. Kết quả cho thấy qua 48h trong điều kiện khơng cĩ ánh sáng, các đĩa mơi trƣờng PGA đã cĩ sự xuất hiện các khuẩn lạc hình trịn, lồi, bĩng và cĩ màu đỏ đậm. Nhƣ vậy, do pH mơi trƣờng bị thay đổi đột ngột về pH acid (pH 1) đã làm mất cân bằng ion giữa trong và ngồi màng tế bào do đĩ làm chậm sự phát triển của vi khuẩn. Vì Serratia marcescens thuộc họ Enterobacteriaceae, họ vi khuẩn đƣờng ruột nên cĩ khả năng sống sĩt trong điều kiện mơi trƣờng, nên việc xử lí acid HCl 1N trong 2 giờ khơng khả thi trong việc tiêu diệt tế bào vi khuẩn. Tiến hành xử lí acid HCl 1N tại mơi trƣờng acid pH 2, các đĩa PGA khơng xuất hiện khuẩn lạc trong 24h ủ tối, và chỉ xuất hiện các khuẩn lạc đặc trƣng khi ủ 48h. Vì Serratia marcescens cĩ thể bị ức chế trong mơi trƣờng acid vì đột ngột bị hạ pH 2. Dù là pH 1 hoặc pH 2 nhƣng với thời gian xử lí ngắn chỉ làm chậm sự phát triển của vi khuẩn và giết chết vi khuẩn một phần. Kết quả của việc xử lí acid HCl 1N trong 2 giờ tại pH 1 và pH 2 là khơng khả thi cho việc tiêu diệt tế bào sống của chủng Serratia marcescens SH1. Xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, khơng thấy xuất hiện khuẩn lạc đặc trƣng của chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH1. Để tránh sai lầm trong việc xử lí acid và chắc chắn vi khuẩn khảo sát đã chết tại pH 1 trong 4 giờ xử lí hay pH mơi trƣờng chỉ tạm thời làm chậm sự phát triển của vi khuẩn nhƣ xử lí pH 1 và pH 2 trong 2h. Tiến ___54___
Đồ án tốt nghiệp hành ủ tối các đĩa PGA thêm 24h. Kết quả cho thấy qua 48h trong điều kiện khơng cĩ ánh sáng, các đĩa mơi trƣờng PGA khơng cĩ xuất hiện các khuẩn lạc hình trịn, lồi, bĩng và cĩ màu đỏ đậm. Nhƣ vậy, pH mơi trƣờng bị thay đổi đột ngột về pH acid (pH 1) và trong thời gian dài đã làm mất cân bằng ion giữa trong và ngồi màng tế bào, đồng thời làm biến tính các protein xuyên màng đính trên màng tế bào làm tế bào khơng trao đổi chất đƣợc dẫn đến sự tử vong của tế bào. Dù Serratia marcescens cĩ khả năng sống sĩt trong điều kiện mơi trƣờng acid nhƣng điều kiện sống tối ƣu của vi khuẩn này là ở 27oC và pH 7, nên việc xử lí acid HCl 1N trong 4h đã đủ thời gian giết chết tế bào vi khuẩn chủng Serratia marcescens SH1. Tiến hành xử lí acid HCl 1N trong 4h tại mơi trƣờng acid pH 2, các đĩa PGA khơng xuất hiện khuẩn lạc trong 24h ủ tối, và khơng xuất hiện các khuẩn lạc đặc trƣng khi ủ 48h. Vì Serratia marcescens cĩ thể thích nghi đƣợc với mơi trƣờng acid nhƣng pH mơi trƣờng aicd hĩa đã làm ảnh hƣởng khả năng thầm thấu của màng và làm biến tính các protein xuyên màng nên hoạt động trao đổi chất của tế bào khơng thế diễn ra. Dù là pH 1 hoặc pH 2 với thời gian xử lí hợp lí là 4 giờ chỉ làm chậm sự phát triển của vi khuẩn và giết chết vi khuẩn một phần. Kết quả của việc xử lí acid HCl 1N trong 2 giờ tại pH 1 và pH 2 là khả thi cho việc tiêu diệt tế bào sống của chủng Serratia marcescens SH1. Và vi khuẩn tiết ra hoạt chất prodigiosin, là sản phẩm thứ cấp, để chống lại điều kiện khắc nghiệt của mơi trƣờng sống nên màu canh trƣờng lên men của 2 nghiệm thức pH 1 và pH 2 tại 4 giờ cĩ màu sắc đậm nhất trơng 6 nghiệm thức thí nghiệm. Tại 24 giờ xử lí với acid HCl 1N, khơng thấy xuất hiện khuẩn lạc đặc trƣng của chủng vi khuẩn Serratia marcescens khi các đĩa petri đã trang 0,1 ml canh trƣờng đã xử lí trong mơi trƣờng thiếu anh sáng với thời gian ủ là 48h. Nhƣ vậy, pH acid (pH 1) của mơi trƣờng đƣợc duy trì trong 24h đã làm ảnh hƣởng đến khả năng thẩm thấu của màng tế bào dẫn đến hoạt động trao đổi chất ở tế bào khơng xảy ra. Do đĩ, tế bào bị tử ___55___
Đồ án tốt nghiệp vong. Mặc dù, Serratia marcescens cĩ khả năng sống sĩt trong điều kiện mơi trƣờng acid. Tiến hành thí nghiệm xử lí acid HCl 1N trong 24h tại pH 2, cho kết quả tƣơng đồng với nghiệm thức xử lí acid tại pH 1. Khi ủ các đĩa thạch mơi trƣờng PGA đã trang canh trƣờng lên men đã qua xử lí trong tối với thời gian 48h; kết quả cho thấy ở tất cả các đĩa đƣợc trang canh trƣờng lên men đã qua xử lí ở các nồng độ pha lỗng 100, 10-1 và 10-2 khơng thấy các khuẩn lạc trịn lồi, màu đỏ đậm xuất hiện. Do pH acid (pH 2) của mơi trƣờng đƣợc duy trì trong 24h đã làm ảnh hƣởng đến khả năng thẩm thấu của màng tế bào dẫn đến hoạt động trao đổi chất ở tế bào khơng xảy ra. Do đĩ, tế bào bị tử vong. ĐC2h A1 B1 ĐC4h A2 B2 24h ĐC A3 B3 Hình 3.1. Khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens SH1 tại ___56___
Đồ án tốt nghiệp các thời điểm 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ tại pH 1 và pH 2 ĐC2h, ĐC4h, ĐC24h là đối chứng tại 2h, 4h và 24h A1, A2, A3: pH = 1 tại 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ xử lí với acid HCl 1N B1, B2, B3: pH = 2 tại 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ xử lí với acid HCl 1N 25.000 a a b 20.000 b b bc bc bc c 15.000 2 giờ 10.000 4 giờ 24 giờ OD OD hiệu 499 chỉnh 5.000 0.000 Đối chứng pH 1 pH 2 Hình 3.2. Nồng độ prodigiosin trong canh trƣờng xử lí acid tại từng thời điểm Dựa vào kết qua đo giá trị OD 499nm (Mekhael và Yuosif, 2009) và phầm mềm xử lí số liệu với khoảng tin cậy là 95%. Tại từng thời điểm xử lí với acid HCl 1N, cho kết quả: ở pH 1 tại 24 giờ xử lí (19,99a), cao thứ 2 là ở pH 2 tại 24 giờ xử lí (18,05b) và cao thứ 3 là ở pH 2 tại 4 giờ xử lí (18,00b). Nhƣ vậy, việc xử lí acid trong 4 giờ là thời gian thích hợp cho việc tiêu diệt tế bào vi khuẩn. Đến đây, cĩ thể kết luận việc xử lí acid HCl 1N ở pH 2 trong 4 giờ là nghiệm thức hợp lí cho việc tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens SH1. Để xác định khả năng sản sinh prodigiosin của chủng SH1, ta tính theo cơng thức (Mekhael và Yuosif, 2009): [ ( )] ⁄ Trong đĩ: ___57___
Đồ án tốt nghiệp OD499: độ hấp thụ của sắc tố OD620: độ hấp thụ của tế bào 1,381: hằng số Lƣợng prodigiosin sau 48h tăng sinh đƣợc đem xử lí với acid HCl 1N tại 3 thời điểm 2h, 4h và 24h. Tại mỗi thời điểm tiến hành đo giá trị OD499nm và OD620nm(Mekhael và Yuosif, 2009). Ở cùng thời điểm, lƣợng prodigiosin ở 2 giá trị pH 1 và pH 2 lần lƣợt là tại 2h xử lí là 5043,2 và 4463,4 so với đối chứng là 3819,8. Cĩ thể nhìn nhận khách quan là khi hạ pH đột ngột làm vi khuẩn tiết hợp chất thứ cấp prodigiosin để chống chịu với mơi trƣờng. Tại 4h xử lí ở pH 1 là 6069,0 và pH 2 là 5876,1 so với đối chứng ở cùng thời điểm là 4529,1. Tại nghiệm thức xử lí 24h khi đƣa pH về pH 2 và pH1 cho thấy số đơn vị prodigiosin do tế bào vi khuẩn tiết ra là 6760,1 và 7111,7 so với đối chứng ở cùng thời điểm là 5197,3. Điều này chứng minh, ở giá trị pH càng thấp vi khuẩn càng sản sinh ra prodigiosin. Vì mơi trƣờng bị đột ngột thay đổi về pH thấp nên vi khuẩn sản sinh prodigiosin càng nhiều để chống chịu với mơi trƣờng, nhƣng do pH quá thấp làm cho tế bào vi khuẩn mất cân bằng ion trong và ngồi tế bào làm cho tế bào vi khuẩn bị tiêu diệt . (xem bảng 1 phụ lục B) ___58___
Đồ án tốt nghiệp 25 20 15 2h 4h 10 24h OD hiệu chỉnh hiệu OD 5 0 OD 499nm OD 620nm OD 499nm OD 620nm OD 499nm OD 620nm Đối chứng pH1 pH2 Hình 3.3 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499) và tế bào (OD 620) trong từng nghiệm thức Bảng 3.1 Prodigiosin unit/tế bào của chủng SH1. Giờ Đối chứng pH 1 pH 2 2h 3819,8 5043,2 4463,1 4h 4529,1 6069,0 5876,1 24h 5197,3 7111,7 6760,1 3.2 Xác định thời gian, nhiệt độ tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn Serratia marcescens từ phương pháp xử lí nhiệt độ Prodigiosin đƣợc biết đến là sắc tố đổ cĩ bản chất là một chất chuyển hĩa thứ cấp chỉ xuất hiện sau giai đoạn phát triển của vi khuẩn Serratia marcescens, và đƣợc nghiên cứu từ lâu để ứng dụng hợp chất cĩ hoạt tính sinh học này vào cuộc sống.Tuy ___59___
Đồ án tốt nghiệp nhiên, chủng S. mercescens đƣợc coi là một trong những tác nhân gây bệnh cơ hội ở ngƣời (Scheurlen, 1960), S. marcescens thƣờng gây nhiễm trùng ở bệnh viện, nhƣ nhiễm trùng phổi và tiết niệu, viêm xoang, viêm tai giữa, viêm tâm nội mạc, nhiễm trùng huyết, và nhiễm trùng da do S. marcescens là rất hiếm Theo báo cáo của Nguyễn Hồng Anh Kha (2009), hợp chất prodigiosin khơng bị biến tính tại khi ở nhiệt độ dƣới 100oC. Dựa vào kết quả trên, tiến hành xử lí canh trƣờng S.marcescens ở các nhiệt độ 50oC, 65oC và 80oC nhằm khảo sát mức nhiệt độ cùng khoảng thời gian thích hợp để tiêu diệt vi khuẩn S.marcescen. Thí nghiệm nhằm tạo mơi trƣờng nghiên cứu an tồn bằng phƣơng pháp xử lý nhiệt canh trƣờng sau tăng sinh vi khuẩn SH1, đảm bảo vi sinh vật chết hồn tồn, đồng thời khảo sát sự ảnh hƣởng của quá trình xử lý nhiệt nào sẽ thu nhận nhiều sắc tố thơ nhất. Kết quả nhận đƣợc từ đĩa mơi trƣờng PGA đƣợc trang canh trƣờng S.marcescens tại mức nhiệt 50oC, sau khi ủ tối suốt 24h cĩ sự xuất hiện những khuẩn lạc hình trịn, lồi, bĩng và cĩ màu đỏ đậm. Cĩ thể thấy, vi khuẩn SH1 cĩ khả năng sống sĩt ở mức nhiệt khá cao là 50oC, tại mức nhiệt này giá trị OD của prodigiosin là 1,200b.Vậy sử dụng phƣơng pháp xử lí nhiệt ở mức nhiệt 50oC để tiêu diệt tế bào là khơng khả thi. Kết quả nhận đƣợc từ đĩa mơi trƣờng PGA đƣợc trang canh trƣờng S.marcescens tại mức nhiệt 65oC, sau khi ủ tối suốt 24h khơng cĩ sự xuất hiện những khuẩn lạc hình trịn, lồi, bĩng và cĩ màu đỏ đậm. Cĩ thể thấy, vi khuẩn bị tiêu diệt ở mức nhiệt 65oC, tại mức nhiệt này giá trị OD của prodigiosin đo đƣợc là 1,287a.Vậy sử dụng phƣơng pháp xử lí nhiệt ở mức nhiệt 50oC để tiêu diệt tế bào là khả thi. Kết quả nhận đƣợc từ đĩa mơi trƣờng PGA đƣợc trang canh trƣờng S.marcescens tại mức nhiệt 80oC, sau khi ủ tối suốt 24h khơng sự xuất hiện những khuẩn lạc hình trịn, lồi, bĩng và cĩ màu đỏ đậm. Cĩ thể thấy, vi khuẩn SH1 bị tiêu diệt hồn tồn năng ở mức nhiệt cao là 80oC, tại mức nhiệt này giá trị OD của prodigiosin ___60___
Đồ án tốt nghiệp đo đƣợc là 1,122c .Vậy sử dụng phƣơng pháp xử lí nhiệt ở mức nhiệt 80oC để tiêu diệt tế bào là là khả thi. Vì mục đích cuối cùng là tạo đƣợc chế phẩm diệt sâu với quy mơ sản xuất cơng nghiệp, nên xử lí canh trƣờng lên men bằng phƣơng pháp nhiệt ở 65oC, 15 phút là biện pháp hợp lí, giảm đƣợc hao mịn vật tƣ sau này. Hình 3.4 Canh trƣờng đã xử lí acid trƣợc trang trên đĩa mơi trƣờng PGA, sau 24h ủ tối. 3.3 Khả năng tiết enzyme ngoại bào Đa phần các bộ phận trên cơ thể cơn trùng đƣợc cấu tạo bởi 3 thành phần là lipit, protein và chitin. Vì vậy canh trƣờng sau lên men thu hồi đƣợc lƣợng prodigiosin cao – là yếu tố độc lực. Để hoạt tính của prodigiosin trong chế phẩm sau này hoạt động tối ƣu thì cần cĩ sự hỗ trợ từ các enzyme ngoại bào nhƣ lipase, protease hay chitinase. 3.3.1 Khả năng giữ lại enzyme ngoại bào từ phương pháp xử lí acid Kết quả thu đƣợc sau 24 giờ, ủ tối trên mơi trƣờng thạch Tween 20 là sự hình thành vịng tủa trắng đục do khả năng phân giải lipit của enzyme lipase cĩ mặt trong canh trƣờng lên men. Tween 20 bị enzyme lipase thủy phân tạo ra các acid béo và các acid béo này tạo phức với ion Ca2+ làm mơi trƣờng xung quanh giếng thạch cĩ màu trắng đục. Tại các giếng thạch đƣợc bơm trực tiếp canh trƣờng lên men vi khuẩn mà khơng qua ly tâm loại bỏ tế bào cĩ sự xuất hiện vịng tủa trắng đục. Kết quả này tƣơng ___61___
Đồ án tốt nghiệp đồng với các giếng bơm dịch ly tâm. Điều này giúp khẳng định lại thí nghiệm xử lí acid để tiêu diệt tế bào vi khuẩn là hồn tồn khả thi. Thí nghiệm định tính protease tiến hành trên mơi trƣờng Casein khi cho kết quả enzyme protease gần nhƣ khơng bị ảnh hƣởng, cho vịng phân giải rất lớn. Khi nhỏ TCA 10% lên mơi trƣờng thấy sự xuất hiện vịng trịn trong suốt xung quanh giếng thạch, và mơi trƣờng chung quanh hĩa đục, đây là phức hợp TCA – casein do enzyme protease cĩ mặt trong canh trƣờng lên men vi khuẩn, enzyme này phân giải casein trong mơi trƣờng nên TCA tạo phức với casein. Vịng trịn trong suốt dễ dàng quan sát đƣợc. Tiến hành thí nghiệm trên mơi trƣờng huyền phù Chitin 1%, kết quả cho thấy khi hạ pH mơi trƣờng về khoảng acid (pH = 1 hay pH = 2) để diệt tế bào vi khuẩn đã làm ảnh hƣởng đến enzyme chitinase, làm enzyme này bị bất hoạt hoặc biến tính, mất khả năng phân giải chitin trong mơi trƣờng. Sau khi tiến hành thí nghiệm khảo sát định tính các enzyme ngoại bào gồm: lipase, protease và chitinase. Kết quả cho thấy việc hạ đột ngột pH mơi trƣờng từ trung tính (pH 7 0,5) về acid (pH = 2) khơng gây ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme protease. Enzyme lipase của vi khuẩn khơng giữ đƣợc hoạt tính mạnh nhƣ ban đầu, nhƣng khả năng thủy phân lipit của enzyme này đƣợc bảo tồn đƣợc một phần trong mơi trƣờng acid khi xử lí. Chế phẩm diệt sâu từ prodigiosin sau này sẽ hồn hảo hơn nếu giữ đƣợc enzyme ngoại bào chitinase, nhƣng pH mơi trƣờng acid khi xử lí đã làm mất hoạt tính phân giải chitin của enzyme này. Tĩm lại, 2 trong 3 enzyme ngoại bào là lipase và protease đã giữ đƣợc hoạt tính trong suốt quá trình xử lí acid HCl 1N. ___62___
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2. Khả năng bảo tồn các enzyme trong canh trƣờng lên men bằng phƣơng pháp xử lí acid. Đƣờng kính vịng phân giải (D – d) mm Hệ số trên mơi trƣờng tƣơng ứng STT pha lỗng Casein agar Tween 20 Chitin agar agar 1 21 28,3 1,5 15,7 2,9 0 2 22 27,3 0,6 13,3 1,2 0 3 23 28,3 3,9 12,3 1,5 0 4 24 25,3 2,5 0 0 5 25 17,0 14,8 0 0 ___63___
Đồ án tốt nghiệp A1 B1 C1 A2 B2 C2 A3 B3 C3 A4 B4 C4 A5 B5 C5 Hình 3.5. Khả năng bảo tồn1 các enzyme trong canh trƣờng đã xử lí 1 2 3 4 A1, A2, A3, A4, A5: Khả năng thủy phân Casein theo nồng độ pha lỗng : 2 , 2 , 2 , 2 , 25 1 2 3 4 5 B1, B2, B3, B4, B5: Khả năng thủy phân Lipit theo nồng độ pha lỗng: 2 , 2 , 2 , 2 , 2 ___64___
Đồ án tốt nghiệp 1 2 3 4 5 C1, C2, C3, C4, C5: Khả năng thủy phân Chitin theo nồng độ pha lỗng: 2 , 2 , 2 , 2 , 2 3.3.2 Khả năng giữ lại enzyme ngoại bào từ phương pháp xử lí nhiệt độ Kết quả thu đƣợc sau 24 giờ, ủ tối trên mơi trƣờng thạch Tween 20 cho thấy việc xử lí canh trƣờng ở 65oC đã làm mất đi hoạt tính phân giải lipit của enzyme lipase. Vì vậy, xung quanh giếng thạch khơng cĩ sự xuất hiện của vịng tủa trắng đục. Sau khi tiến hành thí nghiệm khảo sát định tính các enzyme ngoại bào gồm: lipase, protease và chitinase. Kết quả cho thấy xử lí canh trƣờng lên men vi khuẩn bằng phƣơng pháp nhiệt, tại mức nhiệt 65oC đã gây ảnh hƣởng một phần đến hoạt tính của enzyme protease. Enzyme lipase và chitinase của vi khuẩn bị biến tính hồn tồn. Tĩm lại, với thí nghiệm định tính enzyme đƣợc tiến hành ở phƣơng pháp xử lí nhiệt và phƣơng pháp xử lí acid nhằm khảo sát khả năng bảo tồn hoạt tính của các enzyme ngoại trong canh trƣờng xử lí. Kết quả cho thấy phƣơng pháp xử lí acid cĩ ƣu điểm bảo tồn đƣợc hoạt tính của 2 trong 3 enzyme ngoại bào là lipase và protease so với phƣơng pháp xử lí nhiệt. Bảng 3.3. Khả năng bảo tồn các enzyme trong canh trƣờng đã xử lí bằng phƣơng pháp xử lí nhiệt. Đƣờng kính vịng phân giải (D – d) mm Hệ số STT trên mơi trƣờng tƣơng ứng pha lỗng Casein agar Tween 20 agar Chitin agar 1 21 19,3 0,6 0 0 2 22 17,7 1,2 0 0 3 23 14,7 0,6 0 0 4 24 0 0 0 5 25 0 0 0 ___65___
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.6. Khả năng bảo tồn các enzyme trong canh trƣờng đã xử lí 1 2 3 A1, A2, A3,: Khả năng thủy phân Casein theo nồng độ pha lỗng: 2 , 2 , 2 A1 B1 C1 A2 B2 C2 A3 B3 C3 1 2 3 B1, B2, B3,: Khả năng thủy phân Lipit theo nồng độ pha lỗng: 2 , 2 , 2 1 2 3 C1, C2, C3,: Khả năng thủy phân Chitin theo nồng độ pha lỗng: 2 , 2 , 2 Sau đây phƣơng pháp xử lý acid dịch nuơi cấy vi khuẩn Serratia marcescens đƣợc chọn để khảo sát hoạt tính sinh học của prodigiosin dƣới dạng chƣa trích ly bằng dung mơi. ___66___
Đồ án tốt nghiệp 3.4 Khả năng kháng khuẩn 3.4.1 Khả năng kháng khuẩn của prodigiosin từ phương pháp xử lí acid Prodigiosin cĩ khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số lồi vi khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng thấm qua màng ngồi tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme nhƣ DNA gyrase, topoisomerase IV, dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira,2009). Kết quả kháng khuẩn cho thấy dịch nuơi cấy S. marcescens xử lý acid khả năng kháng khuẩn cả vi khuẩn Gram âm E.coli và Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dƣơng (Bảng 3.4 và hình 3.7) Bảng 3.4. Khả năng kháng khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus của hoạt chất prodigiosin trong canh trƣờng lên men. Khả năng kháng khuẩn STT Hệ số pha lỗng Vịng kháng khuẩn Vịng kháng khuẩn S. E.coli (D – d) mm aureus (D – d) mm 1 21 6,7 1,1 8 0,0 2 22 5,7 2,5 7,7 0,6 3 23 0 0 4 24 0 0 5 25 0 0 ___67___