Đồ án Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì

Nội dung text: Đồ án Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS SPP. PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG ĐỂ KÉO DÀI THỜI GIAN BẢO QUẢN BÁNH MÌ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: ThS. Huỳnh Phương Quyên TS. Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thái Thiên Dung MSSV: 1311100223 Lớp: 13DSH01 TP.Hồ Chí Minh, 2017
2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong khóa luận đã được chỉ rõ nguồn gốc. TP.HCM, ngày 05 tháng 08 năm 2017 Học viên thực hiện luận văn Nguyễn Thái Thiên Dung
3. LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý Thầy, Cô trường Đại học Công Nghệ TP. HCM đã nhiệt tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cũng như niềm đam mê nghiên cứu khoa học cho sinh viên trong suốt thời gian học tập. Để hoàn thành được đồ án “Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì” trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức em đã gặp phải không ít lần khó khăn nhưng nhờ có sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của ThS. Huỳnh Phương Quyên và TS. Nguyễn Hoài Hương, Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM, cùng những kiến thức và kỹ năng cần thiết Cô truyền dạy mà em có thể đạt được thành quả của ngày hôm nay. Em xin chân thành cảm ơn các Cô. Em xin cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức khỏe. Cám ơn các bạn đại học khóa 2013– 2017 và các em khóa 2015 – 2019 trường Đại học Công nghệ TP. HCM, luôn bên cạnh và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm đồ án tại truờng. Cuối cùng, từ tận đáy lòng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình đã luôn dành tình yêu thương vô vàn cho con, đã luôn ủng hộ, động viên và tạo niềm tin để con luôn vững bước trên con đường mình đã chọn. TP.HCM, ngày 05 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực hiện đồ án Nguyễn Thái Thiên Dung
4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Tình hình nghiên cứu 2 3. Mục tiêu 2 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 2 5. Phương pháp nghiên cứu 3 6. Kết quả đạt được của đề tài 3 7. Kết cấu đồ án 3 Chương 1: TỔNG QUAN 5 1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic 5 1.1.1 Giới thiệu chung 5 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus 7 1.1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 9 1.1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic 10 1.1.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic 12 1.1.2.1 Quá trình trao đổi chất 12 1.1.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic 13 1.1.3. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic 14 1.2 Tổng quan về nấm mốc 15 1.2.1. Đặc điểm 16 1.2.2 Độc tố do nấm tiết ra 16 1.2.3 Tác hại của nấm 17 i
5. Đồ án tốt nghiệp 1.2.4 Một số chủng nấm gây độc cho thực phẩm 17 1.3 Tổng quan về công nghệ sản xuất bánh mì 18 1.3.1 Giới thiệu chung 18 1.3.2 Quy trình làm bánh mì 19 1.3.3 Ảnh hưởng của vi sinh vật đến việc bảo quản bánh mì 23 1.3.4 Vai trò của nấm men trong lên men bánh mì 24 1.4 Tổng quan về bột chua 25 1.4.1. Đặc tính của bột chua 25 1.4.2. Các loại hợp chất hương liệu trong bột chua 26 1.4.3. Ảnh hưởng của phản ứng giữa Maillard và Caramel hóa đối với hương vị của bánh mì 27 1.4.4. Con đường trao đổi chất của vi khuẩn LAB trong bột chua 28 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. Địa điểm nghiên cứu 31 2.2. Thời gian thực hiện 31 2.3. Vật liệu nghiên cứu 31 2.3.1. Giống vi sinh vật 31 2.3.2. Hoá chất và môi trường sử dụng 31 2.3.2.1. Hoá chất 31 2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy 31 2.4. Thiết bị và dụng cụ 32 2.4.1. Thiết bị 32 2.4.2. Dụng cụ 32 2.5. Phương pháp luận 32 2.6. Phương pháp nghiên cứu 33 2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu 33 2.6.2. Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp. 34 2.6.2.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa 34 2.6.2.2 Khả năng sinh acid 37 ii
6. Đồ án tốt nghiệp 2.6.2.4 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp. in vitro 38 2.6.3. Xây dựng đường chuẩn 41 2.6.3.1. Lactobacillus spp. 41 2.6.3.2. Nấm mốc Aspergillus niger 44 2.6.4. Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger khi đồng lên men bánh mì của vi khuẩn LAB với nấm men 47 2.6.5 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì 50 2.6.5.1 Khảo sát mức độ ưa thích sản phẩm bánh mì có bổ sung vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus sp.C1 ở các mật độ khác nhau 50 2.6.5.2 Khảo sát mức độ ưa thích về màu sắc, độ xốp, mùi vị của bánh mì có bổ sung vi khuẩn lactic với bánh mì thường và bánh mì có chất bảo quản 52 2.6.5.3 Độ nở bánh mì 54 2.6.5.4 Độ ẩm bánh mì 54 3.1 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp. 55 3.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào; khảo sát về sinh lý, sinh hóa 55 3.1.2 Khả năng sinh acid 56 3.1.3 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp. in vitro 57 3.2 Xây dựng đường chuẩn 59 3.2.1. Lactobacillus spp. 59 3.2.2. Nấm mốc Aspergillus niger 59 3.3 Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng lên men bánh mì với nấm men 60 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì 63 3.4.1. Đánh giá cảm quan 63 3.4.1.1 Khảo sát mức độ ưa thích sản phẩm bánh mì có bổ sung vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus sp.C1 ở các mật độ khác nhau 63 iii
7. Đồ án tốt nghiệp 3.4.1.2 Khảo sát mức độ ưa thích về màu sắc, độ xốp, mùi vị của bánh mì có bổ sung vi khuẩn lactic với bánh mì thường và bánh mì có chất bảo quản 66 3.4.2 Đánh giá độ nở 68 3.4.3 Đánh giá độ ẩm 71 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 1. Kết luận 74 2. Kiến nghị 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 Tài liệu tiếng Việt 76 Tài liệu tiếng Anh 77 PHỤ LỤC THÀNH PHẨN MÔI TRƯỜNG 1 PHỤ LỤC BẢNG MÃ HÓA MẪU THỬ CẢM QUAN 3 PHỤ LỤC KẾT QUẢ 9 PHỤ LỤC HÌNH 11 PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU 18 iv
8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIẾT TẮT - VSV: Vi sinh vật - LAB: Lactic acid bacteria/Lactobacillales - MRS agar: de Man, Rogosa, Sharpe Agar - MRS broth: de Man, Rogosa, Sharpe Broth - PDA: Potato Dextrose Agar - PDB: Potato Dextrose Broth - SAS: Statistical Analysis Systems v
9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) 15 Bảng 2.1: Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì. 48 Bảng 3.1: Khảo sát đặc điểm hình thái và sinh lý của vi khuẩn Lactobacillus spp. 55 Bảng 3.2: Độ acid (% TA) của chủng Lactobacillus spp. 57 Bảng 3.3: Tỉ lệ ức chế của vi khuẩn Lactobacillus spp. với nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn 57 Bảng 3.4: Kết quả mật độ Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 60 Bảng 3.5: Bảng tính mật độ nấm mốc để cảm nhiễm. 61 Bảng 3.6: Bảng mật độ / khối lượng cần bổ sung 61 Bảng 3.7: Kết quả đối kháng nấm giữa các mẫu 62 Bảng 3.8: Mức độ ưa thích của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5 64 Bảng 3.9: Mức độ ưa thích của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.C1 64 Bảng 3.10: Kết quả đánh giá cảm quan mức độ ưa thích về các chỉ tiêu màu sắc, độ xốp, mùi, vị của các mẫu bánh mì 66 Bảng 3.11: Đánh giá chung về mức độ ưa thích của các mẫu bánh mì 67 Bảng 3.12: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của mẫu bánh mì BML5 69 Bảng 3.13: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của mẫu bánh mì BMC1 69 Bảng 3.14: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của các mẫu bánh mì 70 Bảng 3.15: Đánh giá độ ẩm của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 72 Bảng 3.16: Đánh giá độ ẩm của các mẫu bánh mì khi vừa nướng xong và sau 7 ngày bảo quản 72 vi
10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus 7 Hình 1.2: Tế bào nấm Aspergillus niger 16 Hình 1.3: Bánh mì thành phẩm 18 Hình 1.4: Quy trình làm bánh mì 20 Hình 1.5: Các con đường lên men dị hình bột chua điển hình bởi vi khuẩn sinh acid lactic (được chuyển thể từ Liu và những người khác năm 2008) 30 Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu đề tài 33 Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát đặc điểm sinh lí, sinh hoá chủng Lactobacillus spp 34 Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh acid chủng Lactobacillus spp. 37 Hình 2.5: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. 39 Hình 2.6: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế của phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn 41 Hình 2.7: Sơ đồ quy trình dựng đường chuẩn chủng Lactobacillus spp. 42 Hình 2.8: Sơ đồ quy trình dựng đường chuẩn nấm mốc A.niger 44 Hình 2.9: Vùng đếm hồng cầu 45 Hình 2.10: Sơ đồ quy trình thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì. 47 Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc trên MRS agar 56 Hình 3.2: Kết quả nhuộm Gram 56 Hình 3.3: Đồ thị khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 58 Hình 3.4: Đối kháng nấm Aspergillus niger 58 Hình 3.5: Đường chuẩn củng vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 59 Hình 3.6: Đường chuẩn nấm mốc Aspergillus niger 59 vii
11. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.7: Khảo sát đối kháng in vivo 63 Hình 3.8: Mẫu bánh mì bổ sung 2 chủng lactic chuẩn bị đánh giá cảm quan 65 Hình 3.9: Tiến hành thí nghiệm cảm quan mẫu bổ sung 2 chủng lactic. 66 Hình 3.10: Mẫu bánh mì chuẩn bị đánh giá cảm quan 68 Hình 3.11: Tiến hành thí nghiệm cảm quan 68 Hình 3.12: Độ nở của bánh mì 71 viii
12. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cùng với sự phát triển của nền kinh tế, chất lượng cuộc sống và nhu cầu của con người ngày càng cao, nhất là nhu cầu về lương thực thực phẩm. Con người đòi hỏi thực phẩm đa dạng, tiện dụng, an toàn và hiệu quả. Bánh mì là sản phẩm chế biến từ bột mì nhào với nước, muối và nấm men, để lên men cho nở xốp, sau đó nướng hay hấp chín. Khoảng một nửa số dân trên thế giới dùng bánh mì làm món ăn vào buổi sáng bởi tính tiện dụng. Trên khắp thế giới, bánh mì rất đa dạng về cả hình dạng và công thức chế biến cũng như cách bảo quản. Sự hư hỏng của sản phẩm bánh mì chủ yếu là do sự tăng trưởng của nấm; các loài chủ yếu liên quan đến là Aspergillus, Fusarium, và Penicillium. Ngoài những thiệt hại kinh tế lớn bắt nguồn từ sự hiện diện của nấm mốc, mối quan tâm khác là việc nấm mốc sản xuất độc tố tiềm năng có thể gây ra vấn đề sức khỏe cộng đồng (Legan, 1993). Trong những năm gần đây, bảo quản sinh học (dùng vi khuẩn và / hoặc các chất chuyển hóa của vi khuẩn để ngăn chặn sự hư hỏng và để kéo dài thời hạn sử dụng của thực phẩm) (Stiles, 1996) đã đạt được sự quan tâm ngày càng tăng do nhu cầu của người tiêu dùng. LAB có lịch sử lâu dài trong việc bảo quản thực phẩm khỏi các vi sinh vật gây hư hỏng - chúng thường được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm, có thể sản sinh ra một số chất chuyển hóa mang lại lợi ích cho sức khỏe và do đó thường được coi là an toàn (GRAS) (Belal J. Muhialdin, Zaiton Hassan and Nazamid Saari, 2011), chẳng hạn như axit hữu cơ, axit béo, hydrogen peroxide và bacteriocins. Hoạt tính kháng nấm của LAB (Hassan & Bullerman, 2008; Magnusson, Strom, Roos, Sjogren, & Schnürer, 2003; Sjogren, MAG nusson, Broberg, Schnürer, & Kenne, 2003) có thể sử dụng để chống nấm mốc kéo dài thời gian bảo quản của bánh mì. Chính vì thế, tôi thực hiện đề tài về: “Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì”. 1
13. Đồ án tốt nghiệp 2. Tình hình nghiên cứu Có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để tạo chế phẩm trong nông nghiệp cả trong nước và trên thế giới. Trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu dùng vi sinh vật để kháng lại nấm bệnh theo phương pháp đối kháng trực tiếp (Magaldi, 2004) như: “Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn probiotic Lactobacillus plantarum trong chế biến sữa chua” (Đoàn Anh Dũng, Nguyễn Công Hà, Lý Nguyễn Bình và Lê Nguyễn Đoan Duy - Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, 2015), đồ án tốt nghiệp “Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm Aspergillus niger và Mucor sp. của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5” (Phan Nguyễn Hương Thảo, 2015). Ngoài nước có công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic được phân lập từ Kim Chi để kháng lại Aspergillus fumigatus Jeong- 75, Hàn Quốc theo phương pháp đối kháng che phủ (Magnusson và Schnurer, 2001). Ngăn ngừa sự hư hỏng nấm mốc bằng cách sử dụng vi khuẩn axit lactic có đặc tính chống nấm (Carla Luciana Gerez, Maria Ines Torino, Graciela Rollán, Graciela Font de Valdez, 2009). Vi khuẩn acid lactic trong bảo quản nâng cao chất lượng bánh mì (Belal J. Muhialdin, Zaiton Hassan và Nazamid Saari, 2015). 3. Mục tiêu Sử dụng Lactobacillus spp. kết hợp nấm men trong lên men bánh mì nhằm kéo dài thời gian bảo quản bánh mì và cải thiện cảm quan sản phẩm. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacullus sp.C1. - Xây dựng đường chuẩn của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacullus sp.C1, nấm Aspergillus niger để xác định mật độ tế bào, bào tử từng chủng. - Khảo sát khả năng kháng nấm mốc của vi khuẩn LAB in vitro. 2
14. Đồ án tốt nghiệp - Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng lên men bánh mì với nấm men. - Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì. 5. Phương pháp nghiên cứu a) Phương pháp luận Chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ nem chua, cơm mẻ nên bản thân chủng vi khuẩn đã có tính an toàn thực phẩm. Trên cơ sở khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic đối với các nấm gây hư hỏng thực phẩm, người thực hiện đề tài tiếp tục nghiên cứu và tìm hiểu các tác nhân gây ức chế nấm nhiễm thực phẩm. Từ đó ứng dụng chủng vi khuẩn lactic để ức chế nấm mốc trên thực phẩm và cụ thể là bánh mì. b) Phương pháp xử lý số liệu - Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị. - Sử dụng phần mềm SAS9.4 để xử lí số liệu. 6. Kết quả đạt được của đề tài - Khẳng định được hoạt tính sinh học của chủng Lactobacillus spp - Xác định được mật độ tế bào của Lactobacillus spp., A.niger. - Đánh giá tỉ lệ ức chế nấm của 2 chủng vi khuẩn thông qua phương pháp kháng nấm trực tiếp theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. (Dual Culture Two Line Culture Method). - Xác định và kéo dài thời gian bảo quản của bánh mì. 7. Kết cấu đồ án - Mở đầu - Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu. 3
15. Đồ án tốt nghiệp - Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án. - Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biến chứng cho kết quả thu được. - Kết luận và kiến nghị - nội dung chương tóm tắt lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài. 4
16. Đồ án tốt nghiệp Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic 1.1.1 Giới thiệu chung Lịch sử phát hiện ra vi khuẩn lactic: - Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hoá học người Thuỵ Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua. - Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. - Vào năm 1878, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic). - Đến năm 1881, ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình thành. Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không di động, không có khả năng tạo bào tử. Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn hiếu khí tuỳ nghi, không chứa cytochrom và enzyme catalase, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh. Chúng phân giải H2O2 để tạo ra H2O và O2 để phát triển. Chính do sự sinh acid lactic, một acid yếu nên vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong các thực phẩm lên men, dùng để ức chế sự tăng trưởng của các tác nhân gây hư hỏng. LAB có thể lên men các loại đường monosaccharide và disaccharide nhưng không phải bất cứ chủng vi khuẩn lactic nào cũng có thể lên men đường disaccharide: một số chủng không thể lên men saccharose, một số lại không thể sử dụng được lactose, các vi khuẩn latic không lên men được tinh bột (ngoại trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) và các loại polysaccharide khác. Việc phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái sinh học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc kiềm. Phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại 5
17. Đồ án tốt nghiệp cũng được sử dụng trong phân loại. Theo khóa phân loại của Bergey, họ Lactobacilliaceae chia làm 2 họ: Streptococeae và Lactobacieae. - Streptococeae lại chia ra Streptococcus và Leuconostoc. - Lactobacileae chỉ có 1 loài là Lactobacillus. Vi khuẩn lactic có nhiều trong thiên nhiên. Chúng tồn tại nhiều ở cỏ, nhất là cỏ khô, trong cơ thể người và động vật, trong miệng, ruột. Một số loài trong họ vi khuẩn lactic như Streptococcus có khả năng gây bệnh. Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng gồm nhiều giống rất khác nhau, tế bào của chúng có thể là hình cầu, hình que Phân biệt chúng về khả năng lên men đồng hình hay dị hình. Khả năng tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi. Vi khuẩn lactic chịu được ở trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl (tới 7 – 10%). Các vi khuẩn lactic ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (5 oC hoặc thấp hơn), các loài ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 25 - 35 oC, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích là 40 – 45 oC. Khi gia nhiệt tới 60 – 80 oC hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút. Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của peptone, acid amin hay muối amin. Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5.5 – 6, khi pH nhỏ hơn 5.5 quá trình lên men bị dừng lại. Vi khuẩn lactic có hoạt tính proteaza: phân huỷ protein của sữa thành các peptid và acid amin. Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường là trực khuẩn cao hơn. Vi khuẩn lactic lên men được đa số disacarit. Một số loài có khả năng tạo thành màng nhầy. Một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rửa thực phẩm. Như vậy, ngoài khả năng tạo thành acid lactic, các loài này còn có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh (người ta gọi các hợp chất này là bacteriocin). Những chất kháng sinh này không dùng trong y 6
18. Đồ án tốt nghiệp học mà chỉ được dùng trong bảo quản thực phẩm có hiệu quả khả quan. Các vi khuẩn lactic ngoài việc tạo thành acid còn có 1 số loài tạo được chất thơm ( diacetyl, acetoin, acid bay hơi ) như Streptococcus diacetylactic. 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus Tuỳ theo hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que. Kích thước của chúng cũng thay đổi tuỳ theo từng loài. Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus Phân loại khoa học: - Giới: Vi khuẩn - Ngành: Firmicutes - Lớp: Bacilli - Bộ: Lactobacillales - Họ: Lactobacillacea - Giống: Lactobacillus Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 loài như: L.acidophilus, L.brevis, L.casei, L.fermentum, L.plantarum, L.bulgaricus, 7
19. Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catatalase âm tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu bằng con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes. Cácloài Lactobacillus được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có chứa các vi khuẩn này. Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, plantarum. Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của carbohydrate, các loài Lactobacillus có thể chia thành 3 nhóm. - Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc, chúng được gọi là Thermobacterium, có fructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase). Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, chúng phát triển ở 45℃. - Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý, chúng được gọi là Streptobacterium (có FDPaldolase và cảm ứng phosphoketolase). Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acetic. - Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc, chúng được gọi là Betabacterium (có phosphoketolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Lactobacillus có vai trò hữu ích trong điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy khi đi du lịch, tiêu chảy do nhiễm khuẩn Clotridium difficile, tình trạng không dung nạp Lactose, bệnh về da như: bang đỏ do sốt, chàm, mụn trứng cá, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường hô hấp. 8
20. Đồ án tốt nghiệp 1.1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao. Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Để sinh trưởng bình thường, ngoài nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như nguồn carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và lưu huỳnh mà chúng còn có nhu cầu vềộ m t số vitamin, các chất sinh trưởng và chất khoáng.  Nhu cầu dinh dưỡng carbon Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từcác monosaccharide (glucose, fructose, manose) và các disaccaride (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccaride (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,  Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton, Hiện nay, cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp người ta không sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.  Nhu cầu về vitamin Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men.  Nhu cầu các chất hữu cơ khác Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ.
Một số acid hữu cơ có 9
21. Đồ án tốt nghiệp ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic. Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic.  Nhu cầu các muối vô cơ khác Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie, mangan. Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào.  Nhu cầu dinh dưỡng oxy Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiều khí (microaerophile), sinh trưởng trên bề ặm t môi trường thạch ở điều kiện kỵ khí, một số loài là vi khuẩn kỵ khí (B.J.B Wood and Holzapfel W.H, 1995). Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy, vừa sống được trong môi trường không có oxy. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí. 1.1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004). Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này. 10
22. Đồ án tốt nghiệp  Thành phần môi trường nuôi cấy Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh ậv t dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi trường bên ngoài. Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic. Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng. Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men.  Yếu tố môi trường - Ảnh hưởng của nhiệt độ Cũng giống như các sinh vật khác, nhiệt độ môi trường cũng ảnh hưởng rất lớn đối với vi sinh vật. Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh. Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 40℃. Một số có thể sinh trưởng dưới 15℃ và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới 5℃ (B.J.B Wood and Holzapfel W.H, 1995). - Ảnh hưởng của pH Vi khuẩn lactic nói chung có thể phát triển được trong môi trường acid, khoảng pH của chúng có thể từ 4.5 – 8.5. Trong quá trình lên men, vi khuẩn sẽ sinh ra acid lactic, khi pH thấp hơn 4 một mặt nó sẽ ức chế các vi khuẩn tạp nhiễm, tuy nhiên nó cũng ức chế sự phát triển của chính nó, do đó cần phải theo dõi suốt quá trình lên men, dùng bazơ để điều chỉnh pH về thích hợp. 11
23. Đồ án tốt nghiệp - Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men. 1.1.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic 1.1.2.1 Quá trình trao đổi chất Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic. Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhóm:  Vi khuẩn lên men lactic đồng hình Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và ộm t lượng nhỏ acid acetic, acetol, di-acetiyl. Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men: 4 6 12 6 → 2 3CHOHCOOH + 21,8.10 J . Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucose được chuyển hóa theo chu trình EMP (Embden-Mayerhoff), vi khuẩn sử dụng tất cả loại enzyme aldolase cho quy trình này, còn hydro tách ra khi dehydro hóa triozophophat được chuyển đến pyruvat. Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có enzyme cacboxylase cho nên acid pyruvic không thủy phân hủy nữa mà tiếp tục khử thành acid lactic.  Lên men lactic dị hình Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài các sản phẩm phụ như acid acetic, ethanol, acid succinic, C 2. Phương trình chung biễu diễn quá trình lên men: 12
24. Đồ án tốt nghiệp 6 12 6 → 3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3 + 2 5 + 2 Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic và acid acetic 10% các loại khí 20%, đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự tích lũy ộm t lượng lớn acid formic. Như vậy, trong quá trình lên men lactic dị hình có nhiều sản phẩm phụ khác nhau đáng kể được tạo thành, chứng tỏ quá trình này phức tạp hơn nhiều so với quá trình lên men lactic đồng hình. Theo quan điểm tiến hóa sinh lý trong vi sinh vật học, người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hóa độc lập của lên men dị hình. 1.1.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrat khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinhậ v t có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm. Khi ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy, 2007). Vi khuẩn lactic còn sản sinh bacteriocin ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong bảo quản sinh học. Ngoài ra, chúng còn sản sinh các chất hay các phân tử nhỏ có hoạt tính kháng nấm như reuretin, acid lactic, 13
25. Đồ án tốt nghiệp 1.1.3. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic LAB được biết đến bởi khả năng kháng nấm của chúng, điều đó liên quan đến việc sản xuất 1 loạt các loại hợp chất bao đồm acid, alcohol, CO2, diacetyl, H2O2, phenyllactic acid, bacteriocin và cycle peptide. Đặc tính nổi bật của hợp chất bề mặt của LAB là tính ổn định nhiệt của các hợp chất kháng nấm có trong nó. Điều này thúc đẩy việc sử dụng các hợp chất bề mặt của LAB hoặc các hợp chất chống nấm trong các thực phẩm được xử lý nhiệt. Các hợp chất bề mặt của LAB hoạt động trong phổ pH rộng, kéo dài từ 3 đến 9 tùy thuộc vào từng chủng khác nhau. Đây có thể coi là một yếu tố chính khi LAB được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm khi so sánh với chất bảo quản hóa học (Belal J. Muhialdin, Zaiton Hassan and Nazamid Saari, 2011). Giống Lactobacillus đã được báo cáo là có hoạt tính kháng nấm khi đánh giá bằng khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng. Hoạt động kháng nấm của L.coryniformis cornyformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt độ cao và độ pH 3-4,5 (Magnusson và cộng sự, 2001). Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của LAB đã xác định được ộm t số hợp chất có tác dụng ức chế chống lại nấm mốc và các loài nấm men khác nhau (Corsetti và cộng sự, 1998, (Bảng 1.2).; Lavermicocca và cộng sự, 2000; Niku- Paavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003; Sjogren và cộng sự, 2003; Sjogren, 2005). Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996) 14
26. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) Hợp chất được xác định Nguồn sản xuất 4-hydroxy-phenyllacticacid 3- Lactobacillusplantar 21B phenyllacticacid 3 -hydroxydecanoicacid 3 - hydroxydodecanoicacid 3 - Lactobacillusplantarum MILAB14 hydroxytetradecanoicacid 3-hydroxy-5-cis – dodecenoicacid cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin Lactobacillusplantarum VTTE- mevalonolactone 78076 Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-, Lactibacillus sanfranciscensis CB1 formic- and n- valeric acid. 1.2 Tổng quan về nấm mốc Giới nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn tự dưỡng có thành tế bào bằng kitin (chitin). Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các dạng sợi đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium). Nấm thường sinh sản qua bào tử hoặc qua hình thức sinh sản tự dưỡng. Quá trình sinh sản có thể là vô tính hay hữu tính. Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả thể). Phần lớn các nấm thường không quan sát được bằng mắt thường. Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh trên cơ thể động vật, thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật chất. 15
27. Đồ án tốt nghiệp 1.2.1. Đặc điểm Phân loại khoa học Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Aspergillus Tên Khoa Học: Aspergillus niger Nấm mốc Aspergillus có hình dạng sợi, phân nhánh có vách ngăn (cấu tạo đa bào). Khi mới phát triển sợi nấm màu trắng, sau đó sẫm lại nhưng không hoàn toàn đen. Bào tử của chúng là có màu đen tuyền. Từ một sợi đầu tiên chúng phân nhánh tạo ra 2 - 4 nhánh sợi nhỏ. Nấm mốc Aspergillus có hai hình thức sinh sản: hữu tính và vô tính. Hình 1.2: Tế bào nấm Aspergillus niger 1.2.2 Độc tố do nấm tiết ra Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc 16
28. Đồ án tốt nghiệp đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người. Hiện nay có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên chỉ có khoảng 20 loài độc tố có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm. Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), ochratoxin A, stermatocystin, axit cyclopianxoic. Aspergillus niger chứa nhiều độc tố, một số vô hại. Các độc tố nó chứa malformin C, và ochratoxin A. A. niger có thể là có lợi mặc dù nó là độc hại. Thông qua quá trình lên men, nó có thể sản xuất các enzym hữu ích mà có thể được sử dụng trong việc sản xuất xi-rô ngô, Beano, rượu vang và rượu táo (Rajkumar, 2010). 1.2.3 Tác hại của nấm Aspergillus niger là một loại nấm và một trong những loài phổ biến nhất của các chi Aspergillus. Nó gây ra một căn bệnh được gọi là nấm mốc đen trên một số loại trái cây và rau quả như nho, hành tây, và đậu phộng, và là một chất gây ô nhiễm phổ biến của thực phẩm. Aspergillus niger là một trong những nguyên nhân phổ biến nhất của nhiễm trùng tai nấm, mà có thể gây đau, thính lực tạm thời mất mát, và trong trường hợp nghiêm trọng, thiệt hại cho ống tai và màng tympanic. 1.2.4 Một số chủng nấm gây độc cho thực phẩm Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (fungal flora) có 3 chủng giống nấm mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus, Fusarium và Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào thời gian trước, trong và sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu, đậu đỗ, Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: độc cấp tính, mãn tính, gây đột biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối loạn chức năng hoạt ộđ ng của thận, có thể gây chết đối với trường hợp nặng. Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết. Nhiều công trình 17
29. Đồ án tốt nghiệp thử nghiệm đã xác định độc tố vi nấm có thể gây ung thư, đặc biệt là ở gan. Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã xác định có ộm t số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép ADN và gây hậu quả là đột biến hoặc quái thai. 1.3 Tổng quan về công nghệ sản xuất bánh mì 1.3.1 Giới thiệu chung Bánh mì là sản phẩm chế biến từ bột mì nhào với nước, muối và nấm men, để lên men cho nở xốp, sau đó nướng hay hấp chín. Bột mì và nấm men là hai nguyên liệu chính ảnh hưởng nhiều nhất đến quy trình sản xuất và chất lượng sản phẩm. Hình 1.3: Bánh mì thành phẩm  Hệ enzyme trong bột mì: Enzyme trong bột có đầy đủ các hệ trong hạt mì, tuy nhiên trong sản xuất cần đặc biệt lưu ý protease và amilase. Protease phân giải protein cấu trúc bậc ba, do đó gluten bị vụn nát làm giảm chất lượng bột nhào. Protease bột mì có hoạt độ mạnh ở 45 - 47°C và pH = 4,5 - 5,6. Khi bổ sung chất khử thì hoạt độ của protease tăng nhưng với chất oxy hoá và muối ăn thi bị kìm hãm. Amylase thuỷ phân tinh bột giúp cho bột nhào lên men nhanh và tăng chất lượng bánh vì lượng đường 18
30. Đồ án tốt nghiệp trong bột không đủ cho quá trình lên men. Tác dụng tích cực này chỉ đối với amylase vì nó thuỷ phân tinh bột thành maltose, còn α - amylase thuỷ phân tinh bột thành dextrin mà dextrin thì liên kết với nước kém làm cho ruột bánh bị ướt, do đó làm giảm chất lượng bánh. 1.3.2 Quy trình làm bánh mì  Nguyên liệu: Bột mì số 11 200 gram Men 2.5 gram Đường 30 gram Sữa tươi không đường 135 ml Bơ Zelachi 15 gram Trứng gà 1⁄2 trứng Muối 2 gram Vani 1 ống 19
31. Đồ án tốt nghiệp  Quy trình làm bánh mì: Nguyên liệu Nhào bột Lên men ổn định sơ bộ Chia bột Vê bột Tạo hình Lên men kết thúc Nướng Làm nguội Sản phẩm Hình 1.4: Quy trình làm bánh mì 20
32. Đồ án tốt nghiệp  Thuyết minh quy trình: 1. Nguyên liệu: Các thành phần khô gồm bột mì, men, đường, muối được trộn trước để đảm bảo sự phân bố đều các hạt khô trong bột mì. Cho men khô vào bột trước khi cho sữa vào sẽ giúp cho khả năng hoạt động của men tốt hơn. Sau đó trộn bơ, sữa, trứng và vani. Lưu ý: Bơ lúc này đã được làm tan chảy và sữa đã được gia nhiệt đến 80℃. Sau khi trộn, dùng dụng cụ đậy kín để bột nghỉ 10 phút tạo điều kiện cho độ ẩm có thể phân tán hết khối bột. 2. Nhào bột: Mục đích: Phân bố đều các nguyên liệu tạo thành khối bột nhào đồng nhất. Tạo thành mạng gluten có tính đàn hồi và nhớt dẻo, cố khả năng giữ khí. Cách làm: Khoảng 30 – 45 phút, đến khi nào không còn ảm giác bột dính tay và trở nên trơn mịn, dẻo dai có thể cảm nhận được. Đây là khâu quan trọng nhất trong việc làm bánh nở bông và mềm. Bột nhào chưa đủ hoặc nhào quá kỹ đều làm giảm khả năng nở của bột. 3. Lên men ổn định sơ bộ: Mục đích: tạo khí CO2 làm nở bột, tạo độ xốp cho bánh. Tạo mùi vị thơm ngon cho bánh mì. Tăng độ tiêu hóa của bánh mì đối với cơ thể người. Cách làm: khối bột nhào sau khi đã đạt mức độ thích hợp được để yên trong 30 phút. 4. Chia bột: Mục đích: sau khi lên men, khí CO2 được sinh ra cần được ép hết đi, phân tán men và nhiệt độ nhiều hơn trong toàn khối bột. Cách làm: Tuỳ theo độ lớn nhỏ của bánh mì mà chia khối bội thành từng khối bột nhỏ hơn có khối lượng bằng nhau. Việc chia bánh nhỏ có khối lượng bằng nhau sẽ kích thích việc nở tối đa và nở đồng đều cho từng khối bột. 21
33. Đồ án tốt nghiệp 5. Vê bột, tạo hình: Mục đích: sau khi chia cấu trúc của bột nhào bị phá vỡ, phải qua quá trình vê để ổn định lại cấu trúc. Cách làm: Sau khi chia bột thành những khối đồng đều nhau, từng khối được vê thành các khối cầu tròn có bề mặt nhẵn mịn để tránh tình trạng bánh bị nứt sau lên men. Hình dáng cầu cũng là hình dáng giúp cho khối bột nở tốt nhất trong quá trình lên men. 6. Lên men kết thúc: Mục đích: lên men ổn định là bước kỹ thuật quan trọng có ảnh hưởng quyết định tới chất lượng bánh. Trong quá trình chia và tạo hình thì hầu hết lượng CO2 trong cục bột thoát ra ngoài. Muốn cho bánh nở và có thể tích, hình dáng cần thiết thì phải để cục bột lên men kết thúc rồi mới đưa vào lò nướng. Cách làm: Vệ sinh, đặt vào lò 1 cốc chứa nước để cấp ẩm và bật lò nướng ở nhiệt độ 150℃ trong vòng 10 phút để làm nóng môi trường ủ, mở cửa lò cho nhiệt độ giữ ở mức vừa phải không quá nóng để bánh lên men tốt hơn. Cho bánh đã tạo hình vào ủ trong 35-400C/40 – 45 phút. 7. Nướng: Mục đích: tiêu diệt hệ vi sinh vật và ức chế hệ enzyme trong khối bột nhào. Làm chín bánh, tạo hương vị, màu sắc cho sản phẩm. Cách làm: Nhiệt độ sử dụng là 150 - 170℃ trong vòng 10 – 15 phút. Nhiệt độ và thời gian nướng phụ thuộc và khối lượng mỗi bánh. Bánh nhỏ thì nhiệt độ buồng nướng cao, thời gian nướng ngắn. Bánh to thì phải hạ nhiệt độ xuống đồng thời kéo dài thời gian nướng vì nếu nhiệt độ cao, vỏ bánh sẽ cháy nhưng ruột bánh lại không kịp chín. 8. Làm nguội: Mục đích: chuẩn bị cho quá trình bao gói bánh sau khi nướng. 22
34. Đồ án tốt nghiệp 1.3.3 Ảnh hưởng của vi sinh vật đến việc bảo quản bánh mì Trong điều kiện độ ẩm không khí dưới 79% và nhiệt độ dưới 20℃, ẩm độ của hạt dưới 15% vi sinh vật trong bột sẽ không tăng lên mà dần dần chết đi khi bảo quản bột trong thời gian dài. Nếu ẩm độ của bột chỉ cần tăng lên 1 – 2% thì vi khuẩn và nấm mốc trong bột sẽ phát triển mạnh. Để bảo quản bột tốt cần bảo quản bột ở độ ẩm không khí dưới 79%, ẩm độ của bột không quá 14 – 15% trong điều kiện nhiệt độ ổn định. Ở điều kiện này, giữ bột được 3 – 5 tháng, ở điều kiện ẩm độ bột từ 12 – 13% giữ được 1 năm. 1.3.3.1 Hệ vi sinh vật bánh mì Hệ vi sinh vật bánh mì bắt nguồn từ bột mì, man bánh mì và tạp nhiễm. Khi làm bột nhào men bánh mì hoạt động mạnh tạo ra rượu và khí carbonic làm nở bột nhào. Khi nắn bánh và đem nướng hầu hết vi sinh vật đều bị tiêu diệt trừ một số bào tử chịu nhiệt còn tồn tại. Khi nướng bánh nhiệt độ bên ngoài tới 180 – 200℃, các vi sinh vật ngoài vỏ bánh chết hết và trong ruột bánh nóng dần lên nhưng bào tử của chúng vẫn còn sống. Khi gặp điều kiện thuận lợi, các bào tử của trực khuẩn khoai tây và trực khuẩn cỏ khô phát triển làm hỏng bánh mì. Trong quá trình vận chuyển và bảo quản còn bị tạp nhiễm các vi sinh vật trong đó có cả trực khuẩn đường ruột rất nguy hiểm. Vì vậy khi vận chuyển và bảo quản cần đảm bảo vệ sinh an toàn. 1.3.3.2 Hư hỏng bánh do vi sinh vật Do bánh mì thành phẩm còn một số bào tử của các trực khuẩn không bị tiêu diệt khi nướng bánh hay các tế bào sinh dưỡng của một số vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Đó chính là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì. - Bệnh nhớt ruột bánh mì do vi khuẩn Bacillus: bệnh này do trực khuẩn khoai tây và trực khuẩn cỏ khô gây ra. Khi chúng phát triển sẽ tiết ra enzyme protease thuỷ phân protein l àm ruột bánh mì bị dính nhớt, thẫm màu và có mùi khó chịu. Để hạn chế bệnh này cần tăng độ axit của bột nhào, làm pH giảm xuống khoảng 4,5 - 5 sẽ kiềm hãm trực khuẩn Bacillus mesentericus và Bacillus subtilis phát triển. 23
35. Đồ án tốt nghiệp - Ruột bánh mì bị đỏ: có một số vi khuẩn và nấm sinh sắc tố phát triển trong ruột bánh mì và làm ruột bánh mì có màu đỏ. Bệnh này không nguy hiểm đối với người, thườngặ g p vi khuẩn Bacillus prodigiosum. - Mốc bánh mì: bánh mì thường bị mốc bên ngoài do tạp nhiễm các bào tử nấm mốc và bảo quản trong điều kiện nóng ẩm cũng như ẩm độ của bánh mì cao và xếp quá chặt. - Bệnh say bánh mì: bệnh này do nấm Fusarium sporotrichioides có lẫn trong bột mì từ những hạt lúa mì ở những cây có nấm này ký sinh trên đồng ruộng. Nấm này chiụ nhiệt cao và không bị chết khi nướng bánh. Khi chúng phát triển trên bánh mì không thấy dấu hiệu hư rõ rệt nhưng chúng tiết ra độc tố khi ăn phải người bị ộng độc thấy ngây ngất như say rượu. 1.3.4 Vai trò của nấm men trong lên men bánh mì Chức năng chính của nấm men là sinh khí CO2 làm tăng thể tích khối bột nhào. Ngoài ra, các sản phẩm của quá trình lên men được tích lũy trong khối bột sẽ tạo nên các hương vị đặc trưng cho bánh mì thành phẩm. Vì vậy, nấm men có vai trò rất quan trọng trong lên men bánh mì. Nấm men sử dụng đường có trong bột mì làm cơ chất chủ yếu để tạo ra sản phẩm là cồn và CO2 theo phương trình: 6 12 6 → 2 2 5 + 2 2 Lượng CO2 tích tụ trong khối bột nhào tạo nên những túi khí, do đó khối bột trở nên xốp và thể tích tăng lên rõ rệt. Khi nướng bánh ở nhiệt độ cao, CO2 có trong mạng lưới gluten tăng thể tích làm cho mạng gluten cũng căng lên và trở thành túi chứa CO2. Nhiệt độ càng tăng, CO2 bắt đầu thoát khỏi mạng gluten sẽ tạo nên những lỗ xốp trong bột bánh làm cho bánh có độ xốp. Trong suốt quá trình lên men bột nhào và lên men kết thúc, luôn xảy ra những phản ứng sinh hóa sinh ra các sản phẩm như: rượu, acid, este, andehyde, ceton, furfurol nhằm tích tụ hương thơm và mùi vị đặc trưng cho bánh mì. Đặc biệt khi nướng bánh, gần 70 chất gây hương vị đượctạo thành và có xảy ra phản ứng Maillard sinh ra melanoidin (là các polymer không no hòa tan được trong nước, sau đó là các 24
36. Đồ án tốt nghiệp polymer không no và không hòa tan trong nước, nhưng đều có màu đậm và gọi chung là melanoidin). Nấm men cũng giúp chuyển hóa những chất có cấu trúc phức tạp trong bột mì thành những chất đơn giản giúp cho hệ tiêu hóa của người sử dụng. 1.4 Tổng quan về bột chua Lên men bột và nước dựa trên một quá trình tức thời để tạo ra bột nhào chua là một phương pháp quan trọng hiện nay (Vogel và cộng sự, 1999). Khối bột lỏng sẽ được bổ sung chủng khởi động, sử dụng các công thức và điều kiện lưu giữ để làm mới men cái theo chu kỳ (Hammes & Ganzle, 1995; Onno & Rouseel, 1994; Ottogalli, Galli, & Foschino, 1996). Trong các vi khuẩn lên men chính, ngoại trừ nấm men còn có vi khuẩn sinh acid lactic (LAB). Trong quá trình tạo bột chua truyền thống, một phần bột được trộn lẫn với men và bổ sung đủ nước để tạo độ xốp, sau đó để lên men trong vài giờ, thường là để qua đêm và cho tiếp xúc với không khí. Khối bột xốp sau đó sẽ được trộn chung với phần bột còn lại, ngoài ra còn có nước, muối và chất béo đến một độ dẻo nhất định và được cho lên men trong một thời gian ngắn trước khi kiểm tra lại và đem đi nướng. Kết quả, bánh mì có hương vị tuyệt vời hơn nhờ vi khuẩn lên men xâm nhập từ không khí hoặc do việc bổ sung vào 2-5% phần sản phẩm lên men của mẻ trước (Bruemmer & Lorenz, 1991). Trong quá trình chuẩn bị nướng bánh mì, một khối bột nhào xốp nên có mật độ vi khuẩn lactic vào khoảng 108 – 109 cfu/g còn nấm men thì 106 – 107 cfu/g, để có thể làm acid hóa giúp lên men khối bột và làm nở bột. Tuy nhiên, LAB có thể nhiễm vào bột 1 cách tự nhiên, từ 1 sản phẩm sữa lên men hoặc từ các chủng khởi động thương mại có chứa các dòng LAB đặc trưng được sản xuất trong quá trình lên men công nghiệp (Vuyst & Neysens, 2005). 1.4.1. Đặc tính của bột chua Đặc trưng điển hình bột chua (bột bánh mì) chủ yếu là do VSV của nó, về cơ bản đại diện bởi LAB và nấm men. Do sự có mặt của VSV, bột được chuyển hóa. Những VSV này đảm bảo sản xuất acid khi đun sôi hỗn hợp bột và nước. Cơ chế 25
37. Đồ án tốt nghiệp chua rất phức tạp (Hammes và Gänzle, 1998). Trong quá trình lên men, các thay đổi sinh hóa xảy ra trong các thành phần carbohydrate và protein của bột nhờ hoạt động của vi khuẩn và các enzyme (Spicher, 1983). Nhiều tính chất vốn có của bột chua dựa vào các hoạt động trao đổi chất của LAB: lên men lactic, thủy phân protein, và tổng hợp các hợp chất dễ bay hơi, chất chống mốc là một trong những hoạt động quan trọng nhất trong quá trình lên men chua (Hammes và Gänzle, 1998; Gobbetti và cộng sự, 1999). Sự lên men bột, cụ thể là bột chua, bị chi phối bởi LAB đặc biệt với nồng độ thích hợp 108 cfu/g, có thể cùng tồn tại hoặc có thể cộng sinh với các loại nấm men thông thường có nồng độ thấp hơn (Gobbetti và cộng sự, 1999; Vogel và cộng sự, 2002). Nấm men thường kết hợp với LAB trong bột chua với tỷ lệ nấm men/LAB thường là 1:100 (Gobbetti và cộng sự, 1994; Ottogalli và cộng sự, 1996). 1.4.2. Các loại hợp chất hương liệu trong bột chua Quá trình lên men bột chua là yếu tố quan trọng trong việc tạo ra mùi vị cho bánh mì (Lund và cộng sự, 1989; Rothe & Ruttloff, 1983). Các hoạt động trao đổi chất kết hợp của các vi sinh vật, tạo ra sự acid hóa hoặc tạo chua có ảnh hưởng đến đặc tính của bánh mì, đặc biệt là kết cấu, tăng thời hạn sử dụng bằng cách giảm sự tăng trưởng của mốc trong quá trình bảo quản (Corsetti và cộng sự, 2000; Oura, Soumalainen & Wiskari, 1982; Rochenck và Voysey, 1995) và tạo ra các thành phần hương vị điển hình mang lại đặc điểm cảm quan chua đặc trưng (Gobbetti, 1998; Katina và cộng sự, 2005). Trong quá trình lên men có hai loại hợp chất hương vị được sản xuất. Hợp chất không bay hơi bao gồm acid hữu cơ được sản xuất bởi vi khuẩn đồng hình (Gobbetti, Corsetti, & De Vincenzi, 1995a) và dị hình (Gobbetti, Corsetti, & De Vincenzi, 1995b) làm acid hóa, giảm độ pH và đóng góp hương vị cho bột bánh mì (Barber, Benedito de Barber, Martinez-Anaya, Martinez, và Alberola, 1985; Galal, Johnson, và Varriano-Marston, 1978). Loại thứ hai các hợp chất dễ bay hơi của bánh mì từ bột chua chứa rượu, aldehyde, ketones, este và lưu huỳnh. Tất cả các 26
38. Đồ án tốt nghiệp hợp chất này được sản xuất bằng phương pháp sinh học và các hoạt động sinh hóa trong quá trình lên men và đóng góp vào hương vị (Spicher, 1983).  Hợp chất không bay hơi Phản ứng giữa vi khuẩn lactic với các enzyme ngoại bào ảnh hưởng đến hoạt tính của vi sinh vật trong quá trình acid hóa, sản sinh acid acetic và các đặc tính kết cấu bánh mì. Nó thể hiện sự tăng cường các hoạt động enzyme nội sinh trong bột đã thu được khi kết hợp LAB với glucose oxidase VSV, lipase, endo xylanase, amylase và protease.  Hợp chất bay hơi Sự chuyển hóa ở vi khuẩn chứng minh việc sản xuất các hợp chất dễ bay hơi khác nhau cho sự lên men của nhóm vi khuẩn lactic. Các sản phẩm được tạo ra của quá trình lên men là 2-metyl-1-propanol; 2,3 methyl-1-butanol và các iso-alkoho khác. Các dòng LAB có sự khác biệt trong sự trao đổi chất và các hợp chất thơm. Sản xuất các hợp chất thơm dễ bay hơi trong quá trình lên men với sự kết hợp của các chủng đơn lẻ S. cerevisiae và C. guilliermondii, Lb. Plantarum đã được thử nghiệm, được sử dụng trong cả bột lúa mì và các chất nền đơn giản như maltose và glucose (Stolz và cộng sự, 1993). Chỉ sử dụng men trong bánh mì, bảy chất dễ bay hơi đã được tìm thấy nhiều: acetaldehyde, aceton, ethyl acetat, ethanol, hexanal, rượu isobutyl, và propanol. 1.4.3. Ảnh hưởng của phản ứng giữa Maillard và Caramel hóa đối với hương vị của bánh mì Các phản ứng Maillard và Caramel hóa ảnh hưởng chính đối với sự hình thành hương vị trong các sản phẩm từ hạt khi có sự đun nóng thì phản ứng liên quan đến các tiền chất đơn giản như acid amin và aldose đơn giản hoặc ketose đường (Rothe & Ruttloff, 1983). Số lượng acid amin tự do cao nhất đã được tạo ra trong quá trình lên men bột chua với sự kết hợp giữa LAB và S. exigus M14 (Gobbetti, Corsetti và 27
39. Đồ án tốt nghiệp cộng sự, 1994; Gobbetti, Simonetti và cộng sự, 1994; Kratochivil & Holas, 1983, Rothe, 1974). Các acid amin này là đơn chất của iso-alcohols (Gobbetti, Corsetti, & De Vincenzi, 1995b; Hansen & Schieberle, 2005) góp phần trực tiếp cho hương vị bánh mì trong quá trình lên men và nướng bánh mì (Bredie, Mottram & Guy, 2002; Damiani và cộng sự, 1996). Các sản phẩm phản ứng Maillard từ quá trình xử lý nhiệt độ cao bao gồm pyrazines, pyrrole, furan và các hợp chất chứa sunfur và các sản phẩm khác như alkanals, alkenals 2 và 2,4-alkadienal (Parker, Hassell, Mottram, & Guy, 2000). Hơn nữa, ở nhiệt độ cao hơn thì pyrrole, thiophenes, thiophenones, thiapyrans và thiazolines tăng lên và furan và aldehyde giảm (Bredie và cộng sự, 2002). Pyrazin là các hợp chất có chứa nitơ có đặc tính mùi và hương vị rất mạnh (Ji và Berhard, 1992). Do đó, việc sản xuất các hợp chất này có ảnh hưởng đáng kể đến hương vị của bánh mì. 1.4.4. Con đường trao đổi chất của vi khuẩn LAB trong bột chua Các carbohydrate có trong bột mì gồm maltose tiếp theo sucrose, glucose, fructose và, cùng với một số trisaccharides như maltotriose và raffinose. Lượng glucose tăng quá trình lên men, trong khi giảm sucrose trong sự hiện diện của nấm men do tác động của VSV. Các nấm men có mặt trong bột chua không thể lên men maltose, một loại đường phổ biến trong bột. Tuy nhiên, tế bào nấm men vẫn có thể phát triển vì glucose cung cấp vào môi trường bởi một số loài LAB, đáng chú ý L. sanfranciscensis. Bắt đầu từ glucose, LAB lên men đồng hình sản xuất acid lactic qua đường phân (lên men đồng hình), trong khi LAB lên men dị hình cũng sản xuất, ngoài acid lactic, CO2, acid aCetic, và/hoặc ethanol thông qua con đường 6- phosphogluconate/phosphoketolase(6-PG/PK) (lên men dị hình). Hexoses khác với glucose đi vào những con đường chính ở mức glucose-6-phosphate hoặc fructose-6- phosphate sau khi đồng phân hóa và/hoặc phosphoryl (Axelsson, 1999). Disaccharides được chia bởi hydrolases và/hoặc phosphohydrolases cụ thể đối với monosacarit rằng sau đó nhập vào con đường chính. Pentoses là phosphoryl hóa và chuyển đổi sang ribulose-5-phosphate hoặc xylulose-5-phosphate bởi epimerases 28
40. Đồ án tốt nghiệp hoặc isomerase và sau đó chuyển hóa phần sau của con đường 6-PG/PK (Axelsson, 1999). Sử dụng pentoses không chỉ giới hạn đối với các loài LAB có chứa phosphoketolase cấu thành, các enzyme quan trọng của con đường 6-PG/PK (lên men dị hình bắt buộc); LAB lên men dị hình tùy nghi, tạo ra hexose lên men thông qua glycolysis vì chúng có chứa một aldolase fructose-1,6-diphosphate cấu thành (enzyme chính của glycolysis), pentoses lên men giống như loài lên men dị hình bắt buộc. Trong những trường hợp như vậy, phosphoketolase của LAB lên men dị hình tùy nghi được gây ra bởi các đường pentose sẵn có (Hammes và Vogel, 1995). Quá trình lên men của pentoses tạo ra một lượng cân bằng của acid lactic và acid axetic; không có CO2 được hình thành, và vì không có bước khử là cần thiết để đạt được các trung gian xylulose-5-phosphate, acetyl phosphate được sử dụng bởi kinase acetate trong một bước phosphoryl mức bề mặt năng suất acetate và adenosine triphosphate. Buộc LAB lên men đồng hình không lên men pentoses (Axelsson, 1999). Cho đến nay, một số nghiên cứu đã được nhắm vào các trình tự của bộ gen hoàn chỉnh của lactobacilli, bao gồm L. brevis (Makarova và cộng sự, 2006), L. plantarum (Kleerebezem và cộng sự, 2004), và Lb . reuteri cũng được tìm thấy trong bột chua, hoàn chỉnh. 29
41. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5: Các con đường lên men dị hình bột chua điển hình bởi vi khuẩn sinh acid lactic (được chuyển thể từ Liu và cộng sự, 2008) Các con đường trao đổi chất của LAB ảnh hưởng đến chất lượng bánh mì được kết hợp với nguồn cacbon trung tâm sẵn có của các đồng yếu tố ảnh hưởng đến thế oxi hóa khử tế bào và môi trường. Chuyển hóa đồng hình và dị hình khác nhau về yêu cầu tái tạo đồng phân, giảm giảm nicotinamide adenine dinucleotide hoặc nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. Việc sử dụng các chất đồng nhất, như oxy hoặc fructose, như chất nhận electron bởi LAB lên men dị hình bắt buộcphải kết hợp với việc gia tăng sản xuất acetat trong bột nhão. Dựa trên các yêu cầu trao đổi chất khác nhau cho sự tái tạo cofactor, LAB lên men đồng hình và dị hình có ảnh hưởng đến các phản ứng oxi hóa khử trong bột chua có ảnh hưởng đến chất lượng bánh mì ngoài sự hình thành của acetate. 30
42. Đồ án tốt nghiệp Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh và phòng thí nghiệm thực phẩm khoa Công Nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM. 2.2. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ 24/04/2017 đến 16/07/2017. 2.3. Vật liệu nghiên cứu 2.3.1. Giống vi sinh vật Giống vi khuẩn lên men Lactobacillus sp.L5, Lactobacillus sp.C1, nấm mốc Aspergillus niger do phòng thí nghiệm vi sinh, nấm men Saccharomyces cerevisiae của Saf-Instant. 2.3.2. Hoá chất và môi trường sử dụng 2.3.2.1. Hoá chất - Các hoá chất dùng để pha môi trường MRS, môi trường PDA. - Các hoá chất dùng để pha các loại thuốc nhuộm: Tím kết tinh (Crystal violet), Fushin, Malachite green. - Chất bảo quản Natri benzoate và Canxi propionate. 2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy - Môi trường MRS – broth, MRS cải tiến, MRS agar. - Môi trường PDA, PDB. 31
43. Đồ án tốt nghiệp 2.4. Thiết bị và dụng cụ 2.4.1. Thiết bị - Tủ cấy vi sinh (Brlad France) - Tủ ủ (Memmert Germany) - Tủ lạnh Toshiba - Tủ sấy (Memmert Germany) - Máy ly tâm (Tuttligen Germany) - Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 henesis (USA) - Autoclave (Memmert Germany) - Bếp từ (Billy – England) - Máy nước cất (Branstead USA) - Bể điều nhiệt 2.4.2. Dụng cụ - Ống nghiệm, đĩa petri, erlen, cốc thuỷ tinh, bình định mức, ống đong, đũa thuỷ tinh. - Pipet thuỷ tinh 5ml, 10ml, 20ml, pipetman 100 – 1000μl - Que cấy, que trang, cây đục thạch, đèn cồn, eppendorf 1ml, ống ly tâm lớn. - Bông thấm nước, bông không thấn nước, giấy lọc, lam, lamell, buồng đếm hồng cầu, giá đỡ ống nghiệm, rổ nhựa. 2.5. Phương pháp luận  Mục tiêu: Khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus niger khi đồng lên men bánh mì của vi khuẩn Lactobacullus spp. với nấm men.  Nội dung: Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1. Xây dựng đường chuẩn của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacullus sp.C1, nấm Aspergillus niger để xác định mật độ tế bào, bào tử. 32
44. Đồ án tốt nghiệp Khảo sát khả năng đối kháng Aspergillus niger của vi khuẩn LAB. Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng lên men bánh mì với nấm men. Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì. 2.6. Phương pháp nghiên cứu 2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu Xây dựng đường chuẩn bào tử Aspergillus niger - Hình thái khu ẩn lạc, tế bào Khảo sát vi khuẩn và đặc điểm sinh lý, sinh hóa. Lactobacillus sp. L5 - Khả năng sinh acid. C1 - Khả năng đối kháng Aspergillus niger in vitro. Xây dựng đường chuẩn tế bào LAB Mật độ nấm Mật độ LAB Khảo sát khả năng kháng nấm 105 (bt/ml) - 1010 (cfu/ml) A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng 9 Mật độ nấm - 10 (cfu/ml) lên men bánh mì với nấm men 8 104 (bt/ml) - 10 (cfu/ml) - Đánh giá cảm quan Khảo sát ảnh hưởng của LAB - Độ nở bánh mì. lên chất lượng bánh mì - Độ ẩm bánh mì. Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu đề tài 33
45. Đồ án tốt nghiệp 2.6.2. Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp. 2.6.2.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa  Quy trình thí nghiệm: Chủng vi khuẩn LAB Tăng sinh trong môi trường MRS-broth Ủ 24-48h Cấy truyền sang môi Quan sát hình thái trường MRS agar khuẩn lạc - Nhuộm Gram Cấy giữ Khảo sát đặc điểm - Nhuộm bào tử giống sinh lý, sinh hóa - Catalase Khẳng định chủng LAB thuần khiết Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát đặc điểm sinh lí, sinh hoá chủng Lactobacillus spp.  Thuyết minh quy trình: Mục đích: Các chủng vi khuẩn lactic có thể bị suy yếu và nhiễm các loài vi sinh vật khác trong quá trình bảo quản. Do đó, người thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm này nhằm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng. 34
46. Đồ án tốt nghiệp Tiến hành:  Khảo sát đặc điểm nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc: Chủng vi khuẩn lactic L5 và C1 được hoạt hoá và tăng sinh trong môi trường MRS broth đã được hấp khử trùng ở 121℃ trong 30 phút và ủ ờ 37℃ trong 24 giờ. Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển sang môi trường MRS agar để ủ ở 37℃ trong 48 giờ, sau đó quan sát hình thái khuẩn lạc lactic. Tiếp theo, tiến hành khảo sát lại các đặc điểm nuôi cấy của chủng vi khuẩn lactic bao gồm các phương pháp: nhuộm gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm catalase.  Môi trường giữ giống: Sau khi đã khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng, tiến hành cấy chuyển khuẩn lạc sang môi trường MRS agar trong ống thạch nghiêng, ủ ở 37℃ trong 24 đến 48 giờ và bảo quản trong tủ lạnh phòng thí nghiệm.  Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hoá  Nhuộm Gram - Tiến hành: Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí. Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Tẩy cồn trong 20 giây, rửa nước, thấm khô. Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 30 giây, rửa nước, để khô trong không khí. Soi kính: dùng vật kính dầu 100x. - Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ. 35
47. Đồ án tốt nghiệp  Nhuộm bào tử - Tiến hành: dùng phương pháp Schaeffer-Fulton Nuôi cấy vi khuẩn ở 37oC, 5 – 7 ngày. Làm vết bôi và cố định tế bào trên lame như đối với nhuộm Gram. Nhuộm bằng dung dịch malachite green trong 10 phút, rửa nước. Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khô. Soi kính: dùng vật kính dầu 100x. - Kết quả: Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ. Chú ý: phân biệt bào tử với các hạt dị nhiễm cũng bắt màu lục.  Thử nghiệm catalase - Tiến hành: Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3-10%, nhỏ một giọt lên phiến kính. Dùng đầu que cấy platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính. - Kết quả: Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính. Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên thạch đĩa cũng cho kết quả tương tự. 36
48. Đồ án tốt nghiệp 2.6.2.2 Khả năng sinh acid  Quy trình thí nghiệm: Chủng vi khuẩn LAB Tăng sinh trong môi trường MRS-broth Ủ 370C 24h Ly tâm Sinh khối Dịch sau ly tâm Phenolphthalein Chu ẩn độ NaOH 0.1N Kh ả năng sinh acid Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh acid chủng Lactobacillus spp.  Thuyết minh quy trình: - Mục đích: Xác định khả năng sinh acid của chủng Lactobacillus spp - Tiến hành: + Chủng vi khuẩn lactic L5 và C1 được hoạt hoá và tăng sinh trong môi trường MRS broth đã được hấp khử trùng ở 121℃ trong 30 phút và ủ ờ 37℃ trong 24 giờ. + Hút 10ml dịch tăng sinh vào ống Falcon (lặp lại 3 lần). Ly tâm 4000 vòng/15 phút, phần dịch sau ly tâm cho vào erlen. 37
49. Đồ án tốt nghiệp + Bổ sung 3 giọt phenolphthalein, chuẩn độ bằng NaOH 0.1N đến khi dung dịch có màu hồng nhạt và pH = 8 – 8.3 - Kết quả: 푠ố 푙 × 0.1 × 90 × 100 % = 푡ℎể 푡í ℎ ẫ 1000 Trong đó %TA: độ acid Số ml NaOH: thể tích NaOH 0.1N đã sử dụng đổ chuẩn độ. Thể tích mẫu (ml): dịch sau ly tâm chủng Lactobacillus spp Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4 2.6.2.4 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp. in vitro  Quy trình thực hiện: 38
50. Đồ án tốt nghiệp Hoạt hóa A.Niger trên Hoạt hóa chủng vi khuẩn môi trường PDB LAB trên môi trường MRS-broth Tăng sinh A.Niger trên môi trường PDB Tăng sinh chủng vi khuẩn LAB trên môi trường Cấy vào đĩa petri MRS-broth chứa môi trường PDA Đặt thạch nấm Đặt thạch nấm ĐC âm Lặp lại Ria 2 (Không 3 lần đường ria vi LAB khuẩn) Ủ 72h ở nhiệt độ phòng Đo đường kính ức chế nấm Tỷ lệ ức chế nấm bệ nh Hình 2.5: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn.  Thuyết minh quy trình: - Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của chủng vi khuẩn theo phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn. 39
51. Đồ án tốt nghiệp - Tiến hành: Chuẩn bị môi trường vi khuẩn: Hoạt hóa 2 chủng vi khuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm: hoạt hóa trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h. Chuẩn bị chủng nấm để đối kháng: Hoạt hóa chủng nấm mốc có sẵn trong phòng thí nghiệm: hoạt hóa trong môi trường PDB ở 370C trong. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường PDB ở 370C trong 24h. Cấy điểm vào đĩa petri chứa môi trường PDA và ủ 72h ở nhiệt độ phòng.  Chuẩn bị môi trường khảo sát đối kháng: Môi trường MRS cải tiến được hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sau đó, phối vào đĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi đĩa 15ml. Khi thạch đã đông, ta tiến hành đục thạch ở đĩa nấm mốc đặt vào tâm các đĩa. Mỗi đĩa lặp lại 3 lần. Sau đó, ủ 24h ở nhiệt độ phòng. Sau 24h, ta tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn cách ngoài mép đĩa 1,5cm (2 vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm đĩa trên cùng một đường kính) cần thử đối kháng vào. Mẫu đối chứng là chỉ cấy nấm vào tâm đĩa, không cấy 2 vạch vi khuẩn lên. Tiếp tục ủ 72h ở nhiệt độ phòng. Quan sát, đọc kết quả đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm sau 3 ngày. 40
52. Đồ án tốt nghiệp Ta tiến hành đo tỉ lệ ức chế theo hình và công thức phần trăm: 1.5 1.5 Dđc Dtn cm cm Đường cấy vi khuẩn Hình 2.6: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế của phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn Trong đó: Dđc: đường kính (cm) đĩa nấm đối chứng Dtn: đường kính (cm) đĩa thí nghiệm Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4 2.6.3. Xây dựng đường chuẩn 2.6.3.1. Lactobacillus spp. Đường chuẩn = vẽ đồ thị tương quan giữa OD600nm và log(tb/ml).  Quy trình thí nghiệm: 41
53. Đồ án tốt nghiệp LAB 0 0 Ủ 37 C 24h Tăng sinh trong môi Ủ 37 C 24h trường MRS-broth Đo OD600nm Cấy trang Đếm khuẩn lạc Đư ờng chuẩn Hình 2.7: Sơ đồ quy trình dựng đường chuẩn chủng Lactobacillus spp.  Thuyết minh quy trình: - Mục đích: Xác định mật độ vi khuẩn lactic bổ sung vào bánh mì. - Tiến hành: Chủng Lactobacillus spp. được tăng sinh trong môi trường MRS- broth ở 37℃ trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ, ta tiến hành đo 600푛 và cấy trang ở cùng thời điểm. 푛 Đo 푶푫 풏 : Ta thực hiện pha loãng theo hệ số 2 bằng cách: + Hút 5ml môi trường MRS broth đã được khử trùng ở 121℃ trong 30 phút vào 10 ống nghiệm, trong đó gồm 9 ống dùng để pha loãng và 1 ống làm mẫu trắng. + Đối với 9 ống nghiệm để pha loãng (tất cả đều được đánh số thứ tự rõ ràng): Hút 5ml dịch tăng sinh cho vào ống thứ nhất, lắc đều ta được dung dịch pha loãng 2 lần. Sau đó từ ống thứ nhất hút 5ml sang ống thứ 2, lắc đều ta được dung dịch pha loãng 4 lần. 42
54. Đồ án tốt nghiệp + Tiến hành tương tự ta được chuỗi ống nghiệm chứa dung dịch pha loãng theo hệ số 2푛: 2 lần, 4 lần, 8 lần, 16 lần, 32 lần, 64 lần, + Đo 600푛 9 ống chứa dịch đã pha loãng. Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc: - Pha loãng mẫu:  Chuẩn bị 9 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước muối sinh lý đã được hấp khử trùng ở 121℃ trong 30 phút. Đánh số thứ tự từ 1 đến 9 tương ứng với 9 mật độ pha loãng từ 10−1đế푛 10−9.  Hút 1ml dịch tăng sinh vào ống thứ nhất, lắc đều. Sau đó, hút 1ml từ ống thứ nhất sang ống thứ 2, tương tự thao tác cho đến hết 9 ống. - Cấy trang:  Hút 0.1ml dịch pha loãng ở ống 10−5 vào đĩa petri chứa môi trường MRS agar. Chọn nồng độ từ 10−5đế푛 10−9 để cấy trang, mỗi nồng độ lặp lại trên 3 đĩa.  Sau khi trang khô, ta ủ ở nhiệt độ 37℃ trong 24 – 48 giờ cho khuẩn lạc có thể phát triển thuận lợi để đếm.  Sau khi đếm khuẩn lạc, ta định lượng vi sinh vật bằng công thức ΣC = (푛1 + 0.1푛2) Trong đó: N – số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu. C – số khuẩn lạc đếm được trên các đãi petri đã chọn (chọn các đĩa có số khuẩn lạc dao động từ 25 – 250 khuẩn lạc). 푛1, 푛2 – số đĩa petri ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp đã chọn. d – hệ số pha loãng mẫu. 43
55. Đồ án tốt nghiệp 2.6.3.2. Nấm mốc Aspergillus niger Đường chuẩn = vẽ đồ thị tương quan giữa OD620nm và log(tb/ml).  Quy trình thực hiện: Aspergillus niger Cấy truyền sang môi trường PDA Ủ 370C 72h Cạo bào tử trên đĩa petri Định mức 100ml Buồng đếm hồng Đo OD620nm cầu Đường chu ẩn Hình 2.8: Sơ đồ quy trình dựng đường chuẩn nấm mốc A.niger  Thuyết minh quy trình: - Mục đích: Xác định mật độ tế bào nấm mốc để cảm nhiễm bánh mì. - Tiến hành: Chuẩn bị mẫu: Giống được cấy truyền sang môi trường PDA agar và được ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 đến 4 ngày để nấm có thể mọc kín đĩa môi trường. Sau khi ta thu được đĩa nấm nuôi cấy, hút 5ml nước muối sinh lý 0.9% có bổ sung Tween 80 vô trùng vào đĩa nấm, dùng muỗng inox đã được hấp khử trùng cạo bề mặt đĩa nấm sau đó đổ 44
56. Đồ án tốt nghiệp vào bình định mức 100ml. Lặp lại thao tác cạo khoảng 5 lần đến khi bề mặt đĩa nấm được cạo sạch. Cuối cùng định mức dịch nấm bằng nước muối sinh lý có Tween đến 100ml, ta được mẫu dung dịch nấm cần. 푛 Đo 푶푫 풏 : Ta thực hiện pha loãng theo hệ số 2 bằng cách: + Hút 5ml môi trường MRS broth đã được khử trùng ở 121℃ trong 30 phút vào 10 ống nghiệm, trong đó gồm 9 ống dùng để pha loãng và 1 ống làm mẫu trắng. + Đối với 9 ống nghiệm để pha loãng (tất cả đều được đánh số thứ tự rõ ràng): Hút 5ml dịch tăng sinh cho vào ống thứ nhất, lắc đều ta được dung dịch pha loãng 2 lần. Sau đó từ ống thứ nhất hút 5ml sang ống thứ 2, lắc đều ta được dung dịch pha loãng 4 lần. + Tiến hành tương tự ta được chuỗi ống nghiệm chứa dung dịch pha loãng theo hệ số 2푛: 2 lần, 4 lần, 8 lần, 16 lần, 32 lần, 64 lần, + Đo 620푛 9 ống chứa dịch đã pha loãng. Định lượng: Hút 1ml mẫu + 4ml dung dịch nước muối sinh lý có pha Tween 80, ta thu được dịch pha loãng 5 lần. Dùng ống nhỏ giọt hút 1 giọt dung dịch pha loãng lên buồng đếm và đậy lamer, tiến hành soi và đếm ở vật kính x40. Đếm số tế bào ở những ô màu trắng (Hình 2.9). Hình 2.9: Vùng đếm hồng cầu 45
57. Đồ án tốt nghiệp Sau đó, số liệu sau khi đếm được tính toán theo công thức: + + + = 1 2 3 4 1 4 Với: 1, 2, 3, 4 lần lượt là số tế bào đếm được của 4 ô ở 4 góc buồng đếm 1 là số tế bào trung bình của buồng đếm ở lần 1. Lặp lại thao tác đếm 3 lần, ta được: + + = 1 2 3 3 Khi đó: 1000 푆ố ( / 푙) = 퐹 1 2 0.1 Với: – số tế bào trung bình ở cả 3 lần đếm 1 2 0.1 – thể tích 1 ô (trong 4 ô) của buồng đếm F – hệ số pha loãng 46
58. Đồ án tốt nghiệp 2.6.4. Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger khi đồng lên men bánh mì của vi khuẩn LAB với nấm men  Quy trình thí nghiệm ` Lactobacillus spp. TS trong môi trường Aspergillus niger MRS – Broth Ủ + lắc Cấy truyền sang môi trường PDA Đo OD600nm Ủ 370C 72h Pha loãng đến các mật độ Cạo bào tử trên đĩa petri 1010, 109, 108 (cfu/ml) Sau 24 giờ Định mức 100ml Ly tâm Bỏ dịch Đo OD620nm Rửa nước cất x2 Pha loãng đến các mật độ Ly tâm 5 4 10 , 10 (tb/ml) TH1: 104 TH2: 105 TH3: không cảm nhiễm Sinh khối Bánh mì Theo dõi ngày đầu tiên xuất hiện tơ nấm sau nướng Hình 2.10: Sơ đồ quy trình thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì. 47
59. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.1: Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì. Mật độ nấm TH1: Cảm TH2: Cảm TH3: (tb/ml) nhiễm A.niger nhiễm A.niger không cảm nhiễm mật độ 104 mật độ 105 Chất bổ sung L5 mật độ 1010(cfu/ml) BML5-10/4 BML5-10/5 BML5-10 L5 mật độ 109(cfu/ml) BML5-9/4 BML5-9/5 BML5-9 L5 mật độ 108(cfu/ml) BML5-8/4 BML5-8/5 BML5-8 C1 mật độ 1010(cfu/ml) BMC1-10/4 BMC1-10/5 BMC1-10 C1 mật độ 109(cfu/ml) BMC1-9/4 BMC1-9/5 BMC1-9 C1 mật độ 108(cfu/ml) BMC1-8/4 BMC1-8/5 BMC1-8 Natri benzoate BMNa/4 BMNa/5 BMNa Canxi propionate BMCa/4 BMCa/5 BMCa Không bổ sung BMTL/4 BMTL/5 BMTL  Thuyết minh quy trình:  Mục đích: Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp. trên bánh mì.  Tiến hành: Chủng Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 cấy truyền 5% sang môi trường MRS để tăng sinh với 200ml, sau đó được đem đi ủ và lắc đồng thời ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 tiếng. Sau đó đo OD600nm, pha loãng huyền phù gốc bằng nước muối sinh lý 0.9% vô trùng để đạt được các mật độ 1010, 109, 108 (cfu/ml) với lượng dịch là 67.5ml. Lấy 67.5ml dịch pha loãng, ly tâm 4000 vòng trong 15 phút trong ống Falcon, sau đó bỏ dịch. 48
60. Đồ án tốt nghiệp Cho nước cất vô trùng vào ống, lắc nhẹ để rửa sạch sinh khối sau đó đem ly tâm 4000 vòng trong 15 phút. Lặp lại thao tác rửa nước cất rồi ly tâm thêm 1 lần nữa để loại bỏ tối ưu các tạp chất của môi trường nuôi cấy còn sót. Sinh khối thu được sẽ được hòa với 67.5ml sữa không đường, lắc nhẹ cho hòa tan rồi bổ sung vào với các thành phần bánh mì. Mỗi mẫu bánh có khối lượng tỉ lệ với 100gr bột mì. Bột mì số 11 100 gram Men 1.25 gram Đường 15 gram Sữa tươi không đường 67.5 ml Bơ Zelachi 7.5 gram Trứng gà 1⁄4 trứng Muối 1 gram Vani 1⁄2 ống Trường hợp 1: Có cảm nhiễm nấm A.niger mật độ 104 (tb/ml) Giống được cấy truyền sang môi trường PDA agar và được ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 đến 4 ngày để nấm có thể mọc kín đĩa môi trường. Sau khi ta thu được đĩa nấm nuôi cấy, hút 5ml nước muối sinh lý 0.9% có bổ sung Tween 80 vô trùng vào đĩa nấm, dùng muỗng inox đã được hấp khử trùng cạo bề mặt đĩa nấm sau đó đổ vào bình định mức 100ml. Lặp lại thao tác cạo khoảng 5 lần đến khi bề mặt đĩa nấm được cạo sạch. Định mức dịch nấm bằng nước muối sinh lý có Tween 80 đến 100ml, ta được mẫu dung dịch nấm cần. Sau đó đo OD620nm, pha loãng bằng nước muối sinh lý 0.9% có bổ sung Tween 80 vô trùng đến mật độ 104 (tb/ml). Cho cả 9 mẫu bánh mì vào từng bao khác nhau và tiến hành xịt nấm lên 49
61. Đồ án tốt nghiệp bề mặt cả 9 mẫu. Đóng kín miệng bao rồi theo dõi từng ngày đến khi bánh mì có dấu hiệu nổi mốc và ghi nhận kết quả. Trường hợp 2: Có cảm nhiễm nấm A.niger mật độ 105 (tb/ml) (tương tự như trường hợp 1 với mức cảm nhiễm nấm mật độ 104 (tb/ml)). Trường hợp 3: Không cảm nhiễm nấm, để ngoài tự nhiên - Cho cả 9 mẫu bánh mì vào từng bao khác nhau và đóng kín miệng bao. - Theo dõi từng ngày đến khi bánh mì có dấu hiệu nổi mốc và ghi nhận kết quả. Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4. 2.6.5 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì 2.6.5.1 Khảo sát mức độ ưa thích sản phẩm bánh mì có bổ sung vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus sp.C1 ở các mật độ khác nhau  Mục đích - Sử dụng phép thử Cho điểm thị hiếu. - Phép thử Cho điểm thị hiếu cho phép đánh giá mức độ ưa thích sản phẩm của người thử đối với một dãy các mẫu khác nhau về các đặc tính cảm quan, bằng cách cho điểm theo thang điểm đã được quy ước.  Nguyên tắc Người thử sẽ nhận được lần lượt 1 dãy mẫu đã được mã hóa, yêu cầu người thử cho điểm lần lượt từng mẫu theo thang điểm đã được quy ước (thang điểm 9). Khi giới thiệu mẫu, các trật tự mẫu phải được trình bày ngẫu nhiên đối với tất cả người thử và xuất hiện cùng một số lần như nhau đảm bảo sự cân bằng đối với nhóm người thử. 50
62. Đồ án tốt nghiệp  Cách tiến hành: - Dụng cụ: Các dụng cụ thông thường (đĩa, ly nhựa). - Phòng đánh giá: Phòng A.04.29, Cơ sở Điện Biên Phủ. - Điều kiện phòng cảm quan: sạch sẽ, thoáng mát, không có mùi lạ, yên tĩnh, ánh sáng trắng. - Số lượng người thử: 120 người. - Trình độ người thử: sinh viên không qua huấn luyện. - Trật tự trình bày mẫu: sử dụng hình vuông Latin Williams (n=3). - Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4 Phiếu hướng dẫn Phiếu hướng dẫn Vui lòng thanh vị bằng nước lọc trước khi bắt đầu thử mỗi mẫu. Bạn sẽ nhận được lần lượt 3 mẫu bánh mì. Hãy nếm các mẫu bánh này và cho biết mức độ ưa thích của bạn đối với từng mẫu bánh mì đó trên thang điểm 9 trong phiếu trả lời bằng cách GHI MÃ SỐ MẪU và đánh dấu (x) vào ô điểm mà bạn cho là thích hợp nhất. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Trong đó: Điểm 1: cực kì không thích 6: hơi thích thích 2: rất không thích 7: thích 3: không thích 8: rất thích 4: hơi không thích 9: cực kì thích 5: không thích cũng không ghét Chân thành cảm ơn các bạn đã tham gia buổi cảm quan! 51
63. Đồ án tốt nghiệp Phiếu trả lời PHIẾU ĐÁNH GIÁ Mã số mẫu: Mã số người thử: Ngày: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Chân thành cảm ơn các bạn đã tham gia buổi cảm quan! 2.6.5.2 Khảo sát mức độ ưa thích về màu sắc, độ xốp, mùi vị của bánh mì có bổ sung vi khuẩn lactic với bánh mì thường và bánh mì có chất bảo quản  Mục đích - Sử dụng phép thử Cho điểm thị hiếu - Phép thử Cho điểm thị hiếu cho phép đánh giá mức độ ưa thích sản phẩm của người thử đối với một dãy các mẫu khác nhau về các đặc tính cảm quan, bằng cách cho điểm theo thang điểm đã được quy ước.  Nguyên tắc Người thử sẽ nhận được lần lượt 1 dãy mẫu đã được mã hóa, yêu cầu người thử cho điểm lần lượt từng mẫu theo thang điểm đã được quy ước (thang điểm 9). Khi giới thiệu mẫu, các trật tự mẫu phải được trình bày ngẫu nhiên đối với tất cả người thử và xuất hiện cùng một số lần như nhau đảm bảo sự cân bằng đối với nhóm người thử.  Cách tiến hành: - Dụng cụ: Các dụng cụ thông thường (đĩa, ly nhựa). - Phòng đánh giá: Phòng A.04.29, Cơ sở Điện Biên Phủ. - Điều kiện phòng cảm quan: sạch sẽ, thoáng mát, không có mùi lạ, yên tĩnh, ánh sáng trắng. - Số lượng người thử: 60 người. - Trình độ người thử: sinh viên không qua huấn luyện. - Trật tự trình bày mẫu: sử dụng hình vuông Latin Williams (n=5). - Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4. 52
64. Đồ án tốt nghiệp Phiếu hướng dẫn Phiếu hướng dẫn Vui lòng thanh vị bằng nước lọc trước khi bắt đầu thử mỗi mẫu. Bạn sẽ nhận được lần lượt 5 mẫu bánh mì. Hãy nếm các mẫu bánh này và cho biết mức độ ưa thích của bạn đối với từng mẫu bánh mì đó. Người thử ghi mã số mẫu và đánh dấu (x) lên thang 9 điểm trong phiếu trả lời. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Trong đó: Điểm 1: cực kì không thích 6: hơi thích thích 2: rất không thích 7: thích 3: không thích 8: rất thích 4: hơi không thích 9: cực kì thích 5: không thích cũng không ghét Chân thành cảm ơn các bạn đã tham gia buổi cảm quan! Phiếu trả lời PHIẾU ĐÁNH GIÁ Mã số mẫu: Mã số người thử: Ngày: Màu sắc: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Độ xốp: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Mùi: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Vị: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Đánh giá chung: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Chân thành cảm ơn các bạn đã tham gia buổi cảm quan! 53
65. Đồ án tốt nghiệp 2.6.5.3 Độ nở bánh mì - Nguyên tắc: Đánh giá so sánh độ nở thông qua sự thay đổi về chiều cao và bề ngang của mỗi chiếc bánh. - Tiến hành: + Dùng thước đo đường kính và chiều cao của khối bột sau khi nhào. + Bột sau khi lên men sử dụng thước đo lại đường kính và chiều cao để xác định độ thay đổi của khối bột. + Bánh sau khi đã nướng, dùng thước đo đường kính và chiều cao để xem sự thay đổi của bánh. - Khả năng nở của bột được đánh giá qua hiệu số (D-d) và (H-h)cm. (D-d) và (H-h) càng lớn thì khả năng nở của bột càng cao. Trong đó : D : là đường kính khối bột sau khi ủ/sau khi nướng (cm). d : là đường kính khối bột trước khi ủ/trước khi nướng (cm). H : là chiều cao khối bột sau khi ủ/sau khi nướng (cm). h : là chiều cao khối bột trước khi ủ/trước khi nướng (cm). Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4 2.6.5.4 Độ ẩm bánh mì - Nguyên tắc: Dùng nhiệt để làm bay hơi nước có trong mẫu. Từ chênh lệch khối lượng mẫu trước và sau khi sấy, tính được độ ẩm của mẫu. - Tiến hành: Sấy mẫu ở 100 – 1050C đến khối lượng không đổi, khi đó lượng nước tự do có trong mẫu sẽ bốc hơi hết. - Công thức tính độ ẩm (W): W% = ((M1 - M2)/M) x 100 Trong đó: W: độ ẩm (%) M1 là khối lượng petri và mẫu trước khi sấy (g) M2 là khối lượng đĩa petri và mẫu sau khi sấy (g) M là khối lượng mẫu đem sấy (g) Số liệu được xử lí bằng phần mềm SAS 9.4 54
66. Đồ án tốt nghiệp Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp. 3.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào; khảo sát về sinh lý, sinh hóa Các chủng vi khuẩn lactic có thể bị suy yếu và nhiễm các loài vi sinh vật khác trong quá trình bảo quản. Do đó, người thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm này nhằm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử. Các thử nghiệm catalase tạo điều kiện cho việc phát hiện các enzyme catalase trong vi khuẩn. Phản ứng catalase là rất cần thiết để phân biệt từ catalase âm Streptococcaceae đến catalase dương Micrococcaceae. Một số báo cáo ghi nhận giá trị của phản ứng catalase trên các chủng Enterobacteriaceae. Các thử nghiệm catalase cũng rất có giá trị trong việc phân biệt các vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí bắt buộc, ví dụ như các vi khuẩn kỵ khí thường thiếu các enzyme này. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn catalase âm tính (theo khóa phân loại Bergey). Qua các khảo sát (Bảng 3.1), 2 chủng Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 đã đảm bảo được chủng thuần khiết lactic, đảm bảo được sự chính xác của đề tài. Bảng 3.1: Khảo sát đặc điểm hình thái và sinh lý của vi khuẩn Lactobacillus spp. Lactobacillus sp.L5 Lactobacillus sp.C1 Khuẩn lạc trên Khuẩn lạc tròn, to, nhẵn, lồi, Khuẩn lạc to, tròn, nhẵn, lồi, mép MRS agar bóng, màu trắng đục, rìa tròn gợn sóng, màu trắng đục Mô tả hình thái Vi khuẩn hình que hơi ngắn Vi khuẩn hình que dài vi khuẩn Nhuộm gram (+) (+) Nhuộm bào tử (-) (-) Catalase (-) (-) Chú thích: (+) dương tính – (-) âm tính 55
67. Đồ án tốt nghiệp A B Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc trên MRS agar A: Lactobacillus sp.L5 – B: Lactobacillus sp.C1 A B Hình 3.2: Kết quả nhuộm Gram A: Lactobacillus sp.L5 – B: Lactobacillus sp.C1 3.1.2 Khả năng sinh acid Vì đề tài khảo sát sự ảnh hưởng của vi khuẩn lactic khi đồng lên men với nấm men mà acid lactic (0,1-0,3%) có tác dụng làm gluten trương nở và liên kết với tinh bột tốt hơn, làm chậm quá trình thoái hoá tinh bột (Bùi Đức Hợi, 2009). Để khảo sát chủng lactic sử dụng có khả năng bảo quản tốt bánh mì về mặt tính chất, người thực hiện đề tài khảo sát khả năng sinh acid lactic của Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1. Chủng Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 thuộc nhóm vi khuẩn lên men đồng hình (Lưu Đại Kim Phượng, 2016). Hàm lượng % acid lactic của 2 chủng 56
68. Đồ án tốt nghiệp vi khuẩn lactic được nuôi cấy trong môi trường MRS broth ở 37oC trong 24 giờ (Bảng 3.2). Kết quả cho thấy được với chủng Lactobacillus sp.L5 (1.83%) sinh acid cao hơn Lactobacillus sp.C1 (1.76%). Bảng 3.2: Độ acid (% TA) của chủng Lactobacillus spp. Lactobacillus sp.L5 Lactobacillus sp.C1 %TA 1.83 ± 0.02 1.76 ± 0.01 (Kết quả được so sánh theo dòng dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 95%) 3.1.3 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp. in vitro Aspergillus niger là một loại nấm nhiệt có khả năng sinh trưởng mạnh trong điều kiện thời tiết nóng ẩm (Metzger, 2008). A.niger là một loại nấm phổ biến phát triển rất nhanh của các chi Aspergillus. Nó gây ra một căn bệnh được gọi là nấm mốc đen lên bánh mì. Phương pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture Method) trên môi trường rắn theo mô tả của Brunner và cộng sự (2005) là phương pháp dễ thực hiện và thể hiện rõ nét sự ức chế của vi khuẩn đối với nấm trong thời gian ngắn. Nên người thực hiện đề tài chọn phương pháp ria 2 đường vi khuẩn cùng với nấm A.niger làm VSV chỉ thị trong khảo sát in vitro. Kết quả được thể hiện qua Bảng 3.2. Ta có tỷ lệ đối kháng Lactobacillus sp.L5 (65.15%) và Lactobacillus sp.C1 (59.87%) tương đương nhau. Bảng 3.3: Tỉ lệ ức chế của vi khuẩn Lactobacillus spp. với nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn Vi khuẩn Tỷ lệ đối kháng (%) Lactobacillus sp.L5 65.15 ± 12.00 Lactobacillus sp.C1 59.87 ± 12.02 (Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 95%) 57
69. Đồ án tốt nghiệp TỶ LỆ ĐỐI KHÁNG NẤM 80.00 60.00 40.00 20.00 0.00 L5 C1 Hình 3.3: Đồ thị khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 A B C Hình 3.4: Đối kháng nấm Aspergillus niger A: Đĩa đối chứng – B: Đĩa kháng nấm chủng Lactobacillus sp.C1 – C: Đĩa kháng nấm chủng Lactobacillus sp.L5 58
70. Đồ án tốt nghiệp 3.2 Xây dựng đường chuẩn 3.2.1. Lactobacillus spp. Mục đích: Xác định mật độ tế bào vi khuẩn lactic để bổ sung vào bánh mì. Đường chuẩn Đường chuẩn Lactobacillus sp.L5 Lactobacillus sp.C1 0.5 0.5 0.4 0.4 y = 0.2784x - 1.948 y = 0.3052x - 1.4226 0.3 R² = 0.9133 0.3 R² = 0.9251 0.2 0.2 OD600nm OD600nm 0.1 0.1 0 0 6.8 7.3 7.8 8.3 4.5 5 5.5 6 log cfu/ml log cfu/ml Hình 3.5: Đường chuẩn chủng vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 3.2.2. Nấm mốc Aspergillus niger Mục đích: Xác định mật độ bào tử nấm để cảm nhiễm bánh mì khảo sát sự đối kháng. Đường chuẩn Aspergillus niger ĐN3 0.4 y = 0.2856x - 1.5645 0.3 R² = 0.9134 0.2 OD620nm 0.1 0 5.2 5.7 6.2 6.7 log tb/ml Hình 3.6: Đường chuẩn nấm mốc Aspergillus niger 59
71. Đồ án tốt nghiệp 3.3 Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng lên men bánh mì với nấm men  Lactobacillus spp. Để xác định được mật độ của dịch tăng sinh, người thực hiện đề tài tiến hành pha loãng đo OD600nm, kết quả được thể hiện qua Bảng 3.4. Bảng 3.4: Kết quả mật độ Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 Lactobacillus sp.L5 Lactobacillus sp.C1 y = 0.2784x - 1.948 y = 0.3052x - 1.4226 OD600nm y 0.468 0.477 log (cfupha loãng/ml) x 8.678 6.224 cfu pha loãng/ml 10 476607551.934 1675387.744 tb pha cfu/ml loãng/ml x hệ 2.440 × 1011 5.489 × 1010 số pha loãng Vậy: ta xác định được mật độ vi khuẩn lactic trong bình tăng sinh + Lactobacillus sp.L5 là 1011(cfu/ml) => Để đạt được mật độ mong muốn là 1010(cfu/ml), 109(cfu/ml) và 108(cfu/ml), ta lần lượt pha loãng dịch gốc 10, 100 và 1000 lần. + Lactobacillus sp.C1 là 1010(cfu/ml) => Để đạt được mật độ mong muốn là 109(cfu/ml) và 108(cfu/ml), ta lần lượt pha loãng dịch gốc 10 và 100 lần.  Aspergillus niger ĐN3 Để xác định được mật độ của nấm, người thực hiện đề tài tiến hành pha loãng đo OD620nm, kết quả được thể hiện qua Bảng 3.5 60
72. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.5: Bảng tính mật độ nấm mốc để cảm nhiễm. y = 0.2856x - 1.5645 OD620nm y 0.428 log (tb pha loãng/ml) x 6.98 tb pha loãng/ml 10 9474157.849 tb pha loãng/ml x hệ tb/ml 9.474 × 106 số pha loãng Vậy mật độ nấm mốc là: 106 (bt/ml). Để đạt được mật độ mong muốn là 105(bt/ml) và 104(bt/ml), ta lần lượt pha loãng dịch gốc 10 và 100 lần. Sử dụng bình xịt để cảm nhiễm, thể tích cảm nhiễm cho 1 mẫu bánh mì tương ứng 100gr bột mì là 1ml dịch nấm. Bảng 3.6: Bảng mật độ / khối lượng cần bổ sung Mật độ dự tính Mật độ thực tế Chất bổ sung (cfu/ml)/(bt/ml) Mẫu BML5-10 1010 Lactobacillus sp.L5 1.65 × 1010 cfu/g Mẫu BML5-9 109 Lactobacillus sp.L5 1.65 × 109 cfu/g Mẫu BML5-8 108 Lactobacillus sp.L5 1.65 × 108 cfu/g Mẫu BMC1-10 1010 Lactobacillus sp.C1 3.71 × 1010 cfu/g Mẫu BMC1-9 109 Lactobacillus sp.C1 3.71 × 109 cfu/g Mẫu BMC1-8 108 Lactobacillus sp.C1 3.71 × 108 cfu/g Mẫu BMTL - - - Mẫu BMNa - C6H5COONa 1gr Mẫu BMCa - C6H10CaO4 1gr Mật độ nấm 105 Aspergillus niger 9.47 × 103 bt/g Mật độ nấm 104 Aspergillus niger 9.47 × 102 bt/g 61
73. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7: Kết quả đối kháng nấm giữa các mẫu Mật độ nấm Cảm nhiễm Cảm nhiễm (bt/ml) nấm A.niger nấm A.niger Không cảm nhiễm mật độ 104 mật độ 105 Mẫu Mật độ (cfu/ml) Thời gian sau nướng bắt đầu xuất hiện tơ nấm (ngày) 10 BML5-10 10 3.83de ± 0.29 3.67b ± 0.29 7.50ab ± 1.80 9 BML5-9 10 4.17cde ± 0.29 3.83b ± 0.58 7.50ab ± 0.87 8 BML5-8 10 4.83abc ± 0.29 4.50ab ± 0.50 7.50ab ± 0.50 10 BMC1-10 10 4.33bcde ± 0.29 3.83b ± 0.29 7.67ab ± 2.08 9 a a BMC1-9 10 5.33 ± 0.58 5.00 ± 0.87 8.00ab ± 1.32 8 BMC1-8 10 5.17ab ± 0.58 4.50ab ± 0.00 7.33ab ± 0.76 BMNa 3.67e ± 0.29 3.50b ± 0.00 7.83ab ± 1.76 BMCa 4.67abcd ± 0.29 4.17ab ± 0.29 10.00a ± 1.80 BMTL 3.67e ± 0.29 3.50b ± 0.00 5.50b ± 0.50 (Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 95%) Dựa vào kết quả Bảng 3.7, khi không cảm nhiễm nấm, mẫu BMCa có số ngày bảo quản lâu nhất còn mẫu BMTL có số ngày bảo quản ít nhất. Các mẫu còn lại tương đương nhau. Khi cảm nhiễm nấm (105bt/ml) ở mật độ cao có thể dẫn đến sai lệch về kết quả. Kết quả cho thấy mẫu BMC1-9 số ngày bảo quản lâu nhất và BMCa, BML5-8, BMC1-8 có số ngày bảo quản tương đương nhau. Còn những mẫu BML5-10, BML5- 9, BMC1-10, BMNa và BMTL số ngày bảo quản ít nhất. 62
74. Đồ án tốt nghiệp Khi cảm nhiễm nấm (104bt/ml) ở mật độ thấp hơn, mẫu BMC1-9 có số ngày bảo quản lâu nhất và BMNa, BMTL số ngày bảo quản ít nhất. Còn những mẫu được bổ sung vi khuẩn lactic BML5-10, BML5-9, BML5-8, BMC1-10, BMC1-8 và mẫu bổ sung chất bảo quản BMCa số ngày bảo quản tương đương nhau. Điều này cho thấy rằng, mẫu BML5 và BMC1 là 2 mẫu có bổ sung vi khuẩn lactic có khả năng sinh hợp chất giúp kháng nấm bảo quản bánh mì trong thời gian dài tương đương với mẫu BMCa là mẫu có bổ sung chất bảo quản sử dụng phổ biến hiện nay. Và mẫu BMNa cũng là chất bảo quản nhưng do hoạt động tốt môi trường acid nên khi sử dụng bảo quản bánh mì không đạt hiêu quả cao bằng mẫu BMCa là chất hoạt động động tốt ở môi trường không cần acid. Đồng thời cũng cho thấy tính khả thi của đề tài đưa ra là sử dụng vi khuẩn lactic kéo dài thời gian bảo quản thay thế cho hợp chất bảo quản. Hình 3.7: Khảo sát đối kháng in vivo 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì 3.4.1. Đánh giá cảm quan 3.4.1.1 Khảo sát mức độ ưa thích sản phẩm bánh mì có bổ sung vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus sp.C1 ở các mật độ khác nhau 63
75. Đồ án tốt nghiệp Qua kết quả dựa trên cơ sở lí hoá, nhận thấy được lợi ích của việc bổ sung vi khuẩn lactic vào bánh mì sẽ giúp cải thiện được chất lượng của bánh. Thế nhưng, trên thực tế người tiêu dùng ít dựa vào các chỉ tiêu lí hoá để đánh giá chất lượng bánh mì mà chủ yếu quan tâm đến giá trị cảm quan sản phẩm. Điều quan ngại là mùi chua đặc trưng của acid lactic được sản sinh bởi vi khuẩn lactic bổ sung vào bánh mì có thể gây ảnh hưởng đến giá trị cảm quan. Chính vì vậy, người làm đề tài bố trí thí nghiệm cảm quan với phép thử Cho điểm thị hiếu nhằm tìm hiểu mức độ ưa thích đối với các mẫu sản phẩm được bổ sung chủng LAB với các mật độ LAB khác nhau và thu được kết quả thể hiện qua Bảng 3.8 và Bảng 3.9. Bảng 3.8: Mức độ ưa thích của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5 Mẫu Mật độ Mức độ ưa thích (điểm) (cfu/ml) 10 BML5-10 10 4.97b 9 BML5-9 10 5.67a 8 BML5-8 10 5.22ab (Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 95%) Bảng 3.9: Mức độ ưa thích của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.C1 Mẫu Mật độ Mức độ ưa thích (điểm) (cfu/ml) 10 BMC1-10 10 4.73b 9 BMC1-9 10 6.37a 8 BMC1-8 10 6.87a (Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 99%) Biện luận: Theo kết quả đánh giá cảm quan như trên, cho thấy: Đối với mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5: mẫu BML5-8 và mẫu BML5-10 có mức độ ưa thích không có sự khác biệt. Tuy nhiên, mức độ ưa thích của 2 mẫu này thấp hơn mẫu BML5-9. 64
76. Đồ án tốt nghiệp Đối với mẫu bánh bổ sung Lactobacillus sp.C1: mẫu BMC1-9 và mẫu BMC1- 8 không có sự khác biệt về giá trị cảm quan. Riêng mẫu BMC1-10 ít được ưa thích hơn. Do ở cả 2 mẫu A của chủng L5 và C1 với mật độ tế bào LAB khá cao dẫn đến sinh acid lactic và enzyme protease, enzyme amylase nhiều làm kiềm hãm những biến đổi sinh lý, sinh hóa trong quá trình lên men của khối bột nhào: enzyme protease phá hủy mạng gluten và enzyme amylase sinh dextrin làm giảm chất lượng bột nhào, sinh acid lactic quá nhiều làm bánh có vị chua. Dựa vào kết quả đánh giá cảm quan, cho thấy người thử ưa thích mẫu bánh mì bổ sung vi khuẩn lactic ở 2 mật độ 108 (cfu/ml) và 109 (cfu/ml) và các thí nghiệm sinh lý, sinh hóa về nấm men thường kết hợp với LAB trong bột chua với tỷ lệ nấm men/LAB thường là 1:100 (Gobbetti và cộng sự, 1994; Ottogalli và cộng sự, 1996) kết hợp thử nghiệm in vivo mẫu có mật độ 109 (cfu/ml) kéo dài số ngày bảo quản được lâu hơn, người thực hiện đề tài chọn 2 mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5 ở mật độ 109 (cfu/ml) và Lactobacillus sp.C1 ở mật độ 109 (cfu/ml) để thực hiện thêm khảo sát mức độ ưa thích với mẫu bổ sung chất bảo quản và mẫu bánh mì thường cùng với khảo sát độ nở và độ ẩm. A B Hình 3.8: Mẫu bánh mì bổ sung 2 chủng lactic chuẩn bị đánh giá cảm quan A: Mẫu bổ sung Lactobacillus sp.L5 – B: Mẫu bổ sung Lactobacillus sp.C1 65
77. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.9: Tiến hành thí nghiệm cảm quan mẫu bổ sung 2 chủng lactic. 3.4.1.2 Khảo sát mức độ ưa thích về màu sắc, độ xốp, mùi vị của bánh mì có bổ sung vi khuẩn lactic với bánh mì thường và bánh mì có chất bảo quản Để khảo sát và so sánh xem liệu những mẫu bánh mì có bổ sung LAB có được người tiêu dùng ưa thích bằng những mẫu có bổ sung chất bảo quản không, người thực hiện đề tài tiến hành buổi thí nghiệm cảm quan với phép thử Cho điểm thị hiếu để đánh giá mức độ ưa thích về các chỉ tiêu màu sắc, độ xốp, mùi, vị của mẫu bánh mì bổ sung LAB cùng với mẫu bánh mì bổ sung Canxi propionate, Natri benzoate và mẫu bánh mì thường. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.10 và Bảng 3.11. Bảng 3.10: Kết quả đánh giá cảm quan mức độ ưa thích về các chỉ tiêu màu sắc, độ xốp, mùi, vị của các mẫu bánh mì Mẫu Mức độ yêu thích (điểm) Mật độ Màu sắc Độ xốp Mùi Vị (cfu/ml) 9 BML5 10 6.33b 6.63ab 6.72a 6. 68ab 9 BMC1 10 6.33b 6.27 6.58a 6.30b BMNa 6.32 6.07b 5.68b 5.38c BMCa 7.00a 6.90a 6.68a 6.92a BMTL 6.75ab 6.32ab 6.55a 6.90ab (Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 99%) 66
78. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.11: Đánh giá chung về mức độ ưa thích của các mẫu bánh mì Mẫu Mức độ yêu thích (điểm) Mật độ (cfu/ml) Đánh giá chung 9 BML5 10 6.85ab 9 BMC1 10 6.30bc BMNa 5.52d BMCa 6.88a BMTL 6.10c (Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 99%) Biện luận: Dựa vào điểm trung bình cảm quan về các chỉ tiêu màu sắc, độ xốp, mùi, vị của 5 mẫu bánh mì khảo sát cho thấy: mẫu BMCa có điểm mức độ ưa thích cao nhất trong khi mẫu BMNa có mức điểm thấp nhất. Qua thí nghiệm cảm quan cũng nhận thấy rằng tất cả các mẫu bổ sung vi khuẩn LAB có những tính chất về độ xốp, mùi và vị tương đương với mẫu bánh mì thường và mẫu bánh mì bổ sung Canxi propionate là chất bảo quản được sử dụng phổ biến, trong khi mẫu bổ sung Natri benzoat được đánh giá ở mức thấp nhất. Điều này cho thấy không có sự khác biệt về giá trị cảm quan, khẳng định tính khả thi của đề tài được đề ra do đó có thể sử dụng vi khuẩn LAB để thay thế cho chất bảo quản. Ngoài ra, ở thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì của vi khuẩn lactic cũng góp phần chứng minh giả thuyết kéo dài thời gian bảo quản của bánh mì. 67
79. Đồ án tốt nghiệp A B C D E Hình 3.10: Mẫu bánh mì chuẩn bị đánh giá cảm quan A: Mẫu bổ sung Lactobacillus sp.L5 – B: Mẫu bổ sung Lactobacillus sp.C1 C: Mẫu bổ sung Natri benzoate – D: Mẫu bổ sung Canxi propionate E: Mẫu không bổ sung Hình 3.11: Tiến hành thí nghiệm cảm quan 3.4.2 Đánh giá độ nở Độ nở của bánh thể hiện khả năng lên men của nấm men và vi khuẩn lactic. Tác nhân làm bánh mì nở là CO2 sinh ra trong quá trình lên men và được giữ lại trong các mạng gluten. Khi nướng bánh ở nhiệt độ cao, CO2 sẽ tăng thể tích, mạng gluten sẽ căng ra và tạo thành những túi chứa CO2. Khi nhiệt độ cao hơn, CO2 sẽ thoát ra khỏi túi chứa nó và tạo ra những lỗ xốp trong bánh, kết quả là bánh có độ xốp. Khả năng lên men càng mạnh, độ xốp của bánh càng lớn, bánh càng nở và thể tích bánh càng tăng. 68
80. Đồ án tốt nghiệp Để đánh giá khả năng lên men của các mẫu có bổ sung chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ nem chua vs cơm mẻ, thí nghiệm tiến hành so sánh độ nở của các mẫu thông qua sự thay đổi về chiều cao và bề ngang của mỗi chiếc bánh sau quá trình lên men và nướng, kết quả thể hiện ở các bảng sau: Bảng 3.12: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của mẫu bánh mì BML5 Mẫu Độ nở sau khi Mẫu Độ nở sau khi ủ (cm) nướng (cm) Mật độ Ngang Cao Mật độ Ngang Cao (cfu/ml) (cfu/ml) 10 10 BML5-10 10 0.87a 1.00a BML5-10 10 1.20a 1.27a 9 9 BML5-9 10 1.07a 0.93a BML5-9 10 1.27a 1.17a 8 8 BML5-8 10 1.00a 0.80a BML5-8 10 1.30a 0.97a (Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 95%) Mẫu được bổ sung vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 giữa các mật độ không có sự khác biệt về độ nở sau khi ủ cũng như sau khi nướng (Bảng 3.12). Bảng 3.13: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của mẫu bánh mì BMC1 Mẫu Độ nở sau khi Mẫu Độ nở sau khi ủ (cm) nướng (cm) Mật độ Ngang Cao Mật độ Ngang Cao (cfu/ml) (cfu/ml) 10 10 BMC1-10 10 1.00a 0.93a BMC1-10 10 1.17a 1.20a 9 9 BMC1-9 10 1.10a 0.97a BMC1-9 10 1.30a 1.23a 8 8 BMC1-8 10 1.07a 0.67b BMC1-8 10 1.20a 1.00a (Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 95%) 69
81. Đồ án tốt nghiệp Còn ở mẫu được bổ sung vi khuẩn Lactobacillus sp.C1, chiều cao mẫu BMC1- 8 có độ nở thấp hơn với 2 mẫu còn lại BMC1-10 và BMC1-9. Sau khi nướng, các mẫu BMC1 không có sự khác biệt (Bảng 3.13). Bảng 3.14: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của các mẫu bánh mì Mẫu Độ nở sau khi ủ Mẫu Độ nở sau khi (cm) nướng (cm) Mật độ Ngang Cao Mật độ Ngang Cao (cfu/ml) (cfu/ml) 9 9 BML5 10 0.98b 0.91b BML5 10 1.30b 1.17b 9 9 BMC1 10 1.05b 0.86b BMC1 10 1.27b 1.23b BMNa 0.37c 0.53c BMNa 0.90c 0.80c BMCa 1.60a 0.43c BMCa 2.00a 1.60a BMTL 1.20b 1.37a BMTL 1.40b 1.50a (Kết quả được so sánh theo cột dựa trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy 99%) Sau khi ủ, mẫu BMTL có xu hướng nở tốt nhất, còn ở mẫu BMNa nở kém nhất. Hai mẫu BML5, BMC1 nở tương đương nhau nhưng nở kém hơn BMCa và BMTL. Xét về các mẫu bánh mì sau khi hoàn thành, mẫu BMCa có độ nở tốt nhất và mẫu BMNa nở kém nhất. Hai mẫu BML5, BMC1 nở tương đương nhau nhưng nở kém hơn BMCa và BMTL. (Bảng 3.14) Đối với mẫu BMTL là mẫu bánh mì thường không bị ức chế bởi một chất nào nên nấm men hoạt động tốt giúp sinh CO2 làm tăng thể tích bánh. Ở 2 mẫu có bổ sung vi khuẩn lactic BML5 và BMC1 vì do sinh acid lactic nên phần nào làm kiềm hãm sự hoạt động của nấm men và như khảo sát khả năng sinh acid thì chủng Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 sinh lượng acid tương đương nhau nên ở thí nghiệm khảo sát độ nở cũng có độ nở tương đương nhau. Do mẫu BMCa là mẫu được bổ sung Canxi propionate bản chất không đòi hỏi môi trường acid như benzoate mà trong 70
82. Đồ án tốt nghiệp quá trình lên men nấm men có thể không tạo ra được môi trường acid thích hợp cho benzoate hoạt động nên so 2 mẫu bổ sung chất bảo quản hóa học thì BMCa nở tốt hơn BMNa. Và qua khảo sát, ta cũng thấy được, mẫu bổ sung vi khuẩn lactic có độ nở tương đương với mẫu bổ sung Canxi propionate là chất bảo quản được sử dụng phổ biến. Điều này cho thấy không có sự khác biệt về mặt tính chất khi sử dụng vi khuẩn lactic làm chất bảo quản, khẳng định tính khả thi của đề tài được đề ra. A B C Hình 3.12: Độ nở của bánh mì A: Mẫu sau khi nhào – B: Mẫu sau khi ủ – C: Mẫu sau khi nướng 3.4.3 Đánh giá độ ẩm Sau khi nướng, làm nguội và trong quá trình bảo quản bánh mì đã xảy ra các biến đổi phân bố ẩm giữa vỏ và ruột bánh làm giảm độ ẩm của bánh, thay đổi tính chất cơ cấu ruột bánh, bánh trở nên dẻo và đàn hồi. Nhằm so sánh sự khác biệt lượng nước sau khi nướng và sự thay đổi sau khi bảo quản 7 ngày trong các mẫu bánh mì, người thực hiện đề tài thực hiện thí nghiệm đánh giá độ ẩm của bánh mì. 71