›

Đồ án Sản xuất nấm Paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng Meilodogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu

pdf 100 trang thiennha21 12/04/2022 3820
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Sản xuất nấm Paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng Meilodogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_san_xuat_nam_paecilomyces_sp_de_phong_tru_tuyen_trung.pdf

Nội dung text: Đồ án Sản xuất nấm Paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng Meilodogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SẢN XUẤT NẤM PAECILOMYCES SP. ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG MEILODOGYNE SP. GÂY HẠI TRÊN CÂY HỒ TIÊU. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện : PHAN ÁNH NGÂN MSSV: 1211100132 Lớp: 12DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2016.
  2. LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân em dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai – giảng viên Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Đề tài được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Tất cả các số liệu, hình ảnh, các kết quả là nghiên cứu hoàn toàn trung thực. Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu có phát hiện sự gian lận em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Tp. HCM, ngày 15 tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện Phan Ánh Ngân i
  3. LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập tại trường đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường. Và đặc biệt, trong học kỳ này. Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của các thầy cô thì em nghĩ bài thu hoạch này của em rất khó có thể hoàn thiện được. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy. Bài báo cáo đồ án tốt nghiệp thực hiện trong khoảng thời gian 3 tháng. Bước đầu đi vào thực tế của em còn hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ. Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô và các bạn học cùng lớp để kiến thức của em trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn. Em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các thầy cô của trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM, đặc biệt là TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường đã tạo điều kiện cho em để em có thể hoàn thành tốt bài báo cáo đồ án tốt nghiệp này. Và em cũng xin chân thành cám ơn các thầy cô ở phòng thí nghiệm, các anh chị, các bạn đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành báo cáo đồ án tốt nghiệp. Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, cũng như là trong quá trình làm bài báo cáo, khó tránh khỏi sai sót đồng thời do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của Thầy/Cô để em học thêm được nhiều kinh nghiệm và áp dụng vào công việc sắp tới. Em xin chân thành cảm ơn ! ii
  4. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 MỤC ĐÍCH 2 NỘI DUNG 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 Giới thiệu về nấm Paecilomyces sp. 3 1.1.1. Phân loại khoa học 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái 4 1.1.3. Cơ chế tiết độc tố của nấm Paecilomyces 5 1.1.4. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến trùng 6 1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 7 Tổng quan về tuyến trùng Meloidogyne sp. gây bệnh bướu rễ trên cây hồ tiêu 11 1.2.1. Tổng quan về tuyến trùng ký sinh thực vật 11 1.2.2. Phân loại khoa học 14 Các nghiên cứu nước ngoài về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces sp. trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng 19 Các nghiên cứu trong nước về nhân nuôi và sử dụng Paecilomyces sp. trong phòng trừ tuyến trùng hại cây 22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24 iii
  5. Vật liệu nghiên cứu, thiết bị và hóa chất 24 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu 24 2.2.2. Thiết bị 24 2.2.3. Các loại môi trường sử dụng 25 Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1. Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse sp. 27 2.3.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng 28 2.3.3. Các phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật 28 2.3.4. Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) 29 2.3.5. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. trên các loại môi trường nhân sinh khối (theo Lê Hữu Phước, 2009) 30 2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp 30 2.3.7. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 31 2.3.8. Khảo sát khả năng kí sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne sp. của nấm Paecilomyces sp 35 2.3.9. Đánh giá tác động của chế phẩm nấm Paecilomyces sp. trong việc phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. trên cây hồ tiêu 36 2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 Kết quả hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp. 38 Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm, trừ sâu đến sự phát triển của Paecilomyces sp 39 iv
  6. 3.2.1. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu đến sự phát triển của Paecilomyces sp. 39 3.2.2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của Paecilomyces sp. 41 3.2.3. Khảo sát khả năng đồng sinh trưởng của nấm Trichoderma sp. và Paecilomyces sp 43 Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển của nấm Pacilomyces sp. (môi trường lỏng) 44 3.3.1. Khảo sát môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces sp 44 3.3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển của nấm Paecilomyces sp. (môi trường rắn) 49 Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces sp 52 3.4.1. Trong điều kiện phòng thí nghiệm 52 3.4.2. Trên đồng ruộng 55 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 Kết luận 58 Kiến nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Tài liệu tiếng việt 59 Tài liệu tiếng anh 59 Tài liệu từ internet 61 PHỤ LỤC 1 v
  7. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CDB: Czapeck – Dox. CMB: Complete Media NSC: ngày sau cấy. NT: nghiệm thức. PDA: Potato D – Glucose Agar SDAY1: Sabourand dextrose Yeast SDAY3: Sabourand dextrose Yeast bổ sung khoáng. vi
  8. DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1. Bố trí thí nghiệm 31 Bảng 2. 2. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thuốc trừ sâu 32 Bảng 2. 3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thuốc trừ nấm 33 Bảng 2. 4. Bố trí thí nghiệm khả năng đồng sinh trưởng của Trichoderma sp. và Paecilomyces sp 35 Bảng 2. 5. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Paecilomyces sp. 37 Bảng 3. 1. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường trừ nấm. . 40 Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp 40 Bảng 3. 3. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. 41 Bảng 3. 4. Tỷ lệ khuẩn lạc bị ức chế 41 Bảng 3. 5. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. 43 Bảng 3. 6. Đường kính tản nấm Trichoderma sp. khi cấy đồng thời với nấm Paecilomyces sp 43 Bảng 3. 7. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. sau thời gian nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc. 44 Bảng 3. 8. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. tính theo logarit 46 Bảng 3. 9. Số lượng bào tử sau 14 ngày nuôi cấy 51 Bảng 3. 10. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. nhân nuôi trên khay ngô mảnh và gạo tấm 52 Bảng 3. 11. Tỷ lệ phần trăm số tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị nấm Paecilomyces sp. ký sinh. 53 Bảng 3. 12. Đánh giá cấp hại của tuyến trùng trên cây hồ tiêu. 55 vii
  9. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces sp. được nuôi nấy trên môi trường PDA. 4 Hình 1.2. Nấm Paecilomyces sp, được chụp dưới kính hiển vi 5 Hình 1.3. Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin) 6 Hình 1.4. Cấu tạo tuyến trùng ký sinh thực vật 15 Hình 1.5. Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp. 17 Hình 1.6. Một số chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp. phòng trừ tuyến trùng. 22 Hình 3.1. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA. 38 Hình 3.2. Tản nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc hóa học. (A: Actara 25WG; B: Sherpa 25EC; C: Plutel 1,8 EC; D: Oshin 20WP; E: đối chứng) 39 Hình 3.3. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc hóa học (A: Antracol 70WP; B: Cup 2,9 SL; C: Saizole 5SC; D: Carbenzin 50WP; E: đối chứng) 42 Hình 3.4. Đĩa nấm khi cấy đồng thời Trichoderma sp. và Paecilomyces sp. 44 Hình 3.5. Dịch nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường. (A: Môi trường CDB; B: Môi trường CMB; C: Môi trường SDAY1; D: Môi trường SDAY3). 45 Hình 3.6. Mật độ bào tử tính theo logarit trên bốn loại môi trường lỏng. 48 Hình 3.7. Hình nấm Paecilomyces sp. được nuôi cấy trên 4 loại môi trường rắn(A: môi trường ngô mảnh, B: môi trường gạo tấm, C: môi trường lúa, D: môi trường cám) 50 Hình 3.8. Mật độ tế bào sau 14 ngày lên men rắn trên 4 loại môi trường. 51 Hình 3.9. Nấm Paecilomyces sp. nhân nuôi trên khay. 52 Hình 3.10. Tỷ lệ tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị chết ở các ngày sau khi lây nhiễm. Error! Bookmark not defined. Hình 3.11. Nấm Paecilomyces sp. tấn công con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne sp.; (A, B: con cái tuyến trùng trước khi lây nhiễm nấm; C, E: con cái tuyến trùng bị lây nhiễm nấm được soi dưới kính hiển vi; D, F: con cái và con cái viii
  10. mang túi trứng của tuyến trùng bị nhiễm nấm Paecilomyces sp. soi dưới kính hiển vi sau khi nhuộm Methylene blue). 54 Hình 3.12. Người dân pha chế phẩm Paecilomyces sp. tưới vào gốc cây hồ tiêu 56 Hình 3.13. Trước khi tưới. 57 Hình 3.14. Sau khi tưới. 57 ix
  11. Đồ án tốt nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ Hồ tiêu được xem là một trong những cây trồng chủ lực chính của Việt Nam. Hồ tiêu (piper nigrumL.) được xem là “vua của các loại gia vị” và trở thành sản phẩm nông nghiệp quan trọng nhất của Việt Nam. Năm 2015, mặc dù chưa có thống kê đầy đủ, nhưng dự báo diện tích hồ tiêu cả nước đã vượt con số 100.000 ha (Theo số liệu Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam, 2015). Tuy nhiên, cũng như các ngành nông nghiệp khác, ngành hồ tiêu cũng phải đối mặt với các vấn đề về thiệt hại năng suất gây nên do dịch hại. Do đó, bảo vệ thực vật là một trong những phần rất quan trọng trong việc nâng cao năng suất hồ tiêu vì dịch hại được xem như nguyên nhân chính làm giảm năng suất và chất lượng hồ tiêu (Trịnh Thị Thu Thủy và ctv, 2012). Bên cạn các loại bệnh hại, tuyến trùng là dịch hại nguy hiểm trên cây hồ tiêu. Theo kết quả điều tra của Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp miền Nam thì tuyến trùng xuất hiện phổ biến ở tất cả các vùng trồng tiêu trong cả nước với mức độ gây hại cao. Việc tìm ra giải pháp để kiếm soát tác nhân tuyến trùng gây hại rất quan trọng. Hiện nay, đa số nông dân thường sử dụng các loại thuốc hóa học để phòng trừ. Tuy có tác dụng nhanh và hiệu quả nhưng các loại thuốc hóa học lại gây ra tác động xấu đối với môi trường, để lại tồn dư trong nông sản, tăng tính kháng của sâu bệnh làm cho việc phòng trừ trở nên khó khăn hơn. Vì vậy, hiện nay, các tác nhân sinh học là một trong những hướng tiềm năng trong việc phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu. Trên thế giới hiện nay có rất nhiều nghiên cứu sử dụng tác nhân sinh học để phòng trừ tuyến trùng. Đặc biệt, nấm Paecilomyces sp. được xem là một trong những loài nấm diệt tuyến trùng giệu quả cao nhất (Burges H. D., 1998; Butt T. M và Copping L., 2000). Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về nấm Paecilomyces vẫn còn hạn chế. Năm 2014, Phùng Lê Kim Yến thuộc trường đại học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh, phân lập được chủng nấm Paecilomyces sp. và đã chứng minh chủng nấm này có hiệu lực trừ tuyến trùng tốt. Tuy nhiên, tác giả chưa đưa ra được môi trường sản xuất thích hợp đối với chủng nấm này để ứng dụng trên đồng ruộng. Vì vậy, sinh viên chọn đề tài: “Sản xuất nấm Paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu”. 1
  12. Đồ án tốt nghiệp MỤC ĐÍCH Chọn môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces sp. và đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng của chế phẩm nấm Paecilomyces sp. NỘI DUNG ❖ Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp. ❖ Khảo sát ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ❖ Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ❖ Đáng giá khả năng trừ tuyến trùng hại hồ tiêu trong điều kiện in vitro và trên đồng ruộng. 2
  13. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu về nấm Paecilomyces sp. 1.1.1. Phân loại khoa học Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceace Chi: Paecylomyces Chi Paecilomyces do Bainier mô tả năm 1907, sau đó được nhiều tác giả chấp nhận chi mới này và bổ sung nhiều loài mới. Paecilomyces lilacinum đã được phân loại trong phần Isarioidea, mà trạng thái hoàn hảo vẫn chưa được tìm thấy. Nấm Paecilomyces spp. có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 31 loài và phân bố trên diện rộng trong đó có thể kể đến là Paecilomyces farinosus, Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces amoeneroseus, Paecilomyces javanicus, Paecilomyces tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces lilacinus (Dilip K. Arora, P. D. Bridge, Deepak Bhatnagar, 2004). Nấm Paecilomyces sp. có rất nhiều loài, có phổ ký sinh tuyến trùng rất rộng, cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Nấm Paecilomyces spp. dễ dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa thực vật. Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên. Một số loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như: - Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết tuyến trùng - Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất - Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, tuyến trùng. - Paecilomyces lilacinus phân lập từ xác bã hữu cơ, đôi khi ở tuyến trùng chết, rừng cao su, đất trồng tiêu (Crop Protection Compennium, 2002). 3
  14. Đồ án tốt nghiệp 1.1.2. Đặc điểm hình thái Paecilomyces sp. là loài nấm sợi được tìm thấy trong đất hay xác tuyến trùng. Khi được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo nấm thường phát triển khá chậm, có dạng thảm nhung, dạng bó sợi và thường lúc đầu có màu trắng sau đố khi bào tử phát triển thì chuyển sang màu hồng nhạt, màu tím hay màu lục nhạt (nên thường được gọi là nấm tím) tùy vào từng loài. Cũng có loài màu nâu hay vàng sẫm. Sợi nấm mềm, có vách, trong suốt và rộng từ 2,5 - 4 µm (Wikipedia). Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, mức độ phân nhánh của nấm Paecilomyces sp. thường lớn hơn nấm mốc xanh Penicillium, gốc cuống dạng bình phình to, phía trên nhỏ và uốn cong. Cuống bình thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều. Bào tử phân sinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Trần Văn Mão, 2002). Khuẩn lạc mọc theo đường tròn đồng tâm. Có thể phân biệt các loài khác nhau của Paecilomyces thông qua hình thái đại thể và vi thể. (Phùng Lê Kim Yến, 2014) Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces sp. được nuôi nấy trên môi trường PDA. (Nguồn: Thể bình gồm một phần đuôi phình to, thon dần ở phần đầu như một cái cổ. Bào tử trong chuỗi có nhiều dạng từ elip đến hình thoi. Bào tử có thành trơn hoặc hơi nhám, không có bào tử chống chịu. 4
  15. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Nấm Paecilomyces sp, được chụp dưới kính hiển vi (Nguồn: 1.1.3. Cơ chế tiết độc tố của nấm Paecilomyces Khi được nuôi cấy lên men chìm người ta đã chiết tách được hoạt chất sinh học có tên gọi là leucinostatins (còn gọi là paecilitoxin). Leucinostatins là một peptide trung tính với cấu trúc gồm: α - aminoisobutyric acid, L-leucine, β - alanine và theo sau bởi 3 acid amin bất thường (L – threo – β - hydroxy leucine, 2 – amino – 2 – hydroxy – 4 – methyl – 8 oxodecanoicacid và cis – 4 – methyl – L - proline (theo Mori et al. 1982). Leucinostatins có 6 loại đã được mô tả là A, B, C, D, E, F. Leucinostatins có khả năng kháng khuẩn, chống lại vi khuẩn Gram dương và nhiều loại nấm (theo Fukushima et al. 1983 a,b). Tuy nhiên trong cơ chế kiểm soát tuyến trùng không có sự tham gia của loại độc tố này. Tùy từng loài Paecilomyces khác nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriunbin, viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng. 5
  16. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin) 1.1.4. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến trùng Nhiều loài vi nấm được phân lập từ trứng tuyến trùng sần rễ (Stirling và West, 1991). Được nghiên cứu nhiều nhất là Paecilomyces lilacinus và Paecilomyces chalmydosporia, chúng được xem là có khả năng ký sinh tuyến trùng hiệu quả nhất, có thể kí sinh cả trứng lẫn con cái (Siddiqui và Mahmood, 1996). Có hai rào cản đối với nấm kí sinh tuyến trùng khi xâm nhiễm kí chủ là lớp biểu bì ấu trùng tuổi 2 (J2) và vỏ trứng. Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình xâm nhiễm là khả năng tiết enzyme protease và chitinase, bởi vì vỏ trứng được cấu tạo bởi 3 lớp riêng biệt: lớp vitelline bên ngoài, một lớp chitin và một lớp lipoprotein bên trong. Theo Llorca và Claugher (1990), trong quá trình xâm nhiễm, ở giai đoạn đầu, một mạng lưới sợi nấm phân nhánh tiếp xúc với vỏ trứng, sau đó chúng tiết enzyme để phân hủy vỏ trứng dẫn đến sự tan rã của lớp vitellin, sự phân hủy lớp chitin và lipoprotein (Morton et al., 2004). Các loài nấm khác nhau có khả năng xâm nhiễm tuyến trùng và trứng theo các phương thức khác nhau. Ban đầu, các bào tử và sợi nấm tiếp xúc với vỏ trứng. Nấm kí sinh tuyến trùng sử dụng cả cách thức hóa học (tiết enzyme) và cơ học. Nấm tiết ra các enzyme làm mềm vỏ trứng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mộc mầm, thông qua lổ thủng đó mầm của bào tử nấm sẽ xâm nhập vào bên trong 6
  17. Đồ án tốt nghiệp trứng tuyến trùng (Perry và Starr, 2009). Khả năng tiết enzyme chitinase và protease đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập trứng tuyến trùng của các loài nấm (Tikhonov et al., 20002) do vỏ trứng được cấu tạo từ chitin và protein tạo thành một cấu trúc sợi nhỏ và vô định hình (Wharton, 1980). Sau khi xâm nhập vào bên trong chúng hoạt động, tiết ra các độc tố làm tê liệt và phá hủy bên trong cơ thể tuyến trùng, hút dinh dưỡng để sinh sản, tiêu diệt trứng, ấu trùng, làm thay đổi sự trao đổi chất, hoạt động sinh lý, dẫn đến cái chết của tuyến trùng. 1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Các nhà khoa học cũng cho biết rằng nấm Paecilomyces spp. khi tấn công vào cơ thể tuyến trùng nếu gặp những điều kiện không thích hợp về nhiệt độ và ẩm độ, ánh sáng thì nấm sẽ tạo nên những thể chịu đựng (resistant structures) để đối phó lại với môi trường (Penland, 1982). 1.1.5.1 Nguồn dinh dưỡng Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces sp. cần nhiều dưỡng chất, nếu thiếu dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với tuyến trùng (theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). Carbon và Nitơ cùng với sự cân bằng giữa chúng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển cũng như sự hình thành bào tử của nấm Paecilomyces sp. (theo trích dẫn của Rayati và ctv, 2001). Các nghiên cứu cho biết, việc bổ sung nguồn đường có ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme của nấm (dẫn theo Rayati và ctv, 2001). Các tác giả còn cho biết sucrose là cơ chất tốt nhất (8,725 cm) cho sự tăng trưởng, tiếp theo là glucose (5,625 cm). Liang, K. (1981) đã cho biết nấm Paecilomyces tenuipes khi thiếu nguồn nitơ động vật tính gây bệnh giảm xuống rõ rệt (Hill, K. L, 1999, trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). 1.1.5.2 Nhiệt độ Nhiệt độ và độ ẩm tương đối được coi là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển, hình thành bào tử và lây nhiễm của các loài nấm kí sinh tuyến trùng (Ayyasamy và Baskaran, 2005). Nhiệt độ thích hợp cho nấm trong khoảng 20 – 25 0C, nhưng ở 25 0C nấm phát triển tốt nhất (Lee et al., 1999). Gần đây, Stather và 7
  18. Đồ án tốt nghiệp ctv đã công bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. và xác định nấm Paecilomyces sp. thích hợp ở nhiệt độ 28 0C. Nếu nhiệt độ cao bào tử dễ bị chết hoặc không hình thành, khi tấn công tuyến trùng nếu gặp điều kiện nhiệt độ, ẩm độ hay ánh sáng không thích hợp thì nấm Paecilomyces sp. sẽ tạo nên những thể chịu đựng để đối phó lại môi trường (theo Penland, 1982). Khi nuôi nấm Paecilomyces farinosus ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau cho thấy nhiệt độ 15 0C có lợi cho sự hình thành bào tử hơn là nhiệt độ 24 0C. Khi nuôi nấm Paecilomyces papillata, nhiệt độ thích hợp nhất là 24 - 26 0C, nhưng ở nhiệt độ 18 0C tỷ lệ ký sinh cao hơn 18 % so với nhiệt độ 25 0C. Nguyên nhân có thể là do dưới nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình, dị hóa, làm tăng quá trình đồng hóa, từ đó làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần Văn Mão, 2002). Julio J. D và ctv. (2004) đã chứng minh rằng rất ít hoặc không có bào tử nấm được tạo nên ở các nhiệt độ 12 0C, 16 0C và 30 0C. 1.1.5.3 Ẩm độ Nấm phát triển thích hợp ở ẩm độ 80 – 90% (Phạm Thị Thùy, 2004). Ẩm độ cao sẽ rất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, tuy nhiên ẩm độthấp sẽ có lợi cho duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm Paecilomyces sp. có khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm độ từ 0 – 34 % hơn là khi ẩm độ 75 %. 1.1.5.4 pH pH môi trường được quyết định bởi nồng độ ion H+, chính nồng độ ion H+ có ảnh hưởng đến hệ thống enzyme của tế bào và ảnh hưởng việc hấp thu khoáng, acid hữu cơ của tế bào nấm cho quá trình phát triển cũng như hình thành bào tử (Dasrupta, 1994). Nấm thường sống trong phạm vi pH = 3,5 – 8. Nhưng nấm tuyến trùng ưa pH hơi acid và nấm phát triển thích hợp ở pH = 5,5 – 6. Theo nghiên cứu của Sung Mi Shim et al., (2003), thì giá trị pH phù hợp cho sự phát triển của P. fumosoroseus nằm trong khoảng 6 – 9, còn P. japonica phát triển tối ưu ở pH 7 (Choi et al., 1999), P. sinclairii phát triển tối ưu ở pH 8 (Shim et al., 2003). 1.1.5.5 Ánh sáng 8
  19. Đồ án tốt nghiệp Các loài nấm ký sinh tuyến trùng, tuyến trùng rất cần ánh sáng cho sự phát triển và tạo bào tử. Ánh sáng là nhân tố không thể thiếu cho việc hình thành bào tử (theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). Ánh sáng cũng rất cần thiết cho quá trình sinh bào tử của nấm Paecilomyces spp. Nếu thiếu ánh sáng thì nấm Paecilomyces spp. sẽ không tạo nhiều bào tử. 1.1.5.6 Độ thoáng khí Nấm tuyến trùng đa số đều thuộc loại hiếu khí. Khi nấm phát triển chúng đòi hỏi có lượng oxy thích hợp trong dụng cụ nhân nuôi hay trong cả biên độ rộng của không gian nuôi cấy, nếu phù hợp nấm sẽ phát triển tốt. 1.1.5.7 Môi trường nuôi cấy Năm 1986, tác giả Jeanne M. M. I. và CS. (1986) đã thử nghiệm nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. bằng phương pháp lên men chìm. Tác giả đã tiến hành thử nghiệm các điều kiện nhân sinh khối tạo bào tử chồi (Blastospore) bằng các nguồn nitơ và cacbon khác nhau. Kết quả cho thấy trong các nguồn nitơ thử nghiệm thì (NH4)2SO4 thích hợp nhất cho nấm Paecilomyces sp. phát triển, tạo bào tử chồi. nhiều nghiên cứu về sản xuất nấm Paecilomyces sp. trong điều kiện nuôi cấy lỏng đã chỉ ra rằng để tối ưu hóa cho sản xuất tối đa sinh khối sợi nấm và exo – polysaccharide của nấm Paecilomyces japonica. Kết quả cho thấy với thành phần glucose 30g, 20 g cao nấm men, 0,5g KH2PO4 và 0,1 g CuCl2.2H2O và 1 lít nước cất được cho là môi trường tối ưu để sản xuất nấm Paecilomyces japonica ở nhiệt độ 27 0C sẽ cho sinh khối sợi nấm và lượng polysaccharide lần lượt là 23,1 g / l và 2,5 g / l (Lee JS, Iung WC, Park SJ, Lee KE, Shin WC, Hong Ex, 2012). Nghiên cứu của Li Gao (2015) báo cáo về tác động của các yếu tố dinh dưỡng và môi trường ảnh hưởng đến sản xuất sinh khối và bào tử nấm Paecilomyces lilacunus IPC – P. Các yếu tố này bao gồm nguồn carbon và nitơ, tỷ lệ C / N, các khoáng chất và vitamin cùng với nguồn nước, nhiệt độ, chu kỳ sáng / tối và độ pH. Các bào tử đã được cấy trên môi trường cơ bản (sucrose 19.00 g / l, peptone đậu nành 4.06 g / l, K2HPO4 1,00 g / l, KCl 0.50 g / l, MgSO4 0.50 g / l, FeSO4 0,01 g / l, agar 13,00 g / l) trong 4 ngày, trước khi được cấy chuyền qua môi trường hình thành bào tử 9
  20. Đồ án tốt nghiệp (dextrin 2.27 g / l, urê 2.13 g / l, CaCl2 3,00 g / l, ZnSO4 · 7H2O 0,01 g / l, agar 13.00 g / l) cho thêm 4 ngày theo các điều kiện môi trường sau đây: -3,9 MPa / pH 7 / ánh sáng 24 h / nhiệt độ 29 °C; những điều kiện đã được thay đổi để -0,3 MPa / pH 6 / ánh sáng 24 h / nhiệt độ 23 ° C để có được số lượng sinh khối tốt hơn. Số liệu cung cấp thông tin về nhu cầu dinh dưỡng và môi trường của loại nấm này, đó sẽ là điều cần thiết cho việc sản xuất chế phẩm thương mại của nó. Môi trường nuôi cấy lỏng với nồng độ carbon khác nhau và tỷ lệ C / N đã được thử nghiệm để sản xuất bào tử chịu khô hạn của Paecilomyces fumosoroseus. Trong khi tất cả các môi trường được thử nghiệm hỗ trợ hình thành bào tử trong môi trường lỏng, nồng độ bào tử cao (5,8 × 108 bào tử / ml) được sản xuất trong môi trường có chứa 80 g glucose.l-1 và 13,2 g Casamino axit.l-1 (môi trường MS) và một tỷ lệ cao hơn đáng kể (79 %) của các bào tử sống sót không khí khô. có chứa nồng độ glucose trong môi trường lớn hơn 20 g / l và axit Casamino nồng độ từ 13,2 và 40 g / l hỗ trợ sản xuất tối đa của bào tử chịu khô hạn. Tất cả 23 chủng nấm P. fumosoroseus phân lập trong trong môi trường MS được sản xuất cho nồng độ cao của bào tử chịu khô hạn. Khi bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, hơn 60 % số bào tử đông khô được sản xuất trong môi trường MS vẫn còn hoạt tính sau khi bảo quản 7 tháng trong khi ít hơn 25 % của bào tử khô trong không khí sống sót sau 90 ngày lưu trữ. Hàng loạt các nghiên cứu về các loại cơ chất, thành phần môi trường để sản xuất sinh khối nấm Paecilomyces sp. đã được thực hiện. S. Prabhu, S.Kumar và S. Subranmanian (2008) nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Paecilomyces lilacinus trên môi trường lỏng để trừ trứng tuyến trùng. Thí nghiệm được thực hiện trên 4 loại môi trường Potato dextrose broth (PDB), môi trường Richards; 10 % Molasses và môi trường Semi chọn lọc. Kết quả thí nghiệm cho thấy khối lượng sợi nấm đạt cao nhất ở môi trường Semi chọn lọc (19,82g), tiếp theo là môi trường 10 % Molasses (16.85 g). Khối lượng sợi nấm đạt ít nhất ở môi trường PDB (10.5g). Sinh khối sợi nấm đạt cao nhất ở môi trường Semi chọn lọc (32.8 x 107 bào tử / g), tiếp theo là môi trường 10% Molasses (28.8 x 107 bào tử / g). Bào tử đạt ít nhất ở môi trường PDB (10.3 x 107 bào tử / g). Năm 2015, Zhen Yu, You – chi Zhang, Xiang 10
  21. Đồ án tốt nghiệp Zhang và Yin Wang đã thực hiện nghiên cứu lên men nấm Paecilomyces lilacinus bằng chất thải thực phẩm kiểm soát sinh học tuyến trùng sần rễ. Điều kiện môi trường nuôi cấy nấm P. lilacinus được tối ưu hóa thông qua phương pháp lên men bề mặt. Kết quả chỉ ra rằng thời gian lên men, lượng chất thải thực phẩm, độ pH ban đầu và nhiệt độ là các yếu tố quna trọng ảnh hưởng đến sản xuất P. lilacinus. Sinh khối nấm Paecilomyces lilacinus phát triển ở điều kiện tối ưu cho 109,6±0,3 bào tử / ml. Sau khi lên men, nhu cầu oxy hóa của chất thải thực phẩm giảm một cách hiệu quả với 81,92 %. Hoạt tính enzyme protease và khả năng kiểm soát tuyến trùng sần rễ của P. lilacinus nuôi bằng chất thải thực phẩm được đánh giá cao hơn khi nuôi bằng môi trường PDA lần lượt là 10,8 % và 27 %. Lê Hữu Phước và cộng sự (2009) đã thực hiện nghiên cứu nhân sinh khối nấm Paecilomyces spp. trên bốn loại môi trường CDB, CMB, SDAY1 và SDAY3 qua các thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày. Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng Khả năng tạo bào tử ở 4 môi trường dinh dưỡng cao nhất ở 6 NSKL. Mật số bào tử cao nhất ở môi trường SDAY3 (5,6 x 108 bào tử / ml) và thấp nhất là môi trường CDB, chỉ có 0,6 x 108 bào tử / ml. Hai môi trường SDAY1 và CAM cho mật số bào tử lần lượt là 5,0 x 108 bào tử / ml và 4,8 x 108 bào tử / ml, tuy nhiên giữa chúng không có sự khác biệt về mặt thống kê. Tổng quan về tuyến trùng Meloidogyne sp. gây bệnh bướu rễ trên cây hồ tiêu 1.2.1. Tổng quan về tuyến trùng ký sinh thực vật Tuyến trùng ký sinh thực vậy có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những vết thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman et al., 1997). Tổn hại về mặt kinh tế từ 40-50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấn công bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry, 1997). Vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng nên người nông dân thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra. Thiệt hại về cây trồng do tuyến trùng gây ra hậu quả cao đặc biệt vào mùa mưa, trong đó bao 11
  22. Đồ án tốt nghiệp gồm các loại cây thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua bị ảnh hưởng nhiều nhất. Ở Việt Nam, sản lượng tiêu giảm đáng kể do tuyến trùng Meloidogyne spp. gây ra bệnh sần rễ. Chúng phá hoại bộ rễ, tạo nhiều vết thương làm cho các loài vi nấm, vi khuẩn có khả năng xâm nhập và gây bệnh dễ dàng hơn. Khi tuyến trùng gây hại, cây ngừng sinh trưởng, lá vàng, ra hoa và đậu quả kém. Đặc biệt, khi quan sát dưới rễ sẽ thấy có những nốt sần xuất hiện, nếu bệnh quá nặng cây sẽ chết. Bệnh sần rễ không chỉ biểu hiện ở những cây lá vàng mà còn cả những cây xanh tươi do bệnh mới phát triển ở giai đoạn đầu, rễ vẫn vận chuyển nước và khoáng chất được. Tuyến trùng ký sinh trên hồ tiêu gồm tuyến trùng ngoại ký sinh và nội ký sinh, chích hút dinh dưỡng từ rễ làm suy giảm sức khỏe của cây, gây tổn thương rễ, ngăn cản sự hấp thu dinh dưỡng và nước, gây vàng lá cục bộ hoặc vàng toàn bộ cây, gây héo tạm thời vào mùa khô khi thiếu nướcvà có nhiều u bướu rễ, vết thâm đen tại bướu, hoặc bướu bị mục nát, có rất ít rễ non được hình thành. Hội chứng vàng lá cây tiêu có liên quan đến mức độ rễ bị tổn thương do sự ký sinh của tuyến trùng. Triệu chứng sưng rễ thường do tuyến trùng nội ký sinh gây ra, hoặc chỉ là vết thâm nâu, nâu đen trên rễ do tuyến trùng ngoại ký sinh tạo ra. Tuyến trùng luôn hiện diện trong vùng rễ hồ tiêu và tập trung nhiều từ độ sâu 5 đến 40 cm, vì rễ là nơi cung cấp dinh dưỡng cho tuyến trùng. Cây càng tốt, rễ hút dinh dưỡng càng nhiều, tuyến trùng càng phát triển nhanh về số lượng. Mật độ tuyến trùng trên một đơn vị khối lượng đất (50g, 100g) hoặc khối lượng rễ (1g, 5g), số bướu trên đơn vị khối lượng đất hay khối lượng rễ (1g), số tuyến trùng cái trong 1 bướu rễ, là các chỉ tiêu dùng để đánh giá mức độ nhiễm tuyến trùng của đất trồng và cây ký chủ. Vì vây, biện pháp kiểm soát số lượng tuyến trùng cần thực hiện vào thời điểm cây hồ tiêu có tốc độ phát triển cao nhất và lúc tuyến trùng tập trung vào vùng rễ nhiều nhất. Tuyến trùng nhanh chóng tiếp cận và xâm nhiễm vào rễ non sau khi cây được trồng và thiết lập quần thể với nhiều thế hệ cùng tồn tại. Tuy nhiên cơ cấu đất, nguồn hữu cơ, vi sinh vật đối kháng hoặc ký sinh có ảnh hưởng đến số lượng tuyến trùng. Tuyến trùng rễ cây hồ tiêu ít định cư ở tầng đât sâu hơn 60 cm, vì vậy kỹ 12
  23. Đồ án tốt nghiệp thuật trồng và chăm sóc cho hệ rễ phát triển theo chiều sâu sẽ giúp cây “thoát” sự xâm nhiễm tuyến trùng. Tuyến trùng phát tán theo nước mưa, nước tưới, động vật đi lại trong vườn, cây giống nhiễm tuyến trùng, hoặc do con người đi lại vô tình mang đất nhiễm tuyến trùng. Tàn dư rễ có tuyến trùng định cư, cây ký chủ, mảng trứng trong đất là nơi lưu tồn nguồn tuyến trùng trên vườn hồ tiêu hằng năm. Sự phát triển của bệnh trải qua 3 giai đoạn: - Giai đoạn 1: tuyến trùng mới xâm nhập vào rễ và tạo nốt sần, lúc này rễ chưa bị ảnh hưởng nhiều, rễ vẫn còn màu trắng. - Giai đoạn 2: rễ bị đổi màu, chức năng vận chuyển nước và chất dinh dưỡng bị ảnh hưởng. Rễ bị tổn thương và tạo cơ hội cho các vi sinh vật tấn công gây nhiều bệnh khác cho cây. - Giai đoạn 3: rễ bị đổi màu đen và chức năng vận chuyển đã không còn. Theo Trịnh Thị Thu Thủy và cộng sự (2007), có 29 loài tuyến trùng thuộc các họ khác nhau có mặt trong vùng đất trồng tiêu của Việt Nam, phổ biến nhất là chi Meloidogyne. Chúng hiện diện tương đối nhiều nơi trên thế giới, chúng ký sinh bắt buộc với rễ của hàng ngàn loài thực vật. Meloidogyne gồm hơn 60 loài, 4 loài gây hại chính là Meloidogyne javanica, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne incognita và Meloidogyne halpa. Chúng có mặt ở 23 trong số 43 loài cây chính yếu, từ các cây lương thực, đồng cỏ đến các loài cây cảnh. Việc kiểm soát tuyến trùng sẽ rất khó khăn nếu chúng tấn công vào các loài cây lâu năm vì các loài cây lâu năm có rễ ăn sâu vào đất. Meloidogyne spp. được Neal phát hiện đầu tiên ở cây sắn vào năm 1889. Rễ bị tuyến trùng xâm hại sẽ hấp thu nước và các khoáng chất yếu đi so với bình thường, làm giảm sự tăng trưởng, chất lượng, năng suất cây trồng, từ đó kéo theo sự suy giảm sức đề kháng của cây trồng với sự tác động của các yếu tố ngoại cảnh như hạn hán, dịch bệnh, 13
  24. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2. Phân loại khoa học Giới: Animalia Ngành: Nematoda Lớp: Secernentea Bộ: Tylenchida Họ: Heteroderidae Loài: Meloidogyne 1.2.3. Đặc điểm sinh thái Theo phân loại của Goldi (1887, có chỉnh sửa vào năm 2000), Meloidogyne spp. có đặc điểm sau: Đối với con cái trưởng thành thì có hình tròn tới dạng quả lê, màu trắng, ít vận động. Không có giai đoạn u nang. Có kim chích nhỏ và mảnh, thường dài từ 12–15 μm. Lỗ bài tiết nằm trước tới khoang giữa khối tròn, thường chỉ sau kim chích. Sáu tuyến trực tràng lớn tiết các chất đặc sệt để bảo quản trứng, đẻ trứng ra ngoài. Con đực trưởng thành có hình giống con giun, dài đến 2 mm, đuôi xoắn và tròn, phát triển qua các lần biến thái trong rễ. Có kinh chích nhỏ nhưng mảnh, dài 18–25 μm. Tuyến hầu chủ yếu nằm ở phần bụng đến ruột. Gai nhỏ và mảnh, thường dài 25–33 μm, ống dẫn dài từ 7–11 μm. Có tinh hoàn duy nhất. Ấu trùng: trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra trong một bọc gelatin (còn gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt của sần rễ. Ấu trùng cảm nhiễm tuổi 2 (J2) có dạng cân đối hình giun, dài khoảng 0,4 – 0,5 mm. Kim chích và vùng đầu kitin hóa yếu, đuôi hình chóp. 14
  25. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4. Cấu tạo tuyến trùng ký sinh thực vật (Nguồn: thesoilhuggersjourney.wordpress.com) 1.2.4. Hình thức sinh sản Tuyến trùng phần lớn sinh sản hữu tính là chủ yếu. Tỷ lệ đực, cái phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến quá trình sinh sản và phát triển qua các giai đoạn từ tuyến trùng non lên tuyến trùng trưởng thành để phân giới đực cái. Tuyến trùng đẻ trứng là chủ yếu, trứng được hình thành trong cơ thể mẹ và phát triển trong tế bào trứng. Một trứng đã thụ tinh là trứng có một nhân với các nhiễm sắc thể, sau đó thực hiện quá trình phân chia nhân tế bào.Trứng sau khi thụ tinh, một số phát triển trong vỏ trứng, vỏ cơ thể mẹ chuyển thành nang và tuyến trùng non phát triển trong đó, sau đó chui ra ngoài ở tuổi 2 trong điều kiện ngoại cảnh phù hợp. 1.2.5. Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp. Con cái đẻ trứng trong một khối chất đặc sệt chứa chất nền glycoprotein, được tiết bởi bởi sáu tuyến lớn trong ruột thông qua hậu môn (Sharon và Spiegel, 1993). Các khối trứng thường được tìm thấy trên bề mặt của sần rễ, đôi khi các bọc trứng này có thể nằm trong sần rễ. Khối trứng ban đầu mềm, dính và trong vắt như pha lê nhưng lúc sau lại cứng và có màu nâu xẫm. 15
  26. Đồ án tốt nghiệp Sau quá trình phát triển phôi thai, lần lột xác thứ nhất xảy ra bên trong trứng và phát triển thành ấu trùng tuổi 2 dạng cảm nhiễm (J2). J2 dễ bị tổn thương, do đó chúng cần xâm nhiễm và định cư vào kí chủ càng nhanh càng tốt. Ấu trùng J2 có thể xâm nhập vào rễ ngay cạnh nốt sần hoặc có thể xâm nhập vào rễ mới, ở đó chúng tấn công vào các mô phân sinh ở đỉnh rễ, tiết các hợp chất (ascorbic acid, gibberellin hay glutamic acid) và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương (Bird và Loveys, 1975). Sau khi J2 xâm nhập, đỉnh rễ phình ra và sự phát triển của rễ dừng lại trong một thời gian ngắn. Tuyến trùng hút dinh dưỡng tại các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm cho quá trình sinh lý sinh hóa của mô rễ thay đổi và hình thành các điểm dinh dưỡng của tuyến trùng (vùng dinh dưỡng này gồm 5–6 tế bào khổng lồ). Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồ các mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng ký sinh cũng phình to tạo ra các bướu rễ. Sau khi xâm nhập vào rễ, J2 cũng nhanh chóng thay đổi về hình thái: cơ thể phình ra và các cơ quan cũng dần phát triển. Quá trình phát triển của tuyến trùng trong rễ từ J2 trải qua 3 lần lột xác và đạt đến trưởng thành. Lần lột xác cuối cùng là sự biến thái thật sự đối với con đực, từ dạng cuộn gấp khúc trong J2 chúng được nở ra và có dạng hình giun, trong khi con cái có dạng hình tròn như quả lê hay quả chanh. 16
  27. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5. Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp. (Nguồn: extension.umn.edu) 1.2.6. Cơ chế xâm nhiễm của tuyến trùng Meloidogyne sp. lên rễ cây Khi chuẩn bị xâm nhập vào rễ, J2 tập trung dọc theo các tế bào non gần hay ngay tại vùng dính rễ. J2 thường tấn công vào các mô phân sinh ở đỉnh rễ, nơi các rễ bên mọc ra tạo nan điểm xâm nhập cho các J2 khác và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương. Khi J2 tiếp xúc với bề mặt rễ, chúng thường dùng kim chích và xâm nhập ngay vào trong rễ. Sự xâm nhập của chúng có thể xảy ra ở bất kỳ phía nào của rễ. Sau khi xâm nhập vào trong rễ, tuyến trùng di chuyển giữa các tế bào vỏ rễ làm cho các tế bào bị tách dọc ra, sau đó tuyến trùng định vị tại vùng mô phân sinh của vỏ rễ và bắt đầu quá trình hấp thu dinh dưỡng. Khi hút dinh dưỡng, tuyến trùng cắm phần đầu vào các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm cho quá trình sinh lý sinh hóa của mô rễ thay đổi và hình thành các vùng dinh dưỡng cho tuyến trùng. Vùng này gồm 5-6 tế bào khổng lồ (tế bào có nhiều nhân) được tại thành trong vùng nhu mô hoặc vùng mô libe. Tế bào khổng lồ phát triển từ một tế bào ban đầu duy nhất. Các tế bào khổng lồ thường chứa nhiều nhân (có thể lê đến 80 nhân trong mỗi tế 17
  28. Đồ án tốt nghiệp bào) và các nhân bên trong tế bào khổng lồ thường là đa bội (Huang và Maggenti, 1969; Wiggers và công sự, 1990). Đây là sự thích nghi chuyên hóa cao của tế bào được tạo ra và duy trì do tuyến trùng ký sinh. Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồ, các mô rễ xung qunah nơi tuyến trùng ký sinh cũng phình to ra tạo thành sần rễ. Sần rễ thường được tạo thành trong vòng 1-2 ngày sau khi tuyến trùng xâm nhập. Kích thước của nốt sần liên quan đến cây chủ, số lượng J2 xâm nhập và loài tuyến trùng ký sinh. Khi tế bào khổng lồ được hình thành, tuyến trùng J2 trở nên ít vận động và lớn dần, hình thành dạng “xúc xích”. Dưới những điều kiện thuận lợi, J2 sẽ biến thái thành ấu trùng tuổi 3 (J3) sau 14 ngày, sau đó đến giai đoạn ấu trùng tuổi 4 (J4), và cuối cùng đến giai đoạn trưởng thành. Tổng cộng thời gian ấu trùng ở giai đoạn tuổi 3 và 4 là ngắn hơn so với giai đoạn ấu trùng tuổi 2 hoặc tươnrg thành, thường là từ 4-6 ngày. J3 và J4 thiếu kiêm chích và do đó không hút thức ăn được. Con đực, khi đã được hình thành, giống hình con giun và không có bằng chứng nào cho thấy chúng hút chất dinh dưỡng. Các con đực có thể được tìm thấy nhiều trong các loài có khả năng di chuyển không giao hợp khi các điều kiện không thuận lợi cho sự phát triển của con cái, như khi mật độ tuyến trùng quá cao và có sự giới hạn về nguồn thức ăn (Perry và Starr, 2009). 1.2.7. Một số biện pháp phòng trừ Ở Việt Nam, việc kiểm soát tuyến trùng chủ yếu dựa vào các phương pháp vật lý (cày ải, luân canh cây trồng, ) hay hóa học. Hoạt chất sinh học được nghiên cứu nhiều nhất có thể phòng trừ tuyến trùng là chitosan và azzadiractin được chiết xuất từ cây neem (Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh, 1996). Có rất ít nghiên cứu sử dụng vi sinh vật (nấm, vi khuẩn) để kiểm soát tuyến trùng hại thực vật. Gần đây, viện sinh học nhiệt đới đã sử dụng phân ủ có chứ T. harzianum và bánh dầu neem để phòng trừ tuyến trùng sần rễ trên tiêu và cho thấy sự giảm mật độ tuyến trùng từ 2-4 lần so với đối chứng (Dương Đức Hiếu và cộng sự, 2010). Từ những năm 1970 trở lại đây các loại thuốc hóa học khác nhau đã được sử dụng rộng rãi để phòng trừ tuyến trùng ký sinh thực vật như các loại thuốc xông 18
  29. Đồ án tốt nghiệp hơi, các loại thuốc không xông hơi. Tuy nhiên biện pháp này lại gây hậu quả xấu đến môi trường và sức khỏe cộng đồng, đặc biệt thuốc hóa học cũng làm cho nhiều loại tuyến trùng trở nên kháng thuốc. Do đó cũng chỉ nên dùng thuốc hóa học trong trường hợp cần thiết và phải sử dụng chúng một cách hợp lý. Đưa thuốc vào độ sâu 35 – 40 cm đã cày bừa kỹ, ẩm độ 75 % và nhiệt độ phải phù hợp trong thời điểm cần xử lý với từng loại thuốc. Dùng thuốc vào đúng giai đoạn mẫn cảm nhất của tuyến trùng, có thể thực hiện trước khi trồng, sau khi thu hoạch và trong bảo quản. Các nghiên cứu nước ngoài về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces sp. trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng Nấm gây bệnh cho tuyến trùng và tuyến trùng là một tác nhân sinh học quan trọng trong việc khống chế tuyến trùng và tuyến trùng gây hại. Vai trò trấn áp những trận dịch lớn do tuyến trùng gây hại của các chủng nấm ký sinh được trình bày rất rõ trong nhiều công trình của các tác giả trên thế giới: V.P. Paspelop (1932- 1940), Dusky S.R. (1959), Tanada I. (1959 -1964), Hall I. M. (1964) (dẫn theo Nguyễn Ngọc Tú, 1997). Đây là một nhân tố hữu dụng trong hệ thống quản lý sâu hại tổng hợp IPM (Gillespie; Rombach và CS., 1986). Trên thế giới, việc sử dụng nấm ký sinh gây bệnh để phòng trừ sinh học đối với các loài tuyến trùng và tuyến trùng đã được quan tâm nghiên cứu từ đầu thế kỷ 19. Nhiều loài nấm có khả năng nhiễm và tiêu diệt trứng tuyến trùng. Hầu hết các loài nấm này có cơ chế hoạt động là hoại sinh và xâm nhập vào trứng gây chết. Các loài nấm ký sinh trứng tuyến trùng bao gồm Paecilomyces, Pochonia và Verticilium. Paecilomyces lilacinus và Pochonia chlamydosporiaare cho hiệu quả ký sinh trứng tuyến trùng tốt nhất. Paecilomyces lilacinus được chứng minh kiểm soát thành công tuyến trùng sần rễ, M. javanica và M. incognita trên cà chua, cà tím và các loài rau khác (Cayrol et al, 1989; Verdejo – Lucas et al, 2003; Goswami và Mittal, 2004; Van Damme et al, 2005; Goswami et al., 2006; Haseeb và Kumar, 2006). Huma Abbas , Nazir Javed , Sajid Aleem Khan , Muhammad Kamran , Muhammad Atiq (2016) thực hiện nghiên cứu sử dụng nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng sần rễ trên cây cà tím. Thí nghiệm này được thực hiện trong điều kiện nhà lưới vào 7 ngày đã 19
  30. Đồ án tốt nghiệp chứng minh được rằng, Paecilomyces lilacinus có khả năng làm giảm số lượng lớn tuyến trùng và có khả năng thay thế cho các loài thuốc hóa học phòng trừ tuyến trùng. Trong những thập kỷ 60 đến 80 của thể kỷ trước, việc nghiên cứu nuôi cấy các nấm ký sinh gây bệnh cho tuyến trùng và tuyến trùng hại đã được phát triển rất mạnh mẽ nhưng chủ yếu là nấm Metarhizium và Beauveria. Trong đó phải kể đến các công trình nghiên cứu của Muller Cogler E. (1961), Hall I. M. (1963- 1964), Camera J. W., Mac Bain (1963- 1967), Madelin M. F. (1965- 1966), Ignoffo C. M. (1977), H.D Burges và CS. (1982), N. K. Maniania và CS. (1984) (theo Nguyễn Ngọc Tú và CS.,1997), Ferron P. (1978). Các công trình đã tập trung nghiên cứu rất tỷ mỷ về phương pháp để nhân giống, các môi trường dinh dưỡng, các thiết bị nuôi cấy, phương pháp thu bào tử từ sinh khối nấm, tạo chế phẩm sinh học và sử dụng chúng để phòng trừ sâu hại và tuyến trùng trên đồng ruộng. Trong những năm gần đây, một số các công trình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm kí sinh tuyến trùng. Các chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm ký sinh có một vai trò quan trọng trong việc phòng chống sâu hại cây trồng, đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con người (Noris và CS., 2002). Alamgir Khan, Kleith L. Williams, Helena K.M. Nevalainen (2004) thực hiện nghiên cứu về ảnh hưởng của enzyme protease và chitinase từ nấm Paecilomyces lilacinus trên cấu trúc vỏ và sự nở của tuyến trùng Meloidogyne javanica. Một serine protease và một enzyme được chuẩn bị từ 6 chitinase, được tách chiết và tinh sạch từ môi trường nuôi cấy lỏng chủng nấm Paecilomyces lilacinus 251, tấn công vào các trứng tuyến trùng Meloidogyne javanica để nghiên cứu hiệu quả của các loại enzyme đến cấu trúc vỏ trứng. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử chứng minh rằng enzyme protease và chitinase đã làm thay đổi lớn cấu trúc của vỏ trứng khi chúng tấn công riêng lẻ hoặc kết hợp với nhau. Dưới tác động protease lên vỏ trứng, lớp lipid biến mất và lớp chitin mỏng hơn. Khi sử dụng chitinase có lớp không bào lớn, lớp viteline bị chia ra và mất đi tính toàn vẹn của nó. Những thay đổi lớn trên lớp vỏ trứng xảy ra do ảnh hưởng khi kết hợp enzyme 20
  31. Đồ án tốt nghiệp protease và chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. Lớp chitin bị thủy phân và lớp vitelline mất đi tính vẹn toàn. Hiệu lực của enzyme chitinase và protease từ nấm Paecilomyces lilacinus khi sử dụng riêng rẻ hoặc kết hợp cũng cho kết quả làm giảm sự nở của con cái tuyến trùng M. javanica. Nghiên cứu chỉ ra rằng một số tuyến trùng đã nở khi được tiếp xúc với enzyme của nấm sẽ có sự hiện diện của enzyme chitinase từ nấm Paecilomyces lilacinus giữ lại hoạt động của chúng dưới sự hiện diện của protease nội sinh. Mendoza A. R., R. A. Sikora, và S. Kiewnick. (2007) đã thực hiện nghiên cứu về sự ảnh hưởng của Paecilomyces lilacinus chủng 251 lên kiểm soát sinh học tuyến trùng Radopholus similis ở cây chuối. Khả năng nâng cao hiệu quả diệt tuyến trùng của chủng nấm đã được chứng minh. Sự tương quan đáng kể giữa liều dùng và nồng độ để kiềm hãm R. similis đã được xác định. Ở nồng độ 6 × 106 cfu /g đất khô được xem là liều dùng tối ưu của P. lilacinus. Tác giả chứng minh rằng P. lilacinus là tác nhân kiểm soát sinh học hiệu quả chống lại R. similis và cũng là nhân tố quan trọng trong việc kiểm soát tuyến trùng trên cây chuối. Năm 2006, M. Nasr Esfahani và B. Ansari Pour nghiên cứu hiệu quả của nấm Paecilomyces lilacinus trong kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne Javanica và ảnh hưởng của nấm đến sự phát triển của cây cà chua trong điều kiện nhà kính. Kết quả chứng minh rằng P. lilacinus cải thiện sự phát triển cây trồng và làm giảm đáng kể số lượng tuyến trùng và trứng tuyến trùng khi bị nhiễm M. Javanica như tác nhân gây bệnh làm rễ sần to. Nấm sẽ đạt hiệu quả cao nhất khi nấm và tuyến trùng được nhiễm đồng thời hoặc nấm được nhiễm trước và tuyến trùng nhiễm sau. Tuyến trùng đã trưởng thành bị tấn công hoặc bị chết đều có sự hiện diện của sợi nấm trên cơ thể chúng. Cheu Guan Pau và cộng sự (2012) đã phân lập được 10 chủng nấm Paecilomyces lilacinus từ đất vườn trồng 2 loại tiêu đen ở Sarawark có thể phòng trừ tuyến trùng gây sần rễ. Sau quá trình nghiên cứu, thí nghiệm đã chỉ ra rằng cả 10 chủng nấm nêu trên đều có khả năng phòng trừ tuyến trùng với mật độ bào tử 105 bào tử / ml. 21
  32. Đồ án tốt nghiệp Hiện nay, có rất nhiều nơi trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm từ nấm Paecilomyces spp. vào trong thực tiễn đời sống. Một số sản phẩm phòng trừ tuyến trùng đã được thương mại hóa như nemaxxion biol do công ty Greencorp,2014 sản xuất lên men lỏng, bao gồm các loại vi khuẩn và nấm (Bacillus subtilis, Trichoderma spp. và Paecilomyces spp.) hay REM G cũng là một sản phẩm phòng trừ tuyến trùng bao gồm các chủng nấm Arthrobotrys spp., Mycorrhia (Glomus spp.), Dactyllela spp., Paecilomyces spp., và các loại vi khuẩn (B. spp) và (Pseudomonas spp.), sản phẩm được bổ sung enzyme chitinolytic, protease và enzyme lipolytic nhằm phá vỏ thành tế bào của tuyến trùng. Các sản phẩm này có hiệu lực cao trên cây cà chua ở vùng Souss – Massa Draa ở Morocco. Hình 1.6. Một số chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp. phòng trừ tuyến trùng. Các nghiên cứu trong nước về nhân nuôi và sử dụng Paecilomyces sp. trong phòng trừ tuyến trùng hại cây Ở Việt Nam, kiểm soát tuyến trùng chủ yếu dựa vào các phương pháp vật lý (cày ải, luân canh cây trồng, ) hay hóa học. Hoạt chất sinh học được nghiên cứu nhiều nhất để phòng trừ tuyến trùng là chitosan và azadiractin được chiết xuất từ cây neem (Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh, 1996). Có rất ít nghiên cứu sử dụng vi sinh vậy (vi nấm, vi khuẩn) để kiểm soát tuyến trùng hại thực vật. Gần đây, Viện sinh học nhiệt đới đã sử dụng phân ủ chứa T. harzianum và bánh dầu neem để 22
  33. Đồ án tốt nghiệp phòng trừ tuyến trùng sần rễ trên tiêu và cho thấy có sự giảm mật độ tuyến trùng từ 2 – 4 lần so với đối chứng (Dương Đức Hiểu và cộng sự, 2010). Trần Thị Tho và cộng sự (2014) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của nấm tím Paecilomyces javanicus; khả năng hình thành bào tử của các chủng nấm P. javanicus và ảnh hưởng của một số loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của nấm này. Kết quả cho thấy môi trường có bổ sung pepton và cao nấm men là môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm P. javanicus. Sau 14 ngày nuôi cấy nấm P. javanicus cho mật số bào tử 108 cfu / cm2. Nghiên cứu do nhóm tác giả Lê Thị Mai Linh, Nguyễn Thị Duyên, Trịnh Quang Pháp, Nguyễn Thị Phương Anh, Phạm Văn Ty ( Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội) thực hiện nghiên cứu khả năng ức chế tuyến trùng Meloidogyne Incognita trên cà phê của nấm Paecilomyces Javanicus. Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch nuôi cây nấm P. javannicus với nồng độ 5, 10, 20% có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng nở trứng và gây chết đối với tuyến trùng M. incognita. Với nồng độ 20% dịch nuôi cấy nấm tương ứng với 106 bào tử / ml thì hiệu lực là cao nhất, có thể ức chế nở trứng đến 96% và khả năng gây chết cao nhất đối với ấu trùng M. incognita là 75% so với đối chứng. Do vậy, nguồn nấm P. javannicus có khả năng được phát triển trong phòng trừ sinh học đối với tuyến trùng M. incognita trên đồng ruộng. 23
  34. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ ngày đến ngày tại phòng thí nghiệm trường Đại học Công nghệ Tp.HCM. Vật liệu nghiên cứu, thiết bị và hóa chất 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu Chủng nấm Paecilomyces sp. được phân lập bởi Phùng lê Kim Yến (2014) tại phòng thí nghiệm trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM. Chủng nấm Trichoderma sp. được phân lập bởi Lê Nhật Đăng (2015) tại phòng thí nghiệm trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Mẫu rễ tiêu nghi nhiễm tuyến trùng thu nhận tại vườn tiêu thuộc tỉnh Bình Phước. 2.2.2. Thiết bị Nồi hấp khử trùng Que cấy trang Đèn cồn Ống nghiệm Kính hiển vi quang học Dao cấy Dụng cụ đục lỗ thạch 5mm Đĩa Petri Micropipet Erlen Máy đo quang Bếp từ Cốc thủy tinh Máy đo pH Hóa chất 24
  35. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3. Các loại môi trường sử dụng 2.2.3.2. Môi trường PDA (Potato D-glucose Agar) D-glucose 20g Agar 20g Khoai tây 200g Nước cất 1000ml 2.2.3.3. Môi trường CDB (Czapeck-Dox) Saccharose 40g NaNO3 3g MgSO4.7H2O 0,5g K2HPO4 1g Khoai tây 200g Nước 1000ml 2.2.3.3. Môi trường CMB (Complete Media) KH2PO4 0,4g MgSO4 1g KCl 1 g Na2HPO4 1,4 g NH4NO3 0,7 g Glucose 10 g Yeast extract 5 g Nước cất 1000ml 2.2.3.4. Môi trường SDAY1 (Sabourand dextrose Yeast) Glucose 40g Pepton 10g Yeast extract 2g Nước cất 1000ml 2.2.3.5. Môi trường SDAY3 (Sabourand dextrose Yeast bổ sung khoáng) NaNO3 2g 25
  36. Đồ án tốt nghiệp KH2PO4 1g MgSO4.7H2O 0,5g Glucose 40g Pepton 10g Yeast extract 2g Phương pháp nghiên cứu Ống giống (Phòng thí nghiệm trường ĐH Công nghệ Tp. HCM) Lây nghiễm Tuyến trùng cái Phâ n lập (từ tuyến trùng bị chết) Làm thuần Giữ giống Bảo quản Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của Nhân giống nấm Paecilomyces sp. Chọn môi trường nhân sinh khối tốt nhất Trong phòng thí nghiệm. Thử nghiệm hiệu lực diệt tuyến trùng. Trên đồng ruộng Hình 2. 1. Sơ đồ nghiên cứu 26
  37. Đồ án tốt nghiệp 2.3.1. Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse sp. ❖ Phương pháp lây nhiễm vi nấm với tuyến trùng Chuẩn bị môi trường WA có bổ sung 0,1 g / l chloramphenicol, hấp khử trùng rồi phân phối đều ra các đĩa Petri vô trùng. Cấy nấm vào giữa đĩa Petri môi trường, dùng kim hút đặt 8 tuyến trùng cái (trứng) xung quanh vị trí cấy nấm, cách tâm đĩa 2cm. Đặt đĩa Petri trong tủ ủ với nhiệt độ 25 ± 2 0C. Theo dõi sự xâm nhiễm của nấm vào cơ thể tuyến trùng sau 2, 4, 6, 8, 10, 12 ngày cấy nấm (Khan và cộng sự, 2009). ❖ Phân lập lại: tiến hành thu con cái tuyến trùng chết trong đĩa nấm nghi nhiễm Paecilomyces sp. Dùng đũa thủy tinh vô trùng nghiền mẫu với 10 ml nước cất vô trùng. Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-6 và tiến hành trãi đĩa trên môi trường PDA. ❖ Làm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử Chuẩn bị đĩa petri có chứa sẵn 1 lớp mỏng môi trường thạch nước cất WA. Tạo dung dịch bào tử bằng cách dùng que cấy đã khử trùng lấy bào tử từ ổ bào tử (chú ý không lấy quá nhiều bào tử) khoảng 1 - 10 bào tử trên quang trường vật kín x10. Hòa bào tử vào ống nghiệm chứa 10 ml nước cất vô trùng. Lắc đều tay để bào tử hòa loãng đều trong ống nghiệm trong vòng 15 – 20 phút. Đổ dịch bào tử vào đĩa petri có chứa 1 lớp mỏng môi trường thạch nước cất và tráng qua toàn bộ đĩa rồi lắc nhẹ cho dịch tràn đều trên toàn bộ bề mặt môi trường trong thời gian từ 30 giây đến 1 phút. Trút bỏ toàn bộ dung dịch trong đĩa môi trường. Dán đĩa bằng paraffin và đặt đĩa môi tường nghiêng khoảng 30 – 400 cho ráo nước trong điều kiện tối từ 18 – 20 giờ. Quan sát đĩa môi trường dưới kính lúp để tìm bào tử nẩy mầm. Dùng que cấy dẹt, sắt để cắt xung quanh bào tử (cắt toàn bộ môi trường phía dưới của bào tử) và chuyển miếng thạch có bào tử đó sang đĩa môi trường mới. Ủ đĩa trong điều kiện phòng thí nghiệm và quan sát hình thái tản nấm sau 2 ngày. 27
  38. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường PDA tiến hành hấp khử trùng. Sau khi hấp khử trùng xong để nghiêng một góc 45 0C các ống thạch này trên giá gỗ. Tiến hành cấy truyền giữ giống nấm trên bề mặt thạch nghiêng. Sau đó bảo quản các ống giống này trong điều kiện lạnh. (3 – 5 0C) 2.3.3. Các phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật 2.3.3.1. Phương pháp đổ/trải đĩa đếm khuẩn lạc ❖ Chuẩn bị đĩa petri vô trùng Môi trường được chuẩn bị - hấp khử trùng và được bảo quản mát ở 45 0C trong bể điều nhiệt. Hút 1ml mẫu vào đĩa trống (chọn nồng độ thích hợp). Đổ vào đĩa đã cấy 10 – 15ml môi trường, lắc đều. Để nguội môi trường và đem ủ. ❖ Đếm tất cả khuẩn lạc đơn lẻ mọc trên môi trường • Thường chọn những đĩa có số khuẩn lạc khoảng 30 –300. • Dùng bút để đếm các khuẩn lạc đã đếm. • Tính toán kết quả (dựa trên số khuẩn lạc đếm được và độ pha loãng để tính ra số khuẩn lạc vsv trong dung dịch ban đầu). 2.3.3.2. Phương pháp đếm trực tiếp tế bào trong buồng đếm hồng cầu Phương pháp này thường áp dụng để đếm tế bào nấm men hoặc bào tử nấm mốc. ❖ Chuẩn bị nước muối sinh lý và 0,1% Tween 80. ❖ Chuyển khoảng 10ml nước muối sinh lý này sang đĩa petri chứa bào tử (đường kính 9 cm), dùng que cấy vòng cào bào tử trên bề mặt đĩa, chuyển bào tử sang bình định mức 100 ml bằng pipet Pastuer, lặp lại các bước này tối thiểu ba lần bảo đảm chuyển hết bào tử sang bình định mức 100 ml. ❖ Lắc đều, pha loãng đến nồng độ 10-1, 10-2, (sao cho mỗi ô nhỏ chứa 5-10 tế bào) ❖ Đếm trong buồng đếm hồng cầu. ❖ Đậy buồng đếm bằng một phiến kính mỏng. 28
  39. Đồ án tốt nghiệp ❖ Nhẹ nhàng dùng đầu pipet (chứa 1 giọt huyền phù vi sinh vật), đặt vào cạnh buồng đếm (nơi tiếp giáp với phiến kính mỏng). Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có cùng không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm được phủ bởi dịch huyền phù tế bào, còn các rãnh chung quanh thì không bị dính ướt. ❖ Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang. Khi đó, dịch nằm trong khoang có độ dày khoảng 0,1 mm. ❖ Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính x4 để tìm buồng đếm. Chỉnh thật rõ, sau đó chuyển qua vât kính x10 hoặc x40 để đếm. ❖ Điều chỉnh cường độ ánh sáng bằng cửa sập để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào lẫn các đường kẻ. Tùy vào số lượng tế bào mà có thể chọn cách đếm tất cả các tế bào có trong ô trung tâm hay chỉ đếm các tế bào có trong một số ô vuông lớn đại diện. Đếm bào tử trong vùng có chữ W (vùng đếm bạch cầu). ❖ Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dịch từ 3-5 phút; phải đếm các tế bào nằm trên 2 đường kẻ kề nhau được chọn của từng ô. • Mật độ bào tử trong mẫu là: Bào tử / 1mm3 = = 1 2.0,1 10 Bào tử / 1ml = B.1000.10 (B là số bào tử trung bình đếm được) • Số bào tử trong dung dịch gốc: Bào tử / ml = B.1000.10.F (F là hệ số pha loãng) • Số bào tử trên 1 đĩa Petri 9 cm = B.104.F 2.3.4. Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) ❖ Trứng và con cái Meloidogyne spp. được tách ra từ rễ cây hồ tiêu thu được ở tỉnh Bình Phước. Mẫu rễ lấy về được rửa sạch dưới vòi nước chảy, để khô tự nhiên, cân khối lượng và đánh giá mức độ nguy hại trước khi tách tuyế trùng. Các cấp đô nguy hại của rễ được đánh giá dựa vào sự hiện diện của các nốt sần. ❖ Mẫu rễ lấy về được rửa sạch dưới vòi nước chảy, để trên giấy thấm khô tự nhiên. Sau đó, dùng dao cấy nhọn tách từ từ phần rễ dưới ánh đèn sáng và 29
  40. Đồ án tốt nghiệp bắt con cái, túi trứng trong nốt sần. Con cái có màu trắng đục, hình quả lê, kích thước tùy vào con to nhỏ khác nhau, thường dài khoảng 600 - 700 nm, rộng 400 - 500 nm. Túi trứng có màu hơi vàng nâu, hình bầu dục với kích thước tương đương với kích thước con cái. 2.3.5. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. trên các loại môi trường nhân sinh khối (theo Lê Hữu Phước, 2009) ❖ Thí nghiệm được bố trí như sau NT1: môi trường Czapeck- Dox NT2: môi trường CMB NT3: môi trường SDAY1 NT4: môi trường SDAY3 ❖ Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức tương ứng với 4 loại môi trường CDB, CMB, SDAY1, SDAY3 và 3 lần lặp lại. Mỗi đơn vị thí nghiệm tương ứng với 1 bình tam giác 500ml (chứa 250ml môi trường thử nghiệm). Các bình tam giác chứa môi trường này đã được thanh trùng bằng autoclave ở 121 0C trong 15 phút. Ở mỗi bình tam giác, chủng 25 ml huyền phù bào tử nấm có mật số 4,72.106 bào tử / ml. Các đơn vị thí nghiệm (bình chứa môi trường) được đặt trên máy lắc tốc độ 120 vòng / phút ở nhiệt độ phòng, thời gian 12 giờ sáng / 12 giờ tối. ❖ Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng bào tử quan sát và đếm được vào các thời điểm: 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày sau khi lắc cho tất cả các thí nghiệm. Ở mỗi thời điểm, tiến hành pha loãng dung dịch huyền phù bào tử nấm trong mỗi bình môi trường. Đếm mật số bào tử / ml cho từng nghiệm thức. 2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 30
  41. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2. 1. Bố trí thí nghiệm Nghiệm thức Cơ chất Khối lượng NT1 Lúa 100g NT2 Gạo Tấm 100g NT3 Cám trấu 100g NT4 Ngô mảnh 100g Cấy giống có mật độ 9,44 x 106 bào tử / ml. Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức tương ứng với 4 loại môi trường cám, gạo tấm, lúa, ngô mảnh và 3 lần lặp lại. Thí nghiệm được thực hiện trên chai thủy tinh. ❖ Chỉ tiêu đánh giá: Số lượng bào tử quan sát và đếm được vào thời điểm 14 ngày sau khi lắc. Ở thời điểm 14 ngày, tiến hành pha loãng dung dịch huyền phù bào tử nấm trong mỗi bình môi trường theo nồng độ 10-7 10-8 10-9. Đếm mật số bào tử / ml cho từng nghiệm thức. Số liệu mật số bào tử / ml được đổi sang logarit thập phân để xử lý trên phần mềm SAS và excel. 2.3.7. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 2.3.7.1. Khảo sát ảnh hưởng của các loài thuốc trừ sâu đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 31
  42. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2. 2. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Nghiệm thức Thuốc trừ nấm Hoạt chất Liều lượng NT 1 Đối chứng Nước cất - NT 2 Sherpa 25EC Cypermethrin 0,125% NT 3 Plutel 1,8 EC Abamectin 1,8% 0,75% NT 4 Oshin 20WP Dinotefuran 0,6% NT 5 Actara 25WG Thiamethoxam 0,6% ❖ Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm và môi trường nuôi cấy Nguồn nấm Paecilomyces: Chủng Paecilomyces sp. được nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày. Môi trường nuôi cấy: Mỗi chai môi trường PDA sau khi được hấp khử trùng ở 121 0C, 1 atm trong 15 phút sẽ được để nguội đến 50 0C rồi bổ sung từng loại thuốc bảo vệ thực vật (ứng với từng nghiệm thức) theo liều lượng khuyến cáo của nhà sản xuất. ❖ Tiến hành nuôi cấy: Đổ đĩa và để nguội cho đến khi môi trường đông lại trong đĩa petri rồi dùng khoanh thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch có chứa nấm Paecilomyces sp. từ đĩa nấm đã chuẩn bị và đặt vào vị trí tâm đĩa môi trường vừa chuẩn bị xong. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phòng. ❖ Các chỉ tiêu theo dõi: • Đo đường kính khuẩn lạc (cm) trong 3, 5 và 7 ngày sau cấy • Tỷ lệ (%) ức chế được tính theo công thức: U = − x100 Trong đó: • U: % khuẩn lạc bị ức chế. • D: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức đối chứng. • X: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức xử lý thuốc. Chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ (Hassan, 1989): 32
  43. Đồ án tốt nghiệp Cấp 1: không ảnh hưởng ( 90%) 2.3.7.2. Khảo sát ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Bảng 2. 3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thuốc trừ nấm Nghiệm thức Thuốc trừ sâu Hoạt chất Liều lượng NT1 Đối chứng Nước cất - NT2 Saizole 5SC Hexaconazole 0,2% NT3 Carbenzim 500FL Carbendazim 0,2% NT4 Antracol propineb 2,5% NT5 Cup 2,9SL Nano đồng 0,25% ❖ Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm và môi trường nuôi cấy Chủng Paecilomyces sp. được nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày. Môi trường nuôi cấy: Mỗi chai môi trường PDA sau khi được hấp khử trùng ở 121 0C, 1atm trong 15 phút được để nguội đến 50 0C rồi bổ sung từng loại thuốc bảo vệ thực vật (ứng với từng nghiệm thức) theo liều lượng khuyến cáo của nhà sản xuất. ❖ Tiến hành nuôi cấy: Đổ đĩa và để nguội cho đến khi môi trường đông lại trong đĩa petri rồi dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch có chứa nấm Paecilomyces sp. từ đĩa nấm đã chuẩn bị và đặt vào vị trí tâm đĩa môi trường vừa chuẩn bị xong. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phòng. ❖ Các chỉ tiêu theo dõi: • Đường kính khuẩn lạc (cm) • Tỷ lệ ức chế: 33
  44. Đồ án tốt nghiệp U = − x100 Trong đó: • U: % khuẩn lạc bị ức chế. • D: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức đối chứng. • X: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức xử lý thuốc. ❖ Chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ (Hassan, 1989): Cấp 1: không ảnh hưởng ( 90%) 2.3.7.3. Khảo sát khả năng đồng sinh trưởng của nấm Paecilomyces sp. và nấm Trichoderma sp. ❖ Chuẩn bị: Chủng Trichoderma sp. được nuôi cấy trong môi trường PDA sau 7 ngày và chủng Paecilomyces sp. được nuôi cấy trong môi trường PDA sau 14 ngày được cấy truyền để quan sát khả năng đồng sinh trưởng. Môi trường PDA được hấp khử trùng ở 121 0C, 1 atm trong 15 phút. Sau khi hấp khử trùng, nhiệt độ môi trường giảm xuống còn 50 – 60 0C, rót 20 ml môi trường vào các đĩa petri đã hấp khử trùng, đặt đĩa trên mặt phẳng cho đến khi thạch đông hoàn toàn. ❖ Tiến hành: Đĩa đối chứng dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch trên có nấm Paecilomyces sp. Dùng dao cất chuyển miếng thạch đặt cách mép đĩa petri 1 cm. Đĩa đối kháng dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch trên đĩa môi trường PDA có nấm Paecilomyces sp. Dùng dao cấy chuyển miếng thạch này đặt vào đĩa môi trường mới (đặt cách mép đĩa 1 cm). Sau đó, dùng một khoan thạch khác đục một miếng thạch của nấm Trichoderma sp. đặt vào vị trí đối xứng qua tâm đường kính đĩa thạch (đặt cách mép đĩa 1 cm giống như cách đặt nấm Paecilomyces sp.) Các thao tác trên đều được tiến hành trong tủ cấy vi sinh dưới ngon lửa đèn cồn. Nuôi ủ các đĩa ở nhiệt độ phòng, điều kiện ánh sáng 12 giờ sáng / 12 giờ tối. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 34
  45. Đồ án tốt nghiệp Sau 3, 5 và 7 ngày, tiến hành đo đường kính khuẩn lạc của các tản nấm ở hai đĩa và tính tỷ lệ phần trăm ức chế của hai loại nấm. Bảng 2. 4. Bố trí thí nghiệm khả năng đồng sinh trưởng của Trichoderma sp. và Paecilomyces sp. Nghiệm thức Bố trí thí nghiệm Lặp lại Nghiệm thức 1 Đối chứng Paecilomyces sp. 3 Nghiệm thức 2 Trichoderma sp. + Paecilomyces sp. 3 ❖ Chỉ tiêu theo dõi: quan sát hình thái của cả ai chủng nấm sau 3, 5, 7 ngày nuôi cấy. Ở mỗi thời điểm, tiến hành đo đường kính tản nấm của hai loại nấm Trichoderma sp., Paecilomyces sp. và tỷ lệ ức chế sự phát triển được tính theo công thức (Fokkema, 1973) X= 푅1−푅2 100 푅1 Trong đó: • X là phần trăm ức chế; • R1 là đường kính khuẩn lạc nấm bệnh phát triển trong đĩa đối chứng khi không có chủng đối kháng (mm); • R2 là đường kính khuẩn lạc nấm phát triển trong đĩa đối kháng khi có chủng đối kháng (mm); Mức độ ức chế sự phát triển được phân thành 4 cấp độ và đánh giá mức độ ức chế (Nguyễn Thị Thuần và cộng sự, 1996; Trần Kim Loang và cộng sự, 2009): • Cấp độ 1: ức chế cao: nấm Trichoderma ức chế trên 60 %; • Cấp độ 2: đối kháng trung bình: nấm Trichoderma ức chế bệnh từ 40 đến 59 %; • Cấp độ 3: đối kháng yếu: nấm Trichoderma ức chế từ 20 đến 40 %; • Cấp độ 4: không đối kháng: nấm Trichoderma ức chế dưới 19 %. 2.3.8. Khảo sát khả năng kí sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne sp. của nấm Paecilomyces sp. Tiến hành nuôi cấy huyền phù bào tử nấm Paecilomyces sp. trên các đĩa Petri môi trường PDA. Sau 5 ngày nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA 35
  46. Đồ án tốt nghiệp tiến hành cấy tuyến trùng cái Meloidogyne sp. (8 tuyến trùng cái/ 1 đĩa PDA) vào mép khuẩn lạc nấm Paecilomyces sp. Tiến hành thí nghiệm trong thời gian 4 ngày. Bố trí thí nghiệm gồm 4 đĩa và lặp lại 3 lần. Sau mỗi ngày, thu kết quả thí nghiệm bằng cách dùng nước cất vô trùng cho vào các đĩa Petri rồi dùng kim mũi mác thu tuyến trùng cái. Quan sát sự lây nhiễm nấm Paecilomyces sp. trên tuyến trùng cái bằng cách làm tiêu bản nhuộm với methylene blue và soi dưới kính hiển vi. 2.3.9. Đánh giá tác động của chế phẩm nấm Paecilomyces sp. trong việc phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. trên cây hồ tiêu ❖ Mục đích: xác định hiệu quả phòng trị tuyến trùng hại hồ tiêu trên đồng ruộng của chủng nấm Paecilomyces sp. ❖ Bố trí thí nghiệm: • Địa điểm trên vườn tiêu bị tuyến trùng gây hại tại xã Đa Kia, huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước. • Vườn tiêu được chia thành 2 lô thí nghiệm: Lô đối chứng do nông dân tự phòng trị. Lô thí nghiệm tưới nấm Paecilomyces sp., liều lượng 106 bào tử / ml, mỗi trụ tiêu tưới 1 lít dung dịch nấm sau khi pha. ❖ Mỗi công thức chọn 12 cây có tỷ lệ bị hại ở cấp 2 (Theo QCVN 01 - 172 : 2014/BNNPTNT) 36
  47. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2. 5. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Paecilomyces sp. Nghiệm thức Công thức Liều dùng NT1 Phun thuốc hóa học phòng Tưới nước, bón phân và phun trừ tuyến trùng thuốc hóa học VIFU-SUPER 5G (Hoạt chất: Carbosulfan), cách dùng: pha từ 20 - 30 kg/ha. NT2 Phun chế phẩm nấm Chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp. Paecilomyces sp. có mật độ ban đầu là 1010 bào tử / g được pha loãng với nước nồng độ 106 bào tử / ml, tưới đều vào các gốc tiêu. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bị hại trước và sau khi tưới nấm. Cấp hại Tỷ lệ (%) bị hại được đánh giá theo QCVN 01 - 172 : 2014/BNNPTNT • Cấp 1 (nhẹ): ≤1/3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán cây bị vàng, cành bị khô. • Cấp 2 (trung bình): >1/3 -<2/3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán cây bị vàng, cành bị khô. • Cấp 3 (nặng): ≥2/3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán cây bị vàng, cành bị chết khô hại trước và sau khi tưới nấm. 2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Excel và SAS để xử lý số liệu. 37
  48. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp. Sử dụng nguồn nấm Paecilomyces sp. của Phùng Lê Kim Yến (2014) và Lê Trần Quang Huy (2015), sinh viên tiến hành nhiễm lại trên con cái và trứng tuyến trùng, theo dõi trong phòng thí nghiệm Từ những cá thể con cái và trứng bị nghi ngờ bị chết do nhiễm nấm Paecilomyces sp,, sinh viên đã tiến hành phân lập lại và sau 7 ngày nuôi cấy, trên môi trường PDA đã xuất hiện tản nấm có màu trắng xốp sau sang màu hồng rồi màu hồng tím như hình 3.1. Hình 3.1. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA. Tản nấm có hình tròn đồng tâm, dạng thảm nhung khi nuôi cấy trên môi trường PDA. Ban đầu sợi tơ nấm có màu trắng, mềm, mịn. Sau 4 ngày nuôi cấy sợi nấm bắt đầu chuyển sang màu hồng nhạt và chuyển sang màu tím ở 14 ngày nuôi cấy. Khi quan sát dưới kính hiển vi có thể thấy cuốn bào tử dài, cong mọc phân nhánh từ các sợi nấm, các thể bình có dạng hình chai nước ở gốc phồng to, ở cổ thì nhỏ dần và mộc vươn thẳng. Các bào tử hình oval, dài khoảng 1,5 – 2,5 μm, mọc thưa thớt trên các thể bình liên kết với nhau thành chuỗi dài, hay bị đứt đoạn. 38
  49. Đồ án tốt nghiệp Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm, trừ sâu đến sự phát triển của Paecilomyces sp. 3.2.1. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu đến sự phát triển của Paecilomyces sp. Tiến hành thí nghiệm như mục 2.3.7.2 để khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. trên các môi trường thuốc trừ nấm, sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy trên các loại môi trường, thu được kết quả như hình 3.2. B E A D C Hình 3.2. Tản nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc hóa học. (A: Actara 25WG; B: Sherpa 25EC; C: Oshin 20WP; D: Plutel 1,8 EC; E: đối chứng) 39
  50. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3. 1. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường trừ nấm. Đường kính tán nấm (cm) qua các ngày nuôi cấy Nghiệm thức 3 NSC 5 NSC 7 NSC Đối chứng 2,46a ± 0,05 3,18a ± 0,07 3,80a ± 0,17 Sherpa 25EC 1,70b ± 0,00 2,23b ± 0,05 2,80b ± 0,10 Plutel 1,8 EC 1,30c ± 0,17 1,78c ± 0,07 2,13c ± 0,15 Oshin 20WP 1,97b ± 0,11 3,03a ± 0,03 3,63a ± 0,37 Actara 25WG 2,33a ± 0,11 3,1a ± 0,10 3,77a ± 0,05 CV (%) 5,60 3,28 6,48 Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp. Tỷ lệ (%) khuẩn lạc bị ức chế ở Cấp độ ức chế nấm của các Nghiệm thức các ngày sau cấy loại thuốc hóa học 5 NSC 7 NSC 5 NSC 7 NSC Đối chứng - - - - Sherpa 25EC 28,80c 26,11b 1 1 Plutel 1,8 EC 43,96b 40,08b 1 1 Oshin 20WP 4,70d 5,98c 1 1 Actara 25WG 2,60d 2,56c 1 1 CV (%) 7,72 19,42 Số liệu ở bảng 3.2 cho thấy, vào thời điểm 5NSC và 7 NSC, cả 4 loại thuốc trừ sâu đều có tác động đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces sp., tuy nhiên các loại thuốc thử nghiệm nêu trên chỉ có tác động thấp (chỉ bị ảnh hưởng ở cấp 1, cấp thấp nhất, theo Hassan (1999). Trong 4 loại thuốc hóa học, thuốc Actara 25WG có ảnh hưởng thấp nhất (ở 5 NSC là 2,6 % và ở 7 NSC là 2, 56 %), tiếp theo là Oshin 20WP (ở 5 NSC là 4,7 % và 7 NSC là 5,98 %), Sherpa 25EC xếp thứ ba (5 NSC là 28,8 và 7 NSC là 26,11 %). Plutel 1,8 EC có tác động nhiều nhất 40
  51. Đồ án tốt nghiệp trong 4 loại thuốc (ở 5 NSC là 43,96% và ở 7 NSC là 40,08%). Kết quả trên cho thấy, khi sử dụng chế phẩm sinh học phòng trừ tuyến trùng từ nấm Paecilomyces sp. trong trường hợp cần thiết có thể kết hợp sử dụng chung với cả bốn loại thuốc hóa học trên. 3.2.2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của Paecilomyces sp. Bảng 3. 3. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. Đường kính tán nấm (cm) qua các ngày nuôi cấy Nghiệm thức 3 NSC 5 NSC 7 NSC Đối chứng 2,37a ± 0,15 3,18a ± 0,07 3,8a ± 0,17 Carbenzim 50WP 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00 Cup 2,9 SL 1,95b ± 0,38 2,1b ± 0,1 3,03b ± 0,06 Saizole 5SC 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00 Antracol 70WP 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00 CV (%) 21,83 5,33 5,97 Bảng 3. 4. Tỷ lệ khuẩn lạc bị ức chế Tỷ lệ (%) khuẩn lạc bị ức chế ở Cấp độ ức chế nấm của các Nghiệm thức các ngày sau cấy loại thuốc hóa học 5 NSC 7 NSC 5 NSC 7 NSC Đối chứng - - - - Carbenzim 100,00a 100,00a 4 4 50WP Cup 2,9 SL 33,99b 20,09b 1 1 Saizole 5SC 100,00a 100,00a 4 4 Antracol 100,00a 100,00a 4 4 70WP CV (%) 2,61 2,25 41
  52. Đồ án tốt nghiệp Kết quả ở bảng 3.3 và bảng 3.4 cho thấy có 3 loại thuốc trừ bệnh ức chế hoàn toàn 100 % sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. là Saizole 5SC, Antracol 70WP và Carbenzin 50WP. Riêng thuốc Cup 2,9 SL có tỷ lệ ức chế khuẩn lạc thấp nhất là 33.9% sau 5 NSC và 20,09 % ở thời điểm 7 NSC, chỉ ức chế ở cấp 1 (theo Hassan, 1989). Vì vậy, khi phun chế phẩm nấm Paecilomyces sp. cần lưu ý không phun đồng thời cùng với các loại thuốc hóa học là Carbenzin 50 WP, Saizole 5SC và Antracol 70WP. Còn thuốc hóa học Cup 2,9 SL có tác động ức chế thấp đối với nấm Paecilomyces sp. nên có thể sử dụng chung khi phun trên đồng ruộng. A B E C D Hình 3.3. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc hóa học (A: Antracol 70WP; B: Cup 2,9 SL; C: Saizole 5SC; D: Carbenzin 50WP; E: đối chứng) 42
  53. Đồ án tốt nghiệp 3.2.3. Khảo sát khả năng đồng sinh trưởng của nấm Trichoderma sp. và Paecilomyces sp. Tiến hành thí nghiệm như ở mục 2.3.8 và lần lượt đo đường kính khuẩn lạc của nấm Paecilomyces sp. sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. Bảng 3. 5. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. Đường kính tản nấm Tỷ lệ ức chế Mức độ đối Công thức sau 7 ngày nuôi cấy (%) kháng Đối chứng 2,80 ± 0,36 - - Nấm Paecilomyces Đối kháng yếu 2,10 ± 0,30 24,33 sp. nuôi cấy (-) Bảng 3. 6. Đường kính tản nấm Trichoderma sp. khi cấy đồng thời với nấm Paecilomyces sp. Đường kính tản nấm Tỷ lệ ức chế Mức độ đối Công thức sau 7 ngày nuôi cấy (%) kháng Đối chứng 8,3 ± 0,26 - - Nấm Trichoderma sp. Đối kháng yếu 5,57 ± 0,66 32,93 nuôi cấy (-) Theo như kết quả thu nhận được, khi nuôi cấy đồng thời hai loại nấm Trichoderma sp. và Paecilomyces sp. trên môi trường PDA, nấm Trichoderma sp. có ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp., tuy nhiên chỉ có ảnh hưởng yếu. Ở thời điểm 7 NSC, tỷ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp. và nấm Trichoderma sp. lần lượt là 24,33 % và 32,93 %, nấm Trichoderma sp. đối kháng yếu với nấm Paecilomyces sp., theo hình chụp được từ kính hiển vi, hai loại nấm này chỉ cạnh tranh chất dinh dưỡng và không gian sống. Vì vậy, khi sử dụng chế phẩm Paecilomyces sp. có thể kết hợp sử dụng Trichoderma sp. nhưng cần lưu ý sử dụng liều lượng hợp lý. 43
  54. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.4. Đĩa nấm khi cấy đồng thời Trichoderma sp. và Paecilomyces sp. Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển của nấm Pacilomyces sp. (môi trường lỏng) 3.3.1. Khảo sát môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces sp. Bảng 3. 7. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. sau thời gian nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc. Thời điểm nuôi cấy (x108 cfu) 2 ngày 4 ngày 6 ngày 9 ngày 12 ngày 14 ngày CDB 2,14b 2,57c 10,40bc 6,45c 2,87c 1,14b CMB 1,45b 1,95c 3,60c 2,18d 2,45c 0,80b SDAY1 7,25a 20,95b 21,35b 15,65b 7,11b 5,49a 44
  55. Đồ án tốt nghiệp SDAY3 5,49ab 37,24a 45,30a 33,70a 11,57a 3,73ab CV (%) 22,37 20,69 18,82 8,22 25,28 23,89 Nấm Paecilomyces sp. được nuôi cấy lỏng lắc trên 4 loại môi trường thí nghiệm trong 14 ngày, ở mỗi thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày tiến hành lấy dịch sinh khối. A B C D Hình 3.5. Dịch nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường. (A: Môi trường CDB; B: Môi trường CMB; C: Môi trường SDAY1; D: Môi trường SDAY3). 45
  56. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3. 8. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. tính theo logarit Mật độ bào tử tính theo logarit 2 ngày 4 ngày 6 ngày 9 ngày 12 ngày 14 ngày CDB 8,32a ± 0,15 8,79bc ± 0,49 8,99bc ± 0,20 8,80ab ± 0,07 8,45b ± 0,08 8,06b ± 0,00 CMB 7,93a ± 0,70 8,28c ±0,16 8,55c ± 0,05 7,97b ± 0,92 8,39b ± 0,06 7,90b ± 0,07 SDAY1 8,86a ± 0,00 9,31ab ± 0,13 9,32ab ±0,11 9,19ab ± 0,05 8,85a ± 0,07 8,74a ± 0,01 SDAY3 8,74a ± 0,00 9,57a ± 0,01 9,65a ± 0,02 9,53a ± 0,01 9,06a ± 0,10 8,56a ± 0,16 CV(%) 4,23 2,96 1,28 5,19 0,91 1,03 Qua kết quả ở bảng 3.8 cho thấy, ở các thời điểm đều có sự gia tăng về sinh khối nấm so với lượng sinh khối nấm cấy vào ban đầu. Ở thời điểm 2 ngày sau cấy, môi trường SDAY1 có ưu thế tạo nhiều bào tử hơn (mật độ bào tử là 7,25.108 bào tử / ml), tiếp đến là môi trường SDAY3 với mật độ bào tử là 5,49.108 bào tử / ml. Tuy nhiên, cả 2 môi trường này đều tạo ra số lượng bào tử tương đối như nhau, không có sự sai khác có nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa 5 %. Ở thời điểm 4 ngày sau khi cấy, môi trường SDAY3 cho lượng bào tử cao nhất, đạt 37,24.108 bào tử / ml, tiếp đến là môi trường SDAY1 là 20,95.108 bào tử / ml. Cả hai môi trường CDB (2,57.108 bào tử / ml) và CMB (1,95.108 bào tử / ml) cho lượng bào tử thấp hơn nhiều so với 2 loại môi trường trên. Ở thời điểm 6, 9 và 12 ngày sau khi cấy, môi trường SDAY3 vẫn trội hơn ba loại môi trường còn lại. Mật độ bào tử lần lượt sau 6, 9 và 12 ngày sau cấy là 45,30.108 bào tử / ml, 33,70.108 bào tử / ml, 11,57.108 bào tử / ml. Tiếp theo là môi trường SDAY1 với mật độ bào tử lần lượt là 21,35.108 bào tử / ml, 15,65.108 bào tử / ml, 7,11.108 bào tử / ml. Môi trường CDB đạt lượng bào tử thấp hơn là 10,40.108 bào tử / ml, 6,45.108bào tử / ml và 2,87.108 bào tử / ml.Môi trường CMB cho lượng bào tử thấp nhất là 3,60.108 bào tử / ml; 2,18.108 bào tử / ml; 2,45.108 bào tử / ml. Điều này cũng phù hợp với nghiên cứu của Lê Hữu Phước (2009), tác giả đã khẳng 46
  57. Đồ án tốt nghiệp định rằng ở thời điểm 6 NSC là thời điểm thu mật độ bào tử cao nhất cho nấm Paecilomyces sp. Ở thời điểm 14 ngày sau cấy, hai môi trường SDAY1 và SDAY3 đều cho lượng bào tử (5,49.108 bào tử / ml và 3,73.108 bào tử / ml) cao hơn so với hai loại môi trường CDB, CMB. Tuy nhiên, không có sự khác biệt có nghĩa ở hai môi trường SDAY1 và SDAY3 với mức ý nghĩa 1%. Điều này cũng trùng khớp với các nghiên cứu của Trần Thị Tho (2014), trong các loại môi trường trên, môi trường SDAY3 là loại môi trường thích hợp để nhân nuôi nấm Paecilomyces sp. Kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Boucias và Pendland (1998), các tác giả nhận định rằng nấm Paecilomyces có thể dễ dàng nuôi cấy trên môi trường Sabouraud dextrose. Ngoài ra, các nghiên cứu được tiến hành trongnước cũng có kết quả tương tự, Phạm Thị Thùy và ctv. (1995) đã xác định môi trường Sabouraud bổ sung thêm khoáng chất là môi trường nhân giống nấm Paecilomyces sp. tốt nhất. 47
  58. Đồ án tốt nghiệp Mật độ bào tử tính theo logarit 12.00 10.00 9.57 9.66 9.53 9.31 9.32 9.00 9.19 9.06 8.86 8.79 8.81 8.85 8.74 8.55 8.568.74 8.32 8.28 8.398.45 8.00 7.93 7.97 7.908.06 6.00 4.00 2.00 0.00 2 ngày 4 ngày 6 ngày 9 ngày 12 ngày 14 ngày CDA CMA SDAY1 SDAY3 Hình 3.6. Mật độ bào tử tính theo logarit trên bốn loại môi trường lỏng. 48
  59. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào biểu đồ về khả năng sinh bào tử sau 14 ngày nuôi cấy, tất cả 4 loại môi trường đều làm tăng mật độ bào tử. Hai môi trường SDAY1 và SDAY3 cho mật số bào tử cao hơn so với CDB và CMB ở thời điểm 2 ngày, tuy giữa chúng không khác biệt nhau về mặt thống kê. Có thể thấy rằng, bắt đầu từ thời điểm 6 ngày sau cấy, mật độ bào tử đạt cao nhất và bắt đầu giảm xuống ở thời điểm 9 ngày, 12 ngày và 14 ngày. Khả năng tạo bào tử ở 4 môi trường dinh dưỡng cao nhất ở 6 ngày. Mật độ bào tử cao nhất ở môi trường SDAY3 (45,30 x108 bào tử / ml) và thấp nhất là môi trường CMB, chỉ có 3,60 x108 bào tử / ml. Hai môi trường SDAY1 và CDB cho mật số bào tử lần lượt là 21,45 x108 bào tử / ml và 10,40 x108 bào tử / ml. Vì vậy, khi lên men thu sinh khối nấm Paecilomyces sp. trên môi trường lỏng, lắc 150 vòng/ phút, thời điểm thu sinh khối để cho lượng sinh khối đạt cao nhất là 6 ngày sau khi cấy. 3.3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển của nấm Paecilomyces sp. (môi trường rắn) Chủng nấm Paecilomyces sp. đã được nhân giống cấp 1 trên môi trường PDA. Tiến hành thí nghiệm xác định môi trường nhân sinh khối nấm cấp 2 trong chai trên các nguồn cơ chất như trấu, ngô mảnh , lúa và gạo tấm sau 14 ngày. 49
  60. Đồ án tốt nghiệp A B C D Hình 3.7. Hình nấm Paecilomyces sp. được nuôi cấy trên 4 loại môi trường rắn(A: môi trường ngô mảnh, B: môi trường gạo tấm, C: môi trường lúa, D: môi trường cám) Sau 14 ngày, tiến hành lấy sinh khối nấm pha loãng đến nồng độ 109 và cấy trang trên môi trường PDA. Kết quả xác định môi trường tối ưu nhân sinh khối nấm được thể hiện trong bảng 3.9. 50
  61. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3. 9. Số lượng bào tử sau 14 ngày nuôi cấy Số lượng bào tử Mật độ tế bào Nghiệm thức (*1010 bào tử / g) theo logarit Lúa 0,55c 9,74c ± 0,02 Cám trấu 0,21c 9,32d ± 0,05 Gạo tấm 2,34b 10,37b ± 0,06 Ngô mảnh 3,64a 10,55a ± 0,09 CV (%) 22,84 0,60 Ghi chú: lượng cấy giống ban đầu là 9,44x106 bào tử / g cơ chất. Mật độ tế bào trên 4 loại môi trường rắn theo logarit. 11 10.5 10 Mật độ tế bào 9.5 theo logarit 9 8.5 Gạo Bắp Lúa Cám Hình 3.8. Mật độ tế bào sau 14 ngày lên men rắn trên 4 loại môi trường. Kết quả cho thấy rằng, sau 14 ngày nuôi cấy, mật độ bào tử đạt cao nhất khi nuôi cấy trên môi trường ngô mảnh (3,643 x 1010 bào tử / g), tiếp theo là môi trường gạo tấm (2, 343 x 1010 bào tử / g), nuôi cấy cho sinh khối thấp nhất ở môi trường lúa (0,500 x 1010 bào tử / g) và cám trấu (0,21 x 1010 bào tử / g). Vì vậy, khi đưa vào sản xuất chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp. nên sử dụng ngô mảnh hoặc gạo tấm làm chất mang. Vì vậy, sinh viên quyết định chọn ngô mảnh và gạo tấm lên men theo mẻ số lượng lớn. Thử nghiệm nhân sinh khối nấm Paecilomyces sp. trên khay nhựa Thử nghiệm nhân sinh khối nấm Paecilomyces sp. trên môi trường gạo tấm với dụng cụ là các khay có kích thước 50 x 50 cm. Mỗi khay gồm 1 kg gạo tấm 51
  62. Đồ án tốt nghiệp ngâm nở, hấp tiệt trùng 121 0C, 1 atm trong 15 phút. Mật độ cấy giống ban đầu là 5.106 bào tử / ml, lên men ở nhiệt độ phòng trong thời gian 14 ngày. Bảng 3. 10. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. nhân nuôi trên khay ngô mảnh và gạo tấm. Mật độ bào tử (bào tử / g) Ngô mảnh Gạo tấm Lần 1 2,41.1010 1,68. 1010 Lần 2 4,44.1010 2,33.1010 Lần 3 4,08.1010 3,02.1010 Trung bình 3,64.1010 2,34.1010 Kết quả ở bảng 3.10 và hình 3.9 cho thấy nấm Paecilomyces sp. phát triển tốt trên cả hai loại môi trường ngô mảnh và gạo tấm. Sau 14 ngày nuôi cấy, cả hai loại môi trường đều cho số lượng mật độ lớn tương đương với nhau. Hình 3.9. Nấm Paecilomyces sp. nhân nuôi trên khay. Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces sp. 3.4.1. Trong điều kiện phòng thí nghiệm Tiến hành khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng cái Meloidogyne sp. ký sinh trên rễ cây hồ tiêu theo phương pháp nêu ở mục 2.3.8 trong thời gian 4 ngày 52
  63. Đồ án tốt nghiệp trong môi trừơng thạch đĩa PDA với nấm Paecilomyces sp. nuôi cấy 5 ngày tuổi. Tiến hành thu kết quả sau từng ngày lây nhiễm. Bảng 3. 11. Tỷ lệ phần trăm số tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị nấm Paecilomyces sp. ký sinh. Thời Tỷ lệ tuyến trùng cái bị lây nhiễm nấm Paecilomyces sp. gian (%) Tỷ lệ trung bình sau sau 3 lần thí Đợt 1 Đợt 2 Đợt 3 lây nghiệm (%) nhiễm (ngày) 1 37,5 ± 12,5 33,33 ± 7,22 59,72 ± 7,22 37,5 ± 8,84 2 54,17 ± 7,22 58,33 ± 14,43 54 ± 19,09 55,56 ± 12,67 3 58,33 ± 19,10 58,33 ± 26,02 68,75 ± 25 59,72 ± 20,52 4 79,17 ± 19,10 95,83 ± 7,22 71,88 ± 12,5 82,29 ± 12,94 Kết quả thí nghiệm ở bảng 3.11 cho thấy chủng nấm Paecilomyces sp. có khả năng ký sinh con cái tuyến trùng cao. Tỷ lệ nấm Paecilomyces sp. ký sinh con cái tuyến trùng cao nhất ở thời điểm 4 ngày sau khi cho lây nhiễm (đạt 82,29 %). 53
  64. Đồ án tốt nghiệp A B C D E F Hình 3.10. Nấm Paecilomyces sp. tấn công con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne sp.; (A, B: con cái tuyến trùng trước khi lây nhiễm nấm; C, E: con cái tuyến trùng bị lây nhiễm nấm được soi dưới kính hiển vi; D, F: con cái và con cái mang túi trứng của tuyến trùng bị nhiễm nấm Paecilomyces sp. soi dưới kính hiển vi sau khi nhuộm Methylene blue). Qua kết quả quan sát sự lây nhiễm của tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bởi nấm Paecilomyces sp. cho thấy sợi nấm Paecilomyces sp. ký sinh bao phủ khắp các phần cơ thể tuyến trùng cái. Sự xâm nhập của nấm Paecilomyces sp. đã được ghi nhận trong bài báo của tác giả Morgan-Jone et.al (1984), nấm Paecilomyces sp. tấn công tuyến trùng cái qua các phần bị trầy xướt, qua hậu môn hoặc âm đạo của tuyến trùng cái. Tuy nhiên một số tác giả khác như Jatala (1986) lại giải thích rằng nấm Paecilomyces sp. tấn công cơ thể tuyến trùng cái Meloidogyne sp. chỉ qua những chổ mở của cơ thể. Khi quan sát sự lây nhiễm trên trứng tuyến trùng, nấm Paecilomyces sp. cho thấy mạng lưới sợi nấm phân nhánh đến nhiều trứng. Phần cuối của hệ sợi có 1 cấu trúc sợi sắt nhọn được xem như là giác bám giúp bám vào vỏ trứng tuyến trùng. 54
  65. Đồ án tốt nghiệp Những trứng bị nấm Paecilomyces sp. tấn công có biểu hiện bị teo lại (do áp lực của mạng lưới sợi nấm). Đây là phương pháp xâm nhập vật chủ bằng cơ học (theo giải thích của tác giả Holland et al., 1999). Khi sợi nấm chạm vào bề mặt trứng, nó phản ứng tiếp xúc bằng cách hình thành những giác bám. Sau đó, dùng chất dính kết giúp cho việc kết nối nấm và vật chủ. (Lopez-Llorea et. al, 2002) 3.4.2. Trên đồng ruộng Chế phẩm Paecilomyces sp. lên men có mật độ 1010 bào tử / ml được chuyển đến vườn trồng tiêu thuộc xã Đa Kia, huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước để thử nghiệm. Sau 15 ngày thử nghiệm, quan sát đặc điểm hình thái cây trong vườn hồ tiêu ở các nghiệm thức thí nghiệm và nhận xét kết quả. Số liệu ở bảng 3.12 cho thấy, các trụ tiêu thí nghiệm ở các công thức đối chứng của nông dân và công thức tưới nấm đều bị tuyến trùng gây hại khá nặng, hơn 1/3 số lá bị vàng (hình 3.13), theo QCVN 01 – 172 : 2014/BNNPTNT, toàn bộ các cây thí nghiệm đều bị hại ở cấp 2 (< 1 / 3 - < 2 / 3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán cây bị vàng. Sau 15 ngày thí nghiệm, các cây tiêu của công thức phun nấm không có biểu hiện vàng thêm và cấp hai cũng chỉ ở mức cấp 2. Trong khi đó, công thức đốichứng đã có 3 cây bị chết. Tuy chưa đủ thời gian để đánh giá đầy đủ hiệu quả của thí nghiệm, nhưng kết quả bước đầu cho thấy, trên điều kiện đồng ruộng, nấm Paecilomyces sp. cho hiệu quả khống chế tuyến trùng gây hại hồ tiêu có chiều hướng tốt hơn so với đối chứng phun thuốc hóa học của nông dân (bảng 3.12) Bảng 3. 12. Đánh giá cấp hại của tuyến trùng trên cây hồ tiêu. Cấp hại của cây tiêu Cấp hại của cây tiêu sau tưới Công thức trước tưới 15 ngày Đối chứng 2 2,25 (đã có 3 cây bị chết) Tưới nấm 2 2 55
  66. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.11. Người dân pha chế phẩm Paecilomyces sp. tưới vào gốc cây hồ tiêu 56
  67. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.12. Trước khi tưới. Hình 3.13. Sau khi tưới. 57
  68. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Trong bốn loại môi trường lỏng, môi trường SDAY3 cho mật độ bào tử cao nhất, thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces sp. - Môi trường ngô mảnh và gạo tấm thích hợp nhất để nhân giống sản xuất chủng nấm Paecilomyces sp. - Trong các loại thuốc BVTV khảo nghiệm, các loại thuộc trừ sâu Sherpa 25EC, Plutel 1,8 EC, Oshin 20WP và Actara 25WG đều có ảnh hưởng nhẹ đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Trong các loại thuốc trừ nấm, Cup 2,9 SL có ảnh hưởng nhẹ đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp., còn các loại thuốc Carbenzim 50WP, Saizole 5SC và Antracol 70 WP đều có tác động mạnh (cấp độ 4). - Nấm Paecilomyces sp. có khả năng kí sinh tuyến trùng cái Meloidogyne sp. hại cây hồ tiêu với tỷ lệ 82,29 % sau 4 ngày. - Trên đồng ruộng, nấm Paecilomyces sp. có khả năng làm giảm triệu chứng bệnh do tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu ở thời điểm 15 ngày sau khi tưới. Kiến nghị - Định danh chủng nấm Paecilomyces sp. để có kết luận chính xác hơn và phù hợp hơn với các nghiên cứu khoa học khác. - Xác định LD50 và LC50 của nấm Paecilomyces sp. trên tuyến trùng, xác định liều lượng sử dụng trong công tác BVTV sao cho hiệu quả và tiết kiệm. - Tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp. như độ ẩm, các loại khoáng chất, nhiệt độ, và thời gian bảo quản chế phẩm. - Tiến hành đánh giá khả năng ký sinh tuyến trùng của chế phẩm Paecilomyces sp. ở quy mô lớn hơn. 58
  69. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Lê Thị Mai Châm (2014). Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp. trên cây hồ tiêu. Ngô Thị Thu Hà (2013). Nghiên cứu phân lập nấm Purpureocillium lilacinum để phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp. Nguyễn Hoài Hương (2014). Công nghệ lên men. Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Lê Trần Quang Huy (2015). Đánh giá khả năng kí sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại cây trồng của chủng nấm Paecilomyces sp. Lê Hữu Phước (2009). Phân lập và chọn môi trường nhân sinh khối ba loài nấm ký sinh tuyến trùng Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok, Beauveria bassiana (Bals.) Vuill và Paecilomyces spp. trên nhóm rau ăn lá ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Bùi Cách Tuyến – Lê Đình Đôn. Cây hồ tiêu Bệnh hại và biện pháp phòng trừ. Nhà xuất bản nông nghiệp. Trần Thị Tho, Trần Văn Hai, Trịnh Thị Xuân (2014). Khảo sát đặc tính sinh học của các chủng nấm tím Paecilomyces javanicus ký sinh rệp sáp giả tại Đồng Bằng Sông Cửu Long. Phùng Lê Kim Yến (2014). Phân lập nấm Paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được. Tài liệu tiếng anh A. Usman and M.A. Siddiqui (2012). Effect of some fungal strains for the management of rootknot nematode (Meloidogyne incognita) on eggplant (Solanum melongena). Journal of Agricultural Technology 8(1): 213-218. Abhishek Sharma & Satyawati Sharma & Aditya Mittal & Satya Narayan Naik, 2012. Statistical optimization of growth media for Paecilomyces lilacinus 6029 using non-edible oil cakes. 59
  70. Đồ án tốt nghiệp Huma Abbas , Nazir Javed , Sajid Aleem Khan , Muhammad Kamran , Muhammad Atiq, 2016. Exploitation of Nematicidal Potential of Paecilomyces lilacinus against Root Knot Nematode on Eggplant. Juan Morales – Ramos, Guadalupe Rojas, David I. Shapiro-Ilan, 2014. Mass production of benefical organisms. Lee JS, Iung WC, Park SJ, Lee KE, Shin WC, Hong Ex, 2012. Culture conditions and medium components for the production of mycelial biomass and exo-polysaccharides with Paecilomyces japonica in liquid culture. Li Gao, 2014. Optimization of Culture Medium for Sporulation and Biomass Production of a Nematophagous Fungus: Consideration of Nutritional and Environmental Conditions. M. Nars Esfahani and B. Ansari Pour, 2006. The effects of Paecilomyces lilacinus on the Pathogenesis of Meloidogyne Javanica and Tomato plant growth parameters. Marie-Stéphane Tranier, Johan Pognant-Gros, Reynaldo De la Cruz Quiroz, Cristóbal Noé Aguilar González , Thierry Mateille , Sevastianos Roussos, 2014. Commerical biological control agents targeted against plant-parasitic root – knot namatodes. Mark A. Jackson, Micheal R. Macguire, Lawrence A. Lacey and Stephen P. Wraight, 1997. Liquid culture production of desiccation tolerant blastospores of the bioinsecticidal fungus Paecilomyces fumosoroseus Mendoza A. R., R. A. Sikora, và S. Kiewnick ,2007. Effects of Paecilomyces lilacinus protease and chitinase on the eggshell structures and hatching of Meloidogyne javanica juveniles. Mendoza A. R., R. A. Sikora, and S. Kiewnick. 2007. Influence of Paecilomyces lilacinus strain 251 on the biological control of the burrowing nematode Radopholus similisin banana. Nematropica 37:203-213. 60
  71. Đồ án tốt nghiệp Pau, C.G., C.T.S. Leong, S.K. Wong, L. Eng, M. Jiwan, F.R. Kundat, Z.F.B.A. Aziz, O.H. Ahmed and N.M. Majid, 2012. Isolation of Indigenous Strains of Paecilomyces lilacinus with Antagonistic Activity against Meloidogyne incognita Poornima Sharma1 and Rakesh Pandey, 2009. Biological control of root- knot nematode; Meloidogyne incognita in the medicinal plant; Withania somnifera and the effect of biocontrol agents on plant growth. R. P. Esser and N. E. El-Gholl, 1993. Paecilomyces lilacinus, a fungus that parasitizes nematode eggs. S. Prabhu, S. Kumar and S. Subramanian, 2008. Mass production and commercial formulation of Paecilomyces lilacinus. Zhen Yu, You – chi Zhang, Xiang Zhang và Yin Wang, 2015. Conversion of food waste into biofertilizer for the biocontrol of root - knot nematode by Paecilomyces lilacinus. Tài liệu từ internet wiki/Purpureocillium&prev=search %E1%BB%83n+th%C3%A0nh+n%E1%BA%A5m+purple&oq=N%E1%BA%A5 m+Paecilomyces+sp+chuy%E1%BB%83n+th%C3%A0nh+n%E1%BA%A5m+pur ple&aqs=chrome 69i57.21784j0j7&sourceid=chrome&ie=UTF- 8#q=n%E1%BA%A5m+Paecilomyces+sp+wiki Incognita-tren-ca-phe-cua-nam-Paecilomyces-Javanicus-8655.html 61
  72. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A. XỬ LÝ THỐNG KÊ A.1. ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ BỆNH ĐẾN ĐƯỜNG KÍNH KHUẨN LẠC NẤM PAECILOMYCES SP. Đường kính tản nấm ở thời điểm 3NSC 14:48 Wednesday, January 7, 2004 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NT 5 Actara 25WG Oshin 20WP Plutel Sherpa 25EC ĐC Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 2.69733333 0.67433333 56.19 F NT 4 2.69733333 0.67433333 56.19 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for KQ Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.012 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.1993 Means with the same letter are not significantly different. 1
  73. Đồ án tốt nghiệp t Grouping Mean N NT A 2.46667 3 ĐC A 2.33333 3 Actara 25WG B 1.96667 3 Oshin 20WP C 1.70000 3 Sherpa 25EC D 1.30000 3 Plutel Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.012 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 0.2835 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NT A 2.46667 3 ĐC A 2.33333 3 Actara 25WG B 1.96667 3 Oshin 20WP B 1.70000 3 Sherpa 25EC C 1.30000 3 Plutel Đường kính tản nấm ở thời điểm 5NSC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 4.67166667 1.16791667 152.34 F NT 4 4.67166667 1.16791667 152.34 <.0001 Alpha 0.01 2
  74. Đồ án tốt nghiệp Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.007667 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 0.2266 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NT A 3.18333 3 ĐC A 3.10000 3 Actara 25WG A 3.03333 3 Oshin 20WP B 2.23333 3 Sherpa 25EC C 1.78333 3 Plutel Đường kính khuẩn lạc ở thời điểm 7NSC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 6.48933333 1.62233333 38.63 F NT 4 6.48933333 1.62233333 38.63 <.0001 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.042 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 0.5303 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NT A 3.8000 3 ĐC 3
  75. Đồ án tốt nghiệp A 3.7667 3 Actara 25WG A 3.6333 3 Oshin 20WP B 2.8000 3 Sherpa 25EC C 2.1333 3 Plutel A.2. TỶ LỆ (%) ỨC CHẾ SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM PAECILOMYCES SP. Ở thời điểm 3NSC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 17413.20603 4353.30151 95.16 F NT 4 17413.20603 4353.30151 95.16 <.0001 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 45.74573 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 17.502 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NT A 100.000 3 ĐC B 46.500 3 Plutel C B 29.480 3 Sherpa 25EC C D 12.167 3 Oshin 20WP D 4.100 3 Actara 25WG Ở thời điểm 5NSC Sum of 4
  76. Đồ án tốt nghiệp Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 18880.65776 4720.16444 603.40 F NT 4 18880.65776 4720.16444 603.40 F Model 4 18682.77103 4670.69276 101.59 <.0001 Error 10 459.74507 45.97451 Corrected Total 14 19142.51609 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.975983 19.42414 6.780450 34.90733 5
  77. Đồ án tốt nghiệp Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 4 18682.77103 4670.69276 101.59 F Model 4 16.01066667 4.00266667 121.91 F NT 4 16.01066667 4.00266667 121.91 <.0001 anh huong tren MT khang benh 3N 4 6
  78. Đồ án tốt nghiệp 02:59 Saturday, January 17, 2004 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for KQ Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.032833 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 0.4689 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NT A 2.3667 3 ĐC B 1.7833 3 Cup C 0.0000 3 Carbenzi C 0.0000 3 Saizole C 0.0000 3 Antracol Ở thời điểm 5 ngày The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 26.88266667 6.72066667 2122.32 F NT 4 26.88266667 6.72066667 2122.32 <.0001 The ANOVA Procedure 7
  79. Đồ án tốt nghiệp t Tests (LSD) for KQ Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.003167 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 0.1456 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NT A 3.18333 3 ĐC B 2.10000 3 Cup C 0.00000 3 Carbenzi C 0.00000 3 Saizole C 0.00000 3 Antracol A.4. SỐ LƯỢNG BÀO TỬ NẤM PAECILOMYCES SP. Ở thời điểm 2 ngày Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 45.42430000 15.14143333 18.12 0.0086 Error 4 3.34190000 0.83547500 Corrected Total 7 48.76620000 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.931471 22.37560 0.914043 4.085000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 3 45.42430000 15.14143333 18.12 0.0086 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.835475 Critical Value of t 4.60409 Least Significant Difference 4.2083 8