Đồ án Phân lập vi khuẩn có khả năng phân huỷ Cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu

Nội dung text: Đồ án Phân lập vi khuẩn có khả năng phân huỷ Cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu

1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HUỶ CELLULOSE TRONG MỤN DỪA VÀ VỎ TIÊU NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG SVTH: NGÔ HOÀNG HUY MSSV: 0851110095 Tp. Hồ Chí Minh, năm 2012
2. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC 1. Đặt vấn đề 1 2. Tình hình nghiên cứu 2 2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 2 2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 4 3. Mục đích nghiên cứu 5 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 5 5. Phương pháp nghiên cứu 5 6. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 5 7. Kết quả đạt được 6 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7 1.1. Hiện trạng của vỏ tiêu và mụn dừa 7 1.1.1. Vỏ tiêu 7 1.1.2. Mụn dừa 8 1.2. Thành phần và tính chất hóa học của mụn dừa 13 1.2.1. Lignin 14 1.2.2. Hemicellulose 16 1.2.3. Tannin 18 1.2.4. Cellululose 19 1.2.4.1 .Giới thiệu 19 Trang i
3. Đồ án tốt nghiệp 1.2.4.2. Enzyme phân giải cellulose (enzyme cellulase) 22 1.2.4.3. Nguồn gốc enzyme cellulase 26 1.2.4.4. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 34 1.2.4.5. Ứng dụng của enzyme cellulase 36 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 40 2.1.1. Thời gian 40 2.1.2. Địa điểm 40 2.2. Vật liệu 40 2.2.1. Nguồn mẫu 40 2.2.2. Hóa chất 40 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị 41 2.2.3.1. Dụng cụ 41 2.2.3.2. Thiết bị 42 2.2.4. Thiết kế thí nghiệm 42 2.2.4.1. Mục tiêu 42 2.2.4.2. Thiết kế thí nghiệm 43 2.2.5. Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm 47 2.3. Tiến hành thí nghiệm 49 2.3.1. Mục tiêu 1: Phân lập vi khuẩn chịu nhiệt phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu 49 Trang ii
4. Đồ án tốt nghiệp 2.3.1.1. Thí nghiệm:Tăng sinh mẫu có xử lý nhiệt 49 2.3.1.2. Thí nghiệm: Sàng lọc mẫu tăng sinh chứa quần thể vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ thạch 51 2.3.1.3. Thí nghiệm: Phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trên môi trường thạch chứa CMC 52 2.3.2. Mục tiêu 2: Sàng lọc vi khuẩn phân hủy cellulose từ các chủng phân lập 53 2.3.2.1. Thí nghiệm: Khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC 53 2.3.2.2. Thí nghiệm: Khảo sát khả năng mọc của các chủng trên môi trường thạch có chứa giấy lọc 54 2.3.3. Mục tiêu 3: Khảo sát hình thái khuẩn lạc tế bào, bào tử và phản ứng sinh hóa vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase 56 2.3.3.1. Thí nghiệm: Khảo sát hình thái khuẩn lạc,bào tử vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase 56 2.3.3.2. Thí nghiệm: Khảo sát một số phản ứng sinh hóa các chủng phân lập có hoạt tính cellulase 58 2.3.4. Mục tiêu 4: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có enzyme cellulase có tiềm năng sử dụng ủ compost từ mụn dừa 58 2.3.4.1. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme CMCase và FPase 58 a. Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở các pH khác nhau 59 b. Thí nghiệm: Định tính hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH khác nhau bằng phương pháp đục lổ thạch 60 Trang iii
5. Đồ án tốt nghiệp c. Thí nghiệm: Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH 61 d. Thí nghiệm: Định lượng hoạt tính enzyme FPase của các chủng ở các pH 64 e. Thí nghiệm: Khảo sát khả năng thủy phân giấy lọc của các chủng vi khuẩn 67 2.3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng oxy đến hoạt tính enzyme CMCase và enzyme FPase của các chủng phân lập 68 a. Thí nghiệm: Chuẩn bị môi trường tăng sinh khảo sát ảnh hưởng của oxy đến hoạt tính enzyme CMCase và enzyme FPase của các chủng phân lập 68 b. Thí nghiệm: Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các giống ở 2 chế độ không lắc và lắc 150 vòng/phút 69 c. Thí nghiệm: Xác định hoạt tính enzyme FPase của các giống ở 2 chế độ không lắc và lắc 150 vòng/phút 70 2.3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng sinh enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút 71 a. Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở pH7 71 b. Thí nghiệm: Định tính hoạt tính enzyme tannase trên đĩa thạch chứa tannic acid ở điều kiện pH7 và lắc 150 vòng/phút 72 c. Thí nghiệm: Xác định hoạt tính enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút 74 Bảng 2.8: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme tannase 75 Trang iv
6. Đồ án tốt nghiệp d. Thí nghiệm: Khảo sát khả năng chịu tannic acid của các chủng phân lập ở các nồng độ khác nhau 1 %, 3 %, 5 % 75 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 78 3.1. Mục tiêu 1: Phân lập vi khuẩn chịu nhiệt phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu 78 3.1.1. Thí nghiệm:Tăng sinh mẫu có xử lý nhiệt 78 3.1.2. Sàng lọc mẫu tăng sinh quần thể vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ thạch 78 3.1.3. Thí nghiệm: Phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trên môi trường thạch chứa CMC 80 3.2. Mục tiêu 2: Sàng lọc vi khuẩn phân hủy cellulose từ các chủng phân lập 83 3.2.1. Thí nghiệm: Khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC 83 3.2.2. Thí nghiệm: Khảo sát khả năng mọc của các chủng trên môi trường thạch có chứa giấy lọc 85 3.3. Mục tiêu 3: Khảo sát hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử và phản ứng sinh hóa vi khuẩn (hoặc xạ khuẩn) phân lập có hoạt tính cellulase 87 3.3.1. Thí nghiệm: Khảo sát hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase 87 3.3.2. Thí nghiệm: Khảo sát một số phản ứng sinh hóa các chủng phân lập có hoạt tính cellulase 92 3.4. Mục tiêu 4: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có enzyme cellulase có tiềm năng sử dụng ủ compost từ mụn dừa 95 Trang v
7. Đồ án tốt nghiệp 3.4.1. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme CMCase và FPase 95 3.4.1.1. Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở các pH khác nhau 95 3.4.1.2 Thí nghiệm: Định tính (bán định lượng) hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH khác nhau trên đĩa thạch chứa CMC 96 3.4.1.2. Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH 103 3.4.1.3. Định lượng hoạt tính enzyme FPase của các chủng ở các pH 107 3.4.1.4. Khảo sát khả năng thủy phân giấy lọc của các chủng vi khuẩn 111 3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oxy đến hoạt tính enzyme CMCase và enzyme FPase của các chủng phân lập 113 3.4.2.1. Chuẩn bị môi trường tăng sinh khảo sát ảnh hưởng của oxy đến hoạt tính enzyme CMCase và enzyme FPase của các chủng phân lập 114 3.4.1.2. Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các giống ở 2 chế độ không lắc và lắc 150 vòng/phút 114 3.4.1.3. Xác định hoạt tính enzyme FPase của các giống ở 2 chế độ không lắc và lắc 150 vòng/phút 115 3.4.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút 116 3.4.3.1. Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở pH7 116 3.4.3.2. Định tính hoạt tính enzyme tannase trên đĩa thạch chứa tannic acid ở điều kiện pH7 và lắc 150 vòng/phút 116 3.4.3.3. Xác định hoạt tính enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút 118 Trang vi
8. Đồ án tốt nghiệp 3.4.3.4. Khảo sát khả năng chịu tannic acid của các chủng phân lập ở các nồng độ khác nhau 1 %, 3 %, 5 % 119 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 123 4.1 Kết luận 123 4.2 Kiến nghị 124 Trang vii
9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Diện tích và sản lượng tiêu của vùng Đông Nam Bộ và Tây Nguyên 7 Bảng 1.2: Diện tích dừa ở tỉnh Bến Tre (ha) 9 Bảng 1.3: Diện tích, năng suất và sản lượng dừa cả nước .10 Bảng 1.4: Sản lượng dừa (đơn vị 1.000 trái) của các nước trên thế giới 12 Bảng 1.5: Một số ứng dụng của mụn dừa 12 Bảng 1.6: Phân loại enzyme phân cắt β-1,4-glucan 24 Bảng 1.7: Enzyme cellulase nguồn gốc từ vi sinh vật 27 Bảng 1.8: Danh sách một số vi khuẩn (kể cả xạ khuẩn) phân hủy cellulose và đặc điểm của chúng 28 Bảng 2.1: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm dựng đường chuẩn glucose trên cơ chất là CMC 62 Bảng 2.2: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme CMCase theo pH 63 Bảng 2.3: Thành phần môi trường hóa chất của thí nghiệm chuẩn bị dung dịch glucose chuẩn 64 Trang viii
10. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.4: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm dựng đường chuẩn glucose trên cơ chất giấy lọc 65 Bảng 2.5: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme FPase ở các pH 66 Bảng 2.6: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính CMCase ở hai chế độ không lắc và lắc 70 Bảng 2.7: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính FPase 71 Bảng 2.8: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme tannase 75 Bảng 3.1: Các chủng thu được từ mẫu mụn dừa ở Cao Lãnh 81 Bảng 3.2: Các chủng thu được từ mẫu mụn dừa ở Lai Vung 82 Bảng 3.3: Các chủng thu được từ mẫu vỏ tiêu ở Bà rịa Vũng Tàu 82 Bảng 3.4: Hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC 83 Bảng 3.5: Quan sát hình thái khuẩn lạc 87 Bảng 3.6: Kết quả nhuộm gram và nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn phân lập 91 Bảng 3.7: Tổng kết kết quả phân lập và test sinh hóa các chủng 94 Trang ix
11. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.8: Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi khuẩn BHM3 ở pH khác nhau 97 Bảng 3.9: Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi khuẩn BHM4 ở pH khác nhau 97 Bảng 3.10 : Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi khuẩn BHM5 ở pH khác nhau 98 Bảng 3.11 : Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi khuẩn BHM8 ở pH khác nhau 99 Bảng 3.12 : Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi khuẩn BHM10 ở pH khác nhau 100 Trang x
12. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Các thành phần cấu tạo lignin thực vật 15 Hình 1.2: Cấu trúc lignin 16 Hình 1.3:Một số đường monomer cấu tạo hemicellulose 17 Hình 1.4: Cấu trúc hemicellulose 18 Hình 1.5: Cấu trúc tannic acid 19 Hình 1.6: Cấu trúc của cacboxyl methyl cellulose (CMC) 21 Hình 1.7: Công thức cấu tạo của cellulose 22 Hình 1.8: Cơ chế cắt cơ chất cellulose của enzyme cellulase 26 Hình 2.1: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 1 43 Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 2 44 Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 3 45 Hình 2.4: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 4 46 Hình 2.5: Các mẫu mụn dừa thu thập 49 Hình 2.6: Sơ đồ tăng sinh vi sinh vật chịu nhiệt 50 Trang xi
13. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.7: Sơ đồ sàng lọc mẫu tăng sinh chứa quần thể vi sinh vật phân huỷ cellulose 51 Hình 2.8: Sơ đồ phân lập vi sinh vật trên môi trường thạch chứa 53 Hình 2.9: Sơ đồ khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng 54 Hình 2.10: Sơ đồ tiến hành khảo sát khả năng mọc trên môi trường thạch có chứa giấy lọc 55 Hình 2.11: Mẫu enzyme ở các pH sau khi lọc 59 Hình 2.12: Sơ đồ chuẩn bị môi trường lỏng ở các pH khác nhau 60 Hình 2.13: Sơ đồ định tính hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH khác nhau bằng phương pháp đục lỗ thạch 61 Hình 2.14: Xác định hoạt tính enzyme CMCase 64 Hình 2.15: Xác định hoạt tính enzyme FPase 67 Hình 2.16: Sơ đồ khảo sát khả năng thủy phân giấy lọc của các chủng phân lập 68 Hình 2.17: Chuẩn bị môi trường khảo sát hoạt tính enzyme ở hai chế độ lắc và không lắc 69 Hình 2.18: Sơ đồ định tính khả năng sinh enzyme tannase của các chủng 73 Hình 2.19: Sơ đồ khảo sát khả năng tăng sinh khối của các chủng phân lập trong tannic acid ở các nồng độ khác nhau 77 Trang xii
14. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.1: Sàng lọc quần thể vi sinh vật tăng sinh bằng phương pháp đục lỗ thạch 80 Hình 3.2: Khả năng mọc khuẩn lạc của các chủng trên môi trường thạch có chứa giấy lọc 86 Hình 3.3 :Hình thành sinh khối trong các mẫu môi trường tăng sinh 96 Hình 3.4 : So sánh kích thước vòng halo của các chủng ở bốn pH 102 Hình 3.5 : So sánh kích thước vòng halo của các chủng ở pH7 102 Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của chủng BHM3 104 Hình 3.7: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của chủng BHM4 104 Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của chủng BHM5 105 Hình 3.9: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của chủng BHM8 105 Hình 3.10: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của BHM10 106 Hình 3.11: So sánh hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở pH7 106 Trang xiii
15. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.12: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính FPase của chủng BHM3 108 Hình 3.13: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính FPase của chủng BHM4 108 Hình 3.14: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính FPase của chủng BHM5 109 Hình 3.15: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính FPase của chủng BHM8 109 Hình 3.16: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính FPase của chủng BHM10 110 Hình 3.17: So sánh hoạt tính enzyme FPase của các chủng ở pH7 110 Hình 3.18: Khả năng thủy phân giấy lọc sau 5 ngày 112 Hình 3.19: Khả năng thủy phân giấy lọc sau 10 ngày 112 Hình 3.20: So sánh phần trăm giảm giấy lọc của các chủng sau 5và 10 ngày 112 Hình 3.21: Hoạt tính CMCase của các chủng ở hai chế độ lắc và không lắc 114 Hình 3.22: Hoạt tính FPase của các chủng ở hai chế độ lắc và không lắc 115 Hình 3.23: Khảo sát hoạt tính enzyme tannase trên môi trường thạch. 118 Trang xiv
16. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.24: Hoạt tính enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút 119 Hình 3.25. Sinh khối sau khi ly tâm . .120 Hình 3.26: Sinh khối của các chủng ở nồng độ tannic acid khác nhau 121 Trang xv
17. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nông nghiệp là ngành kinh tế quan trọng của Việt Nam. Hiện nay, Việt Nam vẫn là một nước nông nghiệp. Năm 2009, giá trị sản lượng của nông nghiệp đạt 71,473 nghìn tỷ đồng (giá so sánh với năm 1994), tăng 1,32 % so với năm 2008 và chiếm 13,85 % tổng sản phẩm trong nước. Tỷ trọng của nông nghiệp trong nền kinh tế bị sụt giảm trong những năm gần đây, trong khi các lĩnh vực kinh tế khác gia tăng. Đóng góp của nông nghiệp vào tạo việc làm còn lớn hơn cả đóng góp của ngành này vào GDP. Trong năm 2005, có khoảng 60 % lao động làm việc trong lĩnh vực nông, lâm nghiệp, và thuỷ sản. Sản lượng nông nghiệp xuất khẩu chiếm khoảng 30 % trong năm 2005. Việc tự do hóa sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là sản xuất lúa gạo, đã giúp Việt Nam là nước thứ hai trên thế giới về xuất khẩu gạo và nằm trong những nước xuất khẩu các nông sản quan trọng khác là tiêu, sợi bông, đậu phộng, cao su, đường và trà. Tuy nhiên trong sản xuất nông nghiệp hằng năm có khoảng 232 tỷ chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành nhờ quá trình quang hợp. Trong số này có 172 tỷ tấn được tạo thành ở trên đất liền và 60 tỷ tấn được tạo thành trong các đại dương. Trong số này có đến 30 % là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89 % trong bông là 40 - 50 % trong gỗ. Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái. Mặt khác đứng trước áp lực rút ngắn thời gian nhưng hiệu quả canh tác trên một diện tích đất nông nghiệp phải không ngừng tăng lên người nông dân đã áp dụng các tập quán canh tác mới như cải thiện giống, bón phân, Hiện nay có rất nhiều loại phân bón sử dụng trong nông nghiệp như: phân hữu cơ, phân sinh học, phân vi sinh. Tuy nhiên việc phụ thuộc quá nhiều vào phân hóa học và loại bỏ rơm rạ, phụ phế phẩm vừa Trang 1
18. Đồ án tốt nghiệp gây ảnh hưởng đến môi trường sống vừa lãng phí một nguồn nguyên liệu sản xuất phân bón thân thiện với môi trường. Do vậy sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh sẽ thay thế dần việc bón phân hoá học trên đồng ruộng, đất trồng trọt mà vẫn đảm bảo được nâng cao năng suất thu hoạch. Sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh về lâu dài sẽ dần dần trả lại độ phì nhiêu cho đất như làm tăng lượng phospho và kali dễ tan trong đất canh tác, cải tạo, giữ độ bền của đất đối với cây trồng nhờ khả năng cung cấp hàng loạt các chuyển hoá chất khác nhau liên tục do nhiều quần thể vi sinh vật khác nhau tạo ra. Việc sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh còn có ý nghĩa rất lớn là tăng cường bảo vệ môi trường sống, giảm tính độc hại do hoá chất trong các loại nông sản thực phẩm do lạm dụng phân bón hóa học. Trên thế giới, có hai phương pháp phổ biến để xử lý nguồn cellulose trong tự nhiên: thứ nhất là xử lý bằng vật lý và hóa học; thứ hai là xử lý các chất thải hữu cơ cellulose bằng công nghệ sinh học đặc biệt là sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ các nguồn vi sinh vật, phương pháp này tỏ ra hiệu quả hơn trong việc sản xuất phân bón, chi phí phù hợp và các điều kiện thực hiện đơn giản hơn rất nhiều so với xử lý bằng hóa học chính vì thế hiện nay có nhiều nghiên cứu tối ưu quy trình này nhằm đưa ra sản xuất rộng rãi. Một trong những yếu tố đó là nguồn giống vi sinh, yếu tố đóng vai trò chủ đạo để nâng cao hiệu quả sản xuất phân bón, rút ngắn thời gian ủ, Từ các vấn đề đặt ra ở trên tôi đi đến chọn đề tài “Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu”. 2. Tình hình nghiên cứu 2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về ứng dụng của vi nhuẩn phân hủy cellulose. Trong số đó có nghiên cứu về triển vọng của vi khuẩn phân hủy cellulose sản xuất etanol nhiên liệu. Sinh khối chứa lignocellulosic là một nguồn tài Trang 2
19. Đồ án tốt nghiệp nguyên tái tạo phong phú với tiềm năng lớn cho bioconversion để gia tăng gía trị chế phẩm sinh học. Việc đốt cháy dầu mỏ nhiên liệu hóa thạch đã trở thành một mối quan tâm đối với khí hậu toàn cầu. Đốt nhiên liệu hóa thạch cũng đã tạo ra một mối quan tâm đến nguồn dầu khí không ổn định, cũng như, việc tăng chi phí nhiên liệu. Những mối quan tâm này dẫn đến sự nỗ lực toàn cầu nghiên cứu sử dụng nguồn tài nguyên tái tạo mà vẫn đáp ứng nhu cầu năng lượng ngày càng cao của thế giới. Tại Canada tiêu chuẩn nhiên liệu tái tạo được nâng lên để các nhiên liệu sẽ chứa 5 % ethanol (năm 2010), còn ở Hoa Kỳ Cơ quan Bảo vệ môi trường tăng tiêu chuẩn nhiên liệu tái tạo của họ để sản xuất ethanol 10,21 % hỗn hợp nhiên liệu vào năm 2009, trong khi hiện tại tỷ lệ ethanol trộn trong nhiên liệu ở Brazil là 25 % (quy định tại 2007) [2,501-507]. Sinh khối chứa lignocellulosic là một nhiều tiềm năng tài nguyên để sản xuất nhiên liệu sinh học bởi vì nó phần lớn là dồi dào, rẻ tiền. Phế phẩm nông nghiệp là một nguồn chứa lignocellulosic dồi dào và rẻ tiền. nguồn tài nguyên có thể thu từ: lá, thân của một số cây nông nghiệp như: phế thải ngô, bã mía, vỏ trấu, cây thân gỗ. Ngoài ra, một số cây chuyên dụng để sản xuất năng lượng sinh học như một số loại cỏ như: cỏ Miscanthus, cỏ Bermuda, Để chuyển đổi nguồn nguyên liệu giàu của lignocellulose tới những đường dễ lên men gồm 3 bước: Giảm kích thước. Phân đoạn. Thủy phân enzyme (Pluz Wyman, 1999; Zhang và. Lynd, 2004 B). Một trong những quan trọng nhất và khó khăn thách thức công nghệ là để khắc phục tính bền của vật liệu tự nhiên chứa lignocelluloses, enzyme có khả năng thủy thủy phân để sản xuất các loại đường lên men ở điều kiện thường (Chang và cộng sự, 1981;. Trang 3
20. Đồ án tốt nghiệp Demain et al, 2005;. Fan et al, 1982. Grethlein, 1984; Hsu, năm 1996; Lin và cộng sự, 1981; McMillian, năm 1994; Millett et al, 1976;. Moreira, 2005;.Mosier et al, 2005; ngựa để cởi và cộng sự, 1993;. Weil và cộng sự, 1994. ; Wyman, năm 1999; Wyman và cộng sự, 2005a). Gần đây, các công ty công nghệ sinh học Genencor và Novozymes đã cho ra một quy trình công nghệ làm giảm chi phí sản xuất enzyme cellulase từ đó làm giảm chi phí cho quá trình lên men phế phẩm từ 5,40 USD/gallon ethanol xuống khoảng 20 cent/gallon ethanol (Moreira, 2005). Công nghệ này ngoài giảm chi phí sản xuất cellulase còn nhằm nâng cao hiệu suất lên men và rút ngắn thời gian lên men. 2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Vấn đề môi sinh ngày càng trở nên trầm trọng trên phạm vi toàn cầu. Ở Việt Nam, lượng rác thải ra ngoài môi trường ngày càng lớn, nguy cơ ô nhiễm môi trường ở nhiều nơi là rất cao. Việc sử dụng biện pháp vi sinh học trong xử lý rác thải đã và đang mang lại nhiều giá trị to lớn. Tuy nhiên, việc sử dụng các vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên để xử lý rác thải, thời gian thường kéo dài gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường, tốn nhiều diện tích và công sức. Để xử lý rác triệt để hơn, giảm giá thành và thời gian xử lý, ngoài việc tạo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phát triển tốt thì việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sinh trưởng nhanh, hoạt tính phân giải mạnh, chịu được nhiệt độ cao để bổ sung vào các bể rác là một trong những hướng nghiên cứu đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Năm 1999, Nguyễn Lan Hương và cộng sự đã phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung vào bể ủ rác thải đã rút ngắn được chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5 - 7 ngày. Năm 1999, Tăng Thị Chính và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện lên men và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt được phân lập từ bể ủ rác thải. Trang 4
21. Đồ án tốt nghiệp Cũng trong năm này, Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu và tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn ưa ấm phân lập từ mùn rác ở một số nơi có khả năng phân giải cellulose mạnh. Nghiên cứu về phân lập và định danh các dòng vi khuẩn trong dạ cỏ bò của Võ Văn Phước Duệ và Cao Ngọc Diệp năm 2011. Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose trên địa bang tỉnh Thừa Thiên Huế của tác giả Phạm Thị Ngọc Lan. Ngoài ra còn có nghiên cứu khác về phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose từ các nguồn giàu xơ khác như: trong trấu đang hoai mục, vỏ và bã tiêu, 3. Mục đích nghiên cứu Nhằm tìm và chọn ra được chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose tốt nhất để tổng hợp thành chế phẩm sinh học và sử dụng nó để sản xuất phân compost, ứng dụng để xử lý rác thải môi trường giàu xơ. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose từ mụn dừa và vỏ tiêu Sàng lọc và tuyển chọn các chủng làm nguồn giống cho quá trình ủ compost từ mụn dừa. 5. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thực nghiệm. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu tiến hành sử dụng phần mềm Statgraphics plus 3.0. 6. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Trang 5
22. Đồ án tốt nghiệp Ý nghĩa khoa học: việc chọn chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose nhằm nâng cao hiệu quả xử lý phụ phế phẩm giàu xơ, cải thiện ô nhiễm môi trường, đồng thời sản phẩm sau quá trình ủ compost sử dụng làm phân bón phân hữu cơ vi sinh cho quá trình bón lót nhằm cải tạo và làm tăng dinh dưỡng trong đất. Ý nghĩa thực tiễn: ứng dụng công nghệ sinh học vào đời sống sản xuất, bảo vệ môi trường và xây dựng nền nông nghiệp ngày càng phát triển bển vững. 7. Kết quả đạt được Thu được 5 chủng (4 chủng vi khuẩn và 1 chủng xạ khuẩn) có khả năng phân hủy cellulose và tannic acid, và tuyển chọn các chủng có tiềm năng ủ compost mụn dừa. Gồm 4 chương: Chương 1: Tổng quan đề tài nghiên cứu. Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Chương 3: Kết quả và thảo luận. Chương 4: Kết luận và kiến nghị. Trang 6
23. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Hiện trạng của vỏ tiêu và mụn dừa 1.1.1. Vỏ tiêu Trong những năm gần đây, Việt Nam luôn nằm trong các nhóm nước dẫn đầu về xuất khẩu hồ tiêu trên thế giới, theo báo cáo mới công bố của Hội đồng hạt tiêu quốc tế (IPC) ước tính lượng tiêu xuất khẩu của Việt Nam trong cả năm 2011 đạt 115.000 tấn, và dự báo năm 2012 là 120.000 tấn. Diện tích trồng hồ tiêu trong nước chủ yếu tập trung tại các vùng Tây Nguyên, Đông Nam Bộ (trong đó Đông Nam Bộ và Tây Nguyên chiếm hơn 78 % diện tích trồng hồ tiêu cả nước), đảo Phú Quốc. Bảng 1.1: Diện tích và sản lượng tiêu của vùng Đông Nam Bộ và Tây Nguyên Năm 2011 Năm 2012 6 tỉnh trọng Diện Diện Diện Năng Sản Diện Năng điểm tích tích tích Sản lượng suất lượng tích thu suất trồng thu trồng Tổng 42.171 37.153 2,46 91.535 44.279 38.102 2,37 90.168 Bình 9.566 9.181 2,85 26.155 10.140 9.015 3,07 27.682 Phước Gia Lai 5.832 4.881 3,22 15.733 5.794 5.234 3,27 17.129 Đồng Nai 7.021 6.273 2,09 13.111 8.125 7.101 1,46 8.304 Trang 7
24. Đồ án tốt nghiệp Đăk Nông 7.915 6.130 2,15 13.096 8.000 6.022 2,29 13.814 Bà Rịa 6.939 6.304 1,86 11.725 7.370 6.364 1,72 10.954 Vũng Tàu Đăk Lăk 4.898 4.383 2,67 11.715 4.850 4.366 2,81 12.285 (Nguồn: theo thống kê của Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam (VPA)) Sở dĩ hồ tiêu Việt Nam có thể phát triển một cách rực rỡ như vậy là do Việt Nam hội tụ tất cả các điều kiện thuận lợi về tự nhiên, về con người, về ứng dụng khoa học kỹ thuật trong sản xuất và chế biến. Tuy nhiên, song song với những phát triển về sản lượng và chất lượng, người nông dân trồng hồ tiêu đã và đang đối mặt với tình trạng sâu hại, bất lợi về thời tiết và đặc biệt là giá thành phân bón tăng cao. Mặc khác lượng phế phẩm từ hồ tiêu (chủ yếu là vỏ tiêu) với số lượng lớn khoảng 16.666 tấn/năm nếu không có các biện pháp xử lý thì chúng là nguồn gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Việc nghiên cứu phương pháp compost để xử lý phế phẩm này vừa giải quyết được ô nhiễm vừa tạo ra giá trị kinh tế cao. Sỡ dĩ vỏ tiêu được chọn làm nguyên liệu để ủ compost vì trong vỏ tiêu chứa hàm lượng chất dinh dưỡng cao nên người ta có thể sử dụng bã cà phê như một chất bón cây rất hữu hiệu. Trong thành phần của nó chứa nhiều canxi, phốt pho, nitơ cũng như các chất khoáng khác giúp ích cho sự phát triển của cây. Khi đó giá thành của loại phân bón hữu cơ này chỉ bằng khoảng 30 % so với các loại phân khoáng bán trên thị trường. Hơn nữa, sử dụng các loại phân hữu cơ sinh học từ xác, bã thực vật nói chung và vỏ quả cà phê nói riêng bón cho các loại cây trồng sẽ góp phần cân bằng hệ sinh vật trong đất. Từ đó, cải thiện được kết cấu, độ xốp, độ phì nhiêu của đất. 1.1.2. Mụn dừa Trang 8
25. Đồ án tốt nghiệp Bến Tre có diện tích và sản lượng dừa lớn nhất Việt Nam, với hơn 52.000 ha dừa (chiếm 51,23 % diện tích cây lâu năm; 24,795 % đất nông nghiệp và chiếm 19,07 % diện tích tự nhiên) chiếm 2/3 diện tích, sản lượng dừa cả nước và đứng hàng đầu về chất lượng, sản lượng thu hoạch hàng năm đạt trên 390 triệu trái, chiếm 36 % sản lượng cả nước là cây có diện tích lớn nhất và ổn định nhất so với các cây khác trên địa bàn tỉnh Bến Tre. Giá trị sản xuất các sản phẩm dừa chiếm hơn 25 % tổng giá trị sản xuất công nghiệp toàn tỉnh; kim ngạch xuất khẩu các sản phẩm từ dừa không ngừng gia tăng, có lúc chiếm tới hơn 40 % tổng kim ngạch xuất khẩu của tỉnh, sản phẩm dừa đã xuất khẩu đến trên 50 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới. Ngành dừa luôn đóng vai trò quan trọng trong phát triển kinh tế - xã hội tỉnh. Trái dừa ngoài đáp ứng cho nhu cầu giải khát ngày càng tăng nhất là ở các thành phố lớn Bến Tre cung cấp khoảng 150 – 200 triệu trái/năm, hiện nay một số ngành nông nghiệp phát triển từ nguồn nguyên liệu dừa cũng tăng theo từng năm cho ra nhiều sản phẩm có giá trị như: cơm dừa nạo sấy, dầu dừa, kẹo dừa, thạch dừa, chỉ xơ dừa, thảm xơ dừa, vỏ dừa cắt lát, mụn dừa, than hoạt tính và khoảng 100 sản phẩm hàng thủ công mỹ nghệ từ cây dừa, trái dừa, gáo dừa, cọng dừa, chà dừa, nhen dừa được xuất khẩu sang nhiều quốc gia trên thế giới. Bảng 1.2: Diện tích dừa ở tỉnh Bến Tre (ha) Đơn vị/năm 2005 2008 2009 2010 2011 Toàn tỉnh Bến Tre 37.595 47.569 49.920 51.560 55.870 Trong đó: Thành phố Bến Tre 1.336 1.492 1.500 1.528 1.869 Châu Thành 4.960 5.297 5.453 5.541 6.352 Trang 9
26. Đồ án tốt nghiệp Chợ Lách 914 1.154 771 803 1.098 Mỏ Cày Nam 12.908 17.956 12.607 12.869 13.625 Mỏ Cày Bắc 6.955 7.244 8.120 Giồng Trôm 10.071 12.048 12.569 13.007 13.957 Bình Đại 4.452 5.204 5.435 5.840 5.445 Ba Tri 750 1.371 1.370 1.413 1.490 Thạnh Phú 2.204 3.047 3.260 3.315 3.914 (Theo Niên giám thống kê của Cục Thống kê tỉnh Bến Tre, tính đến năm 2011) Bảng 1.3: Diện tích, năng suất và sản lượng dừa cả nước Năm Diên tích (ha) Năng Suất (tr/ha/năm) Sản lượng (trái) 1999 32.364 6.436 208.294.704 2000 37.758 7.016 264.910.120 2001 35.540 6.252 222.196.080 2002 35.262 6.032 212.700.384 2003 35.018 6.784 237.562.112 2004 35.855 7.350 263.754.750 2005 36.827 7.508 276.497.116 Trang 10
27. Đồ án tốt nghiệp 2006 34.104 7.961 271.501.944 2007 34.906 8.520 287.974.500 2008 47.569 7.425 353.199.825 Về tính toán tốc độ phát triển bình quân của diện tích, năng suất và sản lượng dừa như sau: Diện tích: 103.93 % Năng suất: 101.44 % Sản lượng: 105.42 % (Nguồn: Thống kê tỉnh Bến Tre năm 2004 - 2007 và cung cấp của Phòng Tổng Hợp Cục Thống Kê Bến Tre) Cây dừa tiếp tục giữ vị trí quan trọng trong các quốc gia trồng dừa, đặc biệt là khu vực Châu Á - Thái bình dương. Diện tích và sản lượng dừa tiếp tục gia tăng cùng với giá cả hấp dẫn hơn của những sản phẩm như là sữa dừa, cơm dừa nạo sấy giúp các nước trồng dừa tăng thêm nguồn thu ngoại tệ từ việc xuất khẩu các sản phẩm chế biến từ dừa. Sản lượng dừa thế giới hiện nay đạt 11.439 triệu tấn cơm dừa khô (trong đó các nước thuộc APCC đạt 9.442 triệu tấn, chiếm 82,54 %). Indonesia là nước dẩn đầu về diện tích dừa với 3,98 triệu ha, Philippines xếp thứ hai với 3,26 triệu ha, Ấn Độ xếp thứ ba với 1,92 triệu ha dừa, kế tiếp là Sri Lanka với 394.836 ha. Sản lượng dừa ở các quốc gia quy ra trái giai đoạn 2000 - 2004: Trang 11
28. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.4: Sản lượng dừa (đơn vị 1.000 trái) của các nước trên thế giới Quốc gia 2000 2001 2002 2003 2004 Indonesia 15 237.000 15.815.000 15.492.000 16.146.000 16.657.000 Philippines 12.995.000 13.146.000 14.068.000 14.294.000 12.459.000 Sri Lanka 3.096.000 2.769.000 2.393.000 2.562.000 2.591.000 Việt Nam 1.031.960 935.640 789.550 693.500 680.684 Tuy nhiên trong quá trình sản xuất nông nghiệp nói chung và sản phẩm từ dừa nói riêng nhất thiết phải thải một khối lượng lớn các phụ phế thải vào môi trường, trong đó mụn dừa là một trong những phế liệu khó xử lý để tái sử dụng do hàm lượng cellulose, lignin và tannase trong mụn dừa khá cao. Theo ước tính của Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bến Tre, hiện mỗi ngày các cơ sở sản xuất chỉ xơ dừa trong tỉnh thải ra khoảng 1000 tấn mụn dừa. Do không có kho bãi chứa và các cơ sở này chủ yếu sản xuất nhỏ lẻ nên lượng mụn dừa này được thải trực tiếp ra sông gây ô nhiễm nghiêm trọng đến nguồn nước và không khí. Một số hộ dân sử dụng mụn dừa này để phủ gốc và bón lót cho cây nhưng số lượng không đáng kể so với nguồn phế liệu khổng lồ này. Hiện nay có một số ứng dụng mụn dừa vào trong nông như nghiệp như: Bảng 1.5: Một số ứng dụng của mụn dừa Mục đích Ứng dụng Mụn dừa qua quá trình xử lý, kết hợp vi sinh thành một Làm đất sạch loại đất trồng hữu cơ có các đặc tính ưu việt: Tơi xốp, 1 thoáng khí, dễ thấm nước, giữ ẩm cao, không mang mầm bệnh, chứa nhiều vi sinh vật có lợi cho đất. Sau 6 Trang 12
29. Đồ án tốt nghiệp tháng sử dụng, đất sạch trở nên “mùn hoá” có ích cho cây trồng. Mụn dừa còn là nguyên liệu tốt để làm giá thể trồng 2 Giá thể trồng nấm nấm rơm và nấm bào ngư. Do có độ xốp, khả năng giữ nước, giữ chất dinh dưỡng. Mụn dừa là nguyên liệu để sản xuất phân hữu cơ vi Nguyên liệu sản sinh: Sau khi mụn dừa được sấy khô loại bỏ tạp chất có 3 xuất phân hữu cơ hại, áp dụng tiếp kỹ thuật vi sinh sẽ cho ra sản phẩm sinh học phân hữu cơ vi sinh, giúp cải tạo đất bạc màu một cách hiệu quả. 1.2. Thành phần và tính chất hóa học của mụn dừa Mụn dừa là chất hữu cơ và có thể tái sử dụng. Mụn dừa là chất nền trên mặt đất, do đó có thể ngăn chặn những tác nhân có hại cho đất. Độ pH của mụn dừa khoảng 5.5. Chất lượng mụn dừa không bị ảnh hưởng nếu pH thấp hơn. Tỷ lệ C/N khoảng 80:1. Độ xốp khoảng 10 - 12 %. Chất hữu cơ khoảng 94 - 98 %. Tổng lượng tro khoảng 3 - 6 %. Cellulose khoảng 20 - 30 %. Lignin khoảng 69 - 70 %. Tannin khoảng 8 – 8,5 %. Trang 13
30. Đồ án tốt nghiệp Trong thành phần của mụn dừa, tannin chiếm tỷ lệ tương đối lớn so với các loài thực vật khác. 1.2.1. Lignin Là một hợp chất cao phân tử đặc biệt của thực vật đặc biệt là thực vật bậc cao (hạt trần, hạt kín), thường tập trung ở những mô hóa gỗ, là chất kết dính tế bào, làm tăng độ bền cơ học, lignin chiếm tỷ lệ cao ở những mô mạch được chuyển hóa để vận chuyển chất lỏng chúng có chức năng chống thấm nước qua vách tế bào mô xylem, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh. Khác với cellulose và hemicellulose, lignin hình thành từ các dẫn xuất của phenyl, propan, một chất thơm có mạch nhánh. Lignin là một polymer gốc rượu, có cấu trúc 3 chiều rất phức tạp và có nhiệm vụ nâng đỡ tế bào. Sau cellulose, lignin là một polymer phong phú trong tự nhiên được thực vật tổng hợp và chiếm khối lượng rất lớn nguồn chất thơm trên trái đất. Lignin giúp tế bào thực vật cứng hơn và giúp cho thực vật tránh được sự xâm nhiễm của vi sinh vật. Lignin được tìm thấy trong vách tế bào ở dạng phức hợp các polysaccharide khác như cellulose và hemicellulose, nó cũng giúp bảo vệ các polysaccharide này khỏi sự phân hủy sinh học. Có thể phân loại lignin theo thành phần chứa nó như lignin gỗ cứng, lignin gỗ mềm và lignin cỏ. Thực vật càng già, lượng lignin tích tụ càng lớn. Lignin gỗ mềm (thực vật hạt trần): bao gồm những cấu trúc chủ yếu bắt nguồn từ rượu coniferyl, một ít từ p-coumaryl, không có sinapyl. Lignin gỗ cứng (thực vật hạt kín) chứa số lượng cân bằng coniferyl và sinapyl (46 %) và một lượng nhỏ (8 %) coniferyl p-hydroxylferylpropan (có nguồn gốc từ coumaryl). Trang 14
31. Đồ án tốt nghiệp Lignin cỏ là hợp chất của coniferyl, sinapyl và p-hydroxyphenylpropan với coumaric acid (5 - 10 %) chủ yếu là ester với nhóm hydroxyl tận cùng của rượu p- coumaryl. Thành phần của lignin gồm 62 - 65 % cacbon, 5 - 6 % hydro, nhiều nhóm metoxyl (-OCH3) và nhiều nhóm hydroxyl (-OH) tự do. Hình 1.1: Các thành phần cấu tạo lignin thực vật Rượu oxyhydro coniferilic là nhân tố cấu tạo chủ yếu của lignin. Các liên kết phổ biến trong lignin là aryl-aryl, aryl-glycerol, diarylete. Ngoài ra còn các kiểu liên kết phenyl-cumaryl, biphenyl, diarylete. Vì dẫn xuất của các hợp chất thơm có mạch bên nhiều nhóm chức hoạt động, đặc biệt là –OH của nguyên tử cacbon (đối với vòng thơm) nên lignin tham gia vào nhiều loại phản ứng đặc trưng khác hẳn với cellulose và hemicellulose như: phản ứng thế, phản ứng ester hóa, oxy hóa, dimetyl hóa. Lignin có cấu tạo vô định hình, không tan trong nước và tan trong acid vô cơ. Dưới tác dụng của kiềm bisulfitnatri và acid sulfuric thì lignin mới bị phân giải một phần và chuyển sang dạng hòa tan. Trang 15
32. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2: Cấu trúc lignin 1.2.2. Hemicellulose Khác với cellulose, phân tử hemicellulose nhỏ hơn nhiều thông thường không quá 150 gốc đường, được nối với nhau không chỉ bằng liên kết 1,4 mà còn liên kết 1,3 và 1,6-glucoside tạo ra mạch ngắn và phân nhánh Hemicellulose là một heterpolymer có ở trong vách tế bào thực vật cùng với cellulose. Hemicellulose không tan được trong nước chỉ tan được trong dung dich kiềm. Hemicellulose có cấu trúc vô định hình và ít bền vững. Nó dễ bị phân hủy bởi các enzyme hemicellulase. Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide nào mà nó sẽ có những tên tương ứng như manan, galactan, glucan và xylan. Các polysaccharide như manan, galactan, glucan hay xylan đều là các chất phổ biến trong thực vật, chủ yếu ở các thành phần của màng tế bào của các cơ quan khác nhau như gỗ, rơm rạ, v.v Trang 16
33. Đồ án tốt nghiệp Trong thiên nhiên loại hemicellulose dễ gặp nhất là xylan. Xylan thường thấy nhiều trong rơm, rạ Xylan là một polymer chính của thành tế bào thực vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-D-xylopyranose, là nguồn năng lượng dồi dào thứ hai trên trái đất. Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên. Các gốc thay thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và glucuronosyl. Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác. Hemicellulose chứa nhiều đơn phân đường khác. Ngoài glucose, các phân tử đường trong hemicellulose có thể là nhóm hexose (mannose, galactose) và nhóm pentose ( xylose, arabinose). Hemicellulose chứa hầu hết các đường D-pentose và một ít các đường dạng L. Hình 1.3:Một số đường monomer cấu tạo hemicellulose Trang 17
34. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4: Cấu trúc hemicellulose 1.2.3. Tannin Tannin (tannin thực vật - phân tử sinh học, hoàn toàn khác so với tannin tổng hợp) là chất làm se, đắng. Là nhóm các polyphenol tồn tại phổ biến trong thực vật, có khả năng tạo liên kết bền vững với protein và một số hợp chất cao phân tử thiên nhiên (cellulose, pectin). Tannin có phân tử khối từ 500 - 3000 đvC, có khả năng kết tủa với gelatin (protein loại collagen được chiết xuất từ da, xương động vật, ở nhiệt độ thường có thể rắn) và các protein khác trong môi trường nước. Tannin tan trong nước đặc biệt là nước nóng, cồn hay kiềm loãng, không tan trong dung môi hữu cơ, tạo tủa với protein, gellatin, không bay hơi Trong trà, tiêu, rượu vang (đặc biệt là rượu vang đỏ), lựu, hồng, dâu, trong các loại rau làm gia vị (đinh hương, ngải quế ), trong các quả non (vì thế quả bơ non Trang 18
35. Đồ án tốt nghiệp thường đắng hơn quả bơ chín) đều chứa tannin, đặc biệt trong các thực vật già, thân đã hóa gỗ thì tannin càng nhiều. Trong thực vật có 2 loại tannin sau: Tannin thủy phân được (hydrolysable tannin), tiêu biểu đó là acid gallic HOOCC6H2(OH)3 (IUPAC: acid 3,4,5-trihydroxybeoic). Tannin không thủy phân được (Condzensed Tannin) còn gọi là proanthyocyanidins, tiêu biểu đó là flavones C15H10O2 (IUPAC: 2-phenylchromen-4- one (2-phenyl-1-benzopyran-4-one). Hình 1.5: Cấu trúc tannic acid 1.2.4. Cellululose 1.2.4.1 .Giới thiệu Trang 19
36. Đồ án tốt nghiệp Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 1011 tấn cellulose (trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50 % và trong bông chiếm khoảng 90 %), là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật, đó chính là nguồn năng lượng vô tận cho sự phát triển cho sự phát triển xã hội. Theo đó, cellulose được tìm thấy trong hầu hết các loại chất thải hữu cơ và chiếm tỉ lệ cao trong thành phần cấu trúc từ các chất thải của ngành công nghiệp gỗ, nông nghiệp và chất thải gia đình. Cellulose có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n mức độ polymer hóa của cellulose rất cao tới 10000 - 140000 đơn vị glucose/phân tử. Cellobiose là lặp đi lặp lại đơn vị nhỏ nhất của cellulose và có thể cuối cùng được chuyển đổi thành glucose. Về bản chất hóa học cellulose là một rượu đa chứa có phản ứng với kiềm hay kim loại kiềm tạo cellulose-alcolate. Nguyên tử hydro ở các nhóm OH bậc một và hai trong phân tử cellulose cũng có thể bị thay thế bởi các gốc metyl, etyl, tạo ra những chất có độ kết tinh và độ hòa tan cao trong nước khác nhau. Cellulose là polymer thẳng của các đơn vị β-D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucoside. Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen người ta biết rằng cellulose có cấu tạo dạng sợi. Các sợi này liên kết lại thành những bó nhỏ gọi là các microfibril có cấu trúc không đồng nhất. Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình. Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở mạch cacbon của mạch khác, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết bằng kiên kết Van der Waals nên dễ bị tấn công. Trang 20
37. Đồ án tốt nghiệp Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài phân tử cellulose kết tinh. Các cây gỗ lâu năm thường chứa hàm lượng cellulose kết tinh nhiều, các cây thảo mộc thì ngược lại, chứa nhiều cellulose vô định hình. Trong vách tế bào thực vật, cellulose tồn tại trong mối liên kết chặt chẽ với các polysaccharide khác: hemicellulose, pectin và lignin tạo thành liên kết bền vững. Cellulose bị oxy hóa bởi một số tác nhân tạo thành sản phẩm oxy hóa một phần là oxy-cellulose. Tác nhân oxy hóa chọn lọc nhất là acid iodic (HIO4). Đặc biệt cellulose hòa tan trong dung dịch cupri hydrate (Cu(NH3)4(OH)2), và hàng loạt các phức chất của đồng, niken, kẽm Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dạng tự do, hydro của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hóa học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên các dẫn xuất este hoặc este của cellulose. Một trong những dẫn xuất được ứng dụng nhiều là CMC (cacboxyl methyl cellulose), trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc –OCH2COOH. Hình 1.6: Cấu trúc của cacboxyl methyl cellulose (CMC) Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân. Người và động vật không có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose Trang 21
38. Đồ án tốt nghiệp có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose. Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose. Vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn. Hình 1.7: Công thức cấu tạo của cellulose 1.2.4.2. Enzyme phân giải cellulose (enzyme cellulase) Sự phân giải cellulose rất phức tạp, đòi hỏi sự có mặt của nhiều enzyme như endoglucanase, β-glucosidase, cellobiohydrolase. Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase tham gia thủy phân phân tử cơ chất theo một cơ chế riêng. Tuy nhiên, những enzyme này thường phối hợp hoạt động để thủy phân hoàn toàn phân tử cơ chất thành sản phẩm đơn giản nhất là glucose. Trang 22
39. Đồ án tốt nghiệp Cellulase là enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase) hoạt động phối hợp trong việc thủy phân cellulose thành glucose ở nhiệt độ thường hoặc 40 - 50 oC. Hệ cellulase gồm ba thành phần chính: Enzyme thứ nhất là 1,4 β -D-glucan cellobiohydrolase (tên khoa học khác: cellobiohydrolase, enzyme C1, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và avicellase) – EC.3.2.1.4 (CBH) . Enzyme này cắt hai đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Trọng lượng phân tử của enzyme này là từ 53 - 75 kDa. Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng. Enzyme thứ hai là 1,4 β-D-glucan- 4 -glucanohydrolase (tên gọi khác: endoglucanse, endo 1,4-β-glucanase, enzyme Cx)- EC 3.2.1.6 (EG) chứa 418 acid amine, có trọng lượng phân tử từ 42 – 49 KDa. Chúng hoạt động ở nhiệt độ khá cao và tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose trong lichenin và β -D- glucan. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose. Enzyme thứ ba là β-D-glucoside glucohydrolase (tên khác là cellobiase và β -glucosidase) có khả năng hoạt động ở pH rất rộng (pH 4,4 – 4,8) EC.3.2.1.21, trọng lượng phân tử khoảng 50 – 98 KDa, pI = 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao. Chúng tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành glucose, không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy. Nhiều nghiên cứu cho rằng các enzyme EG có tác dụng phân cắt tốt trên cellulose vô định hình và đặc biệt có tác dụng trên cơ chất celluolose biến tính CMC, HEC. Vì vậy, để xác định hoạt tính enzyme này người ta sử dụng cơ chất là CMC. Còn các enzyme CBH thì có tác dụng trên cellulose kết tinh, ít trên cellulose vô định hình và hầu như không có tác dụng phân cắt cellulose biến tính. Cơ chế phối hợp cắt cellulose: Đầu tiên enzyme EG tấn công vào giữa mạch cellulose. Tiếp sau đó enzyme CBH tiếp tục phân cắt để tạo các sản phẩm cuối là Trang 23
40. Đồ án tốt nghiệp cellobiose. Việc phân cắt cuối cùng tạo thành glucose là nhờ vào enzyme thứ ba là β- glucosidase. Tuy enzyme β-glucosidase không tác dụng trên chuỗi cellulose nhưng vẫn được xếp vào hệ thống enzyme cellulase. Bảng 1.6: Phân loại enzyme phân cắt β-1,4-glucan Trang 24
41. Đồ án tốt nghiệp Tên hệ thống Tên thường gọi EC No. Cơ chất Liên kết thủy phân Sản phẩm chính -1,4-D-glucan-4- Cellulase, endoglucanase Cellulose, 1,3-1,4-- 1,4--dextrins, 1,3-1,4-- 3.2.1.4 1,4- glucanohydrolase (EG) glucans dextrins -1,3-1,4-D-glucan-4- 3.2.1.73 Lichenin, 1,3-1,4-- Hỗn hợp 1,3-1,4-- Lichenase, -glucanase Kế 1,4- sau 1,3-- glucanohydrolase glucans dextrins Endo Kế liên kết 1,4-- -1,3-D-glucan-3/4- Laminarinase 3.2.1.6 Laminarin, 1,3-1,4-- Hỗn hợp 1,3-1,4-- hoặc 1,3-- và sau glucanohydrolase glucan dextrins 1,3-- -1,3-D-glucan-3- Laminarin, pachyman 1,3--dextrins (1,3-- Laminarinase 3.2.1.39 1,3- glucanohydrolase (1,3-1,4--glucans) dextrins) -1,4-D-glucan- Cellulose, 1,3-1,4-- Cellobiohydrolase (CBH) 3.2.1.91 1,4- Cellobiose cellobiohydrolase glucans -1,4-D-glucan- Exo Exoglucanase 3.2.1.74 1,4--glucans 1,4- Glucose glucohydrolase 1,4-, 1,3- và Glucose -glucosidase Cellobiase 3.2.1.21 -D-glucosides 1,6- Trang 25
42. Đồ án tốt nghiệp β-gluosidase Cx C1 Cellulose Cellulose phản ứng Cellobiose Glucose Hình 1.8: Cơ chế cắt cơ chất cellulose của enzyme cellulase 1.2.4.3. Nguồn gốc enzyme cellulase Rất nhiều loài nấm và vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose. Gồm những cơ chế yếm khí hay hiếu khí, ưa nhiệt hoặc ưa nhiệt trung bình. Chúng rất đa dạng và phong phú và đa dạng trong tự nhiên nhưng chỉ có một số ít sinh enzyme ngoại bào, có khả năng phân hủy cellulose kết tinh trong ống nghiệm. Trang 26
43. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.7: Enzyme cellulase nguồn gốc từ vi sinh vật  Vi khuẩn Vi khuẩn sinh ra chủ yếu endoglucanase và β-glucosidase gần như không tạo ra exoglucanase. Vi khuẩn trong dạ cỏ: Ruminococcus albus. Vi khuẩn hiếu khí: Cellulomonas persica sp. và Cellulomonas iranensis sp. Trang 27
44. Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn kỵ khí: Clostridium thermocellum, Clostridium cellulovorans, Clostridium celluloliticus. Cellulase từ vi khuẩn trong nhiều trường hợp được nghiên cứu có hoạt tính cao hơn cellulase từ nấm mốc. Tuy nhiên nhìn chung vi khuẩn sản xuất enzyme ngoại bào số lượng thấp hơn nấm mốc. Do đó trong cellualase từ vi khuẩn sản xuất từ công nghiệp cần có phương pháp thu enzyme thích hợp. Vi sinh vật hiếu khí có thể phân hủy vật liệu giàu xơ bao gồm các thành phần khác, trong khi vi sinh vật kị khí chỉ có phân hủy cellulose. Các vi sinh vật kị khí thường được phân lập trong dạ cỏ đại gia súc hay bồn ủ kị khí. Các vi sinh vật phân hủy trong hố ủ compost, bùn họat tính thường là vi sinh vật hiếu khí. Một số chịu nhiệt vì được phân hủy từ suối nước nóng, đa số ưa ấm.  Xạ khuẩn Nhiều loại xạ khuẩn thuộc giống Streptomyces được phát hiệm có khả năng sinh ra cellulase.Streptomyces antibioticus, Streptomyces thermoviolaceus var. Oingenes, Strptomyces cellulolyticus sp. Bảng 1.8: Danh sách một số vi khuẩn (kể cả xạ khuẩn) phân hủy cellulose và đặc điểm của chúng Tài liệu tham Phân loại Giống Loài Nhiệt độ Nguồn phân lập khảo Caldocellulos Suối nước nóng Rainey et al. Họ Saccharolyticus Chịu nhiệt iruptor 1994 Syntrophom onodaceae "Anaerocellu Thermophilum Chịu nhiệt Suối nước nóng Svetlichnyi et Trang 28
45. Đồ án tốt nghiệp m" al. 1990 Berger et al. Butyrivibrio Fibrisolvens Ưa ấm Dạ cỏ 1990 Lachnospira ceae Ruminococcu Aurilia et al. Flavefaciens Ưa ấm Dạ cỏ s 2000 Họ Anderson & Eubacteriac Eubacterium Cellulolyticum Ưa ấm Dạ cỏ Blair 96 eae Clostridium Acetobutylicum Ưa ấm Đất From sequence Shoseyov et al. Clostridium Cellulovorans Ưa ấm Gỗ lên men 1992, Tamaru et al. 2000 Họ Varel et al. Clostridiace Clostridium Herbivorans Chịu nhiệt Ruột lợn 1995 ae Yanling et al. Clostridium Cellulosi Chịu nhiệt Phân bón 1991 Lamed et al. Clostridium Cellobioparum Ưa ấm Dạ cỏ 1987 Trang 29
46. Đồ án tốt nghiệp Pohlschröder et Clostridium Papyrosolvens Ưa ấm Bột giấy al. 94 Pagés et al. Clostridium Cellulolyticum Ưa ấm Compost 1997, Belaich et al. 1997 Lamed et al. Clostridium Thermocellum Chịu nhiệt Nước thải + đất 1991 Cellulofermentan Yanling et al. Clostridium Ưa ấm Phân bón s 1991 Cavedon et al. Clostridium sp. C7 Ưa ấm Bùn 1990 Sinh khối thối Ponpium et al. Bacteroides sp. P-1 Ưa ấm rữa 2000 Lamed et al. Bacteroides Cellulosolvens Ưa ấm Nước thải 1991 Họ Thermoactino Hägerdahl et sp. YX Chịu nhiệt Thermoacti myces al., 1979 nomycetacea e Caldibacillus Cellulovorans Chịu nhiệt Sunna et al. Trang 30
47. Đồ án tốt nghiệp 2000 Họ Bacillus Circulans Ưa ấm Kim 1995 Bacillaceae Eppard et al. Bộ Suối nước nóng 1996; Acidothermus Cellulolyticus Chịu nhiệt Frankineae, có tính acid Maréchal et al. Họ 2000 Acidotherm aceae Lednicka et al Cellulomonas Biazotea Ưa ấm 2000 Thayer et al. Cellulomonas Cartae Ưa ấm 1984 Lednicka et al. Bộ Cellulomonas Cellasea Ưa ấm Micromonos 2000 porineae, Lednicka et al. Họ Cellulomonas Cellulans Ưa ấm Đất 2000 Cellulomona daceae Lednicka et al. Cellulomonas Fimi Ưa ấm Đất 2000 Cellulomonas Flavigena Ưa ấm Đất Lednicka et al. Trang 31
48. Đồ án tốt nghiệp 2000 Họ Micromonosp Microbacter Melonosporea Ưa ấm Compost Wilson 1992 ora iaceae Coughlan & Actinoplanes Aurantiaca Ưa ấm Đất Mayer 92 Schrempf & Streptomyces Reticuli Ưa ấm Đất Walter 96 El-Din et al. Streptomyces Aureofaciens Ưa ấm Compost 2000 Họ MacKenzie et Streptomyces Flavogriseus Ưa ấm Đất Micromonos al. 1984 poraceae Perito et al. Streptomyces Rochei Ưa ấm Ruột mối 1994 Coughlan & Streptomyces Viridosporus Mayer 92 Thermobifid Wilson 1992; Chịu nhiệt a(Thermomo Fusca Đất Kukolya, pers. nospora) commun. 2003 Trang 32
49. Đồ án tốt nghiệp Thermobifid Kukolya et al. Cellulolytica Chịu nhiệt Compost a 2002 Microbispora Bispora Chịu nhiệt Đất Wilson 1992 Họ Streptospor angiaceae Họ Schellhorn & Fibrobacteri Fibrobacter Succinogenes Ưa ấm Dạ cỏ Forsberg 1984 aceae Sporocytoph Coughlan & Myxococcoides Ưa ấm Đất Họ aga Mayer 92 Flexibacteri aceae Mullings et al. Cytophaga sp. Ưa ấm Đất 1984 (Nguồn:  Nấm sợi Nấm được nói chung quan trọng hơn vi khuẩn phân hủy cellulose, đặc biệt là các trường hợp nếu cellulose có thêm với lignin (ví dụ, trong gỗ hoặc rơm). Vì cellulose giàu cacbon nhưng không chứa nitơ hoặc các yếu tố thiết yếu khác, các cấu trúc sợi nấm của nấm là một lợi thế cạnh tranh. Một vài loại nấm kể đến là Chaetonium, Fusarium, và Aspergillus. Trang 33
50. Đồ án tốt nghiệp Nhiều loại nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc giống alternaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Pinicillium, Cladosporum Trong đó 2 giống Trichoderma và Aspergillus đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất cellulase. Giống Trichoderma sinh tổng hợp một lượng tương đối lớn endoglucanase và exoglucanase, nhưng chỉ một lượng ít β-glucosidase, trong khi các chủng thuộc giống Aspergillus sinh ra một lượng tương đối lớn endoglucanase và β-glucosidase nhưng chỉ một lượng nhỏ exoglucanase. Ngoài ra, cellulase còn có mặt trong các hạt của thực vật bậc cao, hạt lúa mạch, giun đất, sâu róm và ốc sên. Tuy nhiên người ta vẫn ưu tiên ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất enzyme cellulase do vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất sinh khối với số lượng lớn. Đây cũng là nguồn nguyên liệu con người có thể chủ động tạo ra được. Chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn. Vi sinh vật sinh trưởng và phát triển với tốc độ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn. Hơn nữa enzyme sinh ra từ vi sinh vật có hoạt tính enzyme rất mạnh vượt xa các sinh vật khác. Vi sinh vật rất nhạy cảm với môi trường, thành phần dinh dưỡng nuôi chúng cũng như một số tác nhân lý hóa khác. Do đó trong quá trình nuôi cấy có thể thay đổi mội số tác nhân nhằm cảm ứng khả năng sinh enzyme của chúng. Sinh khối sinh ra sau khi nhân giống có thể trộn với chất mang và sử dụng, bỏ qua một loạt quy trình tách chiết từ đó giảm công sức và giá thành sản xuất. Tuy vậy trong quá trình chọn nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp. 1.2.4.4. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase Trang 34
51. Đồ án tốt nghiệp Trong tự nhiên, đa số các loài vi sinh vật sống hoại sinh, phân giải các nguồn hợp chất hữu cơ có sẵn trong môi trường thành các chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của mình. Khả năng sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng sinh tổng hợp các enzyme chịu sự tác động của nhiều yếu tố môi trường như: nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường, nguồn cacbon, nguồn nitrogen. Nguồn cacbon: các loài vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau tùy thuộc đặc điểm của từng loài. Có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn cacbon, có loài thì không đòi hỏi nghiêm ngặt mà có khả năng sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbon có thể đơn giản như các loại đường đơn, đường đôi hoặc phức tạp như glucan, tinh bột, cellulose. Ngoài ra, nguồn cacbon như nguồn cơ chất cảm ứng cho vi sinh vật sinh enzyme. Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cộng sự (1999) cho thấy, nguồn cacbon thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải là glucose và CMC. Nguồn cacbon thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn CD6-9 là tinh bột, chủng CD9-9 là CMC và saccharose, chủng CD5-12 là lactose; các chủng Actinomyces griseus là bã mía hoặc mùn cưa. Nguồn cacbon thích hợp đối với các chủng xạ khuẩn ưa ấm là vỏ lạc, rơm. Nguồn nitrogen: các loài vi sinh vật khác nhau có nhu cầu khác nhau đối với nguồn nitrogen. Nhìn chung, các loài đều có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ nhưng mức độ đồng hóa tùy thuộc từng loài. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong môi trường chứa nguồn nitrogen là peptone và cao nấm men. Nhiệt độ nuôi cấy: Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ sinh trưởng, các loài vi sinh vật được chia làm 3 nhóm: các loài ưa lạnh và chịu lạnh; các loài ưa ấm và các loài chịu nhiệt. Các loài ưa lạnh có khả năng sinh trưởng trong điều kiện dưới 15 oC, các Trang 35
52. Đồ án tốt nghiệp loài ưa ấm thường sinh trưởng phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 20 – 37 oC; còn các loài chịu nhiệt có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50 oC. Khi nghiên cứu các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải cho thấy, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ 45 -55 oC và có thể chịu được nhiệt độ 65 – 80 oC. pH môi trường nuôi cấy ban đầu: pH môi trường ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi sinh vật. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase thích hợp với pH môi trường ban đầu là 7,0; còn chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus thích hợp với pH môi trường ban đầu là 6,7. Đối với các chủng nấm mốc N1 và N2 sinh tổng hợp cellulase tối ưu ở môi trường có pH ban đầu là 4,5 và 5,5; các chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong khoảng pH môi trường ban đầu từ 6,0 - 7,0. Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các loại enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố khác như: thời gian nuôi cấy, tốc độ lắc và sục khí, lượng giống được tiếp vào ban đầu. Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme. Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme. Sharma và cộng sự (1995) nhận thấy, ion Ca2+ làm tăng hoạt tính cellulase của Bacillus sp. D04 lên 40 % so với đối chứng; còn Mg2+ làm giảm nhẹ (hoạt tính còn lại 92 %) và Zn2+ ức chế mạnh hoạt tính enzyme này (hoạt tính còn lại bằng 37 % so với đối chứng). 1.2.4.5. Ứng dụng của enzyme cellulase  Cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc Trang 36
53. Đồ án tốt nghiệp Chăn nuôi là một nhánh quan trọng của ngành nông nghiệp Việt Nam. Thu nhập từ chăn nuôi hàng năm đạt 20 % tổng giá trị kinh tế của ngành nông nghiệp. Chăn nuôi không những cung cấp các loại thực phẩm như trứng, thịt, sữa cho thị trường mà còn cung cấp nguồn phân bón rất hữu ích cho ngành trồng trọt. Đây cũng là nguồn thu nhập đáng kể góp phần xóa đói giảm nghèo, nâng cao đời sống cho người dân Việt Nam. Tuy nhiên, ngành nông nghiệp nói chung và chăn nuôi nói riêng đang gặp phải nhiều khó khăn. Một trong những vấn đề cần được giải quyết hiện nay là làm thế nào để nâng cao năng suất vật nuôi, tăng hiệu quả chăn nuôi mà vẫn đảm bảo an toàn cho môi trường xung quanh, đặc biệt là sức khỏe con người. Do đó người ta hướng đến sử dụng phối hợp enzyme cellulase với các enzyme thủy phân khác nhau như pectinase, hemicellulase, Trong quá trình ủ cỏ xanh có tác dụng phân giải thành tế bào thực vật, do đó tăng nguồn dinh dưỡng cho nhóm vi khuẩn lactobacilli lên men sinh acid lactic, ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật có hại khác. Trong chăn nuôi (với động vật ăn cỏ) nếu thức ăn có trộn thêm cellulose sẽ tăng sự tiêu hóa, sự hấp thu thức ăncho động vật, đặc biệt là động vật còn non có hệ tiêu hóa chưa hoàn chỉnh, do đó sẽ làm giảm chi phí thức ăn cho động vật và chúng sẽ tăng trọng nhanh hơn.  Tăng hiệu suất trích ly trong công nghệ thực phẩm Sử dụng các chế phẩm enzyme có thể coi là một trong những phương hướng tiến bộ có triển vọng nhất của sản xuất nước quả và nước uống không cồn. Dịch quả sau khi ép chiết thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các chất xơ có bản chất polysaccharide làm cho dịch có độ nhớt cao và màu đục. Cellulase thường được sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phân các polysaccharide làm giảm độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình tách chiết và làm trong. Cellulase kết hợp với các Trang 37
54. Đồ án tốt nghiệp hemicellulase, pectinase được ứng dụng chủ yếu để xử lý phá vỡ màng tế bào. Trong quá trình sản xuất nước cà rốt thường sử dụng cellulose xử lý ở giai đoạn dịch hóa. Trong công nghệ sản xuất bia, dịch lên men ngoài các thành phần đường, protein còn có một lượng không nhỏ các phân tử khối lượng cao như cellulose và β-glucan, làm ảnh hưởng xấu đến quá trình lọc và chất lượng sản phẩm. Người ta thường sử dụng β-glucanase để loại bỏ những thành phần này. Các chế phẩm như Finizym 200L gồm các cellulase từ A.niger, β-glucanase từ Bacillus subtillis, Disporotrichum dimorphosporum đã được sử dụng trong sản xuất bia. Ngoài ra, enzyme cellulase còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì, bánh bisqui và thực phẩm chức năng. Glucanase từ Humicola insolens được ứng dụng trong sản xuất bánh mì, làm tăng độ mềm và xốp cho bánh mỳ. Hệ cellulase từ Trichoderma reesei, A. niger được ứng dụng trong sản xuất fructooligosaccharide. Đây là một trong số các oligosaccharide chức năng (prebiotic) được sản xuất để bổ sung vào khẩu phần ăn. Cellulase phá vỡ thành tế bào thực vật giúp cho việc trích ly các chất từ thực vật và từ cây thuốc được dễ dàng. Sử dụng cellulase phá vỡ cấu trúc thành tế bào thực vật mất vách cellulose trở thành tế bào trần. Sử dụng tế bào trần để nghiên cứu lai tế bào nhằm tạo các tế bào lai có những tính trạng mới theo mong muốn, tế bào trần còn được sử dụng để tiến hành các kỹ thuật chuyễn và nạp gen.  Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ Sử dụng cellulase xử lý nguyên liệu giàu cellulose trước khi lên men đã làm tăng hiệu suất thu hồi dung môi lên trung bình là 1,5 %. Nhiều chế phẩm enzyme đã đựợc sử dụng trong ngành công nghiệp này như neutrase 0,5L có chứa hệ cellulase sử dụng trong công nghiệp sản xuất ethanol. Đồng thời, nhiều chủng vi sinh vật kỵ khí trong chi Clostridium sinh tổng hợp cellulase đựợc sử dụng trong công nghệ lên men sản xuất dung môi hữu cơ, acetic acid, sản xuất acetone, butanol và isopropanol. Trang 38
55. Đồ án tốt nghiệp  Thủy phân gỗ, các phế liệu giàu cellulose và sản xuất phân bón vi sinh Việc sử dụng enzyme quan trọng nhất trong công tác bảo vệ môi trường là sử dụng enzyme trong xử lý chất thải, chuyển các chất thải thành sản phẩm có ích. Trong nhiều năm qua cả ở thế giới và Việt Nam, các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme phân hủy cellulose đã được ứng dụng rất có hiệu quả để xử lý rác thải sinh hoạt. Nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm đã được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong quá trình xử lý rác thải ở Việt Nam. Nhiều chế phẩm vi sinh trong đó có chứa hệ sinh vật sinh tổng hợp cellulase đã được nghiên cứu và sản xuất để xử lý rác thải. Trong đó, chế phẩm Micromix 3 khi bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, giảm một nửa thời gian lên men so với đối chứng. Đồng thời, lượng mùn tạo thành khi xử lý rác bằng chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29 % và các chất dinh dưỡng cao hơn 10 % so với đối chứng. Sản phẩm của quá trình xử lý rác thải được phối trộn và bổ sung thêm một số vi sinh vật có ích cố định đạm tạo thành phân bón vi sinh, được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp đã góp phần nâng cao năng suất cây trồng, giảm thiểu được nguồn và nguy cơ gây ô nhiễm môi trường. Trang 39
56. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 01/04/2012-21/06/2012. 2.1.2. Địa điểm Phòng Thí Nghiệm Vi Sinh Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguồn mẫu Mụn dừa: Mụn dừa (hay mùn dừa - coco peat) được coi là loại phế phẩm nông nghiệp, được thu thập Thành phố Cao Lãnh tỉnh Đồng Tháp (ký hiệu: mẫu 1) và ở huyện Lai Vung (ký hiệu: mẫu 2). Vỏ tiêu: thu thập ở Bà Rịa Vũng Tàu (ký hiệu: mẫu 3). Khối lượng mỗi mẫu: 200g. 2.2.2. Hóa chất MgSO4.7H2O K2HPO4 KH2PO4 NH4NO3 FeCl3.6H2O Trang 40
57. Đồ án tốt nghiệp CaCl2 Hóa chất phân tích CMC Tannic acid Giấy lọc DNS Glucose Hóa chất khác: Cồn 70o, cồn 96o. Các hóa chất pha môi trường, NaCl, HCl 1N, NaOH 1N. 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị 2.2.3.1. Dụng cụ Ống nghiệm có nắp. Ống nghiệm không nắp. Đĩa petri. Cốc 100ml, cốc 250ml, cốc 1000ml Ống đong Erlen 250ml. Pipet 1ml, 2ml, 10ml. Pipet man 200µl. Đầu típ 200µl. Ống ly tâm. Trang 41
58. Đồ án tốt nghiệp Nhiệt kế. Đũa thủy tinh. Bao hấp, giấy gói, thun. 2.2.3.2. Thiết bị Tủ cấy vi sinh. Tủ ủ. Tủ lạnh Toshiba. Autolave. Máy đo quang. Máy ly tâm. Giấy quỳ. Cân phân tích. Bếp từ. Máy nước cất. 2.2.4. Thiết kế thí nghiệm 2.2.4.1. Mục tiêu Đồ án tốt nghiệp hướng đến 4 mục tiêu:  Mục tiêu 1: Phân lập vi khuẩn chịu nhiệt phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu.  Mục tiêu 2: Sàng lọc vi khuẩn phân hủy cellulose từ các chủng phân lập.  Mục tiêu 3: Khảo sát hình thái khuẩn lạc, tế bào,bào tử và phản ứng sinh hóa vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase. Trang 42
59. Đồ án tốt nghiệp  Mục tiêu 4: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn (hoặc xạ khuẩn) có enzyme cellulase có tiềm năng sử dụng ủ compost từ mụn dừa. 2.2.4.2. Thiết kế thí nghiệm Để hoàn thành tất cả các mục tiêu, tôi tiến hành thiết kế các thí nghiệm cho từng mục tiêu. Mụn dừa 1 Mụn dừa 2 Vỏ tiêu Tăng sinh trên môi trường chọn lọc chứa mẫu mụn dừa và vỏ tiêu và thành phần khoáng của môi trường BHM có tiến hành qua khâu xử lý nhiệt (Thí nghiệm 2.1.1.1.) Sàng lọc những mẫu có chứa quần thể vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose bằng phương pháp đục lỗ thạch (Thí nghiệm 2.1.1.2 ) Phân lập vi sinh vật trên môi trường thạch chứa CMC để lựa chọn sơ bộ vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose (Thí nghiệm 2.1.1.3 ) 8 chủng vi sinh vật Hình 2.1: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 1. Trang 43
60. Đồ án tốt nghiệp 8 chủng vi sinh vật Khảo sát khả năng tiết enzyme CMCase từng Khảo sát khả năng mọc trên môi trường thạch chủng trên đĩa thạch chứa CMC (cấy điểm) chứa giấy lọc (cấy ria) (Thí nghiệm 2.1.2.1) (Thí nghiệm 2.1.2.2 ) 5 chủng vi sinh vật phân giải cellulose Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 2. Trang 44
61. Đồ án tốt nghiệp 5 chủng vi sinh vật phân giải cellulose Nuôi cấy khảo sát hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử Khảo sát một số phản ứng sinh hóa (Thí nghiệm 2.1.3.1) (Thí nghiệm 2.1.3.2 ) Khả năng sinh Indol Khả năng sinh enzyme Khảo sát khuẩn lạc gellatinase Nhuộm Gram Nhuộm bào tử Khả năng biến dưỡng citrate Bộ giống gồm 5 chủng Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 3. Trang 45
62. Đồ án tốt nghiệp Bộ giống gồm 5 chủng Tăng sinh trên môi trường lỏng chứa mụn dừa Không lắc và lắc 150 pH môi trường: pH3, pH5, vòng/phút pH7, pH9 Hoạt tính phân huỷ CMC Hoạt tính phân huỷ giấy lọc Đục lỗ thạch Xác định hoạt tính Xác định hoạt tính Khả năng thủy phân giấy lọc CMCase FPase (Thí nghiệm 2.1.4.1.b ) bằng nguyên tế bào vi khuẩn (Thí nghiệm 2.1.4.1.c) (Thí nghiệm 2.1.4.1.d) (Thí nghiệm 2.1.4.1.e) Khảo sát hoạt tính phân huỷ tannin của năm chủng ở pH7 và lắc 150 vòng/phút Đụ c lỗ thạch (thạch tannic acid) Hoạt tính enzyme tannase Khảo sát khả năng chịu tannic (Thí nghiệm 2.1.4.3.c) acid ở các nồng độ khác nhau (Thí nghiệm 2.1.4.3.b) (Thí nghiệm 2.1.4.3.d) Các chủng có tiềm năng sử dụng ủ compost mụn dừa Hình 2.4: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 4 Trang 46
63. Đồ án tốt nghiệp 2.2.5. Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm  Môi trường tăng sinh mẫu trên môi trường lỏng (kí hiệu:môi trường TS) (g/l) MgSO4.7H2O 0,2 K2HPO4 1 KH2PO4 1 NH4NO3 1 FeCl3.6H2O 0,05 CaCl2 0,02 pH = 7.0  Môi trường phân lập và giữ giống trên đĩa thạch (kí hiệu : môi trường PL): (g/l) MgSO4.7H2O 0,2 K2HPO4 1 KH2PO4 1 NH4NO3 1 FeCl3.6H2O 0,05 CaCl2 0,02 CMC 10 Agar 22 pH = 7.0 Trang 47
64. Đồ án tốt nghiệp  Môi trường định tính hoạt tính CMC của vi khuẩn (kí hiệu : môi trường ĐT): (g/l) CMC 10 Agar 22  Môi trường thử nghiệm khả năng mọc trên giấy lọc trên đĩa thạch (kí hiệu : môi trường M): (g/l) MgSO4.7H2O 0.2 K2HPO4 1 KH2PO4 1 NH4NO3 1 FeCl3.6H2O 0.05 CaCl2 0,02 Giấy lọc ½ đĩa thạch Agar 22 pH = 7.0  Môi trường tăng sinh chứa giấy lọc (kí hiệu : môi trường GL): (g/l) MgSO4.7H2O 0,2 K2HPO4 1 KH2PO4 1 NH4NO3 1 FeCl3.6H2O 0,05 CaCl2 0,02 Trang 48
65. Đồ án tốt nghiệp Giấy lọc kích thước 1x6 cm pH = 7.0  Môi trường tăng sinh chứa Tannic acid 1 % (kí hiệu : môi trường TA): (g/l) MgSO4.7H2O 0,2 K2HPO4 1 KH2PO4 1 NH4NO3 1 FeCl3.6H2O 0,05 CaCl2 0,02 Tannic acid 1 pH = 7.0 2.3. Tiến hành thí nghiệm 2.3.1. Mục tiêu 1: Phân lập vi khuẩn chịu nhiệt phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu 2.3.1.1. Thí nghiệm:Tăng sinh mẫu có xử lý nhiệt Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Hình 2.5: Các mẫu mụn dừa thu thập Trang 49
66. Đồ án tốt nghiệp Tiến hành Trước khi tiến hành phân lập ta phải chuẩn bị mẫu. Tăng sinh 3 mẫu: 2 mẫu mụn dừa và 1 mẫu vỏ tiêu trên môi trường TS . Thực hiện: với mỗi mẫu pha 100ml môi trường tăng sinh TS mang đi hấp khử trùng 121 oC/15 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung vào mỗi erlen 5 g mụn dừa và vỏ tiêu. Mang đi lắc 150 vòng/phút trong 3 ngày, sau đó đun 80 oC/15 phút và lắc tiếp 2 ngày. Thu được 3 erlen 100 ml dung dịch chứa mẫu phân lập. Sơ đồ các bước tiến hành Pha 100 ml môi trường TS o Hấp khử trùng 121 C/15phút Bổ sung 5 g mụn dừa (hoặc vỏ tiêu) Lắc 150 vòng/phút trong 3 ngày o Xử lý nhiệt 80 C/15 phút/mẫu Mẫu tăng sinh Hình 2.6: Sơ đồ tăng sinh vi sinh vật chịu nhiệt Trang 50
67. Đồ án tốt nghiệp 2.3.1.2. Thí nghiệm: Sàng lọc mẫu tăng sinh chứa quần thể vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ thạch Tiến hành Pha 100ml môi trường ĐT, đun và khấy đều để CMC và agar tan đều. Sau đó hấp khử trùng môi trường, đổ môi trường vào đĩa petri, để nguội và đục lỗ thạch. Dùng pipet vô trùng hút khoảng 0,2 ml dịch tăng sinh cho vào lỗ thạch. Ủ đĩa thạch ở 37 oC trong 1 ngày sau đó tiến hành đổ lugol. Sơ đồ các bước tiến hành Pha 100ml môi trường ĐT o Hấp khử trùng 121 C/15 phút Đổ môi trường vào đĩa petri đã hấp khử trùng Để nguội Đục lỗ thạch (3 lỗ/đĩa) Cho 0,2 ml dịch tăng sinh vào lỗ thạch o Ủ ở 37 C trong 1 ngày Đổ lugol Hình 2.7: Sơ đồ sàng lọc mẫu tăng sinh chứa quần thể vi sinh vật phân huỷ cellulose Trang 51
68. Đồ án tốt nghiệp 2.3.1.3. Thí nghiệm: Phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trên môi trường thạch chứa CMC Tiến hành Cách chuẩn bị đĩa môi trường phân lập: Sau khi pha môi trường PL vào bình tam giác thì tiến hành hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút cho cả môi trường và đĩa petri. Khi môi trường đã nguội khoảng 45 – 50 oC thì ta tiến hành đổ vào đĩa petri. Để môi trường nguội, ta lật ngược đĩa và đem ủ 30 oC trong 24 giờ để kiểm tra có bị nhiễm (nhiễm nấm men và nấm mốc) hay không. Chỉ sử dụng nếu đĩa không bị nhiễm. Chuẩn bị nước muối sinh lý: pha 100 ml nước muối sinh lý 0,85 % sau đó đem hấp khử trùng ở 121 oC, 1 atm, để nguội, sử dụng nước muối sinh lý để pha loãng mẫu. Tiến hành phân lập Sau khi tăng sinh mẫu xong , tiến hành pha loãng mẫu : Nồng độ pha loãng 10- 1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-5 10-7 Thể tích mẫu (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Thể tích nước muối sinh lý 0.85 % đã hấp khử 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 trùng (ml) Chọn 3 độ pha loãng 10-3, 10-5 và 10-7. Hút 0,1 ml mỗi độ pha loãng cho vào đĩa môi trường đã chuẩn bị ở trên, cấy trang cho đều và mặt thạch vừa khô rồi đem ủ ở 37 oC trong 3 ngày. Cấy chuyền: sau khi ủ theo dõi thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chọn các dạng khuẩn lạc khác nhau, mỗi khuẩn lạc cấy vào một đĩa riêng theo đường zigzac (đường cấy sau Trang 52
69. Đồ án tốt nghiệp chỉ chạm vào đường cấy trước một vài điểm), sau khi cấy xong một đường cấy phải hơ nóng đầu que cấy trên ngọn đèn cồn. Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 37 oC trong tủ ủ. Cứ như thế cho đến khi các khuẩn lạc rời đều thì kiểm tra dưới kính hiển vi thấy khuẩn lạc đồng nhất về hình dạng, kích thước, khuẩn lạc rời là xem như đã thuần. Nếu mẫu thuần thì trữ mẫu. Nếu mẫu chưa thuần thì tiếp tục cấy đến khi thuần. Sơ đồ các bước tiến hành phân lập Pha 300 ml môi trường PL o Hấp khử trùng 121 C/15phút Đổ môi trường vào đĩa petri đã hấp khử trùng Để nguội C ấy trang đĩa bằng dịch tăng sinh đã pha loãng bằng nước muối sinh lý Lật ngược đĩa o Ủ ở 37 C trong 3 ngày Quan sát và cấy chuyền các chủng vi sinh vật Hình 2.8: Sơ đồ phân lập vi sinh vật trên môi trường thạch chứa CMC 2.3.2. Mục tiêu 2: Sàng lọc vi khuẩn phân hủy cellulose từ các chủng phân lập 2.3.2.1. Thí nghiệm: Khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC Tiến hành Trang 53
70. Đồ án tốt nghiệp Sau khi pha môi trường PL vào bình tam giác thì tiến hành hấp khử trùng ở 121 oC, 1 atm trong 15 phút cho cả môi trường và đĩa petri. Khi môi trường đã nguội khoảng 45 – 50 oC thì ta tiến hành đổ vào đĩa petri. Khi môi trường trong đĩa thạch đã nguội ta tiến hành cấy điểm các giống đã thu được (3 điểm/đĩa). Sau khoảng 3 ngày, khi các điểm đã hình thành khuẩn lạc ta tiến hành tráng lugol để xem kích thước vòng halo. Sơ đồ các bước tiến hành Pha 300ml môi trường PL o Hấp khử trùng 121 C/15phút Đổ môi trường vào đĩa petri đã hấp khử trùng Để nguội Cấy điểm các giống (3 điểm/đĩa) Lật ngược đĩa o Ủ ở 37 C trong 3 ngày Tráng lugol Hình 2.9: Sơ đồ khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng 2.3.2.2. Thí nghiệm: Khảo sát khả năng mọc của các chủng trên môi trường thạch có chứa giấy lọc Sau khi pha 200 ml môi trường M vào bình tam giác thì tiến hành hấp khử trùng ở 121 oC, 1 atm trong 15 phút cho cả môi trường và đĩa petri. Khi môi trường đã nguội Trang 54
71. Đồ án tốt nghiệp khoảng 45 – 50 oC thì ta tiến hành đổ vào đĩa petri. Tiếp theo từ từ ½ miếng giấy lọc lên môi trường sao cho nằm một bên của đĩa thạch. Chú ý giấy lọc cho vào chỉ vừa thấm trên bề mặt thạch vào môi trường không nằm sâu vào môi trường.  Kết quả Dòng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase sẽ mọc trên giấy lọc, ½ đĩa còn lại không có giấy lọc dùng làm đối chứng. Sơ đồ tiến hành Pha 200 ml môi trường M o Hấp khử trùng 121 C/15phút Phối môi trường vào các đĩa petri vô trùng Cho ½ miếng giấy lọc vào một bên đĩa Cấy ria các giống o Ủ ở 37 C trong 5 ngày Kiểm tra kết quả Hình 2.10: Sơ đồ tiến hành khảo sát khả năng mọc trên môi trường thạch có chứa giấy lọc  Các chủng được chọn lọc chuyển sang giữ giống trên ống thạch nghiêng Tiến hành Trang 55
72. Đồ án tốt nghiệp Các bước pha môi trường giữ giống tương tự như tiến hành môi trường phân lập (môi trường PL). Sau đó ta phối môi trường PL vào và hấp khử trùng các ống nghiệm ở 121 oC trong 15 phút. Trong thời gian chờ đông thạch ta để nghiêng các ống nghiệm rồi cấy ria các ống thuần vào. 2.3.3. Mục tiêu 3: Khảo sát hình thái khuẩn lạc tế bào, bào tử và phản ứng sinh hóa vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase 2.3.3.1. Thí nghiệm: Khảo sát hình thái khuẩn lạc,bào tử vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase a. Khảo sát hình thái khuẩn lạc các chủng phân lập có hoạt tính cellulase Tiến hành Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn: Nhỏ 5 μl nước cất vô trùng lên kính mang vật. Khử trùng dao lam trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội. Dùng dao lam lấy một khuẩn lạc riêng lẻ và thạch rồi trải đều lên giọt nước trên lame. Quan sát hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn ở hai vị trí: vuông góc và song song với vật kính ở độ phóng đại 10 và 40. b. Nhuộm Gram các chủng phân lập có hoạt tính cellulase Tiến hành theo phương pháp nhuộm của Hans Cristian Joachim Gram . Làm tiêu bản Dùng que cấy lấy nước vô trùng và lấy một chút sinh khối làm vết bôi. Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên đèn cồn. Nhuộm tiêu bản: Trang 56
73. Đồ án tốt nghiệp Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi. Sau đó nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 phút. Tiếp tục nhuộm lugol, đợi 1 phút, rửa lại bằng nước cất. Tẩy cồn (hoặc dịch tẩy màu) trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu, rửa lại bằng nước cất. Nhuộm bổ sung Fuchsin hoặc safranin từ 10 – 30 giây. Rửa nước và hơ nhẹ trên đèn cồn. Làm khô và soi tiêu bản với vật kính dầu. Kết quả: Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu đỏ. c. Nhuộm bào tử các chủng phân lập có hoạt tính cellulase Theo phương pháp nhuộm Schaefera và Fulton cải tiến. Các mẫu giống trên 2 tuần tuổi trên ống thạch nghiêng. Các bước tiến hành: Dùng que cấy vô trùng lấy 1 ít vi khuẩn từ ống thạch nghiêng hòa tan vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần để cố định vết bôi. Sau đó nhỏ lên vết bôi 1 - 2 giọt cồn 95o, đốt cháy và dập tắt ngay. Đặt tiêu bản lên giá đỡ, giá đỡ đặt trên cốc có chứa một ít nước đang đun nóng (không để sôi) trên bếp. Nhỏ 2 - 3 giọt dung dịch lục malachite 5 % lên vết bôi và tiến hành hơ nóng trong 5 - 10 phút. Rửa lại vết bôi bằng nước cất trong 30 giây. Làm khô vết bôi, sau đó nhỏ 2 - 3 giọt fushin kiềm, để trong 30 giây. Rửa nước và thấm khô. Quan sát dưới kính hiển vi. Trang 57
74. Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.2. Thí nghiệm: Khảo sát một số phản ứng sinh hóa các chủng phân lập có hoạt tính cellulase a. Thử nghiệm khả năng sinh Indol Tiến hành Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này: nuớc trypton. Thuốc thử: thuốc thử Kovacs. Quan sát sự thay đổi màu khi nhỏ thuốc thử Kovacs. b. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate Tiến hành Môi trường sử dụng: môi trường Simmon Citrate Agar (SCA). Chủng thuần được cấy trên bề mặt môi trường SCA rắn trong ống thạch nghiêng. Ống thạch được ủ ở 35 oC trong 24 - 48 giờ. Ống đối chứng không cấy vi sinh vật để đối chiếu kết quả. c. Thử nghiệm khả năng sinh enzyme gelatinase Tiến hành Môi trường sử dụng là môi trường dinh dưỡng chứa gelatin Nutrient gelatin trong các ống thạch nghiêng. Tiến hành cấy một lượng sinh khối lớn chủng thuần sâu vào trong ống ủ ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày. Thực hiện ủ song song một ống môi trường đối chứng không được cấy vi sinh vật. 2.3.4. Mục tiêu 4: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có enzyme cellulase có tiềm năng sử dụng ủ compost từ mụn dừa 2.3.4.1. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme CMCase và FPase Trang 58
75. Đồ án tốt nghiệp a. Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở các pH khác nhau Tiến hành Pha 2000 ml môi trường TS phối vào 20 erlen, mỗi erlen 100 ml. Tiến hành chỉnh pH cho môi trường bằng NaOH 0,1 N hoặc HCl 0,1 N, mỗi chủng tiến hành bốn pH 3, 5, 7, 8. Thêm 5 g mụn dừa vào mỗi erlen. Hấp khử trùng các erlen ở 121 oC, 1 atm. Khi môi trường đã nguội cấy các giống vi khuẩn vào, lắc erlen 150 vòng/phút. Sau 3 ngày tiến hành lọc qua giấy lọc, dịch thu được sử dụng để khảo sát hoạt tính các enzyme. Hình 2.11: Mẫu enzyme ở các pH sau khi lọc Trang 59
76. Đồ án tốt nghiệp Sơ đồ tiến hành Pha 2000 ml môi trường TS Phối vào các erlen Chỉnh pH 3, 5, 7, 8 (bốn pH/giống) Thêm 5 g mụn dừa/erlen o Hấp khử trùng 121 C trong 15 phút Cấy giống Lắc 150 vòng/phút Hình 2.12: Sơ đồ chuẩn bị môi trường lỏng ở các pH khác nhau b. Thí nghiệm: Định tính hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH khác nhau bằng phương pháp đục lổ thạch Tiến hành Pha 300 ml môi trường, hấp khử trùng môi trường, hấp khử trùng đĩa, dụng cụ để sử dụng đục lỗ thạch, pipet. Đổ môi trường vào các đĩa và để trên bề mặt phẳng, chờ cho thạch đông. Tiến hành đục lỗ thạch. Hút 0,2 ml mẫu môi trường sau khi lọc qua giấy lọc vào các đĩa. Sau đó ủ ở 37 oC trong 48 giờ. Trang 60
77. Đồ án tốt nghiệp Kết quả: nhỏ thuốc thử lugol, quan sát và ghi nhận hiện tượng. Quan sát khả năng tạo vùng trong suốt (vùng halo) xung quanh khuẩn lạc của vi khuẩn. Từ đó tính được đường kính vòng thủy phân cellulose của vi khuẩn theo công thức sau: Hoạt tính (d) = đường kính vòng halo - đường kính lỗ đục Sơ đồ các bước tiến hành Pha 100 ml môi trường ĐT o Hấp khử trùng 121 C/15 phút Đổ môi trường vào đĩa petri đã hấp khử trùng Để nguội Đục lỗ thạch (3 lỗ/đĩa) Cho 0,2 ml dịch tăng sinh vào lỗ thạch o Ủ ở 37 C trong 1 ngày k Đổ lugol Hình 2.13: Sơ đồ định tính hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH khác nhau bằng phương pháp đục lỗ thạch. Chú ý : Các thao tác đỗ đĩa, đục lỗ, cấy đều phải thực hiện trong tủ cấy vô trùng. c. Thí nghiệm: Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH Trang 61
78. Đồ án tốt nghiệp Theo định nghĩa: một đơn vị CMCase là lượng enzyme mà sẽ giải phóng đường khử như glucose khi thủy phân CMC với vận tốc 1 µmol/phút dưới các điều kiện phản ứng.  Dựng đường chuẩn glucose trên cơ chất là CMC Hòa tan 100 mg glucose monohydrate với 80ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm sau: Bảng 2.1: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm dựng đường chuẩn glucose trên cơ chất là CMC Đối Ống 1 2 3 4 5 6 chứng Nống độ glucose 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 (mg/ml) Dung dịch glucose 1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 mg/ml(ml) Dung dịch CMC 1 1 1 1 1 1 1 % pH5 (ml) Dung dịch DNS- 2 2 2 2 2 2 2 lactose (ml) Nước cất 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 Khi chuẩn bị xong các ống hóa chất, lắc đều các ống nghiệm này. Sau đó đem đun sôi cách thủy trong vòng 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu Trang 62
79. Đồ án tốt nghiệp nước mát. Đặt độ hấp thụ của ống đối chứng ở bước sóng 540 nm bằng 0. Đo độ hấp thụ của của các ống còn lại ở bước sóng 540 nm và ghi lại kết quả.  Tiến hành các mẫu thí nghiệm Đối với một giống ở một pH ta thực hiện như sau: Chuẩn bị 3 ống thí nghiệm : 1 đối chứng (ĐC), 1 thí nghiệm (TN), 1 ống trắng (T). Bảng 2.2: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme CMCase theo pH Đối chứng Không phản ứng Phản ứng 1 ml dung dịch enzyme 1 ml dung dịch enzyme đã ủ 1ml nước cất đun ở 105 oC trong 10 trước ở nhiệt độ 40 oC phút 1 ml dung dịch CMC 1 % (ở pH 2ml DNS - lactose 2ml DNS - lactose tương ứng với pH enzyme) đã ủ trước ở nhiệt độ 40 oC 1 ml dung dịch CMC 1 % (ở 1 ml dung dịch CMC 1 pH tương ứng với pH % (ở pH tương ứng với 2 ml DNS - lactose enzyme) pH enzyme) Lắc đều và ủ ở 40 oC trong 10 phút. Lắc đều, đun sôi ở nhiệt độ 105 oC trong 15 phút. Để nguội, đo ở bước sóng 540 nm. Trang 63
80. Đồ án tốt nghiệp Ghi nhận kết quả. Hình 2.14: Xác định hoạt tính enzyme CMCase d. Thí nghiệm: Định lượng hoạt tính enzyme FPase của các chủng ở các pH Theo định nghĩa: một đơn vị cellulase là thể tích enzyme mà sẽ giải phóng đường khử như glucose khi thủy phân giấy lọc với vận tốc 1 µmol/phút dưới các điều kiện phản ứng.  Dựng đường chuẩn glucose trên cơ chất giấy lọc Bảng 2.3: Thành phần môi trường hóa chất của thí nghiệm chuẩn bị dung dịch glucose chuẩn GS1 GS2 GS3 GS4 Dung dịch glucose 1 1 1 1 standard stock (ml) Dung dịch đệm acetate 4 2 1 0,5 pH5(ml) Trang 64
81. Đồ án tốt nghiệp Nồng độ (mg/ml) 2 3,3 5 6,7 Hút 0,5 ml dung dịch GS1 tới GS4 cho vào ống nghiệm: Bảng 2.4: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm dựng đường chuẩn glucose trên cơ chất giấy lọc 1 2 3 4 Dung dịch GS1 tới 0,5 0,5 0,5 0,5 GS4 (ml) Dung dịch đệm 1 1 1 1 acetate pH5(ml) Cho thêm một mảnh giấy lọc 1 x 6 cm. Ủ ở 50 oC trong 60 phút. DNS - lactose 3 ml. Đun cách thủy các mẫu trong 105 oC trong 15 phút. Chuyển các ống nghiệm vào bể nước để làm nguội. Đo ở bước sóng 540 nm.  Tiến hành các mẫu thí nghiệm Đối với một giống ở một pH ta thực hiện như sau: Chuẩn bị 4 ống thí nghiệm: 1 enzyme đối chứng (EĐC), 1 cơ chất đối chứng (CĐC), 1 thí nghiệm (TN), 1 ống trắng (T). Trang 65
82. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.5: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme FPase ở các pH Enzyme đối Cơ chất đối Enzyme Mẫu trắng chứng chứng Giấy lọc 1x6 cm 1 mảnh 1 mảnh Dung dịch đệm acetate (ở pH tương 1 1 1,5 1,5 ứng với pH enzyme) (ml) Ủ enzyme pha loãng, mẫu trắng và đối chứng ở 50 oC trong 10 phút. Enzyme pha loãng 0,5 0,5 (ml) Ủ tất cả các mẫu ở 50 oC trong 60 phút. DNS - lactose 3 ml. Đun cách thủy các mẫu trong 5 phút. Chuyển các ống nghiệm vào bể nước để làm nguội. Đo ở bước sóng 540 nm. Trang 66
83. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.15: Xác định hoạt tính enzyme FPase e. Thí nghiệm: Khảo sát khả năng thủy phân giấy lọc của các chủng vi khuẩn Tiến hành Cắt giấy lọc với kích thước 1 x 6 (cm). Sấy ở 105 oC đến khi khối lượng không đổi sau đó cho vào bình hút ẩm 30 phút, cân và ghi nhận khối lượng. Sau đó cho giấy lọc vào các ống nghiệm. Pha 100 ml môi trường GL, hấp khử trùng 121oC, 15 phút. Để nguội, hút 5 ml môi trường cho vào các ống nghiệm. Cấy giống thuần chủng vào. Sau đó đem ủ ở 37 oC, và theo dõi sự thủy phân qua năm ngày, và mười ngày bằng cách lấy giấy lọc ra khỏi ống nghiệm, rửa sơ giấy lọc, sấy ở 105 oC đến khi khối lượng không đổi sau đó cho vào bình hút ẩm 30 phút, cân và ghi nhận khối lượng. Khi đó ta có công thức tính khả năng phân giải: (Khối lượng ban đầu – Khối lượng lúc sau)/Khối lượng ban đầu x 100 Trang 67
84. Đồ án tốt nghiệp Qui trình thực hiện: Giấy lọc 1x6 (cm) Pha 1000 ml môi trường GL pH7 Sấy Hút khoảng 5ml cho vào các ống nghiệm Hút ẩm Ống nghiệm + giấy lọc Cân o Hấp khử trùng 121 C trong 15 phút Cấy giống o Ủ ở 37 C trong 5 và 10 ngày Hình 2.16: Sơ đồ khảo sát khả năng thủy phân giấy lọc của các chủng phân lập 2.3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng oxy đến hoạt tính enzyme CMCase và enzyme FPase của các chủng phân lập a. Thí nghiệm: Chuẩn bị môi trường tăng sinh khảo sát ảnh hưởng của oxy đến hoạt tính enzyme CMCase và enzyme FPase của các chủng phân lập Tiến hành Pha 1000 ml môi trường TS ở pH7 vào 10 erlen (100 ml/erlen). Thêm 5 g mụn dừa vào mỗi erlen. Hấp khử trùng các erlen ở 121 oC, 1 atm. Khi môi trường đã nguội cấy các giống vi khuẩn vào erlen (2 erlen/giống). 5 erlen của 5 giống để ở điều kiện phòng, 5 erlen còn lại lắc 150 vòng/phút. Trang 68
85. Đồ án tốt nghiệp Sau 3 ngày tiến hành lọc qua giấy lọc, dịch thu được sử dụng để khảo sát hoạt tính các enzyme Sơ đồ tiến hành Pha 1000 ml môi trường TS pH7 Phối vào các erlen Thêm 5 g mụn dừa/erlen o Hấp khử trùng 121 C trong 15 phút Cấy giống 5 erlen để ở điều kiện phòng 5 erlen ở chế độ lắc 150 vòng/phút Hình 2.17: Chuẩn bị môi trường khảo sát hoạt tính enzyme ở hai chế độ lắc và không lắc b. Thí nghiệm: Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các giống ở 2 chế độ không lắc và lắc 150 vòng/phút Tiến hành Enzyme: Lọc dịch enzyme từ các erlen sau 3 ngày để xác định hoạt tính: 5 mẫu lắc và 5 mẫu không lắc. Trang 69
86. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.6: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính CMCase ở hai chế độ không lắc và lắc Đối chứng Không phản ứng Phản ứng 1 ml dung dịch enzyme 1 ml dung dịch enzyme 1 ml nước cất đã ủ trước ở nhiệt độ 40 đun ở 105 oC trong 10 phút oC 1 ml dung dịch CMC 1 2ml DNS - lactose 2 ml DNS - lactose % ở pH 5 đã ủ trước ở nhiệt độ 40 oC 1 ml dung dịch CMC 1 % ở 1 ml dung dịch CMC 1 % 2 ml DNS - lactose pH5 ở pH5 Lắc đều và ủ ở 40 oC trong 10 phút. Lắc đều, đun sôi ở nhiệt độ 105 oC trong 15 phút. Để nguội, đo ở bước sóng 540 nm. Ghi nhận kết quả. c. Thí nghiệm: Xác định hoạt tính enzyme FPase của các giống ở 2 chế độ không lắc và lắc 150 vòng/phút Enzyme: Lọc dịch enzyme từ các erlen sau 3 ngày để xác định hoạt tính: 5 mẫu lắc và 5 mẫu không lắc. Trang 70
87. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.7: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính FPase Enzyme đối Cơ chất đối Enzyme Mẫu trắng chứng chứng Giấy lọc 1x6cm 1 mảnh 1 mảnh Dung dịch đệm acetate 1 1 1,5 1,5 pH5(ml) Ủ enzyme pha loãng, mẫu trắng và đối chứng ở 50 oC trong 10’ Enzyme pha 0,5 0,5 loãng (ml) Ủ tất cả các mẫu ở 50 oC trong 60 phút DNS - lactose 3 ml Đun cách thủy các mẫu trong 5 phút Chuyển các ống nghiệm vào bể nước để làm nguội Đo ở bước sóng 540 nm 2.3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng sinh enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút a. Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở pH7 Tiến hành Trang 71
88. Đồ án tốt nghiệp Pha 700 ml môi trường TS phối vào 7 erlen, mỗi erlen 100 ml. Tiến hành chỉnh pH7 cho môi trường bằng NaOH 0,1 N hoặc HCl 0,1 N. Thêm 5 g mụn dừa vào mỗi erlen. Hấp khử trùng các erlen ở 121 oC, 1 atm. Khi môi trường đã nguội cấy các giống vi khuẩn vào, lắc các erlen 150 vòng/phút. Sau 3 ngày tiến hành lọc qua giấy lọc, dịch thu được sử dụng để khảo sát hoạt tính các enzyme. b. Thí nghiệm: Định tính hoạt tính enzyme tannase trên đĩa thạch chứa tannic acid ở điều kiện pH7 và lắc 150 vòng/phút Tiến hành Cân 1 g tannic acid pha vào khoảng 10ml nước cất lắc đều. Cân 3,5 g agar lắc đều trong 50 ml nước cất, chỉnh về pH7, cho thêm nước cất đến 90 ml. Hấp khử trùng riêng hai thành phần, sau đó trộn vào nhau. Lắc đều môi trường, sau đó phối vào đĩa petri vô trùng. Đợi môi trường nguội, tiến hành đục lỗ thạch. Thêm 0,2 ml dịch enzyme pH7 của các chủng vi khuẩn đã lắc 150 vòng/phút sau 3 ngày. Ủ các đĩa ở 37 oC trong 24 giờ, sau đó tráng đĩa bằng dung dịch FeCl3/HCl. Trang 72
89. Đồ án tốt nghiệp Cân 3,5 g agar + 50 ml nước cất Sơ đồ tiến hành Cân 1 g tannic acid + 10 ml Chỉnh về pH7 nước cất Thêm nước cất đến 90 ml Lắc đều Hỗn hợp 1 Hỗn hợp 2 o Hấp khử trùng 121 C trong 15 phút Trộn đều hai hỗn hợp Phối vào đĩa petri Đợi nguội Đục 3 lỗ thạch/đĩa Hút 0,2 ml enzyme cho vào lỗ thạch Ủ 37oC trong 24 giờ Tráng lugol Quan sát kết quả Hình 2.18: Sơ đồ định tính khả năng sinh enzyme tannase của các chủng Trang 73
90. Đồ án tốt nghiệp c. Thí nghiệm: Xác định hoạt tính enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút Hóa chất Đệm acetate pH7 nồng độ 0,05 M. Cơ chất tannic axit 0,35 %: Ethanol 90 %. Enzyme: Dịch enzyme của các giống ở pH7 sau khi lắc 150 vòng/phút trong 3 ngày. Dịch enzyme chỉ chứa mụn dừa không cấy giống ở pH7, lắc 150 vòng/phút trong 3 ngày (đối chứng). Tiến hành: Mỗi giống ở mỗi pH tiến hành 3 ống: 1 ống trắng, 1 ống không phản ứng, 1 ống phản ứng. Tiến hành theo các bước sau: Trang 74
91. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.8: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme tannase Ống Trắng Không phản ứng Phản ứng Cơ chất tannic axit 1 1 1 0,35 % (ml) Ủ ở 30 oC trong 5 phút 0,25 ml đệm acetate 0,25 ml dịch 0,25 ml dịch pH7 nồng độ 0.05M enzyme đối chứng enzyme Ủ ở 30 oC trong 15 phút Thêm 5 ml cồn 90 % vào các ống và lắc đều để dừng phản ứng. Hút 0.25 ml dịch ở các ống trên cho vào các ống tương ứng. Thêm 5 ml cồn 90 % vào các ống, lắc đều. Đo ở bước sóng 310 nm. d. Thí nghiệm: Khảo sát khả năng chịu tannic acid của các chủng phân lập ở các nồng độ khác nhau 1 %, 3 %, 5 % Tiến hành Pha 600 ml môi trường TA ta được môi trường TA lỏng có chứa tannic acid 1 %. Tương tự như vậy, ta pha được môi trường chứa tannic acid 3 % và 5 %. Ở mỗi nồng độ phối vào 6 erlen, mỗi erlen 100 ml. Trong đó 1 erlen làm đối chứng và 5 erlen có cấy giống đã phân lập được. Trang 75
92. Đồ án tốt nghiệp Lắc các erlen ở chế độ 150 vòng/phút trong 3 ngày. Sau 3 ngày, dùng micropipet hút 1 ml dịch ở các erlen ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút để lấy phần sinh khối phía dưới. Dùng nước muối sinh lý để tiến hành pha loãng và đo ở bước sóng 600 nm Sơ đồ tiến hành Trang 76
93. Đồ án tốt nghiệp Cân 1 g tannic acid + 10 ml nước cất Pha các thành phần còn lại của môi trường TA Lắc đều Chỉnh về pH7 Hỗn hợp 1 Hỗn hợp 2 o Hấp khử trùng 121 C trong 15 phút Trộn đều hai hỗn hợp Phối vào các erlen Đợi nguội Cấy giống Lắc 150 vòng/phút trong 3 ngày Ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút Sinh khối Pha loãng bằng nước muối sinh lý Đo ở bước sóng 600 nm Hình 2.19: Sơ đồ khảo sát khả năng tăng sinh khối của các chủng phân lập trong tannic acid ở các nồng độ khác nhau Trang 77
94. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Mục tiêu 1: Phân lập vi khuẩn chịu nhiệt phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu 3.1.1. Thí nghiệm:Tăng sinh mẫu có xử lý nhiệt Trong tất cả các thí nghiệm này, nguồn cellulose trong quá trình tăng sinh các chủng là mụn dừa. Tuy nhiên mụn dừa và vỏ tiêu đều là nhửng phụ phế phẩm giàu xơ, khảo sát mụn dừa để tiến đến khảo sát các chủng trên vỏ tiêu. Trong thí nghiệm tăng sinh, mụn dừa đóng vai trò là chất cảm ứng cho các chủng tiết enzyme cellulase. Quá trình tăng sinh các mẫu đều phải qua bước xử lý nhiệt. Mục đích của bước này nhằm chọn các vi sinh vật có bào tử hoặc có khả năng chịu nhiệt có khả năng phân hủy cơ chất giàu cellulose (mụn dừa và vỏ tiêu) vì trong quá trình ủ compost có pha thermophilic, nhiệt độ trong pha này có thể lên trên 50 oC, do đó đòi hỏi cần phải có nguồn giống chịu được nhiệt độ này. Môi trường sử dụng để tăng sinh là TS, môi trường này cung cấp các thành phần khoáng thiết yếu cho sự phát triển của vi sinh vật đã được nghiên cứu phân lập vi khuẩn phân giải cellulose từ các nguồn đất, rơm rạ. Kết quả phân lập cho kết quả khả quan về cả vi sinh vật và hoạt tính của chúng nên quyết định chọn môi trường này để phân lập. Thí nghiệm này thu được ba erlen của ba mẫu chứa vi sinh vật chịu nhiệt. 3.1.2. Sàng lọc mẫu tăng sinh quần thể vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ thạch Trang 78
95. Đồ án tốt nghiệp Có thể bỏ qua bước này để chuyển sang bước phân lập vi sinh vật từ các mẫu, tuy nhiên nếu có bước này sẽ giảm rủi ro phân lập các mẫu không có chứa vi sinh vật quan tâm. Các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy các vật liệu giàu xơ đều có khả năng tiết enzyme ngoại bào cellulase. Chính vì thế, dựa vào đặc tính này ta thử dịch tăng sinh trên môi trường ĐT để bước đầu sàng lọc các mẫu có vi sinh vật phân hủy cellulose. Dịch tăng sinh của các mẫu có chứa enzyme cellulase tạo ra vòng trong suốt khi nhỏ lugol trong khi vùng còn lại có màu tối hơn Sau khi lắc tăng sinh mẫu rồi tiến hành xử lý nhiệt ở 80 oC trong 15 phút nhằm thu được các vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt hoặc có bào tử nhằm làm nguồn giống trong quá trình ủ compost. Sau đó dịch tăng sinh được thử trên môi trường thạch đục lỗ chứa CMC 1 % và agar nhằm sàng lọc các mẫu có chứa vi sinh vật vừa chịu được nhiệt vừa có khả năng sinh enzyme ngoại bào cellulase. Sau tráng lugol trên các đĩa thạch các mẫu đều vòng halo. Vòng halo khá lớn, đủ để đánh giá trong cả ba mẫu đều có chứa vi sinh vật phân hủy cellulose. Quan sát hình 3.1: Đây là kết quả có được trong thử nghiệm khả năng phân hủy cellulose của vi khuẩn sau khi tăng sinh. Bằng cách nhỏ dịch tăng sinh của từng vi khuẩn vào lỗ thạch, nuôi ủ 37 oC, trong ba ngày, sau đó nhỏ lugol. Các quần thể vi sinh vật từ 3 nguồn phân lập là mụn dừa và vỏ tiêu đều có khả năng phân hủy cellulose. Do đó cả 3 mẫu đều được sử dụng làm nguồn phân lập Trang 79
96. Đồ án tốt nghiệp Mụn dừa 1 Mụn dừa 2 Mẫu tiêu Hình 3.1: Sàng lọc quần thể vi sinh vật tăng sinh bằng phương pháp đục lỗ thạch 3.1.3. Thí nghiệm: Phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trên môi trường thạch chứa CMC Mục đích của bước này nhằm tách riêng từng chủng vi sinh vật trong mẫu mụn dừa và vỏ tiêu để thu nhận được giống ở dạng thuần khiết. Sau khi biết chắc rằng trong môi trường tăng sinh có vi khuẩn cần phân lập, tiến hành cấy trang dịch tăng sinh sang môi trường PL phân lập. Môi trường này có chứa CMC đặc trưng cho việc phân lập các chủng vi sinh vật phân huỷ cellulose. Sau 3 ngày ủ 37 oC, từ mỗi dịch tăng sinh ba mẫu phân lập được 8 chủng vi khuẩn có hình dạng khuẩn lạc khác nhau. Tiến hành cấy ria và giữ tất cả các giống để tiến hành khảo sát hoạt tính và xem xét hình thái các chủng sau nhiều ngày có trùng với nhau không. Trang 80
97. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1: Các chủng thu được từ mẫu mụn dừa ở Cao Lãnh Ký hiệu Hình thái Mô tả Kích thước khuẩn lạc lớn, tròn, khuẩn lạc trắng đục, BHM1 rìa có màu hồng nhạt, nhô, tròn bóng Kích thước khuẩn lạc lớn, BHM2 nhầy nhớt, màu đục sữa, nhô. Kích thước nhỏ, màu trắng BHM3 trong, nhầy nhớt. Kích thước lớn, màu trắng đục, bề mặt khuẩn lạc khô, BHM4 khuẩn lạc bám chặt trên bề mặt thạch. Trang 81
98. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2: Các chủng thu được từ mẫu mụn dừa ở Lai Vung Ký hiệu Hình thái Mô tả Kích thước lớn, màu trắng đục. Những ngày đầu BHM5 khuẩn lạc tròn trong, về sau khuẩn lạc hình thành sợi đen . Kích thước nhỏ, bề mặt BHM6 khô, khuẩn lạc nhô, màu trắng đục Bảng 3.3: Các chủng thu được từ mẫu vỏ tiêu ở Bà rịa Vũng Tàu Ký hiệu Hình thái Mô tả Kích thước lớn, màu trắng đục, khuẩn lạc nhầy nhớt, BHM8 dính bám trên bề mặt thạch Trang 82
99. Đồ án tốt nghiệp Kích thước lớn, nhầy nhớt, BHM10 màu trắng trong. 3.2. Mục tiêu 2: Sàng lọc vi khuẩn phân hủy cellulose từ các chủng phân lập 3.2.1. Thí nghiệm: Khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC Trong môi trường phân lập một số thành phần tạp đặc biệt là trong agar, agar sử dụng ở đây là agar thực phẩm không phải là agar vi sinh do đó có thể chứa một số gốc đường cũng có thể làm nguồn cacbon cho vi sinh vật vì thế bước thử nghiệm này là cần thiết để sàng lọc lại vi sinh vật có khả năng phân huỷ cellulose. Sau khi cấy điểm và ủ ở nhiệt độ 37 oC trong 3 ngày trên môi trường PL, tiến hành đổ lugol, từ 8 chủng phân lập ở trên chỉ thu lại được 5 chủng có quầng sáng xung quanh khuẩn lạc, chỉ 5 chủng phân lập có hoạt tính celulase là BHM3, BHM4, BHM5, BHM8 và BHM10. Bảng 3.4: Hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC Trang 83
100. Đồ án tốt nghiệp Đường kính (mm) Giống Vòng lugol trên đĩa thạch Vòng Khuẩn lạc Vòng halo phân giải 4 13 9 BHM3 2 9 7 3 11 8 4 14 10 BHM4 4 13 9 4 15 11 3 14 11 BHM5 4 14 10 4 14 10 Trang 84
101. Đồ án tốt nghiệp 0.3 0.8 0.5 BHM8 0.2 0.7 0.5 0.3 1 0.7 4 18 14 BHM10 3 21 18 4 17 13 3.2.2. Thí nghiệm: Khảo sát khả năng mọc của các chủng trên môi trường thạch có chứa giấy lọc Định tính khả năng sinh enzyme CMCase là chưa đủ để đánh giá hoạt lực của enzyme cellulase vì hoạt động enzyme cellulase dựa trên sự phối hợp của ba loại enzyme exoglucanse, endoglucanse và β –glucosidase. Do đó phải lựa chọn nguồn cacbon khác CMC để đánh giá hoạt tính, ở đây là giấy lọc do trong giấy lọc có chứa cả vùng vô định hình và vùng kết tinh. Hơn nữa giấy lọc là nguồn cơ chất có chứa cellulose tương đối giống với mụn dừa. Sau khi khảo sát khả năng sinh enzyme CMCase, 5 chủng có khả năng mọc trên thạch và có quầng sáng sẽ được khảo sát khả năng hình thành khuẩn lạc trên bề mặt thạch có chứa giấy lọc vì hoạt tính CMCase ít có ý nghĩa trong việc chọn giống ủ compost. Thực hiện thí nghiệm này nhằm chọn ra các chủng có khả năng sử dụng Trang 85
102. Đồ án tốt nghiệp nguồn cacbon duy nhất trong môi trường là cellulose. Sau 5 ngày cấy ria, 5 chủng thu được đều có khả năng mọc trên giấy lọc, ½ đĩa thạch đối chứng không có khuẩn lạc. BHM3 BHM4 BHM5 BHM8 BHM10 Hình 3.2: Khả năng mọc của các chủng trên môi trường thạch có chứa giấy lọc Trang 86
103. Đồ án tốt nghiệp Kết luận: 5 chủng BHM3, BHM4, BHM5, BHM8, BHM10 là vi sinh vật chịu nhiệt có khả năng sinh enzyme CMCase và cellulase, phù hợp với mục đích phân lập. 3.3. Mục tiêu 3: Khảo sát hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử và phản ứng sinh hóa vi khuẩn (hoặc xạ khuẩn) phân lập có hoạt tính cellulase 3.3.1. Thí nghiệm: Khảo sát hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase Sau khi có một bộ giống gồm 5 chủng có hoạt tính cellulase trước khi tiến hành khảo sát hoạt tính cần chắc rằng các chủng này là hoàn toàn khác nhau. Tuy chưa thể dựa vào đây để định danh nhưng bước này phần nào giúp người thực hiện đánh giá sự khác biệt giữa các chủng phân lập được.  Quan sát hình thái khuẩn lạc Khuẩn lạc của các chủng có thể lồi, dẹt, có khuẩn ty Do đó để quan sát sơ bộ hình thái cách đơn giản nhất là quan sát một khuẩn lạc riêng lẻ. Dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 10 ta có thể quan sát và mô tả hình thái khuẩn lạc các chủng. Bảng 3.5: Quan sát hình thái khuẩn lạc Quan sát hình thái Mô tả BHM3 Bề mặt lồi, rìa tròn, trắng trong Trang 87
104. Đồ án tốt nghiệp BHM4 Bề mặt phẳng, màu trắng đục, rìa răng cưa BHM5 Khuẩn lạc có khuẩn ty BHM8 Khuẩn lạc lồi, trắng đục, rìa tròn. BHM10 Bề mặt lồi, trắng trong, rìa tròn  Kết quả nhuộm Gram Vi khuẩn có cấu tạo đơn bào, đa số chúng có đường kính từ 0,2 - 2 μm, chiều dài từ 2 - 8 μm. Hình dạng tế bào có thể là hình cầu, hình que, hình xoắn hay hình dấu phẩy; các tế bào có thể tồn tại đơn lẻ, hay có thể kết đôi, kết chuỗi và kết chùm. Chúng Trang 88
105. Đồ án tốt nghiệp sinh sản chủ yếu bằng hình thức phân đôi tế bào. Một số loài vi khuẩn có khả năng tạo bào tử; một số loài có khả năng di động nhờ chúng có tiên mao. Khi quan sát vi khuẩn, nói chung quan sát các đặc điểm mang tính đặc trưng như hình dáng, kiểu liên kết giữa các tế bào, khả năng di động, sự hình thành bào tử và nhuộm Gram. Nhằm phân biệt các dạng vi khuẩn thuộc hai nhóm Gram âm và Gram dương. Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh, iod và fushin mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau. Kết quả hình thái tế bào quan sát bằng phương pháp nhuộm gram ta nhận được kết quả đều là vi khuẩn gram dương: Dòng vi khuẩn BHM3 cho kết quả gram dương, hình oval. Dòng vi khuẩn BHM4 cho kết quả gram dương, hình que ngắn. Dòng vi khuẩn BHM5 cho kết quả gram dương, hình cầu. Dòng vi khuẩn BHM8 cho kết quả gram dương, que ngắn. Dòng vi khuẩn BHM10 cho kết quả gram dương, hình que ngắn. Sau 2 tuần, tiến hành nhuộm gram một lần nữa để xem có sự thay đổi hình thái của tế bào hay không, kết quả cho thấy các vi khuẩn không thay đổi hình thái. Đối với kết quả nhuộm bào tử của các chủng vi khuẩn sau 2 tuần theo phương pháp Schaefera và Fulton cải tiến, theo đó bào tử sẽ bắt màu xanh, tế bào chất bắt màu hồng. Nhưng quan sát bảng 3.8 ta không thấy xuất hiện bào tử ở cả năm dòng vi khuẩn, chỉ thấy hình dạng tế bào bắt hồng có hình que, cầu hoặc oval.  Kết quả nhuộm bào tử Nhiều loài vi khuẩn có khả năng hình thành một cấu trúc nghỉ được gọi là nội bào tử hay nha bào. Mỗi tế bào vi khuẩn làm phát sinh một nội bào tử, bào tử có thể này Trang 89