›

Đồ án Phân lập và tuyển chọn và xác định môi trường nhân sinh khối của các chủng Azotobacter spp trong đất trồng phục vụ sản xuất phân bón vi sinh

pdf 59 trang thiennha21 12/04/2022 4670
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập và tuyển chọn và xác định môi trường nhân sinh khối của các chủng Azotobacter spp trong đất trồng phục vụ sản xuất phân bón vi sinh", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_phan_lap_va_tuyen_chon_va_xac_dinh_moi_truong_nhan_sin.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập và tuyển chọn và xác định môi trường nhân sinh khối của các chủng Azotobacter spp trong đất trồng phục vụ sản xuất phân bón vi sinh

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân lập và tuyển chọn và xác định môi trường nhân sinh khối của các chủng Azotobacter spp trong đất trồng phục vụ sản xuất phân bón vi sinh Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện :MAI THỊ QUỲNH TRÂN MSSV: 0851110255 Lớp: 08DSH1 TP. Hồ Chí Minh,
  2. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Song song với sự phát triển không ngừng của các ngành công nghiệp thì nông nghiệp ở nước ta cũng đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể nhờ tiến bộ của khoa học kĩ thuật, làm cho năng suất và chất lượng cây trồng tăng lên gấp nhiều lần. Trong nông nghiệp, đạm được xem là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng đối với cây trồng. Việc cung cấp đạm cho cây trồng từ phân bón là vô cùng quan trọng nhằm đáp ứng nhu cầu sinh trưởng, phát triển của cây và phần nào bù đắp lại lượng đạm mà cây trồng đã lấy đi từ đất qua các vụ mùa. Khi bón phân đạm vào đất, cây trồng chỉ hấp thu khoảng 40 - 50% lượng phân bón, lượng còn lại bị nước mưa, nước tưới rửa trôi, hoặc bị chuyển hóa và bốc hơi ở dạng NH3, NOx, N2. Bên cạnh đó, sự lạm dụng quá nhiều phân bón hóa học để gia tăng năng suất đã làm cho đất đai ngày càng bạc màu, độ phì nhiêu kém dần, tình trạng ô nhiễm nguồn nước mặt gây nên hiện tượng nước nở hoa, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và môi trường sống của con người cũng như các sinh vật khác trong tự nhiên (Shenoy và ctv, 2001; Huỳnh Thu Hòa, 2006). Vì vậy, việc gia tăng bón phân đạm hóa học chỉ là giải pháp tạm thời, không thể áp dụng lâu dài bởi chúng phát sinh nhiều mối lo ngại. Hiện nay, phân vi sinh có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với phân hóa học nhờ tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, giảm chi phí sản suất thì phân vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nông nghiệp bền vững. Tuy nhiên tình hình sản xuất phân vi sinh ở nước ta vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp, do quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định. Do đó, nghiên cứu để hoàn thiện và nâng cao chất lượng phân vi sinh là việc làm hết sức cần thiết. Trong đó, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm [7]. Thời gian gần đây việc nghiên cứu và sử dụng phân sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật, đã được nhiều nước trên thế giới quan tâm nhằm tạo ra một sản phẩm sạch, giảm bớt chi phí đầu tư sản xuất trong nông nghiệp và bảo vệ môi trường 1
  3. Đồ án tốt nghiệp hướng tới xây dựng một nền nông nghiệp bền vững. Và một trong những hướng nghiên cứu đang được chú ý nhiều nhất hiện nay là sản xuất phân sinh bón vi sinh cố định đạm có nguồn gốc từ vi sinh vật với chủng Azotobacter spp là chủng được quan tâm nhiều nhất vì nhiều đặc điểm thuận lợi như khả năng cố định đạm tự do trong không khí, tổng hợp nhiều chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA, GA3 làm hệ thống rễ phát triển vững chắc, hấp thu nước và chất dinh dưỡng tốt (Okon, 1985) góp phần nâng cao độ phì nhiêu của đất, kích thích tăng trưởng, tăng năng suất cây trồng, hạn chế bón phân hóa học và phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững [11] Xuất phát từ thực tế đó, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và xác định môi trường nhân sinh khối của các chủng Azotobacter spp trong đất trồng phục vụ sản xuất phân bón vi sinh”. 2. Mục tiêu của đề tài Phân lập và tuyển chọn được một số chủng Azotobacter cố định đạm cao trong đất trồng. Xây dựng quy trình nhân sinh khối một số chủng Azotobacter có hoạt tính cố định đạm làm phân sinh học chuyên dụng cho cây trồng. 3. Ý nghĩa của đề tài Ý nghĩa khoa học - Xác định được một số chủng Azotobater spp có khả năng cố định đạm ứng dụng trong sản xuất phân bón vi sinh - Thiết lập quy trình nhân giống, nhân sinh khối Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng Azotobacter spp có hoạt tính cố định đạm để sản xuất phân vi sinh có hiệu quả, nâng cao độ phì nhiêu của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây trồng và góp phần phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững. 2
  4. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về vi sinh vật cố định Nitơ (N) 1.1.1. Chu trình Nitơ trong tự nhiên Nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu đối với động vật, thực vật và ngay cả đối với các loài vi sinh vật. Dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn trong không khí, nitơ chiếm 78,16% thể tích. Người ta ước tính rằng, trong bầu không khí bao trùm lên một hecta đất đai chứa tới 8 triệu tấn nitơ. Lượng nitơ này có thể cung cấp cho cây trồng tới hàng chục triệu năm (nếu như cây trồng có khả năng đồng hóa nó). Trong cơ thể các loại sinh vật trên trái đất cũng có khoảng 0,4 x 109 tấn nitơ. Trong các vật trầm tích chứa khoảng 4 x 1015 tỷ tấn nitơ. Cây trồng không đồng hóa trực tiếp nitơ hữu cơ, mà phải nhờ các loại vi sinh vật phân hủy và chuyển hóa nguồn nitơ bền vững thành ra nitơ dạng dễ tiêu (NH3 hoặc NH4+), cung cấp nguồn dinh dưỡng nitơ cho cây trồng, quá trình này được gọi là quá trình amôn hóa. Tiếp nối quá trình amôn hóa, các loài vi sinh vật lại chuyển hóa tiếp từ NH3 thành NO3- được gọi là quá trình nitrat hóa. Tiếp theo của quá trình nitrat hóa, các loại vi sinh vật lại chuyển hóa từ NO3- thành N2 để bù trả nitơ cho không khí được gọi là quá trình phản nitrat hóa. Dưới tác dụng của các loại vi sinh vật, nitơ không khí được chuyển vào các hợp chất hữu cơ chứa nitơ được gọi là quá trình cố định nitơ phân tử. Tất cả các quá trình: cố định – phân hủy - chuyển hóa và phản nitrat hóa luôn xảy ra dưới tác dụng của các loài vi sinh vật và tạo được thế cân bằng nitơ. Nhờ đó mà đã khép kín được vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên. 3
  5. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1 Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên Hợp chất Nitơ (protein, urea ) Vi sinh vật thủy phân Tạo sinh Ammoniac Tế bào Nitơ hữu cơ Tế bào thực vật khối Phân hủy nội bào - NO2 Khử Khí Nitơ nitrat - NO 3 Chất hữu cơ Carbon Hình 1.2 Tóm tắt qúa trình chuyển hóa nitơ của vi sinh vật (theo climategis.com)
  6. Đồ án tốt nghiệp 1.1.2. Các vi sinh vật cố định Nitơ phân tử Vi sinh vật cố định N có một vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn N2 và cung cấp một lượng N đáng kể cho cây trồng. Theo tính toán của các nhà khoa học, các nhóm vi sinh vật cố định N BNF (Biological nitrogen fixation) có thể cung cấp tới 240 x 106 tấn N/năm trên cả hành tinh, gấp 6 lần lượng N mà cả thế giới sản xuất bằng con đường hóa học. Vi sinh vật cố định N là các nhóm vi sinh vật có khả năng chuyển hóa khí N2 dồi dào trong khí quyển (79%) thành dạng NH4+ cung cấp cho cây. Có 2 nhóm vi sinh vật cố định nitơ :1) nhóm vi sinh vật sống tự do và hội sinh; 2) nhóm vi sinh sống cộng sinh 1)Nhóm vi sinh vật sống tự do và hội sinh co một số loài điển hình sau: Vi khuẩn Azotobacter Vi khuẩn Beijerinskii Vi khuẩn Clostridium 2)Nhóm vi sinh vật sống cộng sinh có một số loài điển hình sau: Rhizobium Azospirillum Một số vi sinh vật cố định đạm khác Ngoài những giống vsv cố định nitơ phân tử nói trên, còn vô số những giống khác đều có khả năng cố định nitơ phân tử, chúng có nhiều ý nghĩa trong sản xuất nông lâm, ngư nghiệp. Vi khuẩn: Azotomonas insolita, Azotomonas fluorescens, Pseudomonas azotogenis,Klebsiella pneumonia,; Aerobacter aerogene, Rhodospirillum rubrum,Chromatium sp,Chlorobium sp, Rhodomicribium spp,Desulfovibrio desulfuricans; Methanobacterium spp Xạ khuẩn : Một số loài thuộc giống: Actinomyces, Frankia, Nocardia, Actinopolyspora, Tảo – Vi khuẩn lam: Plectonema, Anabaena azolla,; Anabaena Ambigua, Anabaena cylindrica, Calothrix elenkii 5
  7. Đồ án tốt nghiệp 1.1.3. Quá trình cố định Nitơ phân tử Trong suốt một thời gian dài, cơ chế của quá trình cố định nitơ vẫn là một bí ẩn của tự nhiên. Trong khi con người đang sử dụng những điều kiện kỹ thuật rất cao và tốn kém (400- 5000 C, 200-1000atm) để phá vỡ mối liên kết ba của phân tử nitơ. 5 Phân tử N2 (có năng lượng 9,4.10 J/mol) thì các vi sinh vật cố định đạm lại có thể đồng hóa ngay trong các điều kiện bình thường về áp suất và nhiệt độ. Những nghiên cứu trong những năm gần đây đã cho thấy rõ được một phần cơ chế của quá trình cố định nitơ là nhờ enzyme. Quá trình cố định nitơ là quá trình khử N2 thành NH3 nhờ enzyme nitrogenase với sự có mặt của ATP (andenozintriphotphat N2+ AH2 + ATP -> NH3 + A + ADP + P (AH2 là chất cho e) ADP: adenozin photphat. ATP cấu tạo thành 3 nhóm base nitro adenine, đường ribose và 3 nhóm phosphate. Bằng phương pháp sắc ký trên ICC ”120” BIP (Pháp) với cột sắc ký poropak, ta nhận được và xác định được cường độ cố định nito phân tử theo hoạt tính của nitrogenase. Sau một thời gian nghiên cứu các nhà khoa học dần hoàn thiện cơ chế cố định nito phân tử. Theo cơ chế mới nhất (1992) thì quá trình cố định nitơ phân tử được chia theo hai hướng cơ bản: con đường khử và con đường oxi hóa. Quá trình cố định nitơ được thể hiện bằng phương trình sau: N2 → HN=NH → H2N - NH2 → NH3→ NH4OH - + nitrogenase, N2 + 8e +16Mg.ATP + 8H 16O 2NH3 + 16Mg.ADP +16P + H 2O. Cơ chế của quá trình cố định nitơ này khá phức tạp và được làm sáng tỏ nhờ các công trình nghiên cứu nhiều năm gần đây (Hardy, Bun, 1968; Mortenson, 1966, 1968; Hardetal, 1970; Bulen, Lecomte, 1966; Begersen, 1969; Silop, 1971 ) Nitrogenase là một phức gồm 2 protein chủ yếu: một protein MoFe (nitrogense, MW 220000) liêm kết với 1-2 protein Fe (nitrogenase reductase, MW 64000) Fe phân tử có khối lượng phân tử khoảng 6.104 Mo-Fe protein có khối lượng phân tử khoảng 2,2.105 6
  8. Đồ án tốt nghiệp Mo-Fe protein chứa hai nguyên tử Mo (molipden) và 28-32 nguyên tử Fe và 25-30 nguyên tử sắt không bề với axit. Fe và Mo của protein Mo-Fe được chứa bên trong cột cofactor gọi là FeMo-co và sự khử N2 diễn ra cofactor này. Quá trình khử: Trước hết protein Fe được khử bởi ferredoxin sau đó liên kết với ATP làm thay đổi hình thể của protein Fe và hạ thấp thế khử của protein này ( từ 100mV- 400mV) tạo điều kiện cho protein Fe khử protein MoFe. ATP bị thủy phân khi diễn ra sự chuyển đổi electron này. Cuối cùng protein Mo-Fe khử chuyển các electron tới nitrogen nguyên tử. Electron của các chất khử (ferredoxin, ditionit) đi vào trung tâm chứa Fe của thành phần II ( protein Fe) và tiếp tục chuyển thành phần enzyme (protein Mo-Fe). Electron đã hoạt hóa sẽ đi theo mạch nguyên tử Fe để đến Mo, ở bên trong “hạt”, Mo sẽ bị khử, nhờ đó có khả năng phản úng nhanh với N2.Phân tử N2 đi qua khe có 0 kích thước khoảng 4-5 A, tức tương đương với chiều dài phân tử N2 vào bên trong enzyme và được hoạt hóa ở đây. Kết quả của quá trình nitrogenase hoạt hóa và hấp thụ hóa học nitơ sẽ làm đứt hai 5 dây nối trong số dây nối cực phân tử N2 năng lượng tiêu phí là 7,8.10 j/mol. Dây nối thứ basex bị cắt đứt khi tiếp xúc với hydro đã được hoạt hóa nhờ các enzyme dihydrogenase và hệ thống hydrogenase. Sau đó NH3 hoặc sản phẩm khử sinh ra sẽ liên kết axit để tạo thành axit amin. Con đường oxi hóa: N2 → N2O → (HNO)2 → NH4OH Qua hai hướng đó người ta thu được kết quả sau: Nếu nồng độ nitơ nhiều sẽ ức chế quá trình tạo nito phân tử. Hiệu suất cố định nitơ phân tử của những vi sinh vật kỵ khí thường cao hơn vi sinh vật hiếu khí.tìm thấy hợp chất loại khử khi nuôi các vi sinh vật cố định nitơ phân tử. Qua đó cho ta thấy con đường khử có nhiều khả năng hơn. 7
  9. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3 Sơ đồ chuyển điện tử trong quá trình khử và oxi hóa N 1.2. Vi khuẩn Azotobacter 1.2.1. Phân loại Theo Fribram (1938) phân loại khoa học của Azotobacter được ghi nhận như sau: Giới: Vi khuẩn Ngành : Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Azotobacteraceae Chi : Azotobacter Azotobacter là vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất được nhà vi sinh vật Hà Lan Beijerinckphân lập và nuôi cấy thuần khiết năm 1901. Theo Becking (1974), Azotobacter spp có 4 loài đặc trưng sau A.chroococcum Beijerinckii A.vinelandii A.agilis 8
  10. Đồ án tốt nghiệp Theo FAO (1982) Azotobacter sppcó các loài phổ biến sau : A.chroococcum A.beijerinekii A.vinellandii A.insignis A.agilis A.macrocytogenes A.paspali 1.2.2. Đặc điểm hình thái Azotobacter spp là vi khuẩn hiếu khí nhưng có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí, Gram âm không sinh bào tử. Vi khuẩn Azotobacter khi nuôi cấy trong các môi trường nhân tạo thường biểu hiện đặc tính đa hình. Hình dạng tế bào và chu kì biến đổi của chúng phụ thuộc vào tuổi của ống giống và điều kiện phát triển. Khi còn non tế bào có dạng que đầu tròn đứng riêng lẻ hay xếp thành từng đôi chồng chất, chất tế bào nhuộm màu đồng đều, sinh sản bằng cách phân cắt có khả năng di động nhờ tiên mao. Kích thước: 2,0-7,0 × 10-25 µm. Khi già tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thước thu nhỏ lại biến thành dạng hình cầu. Khi già, tế bào thường được bao bọc lớp vỏ dày và tạo thàng nang xác. Khi môi trường sống không thuận lợi như thay đổi nồng độ các chất dinh dưỡng hoặc bổ sung một số chất hữu cơ như ethanol, butanol-n hoặc β- hydroxybutyrate. Khi gặp điều kiện thuận lợi, nang xác sẽ nứt ra và tạo thành các tế bào mới. Azotobacter spp ít hình thành nang trong môi trường lỏng Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của Azotobacter có dạng nhày, đàn hồi, khá lồi, có khi ở dạng nhăn nheo. Khi già, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng hoặc màu nâu đen. Màu sắc khuẩn lạc là một trong những tiêu chuẩn để phân loại các loài Azotobacter. Trong đất, Azotobacter spp thường phổ biến các loài sau: Azotobacter chrococcum (đồng danh: Az.acidum, Az.araxii, Az.nigricans, Az.galophilum, Az.unicapsulare, Az.woodswnii): Kích thước tế bào 2,0 x 3,1µm, có 9
  11. Đồ án tốt nghiệp khả năng tạo nang xác, có khả năng di động được, có tiêm mao. Khuẩn lạc khi già có màu nâu đen, sắc tố không khuếch tán vào môi trường, có khả năng đồng hóa mannit, ramnose, tinh bột. Azotobacter beijerinskii : Kích thước tế bào 2,4 x 5,0µm, có khả năng tạo nang xác, không có tiêm mao, không di động được. Khi già có màu vàng hoặc màu nâu sáng. Sắc tố không khuếch tán vào môi trường, có khả năng đồng hóa mannit, ramnose, không đồng hóa tinh bột nhưng đồng hóa được benzoat natri. Azotobacter vinelandii (đồng danh: Az.smyrnii, Az.hilgardii, Az.vitreum, Az.fluorescens): Kích thước 1,5 x 3,4µm, có khả năng tạo nang xác, có tiên mao, có khả năng di động. Sinh sắc tố màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường, có khả năng đồng hóa mannit, ramnose, benzoat natri. Azotobacter agilis( đồng danh Az.agile- Azotobacter agile) : tế bào có kích thước 2,8-3,3 µm, không tạo nang xác, có tiên mao có khả năng di động được. Khi già khuẩn lạc có màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường, không có khả năng đồng hóa benzoate natri, mannit, ramnose. 1.2.3. Sự phân bố Azotobacter spp trong tự nhiên Azotobacter spp chủ yếu phân bố ở trong đất và bao gồm 6 loài phổ biến nhưng phân bố giữa các loài trong tự nhiên rất khác nhau chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Phổ biến nhất là Az. Chroococum-đặc trưng trên đất đồng cỏ, một số loài phân bố trong nước ao hồ đặc trưng có Az. Agilis và Az. Vinelandii còn Az. paspali có thể được tìm thấy chỉ trong vùng rễ của cỏ. Ở trong đất, số lượng Azotobacter spp thường là 102- 103/ gam đất. (FAO,2007) Số lượng Azotobacter spp phân bố trong các loại đất khác nhau cũng có sự khác nhau (Islam M. Z., Sharif D. I. and Hossain M. A, 2008). Azotobacter spp thường có ở đất trung tính hoặc kiềm, ở đất có pH <6,0 ít xuất hiện Azotobacter. Đồng thời Azotobacter spp cũng rất mẫn cảm với pH, chúng có thể phát triển được ở pH 4,5-9,0 nhưng thích hợp nhất đối với Azotobacter là 7,2-8,2. Môi trường acid rất bất lợi đối với sự phát triển và các hoạt động sống của Azotobacter và ảnh 10
  12. Đồ án tốt nghiệp hưởng xấu đến quá trình cố định nitơ của Azotobacter. Vì vậy sự phân bố của Azotobacter spp cũng phụ thuộc vào pH. Năm 1961, 148 mẫu đất được kiểm tra bởi Becking cho thấy tất cả các mẫu đất có pH >7,5 đều có Azotobacter spp và trong khoảng pH 7-7,4; 6,5-6,9; 6,0-6,4 đều xuất hiện Azotobacter spp với tỷ lệ 89%, 57%, 32%. pH thấp giới hạn sự phát triển của Azotobacter spp. Jensen (1965) cho thấy Azotobacter spp được tìm thấy ở PH >6,0. Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Ngọc Quyên, Vũ Minh Đức, Ngô Tự Thành (2003), đã phân lập được 18 chủng Azotobacter từ 50 mẫu đất trồng , phần lớn ở các mẫu có pH 5,15- 7,75. Các chủng thu nhận từ đất khô tồn tại tốt trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo. Các chủng phân lập từ đất ẩm dễ bị chết sau một thời gian dài bảo quản trong ống nghiệm và dễ bị nhầm lẫn với Azomonas.(một loại vi khuẩn cố định nitơ giống Azotobacter spp nhưng không hình thành bào nang) Phần lớn các loài Azotobacter chỉ phát triển được ở pH lớn hơn 6, vì vậy hầu như không gặp chúng ở đất chua. Đối với đất chua, đặc trưng là loài Az. Indicum có thể phát triển trong môi trường với pH 3. Azotobacter cần độ ẩm cao hơn so với nhiều vi khuẩn khác nên cũng ít gặp chúng ở các vùng đất khô hạn[8]. Islam M. Z., Sharif D. I. and Hossain M. A.(2008) đã tiến hành phân lập Azotobacter spp ở 7 loại đất khác nhau bao gồm đất trồng lúa, đất bỏ hoang, đồng cỏ, đất rừng, đất mùn ở sông, đất trồng cây họ đậu, đất không trồng cây họ đậu cho thấy số lượng Azotobacter spp ở các loại đất này là khác nhau. Ngoài ra trong nghiên cứu này cũng cho thấy số lượng Azotobacter spp cũng phụ thuộc vào pH và độ ẩm của đất ở những loại đất có độ ẩm cao không thích hợp cho sự phát triển của Azotobacter spp. 11
  13. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1 Sự khác nhau của loại đất phân lập về pH, độ ẩm và số lượng Azotobacter spp Số lượng Azotobacter Số thứ tự Loại đất phân lập pH Độ ẩm (%) spp CFU (.105) 1 Đất trồng cây họ đậu 4,5 21,65 11 Đất không trồng cây 2 4,2 30,89 4 họ đậu 3 Đất trồng lúa 4,4 81,15 3 4 Đồng cỏ 4,5 18,76 9 5 Đất rừng 4,3 44,92 7 6 Đất bỏ hoang 4,7 17,09 7 7 Đất mùn ở song 5,6 87,31 0 Nguồn (Islam M. Z., Sharif D. I. and Hossain M. A, 2008) 1.2.4. Hiệu quả sử dụng chế phẩm phân bón chứa Azotobacter Azotobacter spp có tác dụng tăng cường nguồn thức ăn N cho cây trồng, trung bình khi tiêu thụ 1g các chất sinh năng lượng Azotobacter có khả năng đồng hóa được khoảng 10-15g N phân tử. Bón rơm rạ hay phân xanh vào ruộng là cung cấp nguồn năng lượng cho Azotobacter và hoạt động của Azotobacter sẽ làm giàu N cho đất. Các biện pháp kỹ thuật như bón vôi để trung hòa đất, bón lân tưới nước làm tươi xốp đất, phơi đất đều làm tăng cường rõ rệt sự phát triển và cố định N của Azotobacter trong đất. Malik et al., (1994) đã sử dụng các vi khuẩn Azotobacter, Azospirilium, Acetobacter, Bacillus và Pseudomonas để giúp cây lúa nước phát triển tốt và gia tăng năng suất so với đối chứng và sự tổng hợp IAA của những vi khuẩn này giúp rễ lúa phát triển nhiều hơn để hấp thu nhiều nước và dưỡng chất hơn. Ngoài được sử dụng làm phân bón hữu cơ vi sinh thì mới đây có nghiên cứu của Markus Ribbe, một nhà nghiên cứu của Đại học California tại Mỹ (2010), cho thấy Azotobacter vinelandii có khả năng sinh ra một loại enzyme vanadium nitrogenase. Enzyme này có thể tự động tạo ra những chuỗi phân tử carbon ngắn 12
  14. Đồ án tốt nghiệp gồm hai hoặc ba nguyên tử. Vì thế ông khẳng định các nhà khoa học có thể tác động vào vanadium nitrogenase để enzyme này tạo ra dầu mỏ. Và có thế sử dụng vi khuẩn này để chế tạo ra nhiên liệu dành cho động cơ. Ở Việt Nam, việc sản xuất và sử dụng chế phẩm Azotobacterin chỉ đặt ra trong những điều kiện thâm canh có khả năng dồi dào về phân bón, cần bón vôi và bón phân lân để làm tăng số lượng Azotobacter trong đất. Phần lớn các nghiên cứu chỉ dừng lại ở mức độ khảo sát chưa được áp dụng rộng rãi trong nông nghiệp. Sau nhiều năm nghiên cứu, thử nghiệm và áp dụng trong sản xuất rau màu ở nhiều địa phương cho kết quả tốt, Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch cho biết phân bón có chứa Azotobacter spp khi bón làm giảm từ 30 đến 50% lượng đạm urê, làm cho đất tơi xốp. Qua các mô hình thử nghiệm và thực tế sản xuất ở nhiều địa phương cho thấy phân có tác dụng làm tăng năng suất lúa, ngô và các loại rau màu, cây ăn quả từ 18 đến 35%. Loại phân vi sinh này có khả năng phòng chống một số bệnh cho cây trồng như bệnh héo xanh khoai tây và các loại rau xanh; bệnh khô vằn trên ngô, lúa; giảm các loại sâu hại như sâu cuốn lá, sâu đục thân trên lúa và sâu tơ, sâu xanh trên các loại rau xanh [10]. Sản xuất ở quy mô công nghiệp hoặc thủ công nghiệp những chế phẩm Azotobacter và gọi là Azotobacterin. Đó là những dịch nuôi cấy Azotobacter được hấp thụ vào than bùn hoặc các loại đất giàu chất hữu cơ đã trung hoà và bổ sung thêm một ít phospho, kali 1.3. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về phân lập, tuyển chọn, nhân giống và nhân sinh khối vi khuẩn Azotobacter 1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Islam M. Z., Sharif D. I. and Hossain M. A.(2008) đã phân lập các chủng Azotobacter spp từ các mẫu đất khác nhau. Trong đó mẫu đất trồng cây họ đậu mật độ tế bào (CFU) Azotobacter spp xuất hiện nhiều nhất 11.105/g đất và đất trồng lúa xuất hiện ít Azotobacter spp nhất 3.105/g đất. Ridvan Kizilkaya (2008) đã đánh giá khả năng cố định nitơ của Azotobacter spp trong môi trường nuôi cấy Ashby và trong các môi trường đất khác như đất mùn, đất khô hạn, đất sét trong đó khả năng cố định của Azotobacter spp trên môi 13
  15. Đồ án tốt nghiệp trường Ashby trong 3 ngày nuôi cấy là từ 3,50- 29,35microgam N/ml trung bình là 10.24 cao hơn các môi trường đất khác. Đánh giá hiệu quả của việc nhiễm chế phẩm Azotobacter spp cho đất và hạt giống, cây con đã được chứng minh trên các thí nghiệm đồng ruộng qua các nghiên cứu như: Puneet (1998) cho thấy việc nhiễm Azotobacter sp kích thích nẩy mầm của hạt, kích thích ra rễ và sinh trưởng, năng suất lúa mì, ngô tăng 10-15% so với đối chứng [29]. Các kết quả nghiên cứu của Nhật Bản, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn Độ cho thấy sử dụng chế phẩm Azotobacter có thể cung cấp cho cây trồng từ 30-60 kg N/ha/năm và tổng lượng N do vi sinh vật tổng hợp trên hành tinh có thể đạt đến 240 triệu tấn/năm. Vi khuẩn cố định N tự do Azotobacter còn có khả năng tổng hợp B1, giberellin, cytokinin kích thích tăng trưởng cây trồng [30]. 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Một số đề tài công trình nghiên cứu trong nước có liên quan đến đề tài : Đỗ Thu Hà (2008), đã phân lập được 8 chủng Azotobacter có khả năng cố định đạm và 2 chủng có khả năng sinh IAA từ 30 mẫu đất trồng lúa, rau và bỏ hoang ở thôn Bình Kỳ- Hòa Qúy-Ngũ Hành Sơn-TP.Đà Nẵng. Trong đó tuyển chọn 2 chủng có hoạt tính mạnh nhất có thể ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh [3] Nguyễn Thu Hà, Vũ Minh Đức, Nguyễn Ngọc Quyên, Ngô Tự Thành (2003), đã phân lập được 18 chủng Azotobacter từ 50 mẫu đất trồng. Trong đó tuyển chọn được 3 chủng Azotobacter spp có hoạt tính ARA và tổng hợp IAA, kích thích sự nảy mầm của hạt ngô lai DK.888 và ngô tẻ P.11[4]. Nguyễn Thị Luyện (2011), đã phân lập được 10 chủng Azotobacter spp từ 30 mẫu đất trồng bắp, đậu xanh và lúa tại huyện Long Khánh - Đồng Nai. Trong đó tuyển chọn được 4 chủng Azotobacter spp có hoạt tính có định Nito mạnh và 2 chủng có khả năng kích thích nảy mầm tốt [8]. 14
  16. Đồ án tốt nghiệp Châu Ngọc Anh (2012), đã phân lập được 16 chủng Azotobacter spp từ 36 mẫu đất trồng bắp, lúa và cây ăn quả tại huyện Trảng Bom – Đồng Nai, huyện Tam Nông – Đồng Tháp và huyện Bình Minh – Vĩnh Long. Trong đó tuyển chọn được 2 chủng Azotobacter spp có hoạt tính cố định Nitơ mạnh và có khả năng sinh IAA kích thích nảy mầm tốt [2]. Phạm Bích Hiên và cộng sự ( 2003) đã nghiên cứu 10 chủng Azotobacter của Việt Nam và nhận thấy rằng ngoài khả năng cố định N chúng còn có khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA. Nhiệt độ thích hợp của các chủng này là 25-300C, pH thích nghi rộng từ 5,5- 8,0 [5]. Phạm Ngọc Lan (1999) đã phân lập được 37 chủng Azotobacter trên đất gò đồi vùng Thừa Thiên - Huế. Nhóm nghiên cứu cũng tuyển chọn được hai chủng có khả năng kháng kháng sinh, tồn tại được ở pH kiềm ( pH = 8). Kết quả thử nghiệm gây nhiễm cây giống keo tai tượng trong vườn ươm đã làm tăng tỷ lệ sống, sinh khối, chiều cao cây và hàm lượng N trong lá cũng cao hơn so với đối chứng [11]. Thái Sơn Nam (2010) đã khái quát quy trình sản xuất các vi sinh vật có khả năng cố định đạm trong tự nhiên như vi khuẩn cộng sinh Rhizobium, vi khuẩn Azotobacter, vi khuẩn Azospirillum [13] 15
  17. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau: - Phân lập và mô tả đặc điểm sinh học một số chủng Azotobacter spp. - Tuyển chọn các chủng Azotobacter spp có khả năng cố định đạm mạnh - Đánh giá khả năng kích thích của các chủng vi khuẩn Azotobacter spp lên sự nẩy mầm của hạt đậu đen - Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng Azotobacter spp được tuyển chọn. 2.2. Vật liệu và địa điểm nghiên cứu 2.2.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu * Vật liệu: mẫu đất lấy từ đất trồng bắp và đậu xanh và mẫu Azotobacter nhập nội *Hoá chất: Cồn 960, cồn 700. Crystal violet , Glucol, Fucshin, dầu xem kính. Thuốc thử Nessler. Thuốc thử Tashiro. H2SO4 đậm đặc . H2SO4 0,1N chuẩn. NaOH 0,1N chuẩn NaOH 40ất pha môi trường dinh dưỡng Agar . Xúc tác ( K2SO4: CuSO4 tỉ lệ 3:1). Môi trường nuôi cấy Ashby (g/l): Manitol 20g K2HPO4 0,2g MgSO4.7H2O 0,2g K2SO4 0,2g CaCO3 5g 16
  18. Đồ án tốt nghiệp NaCl 0,2g Agar 20g Nước cất 1000ml Môi trường Burk (g/l) K 2HPO4 0,8g KH2PHO4 0,2g MgSO4.7H2O 0,2g NaCl 0,2g CaSO4 0,1g Hỗn hợp Fe- Mo 1ml Sucrose 20g H3BO3 100mcg ZnSO4 .7H2 O 100mcg MnSO4.4H2O 10mcg CuSO4.5H 2O 3mcg KI 1mcg Nước cất 1000ml Agar 20g Hỗn hợp Fe- Mo FeCl3.6H2O 1,45g NaMoO4.2H 2O 0,253g Nước cất 100ml * Dụng cụ và thiết bị: Dụng cụ: Dao, bịch nilon 0,5kg, giấy dán, bút Ống nghiệm có nắp, ống nghiệm không nắp. Đĩa pertri Cốc 50ml, 100ml, 250ml, 1000ml Erlen 100ml, 250ml, 500ml,1000ml Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml 17
  19. Đồ án tốt nghiệp Pipetman 10µl-100 µl Đầu típ 100 µl Đũa thủy tinh Giấy lọc Que cấy trang, que cấy, que gắp Đèn cồn Bông thấm nước, bông không thấm nước Bao nilon hấp, dây thun, báo, bút lông dầu Thiết bị Tủ cấy vi sinh (Brlad France) Tủ ủ (Memmert Germany) Tủ lạnh Toshiba Autolave (Huxky Đài Loan) Máy đo PH (Hach-Germany) Cân phân tích (Orbital Germany) Bếp từ (Billy – England) Máy nước cất (Branstead USA) Máy lắc Bếp đun Bình đốt mẫu Bộ chưng cất Kjeldahl 2.2.2. Địa điểm nghiên cứu Địa điểm thí nghiệm: Đồ án được thực hiện tại hệ thống phòng thí nghiệm Khoa Môi Trường Và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. Hệ thống phòng thí nghiệm gồm: Phòng thí nghiệm vi sinh. Phòng thí nghiệm thực vật. Phòng thí nghiệm hóa sinh. 18
  20. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3. Thời gian nghiên cứu Đề tài thực hiện từ tháng 05/2012 tới tháng 07/2012. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phân lập các chủng Azotobacter spp ở các loại đất trồng (theo FAO, 2007) Sau khi mẫu đất đem về phòng thí nghiệm được tách riêng ra cho vào từng đĩa nhỏ có đánh số thứ tự, tên mẫu, quan sát và ghi nhận màu sắc của các mẫu đất. Sau đó đo pH các mẫu đất, ở từng loại đất trồng mỗi mẫu đất lấy 25g đất cho vào cốc thêm 50ml nước cất vào khuấy đều sau đó để lắng và dùng máy đó pH đo giá trị pH cho từng mẫu đất (theo Islam M. Z., Sharif D. I. and Hossain M. A. 2008). Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên sinh viên tiến hành gộp các mẫu đất có giá trị pH gần bằng nhau trong cùng một loại đất trồng. Tiếp đó cho các mẫu đất ra đĩa để hong khô trong điều kiện nhiệt độ phòng rồi nghiền mịn. Việc hong khô mẫu đất giúp cho việc phân lập chính xác hơn. Ở từng mẫu đất đất trồng, cân 1g đất cho vào erlen chứa 50ml môi trường Ashby lỏng đã hấp khử trùng ở 1210c, 1atm (không có agar), đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày trong điều kiện lắc liên tục. Sau đó tiến hành pha loãng bằng nước muối sinh lí 0,85%(hệ số pha loãng 10-6). Lấy 0,1ml dịch pha loãng ở lần pha loãng cuối, cấy trên môi trường phân lập là môi trường Ashby. Cấy bằng phương pháp trải đĩa trang cho đến khi khô mặt thạch hoàn toàn và đặt các đĩa cấy ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 đến 2 ngày. Mỗi mẫu cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa pertri. Từ đĩa cấy ban đầu tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc rời rạc có hình dạng, màu sắc khác nhau, sau đó cấy sang đĩa pertri khác chứa môi trường Ashby bằng phương pháp cấy ria để phân lập từng chủng vi khuẩn. Tiến hành phân lập cho đến khi các khuẩn lạc tạo ra có dạng đồng nhất, khi quan sát dưới kính hiển vi chỉ có một dạng vi khuẩn thì lấy các khuẩn lạc rời rạc đó để trữ trong ống thạch nghiêng chứa môi trường trên. Các chủng vi khuẩn thu được và trữ trong từng ống nghiệm tạm xem như một dòng, được trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 50c để bảo quản. 19
  21. Đồ án tốt nghiệp Sau đó theo dõi các chỉ tiêu sau: Tỷ lệ số mẫu đất có xuất hiện khuẩn lạc của Azotobacter spp Số chủng Azotobacter spp phân lập được. 2.3.2. Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng Azotobacter spp Sau khi phân lập thuần khiết các chủng ta tiến hành quan sát: Hình thái khuẩn lạc: quan sát hình thái khuẩn lạc riêng rẽ ngay sau khi mọc và sau khi già đi tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, độ lồi lõm, độ trong, diễn biến màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không , lúc non cho đến lúc già ) Phương pháp nhuộm Gram: ( Lê Thị Vu Lan, Phạm Minh Nhựt, 2008): Dùng que cấy tròn chấm một ít nước cất lên lame rồi dùng que cấy tròn chấm vào khuẩn lạc làm vết bôi, hơ lame trên ngọn lửa đèn cồn để cố định tiêu bản trên lame. Bước 1 –Nhuộm tím crysal violet để ổn định 1 phút, rửa bằng nướccất(dùng bình tia phun ở mép vết bôi đã nhuộm không phun trực tiếp vào giữa vết có thể làm trôi mẫu ), thấm khô bằng giấy thấm. Bước 2: Nhuộm bằng Glucol , ổn định sau 1 phút, tương tự rửa bằng nước cất. Bước 3: Dùng etanol 960 rửa tẩy màu 30 giây, dùng giấy thấm lau khô Bước 4: Nhuộm bổ sung fucshin 2-3 phút, rửa lại bằng nước cất, để khô Bước 5: Soi kính hiển vi ở X100. Quan sát dưới kính hiển vi ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của crytal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của fushin là mẫu Gram âm. Khả năng di động trên thạch mềm: chuẩn bị các ống thạch bán lỏng môi trường Ashby chứa 0,5% agar, dùng que cấy thẳng cấy xuyên qua thạch, đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 đến 4 ngày rồi quan sát xung quanh vết cấy. 20
  22. Đồ án tốt nghiệp 2.3.3. Phương pháp tuyển chọn các chủng Azotobacter spp có khả năng cố định đạm mạnh Sau khi phân lập chọn ra các chủng Azotobacter spp có khả năng cố định nitơ sinh viên tiến hành: + Định tính hàm lượng NH4 trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp so màu với thuốc thử Nessler [8] Chuẩn bị thuốc thử Nessler: cân 15g HgI2 và 10g KI cho vào 15ml H2O cho vào tủ hút khuấy tan cho 80ml dung dịch NaOH 50% sau đó thêm H2O đến 500ml khuấy đều đem lọc cặn. Bảo quản trong lọ tối. Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường Ashby đã hấp khử trùng (ở 1210c, 1atm) mỗi ống nghiệm chứa 10ml môi trường. Cấy các chủng Azotobacter.spp đã phân lập được vào các ống nghiệm, mẫu đối chứng không cấy vi khuẩn chỉ chứa môi trường Ashby. Và đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 5 ngày. Sau đó đem dịch nuôi cấy lọc bằng giấy lọc rồi cho thuốc thử Nessler (lượng thuốc thử bằng nhau ở các mẫu) vào dịch lọc. Quan sát sự thay đổi màu của dịch lọc và so màu với mẫu đối chứng. Mỗi mẫu lặp lại 2 lần. Định lượng N tổng trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp Kjeldahl: Chuẩn bị các erlen chứa 50ml môi trường Ashby đã hấp khử trùng( ở 1210c, 1atm), sau đó cấy các chủng Azotobacter spp đã phân lập được vào erlen, mẫu đối chứng là erlen không cấy vi khuẩn. Sau đó lắc liên tục trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng. + Sau khi lắc xong tiến hành định lượng hàm lượng NH4 bằng phương pháp Kjeldahl: dùng pipet hút 2ml dịch nuôi cấy cho vào bình Kjeldahl thêm 0,2g xúc tác ( K2SO4: CuSO4 tỉ lệ 3:1) lắc nhẹ, đậy kín trong 3 phút . Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh cho 5ml dung dịch H 2SO4 đậm đặc 98%. Giai đoạn này thực hiện trong tủ hote đặt bình hơi nghiêng trên bếp tránh trường hợp khi sô mạnh hóa chất bắn ra ngoài và không bị bay mất ammoniac. Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình còn chưa bị oxy hóa vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 21
  23. Đồ án tốt nghiệp 50ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức tới vạch. Sau đó cất đạm, chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tím hồng, tiếp tục cho vào bình cất 15ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ). Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0,1 N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng) đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn. Bật công tắc cất đạm. Sau khi cất 10- 12 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy quỳ thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy quỳ không đổi sang màu xanh là được. Sau đó đem chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0,1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0,1N sử dụng. Tính kết quả hàm lượng nitơ tổng được tính theo công thức (dựa theo Nguyễn Hoài Hương, 2008): N (mg) = (1,42 * (V1- V2)/a) Với: V1- số ml H2SO4 cho vào bình hứng V2- số ml NaOH 0,1 N đã chuẩn độ a- số ml nguyên liệu sử dụng 1,42 hệ số; cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42 mg N. 2.3.4. Phương pháp xác định khả năng tạo IAA của các chủng Azotobacter spp Đánh giá khả năng tạo IAA của các chủng Azotobacter dựa trên nồng độ IAA có trong dich chiết từ dịch nuôi cấy vi khuẩn. Nồng độ IAA có trong dịch chiết càng cao chứng tỏ khả năng tạo IAA của chủng vi khuẩn càng mạnh. Nồng độ IAA được xác định bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm [5] 22
  24. Đồ án tốt nghiệp * Phương pháp xác định phương trình đường chuẩn của mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA. - Chuẩn bị dung dịch đệm phosphat (200ml) A: KH2PO4 0,136g/100ml nước cất; B: K2HPO4 0,174g/100ml nước cất; Lấy 39ml A + 61ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, điều chỉnh pH 7. - Chuẩn bị thuốc thử Salkowski Lấy 553 ml H2SO4 (98%) cho vào nước cất đủ 1 lít, để nguội sau 12 giờ được dung dịch H2SO4 đậm đặc 10,8M. Cân 4,5g FeCl3 cho vào 1 lít H2SO4 10,8M đã pha ở trên để được thuốc thử Salkowski. - Chuẩn bị đường chuẩn IAA Cân 1,6 mg IAA tổng hợp hòa tan với 10 ml dung dịch đệm phosphat được nồng độ là 160mg/l. Sau đó tiến hành pha loãng ra các nồng độ 0, 5, 10, 16, 20, 40, 80 mg/l. Lấy 4 ml thuốc thử cho vào các ống nghiệm có nồng độ IAA khác nhau có thể tích 2 ml, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Để 10 phút trong tối ở nhiệt độ phòng để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó tiến hành đo OD ở bước sóng 530 nm. Từ kết quả trên, chúng tôi xác định được phương trình đường chuẩn của dung dịch IAA thông qua chỉ số OD530nm. Dựa vào phương trình đường chuẩn để xác định nồng độ IAA (mg/ml) do các vi khuẩn tạo ra có trong môi trường nuôi cấy. Bảng 2.1 Nồng độ IAA thành lập đồ thị đường chuẩn Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 6 Thể tích IAA 160 mg/ml 0 1,0 0,50 0,25 0,20 0,125 0,0625 Dung dich đệm (ml) 2,0 1,0 1,50 1,75 1,80 1,875 1,9375 Tổng thể tích (ml) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Nồng độ IAA (mg/ml ) 0 80 40 20 16 10 5 Thuốc thử Salkowski 4 4 4 4 4 4 4 (ml) 23
  25. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 2.1 Phương trình đường chuẩn về mối tương quan tuyến tính giữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA (mg/ml) Chỉ số OD530nm 1,8 y = 0,0207x + 0,0368 2 1,6 R = 0,995 1,4 1,2 1 0,8 OD 0,6 Linear (OD) 0,4 0,2 0 0 50 100 Nồng độ(mg/ml) Thực hiện nuôi cấy các chủng Azotobacter phân lập được trên môi trường Ashby. Chuẩn bị môi trường lỏng trong các bình tam giác, mỗi bình chứa 50ml dịch môi trường, hấp khử trùng, để nguội. Tiến hành cấy các chủng Azotobacter vào các bình tam giác chứa môi trường đã khử trùng. Nuôi ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút. Sau 5 ngày thu dịch nuôi cấy và li tâm 8000 vòng/phút, li tâm 15 phút, lấy dịch trong để đo lượng IAA được vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 2.3.5. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Azotobacter spp lên sự nảy mầm của hạt đậu đen [8] Chuẩn bị các erlen chứa 50ml môi trường Burk hấp khử trùng (ở 1210c,1atm), sau đó cấy các chủng Azotobacter vào erlen rồi lắc liên tục trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng. Sau 5 ngày tiến hành dùng giấy lọc lọc dịch nuôi cấy. Đậu đen tiến hành chọn những hạt khô, trơn bóng, đen đều các hạt đồng nhất, không bị sâu mọt, không bị vỡ, bị lép. Đem đậu rửa sạch và đem ngâm với nước cất trong vòng 1giờ. 24
  26. Đồ án tốt nghiệp Chuẩn bị các đĩa pertri sạch, dùng một miếng bông thấm nước lót bên dưới đĩa pertri cho 5ml dịch nuôi cấy thấm đều lên miếng bông thấm nước rồi trải đều 10 hạt đậu đen đã ngâm nước lên miếng bông thấm nước, sau đó đặt lên trên hạt một miếng bông thấm có cùng kích thước với miếng bông lót bên dưới đã thấm 3ml dịch nuôi cấy rồi đậy nắp pertri đem ủ ở nhiệt độ phòng. Mẫu đối chứng được làm tương tự nhưng không có dịch nuôi cấy vi sinh vật. Mỗi mẫu lặp lại 3 lần. Theo dõi tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu đen ở các đĩa pertri sau 8h, 16h, 24h ủ. 2.3.6. Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng Azotobacter spp được tuyển chọn 2.3.6.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azotobacter spp (Thực hành công nghệ lên men hướng môi trường và nông nghiệp – Ts. Nguyễn Hoài Hương) Các chủng Azotobacter spp được tuyển chọn được nhân giống trên môi trường có thành phần như sau Bảng 2.2 Thành phần môi trường nhân giống Thành phần Môi trường nhân giống (g/l) Nguồn C 1g sucrose KH2PO4 0.5 K2HPO4 0.5 MgSO4.7H2O 0.2 NaCl 0.1 Cao nấm men 10 pH 7.0 T0 nuôi cấy 300C Thời gian 36h Lắc 150 vòng/phút Sau thời gian nhân giống, cấy các chủng Azotobacter spp vào 4 loại môi trường MT1, MT2, MT3 và MT Ashby để khảo sát khả năng sinh khối. Sau 72h tiến hành 25
  27. Đồ án tốt nghiệp đo OD600 để xác định sinh khối tế bào [26]. Chọn môi trường thuận lợi nhất cho sinh trưởng của vi khuẩn Azotobacter để tiến hành những thí nghiệm tiếp theo. Bảng 2.3 Thành phần môi trường 1 Thành phần Môi trường nhân giống (g/l) Dịch chiết đậu xanh 5% KH2PO4 0.5 K2HPO4 0.5 MgSO4.7H2O 0.5 (NH4)2SO4 1 CaCO3 1 Glucose 5 Saccharose 5 Bảng 2.4 Thành phần môi trường 2 Thành phần Môi trường nhân giống (g/l) KH2PO4 0.5 MgSO4.7H2O 0.25 CaCO3 0.5 Cao nấm men 0.5 Glucose 10 Bảng 2.5 Thành phần môi trường 3 Thành phần môi trường (g/l) Saccharose Cao nấm men Dung dịch khoáng đa lượng Dung dịch khoáng vi lượng Nước cất Lắc 150 vòng/phút 26
  28. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.6 Thành phần môi trường Ashby Thành phần Môi trường nhân giống (g/l) Manitol 20g MgSO4.7H2O 0,2g CaCO3 5g K2SO4 0,2g NaCl 0,2g Nước cất 1000ml Lắc 150 vòng/phút 2.3.6.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azotobacter spp Tiến hành nuôi cấy các chủng Azotobacter spp trên môi trường thuận lợi nhất chọn ra từ thí nghiệm trên, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 150 vòng/phút. Sau 12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h và đo OD600nm để xác định sinh khối tế bào. 2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu thống kê Sử dụng phần mềm Statgraphics xử lý số liệu thô, tính giá trị trung bình và so sánh sự khác biệt của các nghiệm thức. Đồ thị tương quan và phương trình tương quan giữa chỉ số mật độ quang OD với sinh khối tế bào, nồng độ IAA được xử lý trên phần mềm EXCELL 2007 của Microsoft. Các biểu đồ khác cũng được xử lý trên phần mềm này. 27
  29. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn Azotobacter spp trong đất trồng Từ 10 mẫu đất trồng bắp, đậu xanh, sau khi đo pH và tiến hành gộp mẫu thì phân thành 06 mẫu lớn dựa vào giá trị pH đất của các mẫu (bảng 3.1) để tiến hành phân lập các chủng Azotobacter spp. Trong đó mẫu đất trồng bắp gộp lại thành 4 mẫu, đất trồng đậu xanh 2 mẫu và 1 chủng Azotobacter nhập nội từ Thái Lan. Bảng 3.1 Đặc điểm các mẫu đất trồng dùng phân lập vi khuẩn Azotobacter Chủng Số thứ Mẫu đất Khoảng pH Màu sắc mẫu đất Azotobacter tự spp phân lập 1 A1 – Chủng Aztobacter nhập nội từ Thái Lan 2 B1 6,11- 6,18 Màu xám đen A2 Màu nâu đỏ và xám A3, A4, A5 3 Đất trồng B2 6,88- 6,96 đen bắp 4 B3 7,24- 7,31 Màu nâu đỏ A6 5 B4 8,01 Màu nâu đỏ A7 6 Đất trồng X1 6,58- 6,2 Màu nâu đỏ đậu xanh 7 X2 6,99- 7,27 Màu nâu đỏ A8, A9 Theo số liệu ở bảng 3.1 cho thấy đất trồng bắp khá đa dạng về màu sắc bao gồm màu màu xám đen, nâu đỏ. Đất trồng đậu xanh chủ yếu là đất nâu đỏ. Kết quả phân lập từ 06 mẫu đất trồng bắp, đậu xanh có 5/6 mẫu đất trồng trên xuất hiện khuẩn lạc của Azotobacter spp. Trong đó mẫu đất trồng B4 không thấy xuất hiện khuẩn lạc của Azotobacter spp và các mẫu còn lại đều xuất hiện 1-3 dạng khuẩn lạc. Trong 2 loại đất trồng thì đất trồng bắp xuất hiện nhiều chủng Azotobacter spp (6 chủng) hơn so với, đất trồng đậu xanh (xuất hiện 3 chủng). Bảng 3.2 Đặc điểm khuẩn lạc của 8 chủng Azotobacter spp được phân lập và chủng Azotobacter nhập nội 28
  30. Đồ án tốt nghiệp Ngày Đặc điểm hình thái của khuẩn lạc xuất Kí hiện Màu sắc Mặt hiệu khuẩn Bề cắt Hình ảnh lạc sau Hình dạng mặt ngang chủng Còn Lúc khi cấy non già 1 Trong Nâu Tròn, Trơn, Lồi suốt đen đường bong kính>1mm, mép đều, ít nhầy A1 2 Trắng Nâu Tròn, mép Bóng Lồi sữa ở không đều, , gợn thấp tâm ít nhầy song A2 2 Trắng Nâu Không Trơn, Lồi đục đen tròn, mép bong gồ ghề, A3 nhầy và chảy lan 1 Trong Nâu Tròn, Trơn, Lồi suốt từ đường kính bong cao viền >1mm, A4 ngo nhầy, mép ài đều nhẵn vào 29
  31. Đồ án tốt nghiệp 1 Trắng Nâu Tròn, Trơn, Lồi sữa sậm đường bong kính> 1mm, mép đều, ít nhầy A5 2 Trắng Nâu Không Trơn, Lồi sữa đen tròn, mép bong thấp phẳng, nhầy, chảy lan A6 2 Trắng Nâu Không Bóng Lồi sữa từ tròn, có , gợn thấp viền tâm nhạt, song ngo nhầy ài A7 vào 30
  32. Đồ án tốt nghiệp 2 Trắng Nâu Không Bóng Lồi đục đen tròn, chảy , thấp lan , nhầy khôn A8 g bằng phẳn g 2 Trong Nâu Tròn, mép Trơn, Lồi suốt nhạt không đều, bong thấp nhầy, chảy lan A9 Trên 2 loại đất trồng theo dõi gồm: bắp, đậu xanh thì Azotobacter spp có mặt ở các mẫu đất có khoảng pH từ 6,49-8 riêng mẫu B4 có pH > 8,0 không xuất hiện Azotobacter. Kết quả cho thấy là phù hợp với các nghiên cứu về sự phân bố của vi khuẩn Azotobacter trong đất [23]. Năm 1961, 148 mẫu đất được kiểm tra bởi Becking cho thấy tất cả các mẫu đất có pH> 7,5 đều có Azotobacter spp và trong khoảng pH 7-7,4; 6,5-6,9; 6,0-6,4 đều xuất hiện Azotobacter spp với tỷ lệ 89%, 57%, 32%. pH thấp giới hạn sự phát triển của Azotobacter spp. Năm 1965, Jensen cho thấy Azotobacter spp được tìm thấy ở PH >6,0. Như vậy, có 8 chủng Azotobacter spp được phân lập từ 10 mẫu đất trồng (bắp, đậu xanh) lấy ở thị xã Long Khánh - Đồng Nai và thị xã Hồng Ngự - Đồng Tháp. Trong phạm vi thí nghiệm Azotobacter spp không có mặt ở đất có pH>8 và tất cả các có pH từ 6,49-7,31 đều xuất hiện Azotobacter spp. Ký hiệu của các chủng Azotobacter spp được trình bày ở bảng 3.1. 31
  33. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng Azotobacter spp Tiến hành quan sát đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn và làm tiêu bản tế bào để xem trên kính hiển vi. Các khuẩn lạc được quan sát bằng mắt thường và trên vật kính 4x và 10x. Tiêu bản tế bào nhuộm gram được quan sát ở vật kính 40x, 100x. Các khuẩn lạc sẽ được phân loại sơ bộ dựa vào hình thái của khuẩn lạc và hình thái tế bào của vi khuẩn. Bảng 3.3 Kết quả nhuộm gram của các chủng Azotobacter spp Chủng Khả năng di Nhuộm Gram Hình dạng tế bào Azotobacter spp động Hình cầu, xếp thành Không di A1 – Nhập nội Gram âm chùm động Hình oval, đứng rời Không di A2 Gram âm rạc động Hình cầu, đứng Không di A3 Gram âm thành từng cặp động Hình cầu, đứng rời Di động A4 Gram âm rạc hoặc từng cặp Hình que, đứng Không di A5 Gram âm thành chuỗi dài động Hình que ngắn, đầu Không di A6 Gram âm tròn động Hình oval to, đứng Di động A7 Gram âm cạnh nhau Hình cầu, đứng Không di A8 Gram âm thành cặp động Hình cầu, xếp thành Không di A9 Gram âm chuỗi dài động 32
  34. Đồ án tốt nghiệp A1 – Nhập nội A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 Hình 3.1 Kết quả nhuộm gram các chủng Azotobacter spp Az 2.2
  35. Đồ án tốt nghiệp A4 A7 Hình 3.2 Khả năng di động của chủng A4, A7 Từ bảng 3.1 và bảng 3.2 mô tả các đặc điểm về hình thái, màu sắc khuẩn lạc; bảng 3.3 mô tả đặc điểm nhuộm gram vi khuẩn, cho thấy các chủng phân lập được đều mang những đặc điểm phù hợp với những nghiên cứu trước đây về vi khuẩn Azotobacter spp Qua quan sát thấy 8 chủng Azotobacter spp phân lập vá 1 chủng nhập nội từ Thái Lan được có các đặc điểm sau: Khuẩn lạc khi còn non (sau khi mọc) ở tất cả các chủng đều nhầy, lồi, có màu trắng đục, trắng sữa hoặc trắng trong, kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Đỗ Thu Hà (2008), Nguyễn Thị Luyện (2011) và Châu Ngọc Anh (2012) [15], [8], [2]. Sau hơn 2 ngày mọc khuẩn lạc cho đến lúc già đi các chủng có sự thay đổi về màu sắc, hình dạng như sau: A1 – Nhập nội: Khuẩn lạc có hình tròn, trong suốt, bóng và nhầy. Sau 7 ngày, khuẩn lạc chuyển sang màu nâu, bề mặt hơi nhă nheo, ít bóng, lồi và hơi nhầy. Khi già hẳn, khuẩn lạc cóm àu nâu đen, ít nhầy. A2: Khuẩn lạc to, đường kính >1mm, hình dạng không đều, màu trắng sữa, bóng và nhầy. Sau 5 ngày, khuẩn lạc chuyển sang màu nâu nhạt không đều trên bề mặt. Khi già hẳn, khuẩn lạc có màu nâu đen và hơi nhầy. A3: Khuẩn lạc có hình dạng không đều, màu trắng đục, bề mặt hơi nhăn nheo, bóng, ít nhầy. Sau 5 ngày, Khuẩn lạc chuyển sang màu nâu ở xung quanh, bóng, lồi. Khi già hẳn khuẩn lạc có màu nâu đen, nhầy. 34
  36. Đồ án tốt nghiệp A4: Khuẩn lạc tròn đều, trong suốt, đường kính > 1mm, bóng nhẵn, lồi và ít nhầy. Sau 7 ngày, khuẩn lạc chuyển sang màunâu ở viền ngoài , ở giữa màu nhạt hơn xung quanh, ít lan. Khi già hẳn có màu nâu đen, bóng. A5: Khuẩn lạc có hình dạng không đều, đa số tròn, màu trắng sữa, lồi và ít nhầy. Sau 7 ngày, khuẩn lạc chuyển sang màu nâu sậm, nhầy và chảy lan. Khi già hẳn, khuẩn lạc có màu nâu đen. A6: Khuẩn lạc có hình dạng không đều, màu trắng sữa, hơi lồi và bóng, nhầy. Sau 5 ngày, khuẩn lạc chuyển sang màu nâu đen từ viền ngoài, bóng nhầy và chảy lan. Khi già hẳn có màu đen. A7: Khuẩn lạc có hình dạng không đều, đa số tròn, màu trắng sữa. Sau 5 ngày, khuẩn lạc chuỵển sang màu nâu nhạt không đều trên bề mặt. Khi già hẳn có màu nâu đen. A8: Khuẩn lạc có hình dạng không đều, màu trắng đục, bóng, nhầy và chảy lan. Sau 7 ngày khuẩn lạc chuyển sang màu nâu đen không đều, chảy lan và ít bóng. Khi già hẳn khuẩn lạc có màu nâu đen đậm. A9: Khuẩn lạc có hình dạng không đều, đa số tròn, trong suốt, bóng và hơi nhầy. Sau 5 ngày, khuẩn lạc trắng đục ở viền ngoài, giữa khuẩn lạc cóm àu nâu nhạt không đều. Khi già hẳn, khuẩn lạc có màu nâu. 3.3. Kết quả tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng cố định đạm mạnh 3.3.1. Kết quả định tính bằng thuốc thử Nessler Kết quả so màu với thuốc thử Nessler cho thấy, các chủng phân lập đều phản ứng với thuốc thử và có màu vàng, màu đặc trưng thuốc thử Nessler. Màu vàng có độ + đậm nhạt khác nhau tùy thuộc vào hàm lượng NH4 mà các chủng Azotobacter spp sinh ra trong dịch nuôi cấy. Trong 8 chủng phân lập vá 1 chủng nhập nội thì chủng A4 có màu vàng đậm nhất, A6 có vàng nhạt nhất (hình 3.3). Điều này cho thấy chủng A4 có khả năng cố định nitơ mạnh nhất và chủng A6 cố định nitơ yếu nhất. Chủng A4 và A5 có mức độ bắt màu đậm hơn tương đương hoặc hơn so với chủng nhập nội A1. Mức độ cố định nitơ của các chủng giảm dần theo mức độ giảm dần 35
  37. Đồ án tốt nghiệp màu sắc được trình bày như sau: A4, A5, A1 (Chủng đối chứng), A3, A8, A2, A9, A7, A6 Hình 3.3 Phản ứng màu với thuốc thử Nessler của các chủng Azotobacter spp 3.3.2. Kết quả định lượng N tổng bằng phương pháp Kjeldahl Kết quả định lượng N tổng số bằng phương pháp Kjeldahl của 8 chủng phân lập được và 1 chủng đối chứng A1 cho thấy trùng hợp với kết quả so màu với thuốc thử Nessler. Kết qủa trình bày ở bảng 3.4 cho thấy, chủng A4, A5 có khả năng cố định đạm mạnh hơn so với chủng đối chứng A1. Điều này cũng trùng với kết quả định tính bằng thuốc thự Nessler được trình bày ở trên. So với kết quả của Nguyễn Thị Luyện(2011) và Châu Ngọc Anh (2012), 2 chủng A4 và A5 phân lập được của đề tài có khả nâng cố định đạm mạnh hơn hẳn. Có thể sử dụng hai chủng này để sản xuất phân vi sinh cố định đạm. 36
  38. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. Hàm lượng N trong dịch nuôi cấy của các chủng Azotobacter spp Chủng Azotobacter Hàm lượng N Mức độ cố định Số thứ tự spp (mg N/ml) nitơ 1 A1 – Nhập nội 1,753 Mạnh 2 A2 Trung bình 0,518 3 A3 Trung bình 0,759 4 A4 2,08 Mạnh 5 A5 Mạnh 1,938 6 A6 0,234 Yếu 7 A7 0,355 Yếu 8 A8 0,568 Trung bình 9 A9 0,497 Yếu 3.4. Khả năng sinh IAA của các chủng Azotobacter spp phân lập được Ngoài khả năng cố định đạm, các nghiên cứu cho rằng Azotobacter còn có khả năng sinh tổng hợp IAA. Kết quả kiểm tra khả năng sinh tổng hợp IAA của các chủng Azotobacter phân lập được trình bày ở bảng 3.5 Bảng 3.5 Khả năng sinh tổng hợp IAA của các chủng Azotobacter spp(mg/ml). STT Chủng vi khuẩn Hàm lượng IAA ( mg/ml) 1 A1 (đối chứng) 14,66 ± 0,46 2 A2 2,16 ± 0,24 3 A3 0,46 ± 0,17 4 A4 26,69 ± 0,55 5 A5 25,61 ± 1,03 6 A6 0,55 ± 0,23 7 A7 0,67 ± 0,075 8 A8 7,98 ± 1,57 9 A9 0,34 ± 0,25 CV (%) 26% 37
  39. Đồ án tốt nghiệp Số liệu ở bảng 3.5 cho thấy, tất cả các chủng phân lập được đều có khả năng sinh IAA. Trong đó, hàm lượng IAA sinh ra của các chủng biến thiên từ 0,34mg/ml – 26,69mg/ml, 2 chủng A4, A5 mạnh hơn gần 2 lần so với chủng đối chứng. So sánh với kết quả của Châu Ngọc Anh (2012) khả năng sinh IAA của 2 chủng này cao hơn rất nhiều. Khả năng sinh IAA của các chủng trong kết quả của tác giả này chỉ được 0,22 – 18,49mg/ml. 3.5. Khả nâng kích thích sự nảy mầm của hạt của dịch nuôi cấy Azotobacter spp Bảng 3.6 Tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu đen ở các công thức Stt Mẫu Tỷ lệ nảy mầm (%) Sau 8h Sau 16h Sau 24h 1 ĐC 0,37 0,5 0,53 2 A1 0,5 0,73 0,9 3 A2 0,57 0,7 0,73 4 A3 0,5 0,67 0,7 5 A4 0,67 0,83 0,97 6 A5 0,53 0,87 0,93 7 A6 0,53 0,6 0,67 8 A7 0,57 0,73 0,77 9 A8 0,47 0,63 0,73 10 A9 0,47 0,5 0,63 Khả nâng kích thích nảy mầm hạt của các giống được đánh giá bằng thử nghiệm với hạt đậu đen ủ trên đĩa Petri. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6 cho thấy, tất cả các dịch nuôi cấy của Azotobacter spp đều có khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt 38
  40. Đồ án tốt nghiệp đậu đen. Trong đó, dịch nuôi cấy của chủng A4, A5 cho tỷ lệ nảy mầm hạt đậu đen cao nhất tương ứng với 96,7%; 93,3% cao hơn so với mẫu đối chứng A1 và cao hơn hẳn so với mẫu đối chứng không chứa Azotobacter. Tương tự như vậy, khối lượng hạt đậu đen nảy mầm sau 24h ở các công thức ngâm bằng dịch chiết vi khuẩn cũng cao hơn so với nước cất. So sánh với kết quả thí nghiệm của Nguyễn Thị Luyện (2011), tốc độ nảy mầm của hạt đậu sau 8h thì tỷ lệ nảy mầm lớn hơn 60% cao hơn so với mẫu đối chứng 53%, sau 16h các mẫu đều có tỷ lệ nảy mầm cao hơn 80% so với đối chứng chỉ có 73%, sau 24h thì tỷ lệ nảy mầm ở các mẫu đều lớn hơn 90% so với mẫu đối chứng chỉ có 75%. Vậy, kết quả tỷ lệ nảy mầm của thí nghiệm thực hiện kém hơn so với thí nghiệm của Nguyễn Thị Luyện [8] đã nghiên cứu. Nguyên nhân có thể do ảnh hưởng của hạt giống sử dụng thí nghiệm không đồng đều và chất lượng hạt không tốt. Đồ thị 3.1 Tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu đen sau 8h, 16h, 24h 120 100 80 8H 60 16H 24H 40 20 0 ĐC A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 Mặc khác, qua quan sát cho thấy đường kính và kích thước của mầm ở các mẫu có vi khuẩn Azotobacter spp lớn hơn so với mẫu đối chứng (bảng 3.7). 39
  41. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7 Khối lượng hạt đậu đen nảy mầm sau 24h Công thức Khối lượng 10 hạt mầm (g) ĐC 3,22 ± 0,16 A1 – Nhập nội 5,04 ± 0,12 A2 4,07 ± 0,47 A3 3,56 ± 0,13 A4 5,26 ± 0,34 A5 4,94 ± 0,21 A6 4,64 ± 0,26 A7 3,96 ± 0,27 A8 4,27 ± 0,15 A9 3,46 ± 0,18 Trong số này, khối lượng mầm hạt ngâm trong dịch chiết chủng A4 và A5 cao hoặc tương đương với chủng đối chứng A1. Như vậy, các chủng Azotobacter phân lập được đều có khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt. Trong đó, hai chủng A4 và A5 có tác động mạnh hơn so với chủng đối chứng nhập nội. Tóm lại, đề tài đã phân lặp tuyển chọn được 8 chủng Azotobacter trong đó có 2 chủng A4 và A5 có khả năng cố định đạm cao, khả năng sinh tổng hợp IAA mạnh và khả năng kích thích sự này mầm của hạt mạnh hơn so với chủng đối chứng (nhập nội). Vì vậy, có thể ứng dụng các chủng này để sản xuất phân bón và xử lý hạt giống trước khi gieo.Trong đó, đặc biệt quan tâm đến chủng A4. 3.6. Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng Azotobacter spp được tuyển chọn Như đã trình bày ở các phần trên, 2 chủng Azotobacter A4 và A5 có khả năng cố định đạm mạnh, sinh IAA cao. Vì vậy, cần thiết phải nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng này. Kết quả nghiên cứu được trình bày như sau: 40
  42. Đồ án tốt nghiệp 3.6.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azotobacter spp Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn Azotobacter spp đã chọn lọc trên bốn môi trường nuôi cấy khác nhau là MT1, MT2, MT3 và MT Ashby để thăm dò ảnh hưởng của môi trường đến sự sinh trưởng của vi khuẩn. Kết quả cho bởi bảng 3.8 Bảng 3.8 Mật độ vi khuẩn sau 72h nuôi cấy các chủng Azotobacter spp (*1011 tế bào/ml) trên các loại môi trường Môi trường Mật độ tế bào ((*1011 tế bào/ml) ở các môi trường nuôi cấy MT 1 MT 2 MT 3 MT Ashby Chủng vi khuẩn A1 – Nhập nội 3.21 0.85 8.475 1.703 A4 6.52 4.12 11.15 4.89 A5 1.315 1.11 2.317 1.215 CV (%) 39,14% 10 Mật độ TB ban đầu 1.8*10 /1 lít MT Xét về môi trường nuôi cấy thì môi trường 3 cho khả nâng tăng sinh khối tốt hơn cho cả 3 chủng A1 – Nhập nội, A4 và A5. Xét về khả nâng tăng sinh khối của 3 chủng thì chủng A4 có khả nâng tăng sinh khối cao hơn cả đối với chủng A5 và chủng đối chứng. Mặt khác, số liệu ở bàng 3.8 cho thấy trong quá trình nhân sinh khối thì mức độ tăng trưởng tế bào của chủng A5 khá yếu, không phù hợp cho sản xuất sinh khối. Như vật, cho thấy các môi trường có nguồn đạm rất thích hợp cho sự tăng sinh của các vi khuẩn. Đặc biệt môi trường có chứa saccharose và cao nấm men, sự tăng sinh khối của các chủng vi khuẩn cao hơn nhiều so với môi trường Ashby (không có đạm). Cụ thể sinh khối tăng gần 3 lần so với môi trường Ashby, tăng gần 2 lần so 41
  43. Đồ án tốt nghiệp với môi trường 1 và tăng cao hơn hẳn so với môi trường 2. Kết quả còn được thấy rõ qua biểu đồ 3.2 Nhìn vào biểu đồ 3.2. ta thấy tất cả chủng vi khuẩn tuyển chọn đều có khả năng sinh trưởng tốt trên cả ba môi trường. Tuy nhiên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn trên môi trường 3 là cao nhất. Điều này được giải thích do môi trường 3 là môi trường có chứa sẵn nguồn N, nguồn C dễ phân giải cùng các yếu tố vi lượng, vitamin cần thiết cho sự sinh trưởng của vi khuẩn. Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự gia tăng sinh khối của các chủng Azotobacter spp 12 10 8 6 A1-Nhập nội 4 A4 A5 2 0 Môi trường 1 Môi trường 2 Môi trường 3 Môi trường Ashby 3.6.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azotobacter spp Kết quả ở bảng 3.8, môi trường 3 là môi trường tốt để nhân sinh khối 2 chủng A4, A5. Vì vậy, trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng môi trường 3 để xác định thời gian thu sinh khối tốt nhất của các chủng.
  44. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azotobacter spp (*1011 tế bào/ml) Thời gian Mật độ tế bào (*1011 tế bào/ml) ở các thời điểm nuôi cấy 12h 24 h 36h 48 h 60h 72h Chủng vi khuẩn A1 – Nhập nội 5.4 6.15 8.25 7.85 8.4 8.475 A4 9.525 14.08 17.45 19.42 14.135 11.55 A5 1.187 1.225 1.22 1.265 2.4 2.317 CV (%) 97,71% Mật độ TB ban 1.8*1010/1 lít MT đầu Như vậy, trong 24 giờ nuôi cấy đầu tiên, sinh khối các chủng vi khuẩn tăng trưởng chậm. Sau 36 giờ nuôi cấy sinh khối bắt đầu tăng lên rõ rệt. Trong số 2 chủng nuôi cấy, chủng A4 có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn hẳn so với chủng đối chứng. Chủng A5 một lần nữa cũng cho thấy tốc độ tăng sinh khối rất yếu. Hai chủng A1 và A5 lần lượt đạt cực đại tại 72h và 60h. Kết quả nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu của Elazar Fallik’ and Yaacov Okon (1996) về vi khuẩn Azotobacter spp [22] 43
  45. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azotobacter spp 0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 A5 0.10 A4 0.08 A1 0.06 0.04 0.02 0.00 12H 24H 36H 48H 60H 72H Qua đường cong tăng trưởng tb ở biểu đồ 3.3 cho thấy trong quá trình nhân sinh khối tế bào, đối với chủng A4 nên tiến hành thu nhận tế bào ở giai đoạn 48h sau khi nuôi cấy.
  46. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Đề tài đã phân lập được 8 chủng Azotobacter spp từ các mẫu đất trồng bắp, đậu xanh và xác định được đặc điểm, hình thái của các chủng Azotobacter phân lập. Đã xác định được khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter. Trong đó có 2 chủng A4, A5 có khả năng có định Nitơ cao tương ứng là 1,753mg/ml; 2,08mg/ml; 1,938mg/ml và cao hơn hẳn so với chủng nhập nội Tất cả các chủng Azotobacter spp phân lập được đều có khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt. Các chủng A4, A5 có khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt tốt nhất. Chủng A4, A5 vừa có khả năng cố định nitơ cao vừa có khả năng kích thích tốt sự nảy mầm của hạt có thể sử dụng chủng này đển làm vật liệu sản xuất phân bón vi sinh. Các chủng vi khuẩn Azotobacter spp A4, A5 có khả năng sinh trưởng phát triển tốt trong môi trường 3 đã chọn; pH ~ 7; nhiệt độ 280C; tốc độ lắc 150 vòng/phút. Trong đó, chủng A4 có khả năng sinh trưởng rất mạnh. Thời gian đạt sinh khối lớn nhất của chủng A4 trên môi trường 3 là 48h sau khi nuôi cấy. 4.2. Kiến nghị 1. Tiếp tục nghiên cứu thu thập vi khuẩn cố định đạm Azotobacter trên những hệ đất trồng khác. 2. Đề nghị tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của các chủng vi khuẩn Azotobacter có khả năng cố định đạm và các chủng vi sinh vật có ích khác đến sinh trưởng, phát triến và năng suất của các giống cây trồng trước khi tiến hành sản xuất phân vi sinh. 3. Khảo sát thêm các môi trường lên men nhân sinh khối từ nguyên liệu phế thải nông nghiệp, công nghiệp như bã mía, bã bia, 45
  47. Đồ án tốt nghiệp 4. Khảo sát thêm các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men nhân sinh khối như tốc độ lắc, nhiệt độ lên men, thiết bị lên men, 5. Quy trình sản xuất phân bón vi sinh Azotobacterin đề xuất Giống Azotobacter Hoạt hóa Nhân giống Cấy giống (5%) Lên men chìm (28C, pH 7, lắc 150vòng/phút) Xử lý sinh khối Ch ất mang vô trùng Sản phẩm 46
  48. Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình Giai đoạn chuẩn bị (Upstream processing): Chuẩn bị giống: Tiến hành hoạt hóa Azotobacter từ giống gốc trên môi trường Ashby. Môi trường nuôi cấy được phân vào các đĩa Petri và hấp khử trùng. Cấy truyền từ giống gốc sang các đĩa Petri vừa chuẩn bị, sau đó đem lắc ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày. Tiếp theo ta tiến hành nhân giống Azotobacter trước khi lên men nhân sinh khối bằng cách đem lắc trong các bình tam giác trong vòng 24 giờ. Môi trường nhân giống gồm các thành phần: Nguồn C 10g sucrose KH2PO4 0.5 K2HPO4 0.5 MgSO4.7H2O 0.2 NaCl 0.1 Cao nấm men 10 pH 7.0 T0 nuôi cấy 300C Thời gian 36h Lắc 150 vòng/phút Chuẩn bị môi trường lên men: thành phần môi trường lên men nhân sinh khối Azotobacter gồm: Thành phần môi trường (g/l) Saccharose Cao nấm men Dung dịch khoáng đa lượng Dung dịch khoáng vi lượng (pha dung dịch mẹ nồng độ x 100 sau đó sử dụng 10ml dung dịch mẹ cho 1 lít môi trường) Nước cất Lắc 150 vòng/phút 47
  49. Đồ án tốt nghiệp Tiệt trùng môi trường: môi trường được chứa trong một thiết bị lên men, và được dẫn một cách liên tục qua một thiết bị tiệt trùng bằng nhiệt ẩm để có thể hạn chế tối đa các mầm bệnh và sự cạnh tranh của các vi sinh vật tạp. Xử lý nguồn nguyên liệu dung làm chất mang: có nhiều nguồn nguyên liệu được sử dụng làm chất mang như: than bùn, phân trùng quế, đất sét, vermicul, rác thải sinh hoạt, Trong quy trình này nguồn nguyên liệu được chọn sử dụng là than bùn và phân trùng quế: Nguồn nguyên liệu đầu vào do có kích thước không đồng đều nên phải tiến hành nghiền và râynhỏ về kích thước 0,25 mm. Điểu chỉnh về pH ~ 7 bằng CaCO3, độ ẩm về khoảng 20% để có thể đạt được hiệu quả cao trong quá trình khử trùng. Xử lý bằng nhiệt ẩm ở nhiệt độ trung bình khoảng 121C với thời gian 90 phút. Tiến hành bước trao đổi nhiệt để hạ nhiệt độ của nguồn nguyên liệu xuống 40C. Cuối cùng tiến hành đem phối trộn với sinh khối Azotobacter sau lên men. Giai đoạn lên men (fermentor): Môi trường lên men sau khi được tiệt trùng được dẫn đến thiết bị lên men chính, tiến hành cấy giống với tỷ lệ 5% thể tích lên men. Các thông số kỹ thuật cơ bản của giai đoạn này: Nhiệt độ: kiểm soát ở nhiệt độ tối ưu là 28C. pH: kiểm soát ở pH 7 bằng dung dịch NaOH và H2SO4. Độ thông khí: lắc 150vòng/ phút. Thời gian lên men: 48 - 60giờ. Giai đoạn sau lên men (downsteam processing): Sinh khối sau khi lên men được phối trộn với chất mang đã được xử lý ở trên tạo sản phẩm phân vi sinh vật trên nền chất mang vô trùng. Trong đó, sinh khối Azotobacter thu được phối trộn với chất mang theo tỷ lệ thể tích thích hợp ở điều kiện vô trùng, sau đó chuyển đến nơi thoáng mát và giữ ở nhiệt độ 28C. Sau thời gian sinh trưởng 1 tuần, sản phẩm có thể đi sử dụng. 48
  50. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: 1. Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, Chương trình hợp tác nông nghiệp và phát triển nông thôn (CARD) (2009), Báo cáo chế phẩm nốt sần chất lượng cao, pp 6 – 25. 2. Châu Ngọc Anh (2012). Đồ án Thiết lập bộ mẫu Azotobacter ở các vùng sinh thái ứng dụng trong sản xuất phân bón vi sinh, ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM, Tp Hồ Chí Minh. 3. Đỗ Thu Hà et al., (2008). Phân lập và tuyển chọn một số chủng VK Azotobacter có hoạt tính Nitrogenaza và sinh tổng hợp IAA từ đất thôn Bình Kỳ- Hòa Quý- Ngũ Hành Sơn- TP Đà Nẵng, Tuyển tập báo cáo khoa học, Đại học Đà Nẵng. 4. Hồ Thị Kim Anh, Nguyễn Ngọc Dũng, Phạm Thị Hoài Anh (1999). Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố định nitơ trong rễ lúa lên sinh trưởng của mầm lúa CR203, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật. 5. Lê Hà Phương (2009). Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Phân lập một số dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) từ đất trồng rau và thử nghiệm trên rau muống ở Tiền Giang, ĐH Cần Thơ, TP. Cần Thơ. 6. Lê Thị Vu Lan, Phạm Minh Nhựt (2008). Bài giảng thực tập vi sinh đại cương, ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. 7. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001). Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục. 8. Nguyễn Thị Luyện (2011). Đồ án Phân lập và tuyển chọn các chủng Azotobacter trong đất phục vụ sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh, ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM, Tp Hồ Chí Minh 9. Nguyễn Thu Hà, Vũ Minh Đức, Nguyễn Ngọc Quyên, Ngô Tự Thành (2003). Đặc tinh sinh học của một số chủng Azotobacter, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, số 4. 49
  51. Đồ án tốt nghiệp 10. Phạm Bích Hiên, Phạm Văn Toản, Báo cáo hội nghị CNSH toàn quốc (2003). Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng Azotobacter đa hoạt tính sinh học sử dụng cho sản xuất phân bón vi sinh chức năng. 11. Phạm Thị Ngọc Lan, Võ Thị Mai Hương (1999). Góp phần nghiên cứu vi khuẩn cố định Nitơ sồng tự do trong đất hoa màu ở Thừa Thiên Huế, Đại học Khoa học, Đại học Huế. 12. P.T.S Nguyễn Thị Phương Chi, P.T.S Nguyễn Ngọc Dung, Báo cáo tổng kết đề tài chương trình công nghệ sinh học giai đoạn 1991 - 1994 (1993). Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng phân vi sinh vật cố định đạm nhằm năng cao năng suất lúa và cây trồng trên cạn, pp 12- 36. 13. Thái Văn Nam (2011). Đồ án Sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm, ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM, Tp Hồ Chí Minh. 14. Trần LinhPhước (2003). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, NXB Gíao Dục, TP.Hồ Chí Minh. 15. Ts. Trần Nguyên Thảo, Báo cáo tổng kết đề tài Bộ công thương Viện nghiên cứu có dầu và cây có dầu (2011). Nghiên cứu ứng dụng Polymer để sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc, pp 24- 32. 16. Ts. Nguyễn Hoài Hương (2009). Bài giảng thực hành lên men môi trường, ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM 17. TS. Nguyễn Hoài Hương, Bùi Văn Thế Vinh (2008). Bài giảng thực hành hóa sinh, ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM 18. Võ Văn Minh (2008). Giải pháp của nền nông nghiệp sinh thái đô thị, Trường ĐH Sư Phạm – ĐH Đà Nẵng. 50
  52. Đồ án tốt nghiệp Tài liệu tiếng Anh: 19. Ahmad Farah, Iqbal Ahmad, Mohd Saghir Khan (2005). Indole Acetic Acid production by the indigenous isolates of Azotobacter and Fluorescent Pseudomonas in the presence and absence of Tryptophan, Turk J Biol. 29, pp 29 - 34. 20. C.Pairintra and Pakdee. Population dynamics of Effective Microorganism under saline soil condition in Thailand, Soil Science Department Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand, pp 1-6 21. Cristiana Felici, Lorenzo Vettori, Enrico Giraldi, Laura Maria Costantina Forino, Annita Toffanin, Anna Maria Tagliasacchi, Marco Nuti (2008). Single and co-inoculation of Bacillus subtilis and Azospirillum brasilense on Lycopersicon esculentum: Effectson plant growth and rhizosphere microbialcommunity, Applied Soil Ecology, Vol 40, pp 260 – 270. 22. Elazar Fallik’ and Yaacov Okon (1996). Inoculants of Azospirillum brasilense: biomass production, survival and growth promotion of Setaria italica and Zea mays, Soil Biol Biochem, Vol 28, pp 123-126. 23.Islam M.Z., Sharif D.I and Hossain M.A.(2008). A comparative study of Azotobacter spp from different soil sample, J.Soil, Nature 2(3), pp 16 - 19 24. FAO. Application of Nitrogen-Fixing Systems in Soil Improvement and Management, Food and Agriculture Organization of the United Nations. FAO Soils Bulletin 49, Rome (1982). 25. FAO (2007). Guide to laboratory establishment for plant nutrient analysis, 7, pp 134 - 136. 26. Fabricio Cassa´na, Diego Perriga, Vero´nica Sgroya, Oscar Masciarellia, Claudio Pennab, Virginia Lunaa (2009). Azospirillum brasilense Az39 and Bradyrhizobium japonicum E109, inoculated singly or in combination, promote seed germination and early seedling growth in corn (Zea mays L.) and soybean (Glycine max L.), European Journal of Soil Biology, Vol 45, pp 28 – 35. 27. L. Aquilantia,*, F. Favillib, F. Clementi (2003). Comparison of different strategies for isolation and preliminary identification of Azotobacter from soil samples, Soil Biology & Biochemistry 36 (2004), pp 1475–1483 51
  53. Đồ án tốt nghiệp 28. Puneet K.; Sohal R.P (1998). Effect of innoculation of Azotobacter and PSN on fertilizer economy, plant growth and yield of winter maize, Nitrogen fixation with non legumes, Kluwer Academic Publisher, pp 271-273. 29. Shabave V. P., Smolin V. Y., Strekozova V. I, ( 1991). The effects of Azotobacter brasilense sp7 and Azotobacter chroococcum on nitrogen blance in soil under cropping with oats, Biology and Fertility of Soils, pp 290 - 292. 30. Van Lierop, W(1981).Conversion of organic soil pH values measured in water, 0.01 M CaCl2 or 1N KCl, Canadian Journal of Soil Science 6, pp 577–579. 52
  54. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A: CÁC PHẦN XỬ LÝ SỐ LIỆU 1. Phân tích kết quả ảnh hưởng của dịch nuôi cấy các chủng Azotobacter spp sau 8h, 16h, 24h lên tỷ lệ nảy mầm hạt đậu đen. ANALYSIS of VARIANCE for TY LE NAY MAM - Type III Sums of Squares Source Sum of Df Mean F- P- Squares Square Ratio Value MAIN EFFECTS A:CHUNG 1,10017 9 0,122241 24,30 0,0000 B:GIO 1,21006 2 0,605031 120,29 0,0000 INTERACTIONS AB 0,242455 18 0,0134697 2,68 0,0012 RESIDUAL 0,452675 90 0,0050297 2 TOTAL 3,00536 119 (CORRECTED) Multiple Range Tests for TY LE NAY MAM by CHUNG Method: 95,0 percent LSD CHUN Count LS LS Homogeneous G Mean Sigma Groups DC 12 0,46666 0,02047 X 7 3 A9 12 0,53333 0,02047 X 3 3 A6 12 0,6 0,02047 X 3 A8 12 0,61083 0,02047 XX 3 3 A5 12 0,6225 0,02047 XX 3 A2 12 0,66666 0,02047 XX 7 3 A7 12 0,68083 0,02047 X 3 3 A1 12 0,71083 0,02047 X 3 3 A4 12 0,7775 0,02047 X 3 53
  55. Đồ án tốt nghiệp A3 12 0,78666 0,02047 X 7 3 Multiple Range Tests for TY LE NAY MAM by GIO Method: 95,0 percent LSD GIO Count LS LS Homogeneous Mean Sigma Groups 8h 40 0,51275 0,01121 X 35 16h 40 0,6685 0,01121 X 35 24h 40 0,7555 0,01121 X 35 2. Phân tích kết quả ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối của 3 chủng Azotobacter spp sau 72h ANOVA table for SINH KHOI by MOI TRUONG Analysis of Variance Source Sun of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between 28,2648 3 9,42161 1,14 0,3914 groups 66,3773 8 8,29716 Within groups Total (Corr.) 94,6421 11 3. Phân tích kết quả ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của 3 chủng Azotobacter spp trong môi trường 3 ANOVA Table for SINH KHOI by THOI GIAN Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between 29.0914 5 5,81828 0,15 0,9771 groups Within groups 474,552 12 39,546 Total (Corr.) 503,643 17 54
  56. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH 1. Hình dạng khuẩn lạc của các chủng Azotobacter spp sau 2 ngày nuôi cấy A1- Nhập nội A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 55
  57. Đồ án tốt nghiệp 2. Khuẩn lạc của các chủng Azotobacter spp sau 7 ngày nuôi cấy A1 – Nhập nội A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 56
  58. Đồ án tốt nghiệp 3. Kết quả định tính với thuốc thử Nessler 4. Tỷ lệ nảy mầm hạt đậu đen DC A1 A2 A3 A4 A5 57
  59. Đồ án tốt nghiệp A6 A7 A8 A9 58