›

Đồ án Phân lập và tuyển chọn Lactobacillus sp. từ thực vật ủ chua có tiềm năng sản xuất probiotic

pdf 62 trang thiennha21 13/04/2022 6000
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập và tuyển chọn Lactobacillus sp. từ thực vật ủ chua có tiềm năng sản xuất probiotic", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_phan_lap_va_tuyen_chon_lactobacillus_sp_tu_thuc_vat_u.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập và tuyển chọn Lactobacillus sp. từ thực vật ủ chua có tiềm năng sản xuất probiotic

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN LACTOBACILLUS sp. TỪ THỰC VẬT Ủ CHUA CÓ TIỀM NĂNG SẢN XUẤT PROBIOTIC Ngành: Công nghệ SH-TP-MT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hƣớng dẫn : TS. Hoàng Quốc Khánh Sinh viên thực hiện : Trần Quang Huy MSSV: 1311101070 Lớp: 13DSH05 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án này đều trung thực và bắt nguồn từ thực tiễn nghiên cứu. Các tài liệu tham khảo đều có nguồn gốc xác thực. Ngƣời thực hiện Trần Quang Huy
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Hoàng Quốc Khánh, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn,chia sẻ những khó khăn và chỉnh sửa đồ án cho em trong thời gian em thực hiện đồ án tại viện sinh học nhiệt đới TP Hồ Chí Minh. Xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời đã động viên và giúp em có thêm động lực để hoàn thành đồ án này. Xin cảm ơn thầy Ngô Đức Duy, đã nhiệt tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình định danh bằng sinh học phân tử. Xin cảm ơn các anh, chị và các đồng nghiệp tại viện sinh học nhiệt đới đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đồ án. Xin cảm ơn viện sinh học nhiệt đới TP Hồ Chí Minh, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em thực hiện các thí nghiệm để hoàn thành đồ án này. Xin cảm ơn trƣờng ĐH Công nghệ TP Hồ Chí Minh nói chung và các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm và Môi Trƣờng nói riêng đã tận tình dạy dỗ, cung cấp các kiến thức vững vàng cho em trong bốn năm học tập tại trƣờng. Cuối cùng xin cảm ơn ba mẹ đã sinh ra con và cho con điều kiện để học tập để trở thành ngƣời nhƣ hôm nay. Xin chân thành cảm ơn! Ngƣời thực hiện Trần Quang Huy
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Phiếu giao đề tài ĐATN. Lời cam đoan. Lời cảm ơn. Mục lục. Danh mục các từ viết tắt. Danh mục các bảng. Danh mục biểu đồ, đồ thị, sơ đồ, hình ảnh. MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Tổng quan về rau quả lên men 3 1.2 Tổng quan về probiotic 4 1.3 Lịch sử nghiên cứu về probiotic 7 1.4 Các vi sinh vật probiotic thƣờng gặp 9 1.4.1 Chi Lactibacillus 9 1.4.2 Chi Bifidobacterium 10 1.4.3 Chi Sacharomyces 10 1.4.4 Chi Bacillus 11 1.5 Hƣớng dẫn lựa chọn các chủng probiotic 13 1.5.1 Chi, loài và chủng probiotic 14 1.5.2 Các thử nghiệm invitro để sàng lọc chủng có tiềm năng probiotic 14 I
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.5.3 Nguồn phân lập probiotic 15 1.5.4 Probiotic an toàn 15 1.6 Vi khuẩn lactic 17 1.6.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic 17 1.6.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, phân loại 17 1.6.3 Chi Lactobacillus 18 1.6.4 Quá trình lên men lactic 22 CHƢƠNG 2.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Vật liệu 24 2.1.1 Nguyên liệu 24 2.1.2 Hóa chất 24 2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 24 2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy 25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phƣơng pháp phân lập và tuyển chọn 27 2.2.2 Phƣơng pháp quan sát hình thái khuẩn lạc 27 2.2.3 Phƣơng pháp xác định khả năng sinh acid lactic 27 2.2.4 Phƣơng pháp nhuộm Gram 27 2.2.5 Phƣơng pháp khảo sát khả năng di động 28 2.2.6 Phƣơng pháp xác định kiểu hô hấp 28 2.2.7 Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính catalase 29 2.2.8 Phƣơng pháp xác định hoạt tính protease 29 II
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.2.9 Phƣơng pháp xác định hoạt tính amylase 30 2.2.10 Phƣơng pháp xác định khả năng kháng khuẩn 30 2.2.11 Phƣơng pháp định danh bằng sinh học phân tử 31 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 33 3.1 Phân lập LAB từ nguồn thực vật ủ chua 33 3.2 Đặc điểm sinh học của 2 chủng LAB đƣợc tuyển chọn 36 3.2.1 Đặc điểm hình thái của 2 chủng CP1 và MC3. 36 3.2.2 Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 2 chủng CP1 và MC3. 37 3.3 Phổ kháng khuẩn của hai chủng lactic nghiên cứu 40 3.4 Định danh chủng Lactobacillus CP1và Lactobacillus MC3 bằng sinh học phân tử 42 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1 Kết luận 45 4.2 Kiến nghị 45 Tài liệu tham khảo Phụ lục III
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VK Vi khuẩn DC Đối chứng G- Gram âm G+ Gram dƣơng KS Kháng sinh LAB Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic) MT Môi trƣờng MRS De Man - Rogosa – Sharpe ST Sinh trƣởng VSV Vi sinh vật IV
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các vi sinh vật có tiềm năng probiotic 12 Bảng 1.3 Phân loại Lactobacillus dựa vào sản phẩm 19 Bảng 3.1. Kết quả hình thái khuẩn lạc của 11 chủng đƣợc phân lập 32 Bảng 3.2. Kết quả xác định hình thái tế bào 34 Bảng 3.3. Tổng hợp các đặc điểm sinh lý sinh hóa của hai chủng nghiên cứu 38-39 Bảng 3.4. Kết quả thử phổ kháng khuẩn của hai chủng Lactobacillus CP1 và Lactobacillus MC3 41 V
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Kim Chi và một số loại rau củ lên men truyền thống 4 Hình 1.2. Hƣớng dẫn lựa chọn chủng probiotic của FAO & WHO 16 Hình 1.3 Quá trình lên men lactic 22 Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của một số mẫu sau khi làm thuần 33 Hình 3.2. Định tính aicid lactic bằng thuốc thử Uphemen 35 Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) của chủng CP1 nhuộm Gram trên kính hiển vi x100 36 Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) của chủng MC3 nhuộm Gram trên kính hiển vi x100 36 Hình 3.5 Cây phát sinh loài của hai chủng Lactobacillus CP1 và Lactobacillus MC3 và các loài có liên quan 43 . VI
  10. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Ngày nay, cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội, khi chất lƣợng cuộc sống không ngừng đƣợc nâng cao, vấn đề chăm sóc sức khỏe con ngƣời ngày càng đƣợc chú trọng. Do vậy, việc tạo ra các chế phẩm sinh học nhằm cải thiện và tăng cƣờng sức khỏe con ngƣời đƣợc tạo ra ngày càng nhiều. Một trong những chế phẩm sinh học đó chính là probiotic, chúng đƣợc tạo ra từ việc ứng dụng vi sinh vật có lợi bổ sung vào hệ tiêu hóa của con ngƣời. Việc sử dụng vi sinh vật probiotic thực tế đã mang lại nhiều ảnh hƣởng tích cực đối với sức khỏe con ngƣời, thông qua các đặc tính probiotic vốn có của chúng. Điển hình là điều trị các chứng bệnh rối loạn đƣờng tiêu hóa, khắc phục một số hạn chế do việc điều trị kháng sinh dài ngày, giúp đồng hóa lactose trong sữa uống đối với các bệnh nhân không có khả năng dung nạp lactose trong sữa. Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng ảnh hƣởng đến hoạt tính biến dƣỡng nhƣ đồng hóa cholesterol, tạo ra các vitamin và giải phóng các enzyme có lợi giúp cho việc tiêu hóa thức ăn dễ dàng hơn, hấp thu các chất dinh dƣỡng cần thiết, khử các chất có khả năng gây ung thƣ và các hợp chất độc hại, kích thích điều hòa hệ miễn dịch, tăng khả năng đề kháng cho cơ thể vật chủ, Những chủng vi sinh vật probiotic thƣờng đƣợc nghiên cứu và ứng dụng chủ yếu là vi khuẩn lactic (LAB), nhờ chúng có các đặc tính ƣu việt phù hợp cho việc sử dụng tạo chế phẩm probiotic cho ngƣời cũng nhƣ vật nuôi. Những đặc tính đó là: khả năng sống sót và phát triển tốt trong điều kiện bất lợi ở đƣờng tiêu hóa của ngƣời nhƣ acid mật, pH thấp, kháng sinh, Đồng thời, chúng còn có khả năng sản sinh nhiều hoạt chất kháng khuẩn nhƣ acid lactic, bacteriocin, H2O2, diacetyl, tạo môi trƣờng bất lợi, từ đó ức chế vi sinh vật gây bệnh và thiết lập sự cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột. Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng sản sinh nhiều enzyme thúc đẩy quá trình tiêu hóa hấp thu các chất của cơ thể vật chủ. Trang 1
  11. Đồ án tốt nghiệp Xuất phát từ lí do trên nên ngƣời thực hiện đã chọn đề tài “ Phân lập và tuyển chọn Lactobacillus. sp từ nguồn thực vật ủ chua, tiềm năng sản xuất probiotic”. 2. Mục tiêu của đề tài: Phân lập và khảo sát các đặc tính probiotic của các chủng vi khuẩn phân lập từ các nguồn thực vật ủ chua. 3. Nhiệm vụ của đề tài: Phân lập đƣợc ít nhất 01 chủng Lactobacillus Tìm hiểu các đặc tính sinh lý, sinh hoá của chủng phân lập đƣợc. Khảo sát phổ kháng khuẩn của chủng Lactobacillus phân lập đƣợc với các VSV gây bệnh đƣờng ruột ở ngƣời Phân loại chủng nghiên cứu đến loài bằng sinh học phân tử. 4.Đối tƣợng nghiên cứu: các chủng Lactobacillus.sp đƣợc phân lập từ rau , củ lên men trong khu vực thành phố Hồ Chí Minh. Trang 2
  12. Đồ án tốt nghiệp 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về rau quả lên men Lên men thực phẩm là một trong những công nghệ bảo quản thực phẩm đƣợc con ngƣời phát minh ra từ rất sớm, những ngƣời ở vùng ven biển của Châu Á đƣợc cho là đã lên men rau quả trƣớc khi phát triển nền nông nghiệp cây trồng. Lên men sữa ở Trung Đông xuất hiện sau khi thuần hoa vật nuôi. Bia ở Ai Cập và rƣợu gạo ở Đông Bắc Á đƣợc cho là xuất hiện vào 4000 năm trƣớc công nguyên. Ngƣời ta đã cho rằng dƣa chuột là nguyên liệu đầu tiên đƣợc lên men, sau đó là các sản phẩm khác nhƣ kim chi, bắp cải và cho đến ngày nay đã và đang có rất nhiều các sản phẩm lên men với sự đa dạng về chủng loại. Thực phẩm lên men đƣợc phân loại dựa vào sản phẩm của quá trình lên men chẳng hạn nhƣ cồn ( rƣợu, bia), acid hữu cơ bao gồm acid lactic và acid axetic (trong rau củ lên men), cacbondioxide (CO2) ( trong bánh mì), các acid amin và các peptide từ protein. Trong các sản phẩm lên men thì rau, củ, quả lên men nhƣ kim chi, cà pháo, bắp cải là những sản phẩm có từ lâu đời và mang đặc trƣng bản sắc dân tộc của từng vùng miền và từng quốc gia. Quá trình lên men có thể giúp bảo quản rau quả lâu hơn 1 năm mà không cần sử dụng bất kì một phƣơng pháp bảo quản nào khác. Trong rau, củ, quả hoặc nƣớc ép rau củ có chƣa rất nhiều dinh dƣỡng giúp cho các vi sinh vật bao gồm cả các loại gây hƣ hỏng nhƣ Pseudomonas, Erwinia, Enterobacter, nấm men và nấm mốc có thể phát triển đƣợc. Các vi sinh vật gây hƣ hỏng khi phát triển tới số lƣợng từ 104-106 cfu/g. Tuy nhiên có thể ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật gây hƣ hỏng này bằng phƣơng pháp lên men. Rau quả sau khi lên men sẽ có vị chua là do các acid hữu cơ đƣợc tiết ra bởi các vi khuẩn lên men đƣờng trong rau quả, đặc biệt là các vi khuẩn thuộc nhóm lactic. Trang 3
  13. Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn lactic tồn tại trong rau quả hoặc nƣớc ép trái cây với số lƣợng rất thấp từ 102-103 cfu/g. Trong quá trình lên men, các acid hữu cơ sẽ tạo vị chua và làm giảm pH của môi trƣờng, từ đó ức chế hoạt động của các vi sinh vật gây hƣ hỏng, riêng vi khuẩn lactic không chịu ảnh hƣởng của việc giảm pH này là do nhóm vi khuẩn này có khả năng sống sót trong điều kiện acid cao hơn so với các loại vi sinh vật khác, nên sự phát triển của chúng sẽ chiếm ƣu thế hơn. Ngoài hƣơng vị đặc trƣng, các sản phẩm rau quả lên men còn đƣợc chứng minh là có tác động tốt đến sức khỏe nhƣ giúp tiêu hóa tốt và phòng bệnh đƣờng ruột. Đặc biệt vi khuẩn lactic còn tạo nên hệ vi khuẩn có ích cho đƣờng tiêu hóa. Rau quả muối chua tuy không phải là thuốc thuần túy nhƣng làm thức ăn rất tốt cho ngƣời bị bênh béo phì, tiểu đƣờng vì nó ít glucid và ít sinh năng lƣợng. Chính vì những tác động có lợi ,gần gũi với con ngƣời và có hệ vi sinh vật đa dạng nên rau, củ, quả lên men là một trong những nguồn nguyên liệu đƣợc các nhà khoa học quan tâm nhằm phân lập các dòng vi sinh vật có lợi đối với sức khỏe của con ngƣời và vật nuôi, từ đó sản xuất các chế phẩm probiotic. Hình 1.1 Kim Chi và một số loại rau củ lên men truyền thống 1.2 Tổng quan về probiotic Ruột ngƣời đƣợc định cƣ bởi một loạt các loài vi khuẩn, mang tầm quan trọng trong chức năng trao đổi chất cũng nhƣ chức năng miễn dịch, tất cả đều dẫn đến những ảnh hƣởng rõ rệt đến tình trạng dinh dƣỡng và sức khoẻ của vật chủ [19]. Trang 4
  14. Đồ án tốt nghiệp Các probiotics đƣợc định nghĩa là "các vi sinh vật sống, khi tiêu hóa với một số lƣợng nhất định có lợi cho sức khoẻ ngoài dinh dƣỡng cơ bản”[6],[ 32]. Ngoài ra, probiotic còn đƣợc biết đến là vi sinh vật sống tự nhiên có ít hoặc không gây bệnh, nhƣng có chức năng quan trọng đối với sức khỏe, tình trạng chung của vật chủ và đƣợc chú trọng để sử dụng làm thuốc [10],[ 25]. Probiotics ban đầu đƣợc sử dụng để tác động đến sức khoẻ con ngƣời thông qua sự thay đổi hệ vi sinh đƣờng ruột. Hiện nay, các probiotic và những ảnh hƣởng của chúng đối với sức khoẻ con ngƣời đã đƣợc chứng minh bằng cách kết hợp chúng vào các loại thực phẩm truyền thống nhƣ chế phẩm nuôi vi sinh đơn hoặc hỗn hợp, tức là sản xuất các thực phẩm chức năng / dinh dƣỡng hoặc chế phẩm dƣợc để có đƣợc nhiều lợi ích về sức khoẻ [25]. Tác động của probiotic đến sức khoẻ con ngƣời đƣợc khẳng định và xác định rõ trong việc phòng ngừa và điều trị các bệnh khác nhau nhƣ nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa cấp tính hoặc mãn tính (tiêu chảy, không tiêu hóa lactose, bệnh viêm ruột [7], các triệu chứng dị ứng [16],[ 30], ung thƣ [18] và AIDS (hội chứng suy giảm miễn dịch)[8], hô hấp và nhiễm trùng đƣờng tiết niệu. Chế độ ăn uống phù hợp, bao gồm các loại thực phẩm dinh dƣỡng / thực phẩm chức năng / thực phẩm bổ sung với probiotic, prebiotic và synbioitcs, với những lợi ích về dinh dƣỡng và điều trị là kết quả của một hệ thống tiêu hóa (Gastro Integinal) hoạt động tốt, tác động đến sinh lý của con ngƣời, từ đó tác động đến sức khỏe. Trong những thập kỷ qua, ngành công nghiệp thực phẩm đã đƣợc cách mạng hoá hƣớng tới sản xuất thực phẩm chức năng do nhận thức ngày càng cao của ngƣời tiêu dùng về vai trò tích cực của thực phẩm và sức khoẻ [26]. Một số lợi ích có đƣợc là do sự phát triển và hoạt động của vi khuẩn trong quá trình sản xuất thức ăn và một số do sự phát triển và hoạt động của một số loài vi khuẩn lactic trong đƣờng ruột sau khi ăn các thực phẩm có chứa chúng (Ali, 2010).(Trích tài liệu [32]). Để hệ thống miễn dịch và đƣờng tiêu hóa của con ngƣời hoạt động tốt, đòi hỏi phải có sự hiện diện đa dạng và số lƣợng lớn của các vi sinh vật. Hệ vi sinh cộng Trang 5
  15. Đồ án tốt nghiệp sinh cƣ trú và duy trì sự cân bằng trong hệ thống đƣờng tiêu hóa con ngƣời, bất kì sự thay đổi nào về số lƣợng hoặc thành phần của hệ vi sinh điều ảnh hƣởng trực tiếp đến sức khỏe của vật chủ. Ví dụ khi sử dụng kháng sinh làm giảm số lƣợng của một số vi khuẩn, các mầm bệnh có cơ hội để phát triển và gây nhiễm trùng. Phƣơng pháp thay thế hệ vi sinh đƣờng ruột bằng các vi khuẩn có lợi đã khai sinh ra lĩnh vực khoa học chuyên nghiên cứu về probiotic. Probiotics đƣợc định nghĩa là 'Các vi sinh vật sống mà khi đƣợc bổ sung với số lƣợng thích hợp sẽ đem lại lợi ích cho sức khoẻ của vật chủ” [13]. Probiotic đang dần dần đóng vai trò quan trọng trong chức năng miễn dịch, hô hấp và giảm các bệnh truyền nhiễm ở con ngƣời. Vi khuẩn lactic acid (LAB) là các vi sinh vật thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ probiotic và có những lợi ích nhất định trong ứng dụng công nghiệp và y tế [32]. Thuật ngữ "probiotic" có nguồn gốc từ từ Hy Lạp "probios" có nghĩa là "cho sự sống" (trái ngƣợc với "antibiotic", có nghĩa là "chống lại sự sống") [22]. Trong nhiều thế kỷ, LAB đã đƣợc sử dụng để bảo quản thực phẩm cho ngƣời tiêu dùng. LAB là một nhóm lớn các vi sinh vật thuộc Gram âm, hiếu khí hoặc vi hiếu khí, không sinh bào tử, lên men và sinh acid, thƣờng có trong ruột của ngƣời và các động vật khác, rau sống, thịt và các sản phẩm từ thịt, ngũ cốc [9]. LAB và Bifidobacteria đƣợc sử dụng nhƣ là probiotic. Nhƣng một số loại nấm men và bacilli cũng đƣợc sử dụng trong sản xuất probiotic. Ngày nay có rất nhiều sản phẩm probiotic đang có mặt trên thị trƣờng nhƣ kem probiotic, probiotic uống,v.v. Để đƣợc sử dụng làm probiotic, các vi sinh vật phải tồn tại đƣợc trong đƣờng tiêu hóa, bằng cách kháng acid và mật, ngoài ra chúng còn phải có khả năng nhân nhanh số lƣợng. Việc sử dụng các sản phẩm probiotic giúp duy trì sự cân bằng hệ vi sinh trong đƣờng ruột từ đó giúp ngăn ngừa các bệnh nhƣ đái tháo đƣờng type 2, rối loạn chuyển hóa, gan nhiễm mỡ và bệnh mạch vành. [32] Trang 6
  16. Đồ án tốt nghiệp Lợi ích của các thực phẩm lên men có đƣợc là do sự phát triển của các vi khuẩn trong suốt quá trình sản xuất. Vai trò của vi khuẩn probiotic trong việc lên men sữa là để hổ trợ: bảo quản sữa bằng cách tạo ra acid lactic và các hợp chất kháng khuẩn, tạo hƣơng vị (ví dụ acetaldehyde trong sữa chua và phô mai) và cung cấp một số chất hữu cơ khác (nhƣ polysaccharide ngoại bào) mà ngƣời tiêu dùng mong muốn, cải thiện giá trị dinh dƣỡng của thực phẩm, ví dụ nhƣ giải phóng các acid amin tự do hoặc tổng hợp các vitamin và cung cấp các chất đặc biệt có khả năng điều trị hoặc phòng ngừa ung thƣ, cũng nhƣ kiểm soát nồng độ cholesterol [27]. Các lợi ích của việc tiêu thụ các sản phẩm sữa lên men có đƣợc chủ yếu là do sự thay đổi theo hƣớng có lợi của hệ sinh thái trong đƣờng tiêu hóa. Trên khắp thế giới, có khoảng 20 dòng probiotic, trong đó chủ yếu là các Lactobacilli nhƣ: Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. reuterii và các loài khác, Bifidobacteria, các bào tử vi khuẩn sinh acid lactic nhƣ Lactospore, nấm men nhƣ Saccharomyces boulardii, đƣợc sử dụng trong thực phẩm bổ sung, thực phẩm chức năng hoặc thực phẩm chính [23]. Các dòng probiotic khác nhƣ Pediococcus, cùng với các vi khuẩn lactic khác nhƣ Leuconostoc và Lactobacillus đƣợc sử dụng để lên men bắp cải, làm kim chi. Một số dòng Pediococcus sản xuất ra diacetyl tạo hƣơng vị cho bơ, một số loại rƣợu vang và bia. P. pentosaceus, P. acidilactici, P. damnosus, P. claussenii, P.inopinatus, P. parvulus, P. stilesii, P. ethanolidurans and P. cellicola là các chủng thuộc Pediococcus đƣợc sử dụng làm probiotic. Trong Enterococci, Enterococuus faecalis và Enterococcus faecium là những loài chính đƣợc sử dụng làm probiotic. 1.3 Lịch sử nghiên cứu về probiotic Thuật ngữ probiotic có nghĩa là “ cho sự sống” hiện đang đƣợc sử dụng để chỉ các vi khuẩn có lợi đến sức khỏe của con ngƣời và động vật. Các sản phẩm sữa lên Trang 7
  17. Đồ án tốt nghiệp men đƣợc con ngƣời sử dụng từ thời Vedic ( Ấn Độ cổ), những khái niệm khoa học về probiotic đƣợc phát triển vào khoảng năm 1900, khi Henry Tissier, một bác sĩ nhi khoa ngƣời Pháp đã nhận xét sự hiện diện với số lƣợng rất ít các vi khuẩn có hình thái chữ Y trong phân của trẻ em bị tiêu chảy. Những vi khuẩn này ngƣợc lại có rất nhiều ở trẻ em khỏe mạnh [32]. Ông ta đặt tên cho vi khuẩn này là Bacillus bifidus communis và sau này đƣợc đổi tên thành chi Bifidobacterium. Khái niệm probiotic đƣợc báo cáo lần đầu tiên bởi nhà khoa học Nga và đoạt giải Nobel, Elie Metchnikoff vào năm 1907 , ngƣời đã cho rằng tuổi thọ và sức khỏe của ngƣời Bungari là kết quả của việc tiêu thụ sữa lên men, và đề xuất rằng việc sử dụng sữa lên men sẽ cung cấp cho ruột các vi khuẩn lactic, làm giảm độ pH của đƣờng ruột sẽ ức chế các vi khuẩn gây hại [29]. Ông cũng chỉ ra rằng tiêu thụ Lactobacillli giúp kiểm soát nội độc tố sinh ra bởi các loại thành phần khác trong hệ sinh thái ruột [24] Thuật ngữ probiotic ban đầu đƣợc đề xuất nhƣ một từ trái ngƣợc với kháng sinh, và đƣợc dùng để mô tả sự hổ trợ tăng trƣởng cho các vi sinh vật bởi Lilley and Stillwell vào năm 1965 [21],[32]. Fuller sau đó miêu tả probiotic là “các vi sinh vật sống đƣợc bổ sung vào thức ăn có tác động có lợi đến động vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng vi sinh đƣờng ruột” [14]. Định nghĩa về probiotic đã đƣợc làm rõ hơn nữa vào năm 1998 là "các vi sinh vật sống, khi tiêu hóa với một số lƣợng nhất định, có ảnh hƣởng đến sức khoẻ ngoài dinh dƣỡng cơ bản”[15]. Tiến sĩ Minoru Shirota năm 1930 đã phân lập Lactobacillus casei Shirota (LcS) với các tính chất probiotic và đƣa ra thị trƣờng thức uống sữa lên men có chứa probiotic ( Yakult) này trong hơn bảy thập kỷ để cải thiện sức khoẻ đƣờng ruột [20]. Các công trình nghiên cứu của Tissier và Metchnikoff là tiền đề trong việc sử dụng vi khuẩn probiotic. Từ đó có rất nhiều các nghiên cứu về vai trò probiotic của LAB và ứng dụng các tế bào sống . Những quan sát của Tissier và Metchnikoff thu hút đƣợc nhiều sự chú ý và đƣợc thƣơng mại hóa. Tuy nhiên, không phải kết quả lúc nào cũng đƣợc nhƣ mong đợi, Trang 8
  18. Đồ án tốt nghiệp và hầu hết các quan sát này điều trở thành giai thoại. Do đó, khái niệm probiotic đƣợc coi là không có cơ sở khoa học và ít đƣợc quan tâm trong nhiều thập kỉ với một số nghiên cứu về chất thay thế cho chất tăng trƣởng sử dụng cho động vật. Tuy nhiên trong 20 năm qua, nghiên cứu về probiotic đã có những bƣớc tiến đáng kể và chú trọng vào việc lựa chọn,mô tả cụ thể các môi trƣờng nuôi cấy probiotic, chứng minh các lợi ích của chúng đối với sức khỏe, và đảm bảo sự sống sót của các loại vi khuẩn này khi ở trong dạ dày-ruột [32]. Các chủng trong chi Lactobacillus và Bifidobacterium đƣợc sử dụng chủ yếu, nhƣng không phải là duy nhất, số lƣợng các probiotic và các sản phẩm chứa probiotic luôn không ngừng gia tăng. 1.4 Các vi sinh vật probiotic thƣờng gặp Vi sinh vật đƣợc sử dụng làm probiotic gồm nhiều nhóm khác nhau nhƣ VK, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc. Tuy nhiên, vì những đặc tính ƣu việt của LAB phù hợp với việc tạo chế phẩm probiotic cho ngƣời cũng nhƣ vật nuôi nên thành phần của hầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là các chủng LAB. Một số nhóm vi sinh vật probiotic thƣờng gặp 1.4.1 Chi Lactibacillus Chi Lactobacillus bao gồm các chủng thuộc Gram âm, hiếu khí bắt buộc hoặc vi hiếu khí, tế bào hình que. Chúng là một phần chủ yếu trong nhóm vi khuẩn lactic (LAB) (bao gồm Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus và Leuconostoc) có thể chuyển đổi đƣờng hexose thành acid lactic rồi tiết ra môi trƣờng để ức chế sự phát triển của vi sinh vật có hại. Trong cơ thể ngƣời, Lactobacilli thƣờng đƣợc tìm thấy trong cơ quan sinh dục, đƣờng tiêu hóa, và một số nơi khác cùng với Bifidobacterium. Trình tự gen hoàn chỉnh của một số chủng Lactobacillus thƣờng gặp đã đƣợc công bố nhƣ: Lactobacillus plantarum, L. johnsonii, L. acidophilus, L. sakei, L. bulgaricus, L. salivarius. Trang 9
  19. Đồ án tốt nghiệp Một vài chủng Lactobacilli đƣợc sử dụng để sản xuất yogurt, phô mai, nƣớc tƣơng, kim chi, rƣợu và một số thực phẩm lên men khác. Trong tất cả các trƣờng hợp trên, đƣờng sẽ đƣợc chuyển hóa thành acid lactic, tạo thành môi trƣờng ức chế các vi sinh vật gây hƣ hỏng và cho phép bảo quản thực phẩm. Các loài Lactobacilli thƣờng đƣợc chọn là probiotic vì chúng biểu hiện nhiều đặc tính quan trọng nhƣ: khả năng chịu acid và mật cao, khả năng bám dính vào bề mặt ruột, chống lại pH thấp, dịch dạ dày, ức chế các vi khuẩn gây bệnh, kháng kháng sinh, sản xuất exopolysaccharides và loại bỏ cholesterol [28]. 1.4.2 Chi Bifidobacterium Chi Bifidobacterium thuộc Gram âm, không di động, hô hấp hiếu khí.Chúng sống cộng sinh trong đƣờng tiêu hóa và âm đạo của động vật có vú bao gồm cả con ngƣời.Các dòng thuộc chi Bifidobacterium đƣợc sử dụng làm probiotic vì sự đa dạng trong cơ chế kháng muối mật của chúng, điều này là rất quan trọng vì để thể hiện đƣợc đặc tính có lợi thì trƣớc tiên vi sinh vật phải tồn tại đƣợc trong dịch sinh học này. Một vài chủng thuộc chi Bifidobacteria đƣợc coi là các probiotic quan trọng bao gồm: Bifidobacterium infantis, B. adolescentis, B. animalis subsp animalis, B. animalis subsp lactis, B. bifidum, B. longum, B. breve. Bifidobacterium cùng với các probiotic khác đã đƣợc chứng minh là có khả năng chữa táo bón, tiêu chảy du lịch, tiêu chảy liên quan đến kháng sinh, giảm hoạt động của bệnh viêm đại tràng và viêm loét đại tràng, cũng nhƣ điều trị viêm ruột hoại tử ở trẻ sơ sinh, giảm sự phát triển của bệnh eczema, dị ứng thực phẩm, giảm cholesterol [28]. 1.4.3 Chi Sacharomyces Các chủng thuộc chi Saccharomyces bao các các chủng nấm nhƣ: Saccharomyces cerevisiae ( sử dụng cho làm rƣợu, bánh mì, bia), Saccharomyces bayanus ( đƣợc sử dụng để làm rƣợu), và Saccharomyces boulardii đƣợc sử dụng để tạo chế phẩm Trang 10
  20. Đồ án tốt nghiệp probiotic dƣới dạng đông khô để điều trị bệnh tiêu chảy, trong khi vẫn đảm bảo an toàn tuyệt đối [28]. Saccharomyces boulardii: đƣợc dùng nhƣ probiotic từ năm 1950. Là thành phần chính của một số chế phẩm probiotic nhƣ ultralevure (Pháp), florastor, bioflora (Pháp). Tác động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp. Ngừa tiêu chảy do kháng sinh và trị liệu phối hợp trong nhiễm trùng H. pylori, S. boulardii tác động thông qua cơ chế [1] 1. Tiết enzyme proteinase làm giảm độc tố do Clostridium difficile, sản sinh phosphatase làm bất hoạt các nội độc tố do E. coli tiết ra. 2. Tăng lƣợng kháng thể IgA, tăng các men lactase, sucrase, maltase, và N- aminopeptidase, tăng hấp thu ở ngƣời tiêu chảy, duy trì các acid béo chuỗi ngắn cần thiết cho cho việc hấp thu nƣớc và chất điện giải. Ngoài ra, chúng còn tác dụng giảm viêm ở đƣờng ruột do kích thích tế bàoT. 1.4.4 Chi Bacillus 1.4.4.1 Bacillus subtilis Bacillus subtilis là vi khuẩn ứng dụng làm probiotic từ rất sớm. Chúng đƣợc sử dụng qua đƣờng uống để phòng và chữa các rối loạn tiêu hóa nhƣ tiêu chảy sau khi dùng kháng sinh. Bacillus subtilis có tác dụng hồi phục hệ vi sinh vật tự nhiên trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời sau khi dùng kháng sinh kéo dài. Các chế phẩm B. subtilis đƣợc bán ở hầu hết các nƣớc Châu Âu, mặc dù ngƣời ta còn chƣa biết nhiều về cơ chế tác dụng của chúng. Bào tử của B.subtilis có thể vƣợt qua rào chắn đƣờng tiêu hóa, một phần bào tử nảy mầm trong ruột non và sinh sôi trong đƣờng ruột. Một số tác dụng lâm sàng của B. subtilis đã đƣợc biết nhƣ làm tác nhân kích thích miễn dịch trong một số bệnh [1] . Trang 11
  21. Đồ án tốt nghiệp 1.4.4.2 Bacillus clausii Thuộc giống Bacillus, Gram dƣơng, không di động, nuôi cấy dễ dàng với các môi trƣờng dinh dƣỡng thông dụng, có khả năng sinh bào tử giúp vi khuẩn tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt. Bào tử của B.clausii có thể qua dạ dày với tỷ lệ sống sót cao, có thể sống đƣợc trong môi trƣờng dịch vị với pH = 2 ít nhất l2 giờ. Chúng đề kháng rất tốt với nhiều loại kháng sinh. Vì thế, có thể dùng chung trong thời gian điều trị kháng sinh. Khi vào ruột non, bào tử B. clausii sẽ nảy mầm thành dạng sinh trƣởng (ST) và tiếp tục sinh sôi nảy nở trong ruột. Nhờ đó lấp đầy lại đƣợc khoảng trống rối loạn hệ vi khuẩn trong đƣờng ruột. Đồng thời sự sinh trƣởng của B. claussi sẽ tái lập đƣợc điều kiện kị khí, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển trở lại của các VK có lợi ở đƣờng ruột (nhƣ Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroides) đã bị rối loạn vì các nguyên nhân khác nhau. B. clausii thƣờng đƣợc dùng tạo chế phẩm probiotic cho ngƣời nhƣ chế phẩm Enterogermina ở dạng lỏng. Bào tử đƣợc bào chế dƣới dạng hỗn dịch không màu, không mùi, không vị trong từng ống nhựa nhỏ nên tiện lợi khi sử dụng, đặc biệt là cho trẻ em [1],[ 5]. Ngoài ra còn rất nhiều chủng vi khuẩn khác đƣợc cho rằng có tiềm năng probiotic (Bảng 1.1). Bảng 1.1. Các vi sinh vật có tiềm năng probiotic Probiotic Lợi ích đối với con ngƣời Lợi ích đối với động vật Nấm men Saccharomyces boulardii Nhiễm trùng Clostridium difficile Citro rodentium-viêm đại tràng Vi khuẩn Gram (-) Escherichia coli Nissle 1917 NA DSS-gây viêm đại tràng Vi khuẩn Gram ( +) Bifidobacteria bifidum NA Viêm ruột hoại tử ở chuột Trang 12
  22. Đồ án tốt nghiệp Bifidobacteria infantis IBS29 NA Lactobacillus rhamnosus GG Nhiễm nấm ở trẻ sơ sinh NA (Sử dụng với lactoferrin) Lactococcus lactis Bệnh Crohn Viêm đại tràng do DSS Lactobacillus plantarum 299v Tiêu chảy do kháng sinh IL-10-/- mice Lactobacillus acidophilus NA Tăng nhãn áp 40 và viêm đại tràng do C.rodentium Lactobacillus rhamnosus Tiêu chảy do kháng sinh ở trẻ em - Lactobacillus casei NA Viêm đại tráng do DNBS Bacillus polyfermenticus NA Viêm đại tràng do DSS và TNBS Phác đồ phối hợp Lactobacillus rhamnosus GG phối hợp Nhiễm khuẩn NA Bifidobacterium lactis Lactobacillus rhamnosus phối hợp NA Viêm đại tràng do C.rodentinum Lactobacillus helveticus stress mãn tính VSL#3 (Lactobacillus casei, Lactobacillus Viêm túi mật và Viêm đại tràng do DSS plantarum, Lactobacillus acidophilus, viêm loét đại tràng ở trẻ em Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidocacterium infantis and Streptococcus thermophilus) Chú thích: DNBS:dinitrobenzene sulfonic acid; DSS: dextran sodium sulfate; IL10:interleukin 10; NA:not available; TNBS:trinitrobenzene sulfonic acid.[17] 1.5 Hƣớng dẫn lựa chọn các chủng probiotic Để lựa chọn các chủng vi khuẩn làm probiotic, một số tiêu chí nhất định cần phải đƣợc áp dụng để đảm bảo an toàn, sản xuất, quản lý và ứng dụng. Các thí nghiệm in vitro cần đƣợc sử dụng để điều tra xem liệu các dòng vi khuẩn có đáp ứng đƣợc các Trang 13
  23. Đồ án tốt nghiệp tiêu chí trên hay không. Dựa trên các tiêu chí đó để sàng lọc các dòng vi khuẩn có tiềm năng probiotic. Có thể kiểm chứng thêm trên ngƣời và động vật. 1.5.1 Chi, loài và chủng probiotic Cần phải biết chi, loài và chủng probiotic. Đƣợc công nhận là có tác dụng probiotic. Việc xác định chủng loại đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp kiểu hình và kiểu gen. Danh pháp của vi khuẩn phải chính xác với tên khoa học đƣợc công bố hiện nay. Việc sử dụng các danh pháp cũ hoặc gây hiểu nhấm trên nhãn bao bì của sản phẩm là không thể chấp nhận đƣợc [12].DNA là phƣơng pháp đƣợc sử dụng để xác định chủng nào thuộc loài nào và phƣơng pháp phân tích trình tự gen 16S rRNA đƣợc sử dụng phố biến để xác định . 1.5.2 Các thử nghiệm invitro để sàng lọc chủng có tiềm năng probiotic Thử nghiêm in vitro rất quan trọng để đánh giá sự an toàn của vi sinh vật probiotic. Các thử nghiệm này rất hữu ích trong việc xác định các chủng và cơ chế của các tác dụng probiotic. Probiotic đƣợc sử dụng cho con ngƣời cần phải có các thử nghiệm chứng minh hiệu quả đối con ngƣời. Các thử nghiệm này cần có kết quả phù hợp với các kết quả đã công bố. Ví dụ- khả năng kháng muối mật tƣơng đồng với khả năng sống sót trong dạ dày. Hiện nay, các thử nghiệm in vitro đƣợc sử dụng trong nghiên cứu probiotic [12],[ 13]. 1. Khả năng kháng acid trong dạ dày. 2. Kháng muối mật. 3. Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh. 4. Kháng acid mật. 5. Khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột. 6. Khả năng cạnh tranh vị trí bám trên bề mặt với mầm bệnh. Trang 14
  24. Đồ án tốt nghiệp Kĩ thuật gen Việc sử dụng công nghệ gen để cải tiến vi sinh vật hứa hẹn cho sự phát triển của các chủng probiotic trong tƣơng lai. Có thể phân lập các gen quy định một yếu tố cụ thể và chuyển các gen này sang các chủng probiotic mà không làm thay đổi các đặc tính có lợi khác [13]. 1.5.3 Nguồn phân lập probiotic Nguồn phân lập có thể có nguồn gốc từ con ngƣời nhƣ ruột già, ruột non, hoặc sữa mẹ; nguồn gốc từ động vật, thực phẩm nhƣ sữa hoặc thực phẩm lên men. Các chủng probiotic đƣợc phân lập từ con ngƣời có khả năng bám dính vào thành ruột và an toàn hơn so với các chủng từ nguồn khác. Các chủng đƣợc sử dụng đóng vai trò quan trọng trong việc [12]. 1. Định cƣ trong đƣờng ruột, hô hấp, cơ quan sinh dục 2. Chuyển hóa cholesterol, ngăn ngừa ung thƣ 3. Chuyển hóa lactose, hấp thu canxi và tổng hợp các vitamin 4. Điều trị nhiễm trùng và nhiễm nấm âm đạo 5. Táo bón và tiêu chảy 6. Viêm loét dạ dày 7. Mụn trúng cá và các vấn đề về da 8. Sản xuất các kháng sinh tự nhiên, acid lacitc, hydrogen peroxide. 1.5.4 Probiotic an toàn Các dòng probiotic nhƣ Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus có lịch sử lâu dài về sử dụng an toàn và đƣợc công nhận đạt tiêu chuẩn GRAS. Các vi sinh vật khác cần đƣợc nghiên cứu độc tính trƣớc khi đƣợc sử dụng. Các vi sinh vật từ đất hoặc bào tử cần có các dữ liệu an toàn trƣớc khi đƣợc sử dụng nhƣ probiotic. Các Trang 15
  25. Đồ án tốt nghiệp nghiên cứu về an toàn bao gồm: phân loại, xét nghiệm invitro, thử nhiệm trên động vật, thử nghiệm trên con ngƣời, xác định trình tự gen [12]. Quy trình chọn lọc chủng probiotic đƣợc tóm tắt trong hình 1.1. Tuyển chọn và xác định chủng dựa trên kiểu hình và kiểu gen Tên chi, loài, ký hiệu chủng. Đăng kí trong bảo tàng giống quốc tế nào? Xác định chức năng Pha 1:Đánh giá độ an toàn In-vitro In-vitro và trên động vật Trên động vật Trên ngƣời Pha 2:Thử nghiệm lâm sàng ở ngƣời, thử nghiệm mù kép, Tốt nhất nên thử kiểm soát giả dƣợc (DBPC) để xác định xem chủng/sản phẩm nghiêm DBPC 2 lần độc có hiệu quả lập với nhau để khẳng định kết quả Pha 3: kiểm nghiệm mức độ hiệu quả trên ngƣời. So sánh hiệu quả điều trị 1 bệnh đặc trƣng bằng probiotic với phƣơng pháp PROBIOTIC thông thƣờng DÁN NHÃN Tên chi,loài, kí hiệu chủng Số lƣợng tối thiểu vi khuẩn có thể tồn tại cuối thời hạn sử dụng Điều kiện bảo quản thích hợp Thông tin liên hệ với khách hàng Hình 1.2. Hƣớng dẫn lựa chọn chủng probiotic của FAO & WHO Trang 16
  26. Đồ án tốt nghiệp 1.6 Vi khuẩn lactic 1.6.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic Lactic acid bacteria (LAB) thƣờng đƣợc tìm thấy trong các sản phẩm thực phẩm, đất, nƣớc, thực vật, ruột, bộ phận sinh dục và đƣờng hô hấp của ngƣời và động vật. Mặc dù LAB đƣợc sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm để sản xuất thực phẩm lên men bao gồm sữa, thịt, cá, ngũ cốc, trái cây và rau cải, nhƣng chúng cũng đƣợc tìm thấy trong thực phẩm không lên men và đƣợc công nhận là an toàn (GRAS) bởi Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA)[11]. LAB đƣợc sử dụng để đảm bảo an toàn, bảo quản chất lƣợng thực phẩm, phát triển các hƣơng vị mới đặc trƣng, cải thiện khả năng dinh dƣỡng và điều trị của thực phẩm và để ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh và làm hƣ hỏng (Calo Mata và cộng sự 2008). Hoạt động ức chế đa hình của LAB đƣợc ghi nhận do giảm độ pH, sự cạnh tranh về vị trí bám trên bề mặt và nhiều hợp chất kháng sinh đƣợc sản xuất nhƣ axit lactic, axit axetic, hydrogen peroxide, carbon dioxide bên cạnh các bacteriocin (Indira và cộng sự, 2011). Trong số các hợp chất chống vi khuẩn, bacteriocin có ý nghĩa đặc biệt vì sử dụng an toàn và hiệu quả để kéo dài hạn sự dụng cũng nhƣ sự an toàn của sản phẩm thực phẩm. [32] 1.6.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, phân loại Nhìn chung LAB là vi khuẩn Gram dƣơng, không tạo bào tử, kị khí tùy ý và hầu hết không di động. Chúng thuộc loại đa khuyết dƣỡng, đƣợc tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm lên men nhƣ sữa chua, kim chi, dƣa muối chua, nem chua, LAB tồn tại khá hạn chế trong một số MT do nhu cầu dinh dƣỡng cao của nó. Về mặt hình thái, các nhóm LAB tồn tại chủ yếu ở hai dạng: hình que hoặc hình cầu . Về mặt sinh lí, chúng tƣơng đối đồng nhất: thu nhận năng lƣợng nhờ phân giải carbohydrat và tiết ra acid lactic. Khác với các vi khuẩn đƣờng ruột sinh acid lactic, Trang 17
  27. Đồ án tốt nghiệp LAB là nhóm kị khí không bắt buộc, chúng không có cytochrome và enzyme catalase. Tuy nhiên, chúng vẫn có thể ST đƣợc khi có mặt oxy do có enzyme peroxidase [1] . Theo khóa phân loại Bergey (2001), LAB đƣợc xếp vào 4 họ: Lactobacillaceae, Enterococcaceae, Leuconoscaceae, Streptococcaceae, thuộc Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ I: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus; Pediococcus Họ II: Enterococcaceae. Giống: Enterococcus Họ III: Leuconoscaceae Giống: Leuconostoc Họ IV: Streptococceae Giống: Streptococcus; Lactococcus Nhóm LAB đƣợc sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm thuộc về các chi nhƣ Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus. Trong đó Lactobacillus chiếm vị trí quan trọng nhất. 1.6.3 Chi Lactobacillus Giống Lactobacillus có dạng hình que, thƣờng tồn tại từng tế bào riêng rẽ hay dạng chuỗi, kích thƣớc tế bào dao động từ 0,5-1,2 x 1-10 µm. Tế bào không di động, G+, không sinh bào tử. Chúng là dạng kị khí không bắt buộc, có thể tăng trƣởng ở nhiệt độ từ 50C – 530C và tăng trƣởng tối thích từ 300C đến 400C. Chúng có thể sống ở pH nhỏ hơn 5. Trang 18
  28. Đồ án tốt nghiệp Nhu cầu dinh dƣỡng của Lactobacillus rất phức tạp cần phải có nguồn cacbonhydrat, acid amin, peptit, các este của acid béo, dẫn xuất của các acid nucleic, vitamin và khoáng chất. Lactobacillus có thể sử dụng glucose để lên men đồng hình (sản phẩm cuối cùng có hơn 85% là acid lactic) hay lên men dị hình (sản phẩm cuối cùng gồm acid lactic, CO2, ethanol). Sự hiện diện của oxy hay các tác nhân oxy hoá khác nhƣ acetat có thể tạo thành lactat. Một số chất nhƣ citrat, malat, tartrat, quinolat, nitrat, nitrit, cũng đƣợc chúng sử dụng nhƣ nguồn năng lƣợng trong quá trình trao đổi chất hoặc đóng vai trò nhƣ chất nhận electron. Lactobacillus bao gồm 25 loài đƣợc chia thành 3 nhóm chính dựa vào sản phẩm cuối cùng tạo thành là: Nhóm I: lên men đồng hình bắt buộc. Nhóm II: lên men dị hình tuỳ ý Nhóm III: lên men dị hình bắt buộc Bảng 1.3 Phân loại Lactobacillus dựa vào sản phẩm Đặc điểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III Lên men pentose - + + Tạo CO2 từ glucose - + + Tạo CO2 từ - + + gluconate - + + FDP aldolase Một vài đại diện L. acidophilus L. casei L. brevis L. delbrueckii L. cuvatus L. buchneri L. helveticus L. plantarum L. fermentun L. salivarius L. sake L. reuteri Ghi chú: -: không có khả năng +: có khả năng Trang 19
  29. Đồ án tốt nghiệp Một số loài thuộc chi Lactobacillus thƣờng sử dụng để tạo chế phẩm probiotic cho ngƣời nhƣ: L. acidophilus, L. bulgaricus, L. casei, L. kefir, L.delbruckii, L. sporogenes, Lactobacillus acidophilus Là vi khuẩn probiotic có mặt trong hầu hết các men tiêu hóa. Có dạng hình que, kích thƣớc từ 0,5-1 x 2-10 µm, vi khuẩn Gram dƣơng, đi theo cặp hoặc dạng chuỗi ngắn. Đây là LAB ƣa nhiệt, có thể phát triển ở 450C . Chúng có khả năng sống 2 ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật tinh khiết và 8 ngày trong dịch ruột. Chúng có khả năng tạo ra các bacteriocin nhƣ lactocidin, acidophilin, có thể đề kháng đƣợc nhiều loại KS. L. acidophilus nhƣ là một probiotic lên men đồng hình và dị hình sống trong đƣờng ruột, miệng và âm đạo nhƣng chiếm ƣu thế nhất trong số đó là 6 loài lên men đồng hình, tạo thành nhóm gọi là phức hợp L. acidophilus. Các thành viên của nhóm này tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển bình thƣờng của hệ VSV trong đƣờng ruột. Cơ chế tác động bao gồm: 1. Duy trì hệ VSV bình thƣờng trong đƣờng ruột. 2. Tác động lên hệ VSV gây bệnh. 3. Điều hoà khả năng miễn dịch. 4. Hoạt tính chống đột biến và chống ung thƣ. 5. Làm mất sự liên kết của các acid mật. 6. Tạo enzyme lactase. 7. Làm giảm lƣợng cholesterol trong huyết thanh. Trang 20
  30. Đồ án tốt nghiệp Lactobacillus bulgaricus Đây là loài VK quen thuộc, cƣ trú thƣờng xuyên trong ruột ngƣời và động vật, cùng với các loài VK khác tạo thành một khu hệ VSV không thể thiếu L. bulgaricus đã đƣợc ứng dụng cho lên men sữa chua từ rất lâu. Lactobacillus casei Trực khuẩn nhỏ, có kích thƣớc rất ngắn. Chúng có thể tạo thành chuỗi,không chuyển động, G+. Chúng có khả năng lên men đƣợc các loại đƣờng glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, lactose, salicin. Trong quá trình lên men chúng tạo thành acid L-lactic với nồng độ khoảng 180 g/l trong tổng số 210 g/l acid lactic. Lactobacillus delbruckii L. delbruckii có thể lên men đƣợc các loại đƣờng glucose, maltose, fructose, galactose và dextrin. Chúng không có khả năng lên men xylose, arabinose, rhamnose, lactose, raffinose, trehalose, inulin, mannitol. L. delbrukii sản xuất 90% là acid L- lactic từ nguồn đƣờng glucose. Trong thành phần tế bào có chứa các chất khoáng, acid amin quan trọng giúp cơ thể nhanh chóng hồi phục sức khỏe. Lactobacillus sporogenes VK này đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa và biến dƣỡng của con ngƣời. Ổn định ở nhiệt độ phòng, tăng sinh rất nhanh trong ruột. Quá trình lên men tạo acid L (+) lactic, cung cấp phức hợp vitamin B và các enzyme tiêu hóa nhƣ protase, lipase, amylase, lactase, Chúng cũng sản xuất bacteriocin, giúp kiểm soát sự tăng trƣởng vƣợt mức của những nhóm VSV gây thối trong ruột, duy trì sự cân bằng pH acid. Trang 21
  31. Đồ án tốt nghiệp 1.6.4 Quá trình lên men lactic Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kị khí đƣờng với sự tích lũy acid lactic trong MT. Có thể tóm tắt theo phƣơng trình sau: Hình 1.3 Quá trình lên men lactic Các loài LAB khác nhau về cơ chế lên men glucose. Căn cứ vào sản phẩm lên men chia LAB thành hai nhóm. Nhóm VK lên men đồng hình: sản phẩm tạo ra chủ yếu là acid lactic. Nhóm VK lên men dị hình: sản phẩm tạo ra ngoài acid lactic còn có ethanol, CO2, 1.6.4.1 Lên men lactic đồng hình Các LAB lên men đồng hình phân giải đƣờng theo con đƣờng EMP (EmbdenMeyerhof Parnas) và cho sản phẩm chủ yếu là acid lactic (90 - 98%). Chỉ một phần nhỏ pyruvate đƣợc decacboxyl hóa và chuyển thành acid acetic, ethanol, aceton và CO2. Mức độ tạo thành các sản phẩm phụ thuộc vào sự có mặt của oxy. Phương trình tóm tắt C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2CH3CHOHCOOH + 2ATP Một số LAB lên men đồng hình thƣờng gặp là Lactococcus lactis, L. acidophilus, L. casei, L. cremoris, L. hevelticus, L. delbrueckii, S. lactis, S. thermophilus, P. cerevisiae. Trang 22
  32. Đồ án tốt nghiệp 1.6.4.2 Lên men lactic dị hình Vi khuẩn lactic lên men dị hình do thiếu 2 enzyme chủ yếu của con đƣờng EMP là aldolase và triozophosphat – merisoase nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải glucose xảy ra theo con đƣờng PP (pentose - phosphat). Quá trình chuyển hóa trizophosphat thành acid lactic giống nhƣ lên men đồng hình. Sản phẩm của quá trình lên men lactic dị hình ngoài acid lactic (40%), còn có các sản phẩm khác nhƣ acid succinic, ethanol (20%), acid acetic (10%), các chất khí còn lại (20%). Phương trình tóm tắt C6H12O6 CH3CHOHCOOH + CH3CH2OH + CO2 + xKcal Glucose Acid lactic Ethanol Một số LAB lên men dị hình thƣờng gặp là L. mensenteroides, L. cremoris, L.brevis, L. fementum, . Trang 23
  33. Đồ án tốt nghiệp 2 CHƢƠNG 2.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.1.1 Nguồn mẫu thu vi khuẩn lactic Nguồn mẫu bao gồm: Kim chi, Cà pháo muối chua, rau Tiến vua muối chua, Măng chua, Dƣa chua, Cải chua, Dƣa leo muối chua thu ở các chợ Bến Thành, quận 1và chợ Nguyễn Văn Trỗi quận 3 thành phố Hồ Chí Minh. 2.1.1.2 Chủng vi khuẩn kiểm định Bacillus subtilis, Escherichia Coli, Pseudomonas, Salmonella, Staphylococcus aureus trong bộ sƣu tập giống của phòng vi sinh thuộc viện sinh học nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh. 2.1.2 Hóa chất Môi trƣờng MRS đông khô (Italia), cao nấm men, sữa gầy, tinh bột. Glucose, saccharose, lactose, galactose, maltose, manitol, pepton, NaCl, CaCO3, NaOH, phenol, acid lactic, phenolphthalein, gentian violet, KI (Trung Quốc). MgSO4. 7H2O, FeCl3 , K2HPO4, KH2PO4, FeSO4, (NH4)3C6H3O7, fucshin kiềm (Trung Quốc). Agar, cồn (Việt Nam). 2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 2.1.3.1 Thiết bị Nồi hấp vô trùng Máy li tâm thƣờng Máy điện di Tủ cấy Kính hiển vi Máy PCR Tủ đông để giữ mẫu Máy ly tâm lạnh Trang 24
  34. Đồ án tốt nghiệp 2.1.3.2 Dụng cụ Ống nghiệm, đĩa peptri, bình tam giác, que gạt, que cấy, pipet, đầu típ các loại, . 2.1.4 Môi trường nuôi cấy MT1. Môi trƣờng MRS: Dùng để phân lập nuôi cấy và nghiên cứu các đặc tính của vi khuẩn Lactobacillus Thành phần môi trường MRS (g/l): Pepton 10g Cao thịt 10g Cao nấm men 5g Glucose 10g K2HPO4 2g CH3COONa 5g (NH4)3C6H5O7 2g MgSO4.7H2O 0,2g Tween 80 1ml Agar 20g Nƣớc cất 1000ml. MT2. Môi trƣờng MRS lỏng: dùng để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc tính của Lactobacillus. Thành phần tƣơng tự nhƣ MT1 nhƣng không có agar. MT3. Môi trƣờng MRS agar bổ sung 1% CaCO3: Dùng để phân lập và khảo sát khả năng sinh acid tổng. Thành phẩn môi trường MRS agar + 1% CaCO3. Trang 25
  35. Đồ án tốt nghiệp Pepton 10g Cao thịt 10g Cao nấm men 5g Glucose 10g K2HPO4 2g CH3COONa 5g (NH4)3C6H5O7 2g MgSO4.7H2O 0,2g Tween 80 1ml Agar 20g CaCO3 10g Nƣớc cất 1000ml MT4. Môi trƣờng LB: Dùng để nuôi cấy vi khuẩn chỉ thị. Thành phần môi trường LB Pepton 10g Cao nấm men 5g NaCl 5g Agar 20g Nƣớc cất 1000ml MT5. Môi trƣờng thử hoạt tính protease: Môi trƣờng LB bổ sung 1% bột sữa gầy. MT6. Môi trƣờng thử hoạt tính amylase: Môi trƣờng LB bổ sung 1% tinh bột. Trang 26
  36. Đồ án tốt nghiệp 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập và tuyển chọn Mẫu đƣợc pha loãng 10-5, 10-6, cấy trang trên môi trƣờng MRS bổ sung 1 % 0 CaCO3, ủ trong tủ ủ 37 C/ 48-72h, lựa chọn các khuẩn lạc có vòng tan , sau đó cấy ria qua MRS Agar, ủ 370C/24h, thu nhận khuẩn lạc thuần, tiếp tục giữ giống bằng glycerol 20% ở nhiệt độ -200C [31]. 2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc Dịch khuẩn đƣợc hoạt hoá trên môi trƣờng MRS từ 24-48 giờ, hút 0,1ml dịch khuẩn cấy trang trên môi trƣờng MRSa, ủ ở 370C/24-48 giờ. Quan sát, đánh giá nhận xét về hình thái, màu sắc, kích thƣớc, đặc điểm bề mặt bằng kính hiển vi soi nổi [1]. 2.2.3 Phương pháp xác định khả năng sinh acid lactic Chủng đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MRS lỏng ở 370C/ 48 giờ. Ly tâm 6000 vòng/phút, thu hồi dịch nổi. Sử dụng thuốc thử Uphemen để ghi nhận sự chuyển màu. Màu vàng tạo ra càng đậm thì lƣợng acid sinh ra càng nhiều [1]. 2.2.4 Phương pháp nhuộm Gram Đối với LAB muốn quan sát hình thái tế bào, ngƣời ta làm phƣơng pháp nhuộm Gram Nguyên tắc: dựa vào khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iốt, hình thành hai loại phức chất khác nhau. Loại 1: vẫn giữ nguyên màu sắc của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật dạng này thuộc Gram dƣơng (bắt màu tím). Loại 2: không giữ đƣợc màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật dạng này thuộc Gram âm (bắt màu hồng). Trang 27
  37. Đồ án tốt nghiệp Cách tiến hành: Làm vết bôi: lấy 1 giọt canh trƣờng hoặc một ít khuẩn lạc vi khuẩn đặt vào giữa phiến kính, dàn đều tạo thành vùng tròn nhỏ, để khô tự nhiên. Cố định vết bôi: kẹp phiến kính, hơ nhẹ mặt dƣới trên đèn cồn vài lần. Nhuộm vết bôi Đặt miếng giấy thấm lên vết bôi. Nhỏ thuốc nhuộm tím gentian lên giấy thấm giữ trong một phút. Nhỏ bổ sung lugol lên vết bôi, giữ trong một phút. Rửa bằng cồn 30 giây, sau đó rửa lại bằng nƣớc. Nhuộm bổ sung fuchsin kiềm 10 – 30 giây, rửa lại bằng nƣớc. Để khô và xem lại tiêu bản với vật kính dầu x100. Ghi nhận khả năng bắt màu Gram của vi khuẩn [34] 2.2.5 Phương pháp khảo sát khả năng di động Nguyên tắc: dựa vào khả năng di chuyển của vi khuẩn trên môi trƣờng đặc [1]. Cách tiến hành Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 10ml môi trƣờng MRS agar. Sử dụng phƣơng pháp cấy trích sâu, cấy các chủng vi khuẩn kiểm định vào ống nghiệm. Nuôi cấy ở 370C/72 giờ. Quan sát vết cấy, nếu thấy vết cấy mọc lan thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng di động, ngƣợc lại thì không có khả năng di động. 2.2.6 Phương pháp xác định kiểu hô hấp Nguyên tắc: căn cứ vào khả năng sinh trƣởng của vi sinh vật trong điều kiện có nồng độ oxy khác nhau. Trang 28
  38. Đồ án tốt nghiệp Cách tiến hành Chuẩn bị các ống nghiệm thạch đứng chứa 10ml môi trƣờng MRS agar. Cấy các chủng vi khuẩn vào ống nghiệm bằng que cấy đầu nhọn theo phƣơng pháp cấy trích sâu. Nuôi ở nhiệt độ 370C trong 3 ngày. Nhận xét sự sinh trƣởng của vi khuẩn trong môi trƣờng, từ đó xác định quan hệ của chúng với oxy [1]. 2.2.7 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính catalase Nguyên tắc: nhằm phát hiện sự hiện diện của enzyme catalase trong vi sinh vật. Dựa vào khả năng sinh catalase và phân giải H2O2 của các chủng vi sinh vật. Cách tiến hành Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trƣờng MRS lỏng 18 - 24 giờ ở nhiệt độ 370C. Lấy một giọt canh khuẩn lên lame Bổ sung vài giọt hydrogen peroxid (H2O 2) lên giọt canh khuẩn. Quan sát và ghi nhận kết quả: Không có hiện tƣợng sủi bọt -> catalase âm tính. Có hiện tƣợng sủi bọt (do O2 phóng thích) -> catalase dƣơng tính. Đối chứng dƣơng là B. subtilis [35]. 2.2.8 Phương pháp xác định hoạt tính protease Nguyên tắc: dựa vào khả năng phẩn giải protein của các chủng vi sinh vật bằng cách đo vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. Cách tiến hành Cấy chấm điểm các chủng LAB trên môi trƣờng LB bổ sung 1% bột sữa gầy, nuôi trong tủ ấm 370C từ 3-5 ngày. Sau đó quan sát và ghi nhận vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc [1]. Trang 29
  39. Đồ án tốt nghiệp 2.2.9 Phương pháp xác định hoạt tính amylase Nguyên tắc: dựa vào khả năng sinh enzyme amylase phân giải tinh bột của các chủng vi sinh vật bằng cách đo vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. Cách tiến hành Cấy chấm điểm các chủng LAB trên môi trƣờng LB bổ sung 1% tinh bột, nuôi cấy trong tủ ấm 370C từ 2-3 ngày. Dùng thuốc thử Lugol 1% đổ lên bề mặt môi trƣờng đang nuôi cấy. Nếu LAB sinh enzyme amylase phân giải tinh bột sẽ tạo thành vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc. Các vùng chƣa phân giải sẽ tạo màu xanh đen do tinh bột đã phản ứng với Lugol [36]. 2.2.10 Phương pháp xác định khả năng kháng khuẩn Nguyên tắc: phƣơng pháp này dựa trên sự đối kháng giữa vi sinh vật kiểm định và vi sinh vật chỉ thị. Chuẩn bị: Dịch nuôi cấy vi sinh vật chỉ thị trong môi trƣờng LB ở 300C trong 18 giờ. Dịch nuôi cấy LAB trong MRS lỏng 370C/24 giờ. Đem ly tâm ở 11000vòng/phút. Loại bỏ sinh khối. Ống kim loại đục lỗ đƣờng kính 4mm. Cách thực hiện Cấy trang 0,1ml vi sinh vật chỉ thị lên đĩa chữa 20ml môi trƣờng LB agar. Đục lỗ thạch đƣờng kính 4mm Nhỏ 0,1ml dịch ly tâm vào lỗ thạch, sau đó đợi khô. Ủ hiếu khí, 370C, 18-24 giờ Kiểm tra sự tạo thành vòng kháng khuẩn. Đo đƣờng kính vào kháng khuẩn. Trang 30
  40. Đồ án tốt nghiệp Căn cứ vào bề dày vành kháng khuẩn (D-d)/2, bề dày vành kháng khuẩn càng lớn, chứng tỏ hoạt tính kháng khuẩn càng mạnh [2]. D- đƣờng kính vòng vô khuẩn d-đƣờng kính lỗ thạch Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn [3] Bề dày vành kháng khuẩn > 4.0 mm tƣơng ứng với hoạt tính mạnh. Bề dày vành kháng khuẩn từ 2.1 mm † 4.0 mm tƣơng ứng với hoạt tính trung bình. Bề dày vành kháng khuẩn 1-2 mm tƣơng ứng với hoạt tính yếu. Bề dày vành kháng khuẩn = 0 mm tƣơng ứng với không có hoạt tính. 2.2.11 Phương pháp định danh bằng sinh học phân tử 2.2.11.1 Thu nhận DNA Phá màng tế bào và màng nhân bằng protein đặc hiệu (proteinase K) để giải phóng các DNA, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp phenol và chloroform (hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có chứa DNA. Làm kết tủa các acid nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu đƣợc các acid nucleic dạng cô đặc, dễ bảo quản [1],[ 3],[ 4]. 2.2.11.2 Chạy PCR (Polymerase chain reaction ) Nguyên tắc: khuyếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng cặp mồi chuyên biệt. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bƣớc: Trang 31
  41. Đồ án tốt nghiệp Bước 1 (biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA đƣơc biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thƣờng khoảng là 94oC- 95oC trong vòng 30 giây – 60 giây. Bước 2 (lai): nhiệt độ đƣợc hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao động khoảng từ 40oC – 70oC và kéo dài trong vòng 30 giây – 60 giây. Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ đƣợc tăng lên đến 72oC để DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ Kit Qiagen và giải trình tự tại công ty Nam Khoa. Các trình tự nucleotide hoàn chỉnh đƣợc so sánh với ngân hàng dữ liệu gen của NCBI bằng cách sử dụng công cụ BLAST. 3 Trang 32
  42. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Phân lập LAB từ nguồn thực vật ủ chua Từ 7 mẫu thực vật ủ chua thu nhận từ các chợ khác nhau nằm trên địa bàn T.P Hồ Chí Minh, sau khi tiến hành pha loãng bằng nƣớc cất vô trùng, cấy trang lên môi 0 trƣờng thạch MRS agar có bổ sung 1% CaCO3 (MT3), nuôi cấy ở 37 C/3 ngày đã phân lập đƣợc 11 chủng có khả năng sinh acid làm tan CaCO3 (Phụ lục 1 ). Để tăng tính thuần nhất và ghi nhận đƣợc chính xác hình thái khuẩn lạc của các chủng phân lập đƣợc, tiến hành cấy ria các khuẩn lạc trên môi trƣờng MRS agar (MT1). Kết quả ghi nhận hình thái khuẩn lạc đƣợc thể hiện trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả hình thái khuẩn lạc của 11 chủng đƣợc phân lập Nguồn mẫu Kí hiệu chủng phân lập Hình thái khuẩn lạc của chủng MC1 Tròn, bìa nguyên, trắng sữa, lồi, trơn bóng Măng chua MC2 Tròn bìa nguyên, trắng sữa, lồi, trơn bóng MC3 Tròn, bìa nguyên, trắng sữa, lồi, trơn bóng CP1 Tròn, bìa nguyên, trắng sữa,lồi, trơn bóng Cà pháo CP2 Tròn, bìa nguyên, trắng sữa, lồi, trơn bóng Kim chi KC Tròn, bìa nguyên, trơn, trắng đục,lồi,tâm vàng Dƣa chua DCH1 Tròn, bìa nguyên,trơn, trắng sữa, dẹt. Tiến vua TV Tròn,bìa nguyên,trắng sữa,lồi, trơn bóng Dƣa cải DC Tròn,bìa nguyên,trơn,trắng sữa, hơi lồi. Cải chua CC1 Tròn, bìa nguyên,vàng đục,trơn láng,lồi CC2 Tròn, bìa nguyên,trắng sữa, lồi, trơn láng Từ kết quả thể hiện trong bảng 3.1, nhìn chung các chủng phân lập đƣợc đều có hình thái khuẩn lạc tròn, bìa nguyên, màu trắng sữa, bề mặt trơn láng., kích thƣớc dao động từ 1-2 mm. Trang 33
  43. Đồ án tốt nghiệp 1 2 3 4 5 6 7 Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của một số mẫu sau khi làm thuần 1:Măng chua; 2: cà pháo; 3:kim chi;4: dƣa chua; 5: Tiến vua; 6: Dƣa cải; 7: cải chua Để lựa chọn đƣợc chủng thuộc chi Lactobacillus, cần tiến hành nhuộm Gram để xác định hình thái tế bào của các chủng và thử khả năng di động. Kết quả nhuộm Gram, xác định hình thái tế bào đƣợc tổng kết trong bảng 3.2. Từ kết quả nghiên cứu xác định hình thái tế bào và thử nghiệm khả năng di động của các chủng phân lập đƣợc, chỉ có duy nhất chủng CC1 có tế bào hình cầu, điều này không phù hợp với các mô tả về chi Lactobacillus, vì vậy chủng này đƣợc loại bỏ. Riêng 10 chủng còn lại đều có tế bào hình que và không có khả năng di động, đây là một trong các điều kiện vô cùng quan trọng trong việc lựa chọn chủng probiotic. Khi chủng vi khuẩn không có khả năng di động thì khi đƣợc đƣa vào hệ tiêu hóa sẽ cạnh tranh vị trí bám với các vi sinh vật gây hại, đồng thời có thể tác động trực tiếp lên các tế bào biểu mô của ruột-dạ dày, từ đó có những tác động tốt đến hệ tiêu hóa. 10 chủng đƣợc lựa chọn mang kí hiệu CP1, CP2, MC1, MC2, MC3, KC, TV, DCH1, DC và CC2. Trang 34
  44. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2. Kết quả xác định hình thái tế bào Kí hiệu chủng Hình thái tế bào Kết quả nhuộm Gram Khả năng di động CP1 Que + - CP2 Que + - MC1 Que + - MC2 Que - - MC3 Que + - KC Que + - TV Que - - DCH1 Que - - DC Que + - CC2 Que - - CC1 Cầu + - Để có thể xác định đƣợc chủng thuộc chi Lactobacillus, việc đầu tiên là phải xác định đƣợc chủng đó thuộc nhóm vi khuẩn LAB. Ngoài việc dựa vào hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và khả năng di động, cần phải xác định acid mà các chủng này sinh ra là acid lactic. Vì vậy cần tiến hành định tính acid lactic sinh ra trong dịch nuôi cấy tăng sinh của 10 chủng trên. Tiến hành định tính acid lactic bằng thuốc thử Uphemen. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.2. Từ kết quả nghiên cứu để định tính acid lactic, cho thấy dịch ly tâm sinh khối của 10 chủng đều có phản ứng dƣơng tính với thuốc thử Uphemen, điều này chứng tỏ cả 10 chủng trên đều có khả năng sinh acid lactic. Tổng kết lại, qua các thử nghiệm trên, ghi nhận đƣợc 10 chủng trên đều có hình thái khuẩn lạc tròn, bìa nguyên, bề mặt trơn bóng, kích thƣớc dao động từ 1-2 mm, không có khả năng di dộng, có tế bào hình que, sinh acid lactic. Vậy có thể đi đến kết luận 10 chủng này đều thuộc nhóm vi khuẩn LAB. Sau khi đã xác định đƣợc nhóm vi khuẩn của 10 chủng, tiến hành xác định khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn này, để từ đó có thể nhanh chóng loại bỏ các chủng vi khuẩn không có các đặc tính có lợi, giúp việc lựa chọn chủng probiotic đƣợc nhanh chóng và rút ngắn thời gian hơn. Trang 35
  45. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2. Định tính aicid lactic bằng thuốc thử Uphemen Ghi chú: ĐC (-): 3ml MT2+ 2ml thuốc thử Uphemen. ĐC (+): 3ml aicd lactic 2% + 2ml thuốc thử Uphemen. Tiến hành xác định khả năng kháng khuẩn của 10 chủng trên bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch với vi khuẩn kiểm định là Ba.subtilis. Kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ có 2 chủng là CP1 và MC3 có khả năng đối kháng lại với chủng vi khuẩn kiểm định và tạo vòng vô khuẩn. Thông qua kết quả này, có thể lựa chọn 2 chủng CP1 và MC3 để tiến hành xác định các đặc điểm sinh lý-sinh hóa để từ đó có thể xác định đƣợc một cách sơ bộ chi của 2 chủng này. 3.2 Đặc điểm sinh học của 2 chủng LAB đƣợc tuyển chọn 3.2.1 Đặc điểm hình thái của 2 chủng CP1 và MC3. Dùng kính hiển vi soi nổi để mô tả hình thái khuẩn lạc trên môi trƣờng MRS agar. Tiến hành làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát các đặc điểm tế bào của các chủng. Nhìn chung, hai chủng CP1 và MC3 đều có hình que, tế bào dạng đơn hay xếp đôi. Chúng thuộc Gram dƣơng, không di động, không sinh bào tử. Khuẩn lạc tròn, lồi, kích thƣớc dao động từ 1-2 mm, màu trắng sữa, mép trơn, bề mặt bóng ƣớt. Trang 36
  46. Đồ án tốt nghiệp A B Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) của chủng CP1 nhuộm Gram trên kính hiển vi x100 A B Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) của chủng MC3 nhuộm Gram trên kính hiển vi x100 3.2.2 Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 2 chủng CP1 và MC3. Ngoài các đặc điểm đã đƣợc khảo sát nhƣ khả năng sinh acid lactic và khả năng kháng khuẩn. Tiếp tục khảo sát thêm một số đặc điểm sinh lý- sinh hóa của 2 chủng đã lựa chọn. 3.2.2.1 Kiểu hô hấp Khi nuôi cấy hai chủng này trên môi trƣờng thạch đứng, chủng CP1 và MC3 mọc dọc theo vết cấy từ bề mặt xuống tận đáy ống nghiệm. Điều này chứng tỏ hai chủng này thuộc loại hiếu khí tùy nghi. Trang 37
  47. Đồ án tốt nghiệp 3.2.2.2 Hoạt tính catalase 0 Nhỏ vài giọt sinh khối vi khuẩn sau 2 ngày nuôi cấy ở 37 C lên lame, bổ sung thêm 1-2 giọt hydrogen peroxid. Kết quả không thấy hiện tƣợng xủi bọt. Nhƣ vậy hai chủng này không có khả năng oxy hóa H2O2 thành H2O và O2 để giải độc cho tế bào. Do đó các chủng trên đều thuộc loại kỵ khí không bắt buộc. 3.2.2.3 Hoạt tính amylase Sau khi nuôi cấy hai chủng này trên môi trƣờng LB bổ sung 1% tinh bột, và thử với thuốc thử Lugol. Kết quả cho thấy không thấy xuất hiện vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. Điều này chứng tỏ cả hai chủng đều không sinh amylase. 3.2.2.4 Hoạt tính protease Sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng LB có bổ sung 1% casein, cả hai chủng đều không tạo vòng tan. Điều này chứng tỏ cả hai chủng không có khả năng sinh enzyme protease. Qua các kết quả khảo sát các đặc tính sinh lý sinh hóa của 2 chủng cho thấy rằng cả hai chủng đều mang các đặc điểm : tế bào hình que, không có khả năng di động, hiếu khí tùy nghi, catalase âm tính, sử dụng nhiều nguồn đƣờng khác nhau để lên men. Khi so sánh với khóa phân loại của Bergey‟s (1986) (Bảng 3.3) cho phép kết luận chủng CP1 và MC3 thuộc Họ: Lactobacillaceace Chi: Lactobacillus Dựa trên cơ sở nguồn phân lập và các đặc điểm sinh lý- sinh hóa của hai chủng, cho phép xác định đƣợc hai chủng này thuộc chi Lactobacillus, kí hiệu lại là Lactobacillus CP1 và Lactobacillus MC3. Trang 38
  48. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3. Tổng hợp các đặc điểm sinh lý sinh hóa của hai chủng nghiên cứu Đặc điểm hình thái, Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Chi Lactobacillus Lactobacillus CP1 Lactobacillus MC3 1. Tế bào Hình dạng Que dài Que dài Que dài Sắp xếp tế bào 1,2 chuỗi ngắn 1,2 chuỗi ngắn 1,2 chuỗi ngắn 2. Tính chất Gram G+ G+ G+ 3. Khuẩn lạc Hình dạng Tròn lồi Tròn lồi Tròn lồi Màu sắc Trắng sữa Trắng sữa Trắng sữa Kích thƣớc Tùy loài 1,0-2,0 mm 1,0-2,0 mm 4. Quan hệ với Vi hiếu khí Vi hiếu khí Vi hiếu khí oxy 5. Lên men lactic Tùy loài Đồng hình Dị hình 6. Khả năng tạo - - - bào tử 7. Khả năng di - - - động 8. Hoạt tính - - - catalase 9. Hoạt tính - - - Protease Trang 39
  49. Đồ án tốt nghiệp 10. Lên men đƣờng Glucose + + + Galactose + + + Maltose + + + Manitol Tùy loài + + Lactose + + + Saccharose + + + Dextrin Tùy loài - - Sorbitol Tùy loài - - Ghi chú: „-„ âm tính ; „+‟ dƣơng tính. Nhƣ đã nghiên cứu trƣớc đó, 2 chủng Lactobacillus CP1 và Lactobacillus MC3 đều có khả năng đối kháng lại với Ba.subtilis, tức là có khả năng kháng khuẩn, tuy nhiên trong thực phẩm cũng nhƣ trong môi trƣờng sống hằng ngày có chứa rất nhiều vi sinh vật có thể xâm nhập vào hệ tiêu hóa và gây bệnh cho ngƣời và động vật. Chính vì vậy, các chủng probiotic có phổ kháng khuẩn rộng, tức là ức chế đƣợc nhiều loại vi sinh vật khác nhau sẽ đƣợc quan tâm và chú trọng nhiều hơn trong việc sản xuất chế phẩm probiotic. Do đó, để có thể đƣợc sử dụng là probiotic, 2 chủng Lactobacillus CP1 và Lactobacillus MC3 phải có phổ kháng khuẩn rộng. 3.3 Phổ kháng khuẩn của hai chủng lactic nghiên cứu Để tìm hiểu khả năng này, sử dụng phƣơng pháp khếch tán qua giếng thạch, khảo sát hoạt tính đối kháng của hai chủng vi khuẩn lactic đang nghiên cứu với 4 chủng vi khuẩn kiểm định chuyên gây bệnh đƣờng ruột cho ngƣời và động vật. Hoạt tính Trang 40
  50. Đồ án tốt nghiệp ức chế đƣợc đánh giá thông qua kích thƣớc vành kháng khuẩn (( D-d)/2, mm). Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.4. Từ bảng 3.4, cả hai chủng đều có khả năng ức chế cả Gram âm và Gram dƣơng. Nhờ đó khi có sự tồn tại của chúng trong ruột ngƣời sẽ gây bất lợi cho các vi khuẩn gây bệnh và gây thối trong đƣờng ruột. Khả năng kháng khuẩn mà ngƣời thực hiện đo đƣợc không khác biệt với các chủng Lactobacillus phân lập đƣợc từ phân trẻ em trong thí nghiệm của Hoàng Quốc Khánh và Phạm Thị Lan Thanh (2011) [3], mặc dù có sự khác biệt về kích thƣớc vành kháng khuẩn. Đặc biệt chủng Lactobacillus CP1 có khả năng ức chế đối với vi khuẩn Salmonella. Từ kết quả này cho thấy cả hai chủng Lactobacillus CP1 và Lactobacillus MC3 đều tạo ra các hợp chất kháng khuẩn gồm acid hữu cơ và các hợp chất kháng khuẩn khác. Các hợp chất kháng khuẩn này có thể là bacteriocin, hydroxy peroxyde, diacetyl, reutorin. Chính các thành phần này đã tạo ra khả năng ức chế các vi khuẩn chỉ thị của dịch ly tâm vi khuẩn. Khi xét về tỷ lệ ức chế các vi khuẩn chỉ thị, ngƣời thực hiện nhận thấy chủng Lactobacillus CP1 có khả năng kháng mạnh và kháng đƣợc nhiều vi khuẩn chỉ thị hơn chủng Lactobacillus MC3, đặc biệt là sự ức chế đối với Salmonella. Khi tiến hành đo vòng kháng khuẩn ở đĩa peptri, phƣơng pháp đo rất thô sơ, chỉ dựa trên mắt thƣờng và dùng thƣớc mm để đo. Kết quả này có độ tin cậy không cao, chƣa có độ nhạy trong kết quả, ngoài ra cần đƣợc chuẩn hóa về độ dày của môi trƣờng, nồng độ vi khuẩn chỉ thị và thể tích dịch ly tâm cho vào giếng thạch Trang 41
  51. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. Kết quả thử phổ kháng khuẩn của hai chủng Lactobacillus CP1 và Lactobacillus MC3 Trung bình bề rộng vành kháng Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn ,mm khuẩn [3] VSV kiểm Khả năng gây định bệnh [4] Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus CP1 MC3 CP1 MC3 E.coli Viêm 2,33 2,10 ++ ++ ruột,tiêu chảy Pseudomonas Viêm màng trong tim. 2,83 2,50 ++ ++ Viêm đƣờng hô hấp, Salmonella Tiêu chảy, ói mửa, buồn 3,17 0 ++ - nôn S.aureus Gây ngộ độc 3,67 3,01 ++ ++ 3.4 Định danh chủng Lactobacillus CP1và Lactobacillus MC3 bằng sinh học phân tử Để xác định chính xác tên loài của chủng Lactobacillus CP1 và MC3, ngƣời thực hiện gửi chủng này đến phòng xét nghiệm công ty Nam Khoa- TP Hồ Chí Minh. Kết quả định danh đến loài bằng phƣơng pháp giải trình tự gen 16sRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH. Kết hợp với các nghiên cứu về hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và các đặc điểm sinh lý-sinh hóa có thể đi đến kết luận rằng kết quả giải trình tự gen là chính xác và có độ tin cậy cao. Trang 42
  52. Đồ án tốt nghiệp Kết quả giải trình tự gen 16s của chủng Lactobacillus CP1 GATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGA ACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTG GTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGA TGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCG GCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTC ACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGA GACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACG AAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTC TGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACC AGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGC. Kết luận: Chủng Lactobacillus CP1 là Lactobacillus plantarum strain LPL-1 với độ tƣơng đồng 100%. Kết quả giải trình tự gen 16s của chủng Lactobacillus MC3 ATGCTAATACCGCATAACAGCGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCT ATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGC GATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCAT ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAA CACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTA TGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGT GCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAA ACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTA GATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACT CGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGT GCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTG AGGAGTACGACCGCAAGGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGGT Kết luận: Chủng Lactobacillus MC3 là Lactobacillus fermentum strain 17-2b với độ tƣơng đồng 100%. Trang 43
  53. Đồ án tốt nghiệp CP1 99 Lactobacillus plantarum strain LPL-1 40 Lactobacillus plantarum strain SRCM102022 Lactobacillus plantarum strain TMW 1.1623 Lactobacillus acidophilus partial Lactobacillus fermentum strain 17-2b MC3 53 Leuconostoc lactis strain CAU1761 10 Hình 3.5 Cây phát sinh loài của hai chủng Lactobacillus CP1 và Lactobacillus MC3 và các loài có liên quan 4 Trang 44
  54. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ 7 mẫu thực phẩm rau củ lên men, ngƣời thực hiện đã thu đƣợc 11 chủng VK sinh acid và chọn đƣợc 2 chủng Lactobacillus CP1 và Lactobacillus MC3 có các đặc điểm: thuộc chi Lactobacillus, tế bào hình que, Gram dƣơng, vi hiếu khí, lên men lactic đồng hình, catalase âm tính, không tạo hoạt tính protease và amylase, lên men nhiều nguồn đƣờng khác nhau. Cả hai chủng đều có khả năng kháng khuẩn với Ba.subtilis, phổ kháng khuẩn rộng với các vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột, đặc biệt chủng Lactobacillus CP1 có khả năng kháng với Salmonella, là vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột nguy hiểm. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý và sinh hóa, kết hợp với kết quả định danh đến loài. Dựa vào khóa phân loại của Bergey‟s (1986) kết luận chủng Lactobacillus CP1 là Lactobacillus plantarum LPL-1, chủng Lactobacillus MC3 là Lactobacillus fermentum 17-2b Qua kết quả nghiên cứu trên, ngƣời thực hiện nhận thấy rằng, chủng Lactobacillus CP1và chủng Lactobacillus MC3 mang các đặc điểm sinh học có tiềm năng là một probiotic. Do vậy có thể sử dụng để làm probiotic cho ngƣời hoặc động vật. 4.2 Kiến nghị Xác định bản chất của các yếu tố đối kháng của LAB với các vi khuẩn kiểm định. Xác định thêm khả năng tồn tại của chủng LAB trong hệ thống tiêu hóa. Trang 45
  55. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Trần Thị Ái Liên (2012), Nghiên cứu đặc điểm và vai trò của lactobacillus trong chế phẩm probiotic., Luận văn thạc sĩ sinh học, Trƣờng Đại Học Sƣ Phạm tp. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh. 2. Đỗ Quế Mi Hƣơng (2009), Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính kháng vi sinh vật của vi khuẩn lên men lactic để chọn chủng tiềm năng probiotic., Đồ án tốt nghiệp, ĐH Công Nghệ TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh. 3. Hoàng Quốc Khánh và Phạm Thị Lan Thanh (2012), "Phân lập, định danh và xác định các chủng Lactobacillus có tiềm năng probiotic từ phân trẻ sơ sinh.", Tạp Chí Phát Triển Khoa Học và Công Nghệ. 14, tr. 62-76. 4. Trần Linh Thƣớc (2013), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm., NXB Giáo Dục Việt Nam, TP. Hồ Chí Minh. 5. Phạm Hùng Vân (2007), Bacilulus clausii và vai trò probiotics trong điều trị tiêu chảy, Hội thảo chuyên đề, Hội nhi khoa Tp. HCM . Tài liệu tiếng anh 6. Guarner F và Schaafsma G J (1998), "Probiotics.", International Journal of Food Microbiology. 39, tr. 237–238. 7. Minelli E B and Benini A (2008), "Relationship between number of bacteria and their probiotic effects.", Microbial Ecology and Health Diseases. 20, tr. 1651-2235. 8. Cardoso E M and Miura E Trois L (2008), "Use of probiotics in HIV- infected children: a randomized double-blind controlled study", Journal of Tropical Pediatrics. 54, tr. 19-24. 9. Chill D and Maida N Carr F J (2002), "The lactic acid bacteria: a literature survey", Critical Reviews in Microbiology. 28, tr. 281–370. Trang 46
  56. Đồ án tốt nghiệp 10. Cencic A and Chingwaru W (2010), " Antimicrobial agents deriving from indigenous plants", RPFNA. 2, tr. 83-92. 11. Stiles J Chumchalova J, Josephsen J and Plockova M, (2004), "Characterization and purification of acidocin CH5, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus CH5", Journal of Applied Microbiology. 96, tr. 1082-1089. 12. S. K. DASH (2009), "Selection criteria for probiotics.", Focus on Dietary fibres - Pre/Probiotics. 20(3), tr. 26-28. 13. FAO/WHO (2002), Guidelines for the evaluation of probiotics in food, Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization Working Group Report,, London, Ontario. 14. Fuller R (1991), "Probiotics in human medicine", Gut 32, tr. 439–442. 15. Guarner F and Schaafsma G J (1998), "Probiotics", International Journal of Food Microbiology,. 39, tr. 237–238. 16. Antoine J M Kalliomaki M, Herz U, Rijkers G T, Wells J M and Mercenier A, ( 2010), "Guidance for substantiating the evidence for beneficial effects of probiotics: prevention and management of allergic diseases by probiotics", Journal of Nutrition. 140, tr. 713S-721S. 17. Marcelino Kongo (2013), Lactic Acid Bacteria – R & D for Food, Health and Livestock Purposes, Tập 1, InTech, Janeza Trdine 9, 51000 Rijeka, Croatia, tr.202-204. 18. Kumar A Kumar M, Nagpal R, Mohania D, Behare P, Verma V, Kumar P, Poddar D, Aggarwal P K, Henry C J, Jain S and Yadav H, (2010), "Cancer- preventing attributes of probiotics: an update.", International Journal of Food Science and Nutrition. 61(5), tr. 473-496. 19. Laparra J M và Sanz Y (2010), "Interactions of gut microbiota with functional food components and nutraceuticals.", Pharmacological Research. 61, tr. 219–225. Trang 47
  57. Đồ án tốt nghiệp 20. Levin R (2011), "Probiotics-the road map", International Journal of Probiotics and Prebiotics. 6, tr. 133-40. 21. Lilley D M and Stillwell R H (1965), " Probiotics: growth promoting factors produced by microorganisms", Science. 147, tr. 747–748. 22. Longdet I Y, Kutdhik R J và Nwoyeocha I G (2011), "The probiotic efficacy of Lactobacillus casei from human breast milk against Shigellosis in Albino rats", Advances in Biotechnology and Chemical Processes. 1, tr. 12-16. 23. Maity T K và Misra A K (2009), "Probiotics and human health: Synoptic review", Brazilian Journal of Food Agriculture. 9(8), tr. 1778-1796. 24. Metchnikoff E (1907), The prolongation of life, London, UK: William Heinemann. 25. Nissen L và các cộng sự (2009), " Gut health promoting activity of new putative probiotic/protective Lactobacillus spp. strains: a functional study in the small intestinal cell model.", International Journal of Food Microbiology. 135, tr. 288-294. 26. Zoumpopoulou G Papadimitriou K, Foligne B, Alexandraki V, Kazou M, Pot B D and Tsakalidou E, (2015), "Discovering probiotic microorganisms: in vitro, in vivo, genetic and omics approaches", Frontiers in Microbiology. 6, tr. 58. 27. Parvez S và các cộng sự (2006), "Bile salt hydrolase and cholesterol removal effect by Bifidobacterium bifidum NRRL 1976", World Journal of Microbiology and Biotechnology. 22, tr. 455-459. 28. Sabina Fijan (2014), "Microorganisms with Claimed Probiotic Properties: An Overview of Recent Literature", Int. J. Environ. Res. Public Health. 11, tr. 4745-4767. 29. Vaughan R B (1965), "The romantic rationalist: A study of Elie Metchnikoff", Medical History. 9, tr. 201–215. Trang 48
  58. Đồ án tốt nghiệp 30. Chang C J Yao T C, Hsu Y H and Huang J L, (2009), "Probiotics for allergic diseases: Realities and myths", Pediatrics, Allergy and Immunology. 21(6), tr. 900-919. 31. Sachi haruguChi Ayaka iuChi , Wiyada Mongkolthanaruk , Jiro ariMa , Mitsutoshi nagase , và các cộng sự (2012), "Characterization of Novel Amylase from Amylolytic Lactic Acid Bacteria Pediococcus ethanolidurans Isolated from Japanese Pickles (Nuka-zuke)", Food Sci. Technol. Res. 18(6), tr. 861 – 867. 32. Anupama Gupta (2015), Characterization of potentially active new probiotic strains isolated from different sources and to study their prospects as nutraceutical agents, University of Horticulture and Forestry, Nauni-Solan. 33. F. and De Vuyst Leroy, L, (2004), "Functional lactic acid bacteria starter cultures for the food fermentation industry.", Trends in Food Science and Technology 15, tr. 67-78. Tài liệu mạng 34. 35. interpretation-with-precautions/ 36. Trang 49
  59. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 1 1. Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của vi sinh vật bằng phƣơng pháp khếch tán qua giếng thạch của chủng CP1 1 2 3 4 5 1: Ba.subtilis; 2: Pseudomonas;3: Salmonella;4: E.coli; 5:S.aureus 2. Kết quả thử nghiệm khả năng sinh acid lactic làm tan CaCO3
  60. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 2 Kết quả giải trình tự Trình tự gen so sánh của chủng MC3 với các chủng trong ngân hàng gen NCBI Lactobacillus fermentum 17-2b, mức độ tƣơng đồng 98% Query 14 GCTAGTTCGTGGCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATT 73 |||||| | | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1 GCTAGTACAT-GCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATT 59 Query 74 GATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAG 133 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 60 GATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAG 119 Query 134 CGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAGCGTTGTTCGCATGAACA 193 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 120 CGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAGCGTTGTTCGCATGAACA 179 Query 194 ACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGT 253 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 180 ACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGT 239 Query 254 TGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCC 313 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 240 TGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCC 299 Query 314 ACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCAC 373 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 300 ACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCAC 359 Query 374 AATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAA 433 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 360 AATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAA 419 Query 434 GCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAA 493 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 420 GCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAA 479 Query 494 CCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT 553 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 480 CCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT 539
  61. Đồ án tốt nghiệp Trình tự gen so sánh của chủng CP1 với các chủng trong ngân hàng gen NCBI Lactobacillus plantarum LPL-1, mức độ tƣơng đồng là 100% Query 1 GATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1960681 GATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCT 1960622 Query 61 GGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1960621 GGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAA 1960562 Query 121 CACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCA 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1960561 CACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCA 1960502 Query 181 TAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATG 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1960501 TAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATG 1960442 Query 241 GTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGC 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1960441 GTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGC 1960382 Query 301 CGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAG 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1960381 CGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAG 1960322 Query 361 GCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTG 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1960321 GCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTG 1960262 Query 421 AAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTG 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1960261 AAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTG 1960202
  62. Đồ án tốt nghiệp