Đồ án Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease thương mại Tegalase R660L trong tận thu chất màu astaxanthin ở dạng carotenprotein từ phế liệu tôm sú

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease thương mại Tegalase R660L trong tận thu chất màu astaxanthin ở dạng carotenprotein từ phế liệu tôm sú

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE THƯƠNG MẠI TEGALASE R660L ĐỂ THU NHẬN CHẤT MÀU ASTAXANTHIN Ở DẠNG CAROTENOPROTEIN TỪ PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM SÚ. Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Giảng viên hướng dẫn: GVC.TS. Nguyễn Lệ Hà Sinh viên thực hiện: Văn Thị Công Tâm MSSV: 1311110775 Lớp: 13DTP08 TP. Hồ Chí Minh, 2017
2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE THƯƠNG MẠI TEGALASE R660L ĐỂ THU NHẬN CHẤT MÀU ASTAXANTHIN Ở DẠNG CAROTENOPROTEIN TỪ PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM SÚ. Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Giảng viên hướng dẫn: GVC.TS. Nguyễn Lệ Hà Sinh viên thực hiện: Văn Thị Công Tâm MSSV: 1311110775 Lớp: 13DTP08 TP. Hồ Chí Minh, 2017
3. Khoa: Công nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường PHIẾU ĐĂNG KÝ ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN/ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hệ:Đại học chính quy (CQ, LT, B2, VLVH) 1. Họ và tên sinh viên/ nhóm sinh viên đăng ký đề tài (sĩ số trong nhóm): 1 Văn Thị Công Tâm MSSV: 1311110775 Lớp: 13DTP08 Ngành: Công nghệ thực phẩm Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm 2. Tên đề tài đăng ký: Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease thương mại Tegalase R660L trong tận thu chất màu astaxanthin ở dạng carotenprotein từ phế liệu tôm sú. 3. Giảng viên hướng dẫn: GVC.TS. Nguyễn Lệ Hà. Sinh viên đã hiểu rõ yêu cầu của đề tài và cam kết thực hiện đề tài theo tiến độ và hoàn thành đúng thời hạn. Ý kiến giảng viên hướng dẫn TP. HCM, ngày tháng năm . (Ký và ghi rõ họ tên) Sinh viên đăng ký (Ký và ghi rõ họ tên) Trưởng khoa ký duyệt
4. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu độc lập của riêng tôi. Các tài liệu và số liệu sử dụng để phân tích trong nghiên cứu đều đã được công bố trên các tạp chí, giáo trình theo đúng quy định. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu trong luận văn là do tôi tự tìm hiểu, thực hiện thí nghiệm, phân tích một cách khách quan và phù hợp với thực tiễn. Và các số liệu của kết quả này chưa được công bố trong các nghiên cứu đã được thực hiện trước đây. Sinh viên thực hiện Văn Thị Công Tâm
5. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã truyền dạy các kiến thức cũng như sự đam mê về ngành học cho em trong suốt bốn năm em học tại trường. Vì đây là những kiến thức nền tảng để em có thể thực hiện đề tài nghiên cứu này và sẽ là hành trang kiến thức cho emáp dụng vào thực tiễn công việc sau này. Bên cạnh đó, em cũng gửi lời cảm ơnđến ban lãnh đạo Khoa đã tạo điều kiện về phòng ốc, trang thiết bị, dụng cụ cũng như hoá chất để em thực hiện đề tài nghiên cứu. Và em cũng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giảng viên Nguyễn Lệ Hà đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu, hoàn thành báo cáotốt nghiệp. Em không chỉ học được thêm những kiến thức mới từ cô, ngoài ra,côcòn truyền dạy về các kỹ năng sống bổ ích cho công việc sau này. Cuối lời, em kính chúc quý thầy cô luôn dồi dào sức khoẻ để có thể truyền dạy kiến thức và sự đam mê với ngành, nghề cho các thế hệ sau. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô. Sinh viên thực hiện Văn Thị Công Tâm
6. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon 3 1.1.1. Giới thiệu về tôm sú Penaeus monodon 3 1.1.2. Phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon 4 1.1.3. Tình hình xử lý đầu và vỏ tôm 6 1.2. Carotenprotein trong động vật thuỷ sản và một số phương pháp chiết rút 7 1.2.1. Carotenoid 7 1.2.2. Astaxanthin 9 1.2.3. Caotenprotein 11 1.2.4. Các ứng dụng astaxanthin: 13 1.3. Enzyme protease 15 1.3.1. Giới thiệu chung về enzyme protease 15 1.3.2. Phân loại proease 15 i
7. 1.3.3. Tính chất chung của enzyme 16 1.3.4. Yếu tố ảnh hưởng hoạt độ enzyme 17 1.4. Quá trình thuỷ phân protein [4] 19 1.4.1. Khái niệm và bản chất của quá trình thuỷ phân protein: 19 1.4.2. Các phương pháp thuỷ phân protein 19 1.5. Các nghiên cứu tách chiết carotenoprotein trong và ngoài nước: 21 1.5.1. Các nghiên cứu trong nước: 21 1.5.2. Các nghiên cứu ngoài nước: 24 CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1. Nguyên liệu cứu: 27 2.1.1. Đầu tôm: 27 2.1.2. Enzyme protease: 27 2.1.3. Hoá chất 27 2.2. Dụng cụ và thiết bị 27 2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1. Nội dung nghiên cứu 29 2.3.2. Bố trí thí nghiệm 30 ii
8. Phế liệu đầu tôm trước khi được đưa vào thủy phân được xử lý theo thứ tự trình bày trong hình 2.2 30 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu: 37 2.3.4. Xử lý số liệu: 37 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Các thông số cơ bản của nguyên vật liệu dùng trong thí nghiệm 38 3.1.1. Biến đổi số đơn vị hoạt tính enzyme 38 3.1.2. Thành phần nguyên liệu 39 Bảng 3.2. Thành phần nguyên liệu đầu tôm P.monodon 39 3.2. Điểm pI của dịch thuỷ phân 40 3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme prtotease Tegalase R660L 42 3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme protease Tegalase R660L 42 3.3.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid amin trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi acid amin 42 3.3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng astaxanthin thu nhận trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi astaxanthin 45 3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) protease Tegalase R660L đến quá trình thuỷ phân. 48 iii
9. 3.3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) protease Tegalase R660L đến hàm lượng acid amin thu được trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi acid amin 48 3.3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzym) đến hàm lượng astaxanthin và hiệu suất thu hồi astaxanthin 52 3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thuỷ phân 57 3.3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng acid amin trong dịch thủy phân 57 3.4. Tối ưu hoá nhiệt độ và thời gian thuỷ phân phế liệu đầu tôm để thu sản phẩm bột carotenoprotein 60 3.4.1. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân 61 3.4.2. Xác định chỉ tiêu tối ưu của quá trình thuỷ phân 61 3.4.3. Thiết lập phương trình hồi qui của hàm lượng acid amin AP và xác định nhiệt dộ và thời gian tối ưu của quá trình thuỷ phân thu nhận carotenoprotein. 62 3.4.3.1 Thiết lập phương trình hồi qui và phân tích ảnh hưởng của nồng độ, nhiệt độ và thời gian tới thu hồi hàm lượng acid amin 62 3.4.3.2. Thiết lập phương trình hồi qui và phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tới thu hồi astaxanthin. 65 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 4.1. Kết luận 70 iv
10. 4.2. Kiến nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC v
11. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT C Nồng độ enzyme Tg Thời gian T Nhiệt độ AP Hàm lượng acid amin AsP Hàm lượng astaxanthin EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Đặc tính của enzyme protease Tegalase R660L 27 Bảng 3.1. Thành phần nguyên liệu đầu tôm P.monodon (tính trên nguyên liệu khô) 39 Bảng 3.2: Khoảng biến thiên của các yếu tố cần tối ưu khi thuỷ phân đầu tôm61 Bảng 3.3. Thông số nhiệt độ và thời gian tối ưu của quá trình thu nhận bột carotenoprotein 67 Bảng 3.4: Thành phần hóa học trong bột carotenoprotein 68 vi
12. DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Sản lượng nuôi trồng và khai thác thuỷ sản Việt Nam 5 Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của carotenoid 9 Hình 2.1. Nội dung nghiên cứu 29 Hình 2.2. Chuẩn bị đầu tôm 30 Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thuỷ phân phế liệu đầu tôm. 34 Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ enzyme dùng thuỷ phân phế liệu đầu tôm 36 Hình 3.3. Hàm lượng acid amin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau. 42 Hình 3.4. Hàm lượng acid amin của dịch thủy phân theo nhiệt độ ở thời gian thủy phân là 6 giờ 43 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi acid amin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau 44 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi protein ở các nhiệt độ thủy phân sau 6 giờ thủy phân 44 Hình 3.7. Hàm lượng astaxanthin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau 46 46 Hình 3.8. Hàm lượng astaxanthin sau 6 giờ thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau. 46 Hình 3.9. Hiệu suất thu hồi astaxanthin qua các thời gian thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau 47 vii
13. Hình 3.10. Hiệu suất thu hồi astaxanthin sau 6 giờ thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau. 47 Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện hàm lượng astaxanthin và acid amin của dịch thuỷ phân sau 6 giờ với hoạt độ enzyme là 20UI ở các nhiệt độ khác nhau. 48 Hình 3.12. Hàm lượng acid amin theo thời gian ở các các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau 49 Hình 3.13. Hàm lượng acid amin sau 6 giờ thuỷ phân theo các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau 50 Hình 3.14. Hiệu suất thu hồi protein theo thời gian ở các các số đơn vị hoạt độ khác nhau 51 Hình 3.15. Hiệu suất thu hồi protein sau 6 giờ thủy phân 51 Hình 3.16. Hàm lượng astaxanthin theo thời gian ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau 53 Hình 3.17. Hàm lượng astaxanthin thu được trong bột nhão carotenoprotein từ dịch thủy phân sau 6 giờ thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau 54 Hình 3.18. Hiệu suất thu hồi astaxanthin trong bột nahxo caroteinoprotein từ dịch thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau. 55 Hình 3.19. Hiệu suất thu hồi astaxanthin trong bột nhão carotenoprotein từ dịch thủy phân phân sau 6 giờ thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau 55 Hình 3.20. Hàm lượng acid amin và astaxanthin của dịch thuỷ phân sau 6 giờ với các số đơn vị hoạt độ khác nhau, 550C 56 viii
14. Hình 3.21. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng acid amin thu được khi thủy phân ở 30UI và 550C 58 Hình 3.22. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng astaxanthin thu được khi thủy phân ở 30UI và 550C 59 Hình 3.23. Bề mặt đáp ứng của hàm AP ở nồng độ C= 5% 64 Hình 3.24. Bề mặt đáp ứng của hàm AsP ở nồng độ enzyme C= 5% 66 Hình 4.1. Quy trình thu nhận bột nahxo carotenoprotein 72 ix
15. MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Astaxanthin được biết đến là một chất chống oxy hoá mạnh với năng lượng chống oxy hoá gấp 10 lần so với ß- carotene và 500 lần so với vitamin E.[23]. Chính vì lý do này, hiện nay, chất màu này được sử dụng nhiều trong y học, thực phẩm, mỹ phẩm và cả trong thức ăn thuỷ sản, đặc biệt là thức ăn cho cá hồi. Tính đến hiện tại, astaxanthin chủ yếu được thu nhận từ tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Phaffia. Và những năm gần đây, lớp vỏ của các loài giáp sát được chú ý đến trong các nghiên cứu chiết rút astaxanthin, đặc biệt là phế liệu đầu và vỏ tôm. Ngày nay, ngành chế biến tôm đông lạnh xuất khẩu là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn, tạo ra nhiều công ăn việc làm và mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nước. Cùng với sự phát triển của nền kinh tế trong và ngoài nước, ngành thủy sản trong những năm gần đây đã đạt được những thành tựu đáng kể về nuôi trồng, chế biến cũng như xuất khẩu. Trong công nghệ chế biến thủy sản xuất khẩu của Việt Nam, tỷ lệ các mặt hàng giáp xác đông lạnh chiếm từ 70 – 80% sản lượng chế biến. Trong các mặt hàng xuất khẩu của nước ta thì mặt hàng tôm xuất khẩu luôn chiếm tỷ lệ lớn, chiếm hơn 50% tổng kim ngạch xuất khẩu. Cùng với khối lượng tôm xuất khẩu hằng năm thì phế thải liệu của nó bao gồm đầu và vỏ tôm cũng khá lớn. Thông thường đầu tôm chiếm 25 – 40% so với khối lượng toàn cơ thể thì cùng với lượng tôm xuất khẩu năm 2016 là 6.7 triệu tấn sẽ suy ra được lượng phế liệu đầu tôm là 1 – 3 triệu tấn được thải ra trong quá trình chế biến. Trong phế liệu đầu tôm chứa một lượng lớn protein, chitin, chất màu astaxanthin và một số hợp chất sinh học khác. Tuy nhiên, hiện nay phế liệu đầu tôm chỉ được sử dụng chủ yếu để làm thức ăn gia súc, một phần nhỏ để sản xuất chitin. Đây là ộm t cách tận thu phế liệu mang lại hiệu quả kinh tế nhưng không mang lại hiệu quả cao. Vì vậy, cần thiết phải có nhiều nghiên cứu hơn nữa để tìm ra hướng sử dụng nguồn phế liệu này hiệu quả hơn, mang lại lợi ích kinh tế, kỹ thuật và môi trường. Và hiện nay cũng đã có nhiều nghiên cứu về việc chiết rút astaxanthin từ nguồn phế liệu tôm bằng việc thuỷ phân bằng tác nhân hoá học hay trích ly astaxanthin bằng dung môi 1
16. Tuy vậy, các tác nhân hoá học ảnh hưởng đến chất lượng màu của sản phẩm cũng như không thể sử dụng làm thực phẩm cho người. Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong việc thuỷ phân phế liệu tôm sú Penaeus monodon nhằm tận thu astaxanthin ở dạng bột carotenprotein cho mục đích thực phẩm” được tiến hành với mong muốn nâng cao hiệu suất thu được astaxanthin với sự có mặt của protein hoà tan để có thể ứng dụng vào mỹ phẩm, thực phẩm. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Mục đích chung của đề tài này nhằm xác định các thông số của quá trình thủy phân để nâng cao hiệu suất thu nhận carotenprotein cao nhất và bước đầu thăm dò điều kiện thủy phân tối ưu dựa vào bề mặt đáp ứng. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Để đạt được mục tiêu đề ra, chúng tôi thực hiện các bước nghiên cứu như sau: + Khảo sát điểm pH có thể tủa carotenprotein nhiều nhất. + Khảo sát các điều kiện của quá trình thuỷ phân (nồng độ enzyme, nhiệt độ và thời gian thủy phân). + Bước đầu tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian thủy phân dựa vào bề mặt đáp ứng. + Xác định các thông số của bột nhão carotenprotein: màu sắc, mùi, hàm lượng astaxanthin. 2
17. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon 1.1.1. Giới thiệu về tôm sú Penaeus monodon Tôm sú (Tên Tiếng Anh: Giant/ Black Tiger Shrimp) được định loại là: Ngành: Arthropoda – Ngành chân khớp Lớp: Crusstacea – Lớp giáp xác Bộ: Decaoda – Bộ mười chân Họ chung: Penaeidea Họ: Penaeus Fabricius Giống: Penaeus Loài: Monodon Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius Cấu tạo của tôm gồm 2 phần: phần đầu và phần thân. Hầu hết các cơ quan nằm ở phần đầu ngực, phần thân chỉ có ruột và động mạch chủ, thịt tôm nằm gần như hoàn toàn ở thân. Vỏ tôm thường được tạo thành từ nhiều lớp protein, khoáng, lipid bao phủ khung chitin. Toàn bộ lớp vỏ này không sinh trưởng vì vậy tôm phải lột xác từng thời kì sinh trưởng của bản thân. Dưới lớp vỏ là lớp biểu bì có vai trò quan trọng trong việc lột xác bỏ lớp vỏ cũ và hình thành lớp vỏ mới của tôm. Kề trong lớp biểu bì là lớp trung bì có chứa sắc tố chủ yếu là astaxanthin. Chính nhờ sự biến đổi của sắc tố này mà ta có thể phân biệt được chất lượng tôm. Phần đầu thường chiếm khoảng 35 – 45% trọng lượng, phần vỏ chiếm 10 – 15% trọng lượng. Tỷ lệ các phần đầu, thân, vỏ luôn thay đổi phụ thuộc vào giống loài. Vỏ tôm được cấu tạo từ một phức hợp chitin – protein liên kết với một số hợp chất hữu cơ khác (astaxanthin, lipid), bị hóa cứng do kết hợp với canxi cacbonat. Chitin là các loại polysaccharide phổ biến trong tự nhiên chỉ sau cellulose. Nó được cấu tạo bởi các cầu nối 1,4 glucozit. Ngoài lớp màng sáp bao phủ bên ngoài lớp vỏ epicuticle, lipid còn tồn tại dưới dạng phức chất sterol- protein chứa trong lớp 3
18. endocuticle. Bên cạnh các thành phần trên, trong phế liệu đầu và vỏ tôm chứa lượng lớn protein. Protein trong vỏ tôm thường là loại protein không hòa tan, liên kết với lớp vỏ chitin bởi liên kết cộng hóa trị bền vững tương tự như liên kết giữa các phân tử amino acid với nhau trong phân tử protein. Do đó nó không bị tách ra khỏi vỏ tôm. Thành phần trong vỏ tôm mà đề tài quan tâm nhất, đó là astaxanthin. Chất này có màu xanh, và liên kết với protein, khi gia nhiệt, chúng chuyển thành carotenoprotein có màu cam. 1.1.2. Phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon Việt Nam nằm bên bờ Tây của Biển Đông, là một biển lớn của Thái Bình Dương, có diện tích khoảng 3.448.000 km2, có bờ biển dài 3260 km. Vùng nội thuỷ và lãnh hải rộng 226.000 km2, vùng biển đặc quyền kinh tế rộng hơn 1 triệu km2 với hơn 4.000 hòn đảo, tạo nên 12 vịnh, đầm phá với tổng diện tích 1.160km2 được che chắn tốt dễ trú đậu tàu thuyền. Biển Việt Nam có tính đa dạng sinh học khá cao, cũng là nơi phát sinh và phát tán của nhiều nhóm sinh vật biển vùng nhiệt đới ấn Độ - Thái Bình Dương với chừng 11.000 loài sinh vật đã được phát hiện. Bên cạnh đó, nước ta với hệ thống sông ngòi dày đặc và có đường biển dài rất thuận lợi phát triển hoạt động khai thác và nuôi trồng thủy sản. Sản lượng thủy sản Việt Nam đã duy trì tăng trưởng liên tục trong 17 năm qua với mức tăng bình quân là 9,07%/năm. Với chủ trương thúc đẩy phát triển của chính phủ, hoạt động nuôi trồng thủy sản đã có những bước phát triển mạnh, sản lượng liên tục tăng cao trong các năm qua, bình quân đạt 12,77%/năm, đóng góp đáng kể vào tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản của cả nước. Trong khi đó, trước sự cạn kiệt dần của nguồn thủy sản tự nhiên và trình độ của hoạt động khai thác đánh bắt chưa được cải thiện, sản lượng thủy sản từ hoạt động khai thác tăng khá thấp trong các năm qua, với mức tăng bình quân 6,42%/năm [1]. 4
19. Hình 1.1. Sản lượng nuôi trồng và khai thác thuỷ sản Việt Nam Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, tổng sản lượng thủy sản sản xuất năm 2016 đạt hơn 6,7 triệu tấn, tăng 2,5% so với năm 2015. Năm 2016, mặc dù tình hình hạn mặn và dịch bệnh làm ảnh hưởng nhiều tới nuôi tôm nước lợ trong 9 tháng đầu năm. Tuy nhiên, mưa nhiều trong những tháng cuối năm, độ mặn giảm cùng với sự chỉ đạo sát sao của các cấp trong việc kiểm soát dịch bệnh nên sản lượng thu hoạch tăng vào những tháng cuối năm. Sản lượng tôm nước lợ cả nước ước đạt 650 nghìn tấn. Tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, diện tích tốm sú ước đạt 569.500 ha, sản lượng đạt 251 nghìn tấn. Diện tích tôm thẻ chân trắng ước đạt 64.440 ha, tăng 11,5% so với năm 2015, sản lượng ước đạt 253,1 nghìn tấn. Tính trên cả nước, trong những năm gần đây, diện tích và sản lượng tôm nuôi không ngừng tăng, đến năm 2015, diện tích nuôi tôm nước lợ đạt trên 700.000 ha với sản lượng trên 650.000 tấn. Bên cạnh diện tích nuôi trồng rộng lớn, số lượng doanh nghiệp tham gia chế biến và xuất khẩu cũng không ngừng gia tăng. Trêncả nước có khoảng 160 doanh nghiệp tham gia chế biến, xuất khẩu tôm, tập trung chủ yếu ở Miền Trung, Nam Trung Bộ (Khánh Hòa, Phú Yên, Ninh Thuận, Bà Rịa– Vũng Tàu ), Đồng Bằng Sông Cửu Long (Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Cà 5
20. Mau, Kiên Giang), với tổng công suất chế biến đạt gần 1 triệu tấn sản phẩm/năm. Cùng với sự phát triển của ngành thuỷ hải sản, một lượng lớn đầu và vỏ tôm được thải ra môi trường, gây ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, đây lại là nguồn phế liệu chứa nhiều thành phần mang giá trị kinh tế cao: protein, chintin, astaxanthin Phế liệu tôm chủ yếu là đầu và mảnh vỏ, ngoài ra, còn có phần thịt vụn tùy theo giống loài và phương pháp chế biến mà lượng phế liệu tôm có thể vượt quá 60% sản lượng tôm khai thác được. Ví dụ tôm càng xanh, phê liệu chiếm khoảng 60% khối lượng toàn bộ, với tôm sú thì phế liệu chiếm 40% [1]. 1.1.3. Tình hình xử lý đầu và vỏ tôm Trước đây vấn đề xử lý phụ phế phẩm tôm từ các cơ sở chế biến, các công ty gặp nhiều khó khăn, chủ yếu đem đỗ bỏ. Gần đây phụ phế phẩm tôm đã được dùng làm thức ăn cho gia súc, góp phần làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên phương pháp này không đem lại hiệu quả kinh tế cao, việc làm thức ăn đòi hỏi phải sấy mà quá trình này không làm giảm khoáng và chitin, 2 chất này gây khó tiêu cho gia súc. Vì vậy người ta hướng đến một giải pháp mới là sản xuất Chitin – Chitosan. Chất Chitin- Chitosan chứa trong vỏ tôm là một loại nguyên liệu có thể ứng dụng cho nhiều ngành kinh tế. Theo đó, phế liệu tôm được thu gom tại các cơ sở chế biến đông lạnh, sau khi rửa sạch, sấy khô được đưa vào nồi phản ứng để loại bỏ muối vô cơ (muối can xi, muối phốt pho) và các protein. Sản phẩm thu được từ công đoạn này có tên là chitin; sau đó lại được đưa vào ngâm trong dung dịch kiềm khoảng 2 giờ sẽ cho ra một chất mới là Chitosan. Theo một số nhà khoa học, Chitosan có khả năng khống chế sự gia tăng của tế bào ung thư; đã được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả khá cao trong công nghệ bào chế dược phẩm (làm thuốc chữa bỏng (phỏng), thuốc giảm đau, hạ cholesterol, thuốc chữa bệnh dạ dày, thuốc chữa chứng đau xương khớp, chống viêm cấp trên mô lành ). Một số kết quả nghiên cứu của các bác sĩ ở Bệnh viện K Hà Nội, Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Hóa học những năm gần đây đã chứng minh những tác dụng đó của chất Chitosan trong vỏ tôm. Và trên thị trường dược phẩm hiện nay, loại thuốc chữa bệnh khớp làm từ vỏ tôm có tên 6
21. Glucosamin ngày càng ợđư c sử dụng rộng rãi do ít gây tác dụng phụ. Ngoài ra, chất Chitosan cũng được ứng dụng trong một số ngành công nghiệp: hóa chất, mỹ phẩm, xử lý nước thải Các nhà nghiên cứu trên thế giới từ lâu đã quan tâm đến lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan, protein và carotenoid từ phế liệu tôm bằng nhiều phương pháp như phương pháp hóa học, phương pháp sinh học hay kết hợp giữa phương pháp hóa học và sinhọc. h Tuy nhiên, khi xử lý phế liệu tôm để thu chitin và chitosan thì sử dụng acid và bazo sẽ phần nào gây ảnh hưởng môi trường, tăng chi phí xử lý nước thải nhưng chỉ thu được một phần thành phần hoá học có giá trị kinh tế trong đầu tôm. Từđó đã có thêm nhiều nghiên cứu tách chiết carotenprotein trong qui trình sản xuất chintin bằng HCl, HCOOH, thu protein, tách chiết astaxanthin bằng phương pháp lên men lactic và enzyme nhằm nâng cao hiệu quả kinh tế. 1.2. Carotenprotein trong động vật thuỷ sản và một số phương pháp chiết rút 1.2.1. Carotenoid Carotenoid là nhóm hợp chất màu được sử dụng rộng rãitrong công nghiệp thực phẩm. Carotenoid tồn tại rộng rãi trong tự nhiên, tất cả chất màu của rau quả đều là nguồn hợp chất màu tốt. Carotenoid được sử dụng trong công nghiệp được tổng hợp bằng phương pháp hoá học, một lượng nhỏ được tách từ thực vật hoặctảo. Tất cả sinh vật quang hợp ( bao gồm tảo thực vật và khuẩn tảo lục) và một sốvi khuẩn không quang hợp và nấm tổng hợp carotenoid. Nhóm chất màu này tan trong chất béo bao gồm hơn 700 hợp chất tạo ra màu đỏ, cam, vàng. Carotenoid là một mạch hydrocabon dài gồm 40 nguyên tử cacbon và 2 vòng cuối [23]. Hai loại carotenoid được tìm thấy trong tự nhiên: ß – caroten, dẫn xuất oxy hoá của caroten như là lutein, violaxanthin, neoanxanthin, và zeanxanthin, được biết như là xanthophylls. Từ hàng trăm hợp chất carotenoid hiện diện trong tự nhiên, chỉ 50 có hoạt tính sinh học và chúng có thể được chia thành 2 nhóm, tiền vitamin A và không tiền vitamn A. Vitamin A có vai trò quan trọng cho sự phát triển, duy trì một 7
22. loạt biểu mô, tái sản xuất hệ thống miễn dịch, và đặc biệt trong vòng tái sinh tế bào tiếp nhận kích thích ánh sáng của thị giác. Carotenoid được biến đổi thành vitamin A khi cơ thể cần. Tiền vitamin A được tìm thấy trong lá xanh đậm hoặc vàng cam. Những màu tối hơn được liên kết với tiền vitamin này cao hơn.Từ những hợp chất không enzyme, với vai trò chống oxy hoá, một số chất khoáng, vitamin, carotenoid, và tannin có thể bị tách ra. Cả hai carotenoid làtiền vitamin A và không tiền vitamin A, như là lutein, zeaxanthin, và lycopene, có tác động ngăn ngừa ung thư. Từ những hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng này, sự ngăn chặn bệnh tậtbị tách ra nơi mà các gốc tự do đóng vai trò chủ chốt như trong bệnh xơ vữa động mạch, đục thủy tnh thể, Carotenoid là hợp chất kỵ nước, ưa dầu mỡ, không tan trong nước và tan trong các dung môi như acetone, alcohol và chloroform. Bởi vì carotenoid là chất màu tan trong chất béo phổ biến trong tự nhiên, chúng có ích bởi màu của chúng [23] 8
23. Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của carotenoid (a) xanthophylls; (A) zeaxanthin, (B) lutein, (C) beta – cryptoxnthin, (D) astaxanthin; (b) Carotenes; (E) neurosporene, (F) lycopene, (G) ß – carotene, (H) α – carotene [Reference: Britton et al] 1.2.2. Astaxanthin Astaxanthin (3,3’ – dyhydroxy – ß – carotene – 4,4’ – dione) với công thức hoá hoc là C40H52O4, là chất màu đỏ, làm thay đổi màu của tôm hồng, tôm hùm, cua, các loài nhuyễn thể và giáp sát khác [28]. Ở nhiều loài động vật không xương sống, đặc biệt là ở động vật giáp xác, màu sắc rực rỡ ở lớp mô phía ngoài, của máu, 9
24. trứng và cơ thịt dưới da là kết quả của sự tương tác giữa carotenoid với protein. Loại carotenoid thường kết hợp với protein là ketocarotenoid, trong đó thường gặp nhất là astaxanthin và các hợp chất có chứa gốc này. Astaxanthin có khung cấu tạo gần giống ß – carotene nhưng tính chất hoá hoc lại khác nhau, nó có tính chống oxy hoá mạnh hơn nhiều các chất chống oxy hoá khác như ß – caroten và thậm chí cả α – tocopherol [21]. Astaxnthin là chất màu được tìm thấy ở động vật sống dưới nước, như là tôm hùm, cua, tôm. Một sự quan tâm trong sử dụng astaxanthin cho nuôi trồng cá và gia cầm được phát triển, chất màu này không tổng hợp bởi động vậtvà phải cho thêm vào khẩu phần ăn nhằm mục đích cómàu hấp dẫn để tiêu thụ. Xanthophyll này có tính chống oxy hoá gấp 10 lần ß - carotene và 500 lần vitamin E. Ngoài ra, chất màu này được xem là quan trong trong việc phòng ngừa vàchữa bệnh với đặc tính chống oxy hoá và chống lại gốc tự do. Trong sự sát nhập của astaxnthin trong thức ăn cho nuôi trồng thuỷ hải sản là kết quả của sự tạo màu cho cá hồi và loài giáp sát, vì vậy sự hiện diện của nó trong tôm, tôm hùm, cua vàđộng vật có vỏ xương ngoài. Trong tự nhiên, astaxanthin được tìm thấy nhiều ở tảo Haematococus [20]. Astaxanthin tồn tại dưới 3 dạng: sterified, phân tử tự do, phân tử phức tạp với protein, carotenoprotein. Protein này thường tồn tại ở loài giáp sát [17]. Trong vỏ của loài giáp sát, lớp protein đan xen với lớp chitin nơi mà chúng cùng tồn tại [29]. Trong tự nhiên, astaxanthin thường kết hợp với các phân tử khác nhau. Nó thường tồn tại ở dạng phức chất với protein và tạo ra nhiều màu sắc ở nhiều động thực vật khác nhau. Ví dụ, nó là chromophore trong sắc xanh biển, xanh lá và vàng của tôm hùm. Có nhiều trường hợp, astaxanthin chỉ đơn giản hoà tan trong dầu mỡ của các phân tử phức tạp như lipoprotein ở trứng, cũng có thể kết hợp với các phân tử acid béo chẳng hạn bằng một liên kết hoá học thật sự và tạo thành ester [15]. Đúng với bản chất màu của carotenoid, astaxanthin được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược, mỹ phẩm, và công nghiệp thức ăn động vật. Ngoài ra, chúng được sử dụng rộng rãi trong việc tạo màu, làm bền vững thực phẩm bởi vì hoạt động của chúng như vitamin A và hoạt tính sinh học của chúng tốt cho sức 10
25. khoẻ, như là cũng cố hệ thống miễn dịch, giảm nguy cơ bệnh thoái hoá, đặc tính chống oxy hoá 1.2.3. Carotenprotein 1.2.3.1. Sự tồn tại của carotenoprotein: Trong các loài động vật biển không xương sống, ketocaroten thường tồn tại ở dạng phức chất carotenoprotein. Phức chất này là sự kết hợp giữa caroenoid và protein, lipo-protein hoặc glycoprotein. Mặt khác, carotenprotein kết hợp chặt chẽ với các chất thuộc cấu trúc lớp da như: chitin, calcium cacbonate [8]. Sự tồn tại của carotenoprotein là nguyên nhân thay đổi sự hấp thu quang phổ, do đó phức chất thường có màu tía, màu lam, màu xanh lục, tương phản lại màu vàng và màu cam của carotenoid ở dạng tự do. Nhóm keto của carotenoid thường là astaxanthin hoặc cantaxanthin [27]. Carotenoprotein tồn tại 2 dạng chính: (1) carotenoid liên kết với lipoprotein hoặc glycoprotein, (2) carotenoid liên kết với một protein hay một glycoprotein. Phản ứng giữa các nhóm 4 và 4’ keto trong các vòng đầu mạch của axtaxanthin với các nhóm chức của protein là điều kiện tiên quyết để hình thành phức carotenoprotein giữa astaxanthin và protein. 1.2.3.2. Bản chất và tính chất chung của carotenoprotein Bản chất của carotenoprotein Qua một số protein thu được khi tinh chế carotenoprotein, người ta thấy rằng, các protein có mặt trong phân tử này thuộc nhiều nhóm khác nhau. Crustacyanin, loại protein màu xanh biển ở vỏ tôm hùm được tách ra sau khi loại nhóm carotenoid dường như là một protein thuần tuý chỉ gồm các gốc amino acid tạo thành. Ngoài ra, còn có cả thành phần carbonhydrate có chứa hexosamin và gốc đường không chứa nhóm amino chiếm 4,8% trọng lượng phân tử [16]. Tính chất chung của carotenoprotein Carotenoid và carotenoprotein, cả hai dều được xem là chất màu tự nhiên và có hoạt tính sinh học như: chống oxy hoá, kháng khuẩn [26]. Phức hợp carotenoprotein tan trong nước và có tính bền vững. Trong một vài trường hợp, màu 11
26. sắc của nó bền đến về năm trong không khí ở điều kiện nhiệt độ phòng. Các carotenoid liên kết với protein ít bị oxy hoá hơn so với chúng ở dạng tự do. Carotenoid ở dạng tự do có màu vàng, cam hoặc đỏ. Tuy nhiên, trong cơ thể những loài động vật biển không xương sống, các phức hợp carotenorotein tạo nên nhiều màu khác nhau như: xanh lá cây, xanh dương và tía. Trong các loài giáp xác thuỷ sản có chứa 3 loại crustacyanine là α,ß vàγ- crustacyanine. Cả 3 loại này đều có astaxanthin và ở dạng nhóm liên kết. Trong đó, astaxanthin thường liên kết với các phân tử protein tạo thành phức hợp α- crustacyanin, hấp thụ cực đại ở bước sóng (λmax = 628 nm), có màu xanh đen đặc trưng thường thấy ở các loài thuỷ sản sống. Dưới tác dụng của nhiệt, liên kết trên bị phá huỷ và giải phóng astaxanthin tự do có màu ỏđ cam (λmax = 480 nm). Cấu trúc của carotenoid cũng quyết định các chức năng sinh học của chúng, trong đó phần lớn các carotenoid có mạch 40 carbon liên kết với các nhóm chức chứa oxy khác nhau. Trong phế liệu tôm, carotenoid chủ yếu là astaxanthin (trên 95%), thuộc nhóm chất tetraterpenoid, là sắc tố màu đỏ cam. Tương tự như carotenoid khác, nó có tính phân cực thấp và tan tốt trong dầu mỡ [9]. 1.2.3.3. Một số phương pháp chiết rút carotenoprotein từ phế liệu chế biến động vật giáp xác Phế liệu chế biến các loài giáp xác như tôm, cua, ghẹ, tôm hùm thường bao gồm một số thành phần như: các muối kim loại (15 – 35%), protein (25 – 50%), chitin (25 – 35%), lipid và chất màu. Đã có rất nhiều nghiên cứu của các tác giả khác nhau về thành phần carotenoid và carotenoprotein trong nguồn phế liệu này. Chất chủ yếu tạo nên màu của tôm cua là astaxanthin ở dạng tự do hay ester hoá với hàm lượng thường dao động trong khoảng 119 và 148 μg/g, ngoài ra còn có một lượng nhỏ các chất màu khác như lutein, zeaxanthin và astacene [25]. Hiện nay, xu hướng làm thế nào có thể sử dụng chất màu này đang được các chuyên gia quan tâm, chủ yếu là astaxanthin đang bị bỏ phí trong phế liệu chế biến. Các số liệu đã được công bố đã chứng tỏ, hàm lượng chất màu trong phế liệu này thường thấp, ví dụ astaxanthin thường tồn tại với lượng nhỏ hơn 1000 μg/g 12
27. nguyên liệu thô. Điều này cũng cho thấy, để thu được lượng màu đáng kể thì cần một lượng lớn phế liệu. Vì vậy, trong sản xuất thức ăn cho động vật, người ta thường bổ sung phế phẩm này. Tuy nhiên, phương pháp này không đạt hiệu quả cao và không thể áp dụng cho người cần bổ sung astaxanthin vào chế độ ăn. Bên cạnh đó, quá trình sấy khô phế liệu với tác nhân nhiệt tác động mạnh mẽ lên chất màu này, chúng sẽ bị biến đổi do quá trình oxy hoá. Cùng với đó, việc còn tồn tại chitin và tro trong phế liệu rất cao sẽ làm cá khó tiêu hoá, do đó, việc bổ sung phế phẩm này vào thức ăn cho cá cần phải được xem xét kỹ lưỡng. Nhiều công trình đã nghiên cứu nhằm khắc phục nhược điểm trên khi bổ sung nguyên phế phẩm. Một trong những hướng thử nghiệm là ủ chua, tức là xử lý phế liệu bằng acid hữu cơ hoặc vô cơ, việc này có thể giúp ngăn cản việc xâm nhập của vi sinh vật và tách màu được tốt hơn. Bên cạnh đó, có một số nghiên cứu chiết rút carotenoid trong dung môi chất béo như: dầu dừa, dầu đậu nành, hướng dương, dầu cọ Ngoài ra, trên thế giới cũng đã có những nghiên cứu ứng dụng enzyme thương mại vào việc tách chiết astaxanthin. Từ những dẫn chứng trên cho thấy, carotenoprotein là một chất có tiềm năng trong việc sử dụng làm thực phẩm chức năng cho người và trong chăn nuôi, đặc biệt là carotenoprotein chiết rút từ động vật giáp sát giàu astaxanthin ở dạng bền vững. Sản phẩm này không chỉ mang lai lợi ích cho con người về sức khoẻ mà ngay cả về kinh tế. Bên cạnh đó, việc tách chiết astaxanthin từ nguồn phế liệu đầu tôm cũng phần nào giải quyết được vấn đề chất thải rắn và tạo ra giá trị gia tăng. 1.2.4. Các ứng dụng astaxanthin: 1.2.4.1. Ứng dụng trong y khoa: Chất chống oxy hoá mạnh: tác dụng của astaxanthin đã được chứng minh có khả năng tăng cường lưu lượng máu, giảm các stress oxy hóa ở những người nghiện thuốc lá và người thừa cân, béo phì. Một nghiên cứu so sánh giữa astaxanthin và các carotenoid khác đã chỉ ra rằng hợp chất này cho thấy hoạt tính chống oxy hóa rất mạnh chống lại các các gốc tự do [11]. 13
28. Giảm nguy cơ mắc ung thư: do đặc tính chống oxy hóa mạnh, người ta đã tiến hành rất nhiều nghiên cứu về tác dụng của astaxanthin trong điều trị nhiều loại ung thư. Theo một nghiên cứu, astaxanthin có lợi ích cả trong thời gian ngắn và lâu dài đối với bệnh ung thư vú, bao gồm việc ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư [11]. Tốt cho tim mạch: các nhà khoa học cũng đồng thời thực hiện những nghiên cứu về tác dụng của astaxanthin đối với sức khỏe tim mạch. Một nghiên cứu vào năm 2006 đã đánh giá hiệu quả của astaxanthin trên chuột mắc chứng cao huyết áp, kết quả cho thấy astaxanthin giúp cải thiện mức elastin và độ dày của thành động mạch. Người ta còn cho rằng astaxanthin có thể giúp phòng các bệnh lý tim mạch và hạ cholesterol máu, tuy nhiên vẫn chưa có đủ bằng chứng để xác nhận những ý kiến trên [11]. Chữa bệnh đau khớp: astaxanthin trong tương lai có thể trở thành một liệu pháp đầy hứa hẹn trong điều trị chứng đau khớp như trong bệnh viêm khớp dạng thấp (đây là ộm t căn bệnh có ảnh hưởng đến 1 trong tổng số 5 người Mỹ) và hội chứng ống cổ tay. Tuy nhiên, ý kiến này vẫn còn gây nhiều tranh cãi. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng astaxanthin có thể giúp giảm các triệu chứng đau và sưng viêm trong bệnh viêm khớp [11]. 1.2.4.2. Ứng dụng trong thức ăn nuôi trồng thuỷ hải sản Ngăn ngừa Hội chứng màu xanh ở tôm: một nghiên cứu đã chỉ ra, khi bổ sung Astaxanthin với lượng 50 ppm cho tôm bị “Hội chứng màu xanh” sau 4 tuần thì tôm trở lại màu sắc bình thường của chúng. Khi phân tích mô từ các nhóm thử nghiệm xác nhận rằng với những con tôm bị bệnh được bổ sung Astaxanthin, hàm lượng Carotenoid tăng 318%; nhóm còn lại không bổ sung Astaxanthin, chỉ dùng thức ăn thị trường thì sự gia tăng Carotenoid chỉ có 14% và vẫn có “màu xanh” [6]. Nâng cao tỷ lệ sống của tôm: bổ sung Astaxanthin với lượng 100 ppm sẽ làm tăng tỷ lệ sống của ấu trùng tôm lên 91% sau 4 - 8 tuần. Bổ sung 2% nguồn Carotenoids bằng ớt bột với thức ăn tươi cũng giúp cải thiện đáng kể tỷ lệ sống của 14
29. ấu trùng Zoea 2. Bổ sung Astaxanthin ở mức 50 mg/kg thức ăn giúp tăng sản lượng trứng ở tôm sú. Với 150 ppm Astaxanthin cho tôm bố mẹ, cải thiện đáng kể chất lượng Nauplii và tỷ lệ sống Zoea [6]. 1.3. Enzyme protease 1.3.1. Giới thiệu chung về enzyme protease Enzyme protease thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho các quá trình thỷ phân các liên kết peptide (-CO – NH - ) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phâ bố rất rộng rãi trên nhiều đối tương từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa) và động vật (gan, dạ dày bê ). So với protease động vật và thực vật, protesae vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm những enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách dưới dạng tinh thể đồng nhất [4]. 1.3.2. Phân loại proease Protease được chia thành 2 loại: endopeptidase và exopeptidase. Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân thành 2 loại: + Aminopeptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide. + Carboxypeptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide. Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4 nhóm: + Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ: chymotrysin và subtilisin. Nhóm 15
30. chymotrysin bao gồm enzyme động vật như: chymotrysin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm 2 loại enzyme vi khuẩn: subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Các serineproteinase thường hoạt động ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. + Cysteine protease: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài rotein động vật và proteinase ký sinh chung. Các cystein proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. + Aspartic proteinase: hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepepsin, renin. Các asparrticproteinase có chứa nhóm cacboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. + Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt động giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. Ngoài ra, proteinase được phân loại một cách đơn giản thành 3 nhóm: + Protease acid: pH 2 – 4 + Protease trung tính: pH 7 – 8 + Protease kiềm: pH 9 – 11 1.3.3. Tính chất chung của enzyme Enzyme tan trong nước, khi tan tạo thành dung dịch keo [5]. Chúng cũng tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ có cực khác [5]. Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính thì mất khả năng xúc tác [5]. 16
31. 1.3.4. Yếu tố ảnh hưởng hoạt độ enzyme 1.3.4.1. Ảnh hưởng của nông độ enzyme: Khi thừa cơ chất thì nồng độ enzyme tăng, vận tốc tăng. Khi nồng độ enzyme bão hoà với nồng độ cơ chất thì nồng độ enzyme tăng, vận tốc không thay đổi [3]. 1.3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất gọi là nhiệt độ tối ưu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 – 500C. Nhiệt độ tối ưu của các enzyme khác nhau hoàn toàn. Một số enzyme khác có nhiệt độ phản ứng tối ưu ở 600C, một số khác có nhiệt độ tối ưu ở 00C, thậm chí có một số enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis lại hoạt động mạnh ở 900C [3]. Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm. Khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính. Ngược lại, ở nhiệt độ 00C enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu. Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo vệ. Khi nhiệt độ cao thường gây cho enzyme mất hoạt tính. Phản ứng vô hoạt enzyme dưới tác dụng của nhiệt độ thường biểu diễn thứ bậc một. 1.3.4.3. Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme: pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme. Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên, cũng có nhiều enzyme hoạt động ở pH acid yếu. Một số khác lại hoạt đông ở pH kiềm và cả pH acid. Người ta thường sử dụng ảnh hưởng của pH để điều hoà 17
32. phản ứng trong bảo quản, chế biến lương thực, thực phẩm, trong tuyển chọn giống vi sinh vật [3]. 1.3.4.4. Ảnh hưởng của chất kìm hãm Các chất kìm hãm hoạt đông của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giả hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hoá học, cấu tạo hoá học và tính chất vật lý của chúng. Các chất kìm hãm hoạt động của các enzyme bao gồm các ion, các phần tử vô cơ, các chất hữu cơ và cả protein. Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào vi sinh vật. Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng giữa enzyme và các chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được trạng thái cân bằng [3]. Chất kìm hãm cạnh tranh: Các chất kìm hãm cạnh tranh là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch. Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Khi đó, chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động. Nếu chất kìm hãm đã chiếm được vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động thì cơ chất sẽ không còn cơ hội tiếp cận trung tâm này. Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và trung tâm hoạt động làm giảm số lượng các enzyme kết hợp với cơ chất. Kết quả hoạt động của enzyme sẽ giảm [3]. Vì có cấu trúc không gian giống nhau, nên các chất cạnh tranh và cơ chất đều có xu hướng chiếm vị trí trong trung tâm hoạt động. Vận tốc phản ứng lúc này phụ thuộc vào hai yếu tố [3]:  Phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và nồng độ chất cạnh tranh  Phụ thuộc vào ái lực giữa cơ chất và chất cạnh tranh với ezyme. Chất kìm hãm không cạnh tranh: Nếu như trong cơ chế kìm hãm cạnh tranh, các chất kìm hãm chiếm trung tâm hoạt động của enzyme thì trong cơ chế kìm hãm không cạnh tranh, chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt động của enzyme mà 18
33. là vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả sự kết hợp này, chất kìm hãm làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác. Vì thế, các chất kì hãm làm giảm hoạt động của enzyme. 1.3.4.5. Ảnh hưởng của chất hoạt hoá: Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme gọi là chất hoạt hoá enzyme. Các chất hoạt hoá enzyme có bản chất hoá học rất khác nhau. Chúng có thể là những anion, các ion kim loại từ ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng tuần hoàn, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp. Các chất hoạt hoá chỉ có tác dụng hoạt hoá ở một nồng độ nhất định. Vượt quá nồng độ chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme [3]. 1.4. Quá trình thuỷ phân protein 1.4.1. Khái niệm và bản chất của quá trình thuỷ phân protein: Khái niệm: thuỷ phân được định nghĩa là sự phản ứng với nước. Nó là một quá trình hoá học, cái mà phân tử bị cắt thành 2 phần bởi sự tham gia một phân tử nước. Một phân tử nhận một một ion H+ từ nước, nhóm khác thu nhận nhóm hydroxyl [4]. Bản chất: Bản chất của quá trình thủy phân protein: là quá trình phá vỡ các liên kết peptide khi có mặt của nước. Do liên kết peptide là liên kết bền, nên quá trình thủy phân cần có mặt chất xúc tác. Các tác nhân xúc tác gồm: + Tác nhân hóa học: acid (HCl) hay base (NaOH) + Tác nhân hóa sinh học: enzyme thủy phân protein (protease) 1.4.2. Các phương pháp thuỷ phân protein 1.4.2.1. Phương pháp hoá học: Đây là phương pháp thủy phân protein dưới xúc tác của acid mạnh (HCl, H2SO4) hay kiềm mạnh (NaOH) ở nhiệt độ cao để cắt đứt các liên kết peptide. Quá trình này cắt đứt tất cả các liên kết peptide trong protein cơ chất, đồng thời phá hủy một số acid amine [4]. 19
34. + Phương pháp acid Dùng HCl ở nồng độ 6 – 10N, nhiệt độ (100 – 1800C), thời gian thủy phân từ 24 – 48 giờ. Sau quá trình thủy phân, dung dịch được trung hòa đến pH về 6,5– 7. Ưu điểm của phương pháp này có thể nói đến là thời gian diễn ra thủy phân ngắn, pH thấp có thể ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn tồn tại các khuyết điểm. Do sử dụng acid nồng độ cao và nhiệt độ thủy phân cao nên một số acid amine bị phá hủy. Tryptophan bị phá hủy hoàn toàn, các acid amine như serine và threonine bị phá hủy một phần. Asparagine, glutamine bị chuyển thành dạng acid, hầu hết các vitamin bị phá hủy. Bên cạnh đó, muối được hình thành trong quá trình trung hòa nên kết quả là sản phẩm có hàm lượng muối đáng kể. Ngoài ra, chi phí năng lượng và thiết bịcao do phải chịu nhiệt và chống acid ăn mòn, bên cạnh đó,mức độ độc hại cao và gây ô nhiễm môi trường, có thể sinh ra độc tố 3-MCPD, 1,3-DCP. Thực tế, phương pháp này được sử dụng nhiều vì thời gian thủy phân nhanh, hiệu suất cao từ85– 90%, mùi vị sản phẩm ngọt và thơm ngon. + Phương pháp kiềm Sử dụng NaOH nồng độ từ 4– 8N, nhiệt độ 100 – 1100C, thời gian 24 – 48 giờ. Đối với phương pháp này, tryptophan được bảo toàn nhưng xảy ra hiện tượng racemic hóa làm giảm giá trị dinh dưỡng, tạo lysineolanine làm giảm lysine trong thành phần nên phương pháp này ít sử dụng trong công nghiệp. 1.4.2.2. Phương pháp hóa sinh học + Phương pháp vi sinh Đây là quá trình thủy phân protein nhờ xúc tác enzyme từ vi sinh vật. Các enzyme này có thể được tạo ra từ việc nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường riêng sau đó được đưa vào nguyên liệu giàu đạm như trong sản xuất nước tương hoặc tận dụng các enzyme có sẵn trong nguyên liệu ban đầu như sản xuất nước mắm. Thành phần thu được trong dung dịch bao gồm cả protein, pepton, peptide và acid amine [4]. 20
35. + Phương pháp enzyme Đây là phương pháp thủy phân protein trong điều kiện ôn hòa không yêu cầu nhiệt độ cao (thường 40 – 500C). Sử dụng nguồn enzyme từ các chế phẩm enzyme thương mại, có thể kết hợp nhiều loại enzyme với nhau để tăng hiệu suất thủy phân như: protease, cellulase, amylase. Phương pháp này hạn chế sử dụng hóa chất nên ít làm biến đổi acid amine, sản phẩm an toàn và giá trị dinh dưỡng không giảm nhiều, hiệu suất tối đa đạt 70%. Không giống như phương pháp acid, enzyme thủy phân liên kết peptide thường có tính đặc hiệu. Ví dụ: papain sẽ cắt liên kết peptide trong chuỗi gần kề với arginine, lysine và phenylalanine; pepsin cắt các chuỗi có phenylalanine hoặc leucine tham gia liên kết. Bên cạnh những ưu điểm kể trên, phương pháp này vẫn tồn tại khuyết điểm, đó là thời gian thủy phân kéo dài [4]. Trong phương pháp này, enzyme protease đóng vai tròthủy phân chính. Chúng phân cắt các liên kết peptide theo hai cách (exopeptidase và endopeptidase). Vì vậy, tùy theo yêu cầu sản phẩm cuối cùng, mà có thể lựa chọn enzyme phù hợp [4]. Từ những mô tả của các phương pháp thủy phân trên, một nhận xét có thể được đưa ra là phương pháp thủy phân bằng tác nhân hóa học chỉ có thể rút ngắn thời gian thủy phân, nhưng lại làm ảnh hưởng rất nhiều đến chất lượng dịch thủy phân. Trái ngược lại, phương pháp thủy phân bằng tác nhân sinh học chỉ có mỗi khuyết điểm là thời gian thủy phân kéo dài, nhưng lại ít làm biến đổi thành phần hóa học dịch thủy phân, điều kiện thủy phân ôn hòa, dễ xảy ra. Vì vậy có thể nói phương pháp thủy phân bằng enzyme cho ra sản phẩm an toàn và đảm bảo được giá trị dinh dưỡng. 1.5. Các nghiên cứu tách chiết carotenoprotein trong và ngoài nước: 1.5.1. Các nghiên cứu trong nước: a) Nghiên cứu tách chiết và ứng dụng enzyme protease từ tôm sú Penaeus monodon vào chế biến thuỷ sản _ TS. Nguyễn Lệ Hà[12] 21
36. Trong nghiên cứu này, hỗn hợp đầu và vỏ tôm xay nhỏ 2 -5 mm được thuỷ phân bằng chế phẩm enzyme protease tôm sú trong môi trường Na2 – EDTA với các thông số ban đầu: tỉ lệ phế liệu: dung dịch Na2 – EDTA 0.5M pH 7 là 1:3, lượng muối ăn bổ sung 1%, dịch thuỷ phân được khuấy trộn đều sau mỗi nửa giờ. Quá trình thuỷ phân phế liệu đầu và vỏ tôm được thực hiện với enzyme CPE (được thu nhận từ đầu hoặc nội tạng tôm sú) với ba nồng độ 2; 3,5 và 5% ở các nhiệt độ 40, 50 ,60 và 65oC theo thời gian 0; 3; 6; 9;12;15 giờ. Và kết quả thu được là thuỷ phân đầu tôm ở nhiệt độ 53oC, thời gian 10 giờ ở nồng độ CPE 4,5% sẽ thu nhận carotenprotein với hàm lượng carotenoid là 0,7056mg/g. b) Trích carotenoprotein từ đầu tôm sử dụng acid vô cơ và acid hữu cơ _ Phạm Thị Đa Phượng, Nguyễn Công Minh, Nguyễn Thị Như Thường, Ngyễn Văn Hoà, Anil Kumar Anal, Trang Sĩ Trung.[8] Trong nghiên cứu này, các tác giả sử dụng HCl và HCOOH để làm tác nhân thuỷ phân. Đầu tiên, đầu tôm xay nhỏ được thuỷ phân với HCl ở các nồng độ khác nhau: 0,0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5% trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, ẫm u được thuỷ phân bằng cách cho HCCOH 0.3% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Thí nghiệm thứ hai để xác định thừi gian thuỷ phân. Mẫu được thuỷ phân với nồng độ được xác định ở thí nghiệm 1 trong thời gian 1; 2; 3; 4; và 5 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, ẫm u được thêm HCOOH 0.3% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Thí nghiệm thứ ba để xác định nồng độ HCCOH. Mẫu đầu tôm xay nhỏ được thuỷ phân ở nhiệt độ phòng. Dịch thu được từ nồng độ và thời gian thuỷ phân tối ưu từ thí nghiệm 1 và 2, mẫu được thuỷ phân với HCCOH ở các nồng độ khác nhau: 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1% trong 2 giờ ở nhiệt độ thường. Thí nghiệm bốn xác định thời gian thuỷ phân với HCOOH. Đầu tôm xay nhỏ được thuỷ phân ở nhiệt độ thường với nồng độ tối ưu thu được từ thí nghiệm 3 ở các thười gian khác nhau: 1; 2; 3; 4; 5 giờ ở nhiệt độ phòng. 22
37. Kết quả thu được: điều kiện tối ưu để thuỷ phân thu carotenoprotein từ đầu tôm là HCl 2% trong 1 giờ và sau đó thêm vào HCOOH 4% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Với điều kiện thủy phân này, lượng carotenoid thu được là 473,9 ppm. c) Chiết rút chế phẩm đạm giàu carotenoid từ đầu tôm thẻ chân trắng _ Phạm Thị Đan Phượng, Trần Thị Luyến. Tạp chí Khoa học – Công nghệ thuỷ sản số 1/2013 [10] Đạm giàu carotenoid được thu nhận bằng cách thuỷ phân dùng kết hợp 2 enzyme: Alcalase và Flavourzyme. Trong nghiên cứu này, đầu tôm được thuỷ phân tuần tự bằng enzyme Alcalase trước và Flavourzyme. Nguyên liệu được thủy phân bằng enzyme Alcalase với các nồng độ khác nhau từ 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% (w/w: khối lượng enzyme trên khối lượng đầu tôm) ở nhiệt độ 550C trong bể ổn nhiệt lắc đảo, thời gian là 2 giờ, ở pH tự nhiên (pH = 6,9) để xác định tỷ lệ Alcalase/nguyên liệu thích hợp. Để xác định ảnh hưởng của thời gian thủy phân, nguyên liệu được thủy phân bằng Alcalase với tỷ lệ Alcalase thích hợp đã được xác định ở thí nghiệm trên, ủ mẫu ở nhiệt độ 550C trong bể ổn nhiệt lắc đảo, thời gian thực hiện thí nghiệm là 1; 2; 3; 4; 5 giờ. Bất hoạt enzyme Alcalase ở nhiệt độ 850C trong thời gian 15 phút, sau đó làm nguội đến nhiệt độ 550C, tiếp tục thủy phân mẫu thí nghiệm bằng Flavourzyme 0,2% (w/w) trong bể ổn nhiệt lắc đảo ở 550C trong 2 giờ. Sau khi thủy phân bằng Alcalase ở điều kiện thích hợp đã xác định, nguyên liệu được tiếp tục thủy phân bằng Flavourzyme với các tỷ lệ khác nhau từ 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% (w/w) ở 550C trong 2 giờ để xác định tỷ lệ Flavourzyme/nguyên liệu thích hợp. Để xác định thời gian xử lý bằng Flavourzyme thích hợp, mẫu xử lý được xử lý bằng Flavourzyme với nồng độ thích hợp đã được xác định ở các khoảng thời gian khác nhau: 1; 2; 3; 4; 5 giờ ở 550C. Sau khi thủy phân tiến hành ép ểđ tách riêng phần dịch thu hồi chế phẩm đạm giàu carotenoid bằng phương pháp điểm đẳng điện kết hợp xử lý nhiệt có bổ sung chitosan theo Trang Sĩ Trung và cộng sự (2008). Cụ thể: dịch thủy phân chứa đạm giàu carotenoid được điều chỉnh pH về pH 4,3 - 4,5 bằng HCl 10% để kết tủa protein sau đó kết hợp gia nhiệt ở nhiệt độ 700C trong thời gian 10 phút và bổ sung chitosan ở nồng độ 100ppm. Việc chọn chế độ xử lý tối ưu 23
38. dựa trên hiệu suất thu hồi chế phẩm đạm giàu carotenoid và hàmợ lư ng protein và carotenoid chứa trong chế phẩm đạm giàu carotenoid. Chế phẩm đạm giàu carotenoid có thể chiết rút từ đầu tôm bằng việc xử lý kết hợp Alcalase và Flavourzyme ở điều kiện chiết rút thích hợp như sau: nhiệt độ 550C, pH tự nhiên, xử lý bằng Alcalase trước: tỷ lệ Alcalase/đầu tôm là 0,2% (v/w) trong 2 giờ; tiếp tục xử lý bằng enzyme Flavourzyme: tỷ lệ Flavourzyme/đầu tôm là 0,1% (w/w) trong 1 giờ để thu hồi chế phẩm đạm giàu carotenoid với hàm lượng protein và carotenoid cao. Hàm lượng carotenoid có trong bột carotenprotein thu được khi thủy phân phế liệu tôm ở điều kiện tối ưu này là 365,5 mg/kg. d) Tối ưu hoá quá trình trích ly astaxanthin từ vỏ tôm bằng dầu thực vật _ Lê Thị Thuỳ Nga [7] Điều kiện tối ưu để trích ly astaxanthin từ vỏ tôm sú đối với dung môi dầu mè là nhiệt độ: 92,2oC, thời gian: 169 phút, tỉ lệ dung môi : mẫu là 2,54:1; với lượng astaxanthin tối ưu trích ly đạt được là 39,82. Điều kiện tối ưu để trích ly astaxanthin từ vỏ tôm sú đối với dung môi dầu nành là nhiệt độ: 92,2oC, thời gian: 169 phút, tỉ lệ dung môi : mẫu là 2,56:1; với lượng astaxanthin tối ưu trích ly đạt được là 41. Điều kiện tối ưu để trích ly astaxanthin từ vỏ tôm sú đối với dung môi dầu cải là nhiệt độ: 92,2oC, thời gian: 169 phút, tỉ lệ dung môi : mẫu là 2,5:1; với lượng astaxanthin tối ưu trích ly đạt được là 36,03mg/kg. Trong ba loại dung môi khảo sát thì dung môi dầu nành cho hiệu suất trích ly astaxanthin tốt nhất. 1.5.2. Các nghiên cứu ngoài nước: a) Extraction of astaxanthin from giant tiger (Penaeus monodon) shrimp waste using palm oil: Studies of extraction kinetics and thermodynamic.[14] Carotenoid trong phế liệu tôm khô được trích ly bằng cách sử dụng dầu cọ ở nhiệt độ 50; 60 và 700C. Sau khi đạt nhiệt độ cần thiết thì cho 50g phế liệu tôm vào. Nồng độ carotenoid trong dầu cọ được đo bằng UV – 1200 tại λmax (482 nm). 24
39. b) Astaxanthin extraction from shrimp waste by lactic fermentation and enzymatic hydrolysis of carotenprotein complex – R.Armenta – Lospez, I.Guerrero L., and S.Huerta [24] Mẻ cấy vi khuẩn Lactobacillus làm giảm pH hiệu quả nhất sau 48 giờ lên men đạt được pH 4,0. Năng suất trích ly cao nhất thu được với ether dầu mỏ : acetone : nước (15:75:10), cộng thêm BHA:BHT và đưa vào bóng tối để tránh oxy hoá. c) Extraction of carotenprotein from shrimp process wastes with the aid of trysin from atlantic cod. [13] Carotenprotein được thu nhận từ phế liệu tôm bằng cách sử dụng enzyme proteolytic thương mại. Trích ly carotenprotein với sự hiện diện tri – sodium EDTA. Trong nghiên cứu này, enzyme proteolytic được sử dụng trích ly carotenprotein dễ dàng. Enzyme thương ạm i được so sánh với các loại khác, và di – sodium EDTA và nước cất được sử dụng để so sánh với tri – sodium EDTA. d) Recovery of carotenoids from shrimp waste in organic solvents – N.M.Sachidra, N.Bhaskar, N.S Mahendrakar.[22] Trong nghiên cứu này, tác giả đã dùng dung môi hữu cơ để tách chiết carotenoid từ phế liệu tôm sú tại vùng Mangalore, Indo. Phế liệu được vận chuyển ở điều kiện -40C đến phòng thí nghiệm và được bảo quản lạnh ở - 200C cho đến khi sử dụng. Tác giả đã sử dụng các dung môi như: acetone, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, ethyl acetate, ehtyl metyl ketone, petroleum ether, và hexane để trích ly carotenoid trong phế liệu tôm sú và so sánh hiệu quả với việc sử dụng hỗn hợp dung môi acetone và hexane, cũng như hỗn hợp 50:50 isopropyl alcohol và hexane. Kết quả cho thấy được, khi dùng hỗn hợp isopropyl alcohol và hexane cho hiệu quả trích ly cao nhất (43,9µg/g phế liệu) Qua các kết quả của các nghiên cứu trong và ngoài nước ở trên, một điều được nhận thấy là với phương pháp trích ly chỉ thu được astaxanthin mà không thu được acid amin cũng như peptide mạch ngắn, ngược lại, với phương pháp thủy 25
40. phân bằng các tác nhân hóa học cũng như enzyme sẽ thu được cả chất màu carotenoid, acid amin và peptide mạch ngắn. Khi so sánh kết quả thu được giữa tác nhân hóa học và enzyme thì kết quả thủy phân với tác nhân là enzyme sẽ cho kết quả thu được chất màu cao hơn so với tác nhân hóa học. 26
41. CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu cứu: 2.1.1. Đầu tôm: Đầu tôm được thu tại bàn chế biến Nhà máy SX: XN KD CB thuỷ sản xuất khẩu Ngọc Sinh. Đầu tôm được thải ra trong quá trình chế biến, được thu gom, làm sạch và cấp đông ở nhiệt độ -20 0C. Sản phẩm được vận chuyển và bảo quản ở nhiệt độ -18oC cho đến khi tiến hành thí nghiệm. 2.1.2. Enzyme protease: Enzyme protease Tegalase R660L được mua tại Công ty TNHH thương mại hoá chất và nông sản Phương Trâm. Đặc tính của enzyme Tegalase R660L được công ty cung cấp theo bảng 2.1. Bảng 2.1: Đặc tính của enzyme protease Tegalase R660L Xuất xứ Tegarferm – Áo Tên thương mại Tegalase R660L Nhiệt độ hoạt động 15 – 700C Nhiệt độ tối ưu 50 – 600C pH hoạt động 7 – 10 2.1.3. Hoá chất Các hoá chất sử dụng chủ yếu để nghiên cứu: Hoá chất phân tích: NaOH, HCl, Acetone, Hexane, Na2SO4 khan, NaCl, TCA, Casein, Tyrosin, Albumin, Astaxanthin Thuốc thử: Folin, Brafford 2.2. Dụng cụ và thiết bị 27
42. Dụng cụ: Các dụng cụ được dùng trong nghiên cứu bao gồm: pipet, becher, bình ịđ nh mức, ống nghiệm, bình chiết quả lê và một số dụng cụ khác. Thiết bị dùng trong nghiên cứu: Bể điều nhiệt, tủ đông, tủ lạnh, cân 5 số và 4 số, tủ sấy Thiết bị ly tâm, thiết bị đo quang phổ,và một số thiết bị khác. 28
43. 2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Nội dung nghiên cứu Nội dung nghiên cứu tổng quát được thể hiện ở hình 2.1 Nội dung nghiên cứu  Hàm lượng protein Xác định thành phần  Hàm lượng lipid nguyên vật liệu  Hàm lượng astaxanthin  Xác ịđ nh hoạt độ enzyme Khảo sát điểm pH có Hàm lượng protein hoà thể tủa được nhiều tan trong dịch sau khi ly protein nhất tâm Nồng độ enzyme Khảo sát ảnh hưởng Hàm của các thông số công lượng a.a nghệ đến quá trình Nhiệt độ Hàm thuỷ phân đầu tôm sú lượng Penaeus monodon astaxnthi n Thời gian Xác thành phần của bột Hàm lượng astaxanthin carotenoprotein Hình 2.1. Nội dung nghiên cứu 29
44. 2.3.2. Bố trí thí nghiệm Phế liệu đầu tôm trước khi được đưa vào thủy phân được xử lý theo thứ tự trình bày trong hình 2.2 Đầu tôm Cắt nhỏ 1 – 2 cm Gia nhiệt 98oC, 10 phút Định lượng Bảo quản -18oC Hình 2.2. Chuẩn bị đầu tôm Chuẩn bị đầu tôm và thực hiện thuỷ phân: Đầu và vỏ tôm đông lạnh sẽ được cắt nhỏ 1 – 2 cm. Sau đó, nguyên liệu được gia nhiệt lên 980C trong 10 phút. Nguyên liệu được chia nhỏ theo từng phần 20g cho mỗi thí nghiệm và được bảo quản ở tủ đông. Mỗi thí nghiệm, ta sẽ lấy từng phần nhỏ, bổ sung nước cất tỷ lệ 1:3, nâng nhiệt độ nguyên liệu lên nhiệt độ cần thuỷ phân: 45; 55 và 650C. Sau đó, bổ sung enzyme theo từng nồng độ: 5%; 8%; 11%. Trong thời gian thuỷ phân: 0h; 3h; 6h; 9h; 12h hỗn hợp được khuấy đảo cứ 30 phút 1 lần để enzyme có thể tiếp xúc đều nguyên liệu. Hỗn hợp sau khi thuỷ phân được lọc qua vải thô, bổ sung HCl 10% vào đưa dịch sau thuỷ phân về pH: 4; 4,5; 5; 5,5; 6. Sau đó, hỗn hợp được để lắng lạnh 4oC trong 2 giờ. Bột nhão carotenprotein thu nhận bằng các ly tâm 40 phút ở 4,000 vòng/phút, sau đó bột nhão được cho vào tủ đông để tách bớt nước. 30
45. 2.3.2.1. Bố trí nghiệm xác định điểm pI Đầu tôm sau xử lý Bổ sung nước cất với tỉ lệ đầu tôm :nước 1:3 (w/w) Nâng nhiệt lên nhiệt độ thuỷ phân (450C) Bổ sung enzyme Protease 5% Thuỷ phân trong thời gian 30 phút Lọc qua vải thô Kết tủa bằng HCl10% ở các giá trị pH 4 4,5 5 5,5 6 31
46. 0 Lắng lạnh 4 C trong 2 giờ Ly tâm 4,000 vòng/phút, 40 phút Thu dịch thuỷ phân Xác định hàm lượng protein hoà tan Kết luận về điểm đẳng điện của dịch thuỷ phân Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điểm đẳng điện kết tủa của dịch carotenoprotein sau khi thuỷ phân. Đầu tôm sau khi xử lý sẽ được bổ sung thêm nước cất với tỷ lệ đầu tôm với nước cất là 1:3 (w/w). Hỗn hợp sẽ được gia nhiệt lên nhiệt độ thuỷ phân là 450C sau đó, enzyme được cho vào với nồng độ là 5% và khuấy đều để enzyme tiếp xúc với thịt đầu tôm. Hỗn hợp sẽ được giữ ổn định ở nhiệt độ này trong 30 phút để thực hiện thuỷphân. Sau khi thuỷ phân, lọc hỗn hợp qua vải thô để thu dịch. Tiếp đến, bổ sung HCl 10% để hạ pH đến các giá trị cần khảo sát, sau đó, đểyên hỗn hợp trong tủ lạnh với nhiệt độlà 40C trong 2 giờ. Kết thúc thời gian lắng, dịch sẽ được mang đi ly tâm 4,000 vòng/phút trong thời gian 40 phút để thu dịch trong. Dịch trong này được dùng để đo hàm lượng protein hoà tan trong chúng. Nếu hàm lượng protein trong dịch thấp nhất, ta sẽ chọn điểm pH đó là pI. 32
47. 2.3.2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ thuỷ phân phế liệu đầu tôm Đầu tôm sau xử lý Bổ sung nước cất Với tỉ lệ đầu tôm và nước 1:3 (w/w) Nâng nhiệt lên nhiệt độ thuỷ phân ở các nhiệt độ 450C 550C 650C Bổ sung enzyme Protease 5% (20UI) Thời gian thủy phân 0h 3h 6h 9h 12h Lọc qua vải thô 33
48. Xác ịđ nh hàm lượng protein hoà tan Tủa đẳng điện Ly tâm 4.000 vòng/phút, 40 phút Cân định lượng Xác ịđ nh hàm lượng astaxanthin Đánh giá nhiệt độ thuỷ phân Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thuỷ phân phế liệu đầu tôm. Đầu tôm sau khi được xử lý sẽ được bổ sung nước cất với tỉ lệ đầu tômvà nước cất là 1: 3(w/w). Mẫu sẽ được gia nhiệt lên các nhiệt độ thuỷ phân: 450C; 550C; 650C. Khi đạt đến nhiệt độ thuỷ phân, bổ sung enzyme nồng độ 5% và thuỷ phân trong các mốc thời gian 0h (30 phút); 3h; 6h; 9h; 12h. Kết thúc thuỷ phân, lọc qua vải thô lấy dịch trong. Dịch này sẽ được dùng để đo hàm lượng acid amin và peptide mạch ngắn. Ngoài ra, dịch còn được tủa bằng HCl đến pI, sau đó lắng lạnh 40C trong 2 giờ. Tiếp đến, ly tâm để thu bột nhão carotenoprotein nhằm xác định hàm lượng astaxanthin trong bột nhão. 34
49. 2.3.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ enzyme dùng thuỷ phân phế liệu đầu tôm Đầu tôm sau xử lý Bổ sung nước cất Gia nhiệt 550C Bổ sung enzyme Protease 5% (20UI) 8% (30UI) 11% (40UI) Thời gian thủy phân 0h 3h 6h 9h 12h Lọc qua vải thô 35
50. Tủa đẳng điện Xác ịđ nh hàm lượng protein hoà tan Ly tâm 4,000 vòng/phút, 40 phút Cân định lượng Xác ịđ nh hàm lượng astaxanthin Kết luận nồng độ enzyme tối ưu Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ enzyme dùng thuỷ phân phế liệu đầu tôm 36
51. 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu: Xác định hàm lượng protein hoà tan bằng phương pháp Bradford.(Bradford, 1976) Xác định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Anson cải tiến (Anson, M.L., (1938) J. Gen. Physiol. 22, 79-89) Xác định hàm lượng astaxanthin theo phương pháp Tolasa (Tolasa et al. 30 và cộng sự) Xác ịđ nh hàm lượng lipid theo phương pháp TCVN 4331 – 2001 Xác ịđ nh hàm lượng protein theo phương pháp Ref.FAO p .221 – 223, 1986 Xác ịđ nh hàm lượng tro theo phương pháp TCVN 5105:2009 2.3.4. Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê toán học ANOVA dựa trên phần mềm JMP 10 và đồ thị được vẽ trên phần mềm excel. 37
52. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Các thông số cơ bản của nguyên vật liệu dùng trong thí nghiệm 3.1.1. Biến đổi số đơn vị hoạt tính enzyme Hoạt tính enzyme được khảo sát qua các thời gian bảo quản. Theo hình 3.1 thời gian bảo quản hoạt tính enzyme giảm dần. Sau 1 tháng sử dụng, hoạt tính enzyme giảm 3.38% so với khi bắt đầu sử dụng, sau 2 tháng hoạt tính giảm 5,84% so với khi bắt đầu sử dụng và giảm 7,31% sau 3 tháng khi bắt đầu sử dụng. Theo kết quả khảo sát thì enzyme dạng lỏng có hoạt tính giảm nhanh hơn enzyme dạng bột. Shie – Jea Lin và cộng sự (2010) cho rằng hoạt tính enzyme vẫn giảm khi trữ đông ở 800C hoặc thấp hơn và protein enzyme bị biến tính bất thuận nghịch. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme : thời gian bảo quản và điều kiện bảo quản. Ở đây enzyme protease được bảo quản ở 40C, nhưng hoạt tính vẫn giảm. Do đó, nên sử dụng enzyme trong vòng 6 tháng kể từ ngày mở bao bì để đảm bảo hoạt tính enzyme vẫn ổn định và tiết kiệm được lượng enzyme cho vào. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này tận dụng lại enzyme của đề tài nghiên cứu trước, do đó thời gian bảo quản enzyme kéo dài làm cho hoạt tính enzyme giảm đáng kể. Vì vậy, trước mỗi thí nghiệm trong nghiên cứu này, enzyme luôn được xác định hoạt tính để đảm bảo nồng độ enzyme cho vào trước mỗi thí nghiệm và đảm bảo hoạt ổn định trong suốt tất cả các thí nghiệm. 38
53. 21 20.5 20 19.5 19 18.5 18 Hoạt độ(UI/ml) Hoạt 17.5 17 9 10 11 12 Tháng Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn hoạt độ enzyme theo thời gian bảo quản 3.1.2. Thành phần nguyên liệu Bảng 3.1. Thành phần nguyên liệu đầu tôm P.monodon (tính trên nguyên liệu khô) Ẩm (%) 79.81 ± 0.33 Protein (%) 12,2 Lipid (%) 1,29 Tro (%) 6,29 Astaxanthin (μg/g) 297,8 ± 2,33 Độ ẩm của phế liệu đầu tôm sú là 79.81%, độ ẩm này cao hơn gần 3% so với phế liệu đầu và vỏ tôm được thu từ tôm sú nuôi trồng tại vùng Cần Giờ, nhưng thấp hơn 6% so với độ ẩm của thịt đầu tôm sú được thu mua tại huyện Thới Bình, tỉnh Cà Mau. Nhìn tổng thể các hàm lượng protein, lipid của phế liệu đầu tôm dùng trong nghiên cứu này đều thấp hơn phế liệu đầu và vỏ tôm từ tôm sú được nuôi ở vùng Cần Giờ. Cụ thể, hàm lượng protein trong phế liệu đầu tôm được sử dụng 39
54. trong nghiên cứu này thấp hơn gần 22% so với phế liệu đầu và vỏ tôm từ tôm sú tại vùng biển Cần Giờ, tuy nhiên, hàm lượng protein trong phế liệu đầu tôm này không chênh lệch nhiều so với hàm lượng protein trong thịt đầu tôm từ tôm sú của huyện Thới Bình, Cà Mau, cùng với đó, hàm lượng này cao hơn so với hàm lượng protein có trong đầu tôm thẻ chân trắng tại Khánh Hòa. Với một lượng protein tương đối nhiều như thế, nếu chỉ dùng phế liệu này để sản xuất chitin và chitosan thì dường như ta đang bỏ phí một lượng dinh dưỡng cần thiết cho động vật và con người. Ngoài ra, khi sử dụng trực tiếp phế liệu đầu tôm này để sản xuất chitin và chitosan, có vẻ ta cần một lượng hoá chất khá lớn để loại bỏ phần protein này. Nếu như từ đầu, phế liệu đầu tôm này được thuỷ phân để thu hồi lượng protein này, một việc có thể thấy, ngoài việc thu protein mang lại thêm một giá trị kinh tế, còn cóthể giảm đi lượng hoá chất cho việc sản xuất chitin – chitosan và quá trình sản xuất sản phẩm này cũng diễn ra dễ dàng hơn, điều này nâng cao hiệu quả kinh tếhơn. Hàm lượng chất béo thấp hơn gần 3,5% so với hàm lượng chất béo trong phế liệu đầu và vỏ tôm tại vùng Cần Giờ (4,88%), và thấp hơn rất nhiều so phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng tại Khánh Hòa (10,61%).Sự khác nhau này có thể được giải thích bởi sự ảnh hưởng của giống loài, môi trường nuôi trồng và chế độ thức ăn khi nuôi tôm lớn, cũng có thể do thời điểm đánh bắt tôm và cách xử lý nguyên liệu tôm nguyên con để thu nhận đầu tôm phế liệu. 3.2. Điểm pI của dịch thuỷ phân Việc thu nhận carotenoprotein từ dịch thuỷ phân phế liệu đầu tôm được thực hiện nhờ phương pháp kết tủa ở điểm đẳng điện. Dịch lọc được đưa về pH đẳng điện nhằm thu hồi protein ở dạng carotenoprotein bằng dung dịch HCl10%. Nếu điều chỉnh pH cao hơn điểm đẳng điện có thể protein chưa bị kết tủa hoàn toàn, làm giảm hiệu suất quá trình thu nhận. Nếu điều chỉnh pH thấp hơn thì mức độ keo tụ có thể giảm xuống, lúc này có thể nồng độ H+ dư nên một số protein tích điện dương yếu nên đẩy nhau, liên kết giữa các protein yếu đi, tăng khả năng hydrat hoá, độ hoà tan của protein tăng lên và khó kết tụ hơn. Vì vậy, nghiên cứu đã tiến hành xác định điểm đằng điện của dịch thuỷ phân thu được bằng cách xác định hàm lượng protein 40
55. hoà tan của dịch trong sau khi ly tâm thu kết tủa carotenprotein, kết quả được trình bày trong hình 3.1. Dựa vào đồ thị cho thấy, hàm lượng protein hoà tan trong dịch trong cao nhất 0,1051 mg/g tại pH= 6 và thấp nhất 0.0336 mg/g tại pH= 4,5. Hàm lượng protein của dịch trong sau khi tủa carotenoprotein tại pH bằng 4, 5, 5,5 và 6 cao hơn tại pH= 4,5. Điều này được lý giải dựa vào sự thay đổi điện tích, khi pH= 4, lượng H+ trong dịch dư là cho protein tích điện dương nên các phân tử protein đẩy nhau, do đó, chúng không thể tủa xuống. Khi pH= 5;5,5 và 6, protein lúc này cùng tích điện âm nên chúng đẩy nhau, vì vậy, lượng protein tủa xuống thấp. Bên cạnh đó, khi pH= 4,5, phân tử protein trung hoà về điện, chúng hút lẫn nhau làm tăng khối lượng, dưới tác dụng của trọng lực chúng sẽ tủa xuống tách ra khỏi dịch. Từ đó, nhận định rằng, pH có tác dụng tủa protein nhiều nhất là 4,5. Giá trị pH này bằng giá trị pH đẳng điện trong nghiên cứu trên tôm sú Penaeus monodon được nuôi trồng tại Cần Giờ. Qua giá trị này cho thấy, thành phần protein trong nguyên liệu tôm sú Penaeus monodon được nuôi trồng tại 2 vùng khác nhau không có sự khác biệt. 0.12 0.1 0.08 0.06 (mg/g) 0.04 0.02 Hàm lượng protein hoà tan hoà protein lượng Hàm 0 4 4.5 5 5.5 6 pH Hình 3.2. Hàm lượng protein hoà tan của dịch trong thu nhận sau kết tủa carotenoprotein 41
56. 3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme prtotease Tegalase R660L 3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme protease Tegalase R660L Trong thí nghiệm này tiến hành khảo sát nhiệt độ thuỷ phân, với hoạt độ enzyme là 20UI, thời gian từ 0 giờ đến 12 giờ ở các nhiệt độ 450C, 550C và 650C. 3.3.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid amin trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi acid amin 3.3.1.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid amin thu được trong dịch thủy phân Theo hình 3.1 cho thấy, hàm lượng acid amin tăng qua các ố m c thời gian thuỷ phân tại các nhiệt độ khác nhau. Hàm lượng acid amin tăng đáng kể khi nhiệt độ tăng từ 450C lên đến 550C, sau thời gian thuỷ phân 30 phút hàm lượng acid amin tăng 0,316 mg/g, nhưng khi tăng nhiệt độ lên 650C thì hàm lượng acid amin giảm 0,0978 mg/g. Điều này có thể được lý giải dựa vào động học enzyme và nhiệt độ khuyến khích của nhà sản xuất (50 – 600C), khi nhiệt độ tăng lên vận tốc phản ứng tăng từ đó hàm lượng sản phẩm sau thuỷ phân tăng lên, nhưng khi nhiệt độ vượt qua ngưỡng cho phép, vận tốc phản ứng giảm đến mức triệt tiêu khi tiếp tục tăng nhiệt độ. Và đồ thị cho thấy, hàm lượng acid amin của dịch thủy phân đạt cao nhất sau khi thuỷ phân được 6 giờ ở cả 3 nhiệt độ 45, 55, 650C. 12.00 ) 10.00 8.00 6.00 55 phế liệu phế 4.00 65 (mg/g 2.00 45 Hàm lượng acid amin acid lượng Hàm 0.00 0 3 6 9 12 Thời gian (giờ) Hình 3.3. Hàm lượng acid amin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau. 42
57. 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 (mg/g phếliệu) (mg/g 1.00 0.50 Hàm acid lượng Hàm amin 0.00 45 55 65 Nhiệt độ (0C) Hình 3.4. Hàm lượng acid amin của dịch thủy phân theo nhiệt độ ở thời gian thủy phân là 6 giờ 3.3.1.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi protein Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi acid amin theo thời gian thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau được trình bày ở hình 3.5 cho thấy, hiệu suất thu hồi acid amin tăng dần qua các mốc thời gian thủy phân từ 0 giờ đến 6 giờ và sau đó giảm dần ở cả 3 nhiệt độ. Bên cạnh đó, đồ thị còn cho thấy sau thời gian thủy phân 6 giờ, hiệu suất thu hồi acid amin là cao nhất. Ngoài ra, hiệu suất thu hồi acid amin luôn cao hơn khi thủy phân ở nhiệt độ 550C so với hiệu suất thu hồi acid amin khi phế liệu được thủy phân ở nhiệt độ 45 và 650C qua các thời gian thủy phân. Khi xét ở cùng thời gian thủy phân là 6 giờ, hiệu suất thu hồi acid amin tăng lên khi nhiệt độ thủy phân tăng từ 450C lên 550C và giảm khi nhiệt độ tiếp tục tăng lên 650C (Hình 3.6) 43
58. 40.00 35.00 30.00 25.00 i protein (%) proteini hồ 20.00 65oC 15.00 55oC t thu t 45oC suấ 10.00 u u 5.00 Hiệ 0.00 0 3 6 9 12 Thời gian thuỷ phân (giờ) Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi acid amin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau 18.00 16.00 14.00 i proteini 12.00 hồ 10.00 8.00 (%) t thu t 6.00 suấ 4.00 u u 2.00 Hiệ 0.00 45 55 65 Nhiệt độ thuỷ phân (oC) Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi protein ở các nhiệt độ thủy phân sau 6 giờ thủy phân Khi được so sánh với hàm lượng protein hòa tan thu nhận được bằng cách thủy phân phế liệu đầu và vỏ tôm sú bằng enzyme tách chiết từ đầu tôm thì cho 44
59. thấy, hàm lượng acid amin trong nghiên cứu này thấp hơn gần 22 mg/g phế liệu. Điều này có thể được lý giải bởi enzyme sử dụng khác nhau, sự có mặt của EDTA, nhiệt độ và sự tiếp xúc của enzyme với thịt tôm. Với hàm lượng acid amin thu được theo đơn vị mg/g ở trên được chuyển đổi thành phần trăm lần lượt như sau: 10,48%; 12,81%; 12,37%. Kết quả này thấp hơn rất nhiều so với nghiên cứu thu nhận carotenoprotein bằng enzyme trysin từ cá tuyết và dịch tụy của bò có sự bổ sung EDTA, thủy phân ở 4oC và pH= 7,7 và thời gian kéo dài gần 30 giờ trong nghiên cứu của A.Cano – Lopez, B.K. Simpson và N.F.Haard. Cụ thể trong nghiên cứu của A.Cano – Lopez, hàm lượng protein thu được với sự tham gia của enzyme trysin từ cá tuyết là trên 80%, với enzyme trysin từ tuyến tụy bò là trên 60%. Từ hai so sánh trên, có thể sự có mặt của EDTA và nhiệt độ thủy phân thấp đã hạn chế sự tổn thất acid amin trong dịch thủy phân. Kết quả xếp hạng theo xử lý ANOVA cho thấy, tại nhiệt độ 550C sau khi thuỷ phân được 6 giờ thì hàm lượng acid amin cao nhất. 3.3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng astaxanthin thu nhận trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi astaxanthin 3.3.1.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng astaxanthin thu được trong dịch thủy phân Các đường biểu diễn trên hình 3.7 cho thấy được xu hướng tăng giảm của hàm lượng astaxanthin qua các thời gian thuỷ phân ở các nhiệt độ thuỷ phân khác nhau. Hàm lượng astaxanthin tăng qua các ốm c thời gian từ 0 giờ đến 6 giờ và giảm khi thời gian thủy phân kéo dài ếđ n 9 giờ và 12 giờ ở cả 3 nhiệt độ thủy phân. Hàm lượng astaxanthin đạt cực đại sau 6 giờ thuỷ phân ở cả 3 nhiệt độ 45, 55, 650C với các giá trị lần lượt như sau: 11,44; 12,7; 10,31 μg/g.Và thông qua đồ thị biểu diễn ở hình 3.8 cũng cho thấy, hàm lượng astaxanthin thu được cao nhất ở 550C, cao hơn 45oC là 2,96 μg/g và 2,46 μg/g khi so với hàm lượng astaxanthin ở 650C. 45
60. 16.00 14.00 12.00 10.00 8.00 45 (µg/g) 6.00 55 4.00 65 2.00 Hàm lượng astaxanthin lượng Hàm 0.00 0h 3h 6h 9h 12h Thời gian thủy phân (giờ) Hình 3.7. Hàm lượng astaxanthin theo thời gian 14 12 10 8 6 4 2 Hàm lượng astaxanthin (µg/g) astaxanthin lượng Hàm 0 45 55 65 Nhiệt độ (0C) Hình 3.8. Hàm lượng astaxanthin sau 6 giờ thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau. 3.3.1.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi astaxanthin thu được trong dịch thủy phân Hiệu suất thu hồi astaxanthin được biểu diễn trong hình 3.9 cho thấy một xu hướng hiệu suất thu hồi astaxanthin tăng lên khi nhiệt độ tăng từ 450C lên 550C và giảm khi nhiệt độ tăng lên 650C. Xu hướng này được cụ thể qua các con số như sau: 46
61. khi thủy phân ở nhiệt độ 450C, hiệu suất thu hồi astaxanthin là 19,2%, ở 550C sẽ là 21,32% và 17,32% khi thủy phân ở 650C. Và ở đồ thị biểu diễn ở hình 3.10 chứng tỏ rằng, khi thủy phân ở nhiệt độ 550C sẽ cho hiệu suất thu hồi astaxanthin là cao nhất. 30.00 25.00 20.00 i astaxanthin i (%) 15.00 45oC hồ 55oC 10.00 t thu t 65oC suấ 5.00 u u Hiệ 0.00 0h 3h 6h 9h 12h Thời gian thuỷphân (giờ) Hình 3.9. Hiệu suất thu hồi astaxanthin qua các thời gian thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau. 30.00 25.00 20.00 15.00 i astaxanthin i (%) hồ 10.00 t thu t 5.00 suấ u u 0.00 Hiệ 45 55 65 Nhiệt độ thuỷphân (oC) Hình 3.10. Hiệu suất thu hồi astaxanthin sau 6 giờ thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau. Giá trị này thấp hơn nhiều so với giá trị 91,9 % hàm lượng astaxanthin của carotenprotein được chiết bằng enzyme protease từ Cacillus Licheniformis với sự có 47
62. mặt của Na3 – EDTA (Seung Hwan Lee). Và khi so sánh với giá trị hàm lượng astaxanthin được tách chiết bằng hỗn hợp enzyme trysin từ bò và cá tuyết ở 4oC với sự có mặt của 0,5M EDTA trong nghiên cứu của A.Cano – Lopez, B.K.Simpson và N.F.Haard, 80%. Do đó, có thể khi thuỷ phân với sự có mặt của EDTA hiệu suất thu hồi astaxanthin sẽ cao hơn rất nhiều. Kết quả xử lý số liệu trên ANOVA cho thấy nhiệt độ tối ưu để thuỷ phân là 55oC, ở nhiệt độ này, cả hai hàm lượng astaxanthin và hàm lượng acid amin đều cao hơn khi thủy phân ở hai nhiệt độ còn lại. 11.49 12.70 15.00 10.31 10.00 3.02 5.00 3.52 2.56 0.00 45 55 65 Hàm lượng acid amin (mg/g) Hàm lượng astaxanthin (μg/g) Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện hàm lượng astaxanthin và acid amin của dịch thuỷ phân sau 6 giờ với hoạt độ enzyme là 20UI ở các nhiệt độ khác nhau. 3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) protease Tegalase R660L đến quá trình thuỷ phân. Trong thí nghiệm này tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme ảnh hưởng đến quá trính thuỷ phân, với nhiệt độ thuỷ phân là 550C, thời gian từ 0 giờ đến 12 giờ. 3.3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) protease Tegalase R660L đến hàm lượng acid amin thu được trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi acid amin 48
63. 3.3.2.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) đến hàm lượng acid amin thu được trong dịch thủy phân Theo kết quả thí nghiệm thì hàm lượng acid amin tăng dần khi tăng hoạt độ enzyme lên từ 20UI lên 30UI và 40UI. Sau 3 giờ thuỷ phân, hàm lượng acid amin tăng lên 1,05, 1,512 và 0,856 mg/g lần lượt tương ứng với các hoạt độ 20UI, 30UI và 40UI. Trong đó, hàm lượng acid amin đạt cực đại 3,339 mg/g tại hoạt độ 40UI. Trong 6h đầu tiên, ở tất cả các hoạt độ enzyme hàm lượng acid amin tăng mạnh, 0,7661mg/g khi tăng hoạt độ enzyme từ 20UI lên 30UI và khi đầu tôm được thuỷ phân với hoạt độ là 40UI, hàm lượng acid amin tăng một lượng không đáng kể 0,0388 mg/g. Kết quả khi được xử lý ANOVA, hàm lượng acid amin của dịch thuỷ phân ở 30UI và 40UI sau 6 giờ không có sự khác biệt về mặt thống kê. 5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 20UI 2.00 30UI 1.50 40UI acid amin (mg/g) amin acid 1.00 0.50 Hàm lượng peptid mạch ngắn và và mạchngắn peptidlượng Hàm 0.00 0h 3h 6h 9h 12h Thời gian thủy phân (giờ) Hình 3.12. Hàm lượng acid amin theo thời gian ở các các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau Theo hình 3.13 cho thấy càng tăng hoạt độ enzyme thì thu được sản phẩm càng nhiều. Theo kết quả nghiên cứu thu được cho thấy sau 6 giờ phản ứng thì hàm lượng acid amin ứng với hoạt độ 20UI, 30UI, 40UI thu được là 3,4; 4,16; 4,2 mg/g. 49
64. Tuy nhiên, khi tăng hoạt độ enzyme từ 30UI lên 40UI thì hàm lượng acid amin tăng lên không đáng kể và không có sự khác biệt về mặt thống kê. Do theo thời gian phản ứng hàm lượng peptide mạch ngắn và hàm lượng acid amin tự do được giải phóng ra tạo thành một hỗn hợp ngăn cản sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, do đó, quá trình thuỷ phân vẫn tiếp tục diễn ra nhưng với tốc độ chậm. Theo kết quả khảo sát thì tại hoạt độ 30UI thu được lượng acid amin cao nhất. 4.5 4 3.5 ) u 3 2.5 phế liệ phế 2 g / 1.5 (mg 1 Hàm lượng acid amin amin acid lượng Hàm 0.5 0 1 1.5 2 2.5 20 30 40 Số đơn vị hoạt độ enzyme (UI) Hình 3.13. Hàm lượng acid amin sau 6 giờ thuỷ phân theo các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau 3.3.2.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) đến hiệu suất thu hồi protein 50
65. 20.00 18.00 16.00 14.00 i protein i 12.00 hồ 10.00 20UI 8.00 t thu thu t 30UI 6.00 40UI suấ 4.00 u u 2.00 Hiệ 0.00 0 3 6 9 12 Thời gian thuỷ phân (giờ) Hình 3.14. Hiệu suất thu hồi protein theo thời gian ở các các số đơn vị hoạt độ khác nhau 20.00 18.00 16.00 14.00 12.00 i protein (%) protein i 10.00 hồ 8.00 6.00 t thu thu t 4.00 suấ u u 2.00 0.00 Hiệ 20 30 40 Số đơn vị hoạt độ (UI) Hình 3.15. Hiệu suất thu hồi protein sau 6 giờ thủy phân ở các các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau 51
66. Các đường biểu diễn hiệu suất thu hồi acid amin được biểu diễn ở hình 3.14 cho thấy được xu hướng tăng giảm hiệu suất thu hồi acid amin qua các thời thủy phân khác nhau ở ba hoạt độ enzyme. Hiệu suất thu hồi acid amin tăng qua các ốm c thời gian thủy phân từ 0 giờ đến 6 giờ, khi kéo dài thời gian thủy phân ra 9 giờ và 12 giờ, hiệu suất thu hồi acid amin có chiều hướng giảm ở cả ba hoạt độ. Ngoài ra, đường biểu diễn ở hình 3.15 chứng tỏ hiệu suất thu hồi acid amin tăng mạnh khi hoạt độ tăng từ 20UI lên 30UI và tiếp tục tăng không đáng kể khi tăng hoạt độ enzyme lên 40UI. Các hoạt độ enzyme 20UI, 30UI và 40UI chuyển về nồng độ phần trăm so với mẫu lần lượt 5%, 8% và 11%. Kết quả khảo sát trong nghiên cứu này được chuyển về phần trăm lần lượt như sau: 12,37%; 15,16%; 15,31% và được so sánh với nghiên cứu chiết rút chế phẩm đạm giàu carotenoid từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng hai loại enzyme Alcalase và Flavourzyme. Kết quả cho thấy khi thủy phân với tỷ lệ enzyme Alcalase/ đầu tôm là 0,2% (v/w) trong 2 giờ thủy phân và tiếp tục xử lý với enzyme Flavourzyme/ đầu tôm là 0,1% (w/w) trong 1 giờ ở 550C, hàm lượng protein thu được là trên 67%. Kết quả thu được trong nghiên cứu này rất thấp so với kết quả nghiên cứu chiết rút chế phẩm bột đạm giàu carotenoprotein từ đầu tôm thẻ chân trắng. Điều này có thể được lý giải bởi enzyme sử dụng khác nhau và số lượng enzyme được sử dụng trong nghiên cứu. 3.3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzym) đến hàm lượng astaxanthin và hiệu suất thu hồi astaxanthin 3.3.1.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) đến hàm lượng astaxanthin thu được trong dịch thủy phân 52
67. 20.00 18.00 16.00 ) 14.00 u 12.00 10.00 20UI phế liệ phế 8.00 30UI g/g μ 6.00 40UI ( 4.00 Hàm lượng astaxanthin lượng Hàm 2.00 0.00 0h 3h 6h 9h 12h Thời gian thuỷ phân (giờ) Hình 3.16. Hàm lượng astaxanthin theo thời gian ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau Hàm lượng astaxanthin của dịch thuỷ phân ở các hoạt độ enzyme khác nhau được thể hiện ở hình 3.7 cho thấy, khi hoạt độ enzyme tăng từ 20UI đến 40UI thì hàm lượng astaxanthin tăng. Điều này được thể hiện cụ thể qua số liệu như sau: hàm lượng astaxanthin tăng 1,2659; 3,3515μg/g tương ứng khi hoạt độ enzyme tăng từ 20UI lên 30UI và từ 30UI lên 40UI sau thời gian thuỷ phân là 30 phút. Hàm lượng astaxanthin của dịch thuỷ phân sau 6 giờ đạt cực đại ở tất cả các hoạt độ. Sự gia tăng hàm lượng astaxanthin của dịch thuỷ phân sau 6 giờ khi tăng hoạt độ enzyme được cụ thể qua các con số như sau: khi hoạt độ tăng từ 20UI dến 30UI, hàm lượng astaxanthin tăng một cách mạnh mẽ, 5.0061 μg/g, và khi hoạt độ tăng từ 30UI đến 40UI, hàm lượng astaxanthin tăng không đáng kể, 0,1212 μg/g. Xu hướng trên được thể hiện bởi các đưởng biểu diễn trong hình 3.17. Từ đó, nhận định có thể đựơc đưa ra: khi tăng lượng enzyme thì hàm lượng astaxanthin tăng, tuy nhiên, khi nồng độ enyme tăng đến mức bão hoà với cơ chất thì hàm lượng astaxanthin tăng không đáng kể. Tuy khi tăng số đơn vị hoạt độ enzyme từ 30UI lên 53
68. 40UI thì hàm lượng acid amin và peptide mạch ngắn tăng, nhưng khi xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê ANOVA thì không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê giữa chúng. 20.00 g g / 18.00 µg 16.00 14.00 12.00 u) 10.00 8.00 phế liệ phế 6.00 ng astaxanthin ( astaxanthin ng 4.00 lượ 2.00 m m 0.00 Hà 20UI 30UI 40UI Số đơn vị hoạt độ enzyme (UI) Hình 3.17. Hàm lượng astaxanthin thu được trong bột nhão carotenoprotein từ dịch thủy phân sau 6 giờ thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau 3.3.1.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) đến hiệu suất thu hồi astaxanthin Các đường biểu diễn ở hình 3.18 cho thấy xu hướng tăng và giảm của hiệu suất thu hồi astaxanthin qua các thời gian thủy phân từ 0 giờ đến 12 giờ ở cả ba hoạt độ enzyme protease Tegalase R660L. Tương tự như chiều hướng của hàm lượng astaxanthin, hiệu suất astaxanthin tăng mạnh từ 0 giờ đến 6 giờ và sau đó giảm dần khi kéo dài thời gian thủy phân ở cả ba hoạt độ. Bên cạnh đó, hiệu suất thu hồi astaxanthin tăng mạnh khi tăng hoạt độ từ 20UI lên 30UI, và tăng không đáng kể khi tiếp tục tăng hoạt độ lên 40UI. Chiều hướng này được thể hiện bởi các đườngbiểu diễn trong hình 3.19. 54
69. 20.00 18.00 16.00 14.00 12.00 i asraxanthin i 10.00 20UI hồ (%) 8.00 30UI 6.00 t thu t 40UI 4.00 suấ 2.00 u u 0.00 Hiệ 0h 3h 6h 9h 12h Thời gian thuỷ phân (giờ) Hình 3.18. Hiệu suất thu hồi astaxanthin trong bột nahxo caroteinoprotein từ dịch thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau. 35.00 i i 30.00 hồ 25.00 20.00 t thu thu t 15.00 suấ u u 10.00 astaxanthin(%) 5.00 Hiệ 0.00 20UI 30UI 40UI Số đơn vị hoạt độ enzyme (UI) Hình 3.19. Hiệu suất thu hồi astaxanthin trong bột nhão carotenoprotein từ dịch thủy phân phân sau 6 giờ thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau. Các hoạt độ 20UI, 30UI và 40UI được chuyển về nồng độ phần trăm tương ứng: 5%, 8% và 11%. Trong khảo sát này, nồng độ enzyme được xem tốt nhất là 8%. Khi so sánh với các nghiên cứu khác, kết quả hàm lượng astaxanthin thu được trong khảo sát này thấp hơn. Trong nghiên cứu quá trình thuỷ phân thu nhận bột 55
70. carotenoprotein từ đầu và vỏ tôm bằng chế phẩm enzyme protease tách chiết từ đầu tôm sú, hàm lượng carotenoid thu được cao nhất khoảng 53% ở nồng độ enzyme là 4,5%. Còn hàm lượng astaxanthin trong nghiên cứu này đạt cao nhất 24,72% đối với nồng độ enzyme là 11% và 24,64% với nồng độ enzyme là 8%. Nồng độ enzyme dùng trong nghiên cứu này cao hơn so với trong nghiên cứu thủy phân phế liệu đầu và vỏ tôm bằng enzyme được tách chiết từ đầu tôm, nhưng hiệu suất thu hồi lại thấp hơn. Điều này có thể được giải thích bởi sự khác nhau về enzyme sử dụng trong hai nghiên cứu và sự có mặt hay không có EDTA. 14.68 14.72 15.00 6.34 10.00 3.02 5.00 3.70 3.73 0.00 20UI 30UI 40UI Hàm lượng acid amin (mg/g) Hàm lượng astaxanthin (μg/g) Hình 3.20. Hàm lượng acid amin và astaxanthin của dịch thuỷ phân sau 6 giờ với các số đơn vị hoạt độ khác nhau, 550C Từ việc phân tích trên, ở hoạt độ 30UI, hay nồng độ enzyme là 8% thì hàm lượng astaxanthin thu được trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi astaxanthin đều cao nhất. Và bên cạnh đó, kết quả ở hình 3.20 cho thấy rằng, khi đầu tôm được thuỷ phân với hoạt độ 30UI ở 550C sau 6 giờ, hàm lượng astaxanthin và acid amin đạt cao nhất. Từ đó, 30UI được coi là hoạt độ tối ưu để thuỷ phân đầu tôm. 56
71. 3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thuỷ phân Trong thí nghiệm này tiến hành khảo sát thời gian thuỷ phân, với hoạt độ enzyme là 30UI, nhiệt độ 550C. 3.3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng acid amin trong dịch thủy phân Nhìn vào đồ thị được biểu diễn ở hình 3.21, ta thấy chiều hướng thay đổi hàm lượng acid amin theo thời gian. Hàm lượng acid amin tăng khi thời gian thủy phân kéo dài từ 0 giờ đến 6 giờ và giảm khi tiếp tục kéo dài thời gian thủy phân. Ngoài ra, đồ thị có đỉnh tại điểm 6 giờ, điều này chứng tỏ rằng, sau khi thủy phân được 6 giờ hàm lượng acid amin thu được cao nhất. Cụ thể như sau: sau 30 phút thuỷ phân hàm lượng acid amin thu được trong dịch thuỷ phân là 1,60 mg/g phế liệu. Trong 3 giờ thuỷ phân đầu tiên, hàm lượng acid amin sinh ra rất nhiều, tăng thêm 1,51 mg/g phế liệu. Sau 6 giờ thuỷ phân, hàm lượng acid amin tiếp tục tăng, tuy nhiên lượng acid amin chỉ tăng thêm 1,0473 mg/g phế liệu. Thời gian tiếp tục tăng lên 9 giờ, hàm lượng acid amin lại giảm 0,3402 mg/g, và sau 12 giờ thuỷ phân hàm lượng acid amin tiếp tục giảm 1,26696 mg/g. Điều này có thể được lý giải bởi thời gian thuỷ phân kéo dài, sản phẩm thuỷ phân sinh ra ngăn cản enzyme tiếp xúc với cơ chất làm cho vận tốc phản ứng thuỷ phân không tăng đáng kể, bên cạnh đó, việc kéo dài thời gian thuỷ phân tạo điều kiện cho vi sinh vật sử dụng một phần sản phẩm thuỷ phân được taọ thành sản phẩm thứ cấp như NH3 bay hơi. Và thực tế trong thí nghiệm đã làm rõ điều này, dịch thuỷ phân sau 12 giờ bắt đầu có mùi hôi. 57
72. 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 (mg/g) 1.50 1.00 Hàm lượng acid amin acid lượng Hàm 0.50 0.00 0h 3h 6h 9h 12h Thời gian thuỷ phân (giờ) Hình 3.21. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng acid amin thu được khi thủy phân ở 30UI và 550C Trong kết quả nghiên cứu thu nhận carotenoprotein từ phế liệu đầu và vỏ tôm sú bằng enzyme tách chiết từ đầu tôm, thời gian thuỷ phân kéo dài đến 15 giờ và hàm lượng acid amin đạt của dịch thuỷ phân đạt cao nhất khoảng 40 mg/g, sau khi đầu và vỏ tôm thuỷ phân được 9 giờ. Và trong nghiên cứu thu carotenoprotein bằng cách thủy phân phế liệu tôm với tác nhân là enzyme trysin từ ca truyết của tác giả A. Cano – Lopez, thời gian thuỷ phân kéo dài đến gần 30 giờ. Từ đó, kết quả của nghiên cứu này so sánh với kết quả của 2 nghiên cứu nêu trên, ta thấy thời gian thuỷ phân trong nghiên cứu này ngắn hơn so với 2 nghiên cứu trên, và hàm lượng acid amin cũng thấp hơn. Nguyên nhân của sự khác nhau này có thể kể đến là loại enzyme sử dụng, sự có mặt hay không của EDTA và nhiệt độ. Trong nghiên cứu này, sử dụng enzyme protease thương mại, do đó, khi thủy phân đến 6 giờ, lượng acid amin và peptide mạch ngắn được tạo ra nhiều ngăn cản sự tiếp xúc enzyme với cơ chất, bên cạnh đó, lượng acid amin làm giảm pH của dịch thủy phân xuống thấp hơn pH tối ưu của của enzyme mà nhà sản xuất đề nghị. Do đó, sau 6 giờ thủy phân 58
73. lượng acid amin và peptide mạch ngắn tạo ra không nhiều nhưng một số acid amin lại bị bay hơi, nên hàm lượng acid amin giảm sau đó. 3.3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng astaxanthin. 20.00 18.00 16.00 14.00 12.00 10.00 (µg/g) 8.00 6.00 4.00 Hàm lượng astaxatnhin lượng Hàm 2.00 0.00 0h 3h 6h 9h 12h Thời gian thủy phân (giờ) Hình 3.22. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng astaxanthin thu được khi thủy phân ở 30UI và 550C Sự biến thiên hàm lượng astaxanthin theo thời gian được thể hiện trong hình 3.22 cho thấy, hàm lượng astaxanthin tăng dần qua các mốc thời gian, nhưng đạt đến một thời gian nhất định, hàm lượng astaxanthin giảm xuống. Bên cạnh đó, đồ thị còn cho thấy đỉnh cao nhất của hàm lượng astaxanthin là tại điểm 6 giờ của thời gian thủy phân. Ngoài ra, nhìn vào đồ thị, từ điểm 3 giờ đến 6 giờ thủy phân, đồ thị là một đoạn thẳng có độ dốc đứng, điều này chứng tỏ hàm lượng astaxanthin tăng mạnh từ 3 giờ thủy phân đến 6 giờ thủy phân. Và khi xử lý số liệu theo phương pháp thống kê ANOVA cho ta thấy hàm lượng astaxanthin sau 6 giờ thủy phân được xếp hạng cao nhất, điều này càng làm cho ta tin rằng 6 giờ là thời gian thủy phân tốt nhất. Sau khi thuỷ phân được 30 phút, lượng astaxanthin thu được là 3,02μg/g phế liệu, và sau 3 giờ thuỷ phân là 4,56 μg/g phế liệu. Hàm lượng astaxanthin tiếp tục tăng đáng kể sau 6 giờ thuỷ phân, lúc này lượng astaxanthin thu 59
74. được là 14,68μg/g phế liệu, tăng lên 10,11μg/g phế liệu khi so sánh với hàm lượng astaxanthin trong bột nhão carotenoprotein từ dịch thuỷ phân sau 3 giờ. Tuy nhiên, hàm lượng astaxanthin lại giảm xuống còn 8,85μg/g phế liệu khi thời gian thuỷ phân đạt đến 9 giờ, và 6,27 μg/g phế liệu đối với 12 giờ. Nguyên nhân của sự giảm của hàm lượng astaxanthin khi kéo dài thời thuỷ phân có thể do chúng bị phân huỷ dưới tác dụng của nhiệt độ. Lúc ban đầu, chúng còn liên kết mạnh mẽ với protein nên bền vững, thời gian thuỷ phân kéo dài, protein bị phân huỷ sâu sắc tạo thành các acid amin tự do và giải phóng astaxanthi tự do không bền, dễ bị phân huỷ. Theo kết quả nghiên cứu thu hồi carotenoprotein bằng cách thủy phân phế liệu tôm với tác nhân là enzyme trysin từ cá tuyết của tác giả A. Cano – Lopez, hiệu suất thu hồi astaxanthin tăng dần qua các giờ thuỷ phân và đạt cao nhất khi thời gian thuỷ phân gần 50 giờ. Trong nghiên cứu của A.Cano – Lopez được giữ ở nhiệt độ 40C, có lẽ việc khác nhau về nhiệt độ so với nhiệt độ trong nghiên cứu này làm nên sự khác biệt về thời gian thuỷ phân và hiệu suất thu hồi astaxanthin. Và theo kết quả nghiên cứu thu nhận bột carotenoprotein từ phế liệu đầu và vỏ tôm bằng enzyme tách chiết từ đầu tôm, hàm lượng cartenoprotein tăng dần qua các mốc thời gian, đạt cực đại sau 9 giờ thuỷ phân, và sau đó hàm lượng carotenoprotein giảm. Cũng như hàm lượng acid amin, thời gian thuỷ phân để thu hồi astaxanthin trong nghiên cứu này vẫn ngắn hơn thời gian thuỷ phân trong 2 nghiên cứu nêu trên. Việc này có thể được giải thích bởi sự khác nhau về loại enzyme dùng để thủy phân và nhiệt độ thủy phân. Trong nghiên cứu này sử dụng enzyme thương mại, nên có thể nó có hoạt tính mạnh hơn so với enzyme được tách chiết, do đó thời gian thủy phân ngắn hơn. 3.4. Tối ưu hoá nhiệt độ và thời gian thuỷ phân phế liệu đầu tôm để thu sản phẩm bột carotenoprotein Mục đích của việc tối ưu hoá quá trình thuỷ phân phế liệu đầu tôm là để tìm ra các thông số thời gian, nhiệt độ và nồng độ enzyme sử dụng cho kết quả thu nhận carotenoprotein với hàm lượng acid amin và astaxanthin cao nhất. Trong đó, astaxanthin được chú trọng hàng đầu vì giá trị kinh tế của nó cao hơn nhiều so với bột đạm. 60
75. 3.4.1. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân Căn cứ vào kết quả thực nghiệm, thông số được cung cấp bởi nhà sản xuất enzyme và các bố trí thí nghiệm ở các nghiên cứu khác, thí nghiệm thuỷ phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme protease Tegalase R660L với mục đích thu nhận bột carotenoprotein được xác định như sau: Các yếu tố cố định: + Phế liệu đầu tôm, cắt nhỏ 1- 2cm, gia nhiệt 980C trong thời gian 10 phút. + Tỉ lệ phế liệu: nước cất là 1:3 + Khuấy trộn đều dịch thuỷ phân sau mỗi nửa giờ. Các yếu tố biến đổi cần tối ưu: Các yếu tố biến đổi cần tối ưu bao gồm ba yếu tố: nhiệt độ, nồng độ enzyme protease Tegalase R660L và thời gian thuỷ phân. Dựa vào các phân tích kết quả ở mục 3.3, điều kiện biên của từng yếu tố được đề nghị theo bảng 3.3 Bảng 3.2: Khoảng biến thiên của các yếu tố cần tối ưu khi thuỷ phân đầu tôm Yếu tố cần tối ưu Ký hiệu Khoảng biến thiên Nồng độ (%) C 5 - 11 Nhiệt độ (oC) T 45 -65 Thời gian thuỷ phân (giờ) Tg 0 - 12 3.4.2. Xác định chỉ tiêu tối ưu của quá trình thuỷ phân Quá trình thuỷ phân phế liệu tôm được thực hiện với mục đích thu nhận bột carotenoprotein, thực chất là thu nhận astaxanthin và protein. Trong phế liệu đầu tôm, các astaxanthin thường không tồn tại riêng lẻ mà nằm trong phức với protein, khi protein bị thuỷ phân dưới tác dụng của enzyme, các peptide mạch ngắn và acid amin tự do được giải phóng ra, từ đó, astaxanthin bị kéo ra khỏi mạng lưới bao bọc 61
76. và hoà tan vào dịch thuỷ phân. Hàm lượng acid amin và peptide càng cao cũng tương ứng hàm lượng astaxanthin càng cao, tuy nhiên, khi quá trình thuỷ phân diễn ra sâu sắc thì phức chất carotenoprotein càng bị phá vỡ, giải phóng astaxanthin ở dạng tự do nên chúng dễ bị oxy hoá. Như vậy, quá trình thuỷ phân nhằm tới mục đích là thu nhận tối đa lượng astaxanthin AsP  max và acid amin AP  max, trong đó chỉ số được chú ý đến nhiều nhất là AsP (astaxanthin) vì chính chất này mang lại hiệu quả kinh tế cao cho sản phẩm hơn. 3.4.3. Thiết lập phương trình hồi qui của hàm lượng acid amin AP và xác định nhiệt dộ và thời gian tối ưu của quá trình thuỷ phân thu nhận carotenoprotein. Các số liệu sử dụng để thiết lập phương trình hòi qui AP là các số liệu thu được về ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ và thời gian đến hàm lượng acid amin AP trong bột carotenoprotein thu được đã trình bày ở mục 3.3. Số liệu sử dụng thoả mãn điều kiện là nằm trong khoảng biến thiên đã xác định. Trong nghiên cứu này sử dụng phần mềm JMP để xử lý số liệu, đưa ra phương trình hồi qui cho hàm mục tiêu AP. 3.4.3.1 Thiết lập phương trình hồi qui và phân tích ảnh hưởng của nồng độ, nhiệt độ và thời gian tới thu hồi hàm lượng acid amin Tương tự phương trình hồi qui 3.1, phương trình hồi qui của hàm lượng acid amin với 2 yếu tố là nồng độ và thời gian là phương trình đa biến bậc hai. Phân tích hồi qui đa biến bậc hai với hai biến độc lập C, T, C2, T2 và tương tác đôi C*T (Bảng 3.14 Phụ lục B) cho kết quả phương trình hồi qui dạng: AP= 4,2864796 + 0,2946429*T + 0,5160714*Tg + 0,0723214*T*Tg – 0,730102*T2 -1,394388*Tg2 (3.1) Giá trị p= 0,0087 trong phân tích ANOVA của phương trình này nhỏ hơn 0,01 chứng tỏ tồn tại mối quan hệ tương tác giữa hai yếu tố nhiệt độ và thời gian ở mức độ tin cậy 99%, R2= 0,95, chứng tỏ phương trình có thể giải thích cho 95% 62