›

Đồ án Nghiên cứu trích ly tinh dầu một số loại vỏ bưởi ở miền Nam Việt Nam và thử hoạt tính kháng khuẩn, bước đầu ứng dụng để sản xuất kem trị mụn từ tinh dầu bưởi

pdf 78 trang thiennha21 12/04/2022 11020
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu trích ly tinh dầu một số loại vỏ bưởi ở miền Nam Việt Nam và thử hoạt tính kháng khuẩn, bước đầu ứng dụng để sản xuất kem trị mụn từ tinh dầu bưởi", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_trich_ly_tinh_dau_mot_so_loai_vo_buoi_o_mie.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu trích ly tinh dầu một số loại vỏ bưởi ở miền Nam Việt Nam và thử hoạt tính kháng khuẩn, bước đầu ứng dụng để sản xuất kem trị mụn từ tinh dầu bưởi

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nghiên cứu trích ly tinh dầu một số loại vỏ bưởi ở miền Nam Việt Nam và thử hoạt tính kháng khuẩn, bước đầu ứng dụng để sản xuất kem trị mụn từ tinh dầu bưởi Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : T.S Nguyễn Ngọc Hồng Th.S Nguyễn Thị Thu Hương Sinh viên thực hiện : Phạm Quang Thắng MSSV: 1151110307 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành tốt đề tài này, ngoài sự cố gắng phấn đấu không ngừng của bản thân, em còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô và bạn bè, Em xin chân thành cảm ơn. Đặc biệt là cô Nguyễn Ngọc Hồng và Cô Nguyễn Thị Thu Hương đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, bổ ích trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cùng với quý thầy cô bộ môn công nghệ sinh học, cán bộ phòng thí nghiệm và ban lãnh đạo trường Đại học Công Nghệ đã nhiệt tình giúp đỡ em trong thời gian qua. Cùng với tất cả các bạn lớp 11dsh04 ngành công sinh học đã đóng góp những ý kiến bổ ích trong thời gian học tập và thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ những người đã tạo mọi điều kiện để em có được thành quả này. Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn, quá trình thực hiện đề tài còn gặp nhiều khó khăn nên không thể tránh khỏi những thiếu sót. Em xin chân thành đón nhận những ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn. Tp.HCM, ngày tháng năm Phạm Quang Thắng
  3. LỜI CAM ĐOAN  Em xin cam đoan bài khóa luận tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm. Các số liệu, những kết quả thí nghiệm trong báo cáo khoá luận là trung thực. Sinh Viên Thực Hiện Phạm Quang Thắng
  4. MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1 Tổng quan về Bưởi 5 1.1.1 Vị trí phân loại 5 1.1.2 Nguồn gốc 5 1.1.3 Đặc điểm thực vật 6 1.1.4 Thành phần hóa học 7 1.1.5 Một số giống bưởi tại Việt Nam 7 1.2 Tổng quan về tinh dầu 12 1.2.1 Khái niệm về tinh dầu 12 1.2.2 Các thành phần hóa học của tinh dầu 12 1.2.3 Ảnh hưởng của những nhân tố khác nhau đến thành phần và tính chất của tinh dầu bưởi 13 1.2.4 Ứng dụng của tinh dầu bưởi trong các ngành công nghiệp 14 1.2.5 Các phương pháp trích ly tinh dầu 15 1.3 Tổng quan về các chủng vi khuẩn thử nghiệm 20 1.3.1 Staphyllococcus aureus 20 1.3.2 Pseudomonas aeruginosa 23 1.3.3 Escherichia coli ( E.coli ) 24 1.4 Bệnh lý mụn trứng cá 25 1.4.1 Định nghĩa 25 1.4.2 Sinh bệnh học của mụn trứng cá 26 1.4.3 Các yếu tố liên quan đến sinh bệnh học mụn trứng cá 27 1.4.4 Điều trị 28 1.5 Giới thiệu kem bôi trị mụn 29 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Địa điểm 31 2.2 Thời gian nghiên cứu 31 2.3 Vật liệu 31 2.3.1 Nguyên liệu 31 i
  5. 2.3.2 Dụng cụ, thiết bị 31 2.3.3 Hóa chất 32 2.4 Phương pháp nghiên cứu 33 2.4.1 Tiến hành trích ly tinh dầu và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng 33 2.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng khuẩn 38 2.5 Phối chế kem bôi trị mụn 41 2.6 Các thí nghiệm khảo sát 44 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Kết quả khảo sát thời gian chưng cất tinh dầu của các loại bưởi 45 3.2 Thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu các loại bưởi 46 3.2.1 Hoạt tính kháng Pseudomonas aeruginosa của các loại bưởi 46 3.2.2 Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của các loại tinh dầu bưởi 49 3.2.3 Hoạt tính kháng E.coli của tinh dầu các loại bưởi 51 3.3 Kết quả thử nghiệm kem trị mụn 54 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 4.1 Kết luận 62 4.2 Kiến nghị 66 PHỤ LỤC .1 ii
  6. DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các thông số sử dụng để khảo sát thời gian chưng cất 43 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát thời gian chưng cất tinh dầu 3 loại bưởi 44 Bảng 3.2. Kết quả kháng Pseudomonas aeruginosa của tinh dầu các loại bưởi 46 Bảng 3.3. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của 3 loại tinh dầu bưởi 48 Bảng 3.4. Kết quả kháng E.coli của tinh dầu 3 loại bưởi 50 Bảng 3.5. Kết quả tìm ra tỉ lệ kem trị mụn thích hợp 53 Bảng 3.6. Kết quả xét nghiệm ở viện Pasteur 54 Bảng 3.7. So sánh thời gian hết mụn của việc thoa kem và không thoa kem. 55 Bảng 3.8. So sánh thời gian hết mụn của việc thoa kem và thoa kem không có tinh dầu. 58 Bảng 4.1. Hàm lượng tinh dầu thu được trong thời gian chưng cất 55 phút 61 iii
  7. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh trái bưởi Citrus maxima 5 Hình 1.2. Bưởi Phúc Trạch 8 Hình 1.3 Bưởi da xanh 9 Hình 1.4. Bưởi Năm Roi 10 Hình 1.5. Bưởi lông cổ cò 11 Hình 1.6. Bưởi đường lá cam 12 Hình 1.7. Hệ thống chưng cất hơi nước 15 Hình 1.8. Máy ép tinh dầu 17 Hình 1.9. Hệ thống chưng cất hơi nước dưới sự hỗ trợ của vi song 18 Hình 1.10. Staphyllococcus aureus 21 Hình 1.11. Pseudomonas aeruginosa 23 Hình 1.12. Escherichia coli 24 Hình 1.13. Cơ chế gây bệnh trứng cá 26 Hình 1.14. Các dạng mụn trứng cá 27 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 33 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình chưng cất tinh dầu 34 Hình 2.3. Hình dang vỏ các loại bưởi khi thu mẫu 35 Hình 2.4. Vỏ bưởi sau khi xay 35 Hình 2.5. Bộ chưng cất lôi cuốn hơi nước 37 Hình 2.6. Quy trình đánh giá hoạt lực kháng khuẩn của 3 loại tinh dầu 38 Hình 2.7. Sơ đồ quy trình sản xuất kem trị mụn 42 Hình 3.1. Kết quả kháng Pseudomonas aeruginosa của tinh dầu bưởi lông cổ cò 47 Hình 3.2. Kết quả kháng Pseudomonas aeruginosa của tinh dầu bưởi da xanh 47 Hình 3.3. Kết quả kháng Pseudomonas aeruginosa của tinh dầu bưởi năm roi 47 Hình 3.4. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu bưởi da xanh 49 Hình 3.5. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu bưởi năm roi 49 Hình 3.6. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu bưởi lông cổ cò 49 iv
  8. Hình 3.7. Kết quả kháng E.coli của tinh dầu bưởi năm roi 51 Hình 3.8. Kết quả kháng E.coli của tinh dầu bưởi lông cổ cò 51 Hình 3.9. Kết quả kháng E.coli của tinh dầu bưởi da xanh 51 Hình 3.10. Hình ảnh trước và sau khi sử dụng kem bôi trị mụn 60 Hình 4.1. Sơ đồ quy trình chưng cất tinh dầu 62 Hình 4.2. Sơ đồ quy trình sản xuất kem trị mụn 64 v
  9. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT - ĐC: Đối chứng - E.Coli: Escherichia coli - TSA: Trytone casein soy agar - TSB: Tryptic soy broth - TCVS: Tiêu chuẩn vi sinh vi
  10. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1) Lý do chọn đề tài Vỏ các loài cây citrus: cam, chanh, bưởi từ lâu đã được sử dụng để sản xuất tinh dầu ở các nước công nghiệp trên thới giới như Mỹ, Ý. Tinh dầu citrus có mùi thơm dễ chịu, hàm lượng limonen cao được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và mỹ phẩm. Trong các nghiên cứu gần đây còn cho thấy limonen còn có tác dụng tán sỏi, phá khối u, khả năng chống ăn mòn kim loại Ở nước ta, đặc biệt là phía Nam, bưởi một loài cây thuộc loài Citrus được trồng khắp nơi với diện tích tương đối lớn. Từ xa xưa, trong dịp lễ tết người ta đã sử dụng quả bưởi để chưng, trang trí. Không chỉ để trang trí mà những quả bưởi còn được sử dụng làm các vị thuốc trong y học cổ truyền hay kinh nghiệm dân. Theo Đông y cho rằng mỗi bộ phận của quả bưởi đều có tác dụng riêng. Cơm bưởi vị ngọt, chua, tính mát, không độc, có tác dụng kiện tỳ, trị ho, giải rượu. Vỏ ngoài chứa tinh dầu (vỏ trong thường dùng làm mứt), vị cay, đắng, ngọt, tính ấm, có tác dùng trị ho, giảm đau. Hạt bưởi vị đắng, tính ấm, chứa chất béo, có tác dụng trị đau thoát vị bẹn, sa đì. Lá bưởi vị đắng, the, mùi thơm, tính ấm, có tác dụng tán hàn, tán khí, thông kinh lạc, giải cảm, trừ đờm, tiêu thực, hoạt huyết, tiêu sưng, tiêu viêm. Quả bưởi được thu hái quanh năm vỏ có thể ở dạng tươi, khô hay đông lạnh để tách lấy tinh dầu. Các nghiên cứu về tinh dầu bưởi được thực hiện khá nhiều trên thới giới nhưng tại Việt Nam còn rất hạn chế, gần đây mới có một số ít công trình nghiên cứu về tinh dầu bưởi. Tuy nhiên tất cả chỉ tập trung nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu, các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của tinh dầu bưởi ít được quan tâm. Đặc biệt việc nghiên cứu tách chiết các hợp chất có dược tính cao ngoài tinh dầu từ quả bưởi là vấn đề mới mẻ, chưa được quan tâm nghiên cứu. Việc nghiên cứu tách chiết tinh dầu và các hợp chất ngoài tinh dầu có dược tính cao đồng thời thử hoạt tính sinh học của tinh dầu bưởi là việc làm cần thiết góp phần vào việc sử dụng các hợp chất thiên nhiên trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Qua nghiên cứu của đề tài sẽ làm tăng 1
  11. Đồ án tốt nghiệp giá trị kinh tế của cây bưởi ở khu vực miền Nam. Chính vì vậy chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu trích ly tinh dầu một số loại vỏ bưởi ở miền Nam Việt Nam và thử hoạt tính kháng khuẩn, bước đầu ứng dụng để sản xuất kem trị mụn từ tinh dầu bưởi” 2) Mục tiêu nghiên cứu - Tìm ra loại bưởi nào cho hàm lượng tinh dầu nhiều nhất trong 3 lọai: bưởi năm roi, bưởi da xanh, bưởi lông cổ cò. - Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu. - Điều chế thử nghiệm kem bôi trị mụn. 3) Nhiệm vụ nghiên cứu Nghiên cứu cơ sở lí luận và thực tiễn của đề tài. - Tiến hành thực nghiệm ly trích tinh dầu từ các loại vỏ quả bưởi bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. - Thử hoạt tính sinh học về khả năng kháng khuẩn của tinh dầu các loại bưởi từ phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. - Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu các loại bưởi. - Điều chế thử nghiệm kem bôi trị mụn. 4) Các phương pháp nghiên cứu - Nghiên cứu lí thuyết: thu thập, phân tích, tổng hợp tài liệu. - Thực nghiệm: ✓ Các phương pháp tách chiết các hợp chất hợp cơ: Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước cổ điển. Phương pháp sinh hóa: Thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu các loại bưởi trên 3 lọai: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, E.coli. ✓ Sản xuất kem trị mụn. - Xử lý số liệu bằng phần mềm Statgraphics và Excel. 5) Đối tượng nghiên cứu - Quả bưởi da xanh ở Bến Tre. 2
  12. Đồ án tốt nghiệp - Quả bưởi năm roi ở Vĩnh Long. - Quả bưởi lông cổ cò ở Tiền Giang. 6) Lịch sử của vấn đề nghiên cứu Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về tinh dầu vỏ trái Citrus nhưng ở Việt Nam mới có một số ít công trình nghiên cứu về tinh dầu vỏ trái Citrus: - Tách chiết tinh dầu và ankaloit từ quả quất- Nguyễn Thị Lý, Lê Thị Đề Oanh, Phan Thị Bảo Vy. Khoa Công nghệ Hóa Học – ĐHBK TP HCM – 2009. - Khảo sát tinh dầu vỏ trái giống Citrus họ rutaceae - ThS. Nguyễn Minh Hoàng Đại học Mở Tp HCM -2006. Nội dung của công trình là khảo sát thành phần hóa học của tinh dầu bưởi da xanh, cam sành, chanh giấy và thử hoạt tính kháng khuẩn của các loại tinh dầu này. - Duong Phuoc An, Huynh Thi Bich Tuyen, Nguyen Ngoc Khoi * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 1 - 2010: 35-40. Nội dung của công trình là khảo sát thành phần hóa học và thử hoạt tính giải lo âu của tinh dầu bưởi, cam, chanh, quýt, quất. - Ly trích tinh dầu vỏ trái và lá tắc - Trịnh Hoàng Hiếu, Nguyễn Thị Bảo Trân, Lê Ngọc Thạch. Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ, tập 12, số 10 - 2009. Nhóm tác giả đã nghiên cứu ly trích tinh dầu từ lá và vỏ quả tắc bằng hai phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và chưng cát lôi cuốn hơi nước có sự kết hợp của chiếu xạ vi sóng, thử hoạt tính sinh học của tinh dầu lá và vỏ tắc thu được từ hai phương pháp chưng cất trên. - Nghiên cứu trích ly tinh dầu vỏ bưởi Năm Roi (Lương Đức Vỉnh, 2014) - Khảo sát quy trình chiết xuất tinh dầu vỏ bưởi với nguyên liệu xay và không xay (Phan Như Quỳnh, 2010). 7) Những đóng góp mới của đề tài - So sánh hàm lượng tinh dầu 3 loại vỏ bưởi năm roi, da xanh, lông cổ cò. - So sánh hoạt tính kháng khuẩn của 3 loại bưởi. - Khảo sát hoạt tính trị mụn của tinh dầu 3
  13. Đồ án tốt nghiệp - Bước đầu tạo ra kem trị mụn Ý nghĩa về mặt kinh tế của đề tài Tạo ra được sản phẩm trị mụn có thành phần trị mụn từ tinh dầu thiên nhiên. có giá thành rẻ. Ý nghĩa về mặt xã hội Tạo ra sản phẩm trị mụn mới chưa có trên thị trường Ý nghĩa về mặt sức khỏe Tác dụng của tinh dầu bưởi giúp giảm cân, trị cảm lạnh, giải độc, giảm stress, làm mượt tóc, kích thích mọc tóc, sát khuẩn, làm đẹp, chế tạo dược phẩm, giúp khí huyết lưu thông tốt làm cho bạn luôn có một tinh thần vui vẻ và thoải mái. Ý nghĩa về mặt thẫm mỹ Làm se da, kháng khuẩn giảm thâm trên da khi dùng kem trị mụn từ tinh dầu bưởi, Ý nghĩa trong công nghệ thực phẩm Là hương liệu làm ngon bánh kẹo, đồ hộp, các loại rượu khai vị, các loại chè, mứt, các loại nước giải khát, 8. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Kết cấu của đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương: Chương 1: Tổng quan Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4
  14. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về Bưởi 1.1.1 Vị trí phân loại Tên khoa học: Citrus maxima Burm.Merr, Citrus grandis(L.) Osbeck. Giới (regnum) : Plamtac Ngành (divisio) : Magnoliophyta Lớp (class) : Magnoliopsida Phân lớp (sublass) : Rosida Bộ (ordo) : Sapindales Họ (familia) : Rutaceae Chi (genus) : Citrus Loài (species) : C.maxima Hình 1.1. Hình ảnh trái bưởi Citrus maxima [24] 1.1.2 Nguồn gốc Bưởi có nguồn gốc từ Nam Á và Malaysia, mọc tự nhiên theo bờ sông Fiji (tên một đảo quốc ở Thái Bình Dương) và Friendly. Bưởi đã được đưa vào Trung Quốc khoảng 100 năm trước công nguyên. Bưởi được trồng nhều ở miền nam Trung Quốc. Đặc biệt bưởi còn được trồng trên những bờ sông ở miền Nam Thái Lan, ở Đài Loan, khắp miền nam Nhật Bản, Nam Ấn Độ, bán đảo 5
  15. Đồ án tốt nghiệp Malaysia, Indonesia, New Guinea và Tahiti. Người ta tin rằng những hạt giống đầu tiên được thuyền trưởng Shaddock mang đến Châu Mỹ vào cuối thế kỷ 17. Vì vậy bưởi còn được gọi là Shaddock [18]. Bưởi có 2 loài: Bưởi (Citrus grandis) và Bưởi chùm (Citrus paradisi). Bưởi chùm (Citrus paradi Shimaef) hay còn gọi là bưởi đắng, không có hoặc có rất ít ở các nước vùng châu Á. Bưởi chùm trái nhỏ (đường kính khoảng 10-15cm), đặt gọn trong lòng bàn tay, có hình cầu tròn, da trơn láng giống như quả cam, vỏ khi chín có màu vàng hoặc hồng, có mùi đặc trưng của bưởi, ruột bưởi rất đặc, màu đỏ hồng, các múi bưởi dính liền nhau, giống hệt múi cam (khác với bưởi ở Việt Nam Citrus maxima các múi tách rời, tép bưởi mọng nước, xốp), phần vỏ trắng bên trong rất mỏng như phần trắng của vỏ cam [25]. 1.1.3 Đặc điểm thực vật Cây cao khoảng 5 đến 10m, thường có gai lớn (nhất là trồng bằng hạt), nhánh non có lông tơ. Đặc điểm thực vật: - Rễ: Thường là rễ cọc, mọc sâu, nếu đất thoáng nước tốt và tơi xốp rễ có thể mọc sâu đến 4m. - Thân, cành: Bưởi thuộc loại thân gỗ, các cành chính thường mọc ra ở các vị trí trong khoảng 1m cách mặt đất. Cành có thể có gai, nhất là khi trồng bằng hạt. Trong một năm cây có thể cho 3 đến 4 đợt cành, tùy theo chức năng của cành mà chúng có tên khác nhau như: cành mang trái, cành mẹ, cành dinh dưỡng và cành vượt. - Lá: lá bưởi thuộc lá đơn gồm có cuốn lá, cánh lá và phiến lá. Lá lớn, có cành lá to, phiến lá hình xoan đến bầu dục, dạng trái tim, dài từ 12 đến 15cm, mặt dưới gân lá thường có lông. - Hoa: hoa bưởi lớn, mọc đơn hay chùm, cánh hoa màu trắng kem, có từ 20 – 25 nhị đực, bầu noãn có 11 – 16 ngăn, đường kính rộng từ 2,5 – 4 cm, 6
  16. Đồ án tốt nghiệp rất thơm, thường là hoa lưỡng tính. Thời gian từ khi ra hoa đến khi hoa tàn thay đổi tùy giống và điều kiện khí hậu, trung bình là 1 tháng. - Trái: bưởi có trái lớn, hình cầu hay hình trái lê, đường kính từ 10 đến 40cm, có màu xanh và vàng nhạt khi chín, vỏ dày, tép lớn màu vàng nhạt hay hồng. Trái nặng trung bình từ 1 – 2kg. Trái bưởi có 3 phần chính: ngoại bì, trung bì, nội bì. Thời gian chín của trái thay đổi từ 7 đến 8 tháng sau khi thụ phấn. Khi trái đạt độ chín thành thục, hàm lượng acid trong nước giảm dần, trong khi màu sắc của trái từ màu xanh chuyển sang màu vàng và độ cứng của trái sẽ giảm dần. - Hạt: hình dạng, kích thước, trọng lượng, số lượng hạt trong trái và mỗi múi thay đổi nhiều tùy từng giống. Bưởi là loại trái hạt lớn, đơn phôi, có nhiều hạt, tuy nhiên một số giống bưởi như bưởi Năm Roi, bưởi Biên Hòa hạt thường mất dần qua quá trình phát triển của trái [15]. 1.1.4 Thành phần hóa học Bưởi được tận dụng tất cả các bộ phận, từ hoa (để chế hương liệu), lá, vỏ, cơm và cả hạt. Nước bưởi chứa nhiều chất bổ dưỡng như các loại đường trái cây, đạm, béo, acid tannic, beta-caroten và các chất khoáng phospho sắt, Calci, Kali, Magie. Ngoài ra, còn chứa nhiều vitamin (B1, B2, C), trong đó hàm lượng vitamin C khá cao, gấp khoảng 10 lần so với quả lê [17]. - Vỏ quả: chứa flavonoid như naringosid, hesperidin, diosmin, diosmetin, hesperitin, - Dịch quả: glucid, lipid, các chất khoáng (canxi, kali, phospho), caroten và các vitamin (B, C). - Hạt: chứa nhiều limonin, vỏ hạt chứa nhiều pectin, trong hạt có nhiều dầu béo. 1.1.5 Một số giống bưởi tại Việt Nam Việt Nam là nước khí hậu nhiệt đới gió mùa thuộc khu vực Đông Nam Á, có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm. Chính vì điều kiện tự nhiên thuận lợi đã tạo cho Việt 7
  17. Đồ án tốt nghiệp Nam được sự đa dạng và phong phú của các loại cây trồng. Trên khắp mọi miền đất nước có nhiều giống bưởi nổi tiếng thơm ngon, và có tiếng ở trong và ngoài nước như: a) Bưởi Phúc Trạch Hình 1.2. Bưởi Phúc Trạch [26] Bưởi Phúc Trạch là giống bưởi đặc sản của huyện Hương Khê tỉnh Hà Tĩnh. Phúc Trạch là tên làng nơi được cho là tạo ra thứ bưởi này ngon nhất. Bưởi Phúc Trạch có hình cầu tròn, bề ngang và chiều cao gần bằng nhau, cuống quả không lồi, đế quả hơi lõm, vỏ không trơn không ráp, màu sắc vỏ quả xanh vàng, màu sắc thịt quả màu hồng nhạt hoặc màu trắng trong, khối lượng quả đạt từ 1 – 1,5 kg, số múi 14 – 16 múi/quả, tỉ lệ ăn được từ 48,1 – 54,1, số hạt bình quân trong quả 50 – 70 hạt/quả, độ Brix (%) từ 10 – 12,8%, có mùi thơm nhẹ tự nhiên hơi đặc trưng, có vị ngọt hơi thanh chua, ngọt 8
  18. Đồ án tốt nghiệp hậu. Tổng diện tích trồng bưởi Phúc Trạch tại huyện Hương Khê, tỉnh Hà Tĩnh hiện nay là khoảng 1.500 ha [26]. b) Bưởi da xanh Hình 1.3 Bưởi da xanh [35] Bưởi da xanh là đặc sản của xứ dừa Bến Tre. Giống bưởi quý hiếm này chỉ thực sự được chú ý đến trong khoảng một thập niên trở lại đây do chất lượng của nó vượt trội so với nhiều loại bưởi khác. Bưởi da xanh sở dĩ được tôn vinh là bưởi ‘vua’ vì ăn rất ngọt, ráo nước, không hạt (hoặc rất ít hạt), vỏ mỏng, thịt bưởi đỏ sậm bắt mắt và cho trái quanh năm. Bưởi có thể bảo quản trong thời gian dài (vài tháng) mà vẫn đảm bảo chất lượng và cảm quan. Sau khoảng 210 – 216 ngày sau khi đậu quả. Vỏ quả bên ngoài có biểu hiện: các hạt tinh dầu trên vỏ quả nở to, vỏ quả sần sùi, dùng tay ấn nhẹ đáy quả sẽ cảm nhận được độ lún nhất định [35]. c) Bưởi Năm Roi 9
  19. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4. Bưởi Năm Roi [36] Bưởi Năm Roi là một trong những loại bưởi ngon, được người tiêu dùng đánh giá cao, và có giá trị kinh tế lớn. Bưởi Năm Roi được công nhận là giống sạch bệnh, cho năng suất cao và chất lượng tốt, ngon nhất trong các giống bưởi hiện nay, thích nghi với điều kiện tại các vùng sinh thái khác nhau ở nước ta. Tuy nhiên bưởi Năm Roi được trồng nhiều ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Tổng diện tích bưởi Năm Roi là 9,2 ngàn ha, phân bố chính ở tỉnh Vĩnh Long (diên tích 4,5 ngàn ha cho sản lượng 31,3 ngàn tấn, chiếm 48,6% về diện tích và 54,3% về sản lượng bưởi Năm Roi của cả nước), trong đó tập trung ở huyện Bình Minh 3,4 ngàn ha đạt sản lượng gần 30 ngàn tấn. Tiếp theo là tỉnh Hậu Giang (1,3 ngàn ha). Với một hecta, nhà vườn thu hoạch cả trăm triệu đồng trong một năm. Cây cao trung bình từ 7 – 8 m, cao nhất có thể lên đến 15 m, có gai dài khoảng 2,5 cm có khi tới 4 cm nếu sinh sản bằng hạt, hoặc có gai hay gai rất ngắn nếu sinh sản sinh dưỡng, khi còn non thì gai có lông tơ. Thời gian trồng từ tháng tư cho đến tháng giêng. Đặc điểm của Bưởi năm roi là: hình quả lê, trọng lượng trung bình từ 1 – 1,4 kg, trái có núm, khi quả chín có màu vàng xanh, vỏ mỏng, ráo nước, thịt quả màu xanh 10
  20. Đồ án tốt nghiệp vàng, mịn đồng nhất. Múi và vách múi rất dễ tách, ăn dòn, ngọt, thơm, vị hơi dôn dốt chua, đặc biệt là không có hạt mấy, chỉ có hạt lép nhỏ li ti. Tỷ lệ phần ăn được trên 55%, độ brix từ 9 – 12%. Phù hợp ăn tươi, chế biến, tiêu thụ nội địa và xuất khẩu nhiều nước. Thời vụ thu hoạch bắt đầu từ tháng 9 dương lịch [36]. d) Bưởi lông cổ cò Hình 1.5. Bưởi lông cổ cò [37] Vùng chuyên canh: xã An Thái Đông, Mỹ Lương, An Thái Trung, Mỹ Đúc Tây, Thiện Trí (Huyện Cái Bè) có diện tích trồng là 45 ha, sản lương là 1125 tấn/ha. Bưởi lông cổ cò là một đặc sản của huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang. Cây có đặc tính sinh trưởng khá mạnh, phiến lá hình elip, màu xanh đậm và trên bề mặt có lớp lông tơ mịn, có khả năng chống chịu tốt đối với bệnh vàng lá thối rễ. Quả bưởi có dạng hình quả lê, bên ngoải có lớp lông trắng mịn, lớp lông này sẽ rụng dần. Khi chín vỏ quả có màu xanh vàng có phủ lông tơ mỏng bên ngoài vỏ. Vỏ quả khá mỏng, trong quả bì màu trắng hồng, thịt quả màu vàng đỏ, dễ tách, vị ngọt đến ngọt chua nhẹ, độ Brix từ 10 – 11, khá nhiều nước, múi thơm, mỗi trái từ 5 – 30 hạt. Trọng lượng từ 0,9 – 1,4 kg/trái, cá biệt có trái nặng đến 2kg. Bưởi lông cổ cò có thể tồn trữ đến 20 ngày nếu được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ phòng [37]. e) Bưởi đường lá cam Bưởi đường lá cam ở Biên Hòa là giống bưởi được trồng phổ biến ở huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai. Trái bưởi có hình quả lê thấp, láng nhẵn 11
  21. Đồ án tốt nghiệp khác hẳn với các giống bưởi khác như bưởi Ổi, bưởi Năm Roi, bưởi Da Xanh. Khi chín vỏ bưởi có màu xanh vàng. Vỏ quả dễ bóc, tép bó chặt, vị ngon, ngọt. Trái bưởi Đường Lá Cam có kích thước nhỏ hơn bưởi Năm Roi, bưởi Da Xanh, thường từ 0,7 – 1,4 kg/quả và lớn hơi bưởi Ổi. Hình 1.6. Bưởi đường lá cam [38] Còn nhiều loại bưởi khác có giá trị kinh tế cao và được thị trường nước ngoài ưa chuộng 38. 1.2 Tổng quan về tinh dầu 1.2.1 Khái niệm về tinh dầu Tinh dầu là hỗn hợp nhiều hợp chất dễ bay hơi, có mùi đặc trưng tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu cung cấp tinh dầu. Tinh dầu có mùi thơm và thành phần hóa học, tính chất, điểm chảy, điểm sôi, độ tan nhất định trong nước (tan ít hoặc rất ít trong nước), tan nhiều trong dung môi hữu cơ: chloroform, ete, este, Tinh dầu có thể sử dụng trực tiếp hoặc chế ra các chất thơm khác đáp ứng các nhu cầu xã hội (thuốc, mỹ phẩm, chất thơm thực phẩm, nước hoa ) [3]. 1.2.2 Các thành phần hóa học của tinh dầu Vỏ quả ngoài rất giàu chất nagrin – gosid, do có vị đắng, trong vỏ có tinh dầu, tỷ lệ 0,8 – 0.84%, quả chứa 0,5% tinh dầu. Tinh dầu bưởi chứa trên 90% d – limonene, ngoài ra còn có a – pinen , linalool, geraniol, citral, [1] 12
  22. Đồ án tốt nghiệp 1-metyl-4-(prop-1-en-2-yl)cyclohex-1-ene Cấu trúc Limonen (tinh dầu vỏ Cam, Quýt, Bưởi) [23] 1.2.3 Ảnh hưởng của những nhân tố khác nhau đến thành phần và tính chất của tinh dầu bưởi Tinh dầu chứa trong thực vật có thành phần không cố định mà luôn thay đổi theo hướng phát triển của cây cũng như ảnh hưởng của những yếu tố khác. a) Nguyên liệu chế biến và bộ phận dùng để chế biến Mỗi loại cây tinh dầu, ở mỗi bộ phận chứa tinh dầu, có thành phần nhất định trong những điều kiện nhất định, các giống khác nhau thì thành phần tinh dầu cũng khác nhau. Trong cùng 1 cây nhưng lượng tinh dầu ở các bộ phận khác, hàm lượng và thành phần cũng khác nhau [3]. b) Phương pháp chế biến Tùy thuộc vào phương pháp chế biến mà hàm lượng và thành phần cũng khác nhau. Tinh dầu nhận được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ít bị tạp hơn so với tinh dầu trích ly bằng dung môi bay hơi vì các thành phần tạp khác sẽ hòa tan vào nước [3]. c) Hướng phát triển của cây Trong thời gian cây sinh trưởng thành phần tinh dầu chịu hàng loạt các biến đổi và những chuyển hóa này có thể xác định thời kỳ mà cây tích tụ được nhiều tinh dầu nhất và có chất lượng cao nhất để thu hoạch và chế biến. 13
  23. Đồ án tốt nghiệp Tinh dầu tạo thành trong cây không phải có 1 lượng cố định mà biến đổi liên tục theo hướng phát triển của cây. Sự biến đổi này có xu hướng là càng ngày càng tích tụ nhiều những hợp chất có chứa oxi Trong các bộ phận khác nhau của cây, tinh dầu tạo thành và tích lũy không giống nhau mà luôn luôn chuyển hóa lẫn nhau [3]. 1.2.4 Ứng dụng của tinh dầu bưởi trong các ngành công nghiệp a) Ứng dụng trong sản xuất nước uống Nước quả cô đặc: Nước quả cô đặc thường bị mất mùi sau quá trình chế biến. Người ta đã cho thêm hương của vỏ quả và phần hương thu hồi trong nước quả để tăng thêm vị hấp dẫn của nước quả. Nước uống không có rượu: Hiện nay các nước trên thế giới đã sử dụng tinh dầu citrus như cam, chanh, bưởi trong công nghiệp nước uống soda, limonad, xiro. Rượu: Tinh dầu chi citrus đã được dùng phổ biến trong công nghiệp sản xuất rượu như rượu cam, rượu chanh, rượu quýt, rượu bưởi nhằm kích thích khẩu vị [22]. b) Ứng dụng trong các ngành thực phẩm Kẹo, bánh: Có thể dùng tinh dầu cam, chanh, bưởi trong sản xuất kẹo, bánh làm cho kẹo, bánh có hương vị đặc trưng và hấp dẫn. Kem, chè: Trong công nghiệp sản xuất kem người ta thường dùng hương của tinh dầu citrus làm tăng hương vị kem, chè bưởi [22]. c) Ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm Trong tinh dầu vỏ citrus chiếm tỉ lệ cao là d-limonen, chất này có tác dụng làm tan sỏi mật, người ta đã đưa ra một chế phẩm mà trong thành phần chế phẩm dùng để tiêm có 77 – 99,8% limonen. Chế phẩm có 94% limonen, 1% monoleat sorbit và 5% cồn đã được tiến hành thử nghiệm và cho kết quả tốt. 14
  24. Đồ án tốt nghiệp d) Ứng dụng trong lĩnh vực môi trường D-limonen chiếm trên 90% trong hầu hết tinh dầu vỏ quả citrus, người ta đã ứng dụng trong việc xử lý rác là bao xốp. Ngoài ra có 1 nghiên cứu về việc ứng dụng limone trong lĩnh vực môi trường, dùng limone để sản xuất ra thuốc diệt côn trùng [7], [11]. 1.2.5 Các phương pháp trích ly tinh dầu a) Phương pháp chưng cất cổ điển Hình 1.7. Hệ thống chưng cất hơi nước Hơi nước tạo ra từ nồi hơi, thường có áp suất cao hơn không khí, được đưa thẳng vào bình chưng cất. Ngày nay thường dùng phương pháp này để chung cất tinh đầu từ các nguyên liệu thực vật. Điểm ưu việt của phương pháp này là người ta có thể điều chỉnh áp suất, nhiệt độ như mong muốn để tận thu sản phẩm nhưng phải giữ nhiệt độ ở mức giới hạn để tinh dầu không bị phân hủy. Việc sử dụng phương pháp cũng lệ thuộc vào những điều kiện hạn chế, yêu cầu hơi nước không quá nóng và quá ẩm. Nếu quá nóng nó có thể phân hủy nhưng cấu phần có độ sôi thấp, hoặc làm chất nạp khô quăn khiến hiện tượng thẩm thấu không xảy ra. Nếu dòng chảy của tinh dầu ngưng lại sớm quá, người ta phải chưng cất tiếp bằng hơi nước bão hòa trong một thời gian cho đến khi sự khuếch tán hơi nước được tái lập lại, khi đó mới tiếp tục dùng lại hơi nước quá nhiệt. Nếu hơi nước quá ẩm sẽ dẫn đến hiện tượng hơi nước ngưng tụ, phần chất nạp phía dưới sẽ bị ướt, trong trường hợp này người ta phải tháo nước ra bằng một van xả dưới đáy nồi. 15
  25. Đồ án tốt nghiệp Trong công nghiệp, hơi nước trước khi vào bình chưng cất phải đi ngang một bộ phận tách nước. Với hơi nước có áp suất cao thường gây ra sự phân hủy quan trọng, nên tốt nhất là bắt đầu chưng cất với hơi nước ở áp suất thấp và cao dần cho đến khi kết thúc. Không có một quy tắc chung nào cho mọi nguyên liệu vì mỗi chất nạp đòi hỏi một kinh nghiệm và yêu cầu khác nhau. Hiệu suất và chất lượng tinh dầu phụ vào đặc tính của tinh dầu và cách chọn phương pháp chưng cất. Trong phòng thí nghiệm, để chưng cất hơi nước tinh dầu người ta thường dùng bộ dụng cụ thủy tinh Clevenger Ưu điểm: ✓ Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản ✓ Thiết bị gọn, dễ chế tạo ✓ Không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp thụ. ✓ Thời gian tương đối nhanh Nhược điểm: ✓ Không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp. ✓ Chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có những cấu phần dễ bị phân hủy. ✓ Trong nước chưng luôn luôn có một lượng tinh dầu tương đối lớn. ✓ Những tinh dầu có độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém [2]. 16
  26. Đồ án tốt nghiệp b) Phương pháp ép Hình 1.8. Máy ép tinh dầu Trong phương pháp ép vỏ trái được ngâm trong nước hoặc nước muối trong khoảng một giờ trước khi cho vào máy ép. Máy ép đơn giản thường sử dụng là máy ép đĩa, đĩa dưới cố định, đĩa trên di chuyển xoay tròn dần đi xuống. Hai mặt trong đĩa tiếp xúc với vỏ trái có nhiều gờ nhỏ. Vỏ trái để lên mặt đĩa dưới, đĩa trên ép từ từ xuống, lúc đó các túi tiết bị phá vỡ và tinh dầu sẽ chảy ra. Trong khi ép, nên vừa ép vừa phun nước hoặc nước muối để hỗ trợ tinh dầu trôi ra và lúc ngừng ép, bã vỏ trái không hút tinh dầu trở lại. Hiện nay, một số nước vẫn còn dùng phương pháp ép để lấy tinh dầu cam nhưng với những thiết bị hiện đại và hoàn chỉnh hơn. Với các phương pháp cơ học nêu trên, trong phần bã bao giờ cũng còn 30 – 40% lượng tinh dầu. Vì vậy, sau đó người ta phải dùng phương pháp tẩm trích hoặc chưng cất hơi nước để lấy hết phần tinh dầu còn lại. Tinh dầu thu được bằng phương pháp cơ học có mùi thơm tự nhiên hơn các phương pháp khác vì sự ly trích xảy ra ở nhiệt độ phòng, không sử dụng dung môi, nhưng thủ thuật vắt và nạo xát thủ công không phù hợp cho sản xuất quy mô lớn. 17
  27. Đồ án tốt nghiệp Hiện nay có những thiết bị hiện đại hơn cũng dựa trên nguyên tắc làm vỡ các túi tinh dầu mặt ngoài vỏ cam mà vẫn giữ nguyên vẹn trái cam, hoặc tách tinh dầu ra khỏi hỗn hợp nước – tinh dầu bằng máy ly tâm siêu tốc. Chất lượng những loại tinh dầu này được đánh giá rất cao [3]. c) Phương pháp vi sóng Hình 1.9. Hệ thống chưng cất hơi nước dưới sự hỗ trợ của vi sóng [9] Phương pháp vi sóng có đặc điểm: Vi sóng ( micro – onde, microwave ) là sóng điện từ lan truyền với vận tốc ánh sáng. Sóng điện từ này được đặc trưng bởi: + Tần số f, tính bằng Hertz ( Hz = cycles/s ), là chu kỳ của trường điện từ (champ électromagnétique ) trong một giây, nằm giữa 300 Hz và 30 GHz + Vận tốc c là 300.000 km/giây. + Độ dài sóng 휆 (cm) là đoạn đường đi của vi sóng trong một chu kỳ, liên hệ với tần số theo công thức 휆 = c/f. + Hầu hết các lò vi sóng gia dụng đều sử dụng tần số 2450 MHz, ở tần số này 휆 = 12,24 cm. Một số phân tử, thí dụ như nước, phân chia điện tích trong phân tử một cách bất đối xứng. Như vậy các phân tử này là những lưỡng cực có tính định hướng trong nhiều điện trường. Dưới tác dụng của điện trường một chiều, các phân tử lưỡng cực có khuynh sắp xếp theo chiều điện 18
  28. Đồ án tốt nghiệp trường này. Nếu điện trường là một điện trường xoay chiều, sự định hướng của các lưỡng cực sẽ thay đổi theo chiều xoay đó. Cơ sơ của hiện tượng phát hiện do vi sóng là sự tương tác giữa điện trường và các phân tử phân cực bên trong vật chất. Trong điện trường xoay chiều có tần số rất cao 2,45 x 109 Hz , điện trường này sẽ gây ra một sự xáo động ma sát rất lớn giữa các phân tử, đó chính là nguồn gốc sự nóng lên của vật chất. Với một cơ cấu có bất đối xưng cao, phân tử nước có độ phân cực rất lớn, do đó nước là một chất rất lý tưởng để đun nóng bằng vi sóng. Ngoài ra, các nhóm định chức phân cực như: - OH, - COOH, - NH2 trong các hợp chất hữa cơ cũng là những nhóm chịu sự tác động mạnh của trường điện từ. Do đó, những hợp chất càng phân cực càng rất mau nóng dưới sự chiếu xạ của vi sóng. Việc này liên quan đến hằng số điện môi của hợp chất đó. Tóm lại, sự đun nóng bởi vi sóng rất chọn lọc, trực tiếp và nhanh chóng [3]. d) Phương pháp siêu âm Siêu âm là âm thanh có tần số nằm ngoài ngưỡng nghe của con người (16Hz – 18 KHz). Về mặt thực hành, siêu âm đươc chia làm hai vùng: Vùng có tần số cao (5 – 10 MHz), ứng dụng trong y học để chuẩn đoán bệnh Vùng có tần số thấp hơn (20 – 100 KHz), ứng dụng trong các ngành khác, (kích hoạt phản ứng hóa học, hàn chất dẻo, tẩy rửa, cắt rọt, ) dự trên khả năng cung cấp năng lượng của siêu âm. Siêu âm cung cấp năng lượng thông qua hiện tượng tạo và vỡ “bọt” (khoảng cách liên phân tử). Trong môi trường chất lỏng, bọt có thể hình thành trong nửa chu kỳ đầu sẽ vỡ trong nữa chu kỳ sau, giải phóng một năng lượng rất lớn. Năng lượng này có thể sử dụng tẩy rửa các chất bẩn ngay trong vị trí không thể tẩy rửa bằng các phương pháp thông thường, khoan cắt 19
  29. Đồ án tốt nghiệp những chi tiết tinh vi, hoạt hóa nhiều loại phản ứng hóa học, làm chảy và hòa tan lẫn vào nhau trong việc chế tạo những sản phẩm bằng nhựa nhiệt dẻo, Trong lĩnh vực hợp chất thiên nhiên, siêu âm chủ yếu sử dụng để hỗ trợ cho phương pháp tẩm tích giúp thu ngắn thời gian lý trích. Trong một số trường hợp phương pháp siêu âm cho hiệu suất cao hơn phương pháp khuấy từ. Trong trường hợp tinh dầu vì sự ly trích bằng siêu âm được thực hiện ở nhiệt độ phòng nên sản phẩm luôn có mùi thơm tự nhiên. Các thiết bị siêu âm hiện nay chủ bao gồm hai dạng là bồn siêu âm (40 KHz) và thanh siêu âm (20 KHz) [3]. 1.3 Tổng quan về các chủng vi khuẩn thử nghiệm Do một số loại vi khuẩn ở trên da có tác động tăng tiết, ứ đọng bã nhờn gây nên hiện tượng bã nhờn do đó mụn ngày càng phát triển. Một số loại vi khuẩn hay gặp là Propionibacterium acnes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Staphylococcus aureus, E.coli, Corynebacterium acnes, Các lọai vi khuẩn này bình thường có thể có trên da người nhưng nếu gặp ở người có hiện tượng tăng tiết bã nhờn và tích tụ bã nhờn thì các vi khuẩn này rất dễ phát huy tác dụng tức là phối hợp gây nên mụn trứng cá 1.3.1 Staphyllococcus aureus Staphylococcus aureus do Robert Koch phát hiện năm 1878 sau khi thực hiện phân lập từ mủ ung nhọt. Năm 1880 Louis Pasteur cũng đã thực hiện tiến hành phân lập và nghiên cứu về Staphylococcus aureus. 20
  30. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.10. Staphyllococcus aureus Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính 0,5 - 1,5 µm, có thể đứng riêng lẻ nhưng thường tạo từng chùm giống chùm nho, không di động, không sinh bào tử. Staphylococcus aureus thường cư trú trên da, niêm mạc, đường ruột các động vật máu nóng . Staphylococcus aureus là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển dễ dàng trên môi trường nuôi cấy thông thường. Phát triển được ở nhiệt độ 10 - 45°C, mọc tốt ở 37°C, pH thích hợp là 7,0 - 7,5 [41]. Ở môi trường canh thang thì sau 5 - 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ thì làm đục rõ, để lâu có thể lắng cặn [41]. Ở môi trường thạch, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, đường kính khoảng 1 - 2 mm, có thể màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng [41]. Ở môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, làm tan máu hoàn toàn. Tụ cầu vàng tiết ra năm loại dung huyết tố (hemolysin): α, β, γ, δ, ε [41]. 21
  31. Đồ án tốt nghiệp Coagulase do S. aureus sinh ra có khả năng làm đông huyết tương người và động vật khi đã được chống đông. Đây là tiêu chuẩn quan trọng nhất để phân biệt tụ cầu vàng với các tụ cầu khác. Coagulase có ở tất cả các tụ cầu vàng [41]. Coagulase có hai loại: một loại tiết ra môi trường (coagulase tự do), một loại bám vào vách tế bào (coagulase cố định) [41]. Staphylococcus aureus cho phản ứng catalase dương tính, lên men được nhiều loại đường như: mannitol, glucose, lactose, mannose, sucrose, levulose, manit. Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vi khuẩn không sinh bào tử khác. Nó bị tiêu diệt ở 80°C trong 1 giờ, 100°C trong 1 - 2 phút, có thể sống ở môi trường có nồng độ NaCl cao (15%), có thể tồn tại ngoài môi trường khô ráo 4 - 5 tháng. Vi khuẩn tụ cầu vàng gây bệnh bằng cách gây tổn thương trực tiếp lên các cơ quan như: Da: nhọt da, áp xe, viêm mô tế bào. Hô hấp: viêm khí quản, viêm phổi hoại tử, áp xe phổi biến chứng tràn khí màng phổi, tràn khí trung thất, tràn khí dưới da, tràn mủ màng phổi Tim: viêm nội tâm mạc, tràn mủ màng tim. Màng não: viêm màng não mủ. Xương: cốt tủy viêm, viêm khớp Máu: nhiễm trùng máu hoặc gây bệnh bằng cách gián tiếp tiết ra các độc tố gây viêm da tróc vẫy hoặc hội chứng sốc độc tố [41]. 22
  32. Đồ án tốt nghiệp 1.3.2 Pseudomonas aeruginosa Hình 1.11. Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas spp. là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng di động, không sinh bào tử. Pseudomonas có thể tìm thấy ở nhiều môi trường khác nhau như: đất, nước, trên cây và trong các động vật. Là vi khuẩn dị dưỡng, không lên men, linh họat về dinh dưỡng [42]. P. aeruginosa là vi khuẩn điển hình của chi Pseudomonas. P. aeruginosa là một tác nhân gây bệnh cơ hội có thể gây ra các bệnh nhiễm trùng, đặc biệt là ở những người suy giảm miễn dịch, những người bị bỏng nặng, đái tháo đường hoặc xơ nang. P. aeruginosa có thể chiếm khoảng 10% tất cả các bệnh viện gây nhiễm trùng, đặc biệt là viêm phổi, nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng vết thương phẫu thuật và nhiễm trùng máu [42]. P. aeruginosa kháng được nhiều loại kháng sinh, một số kháng sinh có hiệu quả với P. aeruginosa như: ceftazidime, ticarcillin, piperacillin, gentamicin, ciprofloxacin, [42]. 23
  33. Đồ án tốt nghiệp 1.3.3 Escherichia coli ( E.coli ) E. coli là vi khuẩn Gram âm, hình que, kích thước trung bình 0,5 µm x 1 - 3 µm, di động bằng tiêm mao, không sinh bào tử, thường được tìm thấy trong đường ruột của người và các động vật máu nóng [40]. E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có thể sống ở nhiệt độ 10 - 46°C, pH 5,5 - 8. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 37°C, pH thích hợp là 7 - 7,2 [41]. Môi trường canh thang: Nuôi cấy sau 3 - 4 giờ vi khuẩn phát triển làm đục nhẹ môi trường, sau 2 ngày trên mặt môi trường có váng mỏng, những ngày sau vi khuẩn lắng xuống đáy ống [41]. Môi trường thạch thường: Nuôi cấy sau 8 - 10 giờ có thể nhìn thấy khuẩn lạc riêng rẽ, qua kính phóng đại, khuẩn lạc to dần, tròn lồi, hơi phồng, mặt nhẵn, bờ đều, đường kính khoảng 1,5 mm. Những ngày sau, khuẩn lạc chuyển thành màu xám xanh, giữa đục xám. Có thể thấy khuẩn lạc dạng R (xù xì) và M (nhầy) [41] Môi trường thạch EMB: E. coli có khuẩn lạc tròn, hơi lồi, bóng, có ánh kim tím [41]. 24
  34. Đồ án tốt nghiệp E. coli lên men nhiều loại đường như glucose, galactose, lactose, xylose, ramnose, sinh acid và sinh hơi; indol dương tính, methyl đỏ dương tính, Voges Proskauer âm tính, citrat âm tính, urease âm tính, H2S âm tính [41]. E. coli đề kháng yếu, bị tiêu diệt bởi nhiệt độ 55°C trong 1 giờ, 60°C trong 30 phút và chết ngay ở 100°C. Tuy nhiên, ở môi trường bên ngoài các chủng E. coli độc có thể tồn tại tới 4 tháng [41]. Bình thường E. coli sống trong ruột người không gây bệnh. Khi cơ thể suy yếu một số chủng trở nên gây bệnh. E. coli không những gây bệnh đường ruột như tiêu chảy, kiết lỵ mà còn có thể gây một số bệnh khác như viêm đường tiết niệu, viêm gan, viêm phế quản, viêm màng phổi, E. coli O157:H7 là chủng vi khuẩn gây tiêu chảy phổ biến. Ở vài bệnh nhân vi khuẩn này có thể gây rối loạn máu và suy thận, thậm chí dẫn đến tử vong. Chúng ta có thể bị nhiễm E. coli qua tiếp xúc hay phơi nhiễm với phân người và phân động vật, kể cả gia cầm vì thỉnh thoảng phân người và động vật xâm nhập vào ao, hồ, sông hay nói chung là nguồn nước sinh hoạt. Vi khuẩn có thể lan truyền từ người sang người, thông thường qua người không rửa tay sau khi đi vệ sinh. E. coli cũng có thể lan truyền từ tay đến các vật dụng trong nhà. 1.4 Bệnh lý mụn trứng cá 1.4.1 Định nghĩa Mụn trứng cá là một bệnh lý thường gặp với lưu hành khoảng trên 80 – 90% trong độ tuổi dậy thì và cũng thường thấy sau độ tuổi thanh thiếu niên, người lớn trẻ, có khi kéo dài đến tuổi trung niên. Mụn trứng cá là tình trạng viêm nhiễm ở nang lông tuyến bã, liên quan tới sự tăng tiết bã nhờn và sự hình thành nhân trứng cá. Các tổn thương được hình thành do sự tăng tiết chất bã nhờn bị ứ đọng trong các nang lông bởi tình trạng bít tắc sự lưu thông của tuyến bã, đi kèm với tình trạng viêm nhiễm, thông qua sự phát triển của các vi trùng sinh mụn trong các đơn vị 25
  35. Đồ án tốt nghiệp nang lông tuyến bã [36]. 1.4.2 Sinh bệnh học của mụn trứng cá Hình 1.13. Cơ chế gây bệnh trứng cá Có nhiều yếu tố gây mụn trứng cá nhưng có 4 nhân tố chính: Tăng sinh thượng bì nang lông: Biểu mô của phần trên nang lông, vùng phễu, bắt đầu tăng sừng với gia tăng sự kết dính các tế bào sừng. Nút này gây nên chảy xuôi dòng các khối chất sừng, chất bã, vi khuẩn đến tích tụ tại nang lông, làm dãn phần trên của nang lông, tạo thành các cồi mụn nhỏ. Sự sản xuất quá nhiều chất bã: Bệnh nhân mụn trứng cá sản xuất nhiều chất bã hơn người không bị mụn trứng cá. Cùng với sự hiện diện của một loại vi khuẩn trong bệnh mụn trứng cá là Propionibacterium acnes, gây nên hiện tượng viêm và tạo thành cồi mụn. Các nội tiết tố androgen: Ảnh hưởng trên sự sản xuất chất bã, bằng cách kết hợp và ảnh hưởng lên hoạt tính của các tế bào bã tương tự như tác động trên các tế bào sừng ở phễu nang lông. Hiện tượng viêm: Các cồi nhỏ liên tục giãn nở do sự tập trung dày đặc chất sừng, chất bã, vi khuẩn 26
  36. Đồ án tốt nghiệp vào trong lớp bì gây nên đáp ứng viêm. Vai trò của Propionibacterium acnes. P.acnes giữ vai trò tác động trong tiến trình viêm, đây là một trực khuẩn Gram (+), yếm khí và hiếu khí nhẹ [39]. 1.4.3 Các yếu tố liên quan đến sinh bệnh học mụn trứng cá Các cá thể có nguy cơ cao phát triển mụn trứng cá bao gồm những người mang gen có nhiễm sắc thể XYY hoặc có các rối loạn nội tiết như hội chứng buồng trứng đa năng, cường androgen, tăng cortisol máu và dậy thì sớm. Những bệnh nhân này thường có mụn trứng cá nặng và không đáp ứng với các điều trị tiêu chuẩn. Các dạng mụn trứng cá Hình 1.14. Các dạng mụn trứng cá Mụn trứng cá ở trẻ sơ sinh Xảy ra vào khoảng trên 20% trẻ sơ sinh khỏe mạnh. Tổn thương thường xuất hiện vào khoảng 2 tuần tuổi và mất đi hoàn toàn trong vòng 3 tháng. Tổn thương căn bản là các sẩn hồng ban nhỏ ở mặt và cổ, thường thấy vắt ngang qua cầu mũi và ở hai gò má, không có hiện diện cồi mụn. Bệnh còn gọi là “bệnh mụn mủ ở đầu của trẻ sơ sinh”. Mụn trứng cá ở trẻ nhỏ: Xuất hiện ở độ tuổi 3 – 6 tháng và thường có sự hiện diện của cồi mụn. Sẩn, mụn mủ, nốt có thể cũng xuất hiện ở mặt và sẹo có thể xảy ra cho dù bệnh nhẹ. Mụn trứng cá thông thường: Đa số trường hợp khởi phát tổn thương quanh độ tuổi dậy thì. Một số trường hợp khác có thể thấy từ tuổi sơ sinh hoặc trẻ nhỏ. Cường androgen được nhận thấy ở các bệnh nhân nữ mà họ có mụn trứng cá 27
  37. Đồ án tốt nghiệp nặng, khởi phát đột ngột, hoặc phối hợp với rậm lông hoặc chu kỳ kinh nguyệt không đều. Các tổn thương dạng cồi mụn là các tổn thương sớm của mụn trứng cá, không có hiện tượng viêm. Gồm 2 loại: cồi đóng và cồi mở Cồi đóng (mụn đầu trắng) là tổn thương ở nang lông phẳng hoặc hơi nhô lên, màu sắc như da thường. Cồi mở (mụn đầu đen) là các tổn thương hơi nhô lên, trung tâm nang lông có màu đen do nêm chặt chất sừng và lipid. Mụn trứng cá ác tính. Còn gọi là mụn trứng cá loét và sốt cấp tính. Khởi phát đột ngột, nặng, thường gây loét, sốt, viêm đa khớp. Bệnh hiếm gặp, thường thấy ở nam giới trẻ có tiền căn mụn trứng cá. Hình ảnh lâm sàng giống như mụn trứng cá cụm, có rất nhiều các nốt viêm trên thân mình, lưng, ngực, không có ở mặt. Các nốt lớn hoặc các mảng viêm, tạo thành các vết loét đau với bờ nhô cao bao quanh các mảng hoại tử xuất tiết, lành để lại sẹo. Các nốt hồng ban tân sinh mạch máu có thể nhìn thấy. Bệnh nhân có mụn trứng cá ác tính và viêm nang lông dạng mụn trứng cá có thể có viêm xương - tủy xương đa ổ vô trùng [39]. 1.4.4 Điều trị Việc điều trị mụn trứng cá cần áp dụng các nguyên tắc: - Kiêng ngọt, giảm chất béo. - Tôn trọng cấu trúc da. Không cắt, lể, nặn mụn không đúng phương pháp. - Tránh sử dụng mỹ phẩm, corticoid bôi. - Vệ sinh da, sạch, thoáng. - Không dùng kem trộn, các loại kem có chứa chất corticoid để bôi lên mặt vì có nhiều biến chứng độc hại. 28
  38. Đồ án tốt nghiệp - Tránh lo âu, thức khuya, mất ngủ. - Chế độ ăn cần hạn chế đường, mỡ. Nên ăn nhiều rau, trái cây ít ngọt, tập thể dục thể thao đều đặn, chế độ làm việc không quá căng thẳng sẽ góp phần hạn chế sự bùng phát các tổn thương mụn trứng cá và cải thiện chức năng của da [39]. 1.5 Giới thiệu kem bôi trị mụn Công dụng và yêu cầu: Kem bôi trị mụn dùng để bảo vệ da và làm đẹp da đã được tẩy sạch, làm mất lớp dầu trên da để các mỹ phẩm khác dễ dàng bám lên da. Khi sử dụng, kem phải lan nhanh ra trên da và dường như biến mất ngay sau khi bôi lên da. Kem còn có tác dụng trị mụn, giữ ẩm làm mềm mại da. Tùy theo yêu cầu mà kem bôi còn có khả năng chống nắng để bảo vệ da khi sử dụng (ZnO + TiO2) nếu sản phẩm đục, hoặc ester anthranilat của alcol mạch dài trong sản phẩm trong. Thành phần: o Kem trị mụn có đặc điểm: kem bôi ở dạng nhũ o/w với 15 – 30% O: t nc > 0 o 0 50 C, kem nền ở dạng nhũ o/w với 20 – 35% O, t nc = 40 – 55 C. Công thức o 0 truyền thống dựa trên tướng dầu là acid stearic. Tướng dầu (t nc > 50 C) kết tinh ở dạng thích hợp nên khi dùng sẽ không nhìn thấy và để lại lớp film không dầu trên da. Tướng dầu sử dụng acid stearic không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và tạo nên màu hấp dẫn cho sản phẩm (màu óng ánh ngọc trai). Công thức sử dụng chất nhũ hóa là xà phòng và thường được thêm một lượng thích hợp kiềm để trung hòa acid béo tự do. Ngoài ra còn chứa các chất làm mềm, chất làm ẩm, chất chống nắng, hương và chất bảo quản [16]. 29
  39. Đồ án tốt nghiệp Kết luận chương 1: Như vậy đề tài đã nghiên cứu được cơ sở khoa học để hoàn thành nhiệm vụ nghiên cứu thứ nhất của đề tài với những nội dung cơ bản như sau: - Tổng quan về bưởi: vị trí phân loại, nguồn gốc, đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, lợi ích của bưởi, thu hoạch và bảo quản, một số giống bưởi ở miền Nam. - Tổng quan về tinh dầu, ứng dụng của tinh dầu bưởi trong đời sống. - Tổng quan về các chủng vi sinh vật thử nghiệm - Bệnh lý mụn trứng cá - Giới thiệu về kem trị mụn. Những cơ sở khoa học này là phần quan trọng giúp làm tiền đề thiết kế các thí nghiệm đúng bản chất khoa học ở chương 2. 30
  40. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm Thí nghiệm được tiến hành tại Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực phẩm – Môi trường trường đại học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh. Địa chỉ: 475A Điện Biên Phủ, phường 25, quận Bình Thạnh, thành phố Hồ Chí Minh. 2.2 Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 6 năm 2015 đến tháng 8 năm 2015 2.3 Vật liệu 2.3.1 Nguyên liệu - Quả bưởi da xanh thu mua ở Bến Tre - Quả bưởi năm roi thu mua ở Vĩnh Long - Quả bưởi lông cổ cò thu mua ở Tiền Giang - Các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas spp., Staphylococcus aureus được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM. 2.3.2 Dụng cụ, thiết bị Thiết bị: - Bộ chưng cất tinh dầu - Autoclave (Memmert – Đức). - Cân phân tích, cân kỹ thuật. - Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmert – Đức), tủ sấy (Memmert – Đức). - Bếp điện - Bể điều nhiệt Dụng cụ: 31
  41. Đồ án tốt nghiệp - Bao PE - Bông thấm nước, bông không thấm nước. - Pipetman 100 µl, 1000 µl. - Becher 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000ml - Erlen 250 m. - Đĩa Petri - Que cấy trang - Đèn cồn - Ống đong. - Pipette. - Lọ thủy tinh. - Đũa thủy tinh. - Ống nghiệm. - Phễu thủy tinh. - Phễu chiết. - Giấy lọc. 2.3.3 Hóa chất - Các hóa chất để pha môi trường TSA, TSB - Na2SO4 - NaCl - Acid stearic - Alcol cetyl - Potassium hydroxide - Glycerin - Nước deion - Ethnol 960 và ethanol 700 32
  42. Đồ án tốt nghiệp 2.4 Phương pháp nghiên cứu Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm với các nội dung Nội dung nghiên cứu Ứng dụng sản Khảo sát thời gian Đánh giá hoạt xuất kem trị trích ly tinh dầu 3 lực kháng mụn loại bưởi khuẩn Pseudomona Staphylococcus E.coli Điều chế Xét nghiệm Đánh giá s aeruginosa aureus kem trị tại viện hiệu quả mụn Pasteur trị mụn Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 2.4.1 Tiến hành trích ly tinh dầu và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng Quy trình trích ly tinh dầu vỏ bưởi bằng phương pháp chưng hơi nước: 33
  43. Đồ án tốt nghiệp Vỏ bưởi Rửa sạch Gọt thu lớp vỏ ngoài chứa tinh dầu Bỏ cùi trắng Xay nhuyễn Bổ sung nước muối 15% vào nguyên liệu tỷ lệ 6:1 Chưng cất bằng lôi cuốn hơi nước Khảo sát thời gian trích ly tinh dầu Thu hỗn hợp dầu và nước Loại nước trong hỗn hợp tinh dầu nước bằng Na2SO4 Tinh dầu Bưởi Bảo quản Hình 2.2. Sơ đồ quy trình chưng cất tinh dầu 34
  44. Đồ án tốt nghiệp a) Thuyết minh quy trình : - Vỏ bưởi sau gọt sạch lớp vỏ trắng (chú ý không gọt quá sâu có thể làm vỡ cái túi chứa tinh dầu), ảnh hưởng đến kết quả khảo sát, cắt từng miếng nhỏ khoảng 2x3 (cm). Sau đó, cân chính xác 50g (±0,001 g) xay nhuyễn vỏ bưởi trong trong máy xay. Hình 2.3. Hình dang vỏ các loại bưởi khi thu mẫu - Quá trình xay giúp dễ dàng trích ly được tinh dầu trong quá trình chưng cất. Hình 2.4. Vỏ bưởi sau khi xay 35
  45. Đồ án tốt nghiệp - Lắp đặt hệ thống chưng cất hơi nước và chưng trong khoảng từ 30 phút đến 60 phút để lấy tinh dầu vỏ bưởi ở dạng thô. - Sau quá trình chưng cất là quá trình lắng và làm sạch tinh dầu. Để cho việc tách tinh dầu ra dễ dàng, phân lớp rõ ràng của lớp nước và tinh dầu. Cho thêm nước muối bão hòa vào hỗn hợp nước và tinh dầu để tăng tỷ trọng nước chưng. - Sau khi tách tinh dầu ra khỏi hỗn hợp nước chưng thì tiếp tục cho khoảng 5 g Na2SO4 khan để làm khan triệt để những hạt nước còn nằm trong lớp tinh dầu. - Lấy phần nước chưng còn lẫn ít tinh dầu trữ lại và đem chưng lại để thu tinh dầu triệt để hơn. - Thu tinh dầu đã được làm sạch và bảo quản. Tinh dầu vỏ bưởi là hỗn hợp các hợp chất có chứa liên kết đôi trong phân tử nên rất dễ bị quang hóa và bị oxy hóa bởi oxy không khí. Vì vậy, quá trình bảo quản tinh dầu phải đựng trong các lọ dung tích khoảng 5 – 10 ml, sẫm màu, được bịt kín bằng nút cao su và cho tinh dầu vào lọ sao cho lượng không khí trong lọ càng ít càng tốt. Tinh dầu vỏ bưởi được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 40C. - Tính toán kết quả và so sánh lượng tinh dầu của các loại bưởi. Đem tinh dầu các loại bưởi đi bảo quản và thử hoạt tính sinh học Các thông số như: tỷ lệ dung môi (nước), muối đã được kế thừa từ đề tài của Lương Đức Vỉnh (2014) . Theo tài liệu thì tỷ lệ dung môi thích hợp là 6/1 (thể tích dung môi/khối lượng vỏ bưởi), tỷ lệ muối/khối lượng nguyên liệu là 15% . Do vậy đề tài chỉ tập trung khảo sát thời gian chưng cất hỗn hợp các loại bưởi với khối lượng 50 g và so sánh xem loại bưởi nào thu được thế tích tinh dầu cao nhất. b) Khảo sát các yếu tố thời gian đến quá trình trích ly của các loại vỏ bưởi: Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian thích hợp đến quá trình trích ly tinh dầu các loại vỏ bưởi với mục đích thu được lượng tinh dầu nhiều nhất 36
  46. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.5. Bộ chưng cất lôi cuốn hơi nước 37
  47. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng khuẩn Quy trình đánh giá hoạt lực kháng khuẩn 3 loại tinh dầu Vi khuẩn thuần Tăng sinh Pha loãng Cấy trang Đục lỗ Nhỏ tinh dầu, kháng sinh đối chứng Để trong tủ ấm 370 C , trong 24 giờ Đo kích thước vòng vô khuẩn và chụp hình Hình 2.6. Quy trình đánh giá hoạt lực kháng khuẩn của 3 loại tinh dầu a. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị tinh dầu nguyên chất của 3 loại bưởi: bưởi năm roi, bưởi da xanh, bưởi lông cổ cò 38
  48. Đồ án tốt nghiệp Chuẩn bị 3 loại vi khuẩn: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, E.coli Chuẩn bị mẫu thuốc kháng sinh để đối chiếu Cân chính xác 100 mg thuốc kháng sinh cần thử, hóa tan vào 10 ml nước cất, nếu thuốc không tan trong nước thì hòa tan với DMSO, ta sẽ được nồng độ dung dịch mẹ 10 mg/ml. Dung dịch để bảo quản trong tủ lạnh [12]. b. Chuẩn bị môi trường Thạch nền: sử dụng môi trường TSA, pha TSA vào nước cất sau đó hấp khử trùng 1210C, 1 atm, 15 phút. Để nguội đến khoảng 500C đến 600C sau đó đổ vào các đĩa pitri đã tiệt trùng. Để nguội sau đó úp ngược đĩa pitri lại. Môi trường lỏng: sử dụng môi trường TSB, pha 6 g TSB vào 200 ml nước cất sau đó chia ra làm 4 lọ để hấp khử trùng 1210C, 1 atm, 15 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng sau đó cấy E.coli vào lọ số (1), Staphylococcus aureus vào lọ số (2), cấy Pseudomonas aeruginosa vào lọ số 3, còn lọ số (4) dùng để set máy. Sau đó mang đi lắc. Chuẩn bị 20 ống nước muối sinh lý 0,9 % hấp khủ trùng 1210C, 1 atm, 15 phút. c. Ngyên tắc Các hợp chất kháng khuẩn có trong tinh dầu sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu tinh dầu có khà năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Từ đó, xác định được hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng đường kính vòng kháng khuẩn (mm). d. Tiến hành Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: Lấy sinh khối vi khuẩn hòa vào ống nghiệm chứa 2 ml nước muối sinh lý vô trùng (NaCl 0,9%), lắc đều. Độ đục của huyền dịch vi khuẩn được so sánh với độ đục chuẩn 0,5 McFarland. 39
  49. Đồ án tốt nghiệp Hút 0.1 ml dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa và đạt mật độ 108, 107, 106, 105 CFU/ml lên mặt thạch TSA và tiến hành trang đều cho tới khô. Sau đó tạo 5 giếng có đường kính 6 mm trên đĩa thạch và nhỏ 50 µl tinh dầu vào 4 giếng,1 giếng còn lại nhỏ 50 µl kháng sinh ĐC, giữ yên trong vòng 1 giờ để tinh dầu và kháng sinh ĐC có thể khuếch tán vào môi trường thạch. Cuối cùng, các đĩa được đem ủ trong tủ ấm 370C trong 24 giờ và tiến hành đọc kết quả thông qua việc đo đường kính vòng ức chế (mm) (Aibinu, 2007). Phương pháp thu thập và xử lý số liệu Đối với thạch đục lỗ: dùng xilanh hút hết nước nếu có trong giếng thạch, dùng thước đo vòng vô khuẩn (tính bằng mm) và chụp hình. So sánh đường kính vòng vô khuẩn của tinh dầu với kháng sinh. Phương pháp tính toán Kết quả đường kính vòng vô khuẩn thu được qua 3 lần thí nghiệm lặp lại tính trung bình Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với dịch chiết được phân loại dựa theo đường kính vòng vô khuẩn: Đường kính vòng vô khuẩn 20 mm: cực nhạy (theo Celikel và Kavas, 2008) 40
  50. Đồ án tốt nghiệp 2.5 Phối chế kem bôi trị mụn Dụng cụ – Thiết bị: Dụng cụ Cốc thủy tinh 100 ml : 06 Ống nghiệm ly tâm : 04 Đũa khuấy : 02 Lưới amiăng : 02 Nhiệt kế 1000 C : 01 Đĩa nhựa : 04 Giấy pH : 01 Muỗng nhựa : 04 Bình chứ sản phẩm : 02 Thiết bị Bể điều nhiệt : 01 Cân điện 4 số : 01 Cân điện 2 số : 01 Kính hiển vi : 01 Hóa chất: Acid stearic : 9,00 g Alcol cetyl : 0,3 g Potassium hydroxide: 0,39 g Tinh dầu : Khảo sát từ 0,25% – 1% Glycerine : 3,00g Nước deion : 47,31 g Cách tiến hành (i) Chuẩn bị tướng dầu (cốc O): Cho acid stearic, alcol cetyl vào cốc thủy tinh đun nhẹ, lắc đều, không khuấy cho đến khi chảy hoàn toàn trên bếp điện. Khi đun phải lót lưới amiang (ii) Chuẩn bị tướng nước (cốc W): Hòa tan Potassium hydroxide, glycerine vào nước. 41
  51. Đồ án tốt nghiệp (iii) Khuấy tạo kem (Thực hiện trong bể điều nhiệt) Đặt cốc W vào bể điều nhiệt ở nhiệt độ khoảng 50 − 600 C. Lấy cốc O ra khỏi bếp điện, dùng khăn lau nhẹ để giảm nhiệt độ từ từ, sau đó đặt vào bể điều nhiệt, để ổn định nhiệt độ trong 2 phút. Sau khi ổn định nhiệt độ, tiến hành khuấy tạo kem bằng cách cho từng giọt tướng nước vào tường dầu. Sau đó tiếp tục khuấy trong 45 phút. Khi kem đã nhũ bền, kiểm tra pH và hiệu chỉnh nếu cần thiết bằng dung dịch acid citric bão hoà, đưa về pH 5.5−6.5. Cho tinh dầu vào khuấy đều. Rót kem vào bình lưu trữ, để ổn định [16]. 42
  52. Đồ án tốt nghiệp Quy trình sản xuất kem trị mụn Tướng dầu Tướng nước Trộn tướng dầu và tướng nước Kiểm tra và điều chỉnh pH Bổ sung tinh dầu với nồng độ khảo sát khác nhau Khuấy kem với tinh dầu Rót kem để ổn định Sản phẩm kem trị mụn Hình 2.7. Sơ đồ quy trình sản xuất kem trị mụn 43
  53. Đồ án tốt nghiệp 2.6 Các thí nghiệm khảo sát • Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian chưng cất Bảng 2.1. Các thông số sử dụng để khảo sát thời gian chưng cất Thí nghiệm 3 Các nghiệm thức Thời gian 35 40 45 50 55 60 (phút) phút phút phút phút phút phút Các thí nghiệm lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình • Thí nghiệm 2: Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn • Thí nghiệm 3: Thử nghiệm điều chế kem trị mụn và thử hoạt tính 44
  54. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả khảo sát thời gian chưng cất tinh dầu của các loại bưởi Sau khi khảo sát thời gian chưng cất với các nghiệm thức đề tài đã thu được các thông số sau Vỏ bưởi được rửa sạch để loại bỏ tạp chất, cắt nhỏ, cho 50 g ± 0,001 g vỏ bưởi vào máy xay, chưng cất lôi cuốn theo hơi nước thu lấy tinh dầu bưởi. Tinh dầu này o được làm khan với bột Na2SO4 khan (đã sấy 105-110 C x 1 giờ). Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả khảo sát thời gian chưng cất tinh dầu 3 loại bưởi Hàm lượng Hàm lượng tinh Hàm lượng tinh Loại bưởi tinh dầu bưởi dầu bưởi da xanh dầu bưởi lông cổ năm roi (ml/100 g) cò (ml/100 g) Thời gian chưng cất (ml/100 g) 35 phút 0,84 % 0,90 % 1,24 % 40 phút 1,12 % 1,32 % 1,94 % 45 phút 1,70 % 1,90 % 2,04 % 50 phút 2,06 % 2,34 % 2,70 % 55 phút 2,22 % 2,50 % 3,04 % 60 phút 2,22 % 2,50 % 3,04 % Nhận xét: Hàm lượng tinh dầu đạt tiêu chuẩn DĐVN III Thời gian chưng cất càng lâu lượng tinh dầu thu được càng nhiều. Tuy nhiên, đến một thời điểm nào đó thì lượng tinh dầu thu được không tăng mặc dù thời gian kéo dài thêm. Mặt khác, kéo dài thời gian chưng cất còn ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu do nguyên liệu bị cháy khét làm mất mùi thơm tự nhiên của tinh dầu, đồng thời năng lượng tiêu tốn nhiều dẫn đến chi phí sản xuất tăng, không có hiệu quả về kinh tế. 45
  55. Đồ án tốt nghiệp Nhiệt độ chưng cất pha hơi: t ≈ 970C, tại nhiệt độ này tinh dầu cuốn theo hơi nước bay lên và ngưng tụ cùng với hơi nước và nhiệt độ giữ ổn định trong suốt thời gian chưng cất. Trên lý thuyết thì thời gian chưng cất phải được khảo sát từ 5 phút khi bắt đầu có hơi ngưng tụ. Trên thực tế, khoảng thời gian chưng cất 5 – 30 (phút) lượng tinh dầu thu được khó xác định thể tích. Cho nên đề tài lựa chọn khoảng thời gian chưng cất bắt đầu thu tinh dầu là 35 phút để dễ dàng xác định gần đúng thể tích tinh dầu tạo ra. Quá trình chưng cất sẽ khảo sát trong khoảng thời gian 5 phút lấy tinh dầu một lần. Sau khoảng thời gian này lượng tinh dầu thu được không thay đổi nhiều và đồng thời quá trình chưng cất cũng bắt đầu kết thúc (các giọt nước ngưng không còn tinh dầu). Qua kết quả khảo sát lượng tinh dầu ở bảng 3.1 lượng tinh dầu sẽ tăng dần khi tăng thời gian chưng cất hỗn hợp. Tuy nhiên, lượng tinh dầu này sẽ không tăng nữa khi ta tiếp tục chưng cất. Vì thế thời gian chưng cất thích hợp được chọn là 55 (phút) So sánh với kết quả của Lương Đức Vỉnh (2014) cùng làm trên vỏ bưởi năm roi thì thời gian thu tinh dầu là 50 phút so với kết quả của tác giả là 55 phút do khối lượng nguyên liệu thử nghiệm khác nhau. Hàm lượng tinh dầu thu được của bưởi lông cổ cò lớn nhất là 3,04 %, sau đó bưởi da xanh là 2,34 % và cuối cùng là bưởi năm roi 2,22% ml. So với kết quả của Lương Đức Vỉnh (2014) làm trên vỏ bưởi năm roi thì thu được hàm lượng tinh dầu bưởi năm roi là 2,22 %. Điểm mới của đề tài là tính được hàm lượng tinh dầu của bưởi lông cổ cò và bưởi da xanh mà chưa tìm thấy tài liệu tham khảo nào đề cập đến. 3.2 Thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu các loại bưởi 3.2.1 Hoạt tính kháng Pseudomonas aeruginosa của các loại bưởi Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bưởi được thể hiện trong bảng 3.2 qua đường kính vùng ức chế (bao gồm cả đường kính đục lỗ thạch, 6 mm). 46
  56. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2. Kết quả kháng Pseudomonas aeruginosa của tinh dầu các loại bưởi Nồng độ vi khuẩn Đường kính vòng vô khuẩn (mm) 108 107 106 105 Các loại tinh dầu Tinh dầu bưởi năm roi 7,0a ± 0,29 8,0b ± 0,29 8,5b ± 0,0 9,0c ± 0,29 Tinh dầu bưởi lông cổ 9,0a ± 0,29 9,5b ± 0,29 11,0c ± 0,0 12,0d ± 0,29 cò Tinh dầu bưởi da xanh 10,0a ± 0,08 11,0b ± 12,0c ± 12,5d ± 0,08 0,08 0,08 Kháng sinh ĐC 9,0a ± 0,12 9,0a ± 0,12 10,0b ± 11,0c ± 0,12 0,12 Nhận xét: Dựa theo kết quả đưa ra trong bảng 3.2, cho thấy rằng tinh dầu bưởi nói chung đều có khả năng ức chế khá mạnh vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa – trực khuẩn Gram âm điển hình thường thấy trong các bệnh lý về da. Đường kính vòng vô khuẩn Pseudomonas aeruginosa của tinh dầu bưởi năm roi là 8.5 mm, tinh dầu bưởi lông cổ cò là 11 mm, của tinh dầu bưởi da xanh là 12mm. So sánh với kết của F.GÜLAY KIRBAŞLAR et.al (2009) đăng trên tạp chí Pak.J. Bot thử nghiệm trên Citrus paradisi Macfeyden ở nồng độ vi khuẩn là 106 thì bưởi da xanh cho vòng vô khuẩn giống với kết quả của F.GÜLAY KIRBAŞLAR et.al,. Đề tài đã khảo sát thêm hoạt tính kháng khuẩn ở các nồng độ khác như 108, 107, 105 mà chưa có tài liệu thao khảo nào đề cập đến. Trong đó kích thước vòng vô khuẩn của tinh dầu bưởi năm roi là 9 mm, bưởi lông cổ cò là 12 mm, da xanh lớn nhất là 12,5 mm ở nồng độ vi khuẩn là 105 cfu/ml 47
  57. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.1. Kết quả kháng Hình 3.2. Kết quả kháng Pseudomonas aeruginosa của Pseudomonas aeruginosa của tinh dầu bưởi lông cổ cò tinh dầu bưởi da xanh Hình 3.3. Kết quả kháng Pseudomonas aeruginosa của tinh dầu bưởi năm roi 48
  58. Đồ án tốt nghiệp 3.2.2 Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của các loại tinh dầu bưởi Kết quả hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu bưởi được thể hiện trong bảng 3.3 qua đường kính vùng ức chế (bao gồm cả đường kính đục lỗ thạch, 6 mm). Bảng 3.3. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của 3 loại tinh dầu bưởi Nồng độ vi khuẩn Đường kính vòng vô khuẩn (mm) 108 107 106 105 Các loại tinh dầu Tinh dầu bưởi năm 7,0a ± 0,0 7,5b ± 0,0 7,5b ± 0,29 8,0c ± 0,0 roi Tinh dầu bưởi lông 9,0a ± 0,0 9,5b ± 0,0 10,0c ± 0,29 10,5d ± 0,29 cổ cò Tinh dầu bưởi da 11,0a ± 0,0 12,0b ± 0,29 12,5c ± 0,0 13,0d ± 0,0 xanh Kháng sinh ĐC 9,0a ± 0,0 9,0a ± 0,29 10,0b ± 0,0 11,0c ± 0,29 Nhận xét: Dựa theo kết quả đưa ra trong bảng 3.3, cho thấy rằng tinh dầu bưởi nói chung đều có khả năng ức chế khá mạnh vi khuẩn Staphylococcus aureus – trực khuẩn Gram dương điển hình. Đường kính vòng vô khuẩn Staphylococcus aureus của tinh dầu bưởi năm roi là 7.5 mm, tinh dầu bưởi lông cổ cò là 10 mm, của tinh dầu bưởi da xanh là 12.5 mm. So sánh với kết của F.GÜLAY KIRBAŞLAR et.al (2009) đăng trên tạp chí Pak.J. Bot thử nghiệm trên Citrus paradisi Macfeyden ở nồng độ vi khuẩn là 106 thì bưởi da xanh cho vòng vô khuẩn lớn hơn với kết quả của F.GÜLAY KIRBAŞLAR et.al (11 mm),. Đề tài đã khảo sát thêm hoạt tính kháng khuẩn ở các nồng độ khác như 108, 107, 105 mà chưa có tài liệu thao khảo nào đề cập đến. Trong đó kích thước vòng vô khuẩn của tinh dầu bưởi năm roi là 8 mm, 49
  59. Đồ án tốt nghiệp bưởi lông cổ cò là 10 mm, da xanh lớn nhất là 13 mm ở nồng độ vi khuẩn là 105 cfu/ml Hình 3.4. Kết quả kháng Hình 3.5. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của tinh Staphylococcus aureus của tinh dầu bưởi da xanh dầu bưởi năm roi Hình 3.6. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của tinh dầu bưởi lông cổ cò 50
  60. Đồ án tốt nghiệp 3.2.3 Hoạt tính kháng E.coli của tinh dầu các loại bưởi Kết quả hoạt tính kháng E.coli của tinh dầu bưởi được thể hiện trong bảng 3.4 qua đường kính vùng ức chế (bao gồm cả đường kính đục lỗ thạch, 6 mm). Bảng 3.4. Kết quả kháng E.coli của tinh dầu 3 loại bưởi Nồng độ vi khuẩn Đường kính vòng vô khuẩn (mm) 108 107 106 105 Các loại tinh dầu Tinh dầu bưởi năm roi 10,0a ± 0,0 11,0b ± 12,0c ± 13,0d ± 0,0 0,29 0,29 Tinh dầu bưởi lông cổ cò 12,0a ± 0,0 13,0b ± 13,5c ± 14,5d ± 0,0 0,29 0,29 Tinh dầu bưởi da xanh 13,0a ± 0,29 14,0b ± 0,0 14,5c ± 15,0d ± 0,29 0,29 Kháng sinh ĐC 10,0a ± 0,0 10,0a ± 10,5b ± 10,0c ± 0,29 0,29 0,29 Nhận xét: Dựa theo kết quả đưa ra trong bảng 3.2, cho thấy rằng tinh dầu bưởi nói chung đều có khả năng ức chế khá mạnh vi khuẩn E.coli thường thấy trong các bệnh lý về da. Đường kính vòng vô khuẩn E.coli của tinh dầu bưởi năm roi là 12 mm, tinh dầu bưởi lông cổ cò là 13,5 mm, của tinh dầu bưởi da xanh là 14,5 mm. So sánh với kết của F.GÜLAY KIRBAŞLAR et.al (2009) đăng trên tạp chí Pak.J. Bot thử nghiệm trên Citrus paradisi Macfeyden ở nồng độ vi khuẩn là 106 thì 3 loại bưởi cho vòng vô khuẩn lớn hơn so với kết quả của F.GÜLAY KIRBAŞLAR et.al (10 mm),. Đề tài đã khảo sát thêm hoạt tính kháng khuẩn ở các nồng độ khác như 108, 107, 105 mà chưa có tài liệu thao khảo nào đề cập đến. Trong đó kích thước vòng vô khuẩn của tinh dầu bưởi năm roi là 13 mm, 51
  61. Đồ án tốt nghiệp bưởi lông cổ cò là 14,5 mm, da xanh lớn nhất là 15 mm ở nồng độ vi khuẩn là 105 cfu/ml. Hình 3.7. Kết quả kháng E.coli của tinh Hình 3.8. Kết quả kháng E.coli của dầu bưởi năm roi tinh dầu bưởi lông cổ cò Hình 3.9. Kết quả kháng E.coli của tinh dầu bưởi da xanh 52
  62. Đồ án tốt nghiệp Như vậy: Kết quả khảo sát của 3 chủng vi khuẩn cho thấy rằng tinh dầu bưởi có khả năng ức chế cả vi khuẩn gram âm và gram dương, đặc biệt những chủng vi khuẩn này là những vi khuẩn điển hình của hệ vi sinh vật ở da. Trong đó tinh dầu bưởi da xanh cho kết quả kháng tốt nhất với tất cả các loại vi khuẩn. Đường kính vòng vô khuẩn nhạy với Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus, rất nhạy với E.coli. Đây là cơ sở thiết thực cho việc nghiên cứu để điều chế kem trị mụn từ tinh dầu bưởi. 53
  63. Đồ án tốt nghiệp 3.3 Kết quả thử nghiệm kem trị mụn Bảng 3.5. Kết quả tìm ra tỉ lệ kem trị mụn thích hợp Tỷ lệ tinh Kết quả sau lần bôi 1 Kết quả sau lần bôi 2 Kết quả sau lần bôi dầu/kem tan 3 ĐC Mụn phát triển bình thường Mụn phát triển bình Mụn phát triển thường bình thường 0,25% Mụn phát triển bình Mụn phát triển bình Mụn phát triển thường, da mát thường, da mát bình thường, da mát 0,5% Mụn bắt đầu se lại Mụn bắt đầu se lại Mụn bắt đầu se lại 0,75% Mụn bắt đầu se lại Mụn bắt đầu se lại Mụn bắt đầu se lại 1% Da mặt nóng rát sau 15 Da mặt nóng rát sau 15 Kích ứng da, ngứa phút bôi phút bôi, mặt ửng đỏ Nhận xét: Ở tỷ lệ 0,25% cho thấy hiệu quả trị mụn chưa có tác dụng. Ở tỷ lệ 0,5% và 0,75% kết quả sau 3 lần bôi cho thấy các cồi mụn bắt đầu nổi lên sau đó bắt đầu se lại và sau từ 3 đến 4 ngày sử dụng mụn sẽ chóc ra. Đây là tỷ lệ kem tốt nhất. Ở tỷ lệ 1% sau thời gian bôi là 15 phút da mặt nóng rát, mặt ửng đỏ, gây kích ứng da. Nhạy cảm khi ra nắng. Ở tỷ lệ 0,5% và 0,75% đều cho thấy kết quả tốt nhưng để tiết kiệm chi phí sản xuất thì chọn tỷ lệ 0,5% là thích hợp nhất. - Đánh giá cảm quan về kem trị mụn theo phụ lục C ta có: Màu sắc: màu trắng sữa, đồng nhất Mùi: mùi tinh dầu thơm nhẹ 54
  64. Đồ án tốt nghiệp Sau khi bôi tạo cảm giác mát da, không làm kích ứng hay khô da, mụn se lại, dễ tróc, nhân mụn bị đẩy lên bề mặt Sau khi sử dụng kem thì hết mụn và vùng da được cải thiện tốt hơn - Kết quả xét nghiệm ở viện Pasteur cho kết quả đảm bảo theo TCVS Bảng 3.6. Kết quả xét nghiệm ở viện Pasteur TT YÊU CẦU THỬ KẾT QUẢ ĐƠN VỊ PP THỬ GIỚI HẠN NGHIỆM NGHIỆM 1 Tổng vi sinh vật <10 Cfu/g ISO 21149:2006 1000 hiếu khí 2 Pseudomonas Âm tính /g ISO 22717:2006 0 aeruginosa 3 Candida albicans Âm tính /g ISO 18416:2007 0 4 S.coagulase (+) Âm tính /g ISO 22718:2006 0 Nhận xét: Kết quả thử nghiệm đạt tiêu chuẩn vi sinh theo số 06:2011/TT-BYT theo phụ lục E 55
  65. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7. So sánh thời gian hết mụn của việc thoa kem và không thoa kem. Thoa kem Không thoa kem Tần số Tổng Tổng Thời gian (số thời )fi Tần số thời )fi người) gian gian Xi fi (Xi)fi fi (Xi)fi 12 giờ 2 24 288 0 0 0 24 giờ 4 96 2304 0 0 0 36 giờ 14 504 18114 0 0 0 48 giờ 5 240 11520 0 0 0 60 giờ 5 300 18000 1 60 3600 72 giờ 0 0 0 3 216 15552 84 giờ 0 0 0 6 504 42336 96 giờ 0 0 0 10 960 92160 108 giờ 0 0 0 5 540 58320 120 giờ 0 0 0 5 600 72000 30 1164 30 2880 Tổng 50226 283968 người giờ người giờ Điểm trung bình 38.8 96 Độ lệch chuẩn 13,21 16,07 56
  66. Đồ án tốt nghiệp Qua kết quả thống kê cho thấy: như vậy chứng tỏ rằng khi dùng kem trị mụn thì thời gian hết mụn nhanh hơn không dùng kem trị mụn Kiểm nghiệm giả thiết và kết luận Từ các dữ kiện đã thu nhập và chọn lọc được, người nghiên cứu tiến hành kiểm nghiệm giả thuyết bằng phương pháp so sánh trung bình (cỡ mẫu lớn, n1, n2 ≥ 30). 1. Trị số người dùng: gọi µ1, µ2 lần lượt là thời gian trung bình hết mụn của việc không thoa kem và thoa kem. 2. Các giả thuyết: H0: µ1 = µ2, không có sự khác biệt giữa thời gian hết mụn của thoa kem trị mụn và không thoa kem trị mụn. Ha: µ1 # µ2, có sự khác biệt giữa thời gian hết mụn của thoa kem trị mụn và không thoa kem trị mụn. 3. Mức ý nghĩa α=0.01 4. Trị số mẫu: là hiệu hai trung bình mẫu 5. Phân bố mẫu: là phân bố bình thường vì các mẫu đều lớn. 6. Biến số kiểm nghiệm Z = 7. Vùng bác bỏ Với α =0,01, tra bảng Z ta được Zα = 2,58 Nếu (-2,58≤ Zα ≤2,58) thì ta chấp nhận H0 Nếu (Z 2,58)ta bác bỏ giả thuyết H0 và chấp nhận giả thuyết H1 8. Áp dụng dữ kiện Ta có dữ kiện: - = 96 – 38,8 = 57,2 và 16,07 Thay các giá trị trên vào công thức ta được: 57
  67. Đồ án tốt nghiệp Z = = = = 15,1 Quyết định: Vì Z = 15,1 > Zn = 2,58, ta bác bỏ H0 và chấp nhận H1 9. Kết luận Vậy có sự khác biệt giữa thời gian hết mụn của thoa kem trị mụn và không thoa kem trị mụn. Nghĩa là việc bôi kem trị mụn có hiệu quả. Hơn nữa chứng tỏ việc sử dụng kem trị mụn có hiệu quả hơn việc không dùng kem trị mụn 58
  68. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.8. So sánh thời gian hết mụn của việc thoa kem và thoa kem không có tinh dầu. Thoa kem không có tinh Thoa kem có tinh dầu dầu Tần Thời gian số Tổng Tổng Tần (số thời )fi thời )fi số người gian gian ) Xi fi (Xi)fi fi (Xi)fi 12 giờ 2 24 288 0 0 0 24 giờ 4 96 2304 0 0 0 36 giờ 14 504 18114 1 36 1296 48 giờ 5 240 11520 3 144 6912 60 giờ 5 300 18000 3 180 10800 72 giờ 0 0 0 5 360 25920 84 giờ 0 0 0 5 504 35280 96 giờ 0 0 0 4 384 36864 108 giờ 0 0 0 7 756 81648 120 giờ 0 0 0 2 240 28800 30 1164 30 2604 Tổng 50226 227520 người giờ người giờ Điểm trung bình 38.8 86,8 Độ lệch chuẩn 13,21 7,17 59
  69. Đồ án tốt nghiệp Qua kết quả thống kê cho thấy: như vậy chứng tỏ rằng khi dùng kem trị có tinh dầu thì thời gian hết mụn nhanh hơn dùng kem không có tinh dầu Kiểm nghiệm giả thiết và kết luận Từ các dữ kiện đã thu nhập và chọn lọc được, người nghiên cứu tiến hành kiểm nghiệm giả thuyết bằng phương pháp so sánh trung bình (cỡ mẫu lớn, n1, n2 ≥ 30). 1. Trị số người dùng: gọi µ1, µ2 lần lượt là thời gian trung bình hết mụn của việc thoa kem không có tinh dầu và thoa kem có tinh dầu. 2. Các giả thuyết: H0: µ1 = µ2, không có sự khác biệt giữa thời gian hết mụn của việc thoa kem có tinh dầu và thoa kem không có tinh dầu Ha: µ1 # µ2, có sự khác biệt giữa thời gian hết mụn của việc thoa kem có tinh dầu và thoa kem không có tinh dầu. 3. Mức ý nghĩa α=0.01 4. Trị số mẫu: là hiệu hai trung bình mẫu 5. Phân bố mẫu: là phân bố bình thường vì các mẫu đều lớn. 6. Biến số kiểm nghiệm Z = 7. Vùng bác bỏ Với α =0,01, tra bảng Z ta được Zα = 2,58 Nếu (-2,58≤ Zα ≤2,58) thì ta chấp nhận H0 Nếu (Z 2,58)ta bác bỏ giả thuyết H0 và chấp nhận giả thuyết H1 Áp dụng dữ kiện Ta có dữ kiện: - = 86,8 - 38,8 = 48 và 7,17 Thay các giá trị trên vào công thức ta được: 60
  70. Đồ án tốt nghiệp Z = = = = 17,7 Quyết định: Vì Z = 17,7 > Zn = 2,58, ta bác bỏ H0 và chấp nhận H1 8. Kết luận Vậy có sự khác biệt giữa thời gian hết mụn của thoa kem có tinh dầu và thoa kem không có tinh dầu. Nghĩa là việc bôi kem có bổ sung tinh dầu có hiệu quả. Hơn nữa chứng tỏ việc sử dụng kem có tinh dầu có hiệu quả hơn việc thoa kem không có tinh dầu. Hình 3.10. Hình ảnh trước và sau khi sử dụng kem bôi trị mụn (Xem thêm phụ lục E) 61
  71. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết quả nghiên cứu thực nghiệm trên đối tượng 3 loại vỏ bưởi là bưởi năm roi, bưởi da xanh, bưởi lông cổ cò có thể rút ra một số kết luận sau: - Đã xây dựng quy trình trích ly tinh dầu 3 loại vỏ bưởi kết hợp với điều kiện thích hợp nhằm thu được lượng tinh dầu cao nhất có thể mà tốn ít năng lượng. - Bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước đã tách được tinh dầu các loại vỏ bưởi. Khối lượng vỏ bưởi thực nghiệm là 50 g/lần thí nghiệm, không đổi trong suốt quá trình khảo sát. Đã khảo sát được thời gian chưng cất tinh dầu vỏ bưởi cho các loại vỏ bưởi là 55 phút và tìm ra được loại bưởi cho tinh dầu cao nhất là bưởi lông cổ cò, sau đó là bưởi da xanh, cuối cùng là bưởi năm roi. Bảng 4.1. Hàm lượng tinh dầu thu được trong thời gian chưng cất 55 phút Tinh dầu các loại bưởi Hàm lượng tinh dầu thu được Hàm lượng tinh dầu bưởi năm 2,22% roi (ml/100 g) Hàm lượng tinh dầu bưởi da 2,50% xanh (ml/100 g) Hàm lượng tinh dầu bưởi lông 3,04% cổ cò (ml/100 g 62
  72. Đồ án tốt nghiệp Vỏ bưởi Rửa sạch Gọt thu lớp vỏ ngoài chứa tinh dầu Bỏ cùi trắng Xay nhuyễn Bổ sung nước muối có nồng độ 15% vào bình chưng cất tỷ lệ 6:1 Thời gian: t = 55 phút Thu hỗn hợp dầu và nước Làm khan bằng Na2SO4, tách và phân ly tinh dầu Thu được Bảo quản tinh dầu Hình 4.1. Sơ đồ quy trình chưng cất tinh dầu 63
  73. Đồ án tốt nghiệp - Kết quả khảo sát 3 loại vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, E.coli cho thấy tinh dầu bưởi có khả năng ức chế các loại vi khuẩn gram (+), gram (-). Trong 3 lọai vi khuẩn thì các loại tinh dầu bưởi kháng khuẩn mạnh nhất là E.coli, kháng khuẩn yếu nhất là Pseudomonas aeruginosa. Tinh dầu bưởi da xanh có hoạt lực kháng khuẩn mạnh nhất và được chọn để điều chế kem trị mụn. - Điều chế thành công kem trị mụn từ tinh dầu bưởi - Thử nghiệm kết quả kem trị mụn bổ sung tinh dầu bưởi cho kết quả tốt. Kết quả thử nghiệm cho thấy trung bình sau 38,8 giờ mụn được chữa khỏi hoàn toàn, vùng mụn không có dấu hiệu thâm, viêm nhiễm, mùi thơm nhẹ dịu tạo cảm giác dễ chịu cho người sử dụng. 64
  74. Đồ án tốt nghiệp Quy trình sản xuất kem trị mụn Tướng dầu: Tướng nước Trộn tướng dầu và tướng nước cho từng giọt tướng nước vào tướng dầu, khuấy trong 45 phút, nhiệt độ 600C Kiểm tra và điều chỉnh pH về 5.5 – 6.5 Bổ sung tinh dầu với nồng độ 0,5 % Khuấy kem với tinh dầu Rót kem để ổn định Sản phẩm Hình 4.2. Sơ đồ quy trình sản xuất kem trị mụn 65
  75. Đồ án tốt nghiệp 4.2 Kiến nghị Vì điều kiện thời gian, chi phí không cho phép nên đề tài mới chỉ xây dựng được quy trình trích ly tinh dầu các loại vỏ bưởi khu vực miền Nam với điều kiện thích hợp và thử hoạt tính kháng khuẩn, điều chế và thử nghiệm kem trị mụn. Trong khi đó các cây thuộc chi Citrus phân bố rộng rãi ở các vùng. Vì vậy, nếu có điều kiện cần tiếp tục nghiên cứu tinh dầu vỏ của các cây khác thuộc chi Citrus và ứng dụng vào sản xuất để tang nguồn lợi cho những người dân và nước nhà. Ý nghĩa khoa học của đề tài: So sánh được hàm lượng tinh dầu thu được từ 3 loại vỏ bưởi (bưởi năm roi, bưởi da xanh, bưởi lông cổ cò) mà chưa tham khảo được từ các tài liệu đã công bố Thử hoạt tính sinh học trị mụn thông qua việc tạo sản phẩm kem trị mụn tinh dầu bưởi trên người đạt tiêu chuẩn vi sinh của Bộ Y Tế theo số 06:2011/TT-BYT và chưa tham khảo được từ các tài liệu đã công bố. Ý nghĩa thực tế: Tận dụng được vỏ bưởi để tihu được tinh dầu trong sản xuất kem trị mụn nâng cao giá trị kinh tế từ bưởi. Tạo sản phẩm kem trị mụn có hiệu quả từ nguyên liệu rẻ tiền giúp cho giá thành sản phẩm giảm, có ý nghĩa về mặt kinh tế và tốt cho sức khỏe. 66
  76. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Đỗ Tất Lợi (2004). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. [2] Lã Đình Mỡi (2001). Tài nguyên thực vật có tinh dầu ở Việt Nam, NXB Nông Nghiệp [3] Lê Ngọc Thạch (2003). Tinh Dầu, NXB Đại học Quốc gia, Thành phố Hồ Chí Minh. [4] Lê Phạm Tân Quốc, Võ Ái Mỹ, Trịnh Thị Minh Nguyệt. Nghiên cứu tách chiết tinh dầu vỏ cam sành, Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh [5]Lương Đức Vỉnh (2014). Nghiên cứu trích ly tinh dầu vỏ bưởi năm roi, Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu [6] Lưu Thị Thủy (2009). Xác định thành phần tinh dầu vỏ quả bưởi thuộc họ cam (Rutaceae), Trường Đại học Vinh [7] Ngô Văn Tĩnh (2014), Nghiên cứu chiết tách tinh dầu cam, bưởi (Citrus) ứng dụng trong xử lý rác thải xốp, Đại học Thái Nguyên. [8] Nguyễn Minh Hoàng (2006). Khảo sát tinh dầu vỏ giống trái Citrus họ Rutaceae, Đại học Mở TPHCM. [9] Nguyễn Kim Phi Phụng, 2000-2001. Các phương pháp nhận danh; trích ly cô lập các hợp chất hữu cơ. Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên [10] Nguyễn Văn Thanh. Vi sinh học. Nhà Xuất Bản Y học [11]Th.s Nguyễn Ngọc Thanh (2010) Nghiên cứu chiết tách limonene và một số dẫn xuất từ nguồn gốc thực vật Việt Nam sử dụng trong lĩnh vực sát trùng gia dụng (phòng trừ côn trùng y tế) [12] PGS.TS Nguyễn Thượng Dong, 2006. Phương pháp nghiên cứu tác dụng được lý từ thảo dược. NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội [13] Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học 141, 171, 221(1997) 67
  77. Đồ án tốt nghiệp [14] Vi sinh vật y học. NXB Y học (2002) [15] Vũ Công Hậu (1999). Trồng cây ăn quả mjen nam. Nhà xuất bản nông nghiệp [16] Vương Ngọc Chính, Giáo trình Hương liệu – mỹ phẩm, Đại Học Bách Khoa TPHCM, (2007) Tài liệu tiếng Anh [17] Nationnal Institute of Nutritive – Ministry of Health (1995). Food products in Viet Nam – Composition and Nutritive. Medicine publisher. [18] Nevo Foundation, Netherlands Nutrition Centre (1996). Nevo tale. [19] E. Guenther. The Essential oils. VanNostrand, 2, 22-259 (1949) [20] F. GÜLAY KIRBAŞLAR, AYDIN TAVMAN, BAŞARAN DÜLGER, AND GÜLEN TÜRKER (2009). Pak. J. Bot., 41(6): 3207-3212, 2009. Tài liệu Internet [21] aeruginosa-infections [22] www.caythuocquy.info.vn [23] www.duoclieu.net/Dlieuhoc/chuong5.html [24] [25] tang-cuong-suc-khoe-vao-mua-dong.aspx [26] trung/tintuc/buoi-phuc-trach-1.html [27] www.hoahocngaynay.com/vi/nghien-cuu-giang-day/bai-nghien-cuu/86- pectinva-ung-dung.html [28] www.shsu.edu/chm_tgc/sounds/flashfiles/GC-MS.swf [29] 2012091710560440.htm 68
  78. Đồ án tốt nghiệp [30] www.thvl.vn/ Buoi-Nam-Roi [31] www.tailieu.vn [32] www.vienmy.vn/tt/Cuoc-Song/Cach-bao-quan-tinh-dau_666.aspx [33] www.wikipedia.org [34] www.ykhoa.net/duoc/sudungthuoc/27_101.htm [35] [36] [37] tien-giang [38] [39] [23]. [40]. Chi cục thú y TP. Hồ Chí Minh, Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E. coli, 6/2012, khuan-Ecoli.aspx [41]. Đại Học Y Thái Bình, Các vi khuẩn gây bệnh thường gặp, 5/2012, [42]. 69