›

Đồ án Nghiên cứu thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids qua quá trình lên men chủng Candida bombicola

pdf 64 trang thiennha21 12/04/2022 6680
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids qua quá trình lên men chủng Candida bombicola", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_thu_nhan_va_khao_sat_mot_so_hoat_tinh_cua_s.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids qua quá trình lên men chủng Candida bombicola

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH CỦA SOPHOROLIPIDS QUA QUÁ TRÌNH LÊN MEN CHỦNG Candida bombicola Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG Sinh viên thực hiện : HUỲNH THỊ DIỄM TRINH MSSV: 1151110044 Lớp: 11DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. LỜI CAM ĐOAN Người thực hiện đề tài: Huỳnh Thị Diễm Trinh Sinh viên trường: Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh Khoa: Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi Trường Ngành: Công nghệ Sinh học Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Lớp: 11DSH01 MSSV: 1151110044 Người thực hiện đề tài xin cam đoan những nội dung trong đồ án tốt nghiệp này là do người thực hiện đề tài làm tại Viện Sinh học Nhiệt đới, dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Hoàng Dũng. Các số liệu thu thập được và kết quả phân tích trong bài là trung thực, không sao chép từ bất cứ bài báo cáo nào đã được công bố trước đây. Một số nội dung trong đồ án tốt nghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu, thông tin được đăng tải trên các trang web, tác phẩm, bài báo theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ án. Nếu có bất cứ sự sao chép và không trung thực trong bài báo cáo này, người thực hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm - Môi trường, trước ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh Ngày .tháng .năm Sinh viên thực hiện (ký và ghi rõ họ tên)
  3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, các anh chị và các bạn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành của mình đến: Các thầy cô Bộ môn trong khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường cùng các thầy cô trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, đã trực tiếp giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi khi học ở trường. Thầy Nguyễn Hoàng Dũng, phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, một người thầy, người anh đã tận tình hướng dẫn và luôn động viên tôi trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Thầy Hoàng Quốc Khánh và thầy Ngô Đức Duy, phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp. Chị Nguyễn Lương Hiếu Hòa, chị Lê Quỳnh Loan, bạn Trần Lê Việt Hà, bạn Lê Văn Tâm đã luôn bên cạnh giúp đỡ, chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm cũng như những niềm vui nỗi buồn cùng tôi. Tất cả các anh chị, các bạn đang nghiên cứu ở phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học nhiệt đới đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ dạy cho tôi nhiều điều trong suốt quá nghiên cứu. Tập thể lớp 11DSH01, trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, đã sát cánh bên tôi trong suốt những năm tháng trên giảng đường đại học. Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn Ba, Mẹ và các em trong gia đình đã chăm sóc, lo lắng và luôn dõi theo từng bước con đi. Sẵn sàng bên cạnh động viên và khích lệ những lúc con khó khăn nhất, để con có thể vững tin và bước tiếp trên con đường đã chọn. Huỳnh Thị Diễm Trinh
  4. MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Tình hình nghiên cứu 2 3. Mục đích nghiên cứu 2 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 2 5. Phương pháp nghiên cứu 3 6. Các kết quả đạt được 3 7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 5 1.1. Tổng quan về nấm men 5 1.1.1. Đặc điểm hình thái tế bào nấm men 5 1.1.2. Cấu tạo tế bào nấm men 5 1.1.3. Sinh sản ở nấm men 5 1.1.4. Ứng dụng của nấm men 6 1.1.5. Sơ lược về nấm men Candida bombicola 7 1.2. Tổng quan về chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) 8 1.2.1. Khái quát về chất hoạt động bề mặt sinh học 8 1.2.2. Khái quát về sophorolipids (SLs) 10 1.2.2.1. Giới thiệu chung về SLs 10 1.2.2.2. Cấu trúc hóa học của SLs 11 1.2.2.3. Sinh tổng hợp SLs 12 1.2.2.4. Hoạt tính của SLs 13 1.2.2.5. Ứng dụng của SLs 15 i
  5. 1.3. Tình hình nghiên cứu về SLs 17 1.3.1. Nước ngoài 17 1.3.2. Trong nước 18 1.4. Thực trạng nguồn dầu thải ở Việt Nam 18 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20 2.2. Vật liệu nghiên cứu 20 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 20 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 20 2.2.3. Hóa chất 21 2.3. Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1. Tăng sinh và bảo quản chủng C.bombicola ATCC 22214 23 2.3.2. Nuôi cấy và thu nhận Sophorolipids từ chủng C.bombicola ATCC 22214 23 2.3.3. Định tính SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) 25 2.3.4. Xác định thành phần SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 26 2.3.5. Khảo sát một số hoạt tính của SLs thu được 27 2.3.5.1. Khả năng nhũ hóa 27 2.3.5.2. Khả năng kháng oxy hóa 28 2.3.5.3. Khả năng kháng khuẩn 29 2.4. Phương pháp xử lý số liệu 31 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1. Kết quả thu nhận sophorolipids từ nguồn dầu thải và glucose 32 3.2. Kết quả ảnh hưởng của thời gian nuôi lên quá trình thu nhận Sophorolipids 32 3.3. Kết quả định tính SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) 33 3.4. Kết quả khảo sát thành phần SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 35 ii
  6. 3.5. Kết quả khảo sát khả năng nhũ hóa của SLs thu được 37 3.6. Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa của SLs thu được 37 3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được 38 3.7.1. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. 38 3.7.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 39 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 4.1. Kết luận 41 4.2. Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC iii
  7. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CHĐBM Chất hoạt động bề mặt CHĐBMHH Chất hoạt động bề mặt hóa học CHĐBMSH Chất hoạt động bề mặt sinh học CMC Critical micelle concentration DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl HPLC High performance liquid chromatography IC Inhibitory concentration IC50 Inhibitory concentration 50% OD Optical density (mật độ quang học) LB Luria bertani MIC Minimum inhibitory concentration SLs Sophorolipids SDO Soybean dark oil TLC Thin layer chromatography YM Yeast malt medium iv
  8. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại CHĐBMSH và các chủng vi sinh vật tổng hợp điển hình 9 Bảng 1.2. Khả năng nhũ hóa của SLs được sản xuất bởi C.bombicola với cơ chất kỵ nước. 14 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khả năng nhũ hóa của hỗn hợp SLs thu được. 37 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được trên đĩa thạch 39 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 40 v
  9. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tế bào nấm men C.bombicola 7 Hình 1.2. Cấu trúc của sophorolipid 11 Hình 1.3. Quá trình sinh tổng hợp sophorolipids 12 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 22 Hình 2.2. Quy trình thu nhận sophorolipids 24 Hình 2.3. Quy trình phân tích mẫu SLs trong sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 27 Hình 2.4. Cơ chế phản ứng DPPH 28 Hình 3.1. Sophorolipids thu được 32 Hình 3.2. Biểu đồ sản lượng SLs thu được ở những thời gian lên men lên men khác nhau 33 Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu SLs thu được 34 Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao 36 Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu SLs chuẩn 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate. 36 Hình 3.6. Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của hỗn hợp SLs thu được. 38 Hình 3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được trên đĩa thạch 39 vi
  10. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Chất hoạt động bề mặt (CHĐBM) đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống hằng ngày của con người. Chúng có mặt trong hầu hết các sản phẩm thiết yếu, trong mọi ngành công nghiệp, góp phần phát triển và mang lại lợi nhuận vô cùng to lớn cho ngành công nghiệp hóa chất. Chất hoạt động bề mặt là một trong những nhóm hóa chất công nghiệp được sản xuất nhiều nhất hiện nay, với tổng sản lượng trên toàn thế giới vượt quá 15 triệu tấn/năm và đang tăng dần theo thời gian. Chất hoạt động bề mặt được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như chất tẩy rửa, mỹ phẩm, dược phẩm, thưc phẩm, nông nghiệp, sản xuất giấy, tăng hiệu suất thu hồi dầu thô Phần lớn chất hoạt động bề mặt được sản xuất bằng con đường tổng hợp hóa học và từ dầu mỏ. Việc này thường gây ảnh hưởng xấu đến môi trường bởi khả năng phân hủy sinh học của chất hoạt động bề mặt hóa học (CHĐBMHH) kém. Vì vậy, việc tổng hợp và ứng dụng các chất hoạt động bề mặt có nguồn gốc sinh học đang được quan tâm nhiều trong những năm gần đây. Trong đó sophorolipids (SLs) – một dạng chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) thuộc nhóm glycolipid - được xem là rất có triển vọng bởi nhiều nguyên nhân: 1. Vi sinh vật sản xuất không phải tác nhân gây bệnh, dễ dàng thu hồi sản phẩm. 2. Những đặc tính ưu việt của SLs so với các chất hoạt động bề mặt hóa học như khả năng phân hủy sinh học tốt hơn, độc tính thấp, thân thiện với môi trường. 3. SLs có hoạt tính chuyên biệt trong các điều kiện khác nhau về nhiệt độ, pH và nồng độ muối cao. Hiện nay, một vấn đề đặt ra trong việc sản xuất sophorolipids bằng phương pháp sinh học là chi phí sản xuất còn khá cao không thể cạnh tranh với chất hoạt động bề mặt hóa học. Để giải quyết vấn đề trên, hướng sản xuất sophorolipds từ các nguyên 1
  11. liệu rẻ tiền đang được quan tâm hiện nay. Vì lý do đó, đề tài nghiên cứu thu nhận sophorolipids qua quá trình lên men chủng Candida bombicola từ nguồn dầu thải đã được thực hiện. 2. Tình hình nghiên cứu Một số công trình nghiên cứu thu nhận SLs từ quá trình lên men C.bombicola đã được công bố. Kim và cộng sự (2005) đã nghiên cứu thu nhận SLs bởi chủng C.bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu thải phụ phế phẩm của ngành công nghiệp chế biến dầu nành (SDO) và đạt sản lượng 90 g/l. Tương tự, Daverey và Pakshirajan (2009) công bố rằng họ thu được lượng 63,7 g/l SLs thông qua lêm men C.bombicola ATCC 22214. Hiện nay tại Việt Nam, một số công trình đề cập đến việc phân lập, nghiên cứu khả năng tạo CHĐBMSH của một số chủng vi khuẩn đã được công bố. Đa số các chủng được phân lập từ môi trường nước mặn nhằm mục đích xử lý ô nhiễm dầu. Tuy nhiên, những công trình liên quan đến việc sản xuất và ứng dụng SLs vẫn chưa được nghiên cứu thấu đáo. 3. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu thu nhận sophorolipids qua quá trình lên men của chủng C.bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu thải. Khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Lên men chủng C.bombicola ATCC 22214 trên môi trường chứa glucose và dầu thải. - Thu nhận sophorolipids từ dịch lên men. - Định tính và xác định thành phần sophorolipids. - Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian lên men đến sản lượng sophorolipids - Khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids như khả năng kháng khuẩn, chống oxy hóa, khả năng nhũ hóa. 2
  12. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu - Thu nhận SLs thông qua nuôi cấy chủng C.bombicola ở điều kiện 300C, pH6, lắc 180 vòng/phút. - Định tính SLs bằng kỹ thuật sắc ký bảng mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC). - Phân tích thành phần SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - High Performance Liquid Chromatography). - Xác định khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu. - Khả năng chống oxy hóa của SLs cũng được xác định thông qua khả năng bắt các gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). - Khả năng nhũ hóa của SLs được xác định bằng phương pháp đo tỷ lệ hệ nhũ tương được tạo thành so với hệ dung dịch ban đầu. 6. Các kết quả đạt đƣợc Sản lượng SLs thu được sau quá trình lên men đạt 21,9 g/l. Thời gian lên men thu nhận SLs từ chủng C.bombicola thích hợp nhất là 7 ngày. Trong hỗn hợp SLs thu được có khoảng 10 cấu trúc SLs khác nhau. Bước đầu xác định được sự hiện diện của 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate. Khả năng kháng oxy hóa của SLs ở nồng độ 20 mg/ml là 84,32 % và IC50 cũng được xác định 4,4531 mg/ml. Nồng độ ức chế tối thiểu đối với một số vi khuẩn cũng được xác định S.aureus (1,25 mg/ml), P.aeruginosa (2,5 mg/ml), B.subtilis (0,6 mg/ml). Chỉ số nhũ hóa (E24) của SLs từ 39,39 – 65,45 % đối với các loại dầu hạt cải, dầu nành và xăng. 3
  13. 7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Kết cấu của đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương: Chương 1: Tổng quan Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4
  14. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về nấm men 1.1.1. Đặc điểm hình thái tế bào nấm men Nấm men thường có hình cầu hoặc hình bầu dục, một số loại hình que và một số hình dạng khác. Kích thước trung bình của nấm men là 2,5 – 10 µm x 4,5 – 21 µm. Có loài nấm men có khuẩn ti hoặc khuẩn ti giả. Khuẩn ti giả chưa thành sợi rõ rệt mà chỉ là nhiều tế bào nối với nhau thành chuỗi dài. Có loài có thể tạo thành váng khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể [1]. 1.1.2. Cấu tạo tế bào nấm men Nấm men có cấu tạo tế bào khá phức tạp, gần giống như tế bào thực vật. Tế bào nấm men có đầy đủ các thành phần: thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, ty thể, ribosome, nhân, không bào và các hạt dự trữ. Thành tế bào nấm men dầy khoảng 25 nm, được cấu tạo bởi hai lớp phân tử bao gồm 90 % là hợp chất glucan và mannan, phần còn lại là protein, lipid và glucosamine. Màng nguyên sinh chất của tế bào nấm men dày khoảng 8 nm có cấu tạo tương tự như màng nguyên sinh chất của vi khuẩn. Ty thể nấm men có hình bầu dục, được bao bọc bởi hai lớp màng, màng trong gấp khúc thành nhiều tấm răng lược hợc nhiều ống nhỏ làm cho diện tích bề mặt của màng trong tăng lên. DNA của ti thể nấm men là một phân tử dạng vòng có khối lượng phân tử 50x106 Da, chiếm khoảng 15-23 % tổng lượng DNA của toàn tế bào nấm men [1]. 1.1.3. Sinh sản ở nấm men Nấm men sinh sản bằng hai hình thức: vô tính và hữu tính. Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến và điển hình của tế bào nấm men. Khi tế bào trưởng thành, nhân sẽ dài ra và bắt đầu thắt lại ở giữa. Trên tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con, hoặc cùng một lúc tế bào mẹ có thể tạo ra nhiều tế bào con ở nhiều hướng khác nhau (tùy theo giống, loài). Mỗi chồi con sẽ 5
  15. nhận một phần chất nhân và chất nguyên sinh từ tế bào mẹ. Khi chồi con trưởng thành, nó sẽ hình thành một vách ngăn để tách khỏi tế bào mẹ và sống độc lập. Có trường hợp, tế bào con không tách khỏi tế bào mẹ mà tiếp tục nảy chồi tạo một tập hợp tế bào nấm men có dạng xương rồng hay còn gọi là khuẩn ty giả. Ngoài ra, nấm men còn sinh sản vô tính bằng hình thức phân cắt như ở vi khuẩn, chỉ thấy ở chi nấm men Schizosaccharomyces và sinh sản bằng bào tử như: bào tử đốt ở chi Geotrichum, bào tử bắn ở chi Sporobolomyces; bào tử áo ở nấm Candida albicans [1]. Sinh sản hữu tính ở nấm men là do sự tiếp hợp giữa hai tế bào nấm men với nhau hình thành hợp tử. Hợp tử phân chia thành các bào tử túi nằm trong nang (túi), nang chín sẽ vỡ bào tử được phát tán ra bên ngoài, gặp điều thuận lợi phát triển thành một tế bào nấm men mới [1]. 1.1.4. Ứng dụng của nấm men Nấm men đóng vai trò quan trọng trong đời sống con người, một số ứng dụng của nấm men như: Tế bào nấm men cũng như những sản phẩm mà chúng sản sinh ra giàu protein, vitamin, các acid amin cần thiết, chất khoáng Nên nấm men được sử dụng trong thực phẩm bổ sung chất dinh dưỡng, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm Sản phẩm của nấm men còn được sử dụng như chất điều vị trong công nghệ thực phẩm. Trong nông nghiệp: dịch chiết của nấm men có khả năng giúp thực vật chống lại một số bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra. Trong chăn nuôi: nấm men hoặc các sản phẩm từ nấm men bổ sung vào thức ăn của vật nuôi sẽ tăng cường hệ vi sinh vật đường ruột, giúp vật nuôi kháng lại các bệnh đường ruột. Ngoài ra các nghiên cứu cũng nhận thấy sự tăng trọng, tăng sản lượng trứng, sữa khi bổ sung nấm men hoặc các sản phẩm từ nấm men vào thức ăn của vật nuôi. Bên cạnh đó cao nấm men giàu nitrogen, vitamin, chất khoáng và các hợp chất kích thích tăng trưởng nên được sử dụng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vât. 6
  16. 1.1.5. Sơ lược về nấm men Candida bombicola Phân loại nấm men Candida bombicola Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Ngành phụ: Saccharomycotina Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetes Họ: Incertae sedis Giống: Candida Loài: Candida bombicola Chủng: Candida bombicola ATCC 22214 Nấm men Candida bombicola, trước đây được gọi là Torulopsis bombicola, được phân lập từ mật của loài ong nghệ (bumble-bees) thuộc chi Bombus sp [47] . Candida bombicola cùng với một số nấm men như Candida magnolia, Candida apicola, Candida bororiensis, Wickerhamiella domericqiae và Rhodotorula bogoriensis được biết đến với khả năng sản xuất SLs – một glycolipid ngoại bào [12][19][20] [23][47] [48]. Hình 1.1. Tế bào nấm men C.bombicola Nguồn: Kurtzman và Fell, (2001). 7
  17. Tế bào nấm men Candida bombicola có dạng hình oval đến hình thon dài, thường tồn tại riêng rẽ hoặc dính thành cặp, với kích thước tế bào là1,5 – 2,5 µm x 3 – 5 µm (Hình 1.1) [28]. Khi nuôi cấy đĩa trên môi trường bột bắp agar sau 7 ngày ở 250C, tế bào nấm men Candida bombicola không xuất hiện khuẩn ty giả hoặc tế bào bao gồm rất nhiều các chuỗi ngắn phân nhánh dày đặc. Phát triển trong điều kiện hiếu khí thì khuẩn lạc có màu kem đến màu xám tro, trơn, bóng, lồi và ria mép khuẩn lạc có dạng răng cưa [28]. Nấm men Candida bombicola có thể lên men glucose, sucrose và có khả năng đồng hóa glucose, galactose, sucrose, ethanol, glycerol, D – Mannitol, D – Glucitol. Chúng có thể phát triền ở nồng độ đường cao 100 g/L hoặc cao hơn [49]. Ngày nay, Candida bombicola thường được gọi là Starmerella bombicola C.A Rosa & Lachance [14]. 1.2. Tổng quan về chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) 1.2.1. Khái quát về chất hoạt động bề mặt sinh học Chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) là những hợp chất có cấu trúc đa dạng về hoạt tính bề mặt được tổng hợp bởi vi sinh vật. Tất cả CHĐBMSH là hợp chất lưỡng cực, có cấu tạo gồm một nhóm ưa nước (thường là phân tử đường hoặc amino acid) và một nhóm kị nước (thường là acid béo). Do cấu tạo phân cực, CHHBMSH có xu hướng co cụm tại bề mặt và mặt phân cách giữa hai chất (có thể là chất lỏng - chất lỏng, chất lỏng - chất rắn), kết quả là làm giảm sức căng bề mặt (giữa chất lỏng và không khí) và giảm sức căng giữa 2 chất (chất lỏng - chất lỏng và chất lỏng - chất rắn)[30][33] . Không giống như chất hoạt động bề mặt hóa học (CHĐBMHH) thường phân loại theo bản chất các nhóm phân cực, CHĐBMSH được phân loại dựa vào thành phần hóa học và nguồn gốc vi sinh vật tạo ra. Nhìn chung, CHĐBMSH được chia làm các nhóm chính: glycolipid; lipopeptid và lipoprotein; phospholipid và acid béo; CHĐBM trùng hợp và CHĐBM dạng hạt (Bảng 1.1) [6]. 8
  18. Bảng 1.1. Phân loại CHĐBMSH và các chủng vi sinh vật tổng hợp điển hình CHĐBMSH Vi sinh vật sản xuất Pseudomonas aeruginosa Rhamnolipids Pseudomonas sp. Candida bombicola Sophorolipids Candida apicola Glycolipids Candida petrophilum Rhodococcus erythropolis Trehalolipids Mycobacterium tuberculosis Arthrobacter sp. Lipopeptides và Surfactin Bacillus subtilis lipoproteins Lichenysin Bacillus licheniformis Phospholipids, Acid béo Corynebacterium lepus acid béo và Lipid trung tính Nocardia erythropolis lipid trung tính Phospholipids Thiobacillus thiooxidans Alasan Acinetobacter radioresistents KA-53 CHĐBMSH Biodispersan Acinetobacter calcoaceticus A2 dạng trùng hợp Emulsan Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 (polymer) Liposan Candida lipolytica Mannoprotein Saccharomyces cerevisiae CHĐBMSH Vesicles và fimbriae Acinetobacter calcoaceticus dạng hạt Whole cells Nhiều loại vi khuẩn Nguồn: Desai và Banat, (1997) Các CHHBMSH thường tiết ra bên ngoài tế bào (extracellular) như các chất glycolipid, axit béo, photpholipid, polysacarit lipid, lipopetic – lipoprotein, hay chính bản thân bề mặt tế bào vi sinh vật. Ngoài đặc tính làm giảm sức căng bề mặt nó còn có 9
  19. đặc tính kháng sinh như chất gramicidin S hay polymicin. Các CHHBMSH được tạo ra cả ở trên các cơ chất không tan trong nước lẫn tan trong nước. Nó được tạo ra do phản ứng thích nghi với môi trường không thuận lợi, độc hại và có xu hướng tạo ra nhiều trên các cơ chất không tan trong nước [6]. Trên thị trường chất hoạt động bề mặt hiện nay, CHĐBMSH được quan tâm nhiều hơn bởi một số đặc tính ưu việc như: độc tính thấp, khả năng phân hủy sinh học cao, thân thiện với môi trường hơn, tính chọn lọc cao và khả năng hoạt động cao trong môi trường có nhiệt độ, pH và nồng độ muối khắc nghiệt [27]. 1.2.2. Khái quát về sophorolipids (SLs) 1.2.2.1. Giới thiệu chung về SLs SLs được xem như là chất hoạt động bề mặt ngoại bào, là sản phẩm được tiết ra bởi nấm men Candida sp và Wickerhamiella domercqiae. SLs là một dạng CHĐBMSH thuộc nhóm glycolipids có trọng lượng phân tử thấp, đang được quan tâm nhiều hiện nay cho mục đích thương mại [42]. SLs được mô tả lần đầu tiên vào đầu những năm 60 như là một glycolipid ngoại bào được tổng hợp bởi nấm men Torulopsis magnolia [20]. Sau đó vào năm 1968, Tulloch và Spencer đã báo cáo rằng chủng sản xuất SLs thực tế là Torulopsis apicola, hiện nay được gọi là Candida apicola. Một nghiên cứu khác của Spencer và cộng sự (1970) cho thấy rằng SLs cũng được sản xuất bởi nấm men Candida bombicola. Trong đó, nấm men Candida bombicola ATCC 22214 được chú ý và nghiên cứu nhiều hơn cả do nó có khả năng sản xuất với sản lượng cao SLs (400 g/l) và không phải là tác nhân gây bệnh [49]. Không những thế C.bombicola ATCC 22214 còn có khả năng sử dụng dầu thải nhà hàng như là nguồn lipid cho quá trình tổng hợp SLs [17] SLs được xem là một CHĐBMSH có triển vọng bởi vì vi sinh vật sản xuất không phải là tác nhân gây bệnh, dễ dàng thu hồi sản phẩm, có năng suất và chuyển hóa cơ chất cao [38]. 10
  20. 1.2.2.2. Cấu trúc hóa học của SLs Về cấu trúc hóa học, SLs gồm phần ưa nước là disaccharide sophoroses (2-O-β- D-glucopyranosyl-D-glucopyranose) liên kết với gốc hydroxyl của carbon kế cuối hoặc cuối trong chuỗi acid béo C16-C18 (phần kỵ nước) bằng liên kết β-glucosidic ở vị trí C1’ (Hình 1.2) [25]. Trong phân tử SLs, nhóm carboxyl của chuỗi acid béo hoặc ở trạng thái tự do (cấu trúc SLs dạng mở hay dạng acid) hoặc là phản ứng este hóa nội sinh với nhóm hydroxyl ở vị trí C 4” của phần sophorose (cấu trúc SLs dạng vòng hay dạng lacton) [41]. Đây là hai dạng cấu trúc chính trong thành phần cấu tạo của SLs. Các cấu trúc này có sự khác biệt về mức độ acetyl hóa (ở vị trí 6’ và 6”) của phần sophorose và thành phần acid béo (chiều dài chuỗi, mức độ bão hòa, vị trí của nhóm hydroxyl) phụ thuộc vào chủng sản xuất, điều kiện sinh trưởng và nguồn carbon kỵ nước [29]. Các phân tử SLs có cấu trúc khác nhau sẽ dẫn đến một vài sự khác nhau trong các đặc tính sinh học và hóa lý của chúng và có thể được ứng dụng chuyên biệt trong các lĩnh vực khác nhau [29]. Các sophorolipid lacton có hiệu quả hơn trong việc làm giảm sức căng bề mặt và khả năng kháng khuẩn tốt hơn, trong khi sophorolipid acidic tạo bọt và hòa tan tốt hơn. Hình 1.2. Cấu trúc của sophorolipid Nguồn: Van Bogaert và cộng sự (2011) 11
  21. 1.2.2.3. Sinh tổng hợp SLs Hình 1.3. Quá trình sinh tổng hợp sophorolipids (1) lipase, (2) cytochrome P450 monooxygenase, (3) alcohol-dehydrogenase,(4) aldehyde-dehydrogenase, (5) desaturase, (6) cytochrome P450 monooxygenase, (7) glucosyltransferase I, (8) glucosyltransferase II, (9) lactonesterase, (10) acetyltransferase. Nguồn: Van Bogaert và cộng sự (2011) 12
  22. Con đường sinh tổng hợp SLs được trình bày ở hình 1.3. Tiền chất lý tưởng cho quá trình tổng hợp SLs là glucose và acid béo. Ngoài ra, các dạng methyl, ethyl esters của acid béo hay triglycerides cũng có thể được sử dụng. Trong trường hợp này, esterases sẽ thủy phân dần dần những chất này để tạo ra các acid béo. Do các chủng như C.bombicola, C.apicola có thể tăng trưởng trên alkan nên chúng có hệ enzyme cần thiết cho quá trình oxy hóa các alkan này để tạo nên các acid béo. Ở bước đầu tiên, các acid béo được hydroxyl hóa ở vị trí cuối (ω) hay kế cuối (ω -1) bằng enzyme cytochrome P450 monoxygenase. Ở C.bombicola, 5 gen cytochrome P450 monoxygenase khác nhau thuộc nhóm CYP52 đã được xác định. Ở bước thứ 2, glucose thứ nhất được gắn vào vị trí C1’ của nhóm hydroxy bằng enzyme glycosyltransferase I. Ở bước thứ 3, glucose thứ hai được gắn vào vị trí C2’ của glucose thứ nhất nhờ enzyme glycosyltransferase II. Sản phẩm được tạo thành trong quá trình này chỉ là các SLs dạng acid. Tuy nhiên, sau đó chúng thường được biến đổi tiếp thông qua quá trình ester hóa để tạo nên SLs dạng lacton bằng enzyme lactonesterase và acetyl hóa đầu carbohydrate bằng enzyme acetyltransferase để tạo nên các dạng acetyl [50]. 1.2.2.4. Hoạt tính của SLs Sophorolipids là CHĐBMSH thuộc nhóm glycolipids, có chỉ số cân bằng ưa nước – ưa béo (HLB) khá rộng từ 8 – 10. Vì vậy, chúng được ứng dụng rộng trong nhiều lĩnh vực như: mỹ phẩm, dược phẩm, chất tẩy rửa Tiêu chuẩn để đánh giá khả năng hoạt động của một CHĐBM là sức căng bề mặt và nồng độ micelle tới hạn (CMC). SLs sản xuất từ nấm men Candida bombicola trên môi trường chứa: mật rỉ đường mía, dịch chiết nấm men, ure và dầu đậu nành được báo cáo là có khả năng làm giảm sức căng bề mặt nước và nồng độ micelle tới hạn (CMC) tương ứng là 34,15 N/m và 59,43 mg/l [14]. Trong nghiên cứu sản xuất SLs bởi nấm men Candida bombicola từ glucose và một số loại dầu như: dầu đậu nành đen (SDO – phụ phẩm của ngành chế biến dầu nành), dầu bắp, dầu nành như là các nguồn carbon, Kim và cộng sự (2005) đã xác định được giá trị CMC và sức căng bề 13
  23. mặt tối thiểu trong dung dịch nước của SLs tương ứng là 150 mg/l và 48 mN/m; 82 mg/l và 41 mN/m; 88 mg/l và 40,5 mN/m. Tương tự, Otto và cộng sự (1999) cũng đã báo cáo rằng 130 mg/l cho CMC và 39 m.N/m cho sức căng bề mặt tối thiểu của SLs được sản xuất bởi nấm men sử dụng deproteinized whey và dầu hạt cải dầu như là các nguồn carbon. Bên cạnh khả năng làm giảm sức căng bề mặt thì khả năng nhũ hóa của SLs cũng là một hoạt tính quan trọng giúp SLs ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. SLs được sản xuất bời nấm men C.bombicola là một chất nhũ hóa kém, không thể ổn định nhũ tương có chứa nước và một trong hai chất hydrocarbon hoặc dầu thực vật [13][36] Tuy nhiên, một nghiên cứu của Daverey và Pakshirajan (2009) chứng minh được rằng SLs được sản xuất bời nấm men C.bombicola ATCC 22214 sử dụng mật rỉ đường mía như nguồn carbon, đã thể hiện hoạt tính nhũ hóa tốt hơn và ổn định hơn (Bảng 1.2). Trong một nghiên cứu của Ma và cộng sự (2012) về hoạt tính sinh học và bề mặt của phân tử SLs được sản xuất bởi Wickerhamiella domercqiae đã cho thấy rằng SLs có khả năng nhũ hóa mạnh mẽ đối với các cơ chất kỵ nước được chọn cụ thể là paraffin lỏng, dầu hạt cải dầu và sự nhũ hóa trở nên yếu hơn đối với dầu thô. Hơn nữa, các nhũ tương được tạo thành ổn định ngay cả khi để yên trong hơn 1 tuần. Bảng 1.2. Khả năng nhũ hóa của SLs được sản xuất bởi C.bombicola với cơ chất kỵ nước. Non – aqueous phase liquids Emulsification activity Kerosene 1,584 Xylene 2,016 Benzene 26,784 Hexadecane 2,880 Nguồn: Daverey và Pakshirajan (2009) SLs cũng được chứng minh là có khả năng ức chế sự phát triển của một số chủng vi khuẩn. Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của SLs của Kim và cộng sự 14
  24. (2005) cho thấy: nồng độ ức chế (IC) của SLs đối với vi khuẩn Bacillus subtilis và Propionibacterium acne lần lượt là 4,0 mg/l và 0,5 mg/l. Điều đó chỉ ra rằng SLs có thể được sử dụng trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe như là một tác nhân diệt khuẩn. Năm 2013, Joshi-Navare và Prabhune đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của SLs trong sự kết hợp với kháng sinh để tăng cường hiệu quả kháng khuẩn và thu được kết quả: nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của tetracycline với Staphylococcus aureus (ATCC-29.737) được xác định là 150 g/ml và SLs là 400 g/ml. Bên cạnh đó, SLs thô và SLs acid còn cho thấy có tác dụng đáng kể trong việc chống lại các gốc tự do hydroxyl (OH). Theo đó, SLs thô và SLs acid ở nồng độ 0,028%, 0,083 % khối lượng khô (w/v) sẽ bắt được các gốc tự do tương ứng lên đến 97 %, 100 % và 98 %, 100 % [22]. Ngoài ra, SLs còn có những hoạt tính chuyên biệt trong các điều kiện khắc nghiệt về nhiệt độ, pH và nồng độ muối. Kết quả nghiên cứu của Chandran và Das (2011) đã cho thấy SLs hoạt động ổn định trong một phạm vi rộng của pH từ 2 – 10, nhiệt độ từ 100C – 1000C và ở nồng độ muối (NaCl) cao 8 – 10%. 1.2.2.5. Ứng dụng của SLs SLs cho thấy có nhiều khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Hiện nay, việc nghiên cứu phát triển sản phẩm từ SLs đang được nhiều nhóm nghiên cứu tiến hành, đăng ký bằng sáng chế và một số đã được thương mại hóa. Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của SLs là làm chất hoạt động bề mặt. Công ty Saraya ở Nhật đã tiến hành thương mại hóa sản phẩm sophoron, một loại nước rửa chén chứa SLs [18]. SLs cũng có thể được sử dụng trong bột giặt với vai trò là chất tẩy rửa [21]. Vì SLs là một phân tử không mang điện tích nên chúng có thể duy trì được đặc tính có sức căng bề mặt thấp ngay cả trong điều kiện nồng độ muối cao. Khả năng tạo nhũ (emulsifying) của SLs cũng được ứng dụng trong các ngành hóa dầu. Chúng có thể được sử dụng trong việc thu hồi các sản phẩm dầu thứ cấp, loại bỏ thành phần hydrocarbon trong dầu thô. SLs còn được sử dụng để xử lý đất và nước bề mặt bị 15
  25. nhiễm hydrocarbon; hấp thu các kim loại nặng có trong trầm tích [7][32] Ngoài ra, đặc tính tạo nhũ của SLs cũng được áp dụng trong trong công nghiệp thực phẩm để làm tăng chất lượng của bột mì hay trong các khoang chứa lạnh của máy bay để tránh tạo các tinh thể đá [5][34]. Bên cạnh đó, SLs cũng được ứng dụng nhiều trong mỹ phẩm. Công ty Soliance ở Pháp đã thương mại hóa các sản phẩm chăm sóc da, dưỡng thể chứa SLs. Một công ty của Hàn Quốc cũng đang trong quá trình thương mại hóa các sản phẩm chứa SLs trong mỹ phẩm. Ngoài vai trò tạo nhũ, SLs còn đóng vai trò kháng khuẩn trong việc trị mụn, trị gàu và mùi hôi cơ thể [31]. SLs còn cho thấy có nhiều tác động hữu hiệu trong việc bảo vệ da và tóc. Chúng kích thích sự biến dưỡng của các tế bào fibroblast trong lớp biểu mô và kích thích quá trình tổng hợp collagen, nhân tố làm cho da săn chắc [9]. Chúng còn có khả năng ức chế các gốc tự do, ức chế hoạt động của enzyme elastase gây ra lão hóa, thúc đẩy quá trình làm liền da và làm trắng da [22]. SLs cũng cho thấy có khả năng tổng hợp leptin qua đó làm giảm sự tích tụ mỡ thừa ở dưới da [39]. SLs còn là nguồn cơ chất cho các acid béo khó tổng hợp ( , -1) ứng dụng trong công nghiệp tạo mùi và nước hoa. Khả năng kháng khuẩn của SLs còn được sử dụng như là một tác nhân sinh học làm sạch trái cây [40]. Ngoài khả năng kháng khuẩn, SLs còn có khả năng kháng lại một số loại nấm như các loài Phytophtora, Phythium và một số loài tảo biển gây hại [51]. Ngoài ra, các nghiên cứu còn cho thấy SLs có nhiều tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm. Chúng có khả năng chống lại sự suy giảm miễn dịch do virus gây ra [43]. SLs cũng có khả năng ức chế quá trình phát triển của tế bào ung thư bạch cầu (dòng tế bào HL60 leukemia) bằng cách ức chế hoạt tính của protein kinase C [24]. Các diacetyl lacton SLs có khả năng tiêu diệt nhiều dòng tế bào khác nhau như dòng tế bào ung thư gan H7402 [12]. SLs cũng làm giảm tỷ lệ chết do shock nhiễm khuẩn (septic shock) trên mô hình chuột [8]. 16
  26. 1.3. Tình hình nghiên cứu về SLs 1.3.1. Nước ngoài Trên thế giới, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về SLs cũng như những ứng dụng của nó trong các lĩnh vực khác nhau. Kim và cộng sự (2005) đã nghiên cứu thu nhận SLs bởi C.bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu thải phụ phế phẩm của ngành công nghiệp chế biến dầu nành (SDO). Với việc nuôi C.bombicola trong 7 ngày có bổ sung chất dinh dưỡng SDO 15 g/ngày đã thu được sản phẩm SLs 90 g/l. Một số hoạt tính của SLs cũng được tìm thấy: khả năng làm giảm sức căng bề mặt và CMC tương ứng 150 mg/l và 48 mN/m. Một số hoạt tính khác như: khả năng phân tán của SLs cao hơn chất hoạt động bề mặt hóa học SDS và Brij 30; hoạt tính kháng khuẩn của SLs đối với Propionibacterium acne và Bacillus subtilis cũng đã được chứng minh. Trong nghiên cứu của Shah và cộng sự (2007), họ sử dụng dầu thải từ nhà hàng như là nguồn carbon trong sản xuất SLs bởi C.bombicola ATCC 22214. Môi trường gồm 100 g/l glucose, 10 g/l yeast extract, 1 g/l urea và 40 g/l dầu thải đối với lên men trong bình tam giác, 10% (v/v) đối với lên men trong fermentor 3,3 lít. Lên men trong 10 ngày với điều kiện lên men ở 300C, lắc 200 vòng/phút đối với lên men trong bình tam giác và 400 vòng/phút đối với lên men trong fermentor. Sản lượng SLs thu được là 30 g/l (lêm men trong bình tam giác) và 34 g/l (lên men trong fermentor). Daverey và Pakshirajan (2009) công bố rằng họ thu được lượng 63,7 g/l SLs thông qua lêm men C.bombicola ATCC 22214 trên môi trường sử dụng nguyên liệu rẻ tiền nhằm giảm chi phí sản xuất, gồm mật rỉ đường mía, yeast extract, urea và dầu đậu nành. Bên cạnh đó, nồng độ micelle tới hạn và khả năng làm giảm sức căng bề mặt được xác định tương ứng là 59,43 mg/l và 34,15 mN/m, khả năng nhũ hóa và ổn định hệ nhũ tương của SLs đối với dầu kerosene, xylene, benzene và hexane cũng được công bố. 17
  27. Shao và cộng sự (2012) đã nghiên cứu hoạt tính sinh học của các SLs có các cấu trúc khác nhau trong việc chống lại các tế bào ung thư thực quản ở người. Kết quả cho thấy rằng, sự ức chế của diacetylated lactonic SLs trên hai dòng tế bào ung thư thực quản ở người là KYSE 109 và KYSE 450 (sự ức chế tổng số ở nồng độ 30 g/mL) mạnh hơn monoacetylated lactonic SLs (sự ức chế tổng số ở nồng độ 60 g/mL). Sự khác nhau về mức độ không bão hòa của chuỗi acid béo hydroxyl trong các phân tử SLs cũng có ảnh hưởng đến khả năng gây độc của chúng với các tế bào ung thư thực quản. SLs với một liên kết đôi trong chuỗi acid béo sẽ có tác dụng gây độc mạnh nhất (sự ức chế tổng số ở nồng độ 30 g/mL). Acid SLs cho thấy hầu như không có hoạt tính chống lại các tế bào ung thư thực quản. 1.3.2. Trong nước Hiện nay, chất hoạt động bề mặt có nguồn gốc sinh học ở Việt Nam đang được chú trọng nhiều hơn. Một số công trình đề cập đến phân lập, nghiên cứu khả năng tạo CHĐBMSH của một số chủng vi khuẩn đã được công bố như: “Vi khuẩn tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học phân lập từ bãi biển Nha Trang” [2], “Khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học của chủng vi khuẩn KC31” [4], “Vi khuẩn tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học Rhodococcus ruber TD2 phân lập từ nước ô nhiễm dầu ven biển Vũng Tàu” [3]. Đa số các chủng được phân lập từ môi trường nước mặn nhằm mục đích xử lý ô nhiễm dầu. Tuy nhiên, những công trình liên quan đến việc sản xuất cũng như ứng dụng SLs vẫn chưa được nghiên cứu thấu đáo. 1.4. Thực trạng nguồn dầu thải ở Việt Nam Các nhà hàng trên khắp thế giới sử dụng hàng ngàn lít dầu ăn mỗi tuần. Trên khắp Hoa Kỳ ước tính mỗi tuần có khoảng 100 tỷ lít dầu thải ra từ nhà hàng (US EPA Oil Spill, chương trình nội bộ báo cáo năm 1997) [44]. Hiện nay, Việt Nam chưa có thống kê nào về lượng dầu thải từ nhà hàng, nhưng lượng dầu thải ra cũng không phải là con số nhỏ. 18
  28. Dầu ăn sau khi sử dụng ở nước ngoài gần như là bỏ đi thế nhưng ở Việt Nam thì ngược lại, dầu ăn phế thải vẫn được tái sử dụng cho những mục đích kinh doanh khác bất chấp chất lượng không đảm bảo, độc hại, chế biến thực phẩm gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Thông thường với số lượng lớn dầu phế thải như ở TP. HCM mà giới báo chí và cảnh sát môi trường từng điều tra cho thấy, chúng vẫn thường được lén lút đem bán lại cho các cơ sở, xưởng sản xuất chế biến thực phẩm độc hại hoặc bán cho tiểu thương chiên xào tiếp, như món hành phi là một thí dụ điển hình. Dầu ăn phế thải được dùng để chiên nhiều đến mức từ vàng sang đen, rồi vón cục. Lúc này, chu kỳ “tận dụng” của nó mới chấm dứt và thường được đổ thẳng xuống cống rãnh, làm thành những mảng đen bám ở đây, gây ô nhiễm môi trường trầm trọng [53]. Vì vậy, hướng nghiên cứu sản xuất SLs từ nguồn dầu thải thông qua lên men C.bombicola ATCC 22214 hứa hẹn sẽ giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường, đảm bảo sức khỏe con người và đem lại giá trị kinh tế vô cùng to lớn. 19
  29. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian thực hiện: từ tháng 01 năm 2015 đến tháng 08 năm 2015. Địa điểm thực hiện: Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới. Địa chỉ: (9/621 xa lộ Hà Nội, Phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, Thành Phố Hồ Chí Minh). 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Chủng nấm men C.bombicola ATCC 22214 được cung cấp bởi giáo sư Kim EK, thuộc Đại học Inha, Hàn Quốc. Hỗn hợp SLs thu được từ quá trình lên men glucose và dầu thải từ hệ thống nhà hàng KFC (Tp. HCM) như là hai nguồn carbon chính bởi nấm men C.bombicola ATCC 22214. 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu  Dụng cụ Ống nghiệm, đĩa petri, cốc thủy tinh, bình tam giác, ống đong, erlen, becher, đèn cồn, que cấy, pipetteman, đĩa 96 giếng.  Thiết bị - Cân phân tích A&D HR – 200 (Japan). - Nồi hấp khử trùng Autoclave ES – 315, Tomy (Japan). - Tủ lạnh, tủ lạnh sâu -800C Arctical A/S ULTF80, Arctical (Japan). - Tủ cấy Sanyo MCV – 710ATS, Sanyo (Japan). - Tủ lắc có điều chỉnh nhiệt độ Stuart SI500, Stuart (Japan). - Tủ ủ 370C Sanyo MIR – 162, Sanyo (Japan). - Máy ly tâm Hettich EBA 20, Hettich (Germany) - Máy khuấy từ Yellowline IKA, Yellowline (Germany). - Máy votex Disruptor Genie, Scientific Industries (US). - Máy cô quay LABOROTA 4001 - efficient, Heidolph (Germany). 20
  30. - Bảng mỏng TLC Silicagel 60 F254 , Merck (Germany). - Máy Elisa. - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): waters 2695 Separations Module, Water sử dụng cột C18 Chrom _ Silicycle (Canada), Kích thước cột 4,6 x 250 mm, 5 µm. 2.2.3. Hóa chất - Hệ dung môi để tách chiết SLs thô: Ethylacetate, Hexane. - Hệ dung môi chạy sắc ký bảng mỏng (TLC): Chloroform, Methanol, dung dịch hiện màu H2SO4 40 %. - Dung dịch Glycerol 40 %; DMSO 5 %, 10 %. - Hóa chất trong phản ứng DPPH: dung dịch DPPH, Vitamin C, Ethanol. - Các loại môi trường nuôi cấy và lên men sản xuất SLs (Phụ lục B) - Môi trường tăng sinh và nuôi cấy vi khuẩn (Phụ lục B) - Hệ dung môi chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Methanol 99 % (Merck, Germany), nước cất 2 lần. 21
  31. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu Nấm men C.bombicola ATCC 22214 Tăng sinh, cấy truyền giữ giống Lên men thu nhận sophorolipids từ dầu thải Dịch lên men Ly tâm Dịch nổi Tế bào nấm men Chiết hexane và ethyl acetate Sophorolipids (SLs) thô Định tính SLs bằng kỹ thuật sắc Khảo sát một số hoạt tính của SLs ký TLC và HPLC Khả năng kháng khuẩn Khả năng chống oxy Khả năng nhũ hóa hóa .Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 22
  32. 2.3.1. Tăng sinh và bảo quản chủng C.bombicola ATCC 22214  Tăng sinh: Mục đích: Mục đích của việc tăng sinh nhằm gia tăng nhanh chóng số lượng tế bào nấm men trong môi trường nuôi cấy thích hợp để sử dụng cho các thí nghiệm sau. Quy trình tăng sinh: - Chuẩn bị môi trường YM lỏng, phân phối vào các ống nghiệm và hấp khử trùng. - Tiến hành cấy nấm men C.bombicola dưới dạng đông khô vào các ống nghiệm chứa môi trường YM lỏng. - Nuôi cấy lắc trong 48 giờ ở 300C với tốc độ lắc là 150 vòng/phút. - Sau 48 giờ nuôi cấy, sẽ tiến hành cấy truyền dịch nuôi cấy của chủng vào các ống nghiệm chứa môi trường YM lỏng đã được hấp khử trùng, để đảm bảo mật độ tế bào thích hợp cho các thí nghiệm sau.  Bảo quản chủng bằng phương pháp lạnh sâu với dung dịch glycerol 40 %: Mục đích: Bảo quản chủng vi sinh vật là công việc không những để duy trì khả năng sống lâu dài của vi sinh vật, tránh tạp nhiễm mà còn đảm bảo được tính ổn định di truyền và các hoạt tính sinh học cao của chủng được giữ. Điều này có ý nghĩa vô cùng quan trọng đối với sản xuất các chất có hoạt tính sinh học ở quy mô công nghiệp cũng như nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Quy trình bảo quản: - Hút 500 µl dịch nuôi cấy của chủng sau khi cấy truyền được 48 giờ và 500 µl glycerol 40 % cho vào eppendorf loại 1,5 ml vô trùng, trộn đều. - Bảo quản ở -800C. - Giống được bảo quản trong glycerol ở nhiệt độ thấp có thể giữ trong 12 tháng. 2.3.2. Nuôi cấy và thu nhận Sophorolipids từ chủng C.bombicola ATCC 22214 Nguyên tắc: Nấm men C.bombicola có thể sản xuất SLs khi phát triển trên một môi trường bao gồm hai nguồn carbon khác nhau (thường là đường và dầu) và một nguồn nitơ (thường là cao nấm men) [25]. 23
  33. Trong nghiên cứu này, hai nguồn carbon chính được sử dụng là glucose (ưa nước) và dầu thải nhà hàng (kỵ nước). Quy trình:  Lên men sản xuất SLs: Chuẩn bị 500 ml môi trường sản xuất SLs cho vào 5 bình erlen 250 ml, mỗi bình 100 ml, đậy nút bông lại và mang hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút, để nguội. Bổ sung 5 ml (5 % v/v) dịch nuôi cấy của nấm men C.bombicola sau 48 giờ vào các bình erlen. Tiến hành lên men trong tủ lắc trong 3, 5, 7, 10 ngày, ở 300C, pH6 và tốc độ lắc 180 vòng/phút nhằm xác định thời gian lên men đạt sản lượng cao nhất. Dịch lên men glucose + dầu thải bởi C.bombicola ATCC 22214 Ly tâm Dịch nổi Tế bào (sinh khối nấm men) Chiết hexane (2 lần), loại dịch nổi Chiết ethyl acetate (2 lần), thu dịch nổi Cô quay chân không Sophorolipids thô Hình 2.2. Quy trình thu nhận sophorolipids 24
  34. * Thu nhận SLs thô: - Sau khi kết thúc thời gian lên men, tiến hành thu nhận dịch lên men và ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút, tách riêng phần cặn (sinh khối) và dịch nổi. - Thực hiện chiết dịch nổi với hexane (1: 1 v/v, 2 lần) để loại bỏ dầu thừa không được sử dụng hết sau lên men. Sau đó, tiếp tục chiết với ethylacetate (1: 1 v/v, 2 lần) để thu nhận SLs thô. - Tiến hành cô quay chân không loại bỏ dung môi và cuối cùng là cân để xác định khối lượng SLs thu được. 2.3.3. Định tính SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) Nguyên tắc: Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kỹ thuật dùng để tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động. Kỹ thuật này có thể được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc. Mục đích: Để xác định sản phẩm thu nhận được có phải là SLs hay không, so với chất chuẩn được sử dụng là 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate (Sigma). Quy trình: - Mẫu SLs thô và chất chuẩn sẽ được hòa tan trong ethylacetate, sau đó được chấm lên bản sắc ký ở vạch xuất phát ngay những điểm đã đánh dấu cách mép bản sắc ký 1 cm. 25
  35. - Ngâm bản sắc ký vào bình chứa hệ dung môi (chloroform/methanol với tỷ lệ 80:10 v/v) có nắp đậy, đợi khoảng 30 phút cho đến khi dung môi chạy đến vạch đã đánh dấu thì dừng lại. - Lấy bản sắc ký ra, để bên ngoài cho dung môi bay hơi hết. - Sau đó, phun dung dịch acid sulfuric 40 % lên bản sắc ký và đặt ở 1000C để làm xuất hiện sắc ký đồ. 2.3.4. Xác định thành phần SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Nguyên tắc: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) là một kỹ thuật sắc ký sử dụng để phân tách một hỗn hợp trong lĩnh vực hóa phân tích và sinh hóa với mục đích xác định, định lượng và tinh khiết từng thành phân riêng lẻ của hợp chất. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao dựa trên áp lực của bơm cơ học lên một chất dung môi lỏng để tải một chất hỗn hợp đơn giản (pha động) vào cột hóa học chứa các hạt (pha tĩnh), qua đó quá trình phân tách xảy ra dựa vào sự tương tác khác nhau của từng chất trong pha động với các hạt ở pha tĩnh, mà thời gian ra khỏi cột của từng chất là khác nhau. Đồng thời đầu dò có thể là UV – VIS, quỳnh quang, khối phổ sẽ phát hiện chất phân tích khi chúng đi qua cột và ghi lại những đỉnh peak, một đỉnh peak tương ứng với một chất có trong mẫu cần phân tích. Mục đích: dựa trên sự so sánh sắc ký đồ từ mẫu chuẩn được sử dụng là 1′,4″- Sophorolactone 6′,6″-diacetate (sigma) và sắc ký đồ từ mẫu SLs thô có thể định tính, xác định thành phần và độ tinh khiết của mẫu SLs thô đã thu được. Quy trình: - Pha mẫu: cân và hòa mẫu SLs thô, SLs chuẩn trong methanol đạt nồng độ mẫu 10 mg/ml. - Rửa cột và thiết lập chương trình chạy mẫu: 26
  36. - Hệ dung môi methanol và nước cất hai lần phải được đuổi khí trước khi bơm vào hệ thống HPLC. - Rửa cột bằng methanol trong 60 phút. - Cân bằng cột trong 30 phút. - Quy trình phân tích được thể hiện ở hình 2.3 120 100 80 60 40 % methanol % 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 thời gian (t) Hình 2.3. Quy trình phân tích mẫu SLs trong sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) - Sử dụng cột C18 Silia Chrom _ Silicycle (Canada). Kích thước cột 4,6 x 250 mm, 5 µm - Tốc độ dòng 1 ml/phút. - Đầu dò: UV 210 nm. Tiến hành chạy mẫu trong 50 phút và lặp lại 2 lần. 2.3.5. Khảo sát một số hoạt tính của SLs thu được 2.3.5.1. Khả năng nhũ hóa Quy trình: - Mẫu SLs thô sẽ được hòa tan trong dung dịch DMSO 10 % , votex kỹ, để đạt nồng độ 20 mg/ml. - Hút lần lượt 5 ml xăng, dầu đậu nành và dầu hạt cải cho vào các ống nghiệm. 27
  37. - Sau đó, thêm 5 ml dung dịch SLs thô vào từng ống nghiệm, votex kỹ trong 2 phút và để yên trong 24 giờ. Đối chứng âm được sử dụng là nước. - Cuối cùng tiến hành quan sát, đo và tính toán kết quả. Cách tính: Chỉ số nhũ hóa sau 24 giờ được tính theo công thức: E = x 100 24 2.3.5.2. Khả năng kháng oxy hóa Nguyên tắc: DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl; C18H12N5O6, M= 394,33) là một gốc tự do, trong dung dịch ethanol tuyệt đối sẽ có màu tím và độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm. Hình 2.4. Cơ chế phản ứng DPPH Nguồn: Patel Rajesh M và Patel Natvar J (2011). Khi phản ứng với các chất có tính kháng oxy hóa, electron thừa của nguyên tử nitơ trong DPPH sẽ kết hợp với nguyên tử hydro từ chất có tính kháng oxy hóa để tạo thành dạng hydrazine tương ứng (Diphenylpicrylhydrazine) không có gốc tự do. Kết quả làm mất màu tím của DPPH ban đầu và dung dịch dần chuyển sang màu vàng (Hình 2.4). 28
  38. Quy trình: - Hòa tan DPPH (dạng bột) vào ethanol tuyệt đối để đạt nồng độ 0,12 mg/ml (10X). Pha loãng dung dịch xuống nồng độ 0,012 mg/ml (1X) và bao tube lại bằng giấy bạc. - Hòa tan vitamin C (dạng bột) – đối chứng dương, vào nước cất sau đó votex để đạt nồng độ 2 mg/ml (10X). Pha loãng dung dịch xuống nồng độ 0,2 mg/ml (1X) và bao tube lại bằng giấy bạc. - Mẫu SLs thô được hòa tan trong ethanol tuyệt đối, votex để đạt nồng độ 20 mg/ml. Pha loãng mẫu thành dãy các nồng độ tương ứng: 20; 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625; 0,3125; 0,156; 0,078 mg/ml. - Hút 100 µl ethanol tuyệt đối – đối chứng âm cho vào giếng 1, 2 của hàng A. - Hút 100 µl Vitamin C – đối chứng dương ở nồng độ 2 mg/ml cho vào giếng 1, 2 của hàng B và nồng độ 0,2 mg/ml vào giếng 1, 2 của hàng C. - Hút lần lượt 100 µl mẫu SLs ở các nồng độ tương ứng 20; 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625; 0,3125; 0,156; 0,078 mg/ml cho vào các giếng 1, 2 của các hàng D, E, F, G, H, tương tự cho giếng 3, 4 của các hàng ở các nồng độ tiếp theo. - Thêm 100 µl dung dịch DPPH vào tất cả các giếng, trộn đều hỗn hợp. - Bao đĩa bằng giấy bạc và ủ ở 370C trong 30 phút. - Đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 517 nm. Khả năng kháng oxi hóa hay bắt các gốc tự do DPPH của mẫu SLs thô sẽ được tính theo công thức sau: Khả năng kháng oxi hóa của mẫu = (1 ) x 100 2.3.5.3. Khả năng kháng khuẩn ► Định tính khả năng kháng khuẩn bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch Nguyên tắc: Dung dịch SLs sẽ khuếch tán trong môi trường thạch và tác động lên vi khuẩn được kiểm tra. Nếu SLs kháng được vi khuẩn kiểm tra thì sẽ xuất hiện 29
  39. vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Độ lớn của vòng kháng khuẩn sẽ tỷ lệ thuận với độ nhạy cảm của vi khuẩn so với dung dịch SLs. Mục đích: Định tính sơ bộ khả năng kháng khuẩn của SLs thu được. Quy trình: - Các chủng vi khuẩn được khảo sát là: S.aureus, B.subtilis và P.eruginosa. Tất cả các chủng trên sẽ được nuôi cấy lắc trong môi trường LB lỏng, ở 370C trong 24 giờ. - Mẫu SLs thô được hòa tan trong DMSO 10 %, votex kỹ, để đạt được nồng độ 20 mg/ml. - Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường thạch LB đã được hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. Tiến hành đục giếng thạch: đục bốn giếng gồm một giếng chứa đối chứng âm và ba giếng chứa dung dịch SLs thu được. - Hút 100 µl dịch nuôi cấy của từng loại vi khuẩn lần lượt cho vào các đĩa thạch, rồi dùng que cấy trải đều dịch vi khuẩn trên bề mặt thạch. - Hút 60 µl nước cất vô trùng cho vào giếng đối chứng âm và hút 60 µl dung dịch SLs thu được lần lượt cho vào các giếng còn lại. - Ủ đĩa ở 370C trong 24 giờ. - Quan sát và đo vòng kháng khuẩn. ► Sử dụng phƣơng pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Nguyên tắc: Các chủng vi khuẩn sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp có nồng độ của tác nhân kháng khuẩn khác nhau. Nồng độ thấp nhất của tác nhân kháng khuẩn sẽ được xác định khi tại đó có sự tác dụng ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn. Mục đích: Phương pháp MIC được thực hiện trên đĩa 96 giếng nhằm xác định nồng độ SLs thô thấp nhất có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn. 30
  40. Quy trình: - Các chủng vi khuẩn được khảo sát là: S.aureus, B.subtilis và P.aeruginosa. Tất cả các chủng trên sẽ được nuôi cấy lắc trong môi trường LB lỏng, ở 370C trong 24 giờ. - Mẫu SLs thô được hòa tan trong DMSO 10 %, votex kỹ, để đạt được nồng độ 20 mg/ml. Sau đó, pha loãng dung dịch mẫu thành một dãy với các nồng độ: 5; 2,5; 1,25; 0,625 mg/ml. - Hút 100 l dung dịch SLs thu được ở các nồng độ pha loãng lần lượt cho vào các giếng đã được đánh dấu. - Thêm lần lượt 100 l dịch vi khuẩn của các chủng vi khuẩn trên vào các giếng tương ứng. - Đối chứng: + Đối chứng âm: 100 l dịch vi khuẩn và 100 l môi trường LB lỏng. + Đối chứng dương 100 l dịch vi khuẩn và 100 l kháng sinh Ampicillin nồng độ 1 mg/ml. - Trộn đều hỗn hợp dung dịch ở tất cả các giếng. Đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 600 nm và ghi nhận lại. - Đem Ủ ở 370C, trong 24 giờ và đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 600 nm, ghi nhận lại để so sánh sự thay đổi OD trước và sau khi ủ nhằm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của SLs thu được với các chủng vi khuẩn. 2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu được tính toán trên excel và được xử lý bằng phần mềm thống kê phần mềm sigmaplot. 31
  41. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả thu nhận sophorolipids từ nguồn dầu thải và glucose Trong nghiên cứu này, hỗn hợp SLs thô sẽ được thu nhận thông qua quá trình lên men của chủng nấm men C.bombicola trên môi trường gồm hai nguồn carbon chính: glucose và dầu thải. Sau khi lên men 7 ngày, ở 300C, pH6 và tốc độ lắc 180 vòng/phút, tiến hành thu nhận dịch lên men mang đi ly tâm, sau đó tách chiết với dung môi hexane, ethylacetate và cuối cùng cô quay chân không để loại bỏ dung môi sẽ thu được hỗn hợp SLs thô. Qua quá trình lên men của chủng nấm men C.bombicola từ nguồn dầu thải và glucose, sản lượng SLs thô cao nhất đạt 21,9 g/l. Hình 3.1. Sophorolipids thu nhận qua quá trình lên men C.bombicola. Sản phẩm SLs thu được ở trạng thái dầu (lỏng) sền sệt có màu nâu và sánh hơn nước (Hình 3.1). Điều này cũng phù hợp với mô tả của Cavalero và Cooper (2003) về SLs được sản xuất bởi nấm men C.bombicola ATCC 22214. 3.2. Kết quả ảnh hƣởng của thời gian nuôi lên quá trình thu nhận Sophorolipids Sau khi lên men chủng nấm men C.bombicola trên môi trường gồm hai nguồn carbon chính: glucose và dầu thải tại các thời điểm 3, 5, 7, 10 ngày, ở 300C, pH6 và tốc độ lắc 180 vòng/phút. Lượng SLs thu được thể hiện ở hình 3.2 32
  42. 2.5 2.19 1.98 1.78 2 1.53 1.5 1 0.5 Sản Sản lƣợng SLs (g/100ml) 0 3 ngày 5 ngày 7 ngày 10 ngày thời gian lên men (ngày) Hình 3.2. Biểu đồ sản lượng SLs thu được ở những thời gian lên men lên men khác nhau Theo hình 3.2, có thể thấy rằng sản lượng SLs tăng dần từ ngày lên men thứ 3 đến ngày thứ 7 và đạt cao nhất vào ngày lên men thứ bảy (21,9 g/l). Tuy nhiên, sau đó sản lượng lại giảm xuống (17,8 g/l) ở ngày thứ 10. Điều này cho thấy tế bào nấm men C.bombicola bắt đầu sản xuất SLs vào giai đoạn cuối pha lũy thừa và khi tế bào bước vào pha cân bằng. Kết quả này cũng cho thấy sự tương đồng với kết quả nghiên cứu của Davila và cộng sự (1992). Bởi vì là hợp chất ngoại bào nên sau khi được tổng hợp SLs sẽ được tiết ra và tích lũy dần trong môi trường lên men, làm cho sản lượng SLs tăng liên tục và đạt cao nhất vào pha cân bằng. Khi bước vào pha suy vong sản lượng SLs giảm xuống có thể do các phân tử SLs bị phân hủy bởi enzyme hoặc do một tác nhân khác. Như vậy, thời gian lên men thích hợp nhất cho quá trình thu nhận SLs thô là sau 7 ngày kể từ ngày cấy chủng và sản lượng SLs đạt 21,9 g/l. 3.3. Kết quả định tính SLs thu đƣợc bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) Sau khi phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC Silicagel 60 F254) mẫu SLs thô thu nhận được từ quá trình lên men C.bombocola ATCC 22214, sử dụng glucose và dầu 33
  43. thải nhà hàng như nguồn carbon chính trong môi trường lên men. Bản sắc ký đồ được thể hiện ở hình 3.3. Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu SLs thu được (1) Chất chuẩn 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate, (2) Mẫu SLs thu được Theo như hình 3.3 có thể nhận thấy trong mẫu SLs thô có sự hiện diện của 1′,4″- Sophorolactone 6′,6″-diacetate. Bên cạnh đó, còn có một số vạch khác trên bảng sắc ký đồ, cho thấy sự có mặt của một số hợp chất khác trong mẫu SLs thô đã thu được. Theo Van Bogaert và cộng sự (2011), SLs được tổng hợp như là hỗn hợp của hai phân tử hơi khác nhau về cấu trúc, mà hai điểm chính trong sự khác biệt đó là sự lactone hóa tạo SLs lacton và acetyl hóa tạo mô hình acetyl. Kim và cộng sự (2005) cho rằng SLs tạo ra qua quá trình lên men C.bombicola gồm hai dạng SLs lacton và SLs acid, nhưng tỷ lệ của hai loại là khác nhau khi sử dụng các loại dầu khác nhau như: dầu ngô, dầu nành và SDO như nguồn carbon. Từ những dẫn chứng trên, có thể lý giải cho những vạch sắc ký đồ khác 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate là một dạng SLs khác hoặc mẫu SLs thu được chưa tinh khiết, có thể chứa một số chất khác như glucose, các acid béo 34
  44. Như vậy, SLs thu được từ quá trình lên men glucose và dầu thải bởi nấm men Candida bombicola ATCC 22214 là một hỗn hợp của nhiều dạng SLs với cấu trúc khác nhau, trong đó bước đầu xác định được có sự hiện diện của dạng 1′,4″- Sophorolactone 6′,6″-diacetate. 3.4. Kết quả khảo sát thành phần SLs thu đƣợc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Sophorolipids là hỗn hợp nhiều chất. Chúng gần như giống nhau về mặt cấu trúc, nhưng do mức độ ester hóa hoặc acetyl hóa khác nhau đã tạo ra nhiều dạng SLs khác nhau. Vì vậy, thí nghiệm phân tích thành phần SLs trong mẫu thu được đã tiến hành. Kết quả khảo sát thành phần SLs thu được qua quá trình lên men glucose và dầu thải bởi C.bombicola ATCC 22214, được thể hiện ở sắc ký đồ hình 3.4. Bên cạnh đó, để kiểm tra tính chính xác của thí nghiệm, mẫu SLs chuẩn 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″- diacetate (Sigma) cũng được gửi đi phân tích tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP. HCM (Địa chỉ: 02 Nguyễn Văn Thủ, Phường Đa Kao, Quận 1, Tp. HCM – phụ lục C) và cho kết quả tương tự. Theo như bảng sắc ký đồ ở hình 3.4 và hình 3.5 xuất hiện hai đỉnh peak (9-10) tương thích với mẫu chuẩn 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate, thời gian lưu từ phút 33 – 34. Ngoài ra, cũng phát hiện một số đỉnh peak khác so với mẫu SLs chuẩn 1′,4″- Sophorolactone 6′,6″-diacetate, điều này có thể khẳng định cho những lập luận trước đó ở mục 3.3 có cơ sở hơn và phù hợp với các nghiên cứu trước đó [12]. Có thể kết luận rằng, trong mẫu SLs thu được qua quá trình lên men glucose và dầu thải bởi C.bombicola ATCC 22214, có khoảng 10 cấu trúc SLs khác nhau. Trong đó, cấu trúc 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate cũng được xác định và thời gian lưu khi ra khỏi cột sắc ký từ phút 33 – 34. 35
  45. Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu SLs chuẩn 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate. 36
  46. 3.5. Kết quả khảo sát khả năng nhũ hóa của SLs thu đƣợc Khả năng nhũ hóa được xem như một trong những hoạt tính cơ bản của chất hoạt động bề mặt. Vì vậy, mẫu SLs thô cũng được tiến hành khảo sát hoạt tính nhũ hóa trên một số cơ chất kỵ nước như: xăng, dầu nành, dầu hạt cải, cũng đã thu được một số kết quả khả quan (Bảng 3.1). Kết quả cho thấy ở 300C trong 24 giờ, hỗn hợp SLs thu được tạo được lớp nhũ tương và có khả năng nhũ hóa một số cơ chất được khảo sát. Trong đó, hỗn hợp SLs thu được có khả năng nhũ hóa mạnh hơn đối với dầu hạt cải, dầu đậu nành, yếu hơn với xăng. Điều này cũng cho thấy rằng khả năng nhũ hóa của hỗn hợp SLs thu được là phụ thuộc vào sự tương tác trực tiếp giữa phần kỵ nước của SLs với cơ chất kỵ nước được khảo sát. Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khả năng nhũ hóa của hỗn hợp SLs thu được. Cơ chất kỵ nƣớc Chỉ số nhũ hóa (E24) (%) Xăng 39,39 % 1,05 Dầu hạt cải 63,64 % 1,82 Dầu đậu nành 65,45 % 1,80 Như vậy, hỗn hợp SLs thu được có khả năng nhũ hóa một số cơ chất kỵ nước như xăng, dầu hạt cải và dầu đậu nành với chỉ số nhũ hóa (E24) từ 39,39 – 65,45 %. 3.6. Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa của SLs thu đƣợc Để khảo sát khả năng bắt góc tự do của SLs, thử nghiệm DPPH (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) đã được thực hiện. Kết quả khả năng kháng oxy hóa của SLs được thể hiện qua hình 3.6. Theo như biểu đồ cho thấy khả năng bắt các gốc tự do DPPH của hỗn hợp SLs thu được tăng dần theo nồng độ của SLs từ 0,078 – 20 mg/ml. Ở nồng độ 20 mg/ml SLs có khả năng kháng oxy hóa 84,32 %. Nồng độ SLs thu được ức chế các gốc tự do DPPH ở 50 % (IC50) cũng được xác định là 4,4531 mg/ml. 37
  47. Hình 3.6. Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của hỗn hợp SLs thu được. Khả năng bắt các góc tự do của SLs cho thấy SLs có tiềm năng ứng dụng trong ngành mỹ phẩm và dược phẩm là khá cao. 3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu đƣợc 3.7.1. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Để khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs, phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch được thực hiện. Các chủng vi khuẩn S.aureus, B.subtilis và P.aeruginosa được dùng làm chủng chỉ thị. Kết quả thu nhận được trình bày ở hình 3.7 và bảng 3.2. Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được trên đĩa thạch Đƣờng kính vòng kháng STT Chủng vi khuẩn khuẩn (mm) 1 Staphylococcus aureus 18,3 0,6 2 Bacillus subtilis 14,7 0,6 3 Pseudomonas aeruginosa 7,2 0,8 38
  48. Hình 3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được trên đĩa thạch(-) đối chứng âm; (1), (2), (3) mẫu SLs Từ bảng kết quả cho thấy SLs thu được có khả năng kháng S.aureus mạnh nhất, đường kính vòng kháng khuẩn lên đến 18 mm, kháng P.aeruginosa là yếu nhất, đường kính vòng kháng khuẩn chỉ 7 mm. Bước đầu có thể thấy rằng hỗn hợp SLs thu được có khả năng kháng lại các chủng vi khuẩn thuộc Gram (+) mạnh hơn so với các chủng vi khuẩn thuộc Gram (-). 3.7.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Xác định khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch LB chỉ là một phương pháp để định tính, kiểm tra sơ bộ chứ không cho phép định lượng chính xác khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp SLs thu được. Do đó, hoạt tính kháng khuẩn của hỗn hợp SLs thu nhận sẽ được đo lường dựa trên phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thao tác trên đĩa 96 giếng với các chủng vi khuẩn S.aureus, B.Subtilis và P.aeruginosa. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của hỗn hợp SLs thu nhận được đối với các chủng vi khuẩn được trình bày ở bảng 3.3. Kết quả cho thấy hỗn hợp SLs thu được có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn. Trong đó, hoạt tính ức chế có hiệu quả nhất là đối với B.subtilis (0,6 mg/ml) yếu hơn với S.aureus (1,25 mg/ml) và P.aeruginosa (2,5 mg/ml). 39
  49. Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Nồng độ ức chế STT Chủng vi khuẩn tối thiểu (mg/ml) 1 Staphylococcus aureus 1,25 2 Bacillus subtilis 0,60 3 Pseudomonas aeruginosa 2,5 Hoạt tính kháng khuẩn của SLs thu được đối với các chủng vi khuẩn trên ở nồng độ SLs khá thấp, cho thấy tiềm năng ứng dụng SLs cao như là chất sát trùng, kết hợp với kháng sinh để tăng cường hiệu quả điều trị, thích hợp để làm sạch trái cây và rau quả, da và tóc khi kết hợp SLs với các acid trái cây như acid citric, acid lactic và acid [46]. 40
  50. CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sản lượng SLs thu được qua quá trình lên men glucose và dầu thải bởi C.bombicola ATCC 22214 đạt 21,9 g/l. Thời gian lên men chủng C.bombicola thích hợp nhất là 7 ngày, ở 300C, lắc 180 vòng/phút và cho sản lượng SLs cao nhất. Trong hỗn hợp SLs thu được ngoài 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate còn có sự hiện diện của các dạng cấu trúc SLs khác. SLs thu được có khả năng nhũ hóa xăng, dầu hạt cải và dầu đậu nành với chỉ số nhũ hóa (E24) từ 39,39 – 65,45 %. SLs thu được cũng cho thấy có hoạt tính ức chế sự phát triển của một số chủng vi khuẩn với nồng độ ức chế tối thiểu được xác định: S.aureus (1,25 mg/ml), P.aeruginosa (2,5 mg/ml) và B.subtilis (0,6 mg/ml). Ngoài ra, SLs thu được còn có hoạt tính kháng oxy hóa đạt 84,32 % ở nồng độ 20 mg/ml và IC50 cũng được xác định là 4,4531 mg/ml. 4.2. Kiến nghị Phân tách và tinh sạch các dạng cấu trúc khác nhau trong hỗn hợp SLs thu được từ glucose và dầu thải. Lên men sản xuất SLs ở quy mô lớn hơn trong các fermentor 2 – 5 lít. Nhằm thu lượng SLs lớn hơn, hướng đến mục tiêu ứng dụng vào các ngành dược phẩm, mỹ phẩm Tiếp tục tìm nguồn carbon rẻ hơn trong việc sản xuất SLs, làm giảm chi phí sản xuất. Chẳng hạn như thay glucose bằng mật rỉ đường mía. 41
  51. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Nguyễn Lân Dũng (2012). Hình thái và cấu tạo tế bào nhân các vi sinh vật nhân thực, Vi sinh vật học, Nguyễn Lân Dũng, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, Hà Nội, 84-87. [2] Lại Thúy Hiền, Dương Văn Thắng, Trần Cẩm Vân, Doãn Thái Hòa (2003). Vi khuẩn tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học phân lập từ bãi biển Nha Trang. Tạp chí Sinh học, 25, (4), 53-61. [3] Lại Thúy Hiền, Nguyễn Thị Yên, Vương Thị Nga (2013). Vi khuẩn tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học Rhodococcus ruber TD2 phân lập từ nước ô nhiễm dầu ven biển Vũng Tàu. Tạp chí Sinh học, 35, (4), 454-460. [4] Nguyễn Quốc Việt, Nguyễn Bá Hữu, Đặng thị Cẩm Hà (2004). Khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học của chủng vi khuẩn KC31. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2, (4), 501-510. Tài liệu tiếng Anh [5] Akari S and Akari Y (1987). Method of modifying quality of wheat flour product, Japanese patent 61205449. [6] Banat M.I, Franzetti A, Gandolfi A, Besttetti G (2010). Microbial biosufactants production, applications and future potential, Appl Microbiol Biotechnol, 87, 427- 444. [7] Baviere M, Degouy D, Lecourtier J (1994). Process for washing solid particles comprising a sophoroside solution, US patent 5326407. [8] Bluth MH, Kandil E, Mueller CM, Shah V, Lin YY, Zhang H, Dresner L, Lempert L, Nowakowski M, Gross R, Schulze R, Zenilman ME (2006). Sophorolipids block lethal effects of septic shock in rats in a cecal ligation and puncture model of experimental sepsis, Crit Care Med, 34, 188-195. 42
  52. [9] Borzeix CF (1999). Use of sophorolipids comprising diacetyl lactones as agent for stimulating skin fibroblast metabolism, World patent 99/62479. [10] Cavalero DA and Cooper DG (2003). The effect of medium composition on the structure and physical state of sophorolipids produced by Candida bombicola ATCC 22214, Journal of Biotechnology, 103, 31-41. [11] Chandran P and Das N (2011). Characterization of sophorolipid biosurfactant produced by yeast species grown on diesel oil, I J S N, vol 2, (1), 63-71. [12] Chen J, Song X, Zhang H, Qu Y.B, Miao JY (2006). Production, tructure elucidation and anticancer properties of sophorolipid from Wickerhamiella domercqiae, Enzyme Microb Technol, 39, 501-506. [13] Cooper D.G and Paddock D.A (1984). Applied and Environmental Microbiology, 47, 173-176. [14] Daverey A and Pakshirajan K (2009). Production, Characterization and Propertie of Sophorolipids from the Yeast Candida bombicola using a Low-cost Fermentative Medium, Appl Biochem Biotechnol, 158, 663-674. [15] Davila AM, Marchal R, Vandecasteele JP (1992). Kineticộng sự and balance of a fermentation free from product inhibition: sophorose lipid production by Candida bombicola, Appl Microbiol Biotechnol, 38, 6 -11. [16] Desai J.D, Banat I.M (1997). Microbial production of biosurfactants and their commercial potentials, Microbiol Mol Biol Rev, 61, 47-64. [17] Fleurackers S.J.J (2006). On the use of waste frying oil in the systhesis of sophorolipids, Eur.J.Lipid Sci.Technol, 108, 5-12. [18] Futura T, Igarashi K, Hirata Y (2002). Low-foaming detergent compositions, World patent 03/002700. [19] Gobbert U, Lang S, Wagner F (1984). Sophorose lipid formation by resting cells of Torulopsis bombicola,Biotechnol. Lett, 6, 225-230. 43
  53. [20] Gorin P.A.J, Spencer J.F.T, Tulloch A.P (1961). Hydroxy fatty acid glycosides of sophorose from Torulopsis magnolia,Can. J. Chem, 39, 846-855. [21] Hall PJ, Haverkamp J, Van Kralingen CG, Schmidt M (1996). Laundry detergent composition containing synergistic combination of sophorose lipid and nonionic surfactant, US patent 5520839. [22] Hillion G, Marchal R, Stoltz C, Borzeix CF (1998). Use of a sophorolipid to provide free radical formation inhibiting activity or elastase inhibiting activity, US patent 5756471. [23] Hommel R.K, Weber L, Weiss A, Himmelreich U, Rilke O, Kleber H.P (1994). Production of sophorose lipid by Candida (Torulopsis) apicola grown on glucose, J Biotechnol 33, 147-155. [24] Isoda H, Kitamoto D, Shinmoto H, Matsumura M, Nakahara T (1997). Microbial extracellular glycolipid induction of differentiation andinhibition of the protein kinase C activity of human promyelocytic leukemia cell line HL60. Biosci Biotechnol Biochem,61, 609-614. [25] Jose AC and Felix GO (1999). Sophorolipid production by Candida bombicola: Medium Composition and culture methods, J.Biosci Bioeng, 88, 488-494. [26] Joshi-Navare K and Prabhune A (2013). A Biosurfactant-Sophorolipid Acts in Synergy with Antibioticộng sự to Enhance Their Efficiency, Hindawi Publishing Corporation, ID 512495. [27] Kim H.S, Kim Y.B, Lee B.S, and Kim E.K (2005). Sophorolipid production by Candida bombicola ATCC 22214 from a corn-oil processing byproduct, Journal of Microbiology and Biotechnology, 15, (1), 55-58. [28] Kurtzman C.P and Fell J.W (2001). The yeast a taxonomic study, 4th edition. [29] Ma X, Li H and Song X (2012). Surface and biological activity of sophorolipid molecules produced by Wickerhamiella domercqiae var. sophorolipid CGMCC 1576, Journal of Colloid and Interface Science, 376, 165-172. 44
  54. [30] Magdalena P. P, Grazyna A.P, Zofia P.S, Swaranjit S.C (2011). Environmental applications of biosurfactants: Recent Advances, Int. J. Mol. Sci, 12, 633-654. [31] Mager H, Rothlisberger R, Wzgner F (1987). Use of sophorolse-lipid lactone for the treatment of dandruffs and body odeur, European patent 0209783. [32] Marchal R, Lemal J, Sulzer C, Davila AM (1999). Production of sophorolipid acetate acids from oils or esters, US patent 5900366. [33] Maria S.K and Irena B.I (2010). Rhodococcus biosurfactants: Biosynthesis, Properties and Potential Application. Bio. Rhodococcus, 16, 291-313. [34] Masaru K, Takashi N, Yoji A, Kazuo N, Tatsu N, Sumiko T, Jotaro N (2001). Composition for high-density cold storage transportation, Japanese patent 2001131538. [35] Morya VK, Park JH, Kim TJ, Jeon S and Kim EK (2013). Production and characterization of low molecular weight sophorolipid under fed-batch culture, Bioresource Technology, 143, 282-288. [36] Muthuswami K, Gopalkrishnan S, Ravi T.K and Sivachidambaram P (2008). Current Science, 94, (6), 736-747. [37] Otto R.T, Daniel H.J, Pekin G, Pekin et al (1999). Production of sophorolipids from whey, Appl Biochem Biotechnol, 52, 495-501. [38] Parul Dubey, Kaliaperumal Selvaraj, Asmita Prabhune (2013). Sophorolipids: in self assembly and nanomaterial synthesis, World journal of pharmacy and pharmaceutical sciences, 2, (3), 1107-1133. [39] Pellecier F, André P (2004). Cosmetic use of sophorolipids as subcutaneous adipose cushion regulation agents and slimming application, World patent 2004/108063. [40] Pierce D, Heilman T.J (1998). Germicidal composition, World patent 98/16192. 45
  55. [41] Price NP, Ray KJ, Vermillion KE, Dunlap CA, Kurtzman CP (2012). Structural characterization of novel sophorolipid biosurfactants from a newly identified species of Candida yeast, Carbohydrate Research, 348, 33-41. [42] Rosenberg E and Ron EZ (1999). High and low molecular mass microbial surfactants, Appl Microbiol Biotechnol, 52, 154-162. [43] Shah V, Doncel GF, Seyoum T, Eaton KM, Zalenskaya I, Hagver R, Azim A, Gross R (2005). Sophorolipids, microbial glycolipids with anti – human immunodeficiency virus and sperm – immobilizing activities, Antimicrob Agents Chemother, 49, 4093-4100. [44] Shal V, Mia J and Daniel B (2007). Utilization of Restaurant Waste Oil as a Precursor for Sophorolipid Production, Department of Biology, Dowling College, Idle Hour Blvd, Oakdale, New York 11769. [45] Shao L, Song X, Ma X, Qu Y (2012). Bioactivities of Sophorolipid with Different Structures Against Human Esophageal Cancer Cells, Journal of Surgical Research, 173, 286-291. [46] Solaiman D.K.Y (2005). Applications of microbial surfactants, Inform, 16, 408- 410. [47] Spencer JFT, Gorin PAJ and Tulloch AP (1970). Torulopsis bombicola sp. N Antonie Van Leeuwenhoek, 36, 129-133. [48] Tulloch AP and Spencer JFT (1968). Fermentation of long chain compounds by Torulopsis apicola. IV. Products from estersand hydrocarbons with 14 and 15 carbon atoms and from methyl palmitoleate, Can J Chem, 46, 1523-1528. [49] Van Bogaert INA, Zhang J and Soetaert W (2011). Microbial synthesis of sophorolipids, Process Biochem, 46, 821-833. [50] Van Bogaert IN, Saerens K, De-Muynck C, Develter D, Soetaert W, Vandamme E.J (2007). Microbial production and application of sophorolipids, Appl Microbiol Biotechnol, 76, 23-34. 46
  56. [51] Yoo DS, Lee BS, Kim EK (2005). Characteristicộng sự of microbial biosurfactant as an antifungal agent against plant pathogenic fungus, J Microbiol Biotechnol, 15, 1164-1169. Tài liệu Internet [52] sự.psb.ugent.be/genomes/ [53] dau-ran-phe-thai.html 47
  57. PHỤ LỤC Phụ lục A : Bảng kết quả khảo sát hoạt tính của sophorolipids 1. Lƣợng sophorolipids thu đƣợc theo thời gian Sản lượng (g/100ml) Ngày Trung bình Độ lệch chuẩn Lần 1 Lần 2 Lần 3 3 1,783 1,235 1,577 1,53 0,28 5 1,849 1,923 2,178 1,98 0,17 7 2,070 2,367 2,140 2,19 0,16 10 1,748 1,892 1,703 1,78 0,10 2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch Kích thước vòng kháng Vi khuẩn khảo sát khuẩn (mm) Trung bình Độ lệch chuẩn Lần 1 Lần 2 Lần 3 S.aureus 19 18 18 18,3 0,6 B.subtilis 15 15 14 14,7 0,6 P.aeruginosa 8 7 6,5 7,2 0,8 1
  58. 3. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phƣơng pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu S.aureus P.aeruginosa B.subtilis Nồng độ OD600nm OD600nm OD600nm SLs Ban đầu Sau 24h Ban đầu Sau 24h Ban đầu Sau 24h (mg/ml) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Đối chứng 0,339 0,347 0,893 0,912 0,314 0,373 0,817 0,865 0,311 0,325 0,786 0,883 (-) 5 0,287 0,294 0,186 0,191 0,273 0,265 0,184 0,182 0,265 0,260 0,181 0,177 2,5 0,263 0,251 0,139 0,138 0,254 0,257 0,143 0,141 0,248 0,249 0,131 0,132 1,25 0,187 0,187 0,160 0,142 0,180 0,176 0,201 0,202 0,179 0,176 0,108 0,104 0,625 0,127 0,132 0,558 0,481 0,136 0,131 0,335 0,332 0,129 0,129 0,089 0,087 Đối chứng 0,101 0,095 0,080 0,082 0,092 0,097 0,081 0,078 0,083 0,081 0,079 0,078 (+) B.subtilis Nồng độ OD600nm SLs Ban đầu Sau 24h (mg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Đối chứng 0,314 0,345 0,337 0,786 0,883 0,791 (-) 1 0,220 0,223 0,234 0,125 0,139 0,132 0,8 0,187 0,213 0,212 0,129 0,124 0,126 0,6 0,183 0,187 0,188 0,107 0,111 0,113 0,4 0,166 0,154 0,159 0,372 0,437 0,530 Đối chứng 0,080 0,081 0,081 0,075 0,076 0,077 (+) 2
  59. 4. Kết quả khảo sát khả năng nhũ hóa của sophorolipids Chiều cao lớp nhũ Chỉ số nhũ hóa E Chiều cao 24 tương (mm) (%) Trung Độ lệch dung dịch Lần bình chuẩn Lần 1 Lần 3 (mm) Lần 1 Lần 2 Lần 3 2 Xăng 22 21 22 40,00 38,18 40,00 39,39 1,05 55 Dầu hạt 35 34 36 63,64 61,82 65,45 63,64 1,82 cải Dầu 35 36 37 63,64 65,45 67,27 65,45 1,82 nành 5. Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa của sophorolipids OD517nm Nồng độ SL % kháng oxy hóa (mg/ml) Lần 1 Lần 2 Trung bình Độ lệch chuẩn control 0,700 0,780 0,740 0,057 0 0,078 0,695 0,686 0,691 0,006 6,69 0,156 0,678 0,677 0,678 0,001 8,45 0,3125 0,657 0,653 0,655 0,003 11,49 0,625 0,623 0,630 0,627 0,005 15,34 1,25 0,561 0,587 0,574 0,018 22,43 2,5 0,476 0,489 0,483 0,009 34,80 5 0,380 0,390 0,385 0,007 47,97 10 0,225 0,223 0,224 0,001 69,73 20 0,118 0,114 0,116 0,003 84,32 3
  60. Phụ lục B: Các loại môi trƣờng 1. Môi trƣờng giữ giống C.bombicola (Pre-culture media-YM media) - Glucose 1 % - Yeast extract 0,3 % - Malt extract 0,3 % - Peptone 0,5 % 2. Môi trƣờng nuôi cấy C.bombicola sản xuất sophorolipids (sophorolipid production media) - Oil 10 % (dầu thải nhà hàng KFC) - Glucose 10 % - Yeast extract 0,5 % - KH2PO4 0,1 % - MgSO4.7H2O 0,05 % - CaCl2.2H2O 0,01 % - NaCl 0,01 % - Peptone 0,07 % - Tỷ lệ cấy giống 5 % (v/v) 3. Môi trƣờng LB (Luria Bertani) - Tryptone 1 % - Yeast extract 0,5 % - NaCl 1 % 4. Môi trƣờng LB - thạch (Luria Bertani agar) - Tryptone 1 % - Yeast extract 0,5 % - NaCl 1 % - Agar 2 % 4
  61. Phụ lục C: Một số hình ảnh và thiết bị trong thí nghiệm Dịch lên men chủng C.bombicola sau 7 ngày Sản lượng sophorolipids theo thời gian lên men 5
  62. Thí nghiệm xác định khả năng chống oxy hóa của sophorolipids Hệ nhũ tương giữa sophorolipids và các cơ chất kỵ nước. 6
  63. Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Các loại đầu dò trong kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao 7
  64. Máy cô quay chân không 8