›

Đồ án Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (Basella alba L.) và khảo sát hoạt tính sinh học

pdf 118 trang thiennha21 13/04/2022 4470
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (Basella alba L.) và khảo sát hoạt tính sinh học", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_tach_chiet_hop_chat_anthocyanin_tu_qua_mong.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (Basella alba L.) và khảo sát hoạt tính sinh học

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT ANTHOCYANIN TỪ QUẢ MỒNG TƠI CHÍN (BASELLA ALBA L.) VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC. Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Thu Hương Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thanh Loan MSSV: 1211100261 Lớp: 13DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 7/2017
  2. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là trung thực và chƣa từng đƣợc các tác giả khác công bố trong các nghiên cứu, đồ án nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành đồ án đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong đồ án đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong đồ án này. TP. HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thanh Loan i
  3. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận đƣợc sự động viên và giúp đỡ rất lớn từ các cá nhân và tập thể. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hƣớng dẫn ThS. Nguyễn Thị Thu Hƣơng, giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, ngƣời đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Phòng thí nghiệm Trƣờng Đại học Công nghệ TP. HCM đã tạo mọi điều kiện cơ sở vật chất tốt cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các bạn trong nhóm sinh viên làm nghiên cứu khoa học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này. TP. HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thanh Loan ii
  4. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC SƠ ĐỒ vii DANH MỤC HÌNH viii LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Tổng quan về cây mồng tơi 5 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại 5 1.1.2. Đặc điểm và sinh thái 6 1.1.3. Tình hình trồng trọt, tiêu thụ, kỹ thuật canh tác cây mồng tơi ở Việt Nam 7 1.1.3.1. Tình hình trồng trọt và tiêu thụ 7 1.1.3.2. Kỹ thuật canh tác 8 1.1.4. Thành phần hóa học 10 1.1.5. Tính vị và công dụng 11 1.2. Hợp chất Phenol, Flavonoid, Anthocyanin 12 1.2.1. Phenol 12 1.2.1.1. Đại cƣơng về hợp chất phenol 12 1.2.1.2. Phân loại 13 1.2.1.3. Tính chất và chức năng 14 1.2.2. Flavonoid 15 1.2.2.1. Đại cƣơng về flavonoid 15 1.2.2.2. Phân loại 15 1.2.2.3. Lý tính 16 1.2.2.4. Hóa tính 17 i
  5. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.2.5. Hoạt tính sinh học 18 1.2.3. Anthocyanin 21 1.2.3.1. Đại cương về anthocyanin 21 1.2.3.2. Phân loại 23 1.2.3.3. Lý tính 24 1.2.3.4. Hóa tính 24 1.2.3.5. Hoạt tính sinh học 25 1.3. Các phƣơng pháp tách chiết hợp chất thứ cấp trong thực vật 26 1.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 26 1.3.2. Kỹ thuật chiết lỏng – rắn 28 1.3.2.1. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt 28 1.3.2.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm 28 1.3.2.3. Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhlet 29 1.3.2.4. Kỹ thuật chiết bằng máy Kumagawa 30 1.3.2.5. Phƣơng pháp chƣng cất 31 1.3.2.6. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn 32 1.3.2.7. Kỹ thuật chiết pha rắn 33 1.4. Tổng quan về khả năng kháng oxy hóa 34 1.4.1. Quá trình và nguyên nhân gây oxy hóa 34 1.4.2. Khả năng kháng oxy hóa của các hợp chất trong thực vật 35 1.5. Cơ sở khoa học của khả năng kháng khuẩn của các hợp chất trong thực vật .35 1.5.1. Định nghĩa 35 1.5.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất trong thực vật 36 1.6. Các chủng vi sinh vật thí nghiệm 38 1.6.1. Salmonella 38 1.6.2. Staphylococcus aureus 39 ii
  6. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.6.3. Escherichia Coli 40 1.6.4. Bacillus cereus 42 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Error! Bookmark not defined. 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 44 2.2. Vật liệu nghiên cứu 44 2.2.1. Nguồn mẫu 44 2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị 44 2.3. Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 44 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 45 2.4.1. Phương pháp xác định độ ẩm của mẫu 45 2.4.2. Phương pháp xác định tỉ lệ trọng lượng của mẫu 46 2.4.3. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao chiết 46 2.4.4. Phương pháp định lượng polyphenol tổng số 46 2.4.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH 47 2.4.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng kỹ thuật đục lỗ thạch 48 2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu 50 2.4.8. Phương pháp so sánh, đối chiếu 50 2.5. Bố trí thí nghiệm 50 2.5.1. Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm của mẫu quả mồng tơi 50 2.5.2. Thí nghiệm 2: Xác định tỉ lệ trọng lượng của mẫu 51 2.5.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến hàm lượng anthocyanin 51 2.5.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến hàm lượng polyphenol tổng số 54 2.5.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến khả năng kháng oxy hóa 55 iii
  7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.5.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến khả năng kháng khuẩn 55 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined. 3.1. Kết quả xác định độ ẩm và tỉ lệ trọng lƣợng của quả mồng tơi chín 58 3.2. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của dung môi đến hàm lƣợng anthocyanin 58 3.3. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của dung môi đến hàm lƣợng polyphenol tổng số .60 3.4. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của dung môi đến khả năng kháng oxy hóa .63 3.5. Kết quả ảnh hƣởng của dung môi trích ly đến khả năng kháng khuẩn 67 3.5.1. Hoạt tính kháng Bacillus cereus của các loại cao chiết 67 3.5.2. Hoạt tính kháng Salmonella của các loại cao chiết 67 3.5.3. Hoạt tính kháng E.coli của các loại cao chiết 68 3.5.4. Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của các loại cao chiết 69 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined. 4.1. Kết luận 71 4.2. Kiến nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 1 iv
  8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AG : acid gallic BVTV : bảo vệ thực vật db : nguyên liệu DMSO : Dimethyl Sulfoxide DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl IC50 : The half maximal inhibitory concentration NA : Nutrient Agar NB : Nutrient Broth OD : Optical Density TN : thí nghiệm v
  9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại khoa học cây mồng tơi 5 Bảng 1.2. Thành phần hóa học của cây mồng tơi 10 Bảng 1.3. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (Cowan, 1990) 37 Bảng 1.4. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn Salmonella 38 Bảng 1.5. Phân loại khoc học chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus 39 Bảng 1.6. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn E.Coli 40 Bảng 1.7. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn Bacillus cereus 42 Bảng 3.1. Tỉ lệ trọng lƣợng phần sử dụng và độ ẩm quả mồng tơi chín 58 Bảng 3.2. Kết quả đƣờng chuẩn acid gallic 60 Bảng 3.3. Kết quả hàm lƣợng polyphenol tổng trong 4 loại dung môi trích ly quả mồng tơi chín 61 Bảng 3.4. Phần trăm ức chế của cao quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác nhau ( các mẫu tự theo sau các giá trị trong cùng một cột khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 1%). 65 Bảng 3.5. Phƣơng trình đƣờng chuẩn và giá trị IC50 của nghiệm thức 65 Bảng 3.6. Kết quả kháng Bacillus cereus của 4 loại cao chiết 67 Bảng 3.7. Kết quả kháng Salmonella của 4 loại cao chiết 67 Bảng 3.8. Kết quả kháng E.coli của 4 loại cao chiết 68 Bảng 3.9. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của 4 loại cao chiết 69 vi
  10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 50 Sơ đồ 2.2. Quy trình trích ly và thu hồi cao quả mồng tơi 53 Sơ đồ 2.3. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết quả mồng tơi chín 56 Sơ đồ 3.1. Hiệu suất thu hồi cao chiết từ quả mồng tơi chín vối các dung môi khác nhau 59 Sơ đồ 3.2. So sánh hàm lƣợng polyphenol tổng của cao chiết quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác nhau 62 Sơ đồ 3.3. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của vitamin C và cao chiết ở các dung môi trích ly khác nhau. 66 Sơ đồ 3.4. Tổng quát về hoạt tính kháng khuẩn của cao quả mồng tơi chín từ các loại dung môi khác nhau trên cả 4 chủng vi khuẩn. 70 vii
  11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây mồng tơi 6 Hình 1.2. Quả mồng tơi 6 Hình 1.3. Anthocyanin 11 Hình 1.4. Một số hợp chất phenol 13 Hình 1.5. Một số Eucoflavonoid 15 Hình 1.6. Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin 21 Hình 1.7. Cấu trúc của 6 loại phổ biến trong nhóm anthocyanin 22 Hình 1.8. Cấu trúc của một số anthocyanin tự nhiên. Các anthocyanin tƣơng ứng luôn đƣợc glycosyl hóa ở nhóm hydroxy C 3 23 Hình 1.9. Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH 25 Hình 1.10. Kỹ thuật chiết lỏng lỏng 27 Hình 1.11. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt 28 Hình 1.12. Kỹ thuật chiết ngâm dầm 29 Hình 1.13. Bộ chiết Soxhlet 30 Hình 1.14. Máy chiết Kumagawa 31 Hình 1.15. Bộ lôi cuốn hơi nƣớc 31 Hình 1.16. Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn 32 Hình 1.17. Cột chiết pha rắn 33 Hình 1.18. Cơ chế kháng khuẩn 36 Hình 1.19. Vi khuẩn Salmonella 39 Hình 1.20. Vi khuẩn Staphylococcus aureus 40 Hình 1.21. Vi khuẩn Escherichia Coli 41 Hình 1.22. Vi khuẩn Bacillus cereus 42 Hình 2.1. Quả mồng tơi chín 44 Hình 2.2. Kỹ thuật đục lỗ thạch có bổ sung kháng sinh đối chứng 49 Hình 2.3. Hỗn hợp quả mồng tơi giã nhỏ và dung môi sau khi lắc 53 viii
  12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.1. Dịch chiết quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác nhau 58 Hình 3.2. Cao chiết quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác nhau 59 Hình 3.3. Dung dịch đƣờng chuẩn acid gallic 60 Hình 3.4. Đƣờng chuẩn acid gallic 61 Hình 3.5. Đƣờng chuẩn vitamin C 63 Hình 3.6. Phản ứng của DPPH và chất chuẩn vitmin C 63 Hình 3.7. Đƣờng chuẩn của cao chiết ethanol 30%, 50%, 70%, nƣớc cất (theo thứ tự từ trên xuống dƣới, từ trái sang phải) .64 Hình 3.8. Phản ứng của DPPH và cao chiết 64 ix
  13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Từ rất xa xƣa, ngƣời ta đã biết sử dụng các chất màu tự nhiên từ thực vật để tạo màu cho thực phẩm. Trong công nghiệp thực phẩm, các chất nhuộm màu có nguồn gốc tự nhiên chỉ chiếm 6% trong tổng số các chất đƣợc sử dụng để tạo màu. Ngoài việc chiết xuất các sắc tố này trong tự nhiên, ngƣời ta có thể tổng hợp hóa học, sử dụng các chất tạo màu nhân tạo. Tuy nhiên, nếu lạm dụng nhiều phụ gia là các chất màu tổng hợp nhân tạo vào trong thực phẩm sẽ gây ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe con ngƣời. Vì thế việc nghiên cứu ứng dụng chất màu tự nhiên trong chế biến thực phẩm có ý nghĩa rất quan trọng, vừa tạo màu sắc tự nhiên, đặc trƣng của sản phẩm, vừa tăng giá trị cảm quan và đặc biệt là an toàn cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Cây mồng tơi là loại rau xanh ngắn ngày, có thể trồng nhiều vụ trong năm, quen thuộc với ngƣời Việt Nam trong các bữa ăn hàng ngày. Và do kỹ thuật trồng cây khá dễ, dễ chăm bón, dễ tìm mua hạt giống hay cây giống nên nhiều gia đình có thể tự trồng rau mồng tơi tại nhà. Tuy nhiên, chúng ta chỉ thu hoạch và sử dụng lá, phần quả đƣợc phơi khô làm giống, để rơi rụng hoặc bị cắt bỏ. Quả mồng tơi chín có chứa hợp chất anthocyanin có nhiều hoạt tính sinh học quý nhƣ khả năng chống oxy hóa cao nên đƣợc sử dụng để chống lão hóa, hoặc chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, chống viêm, chống các tia phóng xạ, hạn chế sự suy giảm sức đề kháng, sự phát triển của các tế bào ung thƣ Dù vậy, các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính của quả mồng tơi chín có thể ứng dụng trong thực phẩm và y học nhƣng vẫn còn rất hạn chế ở Việt Nam. Việc nghiên cứu sản xuất và bổ sung các hợp chất màu đƣợc tách từ thiên nhiên vào thực phẩm, hạn chế sử dụng phụ gia tổng hợp gây hại cho con ngƣời luôn đƣợc xã hội quan tâm. Các hợp chất màu trong rau quả đƣợc chia làm bốn nhóm chính: Chlorophylls, Carotenoids, Flavonoids, Betalains. Mỗi màu sắc đặc trƣng cho một loại rau quả và chứa một vài chất có hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, màu sắc này lại không 1
  14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP bền theo thời gian và dễ bị ảnh hƣởng bởi những tác động bên ngoài nhƣ: nhiệt độ, pH, ánh sáng Từ những nguyên nhân trên, đề tài “Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (Basella alba L.) và khảo sát hoạt tính sinh học” đƣợc thực hiện, tạo tiền đề khoa học cho các nghiên cứu tạo màu thực phẩm cũng nhƣ trong lĩnh vực y dƣợc mang lại nhiều giá trị thực tiễn. 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 2.1. Các nghiên cứu trong nƣớc - Luận văn tốt nghiệp “Anthocyanin – nghiên cứu tách chiết từ cây mồng tơi Basella ruba L. Và khảo sát khả năng chống oxy hóa, nhận diện hàn the trong thực phẩm” Ngô Trần Hữu Nghĩa (2014). Đề tài sử dụng dịch chiết từ quả mồng tơi. - Luận văn thạc sĩ khoa học “Nghiên cứu tách chiết caroten từ một số loại rau xanh và ứng dụng phối màu” Nguyễn Vũ Thái Hòa (2011). Trong đó, caroten đƣợc tách chiết trong rau mồng tơi. 2.2. Các nghiên cứu ngoài nƣớc - Kumar, S. Sravan, P. Manoj, and P. Giridhar. "A method for red-violet pigments extraction from fruits of Malabar spinach (Basella rubra) with enhanced antioxidant potential under fermentation." Journal of food science and technology 52.5 (2015): 3037-3043. Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của quả mồng tơi lên quá trình lên men. - Nirmala, A., S. Saroja, and G. Gayathri Devi. "Antidiabetic Activity of Basella rubra and its Relationship with the Antioxidant Property." (2011). Vai trò của rau mồng tơi trong điều trị bệnh tiểu đƣờng. 3. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định độ ẩm, tỉ lệ trọng lƣợng của quả mồng tơi chín. 2
  15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Khảo sát hàm lƣợng anthocyanin từ quả mồng tơi chín ở các nồng độ dung môi khác nhau. - Xác định hàm lƣợng polyphenol trong cao chiết quả mồng tơi chín. - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và khả năng kháng khuẩn của cao chiết quả mồng tơi chín làm tiền đề cho việc nghiên cứu ứng dụng tạo màu trong thực phẩm. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Nhiệm vụ 1: Nghiên cứu về cơ sở khoa học, tổng quan tài liệu vấn đề nghiên cứu, làm cơ sở cho các nhiệm vụ tiếp theo. - Nhiệm vụ 2: Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm, thông qua các phƣơng pháp xác định, khảo sát, phân tích. - Nhiệm vụ 3: Xác định độ ẩm, tỉ lệ trọng lƣợng của quả mồng tơi chín. - Nhiệm vụ 4: Thu nhận dịch chiết quả mồng tơi chín bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm trong etanol 30%, 50%, 70% và trong nƣớc cất, đánh giá hàm lƣợng anthocyanin từ cao chiết. - Nhiệm vụ 5: Xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số từ cao chiết quả mồng tơi chín. - Nhiệm vụ 6: Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH. - Nhiệm vụ 7: Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết quả mồng tơi chín. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phƣơng pháp nghiên cứu thu thập tài liệu: Các tài liệu về cây mồng tơi, thành phần hóa học của lá và quả mồng tơi chín, các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các hợp chất thứ cấp, mô hình đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa, phƣơng pháp đục lỗ thạch, sinh vật thí nghiệm. - Phƣơng pháp làm thí nghiệm: Tiến hành làm các thí nghiệm nhằm giải quyết các nhiệm vụ nghiên cứu. 3
  16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Phƣơng pháp xử lý số liệu bằng Excel và SAS. Các số liệu thu đƣợc sẽ đƣợc xử lý nhằm đƣa ra kết luận cho đề tài. 6. Kết quả đạt đƣợc của đề tài - Xác định đƣợc độ ẩm, tỉ lệ trọng lƣợng của quả mồng tơi chín. - Thu nhận đƣợc các loại dịch chiết quả mồng tơi chín bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm trong etanol 30%, 50%, 70% và trong nƣớc cất. - Đánh giá đƣợc hàm lƣợng anthocyanin từ cao chiết cao chiết. - Định lƣợng đƣợc polyphenol tổng của các loại cao chiết. - Tìm ra giá trị IC50, so sánh khả năng kháng oxy hóa và khả năng kháng khuẩn một số loài vi sinh vật của các loại cao chiết. 7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp - Mở đầu - Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu, cơ sở khoa học của đề tài - Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu - Chƣơng 3: Kết quả và thảo luận - Chƣơng 4: Kết luận và kiến nghị - Tài liệu tham khảo 4
  17. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây mồng tơi 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại Cây mồng tơi hay mùng tơi, tầm tơi, tên tiếng anh: Red vine spinach, Creeping spinach, Climbing spinach, Indian spinach, Asian Spinach, có tên khoa học: Basella alba L. là một cây dây leo, thuộc họ Mồng tơi (Basellaceae).[41] Loài này đƣợc tìm thấy [31] ở Châu Á nhiệt đới và Châu Phi, và đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ một loại rau ăn lá. Chi Mồng tơi (Basella) có nguồn gốc ở các nƣớc Nam Á, lan tỏa và mọc hoang ở nhiều nƣớc Châu Á nhiệt đới và đƣợc trồng ở Châu Á, Châu Phi, Nam Mỹ và còn phát triển đến vùng ôn đới thuộc Châu Á và Châu Âu. Phân bố phổ biến ở Châu Phi, quần đảo Ăngti, Brazil và Châu Á (Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam). Ở Việt Nam, cây mọc hoang và đƣợc trồng khắp nơi. Thƣờng gặp ở ven rừng, trên đất ẩm, trong các đất trồng trọt từ vùng thấp tới vùng cao. Tại Châu Phi nhiệt đới, nó phổ biến nhất trong khu vực ấm áp, ẩm ƣớt và hiếm thấy ở các khu vực khô hoặc lạnh lẽo của châu lục này.[41] Bảng 1.1. Phân loại khoa học cây mồng tơi Phân loại khoa học Giới (regnum) Plantae (không phân hạng) Angiospermae (không phân hạng) Eudicots Bộ (ordo) Caryophyllales Họ (familia) Basellaceae Chi (genus) Basella Loài (species) Basella alba Danh pháp Basella alba L. 5
  18. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hình 1.1. Cây mồng tơi Hình 1.2. Quả mồng tơi 1.1.2. Đặc điểm và sinh thái Cây mồng tơi là cây thuộc loại dây leo quấn, có lá và đọt non ăn đƣợc, sống 1 năm hay 2 năm, thân dạng dây leo mập và nhớt, nhẳn bóng có màu xanh hay tím. Cây mồng tơi mọc nhanh, dây có thể dài đến 10 m. Rễ chùm mọc sâu trong đất, thích hợp trồng trên đất tơi xốp. Lá dày hình tim hoặc hình trứng, mọc xen, đơn, nguyên, có cuống, màu xanh, mọng nƣớc. Cụm hoa hình bông mọc ở kẽ lá, màu trắng hay tím đỏ 6
  19. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU nhạt. Quả mọng, nhỏ, hình cầu hoặc trứng, dài khoảng 5 – 6 mm, màu xanh, khi chín chuyển màu tím đen. Cây đƣợc trồng ở phần lớn các vùng nhiệt đới để lấy lá và ngọn làm rau ăn và quả mọng có khi đƣợc dùng để nhuộm màu thực phẩm.[41] Theo Read (1936), trong rau mồng tơi có vitamin A3, vitamin B3, vitamin C, chất saponin, chất nhầy, chất sắt và canxi. Cây mồng tơi có chứa một số phenolic phytochemicals và có tính chất chống oxy hóa. Giống nhƣ hầu hết các loại rau khác, cây mồng tơi có nhiều vitamin A , vitamin C , sắt , và canxi, có lƣợng calo thấp nhƣng có hàm lƣợng protein khá cao. Chất nhầy mọng nƣớc là một nguồn cung cấp giàu chất [31], [45] xơ hòa tan. Mồng tơi phát triển tốt dƣới ánh mặt trời đầy đủ trong điều kiện khí hậu nóng ẩm và ở các khu vực có độ cao thấp hơn 500 mét so với mực nƣớc biển. Cây có nguồn gốc ở các nƣớc châu Á nhiệt đới.[40] Cây phát triển tốt nhất ở đất cát chứa nhiều chất hữu cơ có độ pH dao động từ 5,5 đến 8,0.[31] Ở Việt Nam, mồng tơi đƣợc gieo trồng chủ yếu trong vụ xuân và thu hoạch suốt vụ hè thu. Gieo trồng từ đầu tháng 3 đến tháng 5, thu hoạch từ tháng 5 đến tháng 9, nhiệt độ thích hợp 25 30°C. Tuy nhiên ở các tỉnh phía Nam có thể trồng quanh năm.[32] Có 3 loại giống mồng tơi phổ biến trong sản xuất nhƣ mồng tơi trắng có phiến lá nhỏ, thân mảnh, thân và lá có màu xanh nhạt; mồng tơi tía có phiến lá nhỏ, thân và gân lá có màu tím đỏ và mồng tơi lá to nhập từ Trung Quốc, lá dày, màu xanh đậm, phiến lá to, thân mập, thƣờng đƣợc trồng dày để dễ cắt tỉa cành non, ít nhớt và cho năng suất cao.[33] 1.1.3. Tình hình trồng trọt, tiêu thụ, kỹ thuật canh tác cây mồng tơi ở Việt Nam 1.1.3.1. Tình hình trồng trọt và tiêu thụ Ở Việt Nam, cây mồng tơi chủ yếu mọc hoang và đƣơc trồng khá phổ biến. Trong chƣơng trình phát triển sản xuất rau an toàn trên địa bàn tỉnh Bà Rịa- Vũng Tàu, giúp ngƣời dân nâng cao hiệu quả sản xuất, đảm bảo sản phẩm an toàn phục 7
  20. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU vụ nhu cầu xã hội, rau mồng tơi đƣợc trồng phổ biến ở các vùng chuyên canh rau trên địa bàn tỉnh, đây là loại rau dễ trồng, thời gian sinh trƣởng ngắn có thể trồng nhiều lứa trong năm, nhu cầu tiêu dùng cao, do vậy tiêu thụ dễ dàng. Để so sánh rau mồng tơi sản xuất theo tập quán của nông dân với sản xuất theo chuẩn VietGAP, Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật triển khai mô hình tại vùng chuyên canh rau ở khu phố Kim Sơn, phƣờng Kim Dinh, thành phố Bà Rịa. Mô hình sản xuất theo VietGAP bón phân theo quy trình: Phân hữu cơ hoai mục 20 tấn/ha kết hợp 30 kg chế phẩm Trichoderma, phân vô cơ bón theo công thức: 55N-85P-60K/ha; Ruộng đối chứng: Phân hữu cơ hoai mục 9 tấn/ha, phân vô cơ bón theo công thức: 82N-9P-6K/ha. Theo dõi tình hình sâu, bệnh hại ở ruộng mô hình và đối chứng đều rất thấp, sự khác biệt thể hiện rõ nhất đó là tuyến trùng (gây bƣớu rễ) gây hại ở ruộng đối chứng cao hơn ở giai đoạn 25 ngày sau gieo. Mặt khác, ruộng đối chứng sản xuất theo tập quán nông dân phun 2 lần thuốc BVTV; lần 1 phun thuốc trừ sâu “Tập kỳ” giai đoạn 18 ngày sau gieo, lần 2 phun thuốc trừ bệnh “Carbenda super” giai đoạn 20 ngày sau gieo; ngƣợc lại, ruộng mô hình không sử dụng thuốc BVTV. Kết quả kiểm tra chất lƣợng rau (phân tích định lƣợng) ghi nhận, sản phẩm từ mô hình và đối chứng đều đạt tiêu chuẩn VietGAP, ngoại trừ chỉ tiêu hàm lƣợng Nitrate ở ruộng đối chứng “349 mg/kg”cao hơn so với ruộng mô hình “267 mg/kg”. Về năng suất, mô hình đạt 23,67 tấn/ha/lứa, đối chứng đạt 22,42 tấn/ha/lứa. So sánh về chi phí sản xuất ở mô hình thấp hơn so với đối chứng ở một số công đoạn nhƣ: công lao động, chi phí mua thuốc BVTV do vậy, hiệu quả sản xuất ở mô hình đạt cao hơn so đối chứng 25% (hiệu quả sản xuất mô hình đạt 21,7 triệu đồng/ha/lứa).[44] 1.1.3.2. Kỹ thuật canh tác Giống: Trồng mồng tơi chủ yếu bằng hạt. Hạt mồng tơi dễ mọc nên gieo thẳng trực tiếp trên luống. Lƣợng hạt giống gieo cho 1,000 m2 là từ 2,5 3 kg. Hạt mồng tơi trồng bằng cách rạch hàng. Dùng cây que nhỏ chọc lỗ để bỏ hạt. 8
  21. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Gieo xong rải thuốc chống kiến, dế, mối trong đất (sử dụng Vibasu 10 H) và phủ lên trên một lớp rơm mỏng để giúp tạo ẩm độ cho hạt nhanh nẩy mầm và không bị mất trôi hạt. Tƣới nƣớc để giữ ẩm độ, một tuần sau là hạt nẩy mầm. Thời vụ: Trồng quanh năm, tốt nhất là đầu mùa mƣa. Đất trồng: Mồng tơi là một loại cây tƣơng đối dễ trồng, thích hợp trên nhiều chân đất khác nhau nhƣng tốt nhất vẫn là đất, nhiều mùn, giàu dinh dƣỡng, thoát nƣớc tốt. Trƣớc khi gieo hạt nên cày bừa làm đất thật nhỏ. Lên luống: Lên luống nổi, chiều dài luống tuỳ theo kích thƣớc vƣờn. Chiều rộng: 1 – 1,2 m. Chiều cao mặt luống: 15 – 20 cm. Các luống cách nhau 0,3 – 0,4m. Có hệ thống thoát nƣớc để có thể thoát nƣớc mỗi khi có mƣa to và kéo dài. 2 Bón phân (lƣợng phân tính cho 1,000 m ): - Bón lót: Phân chuồng hoai 1,5 – 2 tấn. Phân super lân 50 kg. - Bón thúc: Sau khi gieo hạt khoảng 2 tuần, nên bón bổ sung khoảng 2 kg Urê và 25 kg bánh dầu kết hợp với việc tỉa cây. Bón phân bằng cách trộn phân vào trong nƣớc rồi tƣới bằng bình hoa sen trên mặt luống rau, sau khi tƣới phân phải tƣới lại một lần bằng nƣớc lã để rửa sạch phân bám dính trên lá rau. Chăm sóc và tƣới nƣớc: Mồng tơi dễ sống, ít sâu bệnh hại nên việc chăm sóc chủ yếu là tƣới nƣớc và bón phân. Các loại bệnh hại trên mồng tơi chủ yếu là sâu hại, bệnh phổ biến là đốm lá. Áp dụng biện pháp phòng trừ tổng hợp nhƣ luân canh với cây trồng khác, làm giàn che 9
  22. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU mƣa, trồng cây trong nhà lƣới, bón phân cân đối nhƣng phải đảm bảo cách ly 10 ngày. Đối với bệnh đốm lá có thể sử dụng Daconil 500 SC phun trừ. Thu hoạch: Khi cây đạt 40 ngày sau khi gieo là có thể sử dụng đƣợc. Sau khi thu hoạch bón thúc bằng phân đạm. Cần nhặt sạch cỏ. Giữ giống: Khi thấy cây già thì thôi thu hái, để cho cành nhánh ra quả, tháng [37] 10 11 hái quả phơi khô cất để giống. 1.1.4. Thành phần hóa học Bảng 1.2. Thành phần hóa học của cây mồng tơi Giá trị dinh dƣỡng trong 100g rau mồng tơi ( theo tài liệu của Bộ Nông Nghiệp Hoa Kỳ, USDA, 2002) Năng lƣợng 79 kJ (19 kcal) Carbohydrate 3,4 % Chất béo 0,3 % Protein 1,8 % Vitamin A 400 g Thiamine (B1) 0,05 mg Riboflavin (B2) 0,155 mg Niacin (B3) 0,5 mg Vitamin B6 0,24 mg Acid ascorbic 102 mg Folate (B9) 140 g Canxi 109 mg Photpho 52 mg Sắt 1,2 mg So sánh với các loại rau ăn lá khác thì rau mồng tơi có độ ẩm cao hơn. 10
  23. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Ngoài ra trong lá rau mồng tơi còn có chứa các chất oligoglycosides, một số triterpene loại oleanane, bao gồm basellasaponins, betavulgaroside I, spinacoside C và momordins. Trong quả mồng tơi có chứa 2 peptide kháng nấm và ribosome khử hoạt tính các protein, có hoạt tính kháng virus đã đƣợc phân lập.[42] Một số hợp chất thứ cấp có mặt trong cây mồng tơi nhƣ: flavonoid (anthocyanins và betalains) chịu trách nhiệm cho màu của lá và quả (Khan et al., 2011 ). Hàm lƣợng chất màu của quả thay đổi trong quá trình phát triển của cây để thích ứng với điều kiện môi trƣờng (Biswall 1995 , Lichtenthaler 1996 ).[40] Hình 1.3. Anthocyanin 1.1.5. Tính vị và công dụng Theo đông y, rau mồng tơi có tính hàn, vị chua, tán nhiệt, mất máu, lợi tiểu, giải độc, đẹp da, trị rôm sảy mụn nhọt hiệu quả rất thích hợp trong mùa nóng. Những tác dụng chữa bệnh của rau mồng tơi: giảm cholesterol, làm lành vết thƣơng, tốt cho xƣơng khớp, chữa yếu sinh lý, trị mụn nhọt, say nắng, đẹp da, trị tiểu khó, chữa bỏng, lợi sữa, trĩ, thanh nhiệt, giải độc, chữa táo bón Trong mồng tơi chứa chất nhầy pectin rất quý để phòng chữa nhiều bệnh, làm cho rau mồng tơi có tác dụng nhuận tràng, thải chất béo chống béo phì, thích hợp cho 11
  24. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ngƣời có mỡ và đƣờng cao trong máu. Tác dụng trừ thấp nhiệt, làm cho ngƣời lao động ngoài trời nắng nóng duy trì đƣợc sức khỏe, phòng chống bệnh tật nhƣ mỏi mệt háo khát, bứt rứt (Theo BS. Phó Thuần Hƣơng sức khỏe và đời sống).[43] Rau mồng tơi chứa nhiều chất dinh dƣỡng, 1/2 chén rau mồng tơi nấu chín cung cấp 90% lƣợng vitamin A và 20% chất sắt khuyến cáo cho chế độ ăn hằng ngày. Tuy nhiên, rau mồng tơi có thể gây ra một số tác dụng phụ, gây khó chịu nếu ăn nhiều nhƣ: gây hấp thu kém, sỏi thận, tạo mảng bám rang, khó chịu trong dạ dày.[46] Ở một số nƣớc Châu Phi và Nam Á quả chín của cây mồng tơi đã đƣợc sử dụng để nhuộm, nƣớc ép quả màu tím đỏ có thể đƣợc sử dụng nhƣ mực in, mỹ phẩm và chất [42] màu thực phẩm. 1.2. Hợp chất Phenol, Flavonoid, Anthocyanin 1.2.1. Phenol 1.2.1.1. Đại cương về hợp chất phenol Các hợp chất phenol là các hợp chất mà trong cấu trúc có một hoặc nhiều vòng thơm (vòng benzen) mang một hoặc nhiều nhóm chức hydroxyl –OH. Trong thiên nhiên các hợp chất phenol là flavonoid, xanthan, coumarin, quinon, các phenol đơn vòng, các polyphenol (lignin, tannin ). Các hợp chất phenol là một nhóm chính trong số các hợp chất có nguồn gốc thứ cấp, chiếm một vị trí quan trọng trong đời sống thực vật với số lƣợng lớn và rất phong phú về cấu tạo. Chúng tham gia vào nhiều quá trình sinh lý và sinh hoá quan trọng, vào các quá trình trao đổi chất dƣới nhiều hình thức khác nhau nhƣ quá trình hô hấp tế bào (vận chuyển H+ trong quá trình photphoryl hoá, oxy hoá ), quá trình quang hợp, điều hòa sinh trƣởng phát triển của thực vật [4], [10] Thực vật có khả năng tổng hợp hàng ngàn hợp chất monophenol, diphenol và polyphenol, tùy theo có một, hai hay nhiều nhóm hydroxyl đính trực tiếp vào nhân benzen (Ngô Xuân Mạnh, 2006). [10] 12
  25. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.2.1.2. Phân loại Dựa vào số lƣợng nhóm hydroxyl mà ngƣời ta chia thành 2 nhóm: phenol đơn giản và phenol phức tạp (polyphenol). Nhóm phenol đơn giản: gồm các chất đƣợc cấu tạo từ 1 vòng benzen và 1 hay nhiều nhóm OH, đƣợc phân thành các: monophenol; diphenol (pyrocatechin, rezoxyn ); triphenol (pyrogalon, oxy hydroquinon ). Nhóm hợp chất phenol phức tạp (polyphenol): trong thành phần cấu tạo, ngoài vòng benzen còn có dị vòng mạch nhánh, đƣợc phân thành các nhóm: monomer và polymer. - Monome hay polyphenol đơn giản • Nhóm C6 – C1 (acid phenol cacbonic, acid gallic, protocachein, ): trong cấu trúc phân tử có thêm nhóm cacbonyl, thƣờng gặp ở hạt nảy mầm. • Nhóm C6 – C3 (acid cumaric, acid cafeic, ): có gốc cacbonyl đƣợc nối với nhân benzen qua hai nguyên tử cacbon, thƣờng gặp ở thực vật bậc cao. • Nhóm C6 – C3 – C6: gọi là các flavonoid và đƣợc chia thành các nhóm phụ nhƣ flavon (quecetin, kampherol, ), flavonol (sắc tố vàng) (epicatechin, epigallocatechin, ), anthocyanidin (sắc tố xanh, đỏ và tím) (anthocyanin), catechin (không màu) • Nhóm hợp chất polyphenol polymer: đƣợc chia thành các nhóm phụ nhƣ Tanin, Lignin, Acid Humic [4] Hình 1.4. Một số hợp chất phenol 13
  26. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.2.1.3. Tính chất và chức năng Các polyphenol có chứa gốc pyrocatechic hoặc pyrogalic nên chúng có thể tham gia phản ứng oxy hóa – khử, phản ứng cộng và ngƣng tụ: - Phản ứng oxy hóa – khử: dƣới tác dụng của enzym polyphenol oxydase, các polyphenol bị oxy hóa tạo thành quinon. - Phản ứng cộng: khi có mặt các acid amin thì các quinon này sẽ tiến hành phản ứng cộng với acid amin để tạo thành các octoquinon tƣơng ứng. - Phản ứng ngƣng tụ: các octoquinon này dễ dàng ngƣng tụ với nhau để tạo thành các sản phẩm có màu gọi chung là flobafen.[9] Đối với thực vật, các hợp chất polyphenol đảm nhận các chức năng sau (Ngô Xuân Mạnh, 2006): - Polyphenol tạo màu sắc (màu đỏ dâu tây, táo, màu tím của sim, khoai tây ) - Tham gia vào các phản ứng oxi hóa khử. - Điều hòa sinh trƣởng thực vật: + Kìm hãm sự nảy mầm của hạt. + p-cumaric acid kích thích sự sinh trƣởng của cây. - Quyến rũ côn trùng, chim trong việc thụ phấn và phát tán hạt. - Chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật, nấm bệnh phá hoại cây. Ví dụ salisilic acid do cây sồi tiết ra có tác dụng diệt khuẩn. Đối với cơ thể con ngƣời (Massimo D’Archivio, 2007): Polyphenol đƣợc chú ý đến bởi khả năng chống oxy hóa của chúng. Chúng có khả năng chuyển electeron trong chuỗi hô hấp bình thƣờng định cƣ trong cơ thể. Chúng có đƣợc khả năng đó là do chúng có khả năng tạo phức bền với các kim loại nặng, do đó làm mất hoạt tính xúc tác của chúng, đồng thời chúng có khả năng dập tắt các quá trình tạo ra các gốc tự do. - Ngoài ra, polyphenol còn có khả năng ức chế sự phát triển của vi nấm. 14
  27. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU - Hiện nay nhiều tài liệu nghiên cứu polyphenol có khả năng chống và ức chế các tế bào ung thƣ và sự hấp thụ tia tử ngoại.[9] 1.2.2. Flavonoid 1.2.2.1. Đại cương về flavonoid Flavonoid là những hợp chất thứ cấp thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa Phần lớn các flavonoid có màu vàng (do từ flavus là màu vàng); tuy vậy, một số các sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng đƣợc xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học, chúng có cùng khung sƣờn căn bản. Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 – diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen A và B nối nhau qua một dây có 3 carbon, nên thƣờng đƣợc gọi là C6 – C3 – C6. Thƣờng các flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B. Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hoặc dạng glycoside. Các đƣờng thƣờng gặp nhất là đƣờng D glucose, kế đó là D galactose, L rhamnose, L arabinose, D xylose, D apiose và acid uronic. [4] 1.2.2.2. Phân loại Flavonoid có cấu trúc mạch C6 C3 C6, đều có 2 vòng thơm. Tùy thuộc vào cấu tạo phần mạch C3 trong bộ khung C6 C3 C6, flavonoid đƣợc phân thành các nhóm sau [27]: flavon, flavonol, flavanol, flavanon, chalcon, anthocyanin, anthocyanidin. Hình 1.5. Một số Eucoflavonoid 15
  28. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Flavon rất phổ biến trong thực vật: Thông, Hoàng cầm (rễ), Mè (lá), Anh thảo, cây la apirenin và luteolin. Chalcon có chủ yếu ở trong một số cây họ Cúc Asteraceae tập trung nhiều nhất ở vỏ cây, gỗ lõi (Keo, Bạch đàn, Dẻ, Đậu tƣơng, Trinh nữ hoàng cung, Dƣơng xỉ ). Không tìm thấy ở động vật. Isoflavonoid: Isoflavon, isoflavanon, rotenoid. Neoflavonoid: neoflavon và calophylloid 1.2.2.3. Lý tính Trong tự nhiên các hợp chất này thƣờng tồn tại dƣới dạng glycoside, dễ tan trong nƣớc và dung môi phân cực, dễ bị thủy phân trong môi trƣờng axit, kiềm nhẹ hoặc bởi enzyme β – glucosidase, emulsin. Có mùi thơm và vị đắng chát đặc trƣng. Do các nối đôi liên hợp mà các flavonoid thƣờng có màu, đặc biệt là màu vàng. Nếu các nối đôi bị phá vỡ thì hợp chất sẽ mất màu. 16
  29. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Có khả năng hấp thụ tia tử ngoại do có hệ thống nối đôi liên hợp. Thƣờng thu đƣợc 2 dải hấp thụ cực đại, dải 1 có λ max = 240 – 280 nm, dải hấp thụ 2 thƣờng cố định dài hơn dải 1 và giữ 2 dải thƣờng có 1 vai phụ, đặc biệt là đối với flavon và flavonol. Tùy theo pH của môi trƣờng và điều kiện tạo muối và phức với các kim loại (K, Na, Fe hoặc Al) mà các bƣớc sóng hấp thụ có thể chuyển dịch.[33] 1.2.2.4. Hóa tính Flavonoid đa dạng về cấu trúc hóa học vì vậy khả năng phản ứng hóa học của chúng rất lớn. - Phản ứng oxy hóa: các flavonoid rất dễ bị oxy hóa. Quá trình này có kèm theo sự mở vòng pyron và đó cũng là nguyên nhân gây ra tác dụng của flavonoid đối với các enzyme oxy hóa khử (oxydoreductase). Nhiều phản ứng oxy hóa khác nhƣ với AgNO3, KMnO4 vẫn đƣợc dùng để định tính và định lƣợng flavonoid. - Phản ứng với kiềm: do các nhóm OH có nhóm axit nên dễ phản ứng với các hydroxit kiềm tạo muối tạo muối tan trong nƣớc, khi có nhóm C=O (cacbonyl) trong phân tử thì tính axit lại càng tăng thêm và flavonoid có thể tan trong dung dịch NaHCO3. - Phản ứng este hóa: trong thiên nhiên ít gặp các este của phenol, nhƣng trong thí nghiệm in vitro, các nhóm OH của phenol thƣờng dễ cho este, thƣờng gặp là este metylic. - Phản ứng tạo phức với kim loại: Nhóm OH thƣờng tạo phức với AlCl3, NaOH, KOH, cho màu vàng đặc trƣng và nhóm chức này cũng là nguyên nhân làm cho các flavonoid tự nhiên có ái lực mạnh với các ion kim loại nặng có hóa trị 2 nhƣ Fe, Cu, Zn, và có thể tạo phức chất bền vững với các nguyên tố thuộc chu kỳ 4. Những kim loại này thƣờng có trong các tế bào sinh vật dƣới dạng các nguyên tố vi lƣợng cần thiết cho sự sinh tồn của tế bào. Mặt khác, các flavonoid có thể ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do có 17
  30. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU hại bằng cách kết hợp với những ion kim loại nặng (Fe, Mn) vốn là những tác nhân xúc tác nhiều quá trình sinh hóa làm xuất hiện các gốc tự do. - Tạo liên kết hydro: các nhóm OH tự do rất dễ nối với nhau bởi các liên kết hydro nội phân tử hoặc giữa các phân tử. Hiện tƣợng này ảnh hƣởng nhiều đến những tính chất hóa lý học nhƣ độ sôi, độ nóng chảy, tính hòa tan, Khả [31] năng phản ứng cũng có thể giảm đi đáng kể. 1.2.2.5. Hoạt tính sinh học Flavonoid là một nhóm các hợp chất đƣợc gọi là "những ngƣời thợ sửa chữa sinh hóa của thiên nhiên" nhờ vào khả năng sửa chữa các phản ứng cơ thể chống lại các hợp chất khác trong các dị ứng nguyên, virus và các chất sinh ung thƣ. Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động khác thƣờng. Các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất thƣờng là các gốc tự do nhƣ OH, ROO (là các yếu tố gây biến dị, huỷ hoại tế bào, ung thƣ, tăng nhanh sự lão hoá ). Một trong những nhóm flavonoids thực vật hữu ích nhất là proanthocyanidins (còn đƣợc gọi là procyanidins). Nhóm này mang lại rất nhiều ích lợi cho sức khỏe. Mỗi proanthocyanidins liên kết với các loại proanthocyanidins khác. Một hỗn hợp gồm các proanthocyanidins liên kết với nhau dạng dime, trime polime đƣợc gọi chung là procyanidolic oligomer, gọi tắt là PCO. Năm 1986, Jacques Masquelier là ngƣời khám phá ra các đặc tính chống oxy hóa và thu dọn gốc tự do của PCO. Nhiều phƣơng pháp hiện đại và phức tạp đã chứng minh hoạt động bảo vệ mạch máu của PCO và tạo cơ sở vững chắc cho việc sử dụng PCO trong điều trị các bệnh lý mạch máu. Các phƣơng pháp này cho thấy PCO có khả năng: - Bắt giữ gốc tự do hydroxyl. - Bắt giữ lipide peroxide. - Làm chậm trễ đáng kể sự khởi đầu của quá trình peroxide hóa lipide. 18
  31. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU - Kìm giữ các phân tử sắt tự do, giúp ngăn chặn sự peroxide hóa lipide do sắt. - Ức chế sự sản sinh ra gốc tự do bằng cách ức chế không cạnh tranh men xanthin oxidase. - Ức chế sự tổn thƣơng do các enzyme (hyaluronidase, elastase, collagenase ) có thể làm thoái hóa cấu trúc mô liên kết. Các flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng nhƣ những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hoá. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu não, lão hoá, thoái hoá gan, tổn thƣơng do bức xạ. Năm 1936, Szent Gyorgy, dƣợc sĩ ngƣời Hungari tách từ ớt và quả chanh một chất cùng với vitamin C có tác dụng chữa đƣợc chứng chảy máu mao mạch, củng cố thành mạch, ông gọi là vitamin C2 hoặc vitamin P (P là chữ đầu của từ tiếng Pháp perméabilité có nghĩa là tính thấm). Về sau ngƣời ta thấy trong giới thực vật có nhiều hợp chất thứ cấp có đặc tính tƣơng tự vitamin P và đặt cho chúng một tên chung là Flavonoid. Lavollay, Neumann Porrot (1941, 1942) đã chứng minh catechin có tác dụng mạnh hơn vitamin C trong việc giữ bền thành mạch. Thực nghiệm cho thấy các Flavonoid có các nhóm OH ở vị trí 3,4 có tác dụng tốt đối với sự nâng cao tính bền vững của thành mạch. Rutin là chất tiêu biểu về tác dụng này. Hyaluronidase là enzym làm tăng tính thấm của mao mạch, khi thừa enzyme này sẽ xảy ra hiện tƣợng xuất huyết dƣới da. Flavonoid ức chế sự hoạt động của hyaluronidase. Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid nhƣ quercetin, rutin, myciretin, hỗn hợp các catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim, tăng thể tích phút của tim Các flavonoid có tác dụng củng cố, nâng cao sức chống đỡ và hạ thấp tính thẩm thấu các hồng huyết cầu qua thành mạch thông qua tác dụng lên các cấu trúc màng tế bào 19
  32. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU của nó. Hay nói cách khác, vitamin P và flavonoid nói chung duy trì độ mềm dẻo của thành mạch, ứng dụng vào điều trị các rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch. Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thƣơng tổn gan, bảo vệ chức năng gan. Nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, favanon, flavanol có tác dụng lợi tiểu rõ rệt, nhƣ là các flavonoid có trong lá Diếp cá, trong cây Râu mèo Các dẫn xuất của kaempferol, quercetin, isorhammetin có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch, dùng cho những ngƣời có biểu hiện lão suy, rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc đầu óc sút kém, mất tập trung, hay cáu gắt Quercetin là một flavonoid làm xƣơng sống cho nhiều loại flavonoid khác, gồm rutin, quercitrin, hesperidin – các flavonoid của cam quít. Những dẫn xuất này khác với quercetin ở chỗ chúng có các phân tử đƣờng gắn chặt vào bộ khung quercetin. Quercetin là một flavonoid bền vững và hoạt động nhất trong các nghiên cứu, và nhiều chế phẩm từ thảo dƣợc có tác dụng tốt là nhờ vào thành phần quercetin với hàm lƣợng cao. - Quercetin có khả năng chống oxy hóa và tiết kiệm lƣợng vitamin C sử dụng, giúp tích lũy vitamin C trong các mô tổ chức. - Quercetin có khả năng chống viêm do ức chế trực tiếp hàng loạt phản ứng khởi phát hiện tƣợng này: ức chế sự sản xuất và phóng thích histamin và các chất trung gian khác trong quá trình viêm và dị ứng. - Quercetin ức chế men aldose reductase rất mạnh, men này có nhiệm vụ chuyển glucose máu thành sorbitol một hợp chất liên quan chặt chẽ với sự tiến triển các biến chứng của đái tháo đƣờng (đục thủy tinh thể do đái tháo đƣờng, thƣơng tổn thần kinh, bệnh võng mạc, ).[34] 20
  33. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.2.3. Anthocyanin 1.2.3.1. Đại cương về anthocyanin Các anthocyanin hiện thuộc nhóm các chất màu tự nhiên tan trong nƣớc lớn nhất trong thế giới thực vật. Thuật ngữ anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó anthocyanin là sự kết hợp giữa Anthos – nghĩa là hoa và Kysanesos – nghĩa là màu xanh.[15] Tuy nhiên, không chỉ có màu xanh, anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rƣc rỡ khác nhƣ hồng, đỏ, cam và các gam màu trung gian.[6] Anthocyanin thuộc nhóm các hợp chất flavonoid, có khả năng hòa tan trong nƣớc và chứa trong các không bào. Về bản chất, các Anthocyanin là những hợp chất glycoside của các dẫn xuất polyhydroxy và polymethoxy của 2 phenylbenzopyrylium hoặc muối flavylium. Anthocyanin là những glycosid do gốc đƣờng glucose, galactose kết hợp với gốc aglucon có màu (anthocyanidin). Aglucon của chúng có cấu trúc cơ bản. Các gốc đƣờng có thể đƣợc gắn vào vị trí 3,5,7; thƣờng đƣợc gắn vào vị trí 3 và 5 còn vị trí 7 rất ít. Phân tử anthocyanin gắn đƣờng vào vị trí 3 gọi là monoglycozit, ở vị trí 3 và 5 gọi là diglycozit. Các anthocyanin khi mấ t hết nhóm đƣờng đƣ ợc gọi là anthocyanidin hay aglu con. R1 OH B OH O+ 3 3 R2 7 A 5 OH OH Hình 1.6. Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin Cho đến nay, ngƣời ta đã xác định đƣợc hơn 500 anthocyanin, 30 anthocyanidin, 18 loại aglucon khác nhau, trong đó 6 loại phổ biến nhất là 21
  34. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU pelargonidin, cyanidin, delphinidin, peonidin, petunidin và maldivin.[9] Mỗi anthocyanidin có thể bị glycosyl hóa acylate bởi các loại đƣờng và các acid khác tại các vị trí khác nhau. Vì thế lƣợng anthocyanin lớn hơn anthocyanidin từ 15 20 lần. Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những loài ra hoa, phần lớn nằm ở hoa và quả, ngoài ra cũng có ở lá và rễ. Trong những loại thƣc vật này, anthocyanin đƣợc tìm thấy chủ yếu ở các lớp tế bào nằm bên ngoài nhƣ biểu bì. Các hợp chất anthocyanin xuất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73 loài và trong vô số giống thực vật sử dụng làm thực phẩm (Bridle và Timberlake, 1996).[19] Các họ thực vật nhƣ vitaceae (nho) và rosaceae (cherry, dâu tây, mâm xôi, táo, ) là các nguồn anthocyanin chủ yếu. Bên cạnh đó còn có các họ thực vật khác nhƣ solanceae ( cà tím), saxifragaceae (quả lý đỏ và đen), ericaceae (quả việt quốc) và brassicaceae (bắp cải tím). Các loại anthocyanin phổ biến nhất là các glucoside của cyanidin, kế đến là pelargonidin, peonidin và delphinidin, sau đó petuidin và maldivin. Số lƣợng các 3–glucoside nhiều gấp 2,5 lần các 3,5–glucoside. Loại anthocyanin hay [12] gặp nhất chính là Cyaidin 3 glucoside. Hình 1.7. Cấu trúc của 6 loại phổ biến trong nhóm anthocyanin 22
  35. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.2.3.2. Phân loại Trong tự nhiên, Anthocyanin rất hiếm khi ở trạng thái tự do (không bị glycosyl hóa). Nhóm hydroxy tự do ở vị trí C 3 làm cho phân tử anthocyanidin trở nên không ổn định và làm giảm khả năng hòa tan của nó so với anthocyanin tƣơng ứng. Vì vậy, sự glycosyl hóa luôn diễn ra, đầu tiên ở vị trí nhóm 3 hydroxy. Nếu có thêm một phân tử đƣờng nữa, vị trí tiếp theo bị glycosyl hóa thƣờng gặp nhất là ở C 5. Ngoài ra, sự glycosyl hóa còn có thể gặp ở các vị trí C 7, C 3’, C 5’. Loại đƣờng phổ biến nhất là glucose, ngoài ra cũng có một vài loại monosaccharide (nhƣ galactose, rammose, arabinose), các loại disaccharide (chủ yếu là rutinose, sambubiose hay sophorose) hoặc trisaccharide tham gia vào quá trình glycosyl hóa. Sự methoxyl hóa các anthocyanin và các glucoside tƣơng ứng diễn ra thông thƣờng nhất là ở vị trí C 3’ và C 5’, cũng có thể gặp ở vị trí C 7 và C 5. Tuy nhiên, cho đến nay, ngƣời ta vẫn chƣa tìm thấy môt hợp chất nào bị glycosyl hóa hay bị methoxyl hóa trên tất cả các vị trí C 3, 5, 7 và 4’ do cần thiết phải còn ít nhất một nhóm hydroxyl tự do ở C 5, 7 hay 4’ để hình thành dạng cấu trúc quinonoidal base (dạng cấu trúc của anthocyanin thƣờng tồn tại trong không bào thực vật có pH từ 2,5 – 7,5). Hình 1.8. Cấu trúc của một số anthocyanin tự nhiên. Các anthocyanin tƣơng ứng luôn đƣợc glycosyl hóa ở nhóm hydroxy C 3 23
  36. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Sự acyl hóa cũng có thể xảy ra ở vị trí C 3 của phân tử đƣờng hay ester hóa ở nhóm hydroxy C 6. Các nhóm acyl hóa chính là các phenolic acid nhƣ ρ coumeric, caffeic, ferulic hay sinapic acid và một loạt các acid nhƣ acetic, malic, malonic, axalic và succinic. 1.2.3.3. Lý tính Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá [2] phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực. Anthocyanin hòa tan tốt trong H2O, C2H5OH, CH3OH, , trong đó khả năng [2] tan trong CH3OH–HCl và C2H5OH–HCl là tƣơng đƣơng nhau và cao nhất. Anthocyanin có bƣớc sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại tại bƣớc sóng 510 ÷ 540nm. Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc của các anthocyanin chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ anthocyanin: thƣờng pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh.[2] 1.2.3.4. Hóa tính Màu sắc anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ, các chất màu và nhiều yếu tố khác, Khi tăng số lƣợng nhóm OH trong vòng benzene thì màu càng xanh đậm.[2] Mức độ methyl hóa các nhóm OH ở vòng benzene càng cao thì màu càng đỏ. Nếu nhóm OH ở vị trí thứ ba kết hợp với các gốc đƣờng thì màu sắc cũng sẽ thay đổi theo số lƣợng các gốc đƣờng đƣợc đính vào nhiều hay ít.[6] Các Anthocyanin cũng phụ thuộc rất mạnh vào pH của môi trƣờng[2]:  Khi pH > 7 các Anthocyanin có màu xanh và khi pH < 7 các Anthocyanin có màu đỏ.  Ở pH = 1 các Anthocyanin thƣờng ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ.  Ở pH = 4~5 chúng có thể chuyển về dạng bazơ Cacbinol hay bazơ Chalcon không màu. 24
  37. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU  Ở pH = 7~8 lại về dạng bazơ Quinoidal Anhydro màu xanh. Hình 1.9. Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH Màu sắc của anthocyanin còn có thể thay đổi do hấp thụ ở trên polysaccharide. Khi đun nóng lâu dài các anthocyanin có thể phá hủy và mất màu.[2] Tóm lại, trong môi trƣờng acid, các anthocyanin là những bazơ mạnh và có thể tạo muối bền vững với acid. Anthocyanin cũng có khả năng cho muối với bazơ. Nhƣ vậy chúng có tính chất amphote. Muối với acid thì có màu đỏ, còn muối với kiềm thì có màu xanh. [2] 1.2.3.5. Hoạt tính sinh học Trong thực vật, anthocyanin có tính kháng khuẩn, kháng nấm, có vai trò tạo điều kiện cho sự thụ phấn, phát tán do hình thành nên màu sắc sặc sỡ trên cành hoa và quả. Mặt khác, anthocyanin là chất có khả năng hấp thụ tia UV cho phép bảo vệ bộ gen của thực vật trƣớc nhóm tác nhân có thể gây đột biến gen này. Sinh tổng hợp anthocyanin ở vỏ đƣợc tăng cƣờng để đáp ứng phù hợp với môi trƣờng: hạn hán, ánh sáng mạnh, nhiệt độ cao, thiếu nitơ và phospho, nhiễm nấm, vi khuẩn, tổn thƣơng, côn trùng, ô nhiễm [9] Đối với sức khỏe của con ngƣời, theo nghiên cứu của David Heber, Đại học Harvard (Mỹ)[17], các anthocyanin có thể cắt đƣợc cơn đau tim, giảm thiểu các tổn 25
  38. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU thƣơng não liên quan đột quỵ và ngăn cản sự tạo thành các cục máu đông trong lòng mạch máu (nguyên nhân dẫn đến tắc mạch, gây tai biến mạch máu não và những cơn nhồi máu cơ tim đột ngột), hạn chế sự suy giảm sức đề kháng. Trong lĩnh vực thực phẩm, với khả năng chống oxy hóa cao, anthocyanin đƣợc sử dụng để bảo quản thực phẩm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa cho thực phẩm.[27] Ngoài các tác dụng chống oxy hóa, anthocyanin còn đƣợc sử dụng nhƣ chất màu tự nhiên tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm và khá an toàn. Ví dụ: Dịch chiết anthocyanin từ các loại rau củ có màu đỏ nhƣ vỏ quả nho, dâu tây, vỏ khoai lang đã đƣợc dùng để làm chất màu thay thế màu tổng hợp trong sản xuất kẹo cứng.[27] Anthocyanin bên cạnh vai trò là màu thiên nhiên đƣợc sử dụng trong thực phẩm, còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quý nhƣ [9], [25]: Khả năng chống oxy hóa cao, chống lão hóa, tăng cƣờng sức đề kháng, điều hòa lƣợng đƣờng huyết của những bệnh nhân đái tháo đƣờng, làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thƣ, tác dụng chống các tia phóng xạ Các ứng dụng trên đã mở ra một triển vọng về việc sản xuất thực phẩm, thực phẩm chức năng chữa bệnh có hiệu quả. [16], [27] 1.3. Các phƣơng pháp tách chiết hợp chất thứ cấp trong thực vật Định nghĩa: Tách chiết là phƣơng pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật. Sản phẩm thu đƣợc của quá trình tách chiết là một dung dịch chứa các chất hòa tan trong dung môi. Dung dịch này đƣợc gọi là dịch chiết.[4] 1.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng Nguyên tắc: Sự chiết lỏng – lỏng là dung môi không phân cực (eter dầu hòa ) sẽ hòa tan tốt các hợp chất không phân cực (các alcol béo, ester béo ), dung môi phân cực trung bình (dietyl eter, chloroform ) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình 26
  39. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU (các hợp chất có chứa nhóm chức eter O , aldehyde CH=O, ceton CO , ester COO ) và dung môi phân cực mạnh (methanol ) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức OH, COOH ).[4] Kỹ thuật này còn đƣợc gọi là sự chiết bằng dung môi (Solvent extraction). Cao alcol ban đầu hoặc dung dịch ban đầu đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập đƣợc riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo. Kỹ thuật chiết lỏng lỏng đƣợc áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau. Việc chiết đƣợc thực hiện lần lƣợt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực ví dụ nhƣ: ete dầu hỏa hoặc hexane, chloroform, ethyl acetate, buthanol Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết đƣợc thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lƣợng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực cao hơn. Dung dịch của các lần chiết đƣợc gom chung lại, làm khan nƣớc với các chất làm khan nhƣ Na2SO4, MgSO4, CaSO4 , đuổi dung môi ta thu đƣợc cao chiết. Hình 1.10. Kỹ thuật chiết lỏng lỏng 27
  40. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.3.2. Kỹ thuật chiết lỏng – rắn 1.3.2.1. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng khá phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp. Nguyên tắc: Dung môi chảy rất chậm qua khối nguyên liệu đựng trong bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dƣới đáy là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt bên dƣới để hứng dung dịch chiết, phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng chứa dung môi tinh khiết.[4] Trong suốt quá trình không khuấy trộn. Nguyên liệu luôn đƣợc tiếp xúc với dung môi, vận tốc dung môi chảy vào bình chứa nguyên liệu bằng vận tốc dung môi chảy ra , tạo ra sự chênh lệch nồng độ hoạt chất cao nên có thể chiết kiệt đƣợc hoạt chất.[36] Ƣu điểm: dịch chiết đƣợc chiết kiệt, dung dịch chiết đậm đặc.[36] Hình 1.11. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt 1.3.2.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm Nguyên tắc: Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp nguyên liệu đã đƣợc cắt nhỏ trong thời gian nhất định để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên, sau đó dung dịch chiết đƣợc lọc ngang qua 28
  41. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ đƣợc cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài). Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một lƣợng ít dung môi. Dung môi sau khi đƣợc thu hồi, đƣợc làm khan nƣớc bằng các chất làm khan và đƣợc tiếp tục sử dụng để chiết lần sau.[4] Hình 1.12. Kỹ thuật chiết ngâm dầm 1.3.2.3. Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhlet Nguyên tắc: Nguyên liệu đƣợc cho vào một túi vải rồi đặt vào ngăn chiết. Dung môi tinh khiết đƣợc cho vào bình cầu và đun hồi lƣu. Dung môi bốc hơi lên đƣợc ngƣng tụ xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi phông xuống bình cầu bên dƣới, mang theo các chất hòa tan từ dƣợc liệu. Ở bình cất, chất tan đƣợc giữ lại, dung môi bốc hơi lên ngƣng tụ xuống bình chiết và đi qua lớp nguyên liệu để hòa tan các chất tan còn lại. Tiếp tục cho đến khi nguyên liệu đƣợc chiết kiệt.[36] Các hợp chất đƣợc hút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môi tinh khiết là đƣợc bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết. Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột cây (dung môi eter dầu hỏa chỉ chiết kiệt những chất kém phân cực nào có thể tan đƣợc trong eter dầu hỏa nóng). 29
  42. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài, rút lấy một giọt dung môi và thử trên mặt kiếng, nếu thấy không còn vết gì trên kiếng là đã chiết kiệt. Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu, đuổi dung môi, thu đƣợc cao chiết.[4] Ƣu điểm: quá trình chiết liên tục, ít tốn dung môi hơn các phƣơng pháp trên, dịch chiết không cần phải lọc. Nhƣợc điểm: các chất không bền với nhiệt độ sôi sẽ bị phá hủy, không thể khuấy trộn. Hình 1.13. Bộ chiết Soxhlet 1.3.2.4. Kỹ thuật chiết bằng máy Kumagawa Sử dụng máy chiết Kumagawa với thiết bị, nguyên tắc giống nhƣ máy chiết Soxhlet, chỉ khác ở túi đựng bột cây đƣợc đặt gần nguồn nhiệt hơn. Có thể cải biến kỹ thuật này với dụng cụ thủy tinh đơn giản có thể dễ dàng tìm thấy trong phòng thí nghiệm: bình cầu (ngâm bột cây trực tiếp trong bình này) và ống ngƣng hơi. Sau một thời gian đun cần thiết, dung dịch chiết đƣợc rót ra và lọc ngang giấy lọc. Dung môi đƣợc cho vào bình cầu và tiếp tục chiết vài lần nhƣ thế đến khi chiết kiệt.[4] 30
  43. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hình 1.14. Máy chiết Kumagawa 1.3.2.5. Phương pháp chưng cất Nguyên tắc: Khi đun sôi một hỗn hợp lỏng, chất nào có nhiệt độ thấp hơn sẽ chuyển thành hơi sớm hơn và nhiều hơn. Khi gặp lạnh, hơi sẽ ngành tụ thành dạng lỏng chứa chủ yếu là chất có nhiệt độ sôi thấp hơn. Quá trình đó gọi là sự chƣng cất. Hình 1.15. Bộ lôi cuốn hơi nƣớc Sự lôi cuốn hơi nƣớc thƣờng đƣợc thực hiện trên cây tƣơi mới thu hái về. Mẫu cây đƣợc cắt nhuyễn, đƣợc đặt vào bình cầu, cho nƣớc cất vào bình sao cho phần thể tích mẫu cây và nƣớc chỉ chiếm tối đa 2/3 thể tích bình cầu. Lấp hệ thống và cắm bếp điện đun nóng. 31
  44. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Nƣớc trong bình cầu khi bị đun nóng sẽ bốc thành hơi bay lên, hơi nƣớc bay lên mang theo tinh dầu, hơi này bị ống ngƣng hơi làm lạnh, ngƣng tụ trở lại thể lỏng, rớt xuống ống gạn. Trong ống gạn, dung dịch tách thành 2 lớp gồm lớp nƣớc và lớp tinh [4] dầu. 1.3.2.6. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn Nguyên tắc: Đối với một chất thông thƣờng, dƣới mỗi điều kiện nhất định chúng sẽ tồn tại ở một trạng thái nào đó trong 3 trạng thái rắn, lỏng hoặc khí. Nếu nén chất khí tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng. Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà ở đó, nếu nâng dần nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không thể trở về trạng thái khí, mà rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn (supercritical). Vật chất ở trạng thái này mang nhiều đặc tính của cả chất khí và chất lỏng, nghĩa là dung môi đó mang tính trung gian giữa khí và lỏng. Hình 1.16. Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn Vì vậy khi CO2 đƣợc đƣa lên nhiệt độ, áp suất cao hơn nhiệt độ tới hạn (31 ), áp suất tới hạn (73,8 bar), CO2 sẽ chuyển sang trạng thái siêu tới hạn. Tại trạng thái này, CO2 có khả năng hòa tan rất tốt các đối tƣợng cần tách ra khỏi mẫu ở cả 3 dạng rắn, lỏng, khí. Sau quá trình chiết, để thu hồi sản phẩm chỉ cần giảm áp suất thấp hơn áp suất tới hạn thì CO2 chuyển sang dạng khí ra ngoài còn sản phẩm đƣợc tháo ra ở bình hứng. 32
  45. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trích ly bằng phƣơng pháp CO2 siêu tới hạn cho các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học cao. Kỹ thuật này sử dụng CO2 ở áp suất cao và nhiệt độ vừa phải để trích ly nên các hợp chất có hoạt tính sinh học cao sẽ không bị phân hủy. Sự thay đổi áp suất và nhiệt độ sẽ làm thay đổi tính chọn lọc các chất hòa tan, nhờ đó có thể phân đoạn sản phẩm ly trích ở các nồng độ cao thấp khác nhau. CO2 sau khi trích sẽ hoàn toàn tách ra ở dạng khí sau khi giảm áp nên sản phẩm có thể đƣợc coi là 100% sạch không dung môi độc hại, đem lại giá trị sử dụng và giá trị thƣơng mại cao cho sản phẩm trích ly.[38] 1.3.2.7. Kỹ thuật chiết pha rắn Nguyên tắc: Chiết pha rắn (hay chiết rắn – lỏng) là quá trình phân bố các chất tan giữa hai pha lỏng và rắn. Trong đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nƣớc hoặc dung môi hữu cơ), chất để hấp thụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và xốp) gọi là pha rắn. Pha rắn (còn đƣợc gọi là pha tĩnh) thƣờng là các hạt silica gel xốp trung tính, hạt oxit nhôm, silica gel trung tính đã đƣợc ankyl hoá nhóm –OH bằng các gốc hydrocarbon mạch thẳng C2, C4, C8, C18, hay nhân phenyl, các polyme hữu cơ, các loại nhựa hoặc than hoạt tính Các hạt này đƣợc nhồi vào cột chiết nhỏ (thƣờng là cột có kích thƣớc 5 x 1 cm) hoặc nén ở dạng đĩa dày 1 – 2 mm với đƣờng kính 3 – 4 cm (đĩa chiết). Hình 1.17. Cột chiết pha rắn 33
  46. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Pha lỏng là pha chứa chất cần phân tích, chúng có thể là dung môi hữu cơ, dung dịch đệm Khi cho pha lỏng đi qua cột chiết (hoặc đĩa chiết), pha rắn tƣơng tác với chất phân tích và giữ một nhóm (hoặc một số nhóm) của chất phân tích lại trên pha rắn, các chất còn lại đi ra khỏi cột cùng với dung môi hòa tan mẫu. Quá trình rửa giải (giải hấp) chất phân tích đƣợc thực hiện bằng một dung môi thích [45] hợp. 1.4. Tổng quan về khả năng kháng oxy hóa 1.4.1. Quá trình và nguyên nhân gây oxy hóa Một gốc tự do có thể đƣợc định nghĩa là một nguyên tử không trọn vẹn, có chứa một điện tử vòng ngoài chƣa ghép đôi (số điện tử là số lẻ) nên không bền vững, phải kết hợp với một nguyên tử khác để có số điện tử chẵn và trở nên bền vững. Sự hiện diện của một electron không kết đôi dẫn đến các tính chất thông thƣờng nhất đƣợc chia sẻ bởi hầu hết các gốc tự do (tạo ra một nguyên tử không trọng vẹn khác, tiếp tục kết hợp với một nguyên tử khác rồi trở thành nguyên tử không trọn vẹn, ). Nhiều gốc tự do không ổn định kéo theo một điện tử của phân tử khác về phía nó và có phản ứng hóa học rất cao. Chúng có thể cho hoặc nhận một điện tử từ phân tử khác, do đó tạo ra những phân tử bị oxy hóa.[10], [20] Các phân tử bị oxy hóa sẽ mất đi chức năng vốn có của nó, là tác nhân oxy hóa cho các phân tử cạnh nó, tấn công các đại phân tử quan trọng dẫn đến tổn thƣơng tế bào và phá vỡ cân bằng nội môi. Quá trình oxy hóa sẽ tạo ra các thay đổi bất lợi tích tụ dần dần trong cơ thể, biểu hiện dƣới dạng các chứng bệnh cụ thể ở từng độ tuổi nhất định. Ung thƣ và xơ vữa động mạch là hai nguyên nhân chính gây tử vong do các gốc tự do, đƣợc tạo ra bên trong cơ thể trong quá trình trao đổi chất hoặc đƣợc đƣa vào từ bên ngoài do ô nhiễm môi trƣờng, khói thuốc lá, tia bức xạ, virus, vi khuẩn, [11] Các gốc tự do có hoạt tính mạnh nhƣ hydroxyl (OH), ion sắt 2+ (Fe O), Cu(OH)2, có hoạt tính trung bình và yếu bao gồm peroxyl (ROO), hydrogen [7] H2O2, singlet oxy (O1), nitric oxide (NO), 34
  47. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Các gốc tự do tạo ra do quá trình sinh dƣỡng sẽ đƣợc kiểm soát bởi các chất chống oxy hóa – một phân tử ổn định cho đi một điện tử cho gốc tự do và làm chậm hoặc ngăn cản gây hại tế bào.[17] Các hợp chất chống oxy hóa tạo nhƣ glutathione, ubiquinol, vitamin E (α tocopherol), vitamin C (ascorbic acid), β carotene, enzyme superoxide dismutase, ngoài ra cơ thể còn có các tế bào có khả năng chồng lại các yếu tố oxy hóa ngoại lai nhƣ neutrophill, monocyte, B cell [21] 1.4.2. Khả năng kháng oxy hóa của các hợp chất trong thực vật Chất chống oxy hóa đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và y dƣợc. Nhiều hợp chất chống oxy hóa tự nhiên trong thực vật có tiềm năng đã đƣợc nghiên cứu nhƣ cà chua, rau bina, các loại quả mộng, cam, quýt, olive, trà, vì chúng có chứa các hợp chất phenolic.[7], [24] Các hydrogen phenolic (AH) thể hiện khả năng kháng oxy hóa mạnh. Chúng tác động trực tiếp lên các gốc tự do đƣợc sinh ra trong cơ thể, đƣa các gốc tự do về trạng thái bền, làm cho quá trình oxy hóa bị loại bỏ thông qua các phản ứng sau: RO2* + AH ROOH + A* (1) RO* + AH ROH + A* (2) RO2* + A* ROOA (3) RO* + A* ROA (4) Các chất A* tạo ra trong các phản ứng (1) (2) khác với các gốc RO2*, RO* vì chúng không có khả năng lấy các ion H+ từ các acid béo không no hay các hợp chất trong cơ thể nên không tạo ra các gốc tự do mới để tiếp tục khởi động quá trình oxy hóa. Các sản phẩm tạo ra trong phản ứng (3) (4) là những sản phẩm khá bền và kết quả là chuỗi phản ứng của các gốc tự do sẽ kết thúc sớm hơn.[7] 1.5. Cơ sở khoa học của khả năng kháng khuẩn của các hợp chất trong thực vật 1.5.1. Định nghĩa 35
  48. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật (kháng khuẩn thực vật) là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng tiêu diệt hay kìm hãm, ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thường rất nhỏ.[11] 1.5.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất trong thực vật Hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật (kháng khuẩn thực vật) là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng tiêu diệt hay kìm hãm, ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thƣờng có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thƣờng rất nhỏ. Hình 1.18. Cơ chế kháng khuẩn Cao chiết từ các loại thực vật có thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi khuẩn ở các mức độ khác nhau nhờ sự can thiệp vào các lớp đôi phospholipid của màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá hủy các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lƣợng tế bào, tổng hợp các thành phần cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền. Nói chung, cơ chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên có liên quan đến sự rối loạn, phá vỡ màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động của proton (PMF), dòng điện tử, sự vận chuyển tích cực, và đông tụ các thành phần của tế bào (Kotzekidou và ctv, 2008) cụ thể ở bảng 1.3. 36
  49. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bảng 1.3. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (Cowan, 1990) Nhóm Phân Ví dụ Cơ chế Phenolnhóm Catechol Phá vỡ màng sinh chất đơn Epicatechin Phá vỡ vách tế bào Phenolic Cinnamic acid Liên kết bám dính, tạo phức hợp acid Quinone Hypericin với thành tế bào, làm bất hoạt Flavonoid Chrysin enzymeLiên kết bám dính Tạo phức hợp với thành tế bào Khử hoạt tính enzyme Phenolic Flavone Abyssinone Ức chế phiên mã ngƣợc HIV Flavonol Bám dính Protein Bám dính Adhesin Ức chế enzyme Phá vỡ màng sinh chất Tạo phức hợp với thành tế bào Tannin Ellagitannin Phá vỡ vách tế bào Tạo phức kim loại-ion Coumarin Warfarin Tƣơng tác với DNA nhân thực (hoạt tính kháng vius) Terpenoid Capsaicin Phá vỡ vách tế bào Tinh dầu Alkaloid Berberine Xen vào thành tế bào hoặc DNA Piperine Mannose Khóa sự kết hợp của virus hoặc Lectin (agglutinin) hấp phụ Polypeptide Falxatin Hình thành cầu Disulfide 8s-heptadeca- 2(Z),9(Z)- Polyacetylen diene-4,6- diyne-1,8-diol 37
  50. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Các hợp chất flavonoid tổng hợp bởi cây trồng để phản ứng lại sự nhiễm khuẩn và có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều loài vi sinh vật. Hoạt tính kháng khuẩn của flavonoid là do khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào, tạo phức với thành tế bào vi khuẩn, và ức chế transpeptidase làm cho mucopeptide – yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp đƣợc. Các flavonoid càng ƣa béo càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật. Các phenolics là làm thay đổi màng tế bào chất, gián đoạn lực đẩy proton và làm kết tủa các chất trong tế bào. Tầm quan trọng của sự có mặt nhóm hydroxyl trong các hợp chất phenolic đã đƣợc chứng minh, phenolics tác động lên các enzyme nhƣ ATPases nằm trong màng tế bào chất và đƣợc bao quanh bởi các phân tử lipid. Các phân tử lipophilic hydrocacbon có thể tích tụ trong lớp lipid kép và làm ảnh hƣởng đến tƣơng tác lipid – protein; ngoài ra có thể có sự tƣơng tác trực tiếp của các hợp chất lipophilic với phần kỵ nƣớc của protein (Burt’s, 2004).[12], [16] 1.6. Các chủng vi sinh vật thí nghiệm 1.6.1. Salmonella Bảng 1.4. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn Salmonella Vực (domain) Bacteria Liên giới (superregnum) Bacteria Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Proteobacteria Lớp (class) Gammaproteobacteria Bộ (ordo) Enterobacteriales Họ (familia) Enterobacteriaceae Chi (genus) Salmonnella 38
  51. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hình 1.19. Vi khuẩn Salmonella Samonella là một ví dụ kinh điển về ngộ độc thực phẩm. Đây là một loại trực khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, di động bằng tiên mao. Salmonella không lên men lactose (trừ S. arizona) và sucrose nhƣng lên men đƣợc dulcitol, mannitol và glocose. Chúng kém chịu nhiệt nhƣng chịu đƣợc một số hóa chất: brilliant green, sodium lauryl sulfate, selenite Để có thể gây ngộ độc, số lƣợng Salmonella phải lên đến cả triệu tế bào trong 1 g thực phẩm. Có 3 dạng bệnh thực sự do Salmonella gây ra: sốt thƣơng hàn do S.typhi, nhiễm trùng máu do S.cholera-suis, rối loại tiêu hóa do S.typhirium và S.enteritidis. Các triệu chứng do Salmonella gây ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện sau 12 – 36 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella. Các triệu chứng thƣờng kéo dài 2 – 7 ngày.[3] 1.6.2. Staphylococcus aureus Bảng 1.5. Phân loại khoc học chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Firmicutes Lớp (class) Bacilli Bộ (ordo) Bacillales Họ (familia) Staphylococcusaceae Chi (genus) Staphylococcus 39
  52. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hình 1.20. Vi khuẩn Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus là cầu khuẩn gram dƣơng, hiếu khí, thƣờng kết dạng chùm có mặt phổ biến ở khắp nơi thƣờng thấy trên da, xoang mũi và tóc Staphylococcus aureus sản sinh ra một loại độc tố đƣờng ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị phân huỷ ở 1000C trong 30 phút. Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này, sau 4 – 6 giờ ủ bệnh sẽ bộc phát nên các triệu chứng lâm sàng nhƣ tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8 giờ.[3] Staphylococcus aureus cho phản ứng đông huyết tƣơng dƣơng tính do chúng tiết ra enzyme coagulase. Đây đƣợc xem là tính chất đặc trƣng của S. aureus, là tiêu chuẩn để phân biệt Staphylococcus aureus với các tụ cầu khác. Có hai dạng coagulase: coagulase cố định (bound coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase tự do (free coagulase) đƣợc phóng thích khỏi thành tế bào. Ngoài ra, chúng còn cho phản ứng DNAse, phosphatase dƣơng tính, có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng Staphylococcus aureus đều nhạy với Novobicine, có khả năng tăng trƣởng trong môi trƣờng chứa đến 15% muối NaCl. 1.6.3. Escherichia Coli Bảng 1.6. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn E.Coli 40
  53. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Vực (domain) Bacteria Ngành (phylum) Proteobacteria Lớp (class) Gammaproteobacteria Bộ (ordo) Enterobacteriales Họ (familia) Enterobacteriaceae Chi (genus) Escherichia Loài (species) E. Coli Hình 1.21. Vi khuẩn Escherichia Coli E.Coli là trực khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, khá phổ biến trong tự nhiên đặc biệt trong đƣờng tiêu hóa của con ngƣời và động vật. Hầu hết các dòng E.Coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đƣờng tiêu hóa, chúng còn đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định đƣờng tiêu hóa. Tuy nhiên, tồn tại ít nhất 4 dòng sau đây có thể gây bệnh cho ngƣời và cho động vật: - Enteropathogenic E.Coli (EPEC) - Enterotocigenic E.Coli (ETEC) - Enteroinvasive E.Coli (EIEC) - Enterohaemorrhagic E.Coli (EHEC) hoặc Verocytoxin E.Coli (VTEC) hay E.Coli O157:H7 41
  54. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Nhƣ vậy, có thể đƣợc phân lập đƣợc dễ dàng ở khắp nơi trong môi trƣờng sống, phân hoặc nƣớc thải. Vi sinh vật này có thể tồn tại rất lâu trong môi trƣờng. Với sự phân bố rộng rãi nhƣ vậy nên E.Coli cũng đƣợc dễ dàng phân lập từ các mẫu thực phẩm bị nhiễm nguyên liệu hay thông qua nguồn nƣớc. Khi các dòng E.coli gây bệnh xâm nhập vào con ngƣời qua con đƣờng tiêu hóa gây ra các bệnh rối loạn đƣờng tiêu hóa, các biểu hiện lâm sàn có thể biểu hiện từ nhẹ đến rất nặng, có thể đe dọa mạng sống của con ngƣời tùy thuộc vào liều lƣợng, dòng gây nhiễm và mức độ đáp ứng của từng ngƣời.[3] 1.6.4. Bacillus cereus Bảng 1.7. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn Bacillus cereus Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Firmicutes Lớp (class) Bacilli Bộ (ordo) Bacillales Họ (familia) Bacillaceae Chi (genus) Bacillus Loài (species) B. cereus Hình 1.22. Vi khuẩn Bacillus cereus 42
  55. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bacillus cereus là trực khuẩn gram dƣơng, sinh bào tử, là vi sinh vật hiếu khí tuyệt đối, tăng trƣởng đƣợc trong nhiệt độ từ 5 - 50 , tối ƣu ở nhiệt độ 35 - 40 , pH dao động từ 4,5 – 9,3, dễ sinh bào tử và bảo tử phát triển rất dễ dàng. Bacillus cereus tiết ra 2 loại độc tố chính là diarhaea toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa. Các triệu chứng ngộ độc do bacillus cereus gây ra là đau bụng, tiêu chảy, không sốt bắt đầu khoảng 4 – 16 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm và kéo dài trong 12 – 24 giờ.[3] 43
  56. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 4 năm 2017 đến tháng 7 năm 2017 tại phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Nguồn mẫu Quả mồng tơi chín đƣợc hái tại số 13, đƣờng 642, ấp Phƣớc Hƣng, xã Phƣớc Thạnh, huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh. Quả mồng tơi chín đƣợc hái lúc 9 11 giờ sáng, chọn quả chín già có lớp vỏ ngoài căng bóng, có màu tím đen đặc trƣng. Hình 2.23. Quả mồng tơi chín 2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị Vi khuẩn chỉ thị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là 4 chủng vi khuẩn đƣợc cung cấp bởi Viện Sinh học Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh bao gồm: - Vi khuẩn Salmonella - Vi khuẩn Enterotoxigenic E. Coli - Vi khuẩn Staphylococcus arueus - Vi khuẩn Bacillus cereus 2.3. Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 44
  57. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Dụng cụ Hóa chất - Bể điều nhiệt - Thuốc thử DPPH (1,1-diphenyl-2- - Bếp đun cách thủy picrylhydrazyl) (Đức) - Bình hút ẩm - Thuốc thử Foline – Ciocalteu - Cân phân tích (3H2O.P2O5.13WO3.5MoO3.10H2O) - Cối giã - Acid gallic (C6H2(OH)3COOH) (Trung - Cốc thủy tinh Quốc) - Máy quang phổ UV – Vis - Dung dịch Na2CO3 bão hòa 2000 - Dung dịch HCl 1N - Máy lắc - Etanol 30%, 50%, 70%, nƣớc cất - Máy ly tâm - Methanol - Tủ ủ 37 - Vitamin C - Tủ sấy 50 - DMSO (dimethylsulfoxid) (Trung Quốc) - Pepton - Meat extract - NaCl - Môi trƣờng NA (Nutrient Agar) 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp xác định độ ẩm của mẫu Nguyên tắc: Dùng nhiệt làm bay hơi hết hơi nƣớc trong mẫu cho đến khi thu đƣợc khối lƣợng không đổi. Cân trọng lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy khô, từ sự hao hụt khối lƣợng tính ra phần trăm ẩm có trong mẫu. Công thức xác định độ ẩm: Độ ẩm (%) = Trong đó: 45
  58. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP M : khối lƣợng cốc (g) M1 : khối lƣợng cốc và mẫu trƣớc khi sấy (g) M2 : khối lƣợng cốc và mẫu sau khi sấy (g) 2.4.2. Phương pháp xác định tỉ lệ trọng lượng của mẫu Nguyên tắc: Xác định tỉ lệ trọng lƣợng phần sử dụng so với tổng trọng lƣợng mồng tơi. Công thức xác định tỉ lệ trong lƣợng: Phần sử dụng (%) = Trong đó: M1 : tổng trọng lƣợng (g) M2 : trọng lƣợng phần sử dụng (g) 2.4.3. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao chiết Mẫu thực vật được tách chiết bởi nhiều loại dung môi khác nhau bằng phương pháp chiết ngâm ở nhiệt độ thường và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lượng dung môi của dịch chiết bằng các thiết bị cô thích hợp. Nguyên tắc phương pháp chiết ngâm: Mẫu thực vật được ngâm trong dung môi (w/v) trong khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hòa tan vào dung môi, đây là quá trình di chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn – lỏng gồm 3 giai đoạn: thâm nhập dung môi vào mẫu, hoà tan các chất trong mẫu, khuếch tán các chất tan. Tiến hành: Ngâm một lượng bột mẫu vào dung môi (tỷ lệ 1:1 (w/v)) trong một bình kín để ở nhiệt độ phòng. Mẫu được ngâm và lắc trong thời gian xác định, sau đó đem đi lọc, ly tâm, ép bã lấy dịch chiết. Phần dịch chiết được cô đặc, thu hồi cao bằng phương pháp cô cách thủy. Các loại cao thu hồi được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4C. 2.4.4. Phương pháp định lượng polyphenol tổng số 46
  59. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Nguyên tắc: Hàm lƣợng phenolic đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Folin Ciocalteau. Đây là phƣơng pháp đo màu dựa vào phản ứng oxy hóa khử giữa các hợp chất polyphenol với thuốc thử Folin Ciocalteau (hỗn hợp của phosphomolybdat và phosphotungstat). Ở môi trƣờng kiềm, thuốc thử sẽ oxy hóa các hợp chất polyphenol và sinh ra các acid heteroply có màu xanh lam có độ hấp thu ánh sáng ở bƣớc sóng  = 765 nm. Tổng hàm lƣợng polyphenol sẽ đƣợc tính bằng cách quy về lƣợng tƣơng đƣơng với chất chuẩn acid gallic, kết quả đƣợc biểu diễn bằng số mg acid gallic tƣơng đƣơng trên 1g mẫu [22] khô (mg GAE/g db). Công thức tính hàm lƣợng polyphenol tổng số: P = Trong đó: P : hàm lƣợng polyphenol (mg GAE/g db) y : nồng độ polyphenol trong mẫu xác định từ đƣờng chuẩn (mg/ml) V : thể tích dịch chiết sau khi trích ly (ml) m : khối lƣợng mẫu sử dụng cho quá trình tách chiết (g) 2.4.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH Khả năng kháng oxy hóa đƣợc xác định bằng phƣơng pháp ức chế gốc tự do DPPH (Michael Antolovich, 2002). DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) là gốc tự do có màu tím giống màu của KMnO4, không tan trong nƣớc, nhƣng tan trong ethanol, methanol. Dung dịch DPPH có độ hấp thu cực đại tại bƣớc sóng  = 517 nm, và sản phẩm khử của nó là 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazin (DPPH-H). DPPH là hợp chất có màu tím đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng 517 nm. Cơ chế của hoạt động quét gốc tự do DPPH là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình oxy hóa bằng sự chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn định hơn.[4] Khi các điện tử lẻ của các 47
  60. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP gốc tự do DPPH kết hợp với hydro từ chất chống oxy hóa thì sẽ hình thành nên DPPH– H lúc này màu sắc chuyển từ màu tím sang màu vàng. Sự biến đổi màu này tƣơng ứng với lƣợng electron kết hợp với DPPH (Prakash et al., 2000).[1] Nhƣ vậy, khi có mặt của chất chống oxy hóa nó sẽ khử gốc tự do DPPH và làm cho dung dịch bị giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm đi.[4] Công thức xác định phần trăm ức chế: %I = Trong đó: ADPPH : giá trị OD517nm của dung dịch DPPH ban đầu pha trong methanol (ADPPH = 0,708) ATN : giá trị OD517nm của dung dịch chuẩn (hoặc dung dịch mẫu). Đánh giá khả năng kháng oxy hóa thông qua giá trị IC50. IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. IC50 đƣợc định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do. Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. Để xác định giá trị IC50, tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau. Đối với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính theo nồng độ, ta dựng đƣờng thẳng y = ax + b qua tất cả các điểm (với y là phần trăm ức chế, x là nồng độ). Đối với những mẫu có hoạt tính phi tuyến tính theo nồng độ, một cách gần đúng, chúng ta chọn 2 nồng độ ức chế trên và dƣới 50% và cũng tiến hành vẽ đƣờng thẳng y = ax + b. Sau khi dựng đƣợc đƣờng thẳng y = ax + b với 2 hệ số a và b đã biết. Thay y = 50% vào phƣơng trình ta sẽ tính đƣợc giá trị x, đó chính là giá trị IC50. Giá trị IC50 đƣợc tính dựa trên đƣờng chuẩn y = ax + b theo công thức: x = 2.4.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng kỹ thuật đục lỗ thạch 48
  61. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Nguyên tắc: Dịch cao chiết ở các lỗ sẽ khuếch tán vào môi trƣờng thạch và tác động lên các chủng khuẩn chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn thì sẽ xuất hiện quầng trong bao quanh các lỗ thạch (vòng ức chế). Từ đó, đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết bằng cách đo đƣờng kính vòng ức chế (mm). Tiến hành: - Các chủng vi khuẩn được hoạt hóa từ ống giống gốc trong môi trường lỏng NB, lắc qua đêm. Cấy trang 100 µl dịch khuẩn (mật độ tế bào tương đương 106 cfu/ml) lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường NA đặc và tiến hành đục lỗ với đường kính d = 6 mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng 2-3 cm. - Chuẩn bị dịch cao chiết bằng cách hòa tan lượng cao chiết trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO) 10% theo nồng độ yêu cầu 100 mg/ml. Bổ sung 100 µl dịch cao chiết vào các lỗ đã đục trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để dịch cao được khuyếch tán đều vào môi trường thạch. Sau đó, ủ các đĩa vào tủ ấm 37 trong 24 giờ và tiến hành đọc kết bằng cách đo giá trị đường kính vòng ức chế (mm) trên đĩa thạch. Đối chứng là dung dịch kháng sinh Amoxicillin. Hình 24.2. Kỹ thuật đục lỗ thạch có bổ sung kháng sinh đối chứng 49
  62. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thực nghiệm đƣợc xử lí thống kê theo phƣơng pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ phân tích số liệu (data analysis) của Microsofl Excel 2010. Dùng phần mềm SAS để đánh giá kết quả, so sánh giá trị trung bình giữa các thí nghiệm. 2.4.8. Phương pháp so sánh, đối chiếu Từ kết quả thực nghiệm đạt đƣợc, tiến hành so sánh với cơ sở khoa học liên quan cũng nhƣ đối chiếu với kết quả của các công trình nghiên cứu khác nhằm đƣa ra kết luận của đề tài. 2.5. Bố trí thí nghiệm Mẫu quả mồng tơi Xử lý mẫu Xác định độ ẩm Trích ly và thu nhận Xác định tỉ lệ trọng lƣợng cao chiết Cao chiết quả mồng tơi của các loại dung môi khác nhau Định lƣợng Đánh giá hoạt tính Đánh giá hoạt tính polyphenol tổng số kháng oxy hóa kháng khuẩn Sơ đồ 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 2.5.1. Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm của mẫu quả mồng tơi Sấy chén sứ sạch ở 105 cho đến khối lƣợng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lƣợng chính xác đến 0,0001g. 50
  63. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Cho vào cốc khoảng 5g mẫu. Cân cốc chứa mẫu bằng cân phân tích với độ chính xác nhƣ trên. Cho cốc chứa mẫu vào tủ sấy ở 105 , dùng nhiệt độ cao để tách ẩm ra khỏi nguyên liệu mẫu, sấy cho đến khi khối lƣợng không đổi, thƣờng tối thiểu là 6 giờ. Sau khi sấy, làm nguội trong bình hút ẩm 15 phút và đem cân ở cân phân tích với độ chính xác nhƣ trên. Khảo sát đƣợc tiến hành với 3 lần lặp lại. Kết quả đƣợc tính dựa trên công thức đƣợc nêu ở trên. 2.5.2. Thí nghiệm 2: Xác định tỉ lệ trọng lượng của mẫu Lấy khoảng 40g cọng mồng tơi có chứa quả chín. Dùng tay tách phần sử dụng (quả mồng tơi chín) ra khỏi cọng cây mồng tơi. Cân tổng trọng lƣợng cọng mồng tơi có chứa quả chín chính xác đến 0,0001g, ghi nhận kết quả. Cân phần quả chín sau khi đã tách ra cũng với độ chính xác nhƣ trên và ghi nhận kết quả. Khảo sát đƣợc tiến hành ngẫu nhiên với 2 lần lặp. Kết quả đƣợc tính dựa trên công thức đƣợc nêu ở trên. 2.5.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến hàm lượng anthocyanin 51
  64. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Quả mồng tơi Giã nhỏ Ngâm với dung môi (1:1) (w/v), HCl 1N Nƣớc Ethanol 30% 50% 70% Lắc 1 tiếng Lọc thô Ly tâm 4000v/phút Thu dịch chiết Cô cách thủy 50 Cao chiết Đánh giá hiệu suất thu hồi Bảo quản lạnh 4 52
  65. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Sơ đồ 2.2. Quy trình trích ly và thu hồi cao quả mồng tơi Thuyết minh quy trình: Nguyên liệu Quả mồng tơi chín đƣợc thu hái vào khoảng 9 – 11 giờ sáng, là khoảng thời gian thực vật hô hấp mạnh mẽ nhất, giúp thu nhận lƣợng hợp chất tối đa. Lựa chọn những quả chín có màu tím đen, loại bỏ những quả héo, rửa sạch, để ráo. Sử dụng 100g quả chín cho quá trình tách chiết. Giã nhỏ Sử dụng cối sứ giã nhỏ quả mồng tơi chín. Quá trình giã sẽ phá vỡ cấu trúc tế bào quả, giải phóng các dịch tế bào, tăng bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất. Tách chiết Chiết hợp chất có trong quả mồng tơi chín nhờ dung môi ethanol 30%, 50%, 70% và nƣớc cất sử dụng phƣơng pháp ngâm dầm để khảo sát mức độ ảnh hƣởng của dung môi đến quá trình trích ly. Cân 100g quả mồng tơi chín, giã nhỏ và thêm dung môi ethanol (30%, 50%, 70%) theo tỷ lệ 1:1 (w/v) trong erlen thủy tinh đậy kín để tránh hiện tượng bay hơi. Quá trình chiết đƣợc diễn ra trong khoảng 24 giờ, trên máy lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng. Hình 2.25. Hỗn hợp quả mồng tơi giã nhỏ và dung môi sau khi lắc 53
  66. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Lọc Để thu hồi dịch chiết cần phải qua khâu lọc thô để loại cặn hạt lẫn trong dịch chiết, sử dụng giấy lọc vả máy hút chân không để lọc nhanh dịch chiết, ly tâm 4000 vòng/phút thu dịch trong để chuẩn bị cho quá trình cô cách thủy loại dung môi. Cô dịch chiết Thu tất cả dịch lọc đem cô cách thủy ở nhiệt độ 500C cho đến khi bay hết dung môi và thu cao chiết. Đánh giá hàm lƣợng anthocyanin từ cao chiết ở mỗi nghiệm thức bằng công thức: Hàm lƣợng (%) = Trong đó: M1 : khối lƣợng cốc sau khi cô mẫu (g) M2 : khối lƣợng cốc trƣớc khi cô mẫu (g) M : khối lƣợng mẫu ban đầu (g) Cao chiết đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 4 trong tủ lạnh nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.5.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến hàm lượng polyphenol tổng số Đƣờng chuẩn acid gallic: - Chuẩn bị các dung dịch acid gallic có các nồng độ khác nhau: 0; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4 mg/ml - Cho 60 휇푙 mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch đã có 4,74 ml nƣớc cất, sau đó cho 300 휇푙 thuốc thử Folin - Ciocateau vào và trộn đều. Sau khoảng 30 giây đến 8 phút cho vào 900 휇푙 dung dịch Na2CO3 20%, lắc đều. Hỗn hợp phản ứng đƣợc giữ ở 40 trong 30 phút. So màu ở bƣớc sóng  = 765nm. 54
  67. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn) rồi làm thí nghiệm nhƣ trên. Mẫu và chất chuẩn đƣợc phân tích 3 lần. Hàm lƣợng polyphenol đƣợc tính toán dựa theo đƣờng chuẩn acid gallic. Kết quả đƣợc tính dựa trên công thức đƣợc nêu ở trên. 2.5.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến khả năng kháng oxy hóa Đƣờng chuẩn vitamin C: - Pha dung dịch vitamin C theo các nộng độ sau: 0; 0,0125; 0,025; 0,05; 0,075; 0,125 (mg/ml) - Dùng micropipette hút 100l mỗi nồng độ vào các ống nghiệm đã chứa sẵn 2ml dung dịch DPPH. - Ủ trong tối 15 phút ở nhiệt độ phòng. So màu ở bƣớc sóng  = 517nm. Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn) rồi làm thí nghiệm nhƣ trên. Kết quả đƣợc đánh giá thông qua giá trị IC50 (Inhibitory concentration) là nồng độ chất chống oxy hóa cần để ức chế (trung hòa) 50% gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định. Mẫu và chất chuẩn đƣợc phân tích 3 lần. Kết quả đƣợc tính dựa trên công thức đƣợc nêu ở trên. 2.5.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến khả năng kháng khuẩn 55
  68. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Giống vi khuẩn Tăng sinh trong môi trƣờng NB 6 Pha loãng về 10 cfu/ml Cấy trang trên môi trƣờng NA Đục lỗ thạch (d=6mm) Nhỏ cao chiết và kháng sinh đối chứng Ủ 37 trong 24 giờ Đo kích thƣớc vòng kháng khuẩn và ghi nhận kết quả Sơ đồ 2.3. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết quả mồng tơi chín Thuyết minh quy trình: Đầu tiên đối với vi sinh vật chỉ thị tiến hành quy trình tăng sinh. Sử dụng que cấy vòng lấy sinh khối của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, E.coli, Salmonella, Bacillus cereus từ các eppendoff giữ giống sang các erlen chứa 10 ml môi trƣờng NB, sau đó lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Tiến hành đo OD dịch tăng sinh ở bƣớc sóng 600 nm để xác định mật độ vi khuẩn và dịch vi khuẩn đƣợc pha loãng để đạt mật độ 106 cfu/ml. Chuẩn bị nƣớc muối sinh lý 0,9%, hấp khử trùng 121 , 1 atm, 20 phút để pha loãng mẫu. 56
  69. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Thạch nền: sử dụng môi trƣờng NA. Hấp khử trùng môi trƣờng 121 , 1 atm, 15 phút. Để nguội đến khoảng 50 đến 60 sau đó đổ vào các đĩa petri đã tiệt trùng. Để nguội sau đó úp ngƣợc đĩa petri lại. Kháng sinh đối chứng: pha dung dịch thuốc kháng sinh Amoxicillin 1%, nếu thuốc không tan trong nƣớc thì hòa tan với DMSO. Dung dịch để bảo quản trong tủ lạnh. Hút 100 µl dịch đã pha loãng cho vào đĩa NA trang đều đĩa cho đến khi dịch khô, dùng ống trụ kim loại (que đục thạch) có đƣờng kính 6 mm tiến hành đục 6 lỗ trên đĩa. Đối với cao chiết cần khảo sát tiến hành pha trong DMSO 1% để đạt nồng độ 100 mg/ml. Sử dụng micropipette hút 100 µl dịch cao chiết cho vào 3 giếng và cao chiết khác vào 3 giếng còn lại, mẫu đối chứng sẽ thay thế cao chiết bằng kháng sinh, giữ yên trong vòng 1 giờ để cao chiết và kháng sinh có thể khuếch tán vào môi trƣờng thạch tiến hành ủ ở 370C trong 24 giờ. Tiến hành đọc kết quả thông qua việc đo đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm). Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với dịch chiết đƣợc phân loại dựa theo đƣờng kính vòng kháng khuẩn: - Đƣờng kính vòng kháng khuẩn 20 mm: cực tốt (theo Celikel và Kavas, 2008) 57
  70. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xác định độ ẩm và tỉ lệ trọng lƣợng của quả mồng tơi chín Bảng 3.8. Tỉ lệ trọng lƣợng phần sử dụng và độ ẩm quả mồng tơi chín Kết quả (%) Tỉ lệ trọng lƣợng 40,30 ± 0,53 Độ ẩm 86,15 ± 0,29 Thí nghiệm sử dụng những phần quả mồng tơi chín có màu tím đen chiếm 40,30 ± 0,53%, phần bỏ đi (gồm quả mồng tơi còn xanh và cọng mồng tơi) tƣơng đối nhiều do quả mồng tơi chín không đều, đồng thời thời gian làm đề tài rơi vào những tháng mƣa nên quả mồng tơi lâu chín, gây khó khăn cho quá trình thu mẫu. Bên cạnh đó, độ ẩm của mẫu quả mồng tơi chín đạt khá cao 86,15 ± 0,29% do cây mồng tơi là một loại rau quả dùng trong thực phẩm sinh hoạt ăn uống hằng ngày nên đạt đƣợc độ ẩm nhƣ trên là hoàn toàn hợp lí. 3.2. Kết quả đánh giá hàm lƣợng anthocyanin từ cao chiết quả mồng tơi chín từ các loại dung môi trích ly khác nhau Mẫu quả mồng tơi chín sau khi được tiến hành tách chiết và thu hồi cao với các loại dung môi ethanol 30%, ethanol 50%, ethanol 70% và nƣớc cất. Hình 3.26. Dịch chiết quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác nhau 58
  71. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình 3.27. Cao chiết quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác nhau Để khảo sát sự ảnh hưởng của các loại dung môi tách chiết đến hàm lƣợng anthocyanin từ quả mồng tơi chín thì hàm lƣợng thu hồi cao là chỉ tiêu quan trọng cần xác định. Kết quả đánh giá hàm lƣợng cao chiết từ quả mồng tơi chín được trình bày ở sơ đồ 3.1. Sơ đồ 3.4. Hiệu suất thu hồi cao chiết từ quả mồng tơi chín với các dung môi khác nhau Dựa vào sơ đồ 3.1 nhận thấy rằng hàm lƣợng cao chiết quả mồng tơi chín của các dung môi khác nhau không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê (p 0,05). 59
  72. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả tách chiết cao cho thấy hàm lƣợng cao của các dung môi nƣớc cất, ethanol 50%, ethanol 30% không có sự khác nhau một cách có ý nghĩa về mặt thống kê. Trong đó, hàm lƣợng tách chiết của dung môi ethanol 70% lớn nhất với giá trị trung bình là 2,4995%. Kế đến là dung môi nƣớc cất, ethanol 30%, ethanol 50% có hàm lƣợng trung bình lần lƣợt là 2,3670%, 2,3235%, 2,3115%. Theo Đinh Phƣơng Liên, “Nghiên cứu chiết xuất citroflavonoid và đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm chiết xuất” (2012), cũng nhƣ một số nghiên cứu liên quan đến việc sử dụng dung môi để tách chiết hợp chất từ thực vật thì phần lớn các tác giả đều sử dụng dung môi ethanol 70% để tiến hành tách chiết vì ethanol 70% đƣợc biết nhƣ một dung môi vạn năng có độ phân cực phù hợp, có khả năng tách chiết rất nhiều hoạt tính sinh học ra khỏi thực vật. Tuy nhiên, để đánh giá dung môi nào phù hợp tách chiết các hoạt tính sinh học có trong quả chín Basella alba L. ngoài đánh giá hàm lƣợng cao cần phải tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cũng nhƣ các hoạt tính sinh học khác của cao chiết từ các dung môi này. 3.3. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của dung môi đến hàm lƣợng polyphenol tổng số Hình 3.28. Dung dịch đƣờng chuẩn acid gallic Bảng 3.9. Kết quả đƣờng chuẩn acid gallic Nồng độ AG (mg/ml) 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 OD  = 765nm 0,117 0,181 0,240 0,296 0,349 0,413 0,472 60
  73. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Acid gallic là chất chuẩn đƣợc sử dụng để định lƣợng polyphenol tổng số. Sau khi ủ ở 40 , dung dịch có màu xanh lam nhƣ hình 3.3 và đƣợc đo độ hấp thu ánh sáng ở bƣớc sóng  = 765nm, thu đƣợc kết quả các giá trị OD nhƣ bảng 3.2. Từ đó, ta dựng đƣợc đƣờng chuẩn acid gallic để tính hàm lƣợng polyphenol tổng số theo công thức đã nêu ở trên. Hình 3.29. Đƣờng chuẩn acid gallic Bảng 3.10. Kết quả hàm lƣợng polyphenol tổng trong 4 loại dung môi trích ly quả mồng tơi chín Nồng độ mẫu 0,1 (mg/ml) Loại dung môi Ethanol 30% Ethanol 50% Ethanol 70% Nƣớc cất trích ly Hàm lƣợng polyphenol 114,197a ± 7,87 82,133b ± 3,51 88,230b ± 2,89 92,797ab ± 0,79 tổng (mg GAE/ g db) 61
  74. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sơ đồ 3.5. So sánh hàm lƣợng polyphenol tổng của cao chiết quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác nhau Từ các kết quả ở sơ đồ 3.2 cho thấy hàm lƣợng polhyphenol tổng số (mg GAE/g db) của dung môi ethanol 30% là 114,20 mg GAE/g db cao hơn hẳn so với hàm lƣợng polyphenol của dung môi ethanol 50% là 82,133 mg GAE/g db, có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê (p < 0,01), có thể lý giải rằng do ethanol 30% có độ phân cực khác so với ethanol 50%, độ phân cực của dung môi ảnh hƣởng đến quá trình trích ly, điều này có thể tác động đến việc định lƣợng polyphenol tổng số. Kế đến là dung môi nƣớc cất, ethanol 70% có hàm lƣợng polyphenol trung bình lần lƣợt là 92,797 mg GAE/g db và 88,230 mg GAE/g db. Qua số liệu thu đƣợc, có thể kết luận rằng dung môi ethanol 30% là dung môi phù hợp nhất cho việc định lƣợng polyphenol tổng số trong cao chiết quả mồng tơi chín. So sánh với một số kết quả nghiên cứu hàm lƣợng polyphenol tổng có trong một số loài thực vật khác. Kết quả hàm lƣợng polyphenol tổng số cao nhất trong quả mồng tơi chín là 114,20 mg GAE/g db. Kết quả này so sánh với hàm lƣợng polyphenol trong lá Trầu đƣợc công bố trên Tạp chí khoa học và phát triển 2013, tập số 11, số 3:412- 62
  75. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 421/J.ci. & Devel. Vol 12, No. 3:412-421, chêch lệch không đáng kể. Trong tạp chí này, hàm lƣợng polyphenol tổng số cao nhất trong là lá Trầu không với 188,19 mg GAE/g db, theo sau là lá ổi và lá trà xanh với hàm lƣợng tƣơng ứng là 146,5 mg GAE/g db. Lá nhàu, lá lốt, lá khoai lang có hàm lƣợng polyphenol thấp nhất 11,7, 39,3 và 60,7 mg GAE/g db so với kết quả hàm lƣợng polyphenol trong lá củ đậu đều thấp hơn.[7] Polyphenol là một trong những thành phần quan trọng nhất và chiếm tỉ lệ lớn trong thực vật nói chung. Đây là chất chống oxy hóa mạnh, và có khả năng kháng khuẩn cao. Vì vậy, chỉ tiêu này khá quan trọng trong nghiên cứu đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết. 3.4. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của dung môi đến khả năng kháng oxy hóa Hình 3.30. Đƣờng chuẩn vitamin C Hình 3.31. Phản ứng của DPPH và chất chuẩn vitmin C 63
  76. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Vitamin C là chất chống oxy hóa chuẩn thƣờng đƣợc sử dụng để so sánh khả năng làm sạch gốc tự do của các chất cần đƣợc khảo sát. Đƣờng chuẩn DPPH đƣợc tính theo µg/ml vitamin C theo phƣơng trình đƣờng chuẩn là y = 0,7057x + 8,9894 (R2 = 0,9941). Hình 3.7. Đƣờng chuẩn của cao chiết ethanol 30%, 50%, 70%, nƣớc cất (theo thứ tự từ trên xuống dƣới, từ trái sang phải) Hình 3.8. Phản ứng của DPPH và cao chiết. 64
  77. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Bảng 3.11. Phần trăm ức chế của cao quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác nhau ( các mẫu tự theo sau các giá trị trong cùng một cột khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 1%). Nồng độ Ethanol 30% Ethanol 50% Ethanol 70% Nƣớc cất Vitamin C (g/ml) 12,5 28,810e ± 0,99 25,845c ± 0,57 36,350d ± 1,17 35,200d ± 0,99 15,393f ± 0,43 25 37,920d ± 0,07 34,040c ±0,85 45,860cd ± 1,99 43,625cd ± 0,13 26,550d ± 1,79 50 52,330c ± 1,06 48,870b ± 4,38 58,685cb ± 0,64 52,755c ± 2,90 45,923c ± 1,01 75 64,620b ± 3,04 59,900b ± 0,72 70,910b ± 1,33 63,845b ± 0,43 65,067b ± 0,88 125 83,475a ± 0,29 78,390a ± 2,97 87,78a ± 2,33 79,945a ± 2,69 94,917a ± 0,53 Bảng 3.12. Phƣơng trình đƣờng chuẩn và giá trị IC50 của nghiệm thức Phƣơng trình đƣờng chuẩn IC50 (g/ml) Vitamin C Y = 0,7057x + 8,9894 58,30 R2 = 0,9941 Ethanol 30% Y = 0,4803x + 25,809 50,37 R2 = 0,9846 Ethanol 50% Y = 0,4629x + 22,791 56,63 R2 = 0,9845 Ethanol 70% Y = 0,4509x + 33,786 34,29 R2 = 0,9828 Nƣớc cất Y = 0,3895x + 32,679 46,48 R2 = 0,9892 65
  78. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sơ đồ 3.6. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của vitamin C và cao chiết ở các dung môi trích ly khác nhau. Khả năng loại 50% các gốc tự do IC50 (Inhibitory concentration of 50%) đƣợc tính toán dựa vào đồ thị và kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.11. Trong đó cao chiết quả mồng tơi chín sử dụng dung môi là ethanol 70% có khả năng làm loại tự do cao nhất (IC50 = 34,29) sau đó là nƣớc cất (IC50 = 46,48), ethanol 30% (IC50 = 50,37) và cuối cùng là ethanol 50% (IC50 = 56,63). Cao chiết quả mồng tơi có khả năng bắt các gốc tự do đặc biệt tốt, cao hơn cả vitamin C trong điều kiện phòng thí nghiệm. Hiệu quả loại gốc tự do của cao chiết ethanol 30%, 50%, 70% và nƣớc cất của quả mồng tơi chín trong thử nghiệm loại gốc DPPH đƣợc trình bày ở bảng 3.4. Kết quả cho thấy hoạt tính loại gốc tự do ở nồng độ 0,125 mg/ml của cao chiết ethanol 70% của quả mồng tơi chín khá mạnh, có khả năng loại gốc tự do trên 87%. Theo kết quả nghiên cứu của Trần Thị Kim Ngân (2015), “Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa của lá sen nelumbo nucifera”, giá trị IC50 của dịch chiết ethanol 70% lá sen non là 13,59 g/ml và của dịch chiết ethanol 96% lá sen trƣởng thành là 2,907 g/ml. So sánh các giá trị IC50 ta có thể thấy quả mồng tơi chín có hoạt tính kháng oxy mạnh hơn dịch chiết từ lá sen. 66
  79. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.5. Kết quả ảnh hƣởng của dung môi trích ly đến khả năng kháng khuẩn 3.5.1. Hoạt tính kháng Bacillus cereus của các loại cao chiết Bảng 3.13. Kết quả kháng Bacillus cereus của 4 loại cao chiết Đƣởng kính vòng kháng Các loại cao chiết Nồng độ vi khuẩn (cfu/ml) khuẩn (mm) Ethanol 30% 0 Ethanol 50% 0 Ethanol 70% 106 13b ± 0,289 Nƣớc cất 0 Amoxicillin 22a ± 1,732 Dựa vào kết quả đƣa ra trong bảng 3.4, cho thấy cao chiết quả mồng tơi chín sử dụng dung môi ethanol 70% có khả năng kháng Bacillus cereus tốt, trong khi 3 loại cao chiết còn lại dung môi lần lƣợt là ethanol 30%, ethanol 50% và nƣớc cất thì có hiện tƣơng ức chế khá tốt. Đƣờng kính vòng kháng khuẩn Bacillus cereus của cao chiết ethanol 70% nồng độ 100mg/ml là 13 mm, so với vòng kháng khuẩn của kháng sinh đối chứng nồng độ 10mg/ml là 22 mm thì nhỏ hơn. Kết quả vòng kháng Bacillus cao nhất của cao chiết quả mồng tơi chín là 13 mm, kết quả này so với kết quả của cao chiết từ cây lá đắng kháng Bacillus đƣợc thực hiện bởi Từ Công Tính (2017), “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và đề xuất ứng dụng từ cây lá đắng”, có vòng ức chế chung bình là 11,7 mm thì kháng tốt hơn rất nhiều. 3.5.2. Hoạt tính kháng Salmonella của các loại cao chiết Bảng 3.14. Kết quả kháng Salmonella của 4 loại cao chiết Đƣờng kính vòng kháng Các loại cao chiết Nồng độ vi khuẩn (cfu/ml) khuẩn (mm) Ethanol 30% 0 Ethanol 50% 9,667b ± 0,333 Ethanol 70% 106 12,167b ± 1,072 Nƣớc cất 0 Amoxicillin 16,667a ± 0,882 67
  80. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Dựa vào kết quả đƣa ra trong bảng 3.5, cho thấy cao chiết quả mồng tơi chín sử dụng dung môi ethanol 50% và ethanol 70% có khả năng kháng Salmonella tƣơng đối tốt, 2 loại cao chiết ethanol 30% và nƣớc cất không có hiện tƣợng kháng. Đƣờng kính vòng kháng khuần Salmonella của cao chiết ethanol 70% nồng độ 100mg/ml cao nhất là 12,167 mm, sau đó là ethanol 50% đạt 9,667 mm, so với vòng kháng khuẩn của kháng sinh đối chứng nồng độ 10mg/ml là 16,667 mm thì đều nhỏ hơn. Kết quả vòng kháng Salmonella cao nhất của cao chiết quả mồng tơi chín là 13 mm, kết quả này so với kết quả của cao chiết lá củ đậu kháng Salmonella đƣợc công bố trên bởi Huỳnh Kim Khánh (2016), “Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính trên mô hình invitro”, Đồ án tốt nghiệp, trƣờng Đại học Công nghệ TP.HCM, là không kháng chứng tỏ cao chiết quả mồng tơi chín có khả năng kháng Salmonella rất mạnh. 3.5.3. Hoạt tính kháng E.coli của các loại cao chiết Bảng 3.15. Kết quả kháng E.coli của 4 loại cao chiết Đƣờng kính vòng kháng Các loại cao chiết Nồng độ vi khuẩn (cfu/ml) khuẩn (mm) Ethanol 30% 11b ± 0,00 Ethanol 50% 10b ± 0,00 Ethanol 70% 106 12,33b ± 0,333 Nƣớc cất 0 Amoxicillin 22a ± 1,528 Dựa vào kết quả đƣa ra trong bảng 3.6, cho thấy cao chiết quả mồng tơi chín sử dụng dung môi ethanol 30%, 50%, 70% có khả năng kháng E.coli tốt. Cao chiết sử dụng dung môi là nƣớc cất không có hiện tƣợng kháng E.coli. Đƣờng kính vòng kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% nồng độ 100mg/ml lớn nhất là 12,33 mm, kế đến là ethanol 30% 11 mm và ethanol 50% 10 mm, so với đƣờng kính vòng kháng sinh đối chứng nồng độ 10mg/ml là 22 mm thì đều thấp hơn. 68
  81. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả vòng kháng E.coli cao nhất của cao chiết quả mồng tơi chín là 12,33 mm, kết quả này so với kết quả của dịch chiết bắp cải tím kháng E.coli đƣợc công bố bởi Phạm Ngọc Khôi (2016), “Khảo sát các điều kiện thu hồi dịch chiết và hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa của dịch chiết bắp cải tím Brassica Oleracea”, Tạp chí khoa học Yersin là 14,5 mm thì nhỏ hơn. [6] 3.5.4. Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của các loại cao chiết Bảng 3.16. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của 4 loại cao chiết Đƣờng kính vòng kháng Các loại cao chiết Nồng độ vi khuẩn (cfu/ml) khuẩn (mm) Ethanol 30% 12,833b ± 0,441 Ethanol 50% 11,667b ± 0,333 Ethanol 70% 106 13,667b ± 0,333 Nƣớc cất 12,333b ± 0,333 Amoxicillin 23a ± 1,528 Dựa vào kết quả đƣa ra trong bảng 3.7, cho thấy cả 4 loại cao chiết đều kháng tốt khuẩn Staphylococcus aureus. Đƣờng kính vòng kháng của cao ethanol 70% nồng độ 100mg/ml là lớn nhất đạt 13,667 mm, kế đến là cao ethanol 30%, nƣớc cất và ethanol 50% lần lƣợt có đƣờng kính vòng kháng là 12,833 mm, 12,333 mm và 11,667 mm, so với đƣờng kính vòng kháng của kháng sinh đối chứng là 23 mm đều nhỏ hơn. Kết quả vòng kháng Staphylococcus aureus cao nhất của cao chiết quả mồng tơi chín là 13,667 mm, kết quả này so với kết quả của dịch chiết bắp cải tím kháng Staphylococcus aureus đƣợc công bố bởi Phạm Ngọc Khôi (2016), “Khảo sát các điều kiện thu hồi dịch chiết và hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa của dịch chiết bắp cải tím Brassica Oleracea”, Tạp chí khoa học Yersin là 13,3 mm lớn hơn rất nhiều. 69
  82. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sơ đồ 3.7. Tổng quát về hoạt tính kháng khuẩn của cao quả mồng tơi chín từ các loại dung môi khác nhau trên cả 4 chủng vi khuẩn. Từ kết quả thí nghiệm được biểu diễn ở hình 3.12 nhận thấy rằng cao chiết quả mồng tơi chín từ các loại dung môi (nồng độ 100 mg/ml) đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn khác nhau trên chủng vi khuẩn Staphylococcus areus một cách có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,01). Cao chiết ethanol 30% kháng tốt 2/4 chủng là E.coli và Staphylococcus aureus với đƣờng kính vòng kháng lần lƣợt là 11 mm và 12,833 mm. Cao chiết ethanol 50% kháng tốt 3/4 chủng lần lƣợt là Salmonella, E.coli và Staphylococcus areus với đƣờng kính là 9,667 mm, 10 mm và 11,667 mm. Cao chiết ethanol 70% kháng tốt 4/4 chủng và có đƣờng kính vòng kháng lần lƣợt là 13 mm, 12,167 mm, 12,33 mm và 13,667 mm. Riêng cao chiết sử dụng dung môi nƣớc cất chỉ kháng chủng Staphylococcus areus với đƣờng kính 12,333 mm nhƣng lại kháng rất tốt. Tất cả các loại cao chiết đều kháng tốt cả vi khuẩn gram ( ) (Salmonella, trực khuẩn đƣờng ruột E.coli) và vi khuẩn gram ( ) (cầu khuẩn Staphylococcus aureus, trực khuẩn Bacillus cereus). 70