›

Đồ án Nghiên cứu sự ảnh hưởng của salicylic acid và aspirin trong tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro

pdf 72 trang thiennha21 13/04/2022 5790
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu sự ảnh hưởng của salicylic acid và aspirin trong tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_su_anh_huong_cua_salicylic_acid_va_aspirin.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu sự ảnh hưởng của salicylic acid và aspirin trong tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA SALICYLIC ACID VÀ ASPIRIN TRONG TĂNG TRƯỞNG CỦA CÂY CHUỐI GIÀ LÙN (Musa acuminata) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. ĐỖ ĐĂNG GIÁP Sinh viên thực hiện : VÕ PHÙNG THỤY THANH TUYỀN MSSV: 1411100147 Lớp: 14DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2018.
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài này do chính tôi thực hiện, đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi. Những thông tin tham khảo trong đồ án đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng. Các kết quả nghiên cứu trong đồ án do tôi tự thực hiện, phân tích một cách trung thực, khách quan và phù hợp với thực tiễn. Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 7 năm 2018 Sinh viên thực hiện Võ Phùng Thụy Thanh Tuyền A
  3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình, tôi xin chân thành cảm ơn tập thể giảng viên khoa Công nghệ sinh học thuộc Viện Khoa học Ứng dụng của trường đại học Công Nghệ Tp.HCM đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại đây. Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Đỗ Đăng Giáp đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ, giúp đỡ, động viên của các anh chị, bạn bè và gia đình trong suốt thời gian thực hiện vừa qua. Vì thời gian hạn hẹp và vốn kiến thức còn hạn chế nên cuốn báo cáo này sẽ không tránh được những thiếu sót. Rất mong nhận được sự chỉ bảo và đóng góp của quý thầy cô để cuốn báo cáo này hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn! Tp. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 7 năm 2018 Sinh viên thực hiện Võ Phùng Thụy Thanh Tuyền B
  4. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii LỜI MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề 1 Mục đích 2 Mục tiêu đề tài 2 Nội dung đề tài 2 Phương pháp nghiên cứu 2 Kết quả đạt được 2 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1 Giới thiệu chung về cây chuối già lùn 4 1.1.1 Giới thiệu 4 1.1.2 Nguồn gốc và phân bố 5 1.1.3 Đặc điểm thực vật học 5 1.1.4 Đặc điểm sinh học 10 1.1.5 Yêu cầu về điều kiện sinh thái của chuối già lùn 12 1.1.6 Công dụng 13 1.1.7 Một số nghiên cứu trước đây 14 1.1.8 Ý nghĩa kinh tế của việc trồng chuối 16 i
  5. 1.1.9 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chuối già lùn ở nước ta 16 1.2 Giới thiệu sơ lược về nuôi cấy mô 19 1.2.1 Khái niệm nhân giống in vitro 19 1.2.2 Lợi ích của nhân giống in vitro 20 1.2.3 Khó khăn trong nhân giống in vitro 20 1.2.4 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 21 1.2.5 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 21 1.2.6 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật 23 1.3 Chất điều hoà sinh trưởng thực vật 24 1.3.1 Salicylic acid (SA) 24 1.3.2 Aspirin 25 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 27 2.2 Vật liệu 27 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 27 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất 27 2.2.3 Môi trường nuôi cấy 27 2.3 Nội dung nghiên cứu 29 2.3.1 Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid ở nồng độ cao lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro 29 2.3.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của aspirin ở nồng độ cao lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro 30 2.3.3 Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid ở nồng độ thấp lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro 31 2.3.4 Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng của aspirin ở nồng độ thấp lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro 32 ii
  6. 2.4 Phương pháp thu nhận số liệu 32 2.5 Phân tích và xử lý số liệu 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid ở nồng độ cao lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro 35 3.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của aspirin ở nồng độ cao lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro 38 3.3 Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid ở nồng độ thấp lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro 42 3.4 Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng của aspirin ở nồng độ thấp lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro 45 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC iii
  7. DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng các nồng độ cao của SA lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) in vitro 29 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng các nồng độ cao của aspirin lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) in vitro 30 Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng các nồng độ thấp của SA lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) in vitro 31 Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng các nồng độ thấp của aspirin lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) in vitro 32 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của salicylic nồng độ cao (0; 1; 2; 3 mg/l) lên sự tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) sau 4 tuần nuôi cấy 35 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của aspirin nồng độ cao (0; 1; 2; 3 mg/l) lên sự tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) sau 4 tuần nuôi cấy 39 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của salicylic acid nồng độ thấp (0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/l) lên sự tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) sau 4 tuần nuôi cấy 42 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của aspirin nồng độ thấp (0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/l) lên sự tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) sau 4 tuần nuôi cấy 45 iv
  8. DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cây chuối già lùn (Musa acuminata) 4 Hình 1.2. Rễ cây chuối già lùn 6 Hình 1.3. Tàn dư của thân thật cây chuối già lùn 7 Hình 1.4. Thân giả cây chuối già lùn 7 Hình 1.5. Lá cây chuối già lùn 8 Hình 1.6. Phát hoa (bắp chuối) già mới nở 9 Hình 1.7. Phát hoa (bắp chuối) già đã nở 10 Hình 1.8. Quả chuối già 10 Hình 1.9. Sơ đồ cây chuối trưởng thành (Trần Thanh Hương, 2011) 12 Hình 1.10. Biểu đồ thống kê thị trường chuối 17 Hình 2.1. Môi trường nuôi cấy trước khi hấp khử trùng 28 Hình 2.2. Môi trường nuôi cấy sau khi hấp khử trùng 28 Hình 2.3. Phương pháp thu nhận chỉ tiêu về trọng lượng cây 33 Hình 2.4. Thiết bị đo chlorophyll cầm tay 34 Hình 3.1. Ảnh hưởng của salicylic acid ở nồng độ cao lên sự phát triển của cây chuối già lùn nuôi cấy in vitro 38 Hình 3.2. Ảnh hưởng của aspirin ở nồng độ cao lên sự phát triển của cây chuối già lùn nuôi cấy in vitro 41 Hình 3.3. Ảnh hưởng của salicylic acid ở nồng độ thấp lên sự phát triển của cây chuối già lùn nuôi cấy in vitro 44 Hình 3.4. Ảnh hưởng của aspirin ở nồng độ thấp lên sự phát triển của cây chuối già lùn nuôi cấy in vitro 48 v
  9. DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của SA nồng độ cao lên chiều cao của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 36 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của SA nồng độ cao lên số rễ của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 37 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của SA nồng độ cao lên số lá và hàm lượng chlorophyll của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 37 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của aspirin nồng độ cao lên chiều cao của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 40 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của aspirin nồng độ cao lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 40 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của aspirin nồng độ cao lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 41 Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của SA nồng độ thấp lên chiều cao của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 43 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của SA nồng độ thấp lên số rễ của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 44 Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của aspirin nồng độ thấp lên chiều cao của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 46 Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng của aspirin nồng độ thấp lên số rễ của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 47 Biểu đồ 3.11. Ảnh hưởng của aspirin nồng độ thấp lên số lá và hàm lượng chlorophyll của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 47 vi
  10. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT MS : Murashige and Koog (1962) NAA : α – napthalene acetic acid SA : salicylic acid vii
  11. LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việt Nam ta là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, là điều kiện tốt cho mọi loài sinh vật phát triển. Các loại cây ăn trái ở nước ta ra quả quanh năm, đây cũng là một trong những nguồn hàng được xuất khẩu mang lại lợi nhuận hiện nay. Các loại trái cây nhiệt đới phổ biến mà ta có như chuối, cam, xoài, trong đó chuối là cây chiếm tỷ trọng khá lớn. Chuối là loại cây có nhiều nguồn dinh dưỡng và lợi ích. Toàn bộ sản phẩm của cây chuối đều có thể sử dụng làm lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc, thuốc nhuộm, Chuối có rất nhiều loại như: chuối cau, chuối xiêm, chuối ngự, Trong số đó thì chuối già là loại chuối phổ biến được nhiều người biết đến. Tiêu biểu hơn trong nhóm chuối già là cây chuối già lùn. Chuối già lùn thường được nhân giống bằng phương pháp nhân giống in vtro. Nhân giống in vitro giúp tạo ra cây giống đồng đều về mặt di truyền, sạch bệnh, năng suất cao, chất lượng đảm bảo. Phương pháp này còn có thể rút ngắn vòng đời từ đó kiểm soát được quá trình tăng trưởng của cây và tạo năng suất cao hơn cho người trồng. Để giúp cây sinh trưởng và phát triển nhanh trong môi trường in vitro thường người ta bổ sung thêm các chất như khoáng, vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng vào môi trường để cây tăng khả năng tự phát triển. Salicylic acid (SA) và aspirin là hai chất đã được biết đến và nghiên cứu sử dụng trên nhiều đối tượng. Salicylic acid đã được thử nghiệm qua một số đối tượng như: đậu nành (Gutierrez- Coronado và cộng sự, 1998); lúa mì (Shakirova và cộng sự, 2003); ngô (Gunes và cộng sự, 2007); Chamomile (Kovacik và cộng sự, 2009) Hiện SA đã được chứng minh như một chất kích thích tăng trưởng của thực vật. Bên cạnh đó, aspirin là một dẫn xuất của SA nó cũng mang một số đặc tính như SA. Kỹ sư Hứa Quyết chiến đã từng sử dụng dẫn xuất đó để tạo chế phẩm sử dụng cho cây, cũng như tại Đại học Rhode Insland người làm vườn ở đây đã sử dụng aspirin với nồng độ thích hợp cho 1
  12. cây và cho biết rằng cây tăng trưởng nhanh hơn hiệu quả hơn so với cây không được sử dụng. Tuy vậy aspirin còn là chất mới chưa được ứng dụng trực tiếp trong nuôi cấy in vitro. Từ các vấn đề trên, với mong muốn nâng cao hiệu quả tạo giống chuối già lùn năng suất tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự ảnh hưởng của salicylic acid và aspirin trong tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro”. Mục đích Tìm ra các điều kiện bổ sung thích hợp để nâng cao hiệu quả tạo giống chuối già lùn (Musa acuminata) năng suất. Mục tiêu đề tài Đánh giá khả năng ảnh hưởng của SA và aspirin tác động lên cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong phương pháp in vitro. Nội dung đề tài Khảo sát ảnh hưởng của SA lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata). Khảo sát ảnh hưởng của aspirin lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata). Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các số liệu thu đựơc xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV, trắc nghiệm phân hạng các nghiệm thức bằng LSD với độ tin cậy 95%. Số liệu được trình bày bằng biểu đồ trong Microsoft Excel 2010. Kết quả đạt được Thí nghiệm 1: Xác định được nồng độ SA cao thích hợp cho sự tăng trưởng cây chuối già lùn Musa acuminata (0 – 1 mg/l). Thí nghiệm 2: Xác định được nồng độ aspirin cao thích hợp cho sự tăng trưởng cây chuối già lùn Musa acuminata (0 – 1 mg/l). 2
  13. Thí nghiệm 3: Xác định được nồng độ SA thấp thích hợp nhất cho sự tăng trưởng cây chuối già lùn Musa acuminata (0,8 mg/l). Thí nghiệm 4: Xác định được nồng độ aspirin thấp thích hợp nhất cho sự tăng trưởng cây chuối già lùn Musa acuminata (0,8 mg/l). Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp bao gồm các chương sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và bàn luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị. 3
  14. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây chuối già lùn 1.1.1 Giới thiệu Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Liliopsida Bộ : Zingiberales Họ : Musaceae Chi : Musa Loài : Musa acuminata Hình 1.1. Cây chuối già lùn (Musa acuminata) Chuối già có danh pháp hai phần là: Musa acuminata (AAA Group), thuộc họ chuối (Musaceae), chúng thuộc nhóm chuối Cavendish. Đây là giống chuối có giá trị thương mại cao, chiếm 47% tổng sản lượng toàn cầu trong giai đoạn 1998 – 2000 và là giống chuối chiếm sản lượng chính trên thế giới. Chuối được trồng ở các nước như Ấn Độ, Nam Trung Quốc, Malaysia, Việt Nam, các nước Đông Phi, Các loài chuối hoang dại được tìm thấy rất nhiều ở Đông Nam Á, có thể nói rằng Đông Nam Á là quê hương của chuối. Theo Persley, Gabrielle J và Pamela George (1996) đã đánh giá: “Việt Nam là một trong những trung tâm xuất xứ của các giống chuối Musa spp , có nhiều loài, giống, và nhân bản Các giống thương mại xuất khẩu chuối của Việt Nam chủ yếu dựa trên các giống địa phương thuộc nhóm giống chuối Cavendish có nguồn gốc bản địa ở Việt Nam”. 4
  15. 1.1.2 Nguồn gốc và phân bố Cây chuối có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Đông Nam Á. Đa số các giống trồng hiện nay là sự kết hợp giữa hai loài hoang dại Musa acuminata (AA) và Musa balbisiana (BB), hay giữa các giống trong cùng một loài với nhau. Hai loài này có kiểu gen nhị bội, thụ tinh được, có cùng số lượng nhiễm sắc thể cơ bản (n=11) nhưng có các đặc điểm hình thái khác nhau (APG II, 2003; Trần Thanh Hương, 2011). Chuối già được trồng nhiều ở các tỉnh Vĩnh Long, Trà Vinh, Bến Tre, Tiền Giang và được chuyển đi tiêu thụ ở Thành phố Hồ Chí Minh, ra Bắc, sang Trung Quốc và châu Âu. Chuối già lùn đang được trồng nhiều ở thị xã Dĩ An, tỉnh Bình Dương mang lại hiệu quả kinh tế cao cho các hộ trồng giống chuối này. Đặc biệt là giống chuối già lùn Long Tân (xã Long Tân, huyện Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai) rất nổi tiếng và mang lại nguồn thu nhập cao cho nhiều hộ dân ở đây. Và nhiều tỉnh, thành trong cả nước cũng đã mở rộng diện tích trồng chuối (trong đó có chuối già lùn) vì lợi nhuận cao, nhiều hộ nông dân đã trở nên khá giả, giàu có nhờ vào trồng chuối. 1.1.3 Đặc điểm thực vật học Chuối già thuộc loại cây thân thảo, cao từ 5 đến 6 mét, sống lâu năm, thân cây tròn, thẳng, có bẹ lá, là cây thân mềm, một lá mầm. Cuống hình tròn có khuyết rãnh, lá to, dài. Chuối già có năng suất cao, phẩm chất tốt (hàm lượng đường, axit và vitamin đều cao). Vì vậy, nó là giống được trồng phổ biến trong nhân dân ta. Hiện nay chuối già là giống có ý nghĩa nhất, nó là mặt hàng xuất khẩu chính trong các loại chuối. 1.1.3.1 Rễ Là rễ chùm, có hai loại: rễ ngang và rễ thẳng. ₋ Rễ ngang mọc xung quanh củ chuối và phân bố ở lớp đất mặt từ 0 – 30 cm, phần nhiều tập trung ở độ sâu 0,15 cm, bề ngang rộng tới 2 – 3 cm loại rễ 5
  16. này sinh trưởng khỏe, phân bố rộng, đó là loại rễ quan trọng nhất để hút nước và dinh dưỡng nuôi cây. ₋ Rễ thẳng mọc ở phía dưới củ chuối, ăn sâu 1 – 1,5cm, tác dụng chủ yếu giữ cây đứng vững. Rễ chuối chứa nhiều nước, giòn, mềm, yếu, dễ gãy; sức chịu hạn, chịu úng đều kém so với nhiều loại cây ăn trái khác. Hình 1.2. Rễ cây chuối già lùn 1.1.3.2 Thân Gồm 2 loại: Thân thật và thân giả ₋ Thân thật: Còn được gọi là củ chuối, có hình tròn dẹt và ngắn, khi phát triển đầy đủ có thể rộng 30 cm. Phần bên ngoài xung quanh củ chuối được bao phủ bởi những vết sẹo từ bẹ lá có dạng tròn. Ở đáy mỗi bẹ lá đều có một chồi mầm nhưng chỉ các chồi ở phần giữa củ là phát triển được, có khuynh hướng mọc trồi dần lên. Các sẹo lá mọc rất gần nhau làm thành khoảng cách rất ngắn. Củ chuối sống lâu năm, là cơ quan chủ yếu dự trữ chất dinh dưỡng, đồng thời là nơi để rễ, lá, mầm và cuống hoa mọc ra. Do đó củ chuối to mập là cơ sở đảm bảo cho cây sinh trưởng nhanh, năng suất cao. Xung quanh củ chuối có nhiều mầm ngủ, sau này sẽ phát triển thành cây con. 6
  17. ₋ Thân giả: Thân cây chuối là thân giả, hình trụ do nhiều bẹ lá lồng vào nhau tạo thành. Các bẹ lá cuốn sát nhau tạo thành một khối hình trụ dẻo dai, gồm những khối sợi và những ô rỗng mọng nước. Thân cây chuối cao từ 3 – 6 m. Hình 1.3. Tàn dư của thân thật cây chuối già lùn Hình 1.4. Thân giả cây chuối già lùn 7
  18. 1.1.3.3 Lá Lá được sắp xếp theo vòng xoắn và gồm có ba phần: ₋ Bẹ lá: Mọc từ thân chính dưới mặt đất, các bẹ lá cuộn chặt vào nhau tạo nên thân giả. Bẹ lá có nhiều chất xơ và các lổ rỗng, xốp, mọng nước. Tiết diện của bẹ lá hình khăn mỏng, hai bề mặt của bẹ lá nhẳn bóng. Chiều dài của mỗi bẹ lá quyết định chiều cao của thân chính khi lá đã phát triển. ₋ Cuống lá: Từ phần cuối của bẹ cho đến phiến lá, dài khoảng 20 – 40 cm. ₋ Phiến lá: Phiến lá đơn, to, rộng, dài 1 – 2 m, rộng 0,3 – 0,6 m, có cuốn lá chạy dọc đến chóp lá. Phiến lá dể bị rách do giông gió, phiến lá được dùng để lót, gói thực phẩm, gói bánh Lá chuối phát triển mạnh nhất từ tháng 5 đến tháng 8, mỗi tháng mọc ra 3 – 4 lá, phiến lá to, dày, màu xanh đậm và bóng. Từ tháng 10 trở đi, cách từ 2 – 3 tuần mới ra 1 lá mới, lá thường mỏng, nhỏ, màu xanh nhạt, sinh trưởng chậm. Đến tháng 12 trở đi mỗi tháng chỉ mọc được 1 lá. Hình 1.5. Lá cây chuối già lùn 8
  19. 1.1.3.4 Hoa chuối Hoa chuối thuộc loại hoa đủ, có đầy đủ các bộ phận: đế, đài, tràng, nhị, nhụy. Trên chùm hoa có 3 loại hoa: hoa cái, hoa trung tính và hoa đực. ₋ Hoa cái: Có đế hoa rất phát triển, tập trung ở phía gốc cuống buồng, phần này dài nhất (50 – 100 cm). Loại hoa này nở ra trước tiên, nhị cái phát triển, nhị đực thoái hóa. Chỉ có hoa cái là phát triển thành trái được. Do đó, khi trồng, chọn lọc cây giống tốt, chăm bón kịp thời để hình thành nhiều hoa cái là nhân tố quan trọng bảo đảm năng suất cao. ₋ Hoa trung tính: Có đế hoa kém phát triển, chiều dài chỉ bằng 1/2 hoa, nhị đực khá phát triển. Loại hoa này không thành quả được, thường mọc ở giữa các chùm hoa cái và hoa đực, số lượng ít. ₋ Hoa đực: Có nhị đực rất phát triển, dài hơn cả đầu nhụy. Đế hoa chỉ bằng 1/3 chiều dài hoa. Loài hoa này không thể phát triển để cho hoa quả được, thường mọc tập trung ở ngọn của chùm hoa. Phần bắp chuối mà nhân dân ta vẫn có thói quen cắt đi gồm một số ít hoa trung tính và phần chủ yếu là số hoa đực. Hình 1.6. Phát hoa (bắp chuối) già mới nở 9
  20. Hình 1.7. Phát hoa (bắp chuối) già đã nở 1.1.3.5 Quả Quả nằm trên buồng, có từ 6 – 8 nải, mỗi nải khoảng 12 quả. Quả nhỏ, dài, mùi thơm. Khi chưa chín, vỏ vẫn màu xanh nhưng khi chín mùi thì màu vàng. Quả chuối có vị ngọt, tính rất lạnh (tính hàn), không độc. Hình 1.8. Quả chuối già 1.1.4 Đặc điểm sinh học Chuối già GrainNain hay còn gọi là già lùn, thường cao khoảng 1,2 – 1,5 m, cây mập, lá rộng bề ngang, nhưng ngắn hơn chiều dài so với lá chuối già cao, phẩm chất khá. Quả của nó có đặc điểm: vị đậm ngọt, thơm và ngon, cuống quả chắc, vỏ 10
  21. quả dày. Vì vậy, chuối già lùn trở thành một loại quả được ưa chuộng nhiều hiện nay. Bên cạnh việc đáp ứng nhu cầu thị trường trái cây nó còn được sử dụng trong nhiều công nghệ chế biến khác như: bánh kẹo, mứt, thực phẩm sấy tất cả đều mang lại giá trị dinh dưỡng cao. Cây chuối gồm hai phần chính: phần dinh dưỡng và phần mang phát hoa. Phần dinh dưỡng gồm một thân ngầm (củ chuối) nằm dưới mặt đất, là thân thật, mang hệ thống rễ bất định và một thân giả khí sinh với hệ thống lá bẹ lồng vào nhau. Mỗi nách lá đều mang chồi ngủ. Trong thời kỳ dinh dưỡng, nhiều chồi dinh dưỡng cùng phát triển trên thân ngầm, nhưng chỉ có các chồi từ giữa đến ngọn thân ngầm mới có thể phát triển thành cây, đảm bảo cho sự nhân giống dinh dưỡng (Bùi Trang Việt và cộng sự, 2000; Trần Thanh Hương, 2011). Ở chuối có hai loại hoa đực và hoa cái riêng biệt. Cả hai loại hoa này đều lưỡng tính, nhưng hoa cái có nhị không có túi phấn, hoa đực có noãn sào bị thoái hóa. Cách mà “bắp chuối” mọc dựng thẳng hướng lên trên, mọc ngang, hay mọc hướng địa, màu sắc thân cây, hình dạng cuống lá, sự phân bố của noãn, chồi đực, hay hình dạng trái được dùng để phân loại các giống trồng (Bùi Trang Việt và cộng sự, 2000; Trần Thanh Hương, 2011). 11
  22. Hình 1.9. Sơ đồ cây chuối trưởng thành (Trần Thanh Hương, 2011) 1.1.5 Yêu cầu về điều kiện sinh thái của chuối già lùn 1.1.5.1 Khí hậu Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp để chuối già lùn phát triển là 20 – 35oC, tối ưu là 25oC. Dưới nhiệt độ này, thời gian sinh trưởng kéo dài. Nhiệt độ 16oC, chuối ngừng sinh trưởng. Lượng mưa: Cây chuối già lùn cần một lượng mưa từ 1500 – 2000 mm phân bố đều trong năm. Các tỉnh Nam bộ mùa nắng kéo dài 6 tháng, mưa không đáng kể nên cần phải tưới. Thiếu nước cây sinh trưởng yếu, 3 – 4 tuần mới nở 1 lá thay vì 1 12
  23. tuần nở 1 lá hoàn toàn, bẹ ngắn đi và chùn ngọn, chậm trổ buồng, nải chuối khít nhau, trái quăn queo. Ánh sáng: Tất cả các giống chuối đều cần ánh sáng và chuối già lùn cũng vậy, mặc dù chuối không có tính quang kỳ. Ở những vườn chuối thiếu ánh sáng thì cây con đời sau thường cao hơn đời trước khoảng 50 cm. Lá màu vàng trắng khi cây bị thiếu dinh dưỡng và ánh sáng. Gió: Gió bão và băng giá là hai yếu tố khí hậu gây thiệt hại vườn chuối khó khắc phục nhất. Vườn chuối không trồng cây chắn gió sẽ làm rách lá nhiều, ảnh hưởng đến quang hợp, giảm năng suất. 1.1.5.2 Đất trồng Rễ chuối là rễ chùm, nhỏ và mềm. Vì vậy, đất trồng chuối cũng phải mềm, kết cấu thuần nhất, không có tầng cứng sỏi đá gần mặt đất. Chuối cũng cần nhiều nước nên đất cũng phải nhiều mùn, xốp, chứa được nhiều nước nhưng cũng cần thoát nước trong mùa mưa. Mực nước ngầm cần sâu trên 0,8 m. Độ pH thích hợp rộng từ 4,8 – 8,0, tối thích là 6,0 – 7,5. Nói chung, cây chuối không kén đất, ở nước ta vùng nào cũng trồng được vì khí hậu thích hợp, chỉ cần đất không bị ngập nước. 1.1.6 Công dụng 1.1.6.1 Làm thức ăn dinh dưỡng Chuối là cây ăn trái được ưa chuộng hầu hết các nước trên thế giới. Ở một số vùng nhiệt đới ẩm, chuối còn là nguồn cung cấp năng lượng chính. Trái chuối chứa protein, tinh bột, chất béo, các loại đường, calci, phốt-pho, kali, kẽm, vitamin A, C, E, chất gôm, vitamin B11, cụ thể là trong 100 g phần ăn được thì có: chất bột đường (27,7 g), chất đạm (1,1 g), nước (74,1 g), sinh tố C (9 mg), B1 (0,03 mg), B2 (0,04 mg), Caroten (359 Unit), Calcium (11 mg), Magnesium (42 mg), Kalium (279 mg), Sắt (0,56 mg), 8,6% Fructos, 4,7% Glucos, 13,7% Sacaros. Đặc biệt trong quả chuối có nhiều Pectin, là 1 Glucid không có giá trị về mặt năng lượng nhưng là chất giúp cho sự tiêu hóa hấp thu tốt, chống nhiễm trùng đường ruột. Chuối cung cấp nhiều năng lượng nhất (trên dưới 100 Calori / 100 g thịt chuối chín tươi) vì chuối chứa nhiều bột đường nhất. 13
  24. Ngoài lượng carbohydrate phong phú, trái chuối còn giàu potassim – một chất khoáng cần cho hoạt động của tim, chứa nhiều vitamin C, B6, đặc biệt là vitamin A – loại vitamin thường thiếu hụt trong bữa ăn của người dân vùng nhiệt đới (Smith và Hamill, 1993; Kalimuthu và cộng sự, 2007). Trong trái chuối có sự hiện diện của Banlec, một loại protein đặc biệt có khả năng ngăn cản sự xâm nhập của virut HIV vào cơ thể (Trần Thanh Hương, 2011). 1.1.6.2 Làm thuốc Chuối già là loại quả chứa nhiều dinh dưỡng nên thường được dùng làm thực phẩm dinh dưỡng và làm thuốc phổ biến hơn mọi loại chuối. Đây là loại thức ăn thích hợp với mọi người, mọi lứa tuổi, một loại quả ngon cần thiết cho trẻ nhỏ, người cao tuổi và những người lao động cực nhọc cần bổ sung năng lượng. Trong chuối già chứa nhiều tinh bột, cứ 100 g chuối già chín có 74 g nước, 1,5 g protid, 0,4 g axit hữu cơ, 22,4 g glucid, 0,8 g xenluluza, cung cấp được 100 calo hơn hẳn các loại quả ngọt khác trong việc cung cấp năng lượng (trong 100 g: cam chứa 43 calo, đu đủ chín chứa 36 calo, nhãn chứa 49 calo, vú sữa chứa 43 calo ). Như vậy, lượng chất glucid có trong chuối chín là rất cao, ở dạng glucaza (20%), fructoza (1.5%) và saccharaza (65%) đây là những loại đường tự nhiên quý của quả chín, giúp dễ tiêu hóa, cơ thể hấp thụ nhanh và cung cấp nhiều năng lượng. Theo y học cổ truyền, chuối già có vị ngọt, tính lạnh, vào vị, đại tràng. Có tác dụng tư âm, nhuận tràng, nhuận phế, thanh nhiệt, giải độc. Dùng cho các trường hợp táo bón, sốt nóng khát nước, mụn nhọt, tăng huyết áp, an thai 1.1.7 Một số nghiên cứu trước đây 1.1.7.1 Nghiên cứu trong nước Do nhu cầu tiêu thụ chuối ngày càng tăng, việc nghiên cứu nhằm tạo các giống chuối mới có tính đồng nhất về tuổi, sạch bệnh, cho năng suất cao và ổn định về chất lượng rất được quan tâm (Gomez, 2000; Haicour và cộng sự, 1998; Strosse và cộng sự, 2006). Năm 1993, Đoàn Thị Ái Thuyền và cộng sự đã đưa ra quy trình nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô bao gồm 5 giai đoạn chính sau: đưa mẫu vào 14
  25. nuôi cấy, tạo và nhân nhanh chồi chuối, tạo rễ cây, ươm chuối trong vườn ươm, bầu chuối và trồng ra ruộng sản xuất. Năm 1994, theo Đỗ Năng Vịnh và cộng sự khi bổ sung BAP từ 7 – 9 mg/l thì hệ số nhân chồi của chuối già là cao nhất. Năm 1997, Phạm Kim Thu và Đặng Thu Vân từ nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất giống cây chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô, môi trường nuôi cấy chuối MS (1962) có bổ sung 1ppm Thiamin HCl đã làm tăng khả năng tái sinh chồi chuối. Năm 1998, Trần Thế Tục và các cộng sự đã chỉ ra rằng lượng phân bón tính cho 1 gốc chuối trong 1 chu kỳ là 100 – 200 g đạm, 20 – 40 g lân và 250 – 300 g kali. Năm 1999, theo Vũ Công Hậu thì lượng phân bón NPK thích hợp tính cho 1 gốc chuối vụ 1 là 50 – 60 g đạm, 30 – 40 g lân và 70 – 80 g kali. Năm 2009, theo Vũ Ngọc Phượng và cộng sự, cây chuối được nuôi trong điều kiện ánh sáng tự nhiên sẽ sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với nuôi cấy ở điều kiện đèn trong phòng thí nghiệm, cường độ ánh sáng tự nhiên thay đổi liên tục trong ngày từ 500 – 7000 lux, cây chuối sẽ dễ thích nghi hơn so vơi ánh sáng đèn. Năm 2017, Mai Hương Trà đã khảo sát ảnh hưởng của nano bạc trên cây chuối già lùn và tìm ra giải pháp mới nhân giống nhanh, hiệu quả như sau: bổ sung nano bạc ở nồng độ 1 ppm vào môi trường là thích hợp nhất trong giai đoạn nhân chồi in vitro của cây chuối già lùn, bổ sung nano bạc ở nồng độ 3 ppm vào môi trường giúp cây chuối già lùn phát triển tốt ở giai đoạn cây in vitro, đối với cây chuối già lùn con khi trồng trên giá thể xơ dừa ngoài vườn ươm thì nồng độ nano bạc thích hợp là 5 ppm. 1.1.7.2 Nghiên cứu ngoài nước Năm 2003, Ở Đài Loan – Trung Quốc, Lee đã thành công trong vi nhân giống cây chuối Cavendish bằng phương pháp nuôi cấy mô. 15
  26. Năm 2006, Kalimuthu và cộng sự đã nghiên cứu ra môi trường tối ưu để nhân chồi trong nuôi cấy mô chuối là môi trường MS có bổ sung 3,0 mg/l BA và 0,2 mg/l NAA. Năm 1984, Hwang và cộng sự thiết lập hệ vi nhân giống thương mại cho việc sản xuất giống chuối Cavendish vào năm 1983. 1.1.8 Ý nghĩa kinh tế của việc trồng chuối So với nhiều loại cây trồng khác, toàn bộ sản phẩm của cây chuối có thể sử dụng làm lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc, thuốc nhuộm, công nghiệp chế biến thực phẩm, làm rượu, làm mứt Và vì một lý do nào đó trong sản xuất kinh doanh việc sản xuất quả tươi gặp trở ngại thì cũng dễ dàng sử dụng vào những mục đích khác với trang thiết bị yêu cầu không cao như sấy khô, làm bột, ủ chua So với các loại rau quả khác, chuối có chu kỳ kinh tế khá ngắn, mức đầu tư không cao, kỹ thuật không phức tạp. Sau trồng 12 tháng thì thu hoạch buồng thứ nhất, sau đó 8 – 10 tháng thu hoạch buồng thứ 2. Đây là điều quan trọng xét trên góc độ khả năng thu hồi và quay vòng đồng vốn. Theo tính toán kinh tế 1 hecta trồng chuối đem lại giá trị sản phẩm bằng 3,8 ha trồng lúa hoặc 10 ha trồng lạc hoặc 6 ha trồng ớt. 1.1.9 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chuối già lùn ở nước ta Trong chiến lược xuất khẩu hàng nông sản đến năm 2020, Bộ Công Thương có đề cập đến việc xuất khẩu chuối và xem đây là một mặt hàng quan trọng mà Việt Nam có nhiều lợi thế. Theo Đề án quy hoạch phát triển rau quả, hoa và cây cảnh đến năm 2010, tầm nhìn 2020 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, chuối được nhiều địa phương chọn làm cây trồng chủ lực. Thị trường tiêu thụ chuối ở trong và ngoài nước còn đang mở rộng. Các nước nhập khẩu lớn là Mỹ, Canada, cộng đồng kinh tế châu Âu (EC). Một số nước thường xuyên nhập khẩu chuối già lùn của nước ta là Trung Quốc, Ả rập Xê út và Nhật Bản. Theo số liệu của Cục Trồng trọt (Bộ NNPTNT), diện tích chuối chiếm gần 20% diện tích cây trái cả nước (khoảng 123.000 ha), với sản lượng khoảng 1,4 triệu tấn/năm. 16
  27. Trong đó phải kể đến một số địa phương có diện tích trồng chuối lớn như: Vĩnh Long (khoảng 990 ha với sản lượng gần 9.400 tấn), huyện Hướng Hóa (Quảng Trị) trồng hơn 550 ha, tỉnh Hưng Yên trồng gần 600 ha chuối tiêu hồng có doanh thu cao gấp 4 lần so với trồng lúa, Tuy nhiên, hiện mới xuất khẩu được khoảng 3000 – 4000 tấn chuối/năm, tiềm năng để xuất khẩu còn rất lớn. So với một cường quốc xuất khẩu chuối như Philippines, tổng diện tích chuối của Việt Nam không thua kém quá nhiều, nhưng lượng chuối xuất khẩu của Việt Nam (theo thống kê của FAO đến năm 2011) chỉ khoảng 40 nghìn tấn (trên tổng sản lượng hơn 1,4 triệu tấn/năm), trong đó chủ yếu là sang Trung Quốc. Năm 2014, chuối Việt Nam xuất khẩu bất ngờ tăng mạnh, nhờ sức hút khắp thị trường từ châu Á đến châu Âu, tạo cơn sốt chuối trong nước; hàng loạt đơn đặt hàng đến từ Hàn Quốc, Nhật Bản, các nước EU, Nga với nhu cầu hàng trăm tấn chuối/ngày. Theo Bộ Công Thương, trong 10 thị trường xuất khẩu rau quả chính của Việt Nam, Trung Quốc vẫn là thị trường đứng đầu, chiếm 28,6% thị phần, tiếp theo là Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ nhưng với thị phần rất nhỏ lần lượt là 4,74%, 3,76% và 3,44% (Theo Việt Báo ngày 16/09/2015). Hình 1.10. Biểu đồ thống kê thị trường chuối 17
  28. Trong những năm gần đây, chuối nuôi cấy mô được trồng khá phổ biến ở các tỉnh nước ta như Bắc Giang, Bắc Cạn, Cao Bằng, Hưng Yên, Huế, Quảng Nam, Bình Định, Lâm Đồng, Đồng Nai, thành phố Hồ Chí Minh, một số tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long, Các giống chuối cấy mô được trồng phổ biến là giống chuối tiêu hồng (phổ biến ở miền Bắc), giống chuối già lùn (phổ biến ở miền Nam) và chuối Laba (Lâm Đồng). Do dễ thích nghi với nhiều chân đất, ít tốn công chăm sóc, cho hiệu quả kinh tế cao nên thời gian qua chuối già lùn đã trở thành cây trồng chủ lực tại nhiều địa phương ở Quảng Nam. Với gần 3.000 ha đất chuyên canh loại cây trồng này, Quảng Nam được xem là vựa chuối già lùn lớn nhất khu vực miền Trung Tây Nguyên hiện nay. Những năm gần đây, bà con vùng đồng bào dân tộc thiểu số ở huyện miền núi cao Tây Giang, tỉnh Quảng Nam cũng đã chọn chuối già lùn làm cây trồng chính trên những khu đất vườn đồi, vườn rừng. Toàn huyện đã có hơn 35 ha đất chuyên canh loại cây này. Công ty trách nhiệm hữu hạn Quốc tế Anh Vĩ (quận 5, TP HCM) vào Việt Nam để đầu tư trồng chuối già lùn nuôi cấy mô xuất khẩu. Hiện nay, công ty đã đầu tư trồng tại Củ Chi, Sóc Trăng, Long An, và có đầu ra thị trường tương đối ổn định là Trung Quốc, Ả rập Xê út và Nhật Bản, với nhu cầu tiêu thụ mỗi năm 2 triệu thùng/năm (13 kg/thùng) tương đương khoảng 400 ha. Ở Đồng bằng Sông Cửu Long, chuối già lùn được trồng nhiều ở các tỉnh Vĩnh Long, Trà Vinh, Bến Tre, Tiền Giang Chuối không còn "loanh quanh" ở chợ quê mà được chuyển đi tiêu thụ ở TP Hồ Chí Minh, ra Bắc và sang Trung Quốc, Châu Âu. Với giá chuối già tăng ở mức cao, nhiều hộ dân ở Đồng bằng Sông Cửu Long đã có thêm nguồn thu nhập khá cao, góp phần tăng thu nhập kinh tế gia đình, xóa đói giảm nghèo ở địa phương. Cây chuối già lùn đang được trồng nhiều ở thị xã Dĩ An, tỉnh Bình Dương mang lại hiệu quả kinh tế cao cho các hộ trồng giống chuối này. 18
  29. Đặc biệt là giống chuối già lùn Long Tân (xã Long Tân, huyện Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai) rất nổi tiếng và mang lại nguồn thu nhập cao cho nhiều hộ dân ở đây. Và nhiều tỉnh, thành trong cả nước cũng đã mở rộng diện tích trồng chuối (trong đó có chuối già lùn) vì lợi nhuận cao, nhiều hộ nông dân đã trở nên khá giả, giàu có nhờ vào trồng chuối. 1.2 Giới thiệu sơ lược về nuôi cấy mô 1.2.1 Khái niệm nhân giống in vitro Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã xác định. Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy in vitro (trong ống nghiệm) để phân biệt với nuôi cấy trong điều kiên tự nhiên ngoài ống nghiệm. Nhân giống vô tính cây trồng in vitro là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô để nhân giống thực vật. Nhờ áp dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng duy truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất. Hơn nữa dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quý hiếm để phục hồi giống cây trồng. Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm: ₋ Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành ₋ Nuôi cấy các cơ quan: rễ, thân, lá, bao phấn, quả ₋ Nuôi cấy phôi non và cây trưởng thành ₋ Nuôi cấy mô sẹo ₋ Nuôi cấy photoplast (nuôi cấy tế bào trần) ₋ Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào). 19
  30. Hiện nay, phương pháp nuôi cấy mô thực vật không những nhằm phục vụ các nghiên cứu cơ bản trong khoa học, mà còn hướng về những ứng dụng thực tiễn. Các nhà thực vật học đã áp dụng phương pháp này với các mục đích sau: - Tạo một quần thể cây trồng lớn và đồng nhất trong một thời gian ngắn, với diện tích thí nghiệm nhỏ, có điều kiện hóa lý kiểm soát. - Tạo được nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt phấn ) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện được. - Cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học. - Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh. - Bảo quản nguồn gen quý. 1.2.2 Lợi ích của nhân giống in vitro Theo Bùi Bá Bổng (1995) nhân giống in vitro có những ưu điểm sau: ₋ Tạo các cây con đồng nhất và giống cây mẹ. ₋ So với các kiểu nhân giống thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng lớn cây con từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn. ₋ Không chiếm nhiều diện tích. ₋ Có thể cung cấp cây giống bất cứ thời điểm nào vì chủ động được, do không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. ₋ Có thể tạo và nhân được các giống mới bằng kỹ thuật cứu phôi, chuyển gene. ₋ Một số cây quí có thể nhân nhanh để đưa vào sản xuất và việc trao đổi giống được thực hiện dễ dàng. 1.2.3 Khó khăn trong nhân giống in vitro Tuy nhân giống in vitro đạt được những thành tựu to lớn nhưng cạnh đó đã gặp không ít khó khăn, theo Nguyễn Văn Uyển và cộng sự (1984) thì có một số khó khăn sau: ₋ Nhân giống trên môi trường agar thì giá thành sản xuất vẫn còn cao và thời gian nhân giống dài. 20
  31. ₋ Khi sản xuất ở qui mô công nghiệp thì chi phí cho năng lượng và nhân công vẫn còn ở mức cao. ₋ Đôi khi xảy ra biến dị soma trong quá trình nuôi cấy, đặc biệt là tái sinh thông qua mô sẹo. ₋ Giới hạn sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống do cây con tạo ra thường đồng nhất về mặt di truyền. ₋ Quá trình nhân giống phức tạp. 1.2.4 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.4.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật Haberland (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Tính toàn năng của một tế bào cho phép từ những cơ quan, bộ phận của cơ thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh đồng nhất về mặt di truyền với cây mẹ. 1.2.4.2 Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào Phân hóa của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hóa đảm nhiệm các chức năng khác nhau. Phản phân hóa của tế bào là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh để thực hiện chức năng phân chia. Hoạt động của các quá trình này được điều khiển bởi các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, cũng như các yếu tố nhiệt độ, môi trường, ánh sáng 1.2.5 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Theo Dương Công Kiên (2002), có một số phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật như sau: 1.2.5.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Một trong những phương thức sinh trưởng để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên). 21
  32. Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp Từ đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường. 1.2.5.2 Nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của tế bào đã phân hóa. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo. 1.2.5.3 Nuôi cấy tế bào đơn Khi mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối. Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch. Khi môi trường thạch có tỷ lệ cytokinin – auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. 1.2.5.4 Nuôi cấy protoplast Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài. 22
  33. 1.2.5.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo. Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội. 1.2.6 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1902, nhà thông thái Haberlanđt lần đầu tiên đưa ra ý tưởng cấy mô của sinh vật ngoài cơ thể. Tuy nhiên, do tiến hành trên cây họ hòa thảo (cây một lá mầm) một loại cây khó thực hiện nên không thành công. Năm 1922, Kote (học trò Haberlandt) và Robbins (nhà khoa học người Mỹ) đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt và nuôi cấy được đỉnh sinh trưởng tách ra từ đầu rễ của một loại cây thuộc họ hòa thảo tạo ra hệ rễ nhỏ và có cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm lại và ngừng hẳn, mặc dù tác giả đã chuyển sang môi trường mới. Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua (Lycopersicum esculentum). Năm 1937, Gautheret và Nobecout đã tạo ra và duy trì được sự sinh trưởng mô sẹo cây cà rốt trong một thời gian dài trong môi trường thạch cứng. Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy phôi họ cà. Trong thời gian này chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công. Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi. Từ năm 1954 đến năm 1959 kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển, các tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn chỉnh. Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn. Ông đã thành công trong việc chuyển cây non của cây sen cạn từ môi trường nuôi cấy tối thiểu. Tuy nhiên, việc nhân giống cây vẫn chưa hoàn chỉnh. Sau đó nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá ra những thành phần dinh dưỡng quan trọng cần thiết cho sự phát triển của các tế bào được nuôi cấy. 23
  34. Năm 1960 – 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa. Năm 1962, Murashige và Skoong đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay. Năm 1966, Guha và Mahheswari nuôi cấy thành công tế bào đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. Năm 1967, Bougin và Nistsh tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng thương mại hóa. 1.3 Chất điều hoà sinh trưởng thực vật 1.3.1 Salicylic acid (SA) 1.3.1.1 Giới thiệu SA là một chất giống như hormone đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự tăng trưởng và phát triển của thực vật (Raskin,1992). SA còn là một acid monohydroxybenzoic béo, một loại acid phenolic và là một acid beta hydroxyl Ngoài ra nó còn là một acid hữu cơ không màu được sử dụng rộng rãi trong tổng hợp hữu cơ. Nó có nguồn gốc từ sự trao đổi chất của salicin. Ngoài việc giữ vai trò là một chất chuyển hóa có hoạt tính quan trọng của aspirin, mà nó còn hoạt động một phần như là một tiền chất của acid salicylic. Công thức hóa học của SA: C7H6O3 SA là chất đã được sử dụng trên các loài thực vật bậc cao, cho đến nay đã hiện diện trong hơn 34 loài thực vật. Ngoại sinh SA được chứng minh là ảnh hưởng đến nhiều quá trình khác nhau trong thực vật bao gồm đóng khí khổng, nảy mầm hạt, năng suất quả (Cutt và cộng sự, 1992). Tuy nhiên, một số tác động này cũng có 24
  35. thể tạo ra từ các hợp chất phenol khác. Ngoài ra các tác động của SA có thể là do các đặc tính hóa học chung của SA (Raskin, 1992). Chỉ gần đây đã có bằng chứng cho thấy SA có vai trò điều tiết duy nhất và cụ thể nó là chất chống oxy hóa hòa tan trong nước. Bên cạnh đó nó còn giúp kích thích tăng trưởng và phát triển của chồi, rễ ở cái cây đã được xử lý. Hiện nay, nó được coi như là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật quan trọng. 1.3.1.2 Một số nghiên cứu sử dụng SA trên thực vật Sử dụng SA như hormone tăng cường tái tạo in vitro ở thực vật trên các đối tượng: cà phê Arabica (Quiroz-figueroa và cộng sự, 2001); đậu ván dầu adsurgen (Luo và cộng sự, 2001); yến mạch nuda (Hao và cộng sự, 2006). SA còn tác động lên sự hình thành và tăng trưởng rễ. Người ta sử dụng nó như chất ngoại sinh tác động qua rễ tạo khả năng chống chịu đối với các stress phi sinh học bao gồm khả năng: chịu nhôm của cây muồng ngủ (Yang và cộng sự, 2003); chịu cadmium của lúa (Guo và công sự, 2007); chịu mặn của lúa mì (Arfan và cộng sự, 2007); chịu mặn trong cây cà chua (Stevens và cộng sự, 2006). SA sử dụng trên một số đối tượng khác như: đậu nành (Gutierrez-Coronado và cộng sự, 1998); lúa mì (Shakirova và cộng sự, 2003); ngô (Gunes và cộng sự, 2007); Chamomile (Kovacik và cộng sự, 2009) và cây húng chanh (S. Govindaraju và cộng sự, 2016). 1.3.2 Aspirin 1.3.2.1 Giới thiệu Aspirin là một dẫn xuất của SA, có nguồn gốc từ vỏ cây liễu. Aspirin cô đặc thường có mùi như giấm, vì nó có khả năng tự phân tách thành SA và acid acetic. Các dẫn xuất của SA đã được sử dụng làm thuốc từ thời cổ xưa, nó mang một số đặc tính như SA. Bổ sung aspirin như chất làm tăng khả năng miễn dịch, giúp chống dịch hại và tấn công của vi khuẩn. Công thức hóa học của aspirin: C9H8O4 25
  36. 1.3.2.2 Một số nghiên cứu sử dụng aspirin trên thực vật Kỹ sư Hứa Quyết chiến đã từng sử dụng dẫn xuất đó để tạo chế phẩm sử dụng cho một số cây trồng. Tại Đại học Rhode Insland người làm vườn ở đây đã sử dụng aspirin với nồng độ thích hợp cho cây và cho biết rằng cây tăng trưởng nhanh hơn hiệu quả hơn so với cây không được sử dụng. 26
  37. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian thực hiện từ tháng 3/2018 đến tháng 7/2018 tại phòng thí nghiệm tế bào thực vật Viện Sinh học Nhiệt đới. 2.2 Vật liệu 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu Mẫu nuôi cấy ban đầu sử dụng là mô chồi chuối già (Musa acuminata) in vitro được khởi tạo và nhân nhanh tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới. 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất Thiết bị: Tủ cấy vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, máy đo chlorophyll và một số thiết bị khác. Dụng cụ: Kéo, dao cấy, kẹp, đĩa petri, đèn cồn, ống đong, chai thủy tinh, Hóa chất: Cồn 96o, 70o, agar, các hóa chất pha môi trường, aspirin, salicylic acid, 2.2.3 Môi trường nuôi cấy Các mẫu chồi cây chuối già lùn in vitro được nhân nhanh trong môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung 0,1 mg/l NAA, 10% (v/v) nước dừa, 30 g/l sucrose, 0,5 g/l than hoạt tính và 8 g/l agar. Tùy thuộc từng nội dung thí nghiệm mà bổ sung salicylic acid và aspirin riêng lẻ ở các nồng độ khác nhau. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh về pH = 5,7 – 5,8, sau đó được hấp khử trùng ở 1 atm (121oC) trong 20 phút. 27
  38. Hình 2.1. Môi trường nuôi cấy trước khi hấp khử trùng Hình 2.2. Môi trường nuôi cấy sau khi hấp khử trùng 28
  39. 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid ở nồng độ cao lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro  Mục đích: Xác định ảnh hưởng của SA ở nồng độ cao lên sự phát triển của chồi cây chuối già lùn (Musa acuminata) in vitro.  Cách thực hiện: Mô chồi chuối già lùn in vitro được cấy vào môi trường. Môi trường được bổ sung thêm SA ở các nồng độ cao khác nhau. Quan sát, ghi nhận kết quả sau 4 tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức cấy 7 mẫu. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng các nồng độ cao của SA lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) in vitro Nghiệm thức Nồng độ SA (mg/l) A0 0 A1 1 A2 2 A3 3  Chỉ tiêu theo dõi: ₋ Trọng lượng tươi (g) ₋ Trọng lượng khô (g) ₋ Chiều cao cây (cm) ₋ Số rễ (rễ) ₋ Số lá (lá) ₋ Hàm lượng chlorophyll (µg/ml). 29
  40. 2.3.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của aspirin ở nồng độ cao lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro  Mục đích: Xác định ảnh hưởng của aspirin ở nồng độ cao lên sự phát triển của chồi cây chuối già lùn (Musa acuminata) in vitro.  Cách thực hiện: Mô chồi chuối già lùn in vitro được cấy vào môi trường. Môi trường được bổ sung thêm aspirin ở các nồng độ cao khác nhau. Quan sát, ghi nhận kết quả sau 4 tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức cấy 7 mẫu. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng các nồng độ cao của aspirin lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) in vitro Nghiệm thức Nồng độ aspirin (mg/l) B0 0 B1 1 B2 2 B3 3  Chỉ tiêu theo dõi: ₋ Trọng lượng tươi (g) ₋ Trọng lượng khô (g) ₋ Chiều cao cây (cm) ₋ Số rễ (rễ) ₋ Số lá (lá) ₋ Hàm lượng chlorophyll (µg/ml).  Sau khi tiến hành Nội dung 1 và Nội dung 2, kết quả được đánh giá và nhận xét: Quan sát thấy tác động của SA và Aspirin ở các mức nồng độ giống nhau. Chồi phát triển tốt nhất ở khoảng nồng độ 0 – 1 mg/l, trên mức này chồi bị ức chế phát triển.  Nghiên cứu SA và aspirin ở nồng độ thấp hơn. 30
  41. 2.3.3 Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid ở nồng độ thấp lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro  Mục đích: Xác định ảnh hưởng của SA ở nồng độ thấp lên sự phát triển của chồi cây chuối già lùn (Musa acuminata) in vitro.  Cách thực hiện: Mô chồi chuối già lùn in vitro được cấy vào môi trường. Môi trường được bổ sung thêm SA ở các nồng độ thấp khác nhau. Quan sát, ghi nhận kết quả sau 4 tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức cấy 7 mẫu. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng các nồng độ thấp của SA lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) in vitro Nghiệm thức Nồng độ SA (mg/l) C0 0,0 C1 0,2 C2 0,4 C3 0,6 C4 0,8 C5 1,0  Chỉ tiêu theo dõi: ₋ Trọng lượng tươi (g) ₋ Trọng lượng khô (g) ₋ Chiều cao cây (cm) ₋ Số rễ (rễ) ₋ Số lá (lá) ₋ Hàm lượng chlorophyll (µg/ml). 31
  42. 2.3.4 Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng của aspirin ở nồng độ thấp lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro  Mục đích: Xác định ảnh hưởng của aspirin ở nồng độ thấp lên sự phát triển của chồi cây chuối già lùn (Musa acuminata) in vitro.  Cách thực hiện: Mô chồi chuối già lùn in vitro được cấy vào môi trường. Môi trường được bổ sung thêm aspirin ở các nồng độ thấp khác nhau. Quan sát, ghi nhận kết quả sau 4 tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức cấy 7 mẫu. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng các nồng độ thấp của aspirin lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) in vitro Nghiệm thức Nồng độ aspirin (mg/l) D0 0,0 D1 0,2 D2 0,4 D3 0,6 D4 0,8 D5 1,0  Chỉ tiêu theo dõi: ₋ Trọng lượng tươi (g) ₋ Trọng lượng khô (g) ₋ Chiều cao cây (cm) ₋ Số rễ (rễ) ₋ Số lá (lá) ₋ Hàm lượng chlorophyll (µg/ml). 2.4 Phương pháp thu nhận số liệu ₋ Trọng lượng tươi (g): Được xác định bằng cách cân khối lượng tươi của mẫu. 32
  43. ₋ Trọng lượng khô (g): Được xác định bằng cách sấy khô mẫu cấy ở 55oC trong 48 giờ, cân xác định khối lượng M1. Tiếp tục sấy mẫu ở cùng điều kiện, cân xác định khối lượng M2. Sai số của 2 lần cân liên tiếp là 0.05% xem như khối lượng khô không đổi. Giá trị cân được cuối cùng là khối lượng khô của mẫu. ₋ Chiều cao cây (cm): Được xác định bằng cách dùng thước đo khoảng cách bắt đầu từ phần trên rễ lên đến đoạn rẽ giữa lá chính và lá phụ gần nhất. ₋ Số rễ (rễ): Được xác định bằng cách đếm trực tiếp số rễ trên cây. ₋ Số lá (lá): Được xác định bằng cách đếm trực tiếp số rễ trên cây. ₋ Hàm lượng chlorophyll (µg/ml): Được xác định bằng cách đo trực tiếp bằng thiết bị đo chlorophyll cầm tay CL-01 (Hansatech) tại Viện Sinh học Nhiệt đới Hình 2.3. Phương pháp thu nhận chỉ tiêu về trọng lượng cây a) Cân mẫu tươi; b) Sấy mẫu bằng tủ sấy; c) Mẫu sau khi sấy khô; d) Cân mẫu khô. 33
  44. Hình 2.4. Thiết bị đo chlorophyll cầm tay 2.5 Phân tích và xử lý số liệu Các thí nghiệm đều được bố trí theo kiểu thí nghiệm đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên. Số liệu được ghi nhận và xử lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV, trắc nghiệm phân hạng các hình nghiệm thức bằng LSD với độ tin cậy 95%. Số liệu được trình bày bằng biểu đồ trong Microsoft Excel 2010. 34
  45. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid ở nồng độ cao lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro Mô chồi chuối già lùn (Musa acuminata) in vitro được cắt thành từng đoạn có kích thước khoảng 1,5 cm và trọng lượng 0,2 ± 0,05 g và nuôi cấy trong môi trường có bổ sung salicylic acid ở các nồng độ khác nhau (0; 1; 2; 3 mg/l). Các chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy. Quan sát trong 4 tuần, nhận thấy ở tuần đầu tiên mẫu cấy chưa có sự khác biệt, từ tuần thứ 2 trở đi các mẫu cấy bắt đầu phát triển và tăng trưởng theo thời gian. Sau thời gian 4 tuần thí nghiệm, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt về hình thái, kết quả thí nghiệm thu được và thể hiện ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của SA nồng độ cao (0; 1; 2; 3 mg/l) lên sự tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) sau 4 tuần nuôi cấy Trọng Trọng Hàm lượng Nghiệm Chiều cao Số lá Số rễ lượng tươi lượng khô chlorophyll thức (cm) (lá) (rễ) (g) (g) (µg/ml) A0 (ĐC) 2,032ns 0,119ns 4,2a 3,52ns 8,12b 5,40 A1 1,687 0,099 4,3a 3,19 7,14b 5,45 A2 1,935 0,111 3,6ab 3,23 10,29ab 5,84 A3 2,128 0,112 3,2b 3,14 11,90a 4,59 Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%; ns: không có sự sai khác trong thống kê. Kết quả thống kê cho thấy, các chỉ tiêu sinh trưởng về trọng lượng của cây chuối già lùn nuôi cấy in vitro trong môi trường có bổ sung salicylic acid (SA) ở các nồng độ 0 – 3 mg/l không có sự khác biệt rõ rệt. Tuy nhiên, khi xét về chiều cao cây thì ở nghiệm thức bổ sung 0 – 1 mg/l SA thu được kết quả tốt nhất, với chiều cao ghi nhận được là 4,2 – 4,3 cm. Sự tăng dần nồng độ SA bổ sung vào môi trường nuôi cấy làm giảm khả năng phát triển chiều cao cây, với số liệu thấp nhất thu được 35
  46. là 3,2 cm ở nghiệm thức bổ sung 3 mg/l SA (Biểu đồ 3.1). Ở chỉ tiêu số rễ cây lại cho kết quả ngược lại. Cụ thể là khi tăng dần nồng độ bổ sung SA, số rễ phát sinh nhiều nhất đạt 12 rễ/cây trong môi trường nuôi cấy có chứa 3 mg/l SA (Biểu đồ 3.2). Ở chỉ tiêu số lá có tương đối đồng đều trên các bình nghiệm thức (3 – 4 lá/mẫu). Các nghiệm thức đều cho thấy cây con phát sinh từ chồi nuôi cấy in vitro có khả năng tổng hợp sắc tố. Bảng 3.1 và Biểu đồ 3.3 cho thấy, hàm lượng chlorophyll đo được có sự tăng dần khi bổ sung SA từ 0 – 2 mg/l vào môi trường nuôi cấy, sau đó có sự giảm nhẹ. Tác động của SA lên các đối tượng khác nhau là khác nhau. Võ Hồng Lê (2018) khi khảo sát ảnh hưởng của SA lên sự tăng trưởng và phát triển của cây lan gấm (Anoectochilus roxburghii) đã ghi nhận rằng, trong môi trường có mặt 1 – 2 mg/l SA, cây đạt chiều cao tốt nhất so với các nghiệm thức khác, với số liệu ghi nhận là 7,486 – 8,377 cm. Ở thí nghiệm này, do kết quả ghi nhận được ở nồng độ 0 – 1 mg/l SA bổ sung cây có sự phát triển tốt, cho nên tiếp tục tiến hành khảo sát ở các nồng độ thấp hơn (0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/l) nhằm tìm ra nồng độ thích hợp cho sự phát triển của chồi cây chuối già lùn nuôi cấy in vitro. Chiều cao (cm) 5 4 3 Chiều cao (cm) 2 1 0 A0 (ĐC) A1 A2 A3 Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của SA nồng độ cao lên chiều cao của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 36
  47. Số rễ (rễ) 14 12 10 8 6 Số rễ (rễ) 4 2 0 A0 (ĐC) A1 A2 A3 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của SA nồng độ cao lên số rễ của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 7 6 5 4 Số lá (lá) 3 Hàm lượng chlorophyll (µg/ml) 2 1 0 A0 (ĐC) A1 A2 A3 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của SA nồng độ cao lên số lá và hàm lượng chlorophyll của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 37
  48. Hình 3.1. Ảnh hưởng của salicylic acid ở nồng độ cao lên sự phát triển của cây chuối già lùn nuôi cấy in vitro (0 3 mg/l: từ trái qua phải) 3.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của aspirin ở nồng độ cao lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro Mô chồi chuối già lùn (Musa acuminata) in vitro được cắt thành từng đoạn có kích thước khoảng 1,5 cm và trọng lượng 0,2 ± 0,05 g và nuôi cấy trong môi trường có bổ sung aspirin ở các nồng độ khác nhau (0; 1; 2; 3 mg/l). Các chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy. Quan sát trong 4 tuần, nhận thấy ở tuần đầu tiên mẫu cấy chưa có sự khác biệt, từ tuần thứ 2 trở đi các mẫu cấy bắt đầu phát triển và tăng trưởng theo thời gian. Sau thời gian 4 tuần thí nghiệm, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt về hình thái, kết quả thí nghiệm thu được và thể hiện ở Bảng 3.2. 38
  49. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của aspirin nồng độ cao (0; 1; 2; 3 mg/l) lên sự tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) sau 4 tuần nuôi cấy Trọng Trọng Hàm lượng Nghiệm Chiều cao Số lá Số rễ lượng tươi lượng khô chlorophyll thức (cm) (lá) (rễ) (g) (g) (µg/ml) B0 (ĐC) 2,063ns 0,087a 4,3a 2,95ns 8,57ns 4,58 B1 2,101 0,089a 4,4a 3,09 7,00 4,10 B2 1,782 0,081ab 3,7ab 2,71 9,05 4,32 B3 1,689 0,078b 3,5b 2,57 6,33 4,83 Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%; ns: không có sự sai khác trong thống kê. Từ kết quả cho thấy không có sự khác biệt rõ rệt giữa các nồng độ của aspirin ở nồng độ cao (0; 1; 2; 3 mg/l). Tuy nhiên nhìn chung ở chỉ tiêu chiều cao thì aspirin ở nồng độ cao tác động tương đối giống SA ở nồng độ cao. Cây phát triển tốt nhất ở khi bổ sung aspirin ở nồng độ 0 – 1 mg/l (đạt chiều cao cây 4,3 – 4,4 cm) và có xu hướng giảm dần khi tăng nồng độ (Biểu đồ 3.4). Trọng lương tươi, trọng lượng khô có xu hướng giảm nhẹ khi tăng nồng độ (Biểu đồ 3.5). Số lá, số rễ ở nghiệm thức này không đồng đều. Hàm lượng chlorophyll đo được ở các nghiệm thức của thí nghiệm này không có sự chênh lệch đáng kể, tuy nhiên có sự thấp hơn khi so sánh với hàm lượng chlorophyll đo được ở các nghiệm thức của nội dung 1. Từ các ghi nhận trên, tiếp tục đánh giá tác động của aspirin ở khoảng nồng độ 0,0 – 1,0 mg/l nhằm tìm ra nồng độ aspirin phù hợp với sự sinh trưởng và phát triển của chồi cây chuối già lùn nuôi cấy in vitro. 39
  50. Chiều cao (cm) 5 4.5 4 3.5 3 2.5 Chiều cao (cm) 2 1.5 1 0.5 0 B0 (ĐC) B1 B2 B3 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của aspirin nồng độ cao lên chiều cao của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 2.5 2 1.5 Trọng lượng tươi (g) 1 Trọng lượng khô (g) 0.5 0 B0 (ĐC) B1 B2 B3 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của aspirin nồng độ cao lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 40
  51. 6 5 4 Số lá (lá) 3 Hàm lượng chlorophyll 2 (µg/ml) 1 0 B0 (ĐC) B1 B2 B3 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của aspirin nồng độ cao lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy Hình 3.2. Ảnh hưởng của aspirin ở nồng độ cao lên sự phát triển của cây chuối già lùn nuôi cấy in vitro (0 3 mg/l: từ trái qua phải) 41
  52. 3.3 Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid ở nồng độ thấp lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro Mô chồi chuối già lùn (Musa acuminata) in vitro được cắt thành từng đoạn có kích thước khoảng 1,5 cm và trọng lượng 0,2 ± 0,05 g và nuôi cấy trong môi trường có bổ sung thêm SA ở các nồng độ khác nhau (0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/l). Các chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy. Quan sát trong 4 tuần, nhận thấy ở tuần đầu tiên mẫu cấy chưa có sự khác biệt, từ tuần thứ 2 trở đi các mẫu cấy bắt đầu phát triển và tăng trưởng theo thời gian. Sau thời gian 4 tuần thí nghiệm, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt về hình thái, kết quả thí nghiệm thu được và thể hiện ở Bảng 3.3. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của salicylic acid nồng độ thấp (0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/l) lên sự tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) sau 4 tuần nuôi cấy Trọng Trọng Hàm lượng Nghiệm Chiều cao Số lá Số rễ lượng tươi lượng khô chlorophyll thức (cm) (lá) (rễ) (g) (g) (µg/ml) C0 (ĐC) 2,106ns 0,088ns 4,1c 2,81ab 6,95ns 3,52 C1 1,826 0,077 4,3bc 2,86ab 7,33 3,40 C2 2,265 0,093 4,6b 3,24a 9,95 4,25 C3 2,228 0,096 4,6b 2,57b 8,24 4,33 C4 2,144 0,091 5,2a 3,05ab 8,66 3,91 C5 2,256 0,094 4,2c 2,90ab 8,11 3,83 Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%; ns: không có sự sai khác trong thống kê. Kết quả ghi nhận ở Bảng 3.3 cho thấy, các chỉ tiêu về trọng lượng tươi và trọng lượng khô không có sự khác biệt thống kê rõ rệt giữa các nghiệm thức. Số lá và số rễ có sự tương đồng nhau. Tuy nhiên, lại có sự khác biệt rõ ràng giữa các nghiệm thức ở chỉ tiêu chiều cao cây chuối già lùn Musa acuminata khi nuôi cấy 42
  53. trong môi trường có bổ sung SA nồng độ thấp (0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/l). Cụ thể là, từ nồng độ 0 – 0,8 mg/l SA bổ sung, chiều cao cây có sự tăng dần (từ 4,1 – 5,2 cm), trong đó, nồng độ 0,4 – 0,6 mg/l có tác động tương tự nhau (4,6 cm). Cây phát triển tốt nhất ở nồng độ SA bổ sung là 0,8 mg/l với chiều cao cây đạt 5,2 cm, cao hơn mẫu trong bình đối chứng (với số liệu ghi nhận đạt 4,1 cm) (Bảng 3.3), sau đó giảm dần khi tăng dần nồng độ SA bổ sung lên 1,0 mg/l (4,2 cm). Hàm lượng chlorophyll đo được ở nội dung này có sự thấp hơn so với ở nội dung sử dụng salicylic acid ở nồng độ cao. Sự sai số này xảy ra có thể là do quá trình vận chuyển và cách thức thu nhận mẫu. Kết quả thu được từ nội dung này cũng tương tự với kết quả của Govindaraju và cộng sự (2016) trên đối tượng cây húng chanh, với ghi nhận sự tăng trưởng cây đạt tốt nhất trong môi trường có bổ sung 0,8 mg/l SA. Chiều cao (cm) 6 5 4 3 Chiều cao (cm) 2 1 0 C0 (ĐC) C1 C2 C3 C4 C5 Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của SA nồng độ thấp lên chiều cao của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 43
  54. Số rễ (rễ) 12 10 8 6 Số rễ (rễ) 4 2 0 C0 (ĐC) C1 C2 C3 C4 C5 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của SA nồng độ thấp lên số rễ của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy Hình 3.3. Ảnh hưởng của salicylic acid ở nồng độ thấp lên sự phát triển của cây chuối già lùn nuôi cấy in vitro (0 1 mg/l: từ trái qua phải) 44
  55. 3.4 Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng của aspirin ở nồng độ thấp lên khả năng tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) trong điều kiện in vitro Mô chồi chuối già lùn (Musa acuminata) in vitro được cắt thành từng đoạn có kích thước khoảng 1,5 cm và trọng lượng 0,2 ± 0,05 g và nuôi cấy trong môi trường có bổ sung thêm aspirin ở các nồng độ khác nhau (0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/l). Các chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy. Quan sát trong 4 tuần, nhận thấy ở tuần đầu tiên mẫu cấy chưa có sự khác biệt, từ tuần thứ 2 trở đi các mẫu cấy bắt đầu phát triển và tăng trưởng theo thời gian. Sau thời gian 4 tuần thí nghiệm, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt về hình thái, kết quả thí nghiệm thu được và thể hiện ở Bảng 3.4. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của aspirin nồng độ thấp (0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/l) lên sự tăng trưởng của cây chuối già lùn (Musa acuminata) sau 4 tuần nuôi cấy Trọng Trọng Hàm lượng Nghiệm Chiều cao Số lá Số rễ lượng tươi lượng khô chlorophyll thức (cm) (lá) (rễ) (g) (g) (µg/ml) D0 (ĐC) 2,849ns 0,113ns 3,9b 2,62ns 10,57ns 6,21 D1 2,878 0,110 4,3b 2,33 10,33 5,46 D2 2,193 0,094 4,4b 2,71 9,00 6,88 D3 2,757 0,106 4,6ab 2,57 11,19 6,11 D4 2,449 0,103 5,4a 2,90 9,91 6,20 D5 2,293 0,101 4,1b 2,95 10,62 5,68 Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%; ns: không có sự sai khác trong thống kê. Kết quả cho thấy, chỉ tiêu chiều cao cây của chuối già lùn Musa acuminata khi bổ sung aspirin nồng độ thấp (0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/l) cho sự phát triển tốt nhất ở nồng độ sử dụng là 0,8 mg/l, với chiều cao cây đạt được là 5,4 cm, cao hơn mẫu đối chứng 1,5 cm (Bảng 3.4). Ở nghiệm thức đối chứng, cây cao 3,9 cm và có sự tăng dần theo chiều tăng nồng độ cho đến giá trị nồng độ tốt nhất là 0,8 45
  56. mg/l aspirin. Sau đó, chiều cao cây bắt đầu giảm khi nồng độ aspirin tăng lên 1,0 mg/l (4,1 cm). Bên cạnh đó, nhìn chung, số trung bình rễ ở thí nghiệm này được ghi nhận là cao hơn so với các nghiệm thức trước, với số rễ trung bình khoảng 10 rễ/mẫu ở các nghiệm thức. Số lá không có sự khác biệt so với các nội dung trước, với số lá trung bình thu dược là 3 lá/mẫu. Tuy nhiên, hàm lượng lượng chlorophyll ghi nhận được ở các nghiệm thức bổ sung aspirin ở nồng độ thấp cao hơn hẳn so với ở nội dung thí nghiệm bổ sung SA nồng độ thấp. Chiều cao (cm) 6 5 4 3 Chiều cao (cm) 2 1 0 D0 D1 D2 D3 D4 D5 Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của aspirin nồng độ thấp lên chiều cao của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 46
  57. Số rễ (rễ) 12 10 8 6 Số rễ (rễ) 4 2 0 D0 (ĐC) D1 D2 D3 D4 D5 Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng của aspirin nồng độ thấp lên số rễ của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 8 7 6 5 Số lá (lá) 4 3 Hàm lượng chlorophyll (µg/ml) 2 1 0 D0 D1 D2 D3 D4 D5 (ĐC) Biểu đồ 3.11. Ảnh hưởng của aspirin nồng độ thấp lên số lá và hàm lượng chlorophyll của cây chuối già lùn Musa acuminata sau 4 tuần nuôi cấy 47
  58. Hình 3.4. Ảnh hưởng của aspirin ở nồng độ thấp lên sự phát triển của cây chuối già lùn nuôi cấy in vitro (0 1 mg/l: từ trái qua phải) 48
  59. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Một số kết luận được rút ra từ các thí nghiệm trên như sau: Salicylic acid và aspirin có tác động gần như tương tự nhau lên sự phát triển của cây chuối già lùn được tạo từ mẫu chồi. Nồng độ thích hợp nhất của salicylic acid và aspirin bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm hỗ trợ cho sự tăng trưởng của cây chuối già lùn Musa acuminata là 0,8 mg/l, với số liệu ghi nhận về chỉ tiêu chiều cao là 5,2 cm và 5,4 cm tương ứng. Khi tăng dần nồng độ salicylic acid và aspirin bổ sung trên 1 mg/l đến 3 mg/l (theo các nội dung nghiên cứu), nhận thấy cây có sự tăng trưởng chậm. 4.2 Kiến nghị Do thời gian thực hiện để tài có giới hạn, một số kiến nghị được đưa ra như sau: ₋ Khảo sát ảnh hưởng của SA và aspirin trong giai đoạn phát triển chồi của cây chuối già lùn Musa acuminata. ₋ Khảo sát ảnh hưởng của SA và aspirin trong giai đoạn ra vườn ươm của cây chuối già lùn Musa acuminata. 49
  60. TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tài liệu tiếng Việt 1. Bùi Bá Bổng (1995). Nhân giống cây bằng nuôi cấy mô. Sở khoa học công nghệ môi trường An Giang. 2. Bùi Trang Việt (2000). Sinh lý thực vật đại cương, Phần II: Phát triển. NXB Đại học Quốc gia TP HCM. 3. Bùi Trang Việt (2002). Sinh lý thực vật đại cương. Phần I: Dinh dưỡng. NXB Đại học Quốc GiaTP HCM. 4. Dương Công Kiên (2003). Nuôi cấy mô thực vật (II). NXB TP HCM. 5. Dương Tấn Nhựt (2011). Công nghệ sinh học thực vật: Nghiên cứu cơ bản và ứng dụng, NXB Nông nghiệp, 536. 6. Đoàn Thị Ái Thuyền, Nguyễn Thị Quỳnh, Trần Văn Minh, Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Văn Uyển (1993). Nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống cây trồng,NXB Nông Nghiệp, TP HCM. 7. Nguyễn Bảo Toàn (2005). Giáo trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Trường Đại học Cần Thơ. 8. Nguyễn Duy Trang, Lê Đình Danh (1988). Một số kết quả nghiên cứu bước đầu về cây chuối. Tuyển tập công trình nghiên cứu cây Công nghiệp – Cây ăn quả. NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 184 196. 9. Nguyễn Đức Thành (2000). Nuôi cấy mô tế bào thực vật – nghiên cứu và ứng dụng. NXB Nông nghiệp. 10. Nguyễn Minh Chơn (2004), Vai trò chất điều hòa sinh trưởng và phát triển của thực vật, Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực vật. NXB Đại học Cần Thơ. 11. Nguyễn Văn Nghiêm, Nguyễn Thị Thanh và cộng sự (2010). Kết quả nghiên cứu và đề xuất các giải pháp khoa học công nghệ và kinh tế thị trường phát triển sản xuất chuối tiêu xuất khẩu ở Việt Nam. Báo cáo tổng kết đề tài thuộc chương trình KC06/06 10 giai đoạn 2006 2010. 50
  61. 12. Nguyễn Văn Uyển, Đoàn Thị Ái Thuyền, Phan Xuân Thanh (1984). Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống cây trồng. NXB TP HCM. 13. Nguyễn Văn Uyển (1993). Nuôi cấy mô tế bào thực vật phục vụ công tác giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, 234. 14. Nguyễn Xuân Thụ, Lê Thị Lan Oanh, Hồ Hữu Nhị (2003), Nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các giống chuối thuộc nhóm AAA-Cavendish Việt Nam bằng chỉ thị isozyme, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, pp. 481 484. 15. Võ Hồng Lê (2018). Nghiên cứu sự ảnh hưởng của acid salicylic và aspirin lên sự tăng trưởng của cây lan gấm (Anoectochilus roxburghii) trong điều kiện in vitro, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Công nghệ, TP HCM. 16. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2008). Sinh lý học thực vật, NXB Giáo dục. 17. Trần Văn Minh (2007). Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Giáo trình, Đại học Huế. 18. Trần Văn Minh (2013). Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Giáo trình, Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh. 19. Trần Thanh Hương và Bùi Trang Việt (2003), Sự tăng trưởng của dịch treo tế bào chuối Cau mẵn (Musa paradisiaca L.), Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, NXB KHKT, pp. 326 329. 20. Trần Thanh Hương và Bùi Trang Việt (2003), Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sự tăng trưởng của tế bào chuối Cau mẵn (Musa paradisiaca L.) được nuôi cấy trong môi trường lỏng, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, NXB KHKT, pp. 766 770. 21. Trần Thanh Hương (2011), Phân tích các biến đổi hình thái học và sinh lý học trong các quá trình phát sinh cơ quan và phôi thế hệ ở một số giống chuối (Musa sp.), Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, TP HCM. 51
  62. B. Tài liệu tiếng Anh 22. Angiosperm Phylogeny group. An update of the Angiosperm Phylogeny group classification for the orders and families of flowering plants, Botanical journal of the Linnean society 2003, vol 141, 399 – 436. 23. Cohen J. I, Chambers J. A (1990). Biotechnology and Biosafety: Perspecyive of an international donor agency. In rich asessment in genetic engineering: Envitromental release of organisms, New York. 24. Gomez Kosky. R (2000). Somatic embryogenesis in liquid media. Maturation and enhancement of germination of the hybrid cultivar FHIA – 18 (AAAB), International network for the improvement of banana and plantain, vol 9, no. 1, pp. 12 – 16. 25. Govindaraju. S, Indra Arulselvi. P (2016). Effect of cytokinnin combined elicitors (L-phenylalanine, salicylic acid and chitosan) on in vitro propagation, secondary metabolites and molecular characterization of medicinal herb – Coleus aromaticus Benth (L), Journal of the saudi society of Agricultural sciences, India. 26. Gutierrez Coronado. M. A and Lar-que-Saavedra. A (1998), “Effects of salicylic acid on the growth of roots and shoots in soybean”, Plant physiology and biochemistry, Vol. 36, No. 8, pp. 563 565. 27. Haicour. R. B. T. Viet, D. Dhed'a, A. Assani, F. Bakry, F.X. Cote (1998). Banana improvement through biotechnology-ensuring food security in the 21st century, vol 7, No. 6. 28. Hwang, S. C, Chen C. L., Lin. J. C and Lin H. L (1984). Cultivation of banana using plantlets from meristem culture. 29. Kalimuthu. K, Saravenakumar. M and Senthikumar. R (2007). In vitro micropropagation of Musa sapientum L. (Cavendish Drarf). African journal of biotechnology. 30. Lee. S. W (2003). Microproagation of Cavendish banana in Taiwan. 31. Persley, Gabrielle J và Pamela George (1996), Banana improvement research challenges and opportunities, Environmentally sustainable 52
  63. development agricultural research and extension group series banana improvement. 32. Sanaa. Z. A. M, Ibrahim.S.L and Sharal. E. H. A (2001), “The Effect α-Naphthaline Acetic Acid (NAA), Salicylic Acid (SA) and Their Comninations on growth, fruit setting. Yield and some correlate Components in dry bean (Phaseolus vulgaris L.)”, Annals of agricultural science, Ain shams university, Cairo, Vol. 46, No. 2, pp. 451 463. 33. Sakhanokho. H. F and Kelley. R. Y (2009), “Influence of salicylic acid on in vitro propagation and salt tolerance in Hibiscus acetosella and Hibiscus moscheutos (cv ‘Luna Red’)”, African journal of biotechnology, Vol. 8, No. 8, pp. 1474 1481. 34. Simmond, N. W (1962). The evaluation of banana. Longman, LonDon. 35. Smith and Hamill (1993). Proceedings of the first international symposium on banana in the suctropics. 36. Strosse. H, Schoofs H, Panis B, Reyniers K, Swennen R (2006). Development of embryogenic cell suspensions from shoot meristematic tissue in bananas and platains (Musa spp.), plant sci 170, 104 – 110. 53
  64. PHỤ LỤC PHỤ LỤC A. Thành phần cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) Thành phần Nồng độ (mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 Khoáng đa lượng CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 KI 0,83 H3BO3 6,2 MnSO4.2H2O 22,3 Khoáng vi lượng ZnSO4.7H2O 8,6 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.7H2O 0,025 Na2EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Glycine 2,0 Pyridoxine HCl 0,5 Vitamin Myo-inositol 100 Nicotinicacid (PP) 0,5 Thiamine HCl (vitamine B1) 0,1 1
  65. PHỤ LỤC B. Thống kê xử lý số liệu bằng chương trình Statgraphics Centurion XV Thí nghiệm 1. Số liệu thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của SA ở nồng độ cao lên sự tăng trưởng của cây chuối già lùn Musa acuminata Bảng ANOVA trọng lượng tươi (g) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ cao. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.322819 3 0.107606 0.86 0.4999 Within groups 1.0007 8 0.125088 Total (Corr.) 1.32352 11 Bảng trắc nghiệm phân hạng trọng lượng tươi cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ cao. Bảng 3.1. NT Count Mean Homogeneous Groups S1 3 1.68733 X S2 3 1.935 X S0 3 2.03233 X S3 3 2.128 X Bảng ANOVA trọng lượng khô (g) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ cao. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.000594917 3 0.000198306 0.44 0.7327 Within groups 0.00363133 8 0.000453917 Total (Corr.) 0.00422625 11 Bảng trắc nghiệm phân hạng trọng lượng khô cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ cao. Bảng 3.1. NT Count Mean Homogeneous Groups S1 3 0.0993333 X S2 3 0.111 X S3 3 0.111667 X S0 3 0.119 X Bảng ANOVA chiều cao (cm) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ cao. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2.53667 3 0.845556 6.26 0.0171 Within groups 1.08 8 0.135 Total (Corr.) 3.61667 11 2
  66. Bảng trắc nghiệm phân hạng chiều cao cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ cao. Bảng 3.1. NT Count Mean Homogeneous Groups S3 3 3.16667 X S2 3 3.6 XX S1 3 4.23333 X S0 3 4.26667 X Bảng ANOVA số lá (lá) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ cao. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.264067 3 0.0880222 0.54 0.6682 Within groups 1.3044 8 0.16305 Total (Corr.) 1.56847 11 Bảng trắc nghiệm phân hạng số lá của cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ cao. Bảng 3.1. NT Count Mean Homogeneous Groups S3 3 3.14 X S1 3 3.19333 X S2 3 3.23667 X S0 3 3.52333 X Bảng ANOVA số rễ (rễ) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ cao. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 41.4046 3 13.8015 4.80 0.0337 Within groups 22.9834 8 2.87293 Total (Corr.) 64.388 11 Bảng trắc nghiệm phân hạng số rễ của cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ cao. Bảng 3.1. NT Count Mean Homogeneous Groups S1 3 7.14 X S0 3 8.11667 X S2 3 10.2867 XX S3 3 11.9033 X 3
  67. Thí nghiệm 2. Số liệu thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của aspirin ở nồng độ cao lên sự tăng trưởng của cây chuối gìa lùn Musa acuminata Bảng ANOVA trọng lượng tươi (g) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ cao. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.375272 3 0.125091 2.37 0.1460 Within groups 0.421463 8 0.0526829 Total (Corr.) 0.796735 11 Bảng trắc nghiệm phân hạng trọng lượng tươi của cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ cao. Bảng 3.2. NT Count Mean Homogeneous Groups A3 3 1.68933 X A2 3 1.782 X A0 3 2.063 X A1 3 2.10133 X Bảng ANOVA trọng lượng khô (g) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ cao. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.00025025 3 0.0000834167 3.33 0.0773 Within groups 0.000200667 8 0.0000250833 Total (Corr.) 0.000450917 11 Bảng trắc nghiệm phân hạng trọng lượng khô của cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ cao. Bảng 3.2. NT Count Mean Homogeneous Groups A3 3 0.0776667 X A2 3 0.0806667 XX A0 3 0.0873333 X A1 3 0.0886667 X Bảng ANOVA chiều cao (cm) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ cao. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.53667 3 0.512222 4.36 0.0426 Within groups 0.94 8 0.1175 Total (Corr.) 2.47667 11 Bảng trắc nghiệm phân hạng chiều cao của cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ cao. Bảng 3.2. NT Count Mean Homogeneous Groups A3 3 3.53333 X A2 3 3.73333 XX A0 3 4.3 X A1 3 4.36667 X 4
  68. Bảng ANOVA số lá (lá) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ cao. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.5025 3 0.1675 1.32 0.3348 Within groups 1.01807 8 0.127258 Total (Corr.) 1.52057 11 Bảng trắc nghiệm phân hạng số lá của cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ cao. Bảng 3.2. NT Count Mean Homogeneous Groups A3 3 2.56667 X A2 3 2.71333 X A0 3 2.95333 X A1 3 3.09333 X Bảng ANOVA số rễ (rễ) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ cao. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 14.7844 3 4.92812 0.57 0.6501 Within groups 69.1288 8 8.6411 Total (Corr.) 83.9132 11 Bảng trắc nghiệm phân hạng số rễ của cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ cao. Bảng 3.2. NT Count Mean Homogeneous Groups A3 3 6.33333 X A1 3 7.0 X A0 3 8.57333 X A2 3 9.04667 X Thí nghiệm 3. Số liệu thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của SA ở nồng độ thấp lên sự tăng trưởng của cây chuối gìa lùn Musa acuminata Bảng ANOVA trọng lượng tươi (g) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ thấp. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.408672 5 0.0817343 1.19 0.3711 Within groups 0.825795 12 0.0688162 Total (Corr.) 1.23447 17 5
  69. Bảng trắc nghiệm phân hạng trọng lượng tươi cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ thấp. Bảng 3.3. NT Count Mean Homogeneous Groups S0.2 3 1.82633 X S0 3 2.10567 X S0.8 3 2.144 X S0.6 3 2.22767 X S1 3 2.256 X S0.4 3 2.26467 X Bảng ANOVA trọng lượng khô (g) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ thấp. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.000686278 5 0.000137256 0.71 0.6304 Within groups 0.00233467 12 0.000194556 Total (Corr.) 0.00302094 17 Bảng trắc nghiệm phân hạng trọng lượng khô cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ thấp. Bảng 3.3. NT Count Mean Homogeneous Groups S0.2 3 0.0773333 X S0 3 0.088 X S0.8 3 0.0913333 X S0.4 3 0.093 X S1 3 0.0936667 X S0.6 3 0.0963333 X Bảng ANOVA chiều cao (cm) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ thấp. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2.28944 5 0.457889 10.84 0.0004 Within groups 0.506667 12 0.0422222 Total (Corr.) 2.79611 17 Bảng trắc nghiệm phân hạng chiều cao cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ thấp. Bảng 3.3. NT Count Mean Homogeneous Groups S0 3 4.2 X S1 3 4.2 X S0.2 3 4.33333 XX S0.6 3 4.56667 X S0.4 3 4.63333 X S0.8 3 5.23333 X 6
  70. Bảng ANOVA số lá (lá) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ thấp. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.770578 5 0.154116 1.80 0.1879 Within groups 1.02907 12 0.0857556 Total (Corr.) 1.79964 17 Bảng trắc nghiệm phân hạng số lá cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ thấp. Bảng 3.3. NT Count Mean Homogeneous Groups S0.6 3 2.57 X S0 3 2.81 XX S0.2 3 2.85667 XX S1 3 2.9 XX S0.8 3 3.05 XX S0.4 3 3.24 X Bảng ANOVA số rễ (rễ) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ thấp. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 16.7753 5 3.35505 0.53 0.7527 Within groups 76.562 12 6.38017 Total (Corr.) 93.3373 17 Bảng trắc nghiệm phân hạng số rễ cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung SA ở nồng độ thấp. Bảng 3.3. NT Count Mean Homogeneous Groups S0 3 6.95333 X S0.2 3 7.33333 X S1 3 8.11 X S0.6 3 8.24 X S0.8 3 8.66333 X S0.4 3 9.95 X Thí nghiệm 4. Số liệu thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của aspirin ở nồng độ thấp lên sự tăng trưởng của cây chuối gìa lùn Musa acuminata Bảng ANOVA trọng lượng tươi (g) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ thấp. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.32384 5 0.264767 1.52 0.2542 Within groups 2.0849 12 0.173742 Total (Corr.) 3.40874 17 7
  71. Bảng trắc nghiệm phân hạng trọng lượng tươi cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ thấp. Bảng 3.4. NT Count Mean Homogeneous Groups A0.4 3 2.193 X A1 3 2.293 X A0.8 3 2.44933 X A0.6 3 2.757 X A0 3 2.84933 X A0.2 3 2.878 X Bảng ANOVA trọng lượng khô (g) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ thấp. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.000638944 5 0.000127789 0.52 0.7545 Within groups 0.00293067 12 0.000244222 Total (Corr.) 0.00356961 17 Bảng trắc nghiệm phân hạng trọng lượng khô cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ thấp. Bảng 3.4. NT Count Mean Homogeneous Groups A0.4 3 0.094 X A0.8 3 0.102667 X A1 3 0.103333 X A0.6 3 0.105667 X A0.2 3 0.11 X A0 3 0.112667 X Bảng ANOVA chiều cao (cm) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ thấp. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 5.44944 5 1.08989 3.85 0.0258 Within groups 3.39333 12 0.282778 Total (Corr.) 8.84278 17 Bảng trắc nghiệm phân hạng chiều cao cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ thấp. Bảng 3.4. NT Count Mean Homogeneous Groups A0.2 3 3.63333 X A0 3 3.93333 X A1 3 4.13333 X A0.4 3 4.4 X A0.6 3 4.56667 XX A0.8 3 5.36667 X 8
  72. Bảng ANOVA số lá (lá) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ thấp. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.789444 5 0.157889 0.34 0.8780 Within groups 5.54707 12 0.462256 Total (Corr.) 6.33651 17 Bảng trắc nghiệm phân hạng số lá cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ thấp. Bảng 3.4. NT Count Mean Homogeneous Groups A0.2 3 2.33 X A0.6 3 2.57333 X A0 3 2.62 X A0.4 3 2.71333 X A0.8 3 2.90333 X A1 3 2.95333 X Bảng ANOVA số rễ (rễ) cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ thấp. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 8.44764 5 1.68953 0.53 0.7482 Within groups 38.0895 12 3.17413 Total (Corr.) 46.5372 17 Bảng trắc nghiệm phân hạng số rễ cây chuối già lùn sau 4 tuần nuôi cấy khi bổ sung aspirin ở nồng độ thấp. Bảng 3.4. NT Count Mean Homogeneous Groups A0.4 3 8.99667 X A0.8 3 9.90667 X A0.2 3 10.33 X A0 3 10.57 X A1 3 10.62 X A0.6 3 11.19 X 9