›

Đồ án Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho cao chiết ethanol từ cây medinilla sp

pdf 97 trang thiennha21 12/04/2022 5220
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho cao chiết ethanol từ cây medinilla sp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_quy_trinh_xac_dinh_nong_do_uc_che_toi_thieu.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho cao chiết ethanol từ cây medinilla sp

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CHO CAO CHIẾT ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP. ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP. Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: Th S. Phạm Minh Nhựt TS. Lương Tấn Trung Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Phượng Hằng MSSV: 1151110009 Lớp: 11DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CHO CAO CHIẾT ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP. ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP. Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: Th S. Phạm Minh Nhựt TS. Lương Tấn Trung Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Phượng Hằng MSSV: 1151110009 Lớp: 11DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  3. LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tơi được thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được cơng bố trong bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào khác. Tơi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng nãm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Phượng Hằng
  4. LỜI CÁM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Ðại học Cơng Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cơ giảng dạy tại Khoa Cơng nghệ sinh học - Thực phẩm - Mơi trường cùng tất cả các thầy cơ đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những nãm học vừa qua. Qua đây em xin được bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khố luận tốt nghiệp. Bên cạnh đĩ em xin cảm ơn các thầy cơ ở Phịng Thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học - Thực phẩm - Mơi trường cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hồn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luơn bên cạnh, động viên con những lúc khĩ khãn, nản lịng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng nãm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Phượng Hằng
  5. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục i Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách các hình vii Danh sách các bảng viii MỞ ĐẦU 1 1. Đặc vấn đề 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Phạm vi nghiên cứu 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu chung về chi Medinilla sp. 3 1.1.1 .Phân loại, nguồn gốc và phân bố 3 1.1.1.1. Phân loại khoa học 3 1.1.1.2 Phân bố và sinh thái 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật học 3 1.2.3 Một số lồi đặc trưng thuộc chi Medinilla sp. 3 1.2.3.1 Medinilla septentrionalis 3 1.2.3.2 Medinilla assamica 4 1.2.3.3 Medinilla lanceata 4 1.2.3.4 Medinilla nana 5 1.2.3.5 Medinilla fengi 6 1.2.3.6 Medinilla formosana 6 1.2. Một số thành phần hĩa học trong thực vật 6 1.2.1 Carbohydrate 6 1.2.1.1. Khái niệm 6 1.2.1.2 Vai trị 6 i
  6. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2 Amino acid 7 1.2.2.1 Khái niệm 7 1.2.2.2 Vai trị 7 1.2.3 Alkaloid 8 1.2.3.1 Khái niệm 8 1.2.3.2 Vai trị 8 1.2.4 Glycoside 9 1.2.4.2 Saponin 9 1.2.4.3Glycoside tim 9 1.2.4.4Anthraquinone glycoside 10 1.2.4.5 Flavonoid và anthoxyanosid 10 1.2.4.6 Tannin 10 1.2.4 Steroid 11 1.2.4.1 Khái niệm 11 1.2.4.2 Vai trị 11 1.2.5 Các hợp chất phenolic 11 1.2.5.1 Khái niệm 11 1.2.5.2 Vai trị 12 1.3. Tổng quan về các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 12 1.3.1. Khái niệm 12 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn chung 12 1.3.3. Một số hợp chất kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất kháng khuẩn trong thực vật 13 1.3.3.1 Alkaloid 13 1.3.3.2 Phenol đơn và acid phenolic 14 1.3.3.3 Flavonoid 15 1.3.3.4 Tannin 16 1.3.3.5 Các hợp chất quinone 16 1.3.3.6 Terpenoid và tinh dầu 17 ii
  7. Đồ án tốt nghiệp 1.3.3.7 Saponin 18 1.2.4. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại Việt Nam 19 1.2.4.1 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thê giới 19 1.2.4.2 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn từ thực vật ở Việt Nam 20 1.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration _MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum bactericidal concentration_MBC)21 1.4.4. Khái niệm, ý nghĩa MIC và MBC 21 1.4.1.1. Khái niệm 21 1.4.1.2. Ý nghĩa 21 1.4.3. Sơ lược về một số phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 22 1.4.3.1Phương pháp khuếch tán trên thạch (agar-diffusion methods) 22 1.4.3.2.Phương pháp pha lỗng (Dilution methods) 22 1.4.4 Một số kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên thực vật 23 1.4.4.1 Tình hình nghiên cứu MIC trên thế giới 23 CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu 25 2.1.2 Địa điểm thu mẫu 25 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 25 2.2.Vật liệu nghiên cứu 25 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 25 2.2.2 Vi khuẩn chỉ thị 25 2.2.3 Mơi trường 25 2.2.3.1 Mơi trýờng nuơi cấy và phân lập 25 2.2.3.2. Dụng cụ và thiết bị 26 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.3.1. Phương pháp thu và tách chiết các hợp chất từ thực vật 26 iii
  8. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị 27 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 27 2.3.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 27 2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 27 2.3.4. Phương pháp pha lỗng vi sinh vật 28 2.3.5 Phương pháp xác định mật độ tế bào 28 2.3.6 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar) 29 2.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên mơi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin (broth dilution resazurin method) 30 2.3.8 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp đĩa giấy khuếch tán (disc diffusion method) 31 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 32 2.4 Bố trí thí nghiệm 32 2.4.1 Thí nghiệm 1: Tách chiết cao ethanol từ cây Medinilla sp. 33 2.4.1.1 Sơ đồ tách chiết 33 2.4.1.2 Thuyết minh quy trình 33 2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol 70% từ cây Medinilla sp. bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch 34 2.4.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu quy trình xác định chỉ số MIC của cao chiết ethanol 70% từ cây Medinilla sp. 35 2.4.3.1 Thí nghiệm 3.1 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch 36 2.4.3.2 Thí nghiệm 3.2 Phương pháp pha lỗng trên mơi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin 37 2.4.3.3 Thí nghiệm 3.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán 38 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol từ cây Medinilla sp. 40 3.1.1 Đối với nhĩm vi khuẩn Escherichia coli 41 3.1.2 Đối với nhĩm Salmonella spp 42 iv
  9. Đồ án tốt nghiệp 3.1.3 Đối với nhĩm Shigella spp 43 3.1.4 Đối với nhĩm Vibrio spp. 44 3.1.5 Đối với nhĩm chủng vi sinh vật gây bệnh khác 45 3.2 Kết quả xác định chỉ số (MIC) của cao chiết ethanol 70% từ cây Medinilla sp. (MEE) 46 3.2.1 Xác định chỉ số MIC của cao chiết bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (WDA) 47 3.2.2 Phương pháp pha lỗng trên mơi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin (MDR) 48 3.2.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (DDA) 50 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 4.1 Kết luận 56 4.2 Kiến nghị 56 v
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT MEE: Medinilla sp. ethanol extract: Cao chiết 70% từ cây Medinilla sp. MIC: Minimum Inhibitory Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu MBC: Minimum Bactericidal Concentration: Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu WDA: Agar well diffusion assay: Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch MDR: Broth dilution resazurin menthod: Phương pháp pha lỗng trên mơi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin DDA: Disc diffision assay: Phương pháp đĩa giấy khuếch tán TSA: Trypticase Soya Agar TSB: Trypton Soya Broth vi
  11. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1. Medinilla septentrionalis 4 Hình 1.2. Medinilla assamica 4 Hình 1.3. Medinilla lanceata 5 Hình 1.4. Medinilla nana 5 Hình 1.5. Medinilla formosana 6 Hình 1.6. Cấu tạo amino acid 7 Hình 1.7. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thiên nhiên 12 Hình 1.8. Berberine 14 Hình 1.9. Eugenol 15 Hình 1.10. Cấu trúc hĩa học saponin 18 Hình 2.1. Đường kính vùng ức chế của MEE đối với chủng Escherichia coli O157:H7 29 Hình 2.2. Sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị resazurin 31 Hình 2.3. Đường kính vùng ức chế của cao chiết Medinilla sp. nồng độ 100 mg/mlđối với chủng Shi. Sonnei 32 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 33 Hình 2.5. Quy trình tách chiết cao ethanol 70% 33 Hình 2.6. Dịch lọc mẫu ethanol 70% 34 Hình 2.7. Quy trình xác định hoạt tính kháng khuẩn 35 Hình 2.8. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch36 Hình 2.9. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp pha lỗng trên mơi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin 37 Hình 2.10. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp đĩa giấy khuếch tán 38 Hình 3.1. Hoạt tính ức chế của MEE (100mg/ml) và ciprofloxacin (500µg/ml) đối với nhĩm Escherichia coli 40 vii
  12. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (500µg/ml) đối với nhĩm Salmonella spp. 41 Hình 3.3. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (500µg/ml) đối với nhĩm Shigella spp. 42 Hình 3.4. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (8µg/ml) đối với nhĩm Vibrio spp. 43 viii
  13. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH BẢNG Bảng 1.1. Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin 44 Bảng 3.1. Kết quả đối kháng của MEE với 20 chủng vi sinh vật khảo sát 44 Bảng 3.2. Chỉ số MIC của MEE đối với 20 chủng vi sinh vật khảo sát bằng phương pháp WDA 47 Bảng 3.3. Chỉ số MIC trên 20 chủng vi sinh vật khảo sát bằng phương pháp MDR 49 Bảng 3.4. Chỉ số MIC trên 20 chủng vi sinh vật khảo sát được thực hiện bằng phương pháp DDA 50 ix
  14. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Trong những năm gần đây, việc kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh cho con người được báo cáo từ khắp nơi trên thế giới (Piddock và ctv, 1989). Tình hình đáng báo động là việc sử dụng kháng sinh bừa bãi ở các nước đang phát triển (Ahmad và ctv, 2001), mặc dù ngành cơng nghiệp dược đã sản xuất một số loại kháng sinh mới trong ba thập kỷ qua, nhưng đề kháng của vi khuẩn đối với các loại thuốc đã tăng lên, vì vi khuẩn cĩ khả năng di truyền nên cĩ khả năng kháng thuốc qua các thế hệ (Cohen, 1992). Thuốc kháng sinh là cơ sở chính để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn. Từ khi phát hiện ra các loại thuốc kháng sinh và sử dụng chúng như hĩa học trị liệu với hy vọng cho ngành y tế rằng kháng sinh sẽ tiêu diệt hồn tồn vi sinh vật gây các bệnh truyền nhiễm. Tuy nhiên, lạm dụng kháng sinh đã trở thành nhân tố chính cho sự xuất hiện và phát triển nên nhiều chủng kháng thuốc của một số nhĩm vi sinh vật (Harbottle và ctv, 2006). Do đĩ, việc quan trọng là phải tìm ra các loại kháng sinh mới. Tuy nhiên theo hồ sơ trước đây, ngay cả những loại kháng sinh thương mại mới được giới thiệu chỉ cĩ hiệu quả trong một thời gian ngắn (Coates, 2002). Hơn nữa, sự phát triển kháng thuốc và sự xuất hiện của các tác dụng phụ khơng mong muốn của thuốc kháng sinh thương mại đã dẫn đến việc tìm kiếm các tác nhân kháng khuẩn mới, chủ yếu là các chất chiết xuất từ thực vật, để tìm ra cấu trúc hĩa học mới để khắc phục những nhược điểm nĩi trên (Ordĩđez và ctv, 2003). Vì lý do này, các nhà nghiên cứu đang ngày càng chuyển sự chú ý sang các sản phẩm thảo dược, tìm kiếm hy vọng mới cho sự phát triển loại thuốc tốt hơn so với các chủng vi khuẩn đã kháng (Braga và ctv, 2005) Hàng nghìn năm trước, con người đã biết về lợi ích của việc sử dụng thực vật để làm giảm hoặc chữa bệnh. Các lồi thực vật tạo thành một nguồn các hợp chất hĩa học mới quan trọng cĩ tiềm năng sử dụng trong y học và các ứng dụng khác. Chiết xuất từ thực vật đã được ghi nhận bởi các nền văn minh cổ đại là cĩ ý nghĩa cho 1
  15. Đồ án tốt nghiệp việc điều trị các bệnh khác nhau, và khoảng 30% doanh số dược phẩm bán ra trên tồn thế giới được dựa trên các sản phẩm tự nhiên (Grabley, 1999) Hiện nay vẫn chưa cĩ nhiều tài liệu khoa học đề cập đến hoạt tính kháng khuẩn củng như quy trình xác định nồng độ kháng khuẩn của chiết xuất từ thực vật được sử dụng trong y học dân gian. Vì vậy, để làm phong phú cho danh sách các thực vật cĩ tiềm năng sử dụng thay thế thuốc kháng sinh, và xây dựng quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu áp dụng đối tượng thực vật _ cây thuốc (cĩ màu) là lý do chính để đề tài “Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho cao chiết ethanol từ cây Medinilla sp” được thực hiện 2. Mục đích nghiên cứu Bước đầu xác định được quy trình phù hợp để khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho cao chiết ethanol từ cây Medinilla sp. 3. Nội dung nghiên cứu Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cho cao chiết ethanol của chi Medinilla sp. Nghiên cứu một số phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) từ đĩ đưa ra quy trình chung cho đối tượng cây thuốc 4. Phạm vi nghiên cứu Sử dụng dung mơi ethanol 70% cho quá trình tách chiết cao Thử nghiệm trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị 2
  16. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về chi Medinilla sp. 1.1.1 .Phân loại, nguồn gốc và phân bố 1.1.1.1. Phân loại khoa học Giới (regnum) : Plantae Ngành (division) : Magnoliophyta Lớp (class): Magnoliopsida Bộ (ordo): Myrtales Họ (familia): Melastomataceae Chi (genus): Medinilla 1.1.1.2 Phân bố và sinh thái Medinilla sp. là một chi cĩ khoảng 193 lồi thực vật cĩ hoa thuộc họ Melastomataceae, cĩ nguồn gốc từ vùng nhiệt đới cổ xưa bắt nguồn từ Châu Phi (hai lồi) về phía đơng qua Madagascar (khoảng 70 lồi) và miền Nam châu Á đến phía tây các đảo Thái Bình Dương. Chi này được đặt tên theo J. de Medinilla, thống đốc của quần đảo Mariana vào năm 1820. (Renner và ctv, 2004) 1.1.2. Đặc điểm thực vật học Medinilla thuộc loại cây bụi hoặc dây leo. Lá mọc đối diện hay vịng, cĩ cuống lá hoặc khơng cuống, phiến lá thường nhẵn, rìa lá cĩ hoặc khơng cĩ răng cưa. Lá bắc nhỏ, sớm rụng. Hoa cĩ 4 hay 6 cánh. Cĩ chùy hoa lớn màu trắng hoặc hồng, cĩ cuống nhỏ và đơi khi cĩ lá bắc con. Đế hoa cĩ hình chén, hình phễu, hình chuơng, hoặc hình ống. Cánh hoa dạng trứng ngược (đầu nhỏ ở phía cuống lá), hình trứng đơi khi xiên. Nhị hoa = 2 x cánh hoa. Hạt nhiều. Bầu nhụy thấp, hình trứng, chĩp cụt hoặc với màng bao quanh đỉnh, đơi khi cĩ vách ngăn.(Jie và ctv, 2007) 1.2.3 Một số lồi đặc trưng thuộc chi Medinilla sp. 1.2.3.1 Medinilla septentrionalis 3
  17. Đồ án tốt nghiệp Là cây bụi, cao khoảng 1 – 7m, nhiều nhánh, nhánh thẳng đứng đơi khi xen kẽ. Cành dày, hình trụ, nhẵn với vỏ mỏng cĩ màu nâu. Cuống lá dày khoảng 0,4 – 0,9 mm. Phiến lá hình lưỡi mác, cĩ kích thước 7–8,5 × 2–2,5 cm, mỏng như giấy, rìa lá cĩ răng cưa nhỏ, thưa thớt. Cụm hoa nách, cĩ kích thước 3,5-5,5 cm, cĩ 1 – 5 hoa, nhẵn, Hình 1.1. Medinilla septentrionalis cuống hoa 1-2,5 cm, đế hoa cĩ hình chuơng 4-4,5 mm Phân bố: Các rừng rậm, bìa rừng, khu vực râm ẩm ướt; độ cao khoảng 200- 1800 m. Được tìm thấy ở Trung Quốc (Quảng Đơng, Quảng Tây, Vân Nam), Myanmar, Thái Lan, Việt Nam. 1.2.3.2 Medinilla assamica Là cây bụi, hoặc dây leo, cao 1 – 4m. Cành cĩ 4 gĩc khi cịn nhỏ, khi trưởng thành cành dày, nhẵn cĩ hình trụ. Lá cĩ cuống hoặc khơng cuống. Phiến lá hình trứng, lanceolateovate hoặc hình elip cĩ kích thước 10 – 21 × 3,8 – 11 cm, rìa lá cĩ đường răng cưa nhỏ, nhọn đỉnh. Đế hoa cĩ hình chuơng (15 – 30 cm). Cuống hoa nhỏ (0.,5 - 2 Hình 1.2. Medinilla assamica mm), đế hoa cĩ hình chén (3 - 4 mm). Cánh hoa màu hồng, cĩ 4 cánh hình trứng - Phân bố: tập trung thưa thớt ở rừng rậm, thung lũng, sườn đồi, nơi ẩm ướt, độ cao khoảng 200 – 1300m. Được tìm thấy ở Trung Quốc, Lào, Ấn Độ, Thái Lan, Myanmar, Việt Nam 1.2.3.3 Medinilla lanceata 4
  18. Đồ án tốt nghiệp Là cây riêng lẽ hoặc bụi, cao khoảng 2 – 5 m. Cuống lá dài khoảng 8 - 10 mm, hơi cĩ lơng; lá hình lưỡi mác đến hình ovate - lanceolate, cĩ kích thước khoảng 15 - 24 × 3-5,5 cm, mỏng như giấy, 2 bề mặt lá nhẵn, đỉnh và đuơi lá nhọn, rìa lá cĩ đường răng cưa nhỏ nơng. Cụm hoa chèn vào lá cành hoặc các đốt của rễ. Hoa mọc theo cụm, hình chùy (15 – 25 cm), đế Hình 1.3. Medinilla lanceata hoa cĩ hình chuơng (5 - 6 mm), cánh hoa hình trứng rộng, cùn ở đỉnh và trịn dần về cuối Phân bố rải rác ở rừng rậm, nơi ẩm ướt, dưới bĩng cây, thung lũng, sườn đồi, độ cao khoảng 400 - 1000m. Được tìm thấy ở Trung Quốc (Hải Nam, Vân Nam) 1.2.3.4 Medinilla nana Là cây bụi, cao khoảng 15 - 100cm. Chúng là thực vật biểu sinh, thân bị. Cuống lá (1 – 4 mm), nhẵn lá cĩ hình lưỡi trứng đến elip, cĩ kích thước 2 - 3,5 × 1,1 - 1,5 cm, lá mọng nước để trữ nước, 2 bề mặt lá nhẵn. Cum hoa cĩ khoảng 1 - 3 hoa, hoa cĩ 4 cánh, màu hồng, hình trứng Hình 1.4. Medinilla nana Phân bố: ở các rừng rậm, độ cao khoảng 1100 – 2000 m. Được tìm thấy ở Trung Quốc (Vân Nam) và Việt Nam 1.2.3.5 Medinilla fengi Là cây bụi, cao 50 – 120 cm, nhiều nhánh. Cuống lá (5 - 12 mm), phiến lá hình trứng đến elip, cĩ kích thước 4 – 10 × 2 - 3,5 cm, lá cĩ răng cưa nhỏ thưa thớt hoặc khơng cĩ răng cưa, đầu và đuơi lá đều nhọn. Hoa mọc theo chùm, cĩ kích 5
  19. Đồ án tốt nghiệp thước 2 – 3 × 3 – 5 cm, chùm khoảng 3 - 6 hoặc 16 hoa, cuống hoa (5 - 10 mm), đế hoa hình phễu (4 – 5 mm), hoa cĩ 4 cánh, màu hồng, hình trứng rộng (6 - 7,5 mm), đỉnh cắt xén hoặc nhọn Phân bố: rừng thường xanh cây lá rộng, những nơi ẩm ướt cĩ bĩng, vết nứt của đá, độ cao khoảng 600 - 1800 m. Được tìm thấy ở Đài Loan và Trung Quốc (Vân Nam). 1.2.3.6 Medinilla formosana Là cây bụi, hoặc dây leo. Lá mọc đối diện hoặc mọc vịng quanh thân, cuống lá (5 – 10 mm), nhẵn; phiến lá hình thuơn - trứng đến trứng - mũi mác, kích thước 10 - 20 × 7 - 14 cm, mỏng như giấy. Cụm hoa đầu cuối hoặc gần cuối, hoa mọc theo chùy, cuống hoa (6 mm), nhẵn. Đế hoa gần hình cầu, kích thước 3 × 2,5 mm, 4 cạnh, nhẵn. Hoa 4 Hình 1.5. Medinilla formosana cánh, hình trứng. Phân bố: rừng, sườn núi, độ cao dưới 100 - 1000 m. Được tìm thấy ở Đài Loan 1.2. Một số thành phần hĩa học trong thực vật 1.2.1 Carbohydrate 1.2.1.1. Khái niệm Carbohydrate là hợp chất hữu cơ được tạo nên từ các nguyên tố: C, H, O. Cơng thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n và là nhĩm phổ biến nhất trong bốn nhĩm phân tử sinh học chính. Ở thực vật carbohydrate tập trung chủ yếu ở thành tế bào, mơ nâng đỡ và mơ dự trữ Nguồn gốc các carbohydrate trong tự nhiên: được hình thành từ trong lá cây của thực vật nhờ quá trình quang hợp của ánh sáng mặt trời và sắc tố xanh chlorophyll (diệp lục) (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013) 1.2.1.2 Vai trị 6
  20. Đồ án tốt nghiệp - Cung cấp năng lượng - Cấu trúc, tạo hình (cellulose, ) - Bảo vệ (mucopolysaccharide) - Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể) - Điểm tựa: bộ khung thực vật - Dự trữ: tinh bột ở thực vật (hạt, thân, củ) (Nguyễn Huy Cơng và ctv, 2005) 1.2.2 Amino acid 1.2.2.1. Khái niệm Amino acid là loại hợp chất hữu cơ tạp chức mà phân tử chứa đồng thời nhĩm amino (-NH2-) và nhĩm cacboxyl (-COOH-) Cơng thức cấu tạo: Gồm nguyên tử carbon trung tâm, nhĩm amin (amino), nhĩm carboxylate, mạch nhánh. Cĩ cơng thức : (H2N)x – R – (COOH)y. Các acid amin khác nhau là do cấu tạo mạch nhánh Hình 1.6. Cấu tạo amino khác nhau acid Trong phân tử amino acid, nhĩm NH2 và nhĩm COOH tương tác với nhau tạo ion lưỡng cực. Vì vậy amino acid kết tinh tồn tại ở dạng ion lưỡng cực (Hồ Chí Tuấn, 2009) 1.2.2.2 Vai trị Vai trị và một số amino acid được thể hiện ở bảng 1.1 7
  21. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1. Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất Các amino acid Hoạt động sinh hĩa Glycine - Là tiền chất của chlorophyll Proline và - Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước hydroxyproline - Cấu tạo nên thành tế bào (nematostatic action) - Thiết yếu để tạo phấn hoa Glutamic và Đạm hữu cơ dự trữ để tạo thành các amino acid khác và glutamine protein thơng qua phản ứng trao đổi Serine - Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước, rất quan trọng cho quá trình tổng hợp chlorophyll Arginine - Là tiền chất của polyamine, rất quan trọng để để phân chia tế bào Phenylalanine - Là tiền chất cấu tạo nên lignine, tạo các chồi gỗ khỏe hơn Alanine - Vai trị rất quan trọng trong việc tạo hoocmon trao đổi chất và kháng virus Tryptophan - Tiền tố của indole-acetic acid, các chất kích thích sinh trưởng tự nhiên 1.2.3 Alkaloid 1.2.3.1 Khái niệm Alkaloid là những hợp chất hữu cơ cĩ chứa dị vịng nitơ, cĩ tính bazơ thường gặp trong nhiều lồi thực vật và đơi khi cịn tìm thấy trong một vài động vật. Chúng cĩ hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể con người và động vật, nhất là đối với hệ thần kinh. Alkaloid là chất độc gây chết người nhưng rất quan trong trong lĩnh vực y học 8
  22. Đồ án tốt nghiệp và cung cấp những loại thuốc cĩ giá trị chữa bệnh cao (Nguyễn Huy Cơng và ctv, 2005) 1.2.3.2 Vai trị - Diệt khuẩn - Tác động lên hệ thần kinh - Hạ huyết áp - Chống ung thư - Là những chất chuyển hĩa thứ cấp, đĩng vai trị trong quá trình sinh sản và giúp bảo vệ thực vật chống lại các sinh vật ăn thực vật. (Nguyễn Huy Cơng và ctv, 2005) 1.2.4 Glycoside Là những hợp chất hữu cơ cĩ cấu tạo phức tạp. Glycoside thường được hịa tan trong dịch tế bào của cây, khi gặp điều kiện thuận lợi thì nĩ cĩ thể bị các enzyme phân hủy. Khi thủy phân glycoside sẽ cho hai phần: một phần khơng đường và một phần gồm một hay nhiều đường, phần đường cĩ thể là đường đơn hay đường đa, cĩ tác dụng làm tăng sự hịa tan glycoside trong nước, cịn phần khơng đường (gọi là aglycon hay genin) cĩ cấu trúc hĩa học rất khác nhau. Tùy theo phần khơng đường này và tác dụng của các cây thuốc, glycoside lại chia làm nhiều chất khác nhau. Cĩ thể kể đến một số glycoside chính sau đây: (Đỗ Tất Lợi, 2004) 1.2.4.2 Saponin a. Khái niệm: Là những glycoside cĩ tính chất gây bọt, phá huyết. Những vị thuốc cĩ chất saponin khi tán nhỏ, lắc với một ít nước thì sẽ gây rất nhiều bọt như bọt xà phịng trong ống thí nghiệm. Bọt này rất lâu mới tan b. Vai trị - Tác dụng bổ, tăng cường sinh lực (saponin cĩ trong họ nhân sâm) - Tác dụng long đờm, dịu ho (cĩ trong cam thảo, viễn chí) - Giảm đau nhức khớp xương (cĩ trong ngưu tất, cỏ xước) - Hạ cholesterol trong máu (Đỗ Tất Lợi, 2004) 9
  23. Đồ án tốt nghiệp 1.2.4.3 Glycoside tim a. Khái niệm: Là các glycoside thực vật, cĩ ảnh hưởng kích thích tim và thường cĩ độc tính cao. Cĩ đặc điểm là những kết tinh, khơng màu, cĩ vị đắng. Tan trong các dung mơi phân cực. Dễ bị thủy phân trong mơi trường acid 1.2.4.4Anthraquinone glycoside a. Khái niệm: thường cĩ màu từ vàng, cam tới đỏ. Gắn vào nhân thường cĩ các nhĩm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH Tuỳ theo vị trí các nhĩm chức gắn vào nhân mà cĩ các dẫn xuất khác nhau b. Vai trị: một số nghiên cứu cho thấy các dẫn chất anthraquinone cĩ tác dụng kích thích miễn dịch chống ung thư 1.2.4.5 Flavonoid và anthoxyanosid a. Khái niệm: là những chất glycoside cĩ màu sắc. Flavonoid là những sắc tố màu vàng cĩ trong thực vật, cịn anthoxyanosid là những sắc tố cùng loại, cĩ thể là màu xanh, tím, đỏ hoặc khơng màu củng được xếp vào nhĩm flavonoid. Cĩ đặc điểm là trong thực vật, flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do (aglycol) và dạng liên kết với glucide (glycoside). Trong đĩ, dạng aglycol thưịng tan trong các dung mơi hữu cơ như este, aceton, cồn nhưng hầu như khơng tan trong nước, cịn dạng glycoside thì tan trong nước nhưng khơng tan trong các dung mơi khơng phân cực như aceton, benzen, chloroform. Những chất này cĩ liên quan chặt chẽ với chất tannin (Nguyễn Huy Cơng và ctv, 2005) b. Vai trị: một chất flavon rất quý là rutin hay rutoside cĩ trong hoa hịe cĩ tác dụng giảm huyết áp, giúp cho cơ thể chống lại những trường hợp đứt mạch máu nhỏ khi huyết áp tăng cao. Vai trị của anthoxyanosid hiện nay chưa được xác định rõ rệt về mặt điều trị. (Đỗ Tất Lợi, 2004) 1.2.4.6 Tannin a. Khái niệm: tanin được định nghĩa là những hợp chất polyphenol cĩ trong thực vật cĩ vị chát được phát hiện dương tính với "thí nghiệm thuộc da" và được định lượng dựa vào mức độ hấp phụ trên bột da sống chuẩn. Tannin cĩ đặc điểm: 10
  24. Đồ án tốt nghiệp - Tannin thường là bột vơ định hình từ màu ngả vàng cho đến màu nâu sáng, khơng mùi hoặc mùi rất nhẹ, vị rất chát, gây săn se niêm mạc. - Khối lượng phân tử từ 500 – 20000, điểm chảy khơng cố định mà thay đổi tùy cách chiết xuất, phân lập - Tannin thường là những chất rất phân cực, dễ tan trong các dung mơi phân cực như cồn, glycerin, aceton - Đa số khơng tan trong các dung mơi hữu cơ - Tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt) - Tạo phức tủa bền với các dun dịch của protein (albumin, gelatin ) nên cĩ tính thuộc da, làm cho da bền, ít thấm nước, khơng bị trương phồng hay thối rửa b. Vai trị Bảo vệ thực vật khỏi các lồi cơn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu. Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng. Cơng dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy. Chữa ngộ độc kim loại nặng và các alkaloid vì làm kết tủa các chất đĩ (Đỗ Tất Lợi, 2004) 1.2.4 Steroid 1.2.4.1 Khái niệm Là những hợp chất thiên nhiên cĩ bộ khung cacbon stenan gồm bốn vịng ngưng tụ với nhau, chứa các mạch bên và các nhĩm chức khác nhau như: CO, - CHO, -COOH, -OH. Steroid tồn tại trong động, thực vật dưới dạng glycosid hoặc liên kết với các cacbon acid amin. Steroids cĩ đặc điểm là hợp chất chất béo hữu cơ hịa tan. Cĩ nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp. Khi đun nĩng với Se ở 36000C sẽ tạo hợp chất Hidrocacbon Diel 1.2.4.2 Vai trị Tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống. Thường dùng làm các thuốc kích thích 1.2.5 Các hợp chất phenolic 1.2.5.1 Khái niệm 11
  25. Đồ án tốt nghiệp Là những hợp chất hĩa học được tìm thấy ở khắp các chất màu của hoa quả được cấu tạo từ các tiểu đơn phân phenol. Cĩ đặc điểm là đa số được tổng hợp từ phenylalanine. Ở thực vật nhĩm phenolics chủ yếu được tìm thấy là caffeic acid 1.2.5.3 Vai trị - Bảo vệ thực vật chống lại mầm bệnh và các động vật ăn cỏ - Chất chống oxi hĩa tự nhiên và tìm thấy trong táo, trà xanh - Chống ung thư, ngăn ngừa bệnh tim và kháng viêm - Một hợp chất phenolic khác là chlorogenic acid được biết như là chất gây ra viêm da dị ứng ở người 1.3. Tổng quan về các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 1.3.1. Khái niệm - Là các hợp chất hữu cơ cĩ trong thực vật cĩ khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi khuẩn, ngăn vi khuẩn nhân lên bằng cách tác động ở mức phân tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hĩa cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hĩa của chúng. Thường cĩ tác dụng đặc hiệu với một nồng độ rất nhỏ . - Các chất kháng khuẩn thực vật thường là các hợp chất như alkaloid, flavonoid, tannin và một số loại tinh dầu 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn chung 12
  26. Đồ án tốt nghiệp Đơng tụ Proton động lực Tế bào chất Vách tế bào Màng tế bào chất Màng protein Hình 1.7. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thiên nhiên Cơ chế hoạt động của các hợp chất kháng khuẩn từ thiên nhiên là phá hủy màng tế bào chất, làm mất ổn định của proton động lực (PMF), dịng điện tử, hoạt động vận chuyển và đơng tụ của các tế bào Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất chủ yếu thơng qua : phá vách tế bào, làm rối loạn màng sinh chất và bất hoạt enzyme, protein của tế bào vi khuẩn . Cĩ nhiều hợp chất kháng khuẩn cĩ nguồn gốc từ thực vật tiêu diệt vi sinh vật thơng qua phá vỡ vách tế bào Cĩ rất nhiều hợp chất tấn cơng vào màng trao đổi chất tiêu diệt vi khuẩn . + Thành phần kỵ nước trong tinh dầu hịa tan lipid trong màng tế bào vi khuẩn làm ảnh hưởng đến cấu trúc và thay đổi tính thấm của màng tế bào vi khuẩn (Sikkema J và ctv, 1994) + Một số loại tinh dầu cĩ khả năng kích thích sự tăng trưởng của sợi nấm giả, điều đĩ chứng minh rằng nĩ cĩ thể hoạt động trên các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp thành phần cấu trúc vi khuẩn (Lambert và ctv, 2001) + Thymol cĩ khả năng phân hủy màng tế bào của vi khuẩn Gram (-) 13
  27. Đồ án tốt nghiệp Tiêu diệt vi khuẩn thơng qua ngăn chặn sự bám dính của vi khuẩn và virus như: mannose specificaglutinin, chrysin 1.3.3. Một số hợp chất kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất kháng khuẩn trong thực vật 1.3.3.1 Alkaloid a. Cơ chế kháng khuẩn chung của alkaloid Cơ chế kháng khuẩn alkaloid: là do khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn Berberine cĩ phổ kháng khuẩn rộng, ức chế được Shigella, S.aureus, Vibrio choleare, Cĩ tính kháng khuẩn với nhiều vi khuẩn gram (-) , gram (+ ) và các vi khuẩn acid b. Một số alkaloid cĩ tính kháng khuẩn điển hình Morphine là một alkaloid được sử dụng trong y tế trong những năm đầu của thế kỷ XIX. Morphine được lấy từ cây thuốc phiện Papaver somniferum. Codein và heroin là hai dẫn xuất của morphine. Diterpenoid alkaloids là một loại alkaloid thường được lấy từ các họ cây mao lương (Ranunculaceae), chúng cĩ đặc tính kháng kháng khuẩn. - Solamargine Solamargine, một glycoalkaloid cĩ trong các cây quả mọng họ cà (Solanum khasianum), và các alkaloid khác trong lồi cây này cĩ tác dung chống lại sự lây nhiễm khi đã mắc phải HIV. Kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhĩm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy. - Berberine Một đại diện quan trọng của alkaloid cĩ trong các cây: hồng đằng, hồng bá, hồng liên Berberine cũng cĩ tác dụng kháng khuẩn đối với shigella, tụ cầu khuẩn. Những năm gần đây, một số nghiên cứu mới nhất cho thấy berberine Hình 1.8. Berberine 14
  28. Đồ án tốt nghiệp cĩ tính kháng khuẩn với nhiều vi khuẩn gram dương, gram âm và các vi khuẩn axit. Ngồi ra cĩ cịn chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh. Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với trùng gây bệnh sốt rét. Cơ chế kháng khuẩn berberine là do khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn gây bệnh sốt rét, chính vì điều này mà tác dụng kháng khuẩn của Berberine khá mạnh đối với loại trùng gây bệnh này. Đặc biệt khi dùng berberine điều trị các nhiễm trùng đường ruột sẽ khơng ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn cĩ ích ở ruột. Các nghiên cứu gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu phối hợp với berberine sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột. 1.3.3.2 Phenol đơn và acid phenolic a. Một số hợp chất phenolic cĩ khả năng kháng khuẩn Catechol và pyrogallol là hai hợp chất hydroxyl hĩa của phenol cho thấy là cĩ độc tính đối với vi sinh vật. Cơ chế được cho là nguyên nhân dẫn đến độc tính của các hợp chất phenolic này đối với vi sinh vật bao gồm sự ức chế enzyme bởi các hợp chất oxy hĩa, cĩ thể thơng qua phản ứng với nhĩm sulfhydryl hoặc thơng qua sự tương tác khơng đặc hiệu của các chất này với protein Hợp chất phenolic cĩ chứa một nhánh thế mà cĩ carbon ở trạng thái oxy hĩa thấp khơng chứa oxy được xếp vào nhĩm tinh dầu và thường được xem như là chất kháng khuẩn. Eugenol là đại diện đặc trưng được tìm thấy trong dầu đinh hương. Eugenol được xem là chất kìm hãm đồng thời Hình 1.9. Eugenol chống lại cả nấm sợi và vi khuẩn. 1.3.3.3 Flavonoid a. Cơ chế kháng khuẩn 15
  29. Đồ án tốt nghiệp Các flavonoid cĩ hoạt tính kháng khuẩn do chúng cĩ khả năng tạo phức với các protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn. Flavonoid càng ưa béo càng cĩ khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật Flavonoid cĩ khả năng kìm hãm sự hơ hấp hay phân chia của vi khuẩn khi cĩ mặt glucose. Flavonoid ức chế transpeptidase làm cho mucopeptide – yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc khơng tổng hợp được Flavonoid gắn lên màng sinh chất của vi khuẩn, làm thay đổi tính thẩm thấu chọn lọc của màng nguyên sinh chất Ức chế tổng hợp acid nucleic của vi khuẩn Cĩ tác dụng vào DNA khuơn, ức chế tổng hợp RNA của vi khuẩn b. Một số hợp chất flavonoid kháng khuẩn điển hình Trong trà xanh cĩ catechine, catechine vơ hoạt độc tố gây bệnh tả của Vibrio cholerae, ức chế enzyme glucosyltransferase của Streptococcus mutans, ức chế hoạt động của Shigella và một số vi khuẩn, vi nấm khác Một số flavonoid như quercetin, hesperetin và catechine cĩ thể chống lại virus type 1 (HSV – 1) gây bệnh mụn giộp, polyvirus type 1, virus type 3 gây bệnh khĩ thở ở trẻ Galangin (3,5,7 – trihydroxylflavone) được chiết xuất từ cây thảo mộc sống lâu năm Helichrysum aureonitens cĩ hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram (+) củng như nấm sợi và virus, đặc biệt là HSV – 1 và coxsackie B type - 1 1.3.3.4 Tannin a. Cơ chế kháng khuẩn Là những hợp chất polyphenol cĩ trong thực vật, cĩ vị chát được phát hiện dương tính với “thí nghiệm thuộc da” và được định lượng dựa trên mức độ hấp phụ của bột da sống chuẩn. Nhiều hoạt động sinh lý của con người, chẳng hạn như sự kích thích của thực bào các tế bào và chống nhiễm khuẩn tại nhiều cơ quan trong cơ thể được thực hiện bởi các hợp chất của tannin. 16
  30. Đồ án tốt nghiệp Một trong những tính chất rất đặc trưng của tannin là tạo phức với các protein thơng qua các liên kết khơng đặc hiệu như liên kết hydro và các liên kết cộng hĩa trị Khi liên kết với protein chúng cĩ thể làm mất hoạt tính của các protein chức năng. Các protein này cĩ thể là enzyme, các protein vận chuyển hay thành tế bào polypeptide Tannin cĩ thể gây độc cho nấm sợi, nấm men và vi khuẩn 1.3.3.5 Các hợp chất quinone a. Cơ chế kháng khuẩn Quinone là những vịng thơm với hai nhĩm thế ketone Chúng tồn tại khắp nơi trong tự nhiên và cĩ phản ứng đặc trưng cao. Những hợp chất này là những hợp chất màu, là nguyên nhân của những phản ứng hĩa nâu ở bề mặt cắt hoặc vết thương của rau trái và là hợp chất trung gian trong con đường tổng hợp melanine ở da người. Quinone gây sự bất hoạt và làm mất chức năng của protein do hình thành phức khơng phục hồi với các acid amin của vi khuẩn Hoạt tính chống chảy máu của chúng là do sự dễ dàng bị oxy hĩa của chúng ở các mơ trong cơ thể. Các amino acid cũng cĩ thể tạo thành quione khi cĩ enzyme xúc tác, chẳng hạn như polyphenoloxydase. Ngồi ra nĩ cịn là nguồn cung cấp các gốc tự do ổn định, quinones được biết là cĩ thể tạo phức khơng thay đổi được với các amino acid ái nhân trong protein, thường dẫn đến làm vơ hoạt và mất chức năng của protein. Vì lí do đĩ khả năng kháng khuẩn của quinone rất lớn. Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào, polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng. Quinone cũng tạo ra chất nền khơng thể sử dụng được cho các vi sinh vật b. Một số hợp chất quinone kháng khuẩn điển hình Cây ĩc chĩ cĩ tác dụng kháng khuẩn: Candida mycoderma, B. Subtills, Hansenula anomala, Botrys cinerea và nhiều lồi nấm mốc, chữa herpes sinh dục, trị ho, viêm phế quản. 17
  31. Đồ án tốt nghiệp Cây bạch hoa xà: S.aureus, Streptococus pyogenes, Pneumococus, E. coli Cĩ tác dụng chữa các bệnh ngồi da, những vết loét, vết thương. Một số lồi thuộc họ Gọng vĩ cĩ thể kháng Mycobacterium tuberculosis. Tác dụng chữa ho, chống co thắt. Cây lá mĩng kháng nhĩm vi khuẩn: Staphylococus, Streptococus, Brucella và Salmonella cĩ tác dụng chữa lở loét, hắc lào, ho, viêm khí quản. 1.3.3.6 Terpenoid và tinh dầu a. Cơ chế kháng khuẩn Terpen: chất chuyển hĩa thứ cấp dựa trên đơn vị isopren Khi các hợp chất cĩ chứa các thành phần bố sung, thường oxi, nĩ được gọi là terpenoid Tinh dầu thuộc nhĩm chất izoprenoid, là sản phẩm trao đổi chất bậc hai Về bản chất hĩa học tinh dầu thường là hỗn hợp các chức khác nhau: hydrocarbon, rượu, phenol, aldehyde, acid, este, Tuy nhiên quan trọng và thường gặp hơn cả trong hợp phần của tinh dầu là terpen và các dẫn xuất chứa oxy của terpen. Cơ chế tác động của terpen chưa được khẳng định rõ ràng, nhưng được suy đốn là liên quan đến sự phá vỡ màng tế bào bởi các hợp chất lipophilic. b. Một số terpenoid và tinh dầu cĩ tính kháng khuẩn điển hình Cây thanh hao hoa vàng: Artemisin là một secquiterpen chiết xuất từ cây thanh hao hoa vàng (Artemisia annua) cĩ hoạt tính kháng sốt rét mạnh, hoạt chất này đã được nghiên cứu và phân lập từ những năm 70. Tinh dầu từ các lồi sả - Andropogon spp. cĩ tác dụng kháng khuẩn chủ yếu lên vi khuẩn Gram âm. Tác dụng của tinh dầu sả tỉ lệ với hàm lượng citral Tinh dầu từ cây bạch đàn – Eucalyptus globulus cĩ tác dụng lên Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus nhưng kém tác dụng với E.coli. Cineol trong tinh dầu là thành phần cĩ tác dụng Menthol cĩ trong tinh dầu bạc hà cĩ tác dụng chọn lọc trên một số chủng Brucella 18
  32. Đồ án tốt nghiệp 1.3.3.7 Saponin Là nguyên liệu đầu tổng hợp các hormone steroid. Chủ yếu là kháng dầu và kháng nấm. a. Cơ chế kháng khuẩn của saponin: Saponin, chủ yếu là asiaticoside cĩ tác dụng lên Mycobacterium leprae, do asiaticoside làm tan màng sáp của vi khuẩn. Nhiều saponin thuộc nhĩm spirostan, nhĩm spirosolan, solanidan và olean đã được nghiên cứu, cĩ tác dụng chủ yếu là kháng nấm. Hình 1.10. Cấu trúc hĩa học saponin b. Một số saponin cĩ khả năng kháng khuẩn điển hình Tomatin cĩ trong cây cà chua nhiều nhất ở lá: hạt khơng cĩ. Tomatin ức chế nhiều loại nấm gây bệnh ở người. Tomatin cịn ức chế nấm gây bệnh cà chua – Fusarium oxysporum f. lycopersici, một số nấm mốc khác như Aspergillus niger, Penicillium notatum và một số vi khuẩn: Staph. aureus, Bacillus cerus, B. mycoides, B. subtilis, E. coli. Parillin cĩ tác dụng kháng Candida albicans, Trichoderma mentagrophytes, Aspergillus niger Cyclamin, Primulasaponin (nhĩm olean) ngồi tác dụng kháng nấm cịn cĩ tác dụng lên vi khuẩn Staph. aureus, E. coli. Một số saponin cịn cĩ tác dụng ức chế virus cúm type A trên thực nghiệm. Saponin của cam thảo cĩ tác dụng mạnh nhất 1.2.4. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại Việt Nam 1.2.4.1 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới - Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được cơng dụng diệt khuẩn của tỏi. Năm 1944, nhà hĩa học Chester J. Cavallito đã phân tích được hợp chất Alicin trong tỏi cĩ cơng dụng như thuốc kháng sinh. Một nghiên cứu khác tại 19
  33. Đồ án tốt nghiệp Brazil năm 1982 đã chứng minh nước tinh chất từ tỏi cĩ thể chữa được nhiều bệnh nhiễm độc bao tử, do thức ăn cĩ lẫn vi khuẩn, nhất là loại Salmonella (Nguyễn Thị Vân Thái, 2003) - Vào năm 1967, Binz đã chứng minh được quinin rất độc với Paramecium. Quinin ở nồng độ 1/20000 làm suy yếu hoạt lực của Paramecium để điều trị các bệnh do Paramecium gây ra (Nguyễn Thị Vân Thái, 2003) - Năm 1928, B. P. Tokin đã chứng minh nhiều chất bay hơi từ cây xanh cĩ tác dụng đối với vi khuẩn được gọi là Phytocid. Gries (1943), Largralge (1956) chiết xuất từ cây Hồ Đào (Juglals ligra – Juglandaceae) được chất Juglon, đây là một dẫn xuất Natoquinon, chất này cĩ tác dụng với nhiều loại nấm và vi khuẩn nha bào. Năm 1959 Horak, Santavi chiết xuất từ cây Cannabit sativa thuộc họ Cannabinnaceae được chất Cannabiriolic cĩ tác dụng với vi khuẩn lao ở người và một số vi khuẩn Gram (+), đặc biệt là vi khuẩn kháng lại Penicilin (Nguyễn Thị Vân Thái, 2003) - Năm 1997 tại Thái Lan, Satapon Direkbusarakom và cộng sự đã thử nghiệm thành cơng khả năng kháng khuẩn của các lồi cây thảo dược như: O.sanctum, C.alata, Tinospora cordifolia, Eclipa alba, Tinospora cripspa, Psidium guajava, Clinacanhus nutans, Andrographic panniculata, Momordica charatina, Phyllanthus reticulates, P.pulcher, P.acidus, P.debelis, P.amarus, và P.urinaria đối với Vibrio spp. Tuy nhiên, chỉ cĩ hai cây Momordica charatina và Psidium guajava cĩ hiệu quả ức chế đối với Vibrio spp. (Nguyễn Thị Vân Thái, 2003) - Năm 2007, J.R. Soberĩn và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt chất kháng khuẩn của chiết xuất từ 12 cây vùng Argentina và chiết xuất Tripodanthus acutifolius cĩ khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn. (Soberĩn J.R. và ctv, 2007) - Năm 2011, Firdaus Jahan và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt động kháng khuẩn của chiết xuất từ lá của cây Syzygium cumini (Jamun), Lawsonia inermis (Mehndi), Zizyphus mauritiana (Ber), Ocimum sanctum (Tulsi) and Ficus religiosa (Peepal) chống lại chủng Staphylococcus aureus (Firdaus Jahan và ctv, 2011) 20
  34. Đồ án tốt nghiệp - Năm 2011, Naveed Ahmad và cộng sự đã nghiên cứu về sự chống oxi hĩa và kháng khuẩn của chiết xuất từ lá và hoa của cây Calotropis procera bằng nhiều loại dung mơi khác nhau (Võ Văn Chi, 2000) 1.2.4.2 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn từ thực vật ở Việt Nam - Năm 1959, Phạm Văn Ngữ đã tiến hành nghiên cứu trên 500 cây thuốc cĩ tác dụng kháng khuẩn mạnh. Năm 1959, Nguyễn Văn Hưởng cùng cộng sự đưa ra chế phẩm Tơ Mộc trị tiêu chảy sau khi nghiên cứu trên 1000 cây thuốc về tính kháng khuẩn (Võ Văn Chi, 1997, 2000) - Năm 2012, Trần Ngọc Hùng và Trương Thị Thành Vinh đã nghiên cứu bước đầu trong điều kiện phịng thí nghiệm cho thấy dịch ép nguyên chất từ cây cỏ mực (Eclipta prostrata L) cĩ tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Streptococus spp (Đỗ Tấn Lợi, 1968) - Qua 20 năm nghiên cứu theo dõi trên động vật và người (1987 - 2007) tập thể của các cán bộ khoa học của Học Viện Quân Y, Viện Lão Khoa, Viện Quân Y 103, Bệnh Viện Lao Và Bệnh Phổi TW, Bệnh Viện Xanh Pơn, Bệnh Viện U Bướu Hà Nội, đã chiết xuất thành cơng Cao tồn phần của lồi Azolla microphylla cĩ tên là Phylamin được thương mại hĩa dưới tên “Mediphylamin” - Năm 2011, Nguyễn Thị Thu Hương đã nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ tỏi (Allium Sativum) đối với một số vi khuẩn gây bệnh ở người (Nguyễn Thị Thu Hương, 2011) 1.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration _MIC) 1.4.1 Khái niệm, ý nghĩa MIC 1.4.1.1 Khái niệm Nồng độ ức chế tối thiểu (minimum inhibitory concentration - MIC) là nồng độ thấp nhất của chất kháng khuẩn cĩ khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật sau khoảng 24 giờ nuơi cấy. (Andrews, 2011) 1.4.1.2 Ý nghĩa Nồng độ ức chế tối thiểu rất quan trọng trong việc xác nhận sự đề kháng của vi khuẩn đối với một tác nhân kháng khuẩn và cũng để theo dõi hoạt động của các tác 21
  35. Đồ án tốt nghiệp nhân kháng khuẩn mới. MIC thường được coi là các đo lường trong phịng thí nghiệm cơ bản nhất của các hoạt động của một tác nhân kháng khuẩn chống lại một chủng vi sinh vật Nồng độ ức chế tối thiểu về mặt lâm sàng được sử dụng khơng chỉ để xác định lượng thuốc mà bệnh nhân sẽ nhận được, do đĩ hạn chế khả năng kháng thuốc của vi khuẩn Chỉ số MIC cĩ tác dụng là tiêu chuẩn so sánh để lựa chọn chất diệt khuẩn phù hợp với từng loại vi sinh vật Việc loại trừ sạch vi khuẩn cĩ thể dự đốn dựa vào dữ liệu MIC. Chọn được nồng độ tối ưu để làm chậm sự phát triển của vi khuẩn kháng thuốc. Ngồi ra cịn cĩ ý nghĩa về: + Dược động học (pharmacokinetics = PK): là sự thay đổi nồng độ của chất diệt khuẩn thay đổi theo thời gian. + Dược lực học (pharmacodynamics = PD) : là mối quan hệ giữa nồng độ với hiệu quả của một chất diệt khuẩn trên vi sinh vật gây bệnh 1.4.3 Sơ lược về một số phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Các phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu được phân loại thành 3 nhĩm chính: khuếch tán, pha lỗng và phương pháp bioautographic. 1.4.3.1 Phương pháp khuếch tán trên thạch (agar-diffusion methods) Trong kỹ thuật khuếch tán, một giếng chứa các hợp chất thử nghiệm ở một nồng độ nhất định được đưa vào tiếp xúc với một mơi trường đã cấy vi sinh vật và đường kính ức chế xuất hiện xung quanh các giếng chứa được đo tại đầu và cuối trong thời gian ủ vi sinh vật. Ở phương pháp này, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được định nghĩa là nồng độ thấp nhất cĩ thể ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật cĩ thể nhìn thấy. Các phương pháp được sử dụng phổ biến như phương pháp đĩa giấy khuếch tán hoặc khuếch tán qua giếng thạch. Phương pháp khuếch tán khơng thích hợp để thực hiện trên mẫu khơng phân cực hoặc các mẫu khơng thể khuếch tán vào mơi trường thạch (Paul Cos và ctv, 2006) 22
  36. Đồ án tốt nghiệp 1.4.3.2 Phương pháp pha lỗng (dilution methods) Trong phương pháp pha lỗng, các hợp chất thử nghiệm được thêm vào mơi trường thích hợp đã được bổ sung vi sinh vật. Phương pháp thường được sử dụng phổ biến là pha lỗng trong mơi trường lỏng, so độ đục và dựa vào chất oxi hĩa khử. Độ đục cĩ thể được ước tính một cách trực quan hoặc xác định chính xác hơn bằng cách đo mật độ quang ở 405 nm. Tuy nhiên, khơng phải mẫu thử nghiệm nào củng hịa tan hồn tồn vào mơi trường, nên sẽ gây ảnh hưởng đến độ đục, vì vậy cần phải thực hiện đối chứng âm và dương để so sánh với kết quả thí nghiệm. Hiện nay các chất oxi hĩa khử MTT và resazurin thường được sử dụng để xác định số lượng vi khuẩn (Eloff, 1998; Gabrielson và ctv, 2002) và phát triển của nấm (Jahn và ctv, 1995; Pelloux-Prayeret và ctv, 1998). Resazurin cĩ lợi thế khơng kết tủa khi cho vào mơi trường, cho phép đọc trực tiếp, dễ thực hiện. Phương pháp pha lỗng phương pháp pha lỗng thích hợp cho khảo nghiệm chiết xuất hoặc hợp chất phân cực và khơng phân cực để xác định giá trị MIC và MBC/MFC. (Paul Cos và ctv, 2006) 1.4.4 Một số kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên thực vật 1.4.4.1 Tình hình nghiên cứu MIC trên thế giới Năm 2005, Mullika đã tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của 19 loại thảo dược lên hai lồi vi khuẩn Probionibacterium acnes và Staphylococcus epidermidis bằng phương pháp thạch. Kết quả cho thấy 13 loại thuốc thảo dược cĩ ảnh hưởng đến sự phát triển của hai lồi vi khuẩn trên mơi trường thạch. Trong đĩ, Garcinia mangostana là thuốc cĩ tác dụng mạnh nhất, với giá trị MIC nhỏ nhất (39 ppm). Điều đặc biệt là giá trị MIC của thảo dược này trên cả hai lồi vi khuẩn thì bằng nhau. (Mullika và ctv, 2005). Năm 2007, Kumar cũng tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của thảo dược lên hai lồi vi khuẩn Probionibacterium acnes và Staphylococcus epidermidis, với 12 loại thuốc thảo dược hemidesmus indicus, eclipta alba, coscinium fenestratum, curcubito pepo, tephrosia purpurea, mentha piperita, pongamia pinnata, symplocos racemosa, euphorbia hirta, tinospora 23
  37. Đồ án tốt nghiệp cordyfolia, thespesia populnea, jasminum officinale. Qua phương pháp thạch cĩ 7 loại thuốc cho kết quả ức chế sự phát triển của hai lồi vi khuẩn này trên mơi trường thạch. Và qua phương pháp pha lỗng xác định được nồng độ ức chế của Coscinium fenestratum trên hai lồi vi khuẩn này bằng nhau và nhỏ nhất. Giá trị MIC trên hai lồi vi khuẩn là 49ppm. (Kumar và ctv, 2007) Chiết suất methanol và acetone từ nhiều cây nấm cĩ tác dụng trên vi khuẩn baccilus cereus, Staphylococcus aureus, listeria monocitogenes, Escherichia coli, salmonella infantis. Qua phương pháp pha lỗng xác định được khoảng giá trị MIC của các chiết suất này từ165 – 2640 mg/ml. B.cereus nhạy với hầu hết các chiết suất từ cinnamomumcassia, azadirachta indica, ruta graveolén, rumex nervosus với khoảng MIC từ 165 – 660 mg/ml. Chiết suất từ Cinnamomum cassia chỉ cĩ hiệu quả trên vi khuẩn E.coli, S. infantis ở giá trị MIC cao nhất (2640 mg/ml) (Mohan & ctv, 2004) Năm 2005, thí nghiệm kiểm tra tác dụng của ethyl acetate và n-butanol chiết suất từ vỏ quả Punica granatum lên E. coli O157:H7, E. coli O26:H11, E. coli O111:NM và E.coli O22 bằng phương pháp thạch. Xác định được giá trị MIC của cả hai chiết suất này lên E. coli O157:H7 là nhỏ nhất (50 ppm). Giá trị MIC của ethyl acetate chiết suất từ Centaurealên vi khuẩn Staphylococcus aureus là 62,5 ppm, thấp hơn so với giá trị MIC của chloramphenicol (125 ppm), nghĩa là ethyl acetate cĩ tác dụng mạnh hơn chloramphenicol lên vi khuẩn Staphylococcus aureus (Kiymet & ctv, 2005) 24
  38. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện tại Phịng Thí Nghiệm Khoa Cơng nghệ Sinh học – Thực phẩm – Mơi trường, Trường Đại học Cơng Nghệ Tp. HCM. 2.1.2 Địa điểm thu mẫu Nguồn mẫu được thu tại Vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng 2.1.3 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 5/2015 đến tháng 8/2015 2.2.Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Tồn bộ mẫu cây Medinilla sp. gồm lá, thân, cành 2.2.2 Vi khuẩn chỉ thị Vi khuẩn chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu là 16 chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh – Khoa sinh học bao gồm: - Nhĩm vi khuẩn Salmonella spp. gồm S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium, S. dublin. - Nhĩm vi khuẩn Escherichia coli gồm E. coli, ETEC, E. coli 0208, E. coli O157:H7 - Nhĩm vi khuẩn Shigella spp. gồm Shi. sonnei, Shi. boydii, Shi. flexneri. - Các vi khuẩn gây bệnh khác: L. monocytogenes, L. innocua, Enterococcus feacalis, Staphylococcus aureus. Và nhĩm vi khuẩn Vibiro: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. Harveyi. V. cholerae được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Nuơi trồng Thuỷ sản II 2.2.3 Mơi trường 2.2.3.1 Hĩa chất Resazurin NaCl 25
  39. Đồ án tốt nghiệp Mơi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Ðộ). Mơi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Ðộ). DMSO – Dimethyl Sulfoxide Glycerol. 2.2.3.2. Dụng cụ và thiết bị a. Dụng cụ Ống nghiệm Dụng cụ đục lỗ Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml Thước đo Ống đong 100 ml Bơng thấm và bơng khơng thấm Pipet 1ml, 10 ml nước Ống ly tâm ependoff 2 ml Ðũa thuỷ tinh Bình mơi trường 250 ml, 500 Các loại đầu típ ml, 1000 ml Micropipette 100 µl, 1000 µl Dây cấy ria, que cấy trang Các loại dụng cụ khác như: bao chịu Đèn cồn nhiệt, kéo, giấy giĩi, kẹp gấp, Đĩa petri muỗng, dao, thun, b. Thiết bị Autoclave (Huxky Ðài Loan) Máy đo UV – VIS (Hach) Tủ ấm 300C, 370C (Memmert Đức) Cân phân tích (Orbital Đức) Máy ly tâm (Tuttligen Đức) Bếp từ (Billy – Anh) Máy đo pH (Hach – Đức) Máy nước cất (Branstead USA) 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu và tách chiết các hợp chất từ thực vật Mục đích: Tách chiết các hợp chất cĩ khả năng kháng khuẩn từ thực vật nhằm phục vụ cho các nghiên cứu về sau. Nguyên tắc: Sử dụng các loại dụng mơi để tách chiết các hợp chất cĩ trong cây thuốc nhờ lực liên kết hĩa học nhờ đĩ ta cĩ thể lơi kéo các chất cần thiết ra khỏi mẫu cây thuốc. 26
  40. Đồ án tốt nghiệp Phương pháp: Mẫu cây thuốc tươi được rửa sạch để lại bỏ bụi bẩn rồi đem đi phơi khơ rồi nghiền thành dạng bột. Bột cây thuốc sẽ được ngâm với dung mơi trong 24 giờ để trích ly hợp chất, sau đĩ lọc lấy dịch lọc. Bã đem ngâm lại với dung mơi, lặp lại từ 3 đến 5 lần cho đến khi dịch lọc trong. Dịch lọc sẽ được loại bỏ dung mơi để giữ lại phần cao chiết bằng cách cơ quay chân khơng ở nhiệt độ nhỏ hơn 500C hoặc cơ cách thủy ở nhiệt độ 700C. Cao chiết thu được sẽ được bảo quản ở nhiệt độ -40C (Atta và Mouneir, 2004) 2.3.2. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị Mục đích: Hoạt hố các vi khuẩn cĩ sẵn trong mẫu phát triển lại bình thường vì chúng cĩ thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Đây cũng là bước đầu giúp thu sinh khối vi khuẩn nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuơi cấy vi sinh vật trên mơi trường dinh dưỡng thích hợp. Mơi trường dinh dưỡng khơng những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà cịn phải đảm bảo cĩ đủ các điều kiện hố lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và mơi trường. Phương pháp: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên mơi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml mơi trường TSB. Sau đĩ tiến hành lắc với tốc độ 150 vịng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phịng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục mơi trường nuơi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013). 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên mơi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đĩ các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 50C) để bảo quản. Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luơn được chuyển đến mơi trường mới trước khi già và chết. Tuỳ từng nhĩm vi sinh 27
  41. Đồ án tốt nghiệp vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển một lần. Đối với giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật chỉ thị: Cấy chuyển định kỳ 1 tháng/lần trong ống thạch nghiêng chứa mơi trường TSA và bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 40C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngồi phương pháp giữ giống trên mơi trường thạch nghiêng, cĩ thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào cĩ thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol. Phương pháp: Vi khuẩn được tăng sinh trong mơi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn cĩ chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.4. Phương pháp pha lỗng vi sinh vật Nguyên tắc: Pha lỗng mẫu là một trong những cơng đoạn cơ bản nhưng cĩ vai trị rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha lỗng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật. Phương pháp pha lỗng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu. Phương pháp: Đối với mẫu lỏng: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha lỗng, khi đĩ ta sẽ được nồng độ pha lỗng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha lỗng ta được nồng độ pha lỗng 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần thiết. 28
  42. Đồ án tốt nghiệp Đối với mẫu rắn: Cân chính xác 10 gram mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha lỗng ta được nồng độ pha lỗng 10-1. Sau đĩ tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1ml dịch pha lỗng ở nồng độ pha lỗng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha lỗng ta được nồng độ pha lỗng 10-2. Và tiếp tục pha lỗng tương tự như mẫu lỏng. (Phạm Minh Nhựt, 2013). 2.3.5 Phương pháp xác định mật độ tế bào Cơng thức tính tốn xác định mật độ tế bào (cơng thức McFahrland): 9 Mật độ = OD600 x 1,02 x 10 (cfu/ml) 2.3.6 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar) (Sen và Batra, 2012) Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng trực tiếp của chất kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị trên mơi trường nuơi cấy. Chất kháng khuẩn cĩ khả năng khuếch tán trong mơi trường agar và tác động lên vi khuẩn chỉ thị. Nếu chất kháng khuẩn kháng được vi khuẩn chỉ thị thì sẽ xuất hiện vịng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Phương pháp: Vi khuẩn được tăng sinh và pha lỗng để đạt nồng độ 106 cfu/ml. Sau đĩ cấy trang vi khuẩn trên mơi trường TSA. Dùng ống thép khơng gỉ (đường kính 6 mm) tiến hành đục lỗ thạch. Nhỏ cao đã pha lỗng với nồng độ cần khảo sát vào các giếng trên đĩa. Sau đĩ đĩa thạch được ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ cho vi khuẩn chỉ thị phát triển. Sau 24 giờ, tiến hành đo đường kính vịng kháng khuẩn quanh miệng giếng trên đĩa -> Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch cao đối với các vi khuẩn chỉ thị. 29
  43. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1. Hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100 mg/ml) đối với chủng Escherichia coli O157 :H7 2.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên mơi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin (broth dilution resazurin method) (Banfi và ctv, 2003) Nguyên tắc: Dựa trên sự thay đổi màu của resazurin theo thời gian phụ thuộc vào sự hoạt động của vi sinh vật, điều đĩ cĩ nghĩa là phản ứng với resazurin cho ta biết mức độ hoạt động của vi sinh vật hơn là số lượng của chúng. Phương pháp: Chuẩn bị dung dịch resazurin bằng cách hịa tan một viên resazurin vào 50 ml nước cất vơ trùng. Chuẩn bị ống nghiệm vơ trùng. Thêm cao pha lỗng với nồng độ khảo sát và vi khuẩn đã được tăng sinh và pha lỗng (106 cfu/ml) vào ống nghiệm đã được bổ sung mơi trường TSB. Sau đĩ đem các ống nghiệm ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ cho vi khuẩn chỉ thị phát triển. Sau 24 giờ, thêm vào các ống nghiệm chất chỉ thị resazurin. Sự thay đổi màu sắc được đánh giá trực quan, bất kỳ thay đổi màu sắc từ tím sang màu hồng hoặc mất màu được ghi nhận là dương tính với sự hoạt động của vi sinh vật trong ống nghiệm. Nồng độ thấp nhất mà tại đĩ sự thay đổi màu xảy ra được xác định là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). 30
  44. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2. Sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị resazurin 2.3.8 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp đĩa giấy khuếch tán (disc diffusion method) (Ahmad, 2011) Nguyên tắc: Đĩa giấy sẽ hấp thu nước từ mơi trường thạch, dịch cao hịa tan và bắt đầu khuếch tán vào thạch cĩ chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với dịch cao được biểu hiện bằng đường kính các vùng ức chế xung quanh khoanh giấy. Phương pháp: Vi khuẩn được tăng sinh và pha lỗng để đạt nồng độ 106 cfu/ml. Sau đĩ cấy trang vi khuẩn trên mơi trường TSA. Đặt các khoanh giấy (d = 6mm) lên mặt thạch, sau đĩ nhỏ dịch cao đã pha lỗng với nồng độ (100mg/ml; 50mg/ml; 25mg/ml; 12,5mg/ml) vào các đĩa. Sau đĩ đĩa thạch được ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ cho vi khuẩn chỉ thị phát triển. Sau 24 giờ, tiến hành đo đường kính vùng ức chế -> Nồng độ thấp nhất xuất hiện vùng ức chế được xác định là giá trị MIC (Anja Klancnik, 2010) 31
  45. Đồ án tốt nghiệp 100mg/ml 50mg/ml Hình 2.3. Đường kính vùng ức chế của cao chiết Medinilla sp. đối với chủng Shi. sonnei 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey. So sánh thống kê bằng phương pháp One way – ANOVA ở mức tin cậy 95% 2.4 Bố trí thí nghiệm Tiến trình thí nghiệm tổng quát được trình bày ở hình 2.4 32
  46. Đồ án tốt nghiệp Mẫu cây Medinilla sp. Xử lý mẫu Cao thuốc Xác định hoạt tính kháng khuẩn Xác định giá trị MIC của cao ethanol trên các chủng vi sinh vật Phương pháp khuếch Phương pháp pha lỗng Phương pháp đĩa tán trên giếng thạch trên mơi trường lỏng bổ giấy khuếch tán (agar well diffusion sung resazurin (broth (disc diffusion assay) assay ) dilution resazurin method) [3.1] [3.2] Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 2.4.1 Thí nghiệm 1: Tách chiết cao ethanol từ cây Medinilla sp. 2.4.1.1 Sơ đồ tách chiết Mẫu cây Medinilla sp. Phơi khơ, xay nhuy ễn Ngâm ethanol 70% Tỷ lệ 1:20 (w/v) Lọc tinh Bã o Cơ cách thủy 70 C Cao Medinilla sp. Hình 2.5. Quy trình tách chiết cao ethanol 70% 33
  47. Đồ án tốt nghiệp 2.4.1.2 Thuyết minh quy trình Mẫu cây Medinilla sp. tươi được rửa sạch để loại bỏ bụi bẩn và đem đi phơi khơ. Cây khi đã khơ được đem xay thành dạng bột. Sau đĩ tiến hành cân 5g bột cây và ngâm trong 100ml ethanol 70% theo tỷ lệ 1 : 20 (w/v) ở nhiệt độ phịng trong 24 giờ. Sau 24 giờ, tiến hành lọc tinh thu lấy dịch lọc. Bã được ngâm tiếp với dung mơi từ 3-5 lần cho đến khi màu sắc dịch lọc khơng thay đổi. Tất cả các dịch lọc thu được qua các lần ngâm được hịa trộn và đem đi cơ cách thủy ở 700C cho đến khi đuổi hết dung mơi, ta thu được cao chiết ethanol 70%. Cao chiết được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 40C để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 2.6. Dịch lọc mẫu ethanol 70% 2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol 70% từ cây Medinilla sp. bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion assay) 34
  48. Đồ án tốt nghiệp Vi sinh vật chỉ thị Mơi trường TSA Cao ethanol 70% DMSO 1% Tăng sinh Đổ đĩa Dịch cao nồng độ 100mg/ml Đo OD Đục lỗ thạch (d=6mm) 600nm Pha lỗng để đạt nồng Nhỏ 100 μl cao pha lỗng 6 độ 10 cfu/ml vào các giếng 0 Hút 100 µl cấy trang Ủ 37 C trong 24 giờ Hình 2.7. Quy trình xác định hoạt tính kháng khuẩn Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai chứa 10 ml mơi trường TSB (hoặc TSB + 1.5% NaCl đối với các chủng Vibrio spp. Sau đĩ nuơi cấy ở 150 vịng/phút ở nhiệt độ phịng trong 18 giờ. Tiến hành đo dịch tăng sinh ở bước sĩng 600nm đê xác định mật độ. Sau đĩ dịch vi khuẩn được pha lỗng để đạt mật độ 106 CFU/ml. Hút 0.1 ml dịch khuẩn đã pha lỗng nhỏ lên mặt đĩa mơi trường thạch TSA, tiến hành trang dịch vi khuẩn trên đĩa cho tới khi khơ hồn tồn. Các đĩa thạch sau đĩ được đục 3 lỗ đường kính với mỗi lỗ là 6mm. Cao chiết Medinilla sp. được pha trong DMSO 1% ở nồng độ 100 mg/ml. Hút 100μl dịch cao chiết và nhỏ vào các giếng trong đĩa mơi trường TSA đã được đục lỗ trước đĩ. Đem ủ ở 370C trong vịng 24 giờ. Đối chứng âm sử dụng DMSO 1%, đối chứng dương sử dụng Ciprofoxacin ở nồng độ 500 µg/ml. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Quan sát: Sau 24 giờ, nếu lỗ nào cĩ vịng kháng khuẩn xung quanh, chứng tỏ cao ethanol 70% cĩ kháng chủng vi khuẩn đĩ. Từ kết quả kháng khuẩn đĩ, sử dụng cao ethanol 70% tiếp tục làm thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 2.4.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu quy trình xác định chỉ sơ MIC của cao chiết ethanol 70% từ cây Medinilla sp. 35
  49. Đồ án tốt nghiệp Kết thúc thí nghiệm 2, xác định được cao chiết cĩ hoạt tính kháng khuẩn với chủng nào và cao chiết này được sử dụng để xác định chỉ số MIC đối với các chủng đối kháng. Tiến trình khảo sát chỉ số MIC được trình bày ở hình 2.8, hình 2.9 và hình 2.10 2.4.3.1 Thí nghiệm 3.1 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch Vi sinh vật chỉ thị Mơi trường TSA Cao ethanol 70% Tăng sinh Đổ đĩa 100 µl Pha lỗng bằng Cấy trang DMSO 1% thành Đo OD Đục lỗ thạch (d=6mm) dãy nhiều nồng độ 600nm theo cấp số 2 Pha lỗng để đạt nồng Nhỏ 100μl cao pha 6 độ 10 cfu/ml lỗng vào các giếng 0 Ủ 37 C trong 24 giờ Đọc kết quả Hình 2.8. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai chứa 10 ml mơi trường TSB (hoặc TSB + 1,5% NaCl đối với các chủng Vibrio spp. Sau đĩ nuơi cấy ở 150 vịng/phút ở nhiệt độ phịng trong 18 giờ. Tiến hành đo dịch tăng sinh ở bước sĩng 600nm đê xác định mật độ. Sau đĩ dịch vi khuẩn được pha lỗng để đạt mật độ 106 CFU/ml. Hút 0.1 ml dịch khuẩn đã pha lỗng nhỏ lên mặt đĩa mơi trường thạch TSA, tiến hành trang dịch vi khuẩn trên đĩa cho tới khi khơ hồn tồn. Các đĩa thạch sau đĩ được đục 3 lỗ đường kính với mỗi lỗ là 6mm. 36
  50. Đồ án tốt nghiệp Cao Medinilla sp. được pha lỗng liên tiếp trong DMSO 1% thành dãy nhiều nồng độ theo cấp số 2: 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12,5 mg/ml. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Quan sát: Sau 24 giờ, kiểm tra sự tạo vịng kháng. MIC được xác định là nồng độ thấp nhất của dịch cao ethanol cĩ sự xuất hiện vùng ức chế xung quang miệng giếng. 2.4.3.2 Thí nghiệm 3.2 Phương pháp pha lỗng trên mơi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin Cao ethanol 70% Ống nghiệm vơ VSV chỉ thị trùng Pha lỗng bằng Mơi trường TSB Tăng sinh DMSO 1% thành dãy nhiều nồng độ theo cấp số 2 Ủ 370C trong 24 Đo OD600nm giờ Tỷ lệ 1:3 (v/v) Pha lỗng để đạt nồng độ Thêm resazurin 6 (tỷ lệ 1:10 (v/v)) 10 cfu/ml Quan sát sự thay đổi màu sắc Xác định MIC Hình 2.9. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp pha lỗng trên mơi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin Cao Medinilla sp. được pha lỗng liên tiếp trong DMSO 1% thành dãy nhiều nồng độ theo cấp số 2: 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12,5 mg/ml. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần 37
  51. Đồ án tốt nghiệp Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai chứa 10 ml mơi trường TSB (hoặc TSB + 1,5% NaCl đối với các chủng Vibrio spp. Sau đĩ nuơi cấy ở 150 vịng/phút ở nhiệt độ phịng trong 18 giờ. Tiến hành đo dịch tăng sinh ở bước sĩng 600nm đê xác định mật độ. Sau đĩ dịch vi khuẩn được pha lỗng để đạt mật độ 106 CFU/ml. Từ dịch tăng sinh, hút 1ml vi khuẩn vào ống nước muối sinh lý 9 ml, khi đĩ ta sẽ được nồng độ pha lỗng là 10-1.Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp một thể tích vi khuẩn được tính theo cơng thức Mc Farland vào các ống nghiệm (chứa 3ml mơi trường TSB và 1ml dịch cao chiết ở các nồng độ). Ủ tất cả các ống nghiệm trong tủ ấm 370C trong 24 giờ. Đối chứng âm sử dụng ống nghiệm chứa 3ml mơi trường TSB bổ sung dịch vi khuẩn. Đối chứng dương sử dụng ống nghiệm chứa 3ml mơi trường TSB bổ sung dịch cao chiết ở các nồng độ. Sau 24 giờ, bổ sung chất chỉ thị resazurin theo tỷ lệ 1:10 (v/v) Quan sát: Sự thay đổi màu sắc trong ống nghiệm so với đối chứng âm. Nồng độ thấp nhất mà tại đĩ sự thay đổi màu sắc từ tím sang màu hồng hoặc mất màu xảy ra được xác định là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) (Banfi và ctv, 2003) 2.4.3.3 Thí nghiệm 3.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán Đĩa giấy lọc (d=6mm) Mơi trường TSA Vi sinh vật Hấp tiệt trùng Đổ đĩa Tăng sinh Cao ethanol 70% pha Đặt đĩa giấy Đo OD600nm lỗng bằng DMSO 1% thành dãy nhiều nồng Nhỏ 10µl lên các đĩa Pha lỗng để đạt độ theo cấp số 2 giấy nồng độ 106 cfu/ml Ủ 370C trong 24 giờ Cấy trang 100µl Đọc kết quả Hình 2.10. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp đĩa giấy khuếch tán 38
  52. Đồ án tốt nghiệp Cao Medinilla sp. được pha lỗng liên tiếp trong DMSO 1% thành dãy nhiều nồng độ theo cấp số 2: 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12,5 mg/ml. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai chứa 10 ml mơi trường TSB (hoặc TSB + 1,5% NaCl đối với các chủng Vibrio spp. Sau đĩ nuơi cấy ở 150 vịng/phút ở nhiệt độ phịng trong 18 giờ. Tiến hành đo dịch tăng sinh ở bước sĩng 600nm đê xác định mật độ. Sau đĩ dịch vi khuẩn được pha lỗng để đạt mật độ 106 cfu/ml. Hút 0.1 ml dịch khuẩn đã pha lỗng nhỏ lên mặt đĩa mơi trường thạch TSA, tiến hành trang dịch vi khuẩn trên đĩa cho tới khi khơ hồn tồn. Đặt đĩa giấy đã hấp tiệt trùng (d = 6mm) lên mặt thạch. Sau đĩ nhỏ 10 µl dịch cao chiết theo nồng độ lên đĩa giấy. Ủ ở 370C trong 24 giờ Quan sát: Sau 24h, tiến hành đo đường kính vùng ức chế -> Nồng độ thấp nhất xuất hiện vùng ức chế được xác định là giá trị MIC. 39
  53. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol từ cây Medinilla sp. Cao ethanol từ cây Medinilla sp. được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị với nồng độ 100 mg/ml 3.1.1 Đối với nhĩm vi khuẩn Escherichia coli Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của cao ethanol 70% (MEE) ở nồng độ 100 mg/ml (MEE) và ciprofloxacin (500 µg/ml) đối với nhĩm vi khuẩn E. coli được trình bày ở Hình 3.1 a a b a a a a Đường kínhvịng ức chế(mm) b *Những giá trị trên cùng một chủng cĩ chữ cái khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Hình 3.1. Hoạt tính ức chế của MEE (100mg/ml) và ciprofloxacin (500µg/ml) đối với nhĩm Escherichia coli Dựa vào hình 3.1, chúng tơi nhận thấy rằng MEE ở nồng độ 100 mg/ml cĩ hoạt tính đối kháng với tất cả các chủng E. coli khảo sát với đường kính vùng ức chế chế từ 12,5 mm đến 15 mm. Điều này chứng tỏ rằng, nhĩm Escherchia coli khảo sát nhạy cảm đối với MEE. Trong đĩ, MEE cĩ khả năng ức chế mạnh đối với chủng ETEC (đường kính vịng ức chế là 14,7 mm). So với kết quả kháng khuẩn của ciprofloxacin (500 µg/ml) thì hoạt tính kháng khuẩn của MEE cũng khá tương đồng. Đối với chủng E. coli O157 :H7, E. coli, hoạt tính kháng khuẩn của MEE 40
  54. Đồ án tốt nghiệp tương đồng với ciprofloxacin (500 µg/ml) và khơng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Đối với chủng E. coli 0208, hoạt tính kháng khuẩn của MEE cao hơn một cách ý nghĩa thống kê (P 0,05). Tuy nhiên, đối với chủng S. dublin, S. typhi và S. typhimurium, hoạt tính kháng khuẩn của MEE cao hơn một cách ý nghĩa 41
  55. Đồ án tốt nghiệp thống kê (P < 0,05) so với ciprofloxacin (500 µg/ml). Điều này chứng tỏ, MEE thể hiện đặc tính kháng khuẩn mạnh và cĩ hoạt tính tốt hơn kháng sinh đối với nhĩm Salmonella spp. ở một nồng độ khảo sát nhất định 3.1.3 Đối với nhĩm Shigella spp. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của MEE và ciprofloxacin (500 µg/ml) trên nhĩm vi khuẩn Shigella spp. được trình bày ở hình 3.3 *Những giá trị trên cùng một chủng cĩ chữ cái khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Hình 3.3. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (500 µg/ml) đối với nhĩm Shigella spp. Dựa vào hình 3.3, chúng tơi nhận thấy MEE cĩ khả năng đối kháng với tất cả 3 chủng trong nhĩm Shigella spp. và đường kính vịng ức chế từ 13,7 mm đến 14,7 mm. khi so sánh với khả năng ức chế các chủng Shigella spp. với ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml thì hoạt tính kháng khuẩn của MEE cĩ sự khác biệt về mặt thống kê. Đối với chủng Shi. flexneri và Shi. boydii, hoạt tính kháng khuẩn của MEE cao hơn một cách ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với ciprofloxacin (500 µg/ml). Một điểm đặc biệt khi tiến hành khảo sát khả năng hoạt tính kháng khuẩn của MEE ở nồng độ 100 mg/ml và ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml đối với Shi.boydii là chủng này cĩ khả năng kháng lại kháng sinh nhưng lại nhạy cảm với 42
  56. Đồ án tốt nghiệp MEE. Điều đĩ chứng tỏ MEE là loại cao chiết cĩ hoạt tính sinh học rất tốt và cĩ tiềm năng trong việc ứng dụng để xử lý các nhĩm vi khuẩn kháng kháng sinh. 3.1.4 Đối với nhĩm Vibrio spp. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của MEE và ciprofloxacin (8 µg/ml) trên nhĩm vi khuẩn Vibrio spp. được trình bày ở hình 3.4 *Những giá trị trên cùng một chủng cĩ chữ cái khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (P 0,05). Trên chủng V. parahaemolyticus, hoạt tính kháng khuẩn của MEE cao hơn một cách ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với ciprofloxacin (500 µg/ml) nhưng đối với chủng V. alginolyticus và V. harveryi thì ngược lại, hoạt tính kháng của MEE lại thấp hơn một cách ý nghĩa thống kê (P < 0,05) khi so với ciprofloxacin ở nồng độ 500µg/ml. 43
  57. Đồ án tốt nghiệp 3.1.5 Đối với nhĩm chủng vi sinh vật gây bệnh khác Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của MEE và ciprofloxacin (8 µg/ml) trên các chủng vi sinh vật gây bệnh khác được trình bày ở hình 3.5 *Những giá trị trên cùng một chủng cĩ chữ cái khác nhau thì khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Hình 3.5. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (500µg/ml) đối với các chủng vi sinh vật gây bệnh khác Dựa vào hình 3.5, chúng tơi nhận thấy MEE cĩ khả năng đối kháng với tất cả 5 chủng vi sinh vật gây bệnh và đường kính vịng ức chế từ 13,8 mm đến 14,2 mm. Khi so sánh với khả năng ức chế các chủng vi sinh vật gây bệnh khác của ciprofloxacin (500 µg/ml) thì hoạt tính kháng khuẩn của MEE cao hơn một cách ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Điều này chứng tỏ rằng, MEE thể hiện đặc tính kháng khuẩn mạnh và cĩ hoạt tính tốt hơn kháng sinh đối với nhĩm vi sinh vật gây bệnh khác Như vậy, kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol 70% từ cây Medinilla sp. (MEE) ở nồng độ 100mg/ml đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị thuộc 5 nhĩm được trình bày trong bảng 3.1. 44
  58. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Kết quả đối kháng của MEE với 20 chủng vi sinh vật khảo sát Chủng vi sinh vật Ethanol 70% Đối chứng Escherichia coli O157:H7 13,3 ± 0,764 13,2 ± 0,289 Escherichia coli 0208 13,8 ± 0,289 12,3 ± 0,289 Escherichia coli 13,3 ± 0,764 13,2 ± 0,289 E.coli-ETEC 14,7 ± 0,577 31,0 ± 0,500 Listeria innocua 14,2 ± 0,289 12,0 ± 0,500 Listeria monocytogenes 13,8 ± 0,764 12,2 ± 0,289 Salmonella dublin 14,3 ± 0,764 12,2 ± 0,764 Salmonella enteritidis 13,3 ± 1,041 13,0 ± 0,500 Salmonella typhi 14,5 ± 0,000 12,5 ± 0,500 Salmonella typhimurium 13,8 ± 1,041 11,0 ± 0,000 Shigella boydii 14,7 ± 0,577 0,0 ± 0,000 Shigella flexneri 14,5 ± 0,500 13,2 ± 0,289 Shigella sonnei 13,7 ± 0,289 33,0 ± 0,500 Vibrio alginolyticus 14,0 ± 1,000 16,2 ± 0,289 Vibrio cholerae 12,5 ± 0,866 13,3 ± 0,577 Vibrio harveyi 13,8 ± 1,041 18,0 ± 0,500 Vibrio parahaemolyticus 12,2 ± 0,289 11,3 ± 0,289 Pseudomonas aeruginosa 13,8 ± 0,289 12,2 ± 0,577 Staphylococcus aureus 14,8 ± 0,289 12,2 ± 0,289 Enterococcus feacalis 13,8 ± 0,764 12,0 ± 0,500 Vùng ức chế (mm) bao gồm đường kính của giếng (d = 6 mm) Cao ethanol 70% (100 mg/ml); Đối chứng : Ciprofloxacin (500µg/ml) đối với 16 chủng, ciprofloxacin (8µg/ml) đối với nhĩm Vibrio spp.; Số liệu là trung bình của 3 lần lặp lại (trung bình ± SD). Dựa vào bảng 3.1, kết quả cho thấy MEE cĩ phổ kháng khuẩn rất rộng. Ở nồng độ 100 mg/ml, MEE cĩ hoạt tính đối kháng với 20/20 chủng vi khuẩn khảo sát. Song song với phổ kháng khuẩn rộng, MEE cịn thể hiện hoạt tính kháng tương đối cao với đường kính vịng ức chế từ 12,2 mm đến 14,8 mm. Trong đĩ, MEE thể 45
  59. Đồ án tốt nghiệp hiện hoạt tính mạnh nhất đối với chủng S. aureus (14,8mm) và thấp nhất là chủng V. parahaemolyticus (12,2mm). Điều này chứng tỏ rằng bản thân cây Medinilla sp. cĩ rất nhiều các hợp chất cĩ hoạt tính sinh học cao nĩi chung và cĩ hoạt tính kháng khuẩn nĩi riêng, đồng thời các hợp chất này hịa tan trong ethanol 70%. Do đĩ, khi sử dụng ethanol 70% để tách chiết, đã thu được cao chiết cĩ hoạt tính sinh học rất tốt. Theo nghiên cứu của Sen và Batra (2012), cao chiết từ cây Melia azedarach L (1 mg/ml) thể hiện hoạt tính mạnh đối với chủng S.aureus và E.coli với đường kính vịng ức chế lần lượt là 19,5mm và 19,6mm (đường kính giếng d = 6mm). Cịn trong nghiên cứu của Oskay (2009) đã tiến hành thử nghiệm khả năng đối kháng của cao chiết từ 19 lồi thực vật (4 mg/ml) trên chủng E. coli và được kết quả cĩ 8/19 lồi thực vật cĩ khả năng kháng mạnh đối với E. coli với đường kính vịng ức chế từ 8 mm đến 14 mm (đường kính giếng d = 6mm), 11/19 lồi thực vật cĩ đường kính vịng ức chế là 6 mm. Từ kết quả của hai nghiên cứu trên, chúng tơi nhận thấy được rằng cao chiết 70% từ cây Medinilla sp. (100mg/ml) cĩ phổ kháng rộng, kháng được nhiều chủng khảo sát, nhưng hoạt tính kháng khuẩn khơng cao, cần phải sử dụng nồng độ lớn (100 mg/ml) để thể hiện tính đối kháng với các chủng vi sinh vật. Tuy nhiên, với mục tiêu khảo sát và chọn lựa quy trình phù hợp trong việc xác định chỉ số MIC của cao chiết thì cao ethanol 70% của cây Medinilla sp. với phổ kháng khuẩn rộng và hoạt tính kháng khuẩn tương đối tốt là đối tượng phù hợp để tiến hành xây dựng. Do đĩ, chúng tơi sử dụng cao chiết ethanol 70% của cây Medinilla sp. để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 3.2 Kết quả xác định chỉ số (MIC) của cao chiết ethanol 70% từ cây Medinilla sp. (MEE) Sau khi xác định được hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol, chúng tơi tiến hành xác định quy trình phù hợp để xác định chỉ số MIC của cao chiết trên các chủng đối kháng. Nồng độ khảo sát lần lượt là 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12,5 mg/ml. 46
  60. Đồ án tốt nghiệp 3.2.1 Xác định chỉ số MIC của cao chiết bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (WDA) Kết quả xác định chỉ số MIC của cao chiết MEE thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch được trình bày trong bảng 3.2. Bảng 3.2. Chỉ số MIC của MEE đối với 20 chủng vi sinh vật khảo sát STT Chủng Giá trị MIC (mg/ml) 1 Escherichia coli O157:H7 50 2 Escherichia coli 0208 50 3 Escherichia coli 12,5 4 E.coli-ETEC 12,5 5 Listeria innocua 25 6 Listeria monocytogenes 25 7 Salmonella dublin 25 8 Salmonella enteritidis 25 9 Salmonella typhi 12,5 10 Salmonella typhimurium 25 11 Shigella boydii 12,5 12 Shigella flexneri 25 13 Shigella sonnei 25 14 Vibrio alginolyticus 25 15 Vibrio cholerae 50 16 Vibrio harveyi 50 17 Vibrio parahaemolyticus 25 18 Pseudomonas aeruginosa 50 19 Staphylococcus aureus 25 20 Enterococcus feacalis 12,5 Qua bảng 3.2 chúng tơi nhận thấy rằng giá trị MIC của MEE đối với 20 chủng khảo sát biến động từ 12,5 mg/ml đến 50 mg/ml khi khảo sát bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Giá trị MIC của cao chiết ethanol của cây 47
  61. Đồ án tốt nghiệp Medinilla sp. khác nhau tùy theo từng chủng vi khuẩn khảo sát khi tiến hành bằng phương pháp này. Đối với nhĩm E. coli, giá trị MIC của MEE biến thiên từ nồng độ 12,5 mg/ml đến 50 mg/ml, trong đĩ giá trị MIC thấp nhất đối với chủng E. coli và ETEC là 12,5 mg/ml. Đối với nhĩm Salmonella spp. và Shigella spp., giá trị MIC được xác định từ 12,5 mg/ml đến 25 mg/ml trong đĩ giá trị MIC thấp nhất đối với hai chủng S. typhii và Shi. boydii. Riêng đối với nhĩm Vibrio spp., giá trị MIC của MEE cao hơn 3 nhĩm vi khuẩn trên, giá trị biến thiên từ 25 mg/ml đến 50 mg/ml. Đối với nhĩm vi khuẩn gây bệnh khác, giá trị MIC của MEE cĩ sự thay đổi khá lớn giữa các chủng, trong đĩ nhạy cảm nhất là chủng Enterococcus feacalis ở nồng độ 12,5 mg/ml, cịn chủng Pseudomonas aeruginosa thì phải đến nồng độ 50mg/ml MEE mới thể hiện được hoạt tính ức chế. Như vậy, kết quả khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của MEE bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch đối với 20 chủng vi sinh vật cho thấy rằng cĩ 5/20 chủng vi khuẩn khảo sát bị ức chế bởi MEE ở nồng độ 50 mg/ml; 10/20 chủng khảo sát bị ức chế ở nồng độ 25 mg/ml; 5/20 chủng bị ức chế ở nồng độ 12,5 mg/ml. Điều này chứng tỏ rằng, giá trị MIC thấp nhất ức chế được vi sinh vật của cao ethanol 70% là 12,5 mg/ml và cao nhất là 50 mg/ml khi đánh giá bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Theo kết quả nghiên cứu của Klancnik và ctv (2010) khảo sát trên nhiều loại chiết xuất từ cây hương thảo thương mại đã xác định được chỉ số MIC bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch đối với chủng Staphylococcus aureus từ 0,635 mg/ml đến >40 mg/ml. Cịn trong nghiên cứu của Akinsulire (2007) giá trị MIC trên chủng S. aures của chiết xuất lá từ cây Kalanchoe crenata là 256 mg/ml. Từ kết quả của hai nghiên cứu trên, chúng tơi nhận thấy rằng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao ethanol 70% thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch cho kết quả tương đối tốt. 3.2.2 Phương pháp pha lỗng trên mơi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin (MDR) 48
  62. Đồ án tốt nghiệp Kết quả chỉ số MIC thực hiện bằng phương pháp pha lỗng trên mơi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin được trình bày trong bảng 3.3 Bảng 3.3. Chỉ số MIC trên 20 chủng vi sinh vật khảo sát bằng phương pháp MDR STT Chủng MIC (mg/ml) 1 Escherichia coli O157:H7 25 2 Escherichia coli 0208 25 3 Escherichia coli 25 4 E.coli-ETEC 12,5 5 Listeria innocua 12,5 6 Listeria monocytogenes 25 7 Salmonella dublin 12,5 8 Salmonella enteritidis 25 9 Salmonella typhii 12,5 10 Salmonella typhimurium 25 11 Shigella boydii 12,5 12 Shigella flexneri 25 13 Shigella sonnei 25 14 Vibrio alginolyticus 25 15 Vibrio cholerae 25 16 Vibrio harveyi 25 17 Vibrio parahaemolyticus 25 18 Pseudomonas aeruginosa 25 19 Staphylococcus aureus 25 20 Enterococcus feacalis 25 Qua bảng 3.3 chúng tơi nhận thấy rằng giá trị MIC của MEE đối với 20 chủng khảo sát biến động từ 12,5 mg/ml đến 25 mg/ml khi khảo sát bằng phương pháp pha lỗng trên mơi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin. Đối với nhĩm E. coli, giá trị MIC của MEE được xác định từ 12,5 mg/ml đến 25 mg/ml, trong đĩ nhạy cảm nhất là chủng ETEC. Đối với nhĩm Salmonella spp., 49
  63. Đồ án tốt nghiệp giá trị MIC của MEE biến thiên từ nồng độ 12,5 mg/ml đến 25 mg/ml, trong đĩ giá trị MIC thấp nhất đối với chủng S.dublin và S. typhi là 12,5 mg/ml. Riêng đối với nhĩm Vibrio spp., giá trị MIC của MEE cao hơn 2 nhĩm vi khuẩn trên, giá trị MIC của MEE là 25 mg/ml. Đối với nhĩm Shigella spp. và nhĩm vi sinh vật gây bệnh khác, giá trị MIC của MEE biến động từ 12,5 mg/ml đến 25 mg/ml, trong đĩ giá trị MIC thấp nhất đối với chủng Shi. boydii và Lis. innocua. Như vậy, kết quả khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của MEE bằng phương pháp pha lỗng trên mơi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin đối với 20 chủng vi sinh vật cho thấy rằng cĩ 15/20 chủng khảo sát bị ức chế ở nồng độ 25 mg/ml; 5/20 chủng bị ức chế ở nồng độ 12,5 mg/ml. Điều này chứng tỏ rằng, giá trị MIC thấp nhất ức chế được vi sinh vật của cao ethanol 70% là 12,5 mg/ml và cao nhất là 25 mg/ml khi đánh giá bằng phương pháp MDR Theo kết quả của Hồng Văn Tuấn (2013), dịch chiết diếp cá giàu flavonoid ức chế vi khuẩn E. coli ở nồng độ thấp nhất là 100 mg/ml cịn trên chủng S. aureus là 50mg/ml bằng phương pháp pha lỗng trên mơi trường lỏng. Giá trị MIC trên vi khuẩn E. coli của chiết xuất ethanol 80% từ lá cây Akk (Calotropis procera) là 21 mg/ml, cịn chiết xuất ethanol 80% từ hoa Akk (Calotropis procera) là 26 mg/ml. Điều này cho thấy cao ethanol 70% từ cây Medinilla sp. cĩ hoạt tính cao, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao ethanol 70% thực hiện bằng phương pháp pha lỗng trên mơi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin cho kết quả tương tốt chỉ với 25 mg/ml cĩ thể ức chế được 15/20 chủng vi sinh vật khảo sát. 3.2.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (DDA) Kết quả chỉ số MIC thực hiện bằng phương pháp đĩa giấy khuếch tán được trình bày trong bảng 3.4 50
  64. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. Chỉ số MIC trên 20 chủng vi sinh vật khảo sát được thực hiện bằng phương pháp DDA STT Chủng MIC (mg/ml) 1 Escherichia coli O157:H7 50 2 Escherichia coli 0208 25 3 Escherichia coli 50 4 Enterotoxigenic E.coli-ETEC 50 5 Listeria innocua 100 6 Listeria monocytogenes 100 7 Salmonella dublin 50 8 Salmonella enteritidis 25 9 Salmonella typhii 12,5 10 Salmonella typhimurium 12,5 11 Shigella boydii 100 12 Shigella flexneri 50 13 Shigella sonnei 50 14 Vibrio alginolyticus 12,5 15 Vibrio cholerae 12,5 16 Vibrio harveyi 100 17 Vibrio parahaemolyticus 25 18 Pseudomonas aeruginosa 100 19 Staphylococcus aureus 50 20 Enterococcus feacalis 100 Qua bảng 3.4, chúng tơi nhận thấy rằng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với 20 chủng khảo sát bằng phương pháp đĩa giấy cĩ giá trị MIC từ 12,5 mg/ml đến 100 mg/ml. Đối với nhĩm E.coli, giá trị MIC của MEE biến động từ 25 mg/ml đến 50 mg/ml, trong đĩ giá trị MIC thấp nhất đối với chủng E. coli 0208. Đối với nhĩm Salmonella spp. giá trị MIC thay đổi từ 12,5 mg/ml đến 50 mg/ml, trong đĩ nhạy 51
  65. Đồ án tốt nghiệp cảm nhất là hai chủng S. typhi và S. typhimurium ở nồng độ 12,5 mg/ml. Đối với nhĩm Vibrio spp. giá trị MIC từ 12,5 mg/ml đến 100 mg/ml, trong đĩ MEE ở nồng độ 100 mg/ml mới cĩ thể ức chế được chủng V. harveyi. Riêng đối với 2 nhĩm Shigella spp., và nhĩm vi sinh vật gây bệnh khác, giá trị MIC của MEE cao hơn 3 nhĩm vi khuẩn trên, giá trị MIC biến thiên từ 50 mg/ml đến 100 mg/ml. Như vậy, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao ethanol 70% từ cây Medinilla sp. bằng phương pháp đĩa giấy khuếch tán thu được kết quả khơng khả quan, 4/20 chủng nhạy ở nồng độ 12,5 mg/ml, trong khi đĩ cĩ đến 13/20 chủng vi sinh vật khảo sát cĩ giá trị MIC từ 50 mg/ml đến 100 mg/ml. Dựa vào kết quả đánh giá chỉ số MIC của cao ethanol 70% từ cây Medinilla sp. đối với 20 chủng vi sinh vật khảo sát thơng qua ba phương pháp bao gồm WDA, MDR và DDA, chúng tơi nhận thấy rằng kết quả xác định chỉ số MIC của MEE cĩ sự khác biệt khá lớn giữa ba phương pháp khảo sát. Xét về độ nhạy của ba phương pháp trong việc xác định chỉ số MIC, chúng tơi nhận thấy rằng phương pháp MDR cĩ độ nhạy cao hơn hai phương pháp cịn lại vì cĩ khoảng phát hiện giá trị MIC từ 12,5 mg/ml đến 25 mg/ml đối với tất cả các chủng vi khuẩn khảo sát trong khi đĩ phương pháp WDA cĩ độ nhạy trung bình từ 12,5 mg/ml đến 50 mg/ml, cịn phương pháp DDA thì khoảng phát hiện cao từ 12,5 mg/ml đến 100 mg/ml, điều này chứng tỏ phương pháp đĩa giấy khuếch tán cĩ độ nhạy thấp. Xét trên phương diện độ chính xác của giá trị MIC thì ba phương pháp cũng cĩ sự khác biệt nhau. Khi so sánh giá trị MIC được xác định qua ba phương pháp với kết quả hoạt tính kháng khuẩn của MEE trong thí nghiệm 2, chúng tơi nhận thấy rằng phương pháp MDR cho kết quả chính xác nhất vì 5 chủng (ETEC, Lis. innocua, S. dublin, S. typhi và Shi. boydii) bị ức chế bởi MEE ở nồng độ 12,5 mg/ml cũng là 5 chủng mà MEE thể hiện hoạt tính đối kháng mạnh nhất, đối với 15 chủng cịn lại thì hoạt tính của MEE là như nhau (13,7mm ± 0,68) nên cĩ nồng độ ức chế tối thiểu đều là 25 mg/ml. Cịn phương pháp WDA cho kết quả MIC tương đối vì phát hiện được 3 chủng (ETEC, S. typhi, Shi. boydii) cĩ khả năng chống lại tác dụng ức chế của MEE ở nồng độ 12,5 mg/ml đồng thời 3 chủng này thể hiện khả năng 52
  66. Đồ án tốt nghiệp nhạy thấp đối với MEE. Phương pháp DDA thì cho kết quả kém chính xác khi so sánh giá trị MIC với hoạt tính kháng khuẩn của MEE. Qua kết quả trên, chúng tơi nhận thấy rằng phương pháp MDR là phương pháp tốt nhất và phù hợp nhất để xác định chỉ số MIC. Phương pháp MDR được dựa trên nguyên tắc phát hiện sự thay đổi màu trong mơi trường của chất chỉ thị resazurin thơng qua quá trình trao đổi chất của vi sinh vật cĩ trong mơi trường (Banfi và ctv, 2003). Vi sinh vật và chất kháng khuẩn được hịa trộn vào trong ống nghiệm chứa mơi trường dinh dưỡng, chất kháng khuẩn sẽ khuếch tán vào mơi trường lỏng ức chế sự phát triển của vi sinh vật, sau đĩ nhờ vào chất chỉ thị resazurin sẽ xác định được nhanh chĩng giá trị MIC, vì vậy phương pháp này rất dễ thực hiện, ít tốn kém, đọc kết quả qua sự thay đổi màu của resazurin, khơng bị ảnh hưởng bởi cảm quan của người đọc khi dựa vào mắt thường. Phương pháp này cĩ thể được sử dụng để xác định các giá trị MIC ở các khoảng nồng độ nhỏ hơn với độ chính xác cao hơn. Hơn nữa, với phương pháp MDR cịn cĩ thể kết hợp để xác định được nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) bằng cách cấy trải dịch nuơi cấy từ các ống thí nghiệm MIC trong thí nghiệm mà khơng cĩ sự phát triển của vi sinh vật lên mơi trường thạch, nuơi ở điều kiện thích hợp, đọc kết quả thơng qua sự hình thành khuẩn lạc trên bề mặt thạch. Chỉ số MBC rất cần thiết khi thực hiện khảo sát kháng khuẩn, thơng qua chỉ số MBC và MIC cĩ thể xác định được nồng độ ức chế và tiêu diệt đối với từng loại vi khuẩn để lựa chọn được nồng độ tối ưu để làm giảm cơ hội phát triển của vi sinh vật. Đối với phương pháp WDA, trong phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, vi sinh vật chỉ thị được trang một lớp mỏng trên bề mặt mơi trường, cho cao ethanol 70% ở nồng độ cần khảo sát vào giếng. Ngay tại giếng, dịch cao sẽ khuếch tán các hoạt chất đối kháng để ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn chỉ thị xung quanh giếng. Giếng thạch cĩ khả năng chứa một thể tích dịch cao nhất định, nên các chất kháng khuẩn cĩ khả năng khuếch tán cao vào mơi trường thạch. Mặc dù phương pháp này rất dễ thực hiện, đơn giản, ít tốn kém, chỉ sử dụng một lượng chất kháng khuẩn nhỏ, tuy nhiên, khi tiến hành đo vịng ức chế, chỉ dựa trên mắt thường đồng 53
  67. Đồ án tốt nghiệp thời do cao chiết từ thực vật thường cĩ màu sắc khá sậm nên việc xác định đường vùng ức chế tương đối khĩ khăn. Quan trọng là phương pháp WDA chỉ giúp xác định MIC mà khơng thể xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC), nếu muốn thực hiện thử nghiệm MBC thơng qua phương pháp này thì cần phải chuẩn bị một mơi trường lỏng, cĩ chất diệt khuẩn cùng vi sinh vật sau đĩ trải hỗn hợp đĩ qua mơi trường thạch mới cĩ thể xác định được MBC, vì vậy sẽ rất tốn thời gian, kết quả khơng tin cậy, sử dụng một lượng lớn chất kháng khuẩn vì phải thực hiện 2 phương pháp mới xác định được khoảng MBC. Đối với phương pháp DDA, dịch chiết của cao ethanol 70% khơng đối kháng trực tiếp với vi sinh vật chỉ thị mà chỉ cĩ hoạt chất của dịch chiết khuếch tán qua mơi trường thạch, ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi sinh vật chỉ thị. Vịng giấy thấm được đặt lên bề mặt đĩa petri đã cấy vi sinh vật rồi nhỏ dịch chiết của cao lên. Tuy nhiên, phương pháp này khơng đạt được kết quả khả quan. Do độ hấp thụ các chất kháng khuẩn từ dịch cao chiết bị hạn chế ở 10µl, cho thấy lượng cao dùng để thử hoạt tính là rất ít, đĩa giấy khơng giữ được lượng dịch ở nồng độ như mong muốn. Đồng thời các chất kháng khuẩn được thấm vào giấy cĩ sự khuếch tán lên mơi trường thạch là khơng cao. Củng như phương pháp WDA, phương pháp này khi thực hiện xác định giá trị MIC củng cho kết quả khơng ổn định, gặp khĩ khăn khi muốn chia nhỏ khoảng nồng độ khảo sát và khơng thể xác định được chỉ số MBC Qua việc so sánh kết quả và ưu nhược điểm của ba phương pháp xác định chỉ số MIC, chúng tơi nhận thấy rằng, phương pháp pha lỗng trong mơi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin là phương pháp cho kết quả chính xác, nhanh chĩng, ổn định, độ nhạy cao đối với các chủng vi sinh vật khảo sát đồng thời phương pháp cĩ những ưu điểm vượt trội so với những phương pháp được khảo sát trong nghiên cứu này. Do đĩ chúng tơi đề xuất phương pháp pha lỗng trong mơi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin nên được sử dụng trong việc xác định chỉ sơ MIC của các loại hợp chất tách chiết từ thực vật củng như các chất cĩ hoạt tính kháng khuẩn đối với vi sinh vật chỉ thị vì đây là phương pháp cĩ độ nhạy cao, dễ thực hiện, cĩ 54
  68. Đồ án tốt nghiệp khả năng phát hiện được các khoảng nồng độ nhỏ, đồng thời phương pháp này cĩ thể liên kết việc xác định chỉ số MBC. Chính vì thế phương pháp MDR là phương pháp tối ưu để xác định chỉ số MIC từ cao chiết thực vật 55
  69. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Tách chiết thu hồi được cao chiết ethanol 70% từ cây Medinilla sp. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao MEE đối với 20 chủng vi sinh vật khảo nghiệm cho thấy cao ethanol 70% ở nồng độ 100 mg/ml cĩ hoạt tính mạnh, phổ kháng rộng, ức chế được 20/20 chủng vi sinh vật Kết quả xác định MIC bằng 3 phương pháp cho thấy, cho thấy rằng phương pháp MDR cĩ độ nhạy cao hơn hai phương pháp cịn lại vì cĩ khoảng phát hiện giá trị MIC từ 12,5 mg/ml đến 25 mg/ml đối với tất cả các chủng vi khuẩn khảo sát trong khi đĩ phương pháp WDA cĩ độ nhạy trung bình từ 12,5 mg/ml đến 50 mg/ml, cịn phương pháp DDA thì khoảng phát hiện cao từ 12,5 mg/ml đến 100 mg/ml. Vì vậy, phương pháp MDR là phương pháp tối ưu để xác đinh MIC từ cao chiết thực vật 4.2 Kiến nghị Xác định chỉ số MIC của cao chiết ethanol 70% từ cây Medinilla sp. đối với 20 chủng vi sinh vật khảo nghiệm ở các nồng độ thấp hơn Xác định chỉ số MBC của cao chiết ethanol 70% từ cây Medinilla sp. đối với 20 chủng vi sinh vật khảo nghiệm Thử nghiệm độc lực của MEE trên mơ hình chuột Định tính thành phần hĩa học chưa trong cây Medinilla sp. Định danh, xác định lồi Medinilla sp. 56
  70. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Vân Thái, Nguyễn Minh Phúc, Ngơ Thị Kim, Nguyễn Kim Độ và Lưu Thị Dung, (2006). Bàn về tiềm năng phịng và chữa bệnh nhiễm khuẩn bằng kháng sinh thảo mộc trong nuơi trồng thủy sản. Báo cáo các cơng trình khoa học. Nhà xuất bản Nơng nghiệp, Hà Nội, 2003. Trần Ngọc Hùng và Trương Thị Thành Vinh, (2012). Kết quả thử nghiệm một số lồi thảo dược trong phịng trị bệnh do vi khuẩn Streptococus spp trên cá trê lai (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male). Khoa học cơng nghệ, kỳ 2:48-52. Võ Văn Chi, (2000). Cây thuốc trị bệnh thơng dụng. NXB Thanh Hĩa Võ Văn Chi, (1997). Từ điển cây thuốc Việt Nam. NXB Y học, Hà Nội Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến, (1997). Phân loại học thực vật bậc cao. NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp Đỗ Tấn Lợi, (1968). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thị Thu Hương, (2011). Bước đầu nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Tỏi (Allium sativum) đối với một số vi khuẩn gây bệnh ở người. Kỷ yếu hội nghị Khoa học Mơi trường và Cơng nghệ sinh học năm 2011:168-175 Phùng Trung Hùng, Phan Nguyễn Hữu Trọng, Nguyễn Phước Long, (2013). Đại cương Carbohydrate. Đọc sách Y sinh Hồ Chí Tuấn, (2009). Amin - Amino acid – Protein. Đại học Y Hà Nội DS. Nguyễn Huy Cơng, DS. Bùi Đức Dũng, DS. Đào Đình Hoan, ThS. Nguyễn Thị Thanh Hồi, (2005). Giáo trình dược liệu. NXB Y học Hà Nội Đỗ Tất Lợi, (2004), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”. Nhà xuất bản Y học Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, (2012). Ngiên cứu phân lập các hợp chất phenolic từ một số thực vật Việt Nam. Luận văn thạc sĩ khoa học, Trường Đại học khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. 57
  71. Đồ án tốt nghiệp Lê Ngọc Thuỳ Trang, (2013). Phân lập và khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum. Khố luận tốt nghiệp Kỹ sư Cơng nghệ Sinh học. Trường Đại học Cơng Nghệ Tp. HCM. Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp. Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật, link : Phạm Minh Nhựt, (2013). Thực hành vi sinh đại cương. Trường Đại học Cơng Nghệ Tp. HCM. 58
  72. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU TIẾNG ANH KJV Piddock, R Wise, (1989). J. Antimicrob. Chemother., 23, 475-483. I Ahmad, AZ Beg. J. Ethnopharmacol. 2001, 74, 113-123. ML Cohen. Science, (1992), 257, 1050-1055 H Harbottle, S Thakur, S Zhao, DG White. Anim. Biotechnol. 2006, 17, 111-124. Ordĩđez, A.A.L., Gĩmez, J.D., Cudmani, N.M., Vattuone, M.A. and Isla, M.I. (2003). Antimicrobial activity of nine extracts of Sechium edule (Jacq.) Swartz. Microbiol Ecol Health Dis 15, 33–39. Grabley, S. and Thiericke, R. (1999) Bioactive agents from natural sources: trends in discovery and application. Adv Biochem Eng/Biotechnol 64, 101–154 Soberĩn J.R., Sgariglia M.A., Sampietro D.A., Quiroga E.N. and Vattuone M.A., (2007). Antibacterial activity of plant extracts from northwestern Argentina. Journal of Applied Microbiology (102): 1450–1461 Mullika traidej Chomnawang, Suvimol Surassmo, Veena S. Nukoolkarn,Wandee Gritsanapan, (2005). Antimicrobial effects Thai medicinal plants against acne- inducing bacteria. Journal of Ethnopharmocology (101) (2005): 330-333 Kumar G.S., Jayaveera K.N., Ashok Kumar C.K., Umachigi P.S., Vrushabendra B.M., Kishore Kumar D.V., (2007). Antimicrobial effects of Indian medicinal plants against acne-inducing bacteria. Tropical journal of Pharmaceutical Research, June 2007: 717-723 Mohan Thakare, Denbow D.M., McElrroy A.R., Novak C.L., Link L.R., (2004). Thesis submitted to the faculty of the Virginia Polytechnic institute and State University in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Sciences in animal and poultry sciences. Pharmacology.42p. Supayang Piyawan Voravuthikunchai, Treechada Sririrak, Surasak Limsuwan, Thanomjit Sup awita, (2005). Inhibilitory Effects of Active Compounds from Punica granatum on Verocytotoxin production by Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Journal of health science: 590-596 59
  73. Đồ án tốt nghiệp Kiymet Guven, Sezgin Celik, Ismet Uysal, (2005). Antimicrobial activity of CentaureaSpecies. Pharmaceatical Biology, pp: 67-71 Sikkema J, de Bont JA, Poolman B. Interactions of cyclic hydrocarbons with biological membranes. J Biol Chem. 1994;269(11):8022–8 Lambert RJW, Skandamis PN, Coote P, Nychas GJE (2001);. A study of the minimum inhibitory concentration and mode of action of oregano essential oil, thymol and carvacrol. J Appl Microbiol, 91(3):453-62. Valgas, C., de Souza, S.M., Smânia, E.F.A., Smânia Jr., A., (2007). Screening methods todetermine antibacterial activity of natural products. Braz. J. Microbiol. 38, 369–380 Mourey, A., Canillac, N., (2002). Anti-Listeria monocytogenes activity of essential oils components of conifers. Food Control 13, 289–292. Ellof, J.N., (1998). A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Med. 64, 711–713 Jie, C. and Renner., S. S., (2007). Melastomataceae. Flora of China 13, 392 – 395 Renner, S. S., (2004). Multiple Miocene Melastomataceae dispersal between Madagascar, Africa and India. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci, 359(1450): 1485-1494 Jennifer M. Andrews, (2011). Determination of minimum inhibitory concentrations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy Volume 48: 5-16. Attia H. Atta, Samar M. Mouneir, (2004). Antidiarrhoeal activity of some Egyptian medicinal plant extracts. Journal of Ethnopharmacology 92: 303–309 Antara Sen và Amla Batra, (2012). Evaluation of antimicrobial activity of different solvent extracts of medicinal plant: melia azedarach l. International Journal of Current Pharmaceutical Research, Vol 4, Issue 2: 67-73 60
  74. Đồ án tốt nghiệp Elena Banfi, Giuditta Scialino and Carlo Monti-Bragadin, (2003). Development of a microdilution method to evaluate Mycobacterium tuberculosis drug susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 796–800 Naveed Ahmad, Farooq Anwar, Sohail Hameed and Mary C. Boyce, (2011). Antioxidant and antimicrobial attributes of different solvent extracts from leaves and flowers of akk [Calotropis procera (Ait.) Ait. F.)]. Journal of Medicinal Plants Research Vol. 5(19), pp. 4879-4887 Anja Klancnik, Barbara Jeršek, Sonja Smole Možina, (2010). Evaluation of diffusion and dilution methods to determine the antibacterial activity of plant extracts. Journal of microbiological methods, 81 (2010) 121–126 Sawai, J., Doi, R., Maekawa, Y., Yoshikawa, T., Kojima, H., (2002). Indirect conductimetric assay of antibacterial activities. Journal of Industrial Microbiology & Technology 29, 296–298 Eloff, J.N., (1998). A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica 64, 711–713. Gabrielson, J., Hart, M., Jarel¨ ov, A., K¨ uhn, I., McKenzie, D., M¨ ollby, R., (2002). Evaluation of redox indicators and the use of digital scanners and spectrophotometer for quantification of microbial growth in microplates. Journal of Microbiological Methods 50, 63–73. Jahn, B., Martin, E., Stueben, A., Bhakdi, S., (1995). Susceptibility testing of Candida albicans and Aspergillus species by a simple microtitre menadione- augmented 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide assay. Journal of Clinical Microbiology 33, 661–667. Pelloux-Prayer, A.L., Priem, B., Joseleau, J.P., (1998). Kinetic evaluation of conidial germination of Botrytis cinereaby a spectrofluorometric method. Mycology Research 102, 320–322 61
  75. Đồ án tốt nghiệp Paul Cos, Arnold J. Vlietinck, Dirk Vanden Berghe, Louis Maes, (2006). Review Anti-infective potential of natural products: How to develop a stronger in vitro ‘proof-of-concept’. Journal of Ethnopharmacology 106 (2006) 290–302 Mustafa Oskay, Dilek Oskay and Fatih Kalyoncu, (2009). Activity of Some Plant Extracts of Some Plant Extracts Some Plant Extracts Plant Extracts Extracts Against Multi-Drug Resistant Human Pathogens. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2009), 8 (4): 293-300. 62