›

Đồ án Chọn lọc chất phụ gia tạo chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học từ Nuclear polyhedrosis virus (NPV) quản lý sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura Fab.)

pdf 59 trang thiennha21 12/04/2022 4870
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Chọn lọc chất phụ gia tạo chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học từ Nuclear polyhedrosis virus (NPV) quản lý sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura Fab.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_chon_loc_chat_phu_gia_tao_che_pham_thuoc_tru_sau_sinh.pdf

Nội dung text: Đồ án Chọn lọc chất phụ gia tạo chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học từ Nuclear polyhedrosis virus (NPV) quản lý sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura Fab.)

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHỌN LỌC CHẤT PHỤ GIA TẠO CHẾ PHẨM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC TỪ NUCLEAR POLYHEDROSIS VIRUS (NPV) KIỂM SOÁT SÂU KHOANG ĂN TẠP (Spodoptera litura FAB.) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THANH LÂM MSSV: 0851110110 Lớp: 08DSH2 TP. Hồ Chí Minh, 2012
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn của Cô Nguyễn Thị Hai. Những kết quả và số liệu trong đồ án là trung thực và chưa được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường và hội đồng về sự cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 21 tháng 07 năm 2012 Sinh viên Nguyễn Thanh Lâm i
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành chương trình đào tạo kỹ sư Công nghệ sinh học của trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh. Con xin khắc ghi công ơn sâu sắc của cha, mẹ và những người thân trong gia đình đã luôn ủng hộ và động viên con trong suốt đoạn đường dài về tinh thần cũng như tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con học tập. Em xin gởi lời tri ân sâu sắc đến Cô Nguyễn Thị Hai, Cô đã chỉ dạy tận tình và tạo mọi điều kiện cho em trong quá trình học tập cũng như thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em xin gởi lời cám ơn chân thành đến Thầy Hoàng Hưng, Thầy Nguyễn Tiến Thắng, Cô Nguyễn Hoài Hương, Cô Nguyễn Thị Sáu, Cô Đỗ Thị Tuyến, Thầy Bùi Đức Chí Thiện, Thầy Bùi Văn Thế Vinh, Thầy Phạm Minh Nhựt, Cô Trịnh Thị Lan Anh, Cô Nguyễn Thị Thu Hương cùng nhiều thầy cô đã cho em những giờ học lý thú và bổ ích. Em xin cám ơn Thầy Huỳnh Văn Thành, Thầy Nguyễn Trung Dũng tổ thí nghiệm khoa Môi trường và Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho em tiến hành thực nghiệm nội dung nghiên cứu của đồ án. Xin gởi lời chia sẽ đến các bạn Trần Hữu Ý, Võ Thị Mai, Phạm Thị Thùy Dương, Hồ Hoàng Đăng Khoa, Nguyễn Thị Tiền, Mai Thị Huỳnh Trân, Trần Mộng Hương Duyên, Lê Thị Mận đã đồng hành trong quá trình học tập và thực hiện đồ án tốt nghiệp. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 21 tháng 07 năm 2012 Sinh viên Nguyễn Thanh Lâm ii
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục tiêu của đề tài 2 3. Phạm vi và đối tượng nghiên cứu 2 3.1 Phạm vi nghiên cứu 2 3.2 Đối tượng nghiên cứu 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở khoa học của đề tài 4 1.2 Virus đa diện nhân NPV 9 1.2.1 Sơ lược về virus đa diện nhân NPV 9 1.2.2 Vai trò của virus đa diện nhân NPV trong tự nhiên 9 1.2.3 Cơ chế tác động của virus đa diện nhân NPV 10 1.2.4 Ưu điểm và nhược điểm của virus đa diện nhân NPV 11 iii
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.3 Quy trình sản xuất chế phẩm virus đa diện nhân NPV 12 1.3.1 Nhân sâu hàng loạt 12 1.3.2 Lây nhiễm virus đa diện nhân NPV lên vật chủ tạo chế phẩm 12 1.4 Sơ lược về sâu khoang 14 1.4.1 Đặc điểm sinh học, sinh thái sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 14 1.4.2 Tác hại và biện pháp phòng trừ sâu khoang ở Việt Nam 16 1.5 Những nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam về sử dụng chất phụ gia bảo vệ virus NPV 18 1.5.1 Những nghiên cứu trên thế giới 18 1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 21 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian thực hiện đề tài 22 2.2 Địa điểm thực hiện đề tài 22 2.3 Dụng cụ và vật liệu thí nghiệm 22 2.3.1 Dụng cụ thí nghiệm 22 2.3.2 Vật liệu thí nghiệm 22 2.4 Nội dung nghiên cứu 24 3.5 Phương pháp nghiên cứu 24 2.5.1 Dịch virus NPV bổ sung một lượng nhỏ thuốc trừ sâu 24 2.5.2 Dịch NPV virus bổ sung Tween 80, rỉ đường 27 2.5.3 Dịch virus NPV bổ sung bột ngô, bột đậu nành 28 iv
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.5.4 Dịch virus NPV bổ sung chất lọc tia cực tím dưới tác dụng động ánh sáng mặt trời 30 2.5.5 Dịch virus NPV bổ sung bột cao lanh và một số chất phụ gia 32 2.6 Phương pháp xử lý số liệu 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tìm hiểu hiệu lực của virus NPV bổ sung hoạt chất hóa học 34 3.1.1 Đánh giá hiệu lực của virus NPV bổ sung thuốc trừ sâu nhóm Cypermethrin (Sherpa 25EC) 34 3.1.2 Đánh giá hiệu lực của virus NPV bổ sung thuốc trừ sâu nhóm Abamectin (Alibaba 1.8EC) 36 3.1.3 Đánh giá hiệu lực của virus NPV bổ sung acid boric 37 3.2 Ảnh hưởng của Tween 80, rỉ đường tăng cường hiệu lực diệt sâu của virus NPV 40 3.2.1 Ảnh hưởng của Tween 80 đối với virus NPV 40 3.2.2 Ảnh hưởng của rỉ đường đối với virus NPV 40 3.3 Ảnh hưởng của bột ngô và bột đậu nành tăng cường hiệu lực diệt sâu của virus NPV 41 3.3.1 Ảnh hưởng của bột ngô đối với virus NPV tăng khả năng diệt sâu khoang 41 3.3.2 Ảnh hưởng của bột đậu tương đối với virus NPV tăng khả năng diệt sâu khoang 42 3.4 Tìm hiểu khả năng lọc tia cực tím bảo vệ virus NPV của trà xanh và rỉ đường duy trì hiệu lực diệt sâu của virus NPV 42 3.4.1 Chọn lọc tỷ lệ rỉ đường thích hợp bảo vệ virus NPV 42 3.4.2 Chọn lọc nồng độ trà xanh thích hợp bảo vệ virus NPV 44 v
  7. Đồ án tốt nghiệp 3.5 Đánh giá hiệu lực của virus NPV khi bổ sung bột cao lanh và một số chất phụ gia 45 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 47 4.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHAO 49 PHỤ LỤC -1- Phụ lục A: Các hình ảnh minh họa -1- Phụ lục B: Bảng xử lý thống kê Statgraphics -7- vi
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BVTV : Bảo vệ thực vật. FAO : Tổ chức nông lương quốc tế . IPM : Quản lý dịch hại tổng hợp. LE : Sâu chết bệnh NPV (Larval equipveilent). NPV : Virus đa diện nhân ký sinh sâu. PIB : Hạt thể vùi đa diện. vii
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Ảnh hưởng của việc bổ sung hoạt chất Cypermethin vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 34 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của việc bổ sung hoạt chất Abamectin vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 36 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của việc bổ sung acid boric vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 39 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của việc bổ sung Tween 80 vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 40 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của việc bổ sung rỉ đường vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 41 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của việc bổ sung bột ngô vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 42 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của việc bổ sung bột đậu nành vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 42 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của việc bổ sung cao lanh vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 46 viii
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ sản chế phẩm HaNPV phòng trừ sâu xânh 14 Hình 1.2: Sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 15 Hình 3.1: Ảnh hưởng của việc bổ sung hoạt chất Cypermethrin vào chế phẩm NPV đến thời gian ủ bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 35 Hình 3.2: Ảnh hưởng của việc bổ sung hoạt chất Abamectin vào chế phẩm NPV đến thời gian ủ bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 37 Hình 3.3: Ảnh hưởng của việc bổ sung Acid boric vào chế phẩm NPV đến thời gian ủ bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 39 Hình 3.4: Ảnh hưởng của việc bổ sung rỉ đường vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 41 Hình 3.5: Ảnh hưởng của việc bổ sung trà xanh vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 43 Hình 1: NPV dưới kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần -1- Hình 2: Chuẩn bị sâu khoang thí nghiệm -1- Hình 3: Lá thầu dầu chuẩn bị sơ bộ -2- Hình 4: Lá thầu dầu cảm nhiễm NPV bằng phương pháp nhúng lá -2- Hình 5: Mẫu thí nghiệm bổ sung rỉ đường lọc tia cực tím của ánh sáng mặt trời -3- Hình 6: Mẫu thí nghiệm bổ sung bột ngô, Tween 80, rỉ đường tăng cường khả năng ăn của sâu khoang và tăng độ bám dính lên lá của NPV -3- Hình 7: Mẫu thí nghiệm NPV bổ sung Sherpa 25EC -4- Hình 8: Sâu khoang chết do NPV -4- ix
  11. Đồ án tốt nghiệp Hình 9: Sâu khoang chết do vi khuẩn -5- Hình 10: Sâu khoang chết Sherpa 25EC -5- Hình 11: Sâu khoang mẫu đối chúng -6- Hình 12: Nuôi giữ giống sâu khoang bằng lá thầu dầu -6- x
  12. Đồ án tốt nghiệp 1. Tính cấp thiết của đề tài Nông nghiệp là ngành kinh tế quan trọng của nước ta hiện nay với tổng sản lượng thu được hàng năm là rất lớn. Năm 2010, tổng diện tích gieo trồng ở nước ta vào khoảng 12,285,500 ha, trong đó cây có thời gian sinh trưởng hàng năm là 9,855,500 ha và cây lâu năm khoảng 2,431,000 ha (Viện quy hoạch và thiết kế nông nghiệp, 2002) (dẫn theo Hà Minh Tùng, 2005) [3]. Với điều kiện thuận lợi, nông nghiệp Việt Nam được hình thành và phát triển trong điều kiện khí hậu khác nhau làm cho đa dạng sịnh học nông nghiệp trở nên phong phú. Cùng với sự đa dạng của cây trồng thì sự đa dạng của sâu hại ở Việt Nam cũng rất lớn. Hàng năm, thiệt hại do sâu hại gây ra khoảng 25 – 30% thậm chí có khi lên đến 40 - 50%. Thành phần sâu hại khoảng 753 loài thuộc 99 họ và 10 bộ (Phan Kế Long, 2006) [21]. Sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) là loài sâu hại nghiêm trọng trên nhiều loại cây trồng, chúng gây tổn thất lớn đến năng suất và sản lượng cây trồng. Theo quan sát của Nguyễn Thị Chắt (1998), trên cây đậu đỗ ở miền Tây Nam Bộ thì mật độ sâu khoang cao vào vụ Đông Xuân lên tới 100 con/m2 và có thể làm trụi lá đậu trong vài ngày, còn ở miền Bắc mật độ sâu non cao từ tháng 4 – 10 và thành dịch có thể vào tháng 5 [11]. Sâu khoang còn là đối tượng gây hại mạnh nhất trên cây lạc nước ta, khi mật độ cao có tới 70 - 80% diện tích lá bị hại, nhiều ruộng khi thu hoạch chỉ còn trơ trọi thân và cành (Ngô Thế Dân và cộng sự, 2000) [5]. Ngoài cây lạc và đậu đỗ loài sâu hại nguy hiểm này phá hoại trên nhiều loại cây trồng ở nước ta như rau cải, rau muống, cà chua Nếu không có biện pháp phòng trừ kịp thời dễ phát triển thành dịch (Phạm Thị Hoa Lê, 2009) [19]. Theo Nguyễn Văn Huỳnh và cộng sự (2011), để quản lý tổng hợp sâu hại trên cây màu, các chuyên gia Trường Đại học Cần Thơ đã nghiên cứu virus SpltNPV để quản lý sâu khoang ăn tạp [17]. 1
  13. Đồ án tốt nghiệp Nhưng khi phun NPV trừ sâu trên đồng ruộng, tia cực tím của ánh sáng mặt trời làm giảm hiệu lực của chúng. Để duy trì hiệu lực của NPV khi phun ngoài đồng ruộng, theo nhiều tác giả cần trộn thêm các chất phụ gia vào dịch virus để lọc tia cực tím của ánh sáng mặt trời, tăng sức ăn của sâu, tăng lượng NPV vào cơ thể sâu và khả năng bám dính vào lá cây. Xuất phát từ thực tế trên, sinh viên tiến hành: “Chọn lọc chất phụ gia tạo chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học từ Nuclear polyhedrosis virus (NPV) quản lý sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura Fab.)” nhằm chọn lọc ra chất phụ gia thích hợp kết hợp với NPV làm tăng cường hiệu lực diệt sâu khoang của chế phẩm. 2. Mục tiêu của đề tài Để có thể sản xuất và sử dụng NPV quản lý Spodopera litura có hiệu quả, phải chọn lọc những chất phụ gia thích hợp có khả năng bảo vệ virus ngoài tự nhiên, cũng như kích thích sự thèm ăn và tăng độ bám dính của NPV khi phung trên đồng. Bước đầu tiến hành thử nghiệm hiệu lực diệt trừ sâu khoang của NPV có phối trộn chất phụ gia. Từ đó tìm ra chất phụ gia có tiềm năng cao để phối trộn với NPV tạo ra chế phẩm hoàn thiện có hiệu lực diệt trừ sâu tốt. 3. Phạm vi và đối tượng nghiên cứu 3.1 Phạm vi nghiên cứu Đề tài tập chung nghiên cứu các chất phụ gia có khả năng làm tăng hiệu lực diệt trừ sâu khoang, các chất có thể bảo vệ NPV trước tia UV, tăng độ bám dính, kích thích thèm ăn. 3.2 Đối tượng nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu tập trung vào sâu khoang (Spodopera litura F.) và virus đa diện nhân ký sinh trên sâu khoang (Nucleo polyhedron virus). 2
  14. Đồ án tốt nghiệp - Các chất phụ gia như: cypermethrin, abamectin, acid boric, rỉ đường, trà xanh, Tween 80, bột cao lanh, bột ngô, bột đậu tương. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Cung cấp những số liệu ban đầu về khả năng diệt sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) của NPV có bổ sung chất phụ gia, để làm cơ sở lựa chọn chất phụ gia thích hợp tạo chế phẩm NPV sử dụng ra đồng ruộng phòng trừ sâu hại cây trồng có hiệu quả cao. - Kết quả nghiên cứu nói trên thực sự cần thiết, góp phần làm cơ sở cho việc xây dựng chế phẩm sinh học trong phòng trừ sâu khoang có hiệu lực cao, tiến tới xây dựng một nền nông nghiệp "sạch" không có sự hiện diện của các hoá chất BVTV độc hại. 3
  15. Đồ án tốt nghiệp 1.1 Cơ sở khoa học của đề tài Sâu khoang (Spodopera litura Fab.) rất phổ biến còn được gọi là sâu thuốc lá, là một loài ăn tạp gây hại nghiêm trọng cho cây trồng (Trang và S. Chaudhari, 2002) [36]. Nó được ghi nhận lần đầu tiên ở huyện Nelson gây hại cho cây thuốc lá (Cottier & Gourlay 1955) [24]. Đến năm 1977, Lynette cho biết nó xuất hiện với số lượng lớn ở Northland và Auckland trong vườn nhà và trên các cây linh lăng, cải dầu [24]. Chúng phân bố rất rộng rãi, bên cạnh Ấn Độ còn hiện diện ở Thái Lan, Phillippines, Australia, Hàn Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, Trung Quốc, Iran, Ai Cập, Bahrain, Fiji, và Formosa (Singh và Jalali, 1997) [37]. Nó sống trên 200 loài cây trồng khác nhau như cây khoai tây, cây bắp, cây bông vải, cây thuốc lá, cây cải, cây cà chua, các loại đậu đỗ (Nguyễn Thị Chắt , 1998) [11] và bùng phát thành dịch hại sau khi mưa lớn hoặc trời nắng nóng kéo dài (Trang, S. Chaudhari, 2002) [32]. Kết quả nghiên cứu của Hill và Waller (1985), đã chỉ ra rằng trên cây lạc của vùng nhiệt đới có 8 loài sâu hại chính và 40 loài gây hại thứ yếu. Những loài gây hại đặc biệt nguy hiểm như sâu khoang (Spodoptera litura Fab.), sâu xám (Agrotis ypsilon), sâu xanh (Heliothis armigera) (dẫn theo Nguyễn Thị Thu, 2008) [14]. Tác giả Wightman, J. A. (1990), cho biết trên lạc tác hại của sâu khoang phụ thuộc vào mật độ và giai đoạn sinh trưởng của cây. Nếu sau gieo 10 ngày, mật độ là 1 con/cây, diện tích lá bị ăn là 47% thì năng suất sẽ giảm 22%. Nhưng nếu mật độ 10 con/cây thì năng suất sẽ giảm là 56%. Song ở giai đoạn cây hình thành củ, cũng với mật độ như trên thì năng suất giảm ít hơn nhiều (9% và 16% ứng với mật độ 1 con/cây và 10 con/cây). Còn theo Nguyễn Thị Chắt điều tra trên cây lạc tại Trảng Bàng, Tây Ninh, trong vụ Đông Xuân sớm 2004 – 2005 thì sâu khoang xuất hiện khi cây 20 ngày sau gieo và đạt cao nhất là 16 con/m2, sau đó mật độ giảm đi nhưng gây hại đến cuối vụ. Sâu xanh Heliothis spp. xuất hiện muộn hơn sâu khoang khi cây đậu được 30 ngày sau gieo, mật số thấp 0,2 con/m2 [13]. 4
  16. Đồ án tốt nghiệp Theo Hồ Khắc Tín (1982), sâu khoang là một trong 10 loài gây hại phổ biến trên đậu tương và đã gây thành dịch ở nhiều vùng trồng đậu tương (dẫn theo Nguyễn Thị Thu, 2008) [14]. Ngô Thị Lam Giang đã ghi nhận được 31 loài côn trùng gây hại trên đậu tương tại Trảng Bom, Đồng Nai trong vụ Thu Đông 2004, trong đó gây hại nặng nhất là sâu cuốn lá, sâu đo xanh, bọ trĩ và sâu khoang Spodoptera litura. Trong điều kiện canh tác của nông dân, sâu khoang phát triển và tạo 2 đỉnh cao về mật độ. Đỉnh thứ nhất vào 40 ngày sau gieo với mật độ 10,5 con/m2, đỉnh thứ 2 kéo dài tới 70 ngày sau gieo với mật độ 7 con/m2 [13]. Một tác hại lớn của thuốc hóa học trừ sâu mà hiện nay trên toàn thế giới quan tâm là: việc sử dụng thuốc hóa học trừ sâu liên tục đã làm tăng sự chọn lọc gen của quần thể sâu hại và làm cho sâu ngày càng chịu đựng với thuốc. Các nghiên cứu ở Mỹ đã cho biết có rất nhiều loài sâu ở Mỹ đã kháng thuốc hóa học trừ sâu (Burrows, T.M., 1983). Sâu khoang ở Ấn Độ và Ai Cập đã kháng hầu hết các loài thuốc hóa học trừ sâu (Ramakrishnan, N. và cộng sự, 1984). Tính đến năm 1986, trên thế giới đã có 447 loài sâu kháng thuốc, trong đó có 264 loài phá hại trong nông nghiệp (Nguyễn Công Thuật,1996) [7]. Tồn dư của thuốc hóa học trừ sâu đã gây ô nhiễm lớn cho nguồn nước, nhiễm độc cho thức ăn. Frisbie, R. và cộng sự (1997), cho biết sự phun thuốc hóa học trừ sâu ở Mỹ đã làm nhiễm độc nặng cho nguồn nước và thức ăn. Ở Việt Nam, Bùi Sĩ Doanh và cộng sự (1995), cũng cho biết dư lượng thuốc Cypermethrin trên các loài đậu đỗ đã lên tới 0,4 – 0,7 mg/kg, vượt xa so với mức tồn dư cho phép (dẫn theo Ngô Trung Sơn, 1998) [6]. Với những lý do trên, các nhà khoa học trên thế giới đều nhất trí rằng: để phòng trừ sâu hại, không thể chỉ sử dụng bất cứ một biện pháp đơn lẽ nào mà phải sử dụng hệ thống quản lý dịch hại tổng hợp (IPM). Hội nghị tư vấn Châu Á – Thái Bình Dương 5
  17. Đồ án tốt nghiệp của FAO, năm 1992 đã khẳng định, “đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình quản lý dịch hại tổng hợp” (dẫn theo Nguyễn Hoàng Nam, 2011) [8]. Trong biện pháp sinh học, virus gây bệnh cho sâu là tác nhân phòng trừ sâu hại vô cùng quan trọng. Ngoài tự nhiên, virus ký sinh hầu hết các loài sâu hại. Đến nay người ta đã phân lập, mô tả được bệnh virus ở 800 loài côn trùng, riêng Baculovius người ta đã phân loại được 300 loài ký sinh trên côn trùng bộ cánh phấn, cánh màng và hai cánh (Jayarajs, 1971). Theo Price D. và cộng sự (1972), virus côn trùng là nhân tố phòng trừ sinh học quan trọng vì phổ ký chủ của chúng hẹp, lại dễ dàng sản xuất với số lượng lớn và độ thuần khiết cao. Hơn nữa chưa có sự ghi nhận nào về sự truyền bệnh vào động vật có xương sống, mặc dù người ta đã tiêm rất nhiều virus vào các loài thú. Virus gây bệnh côn trùng đã được Philips mô tả từ năm 1720. Virus gây bệnh tằm đã được Louis Paster nghiên cứu từ năm 1861. Bệnh virus trên sâu xanh cũng đã được Mally phát hiện năm 1891 tại Nam Phi, song đến năm 1936 Parson mới xác định được nguyên nhân, từ đó việc nghiên cứu sử dụng virus trừ sâu phát triển mạnh (dẫn theo Ngô Trung Sơn, 1998) [6]. Từ những năm 1960 thế giới đã có những nghiên cứu về virus NPV, bao gồm các nghiên cứu cơ bản về tính độc hại của nó đối với môi trường, hiệu lực diệt sâu và quá trình sản xuất chúng (dẫn theo Dương Trình, 2003) [2]. Theo Rabindra và Jayaraj việc sử dụng NPV với nồng độ 250 – 500 LE/ha ở Ấn Độ cho kết quả diệt sâu tương đương thuốc hóa học thông dụng hoặc sau khi dùng NPV ở mức 250 LE/ha mà phun tiếp Endosulfan với một phần hai liều lượng khuyến cáo thì cho kết quả bằng hai lần phun NPV ở mức 500 LE/ha. 6
  18. Đồ án tốt nghiệp Còn ở Trung Quốc các nhà khoa học (1977), kết luận hiệu lực diệt sâu Heliothis của NPV cao hơn Parathion và khi thử nghiệm ở nồng độ 2x106 PIB thì hiệu lực diệt sâu là 98,6% (dẫn theo Dương Trình, 2003) [2]. Tại Mỹ, khi dùng NPV ở mức độ 300 LE/ha trên bông sẽ làm giảm giá thành hơn khi sử dụng thuốc hóa học (Anon, 1977 và Ignoffo 1979) [6]. Ở nước ta, các nghiên cứu về virus côn trùng để trừ sâu hại được bắt đầu từ những năm tám mươi. Trong thời gian này, các nghiên cứu tập trung vào nhóm virus đa diện nhân NPV. Năm 1985, Trung Tâm Nghiên Cứu Cây Bông Nha Hố đã thu thập mẫu từ đồng ruộng về phân lập và sản xuất thử nghiệm chế phẩm NPV sâu xanh. Kết quả cho thấy chế phẩm NPV có hiệu lực tương đương với Sherpa và có thể thay thế cho thuốc hóa học xử lý các ổ dịch bệnh. Sau thành công của chế phẩm NPV cho sâu xanh, gần đây các cơ quan nghiên cứu khoa học trong lĩnh vực bảo vệ thực vật đã tiến hành nghiên cứu chế phẩm NPV cho sâu xanh da láng, đến nay đã đưa ra phun thử nghiệm ở nhiều địa phương như: Long An, Tây Ninh, Bình Dương, Ninh Thuận, Lâm Đồng, Sóc Trăng (Nguyễn Thơ, 1999) [15]. Ưu điểm quý giá của NPV theo Zhu, G.K. và cộng sự (1990), là không ảnh hưởng xấu đến các loài thiên địch [6]. Qua kết quả nghiên cứu trên 18 loài động vật có xương sống, 36 loài động vật không xương sống và 24 loài cây trồng khác nhau. Ignoffo (1975), kết luận NPV trên Heliothis là an toàn để sử dụng cho các loài cây lương thực và an toàn cho người và gia súc. Bên cạnh đó qua theo dõi 25 thế hệ của He. zea và 22 thế hệ của He. armigera, các tác giả Inoffo và Allea (1972), Whilock (1977), đã thấy rằng các loài Heliothis là không kháng NPV (dẫn theo Dương Trình, 2003) [2]. 7
  19. Đồ án tốt nghiệp Ở Mỹ, các nguyên cứu trong phòng cũng cho thấy chuồn chuồn cỏ và các loài ong ăn thịt không bị nhiễm NPV (Heinz, K.M. và cộng sự,1995). Ngoài tác động diệt sâu tức thời, NPV còn có khả năng truyền sang thế hệ sau (Khaire, V.M. và cộng sự, 1986). Do đó có nhiều ưu điểm NPV đã được nghiên cứu để trừ sâu hại trên nhiều loại cây trồng (dẫn theo Ngô Trung Sơn, 1998) [6]. Mới đây tại Mỹ, người ta tìm ra được một loại virut đa diện nhân thu từ sâu đo hại cần tây, loại này có phổ ký chủ rộng, có khả năng lây bệnh cho 31 loài sâu hại thuộc 10 họ của bộ Lepidoptera (Hostetter, D.L.và cộng sự, 1991). Thành công này đã tạo điều kiện thuận lợi cho con người trong việc sản xuất và sử dụng NPV. Nhiều công trình nguyên cứu về nhân nuôi sâu ký chủ và pha trộn NPV với các loại thuốc trừ sâu khác, các chất phụ gia khác để trứ sâu cũng được tiến hành, bước đầu đã có kết quả trong việc hạ giá thành chế phẩm NPV, tăng hiệu lực diệt sâu và rút ngắn thời gian ủ bệnh của NPV, kết quả này sẽ góp phần quan trọng trong việc triển khai sử dụng NPV trừ sâu hại. Tại Việt Nam, sâu hại là một trong những đối tượng nghiêm trọng đối với cây trồng. Dó đó, để phòng trừ sâu hại con người đã dùng rất nhiều biện pháp, một trong những biện pháp được nông dân áp dụng nhiều nhất là biện pháp hóa học. Tuy nhiên, việc dùng thuốc hóa học thường xuyên và liên tục, không đúng cách sẻ để lại nhiều hậu quả nghiêm trọng như hình thành các loài sâu kháng thuốc, đặc biệt là sâu khoang (Spodoptera litura Fab.), sâu xanh (Helicopverpa armigera) sâu xanh da láng (Spodoptera exigua), xuất hiện nhiều loài sâu hại mới, tiêu diệt những loài thiên địch của sâu hại cây trồng và để lại dư lượng độc hại trong sản phẩm nông nghiệp sau thu hoạch, gây ô nhiễm môi trường sống. Vì vậy, việc áp dụng hệ thống phòng trừ tổng hợp trong đó có biện pháp sử dụng NPV phòng trừ sâu khoang gây hại thay thế cho việc sử dụng đơn độc thuốc hóa học là con đường có triển vọng nhất. 8
  20. Đồ án tốt nghiệp 1.2 Virus đa diện nhân NPV 1.2.1 Sơ lược về virus đa diện nhân NPV Virus đa diện nhân Nuclear polyhedrosis virus (NPV) thuộc nhóm Baculovirus. Cấu tạo của NPV gồm nhiều hạt virus trong 1 polyhedron, hạt virus có hình gậy và gồm có một hoặc nhiều nucleocapsid được một lớp vỏ bao bọc quanh, nucleocapsid gồm một phức hợp AND – Protein (Deoxyribo nucleo protein – DNP) được một lớp vỏ protein bao quanh, lớp vỏ ấy gọi là capsid. Nếu bên trong vỏ chỉ có 1 nucleocapsid thì gọi là NPV một nucleocapsid (Single nucleocapsid NPV – SNPV). Nếu bên trong vỏ có nhiều nucleocapsid thì gọi là NPV nhiều nucleocapsid (Multiple nucleocapsid NPV – MNPV). Theo thống kê chưa đầy đủ, trên thế giới có 284 loài côn trùng bị NPV xâm nhiễm, chiếm 40% số lượng côn trùng bị nhiễm virus, trong đó có 243 loài thuộc bộ cánh vẩy, 21 loại thuộc bộ cánh màng, 9 loài thuộc bọ hai cánh, 4 loài thuộc cánh cứng, 4 loài thuộc cánh thẳng và 2 loài thuộc cánh nửa (dẫn theo Chu Thị Thơm, 2006) [1]. 1.2.2 Vai trò của virus đa diện nhân NPV trong tự nhiên [17] Kết quả nghiên cứu ở Thái Lan cho thấy NPV là nguyên nhân gây chết tự nhiên chủ yếu của sâu đo xanh Trichoplusia ni trên cải bắp. Tại Ấn Độ, sâu xanh H. armigera trên bông thường bị chết bệnh do NPV với tể lệ 6,9 – 24,5%. NPV được đánh giá là tác nhân sinh học quan trọng trong kìm hãm số lượng sâu xanh H. armigera ở Trung Quốc, Hoa Kỳ, Philippine (Bilipate, 1988; Coppel và cộng sự, 1977; Navasero và nnk, 1993; Tipvadee, 1983). Kết quả điều tra cho thấy NPV có mặt thường xuyên trong quần thể các loài sâu hại. Ở điều kiện miền Bắc Việt Nam chúng phát sinh gây bệnh cho côn trùng từ tháng 4 – 9 hàng năm. Sâu đo xanh Anomis flava hại đay thường bị nhiễm bệnh do NPV khá cao vào tháng 6 – 7 hàng năm. Tỷ lệ chết do NPV của sâu đo xanh đạt khoảng 11 – 54% và 8 – 68% tương ứng tại Thọ An (Hà Tây) và Châu Giang (Hưng Yên). Sâu 9
  21. Đồ án tốt nghiệp khoang Spodoptera litura trên lạc bị chết bệnh do NPV khá cao, có khi tới 50 – 60%. Trên bông ở phía Nam (Ninh Thuận, Đồng Nai) virus NPV là yếu tố gây chết tự nhiên trên sâu xanh khá quan trọng. Tỉ lệ sâu xanh bị chết bệnh tự nhiên do NPV đạt 9 – 10%. Tại Đắc Lắc, nhiều khi sâu xanh bị chết ở tự nhiên do NPV đạt tới 16%. Sâu keo da láng Spodoptera exigua trên hành tây ở Ninh Thuận bị bệnh do NPV, chết với tỷ lệ không cao thường chỉ khoảng 0,4 – 16,6% (N.V. Cảm, 1991; N. T. Hai, 1996; N. T. Hồng, 1995; P.H. Nhượng, 1996; N. T. Sơn, 1998). 1.2.2 Cơ chế tác động của virus đa diện nhân NPV [1], [6], [8], [16], [18], [20] Virus NPV xâm nhập vào cơ thể sâu qua đường tiêu hóa. Khi virus vào đến ruột giữa dưới tác dụng của dịch ruột (pH > 9) các thể vùi đa diện nhân nhanh chóng hòa tan vào môi trường kiềm và giải phóng ra các nucleocapsid. Các nucleocapsid này sẽ gắn vào các tế bào biểu bì, di chuyển qua lớp tế bào chất và tháo bỏ lớp vỏ khi đi vào nhân. Quá trình nhân lên của virus bên trong nhân sẽ tạo ra các nucleocapsid con và mọc qua màng tế bào nhiễm đi vào trong hệ tuần hoàn của vật chủ. Hệ thống tuần hoàn sẽ giúp cho các virus đi đến được các mô khác nhau của vật chủ để gây ra quá trình xâm nhiễm tiếp theo. Các nucleocapsid sau đó được bao lại tạo thành thể vùi trong nhân hoặc tiếp tục đi xâm nhiễm các tế bào khác của vật chủ. Quá trình này có thể tóm tắt qua 3 giai đoạn như sau: - Giai đoạn tiềm ẩn: Kéo dài 6 đến 12 giờ, đây là giai đoạn các thể vùi PIB xâm nhập vào trong tế bào, các virion được phóng ra, chúng tự đính vào các vị trí thích hợp trên màng nhân tế bào thành ruột của sâu. - Giai đoạn sinh trưởng: Giai đoạn này kéo dài 12 – 48 giờ, đây là giai đoạn tăng nhanh của các virion mới trong dịch ruột của sâu, những sâu tuổi nhỏ chỉ sau 32 giờ trong cơ thể sâu đã chứa đầy các virion trần. - Giai đoạn cuối: Giai đoạn này kéo dài 2 – 5 ngày, ở giai đoạn này xảy ra sự tạo thành thể vùi, nghĩa là các virion được bao bọc bởi các protein. 10
  22. Đồ án tốt nghiệp Sâu bị nhiễm bệnh trong thời gian 2 – 3 ngày đầu, không có biểu hiện triệu chứng bệnh rõ rệt và không có sự thay đổi về sức ăn. Các ngày sau, các đốt thân căng phồng và mọng nước. Cơ thể sâu chuyển sang màu trắng đục, da bở. dễ bị vỡ. Trước khi chết sâu thường trèo lên ngọn cây, trúc đầu xuống phía dưới. Dịch trắng chảy ra ngoài và sâu chết. Nhiều trường hợp sâu nhiễm NPV, nhưng với lượng PIB cực nhỏ, không đủ để gây chết ở giai đoạn sâu non, tuy nhiên khi chuyển sang giai đoạn nhộng hoặc trưởng thành, làm giảm khả năng sinh sản, đẻ rất ít. Nhiều trường hợp do nhiễm NPV sâu không làm nhộng và vũ hóa được. Con trưởng thành đã nhiễm NPV khi đẻ trứng trên mặt vỏ trứng có các thể PIB bám vào và sâu non mới nở có tập tính ăn lại vỏ trứng. Như vậy thế hệ này hoàn toàn bị chết di virus từ giai đoạn tuổi 1 - 2. Xác sâu chết do virus lại là thức ăn hấp dẫn đối với sâu sống. Nhờ vậy mà sự lan truyền dịch hại trên đồng diễn ra mạnh và kéo dài. 1.2.3 Ưu điểm và nhược điểm của virus đa diện nhân NPV 1.2.3.1 Ưu điểm - Lợi ích về kinh tế: Theo Ngô Trung Sơn (1998) giá một lần phun thuốc NPV cao hơn thuốc hóa học, nhưng số lần phun ít hơn nên giá phòng trừ sâu toàn vụ bằng NPV thấp hơn so với thuốc hóa học, phun NPV trừ sâu trên diện rộng có xu hướng cho năng suất và hiệu quả kinh tế cao hơn thuốc hóa học. Đối với những vùng đã nhiều năm dùng thuốc hóa học, sâu không giảm mà còn có hiện tượng bùng phát thành dịch thì sử dụng NPV rất hiệu quả [6]. Trường hợp mật số sâu cao, sau khi phun NPV, sâu chết nông dân có thể tiếp tục thu thập sâu chết, hòa với nước phun trở lại để tiếp tục trừ sâu mà không mất tiền (Nguyễn Thơ, 1999) [15]. - Hiệu quả về môi trường: NPV giết sâu hại nhưng bảo vệ quần thể thiên địch, đảm bảo cân bằng sinh thái tự nhiên. Dùng NPV tránh được hiện tượng sâu kháng thuốc và không để lại dư lượng trong nông sản, không độc cho người và gia súc, không làm ảnh hưởng đến môi trường (Nguyễn Thơ, 1999) [15]. 11
  23. Đồ án tốt nghiệp - Hiệu quả về mặt xã hội: Việc nghiên cứu tạo ra những chủng NPV có độc tính cao, xây dựng quy trình sản xuất sẽ được thực hiện bởi các nhà khoa học. Sau đó chuyển giao cho địa phương sản xuất NPV ở quy mô vừa và nhỏ, chúng ta sẽ sử dụng nguồn nhân lực dồi dào ở nông thôn, giúp nông dân dễ dàng tiếp nhận những tiến bộ của khoa học kỹ thuật trong sinh học (Nguyên Thơ, 1999) [15]. 1.2.3.2 Nhược điểm - Thời gian ủ bệnh còn tương đối dài thường từ 5 – 6 ngày. - NPV thường mang tính chuyên hóa cao, thông thường mỗi loại NPV chỉ diệt được một loại sâu. - NPV dễ bị mất hiệu lực dưới tác động của tia tử ngoại và nhiệt độ cao. 1.3 Quy trình sản xuất chế phẩm virus đa diện nhân NPV [20] 1.3.1 Nhân sâu hàng loạt - Bước 1: Ghép cặp bướm mới vũ hóa 1 – 2 ngày, đảm bảo như điều kiện tự nhiên có cây cho bướm đậu để đẻ, có thể làm bằng giấy gấp. Thức ăn cho bướm là nước đường 3%. Sau giao phối 1 – 2 ngày, hằng ngày thu trứng, trứng để riêng từng ngày, thu trứng 3 – 5 ngày loại bỏ. - Bước 2: Để riêng trứng từng ngày vào trong tủ định ôn nơi có điều kiện ôn, ẩm độ thích hợp, hằng ngày theo dõi cho đến khi trứng nở ra sâu non. - Bước 3: Sâu non mới nở được nuôi bằng thức ăn nhân tạo ngay. Riêng sâu xanh bông thì tuổi nhỏ 1 – 2 nuôi tập thể, đến sâu tuổi 3 tách riêng để tránh cắn lẫn nhau, khi sâu đạt tuổi 4 có thể nhiễm virus hoặc nuôi tiếp cho đến khi vào nhộng. - Bước 4: Giữ nhộng trong điều kiện thích hợp để nhộng phát triển tốt, lưu ý là thu nhộng từng đợt để vũ hóa cùng đợt. 1.3.2 Lây nhiễm virus đa diện nhân NPV lên vật chủ tạo chế phẩm 12
  24. Đồ án tốt nghiệp - Thu sâu chết bệnh: Thời gian sâu chết bệnh phụ thuộc vào nhiệt độ và ẩm độ trong quá trình lây nhiễm, nhưng thích hợp nhất là 28 – 300C và ẩm độ trên 80%. Sau khi nhiễm 3 – 5 ngày thì sâu chết do NPV, phải tiến hành thu ngay vào trong lọ tối, đưa vào lạnh để giữ cho khỏi nhiễm tạp trong vài ngày ủ bệnh, tuy điều kiện cụ thể có thể để lâu hơn. - Nghiền và ly tâm: Việc tách chiết dịch virus được thực hiện qua máy ly tâm, lấy NPV thu được trên sâu chết bệnh từ tủ lạnh ra, đem nghiền nhỏ (hỗn hợp 3 phần nước với 1 phần sâu chết bệnh) rồi lọc qua vải mỏng lọc bỏ bã xác sâu để thu dịch, ly tâm dịch 15,000 – 20,000 vòng/ phút, khoảng thời gian từ 15 – 20 phút, lấy phần tinh thể trắng lắng đọng là virus và loại bỏ nước phần trên. - Hỗn hợp tạo chế phẩm virus: + Chế phẩm dạng dịch thể: Trước khi tạo chế phẩm phải kiểm tra và đếm số lượng PIB, sau đó cho thêm các chất phụ gia như chất bám dính, chất chống thối, chất kháng sinh, chất chống tia tử ngoại, cuối cùng đóng chai tối màu để bảo quản sử dụng. + Chế phẩm dạng bột: Sau khi thu dịch virus tinh, đem sấy phun nhẹ hoặc đông khô rồi phối chế với các chất phụ gia để tạo chế phẩm dạng bột, phương pháp tạo chế phẩm dạng bột đòi hỏi hàm ẩm từ 7 – 10% để bảo quản trong thời gian dài hơn dạng dịch thể. 13
  25. Đồ án tốt nghiệp Nuôi nhân ký chủ sâu xanh Lây nhiễm HaNPV Thu sâu giống Nhiễm HaNPV lên sâu Giữ nhộng Thu sâu chết do HaNPV Ghép cặp bướm Nghiền, lọc sâu chết bệnh Thu trứng Ly tâm để thu dịch virus tinh Nuôi sâu tập thể (tuổi 1 – 2) Hỗn hợp tạo chế phẩm Tách nuôi sâu riêng(tuổi 3- 4) Thêm chất phụ gia Đóng chai, bảo Đóng gói, bảo quản, sử dụng quản, sử dụng Hình 2.1 Sơ đồ sản chế phẩm HaNPV phòng trừ sâu xânh 1.4 Sơ lược về sâu khoang [5], [7], 14], [19] 1.4.1 Đặc điểm sinh học, sinh thái sâu khoang (Spodoptera litura Fabr.) 1.4.1.1 Đặc điểm hình thái - Ngài: Thân dài 16 – 21 mm, sải cánh 37 – 42 mm, cánh trước màu nâu vàng. Phần giữa mép trước cánh tới mép sau cánh có 1 gân ngang rộng màu trắng. - Trứng: Hình bán cầu, đường kính 0,5 mm. Trứng mới đẻ có màu trắng vàng, sau đó chuyển dần thành màu vàng tro tối. Trứng xếp với nhau thành ổ có lông màu nâu vàng phủ ngoài. 14
  26. Đồ án tốt nghiệp - Sâu non: Có 6 tuổi. Đẫy sức dài 38 – 51 mm, hình ống tròn, phần lớn có màu nâu, một số ít màu lục xanh. Vạch lưng và vạch phụ lưng màu vàng. Trên mỗi đốt dọc theo vạch phụ lưng có một vệt đen hình bán nguyệt trong đó vệt ở đốt thứ 1 và thứ 8 của bụng là lớn nhất. - Nhộng: Dài 18 – 20 mm, màu nâu tươi hoặc nâu tối, hình ống tròn. Mép trước đốt bụng thứ 4 và vòng quanh đốt bụng thứ 5, 6, 7 có nhiều chấm lõm. Cuối bụng có một đôi gai ngắn. 1. Trứng 2. Sâu non 3. Nhộng 4. Trưởng thành Hình 2.1. Sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 15
  27. Đồ án tốt nghiệp 1.4.1.2 Tập tính sinh sống và quy luật phát sinh gây hại - Ngài sâu khoang thường vũ hoá vào buổi chiều và lúc chập choạng tối bay ra hoạt động. Ngài thường đẻ trứng ở mặt dưới lá, số lượng trứng đẻ trung bình của ngài cái là 2000 - 2600 trứng. - Sâu non mới nở (tuổi 1) sống tập trung với nhau, lớn lên (tuổi 4) có phản ứng đối với ánh sáng rõ rệt, lẩn trốn ánh sáng vào ban ngày. - Sâu khoang phát sinh quanh năm trên rau. Mỗi năm có 7 đỉnh cao mật độ trên đồng ruộng, thời gian giữa 2 đỉnh cao là 20 - 26 ngày. 1.4.2 Tác hại và biện pháp phòng trừ sâu khoang ở Việt Nam 1.4.2.1 Tác hại của sâu khoang Kết quả nghiên cứu sâu hại lạc năm 1991 - 1992 của Lê Văn Thuyết và cộng sự (1993) cho thấy: sâu khoang là 1 trong 15 loài sâu hại chính trên cây lạc, mật độ giao động từ 3,2 - 73 con/100 cây, về cuối vụ vẫn còn khoảng 60 con/100 cây. Trên đậu tương sâu khoang thường gây thành dịch (Lương Minh Khôi, 1985). Ở miền Bắc Việt Nam vào vụ lạc xuân sâu khoang thường đạt đỉnh cao về mật độ vào đầu tháng 5 (4 - 6 sâu non/cây) và có thể gây hại tới 30% diện tích lá. Ở miền Nam trong vụ đông xuân sâu khoang phát triển đạt đỉnh cao vào khoảng cuối tháng 1 đầu tháng 2, trong trường hơp không áp dụng các biện pháp phòng trừ diện tích lá thường bị hại tới trên 50% (Ngô Thế Dân và cộng sự, 2000). Kết quả nghiên cứu của Đặng Thị Dung (1999) tại Hà Nội và các vùng phụ cận sâu khoang là một trong số 7 loài sâu hại chính trên đậu tương, xuất hiện thường xuyên trên các cánh đồng trồng đậu tương với mật độ cao. 1.4.2.2 Biện pháp phòng trừ Để phòng trừ sâu khoang đa số người dân sử dụng thuốc trừ sâu hoá học, với liều lượng phun và số lần phun cao hơn nhiều so với yêu cầu thực tế. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về biện pháp phòng trừ sâu khoang. Trong đó, biện pháp quản dịch 16
  28. Đồ án tốt nghiệp hại tổng hợp (IPM) được coi là biện pháp hữu hiệu nhất cả về mặt kinh tế và môi trường. Nghiên cứu xác định tỷ lệ thành phần hoá học thích hợp của pheromone sâu khoang (Spodoptera litura) tổng hợp để thu hút trưởng thành sâu khoang vào bẫy. Với tỷ lệ liều lượng Hexal 1 và Hexal 2 là 97/3 microlit cho một mồi hiệu lực hấp dẫn sâu khoang trên đồng ruộng cao nhất, ngày đỉnh cao (ngày thứ 8 sau đặt bẫy) có thể đạt tới 18con/bẫy và thời gian tồn tại hiệu lực là tới 20 ngày (Lê Thanh Hà, Nguyễn Thị Chúc Quỳnh, Lê Văn Trịnh, 2008). Kết quả nghiên cứu của Lương Minh Khôi và cộng sự (1985) cho thấy ong ký sinh trên sâu khoang hại đậu tương Microplitis prodeniae là một loài ký sinh nội thực thụ, nó thể hiện vai trò rõ nét trong việc điều hoà chủng quần sâu khoang. Phạm Thị Vượng (1996) nghiên cứu về ký sinh sâu non sâu khoang hại lạc tại Nghệ An, Hà Tây, Hà Bắc mới chỉ phát hiện được 5 loài ong và ruồi ký sinh thuộc 3 họ của 2 bộ. Bộ Hymenoptera có 2 loài thuộc họ Ichneumonidae, bộ Diptera có 3 loài thuộc họ: Họ Tachinidae có 2 loài, họ Phoridae có 1 loài. Tỷ lệ ký sinh giao động từ 1,99% đến 4,91% cao nhất vào trung tuần tháng 5, thấp nhất ở Hà Bắc rồi đến Nghệ An và cao nhất ở Hà Tây. Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ ký sinh thấp nhất ở những vùng nông dân phun thuốc nhiều lần trên một vụ . Theo kết quả điều tra của Nguyễn Thị Hiếu (2004) ở vùng đồng bằng Nghệ An trên sinh quần ruộng lạc sâu non sâu khoang có 8 loài côn trùng ký sinh. Trong đó, 6 loài ong ký sinh (Bộ Hymenoptera) và 2 loài ruồi ký sinh (Bộ Diptera). Loài Microlitits prodenidae Rao et Chad và Microlitits sp là loài phổ biến và có vai trò quan trọng trong hạn chế số lượng sâu non sâu khoang trên ruộng lạc. Sâu khoang rất thích đẻ trứng trên lá hướng dương, dựa vào đặc điểm này các chuyên gia ICRISAT đã khuyến cáo sử dụng hướng dương trồng xen với lạc để làm cây dẫn dụ sâu khoang đến đẻ trứng rồi thu trứng và sâu non hoặc chỉ cần phun thuốc trên hướng dương để tiêu diệt sâu. Thử nghiệm biện pháp này trên đồng ruộng, nông 17
  29. Đồ án tốt nghiệp dân ở tỉnh Nghệ An và Tây Ninh đã thu được hiệu lực cao. Có thể thu thập hàng ngàn sâu non mới nở cùng nhiều ổ trứng sâu khoang từ mỗi cây hướng dương trồng xen trên ruộng lạc, bởi vậy mật độ sâu mới giảm (Nguyễn Thị Hiếu, 2004). Các nguồn vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virus) có ích cũng được nghiên cứu để phòng trừ sâu khoang như chế phẩm NPV (Nuclear polyhedrosis virus) dưới dạng bột khô thấm nước khi phun ngoài đồng ruộng với liều lượng là 20g/bình, hiệu lực trừ sâu khoang đạt 53,1% sau 5 ngày phun thuốc và 68,7 - 71,6% sau 7 - 10 ngày phun thuốc.(Hoàng Thị Việt và cộng sự, 2002). 1.5 Những nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam về sử dụng chất phụ gia bảo vệ virus NPV 1.5.1 Những nghiên cứu trên thế giới Khi phun NPV trừ sâu trên đồng ruộng, tia cực tím của ánh sáng mặt trời là yếu tố quan trọng nhất làm giảm hiệu lực của chúng. Người ta cũng phát hiện ra tia sáng có bước sóng ngắn 215 – 216 nm có khả năng khử hoạt tính PIB của NPV (Bullok, H.R., 1967). Ignoffo, C.M và cộng sự (1971) đã phát hiện: dưới ánh sáng mặt trời, thể vùi đa diện bi khử hoạt tính là do các peroxide hoặc các gốc peroxide sản sinh từ các amino acid bị chiếu bức xạ bởi tia X (dẫn theo Ngô Trung Sơn,1998) [6]. Để duy trì hiệu lực của NPV khi phun ngoài đồng ruộng, nhiều tác giả đã nghiên cứu trộn thêm các chất phụ gia vào dịch để lọc tia cực tím của ánh sáng mặt trời, tăng sức ăn của sâu, tăng lượng NPV vào cơ thể sâu. Ignoffo C.M và cộng sự (1971) cho biết: các sản phẩm protein, phẩm màu, thuốc nhuộm, than hoạt tính, có khả năng lọc tia cựa tím bảo vệ NPV [30]. Còn theo Arivudainambi và cộng sự (2000), đồng amonium nitrat và đồng sulphate cũng có chức năng tương tự [23]. Các nghiên cứu của Rabindra và cộng sự (1989) tại Ấn Độ cho kết quả: sữa, trứng tươi, nước dừa, đường đen, bột hạt bông, dầu lạc trộn với HaNPV khi phun ra đồng ruộng làm tăng hiệu lực diệt sâu xanh của HaNPV, đặc biệt là đường đen 18
  30. Đồ án tốt nghiệp 0,5 – 5%. Tại Đài Loan, Tuan, S.J. và cộng sự (1988), đã làm thí nghiệm trộn noãn hoàn tố với lượng 50 mg/ml dịch và 5 mg/ml dịch NPV, tỷ lệ sâu chết NPV tương ứng là 66,7% và 46,7%, đối chứng NPV đơn độc sâu chết 28,3% [39]. Ignoffo, C.M. và cộng sự (1995), cũng đã phát hiện thêm các aminoacid vòng thơm: Tryptophan với lượng 0,03 mg/ml dịch NPV hoặc Tyrosine với lượng 0,5 mg/ml dịch NPV có thể làm giảm 50% tác hại của ánh sáng mặt trời đối với NPV. Các sản phẩm tự nhiên giống như các dẫn xuất của lignin chẳng hạn như sản phẩm phụ của ngành công nghiệp giấy cũng có khả năng bảo vệ NPV với tỷ lệ cao (Jacques, 1977, Tamez-Guerra và cộng sự., 2000; El Salamouny và cộng sự., 2002; Elnagar và cộng sự., 2003). Theo C. Garcia thì Carbon và Congo Red bảo vệ tốt nhất HzSNPV [30]. Còn ở Ai Cập, A. El-Helaly và cộng sự (2009), đã tiến hành thí nghiệm hai mươi loài nguyên liệu tự nhiên nguồn gốc từ thực vật có khả năng chống oxy hóa sử dụng làm chất phụ gia, chống tia cực tím kéo dài hoạt động của Nucleopolyhedrovirus Spodoptera litura (spltNPV). Kết quả cho thấy rằng, khi sử dụng carob và cacao làm chất phụ gia thì hiệu lực của virus sau tiếp xúc với tia cựa tím 5 giờ là 49,5 và 49%, trong khi virus một mình thì hiệu lực chỉ còn lại 2%. Còn dùng bắp cải xanh và bắp cải tím thì hiệu lực còn lại lần lược là 53,05 và 50,9% so với sử dụng virus đơn độc là 6,88%. Trong khi đó Caphê và sả hiệu lực còn lại là 47,96 và 44,18% so với virus đơn độc là 16,62%. Hạt và vỏ của nho còn lại là 72,5 và 51,66%, so với 17,5% của virus không thêm chất bảo quản [23]. Để tăng hiệu lực trừ sâu và rút ngắn thời gian ủ bệnh NPV của ký chủ, các nhà khoa học trộn NPV với thuốc trừ sâu Endosulfan 50%, bước đầu cho kết quả tốt (Jayarajs. 1985). Năm 2001, P. D. Kamala Jayanthi và cộng sự, tiến hành phối trộn NPV với Fenvelerate kết quả cho thấy cao hơn hẳn so với công thức chỉ sử dụng NPV một mình [37]. Còn Padue, L.E. và cộng sự, kết hợp phối trộn NPV với Karate 25EC [34]. Ở Ấn Độ, Trang và S. chaudhari (2002), cũng đã tiến hành thí nghiệm kết hợp NPV với Actara, Diflubenzuron, Imidacloprid với nồng độ lần lược là 150ppm, 10ppm, 7ppm. Kết quả cho thấy, khi kết hợp NPV với actara thì hiệu lực đạt 83,18% trong khi 19
  31. Đồ án tốt nghiệp đó NPV đơn độc hiệu lực chỉ đạt 48,3%, với Diflubenzuron hiệu lực đạt 93,3% còn NPV đơn độc hiệu lực chỉ đạt 48,3%, với Imidacloprid thì hiệu lực đạt 88,3% còn NPV đơn độc hiệu lực đạt 46,6% [37]. Ngoài việc kết hợp với thuốc trừ sâu hóa học người ta còn kết hợp với acid boric. Theo Shapiro and Bell (1982) acid boric được chứng minh là làm tăng khả năng hoạt động của B. thuringgiengsis và một số loài Baculoviruses. Giá trị LC50 của NPV đối với Anticarsia gemmatalis được tăng khoảng 5 lần với sự hiện diện của acid boric 0,045%. Thời gian gây chết (LT50) cũng rút ngắn (Morales và cộng sự, 1997). Các kết quả tương tự cũng đã được báo cáo với các chủng NPV của Lymantria dispar (L.) và Spodoptera litura (F.) khi trộn với acid boric 0,5 – 1% (Shapiro and Bell, 1982; Chaudhari, 1992). Mặt dù hiệu quả thực tế của acid boric đối với baculoviruses đã được công nhận nhiều thập kỷ qua (Yadava, 1970), nhưng có rất ít nguyên cứu đánh giá hiệu quả của virus NPV trộn acid boric (Juan Cisneros và cộng sự, 2002) [31]. Bột ngô gần đây được báo cáo là làm tăng đáng kể khả năng tồn tại NPV của Anagrapha falcifara (Kirby) sau khi tiếp xúc với mưa nhân tạo và ánh sáng mặt trời nhân tạo (Tamez - Guerra và cộng sự, 2000) [31]. Ở Trung Quốc đã có những nghiên cứu về chế phẩm sinh học hỗn hợp giữa virus và Bt nhằm năng cao hiệu quả phòng trừ sâu xanh (Ngô Trung Sơn, 1998) [6]. Ngoài các chế phẩm NPV dạng lỏng đã được nghiên cứu thì các chế phẩm dạng bột cũng được các nhà khoa học nghiên cứu. Năm 2002, Juan Cisneros và cộng sự nghiên cứu tạo chế phẩm NPV dạng bột với chất mang là bột ngô thử nghiệm trên các cánh đồng ngô ở Mexico kiểm soát Spodoptera frugiperda. Các thí nghiệm ngoài đồng với một tỷ lệ sử dụng thích hợp được xác định là 24 kg/ha (J. Cisneros and T.Williams,2002). Hạt có chứa 25x1012 PIB/kg hạt tương đương 1,5x1012 PIB/ha đó là tỷ lệ ứng dụng tiêu chuẩn được xác định trong các nguyên cứu trước đó (Martı´nez et al., 2000) [31]. 20
  32. Đồ án tốt nghiệp 1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Ở nước ta, các nghiên cứu về virus côn trùng để trừ sâu hại được bắt đầu từ những năm tám mươi. Đến nay đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về loại virus này, các kết quả điều cho thấy NPV rất mẫn cảm với loài sâu hại. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của NPV là bị mất hiệu lực nhanh chóng dưới tác động của tia cực tím của ánh sáng mặt trời và thời gian ủ bệnh ở ký chủ dài làm cho thời gian diệt sâu thường kéo dài từ 5 – 6 ngày. Theo Nguyễn Văn Huỳnh thì chế phẩm NPV khó bảo quản [17]. Năm 1990, Trung tâm nghiên cứu bông Nha Hố đã tiến hành nghiên cứu khả năng lọc tia cựa tím bảo vệ HaNPV của sữa lọc béo, than hoạt tính và rỉ đường. Kết quả cho thấy, nếu phơi HaNPV ngoài nắng 1 giờ, hiệu lực diệt sâu xanh của chúng chỉ còn 37%, song nếu dịch HaNPV có trộn 3% sữa lọc béo thì hiệu lực diệt sâu vẫn còn 81%, còn trộn 3% than hoạt tính thì hiệu lực của HaNPV cũng còn 50% (Ngô Trung Sơn, 1998) [6]. Các nghiên cứu cho biết, trộn NPV với Bt làm tăng hiệu lực trừ sâu xanh của NPV. Theo Nguyễn Thơ (1999), phối trộn NPV với GV, Bt và một số chất chiết từ thực vật có khả năng diệt sâu như Rotenol , để nâng cao khả năng diệt sâu của NPV mà không gây ảnh hưởng xấu đến môi trường và làm hại đến các động vật có ích và côn trùng khác [15]. Năm 2003, Dương Trình bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm NPV trừ sâu khoang có bổ sung chất phụ gia như bột sữa, mực tàu, rỉ đường, chất bám dính [2]. Nhưng theo Phan Lưu Quốc Hùng (2004), đã tiến hành thử nghiệm hiệu lực của chế phẩm này ngoài đồng cho thấy hiệu lực giết sâu khoang chỉ ở mức trung bình (40 - 55%) [22]. Năm 2011, Nguyễn Hoàng Nam nghiên cứu khả năng bảo vệ NPV của các dịch chiết có nguồn gốc thực vật như trà xanh, hành, tỏi, bắp cải xanh, bắp cải tím, củ cải trắng , kết quả ban đầu cho thấy hiệu lực giết sâu của NPV có bổ sung các loại dịch chiết trên sau 5 ngày phơi nắng cao hơn công thức không có bổ sung dịch chiết [8]. 21
  33. Đồ án tốt nghiệp 2.1 Thời gian thực hiện đề tài Đề tài được tiến hành từ tháng 02/05/2012 đến tháng 21/07/2012. 2.2 Địa điểm thực hiện đề tài Thực nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Khoa Môi trường và Công nghệ sinh học _ Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh. 2.3 Dụng cụ và vật liệu thí nghiệm 2.2.1 Dụng cụ thí nghiệm 2.2.1.1 Dụng cụ nuôi sâu - Hộp nuôi sâu - Lọ nuôi sâu - Lọ ghép bướm - Panh gắp sâu - Máy xay sinh tố - Cân phân tích 2.2.1.2 Dụng cụ thực nghiệm - Kính hiển vi đối pha (Phase contrast microscope_PCM) - Buồng đếm hồng cầu - Máy ly tâm - Hủ nhựa 2.3.2 Vật liệu thí nghiệm 2.3.2.1 Vật liệu nuôi sâu a. Thức ăn nhân tạo 22
  34. Đồ án tốt nghiệp - Đậu xanh hạt ngâm - Men mì - Methyl-paraben - Sorbic acid - Ascorbic acid - Vitamin tổng hợp - Vitamin E - Casein - Agar - Fomalin 40% b. Thức ăn tự nhiên Lá thầu dầu, được hái ở Lô 4 Khu Công nghiệp Tân Bình, Đường 3, Phường Tây Thạnh, Quận Tân Bình, Thành phố Hồ Chí Minh. 2.3.2.2 Chất phụ gia - Sherpa 25 EC - Alibaba 1.8 EC - Acid boric - Rỉ đường - Tween 80 - Bột ngô - Bột đậu nành - Trà xanh 23
  35. Đồ án tốt nghiệp - Bột cao lanh 2.3.2.3 Nguồn sâu khoang Viện Công nghệ sinh học và Môi trường _ Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 2.3.2.4 Nguồn virus NPV Nguồn virus được thu thập tại Ninh Thuận và Bà Rịa Vũng Tàu. 2.4 Nội dung nghiên cứu - Đánh giá hiệu lực của virus NPV đối với sâu khoang khi bổ sung lượng nhỏ hoạt chất Cypermethrin, Abamectin, Acid boric. - Đánh gía hiểu lực của virus NPV đối với sâu khoang khi bổ sung Tween 80, rỉ đường. - Khảo sát tỷ lệ rỉ đường và nồng độ trà xanh thích hợp phối trộn với chế phẩm NPV. - Đánh giá hiệu lực của virus NPV đối với sâu khoang khi bổ sung bột cao lanh. 2.5 Phương pháp nghiên cứu Trong nội dung đồ án này sinh viên sử dụng phương pháp nghiên cứu trong phòng tìm hiểu ảnh hưởng của các chất phụ gia đến hiệu lực diệt sâu khoang của virus NPV. 2.5.1 Dịch NPV bổ sung một lượng nhỏ thuốc trừ sâu 2.5.1.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu lực của virus NPV bổ sung thuốc trừ sâu nhóm Cypermethrin (Sherpa 25EC) Mục đích: Đánh giá hiệu lực của virus NPV đối với sâu khoang khi bổ sung lượng nhỏ thuốc trừ sâu nhóm Cypermethrin. 24
  36. Đồ án tốt nghiệp Chuẩn bị thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức và được nhắc lại 3 lần. Mỗi lần nhắc lại sử dụng 20 sâu tuổi 3, tổng số sâu sử dụng cho thí nghiệm này là 240 sâu tuổi 3. - CT1: Dịch NPV (5,8 x 107 PIB/ml) - CT2: Sherpa 25EC (30ml/16 L nước) - CT3: Dịch NPV (5,8 x 107 PIB/ml) + 100 ppm Cypermethrin - CT4: Đối chứng (nước cất) Tiến hành thí nghiệm: Lá thầu dầu thu ngoài tự nhiên, mang về phòng thí nghiệm xử lý sơ bộ. Loại bỏ những lá già và hư, lựa chọn những lá không quá già cũng không quá non. Sau đó đem rửa với nước thật sạch để ráo. Lá thầu dầu sau khi xử lý được nhúng vào dung dịch đã chuẩn bị như các công thức thí nghiệm, để cho ráo nước rồi cho vào lọ nuôi sâu, mỗi lọ đã thả một sâu tuổi 3 được bỏ đói 2 giờ. Khi sâu ăn hết thức ăn nhiễm virus NPV, thì thay bằng thức ăn sạch. Sau đó theo dõi cho tới khi sâu chết hết hoặc vào nhộng hoàn toàn. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu khoang chết bệnh và thời gian sâu khoang ủ bệnh ở mỗi công thức. 2.5.1.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hiệu lực của virus NPV bổ sung thuốc trừ sâu nhóm Abamectin (Alibaba 1.8EC) Mục đích: Đánh giá khả năng diệt sâu khoang của virus NPV có bổ sung một lượng nhỏ thuốc trừ sâu nhóm Abamectin (Alibaba 1.8EC). Chuẩn bị thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức và được nhắc lại 3 lần. Mỗi lần nhắc lại sử dụng 20 sâu tuổi 3, tổng số sâu sử dụng cho thí nghiệm này là 240 sâu tuổi 3. - CT1: Dịch NPV (5,8 x 107 PIB/ml) 25
  37. Đồ án tốt nghiệp - CT2: Chế phẩm Abatimec 1,8 EC (20 ml/16 L nước) - CT3: Dịch NPV(5,8 x 107 PIB/ml) + 10 pm Abamectin - CT4: Đối chứng (nước cất) Tiến hành thí nghiệm: Lá thầu dầu thu ngoài tự nhiên, mang về phòng thí nghiệm xử lý sơ bộ. Loại bỏ những lá già và hư, lựa chọn những lá không quá già cũng không quá non. Sau đó đem rửa với nước thật sạch để ráo. Lá thầu dầu sau khi xử lý được nhúng vào dung dịch đã chuẩn bị như các công thức thí nghiệm, để cho ráo nước rồi cho vào lọ nuôi sâu, mỗi lọ đã thả một sâu tuổi 3 được bỏ đói 2 giờ. Khi sâu ăn hết thức ăn nhiễm virus NPV, thì thay bằng thức ăn sạch. Sau đó theo dõi cho tới khi sâu chết hết hoặc vào nhộng hoàn toàn. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu khoang chết bệnh và thời gian sâu khoang ủ bệnh ở mỗi công thức. 2.5.1.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu lực của virus NPV đối với sâu khoang khi bổ sung acid boric Mục đích: Đánh giá khả năng diệt sâu khoang của virus NPV khi có bổ sung acid boric. Chuẩn bị thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức, 3 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại sử dụng 20 sâu tuổi 3, tổng số sâu sử dụng cho thí nghiệm này là 300 sâu tuổi 3. - CT1: Dịch NPV (5,8x107 PIB/ml) - CT2: Sherpa 25 EC (30 ml/16 L nước) - CT3: Dịch NPV (5,8x107 PIB/ml) + 1% acid boric - CT4: 1% acid boric - CT5: Đối chứng (nước cất) 26
  38. Đồ án tốt nghiệp Tiến hành thí nghiệm: Lá thầu dầu thu ngoài tự nhiên, mang về phòng thí nghiệm xử lý sơ bộ. Loại bỏ những lá già và hư, lựa chọn những lá không quá già cũng không quá non. Sau đó đem rửa với nước thật sạch để ráo. Lá thầu dầu sau khi xử lý được nhúng vào dung dịch đã chuẩn bị như các công thức thí nghiệm, để cho ráo nước rồi cho vào lọ nuôi sâu, mỗi lọ đã thả một sâu tuổi 3 được bỏ đói 2 giờ. Khi sâu ăn hết thức ăn nhiễm virus NPV, thì thay bằng thức ăn sạch Sau đó theo dõi cho tới khi sâu chết hết hoặc vào nhộng hoàn toàn. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu khoang chết bệnh và thời gian sâu khoang ủ bệnh mỗi công thức. 2.5.2 Dịch virus NPV bổ sung chất bám dính lên mặt lá 2.5.2.1 Thí nghiệm 4: Tìm hiểu ảnh hưởng của Tween 80 đối với virus NPV đến khả năng diệt sâu khoang. Mục đích: Tìm hiểu khả năng diệt sâu khoang của dịch virus NPV bổ sung 1% Tween 80. Chuẩn bị thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nghiệm thức, 4 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại sử dụng 20 sâu tuổi 3, tổng số sâu sử dụng cho thí nghiệm này là 240 sâu tuổi 3. - CT1: Dịch NPV (5,8x107 PIB/ml) - CT2: Dịch NPV (5,8x107 PIB/ml) + 1% Tween 80 - CT3: Đối chứng (nước cất) Tiến hành thí nghiệm: Lá thầu dầu thu ngoài tự nhiên, mang về phòng thí nghiệm xử lý sơ bộ. Loại bỏ những lá già và hư, lựa chọn những lá không quá già cũng không quá non. Sau đó đem rửa với nước thật sạch để ráo. Lá thầu dầu sau khi xử lý được nhúng vào dung dịch đã chuẩn bị như các công thức thí nghiệm, để cho ráo nước rồi cho vào lọ nuôi sâu, mỗi lọ đã thả một sâu tuổi 3 được bỏ đói 2 giờ. Khi sâu ăn hết 27
  39. Đồ án tốt nghiệp thức ăn nhiễm virus NPV, thì thay bằng thức ăn sạch. Sau đó theo dõi cho tới khi sâu chết hết hoặc vào nhộng hoàn toàn. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu khoang chết mỗi công thức. 2.5.2.2 Thí nghiệm 5: Tìm hiểu ảnh hưởng của rỉ đường đối với NPV đến khả năng diệt sâu khoang Mục đích: Tìm hiểu khả năng diệt sâu khoang của dịch virus NPV bổ sung 3% rỉ đường. Chuẩn bị thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nghiệm thức, 4 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại sử dụng 20 sâu tuổi 3, tổng số sâu sử dụng cho thí nghiệm này là 240 sâu tuổi 3. - CT1: Dịch NPV (5,8 x 107 PIB/ml) - CT2: Dịch NPV (5,8 x 107 PIB/ml) + 3% rỉ đường - CT3: Đối chứng (nước cất) Tiến hành thí nghiệm: Lá thầu dầu thu ngoài tự nhiên, mang về phòng thí nghiệm xử lý sơ bộ. Loại bỏ những lá già và hư, lựa chọn những lá không quá già cũng không quá non. Sau đó đem rửa với nước thật sạch để ráo. Lá thầu dầu sau khi xử lý được nhúng vào dung dịch đã chuẩn bị như các công thức thí nghiệm, để cho ráo nước rồi cho vào lọ nuôi sâu, mỗi lọ đã thả một sâu tuổi 3 được bỏ đói 2 giờ. Khi sâu ăn hết thức ăn nhiễm virus NPV, thì thay bằng thức ăn sạch. Sau đó theo dõi cho tới khi sâu chết hết hoặc vào nhộng hoàn toàn. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu khoang chết ở mỗi công thức. 2.5.3 Dịch virus NPV bổ sung chất kích thích ăn của sâu khoang 2.5.3.1 Thí nghiệm 6: Tìm hiểu ảnh hưởng của bột ngô đối với NPV đến khả năng diệt sâu khoang 28
  40. Đồ án tốt nghiệp Mục đích: Tìm hiểu khả năng diệt sâu khoang của dịch virus NPV bổ sung 3% bột ngô. Chuẩn bị thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nghiệm thức, 4 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại sử dụng 20 sâu tuổi 3, tổng số sâu sử dụng cho thí nghiệm này là 240 sâu tuổi 3. - CT1: Dịch NPV (5,8 x 107 PIB/ml) - CT2: Dịch NPV (5,8 x 107 PIB/ml) + 3% bột ngô - CT3: Đối chứng Tiến hành thí nghiệm: Lá thầu dầu thu ngoài tự nhiên, mang về phòng thí nghiệm xử lý sơ bộ. Loại bỏ những lá già và hư, lựa chọn những lá không quá già cũng không quá non. Sau đó đem rửa với nước thật sạch để ráo. Lá thầu dầu sau khi xử lý được nhúng vào dung dịch đã chuẩn bị như các công thức thí nghiệm, để cho ráo nước rồi cho vào lọ nuôi sâu, mỗi lọ đã thả một sâu tuổi 3 được bỏ đói 2 giờ. Khi sâu ăn hết thức ăn nhiễm virus NPV, thì thay bằng thức ăn sạch. Sau đó theo dõi cho tới khi sâu chết hết hoặc vào nhộng hoàn toàn. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu khoang chết ở mỗi công thức. 2.5.3.2 Thí nghiệm 7: Tìm hiểu ảnh hưởng của bột đậu nành đối với NPV đến khả năng diệt sâu khoang Mục đích: Đánh giá khả năng diệt sâu khoang của dịch virus NPV bổ sung 3% bột đậu nành. Chuẩn bị thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nghiệm thức, 4 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại sử dụng 20 sâu tuổi 3, tổng số sâu sử dụng cho thí nghiệm này là 240 sâu tuổi 3. - CT1: Dịch NPV (5,8 x 107 PIB/ml) 29
  41. Đồ án tốt nghiệp - CT2: Dịch NPV (5,8 x 107 PIB/ml) + 3% bột đậu nành - CT3: Đối chứng (nước cất) Tiến hành thí nghiệm: Lá thầu dầu thu ngoài tự nhiên, mang về phòng thí nghiệm xử lý sơ bộ. Loại bỏ những lá già và hư, lựa chọn những lá không quá già cũng không quá non. Sau đó đem rửa với nước thật sạch để ráo. Lá thầu dầu sau khi xử lý được nhúng vào dung dịch đã chuẩn bị như các công thức thí nghiệm, để cho ráo nước rồi cho vào lọ nuôi sâu, mỗi lọ đã thả một sâu tuổi 3 được bỏ đói 2 giờ. Khi sâu ăn hết thức ăn nhiễm virus NPV, thì thay bằng thức ăn sạch. Sau đó theo dõi cho tới khi sâu chết hết hoặc vào nhộng hoàn toàn. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu khoang chết ở mỗi công thức. 2.5.4 Dịch virus NPV bổ sung chất lọc tia cực tím dưới tác động ánh sáng mặt trời 2.5.4.1 Thí nghiệm 8: Khảo sát tỷ lệ rỉ đường thích hợp phối trộn với virus NPV Mục đích: Khảo sát tỷ lệ rỉ đường thích hợp phối trộn với virus NPV lọc tia cực tím duy trì hiệu lực diệt sâu khoang. Chuẩn bị thí nghiệm: Thí nghiệm có 5 nghiệm thức được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 yếu tố và 3 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại sử dụng 20 sâu tuổi 3, tổng số sâu sử dụng cho thí nghiệm này là 900 sâu tuổi 3. - CT1: Dịch NPV (5,8 x 107 PIB/ml) phơi nắng 1, 3, 5 ngày. - CT2: Dịch NPV (5,8 x 107 PIB/ml) + 3% rỉ đường phơi nắng 1, 3, 5 ngày. - CT3: Dịch NPV (5,8 x 107 PIB/ml) + 5% rỉ đường phơi nắng 1, 3, 5 ngày. - CT4: Dịch NPV (5,8 x 107 PIB/ml) + 7% rỉ đường phơi nắng 1, 3, 5 ngày. 30
  42. Đồ án tốt nghiệp - CT5: Đối chứng (nước cất) Tiến hành thí nghiệm: Lá thầu dầu thu ngoài tự nhiên, mang về phòng thí nghiệm xử lý sơ bộ. Loại bỏ những lá già và hư, lựa chọn những lá không quá già cũng không quá non. Sau đó đem rửa với nước thật sạch để ráo. Lá thầu dầu sau khi xử lý được nhúng vào dung dịch đã chuẩn bị như các công thức thí nghiệm, để cho ráo nước rồi cho vào lọ nuôi sâu, mỗi lọ đã thả một sâu tuổi 3 được bỏ đói 2 giờ. Khi sâu ăn hết thức ăn nhiễm virus NPV, thì thay bằng thức ăn sạch. Sau đó theo dõi cho tới khi sâu chết hết hoặc vào nhộng hoàn toàn. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu khoang chết ở mỗi công thức. 2.5.4.2 Thí nghiệm 9: Khảo sát nồng độ trà xanh thích hợp phối trộn với virus NPV Mục đích: Khảo sát nồng độ trà xanh thích hợp phối trộn với virus NPV nhằm lọc tia cực tím dưới tác động của ánh sáng mặt trời duy trì hiệu lực diệt sâu khoang. Chuẩn bị thí nghiệm: Thí nghiệm có 5 nghiệm thức được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 yếu tố và 3 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại sử dụng 20 sâu tuổi 3, tổng số sâu sử dụng cho thí nghiệm này là 900 sâu tuổi 3. - CT1: Dịch NPV (5,8x107 PIB/ml) phơi nắng 1, 3, 5 ngày. - CT2: Dịch NPV (5,8x107 PIB/ml) + trà xanh 2% phơi nắng 1, 3, 5 ngày. - CT3: Dịch NPV (5,8x107 PIB/ml) + Trà xanh 4% phơi nắng 1, 3, 5 ngày. - CT4: Dịch NPV (5,8x107 PIB/ml) + Trà xanh 6% phơi nắng 1, 3, 5 ngày. - CT5: Đối chứng (nước cất). 31
  43. Đồ án tốt nghiệp Tiến hành thí nghiệm: Lá thầu dầu thu ngoài tự nhiên, mang về phòng thí nghiệm xử lý sơ bộ. Loại bỏ những lá già và hư, lựa chọn những lá không quá già cũng không quá non. Sau đó đem rửa với nước thật sạch để ráo. Lá thầu dầu sau khi xử lý được nhúng vào dung dịch đã chuẩn bị như các công thức thí nghiệm, để cho ráo nước rồi cho vào lọ nuôi sâu, mỗi lọ đã thả một sâu tuổi 3 được bỏ đói 2 giờ. Khi sâu ăn hết thức ăn nhiễm virus NPV, thì thay bằng thức ăn sạch. Sau đó theo dõi cho tới khi sâu chết hết hoặc vào nhộng hoàn toàn. Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ sâu khoang chết ở mỗi công thức. 2.5.5 Dịch virus NPV bổ sung bột cao lanh và một số chất phụ gia Thí nghiệm 10: Đánh giá hiệu lực của virus NPV đối với sâu khoang khi bổ sung bột cao lanh và một số chất phụ gia Mục đích: Khảo sát khả năng của bột cao lanh và một số chất phụ gia như 5% rỉ đường, 3% bột ngô, 1% acid boric làm tăng cường hiệu lực diệt sâu khoang của virus NPV. Chuẩn bị thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức và được nhắc lại 3 lần. Mỗi lần nhắc lại sử dụng 20 sâu tuổi 3, tổng số sâu sử dụng cho thí nghiệm này là 240 sâu tuổi 3. - CT1: Dịch NPV (5,8 x 107 PIB/ml) - CT2: Dịch NPV (5,8 x 107 PIB/ml) + bột cao lanh - CT3: Dịch NPV (5,8 x 107 PIB/ml) + bột cao lanh + một số chất phụ gia - CT4: Đối chứng (nước cất) Tiến hành thí nghiệm: Lá thầu dầu thu ngoài tự nhiên, mang về phòng thí nghiệm xử lý sơ bộ. Loại bỏ những lá già và hư, lựa chọn những lá không quá già cũng 32
  44. Đồ án tốt nghiệp không quá non. Sau đó đem rửa với nước thật sạch để ráo. Lá thầu dầu sau khi xử lý được nhúng vào dung dịch đã chuẩn bị như các công thức thí nghiệm, để cho ráo nước rồi cho vào lọ nuôi sâu, mỗi lọ đã thả một sâu tuổi 3 được bỏ đói 2 giờ. Khi sâu ăn hết thức ăn nhiễm virus NPV, thì thay bằng thức ăn sạch. Sau đó theo dõi cho tới khi sâu chết hết hoặc vào nhộng hoàn toàn. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu khoang chết ở mỗi công thức. 2.6 Phương pháp xử lý số liệu - Hiệu lực phòng trừ sâu của các thí nghiệm được tính theo công thức Abbott (1925). K (%) = [(Ca - Ta)/Ca)] x 100 Trong đó: K là hiệu lực của virus NPV ở các công thức Ca là số sâu sống ở công thức đối chứng Ta là số sâu sống ở công thức thí nghiệm sau khi xử lý - Các số liệu nghiên cứu được xử lý trên máy tính theo chương trình Excel và phần mềm xử lý thống kê Statgraphics Centurion XV.I. 33
  45. Đồ án tốt nghiệp 3.1 Dịch NPV bổ sung lượng nhỏ thuốc trừ sâu 3.1.1 Đánh giá hiệu lực của virus NPV bổ sung thuốc trừ sâu nhóm Cypermethrin (Sherpa 25EC) Đối với sâu khoang Spodoptera litura ăn lá nhiều loại rau họ thập tự và các loại đậu đỗ có khả năng kháng rất nhanh với các loại thuốc hóa học (Đỗ Bích Vân, 2010) [17]. Nên virus đa diện nhân NPV đã được phân lập và nghiên cứu tạo chế phẩm chuyển giao cho nông dân sử dụng quản lý loại sâu hại này. Tuy nhiên hạn chế của NPV làm cho chế phẩm này chưa được sử dụng rộng rãi là hiệu lực trừ sâu chưa cao, hơn nữa thời gian sâu chết bệnh còn dài (Ngô Trung Sơn, 1998) [6]. Để hạn chế nhược điểm của NPV năng cao hiệu lực và rút ngắn thời gian sâu chết bệnh, sinh viên tiến hành nghiên cứu bước đầu bổ sung hoạt chất Cypermethrin để trừ sâu khoang. Kết quả thí nghiệm cho thấy chỉ bổ sung với liều lượng 100 ppm Cypermethrin đã năng tỷ lệ sâu chết bệnh NPV lên 96,58% so với chỉ sử dụng NPV đơn độc là 91,40% và chế phẩm Sherpa 25EC chứa hoạt chất Cypermethrin là 93,07%. Bảng 3.1: Ảnh hưởng của việc bổ sung hoạt chất Cypermethin vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) sau 7 ngày. STT Công thức Tỷ lệ sâu chết (%) Hiệu lực diệt sâu (%) 1 CT1: NPV (5,8 x 107 PIB/ml) 91,67 91,40 ± 2,90a 2 CT2: Sherpa 25EC (30ml/16L 93,33 93,07 ± 3,12a nước) 3 CT3: NPV + Cypermethin (5,8 x 96,67 96,58 ± 2,96a 107 PIB/ml + 100 ppm Cypermethin) 4 CT4: Đối chứng (nước cất) - - Bên cạnh việc năng cao hiệu lực diệt sâu, hoạt chất Cypermethin còn giúp rút ngắn thời gian chết bệnh của NPV. Để đạt được hiệu lực 91,40% thì chế phẩm NPV không bổ sung hoạt chất Cypermethin phải mất thời gian 7 ngày (thời gian theo dõi 34
  46. Đồ án tốt nghiệp trong thí nghiệm), trong khi chế phẩm NPV có bổ sung 100 ppm Cypermethin chỉ mất 5 ngày (thời gian theo dõi trong thí nghiệm) đã đạt hiệu lực 96,58%. Tuy nhiên thời gian chết bệnh của chế phẩm NPV có bổ sung Cypermethrin vẫn còn kéo dài hơn so với việc sử dụng Sherpa 25EC một mình là 3 ngày đã đạt hiệu lực 93,07% (thời gian theo dõi trong thí nghiệm). CHẾ PHẨM NPV BỔ SUNG HOẠT CHẤT CYPERMETHRIN 120 100 80 NPV 60 Sherpa 25EC Hiệulực NPV + Cypermethrin 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 Ngày Hình 3.1: Ảnh hưởng của việc bổ sung hoạt chất Cypermethin vào chế phẩm NPV đến thời gian ủ bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) Kết quả nghiên cứu này cho thấy trùng khớp với kết quả nghiên cứu của Trang và Chaudhari ở Ấn Độ vào năm 2002. Sự khác biệt giữa các công thức về hiệu lực diệt sâu không có ý thống kê. Tuy nhiên rút ngắn thời gian ủ bệnh của ký chủ giữa các công thức khác biệt có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%. 3.1.2 Đánh giá hiệu lực của virus NPV bổ sung thuốc trừ sâu nhóm Abamectin (Alibaba 1.8EC) 35
  47. Đồ án tốt nghiệp Nhầm rút ngắn thời gian chết bệnh NPV và năng cao hiệu lực diệt sâu khoang ăn tạp. Sinh viên bước đầu nghiên cứu bổ sung hoạt chất Abamectin vào chế phẩm NPV. Kết quả hiệu lực của chế phẩm có bổ sung Abamectin đạt 91,40% sau 5 ngày (thời gian theo dõi trong thí nghiệm). Nhưng vẫn cao hơn chế phẩm chỉ có một mình NPV, hiệu lực sau 7 ngày (thời gian theo dõi trong thí nghiệm) là 89,96%. Tuy nhiên kết quả thí nghiệm này một lần nữa khẳng định hiệu quả của việc sử dụng NPV trong quản lý sâu hại, vì hiệu lực của nó cao hơn cả một số loại thuốc hóa học, cụ thể trong thí nghiệm này sinh viên sử dụng chế phẩm Alibaba 1.8EC hiệu lực sau 5 ngày (thời gian theo dõi trong thí nghiệm) chỉ đạt 82,61%. Bảng 3.2: Ảnh hưởng của việc bổ sung hoạt chất Abamectin vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) STT Công thức Tỷ lệ sâu chết Hiệu lực diệt sâu (%) (%) 1 CT1: NPV (5,8 x 107 PIB/ml) 90 89,65 ± 0,31a 2 CT2: Alibaba 1,8EC (20ml/16L 83,33 82,81 ± 2,43b nước) 3 CT3: NPV + Abamectin (5,8 x 91,67 91,40 ± 2,90a 107 + 10 ppm Abamectin) 4 CT4: Đối chứng (nước cất) - - Hoạt chất Abamectin giúp rút ngắn thời gian ủ bệnh của sâu khoang, làm sâu chết nhanh hơn. Kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian ủ bệnh của chế phẩm NPV bổ sung Abamectin rút ngắn hơn 2 ngày so với công thức NPV đơn độc. 36
  48. Đồ án tốt nghiệp CHẾ PHẨM NPV BỔ SUNG HOẠT CHẤT ABAMECTIN 100 90 80 70 60 NPV 50 Alibaba 1.8EC Hiệulực NPV + Abamectin 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 Ngày Hình 3.2: Ảnh hưởng của việc bổ sung hoạt chất Abamectin vào chế phẩm NPV đến thời gian ủ bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) Sự khác biệt về hiệu lực diệt sâu và thời gian ủ bệnh giữa công thức sử dụng Alibaba 1.8EC và NPV đơn độc có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%. 3.1.3 Đánh giá hiểu hiệu lực của virus NPV bổ sung Acid boric [31] Acid Boric (H3BO3) trước đây được sử dụng như thuốc trừ sâu để kiểm soát kiến và gián (Hayes and Laws, 1991). Gần đây được các nhà khoa học chứng minh là làm tăng hiệu lực của B. thuringgiengsis và một số loài Baculoviruses (Shapiro and Bell, 1982; Morris et al., 1995). Tại Ấn Độ, Bujjur et al. 1991, đã báo cáo kết quả nghiên cứu của việc kiểm soát Helicoverpa armigera trên hướng dương bằng HaNPV + 0.5% acid boric hiệu quả tăng gấp 4 lần so việc sử dụng một mình HaNPV và báo cáo của Chundurwar et al. (1990) về sự quan trọng của việc kiểm soát H. armigera bằng HaNPV + 0.5% acid boric. Acid boric cũng làm tăng hiệu lực của B. 37
  49. Đồ án tốt nghiệp thuringiensis đối với Lepidoptera tương tự như những gì quan sát cho Baculoviruses (Doane and Wallis, 1964; Govindarajan et al., 1976; Morris et al.). Mặc dù hiệu quả thực tế của acid boric đối với Baculoviruses đã được công nhận, nhưng có rất ít nghiên cứu đánh giá hiệu quả của virus NPV trộn acid boric (Yadava, 1970). Theo Juan Cisneros và cộng sự (2002), kết hợp acid boric với công thức Baculoviruses là một đề xuất hấp dẫn vì nó không tốn kém và có độc tính thấp với các loài động vật có vú. Từ thực tế nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới, sinh viên bước đầu nghiên cứu bổ sung acid boric vào NPV nhằm mục đích xác định tiềm lực của nó đối với NPV trong quản lý Spodoptera litura Fab Kết quả thí nghiệm cho thấy việc bổ sung 1% aicd boric tỷ lệ tử vong của sâu khoang ăn tạp tăng lên so với NPV đơn độc. Hiệu lực của chế phẩm NPV có bổ sung 1% acid boric sau 7 ngày (thời gian theo dõi trong thí nghiệm) là 98,33% còn ở công thức chỉ có NPV một mình hiệu lực chỉ đạt 91,67% (thời gian theo dõi trong thí nghiệm). Cũng trong thí nghiệm này không có bằng chứng cho thấy acid boric có tác dụng gây chết Spodoptera litura. Kết quả công thức chỉ sử dụng một mình acid boric với nồng độ 1% chỉ diệt được 8,33% ấu trùng sâu khoang. Với kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Juan Cisneros và cộng sự, 2002, nhưng thấp hơn báo cáo của Shapiro và Bell (1982) trên ấu trùng L. Dispar. Cho tới thời điểm này, các tác động tiềm ẩn của acid boric trong các công thức bổ sung vào virus đối với Spodoptera litura Fab. vẫn chưa được biết. Nhưng theo giả thuyết được Ya-dava (1970) và Shapiro and Bell (1982) đưa ra, acid boric ảnh hưởng đến các điều kiện hoạt động trong ruột côn trùng, có thể bằng cách làm thay đổi tính toàn vẹn của màng bao chất dinh dưỡng hoặc các tế bào của lớp biểu bì ruột. Ngoài ra, các độc tính của acid boric có thể gây ra căng thẳng sinh lý côn trùng (Juan Cisneros và các cộng sự, 2002). Bảng 3.3: Ảnh hưởng của việc bổ sung acid boric vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 38
  50. Đồ án tốt nghiệp STT Công thức Tỷ lệ sâu chết Hiệu lực diệt sâu (%) (%) 1 CT1: NPV (5,8 x 107 PIB/ml) 91,67 91,40 ± 2,90a 2 CT2: Sherpa 25EC (30ml/16L 93,33 91,31 ± 3,19a nước) 3 CT3: NPV + Acid Boric (5,8 x 98,33 96,49 ± 3,04a 107 + 1% A.Boric) 4 CT4: Acid Boric 1% 8,33 5,19 ± 5,01b 5 CT5: Đối chứng (nước cất) - - Tuy nhiên việc bổ sung acid boric không làm rút ngắn thời gian chết bệnh NPV so với công thức không bổ sung acid boric. CHẾ PHẨM NPV BỔ SUNG ACID BORIC 120 100 80 NPV Sherpa 25EC 60 NPV + Acid boric Hiệulực Acid boric 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 Ngày Hình 3.3: Ảnh hưởng của việc bổ sung Acid boric vào chế phẩm NPV đến thời gian ủ bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) Kết quả xử lý thống kê cho thấy hiệu lực diệt sâu giữa công thức NPV đơn độc và NPV bổ sung acid boric không có sự khác biệt ở mức nghĩa 95%. Kết quả này chưa 39
  51. Đồ án tốt nghiệp cho thấy rõ tìm năng của acid boric. Nên đi ngược lại kết luận của Juan Cisneros và các cộng sự (2002), cũng như những báo cáo trước của nhiều nhà khoa học. Nguyên nhân do sử dụng nồng độ NPV quá cao 5,8x107 PIB/ml, nên làm tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang ở công thức NPV đơn độc tương đương với công thức NPV bổ sung acid boric. 3.2 Ảnh hưởng của Tween 80, rỉ đường tăng cường hiệu lực diệt sâu khoang của virus NPV 3.2.1 Tìm hiểu ảnh hưởng của Tween 80 đối với virus NPV đến khả năng diệt sâu khoang Khi phun NPV ra ngoài tự nhiên, hiệu lực diệt sâu khoang của chúng bị giảm đi do ảnh hưởng của nhiều yếu, song yếu tố rửa trôi và khả năng bám dính của nó lên lá cây đặc biệt cần quan tâm. Nên sinh viên bước đầu tiến hành thí nghiệm đánh giá hiệu lực của NPV bổ sung Tween 80 tăng khả năng bám dính. Qua kết quả nghiên cứu của bảng 4.4 ảnh hưởng của việc bổ sung Tween 80 vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết của sâu khoang có sự khác biệt giữa 2 công thức NPV một mình và NPV có bổ sung Tween 80. Nếu chỉ sử dụng NPV một mình tỷ lệ chết của Spodoptera litura chỉ đạt 91,25% còn bổ sung thêm 1% Tween 80 tỷ lệ chết đạt 95%. Bảng 3.4: Ảnh hưởng của việc bổ sung Tween 80 vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) STT Công thức Tỷ lệ sâu chết Hiệu lực diệt sâu (%) (%) 1 CT1: NPV (5,8 x 107 PIB/ml) 91,25 92,17 ± 3,12a 2 CT2: NPV + Tween 80 (5,8 x 107 95 96,06 ± 2,63a + 1% Tween 80) 3 CT5: Đối chứng (nước cất) - - 3.2.2 Tìm hiểu ảnh hưởng của rỉ đường đối với virus NPV đến khả năng diệt sâu khoang 40
  52. Đồ án tốt nghiệp Qua kết quả nghiên cứu của bảng 4.5 ảnh hưởng của việc bổ sung rỉ đường vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết của sâu khoang có sự khác biệt giữa 2 công thức NPV một mình và NPV có bổ sung rỉ đường. Nếu chỉ sử dụng NPV một mình tỷ lệ chết của Spodoptera litura chỉ đạt 88,42% còn bổ sung thêm 3% rỉ đường tỷ lệ chết đạt 97,43%. Bảng 3.5: Ảnh hưởng của việc bổ sung rỉ đường vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) STT Công thức Tỷ lệ sâu chết Hiệu lực diệt sâu (%) (%) 1 CT1: NPV (5,8 x 107 PIB/ml) 88,75 88.42 ± 2,82b 2 CT2: NPV + rỉ đường (5,8 x 107 97,50 94,87 ± 4,30a + 3% rỉ đường) 3 CT5: Đối chứng (nước cất) - - 3.3 Ảnh hưởng của bột ngô, bột đậu nành tăng cường hiệu lực diệt sâu khoang của virus NPV 3.3.1 Tìm hiểu ảnh hưởng của bột ngô đối với virus NPV đến khả năng diệt sâu khoang Kết quả nghiên cứu của các tác giả điều khẳng định sâu khoang mẫn cảm với NPV, sâu tuổi nhỏ mẫn cảm với NPV hơn sâu tuổi lớn, nồng độ, liệu lượng NPV tăng thì tỷ lệ sâu chết tăng lên (Senthil Kumar, N. Sathiah and R. J. Rabindra, 2005, B. S. Ravishankar and M. G . Venkatesha, 2010, C. M.). Từ thực tế các nghiên cứu trước sinh viên bước đầu nghiên cứu bổ sung bột ngô vào chế phẩm NPV để kích thích sâu khoang ăn tăng lượng PIB vào cơ thể sâu, tăng tỷ lệ sâu chết rút ngắn thời gian ủ bệnh. Qua kết quả nghiên cứu của bảng 4.6 ảnh hưởng của việc bổ sung bột ngô vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết của sâu khoang có sự khác biệt giữa 2 công thức NPV một mình và NPV có bổ sung bột ngô. Nếu chỉ sử dụng NPV một mình tỷ lệ chết của Spodoptera litura chỉ đạt 89,87% còn bổ sung thêm 3% bột ngô tỷ lệ chết đạt 97,43%. 41
  53. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6: Ảnh hưởng của việc bổ sung bột ngô vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) STT Công thức Tỷ lệ sâu chết Hiệu lực diệt sâu (%) (%) 1 CT1: NPV (5,8 x 107 PIB/ml) 90 89,87 ± 6,95a 2 CT2: NPV + Bột ngô (5,8 x 107 + 97,5 97,44 ± 2,96a 3% bột ngô) 3 CT5: Đối chứng (nước cất) - - 3.2.2 Tìm hiểu ảnh hưởng của bột đậu nành đối với virus NPV đến khả năng diệt sâu khoang Qua kết quả nghiên cứu của bảng 4.7 ảnh hưởng của việc bổ sung bột đậu nành vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết của sâu khoang có sự khác biệt giữa 2 công thức NPV một mình và NPV có bổ sung bột ngô. Nếu chỉ sử dụng NPV một mình tỷ lệ chết của Spodoptera litura chỉ đạt 91,25% còn bổ sung thêm 3% bột đậu nành tỷ lệ chết đạt 98,75%. Bảng 3.7: Ảnh hưởng của việc bổ sung bột đậu nành vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) STT Công thức Tỷ lệ sâu chết Hiệu lực diệt sâu (%) (%) 1 CT1: NPV (5,8 x 107 PIB/ml) 91,25 90,99 ± 2,69b 2 CT2: NPV + đậu nành (5,8 x 107 98,75 98,69 ± 2,63a + 3% đậu nành) 3 CT5: Đối chứng (nước cất) - - 3.4 Tìm hiểu khả năng lọc tia cực tím bảo vệ virus NPV của trà xanh và rỉ đường duy trì hiệu lực diệt sâu của virus NPV 3.4.1 Khảo sát tỷ lệ rỉ đường thích hợp phối trộn với virus NPV Theo kết quả nghiên cứu của Ngô Trung Sơn và các cộng sự (1991) tại Ninh Thuận cho thấy sau khi phun ra ruộng 5 ngày, NPV hầu như bị mất hiệu lực hoàn toàn bởi ánh sáng mặt trời [6]. Nguyên nhân là do tia cực tím của ánh sáng mặt trời đã tiêu 42
  54. Đồ án tốt nghiệp diệt NPV (Maiorov, V.I và cộng sự, 1984) [27]. Theo nhiều nhà khoa học, trong tự nhiên có nhiều chất có khả năng lọc tia cực tím của ánh sáng mặt trời, vì vậy chúng có khả năng bảo vệ được NPV khi phun ra ngoài tự nhiên. Tiếp theo công trình nghiên cứu của Ngô Trung Sơn (1991) và Nguyễn Hoàng Nam (2011), sinh viên tiếp tục tiến hành thí nghiệm bổ sung rỉ đường vào chế phẩm NPV. Kết quả thí nghiệm ở sơ đồ hình 4.1 cho thấy: ở tất cả các khoảng thời gian để ngoài tự nhiên, tỷ lệ sâu khoang chết do NPV ở công thức bổ sung rỉ đường đều cao hơn các công thức không rỉ đường. CHẾ PHẨM NPV BỔ SUNG RỈ ĐƯỜNG LỌC TIA CỰC TÍM 90 a b 80 c a 70 b a d 60 c b 50 NPV c NPV-3 NPV-5 Hiệu lực 40 NPV-7 d d 30 20 10 0 1 3 5 Ngày Hình 3.4: Ảnh hưởng của việc bổ sung rỉ đường vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) Tuy nhiên, ảnh hưởng của các tỷ lệ rỉ đường khác nhau đến hiệu lực của NPV cũng khác nhau. Trong thí nghiệm sinh viên sử dụng 3 tỷ lệ rỉ đường là 3%, 5%, 7%, 43
  55. Đồ án tốt nghiệp qua kết quả thí nghiệm cho thấy tỷ lệ 5% cho kết quả tốt nhất qua 3 móc thời gian 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày đạt hiệu lực là 81,40%, 72,89%, 63,16%. Kế tiếp là tỷ lệ 7% đạt hiệu lực 76,23%, 64,39%, 51,63%. Hiệu lực thấp nhất là tỷ lệ 3% kết quả đạt 69,47%, 54,21%, 42,11%. Kết quả sử dụng tỷ lệ 3% phù hợp với kết quả nghiên cứu của Ngô Trung Sơn (1991) còn tỷ lệ 5% và 7% hiệu lực cao hơn nghiên cứu của tác giả và các cộng sự. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đây của Ignffo, C.M. et al (1971) và Rabindra, R.J (1988) là rỉ đường có tác dụng lọc tia cực tím, duy trì được hiệu lực trừ sâu của NPV [30]. Còn nguyên nhân vì sao tỷ lệ 5% cho kết quả tôt hơn 3% và 7%, thì cần có những nguyên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường đến khả năng ăn của sâu khoang, hay tỷ lệ sống sót của NPV. 3.4.1 Khảo sát tỷ lệ trà xanh thích hợp phối trộn với virus NPV Tiếp theo công trình nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Nam (2011), sinh viên tiếp tục tiến hành thí nghiệm bổ sung trà xanh vào chế phẩm NPV. Kết quả thí nghiệm ở hình 4.2 cho thấy: ở tất cả các khoảng thời gian để ngoài tự nhiên, tỷ lệ sâu khoang chết do NPV ở các công thức bổ sung trà xanh đều cao hơn công thức không trà xanh. Tuy nhiên, ảnh hưởng của các nồng độ trà xanh khác nhau đến hiệu lực của NPV cũng khác nhau. Tăng nồng độ trà xanh trong khi cố định nồng độ của virus duy nhất, thì tỷ lệ tử vong của Spodoptera litura tỷ lệ thuận với nồng độ tăng. Trong thí nghiệm sinh viên sử dụng 3 nồng độ trà xanh 2%, 4%, 6%, qua kết quả thí nghiệm cho thấy nồng độ 6% cho kết quả tốt nhất qua 3 móc thời gian 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày đạt hiệu lực là 86,40%, 86,40%, 84,21%. Kế tiếp là nộng độ 4% đạt hiệu lực 84,82%, 82,98%, 78,95%. Hiệu lực thấp nhất là nộng độ 2% kết quả đạt 79,65%, 77,98%, 73,68%. Kết quả sử dụng nồng độ 2% phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Nam (2011) còn nồng độ 4% và 6% hiệu lực cao hơn. 44
  56. Đồ án tốt nghiệp CHẾ PHẨM NPV BỔ SUNG TRÀ XANH LỌC TIA CỰC TÍM 120 100 a a a a a b b a b 80 NPV c NPV-2 60 NPV-4 Hiệu lực NPV-6 40 c c 20 0 1 3 5 Ngày Hình 3.5: Ảnh hưởng của việc bổ sung trà xanh vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) 3.5 Đánh giá hiệu lực của virus NPV khi bổ sung bột cao lanh và một số chất phụ gia Đối với sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura) và sâu xanh da láng (S. exigua) ăn lá rau đậu và kháng thuốc rất nhanh nên các chế phẩm từ vi rút NPV (Nucleopolyhedrovirus) được phân lập (SpltNPV cho sâu ăn tạp) và đã bước đầu sản xuất để chuyển giao cho nông dân sử dụng tại chỗ do khó sản xuất chế phẩm dạng khô (Đỗ Bích Vân, 2010) [17]. Còn theo Nguyễn Văn Huỳnh (2012) nhược điểm để chế phẩm này chưa được sử rộng rãi trên thị trường là thời gian bảo quản ngắn [17]. Nhược điểm về thời gian bảo quản ngắn của chế phẩm NPV dạng lỏng cũng đã được các nhà khoa học trên thế giới khắc phục bằng con đường nghiên cứu tạo chế phẩm dạng bột để 45
  57. Đồ án tốt nghiệp kéo dài thời bảo quản. Năm 2002, Juan Cisneros và cộng sự nghiên cứu tạo chế phẩm NPV dạng bột với chất mang là bột ngô thử nghiệm trên các cánh đồng ngô ở Mexico kiểm soát Spodoptera frugiperda [31]. Các thí nghiệm ngoài đồng với một tỷ lệ sử dụng thích hợp được xác định là 24Kg/ha (J. Cisneros and T.Williams,2002). Hạt có chứa 25x1012 PIB/ Kg hạt tương đương 1,5x1012 PIB/ha đó là tỷ lệ ứng dụng tiêu chuẩn được xác định trong các nguyên cứu trước đó (Martı´nez et al., 2000) [31]. Cũng từ những thực tế nghiên cứu của các nhà khoa học, nên sinh viên bước đầu nghiên cứu bổ sung bột cao lanh như một yếu tố hút ẩm bảo vệ NPV, nhằm kéo dài thời gian tồn tại của chúng. Trong thí nghiệm này sinh viên tiến hành với 3 công thức (i) NPV đơn độc, (ii) NPV bổ sung cao lanh, (iii) NPV bổ sung cao lanh và chất phụ gia. Qua kết quả nghiên cứu của bảng 4.8 cho thấy công thức bổ sung cao lanh không có tiềm lực tăng tỷ chết bệnh NPV so với công thức NPV một mình. Nhưng ở công thức có bổ sung thêm chất phụ gia thì hiệu lực diệt sâu tăng lên đáng kể và kết quả đạt 100% tỷ lệ sâu chết bệnh NPV, so với công thức NPV một mình và NPV bổ sung cao lanh chỉ đạt 91,40% và 93,16%. Bảng 3.8: Ảnh hưởng của việc bổ sung cao lanh vào chế phẩm NPV đến tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) STT Công thức Tỷ lệ sâu chết Hiệu lực diệt sâu (%) (%) 1 CT1: NPV (5,8 x 107 PIB/ml) 91,67 91,40 ± 2,90b 2 CT2: NPV + Cao lanh (5,8 x 107 93,33 93,16 ± 2,74b PIB/ml + 10% cao lanh) 3 CT3: NPV + Cao lanh + Phụ gia 100 100 ± 0,00a (5,8 x 107 PIB/ml + 10% + 3% bột ngô + 5% rỉ đường + 1% acid boric) 4 CT4: Đối chứng (nước cất) - - 46
  58. Đồ án tốt nghiệp 4.1 Kết luận 1. Bổ sung hoạt chất hóa học vào chế phẩm NPV không những tăng tỷ lệ chết bệnh của sâu khoang Spodoptera litura mà còn rút ngắn thời gian ủ bệnh. Nếu chỉ sử dụng chế phẩm NPV đơn độc hiệu lực chỉ đạt 91,40%, nhưng khi có bổ sung 100 ppm Cypermethrin hiệu lực đạt 96,58%. Thời gian chết của ký chủ cũng rút ngắn thay vì là 7 ngày ở công thức NPV một mình thì ở công thức có bổ sung một lượng nhỏ hoạt chất Cypermethrin chỉ là 5 ngày. 2. Hiệu lực của chế phẩm NPV cao hơn chế phẩm Alibaba 1.8EC và ngang bằng với chế phẩm Sherpa 25EC. 3. Bổ sung acid boric vào chế phẩm NPV không làm rút ngắn thời gian ủ bệnh của ký chủ. 4. Rỉ đường và Tween 80 có khả năng làm tăng hiệu lực diệt sâu của chế phẩm NPV, tuy nhiên rỉ đường cho kết quả tốt hơn Tween 80. 5. Bột ngô và bột đậu nành đều có khả năng làm tăng hiệu lực diệt sâu khoang của chế phẩm NPV. Nếu chế phẩm NPV có bổ sung 3% bột ngô và 3% bột đậu nành thì hiệu lực đạt lần lược là 97,44 và 98,69% so với công thức NPV đơn độc là 89,87 và 90,99%. 6. Chế phẩm NPV dễ bị mất hiệu lực bởi tia cực tím của ánh sáng mặt trời. Nếu phơi nắng 1 ngày thì hiệu lực là 52,46% còn khi phơi nắng 5 ngày hiệu lực chỉ còn lại 26,32% so với chế phẩm không phơi nắng là 90%. Trộn thêm các chất phụ gia: rỉ đường, trà xanh, có khả năng hạn chế được ảnh hưởng xấu của tia cực tím đối với NPV. Tuy nhiên, ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và nồng độ trà xanh khác nhau đến khả năng bảo vệ NPV cũng khác nhau. Sử dụng tỷ lệ rỉ đường 5% và nồng độ trà xanh 6% cho kết quả tốt nhất. 47
  59. Đồ án tốt nghiệp 7. Cao lanh có khả năng hút ẩm tốt, nên được sử dụng như chất mang bảo vệ NPV trong chế phẩm NPV dạng bột. Tuy nhiên cao lanh không có tiềm lực năng tỷ lệ chết của sâu khoang, nhưng cũng không làm giảm hiệu lực của chế phẩm NPV. 4.2 Kiến nghị 1. Khảo sát tỷ lệ thích hợp của hoạt chất Cypermethrin, acid boric, bột ngô, bột đậu tương, khi phối trộn với NPV, để chế phẩm đạt hiệu lực diệt sâu tốt nhất. 2. Tiến hành đánh giá hiệu lực của chế phẩm NPV có bổ sung các chất phụ gia tốt nhất được lựa chọn ở quy mô trong chậu và ngoài đồng. 3. Khảo sát ảnh hưởng của các chất phụ gia đến khả năng sống sót của NPV trong thời gian bảo quản. 4. Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm NPV có bổ sung các chất phụ gia tốt nhất được lựa chọn. 48