›

Đồ án Nghiên cứu quy trình tách chiết và tính chất của anthocyanin từ gạo đen hữu cơ

pdf 102 trang thiennha21 12/04/2022 6360
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu quy trình tách chiết và tính chất của anthocyanin từ gạo đen hữu cơ", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_quy_trinh_tach_chiet_va_tinh_chat_cua_antho.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu quy trình tách chiết và tính chất của anthocyanin từ gạo đen hữu cơ

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TÍNH CHẤT CỦA ANTHOCYANIN TỪ GẠO ĐEN HỮU CƠ Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Lệ Hà Sinh viên thực hiện: Đinh Thị Kiều My MSSV: 1211110099 Lớp: 12DTP01 TP. Hồ Chí Minh, 2016
  2. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà LỜI CAM ĐOAN Là sinh viên năm năm cuối của Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh, nay được vinh dự làm đồ án tốt nghiệp để hoàn tất chương trình học của mình. Tôi cam đoan đây là nghiên cứu do tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học-Thực phẩm-Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh. Những số liệu trong bài hoàn toàn trung thực chưa từng có ai công bố. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện Đinh Thị Kiều My 1
  3. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà LỜI CẢM ƠN Tận đáy lòng con xin gửi vạn lời cảm ơn đến cha mẹ, cha mẹ là người cực khổ nuôi nấng, dạy dỗ con thành người. Cha mẹ là người đầu tiên dạy con bước đi, là người thầy giáo đầu tiên dạy con biết từng con chữ, dạy con khi vấp ngã phải biết đứng lên và những kinh nghiệm quý báu trong cuộc sống. Cha mẹ luôn dõi theo con trên bước đường đời, cho dù con ở đâu làm gì con luôn biết cha mẹ luôn ủng hộ cho con, là chỗ dựa vững chắc cho con. Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô Khoa Công nghệ sinh học-Thực phẩm-Môi trường, cùng toàn thể Thầy Cô Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báo về cơ sở ngành cũng như chuyên ngành từ ngày em bước chân vào giảng đường đại học. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS.Nguyễn Lệ Hà, người thầy đáng kính, đã luôn tận tình chỉ dẫn, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành phần thực nghiệm của đồ án. Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học-Thực phẩm-Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh. Cảm ơn tất cả các bạn lớp 12DTP01 đã luôn khích lệ, động viên và giúp đỡ mình trong suốt quá trình học tập tại trường và trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn! TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2016 SVTH: Đinh Thị Kiều My 2
  4. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà MỤC LỤC TRANG DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG vii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4 Gạo đen 4 1.1.1. Khái niệm 4 1.1.2. Nguồn gốc của gạo đen hữu cơ 4 1.1.3. Công dụng của gạo đen hữu cơ 5 1.2. Anthocyanin 6 1.2.1 Giới thiệu 6 1.2.2. Sự phân bố của Anthocyanin. 7 1.2.3. Cấu trúc hóa học của Anthocyanin 8 1.2.4. Tính chất của Anthocyanin 12 1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc và độ bền của Anthocyanin. 14 1.2.5.1. Cấu trúc 14 1.2.5.2. pH 18 1.2.5.3. Nhiệt độ. 20 1.2.5.4. Oxy. 22 1.2.5.5. Enzyme 22 1.2.5.6. Ánh sáng. 23 1.2.5.7. Đường và các sản phẩm biến tính của chúng 24 i
  5. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 1.2.5.8. Các ion kim loại. 25 1.2.5.9. Sulfurdioxide (SO2) 26 1.2.5.10. Acid ascorbic 26 1.2.6. Các Anthocyanin đã được thương mại hóa 29 1.3. Những kết quả nghiên cứu trong nước và thế giới 29 1.3.1. Phương pháp tách chiết Anthocyanin từ gạo. 29 1.3.2. Phương pháp trích ly Anthocyanin từ quả dâu Hội An 30 1.3.3. Phương pháp tách triết Anthocyanin từ bắp cải tím 31 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. 32 2.1. Nguyên vật liệu 32 2.1.1. Nguồn gạo đen 32 2.1.2. Một số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 32 2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm 33 2.2.1. Xác định các thông số cho quá trình trích ly Anthocyanin từ gạo đen 33 2.2.1.1. Xác định tỷ lệ dung môi Nước-EtOH trong quá trình trích ly 35 2.2.1.2 Xác định tỷ lệ nguyên liệu tấm trong dịch trích ly 36 2.2.1.3. Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly Anthocyanin từ gạo đen 38 2.1.2.4. Xác định thời gian thích hợp trích ly Anthocyanin từ gạo đen. 39 2.2.2. Khảo sát một số tính chất của Anthocyanin trong dịch trích ly từ gạo đen 40 2.2.2.1. Sự biến đổi hàm lượng Anthocyanin ở các pH khác nhau 40 2.2.2.2. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của Anthocyanin ở các nhiệt độ khác nhau 42 2.2.2.3. Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích ly gạo đen trước khi cô quay và sau khi cô quay. 43 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 2.3. Các phương pháp phân tích dùng trong thí nghiệm 43 2.4. Phương pháp xử lý số liệu. 43 CHƯƠNG 3 :KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1. Xác định các thông số cho quy trình trích ly Anthocyanin từ gạo đen. 44 3.1.1. Xác định tỷ lệ dung môi nước: ethanol trong pha chế dung môi trích ly Anthocyanin từ gạo đen 44 3.1.2. Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trong quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen 46 3.1.3. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly Anthocyanin từ gạo đen. . 47 3.2. Khảo sát một số tính chất của Anthocyanin trong dịch trích ly gạo đen 53 3.3.1. Sự biến đổi của hàm lượng anthocyanin ở những pH khác nhau 53 3.3.2. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của Anthocyanin ở các nhiệt độ khác nhau 54 3.3.3. Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích ly từ gạo đen 58 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ 63 4.1. Kết luận 63 4.2 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC B SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM. 7 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Gạo đen 4 Hình 1.2 Cấu trúc phổ biến của Anthocyanin 11 Hình 1.3. Cation Flavylium 12 Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc anthocyanin chuyển hóa trong nước 15 Hình 1.5 Những màu sắc phổ biến của các loại athocyanin 18 Hình 1.6 Sự chuyển đổi cấu trúc của anthocyanin trong điều kiện môi trường pH khác nhau 20 Hình 1.7 Sơ đồ sự biến tính của anthocyanin 3,5-diglucoside tại pH 3,7 21 Hình 1.8. Sự biến tính Anthocyanin với phản ứng oxy hóa atechol 23 Hình1.9. Phản ứng ngưng tụ 25 Hình 1.10. Sơ đồ Jurd đối với phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và Anthocyanin (Wiley, 2005) 26 Hình 1.11. Sự chuyển hóa malvin thành malvone bởi H2O2 tạo thành từ sự oxy hóa Ascorbic acid (Wiley, 2005) 27 Hình 1.12. Fla-2-ene được tạo thành từ phản ứng giữa Ascorbic acid và Anthocyanin. 27 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tóm tắt nội dung thí nghiệm khảo sát các thông số trích ly 34 Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ H2O: Ethanol trong pha chế dung môi để trích ly anthocyanin từ gạo đen hữu cơ. 35 Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nguyên liệu thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen 37 Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly Anthocyanin từ gạo đen 38 iv
  8. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen 39 Hình 2.6. Sơ đồ quy trình tóm tắt nội dung thí nghiệm nghiên cứu tính chất của Anthocyanin 40 Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của pH đến hàm lượng Anthocyanin trong dịch trích 41 Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của anthocyanin ở cá nhiệt độ khác nhau 42 Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi H2O:EtOH đến hiệu suất trích ly anthocyanin từ dịch chiết. 44 Hình 3.2. Dịch trích ly các dung môi ở những tỷ lệ khác nhau 45 Hình 3.3. Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi đến hiệu suất trích ly Anthocyanin từ gạo đen hữu cơ. 46 Hình 3.4. Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu suất trích ly Anthocyanin từ dịch chiết. 48 Hình 3.5 Dịch trích ly anthocyanin ở các nhiệt độ khác nhau. 50 Hình 3.6. Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian đến trích ly đến hiệu suất trích ly Anthocyanin trong dịch chiết. 51 Hình 3.7 Dịch trích ly anthocyanin ở các thời gian khác nhau. 52 Hình 3.8. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi độ hấp thu của anthocyanin ở nhưng mức pH khác nhau 53 Hình 3.9. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi hàm lượng của Anthocyanin ở 00C 54 Hình 3.10. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi hàm lượng của anthocyanin ở 200C 55 Hình 3.11. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi hàm lượng của Anthocyanin ở 00C 56 v
  9. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Hình 3.12. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi hàm lượng của anthocyanin ở các nhiệt độ khác nhau 57 Hình 3.13. Biểu đồ biểu thị sự ức chế gốc tự do của vitamin C 58 Hình 3.14. Biểu đồ biểu thị sự ức chế gốc tự do của dung dịch Anthocyanin được trích ly từ tấm đen. 59 Hình 3.15. Biểu đồ biểu thị sự ức chế gốc tự do của dung dịch Anthocyanin được trích ly từ tấm đen sau cô quay. 60 Hình 3.16. Phản ứng màu của dung dịch DPPH khi cho dịch mẫu trích ly anthocyanin từ gạo đen . 61 Hình 3.17. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thích hợp để trích ly Anthocyanin từ gạo đen 63 Hình 4.1. Dịch chiết Anthocyanin trước cô quay. 65 Hình 4.2. Dịch chiết sau cô đặc 66 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học của gạo đen. 5 Bảng 1.2. Bảng các Anthocyanin có nguồn gốc thực vật 8 Bảng 1.3. Một số Anthocyanin phổ biến 9 Bảng 1.4 Các nhóm Anthocyanin hiện có 10 Bảng 3.1. Giá trị %I à IC50 của vitamin C 58 Bảng 3.2. Giá trị %I và kết quả IC50 của dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen trước khi cô quay. 59 Bảng 3.3. Giá trị %I và kết quả IC50 của dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen sau cô quay. 60 Bảng 3.4. So sánh giá trị IC50 của Ascorbic acid và Anthocyanin 61 Bảng 4. Đánh giá sơ bộ cảm quan của dịch chiết anthocynin 63 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Anthocyanin có mặt trong nhiều loại rau quả từ thiên nhiên. Chất màu Anthocyanin là có độ hòa tan trong nước và trong các dung môi phân cực, nên chúng có thể dễ dàng trích ly bằng những dung môi trích ly thông thường mà không độc hại đối với môi trường. Bên cạnh đó màu sắc của chúng trải dài từ màu đỏ, màu tím và màu xanh, có thể ứng dụng vào việc làm phụ gia tạo màu trong thực phẩm nhưng không độc hại. Thêm vào đó Anthocyanin có giá trị sinh học rất cao, chúng được đưa vào chế độ ăn uống trong nhiều thế kỷ qua, nhờ vào tác dụng sinh học rất tốt như có khả năng điều trị chứng huyết áp cao, sốt, rối loạn gan, rối loạn tiêu hóa. Với xu hướng của thế giới hiện nay, mọi người luôn ưa chuộng những sản phẩm có thành phần từ thiên nhiên, lành mạnh đối với sức khỏe con người. Anthocyanin đã được đưa vào sử dụng dưới dạng sản phẩm thực phẩm hay chất màu trong thực phẩm của con người. Với một đất nước nông nghiệp như Việt Nam từ ngàn xưa gạo đã trở thành nguồn lương thực thiết yếu, nuôi sống biết bao thế hệ. Nhưng ngày nay với cuộc sống không ngừng phát triển, quá trình đô thị hóa diễn ra mạnh mẽ, môi trường ngày càng bị ô nhiễm trầm trọng. Những hóa chất độc hại duới danh nghĩa là phụ gia thực phẩm đang thâm nhập vào cơ thể con người mỗi ngày. Hiện nay Việt Nam là nước thuộc top 2 - những quốc gia dẫn đầu về tỷ lệ mắc bệnh ung thư, mỗi năm có khoảng 70000 người chết vì bệnh ung thư và 200 000 mắc mới về bệnh ung thư. Trong vòng năm năm nữa ung thư có thể sẽ trở thành đại dịch ở Việt Nam. Bên cạnh đó theo điều tra mới nhất của hội tim mạch Việt Nam, 2016 có 48% người Việt Nam mắc bệnh tăng huyết áp, đây là một con số đáng báo động. Trong những năm gần đây các nghiên cứu khoa học luôn hướng về những nghiên cứu tạo ra sản phẩm được chiết xuất từ thiên nhiên, cải thiện sức khỏe, chống oxy hóa, nâng cao sức đề kháng của con người. Với mong muốn có những chất màu từ thiên nhiên thay thế những chất màu hóa học đang từng ngày thâm nhập vào cơ thể con người, một thức uống giàu hợp 1
  12. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà chất chống oxy hóa giúp cơ thể tăng cường sức đề kháng có thể chống lại bệnh ung thư. Nhóm nghiên cứu quyết định chọn nguồn gạo đen hữu cơ từ thiên nhiên, không thuốc trừ sâu, không phân bón hóa học làm nguồn trích ly cho đề tài trích ly Anthocyanin, bên cạnh đó cũng sẽ nghiên cứu những tính chất cơ bản của Anthocyanin để phục vụ cho quá trình bảo quản Anthocyanin để duy trì những hoạt tính sinh học của chúng trong quá trình bảo quản. 2. Mục đích nghiên cứu Đề tài có hai mục đích bản bao gồm: Xác định các thông số thích hợp cho quá trình trích ly chất màu Anthocyanin nhằm tách chiết tối đa Anthocyanin từ nguyên liệu phù hợp cho mục đích ứng dụng vào thực phẩm. Nghiên cứu những tính chất của Anthocyanin trong quá trình bảo quản dịch chiết từ gạo đen. 3. Nội dung nghiên cứu. Để thực hiện mục đích nghiên cứu đã đề ra, nhóm nghiên cứu thực hiện các nội dung sau: Xác định các thông số cho quá trình trích ly Anthocaynin từ gạo đen: - Xác định tỷ lệ dung môi thích hợp cho quá trình trích ly Anthocyanin. - Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi thích hợp cho quá trình trích ly Anthocyanin. - Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly Anthocyanin. - Xác định thời gian thích hợp cho quá trình trích ly Anthocyanin. Xác định những tính chất của dịch trích ly Anthocyanin từ gạo đen: - Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của Anthocyanin. - Nghiên cứu những tính chất của Anthocyanin. 2
  13. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 4. Phương pháp nghiên cứu. - Phương pháp thu thập thông tin: Phương pháp nghiên cứu tài liệu làm cơ sở bố trí thí nghiệm. Sử dụng phần mềm Endnote để tìm tài liệu. - Thực hành trong phòng thí nghiệm. 3
  14. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Gạo đen 1.1.1. Khái niệm Gạo đen là loại gạo thuộc giống Oryza sativa L. “GẠO ĐEN” là loại gạo có màu tím đậm hoặc đen nhưng khi nấu chín sẽ chuyển sang màu đỏ tía hoặc tím. Lớp vỏ bên ngoài của gạo này là màu đen nhờ sắc tố Anthocyanin, một chất chống oxi hóa. Loại gạo này được bán dưới dạng “chưa xay xát”, với lớp vỏ ngoài nguyên vẹn. Cho đến ngày nay, không dễ dàng có thể mua được gạo đen; loại gạo này rất đáng giá và được người dân châu Á quan tâm đặc biệt trong nhiều thế kỷ và xu hướng tiêu thụ ngày càng cao ở Châu Âu, Bắc Mỹ Hình 1.1 Gạo đen Ngoài ra trong gạo đen còn có rất nhiều vitamin E giúp tăng cường hệ thống miễn dịch, giàu chất xơ, chất sắt và các vitamin thiết yếu, đặc biệt hàm lượng đường trong gạo đen thấp người tiểu đường dùng có thể ổn định lượng đường trong máu. Theo kết quả nghiên cứu của TS. Zhimin Xu thuộc đại học bang Louisana, Mỹ. Ông nói rằng trong một muỗng canh gạo đen chứa nhiều chất dinh dưỡng tốt cho sức khỏe hơn bất cứ “siêu thực phẩm” nào, bởi một muỗng gạo đen chứa nhiều chất chống oxy hóa (Anthocyanin) hơn một muỗng canh trái việt quất. 1.1.1. Nguồn gốc của gạo đen hữu cơ 4
  15. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Bảng 1.1. Thành phần hóa học của gạo đen. Thành phần Tỷ lệ % Nước 14 Protein 8,2 Lipid 1,5 Glucid 74,9 Acid hữu cơ 0,6 Tro 0,8 Gạo đen là loại gạo đặc biệt được sử dụng nhiều và tìm thấy ở các nước châu Á. Trung Quốc là nước có nhiều giống lúa đen hơn hết, tiếp theo Sri Lanka, Indonesia, India, Philippines, Bangladesh và Việt Nam. Gạo đen thường tìm thấy ở loại phôi nhủ đục sáp của các nhóm indica và japonica. Ở Việt Nam, gạo tím hay đen được dùng làm thuốc và cho tín ngưỡng, chỉ được trồng ở các vùng núi, dưới dạng gạo tẻ hoặc nếp. Gạo đen hữu cơ được sản xuất từ phương pháp “canh tác hữu cơ”. Lúa được trồng theo phương pháp canh tác hữu cơ, không sử dụng phân bón hóa học, thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ , có sự kiểm soát, tác động của khoa học kỹ thuật, công nghệ sinh học, sản phẩm được chế biến và đóng gói theo quy trình kép. Canh tác hữu cơ giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng gạo đen hữu cơ, đảm bảo an toàn sức khỏa cho người tiêu dùng và thân thiện với môi trường. 1.1.2. Công dụng của gạo đen hữu cơ Trong gạo đen chứa nhiều Anthocyanin, đây là hợp chất chống oxy hóa giúp cơ thể chống lại nhiều bệnh. Nó giúp cơ thể giảm nguy cơ đau tim bằng cách ngăn chặn sự tích tụ mảng bám trong động mạch. Ngoài ra nó giúp trung hòa những thiệt hại của các gốc tự do, ngăn ngừa một số dạng ung thư, hỗ trợ giảm cholesterol trong máu. 5
  16. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Gạo đen chứa nhiều chất xơ gấp 5,9 lần rau cần tây giúp làm giảm nồng độ cholesterol, kiểm soát hệ thống tiêu hóa. Đối với người suy nhược cơ thể, chất xơ này có tác dụng kích thích tiêu hóa, tăng hấp thu. Đối với người muốn giảm cân, chất xơ làm giảm cảm giác đói vì vậy nhanh chóng đạt hiệu quả cần thiết. Ngoài ra chất xơ có khả năng chống béo phì, ngừa ung thư ruột kết và rất tốt cho bệnh nhân đái tháo đường. Trong gạo đen hữu cơ chứa selenium gấp 3,3 lần lòng đỏ trứng. Selenium là nguyên tố vi lượng chống oxy hóa mạnh, giúp khử các gốc tự do có trong cơ thể, giúp ngăn ngừa sự phá hủy tế bào, đặc biệt là tế bào gan, tốt cho người uống rượu bia thường xuyên, người có vấn đề về gan như viêm gan và xơ gan, ngăn ngừa ung thư. Gạo hữu cơ đen chứa nhiều chất sắt, chất sắc là một phần của tế bào máu, nếu cơ thể thiếu sắt sẽ dẫn đến thiếu máu. Trong gạo đen hữu cơ cung cấp chất sắt cao hơn 70% so với gạo lức và gấp 1,7 lần thịt bò, do đó gạo đen hữu cơ rất thích hợp cho những phụ nữ thiếu máu sau khi sinh và những người cần bổ sung chất sắt tự nhiên. Trong gạo đen hữu cơ còn có hàm lượng mangan (gấp 1,54 lần gạo lứt). Mangan có tác dụng giúp giải phóng năng lượng từ protein, carbonhydrate, hỗ trợ hệ thống miễn dịch và điều hòa hàm lượng đường trong máu. Gạo đen hữu cơ có hàm lượng kẽm gấp 1,7 lần thịt trai. Kẽm tham gia vào thành phần của hơn 80 loại enzym điển hình như peptidase, đóng vai trò quan trọng cho quá trình tiêu hóa protein , phòng chống ung thư đường tiêu hóa, tắng cường hệ thống miễn dịch. Ngoài ra trong gạo đen hữu cơ còn chứa các thành phần dinh dưỡng: các amino acid, các nhóm acid béo Omega-3 và Omega-6, hơn 120 chất chống oxy hóa (acylated steryl glucoside, gama Aminobutyric) tác động mạnh mẽ lên gốc tự do. Đặc biệt trong gạo đen hữu cơ có chỉ số đường huyết từ thấp đến trung bình (< 58) nên rất thích hợp cho người tiểu đường. 1.2. Anthocyanin 1.2.1. Giới thiệu 6
  17. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Anthocyanin là hợp chất màu hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên, thuộc Flavonoid, là họ màu phổ biến nhất tồn tại ở thực vật bậc cao và tìm thấy được trong một số loại hoa, quả, hạt như: quả nho, quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô, hoa hibicut, đậu đen, quả cà tím, gạo nếp than, gạo đỏ Thuật ngữ Anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó Anthocyanin là sự kết hợp giữa Anthos - nghĩa là hoa và Kysanesos - nghĩa là màu xanh. Tuy nhiên, không chỉ có màu xanh, Anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rực rỡ khác như hồng, đỏ, cam và các gam màu trung gian. Các Anthocyanissn khi mất hết nhóm đường được gọi là Anthocyanidin hay aglycon. Mỗi Anthocyanidin có thể bị glycosyl hóa acylate bởi các loại đường và các acid khác tại các vị trí khác nhau. Vì thế lượng Anthocyanin lớn hơn Anthocyanidin từ 15-20 lần. Chúng được sử dụng làm phụ gia thực phẩm với ký hiệu là E613. 1.2.2. Sự phân bố của Anthocyanin. Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những loài ra hoa, phần lớn nằm ở hoa và quả, ngoài ra cũng có ở lá và rễ. Trong những loại thưc vật này, Anthocyanin được tìm thấy chủ yếu ở các lớp tế bào nằm bên ngoài như biểu bì. Các hợp chất Anthocyanin xuất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73 loài và trong vô số giống thực vật sử dụng làm thực vật (Bridle và Timberiake, 1996). Các họ thực vật như vitaceae (nho) và rosaceae (cherry, dâu tây, mâm xôi, táo ) là các nguồn Anthocyanin chủ yếu. Bên cạnh đó còn có các họ thực vật khác như solanceae (cà tím), saxifragaceae (quả lý đỏ và đen), ericaceae (quả việt quất) và brassicaceae (bắp cải tím). Các loại Anthocyanin phổ biến nhất là các glucoside của cyanidin, kế đến là pelargonidin, peonidin và delphinidin, sau đó petuidin và maldivin. Số lượng các 3-glucoside nhiều gấp 2,5 lần các 3,5-glucoside. Loại Anthocyanin hay gặp nhất chính là Cyanidin-3-glucoside. 7
  18. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Bảng 1.2. Bảng các Anthocyanin có nguồn gốc thực vật Tên thực vật Tên thông thường Loại Anthocyanin Allium cepa Củ hành tím Cy-3-glucoside, 3-galactoside, 3- diglucoside và 3-laminarriobiosidc, Pn-3- glucoside Brassica Bắp cải tím (red Cy-3-sophoroside-5-glucoside cacyl hóa oleraea cabbage) với malonoyl, p-coumaroyl, di- p- coumarol,feruloyl, diferuloyl, sinapoyl và disinapoyl Fragaria spp Dâu tây Pg và Cy-3-glucoside (strawberry) Glycine Đậu nành (vỏ) Cy và Dp-3-glucoside maxima Hibicus Hoa bụt dấm Cy, Pn, mono- và biosides sabdariffa L Raphanus Củ cải đỏ (rễ) Pg và Cy-3-sophoroside-5-glucoside acyl sativus hóa với p-coumaroyl, feruloyl, caffeoyl. Vitis spp Nho Cy, Pn, Dp, Pt và Mv mono và diglucoside; dạng tự do và dạng acyl hóa Cy = cyanidin, Pg= pelagorindin, Pn= peonidin, Dp= delphinidin, Pt = petunidin, Mv= malvidin. 1.2.3. Cấu trúc hóa học của Anthocyanin Anthocyanin thuộc nhóm các hợp chất flavonoid, có khă năng hòa tan trong nước và chứa các không bào. Về bản chất, các Anthocyanin là những hợp chất glycoside của các dẫn xuất polyhydroxy và polymethoxy của 2-phenylbenzopyrylium 8
  19. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà hoặc muối flavylium. Cho đến nay, người ta xác định được 18 loại aglycon khác nhau, trong đó 6 loại phổ biến nhất là pelargonidin, cyanidin, delphinidin, petunidin và maldivin. Bảng 1.3. Một số Anthocyanin phổ biến Anthocyanin Anthocyanidin Đường Có ở cây Pelargonin Pelargonidin 2 glucose Cúc tây Cianin Cynanindin 2 glucose Hoa hồng Ceraxinanin Cynanindin Glucose, galactose Quả mận Prunixianin Cynanindin Ramnoza, glucose Việt quất Idain Cyrinhindin 2 glucose Cẩm quỳ Delfin Peonidin 2 glucose Mẫu đơn Malvin Enidin glucose Nho Peonin Hirsutidin 2 glucose Anh thảo Trong tự nhiên, Anthocyanin rất hiếm gặp khi ở trạng thái tự do (không bị glycoside hóa). Nhóm tự do ở vị trí C-3 làm cho phân tử anthocyanidin trở nên không ổn định và làm giảm khả năng hòa tan của nó so với các Anthocyanin tương ứng. Vì vậy, sự glycosyl hóa luôn diễn ra, đầu tiên ở vị trí nhóm 3-hydroxy. Nếu có thêm một phân tử đường sữa, vị trí tiếp theo bị glycosyl hóa thường gặp nhất là ở C-5. Ngoài ra, sự glycosyl hóa còn có thể gặp ở các vị trí C-7, C-3’, C-5’. Loại đường phổ biến nhất là glucose, ngoài ra cũng có một vài monosaccharide (như galactose, rammose, arabinose), các loại disaccharide (chủ yếu là rutinose, sabubiose hay sophorose) hoặc trisaccharide tham gia và quá trình glycosyl hóa. 9
  20. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Bảng 1.4 Các nhóm Anthocyanin hiện có Anthocyanin R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 Màu sắc E- number Apigeninidin -H -OH -H -H -OH -H -OH Cam Aurantinidin -H -OH -H -OH -OH -OH -OH Cam Capensinidin -OCH3 -OH - -OH - -H -OH Xanh-đỏ OCH3 OCH3 Cyanidin -OH -OH -H -OH -OH -H -OH Đỏ sậm E163a Delphinidin -OH -OH -OH -OH -OH -H -OH Tím, E163b xanh Europinidin -OCH3 -OH -OH -OH - -H -OH Xanh- OCH3 đỏ Hirsutidin -OCH3 -OH - -OH -OH -H - Xanh- OCH3 OCH3 đỏ. Luteolinidin -OH -OH -H -H -OH -H -OH Cam Pelargonidin -H -OH -H -OH -OH -H -OH Cam, đỏ E163d cam Malvidin -OCH3 -OH - -OH -OH -H -OH Tím E163c OCH3 Peonidin -OCH3 -OH -H -OH -OH -H -OH Đỏ sậm. E163e Petunidin -OH -OH - -OH -OH -H -OH Tím E163f OCH3 Pulchellidin -OH -OH -OH -OH - -H -OH Xanh- OCH3 đỏ. 10
  21. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Rosinidin -OCH3 -OH -H -OH -OH -H - Đỏ OCH3 Triacetidin -OH -OH -OH -H -OH -H -OH Đỏ Hình 1.2 Cấu trúc phổ biến của Anthocyanin (intechopen.com/books/the-mediterranean-genetic-code-grapevine-and- olive/production-of-anthocyanins-in-grape-cell-cultures-a-potential-source-of- raw-material-for-pharmaceuti) Sự methoxyl hóa các Anthocyanin và các glucoside tương ứng diễn ra thông thường nhất là ở vị trí C-3’, và C-5’, cũng có thể gặp ở vị trí C-5 và C-7. Tuy nhiên cho đến nay người ta chưa tìm thấy một hợp chất nào bị glycosyl hóa ở tất cả vị trí C-3,-5,-7,-4 do đó cần thiết phải có ít nhất một nhóm hydroxyl tự do ở C-5, -7 hay - 4’ để thành dạng cấu trúc quinonoidal base (dạng cấu trúc thường tồn tại trong không bào thực vật có pH từ 2,5 – 7,5). 11
  22. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Hình 1.3. Cation Flavylium (R1 và R2 là OH, H hoặc OCH3, R3 là glucosyl hoặc H, R4 là OH hoặc glucosyl) (en.wikipedia.org/wiki/Anthocyanin) Sự acyl hóa cũng có thể xảy ra ở vị trí C-3 của phân tử đường hay ester hóa ở các nhóm hydroxy C-6. Các nhóm acyl hóa chính thức là các phenolic acid như beta- coumercic, cafeic, ferulic hay sinap acid và một loạt các acid như acetic, malonic, axalic và succinic. 1.2.4. Tính chất của Anthocyanin Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan rất tốt trong dung môi hữu cơ phân cực. Anthocyanin hòa tốt trong nước và trong dung dịch bão hòa. Khi kết hợp với đường làm cho phân tử Anthocyanin hòa tan nhanh hơn. Màu sắc Anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ, các chất màu và nhiều yếu tố khác, Khi tăng số lượng nhóm OH trong vòng pyran thì màu càng xanh đậm. Trong dung dịch acid, Anthocyanin tồn tại dạng ở cation flavylium có màu đỏ. Khi pH tăng dần, có sự tấn công của nước vào vòng pyran C, Anthocyanin chuyển dần sang dạng base carbinol và chalcone không màu. Đây chính là quá trình hydrat hóa, yếu tố chính tạo nên sự bạc màu của dung dịch màu-nước. trong dung dịch base, có sự dịch chuyển của H+ từ -OH trên vòng B, Anthocyanin chuyển sang dạng anion có màu xanh. Khi pH môi trường càng cao, ion H+ trong nhóm –OH còn lại bị phân hủy và khi ấy điện tử không còn, màu xanh trở nên xanh hơn bởi vì ánh sáng hấp phụ trở 12
  23. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà thành đỏ hơn. Trong môi trường trung tính, cả hai dạng cùng tồn tại nên dung dịch có màu tím. Mức độ methyl hóa các nhóm OH ở trong vòng pyran càng cao thì màu đỏ càng đậm. Nếu nhóm OH ở vị trí thứ ba kết hợp với các gốc đường thì màu sắc cũng sẽ thay đổi theo số lượng các gốc đường được đính vào nhiều hay ít. Các Anthocyanin cũng phụ thuộc rất mạnh vào pH của môi trường:  Khi ở pH>7 các Anthocyanin có màu xanh và khi pH< các Anthocyanin có màu đỏ.  Ở pH=1 các Anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến màu đỏ.  Ở pH = 4-5 chúng có thể chuyển về dạng bazơ Cacbinol hay bazơ Chalcon không màu.  Ở pH = 7-8 lại về dạng bazơ Quinoidal Anhydro màu xanh. Màu sắc của Anthocyanin còn có thể thay đổi do hấp thụ trên polysaccharide. Khi đun nóng lâu dài các Anthocyanin có thể bị phá hủy và mất màu. Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng 510 ÷ 540nm. Độ hấp thu là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc của Anthocyanin chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ Anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ Anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh.  Khả năng hòa tan của Anthocyanin: Athocyanin là những hợp chất phân cực, do đó các dung môi phổ biến nhất được sử dụng trong các phương pháp nghiên cứu là hỗn hợp dung dịch ethanol, methanol hoặc acetone (Kahkone, Hopia & Heinoen, 2001). Trong số các phương pháp phổ biến nhất là những người mà sử dụng chất trích ly là methanol hoặc ethanol ở pH axit (Amr & Al Tamimi, 2007). Từ những phương pháp này, việc khai thác với methanol là hiệu quả nhất (Kapasakalidis, Rastall, & Gordon, 2006); trong thực tế, nó đã được tìm thấy rằng trích ly Anthocyanin từ bột nho, với việc tách chiết với methanol là 20% hiệu quả hơn so với ethanol, và 73% hiệu quả hơn chỉ có nước 13
  24. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà (Metivier, Francis, & Clydesdale, 1980). Tuy nhiên, trong ngành công nghiệp thực phẩm ethanol được ưa thích hơn do methanol rất độc. Trong Anthocyanin chiết từ nho đen, một dung dịch nước. Trong một số nghiên cứu, dung môi với 80% EtOH bão hòa với SO2 được sử dụng chiết tách Anthocyanin (Romani et al, 1999), trong nghiên cứu quan sát rằng các loại dung môi, nồng độ SO2 và nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình khai thác Anthocyanin. Các Anthocyanin từ lúa miến đen được chiết xuất với HCl 0,1% trong MeOH và 70% acetone dịch nước (Awika et al, 2005). 1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc và độ bền của Anthocyanin. So với đa số các chất màu thiên nhiên, Anthocyanin là chất màu có độ bền kém hơn, nó chỉ thể hiện tính bền trong môi trường acid. Ngoài ra, nó có thể phân hủy tạo thành dạng không màu và sản phẩm cuối cùng của sự phân hủy có dạng màu nâu cộng với những sản phẩm không tan. Sự phân hủy Anthocyanin có thể xảy ra trong quá trình trích ly và tinh chế chúng, đồng thời sự phân hủy này còn xảy ra trong quá trình xử lý và bảo quản các sản phẩm thực phẩm. Độ bền của các Anthocyanin phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: cấu trúc hóa học của Anthocyanin, pH, nhiệt độ, sự có mặt của copigment, ion kim loại, oxy, acid ascorbic, SO2, ánh sáng, enzyme, đường và các sản phẩm biến tính của chúng. Vì vậy, nghiên cứu các yếu tổ ảnh hưởng đến độ bền của Anthocyanin là điều cần thiết trước khi ứng dụng nó như một chất màu thực phẩm. 1.2.5.1. Cấu trúc a. Cấu trúc chuyển hóa trong môi trường lỏng. Trong môi trường nước các Anthocyanin tự nhiên giống như chất chỉ thị pH. đỏ ở pH thấp, đỏ xanh ở pH trung tính và không màu ở pH cao. 14
  25. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc anthocyanin chuyển hóa trong nước.(Jackman and Smith, 1992) Tại pH đã cho, tồn tại một cân bằng giữa 4 cấu trúc của Anthocyanin và aglycone: quinonoidal (anhydro) bazo (A) màu xanh, cation flavylium (AH+) màu đỏ, carbinol pseudobase (B), và chalcone (C) không màu. Khi pH 3. Cation flavylium tương đối bền ở môi trường acid (như pH < 3). Trong môi trường trung tính hay acid yếu, Anthocyanin tồn tại chủ yếu ớ các dạng không màu. Vì vậy, sự ổn định của các dạng mang màu, đặc biệt là dạng quinonoidal base, một phần là do sự 15
  26. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà xuất hiện của các gốc acid gắn vào phân tử đường, hay còn gọi là sự co-pigment hóa nội phân tử. Sở dĩ sự co-pigment hóa nội phân tử giúp tăng độ bền của phân tử Anthocyanin là do sự xếp chồng của vòng thơm trong gốc acid với vòng pyrylium của phân tử Anthocyanin, giảm bớt khả năng bị các phân tử nước tấn công hình thành các hợp chất carbinol, chalcone không màu. Ngoài ra, hiệu ứng copiment hóa ngoại phân tử cũng có thể giúp làm bền các cấu trúc quinoldal base hay ion flavylium do sự có mặt của những phức chất không màu, như các flavone, flavonol. Trong quá trình xử lý nhiệt và ánh sáng, quá trình co-pigment hóa ngoại phân tử giữ vai trò quan trọng, ngăn chặn sự mất màu có thể xảy ra. Cơ chế phân hủy do nhiệt nói chung do chuyển hóa thuận nghịch của các ion flavylium thành các dạng chalcone. Chalcone là chất trung gian trong cả hai quá trình phân hủy do nhiệt và ánh sáng của Anthocyanin. Theo các nghiên cứu gần đây (Davis và cộng sự, 1983; Mazza và Brouiỉìard, 1990) hiệu ứng co-pigment hóa chính là cơ chế làm bền màu chính của Anthocyanin trong thực vât do, nó làm giảm tỉ lệ giữa dạng không mang màu (chalcone) và dạng mang màu thông qua việc tạo phức với dạng mang màu, ngăn chặn quá trình chuyển hóa từ dạng mang màu sang dạng không mang màu. Trong dung dịch, Anthocyanin dạng không acyl hóa hay acyl hóa một đơn vị đóng vai trò như một chất chỉ thị pH, tồn tại ở dạng acid hay base tùy thuộc vào giá trị pH. Ở pH acid (pH 6). b. Cấu trúc hóa học Các pigment Anthocyanin thường có độ bền thấp trong tế bào sống của chúng. Như đã trình bày ở trên, độ bền của các Anthocyanin phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: Cấu trúc hóa học của Anthocyaninm, pH, nhiệt độ, sự có mặt của phản ứng co- pigment, ion kim loại, oxy, acid ascorbic, SO2, ánh sáng, enzyme, đường và các sản phẩm biến tính của chúng. 16
  27. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Độ bền màu và cường độ màu của các Anthocyanin phụ thuộc vào vị trí và số lượng của các nhóm hydroxyl, methoxyl, đường và các đường được acyl hóa. Khi số nhóm hydroxyl trong vòng B tăng, cực đại hấp thụ ở vùng thấy được dịch chuyển về phía có bước sóng dài hơn và màu thay đổi từ cam đến xanh dương. Ví dụ: bước sóng hấp thụ cực đại trong dung dịch HCL 0,01% MeOH là 535 nm (cam) đối với pelgonidin, 535 nm (đỏ cam) đối với cyaniding, 545 nm (đỏ xanh) đối với dephinidin.các nhóm methoxyl thay thế các nhóm hydroxyl cho kết quả ngược lại. Nhóm hydroxyl tại vị trí C-3 đặc biệt có ý nghĩa quan trọng vì nó dịch chuyển từ màu cam vàng đến màu đỏ nhưng 3 - deoxyAnthocyanin : luteolinidin và tricetinidin có màu vàng; 3 - deoxyanthocyanidin bền hơn các anthocyanidin khác (Mazza và Brouillard, 1987; Iacobucci và Sueny, 1983). Sự có mặt của nhóm hydroxyl tại vị trí C-5 và nhóm thế ở vị trí C-4, cả 2 bền hóa dạng có màu thông qua sự ngăn cản các phản ứng hydrat hóa dẫn đến dạng không màu. Khi mức độ hydroxyl hóa các aglycone tăng, tính bền của các Anthocyanin sẽ giảm. Tuy nhiên khi tăng sự methoxyl hóa,sẽ thu được kết quả ngược lại. Ví dụ: sự có mặt của nhóm OH ở vị trí 4’ và 7 trong phân tử làm bền hóa đáng kể các pigment, trong khi đó, sự methoxyl hóa có nhóm hydroxyl này làm giảm độ bền. Các Anthocyanin được glycosyl hóa và acyl hóa sẽ cho dạng màu xanh. Sự glycol hóa những nhóm OH tự do làm tăng tính bền của Anthocyanin. Vì vậy, các diglucoside bền hơn các monoglusidc của cùng một Anthocyanin. Ví dụ: thời gian bán sống (giảm 50% độ hấp thu tại bước sóng hấp thu cực đại) của các cianidin 3 - utinoside là 65 ngày tại nhiệt độ phòng trong dung dịch acid citric 0,01M, pH = 2,8. Trong khi đó anthocyanidin tự do trong cùng điều kiện có thời gian bán sống chỉ có 12h. 17
  28. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Hình 1.5 Những màu sắc phổ biến của các loại athocyanin (intechopen.com/books/the-mediterranean-genetic-code-grapevine-and- olive/production-of-anthocyanins-in-grape-cell-cultures-a-potential-source-of- raw-material-for-pharmaceuti) Anthocianin có chứa 2 hay nhiều nhóm acyl (như tematin, platyconin, cinerarrin, gntiodenphin và zebrrinin) là bền trong môi trường trung tính hoặc acid yếu do liên kết hydro giữa các nhóm hydroxyl của các nhân phenolic trong Anthocyanin và acid vòng thơm. Brouillard (1981-1982) và Goto cùng với cộng viên (1982-1983) khảo sát rằng các Anthocyanin diacylate hóa được bền hóa bởi sự liên kết chặt nhờ sự tương tác giữa vòng Anthocyanin và 2 nhóm acyl vòng thơm. 1.2.5.2. pH Trong môi trường nước, pH có ảnh hưởng đáng kể lên màu sắc của Anthocyanin (Brouillard 1984,Mzza và Brouillard 1987). Cấu trúc, độ bền màu, màu sắc của Anthocyanin thay đổi theo sự thay đổi của pH. Sự thay đổi cấu trúc của Anthocyanin khi pH thay đổi đã được đề cập trong phần cấu trúc chuyển hóa. Ở pH < 2.0, dung dịch Anthocyanin có màu hầu như đỏ (R3 = O-đường) hoặc vàng (R3 = H). Khi tăng pH của dung dịch, màu của các Anthocyanin nhạt dần. Khi pH trong khoảng 4.0-6.0, hầu hết các Anthocyanin đều có dạng không màu. Nếu tiếp tục tăng pH, dung dịch sẽ có màu tím hoặc xanh dương và màu này có thể chuyển sang màu vàng khi để yên hoặc xử lý nhiệt. 18
  29. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Sự biến tính của các Anthocyanin tăng mãnh liệt với sự tăng của pH trong môi trường có oxy. Chẳng hạn: rubrobraxinin cloma là các Anthocyanin của bắp cải tím là một triglucozit của xianidin. Khi: pH = 2,4 - 4,0 có màu đỏ thắm. pH = 4 - 6 thì có màu tím. pH = 6 thì có màu xanh lam. pH là kiềm thì có màu xanh lá cây. 19
  30. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Hình 1.6 Sự chuyển đổi cấu trúc của anthocyanin trong điều kiện môi trường pH khác nhau (intechopen.com/books/the-mediterranean-genetic-code-grapevine-and- olive/production-of-anthocyanins-in-grape-cell-cultures-a-potential-source-of- raw-material-for-pharmaceuti) 1.2.5.3. Nhiệt độ. Hầu hết, các phản ứng hóa học liên quan đến độ bền Anthocyanin và tốc độ phân hủy chúng đều phụ thuộc vào nhiệt độ. Sự tăng theo hàm số logarit của các Anthocyanin ứng với sự phân hủy Anthocyanin ứng với sự tăng đại số của nhiệt độ. Tính bền nhiệt của các Anthocyanin phụ thuộc vào cấu trúc của chúng, pH, sự có mặt của oxy và sự tác động qua lại giữa các thành phần. 20
  31. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Hình 1.7 Sơ đồ sự biến tính của anthocyanin 3,5-diglucoside tại pH 3,7 (Zhaohua Hou, 2013) Khi một cấu trúc của Anthocyanin bền với sự gia tăng của pH thì nó cũng bền với sự gia tăng của nhiệt độ. Sự hydroxyl hóa các aglycone làm giảm tính bền của Anthocyanin, trong khi sự methoxyl hóa, glycosyl hóa, acyl hóa sẽ cho kết quả ngược lại. Ví dụ: Anthocyanin 3-glycoside có độ bền nhiệt lớn nhất tại pH = 1.8 - 2.0 với sự có mặt của oxy trong khi Anthocyanidin 3,5-diglycoside có độ bền nhiệt lớn nhất tại pH = 4.0 - 5.0. Cơ chế của sự phân hủy nhiệt xảy ra không những phụ thuộc vào nhiệt độ mà còn phụ thuộc vào bản thân Anthocyanin đó. Drazdina cho rằng coumarin glycoside là sản phẩm phân hủy phổ biến của Anthocyanin 3,5 - diglycoside và cơ chế của sự phân hủy là: đầu tiên cấu trúc cation flavylium chuyển thành dạng quinonidal base, tiếp theo là hình thành nhiều dạng sản phẩm trung gian và cuối cùng thu được dẫn xuất coumarin và thành phần tương ứng với vòng B của anthocyanidin. Sự biến tính này không những được xúc tiến bởi nhiệt độ mà còn bị ảnh hưởng bởi oxy. Anthocyanidin 3-glycoside thì không hình thành những dẫn xuất coumrin mà bước đầu tiên của sự phân hủy bao gồm sự chuyển hóa của dạng carbinol pseudobase không màu, sau đó là sự mở vòng pyrylium để hình thành dạng chalcone trước khi thủy phân liên kết glycoside. 21
  32. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Adams cho rằng, các anthocyanidin 3-glycoside khi được nung nóng ở pH = 2.0-4.0 đầu tiên sẽ bị thủy phân liên kết glycoside (ở 100°C) sau đó là sự biến đổi aglycone thành chalcone. Sự biến tính hơn nữa dẫn đến hình thành dạng sản phẩm màu nâu đặc biệt là với sự có mặt của oxy. Khi đun nóng lâu dài các Anthocyanin có thể bị phân huỷ và mất màu, đặc biệt là các Anthocyanin của dây tây, anh đào, củ cải. Ngược lại các Anthocyanin của phúc bồn tử đen cũng trong điều kiện đó lại không bị thay đổi. Nhìn chung khi gia nhiệt, các chất màu đỏ dễ dàng bị phân huỷ, còn các chất màu vàng thì khó hơn. 1.2.5.4. Oxy. Oxy và nhiệt độ được xem là những tác nhân đặc trưng xúc tiến sự phân hủy của Anthocyanin, từ đó sinh ra những dạng sản phẩm không màu hoặc màu nâu. Sự kết tủa và đóng váng trong nước trái cây có thể gây ra từ sự oxy hóa trực tiếp dạng carbinol pseudobase. Oxy hóa mãnh liệt các Anthocyanin khi nung nóng. Oxy và nhiệt độ là những tác nhân xúc tiến đăc biệt nhất trong nước ép của blueberry, cherry (anh đào), currant, nho, raspberry và dâu. Lượng Anthocyanin còn lại của dâu sẽ lớn hơn khi đóng chai dưới điều kiện chân không hoặc nitrogen (Baravingas và Cain, 1965). Độ bền của các pigment của nho, được sử dụng như là chất màu ở nước giải khát được tăng lên khi đóng hộp với nitrogen. 1.2.5.5. Enzyme Nhiều enzyme nội sinh trong tế bào của cây có khả năng làm mất màu Anthocyanin. Những enzyme này được gọi chung là anthocyanase. Dựa vào đặc tính của các enzyme mà người ta phân làm 2 nhóm: Glycosidase và polyphenol oxidase (PPO). Các enzyme này thu được từ nấm (fugal). 22
  33. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà +Glycosidase: là enzyme thủy phân liên kết glycoside của Anthocyanin tạo ra đường tự do và aglycone này kém bền hơn rất nhiều và mất màu rất nhanh khi có mặt của catecol (Huang 1955). +Polyphenol oxidase (PPO): tác dụng lên Anthocyanin với sự có mặt của o- diphenol thông qua cơ chế oxy hóa kết hợp (h 6-6). Theo Gromeck và Markakis, sự thêm vào glycosidase và PPO xúc tác cho quá trình peroxide hóa phân hủy Anthocyanin. Hình 1.8. Sự biến tính Anthocyanin với phản ứng oxy hóa atechol (Wiley, 2005) Peng và Markakis đã đề nghị một cơ chế mà trong đó o-quinine được tạo thành bởi sự oxy hóa Anthocyanin (H-17). Blom phân lập được enzyme Anthocyanin - glycosidase từ Aspergillus niger và chỉ ra ảnh hưởng của nó trong quá trình thủy phân liên kết glycoside của Anthocyanin. PPO là enzyme có ảnh hưởng yếu lên Anthocyanin dạng quinonoidal base dễ bị thủy phân bởi PPO hơn dạng cation flavylium. Tốc độ phân hủy bởi PPO phụ thuộc vào sự thay thế mô hình của vòng B và mức độ glycosyl hóa. 1.2.5.6. Ánh sáng. 23
  34. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Các Anthocyanin thường không bền khi tiếp xúc với tia tử ngoại, ánh sáng thấy được và các nguồn phóng xạ khác. Ánh sáng có 2 ảnh hưởng đến Anthocyanin: tăng cường cho quá trình sinh tổng hợp và xúc tiến sự biến tính của chúng. Những quả táo giống đỏ sẽ không chín đỏ mà xanh trong bóng tối (Siegenman, 1964 ). Vanburen và cộng sự (1948) tường trình rằng các diglycoside được acyl hóa và methyl hóa là các diglycoside không bị acyl hóa là ít bền hơn và monoglycoside là kém bền nhất, Palamidis và Markakis (1975) đã tìm thấy rằng ánh sáng thúc đẩy quá trình phân hủy Anthocyanin trong nước giải khát có CO2 được phối màu với Anthocyanin từ xác nho. Macccarone và cộng sự đã nghiên cứu sự quang hóa của Anthocyanin và chỉ ra rằng, Anthocyanin diglycosyl hóa tại vị trí C-3 và C-5 là bền hơn các Anthocyanin mono glycoyl hóa tại vị trí C-3 đồng thời chúng bền hơn so với các aglycone tương ứng. 1.2.5.7. Đường và các sản phẩm biến tính của chúng Ở nồng độ 100 ppm, đường và các sản phẩm phân hủy của chúng có tác dụng thúc đẩy sự phân hủy các Anthocyanin. Fructose, arabinose, lactose và sorbose có khả năng phân hủy Anthocyanin mạnh hơn glucose, sucrose,và maltose. Tốc độ phân hủy của Anthocyanin liên quan đến tốc độ phân hủy của đường. Các sản phẩm phân hủy của đường gồm có: furfural, 5-hydroxymethyl furfural và acctaldehyl được thu từ phản ứng Mailard hoặc từ sự oxy hóa của acid ascorbic, polyuronic hoặc ở bản thân các Anthocyanin. Những sản phẩm phân hủy này dễ dàng ngưng tụ với các Anthocyanin hình thành những hợp chất phức tạp có màu nâu sẫm. Sự phân hủy Anthocyanin với sự có mặt của furfural và HMF trực tiếp phụ thuộc vào nhiệt độ và rõ nét nhất là trong nước trái cây sự có mặt của oxy làm tăng thêm hiệu quả phân hủy của tất cả các loại đường và các dẫn xuất của chúng. 24
  35. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Hình1.9. Phản ứng ngưng tụ của A: Cyanidin và furural; B: Cyanidin ketobase và furural (Wiley, 2005) 1.2.5.8. Các ion kim loại. Một số ion kim loại đa hóa trị có thể tương tác với các Anthocyanin có nhóm OH ở vị trí ortho gây ra hiệu ứng sâu màu (bathocromic). Hiện tượng này xảy ra khi kim loại tiếp xúc với Anthocyanin trong quá trình chế biến rau quả hoặc sự cho thêm các muối kim loại vào trong thực phẩm. Sistrunk và Cash đã chứng minh rằng có thể bền hóa màu của dịch trích dâu bằng cách thêm vào đó muối thiếc. Francis (1977) công bố rằng, các ion Ca, Fe, Al tạo thêm sự bảo vệ cho Anthocyanin của nước ép trái việt quất (cranberry), nhưng sự biến đổi màu xảy ra là do sự tạo phức giữa ion kim loại và tannin, kết quả sau cùng là không có lợi. Trong công nghiệp đồ hộp, sự mất màu của những trái cây có chứa Anthocyanin là do có phản ứng với thiếc của đổ hộp (Culpepper và Caldwell, 1972). Trong phản ứng với thiếc, Anthocyanin đóng vai trò như chất khử cực catod hoặc anod. Chất khử cực catod có thể bị khử bởi hydro mới sinh từ phản ứng giữa kim loại và acid, còn chất khử cực anod thường là các Anthocyanin có ít nhất 2 nhóm hydroxyl ở vị trí ortho. 25
  36. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 1.2.5.9. Sulfurdioxide (SO2) Các Anthocyanin thường bị mất màu khi có mặt của SO2. Hiện tượng này thường xảy ra trong quá trình xử lý các sản phẩm thực phẩm có chứa Anthocyanin bằng SO2. Quá trình khử này có thể là thuận nghịch hoặc bất thuận nghịch. Trái cây và nước quả được xử lý bằng một lượng trung bình SO2 (500-2000 ppm), làm mất màu các Anthocyanin của chúng trước khi chế biến, hơn nữa, chúng được desulfit hóa và màu Anthocyanin được phục hồi. Jurd đã đề nghị sơ đồ phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và Anthocyanin trong đó, dạng có màu flavylium phản ứng với ion bisulphate tạo thành chromene - 2 - (hoặc 4 ) - sulphonic acid. Hình 1.10. Sơ đồ Jurd đối với phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và Anthocyanin (Wiley, 2005) SO2 ở nồng độ rất thấp (khoảng 30 ppm) có thể ức chế sự biến tính do enzyme của Anthocyanin trong quả anh đào nhưng không làm mất màu chúng (Goodman và Markakis, 1965 ). Sự tẩy màu bất thuận nghịch xảy ra trong quá trình tẩy quả với lượng lớn SO2 (0.8 - 1.5% ) và soda (0.4 - 1.0%) được dùng trong quá trình tẩy quả. Phản ứng bất thuận nghịch này chưa được biết hoàn toàn. 1.2.5.10. Acid ascorbic Nhiều nhà khảo sát (Beatic và cộng sự 1943; Pederson và cộng sự 1947; Kertesz 1952; Meschter 1953; Markakis và cộng sự 1957; Starr và Francis 1968) quan 26
  37. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà sát sự biến mất đồng thời của acid ascorbic và Anthocyanin trong nước trái cây tồn trữ và đề nghị một tương tác có thế có giữa 2 hợp chất này. Acid ascorbic hiện diện trong hầu hết các sản phẩm trái cây, vitamin này bị oxy hóa tạo thành H2O2 và chính H2O2 làm mất màu Anthocyanin. Hình 1.11. Sự chuyển hóa malvin thành malvone bởi H2O2 tạo thành từ sự oxy hóa Ascorbic acid (Wiley, 2005) Shrikhande và Francis đã tìm thấy rằng các ion đồng xúc tiến và các flavonoid làm giảm sự phân hủy của cả hai acid ascorbic và Anthocyanin. Những sản phẩm không màu ( hình 1.10 ). Acid dehyroascorbic cũng có thể làm mất màu Anthocyanin nhưng tại tốc độ thấp hơn acid ascorbic. Hình 1.12. Fla-2-ene được tạo thành từ phản ứng giữa Ascorbic acid và Anthocyanin. 1.2.6. Ứng dụng của Anthocyanin Anthocyanin được dùng như chất màu thực phẩm với tính an toàn cao và màu sắc đa dạng đẹp mắt. 27
  38. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng để chống lão hóa, hoặc chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, chống viêm, chống các tia phóng xạ Hạn chế sự suy giảm sức đề kháng, sự phát triển của các tế bào ung thư. Athocyanin còn có vai trò thu hút côn trùng giúp cho sự thụ phấn của cây diễn ra tốt hơn. Do đặc tính thay đổi màu theo pH, Anthocyanin có thể sử dụng như một chất chỉ thị: pH 1-3: màu đỏ pH 4: màu hồng pH 5: hồng tím pH 7: tím pH 8: xanh dương pH 9: xanh lá + xanh dương pH 10-12: xanh lá cây pH >12: xanh lá mạ Xác định hàn the : Mặc dù dung dịch mẫu có chứa hàn the (pH 9.5), nhưng khi cho Anthocyanin vào dung dịch mẫu, dung dịch không chuyển sang màu xanh mà chuyển sang màu xám. Nguyên nhân là do hàn the (Natri borate) phản ứng với nhóm ortho hydroxy trong vòng thơm của Anthocyanin tạo thành muối borate. (Nguyễn Thị Phương Anh, Nguyễn Thị Lan, 2007) Ngoài tác dụng là chất màu thiên nhiên được sử dụng khá an toàn trong thực phẩm, tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho mỗi sản phẩm, Anthocyanin còn là hợp chất có nhiều đặc tính sinh học quý như: khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng để chống lão hóa, hoặc chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, hạn chế sự suy giảm 28
  39. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà sức đề kháng; có tác dụng làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư; tác dụng chống các tia phóng xạ. Những đặc tính quý báu của Anthocyanin mà các chất màu hóa học, các chất màu khác hình thành trong quá trình gia công kỹ thuật không có được đã mở ra một hướng nghiên cứu ứng dụng hợp chất màu Anthocyanin lấy từ thiên nhiên vào trong đời sống hằng ngày, đặc biệt trong công nghệ chế biến thực phẩm. Điều đó hoàn toàn phù hợp với xu hướng hiện nay của các nước trên thế giới là nghiên cứu khai thác chất màu từ thiên nhiên sử dụng trong thực phẩm, bởi vì chúng có tính an toàn cao cho người sử dụng. 1.2.7. Các Anthocyanin đã được thương mại hóa Encolor liqid DS (công ty Reggianna, Antociani, Italy) là dịch trích vỏ nho cô đặc. Redberry liqid 88-01 được sản xuất bởi công ty Gillette Food Inc, là dịch trích quả của alderberry, blackberry, blueberry, blackcurrant. Sambucus NR 54 được sản xuất bởi công ty Gilette Food Inc, là dịch trích Anthocyanin từ elderberry. San Red Liqid RC-EX được sản xuất bởi công ty San Ei Chemical Industries ( Nhật) là dịch cô đặc từ bắp cải đỏ mà chúng chứa Anthocyanin diacyl hóa. Powdered San Red PC được sản xuất bởi công ty San Ei Chemical Industries là bột sấy khô của dịch tr ích từ bắp cải đỏ. Powdered San Red PC được sản xuất bởi công ty San Ei Chemical Industries là bột sấy khô của dịch trích từ bắp cải tím. 1.3. Những kết quả nghiên cứu trong nước và thế giới 1.3.1. Phương pháp tách chiết Anthocyanin từ gạo. Anthocyanin là hợp chất màu với những hoạt tính sinh học quý giá, người ta luôn tìm những biện pháp trích ly chúng nhiều nhất từ nhiều nguồn nguyên liệu. 29
  40. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Trong gạo tím có thể chứa hàm lượng Anthocyanin cao và trong đó có hai thành phần chủ yếu: cyanidin và peonidin. Trong những bài nghiên cứu trích ly Anthocyanin từ gạo đen thường sẽ chọn ra những loại dung môi, thời gian, nhiệt độ để thu được Anthocyanin cao nhất. Như bài nghiên cứu về việc trích ly Anthocyanin từ gạo tím Sóc Trăng, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn khảo sát các các yếu tố trong quy trình trích ly: tỷ lệ dung môi trích ly H2O:EtOH, pH của dung môi trích ly để cho hiệu quả trích ly cao nhất, nhiệt độ, thời gian để thu hồi lượng Anthocyanin cao nhất. Ngoài ra còn có nghiên cứu khác sử dụng dung môi MeOH:HCl 1% tỉ lệ 85:15 (v:v) (R.Sompong, 2010). Với mỗi nghiên cứu sử dụng một dung môi khác nhau sẽ sẽ cho ra hiệu quả khác nhau. Việc sử dụng dung môi sẽ ảnh hưởng đến các yếu tố nhiệt độ và thời gian khác nhau. 1.3.2. Phương pháp trích ly Anthocyanin từ quả dâu Hội An. Trong quả dâu, Anthocyanin được phân bố ở tế bào, với bản chất là một hợp chất thiên nhiên khá phân cực. Vì vậy trong quá trình nghiên cứu lựa chọn những hệ dung môi tách chiết khác nhau để có thu được lượng Anthocyanin nhiều nhất: + Methanol - nước - HCl (tỷ lệ 1:1,1% HCl). + Ethanol - nước - HCl (tỷ lệ 1:1,1% HCl). + Nước - HCl (1%). + Nước - formic acid (5%). + Nước - acetic acid (5%). Hệ dung môi tốt cho quá trình tách chiết chất màu Anthocyanin là ethanol- nước là 1:1 (với 1% HCl). Hệ dung môi này cũng có thể dùng để tách chất màu 30
  41. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Anthocyanin từ các loại rau quả tương tự. (Nguyễn Thị Lan, 2010). Màu Anthocyanin biến động trong các môi trường dung môi trích ly khác nhau. 1.3.3. Phương pháp tách chiết Anthocyanin từ bắp cải tím. Bằng phương pháp tối ưu hoá thực nghiệm trong quá trình chiết tách, đã xác định được hàm lượng Anthocyanin trong bắp cải tím Đà Lạt chiếm khoảng 1,11%. Chất màu trong bắp cải được chiết xuất bằng những hệ dung môi khác nhau: ethanol - nước, hệ dung môi ethanol – HCl (1%) - nước, acid citric – HCl (1%), hệ dung môi NaHSO3 – HCl (1%). Nghiên cứu sử dụng 2 phương pháp: phương pháp trích có sự hỗ trợ của sóng siêu âm và phương pháp trích ly thông thường với số lần trích ly khác nhau: một lần, hai lần và ba lần cho hệ dung môi NaHSO3 – HCl (1%). Nhìn chung ở mỗi nguyên liệu trích ly Anthocyanin có đặc tính khác nhau, sẽ dẫn đến kết quả trích ly hàm lượng Anthocyanin khác nhau. Ở nguyên liệu gạo tím đã được sử dụng dung môi H2O:EtOH trong pH=2.2 tỷ lệ đạt cao nhất được 0.083%, ở nguyên liệu bắp cải tím đạt hiệu quả cao nhất là NaHSO3-HCl % Anthocyanin trích ly được là 1,087% ở pH=1, ở nguyên liệu dâu Hội An dung môi trích ly cao nhất là Ethanol- nước ở tỷ lệ 1:1 có bổ sung HCl thu được 1,047% Anthocyanin. Các kết quả nghiên cứu điều đạt được hiệu suất thu hồi Anthocyanin cao khi sử dụng đến HCl vì HCl làm biến tính tế bào giúp Anthocyanin thoát ra dễ dàng hơn bên cạnh đó đây là môi trường bền nhất của athocyanin. Các dung môi trong các nghiên cứu đều sử dụng những dung môi có tính phân cực tốt Ở những phương pháp nghiên cứu sử dụng có hỗ trợ của sóng siêu âm sẽ đạt được kết quả cao nhất. 31
  42. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Nguồn gạo đen Nguyên liệu gạo đen được sử dụng trong nghiên cứu là gạo đen hữu cơ “Hoa Sữa” của công ty Viễn Phú. Gạo được đóng bao hút chân không và bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi sử dụng. Gạo đen hữu cơ là gạo có màu tím đậm đến màu đen, được trồng trên vùng đất U Minh. Gạo đen được canh tác theo phương pháp hữu cơ không thuốc trừ sâu không phân bón hóa học. Gạo có một số thông số kỹ thuật: Thành phần Hàm lượng trong 100g Tỉ lệ Calories 360kcal Chất béo 4g 4% Glucid 72g 72% Protein 9g 9% Ca 28mg 0,028% Anthocyanin 39mg Gạo đen sử dụng trong nghiên cứu phải còn nguyên bao bì, gạo không bị biến đổi màu sắc và còn thời hạn sử dụng. 2.1.2. Một số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là hóa chất dùng trong phân tích. Sử dụng một số hóa chất chuẩn trong phân tích của hãng Merck, Sigma. Ethanol tuyệt đối. HCl. KCl. DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) CH3COONa.3H2O. Ascorbic acid. 32
  43. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 2.1.3. Một số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 2.1.3.1. Dụng cụ - Ống nghiệm. - Bình tam giác. - Đũa thủy tinh. - Pipet. - Nhiệt kế. - Giấy lọc. - Rây Ø 0.0098 và 0.346 inches. - Ống ly tâm 2.1.3.2. Thiết bị - Cân phân tích. - Máy cô quay. - Bể điều nhiệt. - Máy quét quang phổ. - Máy xay nghiền. 2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.2.1. Xác định các thông số cho quá trình trích ly Anthocyanin từ gạo đen Nghiên cứu sử dụng phương pháp thực nghiệm. Quy trình trích ly Anthocyanin bao gồm các bước chủ yếu là trích ly Anthocyanin trong dung môi ở những điều kiện thích hợp sau đó lọc và thu dịch. Các nội dung thí nghiệm chủ yếu được thể hiện trong sơ đồ hình bên dưới. 33
  44. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Gạo đen Xác định tỷ lệ H2O:EtOH để pha dung môi thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen Xác định thời gian thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tóm tắt nội dung thí nghiệm khảo sát các thông số trích ly 34
  45. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 2.2.1.1. Xác định tỷ lệ dung môi Nước-EtOH trong quá trình trích ly Gạo đen TL 1:9 Nghiền, rây qua lỗ rây kích thước 0,25mm TL 2:8 Nhiệt độ :60oC Dung môi TL 3:7 Thời gian 60 p Trích ly H2O:EtOH TLNL: 1:10 (w:w) TL 4:6 Lọc TL 5:5 Cặn Thu dịch 4000 rpm Ly tâm 15 phút Xác định hiệu suất thu hồi anthocyanin Chọn tỷ lệ H2O:EtOH thích hợp Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ H2O: Ethanol trong pha chế dung môi để trích ly anthocyanin từ gạo đen hữu cơ. 35
  46. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Gạo đen được nghiền nhỏ sau đó rây qua sàng rây kích thước lỗ rây là 0,25mm. Dung môi H2O:EtOH ở những tỷ lệ 1:9; 2:8; 3:7; 4:6; 5:5 , đã được chuẩn bị ở nhiệt độ 600C. Sau đó cho gạo đã được cân sẵn với tỷ lệ 1:10 (w:w), cho vào trong các bình chắn sáng chứa dung môi. Cứ 10 phút khuấy đảo hỗn hợp. Quá trình trích ly giữ ổn định nhiệt độ ở 600C trong bể ủ nhiệt thời 60 phút, sau đó đem hỗn hợp đi lọc để loại bỏ cặn thu được phần dịch trong, phần dịch này sau đó đem ly tâm trong vòng 15 phút với tốc độ 4000 rpm, để loại bỏ số cặn nhỏ trong dịch. Cuối cùng sử dụng phương pháp vi sai để xác định hàm lượng Anthocyanin. Tính được hiệu suất thu hồi sau đó sẽ chọn tỷ lệ dung môi thích hợp nhất. 2.2.1.2 Xác định tỷ lệ nguyên liệu tấm trong dịch trích ly Gạo đen được nghiền nhỏ sau đó rây qua sàng rây kích thước lỗ là 0,25mm. Kết quả tỷ lệ dung môi ở thí nghiệm 1 đã được chuẩn bị ở nhiệt độ 600C. Sau đó cho gạo đã được cân sẵn với các tỷ lệ gạo và dung môi 1:6; 1:8; 1:10; 1:12, cho nguyên liệu vào trong các bình chắn sáng chứa dung môi, cứ 10 phút khuấy đảo 3 vòng. Nhiệt độ trích ly luôn giữ ổn định ở 600C trong bể ủ nhiệt trong vòng 60 phút, sau đó đem dịch đi lọc để loại bỏ cặn thu dịch sau đó đem ly tâm trong vòng 15 phút, số vòng là 4000rpm để loại bỏ số cặn nhỏ trong dịch. Cuối cùng sử dụng phương pháp vi sai để xác định hàm lượng Anthocyanin. Tính được hiệu suất thu hồi sau đó sẽ chọn tỷ lệ dung môi thích hợp nhất. 36
  47. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Gạo đen TLNL1:6 w/w Nghiền, rây qua lỗ rây kích thước 0,25mm TLNL:1:8w/w Dung môi Thời gian 60p H2O:EtOH 4:6 Trích ly TLNL:1:10 w/w 0 Nhiệt độ: 60 (v:v) TLNL:1:12w/w Lọc Cặn Thu dịch 4000rpm Ly tâm 15 phút Xác dịnh hiệu suất thu hồi anthocyanin Chọn tỷ lệ nguyên liệu Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen. 37
  48. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 2.2.1.3. Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly Anthocyanin từ gạo đen Gạo đen được nghiền nhỏ, rây qua sàng rây kích thước lỗ là 0,25 mm. Kết quả tỷ lệ dung môi ở thí nghiệm 1 đã được chuẩn bị ở những nhiệt độ khảo sát 400C, 500C, 550C, 600C, 650C, 700C. Sau đó cho gạo đã được cân sẵn với kết quả ở thí nghiệm 2 vào trong các bình chắn sáng chứa dung môi, cứ 10 phút khuấy đảo 3 vòng. Thời gian trích ly trong vòng 60 phút, sau đó đem dịch đi lọc để loại bỏ cặn thu dịch sau đó đem ly tâm trong vòng 15 phút, 4000 rpm để loại bỏ số cặn nhỏ trong dịch. Cuối cùng sử dụng phương pháp vi sai để xác định hàm lượng Anthocyanin, tính hiệu xuất trích ly Anthocyanin và chọn ra được nhiệt thích hợp nhất để trích ly. Gạo đen 400 Nghiền, rây qua lỗ rây kích thước 0,25mm 500 Dung môi Thời gian 60 p 0 Trích ly 55 TLNL:1:8 H2O:EtOH 4:6 (w:w) (v:v) 600 Lọc 650 Thu dịch Cặn 700 4000rpm 15 phút Ly tâm Tính hiệu suất thu hồi anthocyanin Chọn nhiệt đ ộ trích ly Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly Anthocyanin từ gạo đen 38
  49. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 2.1.2.4. Xác định thời gian thích hợp trích ly Anthocyanin từ gạo đen. Gạo đen 60 phút Nghiền, rây qua lỗ rây kích thước 0,25mm 90 phút Dung môi Nhiệt độ 600C H2O:EtOH 4:6 120 phút Trích ly TLNL:1:8 (v:v) (w:w) 150 phút Lọc Cặn Thu dịch 4000rpm Ly tâm 15 phút Xác định hiệu suất thu hồi anthocyanin Chọn thời gian trích ly Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen 39
  50. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Gạo đen được nghiền nhỏ, sau đó rây qua sàng rây có kích thước lỗ là 0,25mm. Kết quả tỷ lệ dung môi ở thí nghiệm 1 đã được chuẩn bị ở nhiệt độ khảo sát thí nghiệm 3. Sau đó cho gạo đã được cân sẵn với kết quả ở thí nghiệm 2 vào trong các bình chắn sáng chứa dung môi. Nhiệt độ trích ly luôn giữ ổn định ở kết quả thí nghiệm 3, trong các khoảng thời gian khoảng sát từ 1h đến 3h, cứ 10 phút khuấy đảo 3 vòng. Sau đó đem dịch đi lọc để loại bỏ cặn thu dịch sau đó đem ly tâm trong vòng 15 phút với 4000rpm để loại bỏ số cặn nhỏ trong dịch. Cuối cùng sử dụng phương pháp vi sai để xác định hàm lượng Anthocyanin, tính hiệu xuất trích ly Anthocyanin. Từ đó chọn được nhiệt độ thích hợp để trích ly. 2.2.2 Khảo sát một số tính chất của Anthocyanin trong dịch trích ly từ gạo đen Dịch trích ly từ gạo đen Nghiên cứu những tính chất của anthocyanin từ dịch trích ly gạo đen. Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của Anthocyanin từ dịch trích ly gạo đen Hình 2.6. Sơ đồ quy trình tóm tắt nội dung thí nghiệm nghiên cứu tính chất của Anthocyanin 2.2.2.1. Sự biến đổi hàm lượng Anthocyanin ở các pH khác nhau. 40
  51. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Dịch trích ly được cho vào các pH đệm khác nhau với tỷ lệ pha loãng, sao cho pH đệm không bị thay đổi. Dịch này được đem đi đo độ hấp thu. Dịch trích ly Pha loãng với dung địch đệm cho pH không đổi Đo độ hấp thu Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của pH đến hàm lượng Anthocyanin trong dịch trích 41
  52. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 2.2.2.2. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của Anthocyanin ở các nhiệt độ khác nhau Dịch trích ly được bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau. Mỗi mốc nhiệt độ được bảo quản trong khoảng thời gian 5 ngày. Mỗi ngày sẽ xác định hàm lượng Anthocyanin còn lại trong mẫu thí nghiệm. Dịch trích ly anthocyanin Bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau 00C 200C 400C Xác định hàm lượng anthocyanin theo thời gian 0 giờ 1giờ 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của anthocyanin ở cá nhiệt độ khác nhau 42
  53. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 2.2.2.3. Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích ly gạo đen trước khi cô quay và sau khi cô quay. Cách dựng đường chuẩn Vitamin C: pha dung dịch vitamin C theo các nồng độ sau: 0; 0,025: 0,05; 0.01; 0,25; 0,5 (mg/ml). Dùng micropipet hút 50 µl mỗi nồng độ vào các ống nghiệm đã chứa sẵn 2ml dung dịch DPPH. Ủ trong tối 15 phút ở nhiệt độ phòng. So màu ở bước sóng 517 nm. Đối với mẫu nghiên cứu (mẫu trước khi cô quay và sau khi cô quay), pha loãng mẫu với nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên. Kết quả đánh giá thông qua giá trị IC50 (Inhibitory concentraion) là nồng độ chất chống oxy hóa cần để ức chế (trung hòa) 50% gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định. Mẫu Vitamin C được dùng để so sánh thông số giá trị IC50. 2.3. Các phương pháp phân tích dùng trong thí nghiệm Định lượng Anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai (the pH differrential method – AOAC 200502). Thử hoạt tính kháng oxy hóa và xác định giá trị IC50 của Anthocyanin bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH (Kirby and Schmidt (1997), đựơc bổ sung chỉnh sửa bởi Haji (2010)). 2.4. Phương pháp xử lý số liệu - Vẽ biểu đồ, đồ thị bằng phần mềm Excel 2013. - Kết quả trong nghiên cứu này là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của 3 lần lặp lại. Dữ liệu được phân tích ANOVA bằng phần mềm Statgraphic Plus 4.0. Sự khác biệt giữa các mẫu là có ý nghĩa về mặt thống kê khi giá trị p < 0,05. 43
  54. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà CHƯƠNG 3 :KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định các thông số cho quy trình trích ly Anthocyanin từ gạo đen 3.1.1. Xác định tỷ lệ dung môi nước: ethanol trong pha chế dung môi trích ly Anthocyanin từ gạo đen 1.4 1.26 1.2 1 0.8 0.68 0.69 0.6 0.44 0.44 0.4 0.2 0 Hiệu suất trích ly anthocyanin % ly anthocyanin tríchsuất Hiệu Tỉ lệ 1:9 Tỉ lệ 2:8 Tỉ lệ 3:7 Tỉ lệ 4:6 Tỉ lệ 5:5 Tỉ lệ dung môi Nước : Ethanol (v:v) Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi H2O:EtOH đến hiệu suất trích ly anthocyanin từ dịch chiết. Anthocyanin từ gạo đen được tách chiết trong dung môi H2O:EtOH với các tỷ lệ khác nhau, kết quả thể hiện trong hình 3.1. Mặc dù kết quả tham khảo từ các nghiên cứu trước cho thấy rằng dùng methanol sẽ cho tác dụng tách chiết tốt hơn tuy nhiên mục đích đề tài là tạo ra dịch trích ly sử dụng trong thực phẩm, cho nên sử dụng methanol là việc không thể, bởi vì vậy ethanol đã được áp dụng làm chất thay thế. Khi sử dụng ethanol có những lợi ích nhất định, chúng dễ dàng bay hơi cho việc đuổi ethanol loại ra khỏi dịch trích ly, cô đặc dịch trích ly sẽ dễ dàng, ethanol này có thể tái sử dụng lại. Theo kết quả thực nghiệm từ đồ thị hình 3.1 cho thấy hiệu suất thu hồi anthocyanin tăng dần tỷ lệ nước khi giảm dần tỷ lệ ethanol, hiệu suất thu hồi đạt cực đại 44
  55. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà ở tỉ lệ H2O:EtOH 4:6 sau đó tăng tiếp tỷ lệ nước hiệu suất thu hồi giảm một các đột ngột. Điều này cũng được thể hiện rõ trong màu của dịch triết, màu có xu hướng đậm dần. Hình 3.2. Dịch trích ly các dung môi ở những tỷ lệ khác nhau Sự khác nhau về hiệu suất trích ly Anthocyanin khi sử dụng dung môi tỷ lệ 4:6 so với các tỷ lệ còn lại là có ý nghĩa thống kê. Thực nghiệm cho thấy, khi giảm tỷ lệ ethanol, tăng tỷ lệ nước, thì hiệu suất trích ly Anthocyanin tăng dần, đạt giá trị cực đại tại tỷ lệ dung môi H2O:EtOH là 4:6, nhưng khi tăng tỷ lệ nước lên thêm thì liên kết ái lực giảm xuống làm hiệu suất thu hồi giảm. Ở mỗi tỷ lệ H2O:EtOH khác nhau sẽ có liên kết ái lực khác nhau, liên kết ái lực này diễn ra ở các vị trí khác nhau của Anthocyanin có thể liên kết với nhóm OH cũng như nhóm đường ở những vị trí khác nhau dẫn đến hiệu suất trích ly khác nhau. Trong thí nghiệm này với tỷ lệ dung môi EtOH:Nước tỉ lệ 4:6 có hiệu suất trích ly cao nhất. Ngoài ra khi tỷ lệ H2O:EtOH 4:6 ta có độ cồn gần 60%, ở độ cồn này độ phân cực của dung môi chiết phù hợp với sự hòa tan của Anthocyanin trong gạo đen. 45
  56. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Tri Liêm (2014) trên nguyên liệu là các loại cám gạo có màu với dung môi là EtOH 58% tương đương với H2O:EtOH tỷ lệ 4:6. Như vậy sử dụng nồng độ dung môi thấp sẽ hạn chế đến môi trường, đồng thời hiệu quả kinh tế cũng tăng vì vậy đề tài chọn tỷ lệ dung môi H2O:EtOH 4:6 cho bước tiếp theo của thí nghiệm. 3.1.2. Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trong quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen 1.05 1 0.99 1 0.98 0.95 0.9 0.87 0.85 0.8 Hiệu suất trích ly anthocyanin anthocyanin % trích suất ly Hiệu Tỉ lệ 1:6 Tỉ lệ 1:8 Tỉ lệ 1:10 Tỉ lệ 1:12 Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (w:w) Hình 3.3. Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi đến hiệu suất trích ly Anthocyanin từ gạo đen hữu cơ. An thocyanin từ gạo đen được tách chiết trong dung môi H2O:EtOH với các tỷ lệ nguyên liệu khác nhau kết quả thể hiện trong hình 3.3. Theo kết quả thực nghiệm cho thấy, hiệu suất thu hồi Anthocyanin thu được thì ở tỷ lệ nguyên liệu 1:8 có hiệu suất trích ly Anthocyanin cao nhất (1%), tiếp theo đó hiệu suất trích ly Anthocyanin giảm dần, thấp nhất đạt 0,98%, nhưng xét về mức ý nghĩa của 46
  57. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà sự khác nhau về các hiệu suất trích ly thì tỷ lệ nguyên liệu 1:8, 1:10, 1:12 là không có sự khác biệt. Tỷ lệ nguyên liệu có ảnh hưởng đến quá trình trích ly, khi tỷ lệ dung môi càng cao, liên kết ái lực với dung môi trích ly càng lớn dễ dàng trích ly Anthocyanin. Ở đây tỷ lệ gạo càng nhỏ dung môi càng nhiều thì sự chênh lệch nồng độ gradien càng lớn, dẫn đến tăng tốc độ khuếch tán và cho phép quá trình trích ly chất rắn bằng dung môi diễn ra tốt hơn (Cacase và Mazz, 2013). Nhưng đến một mức nào đó, khi tăng thể tích dung môi thì cũng không làm tăng hiệu suất trích ly. Kết quả của việc chọn tỷ lệ nguyên liệu trích ly 1:8 có sự chênh lệch so với kết quả trong kết nghiên cứu của Nguyễn Tri Liêm (2014) và kết quả nghiên cứu trích ly từ gạo tím Sóc Trăng của Ninh Lê Thu Thảo (2015) chọn tỷ lệ gạo 1:10. Kết quả nghiên cứu chọn ra tỷ lệ nguyên liệu 1:8 cho quy trình tách chiết anthocyanin từ gạo đen. 3.1.3. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly Anthocyanin từ gạo đen. 47
  58. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 1 0.9 0.864 0.8 0.747 0.74 0.68 0.687 0.7 0.6 0.519 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Hiệu suất trích ly Athocyanin Athocyanin % trích suất ly Hiệu 40 50 55 60 65 70 Nhiệt độ (0C) Hình 3.4. Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu suất trích ly Anthocyanin từ dịch chiết. Bởi vì bản chất của quá trình trích ly là quá trình khuếch tán, quá trình khuếch tán phụ thuộc vào yếu tố nhiệt độ. Bởi vậy việc nghiên cứu này được thực hiện khảo sát ở các nhiệt độ khác nhau từ 400C đến 700C. Theo kết quả thực nghiệm ta thấy, khi tăng dần nhiệt độ từ 400C đến 600C thì hiệu suất trích ly Anthocyanin tăng dần và đạt cực đại ở 600C (0.864%). Nhưng khi tăng nhiệt độ đến 650C và 700C thì hiệu suất trích ly giảm dần. Mặc dù nhiệt độ là một trong các yếu tố làm biến tính và mất màu chủ yếu ở Anthocyanin. Nhiệt độ càng cao, khả năng bị oxy hóa và mất màu của Anthocyanin tăng dần. Tuy nhiên, trong quá trình trích ly, nhiệt độ lại đóng vai trò khá quan trọng do nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng hoạt động, sự tương tác, khuếch tán và ái lực của dung môi đối với Anthocyanin. 48
  59. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Ở nhiệt độ trích ly ở 40oC, quá trình diễn ra chậm do tốc độ khuếch tán của Anthocyanin thấp. Nên hiệu suất trích ly Anthocyanin thu được còn thấp. Ở nhiệt độ 60oC, hiệu suất trích ly Anthocyanin là cao nhất. Do ở nhiệt độ này các phân tử trong tế bào chuyển động nhanh hơn, quá trình anthocyanin tách ra khỏi tế bào diễn ra nhanh làm hiệu suất đạt được cao hơn. Đồng thời ở nhiệt độ này Anthocyanin trong dịch trích ít bị biến tính và tốc độ khuếch tán của Anthocyanin vào dung môi lớn hơn tốc độ phân hủy của Anthocyanin gây ra bởi các tác nhân khác. Có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về hàm lượng Anthocyanin giữa nguyên liệu được trích ly ở 60oC và các thang nhiệt độ còn lại. Ở điều kiện nhiệt độ này. Trong khoảng nhiệt độ 65-70oC, phản ứng phân hủy anthocyanin diễn ra nhanh hơn tốc độ khuếch tán. Bên cạnh đó ở nhiệt độ này nguyên liệu sẽ hút nước trương nở lớn nhất để làm tiền đề cho quá trình hồ hóa nên Anthocyanin bị giữ lại trong gạo nhiều, ngoài ra Anthocyanin dưới tác dụng của nhiệt độ và oxy đã diễn ra phản ứng oxy hóa mạnh. Cho nên ở nhiệt độ này hiệu suất thu hồi Anthocyanin giảm dần Kết quả thí nghiệm phù hợp với kết quả nghiên cứu của Huỳnh Thị Kim Cúc (2004) về trích ly từ dâu tằm Hội An bằng dung môi H2O:EtOH và nghiên cứu trích ly 49
  60. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà anthocyanin từ gạo tím Sóc Trăng của Ninh Lê Thu Thảo (2015) trong dung môi H2O:EtOH có điều chỉnh pH. Hình 3.5 Dịch trích ly anthocyanin ở các nhiệt độ khác Ở nhiệt độ 60oC, hàm lượng Anthocnhauyanin. trích ly được là cao nhất. Vì vậy các thí nghiệm sau sẽ tiến hành trích ly Anthocyanin ở 60oC. 3.1.4. Xác định thời gian thích hợp cho quá trình trích ly Anthocyanin từ gạo đen. Bản chất khuếch tán cần có thời gian, nên chúng ta cần khảo sát thời gian của quá trình trích ly, thời gian khảo sát từ 1h đến 3h, kết quả được thể hiện ở trong hình 3.6. 50
  61. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 1 0.843 0.8 0.657 0.6 0.532 0.371 0.4 0.228 Anthocyanin Anthocyanin % Hiệu suất trích ly trích suất ly Hiệu 0.2 0 1h 1h30 2h 2h30 3h Thời gian Hình 3.6. Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất trích ly Anthocyanin trong dịch chiết. Từ thực nghiệm cho thấy, hiệu suất trích ly Anthocyanin tăng và đạt cực đại ở 1h30 (0.834%), sau đó hiệu suất giảm dần theo thời gian. Khi trích ly 3h (0.228) hiệu suất trích ly anthocyanin đạt giá trị nhỏ nhất. Nguyên nhân hàm lượng anthocyanin trong thời gian đầu (từ 1h đến 1h30) tăng lên là do đây là thời gian mà quá trình khuếch tán diễn ra nhanh hơn quá trình phá hủy Anthocyanin, vì thế hàm lượng Anthocynin trong dịch trích sẽ tăng dần. Sự khuếch tán diễn ra do sự chênh lệch về gradient nồng độ, Anthocyanin trong nguyên liệu có nồng độ cao hơn trong dung môi, thì Anthocyanin sẽ bị khuếch tán vào dung môi dễ dàng và hiệu suất trích ly Anthocyanin trong dịch trích sẽ tăng theo thời gian đến khi gradient nồng độ cân bằng. Ở thời gian trích ly là 2h30 và 3h thì hiệu suất trích ly Anthocyanin lại giảm mạnh so với thời gian trích ly là 1h30. Nguyên nhân là do lúc đầu gradient nồng độ lớn, làm cho Anthocyanin sẽ đi ra dung môi nhiều. Nhưng về sau ở thời gian này, chênh lệch về gradient nồng độ gần như cân bằng, quá trình khuếch tán này gần như dừng lại. Ở điều 51
  62. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà kiện nhiệt độ 60oC, thời gian trích ly trong dung môi càng lâu thì hiệu suât trích ly Anthocyanin giảm do bị oxy hóa, Anthocyanin bị phá hủy. Ở thời gian 1h30, là thời gian đủ cho quá trình khuếch tán xảy ra, đến khi gradient nồng độ cân bằng, ở thời gian này hiệu suất trích ly Anthocyanin không bị giảm do tác nhân oxy hóa và nhiệt độ cao. Cho nên hiệu suất trích ly Anthocyanin thu được từ dịch trích ly là cao nhất. Thời gian trích ly này phù hợp với kết quả nghiên cứu trích ly gạo tím của Sóc Trăng của Ninh Lê Thu Thảo (2015). Thời gian trích ly là 1h30 cho hiệu suất trích ly Anthocyanin là cao nhất, được chọn để tiến hành các thí nghiệm sau. Hình 3.7 Dịch trích ly anthocyanin ở các thời gian khác nhau. 52
  63. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 3.2. Khảo sát một số tính chất của Anthocyanin trong dịch trích ly gạo đen 3.2.1. Sự biến đổi của hàm lượng anthocyanin ở những pH khác nhau 0.500 0.450 0.466 0.400 0.338 0.350 0.370 0.300 0.250 0.290 0.200 0.214 0.150 Độ hấp (nm) hấp Độ thu 0.100 0.118 0.050 0.083 0.058 0.033 0.000 1 3 5 7 9 11 pH Hình 3.8. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi độ hấp thu của anthocyanin ở nhưng mức pH khác nhau. Theo kết quả nghiên cứu ta thấy ở pH có độ hấp thu lớn nhất 0,466 nm nhưng đến pH =3 độ hấp thu bị giảm xuống còn 0,290 nm. Sau đó từ pH=3-5,2 độ hấp thu có xu hướng tăng. Từ khoảng pH=5,2-6 độ hấp thu đột ngột giảm mạnh xuống còn 0,083nm, đến pH=6,7 lại tăng trở lại, đến pH=7,3 độ hấp thu giảm xuống tới mức thấp nhất là 0,033 nm. Ở pH 8,8 độ hấp thu tăng trở lại, cuối cùng đến pH 9,4 độ hấp thu bị giảm xuống còn 0,058nm. Từ kết quả cho thấy pH ổn định nhất là pH từ khoảng 3 đến 5,2 ở những khoảng pH còn lại độ hấp thu không ổn định. Khoảng pH=1 cao nhất vì Anthocyanin đang ở dạng muối flavylium có màu đỏ nên sẽ có độ hấp thu lớn nhất, từ khoảng pH=3 đến 5,2 Anthocyanin ở dạng muối carbinol sẽ không có màu nhưng do ở khoảng pH này có nhiều protein trong dịch trích 53
  64. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà bị mất nước biến tính làm đục mẫu, độ dục làm độ hấp thu tăng. Khoảng pH từ 5,2-6 giảm mạnh nhất là do ở Anthocyanin vẫn tồn tại ở dạng carbinol không màu chuyển thành dịch trong nên pH ở mức thấp nhất. Đến pH 6,7 ở pH này có một số protein trong dịch trích ly bị biến tính làm đục mẫu, làm độ hấp thu tăng lên. Ở khoảng pH=7,4 Anthocyanin chuyển thành dạng chalcone không màu làm cho độ hấp thu đạt mức thấp nhất. Kết quả của quá trình nghiên cứu trên có thể ứng dụng vào việc chọn lựa màu sắc thích hợp cho dịch uống hoặc ứng dụng vào việc chỉnh màu trong thực phẩm từ gốc Anthocyanin. Trong kết quả của quá trình cho thấy ở pH từ khoảng 3 đến 5,2 là khoảng có thể bảo vệ dung dịch trích ly để chúng có thể ít biến đổi nhất. 3.2.2. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của Anthocyanin ở các nhiệt độ khác nhau. 10 8.93 7.79 7.68 8 6.28 6 5.79 6 5.31 4 2 0 0h 1h 24h 48h 72h 96h 120h Hàm lượng anthocyanin lượng anthocyanin mg/ml Hàm Thời gian bảo quản Hình 3.9. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi hàm lượng của Anthocyanin ở 00C Từ kết quả thực nghiệm cho thấy ở 0h hàm lượng Anthocyanin ở mức thấp nhất có 5,31mg/ml, sau đó hàm lượng Anthocyanin tăng dần đến 48h hàm lượng Anthocyanin 54
  65. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà đạt cực đại 8,93 mg/ml, nhưng đến những giờ tiếp theo hàm lượng Anthocyanin giảm dần, đến 120h chỉ còn 5,79 mg/ml. Ở 0h Anthocyanin trong môi trường trung tính ở một số cấu trúc chuyển đổi thành cấu trúc mở vòng chính là dạng chalcone, nên khi đo ở ở thời gian này có độ hấp thu nhỏ nhất. Tuy nhiên ở trong môi trường nước các cấu trúc này chuyển đổi qua lại lẫn nhau khi đến 48h các phân tử xảy ra quá trình co-pigment diễn ra ở một số phân tử còn lại để chúng tồn tại ở dạng quinonoial base, phản ứng này giúp chúng tăng độ bền của scác nội phân tử, giảm bởt khả năng bị các phân tử nước tấn công hình thành các hợp chất không màu. 8 6.84 7 6 5.33 5 4.43 4.55 3.94 4 3.12 2.73 3 2 1 0 Hàm lượng anthocyanin lượng anthocyanin mg/ml Hàm 0h 1h 24h 48h 72h 96h 120h Thời gian bảo quản Hình 3.10. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi hàm lượng của anthocyanin ở 200C Từ kết quả thực nghiệm cho thấy ở 0h hàm lượng Anthocyanin là 4,43 mg/ml sau đó hàm lượng giảm dần khi được 24h chúng ở mức thấp nhất có 2,73mg/ml, sau đó hàm lượng Anthocyanin tăng dần đến 120h hàm lượng Anthocyanin đạt cực đại 6,84 mg/ml. Ở thời gian đầu Anthocyanin bị sốc nhiệt một số phân tử trong chúng chuyển đổi dạng chalcone nên khi đo hàm lượng bằng phương pháp pH vi sai chúng ở mức 55
  66. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà thấp nhất, những sau đó sự co-pigment diễn ra chung chúng tồn tại ở dạng quinonoial base để giúp chúng tăng độ bền cuả các nội phân tử, giảm bởt khả năng bị các phân tử nước tấn công hình thành các hợp chất không màu. 12 9.63 10 8.47 8 6.59 5.8 6 5.19 4 2.73 3.01 2 0 Hàm lượng anthocyanin lượng anthocyanin mg/ml Hàm 0h 1h 24h 48h 72h 96h 120h Thời gian bảo quản Hình 3.11. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi hàm lượng của Anthocyanin ở 00C Từ kết quả thực nhiệm cho thấy ở 0h hàm lượng Anthocyanin là 2,73 mg/ml đạt mức thấp nhất sau đó hàm lượng tăng dần khi ở 96h hàm lượng đạt cực đại 9,63 mg/ml, sau đó hàm lượng Anthocyanin giảm, đến 120h hàm lường Anthocyanin đạt 5,8 mg/ml. Do nhiệt độ ban đầu của dịch trích ly cũng tương đối, không xảy ra hiện tượng sốc nhiệt, ở 40 độ là nhiệt độ thích hợp xúc tác cho phản ứng co-pigment diễn ra làm gia tăng tính bền màu của Anthocyanin, nhưng khi phản ứng xảy ra đến cực đại, theo thời gian hợp chất này vẫn sẽ bị phân hủy Anthocyanin sẽ tồn tại ở chalcone, làm giảm hàm lượng Anthocyanin. 56
  67. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 12 10 8 6 4 2 0 0h 1h 24h 48h 72h 96h 120h Hàm lượng anthocyanin lượng anthocyanin mg/l Hàm 0oC 20oC 40oC Thời gian bảo quản Hình 3.12. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi hàm lượng của anthocyanin ở các nhiệt độ khác nhau. Anthocyanin là một chất nhạy cảm với nhiệt độ. Từ biểu đồ biến đổi Anthocyanin ở các nhiệt độ cho thấy ở 200C là nhiệt hàm lượng Anthocyanin có thời gian bảo quản lâu nhất sau 120h, hàm lượng vẫn có giá trị tiếp tục tăng. Ở 00C hàm lượng Anthocyanin có thời gian bảo quản ngắn nhất chỉ sau 48h thì hàm lượng giá trị Anthocyanin đã giảm. Ở nhiệt độ 400C thời gian bảo quản cũng tương đối ngắn chỉ sau 96h hàm lượng đã bị giảm mạnh. Ở 200C có thời gian bảo quản tốt bởi vì ở nhiệt độ này có thể thích hợp nhất cho phản ứng co-pigment diễn ra làm bền cấu trúc của Anthocyanin, ở nhiệt độ này Anthocyanin tồn tại ở dạng muối flavylium nhiều nhất. 57
  68. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Ở nhiệt độ 400C thời gian bảo quản ngắn nhất, vì ở nhiệt độ cao Anthocyanin sẽ chuyển về dạng chalcone, đây là sự thoái hóa của Anthocyanin. 3.2.3. Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích ly từ gạo đen Dựng đường chuẩn vitamin C với dung dịch DPPH có các nồng độ: 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75. Từ đó ta xác định % ức chế gốc tự do (%I) theo công thức đã nêu. Kết quả thể hiện ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Giá trị %I à IC50 của vitamin C Nồng độ vitamin C (µg/ml) % Ức chế (%I) IC50 (µg/ml) 1,21 15,29 ± 0,9 2,43 36,03 ± 2,13 6,09 57,67 ± 0,31 5,39 µg/ml 12,09 93,50 ± 0.09 18,29 94,25 ± 0,75 120 y = 6.6828x + 14.001 R² = 0.9724 100 93.5 80 57.67 60 % I I % 36.03 40 15.29 20 0 0.00 5.00 10.00 15.00 Nồng độ mẫu vitamin C (µg/ml) Hình 3.13. Biểu đồ biểu thị sự ức chế gốc tự do của vitamin C 58
  69. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Bảng 3.2. Giá trị %I và kết quả IC50 của dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen trước khi cô quay. Nồng độ dung dịch trích ly % Ức chế (%I) IC50 ( µg/ml) (µg/ml) 22,98 15,04 ± 3,95 27,47 22,34± 0.94 45,95 32,13± 0,85 71,83 µg/ml 64,33 48,88± 4,76 91,90 61,12± 0,53 70.00 y = 0.6624x + 2.4208 60.00 R² = 0.9794 61.12 50.00 48.88 40.00 %I 32.13 30.00 22.34 20.00 15.04 10.00 0.00 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 Nồng độ mẫu trích ly (µg/ml) Hình 3.14. Biểu đồ biểu thị sự ức chế gốc tự do của dung dịch Anthocyanin được trích ly từ gạo đen trước cô quay. 59
  70. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Bảng 3.3. Giá trị %I và kết quả IC50 của dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen sau cô quay. Nồng độ dung dịch trích ly % Ức chế (%I) IC50 ( µg/ml) sau cô quay(µg/ml) 18,29 48,58 ± 0,25 30,49 49.78± 0.14 29,7 µg/ml 42,68 52.33± 0,08 54,87 57,81± 0.08 60.00 58.00 y = 0.2726x + 41.903 56.00 R² = 0.9481 54.00 % I % 52.00 50.00 48.00 46.00 15 25 35 45 55 65 Nồng độ mẫu trích ly sau cô quay (µg/ml) Hình 3.15. Biểu đồ biểu thị sự ức chế gốc tự do của dung dịch Anthocyanin được trích ly từ gạo đen sau cô quay. 60
  71. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Bảng 3.4. So sánh giá trị IC50 của Ascorbic acid và Anthocyanin Mẫu Giá trị IC50 đối với chất chống oxy hóa DPPH Dịch trích ly anthocyanin 71,83 µg/ml từ gạo đen trước cô quay Dịch trích ly anthocyanin 29,7 µg/ml từ gạo đen sau cô quay Vitamin C 5,39 µg/m Hình 3.16. Phản ứng màu của dung dịch DPPH khi cho dịch mẫu trích ly anthocyanin từ gạo đen . Trong thí nghiệm này, giá trị IC50 của dịch trích ly Anthocyanin từ gạo đen là 71,83 µg/ml cao hơn chất chuẩn đối chứng vitamin C (5,39 µg/ml) gấp 13 lần. Cho thấy, khả năng kháng oxy hóa của Anthocyanin ở thí nghiệm này còn thấp. Sau quá trình cô quay nồng độ mẫu được nâng cao, giá trị IC50 của dịch trích ly Anthocyanin sau cô quay là 29,7 µg/ml gấp 5,5 lần so với vitamin C. Trong bài nghiên cứu các hoạt tính chống oxy hóa các loại lúa màu ở miền Bắc Thái Lan của nhóm nghiên cứu Noppawat (2015), đối với gạo Chiang mai Black rice có IC50 đối với vitamin C là 6,61 µg, còn dịch trích ly từ gạo là 6,67 µg. Hoạt tính kháng 61
  72. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà oxy hóa từ dịch trích ly gạo Chiang mai Black rice rất cao, hơn 11 lần so dịch trích ly chưa cô quay và gấp 4,5 lần dịch trích ly đã cô quay. Do hàm lượng Anthocyanin trong dịch trích ly thấp dẫn đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích ly. Cần phải nâng cao hiệu suất trích ly để có hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn. 62
  73. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận a) Trong quá trình nghiên cứu đã xây dựng được quy trình trích ly anthocyanin theo quy trình sau: Gạo đen Nghiền, rây qua lỗ rây kích thước 0,25mm Nhiệt độ 600C Dung môi TLNL:1:8 (w:w) Trích ly Thời gian: 1h30 H O:EtOH 4:6 v:v 2 Lọc Cặn Thu dịch 4000rpm Ly tâm 15 phút Dịch chiết anthocyanin Hình 4.1. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thích hợp để trích ly Anthocyanin từ gạo đen 63
  74. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Đã xác định được các thông số thích hợp cho quá trình trích ly chất màu Anthocyanin nhằm tách chiết tối đa Anthocyanin từ nguyên liệu phù hợp cho mục đích ứng dụng vào thực phẩm: Xác định được tỷ lệ H2O:EtOH pha chế dung môi thích hợp cho quá trình trích ly Anthocyanin là tỷ lệ 4:6 (v:v). Xác định được tỷ lệ nguyên liệu và dung môi cho quá trình trích ly Anthocyanin là tỷ lệ 1:8. Xác định được nhiệt độ cho quá cho quá trình trích ly Anthocyanin là 600. Xác định thời gian thích hợp cho quá trình trích ly Anthocyanin là 1h30. b) Trong quá trình nghiên cứu tính chất của Anthocyanin có một số tính chất sau: Xác định được khả năng bắt gốc tự do DPPH của Anthocyanin trong dung dịch gạo trích ly trước cô quay với giá trị IC50 = 71,83 (µg/ml). Xác định được khả năng bắt gốc tự do DPPH của Anthocyanin trong dung dịch gạo trích ly sau cô quay với giá trị IC50 = 29,7 (µg/ml). Đã xác định được Anthocyanin trong dịch trích ly gạo đen bền ở pH từ 3 đến 5,2 ở thích hợp để bảo dịch trích ly Anthocyanin từ gạo đen. Nhiệt độ trích hợp để bảo quản dịch trích ly Anthocyanin từ gạo đen là 200C, ở nhiệt độ này hàm lượng tăng dần, trong lúc bảo quản Anthocyanin, cấu trúc của Anthocyanin không ổn định, luôn có sự chuyển hóa trong cấu trúc của chúng. c) Đánh giá cảm quan của dịch chiết. 64
  75. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Bảng 4. Đánh giá sơ bộ cảm quan của dịch chiết anthocynin DỊCH CHIẾT MÀU SẮC MÙI TRẠNG THÁI Đỏ tươi Mùi cồn Trong, không bị vẫn nặng đục, không kết cặn Hình 4.1. Dịch chiết Anthocyanin trước cô quay. 65
  76. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Đỏ đậm Mùi cồn nhẹ Hình 4.2. Dịch chiết sau cô đặc. 4.2. Kiến Nghị Trong gạo đen ngoài Anthocyanin còn có những thành phần khác cũng được hòa tan khác như protein hòa tan, một số đường và các hợp chất khác. Những thành phần này ảnh hưởng đến việc xác đinh hàm lượng Anthocyanin nên cần phải loại bỏ chúng, đặc biệt là protein. Cần bảo theo dõi sự biến đổi hàm lượng Anthocyanin ở những pH khác nhau theo thời để xem xét việc bảo quản tốt hơn. Nên kéo dài thời gian bảo quản Anthocyanin ở 200C để xác định thời gian Anthocyanin bị thoái hóa. Cần kết hợp giữa việc bảo quản dịch Anthocyanin ở những pH khác nhau với những nhiệt độ khác nhau trong thời gian kéo dài để xác định được điều kiện tối ưu nhất bảo quản dịch Anthocyanin trích ly từ gạo đen. 66
  77. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Trong dịch trích ly gạo đen có thể nghiên cứu théo hướng làm bột sấy vì trong dịch trích ly ngoài Anthocyanin còn những thành phần quý báu khác có giá trị dinh dưỡng cao. 67
  78. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT. 1. Huỳnh thị Kim Cúc, Lê Văn Hoàng, Lê thị Lệ Hường (2010). Chiết anthocyanin từ quả dâu bằng nước sulfured và một số đặc tính của chúng. Trường CĐ LT – TP và ĐH Đà Nẵng 2. Hoàng Thị Lệ Hằng (2014), Nghiên cứu sử dụng enzyme trong quá trình chuẩn bị dịch lên men lactic từ bột khoai lang tím. 3. Lưu Đàm Cư (2005). Nghiên cứu chiết tách chất nhuộm màu thực phẩm từ kinh nghiệm sử dụng thực vật của đồng bào dân tộc thiểu số. 4. Nguyễn Thị Lan và Lê Thị Lạc Quyên (2004), Nghiên cứu ảnh hưởng của hệ dung môi đến khả năng chiết tách chất màu anthocyanin có độ màu cao từ quả dâu Hội An. Tạp chí khoa học công nghệ, Đại học Đà Nẵng. Số 2 (6)/2009. 5. Nguyễn Thị Thanh Tuyền (2014), Nghiên cứu tách chiết và khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin từ phế phẩm gạo đen. 6. Nguyễn Thọ. Các phương pháp xác định tính chất lý hoá cơ bản của nguyên liệu trong công nghệ thực phẩm. 7. Nguyễn Thị Phương Anh, Nguyễn Thị Lan, (2007). Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến màu của anthocyanin từ bắp cải tím ứng dụng làm chất chỉ thị an toàn trong phân tích thực phẩm và hoá học. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học Đà Nẵng.Số:3(20)/2007. 8. Trần Thị Ánh Ngọc (2011). Nghiên cứu thành phần của chất màu anthocyanin chiết từ khoai lang tím. 68
  79. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà TÀI LIỆU TIẾNG ANH. 1. AOAC (2006). Total Monomeric Anthocyanin Pigment Content of Fruit Juices, Beverages, Natural Colorants, and Wines. AOAC Official Method. 2. Azza A.Abou-Arab, Ferial M.Abu-Salem and Esmat A.bou Arrab (2011). Physico-chemical properties of natural pigments (anthocyanin) extracted from Roselle calyces (Hibiscus subdariffa). Department of food technology, national research centre, Dokki, Cairo, Egypt. 3. Giusti. M. M and Wrolstad, R. E. (2001). Characterization and Measurement of Anthocyanin by UV-Visible Spectroscopy. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 4. John Wiley (2005). Handbook of Food Analytical Chemistry: Pigments, Colorants, Flavors, Texture, anh biocative food components. 5. Nguyen Ngoc Mai Trinh, Nguyen Manh Duc, Phan Van Hung (2014), Antioxidant capacity and amylase inhibitory from fresh asiatic pennywort (Centella asiatica). 6. Oliver-Hoyo, M. Allen, D. Solomon, S. Brook, V. Ciraolo, J. Daly, and Jackson. (2001). Qualitative analysis of fourteen white solids and two mixtures using household chemicals. Journal of chemical education 78, 1475-1478. 7. Rodriguez-Saona, L.E and Wrolstad, R.E (2001). Extraction, Isolation, and Purification of Anthocyanins. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 8. Suhad s. Humadi, viorica istudor (2009). Quantitative analysis of bio- active compounds in hibiscus sabdariffa l. extracts. II. quantitative analysis and biological activities of anthocyanins. 9. S.D.SANJA (2009). Characterization and evaluation of antioxidant activity of portulaca oleracea. 10. Zhaohua Hou (2013). Identification of anthocyanins isolated from black rice (Oryza sativa L.) and their degradation kinetics. 69
  80. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà PHỤ LỤC A PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 1) Phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin tổng trong dịch trích ly Dùng phương pháp phân tích pH vi sai để định lượng Anthocyanin trong dịch trích ly. a. Chuẩn bị dung dịch đệm Dung dịch đệm này để ở nhiệt độ phòng và sử dụng trong vài tháng. Trước khi dùng cần hiệu chỉnh lại cho đúng. Pha buffer pH = 1. Cân 1,86g KCl cho vào becher 1 lít, thêm nước cất để hòa tan KCl. Đo pH và chỉnh về pH 1 bằng HCl đậm đặc 37%. Sau đó chuyển vào bình định mức và định mức bằng nước cất. Pha buffer pH = 4,5. Cân 54,43g CH3COONa.3H2O cho vào becher 1 lít, thêm 960 ml nước cất để hòa tan CH3COONa.3H2O. Đo pH và chỉnh về pH 4,5 bằng HCl đậm đặc (37%). Sau đó cho vào bình định mức và định mức bằng nước cất. b. Chuẩn bị mẫu đo Cho 9 ml dung dịch đệm pH 1 vào ống nghiệm 1, tiếp tục cho 1ml dịch trích ly, lắc đều, để yên 15 phút. Sau đó đem đo quang tại 2 bước sóng λmax = 535 nm và λ = 700 nm. Làm tương tự cho ống nghiệm 2 với 10 ml dung dịch đệm pH 4,5 và 1 ml dịch trích ly. Cho mẫu vào máy đo quang và đọc kết quả. Lưu ý: Thời gian từ lúc chuẩn bị xong mẫu đến lúc đo nên nằm trong khoảng 15 – 60 phút để giảm thiểu sai số. Bởi vì thời gian ổn định quá lâu sẽ có xu hướng tăng chỉ số quan sát (observed readings). 1
  81. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Mẫu đo phải đảm bảo không có sương mù (haze) hay cặn lắng (sediment). Tuy nhiên có thể xuất hiện vài chất keo trong mẫu do sự tán xạ ánh sáng và sự xuất hiện của sương mù. Sự tán xạ ánh sáng cần được hiệu chỉnh bằng các đọc độ hấp thu ở bước sóng 700nm (bước sóng mẫu không hấp thu). Mỗi mẫu nghiên cứu lặp lại 3 lần. Tại pH = 1 các Anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavylium có độ hấp thu cực đại. Tại pH = 4,5 chúng ở dạng carbinol pseudobase không màu. Đo độ hấp thụ cực đại của 2 mẫu ở pH = 1 và pH = 4,5 tại bước sóng của độ hấp thụ cực đại λmax so với độ hấp thụ tại bước sóng λ = 700 nm (độ đục của mẫu). (Suhad s. Humadi1, Viorica Istudor, 2009). Dựa trên công thức của định luật Lambert – Beer: Io Lg = ε x l x C (1) I Trong đó: Io Lg đặc trưng cho mức độ ánh sáng yếu dần khi đi qua dung dịch (mật độ quang, I A). I là cường độ ánh sáng sau khi đi qua dung dịch. Io là cường độ ánh sáng chiếu vào dung dịch. C là nồng độ chất nghiên cứu (mol/l). l là chiều dày của lớp dung dịch mà ánh sáng đi qua, (cm). ε là hệ số hấp thụ phân tử, (mol-1 cm-1); ε = 26900 (L. mol–1. cm–1) Hàm lượng Anthocyanin đơn tử theo công thức: A x MW x DF x 1000 a = (mg/l) (2) ε x l Với: 2
  82. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Mật độ quang hay độ hấp thu của Anthocyanin là: A = (Amax pH1 - A700 pH1) - (Amax pH4,5 - A700 pH4,5) Amax (pH=1): độ hấp thu cực đại tại bước sóng λmax. A700 (pH=4,5): độ hấp thu cực đại tại bước sóng 700 nm. MW: khối lượng phân tử Anthocyanin không kể ion Cl- hay nước tinh thể hóa là 449,2 (g/mol). DF: hệ số pha loãng. Hút 1ml mẫu cho vào 9ml dd đệm DF = 10. V: thể tích Anthocyanin thu được, (lít). Từ đó ta tính được phần trăm hàm lượng Anthocyanin toàn phần: a % Anthocyanin = 100% m x (100-w) x 10-2 a là lượng Anthocyanin tính theo công thức (2), (g) m là khối lượng nguyên liệu ban đầu, (g). w là độ ẩm nguyên liệu, (%). 2) Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxi hóa của dịch chiết Anthocayanin từ gạo đen a. Cách tiến hành Chuẩn bị dung dịch DPPH và Ascorbic acid, dung dịch mẫu nghiên cứu - Dung dịch DPPH: Cân 2,364 mg DPPH định mức bằng methanol thành 1000 μl được dung dịch trữ DPPH 6.000 μM. Lấy 500 μl dung dịch trữ định mức thành 50ml dung dịch DPPH 60 μM (dung dịch làm việc). 3
  83. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà - Dung dịch làm việc của mẫu có nồng độ 50 mg/ml. - Dung dịch Ascorbic acid có các nồng độ 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75 (mg/ml). Chuẩn bị đường chuẩn Ascorbic acid: Đường chuẩn ascorbic acid lập ra cần phải có 1 khoảng đủ rộng để có thể đo được hoạt tính kháng oxi hóa của Anthocyanin. - Dùng micropipet hút 50 μl mỗi nồng độ vào các ống nghiệm đã chứa sẵn 2 ml dung dịch DPPH. - Lắc đều các dung dịch trên. Ủ trong tối 15 phút ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thu ở bước sóng 517 nm. - Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp ( nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên. Kết quả được đánh giá thông qua giá trị IC50 (Inhibitory concentration) là nồng độ chất chống oxy hóa cần để ức chế (trung hòa) 50% gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định. - Mẫu Ascorbic acid được dùng để so sánh thông số giá trị IC50 Quy trình thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH: V1 μl mẫu V2 μl ethanol 50 μl dung dịch mẫu 2 ml DPPH (60 μM) trong methanol Ủ 30 phút trong tối Đo quang tại bước sóng 517 nm Hình 2.6 Sơ đồ quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 4
  84. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 푃푃 − ẫ Phần trăm ức chế (I%) = ( ) ∗ 100% 푃푃 Trong đó: A DPPH là giá trị OD517 nm của dung dịch DPPH ban đầu pha trong methanol. A mẫu là giá trị OD517 nm của dung dịch chuẩn (hoặc dung dịch mẫu). Giá trị IC50 được tính toán dựa theo đường chuẩn y = ax+b theo công thức: 50− X = 3) Phương pháp pha dung dịch pH đệm - Chất rắn pha ra dung dịch CM hay CN theo công thức: ∗ ∗ ∗Đ∗ m = = 10∗푃 10∗푃 - Chất rắn pha ra C% theo công thức: %∗ m = 100∗푃 - Chất rắn ngậm nước ra C% theo công thức: %∗ 100 푛𝑔ậ 푛ướ m = 100 푃 ℎô푛𝑔 푛𝑔ậ 푛ướ - Chất rắn ngậm nước ra CM hay CN theo công thức: 100 푛𝑔ậ 푛ướ m = CM * V * M ngậm nước * ∗ 푃 ℎô푛𝑔 푛𝑔ậ 푛ướ - Thể tích dung dịch đậm đặc cần hút pha ra C% là: 2 2 100 1 - Vđđ = 100 푃 - Thể tích dung dịch đậm đặc cần hút pha ra CM hay CN là: ∗ ∗ ∗Đ∗ Vđđ = = 10∗ ∗푃 10∗ ∗푃 10∗ %∗ - Từ C% đồi ra CM theo công thức: CM = 푛ồ푛𝑔 độ 표 pH thỏa quy tắc pH = pHa + log 푛ồ푛𝑔 độ 𝑖 5
  85. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Bảng 2.6 Cách pha các dung dịch đệm pH từ 1 đến 10 pH KCl CH3COONa.3H2O CH3COOH Na2HPO4 Acid citric HCl Na2B4O7.10H2O 0,2M 0,2M 7,15% 2,1% 0,1N 1,1 Hòa tan 1,86g KCl và chỉnh pH bằng HCl đậm đặc (37%) rồi định mức lên 1000ml 3,0 6ml 94ml 4,5 Hòa tan 54,43g CH3COONa.3H2O và chỉnh pH bằng HCl đậm đặc (37%) rồi định mức lên 1000ml 5,2 79ml 21ml 6,0 95ml 5ml 6,7 77,3ml 22,7ml 7,2 82,4ml 13ml 8,0 Hòa tan 0,28g Na2B4O7.10H2O và chỉnh bằng HCl 0,1N rồi định mức lên 100ml 9,7 Hòa tan 8,4g NaHCO3 và 10,6g Na2CO3 rồi định mức lên 500ml 6
  86. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà PHỤ LỤC B SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM. 1. Thí nghiệm 1 Bảng 1. Giá trị OD cùa thí nghiệm xác định tỉ lệ dung môi H2O:EtOH thích hợp cho việc trích ly anthocyanin từ gạo đen. Hàm pH=1 pH=4.5 Hệ số Hàm lượng % Độ hấp % pha lượng trung Athocyanin thu Athocyanin 535nm 700nm 535nm 700nm loãng mg/L bình trung bình mg/L 0.414 0.280 0.390 0.284 20 0.028 9.35 0.53 0.412 0.280 0.400 0.290 20 0.022 7.35 0.41 0.410 0.281 0.401 0.291 20 0.019 6.35 0.36 0.449 0.281 0.410 0.267 20 0.025 8.35 0.47 0.447 0.275 0.425 0.276 20 0.023 7.68 7.83 0.43 0.44 ± 0.05 0.449 0.286 0.415 0.275 20 0.023 7.68 0.43 0.459 0.266 0.425 0.256 20 0.024 8.02 0.45 0.460 0.260 0.425 0.249 20 0.024 8.02 0.45 0.462 0.278 0.421 0.260 20 0.023 7.68 0.43 0.319 0.180 0.275 0.164 20 0.028 9.35 0.67 0.320 0.179 0.280 0.168 20 0.029 9.69 0.69 0.322 0.181 0.276 0.163 20 0.028 9.35 0.67 0.295 0.171 0.256 0.162 20 0.030 10.02 0.72 0.296 0.175 0.252 0.161 20 0.030 10.02 9.57 0.72 0.68 ± 0.06 0.294 0.173 0.250 0.163 20 0.034 11.36 0.81 0.337 0.193 0.296 0.179 20 0.027 9.02 0.64 0.339 0.190 0.297 0.176 20 0.028 9.35 0.67 0.338 0.192 0.294 0.172 20 0.024 8.02 0.57 0.449 0.280 0.393 0.255 20 0.031 10.35 0.68 0.447 0.268 0.403 0.253 20 0.029 9.69 0.63 0.448 0.270 0.402 0.256 20 0.032 10.69 0.70 0.452 0.250 0.406 0.235 20 0.031 10.35 0.68 0.447 0.248 0.403 0.238 20 0.034 11.36 10.61 0.74 0.69 ± 0.03 0.449 0.245 0.408 0.236 20 0.032 10.69 0.70 0.429 0.250 0.419 0.274 20 0.034 11.36 0.74 0.423 0.255 0.415 0.278 20 0.031 10.35 0.68 0.430 0.253 0.420 0.275 20 0.032 10.69 0.70 0.278 0.124 0.204 0.113 20 0.063 21.04 1.39 19.07 1.26± 0.289 0.132 0.206 0.106 20 0.057 19.04 1.25 7
  87. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 0.290 0.127 0.210 0.102 20 0.055 18.37 1.21 0.280 0.136 0.211 0.124 20 0.057 19.04 1.25 0.283 0.130 0.209 0.119 20 0.063 21.04 1.39 0.276 0.139 0.195 0.115 20 0.057 19.04 1.25 0.273 0.111 0.200 0.096 20 0.058 19.37 1.28 0.276 0.115 0.214 0.102 20 0.049 16.36 1.08 0.280 0.116 0.211 0.102 20 0.055 18.37 1.21 0.084 0.025 0.058 0.025 20 0.026 8.68 0.49 0.083 0.024 0.057 0.027 20 0.029 9.69 0.55 0.080 0.023 0.059 0.026 20 0.024 8.02 0.45 0.111 0.035 0.083 0.028 20 0.021 7.01 0.40 0.105 0.034 0.080 0.031 20 0.022 7.35 7.79 0.42 0.44 ± 0.06 0.112 0.036 0.083 0.032 20 0.025 8.35 0.47 0.097 0.025 0.087 0.035 20 0.020 6.68 0.38 0.099 0.029 0.086 0.038 20 0.022 7.35 0.42 0.100 0.030 0.083 0.034 20 0.021 7.01 0.40 Bảng 2. Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Tỉ lệ H2O:EtOH Count Mean Homogeneous Groups Tỉ lệ H2O:EtOH 9 0.44 X 1:9 Tỉ lệ H2O:EtOH 9 0.442222 X 5:5 Tỉ lệ H2O:EtOH 9 0.684444 X 2:8 Tỉ lệ H2O:EtOH 9 0.694444 X 3:7 Tỉ lệ H2O:EtOH 9 1.25667 X 4:6 2. Thí nghiệm 2 Bảng 3. Giá trị OD cùa thí nghiệm xác định tỉ lệ nguyên liệu thích hợp cho việc trích ly anthocyanin từ gạo đen. 8
  88. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà Hàm pH=1 pH=4.5 Hệ Tỉ lệ Độ Hàm lượng lượng % số % dung hấp anthocyanin trung Athocyanin pha Athocyanin môi 535nm 700nm 535nm 700nm thu mg/L bình trung bình loãng STT mg/L 1 0.510 0.251 0.464 0.262 20 0.057 19.04 0.88 2 0.513 0.253 0.465 0.260 20 0.055 18.37 0.85 3 0.511 0.256 0.466 0.267 20 0.056 18.70 0.86 4 0.508 0.274 0.429 0.250 20 0.055 18.37 0.85 5 1:06 0.513 0.275 0.432 0.252 20 0.058 19.37 18.81 0.89 0.87 ± 0.02 6 0.514 0.281 0.433 0.256 20 0.056 18.70 0.86 7 0.546 0.301 0.471 0.283 20 0.057 19.04 0.88 8 0.550 0.299 0.468 0.271 20 0.054 18.03 0.83 9 0.551 0.300 0.467 0.275 20 0.059 19.70 0.91 1 0.494 0.266 0.392 0.214 20 0.050 16.70 0.99 2 0.493 0.265 0.391 0.213 20 0.050 16.70 0.99 3 0.494 0.267 0.392 0.218 20 0.053 17.70 1.05 4 0.495 0.280 0.409 0.248 20 0.054 18.03 1.07 5 1:08 0.495 0.283 0.408 0.245 20 0.049 16.36 16.88 0.97 1.00 ± 0.04 6 0.497 0.283 0.408 0.242 20 0.048 16.03 0.95 7 0.480 0.271 0.399 0.241 20 0.051 17.03 1.01 8 0.479 0.273 0.387 0.232 20 0.051 17.03 1.01 9 0.482 0.272 0.400 0.239 20 0.049 16.36 0.97 1 0.410 0.220 0.310 0.160 20 0.040 13.36 0.97 2 0.409 0.221 0.309 0.162 20 0.041 13.69 0.99 3 0.413 0.224 0.309 0.161 20 0.041 13.69 0.99 4 0.399 0.173 0.364 0.179 20 0.041 13.69 0.99 5 1:10 0.402 0.181 0.362 0.184 20 0.043 14.36 13.69 1.04 0.99 ± 0.05 6 0.404 0.184 0.365 0.185 20 0.040 13.36 0.97 7 0.420 0.160 0.402 0.181 20 0.039 13.03 0.94 8 0.425 0.169 0.407 0.196 20 0.045 15.03 1.09 9 0.416 0.157 0.409 0.189 20 0.039 13.03 0.94 1 0.284 0.140 0.227 0.119 20 0.036 12.02 1.03 2 0.286 0.143 0.225 0.118 20 0.036 12.02 1.03 1:12 11.50 0.98 ±0.04 3 0.285 0.145 0.228 0.120 20 0.032 10.69 0.91 4 0.295 0.155 0.253 0.147 20 0.034 11.36 0.97 9
  89. Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà 5 0.298 0.157 0.251 0.145 20 0.035 11.69 1.00 6 0.299 0.158 0.250 0.142 20 0.033 11.02 0.94 7 0.324 0.168 0.240 0.120 20 0.036 12.02 1.03 8 0.319 0.159 0.240 0.115 20 0.035 11.69 1.00 9 0.325 0.165 0.245 0.118 20 0.033 11.02 0.94 Bảng 4. Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Tỷ lệ nguyên liệu Count Mean Homogeneous Groups Tỷ lệ nguyên liệu 9 0.867778 X 1:6 Tỷ lệ nguyên liệu 9 0.983333 X 1:12 Tỷ lệ nguyên liệu 9 0.991111 X 1:10 Tỷ lệ nguyên liệu 9 1.00111 X 1:8 3. Thí nghiệm 3 Bảng 5 Giá trị OD cùa thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp cho việc trích ly anthocyanin từ gạo đen. Hàm pH=1 pH=4.5 Hệ Hàm lượng lượng % Nhiệt số Độ hấp % anthocyanin trung Anthocyanin độ pha thu Anthocyanin 535nm 700nm 535nm 700nm mg/L bình TB loãng mg/L 0.630 0.366 0.590 0.359 20 0.033 11.02 0.509 0.642 0.380 0.581 0.349 20 0.030 10.02 0.463 0.643 0.380 0.581 0.354 20 0.036 12.02 0.555 0.530 0.296 0.446 0.244 20 0.032 10.69 0.494 40oC 0.534 0.293 0.449 0.246 20 0.038 12.69 11.24 0.586 0.519 ± 0.04 0.537 0.293 0.455 0.246 20 0.035 11.69 0.540 0.539 0.295 0.473 0.261 20 0.032 10.69 0.494 0.538 0.291 0.475 0.263 20 0.035 11.69 0.540 0.542 0.299 0.476 0.265 20 0.032 10.69 0.494 50oC 0.592 0.320 0.511 0.283 20 0.044 14.70 14.73 0.679 0.680 ± 0.03 10