Đồ án Nghiên cứu quy trình sản xuất natto từ đậu nành Việt Nam

89 trang thiennha21 12/04/2022 10061

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu quy trình sản xuất natto từ đậu nành Việt Nam", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_nghien_cuu_quy_trinh_san_xuat_natto_tu_dau_nanh_viet_n.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu quy trình sản xuất natto từ đậu nành Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN/KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT NATTO TỪ ĐẬU NÀNH VIỆT NAM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: GS.TSKH. NGUYỄN TRỌNG CẨN Sinh viên thực hiện: PHẠM HUỲNH MINH TÂM MSSV: 1151110299 Lớp: 11DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN/KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT NATTO TỪ ĐẬU NÀNH VIỆT NAM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: GS.TSKH. NGUYỄN TRỌNG CẨN Sinh viên thực hiện: PHẠM HUỲNH MINH TÂM MSSV: 1151110299 Lớp: 11DSH02 Giảng viên hướng dẫn (Ký và ghi rõ họ tên) TP. Hồ Chí Minh, 2015
BM05/QT04/ĐT Khoa: Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN/ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP (Phiếu này được dán ở trang đầu tiên của quyển báo cáo ĐA/KLTN) 1. Họ và tên sinh viên được giao đề tài: Phạm Huỳnh Minh Tâm MSSV : 1151110299 Lớp : 11DSH02 Ngành : Công Nghệ Sinh Học Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học 2. Tên đề tài: Nghiên cứu quy trình sản xuất Natto từ đậu nành Việt Nam 3. Các dữ liệu ban đầu: • Quy trình dự kiến cho thí nghiệm • Các tài liệu tham khảo liên quan đến đề tài 4. Các yêu cầu chủ yếu: • Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men • Xây dựng quy trình sản xuất, sản xuất thử và kiểm tra chất lượng sản phẩm • Sơ bộ tính kinh tế 5. Kết quả tối thiểu cần phải có: • Thực hiện các yêu cầu ở mục 4 • Nộp 1 bài khóa luận tốt nghiệp và 1 đĩa CD về văn phòng khoa Ngày giao đề tài: 20/05/2015 Ngày nộp báo cáo: 21/09/2015 TP.HCM, ngày tháng năm 2015 Chủ nhiệm ngành Giảng viên hướng dẫn (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)
LỜI CAM ĐOAN Em cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của em, không sao chép bất kỳ từ nguồn nào khác. Em hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về sự cam đoan này. TP. HCM, Ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực hiện Phạm Huỳnh Minh Tâm
LỜI CẢM ƠN Lời nói đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn tất cả thầy cô và các cán bộ nhân viên Trường Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tận tình quan tâm giảng dạy cho em những kiến thức về ngành công nghệ sinh học. Trường đã tạo mọi điều kiện cho em được học tập trong môi trường nghiêm túc và chuyên nghiệp nhất, điều đó đã giúp em trang bị được nhiều kiến thức chuyên môn để hoàn thành đồ án tốt nghiệp và kết thúc khóa học của bản thân một cách tốt đẹp nhất. Em xin gửi lời cám ơn chân thành nhất đến thầy GS. TSKH, Nguyễn Trọng Cẩn đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn chi tiết cho em những kiến thức và kinh nghiệm trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Bên cạnh đó, em cũng gửi lời cám ơn đến các thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo điệu kiện thuận lợi để em có thể thực hiện công tác nghiên cứu hoàn thiện đồ án tốt nhất. Em cũng muốn gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên đang thực hiện các đồ án tại phòng thí nghiệp của Trường Đại Học Công Nghệ TP.Hồ Chí Minh đã hỗ trợ em thực hiện các đánh giá cảm quan cho đồ án tốt nghiệp của mình. Cuối cùng, em xin gửi lời chúc sức khỏe chân thành nhất đến tất cả mọi người
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH VẼ viii MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Tình hình nghiên cứu 1 3. Mục đích nghiên cứu 1 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 1 5. Phương pháp nghiên cứu 2 6. Kết quả đạt được của đề tài 2 7. Kết cấu của ĐA/KLTN 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN VẬT LIỆU 3 1.1. Tổng quan về Natto 3 1.1.1. Nguồn gốc phát hiện đậu nành lên men Natto 3 1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và lợi ích của Natto 3 1.1.2.1. Giá trị dinh dưỡng của Natto 4 1.1.2.2. Lợi ích của Natto 5 1.1.3. Tình hình sản xuất Natto trên thị trường 12 1.1.4. Giới thiệu sơ nét về quy trình sản xuất truyền thống sản phẩm đậu nành lên men Natto Nhật Bản 14 1.1.5. Bản chất sinh hóa của quá trình lên men Natto 15 1.2. Tổng quan về đậu nành (đậu tương) 15 i
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.1. Nguồn gốc và tình hình sử dụng đậu nành trên thế giới 16 1.2.2. Hình thái và cấu trúc 18 1.2.3. Thành phần các chất dinh dưỡng của đậu nành 18 1.2.3.1. Protein và thành phần acid amin 20 1.2.3.2. Lipid 20 1.2.3.3. Carbohydrate 20 1.2.3.4. Chất khoáng 21 1.2.3.5. Vitamin 21 1.2.3.6. Enzyme 22 1.2.4. Lợi ích từ đậu nành 22 1.2.4.1. Cung cấp protein 22 1.2.4.2. Ngăn chặn ung thư 22 1.2.4.3. Ngăn chặn chứng loãng xương 23 1.2.4.4. Lợi ích trong nông nghiệp 23 1.3. Vi khuẩn lên men Natto 25 1.3.1. Phân loại vi khuẩn 25 1.3.2. Hình dạng vi khuẩn và hình thái khuẩn lạc 25 1.3.3. Đặc điểm sinh lý 26 1.3.4. Ứng dụng 26 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1. Đối tượng 28 2.1.1. Nguyên liệu 28 2.1.2. Thiết bị thí nghiệm 28 2.1.3. Hóa chất 29 2.2. Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1. Phương pháp hóa lý 29 2.2.2. Phương pháp cảm quan 31 ii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu 33 2.3. Xây dựng quy trình sản xuất Natto từ đậu nành Việt Nam dự kiến 34 2.4. Bố trí thí nghiệm 35 2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng dịch lên men giống và thời gian lên men đến quá trình lên men Natto 35 2.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên men đến quá trình lên men Natto 37 2.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến quá trình lên men Natto . 38 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng dịch men giống và thời gian lên men đến quá trình lên men Natto 39 3.1.1. Ảnh hưởng của hàm lượng dịch men giống và thời gian lên men đến hoạt độ của enzyme protease được tạo thành 39 3.1.2. Ảnh hưởng của hàm lượng dịch men giống và thời gian lên men đến điểm cảm quan sản phẩm 42 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men Natto 45 3.2.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme protease được tạo thành 45 3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến điểm cảm quan sản phẩm 46 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men Natto 48 3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme protease được tạo thành 48 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến điểm cảm quan sản phẩm 49 3.4. Xây dựng quy trình sản xuất Natto 50 3.4.1. Sơ đồ quy trình 50 3.4.2. Thuyết minh quy trình 51 iii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.5. Đánh giá chất lượng sản phẩm Natto 53 3.5.1. Chất lượng cảm quan 53 3.5.2. Chất lượng hóa học và vi sinh vật 55 3.6. Sơ bộ tính kinh tế cho sản xuất 1 kg Natto tại phòng thí nghiệm 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 Kết luận 57 Kiến nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 1 A. Nattokinase 1 B. Điểm giống và khác nhau giữa chao và Natto 8 C. Đường chuẩn Tyrozin trong phương pháp Anson cải tiến 9 D. Một số hình ảnh trong lúc nghiên cứu 10 E. Xử lý số liệu bằng Statgraphíc 11 iv
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT NA: Nutrition Agar LB: Luria Bertami v
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng chủ yếu của Natto 4 Bảng 1.2. Thành phần các chất có trong hạt đậu nành (% khối lượng) 18 Bảng 1.3. Hàm lượng dinh dưỡng của hạt đậu nành Việt Nam 19 Bảng 1.4. Thành phần Carbohydrate trong đậu nành 20 Bảng 1.5. Thành phần khoáng trong đậu nành 21 Bảng 1.6. Thành phần vitamin trong đậu nành 21 Bảng 2.1. Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin 31 Bảng 2.2. Các bước chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính 31 Bảng 2.3. Bảng điểm đáng giá cảm quan sản phẩm Natto 32 Bảng 3.1. Hoạt độ protease được tạo thành sau 6h 39 Bảng 3.2. Hoạt độ protease được tạo thành sau 12h 39 Bảng 3.3. Hoạt độ protease được tạo thành sau 18h 40 Bảng 3.4. Hoạt độ protease được tạo thành sau 24h 40 Bảng 3.5. Hoạt độ protease được tạo thành sau 30h 40 Bảng 3.6. Điểm cảm quan của sản phẩm sau 6h 42 Bảng 3.7. Điểm cảm quan của sản phẩm sau 12h 42 Bảng 3.8. Điểm cảm quan của sản phẩm sau 18h 42 Bảng 3.9. Điểm cảm quan của sản phẩm sau 24h 43 Bảng 3.10. Điểm cảm quan của sản phẩm sau 30h 43 Bảng 3.11. Hoạt độ protease được tạo thành ở các pH khác nhau 45 Bảng 3.12. Điểm cảm quan của sản phẩm ở các pH khác nhau 46 Bảng 3.13. Hoạt độ protease được tạo thành ở các nhiệt độ khác nhau 48 vi
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.14. Điểm cảm quan của sản phẩm ở các nhiệt độ khác nhau 49 Bảng 3.15. So sánh cảm quan của Natto sản xuất thử nghiệm và Natto thương phẩm của Nhật Bản. 54 Bảng 3.16. Đánh giá cảm quan sản phẩm Natto hoàn thành của các cảm quan viên 55 Bảng 3.17. Thành phần hóa học và vi sinh vật của sản phẩm 55 Bảng 3.18. Chi phí nguyên liệu sản xuất 1 kg Natto tại phòng thí nghiệm 56 vii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Thành phần dinh dưỡng của Natto 4 Hình 1.2. Công thức hóa học của poly-γ-Glutamic acid trong thành phần Natto . 7 Hình 1.3. Hiệu ứng của Nattokinase lên sợi máu 9 Hình 1.4. Một số sản phẩm trên thị trường từ Natto 12 Hình 1.5. Một số sản phẩm Natto khác trên thị trường 13 Hình 1.6. Natto bọc trong rơm theo phương pháp truyền thống 14 Hình 1.7. Hạt đậu nành 16 Hình 2.1. Men giống Bacillus subtilis Natto sử dụng trong nghiên cứu 28 Hình 2.2. Sở đồ quy trình sản xuất Natto dự kiến 34 Hình 2.3. Sở đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch men giống và thời gian lên men 36 Hình 2.4. Sở đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH 37 Hình 2.5. Sở đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 38 Hình 3.1. Biểu đồ khảo sát sự ảnh hưởng của hàm lượng dịch men giống và thời gian lên men đến hoạt độ enzyme protease được tạo thành khi lên men Natto 41 Hình 3.2. Biểu đồ khảo sát sự ảnh hưởng của hàm lượng dịch men giống và thời gian lên men đến điểm cảm quan của sản phẩm Natto 44 Hình 3.3. Biểu đồ khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ pH đến hoạt độ enzyme protease được tạo thành khi lên men Natto 46 Hình 3.4. Biểu đồ khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ pH đến điểm cảm quan của sản phẩm Natto 47 Hình 3.5. Biểu đồ khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme protease được tạo thành khi lên men Natto 48 viii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.6. Biểu đồ khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến điểm cảm quan của sản phẩm Natto 49 Hình 3.7. Sơ đồ sản xuất Natto 50 Hình 3.8. Natto sản xuất thử nghiệm (hình trái) và Natto thương phẩm của Nhật Bản (hình phải) 54 ix
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Natto (納豆) là một loại thức ăn truyền thống độc đáo của người Nhật Bản được lên men từ đậu nành. Natto ngày càng được sử dụng rộng rãi, phổ biến trên thế giới, đặc biệt là các nước châu Mỹ và châu Âu vì lợi ích to lớn mà nó mang lại mà giá thành lại rẻ và dễ chế biến. Enzyme Nattokinase có trong Natto không nhứng giúp làm tan máu đông mà việc sử dụng sản phẩm Natto còn giúp làm chắc xương, giảm đau khớp, nhức đầu, ngừa bệnh tả, thương hàn, kiết lị do chứa hàm lượng vitamin K cao. Mặt khác Natto còn giúp cải thiện hệ tiêu hóa, ngừa táo bón, ung thư, các bệnh về tim mạch, chống lão hóa và béo phì. Với các tính chất trên và đang có tiềm năng phát triển cao trên thế giới – Natto cần được quan tâm nghiên cứu và phát triển. 2. Tình hình nghiên cứu Natto hiện đang được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới, nhưng vẫn còn rất mới lạ với số đông người tiêu dùng ở Việt Nam. Hiện nay trên thị trường Việt Nam, người tiêu dùng chỉ có thể mua Natto nhập khẩu từ Nhật Bản tại các siêu thị hoặc các nhà hàng Nhật Bản với giá khá cao. 3. Mục đích nghiên cứu Để góp phần phổ biến rộng rãi sản phẩm Natto đến với người tiêu dùng Việt Nam cũng như hạ giá thành sản phẩm, người thực hiện đề tài đã chọn “Nghiên cứu quy trình sản xuất Natto từ đậu nành Việt Nam”. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Natto sẽ được lên men ở quy mô phòng thí nghiệm với trọng tâm là tìm ra điều kiện lên men tiêu chuẩn cho sản phẩm. Trên cơ sở đó, đề tài nghiên cứu các vấn đề sau: 1
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch men giống đến quá trình lên men - Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men - Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men - Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men - Đánh giá cảm quan 5. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp hóa lý - Phương pháp cảm quan - Phương pháp xử lý số liệu 6. Các kết quả đạt được của đề tài Khảo sát và chọn được những thông số tối ưu cho quy trình sản xuất Natto từ đậu nành Việt Nam. Thành phẩm tạo thành đạt được điểm cảm quang tương đối tốt về mùi vị, màu sắc và trạng thái. 7. Kết cấu của ĐA/KLTN Đồ án tốt nghiệp gồm: Mở đầu Chương 1: Tổng quan về nguyên vật liệu Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận Kết luận và kiến nghị Do đồ án thực hiện trong thời gian ngắn và phương tiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm còn nhiều thiếu thốn, bên cạnh đó người thực hiện đề tài mới làm quen với công tác khoa học nên kinh nghiệm bản thân còn hạn chế, vì vậy mà đồ án tốt nghiệp còn nhiều sai sót. Rất mong quý thầy cô thông cảm và cho ý kiến đề đồ án được hoàn thiện hơn. 2
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN VẬT LIỆU 1.1. Tổng quan về Natto 1.1.1. Nguồn gốc phát hiện đậu nành lên men Natto [25] Cho tới nay chưa rõ nguồn gốc của Natto từ đâu vì các sản phẩm tương tự Natto cũng có mặt từ rất lâu ở các nước Nam Á. Nhưng tại Nhật có một số vùng ở Đông Bắc Nhật Bản quận Akita được cho là quê hương của Natto. Một truyền thuyết ở Nhật bản kể rằng tướng Minamoto Yoshiie trong trận chiến vào những năm 1083 ở miền Đông Bắc đã phát hiện ra Natto. Một ngày nọ thì doanh trại của Yoshiie bất ngờ bị quân địch tập kích trong khi binh sĩ đang nấu đậu nành làm thức ăn cho ngựa. Trong cơn hỗn loạn thì người ta đã vội vàng cho đậu nành đang nấu dở vào những cái túi rơm và không mở trong suốt mấy ngày liền. Khi mở ra thì đậu đã lên men và sinh mùi kỳ lạ. Một người lính ăn thử thấy rất ngon mới trình lên tướng Yoshiie và vị tướng cũng bị cái mùi vị kỳ lạ kia quyến rũ. Người ta cho rằng đến thời Edo (1603 - 1867) thì Natto đã trở thành món ăn hàng ngày trong bữa ăn của người Nhật và cách chế biến được thay đổi nhiều trong thời Taisho (1912 - 1926) khi những nhà nghiên cứu tìm được cách chiết xuất vi khuẩn Nattokinase mà không cần đến rơm. Phát hiện này đã đơn giản hóa quá trình sản xuất Natto và đạt hiệu quả cao hơn và ngành sản xuẩt món ăn này đã thay đổi nhiều từ đó. Tuy nhiên trong hội chợ đậu nành quốc tế được tổ chức ở Akita (Nhật Bản) năm 1993 rất nhiều sản phẩm tương tự Natto đã được trưng bày có nguồn gốc từ nhiều nước như Nepan, Thái Lan, Indonesia và Nigeria [13]. 1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và lợi ích của Natto Hiệu quả của Natto một phần là do nó được làm từ đậu nành. Ngoài ra trong quá trình lên men, Bacillus subtilis Natto sản xuất ra nhiều loại enzyme, vitamin, axit amin và các chất dinh dưỡng độc đáo khác. Những chất này làm cho Natto trở thành một loại thực phẩm bổ dưỡng, có lợi cho sức khoẻ và độc đáo. Đáng chú ý trong số đó là Nattokinase và Pyrazine có tác dụng ngăn chặn và điều trị bệnh tắc nghẽn 3
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP mạch máu. Natto cũng cung cấp vitamin B12 thường có xu hướng thiếu ở những người ăn kiêng và được coi là pho mát thực vật. 1.1.2.1 Giá trị dinh dưỡng của Natto Thành phần chủ yếu của Natto (tính cho một đơn vị sản phẩm khối lượng 175 g) bao gồm: Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng chủ yếu của Natto [29] Thành phần Khối lượng (g) Tổng lượng chất béo 19 Cholesterol 0 Nattokinase 12 Tổng lượng carbohydrates 25 Protein 31 Hình 1.1. Thành phần dinh dưỡng của Natto 4
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.2.2 Lợi ích của Natto • Ngăn chặn bệnh ung thư [28] [15] Tác dụng ngăn chặn ung thư của Natto một phần là do những chất có sẵn trong thành phần của đậu nành và không bị thuỷ phân trong quá trình hoạt động của vi sinh vật. Đó là các hợp chất Isoflavone như Genestein, Daidzein. Thêm vào đó, đậu nành còn chứa Selenium là một chất khoáng có khả năng ngăn chặn ung thư. Những protein dạng sợi trong đậu nành cũng góp phần làm sạch đường ruột và nhờ đó nó có hiệu quả trong việc ngăn chặn ung thư ruột già. Một lượng lớn Cenlulase tồn tại trong đậu nành lên men tổ hợp với oligosaccharit mà vi khuẩn Bacillus subtilis Natto tạo thành protein dạng sợi cũng giúp giải phóng các chất thải và các chất sinh ung thư. Thông thường 100 g Natto chứa 7 g protein dạng sợi. Ngoài ra, vi khuẩn Bacillus subtilis Natto tự bản thân chúng cũng có hiệu quả ngăn chặn ung thư nhờ tác dụng kháng lại các chất sinh ung thư. Theo tờ Thể thao hàng ngày số ra ngày 25 tháng 9 năm 1996 “Một nghiên cứu tiến hành trên chuột do giáo sư Yukio Kameda tại đại học Kanazawa đã cho thấy chuột được cấy tế bào gây ung thư sau đó được tiêm vi khuẩn phân lập từ Natto hoàn toàn không có sự phát triển của các tế bào ung thư hoặc có tốc độ phát triển tế bào ung thư chậm hơn với chuột không được tiêm”. Những kết quả trên cho thấy nếu ăn các sản phẩm từ đậu nành, đặc biệt là Natto, thường xuyên sẽ rất có hiệu quả trong việc ngăn chặn nhiều căn bệnh ung thư. Theo bác sĩ Dean Ornish, giám đốc Viện nghiên cứu Y học Sausalito, California thì số trường hợp ung thư tuyến tiền liệt ở đàn ông Nhật Bản chỉ bằng 1/4 ở Mỹ. Tuy nhiên những người Nhật di cư tới Mỹ thì số trường hợp ung thư đột ngột tăng. Lý do là được giải thích là do người Nhật ăn nhiều các sản phẩm có nguồn thực vật hơn đặc biệt là nhiều các loại thực phẩm truyền thống của Nhật làm từ đậu nành. Một báo cáo khác của bác sĩ Amy S. Lee Đại học Miền nam Califonia cũng cho rằng sự tồn tại của một loại Isoflavone được gọi là Genistein làm giảm sự phát triển của các tế bào ung thư của chuột. Ông nói rằng Châu Á tiêu thụ lượng đậu nành nhiều gấp 20 - 30 lần Châu Mỹ. Và đây có thể là lí do giải thích cho tỉ lệ mắc các 5
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP chứng ung thư ở đây thấp hơn ở Châu Mỹ. Trung tâm nghiên cứu ung thư tại Hawai năm 1997 đã báo cáo rằng Genisteinm, Daidzein và các loại Isoflavone khác tồn tại trong đậu nành cũng có hiệu quả trong ngăn chặn ung thư tử cung, ung thư vú và ung thư thận. Theo bác sĩ Cathy Read, Tổ chức ngăn chặn bệnh dịch tại London, 1995: “Khoa học đã chỉ rõ hiệu quả bảo vệ của chế độ ăn kiêng sử dụng nhiều protein đậu nành là một phần lí do giải thích tại sao phụ nữ ở Trung Quốc và Nhật Bản lại có tỉ lệ ung thư vú thấp hơn”. Theo nghiên cứu về ung thư ruột kết tại Khoa y tế Trường đại học Havard, cho thấy: Ăn đậu phụ có thể giảm được một nửa nguy cơ ung thư ruột kết [15]. Một nghiên cứu khác tại Nhật được thực hiện năm 1984 cũng kết luận: Thực phẩm từ đậu nành có thể giảm tới 80% nguy cơ ung thư trực tràng và tới 40% ung thư ruột kết. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ ăn kiêng đến bệnh ung thư vú ở Singapore năm 1991 người ta thấy rằng: “Phụ nữ ăn nhiều các sản phẩm từ đậu nành giảm một nửa nguy cơ mắc bệnh ung thư vú so với những người phụ nữ sử dụng ít các sản phẩm đậu nành hơn. Bệnh ung thư vú thấp nhất được tìm thấy ở những phụ nữ sử dụng 55 g đậu nành/ngày, lượng này tương đương với 2 suất đậu nành/ngày”. Cũng qua nghiên cứu ở 8000 đàn ông, người ta thấy rằng những người ăn đậu phụ một lần/tuần hoặc ít hơn có nguy cơ mắc ung thư tiền liệt tuyến nhiều gấp 3 lần so với những người ăn đậu phụ hàng ngày [15]. Genistein là một chất ức chế đặc hiệu của enzyme tyrozin kinase, topoisomerase II và protein histidin kinase. Histidin kinase điều khiển hoạt động của các thụ thể tế bào biểu bì và các yếu tố sinh trưởng thực bào đơn nhân. Tyrozin kinase cũng kết hợp với sản phẩm gen đột biến gây ung thư và có thể có ảnh hưởng lên sự phát triển của tế bào thông qua các cơ chế ngăn chặn. • Ngăn chặn chứng loãng xương Tác dụng ngăn chặn chứng loãng xương của Natto là tổng hoà của nhiều yếu tố. Thứ nhất đó là do ảnh hưởng các hợp chất Isoflavone có sẵn trong đậu nành. Bên cạnh đó trong quá trình lên men đậu nành vi khuẩn Bacillus subtilis Natto cũng tạo 6
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ra các thành phần có ảnh hưởng tích cực trong việc tăng khả năng hấp thụ Ca cho cơ thể như vitamin K2, axit glutamic. Xương được cấu thành bởi axit γ-glutamic kết hợp với Ca. Vitamin K đóng vai trò trung gian trong tổ hợp đó, giúp cho sự tạo thành xương. Vitamin K tồn tại trong tự nhiên ở 2 dạng K1 và K2. Vitamin K1 có trong rong biển, gan và các loại rau. Vitamin K2 có trong các sản phẩm lên men như pho mát hoặc đậu nành lên men trong đó Natto được xác định là có số lượng đáng ngạc nhiên là 870 micrograms vitamin K2 trong 100 g Natto. Một nghiên cứu đã cho kết quả là mức độ vitamin K2 ở những người bị bệnh loãng xương thì thấp hơn ở những người không mắc bệnh này mặc dù mức vitamin K1 ở hai nhóm người này như nhau. kết quả này cho thấy vai trò quan trọng của vitamin K2 trong việc ngăn ngừa bệnh loãng xương. Một nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng axit polyglutamic, một axit tồn tại ở phần nhầy của Natto được tạo ra trong quá trình lên men, cũng làm tăng khả năng hấp thụ Ca của hệ tiêu hoá [15]. Hình 1.2. Công thức hóa học của poly-γ-Glutamic acid trong thành phần Natto • Ngăn chặn bệnh đau tim, đột quỵ và tình trạng suy nhược cơ thể Trong thành phần của Natto có Pyrazine là một enzyme ngăn chặn hiện tượng đông máu. Còn một enzyme khác là Nattokinase được bác sĩ Dr.Hiroyuki Sumi khám phá ra trong quá trình nghiên cứu năm 1990 tại đại học Chicago. Enzyme Nattokinase là một tác nhân có thể làm tan cục máu đông rất tốt. Các cục máu đông làm tắc nghẽn mạch máu, dẫn đến đau tim, đột quỵ và các bệnh có liên quan khác. 7
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Có báo cáo cho rằng có tới 60% trong số nguyên nhân ra tình trạng lão suy là do các cục máu đông có trong não. Natto có 2 enzyme hữu ích, một loại ngăn chặn sự đông máu và một loại làm tan cục máu đông một khi nó được tạo thành, trong việc ngăn chặn các bệnh tim mạch. Trong khi enzyme Urokinase, một loại enzyme chiết xuất từ Urine được dùng làm thuốc chữa bệnh giá trị là 1500 USD/một liều lại chỉ có tác dụng trong 30 phút thì chỉ 100 g Natto cũng có hiệu quả tương tự chỉ với giá 1 USD, và khi vào cơ thể nó lại tác dụng kéo dài có thể lên tới 8 giờ. Một số các bác sĩ ở Nhật cho rằng những người bị bệnh hoặc có nguy cơ mắc bệnh tim nên sử dụng Natto 2 lần/tuần. Ăn Natto cũng giúp cho việc giảm cholesterol trong máu. Trung tâm y tế đại học Y khoa Gifu đã thực hiện một nghiên cứu trên 1242 đàn ông và 3596 phụ nữ và kết quả cho thấy là với những người ăn nhiều Natto hơn thì mức độ cholesterol thấp hơn [28]. Natto đã là thức ăn chủ yếu trong chế độ ăn kiêng của người Nhật trong một thời gian dài gần 1000 năm. Nó đặc biệt phổ biến trong cư dân sống ở phía đông Nhật Bản. Gần đây lượng tiêu thụ Natto tính trên một đầu người mỗi năm là 2 kg. Cho đến nay chưa có nghiên cứu nào cho thấy Natto có những hiệu ứng phụ bất lợi. Nó cũng được biết là không gây ra dị ứng đối với người tiêu dùng. Ở Nhật một số các bác sĩ bắt đầu sử dụng Natto như một loại thuốc trong quy mô thí nghiệm. Một vài bệnh nhân bị bệnh các tĩnh mạch võng mạc mắt bị cô lập do các cục máu xuất hiện trong tĩnh mạch võng mạc làm ngăn cản máu đến mắt đã được điều trị bằng cách ăn Natto 2 lần một tuần và đã có kết quả rõ ràng [28]. Trong đậu nành có chứa nhiều lecithin và linoleic, hai axit này có tác dụng loại bỏ cặn bẩn cho dòng máu. Protein trong đậu nành giúp đảm bảo tính đàn hồi của mạch máu, ngăn chặn bệnh tắc nghẽn động mạch vành, vỡ động mạch ở não và chứng huyết áp cao. Do đó nếu ăn nhiều Natto những căn bệnh thường mắc phải ở những người trưởng thành có thể được ngăn chặn hoặc cải thiện. Nghiên cứu thực hiện năm 1989 của trường đại học Harvard trên 20.000 đàn ông Mỹ chỉ ra rằng sử dụng aspirin hàng ngày lảm giảm chứng suy tim do xuất hiện cục 8
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP máu đông 44%. Aspirin có xu hướng làm máu dễ tan, và nó được biết là nguyên nhân gây ra bệnh chảy máu dạ dày. Tuy nhiên nghiên cứu gầy đây cho rằng ăn các sản phẩm đậu nành mỗi ngày cũng có hiệu quả tương tự mà lại không gây ra tác dụng phụ [15]. Tuy nhiên do Nattokinase nhạy cảm với nhiệt độ và mất hiệu quả của ở 700C nên cách tốt nhất để Natto phát huy tác dụng hiệu quả là ăn không cần đun chín [28]. Hình 1.3. Hiệu ứng của Nattokinase lên sợi máu • Tác dụng kháng khuẩn Vi khuẩn Natto có hiệu quả kháng khuẩn với các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn gây bệnh thương hàn và vi khuẩn gây ra bệnh Hamburger. Theo nghiên cứu của một số nhà khoa học Nhật Bản thì axit Dipicolinic chính là tác nhân kháng khuẩn mà vi khuẩn Bacillus subtilis Natto tạo ra. Trong một kiểm tra thực hiện bởi Khoa nghiên cứu sức khoẻ cộng đồng Nagano số lượng vi khuẩn E.coli 0-157 đã giảm mạnh khi cho dịch chiết vi khuẩn Natto bổ sung vào môi trường. 9
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trước đây khi chưa có các chất kháng sinh, tại Nhật Natto được dùng như một loại thuốc chống lại các căn bệnh như bệnh lỵ, sốt rét và các bệnh đường ruột khác. Năm 1936 tại Nhật, có một thí nghiệm được thực hiện về hiệu ứng kháng sinh của Natto. Kết quả cho thấy Natto có thể hạn chế sự tiết các vi khuẩn gây bệnh sốt rét kí sinh trong một thời gian ngắn với bệnh nhân không có hiệu quả sau 5 tháng điều trị. Một nghiên cứu tại Nhật trên họ vi khuẩn Bacillus tìm ra rằng các vi khuẩn này có khả năng tạo ra một số chất kháng sinh như bacitracin, polymyxin và urethin. Bào tử của vi khuẩn Natto trong đường ruột có thể gây ức chế đối với các vi khuẩn Samonella [28]. • Cải thiện khả năng tiêu hóa và ngăn chặn sự rối loạn trong ruột Trong điều kiện thuận lợi vi khuẩn Natto có thể tăng sinh gấp đôi sau 30 phút và tạo nhiều enzyme có tác dụng trợ giúp cho sự tiêu hóa của đường ruột. Điều này giúp các thành phần dinh dưỡng trong đậu nành vốn khó được tiêu thụ ở người có thể được hấp thụ dễ dàng khi ta ăn Natto. Những enzyme này bao gồm: Protease chuyển hoá protein thành axit amin; amylase chuyển hóa cacbonhydrate phức tạp thành các đường glucose; lipase cắt các chất béo bão hoà thành glyxerin và axit béo; cenlulase phân cắt cenlulose thành cacbonhydrate đơn giản hơn; các enzyme khác như urease, peroxidase, catalase và pectinase. Hầu hêt các vi khuẩn có lợi cho tiêu hoá thì bi giết chết trong dạ dày do axit trước khi vào ruột, nhưng vi khuẩn Natto thì có thể sống sót, phát triển và trợ giúp cho quá trình tiêu hoá [28]. • Ngăn chặn sự lão hoá và béo phì Lecithin đóng vai như là chất hoạt động bề mặt. Nó được tìm thấy với số lượng lớn trong các sản phẩm làm đẹp. Nó làm cân bằng nước và chất béo trong tế bào da và trên bề mặt da. Người ta cho rằng phụ nữ Nhật có làn da nhẵn, mịn hơn phụ nữ Châu Âu và Châu Phi do họ sử dụng nhiều sản phẩm đậu nành mà các thực phẩm này lại chứa nhiều lecithin. Đậu nành chứa 18% chất béo, trong đó 85% là chất béo 10
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP chưa bão hoà bao gồm axit linoleic và axit linolenic. Hai axit béo này có tác dụng tương tự như lecithin, do đó người ta cho rằng đậu nành ngăn chặn sự già hoá của mạch máu và kéo dài tuổi thọ của chúng. Lecithin cũng ngăn chặn huyết áp cao gây ra do bệnh xơ cứng động mạch và sự trì trệ gây ra do giản chất béo trong cơ thể. Lecithin còn có tác dụng mạnh mẽ trong việc chuyển thành dạng sữa các cholesterol dư thừa trong máu và giúp cơ thể loại những cục máu đông khỏi cơ thể. Natto giàu vitamin đặc biệt là vitamin E, một chất chống oxy hóa và tăng cường tuần hoàn máu giúp ngăn chặn những tác hại từ bên ngoài và giữ cho làn da trẻ trung [28]. • Giúp phát triển trí não Kẽm là thành phần chủ chốt trong số các vitamin cần thiết cho sự sống. Nguyên tố này được gọi là khoáng chất thông minh do nó là thành phần cần thiết cho sự phát triển của não bộ và hệ thần kinh. Nó đóng vai trò quan trọng trong sự tổng hợp protein và tạo collagen. Nguyên tố này cũng cần thiết trong cơ chế điều hoà đường huyết và do đó có tác dụng trong việc bảo vệ cơ thể khỏi căn bệnh đái tháo đường, một căn bệnh đang ngày càng xuất hiện nhiều trên thế giới khi mà điều kiện sống ngày càng cao, gây ra nhiều tác dụng nguy hiểm và khoa học hiện nay chưa có thuốc chữa. Các nghiên cứu đã cho thấy kẽm đóng vai trò quan trọng trong sự truyền các xung thần kinh giữa các tế bào não. Sự thiếu hụt kẽm trong quá trình mang thai và quá trình tiết sữa đã được nhận thấy là có liên quan tới nhiều khác biệt bẩm sinh trong hệ thần kinh của đứa trẻ. Sự thiếu hụt kẽm gây cho trẻ sự yếu kếm trong học tập, tính lãnh cảm, tính thờ ơ và sự chậm phát triển trí tuệ. Đậu nành là loại thực phẩm có hàm lượng kẽm cao nhưng lượng kẽm này lại khó được hấp thu vào cơ thể do tác dụng của các chất ức chế enzyme tripsin cũng tồn tại trong đậu nành. Nhưng trong quá trình hoạt động của mình các vi khuẩn Natto đã loại bỏ gần như hoàn toàn các chất ức chế này [14] [15]. 11
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.3. Tình hình sản xuất sản phẩm Natto trên thị trường[10] Mỗi năm ở Nhật người ta tiêu thụ khoảng 50,000 tấn Natto. Thành phố Kumamoto và Mito ở Nhật Bản là hai nơi nổi tiếng về chất lượng Natto. Ngày nay người ta sản xuất Natto hàng loạt đựng trong những hộp nhựa và thường bán kèm với một gói nhỏ nước chấm Shoyu và mù tạt vàng. Mọi người có thể mua Natto nhập từ Nhật ở các cửa hàng thực phẩm Nhật trên trên khắp thế giới với giá khoảng 3 - 5 USD cho một hộp Natto. Thường thì Natto nhập luôn được làm đông và cần phải rã đông trước khi dùng. Hình 1.4. Một số sản phẩm trên thị trường từ Natto Ở Việt Nam, Natto hầu như chưa nhận được sự quan tâm của người dân, rất ít người biết đến và có thể ăn được Natto. Ở các nhà hàng Nhật trên nước ta, giá của một phần cơm trắng với Natto và một chén súp Miso có giá khá cao (khoảng 80.000 đồng). Với giá bình dân hơn, ông Eda Kaname định cư trên đường Lê Thánh Tôn bán một hộp Natto 50 g với giá 50.000 đồng. Ông lập gia đình ở Việt Nam và chuyên làm Natto theo phương pháp cổ truyền và là nhà cung cấp Natto chính cho các quán ăn Nhật ở Sài Gòn. Các quán ăn trên đường Bùi Viện cũng bán cơm phần với Natto có giá khoảng 30.000 đồng/phần Với nhiều lợi ích khác nhau, Natto đang được sự quan tâm trên toàn thế giới, đặc biệt là Mỹ. Natto có mặt trong tất cả các cửa hàng bách hóa với nhiều dạng mặt 12
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP hàng khác nhau, đa dạng. Thị trường Natto: 193 tỉ Yen tương đương khoảng 40 nghìn tỉ đồng. Hình 1.5. Một số sản phẩm Natto khác trên thị trường 13
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.4. Giới thiệu sơ nét về quy trình sản xuất truyền thống sản phẩm đậu nành lên men Natto Nhật Bản[23] Để làm Natto người ta chọn hạt đậu nành nhỏ để quá trình lên men dễ dàng hơn. Đậu nành được rửa rồi ngâm trong nước khoảng 12 - 24h và quá trình này sẽ làm tăng kích thước của hạt đậu. Sau đó đậu nành được đem đi hấp mềm khoảng 6 tiếng, có thể dùng nồi áp suất để giảm bớt thời gian. Cuối cùng đậu nành được trộn với dung dịch men Natto. Những nhà sản xuất khác nhau có thể sẽ thêm bớt những thành phần khác nhau để tạo nên hương vị đặc trưng. Và kể từ lúc này thì người ta sẽ phải rất cẩn thận, tránh không cho vi khuẩn có hại xâm nhập. Theo những người có kinh nghiệm thì nếu thấy đậu đổi màu vàng thì là loại hảo hạng, còn màu đen là loại xấu nhất. Ngoài ra còn có nhiều loại vi khuẩn khác cho ra màu sắc của tương khác nhau và chất lượng cũng phụ thuộc vào đó. Hỗn hợp đậu nành và men được ủ ở 40oC trong hơn một ngày, sau đó nó được làm lạnh và cho vào tủ lạnh chừng một tuần để Natto sản sinh ra những sợi nhớt. Ngày xưa thì người ta đựng đậu nành đã hấp trong những cái giỏ bằng rơm rạ, đây là nguồn cung cấp vi khuẩn Natto tự nhiên. Rồi Natto được hình thành khi gặp điều kiện nhiệt độ thuận lợi như trong lòng đất hay gần ngọn lửa. Hình 1.6. Natto bọc trong rơm theo phương pháp truyền thống 14
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.5. Bản chất sinh hóa của quá trình lên men Natto - Quá trình lên men chính: đậu nành sau khi luộc chín sẽ được bổ sung giống vi khuẩn Bacillus subtilis Natto và được ủ ở nhiệt độ 400C trong vòng 20 - 24h. Trong quá trình này, Bacillus subtilis Natto tiết ra các enzyme protease, amylase, urease, lipase, cellulase, pectinase thuỷ phân các hợp chất phức tạp có trong đậu nành thành các đơn phân đơn giản. Lúc này, pH trong sản phẩm Natto giảm, các amino acid liên kết với nhau hình thành hệ gel. Đến khi protein bị thuỷ phân hết thì amino acid bị amôn hoá hình thành amoniac sẽ kết hợp với mùi các hớp chất khác tạo nên mùi đặc trưng cho sản phẩm. Amoniac càng sinh ra nhiều thì giá trị dinh dưỡng của Natto càng giảm nên chúng ta nên dừng quá trình lên men khi lượng amoniac sinh ra là thấp nhất. Vị ngọt trong sản phẩm Natto là do đường đơn thuỷ phân từ tinh bột. - Quá trình lên men phụ: Ủ lạnh sản phẩm ở 40C sau khi lên men trong 24h để điều vị, kích thích quá trình kéo sợi protein làm tăng độ nhớt. Sau quá trình này, có thể bảo quản lạnh đông để kéo dài thời gian sử dụng của sản phẩm lên men. 1.2. Tổng quan về đậu nành (đậu tương) [24] Nguyên liệu chủ yếu dùng trong lên men tạo Natto là hạt đậu nành. Giới Plantae Ngành Magnoliophyta Lớp Magnoliopsida Bộ Fabales Họ Fabaceae Chi Glycine Loài G. max 15
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đậu nành hay còn gọi là đậu tương, tên khoa học Glycinen Max là loại ngũ cốc giàu protein, lipid, glucid, vitamin và muối khoáng, có đặc tính sinh học do chứa hầu hết các acid amin không thay thế và còn hỗ trợ khi thiếu thức ăn động vật. Vì thế đậu nành là loại ngũ cốc quan trọng trong ngành lương thực thực phẩm thế giới. Tại Việt Nam, đậu nành được trồng nhiều ở miền núi, vùng trung du phía Bắc (Cao Bằng, Sơn La, Bắc Giang) chiếm hơn 40% diện tích đậu nành cả nước. Ngoài ra còn trồng ở các tính Hà Tây, Đồng Nai, Đăklăk. Theo thống kê mỗi năm nước ta trồng khoảng 200.000 ha đậu nành, chủ yếu là vụ đông, sản lượng khoảng 300.000 tấn/năm. Tuy vậy nhu cầu này mới đáp ứng được khoảng 25% nhu cầu trong nước và nhu cầu này tăng khoảng 10%/năm Hình 1.7. Hạt đậu nành 1.2.1. Nguồn gốc và tình hình sử dụng đậu nành trên thế giới [17] Đậu nành là loại ngũ cốc có hàm lượng protein rất cao. Chúng có nguồn gốc từ Châu Á và được sử dụng rộng rãi trên thế giới trong rất nhiều loại thực phẩm. Từ ngàn đời nay cư dân các nước Châu Á đặc biệt là Trung Quốc và Nhật Bản đã sử dụng rất nhiều các sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ đậu nành. Các sản phẩm này được ưa thích và sử dụng phổ biến do hàm lượng protein cao, giá thành rẻ, sẵn có và có tác dụng duy trì sức khoẻ cho người tiêu dùng. Trong vài thập kỉ trở lại đây những các nhà khoa học Phương Tây đang cố gắng để tìm hiểu tại sao người 16
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phương Đông lại ít gặp vấn để với các căn bệnh ung thư như ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư ruột kết, ung thư trực tràng, bệnh loãng xương, các bệnh tắc nghẽn mạch máu. Sau nhiều nghiên cứu, các kết quả cho thấy khoa học đã chứng minh được các tác dụng này của đậu nành có đựơc là do trong thành phần của đậu nành và các sản phẩm của chúng có chứa một số chất hoá học, vitamin và các chất có hoạt tính sinh học hữu ích. Tuy có nguồn gốc từ các nước Châu Á nhưng 45% diện tích sản xuất tương ứng với 55% sản lượng đậu nành trên thế giới được sản xuất tại Mỹ với sản lượng 75 triệu tấn (năm 2000). Ngoài Mỹ, các nước sản xuất đậu nành lớn trên thế giới bao gồm Brazil, Argentina, Trung Quốc và Ấn Độ. Hiện nay sản lượng sản xuất đậu nành ngày càng tăng do đây là nguồn protein thực vật vô cùng quan trọng đối với cuộc sống của con người. Chúng được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm, là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất dầu nành, thức ăn cho động vật, chế biến các sản phẩm sữa thực vật, nguồn cung cấp nhiên liệu sinh học Đậu nành là loại hạt có hàm lượng protein cao nhất trong các loại thực vật với hàm lượng hơn 30%. Ngoài ra nó còn chứa nhiều axit amin cần thiết cũng như các vitamin và khoáng chất. Các sản phẩm từ đậu nành do đó là nguồn thực phẩm quan trọng trong đời sống nhất là với dân cư Châu Á. Trải qua hàng nghìn năm sử dụng con người ta đã phát minh ra rất nhiều cách chế biến đậu nành. Nhờ đó mà ngày nay chúng ta có được một số lượng phong phú các sản phẩm từ đậu nành. Các sản phẩm truyền thống bao gồm bột đậu nành, sữa đậu, đậu phụ; Các sản phẩm đậu nành lên men như Thua nao (Thái Lan), Kinema (Ấn Độ, Nêpal), Natto, tempeh, shoyu, miso (Nhật), Đậu phụ lên men (Trung Quốc), Chao (Việt Nam); Các sản phẩm mới là đậu nành được tách chiết thu protein, có hàm lượng protein cao, là nguyên liệu để tạo thành các sản phẩm giả thịt, cung cấp protein phục vụ cho những người ăn chay với số lượng ngày càng tăng trên thế giới. Dầu thực vật cũng là một sản phẩm được tách chiết từ đậu nành nhờ hàm lượng lipid rất cao. Đậu nành cũng là nguồn cung cấp dầu thực vật dồi dào do sản lượng đậu nành sản xuất hàng năm trên thế giới là rất lớn. Từ đậu nành người ta còn sản xuất sữa đậu nành, một loại sữa thực vật giúp 17
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP giảm hàm lượng cholesterol cho người sử dụng và đang ngày càng phổ biến. Công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc cũng sử dụng đậu nành làm nguyên liệu do giá thành và chất lượng hợp lý. 1.2.2. Hình thái và cấu trúc [1] * Hình dạng: hạt đậu nành có nhiều hình dạng khác nhau như hình tròn, bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, chùy dài. * Màu sắc: vàng, xanh, nâu hoặc đen và các màu trung gian nhưng màu vàng là tốt nhất nên được trồng và sử dụng nhiều. * Cấu trúc hạt: gồm 3 phần chính là vỏ hạt, phôi và tử diệp. - Vỏ: là lớp ngoài cùng của hạt đậu nành, có nhiều loại màu sắc và là yếu tố cho việc xác định giống đậu nành, có tác dụng bảo vệ phôi mầm. - Phôi: là rễ mầm, là phần sinh trưởng của hạt khi nảy mầm. - Tử diệp: gồm hai lá mầm tích trữ dinh dưỡng cho hạt. Bảng 1.2. Thành phần các chất có trong hạt đậu nành (% khối lượng) [3] % khối lượng Protein Lipid Carbohydrate Tro Thành phần toàn hạt (%) (%) (%) (%) Hạt đậu nành 100,0 40,0 20,0 35,0 4,9 Tử diệp 90,0 43,0 23,0 29,0 5,0 Vỏ hạt 8,0 8,8 1,0 86,0 4,3 Phôi 2,0 41,1 11,0 43,0 4,4 1.2.3. Thành phần các chất dinh dưỡng của đậu nành So với các nguyên liệu thực phẩm chính hiện nay, đậu nành thực sự giàu dinh dưỡng, vừa có nguồn protein cao nhất trong các loại đậu vừa là dược liệu quý. Đậu nành có hàm lượng dinh dưỡng thay đổi rộng phụ thuộc vào giống và điều kiện trồng trọt nhưng nhìn chung chúng chứa 35 – 40% protein, 15 - 25% chất béo, 18
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 15 - 30% carbohydrate; các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose và khoảng 5% tro. [1] Theo số liệu phân tích của công ty Ajinomoto, Thái Lan 1994, hàm lượng dinh dưỡng của hạt đậu nành Việt Nam như bảng 1.3 Bảng 1.3. Hàm lượng dinh dưỡng của hạt đậu nành Việt Nam [6] Hạt đậu Hạt đậu Khô đậu Khô đậu Chỉ tiêu Đơn vị nành trồng nành trồng nành ép nành ép ở Đồng Nai ở An Giang công nghiệp thủ công Protein thô % 35,56 38,06 47,81 42,94 Lipid thô % 17,10 18,00 1,50 3,00 Acid linoleic % 8,00 8,45 0,60 1,40 Lysin % 2,05 0,39 2,66 2,72 Methionin % 0,54 0,59 0,61 0,57 Systine % 0,61 0,72 0,72 0,75 Treonin % 1,35 1,53 1,69 1,67 Arginin % 2,11 2,62 3,03 2,85 Phenylalanin % 1,49 1,76 1,83 1,95 Valin % 1,62 1,74 1,85 1,84 Leucin % 2,68 3,03 3,39 3,32 Isoleucin % 1,51 1,67 1,65 1,77 Serin % 1,73 2,05 2,34 2,27 Isoflavones trong đậu nành dao động từ 4,39 mg/g đến 15,58 mg/g, có khả năng phòng chống nhiều loại bệnh ung thư và bệnh tim mạch. Ngoài ra, đậu nành cũng rất giàu chất khoáng và nhiều chất xơ. 19
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.3.1. Protein và thành phần acid amin Trong thành phần hóa học của đậu nành, protein chiếm một lượng rất lớn, protein đậu nành được tạo bởi các acid amin không thể thay thế được với lượng khá cao, tương đương với lượng acid amin có trong thịt và một số thực phẩm quan trọng khác. Hàm lượng protein dao động trong hạt đậu nành từ 29,6 - 50,5%, trung bình chiếm 36 - 40% trọng lượng chất khô. 1.2.3.2. Lipid Hàm lượng lipid trong đậu nành giao động từ 13,5 - 24%, trung bình chiếm 18% trọng lượng chất khô. Lipid chứa nhiều ở nhân hạt đậu nành, tỏng nhóm lipid của đậu nành có 2 thành phần chính là Glyceride và Lecithin. Glycerid đậu nành chứa nhiều acid béo không no khoảng 50-60% Acid Linoleic nên dầu nành được coi là thực phẩm có giá trị sinh học cao. 1.2.3.3. Carbohydrate Cacbonhydrate trong đậu nành chiếm khoảng 34% khối lượng khô, trong đó hàm lượng tinh bột không đáng kể. Carbohydrat được chia làm 2 loại: - Đường tan 10%, Sucrose 5%, Stachyose 4%, Rafinose 1%. - Chất xơ không tan 20%, hôn hợp polysaccharide và dẫn xuất của chúng, chủ yếu là cellulose, hemicellulose và các hợp chất khác của acid peptid. Bảng 1.4. Thành phần Carbohydrate trong đậu nành Thành phần Hàm lượng % Cellulose 4,0 Hemicellulose 15,4 Stachyose 3,8 Rafinose 1,1 20
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Saccharose 5,0 Các loại đường khác 5,2 1.2.3.4. Chất khoáng Thành phần chiếm khoảng 5% trọng lượng khô của hạt đậu nành. Bảng 1.5. Thành phần khoáng trong đậu nành Thành phần Hàm lượng Calci 0,16 – 0,47% Phospho 0,41 – 0,82% Mangan 0,22 – 0,24% Kẽm 0,37 g/kg Sắt 90 – 150 mg/kg 1.2.3.5. Vitamin Hạt đậu nành chứa nhiều loại vitamin cần thiết cho cơ thể nhưng hàm lượng vitamin trong đậu nành thấp, dễ mất trong quá trình chế biến. Bảng 1.6. Thành phần vitamin trong đậu nành Thành phần Hàm lượng (mg/g) Thiamin 11 – 17,5 Riboflavin 3,4 – 3,6 Niacin 21,4 – 23 Biotin 0,8 Pyridoxin 7,1 – 12 Pantothenic acid 13 – 21,5 Folic acid 1,9 Inositon 2300 21
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vitamin A 0,18 – 2,43 Vitamin E 1,4 Vitamin K 1,9 Vitamin B1 0,54 Vitamin B2 0,29 Vitamin PP 2,3 1.2.3.6. Enzyme [3] Enzyme quan trọng của đậu nành là lipoxygenase, được biết đến là lipoxydase xúc tác phản ứng oxy hóa acid béo không bão hòa bởi O2, gây mùi đậu nành. Enzyme urease có nhiều ở đậu nành sống, phân hủy ure thành amoniac, là một hợp chất độc với cơ thể người do đó không nên ăn đậu nành sống. Một số enzyme khác như: amylase, protease, phospholipase, lipoxienase 1.2.4. Lợi ích từ đậu nành 1.2.4.1. Cung cấp protein Hiện nay quy mô dân số thế giới đang không ngừng tăng lên. Tương ứng với nó là nhu cầu về lương thực, thực phẩm ngày càng trở nên cấp thiết. Với hàm lượng protein cao nhất trong các loại thực phẩm từ 30 - 42 % đậu nành đã, đang và sẽ góp phần không nhỏ trong việc đáp ứng nhu cầu protein cho con người, đặc biệt là ở các nước có nền kinh tế kém phát triển. Điều này lí giải tại sao ngày nay đậu nành lại được quan tâm nghiên cứu, phát triển và sử dụng. 1.2.4.2. Ngăn chặn ung thư Mặc dù đã được sử dụng từ rất lâu đời nhưng những tác dụng về mặt y học của đậu nành mãi sau này mới được biết tới cho đến khi khoa học phát triển. Những tác dụng của đậu nành ban đầu được nhận thấy khi tỉ lệ mắc bệnh ung thư ở phụ nữ Châu Á thấp hơn nhiều so với phụ nữ phương Tây. Sau nhiều nghiên cứu người ta 22
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP mới nhận ra rằng khẩu phần ăn của người phương Đông có chứa nhiều sản phẩm từ đậu nành hơn hẳn so với khẩu phần ăn của người Phương Tây là một phần nguyên nhân dẫn đến kết quả có lợi này. Những nghiên cứu đầu tiên được tiến hành từ những năm 1980 về đậu nành đã tìm thấy ở đậu nành những đặc tính đáng ngạc nhiên. Những nghiên cứu này cho thấy các hợp chất Isoflavone trong đậu nành có thể là nguyên nhân ban đầu mang lại cho đậu nành những hiệu quả có lợi đối với sức khoẻ. Chúng giúp giảm sự phát triển của một số căn bệnh ung thư như ung thư vú, ung thư buồng trứng và ung thư tiền liệt tuyến. Trong thành phần của Isoflavone, Genistein đóng vai trò như là yếu tố ức chế sự hình thành mạch máu, các enzyme trong đó có enzyme Tyrozin kinase một loại enzyme ảnh hưởng trực tiếp trong việc hình thành và phát triển của các tế bào ung thư; Genistein và Daidzein có khả năng bất hoạt sự phát triển của ung thư vú và ung thư ruột kết, bằng cách ngăn chặn sự phát triển của khối u và làm cho các tế bào trở nên già cỗi và mất khả năng sinh sản. Theo nghiên cứu trên phụ nữ Trung Quốc có sự liên quan giữa việc sử dụng đậu nành và sự giảm bớt chứng ung thư vú ở phụ nữ tiền mãn kinh [15]. Điều này được giải thích là do việc ăn đậu nành đã làm biến đổi hormon đặc trưng ở phụ nữ tiền mãn kinh, dẫn đến làm giảm các yếu tố gây ung thư vú [12]. 1.2.4.3. Ngăn chặn chứng loãng xương Bên cạnh tác dụng giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư đậu nành cũng được biết tới như là một loại thực phẩm giúp ngăn chặn chứng loãng xương nhất là ở phụ nữ tiền mãn kinh. Isoflavone cụ thể là daidzein có thể duy trì độ chắc của xương nhờ giữ cho xương lượng Ca cần thiết mà không gây ra một hiệu ứng phụ có hại nào. Một số nghiên cứu cho thấy rằng tỉ trọng xương, chiều dài xương lớn hơn và giảm sự tiết Ca trong urine khi chế độ ăn kiêng có chứa các sản phẩm từ đậu nành hoặc khi cơ thể được cung cấp Isoflavone với hàm lượng nhất định [15]. 1.2.4.4. Lợi ích trong nông nghiệp Trong nông nghiệp đậu nành là một loại cây dễ trồng phù hợp với nhiều điều kiện canh tác của nông dân, cho năng suất cao, thích hợp với nhiều loại đất trồng, 23
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP làm tăng hàm lượng đạm trong đất do khả năng cố định đạm của vi khuẩn chứa trong rễ. Ở nước ta hiện nay có nhiều giống đậu nành mới được nghiên cứu thử nghiệm và đưa vào nuôi trồng đã cho năng suất cao, khả năng chống chịu bệnh hại cao như giống đậu DT 84, DT 90 của Viện Di truyền Nông Nghiệp. Cùng với việc nghiên cứu thử nghiệm các giống đậu nành trong nước thì chúng ta cũng nhập khẩu các giống đậu nành có năng suất cao, chất lượng tốt và có khả năng chống chịu bệnh hại và các điều kiện khắc nghiệt của môi trường. Chính vì thế mà trong những năm gần sản lượng đậu nành ở nước không ngừng tăng lên đáp ứng nhu cầu ngày càng lớn trong sản xuất thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Theo tập quán canh tác tại một số vùng ở nước ta, đậu nành thường được trồng vào mùa đông xen giữa vụ lúa hè thu và đông xuân. Điều này giúp tận dụng tối đa diện tích đất nhàn rỗi đồng thời cũng cải thiện được tình trạng của đất trồng và tạo thêm thu nhập cho người nông dân. Chính vì thế mà việc trồng đậu nành ngày càng được nhà nước quan tâm hỗ trợ về giống vốn, tạo điều kiện tốt nhất để có thể phát triển quy mô trồng đậu, đẩy mạnh nông nghiệp phát triển. Tuy có nhiều lợi ích như vậy nhưng những thức ăn từ đậu nành lại khó được hấp thụ. Điều này được giải thích là do trong thành phần của đậu nành có chứa một số chất có tác dụng ức chế enzyme tiêu hoá của cơ thể. Một nhược điếm khác của đậu nành là trong thành phần của nó có chứa axit phytic và các muối của axit này. Chúng ngăn cản sự hấp thu của cơ thể đối với các nguyên tố khoáng như Fe, Ca, Mg, và Zn. Thật may mắn là những nhược điểm này của đậu nành được khắc phục nhờ quá trình lên men.Trong quá trình này các tác nhân lên men sản sinh ra các enzyme có tác dụng phân cắt protein thành các polypeptide, làm biến tính các protein gây ức chế trypsin, một enzyme có tác dụng tiêu hoá của cơ thể; Cũng trong quá trình lên men mà hàm lượng các phyte giảm đáng kể. Chính nhờ lên men mà ngày nay chúng ta có được một phổ sản phẩm vô cùng phong phú từ đậu nành - Một nguồn thực phẩm rẻ, sẵn có, dễ trồng, dễ chế biến. Natto là một sản phẩm như vậy. Loại thức ăn này được sản xuất từ đậu nành hấp chín sau đó lên men nhờ một loại vi sinh vật có trong tự nhiên sau này được đặt tên là Bacillus subtilis Natto. 24
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.3. Vi khuẩn lên men Natto 1.3.1. Phân loại vi khuẩn [6] Sau khi tiến hành phân lập và định tên người ta đã xác định rằng Natto là loại thực phẩm lên men tương đối thuần khiết. Vi khuẩn đóng vai trò chủ yếu trong Natto là loài Bacillus subtilis chủng Natto. Giới Bacteria Ngành Firmicutes Lớp Bacilli Bộ Bacillales Họ Bacillaceae Chi Bacillus Loài Bacillus subtilis Natto B.natto có mặt ở khắp mọi nơi trong tự nhiên, chúng có nhiều trong rơm cỏ nên còn gọi là “trực khuẩn rơm cỏ”. Chúng còn phân bố trên bề mặt các loại hạt và các sản phẩm được chế biến từ các loại hạt đó. Trong bột mì, B.subtilis chiếm khoảng 75 - 95% vi khuẩn tạo bào tử. Trong các sản phẩm thực phẩm truyền thống như mắm, tương, cơm mẻ (cơm lên men chua) cũng có mặt của chúng và có vai trò đáng kể trong quá trình biến đổi sinh học. 1.3.2. Hình dạng vi khuẩn và hình thái khuẩn lạc [20] Bacillus là trực khuẩn nhỏ, thẳng, có kích thước 0,5-2,5 x 1,2-10 µm, thường xếp thành cặp đôi hay chuỗi ngắn, hai đầu tế bào tròn hoặc hơi vuông. Bào tử hình bầu dục có kích thước 0,9 – 0,6 µm, không phân bố theo một nguyên tắc chặt chẽ nào - lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm. 25
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí, khi còn non di động bằng tiên mao, về già, tiên mao rụng nên mất khả năng di động. Khuẩn lạc khô hoặc nhớt, vô màu hay có màu trắng xám nhạt, hơi nhăn hay tạo thành lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào mặt thạch. 1.3.3. Đặc điểm sinh lý Trong giống Bacillus subtilis là loài có tính đa dạng rất lớn về mặt sinh lý. Những đặc tính của chúng bao gồm: Khả năng phát triển trong khoảng pH rộng 5,4 – 8,0; khoảng nhiệt độ lớn 9 – 550C. Các Bacillus subtilis có khả năng thuỷ phân nhanh chóng hầu hết các cơ chất có nguồn gốc động thực vật gồm xenlulose, tinh bột, pectin, protein, agar, hydrocacbon, gelatin có khả năng lên men các loại đường như glucose, arabinose, xylose, manitol và có khả năng sử dụng citrat. Ngoài ra các chủng này còn có hoạt tính bacteriocin, tạo ra các chất subtilisin; tạo axit từ các đường; nitrat hoá; phản nitrat hoá; cố định nitơ; tự dưỡng; hô hấp tuỳ nghi; là vi khuẩn ưa axit; ưa kiềm; ưa nhiệt; ưa tối; sống ký sinh; hầu hết tạo bào tử nên có khả năng sống sót cao trong môi trường, ở bất kỳ nơi nào chúng chiếm ưu thế. Môi trường thuận lợi để Bacillus subtilis phát triển tốt là môi trường LB hoặc môi trường thạch dinh dưỡng NA. 1.3.4. Ứng dụng [5] [17] Bacillus đã được sử dụng từ rất lâu trong lịch sử. Sự lên men đậu tương thực hiện bởi các chủng Bacillus subtilis Natto tạo ra Natto đã được sử dụng nhiều ở Nhật trong hàng nghìn năm nay. Các chủng Bacillus subtilis khác cũng có nhiều ứng dụng trong đời sống. Có loại có hoạt tính diệt nấm tự nhiên, và được sử dụng như là 26
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP tác nhân kiểm soát sinh học. Bacillus subtilis cũng được chứng minh là có thể dễ dàng sử dụng các thao tác di truyền, do đó nó được sử dụng rộng rãi như là một vi khuẩn điển hình trong các nghiên cứu. Bacillus subtilis còn có khả năng tiết protein với hàm lượng lớn vào môi trường, lên tới 20 – 25 g/l. Các chủng Bacillus có thể tạo ra lượng lớn enzyme thuỷ phân sử dụng trong công nghiệp như amylase và protease cho công nghiệp thực phẩm và công nghiệp tẩy rửa, công nghiệp thuộc da, công nghiệp phim ảnh. Lượng enzyme từ Bacillus chiếm khoảng 50% tổng số các enzyme thương mại. Bên cạnh enzyme, Bacillus còn được dùng để tạo ra các chất kháng sinh, các hoá chất có khả năng tăng hương vị cho thực phẩm. Bacillus subtilis + còn được sử dụng trong phân bón dạng lỏng để chuyển hóa NH4 thành axit polyglutamic để làm kho dự trữ N cho đất. Bacillus subtilis có thể phát triển trong môi trường phân bón dạng lỏng bằng cách sử dụng gluconat natri, tạo axit polyglutamic. 27
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng 2.1.1. Nguyên liệu Đậu nành được trồng tại Đồng Nai và được phân phối tại chợ Thị Nghè, Tp Hồ Chí Minh. Tình trạng hạt: vàng đều, vỏ bóng, không sần sùi, không nứt vỏ, không bị hư, rốn đậu nâu bóng, kích thược hạt đều nhau. (Giá 18.000 VND/kg) Giống lên men: Bacillus subtilis Natto được nhập trực tiếp tại phòng thí nghiệm Yuzo Takahashi, Nhật Bản. Giống Natto chuẩn, dạng bột màu trắng, không pha tạp các chủng loại vi sinh vật khác nên đảm bảo tuyệt đối an toàn cho Natto thành phẩm. (Giá 240.000 VND/lọ 3,0 gram) Hình 2.1. Men giống Bacillus subtilis Natto sử dụng trong nghiên cứu 2.1.2. Thiết bị thí nghiệm - Cân điện tử - Máy đo pH - Máy đo quang phổ 28
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Tủ ủ - Tủ Lạnh - Một số dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm 2.1.3. Hóa chất - Dung dịch Casein 2% - Dung dịch TCA 5% - Dung dịch Na2CO3 6% - Thuốc thử Folin (pha loãng 5 lần) - Dung dịch HCl 0,2 N - Dung dịch Tyrozin chuẩn 1 mM/l 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp hóa lý • Xác định pH bằng máy đo pH • Xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Ason cải tiến [7] * Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzym protease có trong dịch nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzym và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung dịch acid trichloracetic. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của Tyrozin để tính lượng sản phẩm do enzym xúc tác tạo nên. Bảng 2.1. Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin Dung dịch hóa chất Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Dung dịch Tyrosin 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 chuẩn (ml) Lượng Tyrosin 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 tương ứng (µM) Dung dịch HCl 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 0,2N (ml) 29
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dung dịch Na2CO3 10 10 10 10 10 10 6% (ml) Thuốc thử Folin 3 3 3 3 3 3 (ml) Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 750 nm Ống số 1 là ống kiểm tra (KT), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường chuẩn Tyrosin. * Phương pháp tiến hành Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống thí nghiệm, 3 ống kiểm tra. Bảng 2.2. Các bước chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính Ống nghiệm Dung dịch hóa chất Thí nghiệm Kiểm tra Dung dịch Casein 2% (ml) 2 2 Dung dịch TCA 5% (ml) 0 5 Dung dịch enzyme mẫu* (ml) 1 1 Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 20 phút Dung dịch TCA 5% (ml) 5 0 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch trong *Dịch enzyme mẫu có được bằng cách nghiền 1 g Natto với 10 ml nước cất sau đó lọc bỏ bã. Lấy 2 ống nghiệm mới khác, cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thí nghiệm và cho vào ống thứ hai 5 ml dịch lọc cùa ống kiểm tra. Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10ml Na2CO3 6% và 3 ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 750 nm. Tính ΔOD = ODTN – ODKT, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn suy ra được số µM Tyrosin. 30
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP * Tính kết quả: Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzym tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm (35,50C) thủy phân Casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 750 nm tương ứng với 1 µM Tyrosin trong đường chuẩn. µmol tyrosin .8 1000 Hđ Protease = . t a Với: Hđ Protease : hoạt độ enzym protease (HP/g) t : thời gian thủy phân (phút) a : khối lượng mẫu enzym đem đi xác định hoạt tính (mg) µM Tyrosin: lượng µM Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn 2.2.2. Phương pháp cảm quan[4] Phương pháp này được sử dụng để đánh giá tổng quát mức chất lượng của một sản phẩm so với tiêu chuẩn hoặc so với một sản phẩm cùng loại trên tất cả tiêu chí cảm quan: màu sắc, mùi, vị, trạng thái. Tình trạng chất lượng của mỗi chỉ tiêu được đánh giá bằng điểm. Giá trị điểm tăng theo mức tăng chất lượng. Khi đánh giá cảm quan các sản phẩm thực phẩm bằng phương pháp cho điểm theo TCVN 3215-79, thì từng chỉ tiêu riêng biệt của sản phẩm ta dùng hệ điểm 20 xây dựng trên thang thống nhất 6 bậc 5 điểm (từ 0 đến 5) trong đó 0 điểm ứng với chất lượng sản phẩm bị hỏng, còn từ 1 đến 5 ứng với mức khuyết tậ giảm dần. Để tiến hành đánh giá cảm quan cho sản phẩm Natto, thí nghiệm xây dựng bảng điểm đánh giá cảm quan 31
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 2.3. Bảng điểm đánh giá cảm quan sản phẩm Natto Chỉ Hệ số quan Yêu cầu Điểm tiêu trọng Hỗn hợp đậu mềm có độ dính nhớt cao, kéo sợi 5 protein trắng, nhiều. Hỗn hợp đậu rất mềm, nhớt dính cao, kéo sợi 4 protein trắng, nhiều. Hỗn hợp đậu mềm, nhớt dinh, kéo sợi protein Trạng 3 1,2 trắng vừa. Thái Hỗn hợp đậu mềm, nhớt dính, kéo sợi protein 2 trắng ít. Hỗn hợp đậu hơi nhớt dính, không kéo sợi 1 protein. Hỗn hợp đậu rời rạt, không kéo sợi protein 0 Màu nâu 5 Màu nâu nhạt 4 Màu nâu đậm 3 Màu 0,8 Màu nâu sữa 2 Màu vàng nâu 1 Không đổi màu hoặc xuất hiện màu lạ do vi 0 sinh vật tạp nhiễm Mùi thơm đặc trưng, dễ chịu 5 Mùi thơm mạnh, có thể chịu được 4 Mùi Mùi thơm mạnh, khó chịu 3 Đặc 1 Mùi thơm nhẹ 2 Trưng Mùi thơm rất nhẹ 1 Không có mùi thơm đặc trưng hoặc có mùi lạ 0 do vi sinh vật tạp nhiễm 32
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vị ngọt ngọt, bùi bùi đặc trưng 5 Vị ngọt ngọt, bùi bùi, hơi đắng 4 Vị ngọt ngọt, bùi bùi, chua 3 Vị 1 Vị bùi bùi, hơi chua 2 Vị bùi bùi 1 Không có vị hoặc có vị lạ do vi sinh vật tạp 0 nhiễm. 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu thí nghiệm Thí nghiệm sử dụng chương trình Excel và Statgraphics 33
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3. Xây dựng quy trình nghiên cứu sản xuất Natto từ đậu nành Việt Nam dự kiến: Chọn lọc hạt chất Đậu nành lượng tốt Ngâm đậu qua đêm Nấu chín bằng nồi áp suất trong 45 phút Để ráo nước Tiệt trùng Thêm dung dịch dụng cụ chứa Lên men chứa Bacillus o đậu ở 120 C subtilis Natto Sau lên men, chờ 1h cho Natto nguội Bọc kín, giữ lạnh ở 4oC; 1 ngày Natto Hình 2.2. Sở đồ quy trình sản xuất Natto dự kiến 34
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4. Bố trí thí nghiệm 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng dịch men giống và thời gian lên men đến quá trình lên men Hòa tan 10 g men Natto đã mua ở trên với 10 ml nước cất ta thu được dịch lên men Natto 1 g/ml. Tiến hành khảo sát với lượng dịch lên men thay đổi như sau: 0,15 ml; 0,25 ml; 0,50 ml; 0,75 ml; 1,00 ml cùng với các khoảng thời gian khác nhau như sau: 6h, 12h, 18h, 24h, 30h để xác định được hàm lượng men giống và thời gian lên men thích hợp nhất. 35
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chọn lọc hạt chất Đậu nành lượng tốt Ngâm đậu ngập nước 12h Nấu chín bằng nồi áp suất trong 45 phút Để ráo nước, cân 50 g đậu nành vào 5 cốc thủy tinh 250 ml đã tiệt trùng, sau đó bổ sung dịch lên men Cốc 1: Cốc 2: Cốc 3: Cốc 4: Cốc 5: 0,15ml 0,25ml 0,50ml 0,75ml 1.00ml Mang 5 mẫu ủ ở 40 độ C, mỗi 6h mang ra khảo sát hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Ason cải tiến và đánh giá cảm quan. Hình 2.3. Sở đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng dịch men giống và thời gian lên men 36
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH lên men đến quá trình lên men Tiến hành khảo sát pH lên men thay đổi như sau: 4, 5, 6, 7 ,8 với thời gian lên men và hàm lượng dịch lên men là kết quả của thí nghiệm 1 để xác định pH lên men thích hợp nhất. Chọn lọc hạt chất Đậu nành lượng tốt Ngâm đậu ngập nước 12h Nấu chín bằng nồi áp suất trong 45 phút Để ráo nước, cân 50g đậu nành vào 5 cốc thủy tinh 250ml đã tiệt trùng, sau đó bổ sung dịch lên men, trộn đều và chỉnh pH Cốc 1: Cốc 2: Cốc 3: Cốc 4: Cốc 5: pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 Mang 5 mẫu ủ ở 40OC, 24h sau đó khảo sát hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Ason cải tiến. Tiếp tục trữ lạnh ở 4OC, 24h sau đó đánh giá cảm quan. Hình 2.4. Sở đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH 37
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men Tiến hành khảo sát pH lên men thay đổi như sau: 30OC, 40OC, 50OC, 60OC, 70OC với thời gian lên men, hàm lượng dịch lên men và pH là kết quả của thí nghiệm 1 và 2 để xác định nhiệt độ lên men thích hợp nhất. Chọn lọc hạt chất Đậu nành lượng tốt Ngâm đậu ngập nước 12h Nấu chín bằng nồi áp suất trong 45 phút Để ráo nước, cân 50 g đậu nành vào 4 cốc thủy tinh 250 ml đã tiệt trùng, sau đó bổ sung dịch lên men, trộn đều và đem ủ Cốc 1: Cốc 2: Cốc 3: Cốc 4: 30OC 40OC 50OC 60OC Sau 24h mang ra khảo sát hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Ason cải tiến. Tiếp tục trữ lạnh ở 4OC, 24h sau đó đánh giá cảm quan. Hình 2.5. Sở đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 38
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng dịch men giống và thời gian lên men đến quá trình lên men Natto 3.1.1. Ảnh hưởng của hàm lượng dịch men giống và thời gian lên men đến hoạt độ của enzyme protease được tạo thành Bảng 3.1. Hoạt độ protease được tạo thành sau 6h Tỷ lệ giống Tyrozin tạo thành Hoạt độ protease ∆(TN – KT) (1 g/ml) (µmol) (HP/g) 0,15 0,0230a ± 0,0026 0,0074 0,00589 0,25 0,0327b ± 0,0025 0,0108 0,00864 0,50 0,0277ab ± 0,0015 0,0090 0,00720 0,75 0,0473c ± 0,0065 0,0159 0,01272 1,00 0,0267ab ± 0,0025 0,0087 0,00696 Bảng 3.2. Hoạt độ protease được tạo thành sau 12h Tỷ lệ giống Tyrozin tạo thành Hoạt độ protease ∆(TN – KT) (1 g/ml) (µmol) (HP/g) 0,15 0,0450c ± 0,0030 0,0151 0,01208 0,25 0,0573b ± 0,0055 0,0194 0,01552 0,50 0,0497b ± 0,0030 0,0167 0,01336 0,75 0,0727a ± 0,0005 0,0248 0,01984 1,00 0,0550b ± 0,0010 0,0186 0,01488 39
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.3. Hoạt độ protease được tạo thành sau 18h Tỷ lệ giống Tyrozin tạo thành Hoạt độ protease ∆(TN – KT) (1 g/ml) (µmol) (HP/g) 0,15 0,0757c ± 0,0035 0,0258 0,02064 0,25 0,1037a ± 0,0045 0,0357 0,02856 0,50 0,0840b ± 0,0075 0,0288 0,02304 0,75 0,0680c ± 0,0070 0,0231 0,01848 1,00 0,0517d ± 0,0095 0,0174 0,01392 Bảng 3.4. Hoạt độ protease được tạo thành sau 24h Tỷ lệ giống Tyrozin tạo thành Hoạt độ protease ∆(TN – KT) (1 g/ml) (µmol) (HP/g) 0,15 0,1197b ± 0,0061 0,0413 0,03304 0,25 0,1373a ± 0,0090 0,0475 0,03800 0,50 0,1020c ± 0,0010 0,0351 0,02808 Bảng 3.5. Hoạt độ protease được tạo thành sau 30h Tỷ lệ giống Tyrozin tạo thành Hoạt độ protease ∆(TN – KT) (1g/ml) (µmol) (HP/g) 0,15 0,1057b ± 0,0042 0,0364 0,02912 0,25 0,1173ab ± 0,0075 0,0404 0,03232 0,50 0,0987a ± 0,0075 0,0339 0,02712 40
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HP/g 0.04 Hàm lượng dịch 0.035 men giống 0.03 (0,1g/ml) 0.15 ml 0.025 0.25 ml 0.02 0.50 ml 0.015 0.75 ml 0.01 1.00 ml 0.005 0 giờ 0 6 12 18 24 30 36 Hình 3.1. Biểu đồ khảo sát sự ảnh hưởng của hàm lượng dịch men giống và thời gian lên men đến hoạt độ enzyme protease được tạo thành khi lên men Natto Nhận xét: Dựa vào biểu đồ hình 3.1 nhận thấy: - Hàm lượng dịch men giống 0,15 ml: hoạt độ protease tạo thành tăng dần theo thời gian lên men và đạt cao nhất tại tại 24h (0,03304 HP/g), sau đó giảm dần. - Hàm lượng dịch men giống 0,25 ml: hoạt độ protease tạo thành tăng dần theo thời gian lên men và đạt cao nhất tại tại 24h (0,03800 HP/g), sau đó giảm dần. - Hàm lượng dịch men giống 0,50 ml: hoạt độ protease tạo thành tăng dần theo thời gian lên men và đạt cao nhất tại tại 24h (0,02808 HP/g), sau đó giảm dần. - Hàm lượng dịch men giống 0,75 ml: hoạt độ protease tạo thành tăng dần theo thời gian lên men và đạt cao nhất tại tại 12h (0,01984 HP/g), sau đó giảm dần. - Hàm lượng dịch men giống 1,00 ml: hoạt độ protease tạo thành tăng dần theo thời gian lên men và đạt cao nhất tại tại 12h (0,01488 HP/g), sau đó giảm dần. - Hoạt độ của enzyme protease được tạo thành đạt cao nhất ở hàm lượng dịch men giống là 0,25 ml và thời gian là 24h. 41
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.1.2. Ảnh hưởng của hàm lượng dịch men giống và thời gian lên men đến điểm cảm quan sản phẩm Bảng 3.6. Điểm cảm quan của sản phẩm sau 6h Tỷ lệ giống Điểm cảm Trạng Thái Màu Mùi Vị (1 g/ml) quan 0,15 0 0 0 0 0 0,25 0 0 0 0 0 0,50 0 0 0 0 0 0,75 0 0 0 0 0 1,00 0 0 0 0 0 Bảng 3.7. Điểm cảm quan của sản phẩm sau 12h Tỷ lệ giống Điểm cảm Trạng Thái Màu Mùi Vị (1 g/ml) quan 0,15 1 0 0 0 1,2 0,25 1 0 1 0 2,2 0,50 1 0 0 0 1,2 0,75 2 1 2 1 6,2 1,00 1 0 1 0 2,2 Bảng 3.8. Điểm cảm quan của sản phẩm sau 18h Tỷ lệ giống Điểm cảm Trạng Thái Màu Mùi Vị (1 g/ml) quan 0,15 2 1 1 2 5,6 0,25 3 2 4 2 11,2 0,50 2 1 1 2 6,2 0,75 2 2 3 2 9,0 1,00 2 1 3 2 8,2 42
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.9. Điểm cảm quan của sản phẩm sau 24h Tỷ lệ giống Điểm cảm Trạng Thái Màu Mùi Vị (1 g/ml) quan 0,15 3 2 4 5 14,2 0,25 4 4 4 5 17,0 0,50 3 2 4 5 14,2 0,75 3 2 4 4 13,2 1,00 3 2 4 4 13,2 Bảng 3.10. Điểm cảm quan của sản phẩm sau 30h Tỷ lệ giống Điểm cảm Trạng Thái Màu Mùi Vị (1 g/ml) quan 0,15 4 4 4 4 16,0 0,25 5 3 3 4 15,4 0,50 4 3 4 4 15,2 0,75 4 3 3 3 13,2 1,00 4 3 3 3 13,2 43
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP điểm 20 Hàm lượng 18 dịch men giống 16 (0,1g/ml) 14 0.15 ml 12 0.25 ml 10 0.50 ml 8 0.75 ml 6 1.00 ml 4 2 0 giờ 6 12 18 24 30 Thời gian lên men Hình 3.2. Biểu đồ khảo sát sự ảnh hưởng của hàm lượng dịch men giống và thời gian lên men đến điểm cảm quan của sản phẩm Natto Nhận xét: Dựa vào biểu đồ hình 3.2 nhận thấy: - Hàm lượng dịch men giống 0,15 ml: điểm cảm quan tăng dần theo thời gian lên men và đạt cao nhất tại tại 30h (16,0 điểm), sau đó tăng chậm dần và có xu hướng sẽ giảm vì khi tiếp tục lên men sẽ sản sinh ra nhiều amoniac làm giảm điểm cảm quan của sản phẩm. - Hàm lượng dịch men giống 0,25 ml: điểm cảm quan tăng dần theo thời gian lên men và đạt cao nhất tại tại 24h (17,0 điểm), sau đó giảm dần. - Hàm lượng dịch men giống 0,50 ml: điểm cảm quan tăng dần theo thời gian lên men và đạt cao nhất tại tại 30h (15,2 điểm), sau đó tăng chậm dần và có xu hướng sẽ giảm vì khi tiếp tục lên men sẽ sản sinh ra nhiều amoniac làm giảm điểm cảm quan của sản phẩm. 44
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Hàm lượng dịch men giống 0,75 ml: điểm cảm quan tăng dần theo thời gian lên men và đạt cao nhất tại tại 24h (13,2), sau đó có xu hướng giảm vì khi tiếp tục lên men sẽ sản sinh ra nhiều amoniac làm giảm điểm cảm quan của sản phẩm. - Hàm lượng dịch men giống 1,00 ml: điểm cảm quan tăng dần theo thời gian lên men và đạt cao nhất tại tại 24h (13,2), sau đó có xu hướng giảm vì khi tiếp tục lên men sẽ sản sinh ra nhiều amoniac làm giảm điểm cảm quan của sản phẩm. Kết Luận: - Hàm lượng giống quá ít thì thời gian lên men sẽ kéo dài, vi sinh vật tạp nhiễm trong môi trường lên men dễ phát triển gây hư hỏng sản phẩm. Nếu lượng giống quá nhiều thì thời gian lên men được rút ngắn nhưng các quá trình tạo sản phẩm phụ chưa được thực hiện, sản phẩm không đạt được chất lượng tốt nhất. - Thời gian lên men: phụ thuộc vào hoạt tính vi sinh vật sử dụng, thời gian lên men có thể dài hoặc ngắn. - Từ các kết quả thí nghiệm ở hình 3.1 và 3.2, cho thấy với lượng dịch lên men là 0,25 ml và thời gian lên men là 24h thu được kết quả lên men Natto là tốt nhất vì ở nồng độ và thời gian đó cho ra được sản phẩm có điểm cảm quan cao nhất (17,0 điểm) và hoạt độ enzyme protease được tạo thành cao nhất (0,038 HP/g). 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men Natto 3.2.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme protease được tạo thành Bảng 3.11. Hoạt độ protease được tạo thành ở các pH khác nhau Tyrozin tạo thành Hoạt độ protease pH ∆(TN – KT) (µmol) (HP/g) 4 0,0903c ± 0,0120 0,03111 0,02489 5 0,1367b ± 0,0055 0,04724 0,03779 6 0,1547a ± 0,0065 0,05355 0,04284 7 0,1427ab ± 0,0090 0,04934 0,03947 8 0,0830c ± 0,0036 0,02841 0,02273 45
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HP/g 0.045 0.04 0.035 0.03 0.025 Hoạt độ 0.02 Protease 0.015 0.01 0.005 0 pH 4 5 6 7 8 Hình 3.3. Biểu đồ khảo sát sự ảnh hưởng của độ pH đến hoạt độ enzyme protease khi lên men Natto Nhận xét: Từ hình 3.3 cho thấy: hoạt đồ enzyme protease được tạo thành đạt cao nhất tại giữa pH = 6 - 7 (pH của đậu nành sau khi nấu chín, không cần điều chỉnh) tại pH 6 là 0,04284 HP/g. 3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến điểm cảm quan sản phẩm Bảng 3.12. Điểm cảm quan của sản phẩm ở các pH khác nhau Điểm cảm pH Trạng Thái Màu Mùi Vị p quan 4 3 2 2 2 H 9,2 5 4 3 4 4 14,2 6 5 4 4 5 18,2 7 5 4 4 4 17,2 8 3 1 2 1 7,4 46
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP điểm 20 18 16 14 12 Điểm cảm 10 quan 8 6 4 2 0 pH 4 5 6 7 8 Hình 3.4. Biểu đồ khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ pH đến điểm cảm quan của sản phẩm Natto Nhận xét: Từ hình 3.4 cho thấy điểm cảm quan của sản phẩm Natto đạt cao nhất tại giữa pH = 6-7 (pH của đậu nành sau khi nấu chín, không cần điều chỉnh) tại pH 6 là 18,2 điểm. Kết Luận: Từ thí nghiệm trên, cho thấy pH lên men Natto của đậu nành sau khi nấu chín khoảng 6 - 7 (gần trung tính) nên không cần điều chỉnh pH để tiết kiệm chi phí và là điều kiện tốt nhất lên men Natto. Với điều kiện tối ưu đó cho ra sản phẩm có điểm cảm quan tốt nhất (18,2 điểm) và hoạt độ enzyme protease được tạo thành cao nhất (0,04284 HP/g) 47
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men Natto 3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme protease được tạo thành Bảng 3.13. Hoạt độ protease được tạo thành ở các nhiệt độ khác nhau Nhiệt độ Tyrozin tạo thành Hoạt độ protease ∆(TN – KT) (OC) (µmol) (HP/g) 30 0,1317b ± 0,0064 0,0455 0,03640 40 0,1667a ± 0,0045 0,0578 0,04624 50 0,0653c ± 0,0055 0,0222 0,01776 60 0,0347d ± 0,0055 0,0115 0,00920 HP/g 0.05 0.045 0.04 0.035 0.03 0.025 Hoạt độ 0.02 Protease 0.015 0.01 0.005 0 OC 30 40 50 60 Hình 3.5. Biểu đồ khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme protease được tạo thành khi lên men Natto Nhận xét: Từ hình 3.5 cho thấy điểm cảm quan của sản phẩm Natto đạt cao nhất trong khoảng nhiệt độ 38 - 40OC, tại 40OC hoạt độ của protease là 0,04624 HP/g 48
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến điểm cảm quan sản phẩm Bảng 3.14. Điểm cảm quan của sản phẩm ở các nhiệt độ khác nhau Nhiệt độ Điểm cảm Trạng Thái Màu Mùi Vị OC quan 30 4 2 2 4 12,4 40 5 4 4 5 18,2 50 3 2 2 2 9,2 60 2 1 2 1 6, 2 điểm 20 18 16 14 12 Điểm cảm 10 quan 8 6 4 2 O 0 C 30 40 50 60 Hình 3.6. Biểu đồ khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến điểm cảm quan của sản phẩm Natto Nhận xét: Từ hình 3.6 cho thấy điểm cảm quan của sản phẩm Natto đạt cao nhất trong khoảng nhiệt độ 38 - 40OC. Tại 40OC đánh giá cảm quan là 18,2 điểm Kết Luận: Từ thí nghiệm trên, cho ta kết luận nhiệt độ lên men Natto 38OC là điều kiện tốt nhất, vì ở nhiệt độ đó cho ra được sản phẩm có điểm cảm quan tốt nhất (18,2 điểm) và hoạt độ enzyme protease được tạo thành cao nhất (0,04624 HP/g) 49
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.4. Xây dựng quy trình sản xuất Natto 3.4.1. Sở đồ quy trình Chọn lọc hạt chất Đậu nành lượng tốt Ngâm đậu qua đêm Nấu chín bằng nồi áp suất trong 45 phút Để ráo nước Thêm0,25 ml Tiệt trùng dung dịch dụng cụ chứa O Lên men ở 38 C trong 24h Bacillus subtilis đậu ở 120oC Natto (1g/ml) Sau lên men, chờ 1h cho Natto nguội Bọc kín, giữ lạnh ở 4oC; 1 ngày Natto Hình 3.7. Sơ đồ sản xuất Natto 50
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.4.2. Thuyết minh quy trình • Chọn lọc - Mục đích: lựa chọn nguyên vật liệu tốt nhất cho quá trình lên men Natto - Biến đổi: không có - Cách tiến hành: Chọn những hạt đậu nành có bề mặt màu vàng nhẹ và rốn hạt màu vàng nâu, vỏ không bong tróc, không bị hư hỏng. Sau khi loại bỏ các hạt kém chất lượng, đậu nành được phân thành 4 loại theo đường kính: o Loại rất nhỏ d 7,9 mm Người ta thường dùng loại đậu nhỏ và nhỏ vừa để làm Natto. Một số nơi người ta lại thích dùng loại đậu nành to. Natto từ đậu tương nhỏ và nhỏ vừa có hương vị đặc trưng riêng và vị đậm do lên men quá mức. Có báo cáo cho rằng hoạt tính của protease kiềm tính (subtilisin) ở Natto làm từ đậu nhỏ thì cao hơn đậu to. Tuy nhiên hoạt tính của protease trung tính (metalloprotease) thì không khác nhau với các kích thước đậu tương khác nhau. Kết quả này cho thấy sự thủy phân protein từ đậu nhỏ lớn hơn đậu lớn trong suốt quá trình nửa sau của quá trình lên men khi giá trị pH của sản phẩm tăng do hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn. Điều này có thể gây ra mùi và vị mạnh hơn của Natto làm từ đậu nhỏ so với đậu lớn. Natto từ đậu nhỏ có mùi đặc trưng yếu hơn và cho thấy tốc độ thủy phân protein chậm hơn mặc dù mùi Natto như vậy vẫn có thể chấp nhận. • Ngâm đậu - Mục đích: chuẩn bị cho quá trình hấp chín. 51
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Biến đổi: ✓ Vật lý: đậu trương, mềm, tăng khối lượng và thể tích ✓ Hoá học: tinh bột, protein hút nước trương nở - Cách tiến hành: Đậu tương được ngâm nước qua đêm cho trương nở. Dừng ngâm nước khi quan sát thấy có hiện tượng sủi bong bóng trên bề mặt nước ngâm. • Nấu đậu - Mục đích: Phá vỡ cấu trúc, phá vỡ thành tế bào để vi sinh vật có thể xâm nhập vào tận lõi hạt. - Biến đổi: ✓ Vật lý: nhiệt độ và áp suất tăng, đậu mềm, dễ dàng bóp nát. ✓ Hoá Học: cấu trúc và thành tế bào của đậu tương bị phá vỡ ✓ Sinh Học: tiêu diệt một số vi sinh vật không mong muốn - Cách tiến hành: Đậu tương sau khi ngâm sẽ được cho vào nồi áp suất và tiến hành nấu ở chế độ nấu đậu trong 45 phút. Đậu nành chín được cho vào các khay tiệt trùng để ráo nước với chiều dày lớp đậu tương vừa phải để vi sinh vật đủ oxy để có thể phát triển chuẩn bị cho quá trình lên men. • Lên men (nhiệt độ 38OC, thời gian 24h) - Mục đích: tạo điều kiện thuận lợi để vi khuẩn lên men Natto - Biến đổi: ✓ Vật lý: đậu chuyển sang màu nâu sữa, bóng, sinh mùi đặc trưng, sinh sợi protein trắng, có độ nhớt cao ✓ Hoá Học: vi sinh vật lên men Natto tiết ra enzyme protease đã phá vỡ các cấu trúc protein trong đậu tương các axit amin dễ tiêu hóa, một phần acid amin bị phân huỷ tiếp tạo thành amoniac kết hợp với các chất sau lên men tạo nên mùi đặc trưng của Natto. Ngoài ra còn có các enzyme khác như: lipase, amylase, cellulase, urease thuỷ phân các hợp chất phức tạp trong đậu nành thành các chất đơn giản. 52
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ✓ Sinh Học: vi sinh vật lên men Natto phát triển mạnh, chiếm ưu thế - Cách tiến hành: Đậu nành đã hấp chín đựng trong khay sẽ được trộn với dung dịch giống chứa Bacillus subtilis Natto rồi đưa vào thiết bị ổn nhiệt để ủ lên men trong điểu kiện hiếu khí ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Dừng quy trình khi đậu nành chuyển sang màu nâu sữa, bóng và có mùi đặc trưng. Chuyển sang giai đoạn giữ lạnh. • Giữ lạnh - Mục đích: tạo hương vị, màu sắc, trạng thái của sản phẩm. - Biến đổi: ✓ Vật lý: nhiệt độ thấp, đậu chuyển sang màu nâu đặc trưng của Natto. ✓ Hoá Học: protein trong đậu nành dần bị phân huỷ hết thành axit amin, ở nhiệt độ thấp, axit amin hình thành hệ gel, kéo sợi. ✓ Sinh Học: quá trình lên men chậm dần, kích thích tạo nhớt - Cách tiến hành: Đậu nành sau khi lên men được đựng vào từng khay tiệt trùng, bọc kín và đưa vào giữ lạnh ở nhiệt đô 4oC trong 1 ngày sau đó có thể chuyển lên ngăn đá của tủ lạnh để bảo quản và dùng dần trong 1 năm. Trước ngày ăn thì để xuống ngăn mát của tủ lạnh cho rã đông 3.5. Đánh giá chất lượng sản phẩm Natto 3.5.1. Chất lượng cảm quan: Sau khi thực hiện các khảo sát, người thực hiện có được các thông số tối ưu cho việc chế biến sản phẩm Natto. Nhằm kiểm tra chất lượng sản phẩm theo cảm quan, người thực hiện đề tài đã tiến hành so sánh cảm quan với mẫu Natto thương phẩm được nhập từ Nhật Bản, mua tại Tokyo Shop (15A8 Lê Thánh Tôn, Phường Bến Nghé, Quận 1, TPHCM) 53
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.8. Natto sản xuất thử nghiệm (hình trái) và Natto thương phẩm của Nhật Bản (hình phải) Bảng 3.15. So sánh cảm quan của Natto sản xuất thử nghiệm và Natto thương phẩm của Nhật Bản. Các chỉ tiêu Natto sản xuất thử Natto thương phẩm của nghiệm Nhật Bản Màu Sắc Nâu nhạt Nâu đậm Bề mặt hạt đậu Trơn, nhẵn, bóng Trơn bóng, hơi sần Kích thước hạt đậu Rộng 3-4mm Rộng 2-3mm Dài 8-10mm Dài 4-5mm Trạng thái Hạt đậu mềm, nhớt, khi Hạt đậu khá mềm, nhớt dùng đũa trộn đều có kéo mạnh, khi dùng đũa trộn sợi protein màu trắng, dài. đều có kéo sợi protein Các hạt đậu hơi dính với trắng, dài hơn. Các hạt nhau. đậu dính với nhau. Mùi đặc trưng Mùi khá mạnh, khó chịu. Mùi nhẹ, dễ chịu hơn. Vị Có độ bùi, nhớt, hơi ngọt, Có độ bùi, ngọt, nhớt, vị vị nhạt, khó ăn. đậm hơn, khó ăn. 54
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhận xét: Dựa vào bảng 3.15 nhận thấy điểm tương đồng của Natto sản xuất thử nghiệm và Natto thương phẩm khá cao. Sự sai khác về kích thước có được là do Natto sản xuất thử nghiệm được làm từ đậu nành của Việt Nam, khác với đậu nành dùng để sản xuất Natto thương phẩm có nguồn gốc từ Nhật Bản. Sự sai khác về kích thước cũng như tỷ lệ các thành phần hóa học của 2 loại đậu nành cũng làm ảnh hưởng đến độ nhớt, mùi, vị, trạng thái của sản phẩm. Ngoài ra, ở các nhà sản xuất Natto khác nhau, người ta còn cho thêm một số phụ gia khác nhau để tạo nên cái riêng cho doanh nghiệp. Vì vậy đề tài này cần được nghiên cứu và mở rộng thêm để có thể sản xuất được sản phẩm Natto một cách chính xác nhất. Bảng 3.16. Đánh giá cảm quan sản phẩm Natto hoàn thành của các cảm quan viên Cảm quan viên Hệ số Điểm Điểm Các chỉ tiêu cảm trung bình trung bình 1 2 3 4 5 quan có hệ số Trạng thái 5 4 5 4 4 4,4 1,2 5,28 Màu 4 4 4 4 5 4,2 0,8 3,36 Mùi 4 5 4 4 4 4,2 1 4,20 Vị 5 4 4 5 4 4,4 1 4,40 Tổng điểm trung bình 17,24 Nhận xét: Dựa vào bảng 3.16 nhận thấy sản phẩm Natto có điểm cảm quan là 17,24 đạt loại khá. Mặt khác, sản phẩm cũng thỏa mãn điều kiện cần là điểm trung bình của các chỉ tiêu lớn hơn 2,8. Như vậy, sản phẩm đạt loại khá. 3.5.2. Chất lượng hóa học và vi sinh vật Bảng 3.17. Thành phần hóa học và vi sinh vật của sản phẩm Chỉ tiêu Kết quả pH 5 Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU/g) < 10 Coliform tổng số (CFU/ml) 0 E.coli (CFU/ml) 0 55
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.6. Sơ bộ tính kinh tế cho sản xuất 1 kg Natto tại phòng thí nghiệm Bảng 3.18. Chi phí nguyên liệu sản xuất 1 kg Natto tại phòng thí nghiệm Nguyên liệu Số lượng Đơn giá Thành tiền Đậu nành 0,6 kg 18.000 VND/kg 10.800 VND Men giống Natto 5 g 240.000 VND/3g 400.000 VND Tổng chi phí sản xuất 410.800 VND Nhận xét: Sơ bộ tính kinh tế cho sản xuất 1 kg Natto tại phòng thí nghiệm khoảng 410.800 VND trong khi đó Natto thương phẩm được nhập từ Nhật có giá 19.000 VND/hộp có trọng lượng 35g tương đương khoảng 540.000 VND cho 1 kg Natto. Vì thế nếu sản xuất được Natto tại trong nước sẽ mang lại nguồn lợi nhuận kinh tế rất lớn. 56
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Qua quá trình nghiên cứu, thu thập số liệu và tổng hợp các kết quả thu được, đề tài rút ra được kết luận như sau: 1. Hàm lượng dịch men giống tốt nhất cho quá trình lên men là 0,25ml dịch men giống (1g/ml) cho 50g đậu nành đã hấp chín, tương đương với tỷ lệ là 0,5%. 2. Điều kiện lên men tối ưu là nhiệt độ 38OC, thời gian lên men 24h và ở môi trường pH = 6-7 (pH của đậu nành sau khi nấu chín) 3. Đã xây dựng được quy trình sản xuất Natto từ đậu nành Việt Nam, sản phẩm đạt chất lượng như sau: Về vi sinh vật: không có vi sinh vật gây bệnh. Về cảm quan: - Đã so sánh với Natto thương phẩm của Nhật đạt tương đương. - Kết quả đánh giá cảm quan từ hội đồng được 17,24 điểm, đạt loại khá. 4. Sơ bộ tính kinh tế cho sản xuất 1 kg Natto tại phòng thí nghiệm khoảng 410.800 VND thấp hơn so với Natto thương phẩm được nhập từ Nhật có giá khoảng 540.000 VND/kg Natto, đạt tiêu chí về kinh tế của đề tài. Kiến Nghị: Natto là một loại thực phẩm có rất nhiều lợi ích và nó đã, đang và sẽ được sử dụng rộng rãi như một sản phẩm chức năng. Ở nước ta Natto còn phải nhập khẩu nên giá khá cao và thị trường của Natto còn hạn chế. Nhưng trong tương lại, nhu cầu về Natto sẽ tăng lên và việc sản xuất Natto trong nước sẽ đem lại hiệu quả kinh tế không hề nhỏ cho người trồng đậu nành cũng như các nhà sản xuất Natto. Do đồ án thực hiện trong khoảng thời ngắn, thiết bị thí nghiệm còn nhiều hạn chế nên việc nghiên cứu nên không thể khảo sát hết các yếu tố có liên quan đến chất lượng của sản phẩm cũng như tính thương mại. 57
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Với những lý do trên người thực hiện đề tài đề nghị: - Cần lên men Natto ở các khối lượng đậu nành cao hơn để đạt kết quả chính xác hơn. - Cần nghiên cứu thêm về B.Natto nhằm tăng sinh tạo giống thuần chủ để giảm chi phí mua men giống từ nước ngoài. - Cần lên men Natto ở các điều kiện pH chi tiết hơn trong khoảng từ 6-7 để đạt được kết quả chính xác nhất. - Cần phải có nhiều nghiên cứu hơn để xác định cũng như thông báo cho người tiêu dùng về những lợi ích dinh dưỡng và y học to lớn mà Natto mang lại. - Nghiên cứu điều kiện và thành phần phụ gia thích hợp nhất để sản xuất Natto chất lượng cao, phù hợp cho người Việt Nam với chi phí thấp và có thể sản xuất theo dây chuyền công nghiệp. 58
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nam [1] Lê Độ Hoàng, Đặng Trần Phú, Nguyễn Uyển Tâm, Nguyễn Xuân Hiển (1997), Tư liệu về cây đậu tượng, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. [2] Nguyễn Đức Lượng chủ biên (2003), Thực tập Công nghệ sinh học, tập 2 – Thí nghiệm vi sinh vật học, Trường Đại học Quốc gia TPHCM, trường ĐH Bách Khoa, NXB Đại học Quốc gia, TPHCM. [3] Nguyễn Đức Lượng (2006), Công nghệ vi sinh - Tập 3: Thực phẩm lên men truyền thống, NXB ĐHQG, TP HCM. [4] Hà Duyên Tư (2006), Kỹ thuật phân tích cảm quan thực phẩm, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật. [5] Đồng Thị Thanh Thu (2000), Sinh hóa ứng dụng, NXB ĐHQG, TP HCM. [6] Lê Chiến Phương, Võ Thanh Trang (2007), Nghiên cứu chế biến phomai đậu nành, tóm tắt kỷ yếu hội nghị khoa học và công nghệ, Viện sinh học Nhiệt đới, TPHCM. [7] Nguyễn Trọng Cẩn (chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, Công nghệ enzyme, NXB Nông Nghiệp – Tp.HCM (1998) [8] Tạp chí National soybean research laboratory, số ra ngày 13/2/2006. [9] Tạp chí Y khoa Naval, Đại học Y khoa Hokkaido, 1936-1939. [10] Bài báo Natto – loại đậu nành độc đáo ở Nhật (biên tập viên của tuần báo Tỉnh Thức) [11] Hồng Lê Thọ. Đậu nành – Nattokinase và khảng năng ngăn ngừa các bệnh tim mạch. 59
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tài liệu tiếng nước ngoài [12] Dr. Jame Zhou, Ph.D(1999), “Soy Isoflavones: A Review of Literature and Use”, Focus on Allergy Research Group newsletter. [13] Sakar PK, Cook PE and Owens ID (1993), Bacillus fermentation of soybean World J Microbiol Biotechnol. [14] Doerge and Sheehan, Letter to the FDA, Feb 18, 1999. [15] Lephart ED, Thompson JM, Setchell KD, Adlercreutz H, Weber KS, Phytoestrogens decrease brain calcium-binding proteins Brain Res 2000 Mar 17;859(1):123-32. [16] Setchell, K. D. R., “Phytoestrogens: the biochemistry, physilogy, and implications for human health of soy isoflavones”, American Journal of Clinical Nutrition, 68 (Supplement): 1333S-46S, 1998. [17] Peter Golbitz and Joe Jordan (2006), Soy Application in Food, Chapter 1 - Soyfoods: Market and Products, Published by CRC Press Taylor & Francis Group. [18] Soomro, AH, T.Masud, Kiran Anwaar (2002) “Role of Lactic acid bacteria (LAB) in food preservation and human health-A review”, Pakistan Journal of Nutrition (1), 20-24. [19] Stephen A.Norrell, Karen E.Mesley (1997), Microbiology Laboratory Manual, principles and applications, Prentice Hall Inc., New Jersey. Tài liệu trên Internet [20] [21] [22] 54&frmMode=View&snewsid=276 [23] [24] 60
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [25] nhung-mon-an-quoc-hon-quoc-tuy-cua-nhat-ban.aspx [26] Natto-ngon-bo-re/ [27] gioi [28] [29] [30] tac-hai-cua-hat-dau-nanh-a98253.html [31] dau-nanh.aspx 61
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC A. Nattokinase Trong thời gian gần đây, chúng ta nghe nhắc nhiều đến Nattokinase với nhiều tác dụng khác nhau, đặc biệt có thể mang tới cho chúng ta một sức khỏe tốt hơn, nâng cao chất lượng sống của con người. Vậy Nattokinase là gỉ? 1. Nattokinase là gì? Nattokinase là một enzyme được tìm thấy trong loại đậu lên men Natto - món ăn truyền thống của người Nhật. Nattokinase có tác dụng làm tan cục máu đông vốn là nguy cơ gây tắc mạch máu dẫn đến tai biến, đột quỵ. 2. Nattokinase được tìm thấy như thế nào? Nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về sự bí ẩn của Natto là tiến sĩ K.Yabe, một chuyên gia về vi sinh học công bố những kết quả tìm tòi của ông về sự lên men của Natto vào năm 1894, ghi lại rằng “Natto, một loại phomai thực vật” để giới thiệu với các nước phương tây vốn rất quen thuộc với các loại phomai từ sữa bò hay sữa dê. Quân đội Nhật Bản trong thời chiến tranh Nhật-Nga (1904) đã phải ăn ngày 3 bữa bằng Natto với cơm nhờ vậy binh lính gìn giữ được sức khỏe không bị đau bụng, tiêu chảy hay táo bón trên đường hành quân. Vào năm 1905 Tiến sĩ Shin Sawamura (đại học Tokyo) đã thành công trong việc tách 2 loại vi khuẩn Natto từ đậu nành nấu chín, trong đó vi khuẩn gây ra mùi hương đặc biệt làm hạt đậu lên men (Bacillus Natto) Sở dĩ các nhà khoa học Nhật Bản đã cất công nghiên cứu về thực phẩm độc đáo này vì cho rằng đây là một thức ăn giúp con người sống lâu, giữ gìn được sức khỏe trong đó có 4 nhà nghiên cứu ăn hằng ngày Natto, đã sống đến 80,4 tuổi vào những năm 1900 là bằng chứng cụ thể. Việc tìm tòi để sản xuất theo lối công nghiệp sản phẩm Natto được nghiên cứu liên tục ở các trường đại học Nhật Bản (như giáo sư Hazawa Jun ở ĐH Hokkaido) ứng dụng các loại enzyme có tính năng tương tự với enzyme từ rơm rạ để phục vụ quân đội viễn chinh Nhật Bản ở Mãn Châu, Trung Quốc từ năm 1919. Từ đó, Natto đã trở thành thực phẩm chủ yếu cho quân đội viễn chinh trong thế chiến thứ hai và ngày càng phổ cập đến nhân dân. Qua thống 1
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP kê chúng ta có thể thấy từ mức tiêu thụ Natto 39.000 tấn năm 1958 tăng vọt lên đến 170,000 tấn/năm 1982 chứng tỏ Natto đã trở thành lương thực dinh dưỡng mà bình quân người Nhật sử dụng 1,42 kg/năm (và hiện nay là khoảng 2 kg/năm). Natto đã trở thành một đề tài nóng hổi khi TIẾN SĨ Sumi Hiroyuki tung ra những kết quả bất ngờ về hiệu quả của Natto trong việc làm tan các huyết khối trong động mạch - một trong những nguyên nhân suy tim và tử vong của bệnh nhân bị các chứng xơ vữa động mạch vành hay đột quỵ vì nghẽn hay xuất huyết não - vào năm 1980, Trong bữa cơm trưa tại nhà ăn của đại học Y khoa Chicago, Sumi lấy một mẫu Natto - món ăn quen thuộc của ông - đặt vào khay thủy tinh có cục máu đông thì 18 giờ sau cục máu đông nầy tan rã dễ dàng, điều đó gợi ý rằng trong Natto có thể có một hay nhiều hoạt chất có thể phẩn hủy huyết khối nhờ thủy phân sợi Fibrin - có khả năng làm đông máu (tụ máu) để ngăn chứng xuất huyết nội. Sumi bắt đầu lưu ý tới vai trò của “Nattokinase” và Vitamin K2 có trong Natto để chứng minh nó là hoạt chất giúp cho người Nhật Bản sống lâu, làm tăng khả năng tạo ra plasmin nội sinh giúp cho cơ thể tránh được tai biến hay đột quị bởi huyết khối hay các chứng xơ vữa động mạch, suy tim biến chứng gây nên. Theo kết quả nghiên cứu của 3 cơ quan y tế - đại học bang Oklahoma (Mỹ), JCR Pharmaceuticals (NB) và Trường Y khoa Miyazaki – phối hợp thử nghiệm trên cơ thể người (in vivo) bằng cách cho ăn Natto 200 g/ngày và đã kiểm chứng được những hiệu ứng kể trên, đặc biệt phát hiện lượng Plasmin nội sinh giảm sụt ở người cao tuổi không đủ để làm tan huyết khối, vón cục trong động mạch thì hiệu quả càng rõ rệt. Năm 1986, TIẾN SĨ Sumi Hiroyuki công bố toàn bộ kết quả nghiên cứu về tác dụng của Nattokinase sau khi thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khác nhau để so sánh, xác định Nattokinase là một loại enzyme mang khả năng phân hủy huyết khối một cách hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại enzyme, gấp 4 lần Plasmin - enzyme nội sinh làm tan máu đông - đồng thời tuyệt đối an toàn cho cơ thể khi hấp thụ qua đường ăn uống. 2
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3. Lợi ích của Nattokinase - Làm tan cục máu đông: Nattokinase làm tan cục máu đông bằng cách làm tan sợi fibrin (chất sợi buộc các tiểu cầu vón kết lại với nhau hình thành cục máu đông). Nattokinase hoạt động mạnh gấp 4 lần plasmin nội sinh (loại enzyme duy nhất trong cơ thể làm nhiệm vụ phá tan sợi fibrin) với cơ chế tương tự như plasmin này. Do sức khỏe và tuổi tác, cơ thể giảm sản sinh plasmin càng làm tăng nguy cơ hình thành cục máu đông. Nattokinase cũng giúp tăng cường plasmin của cơ thể và các thành phần chống đông máu khác như urokinase ( Sumi. H et al. “a novel fibrinolytic enzyme (Nattokinase) in the vegetable cheese Natto ” experience 1987). - Huyết áp: Nattokinase làm giảm huyết áp. Người Nhật ăn loại đậu lên men đã hơn 1000 năm vì mục đích này. Các nghiên cứu chỉ ra rằng nó làm giảm huyết áp bằng cách ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin (ACE). ACE khiến mạch máu bị hẹp lại và huyết áp tăng cao. (Maruyama M. & Sumi H. effect on Natto diet on blood pressure, JTTAS 1995). - Các lợi ích khác: làm chắc xương, trợ giúp đau khớp, giảm nhức đầu, kháng khuẩn, ngừa bệnh tả, thương hàn, bệnh lị. - Cục máu đông làm tắc mạch máu là nguyên nhân chính dẫn đến sa sút trí nhớ, xuất huyết não, nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực và trĩ. Lợi ích tuyệt vời từ Nattokinase hứa hẹn mang lại nhiều lợi ích cho những người bệnh này. 4. Cơ chế hoạt động của Nattokinase Không giống như aspirin và hầu hết các thuốc chống đông máu khác sẽ ức chế sản xuất fibrin, Nattokinase trực tiếp làm tiêu sợi fibrin nên giải phóng tiểu cầu và giải tỏa những khu vực mà dòng máu lưu thông bị cản trở không cần thiết. Bằng cách kích thích cơ thể tăng cường sản xuất plasmin, Nattokinase không những giúp làm tan cục máu đông đã hình thành mà còn hoạt động như một thành phần chống hình thành cục máu đông (tác dụng kép). Nattokinase cũng ức chế Plasminogen Activator PAL -1 vốn là thành phần hạn chế hoạt động của plasmin trong cơ thể. 3
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP (“Ngăn chặn đột quỵ và tai biến với enzyme mạnh có khả năng làm tan cục máu đông trong nhiều giờ”- Viện khoa học sức khỏe Health Sciences Institude, March 2002). 5. Tác dụng phụ Người Nhật Bản ăn đậu Natto đã hơn 1000 năm, các sản phẩm chiết xuất Natto có mặt trên thị trường gần 20 năm mà chưa hề thấy có báo cáo về tác dụng phụ. Trên thực tế Nattokinase đã chứng tỏ giá trị như một loại thuốc hạn chế đông máu như Wafarin, Heparin mà không gây phản ứng bất lợi nào, kể cả dị ứng. Nattokinase an toàn cho mọi lứa tuổi và có vẻ như không có giới hạn về lượng có thể được hấp thụ một cách an toàn. Tuy nhiên, do khả năng làm tan cục máu đông mạnh nên những người bị rối loạn chảy máu, như bệnh haemophiliacs, không nên dùng Nattokinase. Những người có vấn đề chảy máu liên tục, chẳng hạn như viêm loét nặng hoặc mới phẫu thuật cũng cần tạm dừng Nattokinase. Những người đã bị chảy máu nội sọ, hoặc những người phẫu thuật thần kinh hay đột quỵ do thiếu máu cục bộ trong vòng sáu tháng không nên dùng Nattokinase. Những người huyết áp rất cao không kiểm soát được (huyết áp tâm thu lớn hơn 200 mmHg hoặc huyết áp tâm trương lớn hơn 110 mmHg) khi dùng Nattokinase cần theo dõi y tế nghiêm ngặt. Nattokinase không nên dùng cho người dùng thuốc chống đông máu, như aspirin hoặc warfarin. Cho đến nay không có nghiên cứu cho thấy khả năng đi vào sữa mẹ của Nattokinase. Bà mẹ mang thai hoặc cho con bú nên tham khảo bác sĩ của họ trước khi sử dụng Nattokinase. Đó là điều cần lưu ý, tuy nhiên phụ nữ mang thai tại Nhật Bản vẫn thường ăn đậu Natto để đảm bảo cho trẻ sơ sinh khỏe mạnh. 6. Tương tác thuốc Nattokinase chưa loại bỏ vitamin K sẽ hạn chế tác dụng chống đông máu của các loại thuốc kháng đông như Wafarin, Aspirin. Những người đang được điều trị bằng thuốc chống đông máu như Wafarin, Aspirin cần được sự tư vấn của bác sĩ khi muốn sử dụng Nattokinase. 4
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 7. Liều dùng Theo các nghiên cứu của giáo sư Sumi, mỗi gram đậu Natto thô trung bình chứa 40FU. Các nghiên cứu trên người có liều dùng từ 50 – 200 g (tương đương với 2000 - 8000 FU) 8. Nghiên cứu lâm sàng - Hoạt động tiêu huyết khối Tiến sĩ Hiroyuki Sumi khám phá ra Nattokinase vào năm 1980 trong khi tiến hành nghiên cứu tại Đại học Chicago. Tiến sĩ thử nghiệm với gần 200 loại thực phẩm và phát hiện ra tiềm năng của đậu Natto khi cho nó vào cục máu nhân tạo và giữ ở nhiệt độ cơ thể. Ông nhận thấy huyết khối bị tan dần và hoàn toàn biến mất sau 18 tiếng. Tiến sĩ Sumi kế tiếp thử nghiệm lâm sàng với con người và động vật. Trong nghiên cứu đầu tiên, 12 tình nguyện viên được cho sử dụng 200 g Natto hàng ngày. Các hoạt động Fibrinolytic máu của họ được đo theo 2 cách. Lấy mẫu máu và kích thích tạo một cục máu đông trong mẫu sau đó đo thời gian cục máu đông tan hoàn toàn. Nhóm sử dụng Nattokinase mất một nửa thời gian so với nhóm đối chứng. Bài kiểm tra thứ hai dùng máu cho vào đĩa với một loại polymerized fibrinogen đặc biệt. Mức độ tan được đo 4 tiếng 1 lần. Nhóm đối chứng cho thấy không tan trong khi nhóm Nattokinase có tốc độ tan là 15 sp/mm. Một thử nghiệm thứ ba sau đó được thực hiện để đo các mô plasminogen activator (tPA) trong máu. Nhóm dùng Nattokinase cho thấy có sự tăng tPA. tPA làm tăng plasmin, do đó các nghiện chỉ ra rằng ngoài khả năng trực tiếp tiêu sợi Fibrin, nó còn tăng cường hoạt động chống hình thành cục máu đông của cơ thể. Tiến Sĩ Sumi cũng tiến hành một thử nghiệm lâm sàng liên quan đến chó. Một cục máu đông được tạo ra trong tĩnh mạch chân của chó gây tắc nghẽn hoàn toàn. Sau 5h nhóm được cho ăn đậu Natto tĩnh mạch đã hoàn toàn lưu thông. Trong khi đó nhóm dùng giả dược vẫn còn những cục máu đông gây tắc nghẽn 18 giờ sau đó.( Sumi H., Hamada, Tiến Syuushima H, H Mihara, Muraki H “a novel fibrinolytic 5
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP enzyme (Nattokinase) in the vegetable cheese Natto ”a typical and popular soybean food in the Japanese diet. Experientia 1987, Oct 15;43(10):1110-1.). Năm 1995, nhà nghiên cứu ở phòng thí nghiệm Nghiên cứu Công nghệ sinh học và JCR Pharmaceuticalscủa Kobe, Nhật Bản đã thử nghiệm hiệu quả của Nattokinase trong việc giảm huyết khối động mạch cảnh trên chuột. Một số chuột được tiêm huyết khối ở động mạch cảnh, nguồn cung cấp dinh dưỡng cho não. Ba enzyme là Nattokinase, plasmin và elastase được dùng để thử nghiệm trên chuột. Elastase cho thấy không mở lại các động mạch bị chặn. Nhóm ăn Plasmin cho thấy lưu thông phục hồi 16% sau một giờ. Còn nhóm ăn Nattokinase cho thấy phục hồi 62% lưu thông trong cùng khoảng thời gian. Kết quả này giúp nhà nghiên cứu kết luận rằng "các kết quả cho thấy các khả năng tiêu fibrin của Nattokinase là mạnh hơn so với plasmin hoặc elastase trong cơ thể" (Sumi H. Healthy Mirobe “Bacillius Natto” – Japan Bio Science Laboratory) Các nhà nghiên cứu từ JCR Pharmaceuticals, Oklahoma State University và Miyazaki Medical College tiến hành một nghiên cứu sâu hơn nữa trong đó có 12 tình nguyện viên được cho uống 200 mg Nattokinase và sau đó theo dõi khả năng tiêu fibrin của họ thông qua một loạt các xét nghiệm huyết tương. Các đối tượng tham gia thí nghiệm cho thấy khả năng phân hủy cục máu đông cao trong 2 - 8 giờ (“Ngăn chặn đột quỵ và tai biến với enzyme mạnh có khả năng làm tan cục máu đông trong nhiều giờ”- Viện khoa học sức khỏe Health Sciences Institude, March 2002) Thành viên của tổ chức JNKA nghiên cứu về sự làm tan thrombus nhân tạo (khối máu đông bao gồm chủ yếu là fibrin) trong các khoảng thời gian. Sau các khoảng thời gian, độ tan được tính theo vòng nhớt trong do Nattokinase tạo thành. 6
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Năm 2003, Long – Flite trong một thí nghiệm mù soát ngẫu nhiên thực hiện bởi Cesarone, et al, Nattokinase và giả dược đã được trao cho các tình nguyện viên trước khi lên một chuyến bay 7 - 8 giờ. 7 trong số 92 người trong nhóm dùng giả dược cho thấy cục máu đông hình thành. Không ai trong số 94 người trong nhóm Nattokinase hình thành cục máu đông (Cesarone MR et al.: Phòng chống huyết khối tĩnh mạch trong các chuyến bay đường dài với Flite Tabs: Các LONG-Flite ngẫu nhiên, thử nghiệm kiểm soát Angiology 2003; 54: T1-T9). . - Hoạt động huyết áp Năm 1995, các nhà nghiên cứu từ Trường y khoa Miyazaki Kurashiki và Đại học Khoa học và Nghệ thuật tại Nhật Bản đã nghiên cứu tác dụng của Nattokinase với huyết áp ở cả động vật và con người. Trong các thử nghiệm chuột được cho uống một liều duy nhất 400 - 450 g Nattokinase. Tính trung bình huyết áp tâm thu (SBP) của chuột giảm 12,7% trong hai giờ. Nhóm người tình nguyện tham gia có huyết áp cao được uống 30 g lyophilized trích xuất (tương đương 100 g Natto). Trung bình huyết áp tâm thu SBP giảm 10,9% và huyết áp tâm trương (DBP) giảm 9,7% (Maruyama M, Sumi H. Ảnh hưởng của chế độ ăn Natto với huyết áp JTTAS,. 1995.). 7
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP B. Điểm giống và khác nhau giữa chao và Natto NATTO CHAO Nguồn gốc Là thực phẩm truyền thống có Là thực phẩm truyền thống có nguồn gốc từ Nhật Bản nguồn gốc từ Trung Quốc Nguyên liệu Đậu nành (đậu tương) Chất thải sau Nước sau khi nấu chín đậu nành Bã đậu nành, nước whey trong quy trình quá trình làm đậu phụ. Vi sinh vật Bacillus subtilis natto Một số loại mốc chao: lên men Actinomurco elegans Murco hiemalia Murco silvaticus Murco sufu Cở sở hoá Sự thuỷ phân các hợp chất phức tạp trong đậu tương (protein, sinh lipid, tinh bột ) thành các chất đơn giản (đường đơn, amino acid ) nhờ các enzyme như: protease, amylase, cellulase, urease được vi sinh vật tiết ra trong quá trình lên men Lợi ích - Ngăn chặn bệnh ung thư - Chống lão hoá - Ngăn chặn chứng loãng xương - Chống loãng xương - Ngăn chặn bệnh đau tim, đột - Chống ung thư quỵ và tình trạng suy nhược cơ - Giảm mỡ bụng thể - Giảm các vấn đề về sinh lý nữ - Tác dụng kháng khuẩn - Ngăn ngừa xơ vữa động mạch - Cải thiện khả năng tiêu hóa và ngăn chặn sự rối loạn trong ruột - Ngăn chặn sự lão hoá và béo phì - Giúp phát triển trí não 8
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP C. Đường chuẩn Tyrozin trong phương pháp Anson cải tiến Bảng 1. Cách pha dung dich tyrozin để dựng đường chuẩn. Hóa chất Ổng nghiệm 0 1 2 3 4 5 Tyrosin (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 HCl 0,2N (ml) 10,0 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 Hút 1 ml từ mỗi ống trên cho vào ống nghiệm khác, sau đó thêm 4 ml Na2CO3 6%, lắc đều rồi thêm 1 ml Folin (đã pha loãng 5 lần). Để yên ở nhiệt độ phòng 30 phút sau đó đo quang phổ ở bước sóng 750 nm. 0.16 y = 2.8514x + 0.002 0.14 R² = 0.9991 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 Hình 1. Biểu đồ đường chuẩn Tyrozin đo ở bước sóng 750 nm 9
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP D. Một số hình ảnh trong lúc nghiên cứu Hình 2. Đậu nành sau khi ngâm qua đêm (trái) và đậu nành sau khi nấu chính (phải) Hình 3. Mô hình ủ lên men Natto 10
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP E. Xử lý số liệu bằng STATGRAPHICS Summary Statistics for ∆(TN – KT) sau 6h ham luong Count Average Standard deviation Minimum Maximum 0,15 3 0,023 0,00264575 0,021 0,026 0,25 3 0,0326667 0,00251661 0,03 0,035 0,50 3 0,0276667 0,00152753 0,026 0,029 0,75 3 0,0473333 0,00650641 0,041 0,054 1,00 3 0,0266667 0,00251661 0,024 0,029 Total 15 0,0314667 0,0093187 0,021 0,054 ANOVA Table for ∆(TN – KT) by ham luong sau 6h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0,00108707 4 0,000271767 21.12 0,0001 Within groups 0,000128667 10 0,0000128667 Total (Corr.) 0,00121573 14 Multiple Range Tests for ∆(TN – KT) by ham luong sau 6h Method: 95.0 percent LSD ham luong Count Mean Homogeneous Groups 0,15 3 0,023 X 1.00 3 0,0266667 XX 0,50 3 0,0276667 XX 0,25 3 0,0326667 X 0,75 3 0,0473333 X Summary Statistics for ∆(TN – KT) sau 12h ham luong Count Average Standard deviation Minimum Maximum 0,15 3 0,045 0,003 0,042 0,048 0,25 3 0,0573333 0,00550757 0,052 0,063 0,50 3 0,053 0,003 0,05 0,056 0,75 3 0,0726667 0,00057735 0,072 0,073 1.00 3 0,055 0,001 0,054 0,056 Total 15 0,0566 0,00973066 0,042 0,073 ANOVA Table for ∆(TN – KT) by ham luong sau 12h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0,00122627 4 0,000306567 30,86 0,0000 Within groups 0,0000993333 10 0,00000993333 Total (Corr.) 0,0013256 14 11
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Multiple Range Tests for ∆(TN – KT) by ham luong sau 12h Method: 95.0 percent LSD ham luong Count Mean Homogeneous Groups 0,15 3 0,044 X 0,50 3 0,053 X 1.00 3 0,055 X 0,25 3 0,0573333 X 0,75 3 0,0726667 X Summary Statistics for ∆(TN – KT) sau 18h ham luong Count Average Standard deviation Minimum Maximum 0,15 3 0,0756667 0,00351188 0,072 0,079 0,25 3 0,103667 0,00450925 0,099 0,108 0,50 3 0,0913333 0,00750555 0,084 0,099 0,75 3 0,068 0,007 0,061 0,075 1.00 3 0,0513333 0,00950438 0,042 0,061 Total 15 0,078 0,0196687 0,042 0,108 ANOVA Table for ∆(TN – KT) by ham luong sau 18h Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0,00495933 4 0,00123983 27.15 0,0000 Within groups 0,000456667 10 0,0000456667 Total (Corr.) 0,005416 14 Multiple Range Tests for ∆(TN – KT) by ham luong sau 18h Method: 95.0 percent LSD ham luong Count Mean Homogeneous Groups 1.00 3 0,0513333 X 0,75 3 0,068 X 0,15 3 0,0756667 X 0,50 3 0,0913333 X 0,25 3 0,103667 X Summary Statistics for ∆(TN – KT) sau 24h ham luong Count Average Standard deviation Minimum Maximum 0,15 3 0,119667 0,0061101 0,113 0,125 0,25 3 0,137333 0,0090185 0,128 0,146 0,50 3 0,102 0,0105357 0,091 0,112 Total 9 0,119667 0,0170734 0,091 0,146 12