Đồ án Nghiên cứu quá trình tách chiết và tinh sạch protein trong rong bún Enteromorpha spp

88 trang thiennha21 12/04/2022 6560

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu quá trình tách chiết và tinh sạch protein trong rong bún Enteromorpha spp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_nghien_cuu_qua_trinh_tach_chiet_va_tinh_sach_protein_t.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu quá trình tách chiết và tinh sạch protein trong rong bún Enteromorpha spp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH PROTEIN TRONG RONG BÚN ENTEROMORPHA SPP. NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG CN. ĐỖ THỊ TUYẾN SVTH: TRẦN LƯƠNG HỒNG YẾN MSSV: 0851110311 Tp. Hồ Chí Minh, năm 2012
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Protein là hợp chất hữu cơ có ý nghĩa quan trọng bậc nhất trong cơ thể sống, về mặt số lượng, protein chiếm không dưới 50 % trọng lượng khô của tế bào, về thành phần cấu trúc, protein được tạo thành chủ yếu từ các amino acid vốn được nối với nhau bằng liên kết peptide. Đối với động vật thủy sản thì nhu cầu protein cao hơn so với động vật trên cạn. Hàm lượng protein trong thức ăn thuỷ sản khoảng từ 18 - 20 % đối với tôm biển, 28 - 32 % cho cá da trơn, 22 - 30 % đối với cá rô phi, 38 - 40 % đối với cá hồi vân. Protein là một trong các chất dinh dưỡng thiết yếu trong việc duy trì hoạt động sống, sự trao đổi chất trong cơ thể, sự tăng trưởng cũng như các chứa năng quan trọng khác. Tuy nhiên trong 20 loại acid amin thì có 10 loại acid amin không thay thế mà động vật thủy sản (ĐVTS) không có khả năng tự tổng hợp. Bên cạnh đó protein cũng là nguồn dinh dưỡng có giá thành rất cao trong khẩu phần thức ăn thủy sản. Nước ta phải nhập khẩu 20 % nguyên liệu giàu năng lượng, 80 % các loại thức ăn bổ sung, 80 - 90 % thức ăn giàu đạm và hơn 90 % chất phụ gia. Vì thế cần tìm ra một nguồn nguyên liệu vừa rẽ tiền vừa đáp ứng được nhu cầu protein đặc biệt là thành phần acid amin (AA) không thay thế. Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, với chiều dài bờ biển hơn 3.260 km và có nhiều nhánh sông, vùng triều, các vùng vịnh, đậm phá đây là điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển đa dạng của các sinh vật biển. Một trong những loài góp phần vào sự đa dạng này là rong biển. Có đến 800 loài rong biển đã được xác định ở Việt Nam. Trong đó nhiều chi có sản lượng tự nhiên lớn Sargassum, Hormophysa, Hydroclathrus (Rong Nâu); Gracilaria, Hydropuntia, Hypnea (Rong Đỏ); Ulva, Chaetomorpha, Cladophora (Rong Lục) và một số loài khác đang được nuôi trồng trong ao đìa, vịnh, bãi triều ven biển. Ước tính diện tích mặt nước có tiềm năng nuôi trồng và khai thác rong biển trong thời kỳ 2010 - 2015 là 900.000 ha với sản lượng 600 – 700.000 tấn khô / năm. Nhiều loài có giá trị kinh tế cao, khoảng 121 loài đang được người dân ven biển khai thác. Trong đó có 65 Trang 1
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP loài dùng làm thực phẩm và 56 loài dùng trong công nghiệp chế biến hoặc sản xuất các chất như: agar, carrageenan, alginat Ngành rong lục (Chlorophyta) được xem là một ngành lớn, có nhiều loài, đến nay trên toàn thế giới biết khoảng 500 chi và 8.000 loài. Phần lớn chúng sống trong nước ngọt gần 90 %, còn lại ở biển và đại dương khoảng 10 %. Trong các biển và đại dương thế giới đã biết 948 loài thuộc 112 chi, 18 họ và 8 bộ. Ở nước ta, hầu hết các loài thuộc bộ Ulvales, Siphonales, đều sống ở biển, hải đảo, vùng cửa sông và các đầm, phá nước lợ ven biển. Trong nước và trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về rong biển được công bố, sản phẩm chính của các công trình là tạo ra đường có thể lên men (ethanol và n - butanol là những phụ gia nguyên liệu cao cấp). Bên cạnh việc phục vụ cho mục tiêu sản xuất ethanol và butanol, thì rong biển còn được dùng để tách protein từ sinh khối có khả năng sử dụng làm thức ăn thương mại cho tôm và cá. Trong đó thì Enteromorpha spp. có chứa khoảng 15 - 20 % protein trong thành phần với tỷ lệ AA thiết yếu rất giống với nhu cầu AA của tôm sú. Việc sản xuất thành công sản phẩm protein thực vật từ rong Enteromorpha spp. để sử dụng trong thức ăn gia súc sẽ góp phần đa dạng hóa các sản phẩm nông nghiệp, giảm phụ thuộc vào nhập khẩu, giảm chi phí chăn nuôi cho nông dân và tăng tính cạnh tranh cho doanh nghiệp. Việc sử dụng rong biển làm thức ăn gia súc đã giải quyết được một phần khó khăn trong nguyên liệu đầu vào của ngành chăn nuôi mà còn làm giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm môi trường bởi các đặc tính sinh học của rong biển. Với những lý do trên, đối với nước ta việc thu nhận các nguồn lợi từ rong biển có ý nghĩa to lớn về khoa học cũng như thực tiễn, đặc biệt là protein từ rong biển Enteromorpha spp. Do đó cần nghiên cứu để tiến tới sản xuất protein ở quy mô công nghiệp phù hợp với nền kinh tế quốc dân. 1.2 Tình hình nghiên cứu rong biển 1.2.1 Tình hình nghiên cứu rong biển trên thế giới Trang 2
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhiều công trình nghiên cứu về rong biển đã được thực hiện trên các khía cạnh đa dạng sinh học, nguồn lợi chế biến, nuôi trồng và tạo giống rong biển. Các nghiên cứu cho kết quả tốt trong việc khai thác và sử dụng tiềm năng của loài thực vật thủy sinh quan trọng này. Các tác giả Brzeski (1997), Chopin et al. (2001) và Neori et al (2004) cho rằng xu hướng tiến tới quản lý nuôi thủy sản tốt hơn, việc kết hợp nuôi các loài thủy sản có cho ăn (tôm, cá) với nuôi các loài thủy sản hấp thụ dinh dưỡng hữu cơ và vô cơ (rong biển, động vật hai vỏ), sẽ là cách tiếp cận hệ sinh thái quan trọng giúp tái sử dụng dinh dưỡng, có lợi chung cho các đối tượng nuôi trồng, đa dạng hóa nguồn thu nhập từ nhiều đối tượng. Nghiên cứu của Amir Neori (2007) xác nhận việc nuôi rong biển trong các hệ thống ao nuôi kết hợp với thủy sản là mô hình quan trọng cho phát triển bền vững ở các vùng ven bờ [20]. Theo Elizabeth (2008), nuôi kết hợp rong và tôm sẽ làm tăng năng suất và chất lượng tôm nuôi. Theo Akiko Isa et al., 2009 “Rong biển đã được nghiên cứu sử dụng trong thực phẩm, công nghiệp và dược phẩm ở nhiều nước trên thế giới. Các thành phần chiết xuất từ rong có giá trị sinh học như beta caroten, các chất chống oxy hóa cũng đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Rong biển rất giàu protein và khoáng chất, có thể tận dụng để sử dụng trong thực phẩm và thức ăn gia súc”. 1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Đối với loài rong Bún (Enteromorpha spp.và Ulva) những nghiên cứu đầu tiên về sinh hóa và tiềm năng ứng dụng của chúng được thực hiện bởi nhóm nghiên cứu của Viện Sinh Học Nhiệt Đới trong khuôn khổ dự án FSPS II/SUDA 3.3.4 năm 2009 (do DANIDA tài trợ). Các loài rong này mọc tự nhiên nhiều trong ao nuôi tôm nước lợ quãng canh, người nuôi tôm rất thích sự hiện diện của rong này trong ao nuôi tôm so với các loài rong khác và cho rằng rong xuất hiện nhiều sẽ giúp cải thiện môi trường ao nuôi, làm thức ăn cho tôm và cải thiện năng suất của tôm.[4] 1.3 Mục đích nghiên cứu Trang 3
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nghiên cứu quá trình tách chiết và tinh sạch protein từ rong Enteromorpha spp. để bổ sung vào thành phần thức ăn cho tôm và cá. 1.4 Nội dung nghiên cứu - Xác định chỉ tiêu sinh hóa trong rong Enteromorpha spp. - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình tách chiết protein trong rong Enteromorpha spp. + Xác định tỷ lệ nước cần ngâm rong (w/v). + Xác định thời gian cần nghiền rong. + Xác định thời gian, nhiệt độ, % NaOH ủ rong. - Thu nhận được protein thông qua dịch chiết thu từ rong Bún Enteromorpha spp. + Xác định tỷ lệ cồn tối ưu để tủa protein trong dịch chiết. + Xác định % TCA tối ưu để tủa protein trong dịch chiết. + Xác định pH HCl tối ưu để tủa protein trong dịch chiết. - Tinh sạch protein qua sắc ký lọc gel Biogel P - 100. - Xác định các thành phần AA trong protein của rong. 1.5 Phương pháp nghiên cứu - Nghiên cứu lý thuyết. + Thu thập tài liệu trong và ngoài nước có liên quan đến nội dung nghiên cứu. +Tổng hợp phân tích, so sánh và đánh giá lựa chọn hướng nghiên cứu phù hợp. +Phân tích đánh giá điều kiện thực tế về kỹ thuật, kinh tế, xã hội để xác định giới hạn nghiên cứu và phương án thực nghiệm. - Nghiên cứu thực nghiệm. Trang 4
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP + Lập kế hoạch thực hiện thí nghiệm. Xử lý kết quả bằng Excel và phần mềm Stapraphics. 1.6 Giới hạn đề tài Vì lý do giới hạn về thời gian đề tài chỉ thực hiện nghiên cứu quá tình tách chiết, tinh sạch protein trên gel Biogel P - 100, xác định thành phần AA trong protein của rong. 1.7 Tính cấp thiết của đề tài Đề tài là một phần nghiên cứu nằm trong “dự án phát triển nhiên liệu sinh học từ rong biển tại Việt Nam” (Hợp tác giữa Viện Sinh Học Nhiệt Đới (ITB) và SenterNovem với Algen Sustainables ) nhằm mục đích sử dụng nguồn sinh khối rong biển bền vững tách protein sử dụng làm thức ăn thương mại cho tôm và cá. Công nghiệp thức ăn gia súc đang chật vật với việc đưa protein vào thành phần thức ăn với giá thành hợp lý. Việc sản xuất thành công sản phẩm protein thực vật từ rong để sử dụng trong thức ăn gia súc sẽ góp phần đa dạng hóa các sản phẩm nông nghiệp, giảm phụ thuộc vào nhập khẩu, giảm chí phí chăn nuôi cho nông dân và tăng tính cạnh tranh cho doanh nghiệp. Phù hợp với nền kinh tế quốc dân. Đồng thời giảm được ô nhiễm môi trường nước (hiện tượng phú dưỡng hóa) do sự phát triển ồ ạt không kiểm soát được của rong. Trang 5
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về rong bún Enteromorpha spp. Enteromorpha spp. là chi thuộc họ Ulvaceae phân bố trên toàn thế giới, trong nhiều loại môi trường khác nhau. Trên các biển thế giới thống kê 35 loài. Việt Nam có 11 loài và 1 thứ. Chi này được phổ biến rộng rãi ở phía tây bắc Châu Âu, Enteromorpha spp. được biết đến là một loài chiếm ưu thế trong vùng đất ngập nước mặn ven biển. Tất cả các loài Enteromorpha spp. nổi hoặc "di chuyển" lơ lửng. Enteromorpha spp. cũng có thể phát triển trên nhiều loại chất nền, trên cát, bùn, đá, và thậm chí cả bê tông, gỗ hoặc kim loại. Enteromorpha spp. cũng có thể phát triển mà không cần đến giá thể. Ở nước ta loại rong này được tìm thấy nhiều ở các ao hồ nuôi tôm huyện Cần Giờ, Bạc Liêu, chúng phân bố ở vùng nước cạn có đáy mềm (cát, cát bùn, bùn cát ) trong các đầm, phá, vịnh và cả trong các ao nuôi tôm bỏ hoang, có tốc độ phát triển rất nhanh nơi vùng biển ấm và các vùng nước lợ ĐBSCl. 1.1.1 Đặc điểm sinh học của rong Enteromorpha spp. 1.1.1.1 Hệ thống phân loại của rong Enteromorpha spp. Rong Bún Enteromorpha spp. nằm trong ngành rong lục (Chlorophyta), tên thường gọi là Gutweed. Giới: Plantae Ngành: Chlorophyta Lớp: Ulvophycea Bộ: Ulvales Họ: Ulvaceae Hình 1.1:Rong Bún Enteromorpha spp. Chi: Enteromorpha spp. (Nguồn: Beachwatchers.wsu.edu) 1.1.1.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo Trang 6
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình thái Thân có dạng trụ tròn hình ống, dạng túi hay phiến dẹp, có xoan từ gốc đến ngọn ở giữa hoặc hai bên hay chỉ một phần ở gốc, bàn bám dạng đĩa, chia nhiều nhánh hoặc không phân nhánh có một hay nhiều hàng tế bào. Nhìn từ bề mặt, tế bào hình chữ nhật hay hình vuông, sắp xếp thành hàng dọc hoặc không có quy luật, một hạt, một thể sắc tố dạng bản, một hoặc nhiều hạt tạo bột. Chiều dài thân chính từ 5 - 10 cm và có thể lên đến 70 cm tùy thuộc vào các loài trong chi và đường kính thân có thể đạt tới 25 mm. Màu xanh lá cây hay màu nâu nhạt. Cấu tạo tế bào Vỏ tế bào do nguyên sinh chất phân hóa tạo ra, gồm có cellulose ở phía trong và pectin ở phía ngoài. Chất nguyên sinh tạo thành lớp mỏng ở sát thành vỏ tế bào : ở giữa tế bào là một không bào lớn chứa đầy dịch tế bào. Thể sắc tố có các dạng phiến , đai vành móng ngựa, hình sao nhiều cạnh, hình xoắn lò xo, mắt lưới dạng hạt nhỏ . Sắc tố chủ yếu là chlorophyll a, chlorophyll b làm cho rong có màu xanh. Trong thể sắc tố còn có các hạt tạo bột hình tròn nhỏ giàu protit. Hạt tế bào thường nằm giữa khoang túi dịch bào hay sát thành lớp nguyên sinh. Thể nhiễm sắt hình que ngắn hay hạt nhỏ, số lượng ít. Sản phẩm đồng hóa là tinh bột hoặc đôi khi là chất bơ. Trong dịch bào, sản phẩm của quá trình trao đổi chất chủ yếu là đường, tannin, canxi sunfat và các chất có màu antocyan. Trang 7
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.2: Cấu tạo tế bào của rong Enteromorpha spp. Bắt đầu khi phát triển, các tế bào của chúng tạo thành một hàng duy nhất, cấu trúc này là monosiphonous. Ngay sau khi các sợi monosiphonous được hình thành, sau đó sợi sẽ phân chia dọc theo các tế bào tạo ra một sợi hai lớp. Cuối cùng, sau qua trình phân chia tế bào nhiều hơn hai lớp tế bào riêng biệt tạo nên hình ống, cũng là hình thái học khi chúng trưởng thành. Các tế bào bên trong Enteromorpha spp. có thể khác nhau về kích thước và hình dạng từ loài này sang loại khác. Mỗi tế bào chứa duy nhất một lục lạp, các lục lạp này có kích cỡ khác nhau tùy thuộc vào kích thước của tế bào. 1.1.1.3 Hình thức sinh sản và dạng sống Sinh sản Giống như nhiều loại rong khác, Enteromorpha spp. có sự luân phiên giữa các giai đoạn sống vô tính và sinh sản. Cả hai giai đoạn sống tương tự nhau về hình thái. Tuy nhiên, thể bào tử có hai bộ nhiễm sắc thể, ký hiệu là (2N), trong khi thể giao tử chỉ có một bộ nhiễm sắc thể (1N). Sinh sản vô tính bằng bào tử động, có 2 - 4 roi; mỗi tế bào dinh dưỡng có 4 - 8 - 16 bào tử động. Sinh sản hữu tính bằng giao tử đẳng hình hay dị hình, 2 roi hình thành giống như bào tử động. Giao tử có thể nảy mầm đơn tính không có sự giao phối. Giao tử và bào tử động phát sinh thành những dạng sợi một hàng tế bào, sợi này chia cắt ngay thành các chồi hình ống thẳng đứng hoặc hình thành bàn bám một Trang 8
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP lớp tế bào, trên bàn bám xuất hiện chồi thẳng đứng một hàng tế bào, sau đó tế bào chia cắt ngang và dọc tạo ra nhiều hàng tế bào. Trong sơ đồ sau đây, thông qua quá trình nguyên phân, giao tử được sản xuất bởi thể giao tử, sau đó chúng cùng tham gia và phát triển thành một thể bào tử. Các thể bào tử sau đó sẽ trải qua quá trình giảm phân, sản suất bào tử động (sinh sản vô tính tế bào), và mỗi bào tử phát triển thành một thể giao tử. Thể giao tử sau đó sản xuất nhiều giao tử và chu kỳ được tiếp tục. Hình 1.3 : Sơ đồ vòng đời của rong Enteromorpha spp. Dạng sống Chúng phát sinh, nảy mầm từ những bào tử lúc còn non bám vào vật bám, phát triển đến một giai đoạn nào đó tự rời vật bám sống tự do tạo thành bè mảng. Mặc khác những loài sinh sản dinh dưỡng bằng hình thức nảy mầm tái sinh những đoạn thân đứt gãy cũng tạo nên dạng sống tự do. 1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của rong Enteromorpha spp. Nghiên cứu của Anna I. Sousa (2007) [21] cho kết quả nồng độ muối, ánh sáng và dinh dưỡng có tác động lớn đến sự nảy mầm và sinh trưởng của bào tử Enteromorpha spp. Trang 9
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Độ mặn Enteromorpha spp. có thể chịu được độ mặn thay đổi từ nước ngọt đến nước biển từ 34 - 8 ‰và các báo cáo trước đây cho thấy sự có mặt của Enteromorpha spp. trong các suối nước muối và muối mỏ [30]. Ngoài ra Enteromorpha spp. có thể phát triển trên bờ biển đại dương, trong vùng nước lợ, và nội địa trong nước ngọt. Dòng chảy và lưu thông nước Rong phát triển tốt ở vùng nước thường xuyên trao đổi và luân chuyển (tạo ra dòng chảy, dòng triều hay sóng gió bề mặt). Nước bị tù hay di chuyển kém làm cho tốc độ phát triển của rong Enteromorpha spp. chậm lại, đặc biệt nếu kết hợp với nhiệt độ cao, chất huyền phù trong nước lớn, hàm lượng các muối dinh dưỡng thấp sẽ dẫn đến sự tàn lụi của rong một cách nhanh chóng. Nhiệt độ Rong bún Enteromorpha spp. sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 17 oC trở lên. Nhiệt độ tối ưu thích hợp cho rong sinh trưởng và phát triển nằm trong khoảng 25 - 30 oC, nhiệt độ cao hơn 30 oC hay thấp hơn 17 oC sẽ ảnh hưởng không tốt đến sự phát triển của rong. Cường độ ánh sáng Yêu cầu ánh sáng của rong sụn không cao, thích hợp nhất là khoảng 30.000 - 50.000 lux, ánh sáng cao quá hay thấp quá đều ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển rong. 1.1.3 Thành phần hóa học và polysaccharide của rong Enteromorpha spp. 1.1.3.1 Thành phần hóa học. Thành phần hóa học trong rong Enteromorpha spp. luôn luôn thay đổi phụ thuộc vào trạng thái sinh lý, thời gian sinh trưởng và điều kiện sinh sống (nhiệt độ, địa lý, dinh dưỡng, độ mặn). Trang 10
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trong rong Enteromorpha spp. hàm lượng nước chiếm 80 - 90 % còn lại vài phần trăm chất là khô. Bảng 1.1: Thành phần hóa học của rong bún Enteromorpha spp. Thành phần hóa học trong chất khô % khối lượng khô Protein 15 - 20 % Cacbonhydrate 25 - 29 % Lipid 3,47 - 4,36 % Glucide 37 - 44 % Thành phần hóa học khác 15- 32 % a. Protein Hàm lượng protein thay đổi theo mùa và địa lý, trung bình giá trị dao động từ 9,42 - 20,60 % trọng lượng khô. Điều này được suy ra từ thực tế hàm lượng protein cao nhất trong mùa xuân (vào đầu mùa sinh trưởng) và mùa thu (vào cuối mùa sinh trưởng). Hàm lượng protein lại thấp nhất vào mùa hè. Theo báo cáo của Munda Gubensek (1976, 1986), Owens & Stewart (1983), Tkachenko & Koval (1990) [31], [32], [33], [36]. b. Carbohydrate Carbohydrate là thành phần quan trọng nhất trong quá trình trao đổi chất vì nó cung cấp năng lượng cần thiết cho tế bào hô hấp và trao đổi chất khác. Trong thời gian mùa hè, sau giai đoạn tăng trưởng tối đa đã xảy ra ở mùa xuân, hàm lượng carbohydrate lúc này cao hơn lúc đầu và cho thấy xu hướng dao động thành phần cacbonhydrat trong rong. Thực tế là nhiệt độ nước cao nhất trong mùa hè, cùng với Trang 11
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP bức xạ mặt trời cao trong thời gian đó, làm cho quá trình quang hợp xảy ra mạnh nhất. Quá trình này cũng có thể dẫn đến tăng nồng độ carbohydrate. Các thành phần carbohydrate hòa tan có thể chiếm tới 29 % tổng lượng chất khô của rong [23]. c. Lipid So với protein và carbohydrate, lipid chiếm tỷ lệ tương đối nhỏ trong Enteromorpha spp. Nhiệt độ có ảnh hưởng rất nhiều lên sự hình thành lipid của thực vật, làm chậm cả hai quá trình trao đổi chất và vận chuyển (Jones & Harwood 1993) [28]. Hàm lượng lipid trong Enteromorpha spp. sẽ đạt giá trị tối đa vào đầu mùa xuân và khi nhiệt độ tăng lên thì hàm lượng lipid gần như ổn định cho đến khi kết thúc mùa sinh trưởng, dao động từ 3,47 - 4,36 % khối lượng khô. d. Sắc tố Trong rong Enteromorpha spp. có chứa một số sắc tố như sắc tố xanh lục, sắc tố nâu, dẫn đến việc rong thường có màu nâu nhạt và xanh đậm. e. Chất khoáng Hàm lượng khoáng phụ thuộc vào điều kiện sống giai đoạn sinh trưởng. Trong Enteromorpha spp. thành phần khoáng chủ yếu là Ca, K, Mg và các nguyên tố khác như Fe, Al, Si, Ba, 1.1.3.2 Thành phần polysaccharide của rong Enteromorpha spp. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy tế bào của Enteromorpha spp. không chứa thành phần polysaccharide có tính ”nhầy - mucilaginnous” như agar và alginic acid. Hàm lượng lignin trong thành tế bào và thành phần tinh bột pyrenoid cũng rất thấp (Akiko Asa at el.,2009). Cấu trúc tế bào và thành phần tế bào là yếu tố quan trọng làm cơ sở để lựa chọn phương pháp phá vỡ tế bào, giải phóng protein. Thành phần các polysaccharide của thành tế bào rong Enteromorpha spp.(Bimalendu Ray, 2006) [23]. thường chứa các thành phần cellulose và Trang 12
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP hemicellulose có cấu trúc phân nhánh khá phức tạp với các đường monosaccharide như rhamnose, xylose, glucose, glactose, glucuronic acid, iduronic acid chiếm tỷ lệ chính và một lượng protein khá cao. 1.2 Giới thiệu về Protein 1.2.1 Kết cấu đơn vị Protein là polymer của các amino acid nối với nhau bằng các liên kết cộng hóa trị là liên kết peptide. Protein có thể bị thủy phân tạo thành các amino acid tự do bằng nhiều phương pháp khác nhau. Người ta đã phát hiện ra được tất cả 20 AA trong thành phần của tất cả các loại protein khác nhau trong cơ thể sống. Amino acid là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl (COOH) và ít nhất một nhóm amino (NH2), trừ prolin chỉ có các nhóm NH. Trong phân tử amino acid đều có các nhóm COOH và NH2 gắn với carbon 1.2.2 Thành phần cấu tạo Cacbon 50 - 55 %, nito 15 - 18 %, hydro 6,5 - 7,3 %, oxy 21 - 23,5 %, lưu huỳnh 0 - 0,24 %, phosphore 0 - 0,9 %. Một số phân tử protein còn chứa các nguyên tố khác như: Ca, Mn, Zn, Fe, Cu gọi là nguyên tố vi lượng. 1.2.3 Tính chất của protein 1.2.3.1 Tính chất hóa lý Màu sắc và mùi vị của amino acid: thường không màu, nhiều loại có vị ngọt, vị đắng. 1.2.3.2 Độ hòa tan Dễ tan trong nước trong acid và kiềm loãng khó tan trong alcohol và ether. Trạng thái keo của protein bền vững là nhờ có lớp vỏ thủy hóa bao bọc bên ngoài các hạt keo và các điện tích làm cho các phân tử protein ngăn cách và không dính vào nhau. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tính tan protein: pH, nồng độ muối, nhiệt độ, Trang 13
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.3.3 Lưỡng tính và điểm đẳng điện Do thành phần protein là các phân tử AA, mà AA là chất lưỡng tính nên protein cũng là phân tử lưỡng tính. Ngoài ra, do trong thành phần AA của protein có 2 nhóm: - Các AA acid: trong cấu tạo có 2 nhóm COOH, trong đó 1 nhóm dùng để tạo liên kết peptid còn 1 nhóm hình thành ion COO-. - Các AA kiềm: trong cấu trúc có 2 nhóm NH2, trong đó có một nhóm tạo liên + kết peptid còn 1 nhóm hình thành NH3 . Như vậy, phân tử protein vừa có khả năng phân ly như 1 acid tạo COO- vừa + có khả năng phân ly như một chất kiềm tạo NH3 . 1.2.3 Protein trong chăn nuôi thủy sản. Protein là thành phần chất hữu cơ chính của cơ thể ĐVTS, chiếm khoảng 60 - 75 % trọng lượng khô của cơ thể (Halver, 1988). Protein có cấu trúc rất phức tạp. Trong thành phần hóa học của protein có chứa: carbon (50 - 55 %); oxy (22 - 26 %); nitơ (12 - 19 %); hydro (6 - 8 %); và lưu huỳnh (0 - 2 %). Mặc dù chúng rất khác nhau về cấu trúc, chức năng, thành phần hóa học, kích thước nhưng khi bị thủy phân chúng đều phân hủy thành các AA. Nhiệm vụ chính của protein là xây dựng nên cấu trúc của cơ thể. Protein trong thức ăn cung cấp các amino acid nhờ quá trình tiêu hóa và thủy phân. Trong ống tiêu hóa, các amino acid được hấp thu vào máu và đi đến các mô, cơ quan, tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein của cơ thể, phục vụ cho quá trình sinh trưởng, sinh sản và duy trì cơ thể. Do đó, nếu thức ăn không cung cấp đủ nhu cầu protein cho cá sẽ dẫn đến cá chậm lớn, hoặc ngừng tăng trưởng, thậm chí có thể giảm trọng lượng. Mặt khác, nếu lượng protein trong thức ăn vượt quá nhu cầu thì chỉ một phần được sử dụng để tạo protein mới, phần còn lại sẽ được chuyển sang dạng năng lượng, điều này sẽ làm tăng giá thành thức ăn không cần thiết. Chính vì vậy, các nhà khoa học rất chú ý và đã nghiên cứu nhu cầu protein và amino acid của cá, bắt Trang 14
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP đầu từ những năm 50, đến nay, phần lớn các đối tượng nuôi quan trọng và phân bố rộng trên toàn thế giới đã được nghiên cứu về lĩnh vực này. 1.2.4.1 Vai trò protein - Là thành phần chủ yếu tham gia cấu tạo cơ thể, thay tổ chức cũ xây dựng tổ chức mới. - Các AA sẽ tham gia vào các sản phẩm protein đặc biệt có hoạt tính sinh học cao (hormon, enzyme). - AA sẽ tham gia quá trình tạo thành năng lượng ở dạng trực tiếp hay tích lũy ở dạng glucogen hay lipid. Với những chức năng quan trọng trên, không có vật chất nào có khả năng thay thế protein trong cơ thể. Khi thức ăn thiếu protein thì động vật chậm sinh trưởng, chậm phát dục, sức sinh sản giảm. Do đó, protein là chất dinh dưỡng được đặc biệt chú ý trong thức ăn. Mục đích của nuôi động vật thủy sản là biến đổi protein từ thức ăn (tự nhiên và nhân tạo) thành protein cấu tạo cơ thể động vật thủy sản có chất lượng cao. 1.2.4.2 Nhu cầu protein Nhu cầu protein của động vật thủy sản thường lớn hơn động vật trên cạn. Nhu cầu protein của cá dao động trong khoảng từ 25 - 55 %, trung bình 30 %, giáp xác từ 30 - 60 %. Nhu cầu protein tối ưu của một loài nào đó phụ thuộc nguồn nguyên liệu làm thức ăn (tỉ lệ protein và năng lượng, thành phần amino acid và độ tiêu hóa protein), giai đoạn phát triển của cơ thể, các yếu tố bên ngoài khác. Khi động vật thủy sản sử dụng thức ăn không có protein thì cơ thể giảm khối lượng, bởi vì chúng sẽ sử dụng protein của cơ thể để duy trì các chức năng hoạt động tối thiểu của cơ thể để tồn tại. Trái lại nếu thức ăn được cung cấp quá nhiều protein thì protein dư không được cơ thể hấp thu để tổng protein mới mà sử dụng để chuyển hóa thành năng lượng hoặc thải ra ngoài. Thêm vào đó cơ thể còn phải tốn năng lượng cho quá trình tiêu hóa protein dư thừa, vì thế sinh trưởng của cơ thể giảm. Trang 15
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.3.3 Nhu cầu AA Khi nói đến protein, người ta không chỉ quan tâm đến hàm lượng của nó trong thức ăn mà còn chú ý đến các AA tham gia cấu tạo nên protein (đặc biệt là thành phần và tỷ lệ các AA thiết yếu trong protein). Nhu cầu protein nói một cách chính xác hơn đó chính là nhu cầu amino acid. Ngoài nhiệm vụ chính là cấu tạo nên protein, chúng còn là tiền chất của một số sản phẩm trao đổi chất khác. Có hai loại amino acid: thiết yếu và không thiết yếu. AA không thiết yếu: AA không thiết yếu là những AA mà cơ thể sinh vật tự tổng hợp được từ thức ăn. Chúng bao gồm: Alanin, Glycin, Serin, Tyrosin, Polin, Cystein, Cystin. AA thiết yếu: nhu cầu về amino acid thiết yếu được nghiên cứu nhiều bởi vì cá không thể tổng hợp được chúng mà phải lấy từ thức ăn. Cũng như động vật bậc cao, các loài động vật thủy sản nói chung cần 10 loại amino acid, gồm: arginin, histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenillalanin, threonin, tryptophan và valin. Cá không thể dự trữ AA tự do. Nếu như có một AA nào đó chưa được dùng ngay để tổng hợp protein thì sẽ được chuyển thành AA khác hoặc cung cấp năng lượng. Trường hợp này (chuyển AA này thành AA khác hoặc cung cấp năng lượng), nếu xảy ra ở AA thiết yếu thành AA không thiết yếu hoặc cung cấp năng lượng thì rất lãng phí. Do đó sự mất cân đối AA sẽ dẫn đến lãng phí AA. Thiếu cũng như thừa bất kỳ AA nào thì đều làm giảm hiệu quả sự dụng protein. Ngoài ra, giữa các AA có cấu tạo giống nhau còn có tương tác đối kháng (antagonism). Đó là khi hàm lượng một AA nào đó trong thức ăn vượt quá mức nhu cầu sẽ kéo theo nhu cầu của amino acid có cấu tạo hóa học tương tự tăng lên. Ví dụ như tương tác giữa leucine và isoleucine được quan sát trên cá nheo Mỹ. Ngược lại, nếu thiếu loại nào đó thì cũng ảnh hưởng đến các acid amin khác (acid amin giới hạn). AA thường bị coi giới hạn là methionin, lysine vì các nguồn nguyên liệu có Trang 16
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP nguồn gốc thực vật có hàm lượng các AA này thường không đủ theo nhu cầu của ĐVTS. 1.2.5 Các phương pháp tủa protein 1.2.5.1 Tủa bằng muối Đây là cách phổ biến để tủa protein. Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out). Trong dung dịch, protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang điện tích trái dấu. Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính của các dung môi, làm giảm các phân tử protein không mang điện tích, do đó làm tăng tính tan của protein trong dung môi. Giả thuyết của Debye - Huckel cho rằng: “tính tan của protein được biểu diễn bằng một hàm logarit, giá trị của hàm tỉ lệ với căn bậc hai của cường độ ion trong dung dịch”. Thuật ngữ salting out trong môi trường có nồng độ muối cao được giải thích bởi Kirkwood: “sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình Solvate hóa, giảm tính hòa tan của protein dẫn đến sự tủa”. Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn: log S = B – KI Trong đó S: độ hòa tan của protein B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ) K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối có trong dung dịch) I: cường độ ion của muối. Trang 17
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.4: Tỷ lệ protein tủa theo nồng độ muối (Nguồn: 1.2.5.2 Tủa protein bằng các dung môi hữu cơ Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung môi hữu cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp (mặc dù một số dung môi như: 2 - methyl - 2,4 - pentanediol (MPD), dimethyl Sulfoxide (DMSO) và Ethanol có thể được sử dụng ở nồng độ cao. 1.2.5.3 Tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện Khi thay đổi pH của môi trường, mức độ tủa của protein cũng thay đổi. Ở pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton). Ở giá trị pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất H+). Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không Trang 18
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP tích điện. Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn khả năng tương tác với môi trường, khi đó, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường. Hình 1.5: Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của 2 protein khác nhau thay đổi theo pH. (Nguồn: 1.2.5.4 Tủa protein bằng các non – ionic polymer Phương pháp này được thực hiện bằng cách cho thêm non – ionic vào trong dung dịch protein. Khi thêm vào, số lượng các phân tử nước có thể tương tác được với protein giảm xuống. Người ta thường sử dụng dextrans và polyethylen glycols. Khi protein tồn tại ở nồng độ cao, hay pH môi trường vượt ra ngoài điểm đẳng điện mới xảy ra quá trình tương tác giữa các cấu tử trong protein. Muốm thêm loại non – ionic polymer nào vào trong dung dịch protein tùy thuộc vào trọng lượng phân tử của protein đó. Cũng tương tự như tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện. Tại một giá trị pH nào đó (sau khi thêm non – ionic polymer) thì khả năng hòa tan của protein cũng giảm xuống. Các ion non – ionic polymer thường sử dụng là các dung môi hữu cơ như Ethanol hay Acetone. Các dung môi khác ít sử dụng vì khó thao tác và có thể gây biến tính protein. Nhiệt độ thấp làm tăng hiệu quả tủa và giảm sự biến tính protein. Trang 19
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nồng độ ion: 0,05 - 0,2. Đối với chất tan có trọng lượng phân tử càng cao thì lượng dung môi cần cho quá trình tủa càng ít. Nếu trong hỗn hợp có sự hện diện của 2 protein, tính tan của protein này sẽ giảm vì sự hiện diện của protein kia. Thuận lợi của phương pháp tủa bằng cách sử dụng non - ionic polymers là protein sản phẩm bền, và có thể sử dụng ở nhiệt độ phòng. 1.2.5.5 Tủa bằng ion kim loại Trong phương pháp tủa này, ion kim loại sẽ gắn với một phần của phân tử protein. Thuận lợi của phương pháp này là có thể tủa được protein trong một dung dịch rất loãng. Các ion kim loại có thể chia làm ba nhóm. Các ion như Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ và Cd2+ sẽ gắn chặt vào các acid carboxylic và các hợp chất có chứa nitrogen. Các ion như Ca2+, Ba2+, Mg2+ và Pb2+ sẽ gắn với nhóm chức acid carboxylic. Các ion như Ag2+, Hg2+, và Pb2+ sẽ gắn chặt với các nhóm có chứa lưu huỳnh. 1.3 Giới thiệu về kỹ thuật sắc ký lọc gel Các đại phân tử sinh học được tinh sạch bằng cách sử dụng các kỹ thuật sắc ký, kỹ thuật này phân tách chúng theo sự khác biệt về các đặc tính của chúng. Bảng 1.2: Đặc tính và kỹ thuật của một số phương pháp tinh sạch protein Đặc tính Kỹ thuật Lọc gel, còn được gọi là phân tách Kích thước theo kích thước Sắc ký tương tác kỵ nước Kỵ nước Sắc ký đảo phase Trang 20
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu Sắc ký ái lực của ligand) Điện tích Sắc ký trao đổi ion Hình 1.6: Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký Hơn 40 năm qua kể từ khi việc đưa vào thị trường sản phẩm thương mại Saphadex, kỹ thuật sắc ký lọc gel đã đóng một vai trò quan trọng trong việc tinh sạch enzyme, polysaccharide, nucleic acid, protein và các đại phân tử sinh học khác. Lọc gel là kỹ thuật sắc ký đơn giản nhất trong tất cả các loại sắc ký. Lọc gel phân tách các phân tử dựa trên sự khác biệt về kích thước và trọng lượng phân tử. Kỹ thuật này có thể áp dụng theo 2 cách: 1. Phân tách nhóm: các thành phần của một mẫu được phân tách thành 2 nhóm chính theo phạm vi kích thước. Sự phân tách nhóm được sử dụng để loại các phân tử lớn hoặc các phân tử tạp chất nhỏ (như bỏ phenol khỏi dịch nuôi cấy) hoặc để loại muối hoặc trao đổi đệm. Trang 21
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2. Phân đoạn các phân tử sinh học với độ phân giải cao: các thành phần của một mẫu được phân tách theo sự khác biệt về kích thước phân tử của chúng. Phân tách với độ phân giải cao có thể được dùng để cô lập một hoặc nhiều thành phần, để phân tách các monomer ra khỏi khối hỗn hợp, để xác định trọng lượng phân tử hoặc để phân tích sự phân bố theo trọng lượng phân tử. Sắc ký lọc gel cũng có thể được dùng để thực hiện việc gấp cuộn lại các protein biến tính dễ dàng hơn bằng việc kiểm soát cẩn thận sự thay đổi điều kiện của dung dịch đệm. Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật không tinh vi, phù hợp để thực hiện trên các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác động và các điều kiện môi trường khắc nghiệt. Sự phân tách có thể được thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các co - factor thiết yếu, các chất tẩy, urea, guanidine hydrochloride, ở cường độ ion cao hoặc thấp, ở 37 oC hoặc trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm. Sắc ký lọc gel phân tách các phân tử dựa theo sự khác biệt về kích thước khi chúng di chuyển qua môi trường lọc gel được nhồi trong cột, không giống như sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký ái lực, các phân tử không liên kết với môi trường sắc ký do đó thành phần đệm không ảnh hưởng trực tiếp đến độ phân giải (mức độphân tách giữa các peak). Do đó, thuận lợi chủ yếu của sắc ký lọc gel là các điều kiện có thể thay đổi để phù hợp theo loại mẫu hoặc theo những yêu cầu cho quá trình tinh sạch sau này, theo sự phân tích hoặc theo quá trình bảo quản mà không làm thay đổi sự phân tách. Sắc ký lọc gel khá phù hợp cho các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi của pH, nồng độ ion kim loại hoặc các aco – factor và các điều kiện khắc nghiệt. Sự phân tách có thể được thực hiện khi có mặt các ion hoặc các co - factor cần thiết, các chất tẩy, urea, guanidine hydrochloride, ở cường độ ion cao hoặc thấp, ở 37 oC hoặc ở trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm. Protein tinh sạch có thể được thu nhận trong bất kỳ loại dung dịch đệm nào. 1.3.1 Phân tách bằng sắc ký lọc gel Trang 22
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Để phân tách, môi trường lọc gel được nhồi trong cột để tạo nền nhồi. Môi trường này là một chất nền có lỗ ở dạng hạt hình cầu, loại hạt này được chọn vì tính ổn định về vật lý và hóa học của chúng, và tính trơ (thiếu các đặc tính hấp thụ và phản ứng). Nền nhồi được cân bằng bỡi dung dịch đệm, dung dịch này làm đầy các lỗ của chất nền và khoảng không giữa các hạt. Chất lỏng bên trong các lỗ đôi khi được xem như phase tĩnh và chất lỏng ở trạng thái cân bằng với chất lỏng bên ngoài các hạt, được xem như phase động. Cần lưu ý rằng, mẫu được giải hấp một cách đồng nhất, nghĩa là không cần sử dụng các loại đệm khác nhau trong quá trình phân tách. Tuy nhiên, bước rửa giải dùng loại đệm đang chạy thường bao gồm ở thời điểm kết thúc của quá trình phân tách, làm cho việc loại bỏ bất kỳ loại phân tử nào còn lưu trong cột được dễ dàng hơn và để chuẩn bị cột cho lần chạy kế tiếp. Hình 1.7: Quá trình lọc gel Hình 1.7 được giải thích như sau: 1. Các hạt hình cầu của môi trường lọc gel được nhồi trong cột. Trang 23
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2. Mẫu được nạp vào cột. 3. Dung dịch đệm (phase động) và mẫu di chuyển qua cột. Các phân tử khuếch tán trong và ngoài các lỗ của chất nền (cũng được miêu tả như quá trình phân đoạn mẫu giữa phase động và phase tĩnh). Các phân tử nhỏ hơn di chuyển vào sâu trong chất nền hơn và do đó lưu lại trong cột lâu hơn. 4. Khi dung dịch đệm di chuyển liên tục qua cột, các phân tử lớn hơn kích thước lỗ gel không thể khuếch tán vào trong các lỗ gel và bị trì hoãn trong quá trình di chuyển xuống dưới đáy cột. 5. Các phân tử lớn rời cột trước nhất, sau đó là các phân tử nhỏ hơn theo trình tự kích thước của chúng. Quá trình phân tách hoàn toàn xảy ra khi một lượng dung môi bằng tổng thể tích cột (tương đương với thể tích nền nhồi) di chuyển qua môi trường lọc gel. 1.3.2. Phân tách nhóm Sắc ký lọc gel được dùng trong phương thức phân tách nhóm để loại bỏ các phân tử nhỏ ra khỏi một nhóm các phân tử lớn hơn và đây cũng là một giải pháp nhanh, đơn giản trong việc trao đổi đệm. Các phân tử nhỏ như muối (quá trình khử và loại muối) hoặc các gốc tự do dễ dàng được tách ra. Các mẫu có thể được chuẩn bị để bảo quản hoặc dùng cho những phân tích hoặc kỹ thuật sắc ký khác. Sắc ký lọc gel trong phương thức phân tách nhóm thường được dùng kết hợp trong quá trình tinh sạch protein để loại muối hoặc trao đổi đệm. Các loại gel như Sephadex G50, và G100 được dùng để phân tách nhóm. Thể tích mẫu lớn, có thể lên đến 30 % tổng thể tích qua cột (nền gel đã nhồi trong cột) có thể áp dụng với tốc độ dòng cao bằng cách sử dụng các loại cột ngắn, rộng. Hình 1.7, trình bày dữ liệu giải hấp (sắc ký đồ) của một quá trình phân tách nhóm tiêu biểu. Các phân tử lớn được giải hấp trong hoặc ngay sau thể tích trống, Vo khi chúng di chuyển qua cột ở tốc độ tương đương với tốc độ của dung dịch đệm. Đối với một cột được nhồi tốt và đảm bảo, thể tích trống tương đương với khoảng 30 % của tổng thể tích cột. Các phân tử nhỏ chẳng hạn như muối sẽ chui vào lỗ và di Trang 24
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP chuyển xuống dưới cột, nhưng nó không tách ra khỏi cái khác. Những phân tử này thường được giải hấp ngay trước khi lượng dung dịch đệm bằng tổng thể tích cột di chuyển qua cột, ký hiệu Vt. Trong trường hợp này, protein được đo bằng độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm, còn muối được phát hiện bằng đầu dò do độ dẫn điện của dung dịch đệm. Hình 1.8: Sắc kí đồ điển hình của quá trình phân tách nhóm (sắc ký loại muối) Mặc dù trong việc xây dựng phương pháp mới đã được nhiều thành tựu đáng kể. Tuy nhiên, vấn đề tách, làm thuần khiết protein hiện nay vẫn là một công tác phức tạp, khó khăn. Nguyên nhân chủ yếu một mặt protein trong tế bào thực vật với lượng rất ít, mặc khác nó luôn có đồng thời với các protein khác cũng có các tính chất lý hóa rất giống nhau, hơn nữa protein lại rất không bền, dễ bị mất khả năng xúa tác do tác động của các yếu tố bên ngoài. 1.3.3. Bản chất của phương pháp Phương pháp được sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lượng phân tử và phân tích định lượng tương tác phân tử. Trang 25
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.9: Tách các phân tử bằng lọc gel Một số thông số vật lý của phương pháp: + Giới hạn tách (exclution limit): Là trọng lượng phân tử (MW) của phân tử nhỏ nhất không chui vào bên trong hạt gel. Thí dụ giới hạn tách của G50 có FR từ 1.500 - 30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử lớn hơn đều không chui vào hạt gel. + Phạm vi tách (Fructionation range): Thí dụ, sephadex G50 có FR từ 1.500 - 30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ được phân tách dễ dàng bởi G50. + Độ ngậm nước (water regain): Là trọng lượng nước mà 1 gam bột gel khô hút nước. Thí dụ G50 có WR là 5,0 ± 0,3 g. Giá trị này chưa tính đến lượng nước bao quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích của cột. + Thể tích nền (bed volume): Là thể tích cuối cùng mà 1 gam gel khô hấp thu khi trương nở trong nước. G50 có thể tích nền 9 - 11 ml/g gel khô. + Hạt gel (Gel particle): Hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thước hạt xác định bằng mesh hoặc đường kính hạt (bead diameter) tính theo µm. Hạt có kích thước lớn (50 - 100 mesh, 100 - 300 µm cho tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhưng kết quả tách thấp. Ngược lại những hạt mịn (400 mesh, 10 - 40 µm) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thường người ta chọn hạt gel có kích thước 100 - 200 mesh (50 - 150 µm). + Thể tích trống (void volume): Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột. Xác định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Daltons. Trang 26
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP + Thể tích thổi (elution volume): Là thể tích đệm cần thiết để rửa chất cần tách ra khỏi cột. 1.3.4. Đặc tính của gel Có 4 loại gel thường được sử dụng: Dextran có bản chất là polysaccharide tự nhiên do hãng Pharmacia – LKB (Thụy Điển) cung cấp với tên thương mại là Sephadex. Giới hạn tách của gel dextran - 600.000 Daltons, vì dextran tự nhiên chứa ít liên kết ngang nên khó giữ nguyên vẹn hạt nếu kích thước lỗ to hơn. Tuy nhiên nếu dextran được bổ sung thêm. Các liên kết ngang bởi N,N’-methylene bisacrylamide thì dextran có giới hạn tách gia tăng (xem sephacryl cũng do Pharmacia – LKB cung cấp). Gel polyacrylamide: Tạo bởi quá trình đồng hóa polymer của acrylamide và N,N’-methylene bisacrylamide (Bio - Rad cung cấp – Biogel – P là tên thương mại) Gel agarose: Là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo từ galactose và anhydrogalactose. Mạng gel được ổn định nhờ liên kết hydro nhiều hơn là do các liên kết ngang. Hãng Bio -Rad cung cấp agarose với tên thương mại là Bio - gel A, còn Pharmacia – cung cấp tên thương mại là sepharose và seperose. Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thương mại là ultragel, nó cho phép có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử dụng áp suất để tách. Trang 27
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thời gian và địa điểm khảo sát thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2012 tại phòng các chất có hoạt tính sinh học của Viện Sinh Học Nhiệt Đới. 2.2 Vật liệu thí nghiệm 2.2.1 Nguyên liệu Rong Bún Enteromorpha spp. còn tươi được lấy từ Bạc Liêu vào tháng 3 năm 2012, sau khi đem về phòng thí nghiệm rong được rửa nhiều lần bằng nước cất để loại bỏ muối và sấy ở nhiệt độ 60 - 70 oC cho khô hoàn toàn. Sau đó nghiền nhỏ ra bằng máy tới kích thước khoảng 1mm và sử dụng làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo. Quá trình sấy có thể thay bằng phơi khô dưới nhiệt độ mặt trời. Hình 2.1: Bột rong biển sau khi sấy khô 2.2.2 Thiết bị-dụng cụ - Pipette 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml. - Ống nghiệm. - Cốc thủy tinh 100 ml, cốc 500 ml, cốc 1000 ml . - Bình định mức 50 ml, 10 ml, 1000 ml. - Máy sắc ký lọc gel (Bio – Rad). - Máy đông khô (Sentry). Trang 28
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Máy so màu (Thermosi). - Cân phân tích (Precisa). - Máy đo quang UV-vis. - Máy đo pH. - Máy nghiền tế bào. - Bộ chưng cất Kjeldahl. - Tủ lạnh, tủ ủ kết hợp đánh sóng âm. - Bình phá mẫu, bếp đun. - Tủ sấy hút chân không (Thermosi). - Máy li tâm (Hermle). - Tủ sấy, bình hút ẩm. - Cân phân tích, cân kỹ thuật. - Đũa khuấy, nhiệt kế, ống đong, vãi lọc, giấy lọc, phễu. 2.2.3. Hóa chất - Biogel P – 100 (Sweden). - Coomassie Brilliant Blue 250R . - Acid acetic (Merck). - Albumin (Merck). - Acid clohydric (Merck). - NaOH (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 45) %, NaOH 0,1 N. - H2SO4 đậm đặc, H2SO4 0,1 N. - TCA (5, 10, 15, 20, 25) %. - Aceton. Trang 29
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Cồn 96o. - Chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3 : 1). - Thuốc thử Bradford, thuốc thử Tashir. 2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu thí nghiệm 2.3.1. Phương pháp phân tích chỉ tiêu sinh hóa trong rong bún Enteromorpha spp. 2.3.1.1 . Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu của rong bún Enteromorpha spp. a) Thiết bị. - Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g - Cốc sứ - Bình hút ẩm - Tủ sấy bằng điện, có khả năng điều chỉnh nhiệt độ 100 - 105 oC b) Cách tiến hành thí nghiệm. - Cốc đã được sấy khô trong tủ sấy ở 105 oC trong 3 giờ và sau đó làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng, đem cân chính xác (M). - Sấy cốc ở nhiệt độ 105 oC đến khối lượng không đổi, cho cốc đã sấy vào bình hút ẩm 15 phút rồi đem cốc đi cân. - Sau đó cân 3 g rong bún cho vào cốc và đem đi sấy ở nhiệt độ 105 oC đến khối lượng không đổi, cho cốc có mẫu đã sấy vào bình hút ẩm 15phút rồi đem đi cân cả cốc và mẫu. Sau đó làm nguội trong bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng rồi đem cân xác định (M2). - Lập lại thao tác trên nhưng mỗi lần chỉ để khoảng 30 phút trong tủ sấy cho đến khi lượng mất đi của hai lần cân liên tiếp không chênh lệch nhau quá 0,002 - 0,004 g. Trang 30
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP c) Công thức tính kết quả. Độ ẩm tính bằng phần % khối lượng được tính theo Trong đó: M : khối lượng cốc (g) M1 : khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g) M2 : khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g). 2.3.1.2. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl a) Nguyên tắc: vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác. Phản ứng của quá trình vô cơ hóa mẫu như sau: 2H2SO4→ 2H2O +2SO2↑+ O2 Oxi tạo thành trong phản ứng sẽ oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amine; carbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O; còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch. 2NH3 + H2SO4→ (NH4)2SO4 Các nguyên tố P, K, Ca, Mg, chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO, MgO, Dùng kiềm mạnh đuổi NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành thể tự do. Định lượng NH3 bằng một acid. (NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 +H2O + 2NH3↑ Trang 31
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng, bình hứng chứa H2SO4 0.1N 2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dư b) Hóa chất. - H3BO4 4 %. - HCl 0,25 N. - NaOH 40 %. - H2SO4 đậm đặc. - Chất xúc tác ( K2SO4 : CuSO4 =3 : 1) c) Tiến hành thí nghiệm Cân 100 mg bột rong biển đã sấy khô tuyệt đối cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp 5 ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi hóa). Cho thêm vào 200 mg chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh (lưu ý giai đoạn này phải thực hiện trong tủ Hotte, đặt bình hơi nghiêng trên bếp, tránh trường hợp khi sôi mạnh hóa chất bắn ra ngoài, khi đã sôi giữ nhiệt độ bếp đun vừa phải để tránh hóa chất trào ra ngoài và không bị bay mất ammoniac). Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình còn chưa bị oxi hoá vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch. *Cất đạm Chuyển 100 ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tím hồng. Tiếp tục cho vào bình Trang 32
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP cất 20 ml NaOH 45 % cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5 ml NaOH 45 % nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ). Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20 ml H2SO4 0,1 N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn. Bật công tắc cất đạm. Kiểm tra xem hơi ra từ đầu ống sinh hàn có làm xanh giấy quỳ không, nếu không thêm NaOH 45 %.Sau khi cất đạm 20 - 25 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy quỳ thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy qùy không đổi sang màu xanh là được. Ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa. *Chuẩn độ Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0,1 N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0,1 N sử dụng. d) Tính kết quả Hàm lượng % nitơ tổng số tính theo công thức sau N (mg %) = {1,42 * (V1-V2) * 100/a} * n Trong đó: V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng V2: số ml NaOH 0,1 N đã chuẩn độ a: số miligam nguyên liệu 1,42: hệ số, cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42 mg Nitơ n: hệ số pha loãng Hàm lượng % protein tổng số: Trang 33
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP P (mg %) = N * b Trong đó: N: hàm lượng % nitơ tổng số. b: hệ số chuyển đổi trung bình là 6,25. 2.3.1.3 Phương pháp xác định khoáng tổng số a) Nguyên tắc: tro thô là phần vật chất của mẫu còn lại sau khi nung (vô cơ hóa) ở nhiệt độ 550 - 700 oC trong 4 giờ. Để nguội trong bình hút ẩm. Cân tính sự chênh lệch trước và sau khi nung, ta có được hàm lượng tro trong mẫu. b) Các bước tiến hành: Cân 2 g mẫu rong vào chén nung đã biết trọng lượng (Po). Đặt chén có mẫu vào lò nung (t = 100 oC) để mẫu cháy hết khói đen, đóng cửa lò và điều chỉnh đến nhiệt độ 600 oC và nung trong 4 giờ đến khi mẫu có màu trắng hay màu xám xanh là được. Nếu mẫu chưa cháy hết, tiếp tục nung thêm 1 giờ. Làm nguội tro (thấm ướt tro bằng nước cất và thêm vào 10 - 15 giọt HNO3 đậm đặc). Nung chén mẫu ở nhiệt độ 600 oC cho đến khi được cho hóa hoàn toàn. Để hạ nhiệt độ khoảng 200 oC. Làm nguội trong bình hút ẩm trong vòng 15 phút và đem cân P2 lặp lại quá trình nung mẫu cho đến khi khối lượng không đổi. c) Tính kết quả: % chất mất khi nung = (P1 - P2/mg mẫu) * 100 % khoáng tổng số = (P2 - P0/mg mẫu) * 100 Trong đó: Po: khối lượng chén nung trước khi nung P1: khối lượng mẫu và chén trước khi nung P2: khối lượng mẫu và chén sau khi nung Trang 34
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.1.4 Định lượng lipit theo phương pháp SOXHLET Chỉ tiêu phân tích: xác định hàm lượng lipit có trong mẫu bột từ lá cây. a) Nguyên tắc: dựa vào tính chất hòa tan của lipit trong dung môi hữu cơ (ether) để chiết rút lipit khỏi nguyên liệu. b) Hóa chất. - Petroleum ether. c) Cách tiến hành Chuẩn bị mẫu: cân chính xác 1 g mẫu đã nghiền nhỏ và đồng nhất. Chuyển sang bì giấy chuẩn bị sẵn, gấp miệng bao lại. Sấy bao đựng mẫu cho đến khi trọng lượng không đổi(phương pháp xác định trọng lượng khô tuyệt đối). Sau đó lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, cân lại bao có chứa mẫu. *Chuẩn bị mẫu trên máy Soxhlet Cho mẫu vào ống hình trụ đựng mẫu một cách thận trọng tránh để rơi rớt. Đặt bình cầu đựng dung môi lên bếp đun. Lắp ống đựng mẫu với bình cầu đựng dung môi theo nguyên tắc bình thông nhau. Mở nước để nước chảy vào hệ thống sinh hàn. Sau cùng đổ dung môi chiết lipid qua phễu thủy tinh sao cho lượng dung môi đủ ngập mẫu và chiếm 2/3 dung tích của bình đựng dung môi. *Chiết rút lipit trên máy soxhlet Đặt lên bếp cách thủy chỉnh nhiệt độ 45 - 50 oC. Đun cách thủy để trích lipit trong thời gian từ 10 - 12 giờ. Dung môi hữu cơ sôi 45 - 50 oC được chuyển sang dạng hơi theo xi phông được dẫn phía trên của bình chiết vào ống sinh hàn gặp lạnh ngưng thành giọt chảy xuống bình chiết ngập xi phông, ether chảy xuống bình đun. Sau khi chiết rút hết lượng lipit, đem sấy khô ở nhiệt độ 105 oC khoảng 3 giờ, để nguội trong bình hút ẩm, cân lại. d) Tính kết quả: Trang 35
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trong đó: T = % lipit có trong mẫu b = m2 - m1 m1 : trọng lượng bì m2 : (bì + mẫu) trước khi chiết m3 : (bì + mẫu) sau khi chiết 2.3.1.5 Phương pháp định lượng phosphor tổng số bằng quang phổ kế a) Nguyên tắc : phương pháp này dựa vào khả năng của ion orthophosphate phản ứng với amoniummolybdate tạo thành phosphomolybdate, phức chất có màu xanh lơ. 2MoO2.4MoO3 + H3PO4 (MoO2.4MoO3)2H3PO4.4H2O Hàm lượng phospho phụ thuộc vào cường độ màu của mẫu đo ở bước sóng hấp thụ cực đại 650 nm. Dung dịch đối chứng là dung dịch không. b) Tiến hành *Chuẩn bị dung dịch thuốc thử Dung dịch 1: dung dịch chuẩn gốc (chứa 100 µg phospho/ml). Hòa tan 0,144 g KH2PO4 trong bình định mức 100 ml bằng nước cất và định mức tới vạch. Chuẩn bị dung dịch chuẩn để lặp thang chuẩn (chứa 25 µg phospho/ml). Lấy 25 ml dung dịch cho vào bình định mức 100 ml và định mức bằng nước cất tới vạch, ta có dung dịch 1A. Dung dịch HCl 10 %: 250 ml HCl đậm đặc cộng với 750 ml nước cất Dung dịch 2: dung dịch Na2SO3 20 %: cân 10 g Na2SO3 hòa vào trong 50 ml nước cất. Trang 36
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dung dịch 3: dung dịch hydroquinone 0,5 %. Hòa tan 0,25 g hydroquinone trong một ít nước và 3 giọt H2SO3, thêm nước cho đủ 50 ml. Dung dịch 4: thuốc thử Briggs hay dung dịch amoni molybdate 5 %. Hòa tan 5 g amoni molybdate trong 10 ml nước cất. Cho 15 ml H2SO4 đậm đặc vào trong 40 ml nước. Để nguội thêm tiếp dung dịch amoni molybdate 5 % đã chuẩn bị vào hỗn hợp, để nguội thêm nước cho đử 100 ml. Hỗn hợp thuốc thử: trộn các dung dịch 2, 3, 4 theo tỷ lệ 1:1:1. *Chuẩn bị dung dịch tro phân tích - Cân chính xác 2 g mẫu - Vô cơ mẫu ở 550 oC trong 4 giờ, để nguội. Thấm ướt tro bằng vài giọt nước cất và thêm 10 ml dung dịch HCl 10 % và 0,5 ml HNO3 đậm đặc. - Đun nhẹ trong 5 phút (đến khi thấy bay hơi), để nguội đến nhiệt độ phòng. Rửa sạch chất nung và định mức thể tích dung dịch tro đến 250 ml bằng nước cất. Bảng 2.1: Số liệu dựng đường chuẩn Phospho Ống nghiệm ĐC 1 2 3 4 5 Nồng độ P(µg/ml) 0 100 200 300 400 500 Dung dịch P chuẩn (ml) 0 1 1 1 1 1 Nước cất (ml) 5 4 4 4 4 4 Dung dịch thuốc thử 3 3 3 3 3 3 (ml) Nước cất (ml) 2 2 2 2 2 2 * Xác định hàm lượng phospho có trong rong. Trang 37
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Lấy 10 ml dung dịch tro cho vào bình nón dung tích 100 ml, định mức cho đủ 100 ml ta có dung dịch thứ 2. - Lấy 1 ml dung dịch thứ 2 cho vào trong ống nghiệm. - Thêm 3 ml hỗn hợp thuốc thử + nước cất cho đủ 10 ml. Trộn đều hỗn hợp, để yên 30 phút, đem đo ở bước sóng 650 nm. c) Tính toán kết quả Trong đó: X: số µg P có trong dịch thử V: thể tích dung dịch sau khi tro hóa m: khối lượng mẫu thử 10^6 : hệ số chuyển đổi từ g sang µg V: thể tích thử 2.3.1.6 Phương pháp định lượng Sắt a) Nguyên tắc. Fe2+ trong dung dịch kết hợp với orthophenaltrolin thành một phức chất có màu đỏ khá bền vững trong môi trường pH = 3 - 9. Nếu muốn màu không bi ảnh hưởng của thuốc thử thừa và sự có mặt của các ion khác, phản ứng cần tiến hành ở pH = 3,5 - 4,5. Phức này gồm có 3 phân tử orthophenaltrolin kết hợp với một ion Fe2+. Phản ứng đặc hiệu cho Fe2+ nên phải chuyển hết Fe3+ thành Fe2+ bằng cách khử với hydroquinon. b) Hóa chất. - Dung dịch HCl đậm đặc Trang 38
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Dung dịch HCl 20 % - Dung dịch orthophenaltrolin 0,5 % trong nước - Dung dịch đệm pH = 3,5 - 4,5 gồm 650 ml CH3COOH 0,1 M +350 ml CH3COONa 0,1 M - Dung dịch hydroquinon 1 % trong dung dịch đệm pH = 4.5 - Dung dịch chuẩn sắt: cân 0,7203 g (NH4)2Fe(SO4)26H2O, thêm nước cất cho đủ 1000 ml. Như vậy dung dịch này chứa 10 mg/l Fe2+. c) Cách tiến hành thí nghiệm. Chuẩn bị mẫu: Cân 2 g mẫu đem nung thành tro trắng, hòa tro với 5 ml HCl đậm đặc, đun trên bếp cách thủy cho đến khô, lập lại lần thứ hai như trên. Lần thứ ba hòa tan tro trong 5 ml HCl 20 %, lọc, rửa cặn, giấy lọc và phễu nhiều lần bằng nước cất nóng. Dung dịch lọc và nước rửa cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước cất vừa đủ 40 ml. Điều chỉnh pH =3,5 - 4,5 bằng CH3COONa 0,2 M. Sau đó thêm nước cất cho đủ 50 ml. Ta được dịch thử. Bảng 2.2 : Số liệu dựng đường chuẩn Sắt Ống nghiệm ĐC 1 2 3 4 5 Nồng độ Fe chuẩn 0 100 200 300 400 500 (mg/l) Dung dịch Fe chuẩn 0 10 10 10 10 10 (ml) Nước cất (ml) 10 0 0 0 0 0 Dung dịch 1 1 1 1 1 1 hydroquinon (ml) Trang 39
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.1.7 Phương pháp định lượng đường tổng số trong rong Bún Enteromorpha spp. a) Nguyên tắc Hàm lượng đường khử được xác định theo phương pháp Miller. Phương pháp này dựa trên việc đo mật độ quang của phức màu đỏ sậm đặc trưng được tạo ra giữa đường khử và thuốc thử DNS ở bước sóng 540 nm. b) Dụng cụ và hóa chất - Dụng cụ + Bình định mức 100 ml + Bình tam giác 250 ml + Phễu lọc, giấy lọc + Ống nghiệm + Quang phổ kế - Hoá chất + Thuốc thử DNS: cân 5 g DNS vào becher 1000 ml, thêm 200 ml nước cất, đặt vào chậu nước khuấy 80 oC khuấy đều. Thêm dung dịch NaOH (8 g NaOH trong 75 ml nước cất) khuấy đều, ở nhiệt độ 80 oC. Thêm 150 g K, Na-Tartrate vào dung dịch trên, khuấy ở 80 oC. Làm lạnh DNS đến nhiệt độ phòng. Chuyển vào bình định mức 500 ml. + H2SO4 72 % + Nước cất c) Cách tiến hành * Dựng đường chuẩn glucose: Hòa tan 100 mg glucose với 80 ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất cho đến vạch và lắc đều. Trang 40
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 2.3 : Số liệu dựng đường chuẩn glucose Số ống 0 1 2 3 4 5 Nồng độ glucose 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 V dung dịch glucose 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 (ml) V nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 V DNS (ml) 2 2 2 2 2 2 Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 10 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. So bước màu ở bước sóng 540 nm. *Chuẩn bị mẫu phân tích - Cân 0,3 g mẫu rong khô tuyệt đối cho vào lọ nhỏ. - Thêm vào 3 ml H2SO4 72 % khuấy đều, để yên 30 phút. - Bổ sung thêm 80 ml nước cất, sau đó chuyển sang nồi hấp 121 oC, 1 atm trong 20 phút. - Để nguội. - Lọc qua phễu và giấy lọc. - Pha loãng. - Ta thu được dịch thử. - Mẫu glucose chuẩn xử lý với H2SO4 72 % thực hiện tương tự như mẫu rong. - Ta tiến hành như dựng đường chuẩn: Trang 41
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 2.4: Tiến hành xác định đường tổng trong mẫu rong Ống đối Ống mẫu Ống mẫu chứng glucose rong V mẫu (ml) 0 1 1 V nước cất (ml) 1 0 0 V DNS (ml) 2 2 2 Dung dịch mẫu ta lắc đều, đem đun sôi cách thủy trong 10 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. So bước màu ở bước sóng 540 nm. 2.3.1.8 Định lượng Caxi và Magne trong rong Bún Enteromorpha spp. a) Nguyên tắc - Acid etylen diamin tetracetic (trilon B) có khả năng tạo những phức có nhiều cation, đặc biệt là Ca và Mg. Acid etylen diamin tetracetic hoặc muối natri của nó Complexon III ở môi trường kiềm, cho với Ca một phức bền vững mà oxalate ammonium cũng không lấy Ca để tủa được. - Chỉ một vài chỉ thị màu đặc biệt mới phát hiện sự có mặt của Ca2+ và Mg2+, nên eriocrom đen T cho màu đỏ khi có Ca2+ và Mg2+ tự do và màu lơ khi có những ion đó ở dạng phức chất. b) Hóa chất. - Dung dịch KCN 3 % - Dung dịch đệm amonium pH 10: cân 6,7g NH4Cl + 30 ml nước cất, khấy cho tan, thêm 57 ml NH4OH và nước cất cho đủ 100 ml. - Dung dịch Trilon B 0,02 N: cân 3,73 g Trilon B + nước cất cho đủ 1000 ml. - Chỉ thị Đen Eriochrom T: cân 0,1 g Đen Eriochrom T + 50 g NaCl tinh khiết, nghiền nhuyễn trong cối, cất vào chai thủy tinh đậy nút kín. Trang 42
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Chỉ thị murexid: cân 0,1 g murexid + 50 g NaCl tinh khiết. Nghiền nhuyễn trong cối, cho vào chai thủy tinh đậy nút kín. c) Cách tiến hành thí nghiệm. Trước hết xác định tổng lượng canxi và magie, sau đó xác định hàm lượng canxi. Hiệu số giữa tổng lượng canxi và magie với hàm lượng canxi sẽ cho biết hàm lượng magie. Chuẩn bị mẫu thử: tùy theo hàm lượng Ca và Mg, cân chính xác khoảng 2 - 5 g mẫu, nung thành trắng, hòa với 5 ml HCl tinh khiết, đun cách thủy tới khô trên nồi cách thủy sôi. Làm lần thứ 2 như trên. Lần thứ 3 hòa tan với 5 ml HCl 20 %, lọc trên giấy lọc không cho. Rửa chén nung nhiều lần bằng nước cất nóng. Dịch lọc và cả nước rửa cho cả vào bình định mức, cuối cùng cho thêm đủ 20 ml, ta có được dịch thử. *Xác định tổng lượng canxi và magie Nguyên tắc Để xác định tổng lượng canxi và magie, thông thường người ta sử dụng phương pháp xác định độ cứng toàn phần của nước. Phương pháp này là dùng trilon B (EDTA C10H14N2O8Na2) để chuẩn độ và chất chỉ thị màu là đen Eriochrom T (C20H12N2O7SNa). Trong môi trường pH 10 các ion Ca và Mg tác dụng với chất chỉ thị màu sẽ cho ra chất phức tạp có màu đỏ tím. Mg2+ + HI2- MgI- + H+ Xanh lam Đỏ tím Chất phức tạp này bền hơn chất phức tạp của Ca và Mg với trilon B. Do đó, trilon B sẽ chiếm lấy Ca và Mg để tạo thành chất phức tạp bền hơn . Chất chỉ thị màu được phóng thích tự do và trở lại màu xanh lam của nó. Nếu ký hiệu của trilon 2- B là H2Y thì có phản ứng. Trang 43
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - 2- 2- 2- + MgI + H2Y MgY + HI + 2H Đỏ tím Không màu Không màu Xanh lam Cách tiến hành Tiền hành thí nghiệm: lấy 20 ml dung dịch ở trên cho vào bình tam 100 ml giác khô và sạch, nhỏ vào 5 giọt KCN 3 % (để ngăn cản một số ion như Fe3+, Fe2+, Cu2+ tác dụng với trilon B). Thêm vào bình khoảng ½ hạt gạo chỉ thị đen Eriochrom T, dung dịch có màu đỏ tím, dùng dung dịch trilon B chuẩn độ cho đến khi chuyển sang màu xanh lam. Thể tích trilon B 0,02 N chuẩn độ dung dịch có giá trị tương đương với hàm lượng Ca và Mg. Cần thực hiện song song một mẫu đối chứng. Công thức tính: Trong đó: V: thể tích dung dịch trilon B 0,02 N dùng để chuẩn độ Vo: thể tích trilon B 0,02 N dùng để chuẩn độ sự thử không ∆ V= V - Vo a: trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích dung dịch mẫu lấy chuẩn độ. V: thể tích trilon B 0,02 N dùng để chuẩn độ dung dịch mẫu tương đương với 100 g mẫu khô tính bằng ml/100 g mẫu khô. *Xác định hàm lượng canxi Nguyên tắc Dùng trilon B để xác định Ca trong dung dịch với chỉ thị là murexid (C8H5O6N5) trong môi trường có pH 12. - - Chất chỉ thị murexid là H3I trong môi trường pH 12, H3I có màu tím và khi kết hợp với Ca tạo thành chất phức tạp có màu hồng. Trang 44
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - 2+ + H3I + Ca CaH3I tím Hồng Chất phức tạp của Ca với murexid khồng bền bằng chất phức tạp tạo bởi Ca và trilon B. Vì vậy trilon B đẩy chỉ thị murexid ra khỏi chất phức tạp dưới dạng tự do có màu tím. + 2- 2- - + CaH3I + H2Y CaY + H3I + 2H Hồng tím Cách tiến hành Lấy 20 ml dung dịch thử thêm 2 ml dung dịch NaOH 10 %, 5 giọt KCN 3 % và khoảng ½ hạt gạo chỉ thị murexid. Chuẩn độ bằng dung dịch trilon B 0,02 N cho đến khi màu hồng của dung dịch chuyển sang màu tím, cần thực hiện một sự thử không. Công thức tính: Trong đó: V: thể tích dung dịch trilon B 0,02 N dùng để chuẩn độ Vo: thể tích trilon B 0,02 N dùng để chuẩn độ sự thử không V1= V - Vo a: trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích dung dịch mẫu lấy chuẩn độ. V: thể tích trilon B 0,02 N dùng để chuẩn độ dung dịch mẫu tương đương với 100 g mẫu khô tính bằng ml/100 g mẫu khô. Trang 45
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thu nhận protein từ rong bún Enteromorpha spp. 2.3.2.1 Tách chiết protein trong rong Bún Enteromorpha spp. Mẫu rong khô Khảo sát tỷ lệ rong/nước Ngâm 12h (w/v) Khảo sát thời gian Nghiền mẫu nghiền mẫu Lọc lần 1 Bã Dịch lọc Khảo sát: (%)NaOH, Xử lý kiềm kết hợp Xác định hàm lượng nhiệt độ ủ, thời gian ủ đánh sóng âm protein Lọc lần 2 Bã rong Dịch lọc Khảo sát nồng độ, Tủa lạnh 30 phút dung dịch tủa Ly tâm Thu cặn Xác định hàm lượng protein Sơ đồ 2.1: Tách chiết protein trong rong Enteromorpha spp. Trang 46
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Thuyết minh quy trình:  Ngâm mẫu Cân các mẫu rong, mỗi mẫu cân chính xác 1g khô Ngâm qua đêm bằng nước cất, ở nhiệt độ lạnh (10 - 15 oC), với các tỷ lệ rong / nước khác nhau (1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/60, 1/70, 1/80) ml nước cất cho trương nở.  Nghiền mẫu rong Rong sau khi ngâm 12 h trong điều kiện lạnh sẽ được nghiền bằng máy nghiền tế bào với thời gian nghiền khác nhau (1, 2, 3, 4, 5) phút.  Xử lý kiềm kết hợp đánh sóng âm Sau khi nghiền rong ở các thời gian khác nhau, tiến hành lọc mẫu rong lần 1 bằng vãi lọc đã thấm nước cất. Phần dịch lọc: tiến hành pha loãng và xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford. Phần bã lọc : tiến hành xử lý bằng NaOH ở các tỷ lệ khác nhau (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5) % cùng với nhiệt độ ủ (40, 50, 60, 70) oC và thời gian ủ khác nhau (30, 60, 90, 120) phút có kết hợp đánh sóng âm.  Tủa lạnh Sau khi xử lý kiềm tiến hành lọc mẫu rong lần 2 bằng giấy lọc, bỏ phần cặn chỉ lấy phần dịch lọc. Phần dịch lọc tiến hành tủa với các dung dịch và nồng độ khác nhau: TCA (5, 10, 15, 20, 25) %; cồn (1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5); HCl (pH2, pH3, pH4, pH5, pH6) thời gian 30 phút trong điều kiện lạnh.  Ly tâm lạnh Trang 47
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sau khi tủa lạnh tiến hành ly tâm bằng máy ly tâm lạnh 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, phần cặn tiến hành hòa tan trong NaOH 0,1 N rồi pha loãng và xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford. 2.3.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford a) Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein. Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là Bovine plasm – globulin hoặc Bovine serum albumin. Sau khi cho dung dịch thuốc nhuộm vào dung dịch protein, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Trang 48
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 2.5: Đường chuẩn Albumin Ống nghiệm ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nồng độ albumin(µg/m 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 l) Albumin chuẩn(0.1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 µg/ml) Nước cất(ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Thuốc thử Cho 2ml vào tất cả ống nghiệm Bradford(ml) Tiến hành đo OD dung dịch trong các ống nghiệm ở bước sóng 595 nm. b) Tính kết quả Trị số mật độ quang (OD) của các ống từ 1 đến 10 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ protein chuẩn (μg/ml). Tương tự như vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số của ống thử không, rồi chiếu vào đường chuẩn albumin để suy ra lượng protein có trong dịch mẫu thí nghiệm (μg/ml). 2.3.2.3 Khảo sát tỷ lệ nước ngâm, thời gian nghiền tối ưu cho quá trình tách chiết Thí nghiệm 1. Khảo sát tỷ lệ nước ngâm Bột rong Bún Enteromorpha spp. ngâm trong nước cất với các tỷ lệ khác nhau (w/v) trong 12 h ở 5 - 10 oC. Các thông số còn lại được cố định. Trang 49
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bột rong (1g) 1:20 1:30 1:40 1:50 1:60 1:70 1:80 Xác định hàm lượng protein Sơ đồ 2.2: Khảo sát tỷ lệ nước ngâm tối ưu cho quá trình tách chiết protein Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian nghiền Bột rong Bún Enteromorpha spp. được ngâm trong nước cất trong 12 h, sau đó nghiền với các thời gian khác nhau ứng với thể tích nước ngâm tối ưu đã được chọn ở thí nghiệm 1. Các thông số còn lại được cố định. Bột rong (1g) 1 phút 2 phút 3 phút 4 phút 5 phút Xác định hàm lượng protein Sơ đồ 2.3: Khảo sát thời gian nghiền tối ưu cho quá trình tách chiết thu nhận protein Sau khi có hàm lượng protein ứng với từng thể tích nước, thời gian nghiền. Ở thể tích nước, thời gian nghiền nào cho hàm lượng protein cao nhất, đó là thể Trang 50
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP tích nước, thời gian nghiền tối ưu cho quá trình tách chiết thu nhận protein và cố định thể tích nước, thời gian nghiền này cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.3.2.4 Khảo sát % NaOH, nhiệt độ, thời gian cho quá trình xử lý kiềm Thí nghiệm 3: Khảo sát % NaOH tối ưu thu nhận protein Sau khi ngâm với thể tích nước, thời gian nghiền tối ưu nhất. Phần bã sau khi lọc sẽ được đem xử lý với NaOH (w/v). Cho 20 ml NaOH ứng với các nồng độ khác nhau vào bã rong đem đi ủ. Các thông số còn lại cố định. Bã rong Enteromorpha spp. NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH 0,5% 1% 1,5% 2% 2,5% Xác định hàm lượng protein Sơ đồ 2.4: Khảo sát nồng độ NaOH tối ưu cho quá trình tách chiết thu nhận protein Sau khi khảo sát nồng độ NaOH, ta có hàm lượng protein ứng với từng nồng độ NaOH. Ở nồng độ NaOH nào cho hàm lượng protein cao nhất, thì đó là nồng độ NaOH tối ưu cho quá trình tách chiết thu nhận protein và ta sẽ cố định nồng độ NaOH này cho các thí nghiệm tiếp theo. Thí nghiệm 4: Khảo sát nhiệt độ ủ tối ưu cho quá trình thu nhận protein Sau khi xác định được nồng độ NaOH tối ưu, tiếp theo khảo sát nhiệt độ ủ tốt nhất cho giai đoạn xử lý kiềm. Cố định các thông số còn lại. Trang 51
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bã rong Enteromorpha spp. 40oC 50oC 60oC 70oC Xác định hàm lượng protein Sơ đồ 2.5: Khảo sát nhiệt độ ủ tối ưu cho quá trình thu nhận protein Sau khi khảo sát nhiệt độ, ta có hàm lượng protein ứng với từng nhiệt độ. Ở nhiệt độ nào cho hàm lượng protein cao nhất, thì đó là nhiệt độ tối ưu cho quá trình tách chiết thu nhận protein và ta sẽ cố định nhiệt độ này cho các thí nghiệm tiếp theo. Thí nghiệm 5: khảo sát thời gian ủ tối ưu trong bước xử lý kiềm phần bã rong. Tương tự, ta sẽ khảo sát thời gian ủ tối ưu cho quá trình tách chiết thu nhận protein, quá trình đó được thực hiện theo sơ đồ sau: Bã rong Enteromorpha spp. 30 phút 60 phút 90 phút 120 phút Xác định hàm lượng protein Sơ đồ 2.6: Khảo sát thời gian ủ tối ưu cho quá trình thu nhận protein Trang 52
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sau khi khảo sát thời gian ủ, ta có hàm lượng protein ứng với từng thời gian. Ở thời gian nào cho hàm lượng protein cao nhất, thì đó là thời gian tối ưu cho quá trình tách chiết thu nhận protein và ta sẽ cố định thời gian này cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.3.2.5 Khảo sát các dung dịch cồn 96o, HCl và TCA để xác định tỷ lệ, pH, nồng độ tủa tối ưu thu nhận protein. Từ dịch chiết lần 2 có hàm lượng protein cao nhất ứng với nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian tối ưu, ta sẽ lấy dịch chiết này bắt đầu thực hiện thí nghiệm tiếp theo, khảo sát các dung dịch tủa: cồn 96o, HCl và TCA tối ưu cho quá trình tách chiết thu nhận protein. Dịch chiết protein TCA o HCl Cồn 96 10% 15% 20% 25% 30% pH=2 pH=3 pH=4 pH=5 pH=6 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 Xác định hàm lượng protein Sơ đồ 2.7: Khảo sát tỷ lệ giữa dịch chiết với cồn 96o, HCl, TCA tối ưu cho quá trình thu nhận protein. Trang 53
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sau khi có hàm lượng protein ứng với các tỷ lệ tủa bằng cồn 96o, HCl, TCA. Ở tỷ lệ nào của 3 tác nhân cho hàm lượng protein cao nhất, đó là tỷ lệ tối ưu cho việc thu nhận protein từ dịch chiết rong Enteromorpha spp. Cố định tỷ lệ này cho các thí nghiệm tiếp theo. Thí nghiệm 6: Tủa protein bằng TCA Bảng 2.6: Tủa TCA ở các phần trăm khác nhau Nồng độ TCA 10% 15% 20% 25% 30% (%) Dịch protein (ml) 5 5 5 5 5 Thể tích TCA 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 (ml) Tiến hành tủa trong điều kiện nhiệt độ thấp để đảm bảo hoạt chất protein không bị biến tính và quá trình tủa xảy ra tốt. Dịch chiết protein thô được cho vào ống ly tâm 50 ml đặt trong chậu nhỏ chứa đá vụn xung quanh. Thể tích dịch protein và TCA tương ứng với mỗi nồng độ được sử dụng như trong bảng 2.6. Cho từ từ TCA vào trong dịch protein, để yên trong 30 phút trong điều kiện lạnh. Lấy dịch đi ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút. Thu tủa, hòa tan trong 2 ml dung dịch NaOH 0,1 N, rồi đem đi đo hàm lượng. Thí nghiệm 7: Tủa protein bằng cồn 96o. Trang 54
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 2.7: Các tỷ lệ tủa bằng cồn 96o Tỷ lệ dịch chiết : 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 cồn 96o Dịch protein (ml) 5 5 5 5 5 Dung dịch cồn 96o 5 10 15 20 25 (ml) Để tránh làm biến tính protein, cồn 96o phải được làm lạnh trước khi tiến hành tủa. Dịch chiết protein thô được cho vào ống ly tâm 50 ml đặt trong chậu nhỏ chứa đá vụn xung quanh. Thể tích dịch protein và thể tích cồn tương với tỷ lệ được sử dụng trong bảng 2.7. Lắc đều hỗn hợp bảo quản lạnh ở 4oC trong 30 phút. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Thu tủa, hòa tan trong 2ml dung dịch NaOH 0,1 N rồi đem đi xác định hàm lượng. Thí nghiệm 8: Tủa protein bằng HCl Bảng 2.8: Tủa bằng HCl ở các pH Các pH pH2 pH3 pH4 pH5 pH6 Dịch protein (ml) 5 5 5 5 5 Dung dịch HCl(ml) 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 Để tránh làm biến tính protein, dung dịch HCl phải được làm lạnh trước khi tiến hành tủa. Trang 55
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dịch chiết protein thô được cho vào ống ly tâm 50 ml đặt trong chậu nhỏ chứa đá vụn xung quanh. Thể tích dịch protein và thể tích dung dịch HCl tương với tỷ lệ được sử dụng trong bảng 2.8. Lắc đều hỗn hợp bảo quản lạnh trong 30 phút. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút. Thu tủa, hòa tan trong 2 ml dung dịch NaOH 0,1 N rồi đem đi xác định hàm lượng. 2.3.2.6 Tinh sạch protein từ rong Bún Enteromorpha spp. bằng sắc ký lọc gel. a). Nguyên tắc Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để phân tách những phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được thoát ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ chạy trong lỗ gel. Hình 2.2: Bộ máy chạy sắc ký lọc gel Trang 56
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP b). Dụng cụ và hóa chất - Dụng cụ và thiết bị. +Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ. +Phễu đổ gel +Flow Adapor 1,5 cm +Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 50 x 1,5cm +Bình đựng dung dịch đệm phosphate 0,1 N pH 7 +Thiết bị đuổi khí - Hóa chất Gel Biogel P - 100 có các đặc tính: Dạng hạt mịn, kích thước hạt 45 - 90µm; khả năng ngậm nước: 12ml/g gel khô; phạm vi tách: 5000 - 100000 daltons. Đệm phosphate pH 7: Dùng khử bọt khí trước khi dùng. c). Các bước tinh sạch protein. Chuẩn bị cột sắc ký : Sử dụng cột sắc ký Bio – Rad. Tốc độ dòng chảy: 0,14 ml/phút Cột 50 x 1,5 cm Phân đoạn : 2 ml Thể tích : 2 ml Bước1: Chuẩn bị gel Cho10 g bột gel Biogel P - 100 từ từ vào dung dịch đệm phosphate 0,1 N; pH 7 đựng trong cốc, không khuấy, để yên trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng cho quá trình tương nở xảy ra hoàn toàn tạo thể huyền phù đồng nhất của các hạt, sau khi quá trình tương nở xảy ra hoàn toàn gạn lớp nổi trên bề mặt bỏ đi, đổ thêm đệm cho ngập phần gel và đuổi bọt khí bằng máy đuổi khí. Trang 57
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Để gel ổn định cho đến khi 90 - 95 % số hạt ổn định, gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để lọai các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại hơn 90 % hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel. Bước 2: Nhồi cột Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20 % thể tích cột. Rót đều, vừa rót vừa khuấy nhẹ để gel hấp phụ lắng từ từ theo trọng trường. Tránh không cho tạo thành bọt khí, phải rót liên tục. Dịch đệm thừa cho chảy qua van dưới cột. Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 - 5 cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel.Khi cột đã được nạp đầy gel, đặt một đĩa giấy lọc hoặc ít bông thủy tinh lên bề mặt nền cột để bảo vệ mặt cột khi cho mẫu vào hoặc khi thay đổi dịch rửa trôi, khóa đầu ra của cột và gắn adaptor vào. Cho chạy máy sắc ký để ổn định cột bằng đệm phosphate pH 7 với lượng đệm chạy bằng 2 - 3 lần thể tích cột. Sau khi cột đã ổn định đóng đầu ra của cột và điều chỉnh adaptor xuống sát lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền gel qua adaptor. Bước 3: Nạp mẫu vào cột Chuẩn bị mẫu: Mẫu chạy sắc ký phải sạch, hòa tan mẫu trong NaOH 0,1 N. Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,45 micrometre) để làm gia tăng độ bền và thời gian sử dụng của cột. Dùng xi lanh hút mẫu, bơm mẫu vào hệ thống sắc ký. Trang 58
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dịch chiết lần 2 thu được ở nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian tối ưu Tỷ lệ tủa tối ưu Nồng độ tủa tối ưu pH tủa tối ưu của của cồn của TCA HCl Hòa tan tủa bằng NaOH 0,1 N Xác định hàm lượng Tiến hành chạy sắc ký lọc protein trước sắc ký gel Sơ đồ 2.8: Chuẩn bị mẫu chạy sắc ký Bước 4: Thêm dung dịch đêm rửa Sau khi mẫu thấm hết vào cột, bổ sung ngay vài ml dung dịch đệm để rửa, để cho mẫu còn đọng lại thấm hết vào nền cột. Mẫu và dung dịch đệm di chuyên qua côt. Các phân tử di chuyển vào và ra ngoài lỗ hạt gel. Sau đó nối cột với bình chứa dịch thổi cột. Bước 5: Thổi cột Dịch thổi cột được giữ ổn định ở tốc độ thích hợp. Điều này rất quan trọng vì tốc độ thổi cột cao cho kết quả tách mẫu thấp, ngược lại, tốc độ thổi cột thấp kéo dài thời gian tách mẫu, các peak bị hoãng ra cho kết quả tách thấp. Thổi cột liên tục bằng dung dịch đệm phosphate. Bước 6: Thu mẫu và xác định mẫu tách được Trang 59
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dịch ra khỏi cột được đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm bằng detector trong hệ thống sắc ký và được thể hiện độ hấp thu dưới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP - Data View trên máy tính. Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector). Dựa vào sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak. Các peak sẽ được phân tích hàm lượng protein sau sắc ký theo phương pháp Bradford.  Tính kết quả Xác định hiệu suất quá trình tinh sạch bằng hệ thống sắc ký lọc gel: Hiệu suất tinh sạch 2.3.2.7 Thu nhận và bảo quản hoạt chất protein bằng kỹ thuật đông khô. Bước 1 : Làm lạnh mẫu Mẫu cần được làm lạnh trước thành trạng thái rắn (ở nhiệt độ ít nhất – 40 oC). Có thể dung bồn lạnh hoặc tủ lạnh (ngăn đá) để làm lạnh mẫu trước. Bước 2: Đông khô mẫu Nối một lọ nước mẫu đã được làm lạnh trước (ở bước 1) vào một quikseal và mở valve của quickseal để rút chân không của mẫu. Theo dõi đèn hiển thị nhằm đảm bảo chân không và nhiệt độ của bộ ngưng tụ o C1 ≤ -40 C và chân không V1 ≤ 200 militorrs. Còn khi chưa đạt yêu cầu trên thì không được nối them lọ đựng mẫu nữa. Bước 3: Thu mẫu Khi các mẫu đã khô theo yêu cầu thì tắt máy đông khô thì thu bột protein sẽ được cho vào lọ thủy tinh nhỏ và được bảo quản trong điều kiện lạnh (tránh sự biến tính hoạt chất protein do tác động của nhiệt độ. 2.3.2.8 Phương pháp xử lý số liệu. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và phần mềm Stapraphics. Trang 60
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Một số chỉ tiêu sinh hóa ở rong bún Enteromorpha spp. 3.1.1 Xác định độ ẩm của rong Bảng 3.1: Kết quả độ ẩm của rong STT Thí nghiệm Dộ ẩm (%) 1 Thí nghiệm 1 8,468 2 Thí nghiệm 2 8,121 3 Thí nghiệm 3 8,23 4 Giá trị trung bình 8,273 3.1.2 Xác định % khoáng tổng số và chất mất khi nung. Bảng 3.2: Kết quả khoáng tổng số của rong STT Thí nghiệm Khoáng tổng số (%) 1 Thí nghiệm 1 8,69 2 Thí nghiệm 2 8,81 3 Thí nghiệm 3 8,6 4 Giá trị trung bình 8,7 Trang 61
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.3: Kết quả chất mất khi nung của rong STT Thí nghiệm Chất mất khi nung (%) 1 Thí nghiệm 1 70,19 2 Thí nghiệm 2 70.73 3 Thí nghiệm 3 70,58 4 Thí nghiệm 4 70,5 3.1.3 Xác định nito tổng số bằng phương pháp Kjeldahl Bảng 3.4: Kết quả chuẩn độ mẫu định lượng nitơ tổng số STT Thí nghiệm Nito tổng (%) 1 Thí nghiệm 1 2,84 2 Thí nghiệm 2 2,272 3 Thí nghiệm 3 2,982 4 Giá trị trung bình 2,698 3.1.4 Xác định lượng lipit có trong mẫu Bảng 3.5: Kết quả hàm lượng lipit có trong mẫu Bì (g) Bì + Mẫu (trước Bì + Mẫu (sau sấy) Lipit có trong mẫu sấy) (%) 1,4448 2,4532 2,4012 5,2 3.1.5 Định lượng đường tổng số Trang 62
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.6: Kết quả hàm lượng đường tổng có trong mẫu OD540nm mẫu glucose OD540 nm mẫu rong Đường tổng của rong (%) 1,080 0,445 35,42% 3.1.6 Xác định phospho tổng bằng quang phổ kế Bảng 3.7: Kết quả hàm lượng phosphor có trong mẫu OD650 nm hydroquinone 0,5% Hàm lượng phospho có trong rong (%) 0,337 0,042% 3.1.7 Xác định hàm lượng sắt có trong mẫu Bảng 3.8: Kết quả hàm lượng sắt có trong mẫu OD485nm sắt Hàm lượng sắt có trong (%) 0,605 0,013 3.1.8 Xác định hàm lượng canxi và magie Bảng 3.9: Kết quả hàm lượng Ca và Mg có trong mẫu Ca +Mg Ca Mg V Trilon B 0,02N (ml) 4,4 0,8 3,6 Hàm lượng Ca và 0,32 0,875 Mg (%) 3.1.9 Thành phần AA trong protein của rong bún Enteromorpha spp. Trang 63
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.10 : Kết quả phân tích hàm lượng các AA ở rong Bún Enteromorpha spp. Tên các acid amin Kết quả (%) Phương pháp thử Glycine 5,25 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Alanine 5,08 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Serine 0,75 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Proline 1,90 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Valine 2,19 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Threonine 0,12 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Trans – 4 hydroxy – L – prolin 0,00 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Leucine IsoLeucine 4,68 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Methionine 0,35 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Phenylalanine 1,48 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Arginine 0,01 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Aspartic acid 7,59 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Glutamic acid 12,34 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Tryptophan 0,31 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Cysteine 0,04 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Lysine 2,09 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Histidine 0,13 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Trang 64
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tyrosine 1,88% LC/MS/MS-TK.Ez.Faast Cystine 0,002 % LC/MS/MS-TK.Ez.Faast 3.2. Khảo sát tỷ lệ nước ngâm, thời gian nghiền tối ưu cho tách chiết protein ở rong bún Enteromorpha spp. Bảng 3.11 : Kết quả khảo sát tỷ lệ nước ngâm tách chiết protein trong 1 g bột rong Bún Enteromorpha spp. Tỷ lệ bột rong:nước 1:20 1:30 1:40 1:50 1:60 1:70 1:80 ngâm (w/v) % protein (%) 4,21 7,16 6,00 5,55 4,94 4,10 1,70 Đồ thị 3.1: Tỷ lệ nước ngâm tách chiết protein Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.11 và đồ thị 3.1, ta nhận thấy tỷ lệ nước ngâm 1:30 ml cho hàm lượng protein cao nhất (7,16 %) so với tỷ lệ 1:80 ml cho kết quả thấp nhất (1,70%). Ở tỷ lệ 1:20 ml chưa đủ để làm rong trương nở hết và máy phá vỡ tế bào nghiền không được tốt, tỷ lệ 1:40 ml đến 1:80 ml thì lượng nước nhiều làm hao tốn các chi phí khác, nên không cần thiết phải dùng lượng nước nhiều. Trang 65
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vậy trong quá trình ngâm mẫu để tách protein, ta tìm thấy được tỷ lệ nước ngâm 1:30 ml là đạt được giá trị tối ưu nhất để làm cơ sở nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.12 : Kết quả khảo sát thời gian nghiền tách chiết protein trong 1 g bột rong Bún Enteromorpha spp. Thời gian 1 phút 2 phút 3 phút 4 phút 5 phút nghiền % protein 0,99 2,68 7,29 7,41 7,56 (%) Đồ thị 3.2: Thời gian nghiền tách chiết protein Nhận xét:Từ bảng 3.12; đồ thị 3.2, ta nhận thấy thời gian nghiền từ 1 đến 2 phút cho hàm lượng protein thấp nhất so với thời gian nghiền 5 phút vì thời gian chưa đủ để phá vỡ tế bào. Ở thời gian từ 3 đến 5 phút lần lượt cho hàm lượng protein cao (7,29 %); (7,41 %); (7,56 %). Tuy nhiên thời gian quá dài thì hàm lượng protein cũng chỉ có vậy, vì khi khảo sát ta đã giới hạn khối lượng cho từng thí nghiệm. Trang 66
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Ở khảo sát này cho thấy thời gian nghiền cũng ảnh hưởng tới quá trình phá vỡ tế bào, nếu thời gian ít thì hàm lượng protein thấp, còn thời gian dài hàm lượng protein không thay đổi nhiều mà còn tốn năng lượng. Vì thế thích hợp nhất là ở thời gian 3 phút để làm cơ sở nghiên cứu tiếp theo. 3.3 Khảo sát % NaOH, nhiệt độ, thời gian ủ bã ảnh hưởng đến sự tách chiết protein ở rong bún Enteromorpha spp. Khi ta chọn được tỷ lệ nước ngâm, thời gian nghiền tối ưu dựa vào kết quả bảng 3.11; 3.12 để tiếp tục khảo sát ảnh hưởng theo % NaOH, nhiệt độ, thời gian ủ bã khác nhau, tìm ra % NaOH, nhiệt độ, thời gian ủ bã tối ưu đến sự tách chiết protein ở rong Bún Enteromorpha spp. Bảng 3.13: Kết quả khảo sát % NaOH tách chiết protein trong 1 g bột rong Bún Enteromorpha spp. % NaOH 0,5 % 1% 1,5% 2% 2,5% % protein 7,11 7,52 7,18 7,12 7,08 (%) Đồ thị 3.3: % NaOH tách chiết protein Trang 67
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.4 và đồ thị 3.3 ta nhận thấy % NaOH tối ưu dùng để ủ bã rong là nồng độ NaOH 1 % thu được hàm lượng protein cao nhất (7,52 %) so với NaOH 2,5 % (7,08). Vì khi xử lý bằng NaOH 1% làm cho môi trường kiềm tính, các phân tử protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất H+), tính tan của protein tăng cao. Như vậy protein trong bã bị hòa tan ra ngoài dung dịch bởi NaOH, ở NaOH 0,5 % môi trường không đủ kiềm để hòa tan protein nên hàm lượng thấp (7,11 %). Đối với NaOH 1% thì hầu như protein hòa tan hoàn toàn thuận lợi cho quá trình tạo tủa protein dẫn đến hàm lượng protein cao (7,52 %). Tuy nhiên sự hòa tan protein không tăng tuyến tính với nồng độ NaOH, ở NaOH 1,5% tới NaOH 2,5 % hàm lượng protein giảm dần vì môi trường pH quá cao làm ảnh hưởng đến protein và gây biến tính protein. Vậy trong quá trình ủ bã để tách protein, thì ở NaOH 1 % thu được hàm lượng protein cao nhất để làm cơ sở nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.14: Kết quả khảo sát nhiệt độ ủ tách chiết protein trong 1 g bột rong bún Enteromorpha spp. Nhiệt độ ủ 40oC 50oC 60oC 70oC % protein (%) 6,79 7,53 6,97 6,70 Trang 68
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đồ thị 3.4: Nhiệt độ tách chiết protein Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.14 và đồ thị 3.4, ta nhận thấy nhiệt độ tối ưu để ủ bã rong là 50 oC ta thu được % protein cao (7,53 %). Việc xử lý bằng kiềm NaOH 1 % kết hợp với nhiệt độ 50 oC làm cho các phân tử polysaccharic trong rong bị cắt đứt, dịch chiết protein được tan trong dịch NaOH thuận lợi cho quá trình tạo tủa. Ở 40 oC thì nhiệt độ không cao để thúc đẩy quá trình cắt các liên kết trong tảo. Khi nhiệt độ tăng cao 60 oC; 70 oC làm cho protein bị biến tính vì nhiệt độ dẫn đến hàm lượng protein thấp dần. Đồng thời pH kiềm kết hợp với nhiệt độ cao gây khả năng tạo gel càng lớn. Vậy với nồng độ NaOH 1 % và nhiệt độ 50 oC thì thu được hàm lượng protein cao nhất, dựa vào kết quả này ta bố trí thí nghiệm tiếp theo. Bảng 3.15: Kết quả khảo sát thời gian ủ tách chiết protein trong 1 g bột rong bún Enteromorpha spp. Thời gian ủ 30 phút 60 phút 90 phút 120 phút % protein (%) 6,77 7,51 7,66 6,73 Trang 69
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đồ thị 3.5: Thời gian ủ tách chiết protein Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.15 và đồ thị 3.5, nhận thấy thời gian ủ tối ưu là 90 phút thu được % protein cao (7,66 %). Thời gian ủ cũng ảnh hưởng đến kết quả vì nếu ít quá (30 - 60 phút) thời gian chưa đủ để cắt các liên kết, còn nếu như thời gian ủ dài quá 120 phút làm protein bị biến tính dẫn đến hàm lượng protein thấp (6,73 %) ảnh hưởng việc thu nhận protein. Vậy với thời gian ủ 90 phút thì thu được hàm lượng protein cao nhất, dựa vào kết quả này ta bố trí thí nghiệm tiếp theo. 3.4 Khảo sát quá trình tủa theo các % TCA , tỷ lệ cồn 96o và pH ảnh hưởng thu hàm lượng protein ở dịch chiết rong Bún Enteromorpha spp. Khi chọn được dịch chiết tốt nhất có chứa hàm lượng protein cao nhất, tiếp tục khảo sát quá trình tủa protein ảnh hưởng bởi các dung dịch tủa. 3.4.1. Nồng độ TCA tối ưu tủa protein ở dung dịch chiết rong Bún Enteromorpha spp. Trang 70
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.16: Kết quả khảo sát nồng độ TCA tủa protein trong 5 ml dung dịch chiết rong Bún Enteromorpha spp. Nồng độ 10% 15% 20% 25% 30% TCA (%) % protein 7,5 7,55 7,62 8,27 7,86 (%) Đồ thị 3.6: Nồng độ TCA tủa protein Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.16 và đồ thị 3.6, nhận thấy phần trăm TCA tối ưu dùng để tủa protein trong 5ml dung dịch chiết rong là nồng độ TCA 25 % thu được % protein cao nhất (8,27 %) so với TCA 10%. Vì TCA là axit hữu cơ nên khi cho vào dịch chiết rong sẽ tạo nên môi trường axit yếu, protein mất điện tích, pH của môi trường đạt gần tới điểm đẳng điện có khả năng gây tủa. Nồng độ TCA ở 25 % sẽ cho hàm lượng protein cao nhất (8,27 %). Còn ở nồng độ TCA 30 % thì nồng độ acid cao làm cho protein bị biến tính dẫn đến hàm lượng protein thấp (7,86%). Với TCA 10 %, 15 %, 20 % nồng độ chưa cao để gây tủa protein dẫn đến hàm lượng protein thấp. Trang 71
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vậy trong quá trình khảo sát % TCA tủa protein, ta tìm thấy được TCA 25 % là tác nhân gây tủa để thu được hàm lượng protein cao nhất làm cơ sở nghiên cứu tiếp theo. 3.4.2. Tỷ lệ cồn tối ưu tủa protein ở dung dịch chiết rong bún Enteromorpha spp. Khi ta chọn được dịch chiết tốt nhất có chứa hàm lượng protein cao nhất, dựa vào đó ta khảo sát quá trình tủa theo tỷ lệ cồn ảnh hưởng hàm lượng protein. Bảng 3.17: Kết quả khảo sát tỷ lệ cồn tủa protein trong 5 ml dung dịch chiết rong Enteromorpha spp. Tỷ lệ dịch 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 chiết : Cồn % protein 6,72 6,82 6,92 7,68 7,01 (%) Đồ thị 3.7: Tỷ lệ cồn tủa protein Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.17 và đồ thị 3.7, ta nhận thấy tỷ lệ cồn tối ưu tủa protein ở trong 5ml dung dịch chiết rong là ở tỷ lệ dịch chiết : cồn = 1 : 4 ta thu Trang 72
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP được % protein cao (7,68 %) so với tỷ lệ dịch chiết : cồn = 1 : 1 (6,72 %). Vì khi thêm cồn lạnh vào dịch chiết rong, các phân tử protein bị mất nước và kém bền trong dung dịch, là do cồn 96o là dung môi háo nước, chúng sẽ lấy nước của protein khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, cồn lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng có thể làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Do đó, khi tỷ lệ cồn cao (1:5) hay thấp (1:1; 1:2; 1:3) đều ảnh hưởng quá trình tủa. Vậy trong quá trình khảo sát tỷ lệ cồn 960 tủa protein, ta tìm thấy được tỷ lệ cồn 96o (1:4 ) là đạt được giá trị tối ưu nhất để làm cơ sở nghiên cứu tiếp theo. 3.4.3. pH tối ưu tủa protein ở dung dịch chiết rong Bún Enteromorpha spp. Khi ta chọn được dịch chiết tốt nhất có chứa hàm lượng protein cao nhất, dựa vào đó ta khảo sát quá trình tủa theo HCl ở các pH ảnh hưởng hàm lượng protein. Bảng 3.18: Kết quả khảo sát pH tủa protein trong 5 ml dung dịch chiết rong Bún Enteromorpha spp. HCl ở các pH2 pH3 pH4 pH5 pH6 pH % protein 7,06 7,15 7,99 7,44 6,85 (%) Trang 73
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đồ thị 3.8: HCl tủa protein Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.18 và đồ thị 3.8, ta nhận thấy pH tối ưu tủa protein ở trong 5 ml dung dịch chiết rong là pH4 ta thu được % protein cao (7,99 %) so với pH6 (6,85 %). Vì khi thêm HCl vào dịch chiết rong, HCl là axit vô cơ mạnh, axit này có tính háo nước, sẽ lấy nước của dung dịch protein , protein bị khử nước. Đồng thời pH của môi trường giảm xuống, ở pH2 và pH3 protein tích điện dương khi đó tính tan của protein tăng vì thế hàm lượng protein ở các pH này thấp (7,06 %) , (7,15 %). Ở pH4 dịch chiết đạt giá trị đẳng điện, khi đó protein không tích điện. Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn khả năng tương tác với môi trường, khi đó, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường dẫn đến hàm lượng protein ở pH này cao (7,99 %). Protein tạo tủa là do mất lớp áo nước và trung hòa điện tích. Còn ở pH5 và pH6 đây là môi trường acid loãng và gần như trung tính nên tính tan của protein tăng không còn tủa như ở pH4. Vậy trong quá trình khảo sát pH tủa protein, ta tìm thấy được pH4 là đạt được giá trị tối ưu nhất để làm cơ sở nghiên cứu tiếp theo. 3.5 So sánh sự tủa protein trong cồn 96o, TCA và HCl. Trang 74
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Khi ta chọn được nồng độ TCA 25 %, tỷ lệ cồn 1:4, HCl pH4 là kết quả tối ưu nhất để tủa protein, dựa vào bảng 3.19 ta so sánh 3 tác nhân tủa để tìm ra tác nhân tủa tốt nhất. Bảng 3.19: Kết quả tủa protein với 3 tác nhân tủa cồn, TCA, HCl. Hiệu suất thu pH ( nồng độ Tác nhân tủa Thời gian tủa % protein (%) hồi protein hoặc tỷ lệ) (%) TCA 25% 30 phút 8,21 48,69% HCl pH4 30 phút 7,83 46,44% Cồn 96o 1:4 30 phút 7,55 44,78% Đồ thị 3.9: Các dung dịch tối ưu tủa protein Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.19 và đồ thị 3.9, hàm lượng protein thu được bằng tủa TCA là cao nhất 8,21 %, nhưng phải ở nồng độ 25 % so với tủa bằng cồn Trang 75
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP và HCl tỷ lệ 1:4 và pH4. Đối với phương pháp tủa protein bằng cồn và HCl cho hàm lượng protein thấp hơn tủa bằng TCA. Từ những suy luận trên, chúng tôi nhận thấy rằng, phương pháp tủa bằng TCA là tốt nhất. 3.6. Tinh sạch hoạt chất protein qua lọc gel Sau khi tiến hành chiết xuất và tủa protein bằng 3 tác nhân: cồn lạnh, TCA và HCl, chúng ta tiến hành chạy sắc ký các sản phẩm tủa ở các tỷ lệ, nồng độ và pH tối ưu. Đối với sản phẩm tủa bằng cồn lạnh, TCA và HCl, quá trình tinh sạch được thực hiện qua lọc gel Biogel P - 100. 3.6.1. Tinh sạch protein qua lọc gel Biogel P - 100 sau khi tủa protein bằng TCA. Lấy 2 ml dịch protein từ 4 ml dịch tủa đã pha trong NaOH 0,1 N, cho chạy qua hệ sắc ký cột Biogel P - 100. Trang 76
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.1: Sắc ký đồ qua tinh sạch protein bằng sắc ký lọc gel sau khi tủa protein bằng TCA. Kết quả tinh sạch protein qua lọc gel sau khi tủa protein bằng TCA thu được 2 peak với thứ tự như sau. Peak 1:Từ ống 19 đến ống 32 thu được 28 ml Peak 2:Từ ống 33 đến ống 69 thu được 74 ml Xác định hàm lượng cho từng peak. Tuy nhiên hàm lượng protein của peak 2 là cao nhất nên có thể dự đoán peak 2 có chứa protein quan tâm. Bảng 3.20: Kết quả xác định hàm lượng protein trước và sau khi tinh sạch qua tác nhân tủa protein bằng TCA. ∑Hàm lượng (mg) Hiệu suất tinh sạch (%) Trước sắc ký 9.125 100% Sau sắc ký 8,17 90% Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.20, ta nhận thấy sau khi tinh sạch protein qua sắc ký lọc gel ta có thể nhận thấy hàm lượng protein sau khi tinh sạch thấp hơn hàm lượng protein trước khi tinh sạch. Vì một số protein tạp được loại bỏ sau khi chạy sắc ký lọc gel Biogel P - 100. 3.6.2 Tinh sạch hoạt chất protein qua lọc gel Biogel P - 100 sau khi tủa protein bằng HCl. Lấy 2 ml dịch protein từ 4ml dịch tủa đã pha trong NaOH 0,1 N, cho chạy qua hệ sắc ký cột Biogel P - 100. Trang 77
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.2: Sắc ký đồ qua tinh sạch protein bằng sắc ký lọc gel sau khi tủa protein bằng HCl Kết quả tinh sạch protein qua lọc gel sau khi tủa protein bằng HCl thu được 2 peak với thứ tự như sau. Peak 1:Từ ống 16 đến ống 31 thu được 32 ml Peak 2:Từ ống 32 đến ống 60 thu được 58 ml Xác định hàm lượng cho từng peak. Tuy nhiên hàm lượng protein của peak 1 là cao nhất nên có thể dự đoán peak 1 có chứa protein quan tâm. Bảng 3.21: Kết quả xác định hàm lượng protein trước và sau khi tinh sạch qua tác nhân tủa protein bằng HCl. ∑Hàm lượng (mg) Hiệu suất tinh sạch (%) Trước sắc ký 7,125 100% Sau sắc ký 4,17 59% Trang 78
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.21, ta nhận thấy sau khi tinh sạch protein qua sắc ký lọc gel ta có thể nhận thấy hàm lượng protein sau khi tinh sạch thấp hơn hàm lượng protein trước khi tinh sạch. Vì một số protein tạp được loại bỏ sau khi chạy sắc ký lọc gel Biogel P - 100. 3.6.3 Tinh sạch hoạt chất protein qua lọc gel Biogel P - 100 sau khi tủa protein bằng cồn 96o. Lấy 2 ml dịch protein từ 4 ml dịch tủa đã pha trong NaOH 0,1 N, cho chạy qua hệ sắc ký cột Biogel P - 100. Hình 3.3: Sắc ký đồ tinh sạch protein bằng sắc ký lọc gel sau khi tủa protein bằng cồn 96o. Kết quả tinh sạch protein qua lọc gel sau khi tủa protein bằng cồn 96o thu được 2 peak với thứ tự như sau. Peak 1:Từ ống 16 đến ống 26 thu được 22 ml Peak 2:Từ ống 33 đến ống 69 thu được 74 ml Trang 79
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Xác định hàm lượng cho từng peak. Tuy nhiên hàm lượng protein của peak 1 là cao nhất nên có thể dự đoán peak 1 có chứa protein quan tâm. Bảng 3.22: Kết quả xác định hàm lượng protein trước và sau khi tinh sạch qua tác nhân tủa protein bằng cồn 96o. ∑hàm lượng (mg) Hiệu suất tinh sạch (%) Trước sắc ký 3,225 100% Sau sắc ký 2,35 73% Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.22, ta nhận thấy sau khi tinh sạch protein qua sắc ký lọc gel ta có thể nhận thấy hàm lượng protein sau khi tinh sạch thấp hơn hàm lượng protein trước khi tinh sạch. Vì một số protein tạp được loại bỏ sau khi chạy sắc ký lọc gel Biogel P – 100. 3.6.4 So sánh kết quả tinh sạch protein với 3 tác nhân tủa bằng cồn 96o, TCA, HCl. Bảng 3.23: Kết quả tinh sạch protein với 3 tác nhân tủa bằng cồn 96o, TCA, HCl qua sắc ký lọc gel. Hàm lượng protein (mg) Hiệu suất (%) Dịch thu được sau khi chạy sắc ký, khi tủa 8,17 90 % protein bằng TCA Dịch thu được sau khi chạy sắc ký, khi tủa 2,35 73 % protein bằng cồn 96o Dịch thu được sau khi 4,17 59 % chạy sắc ký, khi tủa Trang 80
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP protein bằng HCl Đồ thị 3.10: Hàm lượng protein TSK và SSK của 3 dung dịch tủa Nhận xét:Vậy sau khi tinh sạch protein trên sắc ký cột Biogel P - 100 thu hàm lượng cao trong quá trình tinh sạch, một số protein tạp được loại bỏ. Ta dựa vào bảng 3.14 thì độ tinh sạch và hiệu suất thu nhận của tủa TCA là tốt nhất khi qua gel Biogel P - 100 và tủa HCl là thấp nhất. Trang 81
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ những kết quả thu được qua khảo sát thí nghiệm, từ đó rút ra những kết luận: - Tách chiết protein với tỷ lệ bột rong : nước ngâm là 1:30 ml (w/v) và thời gian nghiền 3 phút là tối ưu để tách chiết protein từ rong Bún Enteromorpha spp. - Ngâm bã rong với NaOH 1%, nhiệt độ ủ 50 oC và thời gian ủ 90 phút là tối ưu để tách chiết protein từ bã rong Bún Enteromorpha spp. - Tủa protein ở trong dịch chiết lần 2 sử dụng tỷ lệ dịch chiết : cồn = 1: 4 (v/v). - Tủa protein ở trong dịch chiết lần 2 sử dụng nồng độ TCA 25 % là tối ưu nhất. - Tủa protein ở trong dịch chiết lần 2 sử dụng HCl ở pH 4 là tối ưu nhất. - Phương pháp tủa bằng TCA cho hiệu suất thu nhận protein cao nhất (90 %) so với tủa HCl (59 %) và tủa cồn (73 %). Vậy ta kết luận hiệu suất thu nhận protein khi tủa TCA và cồn là tốt nhất khi qua sắc ký lọc gel Biogel P - 100. 4.2. Kiến nghị Với những kết quả thu được chúng tôi đã hiểu được một số vấn đề cơ bản về protein và những bước tiến hành tách chiết, thu nhận. Tuy nhiên, vì điều kiện thời gian có giới hạn nên chỉ nghiên cứu trong phạm vi giới hạn nêu trên. Nếu có điều kiện chúng tôi sẽ thực hiện tiếp đề tài theo hướng bổ sung protein từ rong vào thành phần thức ăn của ĐVTS. Trang 82
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1]. Trần Thị Ân, Đái Duy Ban, Nguyễn Hữu Chấn, Đỗ Đình Hồ, Lê Đức Trình. 1980. Hoá sinh học. NXB Y học, Hà Nội. [2]. Báo cáo dự án FSPS II/SUDA 3.3.4 (2009). Identify potential for use of recirculation technology for employment generration in aquaculture. [3]. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng. 1999. Hoá sinh học. NXB Giáo dục, Hà Nội. [4]. DANIDA (2002), Seaweed farming and production in Vietnam, present situation and possibilities. Báo cáo dự án. [5] Nguyễn Hữu Dinh, Huỳnh Quang Năng, Trần Ngọc Bút, Nguyễn Văn Tiến. Rong biển Việt Nam (phần phía Bắc), NXB KH & KT, HCM, 364 tr., (1993). [6] Nguyễn Hữu Đại (1999), Thực vật thủy sinh. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. [7] Trần Thị Hà (2000). Giáo trình kỹ thuật nuôi trồng rong biển. NXB nông nghiệp. [8] Nguyễn Xuân Hòa, Nguyễn Hữu Đại, Nguyễn Xuân Vy (2001), Sự hấp thụ, tích lụy Nitrate, Phosphate và khả năng xử lý môi trường ưu dưỡng của rong xà lách Ulva (Chlorophyta, Ulvales) Tuyển tập nghiên cứu biển, Tập XI: 105 – 114. [9] Phạm Hoàng Hộ. “Rong biển Việt Nam (phía Nam)”. NXB Sài Gòn, 560 tr. , 1969. [10] Le Dinh Hung, Huynh Quang Nang, Bui Minh Ly, Ngo Quoc Buu and Tran Thi Thanh Van (2004), The chemical composition of some commercial species of Red algae (Rhodophyta) along the coast of the Southern of Vietnam (in Vietnamese). Journal of Chemistry, Vol. 42, Number 2, 159 - 162. Trang 83
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [11]Nguyễn Đức Lượng. Thí nghiệm hóa sinh học, nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp HCM, Tp HCM. [12] Nguyễn Văn Mùi. Thực hành hóa sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, trang 46. [13] Huynh Quang Nang, Nguyen Huu Dinh and Tran Kha (1999), Some results of study on the species Gracilaria heteroclada Zhang et Xia in the Southern Vietnam seawaters (in Vietnamese). Proceedings of the fourth National Conference on Marine Science and Technology. Ha Noi, Vol. II, pp. 1005 – 1009. [14]. PGS. TS. Nguyễn Tiến Thắng (2010). Giáo trình công nghệ enzyme, trường Đại học Kỹ Thuật Công nghệ Tp. HCM, Tp HCM. [15]. PGS. TS. Nguyễn Tiến Thắng (2009). Thực hành môn : Công nghệ enzyme và protein, Viện Sinh học Nhiệt đới, Tp HCM. [16]. Đồng Thị Thanh Thu (1995). Hóa sinh ứng dụng, tủ sách đại học tổng hợp Tp. HCM. [17]. Nguyễn Văn Tiến. “Nguồn lợi Rong biển”. Chuyên khảo biển Việt Nam, IV. (nguồn lợi Sinh vật và các hệ sinh thái biển), Hà Nội. Tr. 236-280 (1994). [18]. Nguyễn Thanh Tùng (1999). Tài nguyên và sinh thái rong. Tủ sách đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh. [19]. Viện Nuôi trồng thủy sản II, “Quy hoạch phát triển nuôi tôm nước lợ Việt Nam đến năm 2015 và định hướng đến năm 2020”. Báo cáo Bộ NN & PTNT 2007-2009,147 tr. (2009). Tài liệu nước ngoài [20] Amir Neori (2007), Essential role of seaweed cultivation in integrated multitrophic aquaculture farms for globar expansion of mariculture: an analysis. J Appl Phycol. Trang 84
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [21] Anna I. Sousa et al. (2007), Influence of salinity and nutrients and light on the germination and growth of Enteromorpha sp spores. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 341:142-150. [22] Aguilera-Morales, M., Casas-Valdez, M., Carrillo-Dominguez, S., Gonzalez-Acosta, B. and Perez-Gil, F. (2005), Chemical composition and microbiological assays of marine algae Enteromorpha spp. as a potential food source. Journal of Food Composition and Analysis 18, 79-88. [23] Bimalendu Ray et al. (2006), Polysaccharidas from Enteromorpha compressa: Isolation, purification and structural features, Carbohydrate Polymers, Volume 66, Issue 3, Pages 408-416. [24] Chattopadhyay et al. (2007), Sulphated polysaccharides from Indian sample of Enteromorpha compressa (Ulvales, Chlorophyta); Isolation and structural features, Food Chemistry, Volume 104, Issue 3, Pages 928-935. [25] Dodson J.R., Aronson J.M., 1978, Cell wall composition of Enteromorpha intestinalis, Bot. Mar., 21, 241–246. [26] Haroon A.M., Szaniawska A., 1995, Variations in energy values and lipid content in Enteromorpha spp. from the Gulf of Gdańsk, Oceanologia, 37 (2), 171–180. [27] Hoppe H.A., 1966, Nahrungsmittel aus Meeresalgen, Bot. Mar., 9 (Suppl.), 18–40. Jones A. L., Harwood J. L., 1993, Lipids and lipid metabolism in the marine alga Enteromorpha intestinalis, Phytochemistry, 34 (4), 969–972. [28] Jones A. L., Harwood J. L., 1993, Lipids and lipid metabolism in the marine alga Enteromorpha intestinalis, Phytochemistry, 34 (4), 969–972. [29] Lowry O.H., Farr A. L., Randall R. J., Rosebrough N. J., 1951, Protein measurement with Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 193, 265–275. [30] Moss, B. & MARSLAND, A., 1976. Regeneration of Enteromorpha. Br. phyeol. J., 11: 309-313. SCAGEL, R. F., 1960. The life history studies of the Trang 85