›

Đồ án Nghiên cứu quá trình sản xuất Ethanol từ rau rác thải tại chợ nông sản thực phẩm thủ Đức

pdf 74 trang thiennha21 12/04/2022 6690
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu quá trình sản xuất Ethanol từ rau rác thải tại chợ nông sản thực phẩm thủ Đức", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_qua_trinh_san_xuat_ethanol_tu_rau_rac_thai.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu quá trình sản xuất Ethanol từ rau rác thải tại chợ nông sản thực phẩm thủ Đức

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RAU RÁC THẢI TẠI CHỢ NÔNG SẢN THỰC PHẨM THỦ ĐỨC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH CN. NGÔ ĐỨC DUY Sinh viên thực hiện : LÊ XUÂN HUY MSSV: 0851110098 Lớp: 08DSH1 TP. Hồ Chí Minh, 2012
  2. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Trang DANH MỤC HÌNH ẢNH iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ viii LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Nhiên liệu sinh học 4 1.1.1. Ưu điểm của nhiên liệu sinh học 4 1.1.2. Nhược điểm của nhiên liệu sinh học 5 1.2. Tình hình sản xuất nhiên liệu sinh học trên thế giới và ở Việt Nam 5 1.2.1. Tình hình trên thế giới 5 1.2.2. Tình hình ở Việt Nam 6 1.2.3. Triển vọng ethanol tương lai 6 1.3. Các nguồn nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học 7 1.3.1. Nguyên liệu chứa tinh bột 7 1.3.2. Nguyên liệu chứa đường- mật rỉ 7 1.3.3. Nguyên liệu chứa lignocellulose 7 1.3.3.1. Cellulose 9 1.3.3.2. Hemicellulose 10 1.3.3.3. Lignin 11 1.4. Sơ lược về nguồn nguyên liệu rau quả 11 1.4.1. Tình hình sản xuất rau củ quả tại Việt Nam 11 1.4.2. Thành phần rau quả 12 1.4.2.1. Chất khô 12 1.4.2.2. Chất béo 14 i
  3. Đồ án tốt nghiệp 1.4.2.3. Acid hữu cơ 14 1.4.2.4. Vitamin 14 1.5. Quy trình sản xuất ethanol từ rau rác thải 15 1.5.1. Tổng quát 15 1.5.2. Tiền xử lý 15 1.5.2.1. Các phương pháp tiền xử lý cơ học 15 1.5.2.2. Các phương pháp tiền xử lý hóa học 15 1.5.2.3. Tiền xử lý sinh học 16 1.5.3. Quá trình thủy phân 16 1.5.3.1. Các nguồn sản xuất enzyme cellulase 16 1.5.3.2. Enzyme cellulase 17 1.5.3.3. Cấu trúc của enzyme cellulase 17 1.5.3.4. Cơ chế thủy phân cellulose của enzyme cellulase 18 1.5.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến qúa trình thủy phân 19 1.5.4. Quá trình lên men 21 1.5.4.1. Nấm men Sacharomyces cerevisiae 21 1.5.4.2. Cơ chế hóa sinh học của quá trình lên men 21 1.5.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 23 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Vật liệu và hóa chất. 25 2.1.1. Rau rác thải 25 2.1.2. Enzyme cellulase 25 2.1.3. Nấm men Sacharomyces cerevisiae 26 2.1.4. Các hóa chất sử dụng 26 2.2. Các thiết bị sử dụng 26 2.3. Các phương pháp sử dụng 28 ii
  4. Đồ án tốt nghiệp 2.3.1. Phương pháp xác định hàm lượng cellulose 28 2.3.2. Phương pháp định tính ethanol 29 2.3.3. Phương pháp đo nồng độ đường khử 30 2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 32 2.3.5. Phương pháp nuôi cấy và đếm nấm men 34 2.3.6. Phương pháp Cordebard 36 2.4. Trình tự nghiên cứu 39 2.4.1. Quy trình công nghệ 39 2.4.2. Thuyết minh quy trình 40 2.4.2.1. Giai đoạn tiền xử lý 40 2.4.2.2. Giai đoạn thủy phân bằng enzyme cellulase 41 2.4.2.3. Giai đoạn lên men bằng nấm men Sacharomyces cerevisiae 44 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 46 3.1. Giai đoạn tiền xử lý cơ chất 46 3.2. Giai đoạn thủy phân bằng enzyme cellulase 48 3.3. Giai đoạn lên men bằng nấm men Sacharomyces cerevisiae 53 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 4.1. Kết luận 58 4.2. Đề nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 iii
  5. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Số tt Tên hình Số trang Hình 1.1 Cấu trúc lignocellulose 8 Mối quan hệ cellulose – hemicellulose trong cầu trúc Hình 1.2 8 lignocellulose Hình 1.3 Công thức hóa học của cellulose 9 Hình 1.4 Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain 10 Hình 1.5 Cầu trúc lignin 11 Hình 1.6 Cầu nối peptide 18 Hình 1.7 Cơ chế quá trình thủy phân 19 Hình 2.1 Rau hư tại chợ Nông Sản Thực Phẩm Thù Đức 25 Hình 2.2 Vị trí địa lý chợ Nông Sản Thực Phẩm Thủ Đức 25 Hình 2.3 S.cerevisiae nhìn dưới kính hiển vi điện tử 40X 26 Hình 2.4 Hệ thống Kjendahl 27 iv
  6. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.5 Máy lắc 28 Hình 2.6 Máy đo quang phổ 28 Hình 2.7 Tủ hấp 28 Hình 2.8 Tủ sấy 28 Hình 2.9 Bể ổn nhiệt 28 Hình 2.10 Cân 28 Hình 2.11 Dung dịch chuyển sang màu vàng khi chuẩn độ bằng Na2S203 37 Hình 2.12 Dung dịch chuyển sang xanh đậm khi cho hồ tinh bột 37 Dung dịch chuyển sang xanh lơ khi tiếp tục chuẩn độ bằng Hình 2.13 38 Na2S203 Hình 2.14 Bã rau trước tiền xử lý bằng NaOH 40 Hình 2.15 Bã rau sau tiền xử lý bằng NaOH 41 v
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Stt Tên bảng Số trang Bảng 1.1 Một số nguyên liệu chứa tinh bột cao 7 Bảng 1.2 Diện tích sản lượng rau theo vùng 12 Bảng 1.3 Hàm lượng hydrocacbon của một số rau quả 13 Bảng 1.4 Thành phần hydrocacbon ở một số loại rau 14 Bảng 1.5 Dựng đường chuẩn glucose 0.5mg/ml 31 Bảng 1.6 Dựng đường chuẩn glucose 10mg/ml 33 Sự thay đổi khối lượng bã sau quá trình tiền xử lý bằng Bảng 3.1 46 NaOH, Na2CO3, Ca(OH)2 Sự thay đổi khối lượng bã sau quá trình tiền xử lý bằng Bảng 3.2 47 NaOH ở các thời điểm khác nhau Bảng 3.3 Nồng độ glucose, hiệu suất tại 25h theo nhiệt độ 48 Bảng 3.4 Nồng độ glucose, hiệu suất tại 25h theo thời gian 50 Bảng 3.5 Nồng độ glucose, hiệu suất tại 25h theo pH 51 vi
  8. Đồ án tốt nghiệp Nồng độ glucose, hiệu suất tại 25h theo lượng enzyme sử Bảng 3.6 52 dụng Bảng 3.7 Sự thay đổi lượng ethanol theo nhiệt độ 53 Bảng 3.8 Sự thay đổi lượng ethanol theo pH 54 Bảng 3.9 Sự thay đổi lượng ethanol theo lượng nấm men sử dụng 56 vii
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ Stt Tên sơ đồ và đồ thị Trang Đồ thị 2.1 Đồ thị đường chuẩn glucose 0.5mg/ml 35 Đồ thị 2.2 Đồ thị đường chuẩn glucose 10mg/ml 37 Sự thay đổi khối lượng bã rau sau quá trình tiền xử lý Biểu đồ 3.1 46 bằng NaOH 2%, Na2CO3 2%, Ca(OH)2 2% Sự thay đổi khối lượng bã rau sau quá trình tiền xử lý Biểu đồ 3.2 47 bằng NaOH ở các thời điểm khác nhau Biểu đồ 3.3 Nồng độ glucose, hiệu suất tại 24h theo nhiệt độ 49 Biểu đồ 3.4 Nồng độ glucose, hiệu suất theo thời gian 50 Biểu đồ 3.5 Nồng độ glucose, hiệu suất theo pH 51 Biểu đồ 3.6 Nồng độ glucose, hiệu suất theo lượng enzyme sử dụng 52 Biểu đồ 3.7 Sự thay đổi nồng độ ethanol theo nhiệt độ 54 Biểu đồ 3.8 Sự thay đổi nồng độ ethanol ở các pH khác nhau 55 Sự thay đổi nồng độ ethanol ở các tỷ lệ nấm men khác Biểu đồ 3.9 56 nhau viii
  10. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nhu cầu năng lượng của loài người đã hiện diện cách nay hàng ngàn năm, khi con người biết dùng lửa trong hoạt động hàng ngày để nướng thịt, đuổi thú dữ, đốt rừng làm rẫy. Kể từ đó nguồn năng lượng từ vật rắn ngày càng trở nên quan trọng, có hơn hai tỉ người trên thế giới đang dùng chất rắn trong gia đình để nấu nướng và sưởi ấm mùa đông. Năng lượng có vai trò quan trọng đối với sự phát triển kinh tế - xã hội và an ninh quốc gia. Vì vậy trong chính sách phát triển kinh tế xã hội bền vững, chính sách năng lượng được đặt lên hàng đầu. Vào thế kỷ 19 gỗ là nguồn năng lượng làm máy chạy bằng hơi nước trong ngành chuyên chở, giúp phát triển mạnh công nghiệp cơ giới. Sau đó, con người chế tạo máy phát điện cung cấp nguồn điện năng mới có nhiều công dụng cho đời sống hàng ngày và thay thế dần những máy chạy bằng hơi nước. Khi tìm thấy nguồn nhiên liệu trầm tích như than đá, dầu hỏa và khí đốt, con người sử dụng loại năng lượng không tái tạo này để chạy máy nổ, chủ yếu trong ngành vận tải, nhiệt và điện năng. Loại nhiên liệu thể lỏng trở nên thông dụng hơn trong ngành vận chuyển vì dễ sử dụng hơn loại nhiên liệu khí và rắn, và từ đó nguồn năng lượng rắn được sử dụng giảm dần. Với tốc độ tiêu thụ như hiện nay và trữ lượng dầu mỏ hiện có, nguồn năng lượng này sẽ nhanh chóng bị cạn kiệt trong vòng 40-50 năm nữa. Để đối phó tình hình đó, cần tìm ra các nguồn năng lượng thay thế được ưu tiên hàng đầu. Trong số các nguồn năng lượng thay thế dầu mỏ đang sử dụng hiện nay (năng lượng gió, năng lượng mặt trời, năng lượng hạt nhân ), năng lượng sinh học đang là xu thế phát triển tất yếu. Để tìm nguồn nhiên liêu thay thế phần nào việc sử dụng xăng dầu trong việc vận chuyển, trong những năm gần đây người ta phải tìm kiếm những phương thức mới sử dụng các nguồn nhiên liệu khác. Chẳng hạn sử dụng ethanol sinh học pha vào xăng chạy máy để giảm phần nào sự sử dụng xăng. Ở nhiều quốc gia công nghệ sản xuất ethanol sinh học với nguyên liệu sắn, ngô, khoai, gỗ rất phổ biến nhưng sẽ ảnh hưởng đến an ninh lương thực thế giới. Do vậy để sản xuất ethanol sinh 1
  11. Đồ án tốt nghiệp học phải tìm ra nguồn nguyên liệu thay thế từ những nguồn nguyên liệu tái sinh như: phế phẩm nông nghiệp, phế phẩm lâm nghiệp, phế phẩm từ nhà máy thực phẩm gia công, cây công nghiệp được gieo trồng cho mục đích làm nguyên liệu, các phế phẩm hữu cơ trong rác do đó để tìm nguồn nguyên liệu thay thế, em tiến hành nghiên cứu” Nghiên cứu quá trình sản xuất ethanol từ rau rác thải tại chợ tại chợ Nông Sản Thực Phẩm Thủ Đức” để sản xuất ethanol. 2. Mục đích nghiên cứu - Khảo sát sơ bộ đặc điểm rau rác thải tại chợ nông sản thực phẩm Thủ Đức - Tiền xử lý chất thải - Khảo sát điều kiện lên men ethanol từ chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae - Thu nhận ethanol sinh học sau lên men. 3. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp xác định hàm lượng cellulose để xác định hàm lượng cellulose trong rau rác thải - Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase thương mại - Xác định hàm lượng đường của dịch thủy phân dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicycid - Sử dụng phương pháp nuôi cấy và nhân giống để tăng hoạt lực của S. cerevisiae - Sử dụng phương pháp đếm nấm men để xác định mật độ nấm men trong 1ml - Xác định nồng độ ethanol sinh ra bằng phương pháp Cordebard - Phương pháp phân tích và xử lý số liệu tiến hành sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2007. 4. Phạm vi nghiên cứu - Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Vi sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, 9/621 xa lộ Hà Nội, Phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, TP. Hồ Chí Minh. - Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 4 đến tháng 7 năm 2012. 5. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp 2
  12. Đồ án tốt nghiệp Gồm 4 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và biện luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 3
  13. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nhiên liệu sinh học Nhiên liệu sinh học là loại nhiên liệu được hình thành từ các hợp chất có nguồn gốc động thực vật như nhiên liệu chế xuất từ chất béo của động thực vật, ngũ cốc, chất thải trong nông nghiệp, sản phẩm thải trong công nghiệp. Nhiên liệu sinh học có thể được phân loại thành các nhóm chính như sau: - Diesel sinh học (biodiesel) là một loại nhiên liệu lỏng có tính năng tương tự và có thể sử dụng thay thế cho loại dầu diesel truyền thống. Biodiesel được điều chế bằng cách từ dẫn xuất một số loại dầu mỡ sinh học thông qua quá trình transester hóa cho phản ứng với các loại rượu phổ biến nhất là methanol. - Ethanol sinh học (bioethanol) là một loại nhiên liệu lỏng, trong đó có thể sử dụng ethanol sinh học pha trộn vào xăng thay chì. Ethanol được chế biến thông qua quá trình lên men các sản phẩm hữu cơ như tinh bột, cellulose, lignocellulose. - Gas sinh học (biogas) là một loại khí hữu cơ gồm methane và các đồng đẳng khác. Biogas được tạo ra sau quá trình ủ lên men các sinh khối hữu cơ phế thải nông nghiệp, chủ yếu là cellulose, tạo thành sản phẩm ở dạng khí. Biogas có thể dùng làm nhiên liệu khí thay cho sản phẩm khí gas từ sản phẩm dầu mỏ [17]. 1.1.1. Ưu điểm của nhiên liệu sinh học Trước đây nhiên liệu sinh học hoàn toàn không được chú trọng hầu như đây chỉ là một nhiên liệu thay thế phụ tận dụng ở quy mô nhỏ. Tuy nhiên sau khi xuất hiện khủng hoảng nhiên liệu ở quy mô toàn cầu cũng như ý thức bảo vệ môi trường được lên cao nhiên liệu sinh học bắt đầu được chú ý phát triển ở quy mô lớn hơn do có nhiều ưu điểm nổi bậc so với các loại nhiên liệu truyền thống như sinh ra ít hàm lượng khí gây hiệu ứng nhà kính và ít gây ô nhiễm môi trường hơn các loại nhiên liệu truyền thống. Các nhiên liệu này lấy từ hoạt động sản xuất nông nghiệp và có thể tái sinh. Do đó chúng giảm sự phụ thuộc vào nguồn nhiên liệu không tái sinh truyền thống [16]. 4
  14. Đồ án tốt nghiệp 1.1.2. Nhược điểm của nhiên liệu sinh học Việc sản xuất ethanol sinh học từ các nguồn tinh bột hay từ các cây thực phẩm được cho là ảnh hưởng đến an ninh lương thực. Khả năng sản xuất ở quy mô lớn cũng còn kém do nguồn cung cấp không ổn định vì phụ thuộc vào thời tiết và nông nghiệp. Bên canh đó giá thành sản xuất nhiên liệu sinh học vẫn còn cao hơn nhiều so với nhiên liệu truyền thống, từ đó việc ứng dụng và sử dụng nhiên liệu sinh học vào đời sống vẫn chưa phổ biến rộng. Tuy ngày nay ở nhiều quốc gia người ta chú trọng vào sản xuất nhiên liệu sinh học từ phế phẩm nông nghiệp và công nghiệp [16]. 1.2. Tình hình sản xuất nhiên liệu sinh học trên thế giới và ở Việt Nam 1.2.1. Tình hình trên thế giới Năng lượng sinh học sẽ góp phần đa dạng hóa nguồn năng lượng, thúc đẩy tăng trưởng kinh tế, giảm thiểu ô nhiễm nhà kính. Đến năm 2015 thế giới sẽ sử dụng 12% nhiên liệu sinh học trong toàn bộ nhu cầu năng lượng. Chính quyền Obama và Cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (EPA) đã công bố Tiêu chuẩn nhiên liệu tái tạo để thúc đẩy việc phát triển nhiên liệu sinh học. Theo kế hoạch thì đến năm 2022 nhiên liệu tái tạo phục vụ giao thông ở Mỹ mỗi năm phải đạt tới 36 tỷ gallon (1gallon=3,785 lít). EPA xác định cuối năm 2011 phần nhiên liệu sinh học từ chất xơ (cellulose) phải đạt tới 6,6 triệu, phần diesel sinh học phải đạt 800 triệu gallon, phần nhiên liệu có thể tái sinh phải đạt 13,95 tỷ gallon. Hiện nay xăng E15 (15% ethanol) được coi là sử dụng an toàn cho ô tô ở Mỹ. Liên minh Châu Âu (EU) quyết định giảm thiểu phát tán khí nhà kính và giảm nhu cầu nhập khẩu xăng dầu bằng cách thực hiện mục tiêu thay thế 10% nhiên liệu dùng trong vận tải bằng các nhiên liệu tái tạo. Có 14 quốc gia trong EU thỏa thuận hợp tác nghiên cứu và triển khai sản xuất nhiên liệu sinh học. Chính phủ Đức xác định đến năm 2020 ở nước này nguồn năng lượng có thể tái sinh ít nhất cũng phải đạt 30% tỷ lệ năng lượng được sử dụng. Chính phủ Pháp huy động 1,35 tỷ Euro để hỗ trợ cho sự phát triển nhiêu liệu sinh học và các nguồn năng lượng tái sinh. Phần Lan quyết định trong 10 năm tới, mỗi năm huy động 327 triệu euro để dành cho các nguồn năng lượng tái sinh [18]. 5
  15. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2. Tình hình ở Việt Nam Việt Nam có nhiều tiềm năng về nhiên liệu sinh học có thể làm nhiên liệu thay thế cho xăng dầu có nguồn gốc dầu mỏ. Nhiều loại cây như sắn, ngô, mía có thể sản xuất ethanol sinh học mà ở Việt Nam lại có nhiều vùng đất rất thích hợp với các loại cây trồng này. Sản lượng sắn cả nước năm 2007 là hơn 7 triệu tấn, mía đường hơn 14 triệu tấn và ngô gần 4 triệu tấn. Với sản lượng này có thể đáp ứng được cho nhu cầu sản xuất ethanol sinh học ở quy mô vừa và nhỏ. Ước tính Việt Nam có thể sản xuất 5 triệu lít ethanol sinh học mỗi năm nếu như có sự điều chỉnh về sản lượng và diện tích cây trồng. Tuy nhiên tiềm năng về nhiên liệu sinh học là rất lớn, song đến nay các hoạt động sản xuất ethanol từ mía, tổng hợp điesel từ dầu cây công nghiệp hoặc từ mỡ động vật chỉ dừng ở quy mô phòng thí nghiệm [17]. Theo Đề án Phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, Việt Nam sẽ sản xuất 150.000 tấn nhiên liệu sinh học, đáp ứng 0,1% nhu cầu xăng dầu của cả nước và tới năm 2025 sẽ nâng lên 5%. Tập đoàn Dầu khí quốc gia Việt Nam đã giao Tổng công ty Dầu Việt Nam nghiên cứu pha chế ethanol với xăng M92 hoặc tương đương M92 có tỷ lệ 5% ethanol với tên gọi thành phẩm là xăng sinh học E5. Xăng sinh học E5 do PV Oil pha chế chính thức có mặt trên thị trường từ ngày 1-8-2010 và được người tiêu dùng ủng hộ và tin dùng. 1.2.3. Triển vọng ethanol tương lai Cần có những nghiên cứu để tăng hiệu quả của ethanol sinh học thành nhiên liệu bền vững để thay thế xăng dầu. Điều này có liên quan đến việc giảm chi phí , tăng năng suất và tăng sự đa dạng của các nguồn nguyên liệu có thể sử dụng. Hướng đi cho những nghiên cứu để phát triển và cải tiến tạo ethanol sinh học là tìm những phương pháp chuyển hóa hemicellulose thành đường để lên men. Những phương pháp hiện nay có thể đạt được hiệu suất 50 – 72% ethanol cho mỗi gam glucose, giới hạn bởi khả năng chịu ảnh hưởng của nấm men đối với ethanol. Điều này dẫn đến hướng khả thi nghiên cứu những chủng nấm men có khả năng chịu ức chế tốt hơn. Ở khía cạnh này, công nghệ sinh học và vi sinh sẽ đóng vai trò rất quan 6
  16. Đồ án tốt nghiệp trọng trong công nghệ gene, không chỉ ở việc phát triển nấm men, mà còn ở việc phát triển những giống vi sinh vật khác có khả năng chuyển hóa cellulose và lignin tạo thành đường và lên men ethanol [17]. 1.3. Các nguồn nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học 1.3.1. Nguyên liệu chứa tinh bột Tinh bột là một polysacarit carbohydrates chứa hỗn hợp amylose và amylopectin, tỷ lệ phần trăm amylose và amylopectin thay đổi tùy thuộc vào từng loại tinh bột, tỷ lệ này thường từ 20%/80% đến 30%/70%. Tinh bột có nguồn gốc từ các loại cây khác nhau có tính chất vật lí và thành phần hóa học khác nhau. Chúng đều là các polymer carbohydrat phức tạp của glucose (công thức phân tử là C6H12O6). Môt số nguyên liệu chứa hàm lượng tinh bột cao: Bảng 1.1 Một số nguyên liệu chứa tinh bột cao 1.3.2. Nguyên liệu chứa đường- mật rỉ Mật rỉ hay rỉ đường là thứ phẩm của công nghệ sản xuất đường thường chiếm tử 3% đến 5% so với lượng mía đưa vào sản xuất. Tỷ lệ phụ thuộc vào chất lượng mía và công nghệ sản xuất. Bình thường lượng chất khô trong mật rỉ chiếm 80% đến 85%, nước chiếm 15% đến 20%. Trong số chất khô thì đường chiếm tới 60%, gồm 35% đến 40% là sacharoza và 20% đến 25% là đường khử. Số chất khô còn lại gọi chung là chất phi đường và gồm 30% đến 32% là hợp chất hữu cơ và 8% đến 10% là chất vô cơ. 1.3.3. Nguyên liệu chứa lignocellulose Thành phần chính của vật liệu lingocellulose là: cellulose, hemicelluloses, lignin. 7
  17. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1. Cấu trúc lignocellulose Hình 1.2 Mối quan hệ cellulose – hemicellulose trong cấu trúc lignocellulose Về cơ bản trong lignocellulose, cellulose tạo thành khung chính và được bao bọc bởi những chất có chức năng tạo mạng lưới như hemicellulose và kết dính như lignin. Cellulose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau và liên kết cộng hóa trị với nhau. Các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose và acid 4-O-methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin [9]. Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản, các sợi này được gắn lại với nhau nhờ hemicelluloses tạo thành cấu trúc vi sợi, với chiều rộng khoảng 25nm. Các vi sợi 8
  18. Đồ án tốt nghiệp này được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tác động của enzyme cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân [9]. 1.3.3.1. Cellulose Cellulose là chất màu trắng, không mùi, không vị, không tan trong nước ngay cả khi đun nóng và các dung môi hữu cơ thông thường, tan trong một số dung dịch acid vô cơ mạnh như: HCl, HNO3 một số dung dịch muối: ZnCl2, PbCl2 Cellulose là một polymer mạch thẳng của D-glucose được liên kết với nhau bằng liên kết β 1-4 glucosid. Các nhóm OH ở hai đầu mạch có tính chất hoàn toàn khác nhau, cấu trúc hemiacetal tại C1 có tính khử,trong khi đó nhóm OH tại C4 có tính chất của rượu[6]. Hình 1.3. Công thức hóa học cellulose Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là vùng kết tinh và vùng vô định hình. Trong vùng kết tinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tác động bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nhau nên dễ bị tác động. Có hai kiểu cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng kết tinh và vô định hình [9,3]. 9
  19. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4. Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain - Kiểu Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo thẳng và định hướng theo chiều sợi, vùng tinh thể xếp xen kẽ với vùng vô định hình. - Kiểu Folding chain: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi, mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa tính chất kết tinh càng cao, vùng vô định hình sẽ dễ bị tác động bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β-glucosid) sẽ làm giảm độ bền nhiệt động của liên kết đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro [2]. 1.3.3.2. Hemicellulose Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 đến 200 đơn phân, hemicellulose chứa cả đường 6 carbon gồm glucose, mannose, galactose và đường 5 gồm xylose, arabinose. Thành phần cơ bản của hemicellulose là β – D xylopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β -(1 4). Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp gồm: - Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -(1 4). - Xylose là thành phần quan trọng nhất. - Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3. 10
  20. Đồ án tốt nghiệp - Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc trisaccharide, sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này. Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định hình và vì thế dễ bị thủy phân [9]. 1.3.3.3. Lignin Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở. Trong tự nhiên lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose, rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn. Lignin được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl(G), chất gốc là rượu trans-coniferyl; syringyl(S), chất gốc là rượu trans-sinapyl; p-hydroxylphenyl(H), chất gốc là rượu trans-p-courmary [10]. Hình 1.5. Cấu trúc của lignin 1.4. Sơ lược về nguồn nguyên liệu rau quả 1.4.1. Tình hình sản xuất rau củ quả tại Việt Nam Trong thời gian qua, diện tích trồng rau quả của Việt Nam phát triển nhanh chóng và ngày càng có tính chuyên canh cao. Tính đến năm 2004, tổng diện tích trồng rau, đậu trên cả nước đạt trên 600 nghìn ha, gấp hơn 3 lần so với năm 1991. Đồng bằng sông Hồng là vùng sản xuất lớn nhất, chiếm khoảng 29% sản lượng rau toàn quốc. Đồng bằng sông Cửu Long là vùng trồng rau lớn thứ hai của cả nước chiếm 23% sản lượng rau của cả nước. Tây Nguyên là vùng sản xuất rau lớn thứ ba cho nhu cầu tiêu thụ thị trường thành phố Hồ Chí Minh và cho xuất khẩu [18]. 11
  21. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.2. Diện tích sản lượng năng suất rau theo vùng 1.4.2. Thành phần rau quả Thành phần hóa học chung của rau quả: Rau quả gồm 2 thành phần chính là chất khô và nước. 1.4.2.1. Chất khô Bao gồm chất khô hòa tan và không hòa tan có trong nguyên liệu. Hàm lượng chất khô là một trong những chỉ tiêu quan trọng nhất của nguyên liệu rau quả. Glucid: Glucid là thành phần chủ yếu trong rau quả chiếm 90% gồm các loại đường, tinh bột, cellulose, hemicellulose và pectin. Đường trong rau quả nhiều nhất là glucose, fructose và saccharose ở trang thái tự do và kết hợp. Các loại đường có độ ngọt khác nhau, thành phần các loại đường trong các loại rau quả không hoàn toàn giống nhau. Đường dễ tan trong nước nhất là đường nóng. Trong môi trường nước, sacharose có thể thủy phân thành hỗn hợp đường glucose và fructose( đường khử). C12H22O11 + H2O = C6H12O6 + C6H12O6 Tinh bột không có vị ngọt không tan trong nước lạnh. Cellulose giúp tăng cường độ chắc cho nguyên liệu. Hemicellulose là polysacharid cao phân tử, cùng với cellulose tao ra màng tế bào của thực vật. Hầu hết không tan trong nước trừ một số pentozan. Pectin: 12
  22. Đồ án tốt nghiệp - Trong quả xanh có nhiều protopectin. - Trong quá trình chín một phần protopectin phân hủy thành pectin hòa tan Bảng 1.3. Hàm lượng hydrocacbon của một số rau quả (theo % chất khô) Bảng 1.4. Thành phần hydrocacbon của một số loại rau 13
  23. Đồ án tốt nghiệp Chất đạm nằm trong rau dưới dạng protid, kèm theo một số aminoacid và amin. Ngoài ra còn có muối nitrat và muối amon. Chất đạm còn có trong thành phần glucose.Protid có trong rau quả không nhiều, thường dưới 1% trừ nhóm đậu và nhóm cải khoảng 3.5- 5.5%. Mặc dù có hàm lượng nhỏ nhưng protid trong rau quả có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình chế biến [18]. 1.4.2.2. Chất béo Rau quả chứa rất ít chất béo 0.1-1%. Trong hạt có nhiều hơn 15-40%. 1.4.2.3. Acid hữu cơ Acid hữu có trong rau quả dưới dạng tự do hay kết hợp. Trong rau quả thường gặp các acid malic (HOOC-CHOH-CH3-CHOH), acid citric(HOOC-CH2-C(OH)COOH-CH2-COOH), acid tactric (HOOC-CH2(OH)-COOH). Các acid oxalic (HOOC-COOH), acid fomic (HCOOH) cũng có nhưng hàm lượng rất thấp [16]. 1.4.2.4. Vitamin Vitamin là yếu tố dinh dưỡng cần thiết cho con người. Phần lớn các vitamin là các chất không bền. Vitamin chia làm 2 nhóm: - Vitamin tan trong chất béo - Vitamin tan trong nước Ngoài ra, trong rau quả còn chứa tinh dầu, các chất màu, tanin [18]. 14
  24. Đồ án tốt nghiệp 1.5. Quy trình sản xuất ethanol từ rau rác thải 1.5.1. Tổng quát Cơ học Tiền xử lý nguyên liệu Hóa học Sinh học Thủy phân nguyên liệu Enzyme thủy phân cellulose Chủng nấm men lên men dịch Lên men dịch đường đường hiệu quả (Sacharomyces cerevisiae) Thu nhận và tinh sạch 1.5.2. Tiền xử lý Để chuyển hóa cacbohydrate (cellulose và hemicellullose) trong lignocellulose thành ethanol, các polymer phải được phân cắt thành những phân tử nhỏ hơn trước khi vi sinh vật hoàn tất quá trình chuyển hóa, nên bước tiền xử lý là bắt buộc để quá trình đường hóa glucose diễn ra tốt. Một số phương pháp tiền xử lý hiện nay: 1.5.2.1. Các phương pháp tiền xử lý cơ học Các phương pháp thuộc nhóm này như: Nghiền nát, xử lý nhiệt. Trong đó phương pháp nghiền nát và sử dụng NaOH được sử dụng trong đề tài nghiên cứu này. Mục đích của quá trình tiền xử lý: - Tăng vùng vô định hình của cellulose. - Tăng kích thước lỗ xốp trong cấu trúc sợi. - Phá vỡ sự bao bọc của lignin và hemicellulose đối với cellulose [1]. 1.5.2.2. Các phương pháp tiền xử lý hóa học Sử dụng tác động của hóa chất trong quá trình tiền xử lý: - Sử dụng acid: Gồm các phương pháp xử lý với acid loãng, bơm hơi nước có acid và nổ hơi có acid. Tuy nhiên, vấn đề gặp phải trong xử lý acid là thiết bị phải chịu 15
  25. Đồ án tốt nghiệp được ăn mòn cao và lượng thạch cao (CaSO4) sinh ra nhiều từ quá trình trung hòa acid với CaOH. - Sử dụng kiềm: Chủ yếu là dùng NaOH, Ca(OH)2 và các hóa chất khác. Trong nghiên cứu này NaOH 2% được sử dụng để tiền xử lý. - Ngoài ra còn có những phương pháp như xử lý với dung môi hữu cơ: dùng dung môi như ethanol, methanol, acetone để hòa tan lignin; xử lý bằng khí SO2, CO2, NH3. Các quy trình này hiện nay chỉ được sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm [1]. 1.5.2.3. Tiền xử lý sinh học Hiệu quả của tiền xử lý được sử dụng 4 loại nấm trắng thối rữa Hanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Ceriporiopsis subvermispora, Pleurotus ostreatus có khả năng thay đổi cấu trúc trong thành phần của cơ chất như sự thủy phân của các enzyme. 1.5.3. Quá trình thủy phân 1.5.3.1. Các nguồn sản xuất enzyme cellulase Người ta thống kê được có hơn 60 loại nấm mốc có khả năng tạo cellulase, gồm có các loại chính là soft-rot, brown-rot và white-rot. Các loại nấm mốc thuộc nhóm white-rot có thể phân hủy cả cellulose và lignin. Nhiều nghiên cứu vẫn đang được tiến hành đối với việc sản xuất cellulase từ vi khuẩn. Gần đây, Coughlan và Ljungdahl trong nghiên cứu của mình [9] đã tìm được 46 loại vi khuẩn có khả năng sản xuất cellulase . Các vi khuẩn này có khả năng phân hủy cellulose cả trong điều kiện hiếu khí và kị khí: Nhóm kị khí điển hình gồm các giống Acetivibrio, Bacteroides, Clostridium, Micromonospora, Ruminococcus Nhóm hiếu khí bao gồm: Acidothermus, Bacillus, Cellulomonas, Pseudomonas 16
  26. Đồ án tốt nghiệp 1.5.3.2. Enzyme cellulase Mặc dù phổ biến nhưng cellulose lại rất bền vững và khó bị phá vỡ vì cellulose có độ kết tinh cao, có khả năng chống lại các quá trình depolymer hóa. Quá trình thủy phân cellulose tạo thành glucose được thực hiện nhờ sự tác dụng đồng thời của ba enzyme khác nhau. Cellulase là enzyme đa cấu tử, gồm ba cấu phần chính: Exocellulase (EC3.2.1.91), endo-1,4–β glucanase( EC 3.2.1.4) và 1,4- β glucosidase( EC 3.2.1.21) có khả năng hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành glucose: - 1,4- β- Dglucan cellobiohydrolase(exocellu lase), enzyme này thủy phân đặc hiệu liên kết β-1,4- glucoside ở đầu không khử của chuỗi cellulose hoặc các cellodextrin để giải phóng cellobiose (cấu trúc gồm 2 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết β- 1,4- glucoside). Enzyme này không có khả năng phân hủy cellulose ở dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất lý hóa, giúp cho enzyme endoglucanase phân giải chúng [2]. - 1,4-β-Dglucan-4- glucanohydrolase (endoglucanase), enzyme này thủy phân liên kết β–1,4– glucoside ở vị trí ngẫu nhiên trong chuỗi cellulose, chuỗi cellodextrin và các dẫn xuất cellulose. Chúng tham gia tác động mạnh đến vùng cellulose vô định hình, tác động yếu đến vùng cellulose kết tinh. - β– glucosidase không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy mà tham gia phân hủy cellobiose, cellodextrin tạo thành glucose. Trong tự nhiên quá trình thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại enzyme cellulase: endoglucanase, exocellulase và β -glucosidase. Ba loại enzyme trên không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng, mỗi một loại enzyme chỉ tham gia thủy phân một phân nào đó trong phân tử cellulose [2]. 1.5.3.3. Cấu trúc của enzyme cellulase Enzyme cellulase gồm: - Trung tâm xúc tác (CD: catalytic domain) với kích thước lớn. 17
  27. Đồ án tốt nghiệp - Trung tâm tạo liên kết với cellulose (CBD) có kích thước nhỏ hơn gồm có 36 amino acid và có một mặt thể hiện tính chất kị nước mạnh. Về mặt lý thuyết, có thể kết luận rằng CBD có vai trò quan trọng trong việc ổn định sự liên kết tạm thời giữa cellulase và bề mặt cellulose. Trên bề mặt cellulose có vùng kỵ nước là do sự sắp xếp chặt chẽ và do liên kết hydrogen mạnh giữa các mạch cellulose, góp phần ngăn cản, không cho các phân tử lớn như nước xâm nhập vào cấu trúc này. Chính tương tác giữa hai vùng có tính chất kị nước của cellulose và CBD mà enzyme liên kết với cellulose. - Cầu nối peptide: Có tác dụng liên kết hai trung tâm này lại với nhau. Đối với enzyme cellulase, cầu nối peptide là một vùng ái đường, được cấu tạo bởi các amino acid serine, threonin và proline [5]. Serine Threonine Proline Hình 1.6. Cầu nối peptide 1.5.3.4. Cơ chế thủy phân cellulose của enzyme cellulase Quá trình thủy phân có thể được tóm tắt như sau: - Enzyme endo-cellulase tác động ngẫu nhiên vào mạch cellulose nhờ tạo liên kết bằng tương tác giữa CBD với cellulose, tạo thành các oligosaccharide. - Enzyme exo – cellulase tác động vào cellulose, oligomer từ đầu đường khử và không khử thông qua tường tác của CBD với cellulose tạo thành cellobiose và glucose. - β-glucosidase tác động cellobiose và oligosaccharide tạo glucose [2]. 18
  28. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7. Cơ chế quá trình thủy phân 1.5.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến qúa trình thủy phân a. Ảnh hưởng của cấu trúc nguyên liệu Cấu trúc tự nhiên của lignocellulose tạo ra nhiều cản trở đến quá trình thủy phân của các tác nhân thủy phân. Ngay cả quá trình thủy phân cellulose tinh khiết, tốc độ thủy phân cũng giảm theo thời gian. Hiệu suất quá trình thủy phân bị ảnh hưởng mạnh bởi tính chất của nguồn nguyên liệu. Cấu trúc của nguyên liệu và cơ chế tác động của enzyme và cơ chất là hai yếu tố chính làm hạn chế hiệu suất quá trình thủy phân. Cellulose có bề mặt trong và ngoài, bề mặt ngoài bao gồm bề mặt bao quanh các xơ sợi, bề mặt trong là bề mặt do các mao quản bên trong xơ sợi tạo thành. Nếu cellulose không được tiền xử lý hiệu quả thủy phân thấp, quá trình xử lý loại bỏ hemicelluse sẽ làm tăng khả năng thủy phân cellulose [8]. 19
  29. Đồ án tốt nghiệp b. Ảnh hưởng của nhiệt độ Giống như nhiều phản ứng enzyme khác, phản ứng thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase chịu ảnh hưởng lớn của nhiệt độ. Tốc độ phản ứng thủy phân tăng theo nhiệt độ tuy nhiên đến một nhiệt độ nhất định tốc độ phản ứng sẽ giảm dần và triệt tiêu. Nếu đưa nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu hoạt tính enzyme sẽ bị giảm khi đó enzyme không có khả năng phục hồi hoạt tính. Ngược lại khi ở nhiệt độ 00C enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính của enzyme tăng dần đều đến mức tối ưu. Khi nhiệt độ cao thường gây cho enzyme mất hoạt tính [8]. c. Ảnh hưởng của pH pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme. Đối với enzyme cellulase khoảng pH thích hợp là 4-5 trong đó tốt nhất là 4.8. d. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Khi nồng độ cơ chất tăng tốc độ phản ứng enzyme tăng vì sẽ có nhiều cơ chất tiếp xúc với enzyme, khi nồng độ cơ chất đủ lớn các enzyme bị bão hòa vì vậy tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng sẽ không thay đổi đáng kể [8]. e. Ảnh hưởng của các chất kìm hãm Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng. Các chất gây kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm các ion, các phần tử vô cơ, các chất hữu cơ và cả protein. Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào sinh vật. Tùy thuộc vào bản chất phức EI bản chất kìm hãm người ta chia ra những chất kìm hãm: Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch. 20
  30. Đồ án tốt nghiệp Chất kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt động của enzyme mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme. Các chất kìm hãm không cạnh tranh thường gồm 2 loại: kìm hãm do sản phẩm phản ứng và kìm hãm do thừa cơ chất [8]. f. Nồng độ enzyme Khi nồng độ enzyme tăng tốc độ phản ứng tăng tăng. Tuy nhiên khi nồng độ enzyme đạt đến một ngưỡng nào đó nồng độ cơ chế sẽ trở thành yếu tố hạn chế tốc độ phản ứng. 1.5.4. Quá trình lên men 1.5.4.1. Nấm men Sacharomyces cerevisiae Trong môi trường giàu chất dinh dưỡng nấm men có hình dạng bầu dục, trong điều kiện yếm khí tế bào có hình tròn ngược lại trong điều kiện hiếu khí tế bào kéo dài hơn. Sinh sản theo kiểu nảy chồi và có khả năng sinh bào tử, sống kị khí không bắt buộc. Có khả năng lên men ở nhiệt độ cao (36 đến 400C), chịu được độ acid. S. cerevisiae thuộc loại lên men nổi, trong quá trình lên men tế bào của chúng lơ lửng trong dung dịch lên men và tập trung trên bề mặt. S. cerevisiae lên men được nhiều loại đường( glucose, fructose, sacharose, maltose ) và nhiều loại nguyên liệu khác nhau như ngô, gạo, khoai, sắn có hàm lượng đường trong dung dịch là 12% đến 14% có khi là 16% đến 18%. 1.5.4.2. Cơ chế hóa sinh học của quá trình lên men Lên men rượu là một quá trình sinh học phức tạp, xảy ra dưới tác dụng của nhiều enzyme. Sự tạo thành rượu từ glucoza được trải qua các giai đoạn sau đây: Đầu tiên do xúa tác của glucokinase, glucoza kết hợp với gốc photphat của phân tử ATP trong tế bào men để tạo thành gluco- 6 photphat và ADP: C6H12O6 + ATP CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO + ADP Tiếp đó glucose- 6 photphat do tác dụng của enzym đồng phân gluco photphat- izomeraza sẽ biến thành fructophotphat: CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OH 21
  31. Đồ án tốt nghiệp Giai đoạn ba dưới tác dụng của enzyme photphofructokinaza, phân tử ATP thứ hai sẽ dính thêm một gốc photphat nữa vào fructo-6 photphat để tạo thành fructo1-6 diphotphat và phân tử ADP thứ hai. CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OH + ATP CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OCH2O(H2PO3) + ADP Sự tạo thành fructo-1,6- photphat đánh dấu kết thúc giai đoạn chuẩn bị của lên men rượu. Giai đoạn thực hiện chuyển hóa các mối liên kết cao năng thành dạng dễ biến đổi dưới tác dụng của các enzyme [4]. Giai đoạn tiếp theo là phân cắt mạch cacbon của frutodiphotphat thành 2 phân tử trioza: gồm aldehyt photphoglyceric và photphodioxyaceton. Phản ứng này được xúc tác bởi aldolaza: CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OCH2O(H2PO3) CH2O(H2PO3)COCH2OH + CH2O(H2PO3)CHOHCHO photphodioxyaceton aldehyt- photphoglyceric Vai tò chủ yếu của các biến đổi tiếp theo của quá trình lên men rượu là andehyt, photpho-glyceric, nhưng trong dịch đang lên men chúng chứa rất ít. Điều này được giải thích bằng hiện tượng đồng phân dưới tác dụng của enzyme triphotphat-izomeraza: CH2O(H2PO3)COCH2OH CH2O(H2PO3)CHOHCHO Giai đoạn tiếp theo là hai phân tử aldehyt photphoglyceric bị oxi hóa. Phản ứng này có sự tham gia của acid photphoric trong canh trường nhờ xúc tác của enzyme triphotphatdehytdronaza- coenzyme của nó là NAD( nicotinamit- adenin- dinucleotit). 2CH2O(H2PO3)CHOHCHO + 2H3PO4 + 2NAD 2CH2O(H2PO3)CHOHCOO ~ H2PO3 + 2 NAD.H2 1-3 diphotphoglyceric acid Phân tử 3- photphoglycero aldehyt kết hợp với photphat, còn hydro chuyển sang coenzyme NAD. Năng lượng được giải phóng do oxy hóa 3- photphoglycero aldehyt sẽ tích tụ trong liên kết cao năng của acid 1,3 diphotphoglyceric mới tạo thành [4]. Tiếp theo với sự tham gia của photphoglyceratkinaza, gốc photphat chứa cao năng của acid 22
  32. Đồ án tốt nghiệp 1,3 diphotphoglyceric sẽ chuyển vào phân tử ADP. Kết quả 3- photphoglyceric được tạo thành, còn ADP nhân thêm năng lượng và biếng thành ATP: 2CH2O(H2PO3)CHOHCOO ~ H2PO3 + 2 NAD 2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH + 2ATP Dưới tác dụng của enzyme photphoglyxeromutaza, gốc acid photphoric sẽ chuyển từ vị trí cacbon thứ 3 sang cacbon thứ 2. Kết quả là 3- photphoglyceric biến thành 2- photphoglyceric theo phản ứng: 2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH 2CH2OHCHO(H2PO3)COOH Dưới tác dụng của enolaza, acid 2- phoyphoglyceric sẽ mất nước và biến thành acid photphopyrovic: 2CH2OHCHO(H2PO3)COOH 2CH3CO(H2PO3)COOH + 2H2O Acid photphopyrovic rất không bền nên dễ bị mất gốc acid photphoric do enzyme pyrovatkinaza và do đó acid pyruvic được tạo thành: 2CH = CO ~ (H2PO3)COOH + 2ADP 2CH3CO – COOH + 2ATP Tới đây acid pyrovic bị decacboxyl để tạo thành aldehyt acetic: 2CH3CHO – COOH 2CO2 + 2CH3CHO Giai đoạn cuối cùng là lên men rượu là aldehyt acetic bị khử bởi NAD.H2: 2CH3CHO + 2NAD.H2 2CH3CH2OH + 2NAD Phương trình tổng quát của quá trình lên men rượu như sau: zymaza C6H12O6 2CO2 + 2CH3CH2OH Trong quá trình lên men rượu, mỗi phân tử gam glucoza sẽ giải phóng ra khoảng 50 kcal. Năng lượng này được nấm men sử dụng chừng 20 kcal. Số còn lại sẽ thải ra canh trường do đó làm tăng nhiệt độ dịch lên men [1]. 1.5.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men a. Ảnh hưởng của nhiệt độ Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho phát triển của chúng đối với nấm men S. cerevisiae nhiệt độ tối ưu nằm trong giới hạn 28-320C b. Ảnh hưởng của Oxi 23
  33. Đồ án tốt nghiệp S.cerevisiae sống kị khí không bắt buộc, khi trong môi trường đủ lượng oxy nấm men phân hủy đường dùng làm nguồn năng lượng để tăng sinh khối. Trường hợp thiếu oxy (kị khí) nấm men sử dụng phần oxy hòa tan trong môi trường để sinh trưởng và lên men. c. Ảnh hưởng của pH pH của dịch đường ảnh hưởng khá lớn đến đời sống của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi chủng vi sinh vật có khoảng pH thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển khác nhau. Đối với nấm men S. Cerevisiae pH tối ưu nằm trong giới hạn 4.5-5. d. Nồng độ dịch lên men Nồng độ đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Nếu dịch lên men có nồng độ ethanol cao sẽ dẫn đến sự ức chế tạp khuẩn và cả nấm men. Nếu nồng độ đường lên men thấp sẽ giảm năng suất thiết bị lên men [1]. 24
  34. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và hóa chất. 2.1.1. Rau rác thải Đối tượng nghiên cứu: rau quả hư lấy tại chợ Nông Sản Thực Phẩm Thủ Đức. a b c Hình 2.1( a,b,c). Rau rác thải tại chợ Nông Sản Thực Phẩm Thủ Đức Hình 2.2. Vị trí chợ Nông Sản Thực Phẩm Thủ Đức TP.HCM 2.1.2. Enzyme cellulase 25
  35. Đồ án tốt nghiệp Enzyme được sử dụng trong nghiên cứu này là enzyme Novoprime B959 được mua ở công ty TNHH Nam Giang, 133/11 Hồ Văn Huê, quận Phú Nhuận, với bản chất là cellulase. Các thông số về hoạt tính được xác định như sau: - Nhiệt độ tối ưu để hoạt động : 500C - pH hoạt động tối ưu 5.0 2.1.3. Nấm men Giống nấm men được sử dụng là Saccharomyces cerevisiae, được được lấy từ giống sau khi phân lập được bảo quản tại phòng Vi sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới. Sau đó đem tăng sinh trong môi trường YPD để sử dụng lên men. Hình 2.3 Saccharomyces cerevisiae nhìn dưới kính hiển vi điện tử 40X 2.1.4. Các hóa chất sử dụng Trong quá trình tiền xử lý sử dụng những hóa chất sau: NaOH 2%, Na2CO3 2%, Ca(OH)2 2%. Trong thí nghiệm xác định lượng đường ta sử dung các hóa chất để pha thuốc thử DNS(3,5-dinitroxalisylic). Các hóa chất nitrocromic, KI 10%, Na2S2O3 0,1N để xác định hàm lượng cồn trong dịch sau lên men. 2.2. Các thiết bị sử dụng - Tủ lắc có điều nhiệt. 26
  36. Đồ án tốt nghiệp - Máy khuấy từ. - Bể ổn nhiệt. - Tủ sấy Prolabo. - Máy ly tâm loại lớn và loại nhỏ. - Tủ lạnh, tủ đông -200C. - Các buồng cấy vi sinh. - Máy đo quang phổ. - Bếp điện. - Hệ thống kjeldahl. - Buồng đếm hồng cầu - Bình hút ẩm. - Kính hiển vi điện tử. - Một số thiết bị khác của phòng thí nghiệm. a b c Hình 2.4(a, b, c). Hệ thống Kjendahl 27
  37. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.5. Máy lắc Hình 2.6. Máy đo quang phổ Hình 2.7. Tủ hấp Hình 2.8. Tủ sấy Hình 2.9. Bể ổn nghiệt Hình 2.10. Cân 2.3. Các phương pháp sử dụng 2.3.1. Phương pháp xác định hàm lượng cellulose 2.3.1.1. Nguyên tắc Phương pháp xác định hàm lượng cellulose dựa vào tính chất bền đối với tác dụng của acid mạnh và bazo mạnh không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu và bazo yếu còn các chất khác đi kèm với cellulose như hemicellulose, ligin ít bị tác dụng của acid và bazơ nên bị oxy hóa tan vào dịch xử lý. 2.3.1.2. Hóa chất - Dung dịch acid nitric (HNO3) đặc. - Dung dịch acid acetic (CH3COOH) đặc. - Rượu etylic 96%. - Ete etylic 28
  38. Đồ án tốt nghiệp 2.3.1.3. Tiến hành Cân 1 gam cellulose đã nghiền nhỏ (sấy đến trọng lượng không đổi ở 100- 1050C) cho vào bình nón dung tích 250ml. Thêm vào mỗi bình 16,5ml hỗn hợp gồm 30ml acid nitric đặc và 30ml acid acetic. Lắp ống làm lạnh hồi lưu và đun sôi hỗn hợp 30 phút. Sau đó để nguội pha loãng bằng nước nóng và lọc qua giấy lọc đã biết trọng lượng phân tử. Rửa kết tủa cellulose nhiều lần bẳng nước cất nóng (mỗi lần 10ml). Rửa bằng rượu etylic 96% 1 đến 2 lần. Sấy giấy lọc có chứa cellulose ở nhiệt độ 100 đến 1050C đến trọng lượng không đổi. Công thức tính hàm lượng cellulose: Trong đó: - X : hàm lượng cellulose tính bằng % - a : trong lượng cellulose sau khi sấy (g) - W : trọng lượng mẫu thí nghiệm (g) - 100 : hệ số chuyển đổi thành 100% 2.3.2. Phương pháp định tính ethanol 2.3.2.1. Nguyên tắc Trong môi trường acid mạnh ethanol bị K2Cr2O7 oxy hóa thành acid acetic. Nếu vừa đử hoặc thiếu dicromat dung dịch có màu xanh của Cr3+. Nếu thừa dicrimat dung dịch có màu xanh lơ. 2.3.2.2. Hóa chất Dung dịch nitrocromic 2.3.2.3. Tiến hành Hút 10 ml ở mỗi mẫu cho vào ống ly tâm, ly tâm 6000 vòng/10 phút. 29
  39. Đồ án tốt nghiệp Cho vào ống nghiệm có nắp: - 2ml dung dịch mẫu vừa ly tâm - 2ml dung dịch nitrocromic Dùng giấy bạc bịt kín, để yên trong 30 phút. Làm mẫu trắng tương tự như trên nhưng thay vì dùng mẫu ta hút 2ml nước cất. 2.3.3. Phương pháp đo nồng độ đường khử 2.3.3.1. Nguyên tắc Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid đinitrosalicycid. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucoza tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalicycid sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. 2.3.3.2. Dụng cụ - Máy đo quang phổ. - Cuvette d= 1cm, V= 4ml. - Bếp điện và các dụng cụ thủy tinh khác. 2.3.3.3. Hóa chất Thuốc thử acid dinitrosalicylic: - Nước cất: 1416ml - 3,5 acid đinitrosalicylic (C7H4N2O7): 10,6g - NaOH 19,8 g Sau khi hòa tan cho thêm vào dung dịch: - Muối Seignette (KNaC4H4O6.4H2O) 306g - Phelnol nóng chảy ở 500C 7,6ml - Natri metarbisulfit (Na2S2O5) 8,3g Chuẩn 3ml thuốc thử acid dinitrosalicylic bằng HCl 0,1N với 5-6ml chỉ thị phenoltalein, nếu cần thêm NaOH. 30
  40. Đồ án tốt nghiệp Dung dịch glucose chuẩn 0,5mg/ml. 2.3.3.4. Xử lý mẫu Mẫu sau khi thủy phân bằng enzyme, được đun sôi 15 phút để kết tủa protein. Sau đó tiến hành ly tâm 60.000 vòng trong 15 phút thu lấy dịch nổi. 2.3.3.5. Tiến hành Cho vào 6 ống nghiệm sạch với các thể tích như sau: Bảng 1.5. Dựng đường chuẩn glucose 0,5mg/ml Từ các ống nghiệm trên lấy 1 ml ở mỗi ống cho vào 6 ống nghiệm khác và thêm vào mỗi ống 3 ml thuốc thử DNS. Đun sôi đúng 5 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm với đối chứng là nước. Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang trục hoành là nồng độ glucose. - Vẽ đồ thị đường chuẩn. - Tương tự hút 1ml dịch đường pha loãng 100 lần cho vào ống nghiệm và cho 3 ml DNS, đun sôi 5 phút, để nguội đo mật độ quang [7]. 2.3.3.6. Tính kết quả - Từ phương trình đường chuẩn glucose tính được x (mg/ml) đường khử trong dịch thủy phân. - Nhân với hệ số pha loãng n để được lượng đường trong 1ml dung dịch gốc. Chọn hệ số pha loãng n sao cho OD nằm trong giới hạn đường chuẩn. 31
  41. Đồ án tốt nghiệp 2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 2.3.4.1. Hóa chất - DNS - Giấy lọc Whatman No.1 - Glucose 2.3.4.2. Dụng cụ - Chai lọ đựng hóa chất - Ống nghiệm có nắp - Nắp cao su - Ống tiêm chích - Ống nghiệm - Eppendort - Đầu tuýp - Pipet thủy tinh - Pipetman 2.3.4.3. Thiết bị - Bể ủ nhiệt - Máy vortex - Máy ly tâm - Máy đo quang phổ 2.3.4.4. Tiến hành Dựng đường chuẩn glucose (10mg/ml): Chuẩn bị 12 ống nghiệm như bảng 1.6: 32
  42. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.6. Dựng đường chuẩn glucose 10mg/ml - Đặt mảnh giấy lọc được cuộn tròn vào ống nghiệm - Chuẩn bị dãy enzyme pha loãng - Chuẩn bị blank và controls + Reagent blank (RB): 1,5 ml đệm acetate + Test(E): 1ml đệm acetate + 0,5 ml enzyme + mảnh giấy lọc + Enzyme control (EC1-5): 1,0 ml đệm acetate + 0,5 ml enzyme pha loãng. + Subtrate control (SC): 1,5 ml đệm acetate + mảnh giấy lọc. - Ủ ấm trước ở 500C những dung dịch enzyme (được pha loãng), blank và controls đến khi trạng thái cân bằng (nghĩa là nhiệt độ dung dịch bằng nhiệt độ bể ủ, khoảng 10 phút).Thêm 0,5 ml dung dịch enzyme pha loãng vào ống nghiệm có cơ chất giấy lọc (E1-E5), thêm 0,5 ml enzyme pha loãng vào ống nghiệm không có 33
  43. Đồ án tốt nghiệp giấy lọc (EC1-EC5).Ủ những ống nghiệm E1-5, GSs, RB, EC1-5 và SC ở 50 0C trong bể ủ nhiệt khoảng 60 phút. - Thêm 3 ml DNS để dừng phản ứng và trộn đều. - Đun cách thủy các ống nghiệm trong 5 phút. - Chuyển các ống nghiệm đến một bể nước lạnh để làm nguội. - Hút 0,5 ml dung dịch thí nghiệm vào eppendort 1,5 ml và ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/ phút trong 1 phút. - Sau khi ly tâm hút 0,2 ml dịch nổi phía trên vào trong một ống nghiệm khác và thêm 2,5 ml nước cất, trộn đều. - Đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 540nm và RB được sử dụng làm ống blank. 2.3.4.5. Tính kết quả - Vẽ đường chuẩn glucose (hàm lượng glucose nằm trên trục x, độ hấp thụ ở 540nm nằm trên trục y). - ∆E1 – 5 = E1 – 5 – [(EC1 – 5) + (SC1 – 5)] - Tính nồng độ glucose thực được giải phóng bởi dãy enzyme pha loãng E1-5 dựa theo đường chuẩn glucose. - Vẽ mối quan hệ giữa những nồng độ glucose thực và dãy nồng độ enzyme pha loãng - Hoạt tính của enzyme được xác định FPU = mg glucose giải phóng x 0.185 Trong công thức này: 1mg glucose = 1 mg glucose = 1 mg/(0,18 mg/μmol) x 0,5 ml x 60 min = 0,185 UI/ml 2.3.5. Phương pháp nuôi cấy và đếm nấm men 2.3.5.1. Hóa chất và thiết bị - Môi trường YPD (yeast) Thành phần môi trường: 34
  44. Đồ án tốt nghiệp + Peptone 20 g + D-glucose 20 g + Yeast extract 10 g + Nước c 1000 ml - Tủ UV, que cấy tròn - Máy lắc - Erlen 250ml+nước cất vô trùng - Micropipet + đầu tuyp xanh - Đèn cồn. 2.3.5.2. Phương pháp nhân giống Giống nấm men trước khi đưa vào lên men cần được nhân giống nhằm tăng sinh khối, tăng hoạt lực giống. Ở quy mô phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành nhân giống như sau: Sau khi nấm men đã phát triển trên môi trường thạch nghiêng, chúng tôi cấy vào erlen chứa 150ml dịch môi trường YPD đã được hấp tiệt trùng, tiếp đó nuôi ở nhiệt độ thường (28-300C) trong 24 giờ trên máy lắc. 2.3.5.3. Phương pháp đếm nấm men Để đánh giá chất lượng canh trường nấm men, cần đếm số tế bào trong 1ml. Chúng tôi đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu. a. Tiến hành - Đặt lá kính lên khu vực buồng đếm. - Lắc đều dịch tế bào nấm men và dùng pipet để lấy một giọt cho vào khe ở mép buồng đếm, tránh tạo bọt khí. Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn. - Đặt buồng đếm vào bàn kính hiển vi và để yên vài phút. - Chỉnh kính hiển vi với vật kính x40, tìm mạng ô đếm ở khu vực buồng đếm. Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lớn (4 x 4 = 16 ô nhỏ). 35
  45. Đồ án tốt nghiệp - Đếm số tế bào trong 5 ô vuông lớn đại diện cho 25 ô vuông lớn trong ô trung tâm. b. Cách tính Số lượng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu được tính bằng công thức: N = [(a/b) x 400/0,1] x 103 x 10n Trong đó: N: Số lượng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu a: Số tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ) b: Số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn 400: Tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm 0,1: Thể tích dịch tế bào chứa trong ô trung tâm 103: Số chuyển mm3 thành ml 10n: Độ pha loãng mẫu 2.3.6. Phương pháp Cordebard 2.3.6.1. Nguyên tắc Trong môi trường acid mạnh ethanol bị K2Cr2O7 oxy hóa thành acid acetic. Nếu vừa đử hoặc thiếu dicromat dung dịch có màu xanh của Cr3+. Nếu thừa dicromat dung dịch có màu xanh lơ. Trong môi trường acid, với lượng thừa KI và lượng dung dịch K2Cr2O7 chuẩn xác định: K2Cr2O7 + 6KI + 14HNO3 2 Cr(NO3)3 + 3I2 + 8KNO3 + 7 H2O Lượng I2 tạo thành được chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3 Na2S2O3 + I2 2NaI + Na2S4O6 2.3.6.2. Hóa chất - Nitrocromic: Cân 16,8295g K2Cr2O7 cho vào bình định mức 250 ml, thêm HNO3 đậm đặc lắc đều, bảo quản tối. - KI 10%: Cân 100g KI tinh thể cho vào bình định mức 1000ml, thêm nước cất lắc đều bảo quản tối. 36
  46. Đồ án tốt nghiệp - Na2S2O3 0.1N: Cân 7,9g Na2S2O3 (12,4g Na2S2O3. 5H2O) cho vào bình định mức 1000ml, lắc đều. 2.3.6.3. Tiến hành - Lấy 1ml dịch cho vào bình nón có nút mài 250ml, thêm 1ml nước cất và 2ml dung dịch nitrocromic. - Đậy kín bình bằng giấy bạc để yên trong 30 phút. - Thêm 2ml dung dịch KI và 20ml nước cất, lắc đều. - Sau 2 phút dùng Na2S2O3 chuẩn độ lượng I2 giải phóng ra. - Chuẩn độ đến khi dung dịch chuyển sang vàng nhạt thì thêm 2ml dung dịch hồ tinh bột 1% để chuyển sang màu xanh đậm. - Tiếp tục chuẩn độ cho đến khi dung dịch trong bình chuyển sang màu xanh lục. - Ghi nhận thể tích Na2S2O3 đã dùng. - Tiến hành song song với mẫu trắng 2ml nước cất. Hình 2.11. Dung dịch chuyển sang màu vàng khi chuẩn chuẩn độ bằng Na2S2O3 Hình 2.12. Dung dịch chuyển sang màu xanh đậm khi cho hồ tinh bột 37
  47. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.13. Dung dịch chuyển sang màu xanh lơ khi tiếp tục chuẩn độ bằng Na2S2O3 2.3.6.4. Kết quả Hàm lượng rượu: A= ( N - n) x 1.15 Trong đó: A: Hàm lượng rượu (g/l) N: Số ml Na2S2O3 dùng chuẩn mẫu trắng n: Số ml Na2S2O3 dùng chuẩn mẫu thực 38
  48. Đồ án tốt nghiệp 2.4. Trình tự nghiên cứu 2.4.1. Quy trình công nghệ Rau rác thải Xay Tỷ lệ nước: rau 1:1 Lọc Bã Thu dịch Dung dịch Erlen Lên men NaOH 2% ủ Ly tâm Xử lý vi sóng Chưng cất Dung dịch Trung hòa HCl2% ethanol Saccharomyces Enzyme cellulase Thủy phân cerevisiae Dịch thủy phân Lọc, ly tâm 39
  49. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Thuyết minh quy trình 2.4.2.1. Giai đoạn tiền xử lý a. Mục đích Cấu trúc tự nhiên của lignocellulose cản trở đến quá trình thủy phân của các tác nhân thủy phân. Cellulose có bề mặt trong và ngoài, bề mặt ngoài bao gồm bề mặt bao quanh các xơ sợi bề mặt trong là bề mặt do các mao quản bên trong xơ sợi tạo thành. Nếu cellulose không được tiền xử lý hiệu quả thủy phân thấp. Xử lý loại bỏ lignin và hemicelluse để phá vỡ cấu trúc bền vững của cellulose làm tăng cấu trúc xốp tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme tiếp xúc trực tiếp với cơ chất. Vì vậy quá trình thủy phân enzyme sẽ diễn ra tốt hơn. b. Trình tự tiến hành Rau rác thải đem đi xay và lấy bã đi sấy ở 1050C. Sau khi thu được bã khô ta tiến hành xử lý trong các dung môi khác nhau, bã được ngâm lần lượt trong các dung dịch: NaOH, Na2CO3, Ca(OH)2, nồng độ 2% trong những khoảng thời gian khác nhau và lượng dung môi sử dụng khác nhau. Sau đó tiến hành xử lý trong lò vi sóng 10 phút. Khảo sát sự thay đổi khối lượng của bã sau khi xử lý. Hình 2.14. Bã rau trước tiền xử lý bằng NaOH 40
  50. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.15. Bã rau sau tiền xử lý bằng NaOH  Thí nghiệm 1: Khảo sát quá trình xử lý của NaOH, Na2CO3, Ca(OH)2 lên bã rau Cân lần lượt 3 mẫu bã đã sấy ở 1050C, mỗi mẫu có khối lượng 1g, cho vào các erlen đựng dung dịch NaOH, Na2CO3, Ca(OH)2, nồng độ 2% theo tỷ lệ bã/dung môi là 1:20. Ngâm 20 phút sau đó tiến hành xử lý các mẫu trên trong lò vi sóng với thời gian 10 phút. Sau đó lọc rửa sạch bã và sấy khô ở 1050C. Chỉ tiêu theo dõi: Sự thay đổi khối lượng của bã sau khi tiền xử lý, lựa chọn dung môi xử lý tối ưu.  Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian xử lý nguyên liệu Sau khi chọn được dung môi xử lý tối ưu ở thí nghiệm 1, ta tiến hành khảo sát thời gian xử lý như sau: lấy 3 mẫu, mỗi mẫu có khối lương 1g. Cho vào các erlen có chứa dung môi đã chọn (từ thí nghiệm 1) theo tỷ bã rắn/dung môi là 1:20. Ngâm trong các khoảng thời gian khác nhau: 20 phút, 1 giờ, 24 giờ. Sau khi ngâm xong tiến hành xử lý trong lò vi sóng 10 phút rồi rửa sạch thu bã rắn và sấy khô ở 1050C. Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự thay đổi khối lượng bã rắn sau khi xử lý ở các khoảng thời gian khác nhau, lựa chọn thời gian xử lý tối ưu. 2.4.2.2. Giai đoạn thủy phân bằng enzyme cellulase a. Mục đích Nhằm chuyển hóa cơ chất cellulose thành sản phẩm cuối cùng là đường glucose. b. Tiến hành 41
  51. Đồ án tốt nghiệp Mẫu sau giai đoạn tiền xử lý ở các điều kiện tối ưu được sử dụng để phản ứng enzyme. Giai đoạn này chúng tôi tập trung vào khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố gồm: lượng enzyme/bã rắn (khô), nhiệt độ, pH, thời gian, là các yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất quá trình thủy phân.  Thí nghiệm 3: Khảo sát nhiệt độ tối ưu phản ứng enzyme cellulase với cơ chất Giống như nhiều phản ứng enzyme khác, phản ứng thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase chịu ảnh hưởng lớn của nhiệt độ. Tốc độ phản ứng thủy phân tăng theo nhiệt độ, tuy nhiên đến một nhiệt độ nhất định tốc độ phản ứng sẽ giảm dần và triệt tiêu. Nếu đưa nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu hoạt tính enzyme sẽ bị giảm khi đó enzyme không có khả năng phục hồi hoạt tính. Ngược lại khi ở nhiệt độ 00C enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính của enzyme tăng dần đều đến mức tối ưu. Khi nhiệt độ cao thường gây cho enzyme mất hoạt tính. Tiến hành: Cân 7 mẫu, mỗi mẫu có khối lượng 1g. Lần lượt cho vào các erlen chứa 50ml dung dịch đệm có pH5, sau đó cho phản ứng với 1ml enzyme ở các nhiệt độ 0 0 0 0 0 0 0 khác nhau: 40 C,42 C,44 C,46 C,48 C, 50 C, 60 C. Các phản ứng được thực hiện trong bể ổn nhiệt với thời gian 24 giờ. Yếu tố được cố định: Phần trăm enzyme/ bã sử dụng, hàm lượng cơ chất, pH dung dịch. Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự thay đổi lượng đường trong các khoảng nhiệt độ khác nhau. Xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu.  Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian phản ứng tối ưu giữa enzyme với cơ chất Thời gian phản ứng cũng rất quan trọng nó ảnh hưởng lớn lượng đường thu được sau phản ứng. Quá trình thủy phân bằng enzyme sẽ diễn ra khi enzyme bắt đầu tiếp xúc với cơ chất nhưng để phản ứng diễn ra hoàn toàn ta cần một khoảng thời gian nhất định. Vì vậy khảo sát thời gian thủy phân để từ đó thu được lượng đường tối đa. Tiến hành: Cân 9 mẫu, mỗi mẫu có khối lượng 1g, lần lượt cho vào các erlen chứa 50ml dung dịch đệm có pH5 sau đó cho phản ứng với 1ml enzyme ở các thời gian 42
  52. Đồ án tốt nghiệp khác nhau 0h, 12h, 14h, 16h, 18h, 20h, 22h, 24h, 36h. Các phản ứng được thực hiện trong bể ổn nhiệt ở 500C. Yếu tố được cố định: Phần trăm enzyme/bã sử dụng, hàm lượng cơ chất, pH dung dịch. Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự thay đổi lượng đường trong các khoảng thời gian khác nhau. Xác định thời gian phản ứng tối ưu.  Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân của enzyme pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme. Tiến hành: Pha dãy đệm có pH lần lượt là : 4.0; 4.2; 4.4; 4.6, 4.8; 5.0; 6.0. Cân 7 mẫu, mỗi mẫu có khối lượng 1 g, lần lượt cho vào các erlen chứa các dung dịch đệm đã chuẩn bị. Cho phản ứng với 1ml enzyme, phản ứng được tiến hành trong bể ổn nhiệt ở 500C và thời gian 24 giờ. Yếu tố cố định: Hàm lượng cơ chất, nhiệt độ, phần trăm enzyme/bã, thời gian phản ứng. Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự thay đổi lượng đường trong dung dịch qua các giá trị pH khác nhau. Xác định pH tối ưu cho quá trình thủy phân.  Thí nghiệm 6: Khảo sát lượng enzyme sử dụng tối ưu cho quá trình thủy phân Khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng enzyme tăng, vì sẽ có nhiều cơ chất va chạm với enzyme tiến hành phản ứng. Khi nồng độ cơ chất đủ lớn các enzyme bị bão hòa cơ chất vì vậy tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng sẽ không thay đổi đáng kể. Vì vậy ta cần thực hiện thí nghiệm để lựa chọn phần trăm enzyme/bã rắn thích hợp nhất cho quá trình thủy phân. Tiến hành: Cân 5 mẫu, mỗi mẫu có khối lượng 1 g lần lượt cho vào các erlen chứa các dung dịch pH4.8. Cho phản ứng với lượng enzyme lần lượt là 0,25ml(3,264 43
  53. Đồ án tốt nghiệp UI/ml);0,5ml(6,529UI/ml);0,75ml(9,793UI/ml);1ml(13,059UI/ml);1,5ml(19,588UI/ml) Phản ứng được tiến hành trong bể ổn nhiệt ở 500C và thời gian 24 giờ. Yếu tố cố định: Hàm lượng cơ chất, thời gian phản ứng, pH dung dịch, nhiệt độ. Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự thay đổi lượng đường sau phản ứng với các lượng enzyme sử dụng khác nhau. Xác định lượng enzyme/bã sử dụng tối ưu. 2.4.2.3. Giai đoạn lên men bằng nấm men Sacharomyces cerevisiae  Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men ethanol sử dụng giống nấm men S.cerevisiae Mục đích: Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến quá trình lên men, ảnh hưởng đến hoạt động trao đổi chất của nấm men S.cerevisiae vì hoạt lực của phức hệ enzyme trong nấm men phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ của quá trình lên men. Tiến hành: Chuẩn bị 4 bình lên men, mỗi bình chứa 100ml dịch đường đã thủy phân bằng enzyme cellulase (tỷ lệ enzyme 5%, bã rắn 5%). Hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút để tiêu diệt các vi sinh vật gây hại. Các thí nghiệm được tiến hành ở các điều kiện lên men dịch thủy phân bằng nấm men S. cerevisiae được nuôi cấy trong môi trường YBD với tỷ lệ 10% với thời gian lên men 24 giờ và ủ ở các nhiệt độ 200C, 250C, 300C,350C. Yếu tố cố định: Thời gian, pH, hàm lượng đường. Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi lượng ethanol sinh ra sau quá trình lên men khi thay đổi nhiệt độ lên men, lượng ethanol được định lượng bằng phương pháp Cordbard.  Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng pH của dịch đường lên quá trình lên men ethanol sử dụng giống nấm men S.cerevisiae Mục đích: pH của môi trường ảnh hưởng khá lớn đến đời sống của vi sinh vật. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi chủng vi sinh vật có khoảng pH thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển khác nhau. 44
  54. Đồ án tốt nghiệp Tiến hành: Chuẩn bị 8 bình lên men, mỗi bình chứa 100ml dịch đường đã thủy phân bằng enzyme cellulase (tỷ lệ enzyme 5%, bã rắn 5%). Hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Các thí nghiệm được tiến hành ở các điều kiện lên men dịch thủy phân bằng nấm men S.cerevisiae được nuôi cấy trong môi trường YBD với tỷ lệ 10% với thời gian lên men 24 giờ và ủ ở nhiệt độ 250C. Yếu tố cố định: Nhiệt độ, thời gian, hàm lượng đường Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi lượng ethanol sinh ra sau quá trình lên men khi thay đổi pH của dịch đường, lượng ethanol được định lượng bằng phương pháp Cordbard.  Thí nghiệm 9: Khảo sát ảnh hưởng của lượng nấm men S. cerevisiae sử dụng đến quá trình lên men ethanol Mục đich: Nấm men là nhân tố tạo ra quá trình lên men chuyển hóa đường thành ethanol và khí carbonic. Mỗi loài nấm men có khả năng lên men khác nhau, cùng loài nấm men nhưng ở những điều kiện lên men khác nhau thì khả năng lên men khác nhau và sản phẩm của quá trình lên men cũng khác nhau.Vì vậy việc lựa chọn tỷ lệ giống lên men sử dụng là rất cần thiết. Tiến hành: Cân 8 mẫu, mỗi mẫu có khối lượng 5g. Lần lượt cho 4 mẫu vào các erlen chứa 100 ml dung dịch đệm có pH 5, 4 mẫu còn lại cho vào cac erlen chứa 100 ml dịch rau, sau đó đem đi hấp tuyệt trùng. Các thí nghiệm được tiến hành ở các điều kiện: nhiệt độ 250C, bã rắn 5%, enzyme 5%, thời gian 24 giờ. Sau 24 giờ tiến hành lên men dịch thủy phân bằng nấm men S.cerevisiae được nuôi cấy trong môi trường YBD ở các nồng độ khác nhau: 0,6.108CFU/ml; 1,2.108CFU/ml; 1,80.108CFU/ml; 2,4.108 CFU/ml với thời gian lên men 24 giờ. Yếu tố cố định: pH, nhiệt độ, thời gian. Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi lượng cồn sau quá trình lên men khi thay đổi lượng nấm men sử dụng bằng phương pháp Cordbard. 45
  55. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Giai đoạn tiền xử lý cơ chất  Thí nghiệm 1: Khảo sát quá trình xử lý của NaOH, Na2CO3, Ca(OH)2 lên bã rau Bảng 3.1.Sự thay đổi khối lượng bã rau sau quá trình tiền xử lý với NaOH, Na2CO3, Ca(OH)2 Biểu đồ 3.1. Sự thay đổi khối lượng bã rau sau quá trình tiền xử lý với NaOH, Na2CO3, Ca(OH)2 Từ các bảng 3.1 và biểu đồ 3.1 cho thấy sự thay đổi khối lượng bã rau sau khi xử lý bằng các hóa chất khác nhau không nhiều, bã rau xử lý bằng dung dịch NaOH 2% 46
  56. Đồ án tốt nghiệp khối lượng bã còn lại sau xử lý là thấp nhất (0,81g) tiếp đến là Ca(OH)2 2% (0,85g) và Na2CO3 2% (0,88g). Điều đó cho thấy NaOH 2% là hóa chất xử lý cho hiệu suất cao nhất (19%). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Mohammad và Keikhosrokarimi (2008) sử dụng NaOH 2%, Ca(OH)2 2%, Na2CO3 2%, vì vậy chọn NaOH 2% làm dung môi để tiền xử lý nguyên liệu.  Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian xử lý nguyên liệu Bảng 3.2: Sự thay đổi khối lượng bã rau sau quá trình tiền xử lý với NaOH ở các thời điểm khác nhau Biểu đồ 3.2. Sự thay đổi khối lượng của bã rau sau khi xử lý với dung môi NaOH ở các thời điểm khác nhau Từ bảng 3.2 và biểu đồ 3.2 cho thấy khối lượng bã giảm dần khi tăng thời gian xử lý, với một lượng nguyên liệu ban đầu có khối lượng như nhau (1,0g) cùng tiền xử lý 47
  57. Đồ án tốt nghiệp bằng NaOH 2% nhưng ở các khoảng thời gian khác nhau thì sự thay đổi khối lượng bã sau tiền xử lý cũng khác nhau, khối lượng bã còn lại là thấp nhất (0,6g) khi ngâm với NaOH 2% trong 24 giờ. Vì vậy thời gian xử lý bằng NaOH 24 giờ là có hiệu quả nhất. 3.2. Giai đoạn thủy phân bằng enzyme cellulase Sau giai đoạn tiền xử lý bã rắn được tiến hành thủy phân bằng enzyme ở các điều kiện tối ưu để thu dịch đường. Thực hiện các thí nghiệm ở mục 2.4.2.2 ta thu được các kết quả sau:  Thí nghiệm 3: Khảo sát nhiệt độ tối ưu phản ứng enzyme cellulase với cơ chất Bảng3.3 Nồng độ glucose, hiệu suất tại 24 giờ theo nhiệt độ 48
  58. Đồ án tốt nghiệp 0.8 0.75 100 0.69 90 0.7 0.67 0.6 80 0.6 0.55 75 69 70 0.49 67 0.5 0.47 60 60 55 0.4 50 Lưlượngợng đườngđường 49 47 40 hiệuHiệ usuất suất 0.3 30 0.2 20 0.1 10 0 0 400C 420C 440C 460C 0 0 0 40 độ C 42 độ C 44 độ C 46 độ C 4848 độC C 5050 độC C 6060 độC C 4400 C Biểu đồ 3.3. Nồng độ glucose, hiệu suất tại 24 giờ theo nhiệt độ Qua bảng 3.3 và biểu đồ 3.3 cho thấy khi tăng nhiệt độ (400C đến 500C) thì lượng glucose thu được tăng (0,49g đến 0,75g) và cao nhất ở 50oC (0,75g), hiệu suất đạt cao nhất ( 75%). Khi tăng nhiệt độ từ 50oC đến 60oC lượng glucose giảm mạnh (0,75g còn 0,47g) điều đó cho thấy nhiệt độ tăng sẽ làm tăng hoạt tính enzyme từ đó tốc độ phản ứng enzyme cũng tăng theo và sản phẩm tạo thành nhiều hơn tuy nhiên sau nhiệt độ bất hoạt enzyme hoạt tính enzyme giảm dần vì thế sau 50oC nồng độ glucose và hiệu suất cũng giảm dần. Do đó 500C là nhiệt độ tối ưu cho quá trình thủy phân. 49
  59. Đồ án tốt nghiệp  Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian phản ứng tối ưu giữa enzyme với cơ chất Bảng 3.4. Nồng độ glucose và hiệu suất theo thời gian 0.9 100 0.78 0.8 0.75 90 0.68 80 0.7 78 0.62 75 0.6 70 0.6 68 0.52 60 62 60 0.5 0.47 52 0.41 50 lượng đường 47 Lượng đường 0.4 0.35 41 40 hiệuHiệ suấtu suất 0.3 35 30 0.2 20 0.1 10 0 0 1h 12h 14h 16h 18h 20h 22h 24h 36h Biểu đồ 3.4. Nồng độ glucose và hiệu suất theo thời gian Qua bảng 3.4 và biểu đồ 3.4 cho thấy khi tăng thời gian xử lý bã rau từ 1 giờ đến 50
  60. Đồ án tốt nghiệp 36giờ lượng glucose thu được tăng đều (0,35g đến 0,78g) và cao nhất ở 36 giờ (0,78g), hiệu suất đạt cao nhất (78%) tuy nhiên trong khoảng thời gian từ 24 – 36giờ lượng đường thay đổi không đáng kể (0,75g đến 0,78g) nên để tiết kiệm thời gian sản xuất, trong quy mô công nghiệp chọn thời gian phản ứng là 24giờ để có thể đạt được hiệu quả hợp lý.  Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân của enzyme Bảng 3.5. Nồng độ glucose và hiệu suất theo pH 0.9 100 0.79 0.8 0.75 90 0.7 79 80 0.62 0.64 75 0.58 70 0.6 0.55 62 64 58 60 0.5 55 0.38 50 Lưlượngợng đưđườngờng 0.4 38 40 hiệuHiệ usuất suất 0.3 30 0.2 20 0.1 10 0 0 pH 4 pH4.2 pH4.4 pH4.6 pH4.8 pH5 PH6 Biểu đồ 3.5. Nồng độ glucose và hiệu suất theo pH 51
  61. Đồ án tốt nghiệp Qua bảng 3.5 và biểu đồ 3.5 khi pH từ 4 đến 4.8 thì nồng độ glucose thu được tăng dần (0,55g đến 0,79g), hiệu suất tăng (từ 55% đến 79%) và cao nhất ở pH 4.8 có lượng đường thu được0,79g. Khi pH4.8 đến pH6 thì nồng độ glucose giảm (0,79g còn 0,38g) và hiệu suất cũng giảm (79% còn 38%) điều đó cho thấy mỗi enzyme sẽ hoạt động tốt nhất ở một khoảng pH nhất định, đối với enzyme cellulase khoảng pH4- 5 nên chọn pH4.8 là tối ưu cho quá trình thủy phân.  Thí nghiệm 6: Khảo sát lượng enzyme sử dụng tối ưu cho quá trình thủy phân Bảng 3.6. Nồng độ glucose và hiệu suất theo lượng enzyme sử dụng 0.9 100 0.77 0.8 0.75 90 80 0.7 77 0.61 75 70 0.6 0.57 61 60 0.5 57 50 Lưlượngợng đườngđường 0.4 0.37 40 37 hiệuHiệ suấtu suất 0.3 30 0.2 20 0.1 10 0 0 0.25 ml 0.5 ml 0.75 ml 1 ml 1.5 ml Biểu đồ 3.6. Nồng độ glucose và hiệu suất theo lương enzyme sử dụng 52
  62. Đồ án tốt nghiệp Qua bảng 3.6 và biểu đồ 3.6 cho thấy khi tăng lượng enzyme sử dụng từ 0,25ml (3,264 UI/ml) lên 1ml (13,059 UI/ml) thì lượng glucose thu được sau phản ứng tăng nhanh (0,37g đến 0,75g) nhưng khi lượng enzyme tăng từ 1ml (13,059 UI/ml) lên 1,5 ml (19,588 UI/ml) thì lượng glucose thu được tăng rất chậm chỉ giao động trong khoảng 0,75g đến 0,77g, điều đó cho thấy lượng enzyme sử dụng là 1ml (13,059 UI/ml) là tối ưu nhất. 3.3. Giai đoạn lên men bằng nấm men Sacharomyces cerevisiae  Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men ethanol sử dụng giống nấm men S.cerevisiae Bảng 3.7. Sự thay đổi lượng ethanol theo nhiệt độ 53
  63. Đồ án tốt nghiệp 1.8 100 1.6 90 1.6 1.48 1.37 1.4 80 70 1.2 59.7 60 1 55.2 Lưlượngợng ethanolethanol thu 51.1 50 thuđược đư trongợc trong 0.8 100ml(g/100ml) 40 100ml 0.6 HihiệuHiệuệ suấtusu suấtấ t 0.45 30 0.4 20 16.7 0.2 10 0 0 0 0 0 0 2020 độC C 2525 độC C 3030 độC C 3535 độC C Biểu đồ 3.7. Sự thay đổi lượng ethanol theo nhiệt độ Qua bảng 3.7 và biểu đồ 3.7 cho thấy khi tăng nhiệt độ lên men từ 200C đến 250C thì lượng ethanol thu được tăng (1,37g/100ml đến 1,6g/100ml) nhưng khi nhiệt độ tăng lên 300C và 350C lượng ethanol tạo thành bắt đầu giảm (1,48g/100ml còn 0,45g/100ml) điều đó cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình lên men, trong nghiên cứu này chọn nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men là 250C.  Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng pH của dịch đường lên quá trình lên men ethanol sử dụng giống nấm men Saccharomyces cerevisiae Bảng 3.8. Sự thay đổi lượng ethanol sau quá trình lên men ứng với các giá trị pH khác nhau. 54
  64. Đồ án tốt nghiệp 4.5 100 3.95 4 3.88 90 80 3.5 3.19 3.29 70 3 2.8 2.67 62.9 64 2.48 60 2.5 Lưlượngợng ethanol đường thu 51.7 53.3 50 thuđược đư trongợc trong 2 43.2 45.3 100ml(g/100ml) 40.2 40 100ml 1.5 Hihiệuệu suấtsuất 30 1 20 0.5 10 0 0 pH4 pH4.2 pH4.4 pH4.6 pH4.8 pH5 pH5.5 Biểu đồ 3.8. Sự thay đổi lượng ethanol tạo ra sau quá trình lên men ở pH khác nhau Qua bảng 3.8 và biểu đồ 3.8 cho thấy khi thay đổi pH của dịch đường lên men từ pH4 đến pH5 thì lượng ethanol thu được tăng nhanh (2,67g/100ml đến 3,95g/100ml) và cao nhất ở pH5 lượng ethanol thu được 3,95g100ml, hiệu suất đạt cao nhất 64%, từ pH5 đến pH5.5 lượng ethanol thu được giảm mạnh (3,95g/100ml còn 2,48g/100ml). Vì vậy pH của dịch đường lên men có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men, mỗi chủng vi sinh vật có khoảng pH thích ứng cho sự sinh trưởng và phát triển khác nhau, khoảng pH hoạt động của nấm men S.cerevisiae nằm trong khoảng pH4.5-5. Đối với nghiên cứu này chọn pH tối ưu cho quá trình lên men là pH5. 55
  65. Đồ án tốt nghiệp  Thí nghiệm 9: Khảo sát ảnh hưởng của lượng nấm men S.cerevisiae sử dụng đến quá trình lên men ethanol Bảng 3.9. Lượng ethanol tạo thành sau quá trình lên men ở các mật độ nấm men khác nhau 5 4.5 4.58 4 4.1 3.67 3.72 3.5 3.58 3.52 3.43 3.36 lượngLượng ethanol ethanol tạo t ạthànho thành sau khi 3 lênsau men khi dịch lên thủydịch phânthủy phâncủa bã bằngcủa S.cerevisiaebã bằng S.cerevisiae 2.5 2 lượngLượng ethanol ethanol tạo t ạthànho thành sau khi lênsau men khi đồng lên men thời đdịchồng thủy thờ i 1.5 phândịch của thủ bãy phân và dịch củ arau bã bằng và 1 S.cerevisiaedịch rau bằng S.cerevisiae 0.5 0 tỷ0,6 lệ.10 0.58 1,2.10tỷ lệ8 1 1,8tỷ .10lệ 1.58 2,4tỷ.10 lệt8 2 Biểu đồ3.9. Lượng ethanol tạo thành sau quá trình lên men ở các mật độ nấm men 0,6.108CFU/ml, 1,2.108CFU/ml, 1,8.108CFU/ml, 2,4.108CFU/ml 56
  66. Đồ án tốt nghiệp 80 70 67.7 60 57.1 58.1 54.7 50 49.7 48.9 47.9 43.1 hiệuHiệ suấtu su ấlênt lên men men của c ủbãa bã 40 Hiệu suất lên men đồng hiệu suất lên men đồng thời của 30 bãth vàời dịch của bã và dịch 20 10 0 8 8 8 0,6tỷ.10 lệ 0.5 1,2tỷ.10 lệ 1 1,8tỷ lệ.10 1.5 2,4tỷ.10 lệt 2 Biểu đồ 4.0. Hiệu suất quá trình lên men ở các mật độ nấm men 0,6.108CFU/ml, 1,2.108CFU/ml, 1,8.108CFU/ml, 2,4.108CFU/ml Qua bảng 3.9, biểu đồ 3.9 và 4.0 cho thấy lượng ethanol tạo thành cao nhất ở tỷ lệ mật độ nấm men 2,4.108CFU/ml (4,1g/100ml, 4,58g/100ml), cho hiệu suất cao nhất (67,7%, 58,1%), tiếp đến là ở mật độ nấm men 1,2.108CFU/ml, 0,6.108 CFU/ml và 1,8.108 CFU/ml. Điều này cho thấy lượng ethanol tạo thành chịu ảnh hưởng của mật độ nấm men đồng thời chịu ảnh hưởng của hàm lượng glucose của dịch thủy phân nên sử dụng mật độ nấm men 2,4.108 CFU/ml là hiệu quả nhất. 57
  67. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận - Kết quả xử lý bã rau nguyên liệu trong các điều kiện dung môi NaOH 2% và thời gian ủ 24 giờ là tương đối tốt so với Ca(OH)2 2% và Na2CO3 2%. Khi tiến hành xử lý ở các điều kiện này 1kg rau nguyên liệu sau xử lý còn lại 24g. - Quá trình thủy phân bã rau nguyên liệu bằng enzyme cellulase sau khi tiền xử lý ở pH 4.8, nhiệt độ 500C và lượng enzyme sử dụng 1ml (13,059UI/ml) là tối ưu nhất. Như vậy 1kg rau nguyên liệu sau quá trình tiền xử lý và thủy phân thu được 18g đường khử. - Quá trình lên men dịch đường bằng Sacharomyces cerevisiae sau khi thủy phân trong các điều kiện thời gian 24 giờ, pH 5.0, nhiệt độ 250C và mật độ nấm men 2,4.108CFU/ml là tốt nhất. Như vậy khi tiến hành lên men ở các điều kiện này 1kg rau thu được 10,458g/l ethanol. 4.2. Đề nghị Do thời gian có hạn nên chưa khảo sát hết được các điều kiện tối ưu, sau đây chúng tôi đưa ra một số đề nghị: - Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân và lên men. - Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men - Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường của dịch lên men đến quá trình lên men 58
  68. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt [1] Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng, Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic , Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật. [2] Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2001. [3] Nguyễn Thị Ngọc Bích, Kỹ thuật cellulose và giấy, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2003. [4] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Cao Tường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên,Tạ Thu Ngọc Anh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền (2004), Công nghệ enzyme, Nxb. Đại học Quốc Gia. [5] Nguyễn Đức Lượng (2006), Vi sinh vật công nghiệp tập 2, Nxb. Đại Học Quốc Gia. [6] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, Thí nghiệm vi sinh vật học, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia tp.Hồ Chí Minh. [7] Nguyễn Văn Mùi, Thực hành hóa sinh học, Nxb. Khoa học và kỹ thuật. [8] Trịnh Hoài Thanh, Nghiên cứu quá trình xử lý rơm rạ để chế biến cồn nhiên liệu, Bộ môn Máy thiết bị- bộ môn công nghệ hóa học. Tiếng anh [9] Charles E. Wyman, Handbook on Bioethanol: Product and Utilization, Taylor and Francis, 1996.p 119- 285. [10] Hetti Palonen, Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose VTT Biotechnology, 2004, p 11-39. [11] Kim, Bruce E. Dale, Global potential bioethanol production from wasted crops, Science Direct, Biomass and Bioenergy 26, 2004, p.361-375. 59
  69. Đồ án tốt nghiệp [12] Mohammad J. Taherzadeh và Keikhosro Karimi, (2008). Pretreatment of Lignocellulosic Wastes to Improve Ethanol and Biogas Production: A Review, International Journal of Molecular Sciences, 9, 1621-1651. [13] Ilona Sárvári Horváth, Carl Johan Franzén, Mohammad J. Taherzadeh, Claes Niklasson, Gunna Lidén, Effect of Fufural on the Respiratory Metabolism of Saccharomyces Cerevisiae in Glucose-Limited Chemostats, American Scociety for Microbiology vol.69, 07/2004, p.4076-4086. [14] Sun, Y. and J. Cheng, 2002. Hydrolysis of lignocellulosic material from ethanol production: A review. Bioresour. Technol, 83: 1-11 Các trang web [15] [16] ên_liệu_sinh_học [17] [18] [19] 60
  70. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC  Đồ thị đường chuẩn glucose 0,5mg/ml Bảng 4.1. Kết quả đo mật độ quang của đường chuẩn glucose 0,5mg/ml Đồ thị 4.1: Đồ thị đường chuẩn glucose 0,5mg/ml 1
  71. Đồ án tốt nghiệp  Đồ thị đường chuẩn glucose 10mg/ml Bảng 4.2. Kết quả đo mật độ quang của đường chuẩn glucose 10mg/ml Đồ thị 4.2. Đồ thị đường chuẩn glucose 10mg/ml  Xác định hàm lượng cellulose 2
  72. Đồ án tốt nghiệp Khối lượng của mẫu giấy, sấy khô đến trọng lượng không đổi: Giấy 1= 0,77(g) Giấy 2= 0,78(g) Giấy 3= 0,78(g) Khối lượng của mẫu sau khi sấy đến trọng lượng không đổi: Mẫu (1+ giấy 1)= 0,98(g) Mẫu (2+giấy 2)= 1,00(g) Mẫu (3+giấy 3)= 1,07(g) Khối lượng mẫu là: a1= Mẫu (1+ giấy 1) – Giấy 1= 0,98 – 0,77= 0,21(g) a2= Mẫu (2+giấy 2) – Giấy 2= 1,00 – 0,78= 0,22(g) a3= Mẫu (3+giấy 3) – Giấy 3= 1,07 – 0,78= 0,29(g) Hàm lượng cellulose là: X1= = = 21% X2= = = 22% X3= = = 29% X= = 24%  Định tính etanol - Sau khi để yên trong 30 phút màu của mẫu đã chuyển thành xanh lơ. - Phương trình phản ứng: 2K2Cr2O7 + 3C2H5OH + 16 HNO3 4Cr(NO3)3 + 4KNO3 + 3CH3COOH + 11H2O 3
  73. Đồ án tốt nghiệp Hình 4.1. Dịch lên men trước khi cho dung dịch nitrocromic Hình 4.2. Dịch lên men đổi màu xanh lơ sau khi cho dung dịch nitrocromic vào  Hoạt tính enzyme cellulase thương mại E1-5 = 0,762 EC1-5= 0,008 SC1-5= 0,016 ∆ E1-5= E1-5 - EC1-5 + SC1-5 = 0,77 Nồng độ glucose thực được giải phóng: x= 73,022mg Hoạt tính của enzyme cellulase: FPU = mg glucose giải phóng x 0,185 = 73,022 x 0,185 = 13,059 UI/ml  Mật độ nấm men Số lượng tế bào trong 1ml mẫu nghiên cứu được tính bằng công thức: 4
  74. Đồ án tốt nghiệp N = [(a/b) x 400/0,1] x 103 x 10n Số tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ) là 240TB Số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn là 80 Độ pha loãng n = 10 lần Số lượng tế bào trong 1 ml mẫu: N= 120.106 TB/ml= 1,2.108CFU/ml  Tính hiệu suất - Hiệu suất quá trình tiền xử lý - Hiệu suất quá trình thủy phân - Hiệu suất quá trình lên men 5