Đồ án Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của cao chiết Hoa Sứ trắng (Plumeria rubra L. var. acutifolia)

118 trang thiennha21 13/04/2022 4032

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của cao chiết Hoa Sứ trắng (Plumeria rubra L. var. acutifolia)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_nghien_cuu_kha_nang_khang_khuan_va_xac_dinh_thanh_phan.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của cao chiết Hoa Sứ trắng (Plumeria rubra L. var. acutifolia)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOẠI CAO CHIẾT HOA SỨ TRẮNG (PLUMERIA RUBRA L. ACUTIFOLIA) Ngành: Công nghệ Sinh học Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Trần Phương Thùy MSSV: 1311100744 Lớp: 13DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2017
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. TP.Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên TRẦN PHƯƠNG THÙY
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên TRẦN PHƯƠNG THÙY
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 3 4. Phạm vi nghiên cứu 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4 1.1. Giới thiệu về cây Sứ trắng 4 1.1.1. Phân loại 4 1.1.2. Đặc điểm hình thái 4 1.1.3. Phân bố 5 1.1.4. Công dụng của cây Sứ Trắng 6 1.1.5. Thành phần hóa học của Hoa Sứ trắng 8 1.1.6 Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ ở Việt Nam và trên thế giới 8 1.2. Đại cương về một số hợp chất hữu cơ hiện diện ở thực vật 9 i
Đồ án tốt nghiệp 1.2.1. Carbohydrate 9 1.2.2. Alkaloid 10 1.2.3. Flavonoid 11 1.2.4. Saponin 12 1.2.5. Tannin 13 1.2.6. Hợp chất glycoside 14 1.2.7. Hợp chất phenolic 15 1.3. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật 16 1.3.1. Khái niệm 16 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn 17 1.4. Tổng quan về vi khuẩn đường ruột 17 1.4.1. Định nghĩa 17 1.4.2. Đặc điểm hình thái 17 1.4.3. Tính chất nuôi cấy 17 1.4.4. Đặc điểm sinh hóa 18 1.4.5. Sức đề kháng 18 1.4.6. Độc tố 19 1.4.7. Cấu trúc kháng nguyên 19 1.4.8. Khả năng gây bệnh 20 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 ii
Đồ án tốt nghiệp 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22 2.1.1. Địa điểm 22 2.1.2. Thời gian 22 2.2. Vật liệu 22 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 22 2.2.2. Địa điểm thu mẫu 22 2.2.3. Vật liệu nghiên cứu 22 2.2.4. Thiết bị và dụng cụ 24 2.2.5. Hóa chất, dung môi 24 2.3. Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu 25 2.3.2 Phương pháp tách chiết cao từ thực vật 25 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 26 2.3.4. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật 27 2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu 27 2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 28 2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết 28 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu 31 2.4. Bố trí thí nghiệm 32 iii
Đồ án tốt nghiệp 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng. 32 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết khác nhau từ Hoa Sứ trắng 34 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng 38 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng 39 3.2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 39 3.2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. 42 3.2.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm Salmonella spp. 44 3.2.5. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 48 3.2.6. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn còn lại 50 3.3. Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết Hoa Sứ trắng từ dung môi ethanol 70% 57 iv
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 1 Phụ lục A. Kết quả đánh giá hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ trắng với các loại dung môi khác nhau 1 Phụ lục B. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với 20 chủng vi khuẩn thử nghiệm 1 Phụ lục C: Cách pha các loại thuốc thử 38 Phụ lục D. Kết quả hình ảnh định tính một số thành phần hóa học của cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ trắng 40 v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TSB: Trypton Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar DMSO: Dimethyl Sulfoxide NA: Non activity DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid PrAEE: Cao chiết ethanol từ Hoa Sứ trắng vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) của cao chiết Hoa Sứ trắng từ các loại dung môi khác nhau trên 10 chủng vi khuẩn gây bệnh. 54 Bảng 3.2. Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) của cao chiết Hoa Sứ trắng từ các loại dung môi khác nhau trên 10 chủng vi khuẩn gây bệnh 55 Bảng 3.3. Kết quả định tính thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ mẫu Hoa Sứ trắng 58 vii
Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây Hoa Sứ trắng 4 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí nghiệm tổng quát 32 Hình 2.2. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng 33 Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao PrAEE 34 Hình 2.4. Định tính một số thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ trắng 36 Hình 3.1. Hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ trắng với các dung môi khác nhau . 38 Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 40 Hình 3.3. A. Vòng ức chế E.coli (EtOH 70%) B. Vòng ức chế E0208 (EtOH 96%) 40 Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. 42 Hình 3.5. A. Vòng ức chế của L.innocua (EtOH 70%) B. Vòng ức chế của L.monocytogenes (EtOH 70%) 42 Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn salmonella spp. 44 Hình 3.7. Vòng ức chế S.dublin của cao chiết EtOH 70% (A) và 96% (B) 44 Hình 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. 46 Hình 3.9. Vòng ức chế của S.boydii của cao chiết EtOH 96% (A) và cao chiết EtOH 50% (B) 47 Hình 3.10. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 49 Hình 3.11. A. Vòng ức chế V.cholerae của cao chiết EtOH 96% và B. Vòng ức chế V.harveyi của cao chiết EtOH 70% 49 Hình 3.12. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da 51 Hình 3.13. Vòng ức chế S.aureus (A) và P.aeruginosa ở cao chiết EtOH 70% (B) 51 viii
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, có tới 3/4 diện tích cả nước là rừng núi. Với đặc điểm khí hậu và địa hình như vậy nên nước ta được đánh giá là nước có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng và phong phú, được xếp thứ 16 trong số 25 quốc gia có mức độ đa dạng sinh vật cao nhất thế giới. Nguồn thực vật phong phú này đã cung cấp cho con người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị. Các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học được ứng dụng rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, đặc biệt là dùng làm thuốc chữa bệnh. Theo các nhà phân loại thực vật, nước ta có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, trong đó khoảng 3.948 loài được dùng làm dược liệu (Viện dược liệu, 2007). Nếu so với khoảng 20.000 loài cây làm thuốc đã biết trên thế giới (IUCN, 1992) thì số loài cây thuốc ở Việt Nam chiếm khoảng 19%. Tuy có nguồn thực vật đa dạng và phong phú nhưng do chúng phân bố rải rác ở nhiều nơi, cùng với sự khai thác nhưng không có kế hoạch bảo tồn nên dẫn đến tình trạng trữ lượng các loài cây ngày càng ít đi. Thế nên, hiện nay chúng ta cần khai thác có hiệu quả về hoạt tính sinh học của các loài cây và duy trì trồng lại các giống đã khai thác, để tạo ra các loại thuốc trị bệnh mới đem lại lợi ích cho con người nhưng không làm cạn kiệt nguồn tài nguyên nước nhà. Nguồn dược liệu của nước ta vô cùng phong phú, trong đó có nhiều cây thuốc kháng sinh được Y học dân tộc dùng làm thuốc từ lâu. Chúng thường là những cây cỏ rất quen thuộc, mọc hoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn như: Hành, Tỏi, Hẹ, Kim ngân, Sâm đại hành, lá Móng tay được nhân dân ta dùng làm thuốc tiêu độc, tiêu viêm, sát khuẩn, chữa các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da, mụn nhọt, chốc lở, viêm họng, viêm phế quản và nhiều bệnh nhiễm khuẩn khác. Nhiều cây thuốc được nhân dân ta dùng chữa vết thương có kết quả tốt như Mỏ quạ, Nọc sởi, lá Vối, lá Bòng bong, Sắn thuyền, Lô hội, lá Trầu không, Sài đất Trong điều trị các vết thương phần mềm, 1
Đồ án tốt nghiệp nhiều tác giả trong và ngoài nước cũng đã công nhận dùng chất kháng khuẩn thực vật chữa vết thương chóng sạch, các đám hoại tử dễ bong, tổ chức hạt non phát triển mạnh, vết thương mau lành hơn chữa bằng kháng sinh tân dược vì trong nước sắc cây thuốc không phải chỉ có kháng sinh mà còn có những chất kích thích giúp vết thương chóng đầy miệng, có các loại men, vitamin và các nguyên tố vi lượng tạo điều kiện cho vết thương chóng khỏi. Hiện nay trên thế giới, phong trào quay về với thiên nhiên đang diễn ra mạnh mẽ và Việt Nam chúng ta cũng đang rất tích cực nghiên cứu về vấn đề này. Ở Việt Nam, các nghị định,các chương trình của nhà nước đã thúc đẩy việc phát hiện, nghiên cứu và sử dụng các nguồn cây thuốc trong kho tàng cây thuốc Việt Nam. Trong các cuốn sách nói về cây thuốc hầu hết đều có nhắc tới công dụng chữa bệnh của cây sứ trong đó có hoa sứ điển hình như trong cuốn sách Từ điển cây thuốc Việt Nam của tác Võ Văn Chi. Theo y học cổ truyền, các bộ phận sau của cây sứ có thể dùng làm thuốc: vỏ thân, vỏ rễ, hoa, nụ hoa, lá tươi và nhựa cây, nhưng sử dụng nhiều nhất là hoa. Toàn cây có chứa một loại kháng sinh thực vật là fulvo plumierin, có tác dụng ức chế sự tăng sinh và phát triển của một số vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis. Thời xa xưa, dân gian thường dùng hoa đại phơi khô để làm thuốc chữa chứng ho, kiết lỵ và tiêu chảy. Với nghiên cứu khoa học và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của cao chiết Hoa Sứ trắng (Plumeria rubra L. var. acutifolia)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng khi tách chiết bằng các dung môi khác nhau. - Bước đầu định tính một số thành phần hóa học hiện diện trong cao chiết Hoa Sứ trắng. 2
Đồ án tốt nghiệp 3. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá hàm lượng thu hồi cao chiết Hoa Sứ trắng từ 4 loại dung môi nước, ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 96%. - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với các vi khuẩn chỉ thị. - Bước đầu định tính một số thành phần hóa học hiện diện trong cao chiết Hoa Sứ trắng. 4. Phạm vi nghiên cứu - Chỉ thực hiện tách chiết trên những loại dung môi là cồn và nước. - Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị. 3
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây Sứ trắng 1.1.1. Phân loại Giới: Plantae Bộ: Gentianales Lớp: Dicotyledons Họ: Apocynaceae (Trúc Đào) Chi: Plumeria Tên khoa học: Plumeria rubra L. var. acutifolia (Poir.) Bailey Tên thường gọi: Sứ cùi, cây Đại, bông Sứ, Chăm pa Hình 1.1. Cây Hoa Sứ trắng 1.1.2. Đặc điểm hình thái Cây cao khoảng 2 – 3 m, có khi cao đến 7 m.Thân tròn mập, phân cành nhiều nhánh, dài, khẳng khiu, cong queo, xù xì. Vỏ cây có màu trắng xám với những sẹo lá để lại, cây có nhựa mủ. Lá cây Hoa Sứ trắng thuôn dài có hình bầu dục, rộng ở giữ và hẹp ở cả 2 đầu. Lá có màu xanh bóng, nhẵn ở mặt trên, lớp lông mịn cùng với gân chính màu trắng và 4
Đồ án tốt nghiệp các gân viền ở mép nổi rõ ở mặt dưới lá. Lá xếp sát nhau thành vòng ở ngọn cành, khi rụng để lại sẹo lớn ở cành. Hoa Sứ trắng ra những cụm hoa trên cuống chung dài khoảng 30 – 50 cm, phân nhánh ở vòng đỉnh, có nhiều sẹo do hoa rụng. Các bông có cánh dày, mập, khi còn nụ thì xếp vặn, nở bung thì khoe sắc trắng của cánh hoa và tâm màu vàng cùng nhị đính trên ống tràng. Hoa nở quanh năm và mang mùi thơm thoang thoảng. Cây Hoa Sứ trắng có quả mọc choãi thẳng hàng, dài từ 10 – 15 cm. Quả chứa các hạt có cánh nhưng ít gặp vì Hoa Sứ trắng khó đậu trái. Cây Hoa Sứ trắng có tốc độ sinh trưởng nhanh. Đây là cây ưa sáng, phát triển tốt trên đất giàu dinh dưỡng, thoát nước tốt. Cây còn có thể trồng trên đất cát, đất sỏi vì Sứ Trắng có khả năng chịu hạn cao. Cây được nhân giống từ giâm cành là chính. Vào mùa mưa, những cành Sứ trắng giâm rất nhanh ra rễ và mọc khỏe. 1.1.3. Phân bố Hoa Sứ trắng là một trong số nhiều loài thuộc chi Plumeria. Chi này có nguồn gốc ở vùng Trung Mỹ. Do có hoa đẹp và đặc biệt có hương thơm, dần dần đã được con người trồng nhiều nơi trên thế giới để làm cảnh và lấy hương từ hoa. Ở nhiều nước Nam Á như Ấn Độ, Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam, Sứ trắng thường được trồng ở các đền đài, và dùng hoa của nó để thờ cúng. Nicaragua và Lào là hai nước lấy cây Sứ Trắng làm quốc hoa, ở đó nó được gọi với cái tên là Sacuajoche (Nicaragua) và Champa (Lào). Sứ Trắng có tên tiếng Anh là frangipani, xuất phát từ tên dòng họ Frangipani của một gia đình hầu tước đã nghĩ ra cách tạo một loại nước hoa có mùi của hoa Sứ Trắng. Ở Việt Nam, Cây Sứ trắng được trồng nhiều tại công viên, dọc đường phố, khu đô thị, khu công nghiệp, trồng dọc lối đi, dải phân cách, cảnh quan nhà máy, bệnh viện hay trồng sân vườn biệt thự Những đình, chùa, lăng miếu hay nghĩa trang cũng sử dụng loại cây này rất nhiều. 5
Đồ án tốt nghiệp 1.1.4. Công dụng của cây Sứ Trắng 1.1.4.1. Công dụng làm cảnh Sứ có nhiều loại và màu sắc khác nhau, từ những cây nhỏ được trồng trong chậu đặt ở những vị trí nhỏ hẹp như sân thượng, ban công nhà, đến những cây Sứ to được trồng trong sân vườn đem lại hương hoa và bóng mát cho ngôi nhà. 1.1.4.2. Công dụng dân gian của cây Sứ trắng Tính vị, tác dụng: Hoa Sứ trắng có vị ngọt, tính bình, thơm, có tác dụng thanh nhiệt lợi tiểu, hòa vị, nhuận tràng, bổ phổi, có tác dụng hạ huyết áp rất rõ. Vỏ cây có vị đắng tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, tả hạ, tiêu thủng, sát trùng. Lá có tác dụng hành huyết, tiêu viêm. Nhựa có tác dụng tiêu viêm và làm mềm những tổ chức rắn chai chân. Theo y học cổ truyền, các bộ phận sau của cây Sứ trắng có thể dùng làm thuốc: vỏ thân, vỏ rễ, hoa, nụ hoa, lá tươi và nhựa cây, nhưng sử dụng nhiều nhất là hoa. Toàn cây có chứa một loại kháng sinh thực vật là fulvo plumierin, có tác dụng ức chế sự tăng sinh và phát triển của một số vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis. Từng bộ phận khác nhau của cây có những công dụng khác nhau: a) Công dụng của hoa Năm 1962, khoa Dược lý trường sĩ quan quân y Việt Nam đã nghiên cứu tác dụng của Hoa Sứ và kết luận rằng “Hoa Sứ có tác dụng hạ huyết áp. Hoa khô có tác dụng mạnh hơn hoa tươi”. Hoa Sứ hạ huyết áp nhưng không làm giãn tĩnh mạch, không tác dụng đối với tuần hoàn ngoại biên mà tác dụng vào trung tâm. Tác dụng huyết áp xuất hiện nhanh và tương đối bền vững. Ngoài ra Hoa Sứ còn có một số công dụng sau: Dự phòng say nắng Viêm ruột, lỵ Khó tiêu, kém hấp thu và kém dinh dưỡng ở trẻ em Nhiễm khuẩn, viêm gan Viêm khí quản, ho 6
Đồ án tốt nghiệp b) Công dụng của vỏ thân, vỏ rễ Trong vỏ thân có gluside là agoniadin và một chất đắng là plumierite. Vỏ thân và rễ có hơi độc, vị đắng, tính mát. Dân gian thường sử dụng để chữa thủy thủng, làm thuốc tẩy xổ (dùng 8 – 15 g), táo bón lâu ngày (thay thế cho đại hoàng), nhuận tràng (dùng 3 – 5 g), viêm chân răng. Ở Ấn Độ, người ta còn dùng vỏ trị tiêu chảy và dùng vỏ rễ để trị bệnh lậu và loét đường sinh dục. c) Công dụng của nhựa mủ Nhựa mũ thành phần chủ yếu là acid plumeric. Cũng có thể dùng nhựa mủ để tẩy xổ, nhưng liều thấp hơn nhiều so với vỏ thân , 0.5 – 0.8g/ngày dưới dạng nhũ dịch. Nhựa mủ còn được dùng để chữa chai chân, sưng tấy, mụn nhọt. Ở Ấn Độ, người ta dùng như chất gây sung huyết để trị thấp khớp và còn dùng xổ. d) Công dụng của lá Lá tươi chứa plumier và một số chất khác đã được sử dụng để điều trị loét, viêm (Bobbarala và ctv, 2000, Zaheer và ctv, 2010). Chiết xuất lá đã cho thấy dấu hiệu của hoạt động kháng khuẩn. Kinh nghiệm dân gian dùng lá cây Sứ trắng chữa bong gân, sai khớp, mụn nhọt. Một số bài thuốc dân gian từ Hoa Sứ: Chữa cao huyết áp, bằng cách dùng như sau: Hằng ngày sử dụng 12 - 20g hoa sứ (loại khô), đem sắc (nấu) lấy nước, uống thay trà trong ngày. Bong gân: Dùng một lá tươi rửa sạch, giã nhuyễn, trộn với một ít muối ăn đắp lên chỗ sưng. Lại dùng một ít lá tươi khác, hơ lên lửa cho héo và đắp phía ngoài rồi cố định bằng băng hoặc vải sạch. Ngày đắp 1 – 3 lần liên tục như vậy 1 – 2 ngày. Đau nhức hay mụn nhọt: Cũng dùng lá tươi giã nhuyễn đắp vào. Chân răng sưng đau: Vỏ rễ ngâm rượu, dùng ngậm rất hiệu quả (chú ý không được nuốt). Ho: Sử dụng 4 – 12g hoa sứ khô, sắc lấy nước, uống thay trà trong ngày. 7
Đồ án tốt nghiệp 1.1.5. Thành phần hóa học của Hoa Sứ trắng - Hoa chứa tinh dầu dễ bốc hơi (chừng 0,05 %) trong có citronellol, farnesol, geraniol, bornesitol, linalol, phenyl-ethyl alcohol, 2-methylbutan-1-ol. Các flavonoid như kaempferol, kaempferol-glycoside, quercetin, quercetin-glycoside , quercitrin, rutin - Vỏ thân có beta-sitosterol, các iridoids như fulvoplumierin (0,25%), al lamcin và allamandin , plumieride (6%), p-benzoquinone, lignan loại liriodendrin - Rễ chứa beta-dihydroplumericic acid, beta-dihydroplumericine, isoplume ricine, plumericine. - Nhựa chứa acetyl-luoeol, alpha và beta-amyrin, cerotic acid, lupeol, lupe ol- acetate, oxymethyl-dioxycinnamic acid, plumieric acid - Lá chứa khoảng 5,6 % pectin. 1.1.6 Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ ở Việt Nam và trên thế giới 1.1.6.1. Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ ở Việt Nam Hiện nay ở Việt Nam chưa có bài viết cụ thể nào nghiên cứu về loài Hoa Sứ. 1.1.6.2. Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ trên thế giới Năm 2010, Ajay Singh Baghel và ctv đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của chiết xuất từ hoa Plumeria rubra L. bằng các loại dung môi nước, ethanol, etyl acetate, chloroform. Năm 2015, Lawal và ctv đã khảo sát thành phần hóa học của chiết xuất tinh dầu từ lá Plumeria rubra L. trồng ở Nigeria. Năm 2014, Muruganantham và ctv đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của chiết xuất ethanol từ Plumeria rubra. Năm 2008, Laila Jarin đã nghiên cứu hoạt động kháng nấm và kháng khuẩn của chiết xuất tinh dầu từ Plumeria rubra. Năm 2012, Ravi Kumar Goyal và ctv đã khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vỏ cây Plumeria alba. 8
Đồ án tốt nghiệp Năm 2010, Subur Khan và ctv đã nghiên cứu đánh giá thành phần hóa học của Plumeria rubra và Plumeria alba. 1.2. Đại cương về một số hợp chất hữu cơ hiện diện ở thực vật 1.2.1. Carbohydrate 1.2.1.1. Khái niệm Carbohydrate là một nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rãi trong cơ thể sinh vật. Được cấu tạo từ các nguyên tố: C, H, O với công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013).Nhìn chung hàm lượng carbohydrate ở thực vật cao hơn động vật. Ở thực vật carbohydrate thay đổi tùy theo loài, giai đoạn sinh trưởng và phát triển. Thực vật: chiếm khoảng 75% trong các bộ phận như củ, quả, lá, thân, cành. Động vật: chiếm khoảng 2% trong gan, cơ máu, (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013). 1.2.1.2. 2.Phân loại Dựa vào cấu tạo, tính chất carbohydrate được chia làm ba nhóm chính sau: Monosaccharide còn được gọi là đường đơn vì chúng là thành phần đơn giản nhất của carbohydrate và không bị thủy phân. Monosaccharide được xem là sản phẩm oxy hóa không hoàn toàn của các polyalcol, công thức có chứa chức aldehyde và cetone. Oligosaccharide là hợp chất trung gian giữa monosaccharide và polysaccharide. Phân tử oligosaccharide và polysaccharide đều do các monosaccharide kết hợp với nhau bằng liên kết O-glycoside do nhóm hydroxyl hemiacetal của một gốc với một hydroxyl bất kì của một gốc khác. Thông thường người ta gọi oligosaccharide là những gluside chứa từ 2 - 10 gốc monosaccharide. Tùy theo số lượng monosaccharide mà người ta gọi disaccharide, trisaccharide, tetrasaccharide 9
Đồ án tốt nghiệp Hầu hết các oligosaccharide dễ kết tinh, dễ hòa tan, có vị ngọt và có phân tử lượng xác định. Polysaccharide là những hợp chất bao gồm hàng trăm đến hàng nghìn monosaccharide kết hợp với nhau bằng liên kết glycoside. Polysaccharide mang nhiều tính khác với mono và disaccharide như: không có phản ứng khử, không có vị ngọt, thường không tan trong nước, khi hòa tan dễ hình thành dung dịch keo. Phân tử polysaccharide có thể gồm một hoặc vài loại monome khác nhau, do đó người ta chia ra polysaccharide đồng thể và polysaccharide dị thể. 1.2.1.3. Vai trò Trong cơ thể sống carbohydrate giữ nhiều vai trò quan trọng: Đảm bảo cung cấp khoảng 60% năng lượng cho các quá trình sống. Có vai trò cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidoglican ). Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide). Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể) (Nguyễn Phương Hà Linh Linh, 2011). 1.2.2. Alkaloid 1.2.2.1. Khái niệm Alkaloid là nhóm hợp chất tự nhiên hiện diện khá nhiều trong các họ thực vật với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Trên thực tế có rất nhiều loài thực vật có alkaloid nhưng ở mức độ vết hoặc tỉ lệ phần vạn. Để giới hạn với ý nghĩa thực tiễn, một cây được xem là có alkaloid phải chứa ít nhất 0,05% alkaloid so với mẫu cây khô. 1.2.2.2 Phân loại Do cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản không thể đáp ứng được cho số lượng alkaloid rất nhiều và đa dạng, nên để tiện lợi, các alkaloid được chia làm 3 loại: alkaloid thật, protoalkaloid và giả - alkaloid (Pseudoalkaloid). 10
Đồ án tốt nghiệp Alkaloid thật là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính base, thường có chứa nguyên tử nitơ trong vòng dị hoàn, thường được sinh tổng hợp từ amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối của một acid hữu cơ, ngoại trừ colchicin, acid aristolochic, alkaloid tứ cấp. Các alkaloid loại này thường được chia thành nhóm theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (ornithin. Lysin, phenylalanin, tryptophan, histidin, acid antranilic ) hơn là theo vòng dị hoàn. Các protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescalin và N, N - dimetyltryptamin. Chúng là những amin đơn giản, được tổng hợp từ các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở vòng dị hoàn. Các giả - alkaloid, là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino aicd, bao gồm hai nhóm hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid (thí dụ conessin) và purin (cafein). Hầu hết các alkaloid hiện diện trong cây có hoa, loại 2 lá mầm, nhưng người ta cũng thấy alkaloid trong động vật, côn trùng, sinh vật biển, vi sinh vật (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 1.2.2.3. Vai trò Nhiều alkaloid đã được sử dụng để làm thuốc trị bệnh. Alkaloid có tác dụng kích thích thần kinh như: strychnine, cafein, lobelin có khả năng diệt ký sinh trùng và các nguyên sinh động vật như: emetin, quinin, conessin, berberin. Các alkaloid có tác dụng ức chế thần kinh trung ương nên được dùng làm thuốc giảm đau trong khi giải phẫu hoặc khi bị bệnh ung thư giai đoạn cuối như: morphin, codeine, cocaine. Các alkaloid được bào chế làm thuốc để giảm hệ thần kinh giao cảm: reserpin, propanol. 1.2.3. Flavonoid 1.2.3.1. Khái niệm Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa Phần lớn có màu vàng ( do từ flavus là màu vàng ); tuy vậy, một sắc tố 11
Đồ án tốt nghiệp có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học chúng có cùng khung sườn cơ bản. Các flavonoid có thể ở dạng tự do hoặc dạng glycoside. Các đường thường gặp nhất là D-glucose; kế đó là D-galactose; L-Rhammose; L-Arabinose Chalcone hiện diện ít trong tự nhiên; flavanol và flavanonol cũng hiếm gặp; flavone và flavonol phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Các glyside flavonol như: rutin, quercitrin, daempherol. Kaempherol rất thường xuyên hiện diện. Antocyanidine dạng glycoside thí dụ như: pelargonidin; cyanidin; delphinidin tạo màu xanh, đỏ, tím cho những cánh hoa và trái. Các flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu. Flavone có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol màu vàng nhạt đến màu vàng; chalcone màu vàng đến cam – đỏ. Các isoflavone; flavanone; flavanonol; leucoantocyanidine; catechin kết tinh không màu. Antocyanidine có màu đỏ, tím, xanh dương tạo màu cho nhiều loại hoa và trái. 1.2.3.2. Vai trò Quercetin ở môi trường kiềm thì có tác dụng kháng khuẩn kém nhưng ở môi trường acid thì có tác dụng rất rõ với vi khuẩn tụ cầu vàng, vi khuẩn tụ cầu trắng samonella oranienbur có tác dụng kháng nấm thực vật. Một số hợp chất thuộc loại isoflavonoid như rotenon ( trích từ cây thuốc cá Derris elliptica Benth, họ Đậu ) có tính độc đối với cá và côn trùng nhưng không độc với các động vật hữu nhũ. Cũng có những hợp chất có tính diệt côn trùng như hợp chất pyrethrin ( trích thừ cây trừ trùng Chrysanthemum cinerariaefolium, họ Cúc ). 1.2.4. Saponin 1.2.4.1. Khái niệm Saponin còn gọi là saponosid do chữ la tinh Sapo = xà phòng (vì nó tạo bọt như xà phòng), là một nhóm glycosid phân bố khá rộng rộng trong thực vật, có một số tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt; làm vỡ hồng cầu còn gọi là tính phá huyết. Saponin thường 12
Đồ án tốt nghiệp ở dạng vô định hình, có vị đắng. Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy thường cao từ 200oC trở lên và có thể trên 300oC. Saponin có thể bị tủa bởi acetat chì, hydroxit barium, sulfat amonium nên có thể lợi dụng tính chất này để cô lập saponin. 1.2.4.2. Vai trò Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho. Một số dược liệu chứa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch môn, Saponin làm tăng sự thấm của tế bào; sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hoà tan và hấp thu Nhiều saponin steroid là nguyên liệu đầu để tổng hợp các chất hormon steroid có hoạt tính cao. Nhiều loại saponin có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn. Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm. Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể). Sapogenin steroid dùng làm nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc steroid. 1.2.5. Tannin 1.2.5.1. Khái niệm Tannin là nhóm hợp chất polyphenol phân bố rộng rãi trong thực vật. Người ta gặp tannin hằng ngày trong cuộc sống ( trà, rượu vang đỏ, trong nhiều loại trái cây, đặc biệt là trong vỏ trái măng cục ). Các tannin có trọng lượng phân tử khoảng 500 – 3000. Các tannin do mang nhiều nhóm –OH nên ít nhiều (tùy theo trọng lượng phân tử của chúng) hòa tan trong nước tạo nên dung dịch nhớt. (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 1.2.5.2. Phân loại Tannin được phân thành hai nhóm chính là “tannin thủy giải được” và “tannin hóa đặc” tùy theo việc tannin có hoặc không bị thủy giải bởi men hoặc dung dịch acid. Tannin hóa đặc là sự polymer của một vài flavanol thí dụ như catechol hoặc epicatechol. Loại này khác với tannin thủy giải được vì nó không được thủy giải dưới tác dụng của acid vô cơ loãng. 13
Đồ án tốt nghiệp Tannin thủy giải được có cấu trúc hóa học là ester của glcose với acid galic. Người ta cũng chia tannin loại này ra là tannin galic và tannin ellagic. 1.2.5.3. Vai trò Ở trong cây, tannin tham gia vào quá trình trao đổi chất, các quá trình oxy hoá khử. Là những chất đa phenol, tannin có tính kháng khuẩn nên có vai trò bảo vệ cho cây. Dung dịch tannin kết hợp với protein, tạo thành màng trên niêm mạc nên ứng dụng làm thuốc săn da. Tannin còn có tác dụng kháng khuẩn nên dùng làm thuốc súc miệng khi niêm mạc miệng, họng bị viêm loét, hoặc chỗ loét khi nằm lâu. Tannin có thể dùng trong để chữa viêm ruột, chữa tiêu chảy. Tannin kết tủa với kim loại nặng và với alcaloid nên dùng chữa ngộ độc đường tiêu hoá. Tannin có tác dụng làm đông máu nên dùng đắp lên vết thương để cầm máu, chữa trĩ, rò hậu môn. 1.2.6. Hợp chất glycoside Các glycosid hiện diện trong rất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ phận của cây : lá, vỏ, hạt Các glycosid thường là chất kết tinh và có vị đắng. Glycosid là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm có hai phần : phần đường và phần không đường được gọi là aglycon. Dưới tác dụng của enzyme thực vật hoặc dung dịch acid hoặc kiềm, glycosid bị thủy phân thành aglycon và phần đường. Phần đường của glycosid : phần đường phổ biến là D-glucose, D-galactose, L- arabinose, L-rhamnose, D-xylose, acid glucuronic, acid galacturonic và một số đường khác. Phần aglycon của glycosid : phần aglycon rất đa dạng và gồm tất cả các loại hợp chất tự nhiên như : monoterpen, sesquiterpen, diterpen, triterpen, steroid, iriđoi, flavonoid, alcaloid, quinonoid, polyphenol 14
Đồ án tốt nghiệp 1.2.7. Hợp chất phenolic 1.2.7.1. Khái niệm Đây là nhóm hợp chất lớn trong các nhóm hợp chất thứ cấp ở thực vật, Các nhà khoa học đã phát hiện ra hơn 8,000 hợp chất phenol tự nhiên, Đặc biệt trong cấu trúc của nhóm này trong phân tử có vòng 6C (vòng benzen) gắn trực tiếp một hay nhiều nhóm hydroxyl (OH). Vì vậy, chúng là những alcol bậc 4 và được đặc trưng bởi tính acid yếu. 1.2.7.2. Phân loại Dựa vào thành phần chính và cấu trúc phenol, người ta chia chúng thành 3 nhóm là phenol đơn giản, phenol phức tạp và nhóm polyphenol, Phân loại này dựa trên bộ khung carbon của các hợp chất trong đó là C6 là nhóm phenyl, C1 là nhóm methyl, C2 là nhóm acetyl, C3 là nhóm thế có 3 carbon, C4 là nhóm thế có 4 carbon C6 (phenol đơn giản, benzoquinone), C6-C1 (acid phenolic), C6-C2 (acetophenone, phenylacetic acid), C6-C3 (acid hydroxycinnamic, coumarin, phenylpropene, chromone), C6-C4 (naphthoquinone), C6-C1-C6 (xanthone), C6-C2- C6 (stilbene, anthraquinone), C6-C3-C6 (flavonoid, isoflavonoid), (C6-C1)2 (tannin thủy phân), (C6-C3)2(lignan, neolignan), (C6- C3-C6)2 (biflavonoid), (C6-C3)n (lignin), (C6)n (catechol melanin), (C6-C3-C6)n (tannin ngưng tụ). Nhóm hợp chất polyphenol là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chất phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc sự trung hợp của các đơn phân. Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng. 1.2.7.3. Vai trò Thực vật tổng hợp rất nhiều các chất thứ sinh so với động vật vì chúng không thể lẫn trốn được kẻ thù mà phải dựa vào hệ thống phòng thủ hóa học này. Nhìn chung vai trò bảo vệ của các hợp chất phenol dựa trên đặc tính kháng khuẩn, kháng dinh dưỡng của chúng. 15
Đồ án tốt nghiệp Các phenol còn có vai trò then chốt trong hình thành các sắc tố của hoa như đỏ, xanh, tím Đặc tính chống oxyl hóa (antioxidant) hay tạo phức với kim loại; tạo ra các tín hiệu thông tin giữ phần ở trên cũng như dưới mặt đất, giữa các cây khác với sinh vật khác; phenol còn là các tác nhân che chắn tia tử ngoại (UV) từ mặt trời. Khả năng che chắn tia UV giúp cho thực vật có thể chuyển từ sống dưới nước lên cạn hoàn toàn. Các nghiên cứu còn cho thấy trao đổi hợp chất phenol không chỉ là bảo vệ chống lại các yếu tố sinh học, vô sinh mà còn có tham gia quá trình điều hòa ở cấp độ phân tử giúp cây sinh trưởng và phát triển bình thường. Các flavonoid như flavonol và anthoxyane có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự phân bố năng lượng ánh sáng ở lá cây, làm tăng hiệu quả quang hợp, Một số hợp chất polyphenol tham gia tạo màu sắc tự nhiên của hoa, quả, hấp dẫn côn trùng thụ phấn cho hoa. 1.3. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật 1.3.1. Khái niệm Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thường rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010). 16
Đồ án tốt nghiệp 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn Cao chiết từ các loại thực vật có thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi khuẩn ở các mức độ khác nhau như sự can thiệp vào các lớp đôi phospholipid của màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá hủy các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lượng tế bào, tổng hợp các thành phần cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền. Nói chung, cơ chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên có liên quan đến sự rối loạn, phá vỡ màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động của proton (PMF), dòng điện tử, sự vận chuyển tích cực, và đông tụ các thành phần của tế bào (Kotzekidou và ctv, 2008). 1.4. Tổng quan về vi khuẩn đường ruột 1.4.1. Định nghĩa Họ vi khuẩn đường ruột (Enterbacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, không có men oxidase, lên men đường glucose có kèm theo sinh hơi hoặc không, khử nitrat thành nitrit, có thể di động hoặc không nhưng nếu di động thì sẽ có tiên mao, không sinh bào tử. 1.4.2. Đặc điểm hình thái Tất cả các vi khuẩn thuộc học này đều là vi khuẩn Gram âm. Kích thước trung bình từ 2 – 4 µm x 0,4 – 0,6 µm. Một số loài hình dạng không ổn định, có thể xuất hiện dạng sợi. Những vi khuẩn di động thì có tiên mao phân bố khắp xung quanh tế bào. Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không sinh bào tử. Một số có vỏ, có thể quan sát được bằng kính hiển vi thông thường. 1.4.3. Tính chất nuôi cấy Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có thể mọc trên môi trường nuôi cấy thông thường. Trong môi trường lỏng, vi khuẩn làm đục đều môi trường sau 12 - 18h nuôi cấy, một số có thể phát triển thành váng trên mặt và lắng cặn dưới đáy ống, 17
Đồ án tốt nghiệp nhưng cũng có thể vừa làm đục môi trường vừa có cặn ở dưới đáy. Trên môi trường đặc có ba dạng khuẩn lạc: Dạng S: Khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng. Dạng R: Mặt khuẩn lạc khô, xù xì. Thường gặp khi nuôi cấy giữ chủng. Dạng M: Hình thức này thường gặp ở những vi khuẩn có khả năng hình thành vỏ. Khuẩn lạc nhầy, kích thước lớn hơn khuẩn lạc dạng S và các khuẩn lạc có xu hướng hòa vào nhau. 1.4.4. Đặc điểm sinh hóa Những đặc tính sau đây thường được xác định khi nghiên cứu vi khuẩn đường ruột: Di động hoặc không di động. Lên men hoặc không lên men một số loại đường. Hai loại đường thường được xác định nhất là glucose và lactose. Sinh hơi hay không sinh hơi khi lên men đường. Có hay không có một số enzyme. Hai enzyme thường được xác định nhất là urease và tryptophanase. Khả năng sinh ra sunfua hydro (H2S) khi dị hóa protein, acid amin hoặc các dẫn chất có lưu huỳnh. Phát triển được hay không phát triển được trên một số môi trường tổng hợp. Ví dụ: khả năng sử dụng citrat như nguồn cacbon duy nhất có trong môi trường Simmons. 1.4.5. Sức đề kháng Vì không có khả năng hình thành bào tử nên các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không có sức đề kháng cao với những điều kiện hóa lý đặc biệt của môi trường. Chúng dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ sôi 100OC và bởi các hóa chất sát khuẩn kháng nguyên K, hiện tượng ngưng kết O có thể bị cho lấp bởi kháng nguyên này. Kháng nguyên O có tính đặc hiệu cao, nó thường được dùng để phân loại vi khuẩn. Dựa thông thường. Tuy nhiên nhiều loài vi khuẩn đường ruột có khả năng sống nhiều 18
Đồ án tốt nghiệp ngày đến nhiều tuần, thậm chí một vài tháng ngoài môi trường. Đây là điều kiện thuận lợi để các vi khuẩn gây bệnh lan truyền. 1.4.6. Độc tố Hầu hết các vi khuẩn đường ruột đều có độc tố. bản chất hóa học của nội độc tố là lipoposaccharid (LPS) của vách tế bào. Nội độc tố chỉ được giải phóng khi tế bào bị ly giải. Nội độc tố có khối lượng phân tử từ 100 đến 500 KDa. Nội độc tố có tính rất độc chỉ cần 0,005 mg nội độc tố đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ. Nội độc tố có thể gây ra tình trạng sốc, nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến đến tử vong. Nội độc tố không bị mất tính độc ở 100OC trong 30 phút. Nội độc tố là chất có khả năng gây sốc. Một số thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh ngoại độc tố như Shigella, E.Coli loại enterotoxigenic e.coli (ETEC ). Ngoại độc tố của Shigella làm cho bệnh lỵ nặng hơn rất nhiều, ngoại độc tố LT (Labile Toxin) của ETEC là yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn này. 1.4.7. Cấu trúc kháng nguyên Họ vi khuẩn đường ruột có ba nhóm kháng nguyên cơ bản: kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên K. Kháng nguyên O: Là kháng nguyên than của vi khuẩn. Đây là thành phần kháng nguyên của vách tế bào. Là một phức hợp protein, poliozid và lipid, trong dó protein làm cho phức hợp có tính kháng nguyên, poliozid quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên còn lipid quyết định tính độc. Không bị phá hủy ở 100OC trong hai giờ hoặc trong cồn 50% nhưng bị mất tính kháng nguyên khi bị xử lý bằng formol 0,5%. Ở những vi khuẩn không có vỏ hoặc màng bọc (không có kháng nguyên K) thì kháng nguyên O nằm ở lớp ngoài cùng. Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết, gọi là “hiện tượng ngưng kết O” với các hạt ngưng kết nhỏ, lắc khó tan. Ở những vi khuẩn có vào kháng nguyên O người ta có thể chia một vài loài vi khuẩn thành type huyết thanh. 19
Đồ án tốt nghiệp Kháng nguyên H: là kháng nguyên lông của tế bào vi khuẩn, chỉ có ở những vi khuẩn có lông. Có bản chất là protein, dễ bị phá hủy ở 100OC hoặc trong cồn 50% nhưng không bị phân hủy trong formol 0,5%. Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tương ưngsẽ xảy ra “hiện tượng ngưng kết H” với các hạt to hơn trong hiện tượng ngưng kết O và rất dễ tan khi lắc. Những vi khuẩn có khả năng di động khi tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thành không di động. Kháng nguyên O và kháng nguyên H có thể được sản xuất riêng để phát hiện riêng biệt các kháng thể tương ứng. Để có kháng nguyên O, người ta cho vi khuẩn này vào cồn 50%, kháng nguyên H sẽ bị phá hủy, kháng nguyên O vẫn tồn tại. Để có kháng nguyên H người ta cho vi khuẩn bào formol 0,5% thì kháng nguyên O bị phá hủy, kháng nguyên H vẫn còn nguyên vẹn. Kháng nguyên K: là kháng nguyên vỏ hoặc bề mặt, kháng nguyên K nằm bên ngoài kháng nguyên thân. Nó có thể dưới dạng một lớp vỏ dày, quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường (như ở Klebsiella) hoặc dưới dạng một lớp rất mỏng chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử (như ở S.Typhii). Kháng nguyên K nếu chi phủ hoàn toàn kháng nguyên O sẽ ngăn cách không cho kháng thể O gắn với kháng nguyên O làm cho phản ứng ngưng kết không xảy ra. Trong trường hợp này cần phải phá hủy kháng nguyên K hoặc vi khuẩn phải được nuối cấy trong điều kiện không sinh ra được kháng nguyên này. 1.4.8. Khả năng gây bệnh Nói về khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đường ruột, trước hết phải đề cập đến các nhiễm khuẩn đường tiêu hóa. Họ vi khuẩn đường ruột đứng đầu trong các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy. Cơ chế gây bệnh, vị trí gây tổn thương ở bộ máy tiêu hóa rất khác nhau tùy theo từng giống, từng loài. Ngoài đường tiêu hóa, các vi khuẩn đường ruột còn có khả năng gây bệnh ở nhiều cơ quan khác như tiết niệu, thần kinh, hô hấp Các thành viên của họ này đứng đầu trong các vi khuẩn gây viêm đường tiết niệu, bỏ xa các vi khuẩn khác. Chúng cũng 20
Đồ án tốt nghiệp đứng đầu trong các vi khuẩn gây nhiễm trùng máu. Có thể nói khái quát ở bất kỳ bệnh phẩm nào cũng có thể gặp thành viên của họ vi khuẩn đường ruột. 21
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh thuộc Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.1.2. Thời gian Từ tháng 03/2017 đến tháng 07/2017. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Hoa Sứ trắng (Plumeria rubra L. var. acutifolia (Poir.) Bailey) 2.2.2. Địa điểm thu mẫu Mẫu được thu tại nghĩa trang phường 8, quận Gò Vấp. 2.2.3. Vật liệu nghiên cứu Các chủng vi sinh vật sử dụng trong quá trình nghiên cứu được cung cấp bởi ThS. Phạm Minh Nhựt giảng viên trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh bao gồm các chủng: Nhóm vi khuẩn Escherichia Coli gồm: E. coli, ETEC, E. coli 0208, E. Coli O157:H7. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. gồm: S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium, S. dublin. Nhóm vi khuẩn Shigella spp. gồm: S. sonnei, S. boydii, S. flexneri. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. gồm: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi, V.cholerae. Nhóm vi khuẩn Listeria spp. gồm: L. monocytogenes, L. innocua. Các vi khuẩn gây bệnh khác bao gồm: E. feacalis, S. aureus,P. aeruginosa. 22
Đồ án tốt nghiệp 23
Đồ án tốt nghiệp 2.2.4. Thiết bị và dụng cụ 2.2.4.1. Thiết bị Tủ sấy Tủ lạnh Máy lọc chân không Bếp từ Tủ ủ Tủ hấp autoclave Bể đều nhiệt Máy lắc 2.2.4.2. Dụng cụ Pipette pasteur Cốc thủy tinh 1000ml Ống nghiệm Cốc thủy tinh 100ml Phễu lọc Đĩa nhựa Giấy lọc Eppendoff Cân phân tích Que trang Kẹp ống nghiệm Dao cấy Micropipette loại 10 – 100 µl Ống trụ kim loại rỗng (d = 6 mm) Micropipette loại 100 – 1000 µl Đèn cồn Đầu tipe Bông không thấm Bình môi trường 500 ml Bông thấm Chai môi trường 100 ml Parafilm 2.2.5. Hóa chất, dung môi Môi trường nuôi cấy và tăng sinh Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ). Môi trường TSA (Trypton Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ). Dung môi: ethanol 96%, ethanol 70%, ethanol 50%, Dimethylsulfoxid (DMSO), nước cất (Việt Nam). 24
Đồ án tốt nghiệp Hóa chất Ciprofloxacin 500 mg (Thái Lan). H2SO4 đậm đặc, H2SO4 loãng, HCl đậm đặc, chloroform, NaCl. Na nitro prusside, pyridine, ninhydrin, ammonia, gelatin 1%, glycerol. Acid acetic glacial, acetic anhydride, benzene, bột Magnesium. NaOH 10%, Ferric chloride (FeCl3) 10%, lead acetate (Pb(C2H3O2) 10%. Thuốc thử: Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendorff, Hager, Wagner. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu Tiến hành thu những mẫu Hoa Sứ trắng nở hoàn toàn, không héo. Sau đó, rửa sạch, để ráo rồi sấy khô đến trọng lượng không đổi và xay mẫu. Mẫu sau khi được xay thành bột được bảo quản trong các túi nhựa ở nhiệt độ 4oC để tiến hành tách chiết cao. 2.3.2 Phương pháp tách chiết cao từ thực vật Tách chiết là dùng dung môi thích hợp có khả năng hòa tan các hợp chất trong cây bằng phương pháp chiết ngâm và lắc để phá vỡ mẫu ở nhiệt độ thường. Sau đó thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lượng dung môi của dịch chiết bằng các thiết bị cô thích hợp. Nguyên tắc: Sử dụng các loại dung môi theo thể tích nhất định để tách chiết các hợp chất có trong cây nhờ lực liên kết hóa học từ đó ta có thể lôi kéo các chất cần thiết ra khỏi mẫu cây. Cách tiến hành: Mẫu hoa Sứ được ngâm trong dung môi theo tỷ lệ 1:20 để ở nhiệt độ phòng. Mẫu được lắc ở 150 vòng/phút trong khoảng 18 – 24 giờ. Sau đó đem đi lọc để thu dịch chiết. Tiếp tục lặp lại 3 lần cho đến khi dịch lọc trong suốt. Tiến hành cô cách thủy ở 70oC để loại bỏ dung môi và thu cao. Cao chiết thu được sẽ được bảo quản ở - 4oC để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. 25
Đồ án tốt nghiệp 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.3.1. Phương pháp cấy chuyển vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 5oC) để bảo quản. Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển một lần. Cách tiến hành: Giống vi sinh vật thuần khiết, được bảo quản trong ống thạch nghiêng và giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC. Sau 1 - 3 tháng phải cấy truyền vi sinh vật qua ống thạch nghiêng mới bằng cách dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi sinh vật trong ống thạch nghiêng cũ ria vào ống thạch nghiêng mới, sau đó đem ống thạch nghiêng mới đi ủ, tùy từng loại vi sinh vật mà quyết định nhiệt độ ủ, nhiệt độ ủ dao động từ 48 – 72 giờ. Ống thạch nghiêng chứa vi sinh vật sau khi ủ xong được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC. (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol. Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -15oC (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 26
Đồ án tốt nghiệp 2.3.4. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường. Cách tiến hành: Môi trường TSB được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút ở 1 atm. Tiến hành hút 100µl dịch vi khuẩn khảo sát vào 20ml môi trường TSB trong đều kiện vô trùng. Sau đó tiến hành lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên sẽ làm đục môi trường. Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng 600nm. Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland): 9 Mật độ = OD600nm x 1,02 x 10 (cfu/ml) 2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật. Phương pháp pha loãng mẫu chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu. Cách tiến hành: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần thiết. (Phạm Minh Nhựt, 2013). 27
Đồ án tốt nghiệp 2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Nguyên tắc: Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Từ đó, xác định được hoạt tính kháng khuẩn của cao thuốc bằng đường kính vòng ức chế (mm). Cách thực hiện: Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa ở mật độ 10-6 vào đĩa chứa môi trường TSA và tiến hành trang đều vi khuẩn lên đĩa cho đến khi khô hoàn toàn. Sau đó đục lỗ thạch để tạo giếng với đường kính 6 mm. Chuẩn bị dịch cao chiết bằng cách hòa tan lượng cao chiết trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO)1% theo nồng độ khảo sát. Bổ sung 100 µl dịch cao chiết vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để dịch cao được khuyếch tán đều vào môi trường thạch và dùng paraflim quấn xung quanh đĩa. Sau đó, ủ các đĩa vào tủ ấm 37oC trong 24 giờ và tiến hành đọc kết bằng cách đo giá trị đường kính vòng ức chế (mm) trên đĩa thạch. (Ramakrishnan, 2011). 2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết từ cây Sứ trắng bằng các phản ứng với thuốc thử đặc trưng dựa trên tính chất hóa học của chúng theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã được chuẩn hoá để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất. Cách tiến hành: Cao chiết được đem ngâm trong dung môi thích hợp, tiến hành lọc và thu dịch lọc. Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng. 2.3.7.1. Định tính carbohydrate Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho 5 - 6 giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ từ từ 2 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào 28
Đồ án tốt nghiệp và đọc kết quả. Kết quả được xem là dương tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ - tím. Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào. Đun cách thủy 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi có xuất hiện tủa màu đỏ của Cu2O. Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Barfoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, sau đó làm lạnh ngay và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu đỏ gạch. 2.3.7.2. Định tính alkaloid Thử nghiệm Mayer: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi quan sát được kết tủa màu trắng đục tạo thành. Thử nghiệm Dragendorff: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng cam. Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml thuốc thử Hager và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng. Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và bổ sung 2 ml thuốc thử Wagner vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi hình thành kết tủa màu nâu đỏ 2.3.7.3. Định tính saponin Thử nghiệm tạo bọt: Hút 5 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó lắc mạnh và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm có xuất hiện bọt và ổn định 2.3.7.4. Định tính cardiac glycoside Thử nghiệm Legal: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml pyridine và 1 ml Na nitro prusside, sau đó bổ sung 5 - 6 giọt NaOH 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu đỏ đậm. 29
Đồ án tốt nghiệp Thử nghiệm Keller Killiani: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml acid acetic glacial và 1 ml dung dịch FeCl3, cho từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic. 2.3.7.5. Định tính flavonoid Thử nghiệm Alkaline: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng, thêm vài giọt HCl loãng vào thấy ống nghiệm về màu cao ban đầu chứng tỏ có sự hiện diện của Flavonoid (mẫu đối chứng làm tương tự, thay NaOH 10% thành nước cất). Kết quả dương tính nếu xuất hiện màu vàng đậm khi bổ sung NaOH và trở về màu cao ban đầu khi bổ sung HCl. Có thực hiện ống đối chứng dương thay NaOH thành nước cất. Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu xanh hoặc tím. 2.3.7.6. Định tính các hợp chất phenol Thử nghiệm lead acetate: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, rồi cho vào 1.5 ml lead acetate 10% sau đó đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng trong ống nghiệm. Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt galatin 1% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng. 2.3.7.7. Định tính tannin Thử nghiệm ferric chloride: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện tủa màu xanh, xanh – đen. Thử nghiệm lead acetate: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử chì acetate vàovà đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu vàng. 30
Đồ án tốt nghiệp 2.3.7.8. Định tính steroid Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp và đọc kết quả ở mặt phân cách. Kết quả xác định được chia thành 2 trường hợp: ở lớp dưới xuất hiện màu đỏ là sterol, xuất hiện màu vàng là triterpenoid. Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm thêm 2 ml acid anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh. Sau đó nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm rồi đọc kết quả. Kết quả xác định được chia thành 2 trường hợp: nếu xuất hiện vòng màu đỏ ở mặt phân cách là steroid. Nếu hình thành màu nâu đỏ đậm là triterpenoid. 2.3.7.9. Định tính amino acid Thử nghiệm Ninhydrin: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin, đun sôi cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi thấy xuất hiện màu tím. 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và Statistical Analysis System 9.4 (SAS). Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0,01 của các giá trị được biểu hiện bằng các mẫu tự khác nhau. 31
Đồ án tốt nghiệp 2.4. Bố trí thí nghiệm Mẫu Hoa Sứ trắng Xử lý mẫu Tách chiết cao bằng các dung môi khác nhau Đánh giá hàm lượng thu Đánh giá hoạt tính Định tính một số hồi của các loại cao chiết kháng khuẩn thành phần hóa học Đánh giá kết quả Hình 2.1. Sơ đồ bố trí nghiệm tổng quát 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng. Thuyết minh quy trình: Mẫu Hoa Sứ trắng sau khi thu được rửa sạch và sấy khô ở 40oC. Sau đó, xay nhuyễn thành bột. Tiến hành cân 40 g bột Hoa Sứ trắng và ngâm trong 800 ml các loại dung môi khảo sát (tỉ lệ 1 : 20 (w/v)) ở nhiệt độ phòng. Đối với dung môi nước cất: mẫu được ngâm với nước cất (tỷ lệ 1 : 20 (w/v)) chứa trong erlen thủy tinh. Cứ mỗi 4 giờ, tiến hành lọc chân không thu nhận dịch chiết, phần bã tiếp tục được ngâm và lọc theo cách như trên. Thu tất cả dịch lọc và cô cách thủy ở 70oC để thu nhận cao. Đối với dung môi ethanol: ngâm mẫu với ethanol (tỷ lệ 1 : 20 (w/v)) ở các nồng độ 50%, 70%, 96% trong erlen thủy tinh đậy kín để tránh hiện tượng bay hơi trong 24 giờ. Sau đó, tiến hành lọc chân không mẫu thu nhận dịch chiết, phần bã tiếp tục được ngâm, lọc với lượng dung môi như lần đầu cho đến khi dịch chiết có màu nhạt 32
Đồ án tốt nghiệp dần. Thu tất cả dịch lọc, sau đó tiến hành loại bỏ dung môi bằng phương pháp cô cách thủy ở 70oC để thu nhận cao chiết. Mẫu Hoa Sứ trắng Xử lý mẫu Ngâm dung môi (1:20) (w/v) trong 24 giờ Lọc tinh Bã Cô cách thủy 70oC Cao chiết Đánh giá hàm lượng thu hồi Hình 2.2. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng Tiến hành đánh giá hàm lượng thu hồi cao ở mỗi nghiệm thức bằng công thức: − H (%) = 1 0 x 100 m Trong đó: H: hàm lượng cao thu được (%) m1: khối lượng cốc sau khi cô mẫu (g) m0: khối lượng cốc ban đầu (g) m: khối lượng mẫu ban đầu dùng để ngâm với dung môi (g) 33
Đồ án tốt nghiệp Sau khi xác định hàm lượng thu hồi các loại cao thu hồi được bảo quản ở nhiệt độ 4oC trong tủ lạnh để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Mỗi nghiệm thức trong thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần. 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết khác nhau từ Hoa Sứ trắng Sau khi thu được cao chiết từ các loại dung môi khác nhau, tiến hành quy trình khảo sát hoạt tính. Vi sinh vật chỉ thị Tăng sinh trong môi trường TSB Lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ Đo OD600nm Pha loãng về 106 cfu/ml PrAEE Cấy trang trên môi trường TSA DMSO Đục lỗ (d = 6 mm) Nồng độ 200 Hút 100 µl mg/ml Ủ 37oC trong 24 giờ Đo đường kính vòng kháng Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao PrAEE 34
Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình: Trong thí nghiệm này, tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Hoa Sứ trắng bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai thủy tinh chứa 20 ml môi trường TSB (riêng đối với các chủng Vibrio spp. thì bổ sung thêm 1,5% NaCl). Sau đó, chai được lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 18 - 24 giờ. Tiến hành đo OD ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào, sau đó dịch vi khuẩn được pha loãng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106 cfu/ml. Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã được pha cho vào đĩa thạch TSA và trang đều. Dùng ống trụ kim loại có đường kính d = 6 mm, đục 6 giếng trên bề mặt đĩa thạch. PrAEE được hòa tan trong DMSO 1% ở nồng độ 200 mg/ml. Hút 100 μl dịch cao chiết cho vào các giếng trong đĩa môi trường TSA. Các đĩa thạch được để yên trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng để dịch cao chiết từ các giếng khuếch tán vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn, sau đó đem ủ ở 37oC trong vòng 24 giờ và đọc kết quả. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. 2.4.3 Thí nghiệm 3: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ trắng Dựa vào quy trình Hình 2.8 có thể chia cao chiết Hoa Sứ trắng làm 2 phần Phần thứ nhất: Cao chiết Hoa Sứ trắng được hòa tan trong dung dịch H2SO4 10% trong khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc và thu phần dịch trong để tiến hành định tính alkaloid. Phần thứ hai: Cao Hoa Sứ trắng được hòa tan trong dung dịch DMSO 1% cho tan hoàn toàn, sau đó tiến hành pha loãng và lọc dung dịch qua giấy lọc để thu dịch trong. Dịch này đem phân tích, định tính một số thành phần hóa học như carbohydrate, saponin, flavonoid, amino acid, steroid, phenolic, tannin, cardiac glycoside. 35
Đồ án tốt nghiệp Cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ trắng Hòa tan trong dung Hòa tan trong dung dịch H2SO4 10% dịch DMSO 1% Lọc Lọc Dịch trong Dịch trong Định tính thành phần Định tính thành phần hóa học hóa học Alkaloid Cardiac Hợp chất glycoside Phenolic Carbohydrate Saponin Flavonoid Tannin Steroid Amino nn acid Hình 2.4. Định tính một số thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ trắng a) Định tính thành phần carbohydrat - Thử nghiệm Molisch - Thử nghiệm Fehling - Thử nghiệm Barfoed b) Định tính thành phần saponin 36
Đồ án tốt nghiệp - Thử nghiệm Foam (tạo bọt) c) Định tính thành phần alkaloid - Thử nghiệm Mayer - Thử nghiệm Dragendorff - Thử nghiệm Hager - Thử nghiệm Wagner d) Định tính thành phần cardiac glycoside - Thử nghiệm Legal - Thử nghiệm Keller Killiani e) Định tính thành phần flavonoid - Thử nghiệm Alkaline - Thử nghiệm Ferric chloride f) Định tính hợp chất phenolic - Thử nghiệm Lead acetate - Thử nghiệm Gelatin g) Định tính thành phần tannin - Thử nghiệm Ferric chloride - Thử nghiệm Lead acetate h) Định tính thành phần steroid - Thử nghiệm Salkowski - Thử nghiệm Libermann Burchard i) Định tính thành phần amino acid - Thử nghiệm Ninhydrin 37
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng Mẫu Hoa Sứ trắng sau khi ngâm trong các loại dung môi khảo sát (nước, ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 96%) được lọc, thu dịch và cô dịch lọc ở 70oC. Kết quả đánh giá hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ trắng từ các dung môi được trình bày trong hình 3.1 Hình 3.1. Hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ trắng với các dung môi khác nhau Dựa vào Hình 3.1 nhận thấy rằng các dung môi tách chiết khác nhau có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ trắng. Tuy cùng quy trình tách chiết nhưng hàm lượng thu hồi cao của các loại dung môi từ Hoa Sứ trắng không giống nhau và có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p > 0,01). Mẫu Hoa Sứ trắng được tách chiết bằng dung môi nước cho hàm lượng thu hồi cao cao nhất trong 4 loại dung môi khảo sát với hàm lượng trung bình là 36,27%. Kế đến là dung môi ethanol 50% và 70% với hàm lượng trung bình lần lượt là 33,63% và 26,97%. Cuối cùng hàm lượng thu hồi cao thấp nhất là của dung môi ethanol 96% là 18,10%. 38
Đồ án tốt nghiệp Trong nghiên cứu này, việc sử dụng các dung môi tách chiết đều là dung môi phân cực vì các dung môi phân cực có thể lôi kéo tốt các hợp chất kháng khuẩn có trong thực vật như flavonoid, alkaloid, glycoside, saponin, tannin, (Ngô Văn Thu, 2011). Sở dĩ chọn dung môi phân cực để tách chiết vì các loại dung môi này có thể bốc hơi nhanh trong quá trình cô mẫu. Ngoài ra nó cũng phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, giúp tiết kiệm cũng như sẽ an toàn hơn so với các dung môi không phân cực. Theo các nghiên cứu liên quan đến việc khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cây thuốc thì phần lớn các tác giả đều sử dụng dung môi EtOH 70% để tiến hành tách chiết cao vì EtOH 70% có khả năng tách chiết rất nhiều chất có hoạt tính kháng khuẩn ra khỏi thực vật (Wendakoon và ctv, 2012). Với hàm lượng thu hồi của 4 loại dung môi khác nhau từ Hoa Sứ trắng thì nước là dung môi cho hàm lượng cao nhất nhưng chưa thể khẳng định rằng nước là dung môi có hoạt tính sinh học mạnh nhất đối với cao chiết từ Hoa Sứ trắng. Do đó, cần phải đánh giá các hoạt tính sinh học mới có thể kết luận được dung môi tốt nhất cho quá trình tách chiết cao. 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng Với mục tiêu nghiên cứu là chọn ra dung môi thích hợp để tách chiết cao có hoạt tính sinh học cao nhất từ mẫu Hoa Sứ trắng nên chúng tôi tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ trắng từ 4 loại dung môi tách chiết khác nhau đối với các chủng vi sinh vật chỉ thị. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với 20 chủng vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch được trình bày ở các Hình 3.2, Hình 3.4, Hình 3.6, Hình 3.8, Hình 3.10, Hình 3.12, Bảng 3.1 và Bảng 3.2. 3.2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 39
Đồ án tốt nghiệp Tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết thu được trên nhóm vi khuẩn Escherichia coli gồm 4 chủng: E. Coli, ETEC, E. coli 0208 và E. coli O157:H7. Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn E. Coli thể hiện trên Hình 3.2. Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli A B Hình 3.3. A. Vòng ức chế E.coli của cao chiết EtOH 70%; B. Vòng ức chế E.0208 của cao chiết EtOH 96% 40
Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả thí nghiệm trên Hình 3.2 nhận thấy rằng các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đều thể hiện hoạt tính kháng nhóm Escherichia coli ngoại trừ cao chiết nước. Đối với cao chiết EtOH 96% ở nồng độ 100 mg/ml và 200 mg/ml ức chế được 4/4 chủng trong nhóm vi khuẩn Escherichia coli với đường kính trung bình từ 8,83 mm đến 11,33 mm. Ở nồng độ 200 mg/ml thì cao chiết EtOH 96% có hoạt lực mạnh nhất đối với chủng E.coli với đường kính vòng ức chế 11,17 mm nhưng thấp hơn hoạt tính của kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml, cao chiết EtOH 96% thể hiện khả năng ức chế chủng E.0208 với đường kính vòng ức chế trung bình cao nhất là 9,83 mm. Trong khi đó, ở nồng độ 50 mg/ml cao chiết EtOH 96% chỉ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng E.coli và E.O157:H7 với đường kính vòng ức chế trung bình 8,33 mm và 8,83 mm. Đối với cao chiết EtOH 70% ở nồng độ 200 mg/ml ức chế được 4/4 chủng nhóm vi khuẩn Escherichia coli, cụ thể là trên chủng ETEC có đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất là 12 mm. Ở nồng độ 100 mg/ml có hoạt tính ức chế 2/4 chủng đó là chủng ETEC và E.0208 và có đường kính vòng ức chế trung bình lần lượt là 9,67 mm và 9,33 mm. Cao chiết EtOH 70% (50 mg/ml) không có hoạt tính ức chế đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli. Cao chiết EtOH 50% chỉ thể hiện hoạt tính ức chế đối với chủng ETEC ở nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml với đường kính vòng chế lần lượt là 10,50 mm và 9,33 mm. Từ kết quả phân tích trên cho thấy rằng trong 4 loại cao chiết khảo sát thì cao chiết EtOH 70% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất nhưng lại có phổ kháng khuẩn hẹp hơn cao chiết EtOH 96%. Theo kết quả nghiên cứu của Baghel (2010) về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EtOH từ lá của Plumeria rubra thì cao chiết này kháng được chủng vi khuẩn E.coli với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 16 mm cao hơn hoạt tính của cao chiết EtOH từ Hoa Sứ trắng nhưng lại sử dụng nồng độ khảo sát cao hơn (250 mg/ml). Mặt khác, khi so sánh với kết quả của Khalil (2012), hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Catharanthus roseus (dừa cạn) ở nồng độ 100 mg/ml ức chế được chủng 41
Đồ án tốt nghiệp E.coli với đường kính vòng kháng 11 mm cao hơn hoạt tính của cao chiết từ Hoa Sứ trắng ở nồng độ 100 mg/ml. Từ kết quả nghiên cứu của Kalpana và ctv (2013) về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá cây Moringa oleifera trên chủng vi khuẩn E.coli cho thấy cao chiết Moringa oleifera ức chế chủng E.coli với đường kính trung bình là 8,3 mm thấp hơn cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ trắng ở cùng nồng độ 200 mg/ml. 3.2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. Tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn của 4 loại cao chiết thu được trên nhóm vi khuẩn Listeria spp. gồm 2 chủng L. innocua và L. monocytogenes và kết quả khảo sát được trình bày ở Hình 3.4. Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. A B Hình 3.5. A. Vòng ức chế của L.innocua (EtOH 70%) B. Vòng ức chế của L.monocytogenes (EtOH 70%) 42
Đồ án tốt nghiệp Kết quả Hình 3.4 cho thấy cao chiết EtOH 70% và EtOH 96% ức chế được cả 2 chủng vi khuẩn nhóm Listeria spp. ở nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml. Và cùng nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml nhưng cao chiết nước chỉ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở chủng L.monocytogenes. Đối với cao chiết EtOH 50% thì không có khả năng ức chế được nhóm vi khuẩn Listeria spp Từ Hình 3.4 nhận thấy rằng cao chiết EtOH 96% ở nồng độ 200 mg/ml có hoạt tính ức chế mạnh nhất đối với chủng L.monocytogenes và có đường kính vòng ức chế trung bình 9,67 mm tương đương với đối chứng dương ciprofloxacin (0,5 mg/ml) (P > 0,01). Nhưng ở nồng độ 100 mg/ml, cao chiết EtOH 96% thể hiện đường kính vòng ức chế cao nhất đối với chủng L.innocua là 9,00 mm. Đối với cao chiết EtOH 70% ở nồng độ 200 mg/ml có hoạt tính ức chế tốt nhất trên chủng L.monocytogenes, L.innocua với đường kính vòng ức chế lần lượt là 13 mm và 10,83 mm tương đương với đối chứng dương ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về phương diện thống kê (P > 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml, cao EtOH 70% ức chế chủng L.monocytogenes và có đường kính vòng kháng cao nhất là 9,67 mm. Cao chiết nước chỉ có hoạt tính ức chế được chủng L.monocytogenes và không ức chế được chủng L.innocua. Ở nồng độ 200 mg/ml cao chiết nước có hoạt lực tương đương với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) và có đường kính vòng ức chế là 11,33 mm, theo như kết quả thống kê thì không có sự khác biệt (P > 0,01). Cao chiết nước ở nồng độ 100 mg/ml thể hiện hoạt tính ức chế trên chủng L.monocytogenes với đường kính vòng kháng là 9,17 mm. Như vậy, khi so sánh với các loại cao chiết thì cao EtOH 70% có hoạt lực mạnh nhất khi khảo sát trên nhóm vi khuẩn Listeria spp Điều này chứng tỏ nhóm vi khuẩn Listeria spp. khá nhạy cảm với cao chiết EtOH 70%, đặc biệt là đối với chủng L.monocytogenes. So với nghiên cứu của Rozman (2009) ở cây Rosmarinus offcinalis L. với nồng độ160 mg/ml có khả năng kháng khuẩn trên chủng L. monocytogenes với đường kính vòng kháng là 8 mm. Đối với cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ trắng ở nổng độ 100 43
Đồ án tốt nghiệp mg/ml có đường kính vòng kháng khuẩn là 9,67 mm cao hơn so với cây Rosmarinus offcinalis L. ở nồng độ 160 mg/ml. 3.2.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm Salmonella spp. Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. gồm 4 chủng : S.dublin, S.enteritidis, S.typhii, S.typhimurium được trình bày ở Hình 3.6. Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn salmonella spp. A B Hình 3.7. Vòng ức chế S.dublin của cao chiết EtOH 70% (A) và 96% (B) 44
Đồ án tốt nghiệp Qua kết quả Hình 3.6 cho thấy rằng các loại cao chiết khảo sát đều có hoạt tính ức chế đối với nhóm Salmonella spp., cụ thể là cao chiết EtOH 96% ức chế được 4/4 chủng ở nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml với đường kính vòng ức chế từ 8,50 mm đến 11,33 mm. Ở nồng độ 200 mg/ml, EtOH 96% có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất ở chủng S.typhii, tiếp đến là S.dublin và S.enteritidis với đường kính vòng ức chế trung bình từ 11 mm đến 11,33 mm tương đương với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) (P > 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml cao EtOH 96% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đối với chủng S.typhii là 10,67 mm. Ở nồng độ 50 mg/ml thì cao chiết EtOH 96% không có hoạt tính ức đối với nhóm vi khuẩn Salmonella. Đối với cao chiết EtOH 70% ở nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml ức chế được 3/4 chủng, ở nồng độ 50 mg/ml chỉ ức chế được 2/4 chủng vi khuẩn nhóm Salmonella spp Ở nồng độ 200 mg/ml hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất thể hiện ở chủng S.typhimurium với đường kính vòng ức chế 11,83 mm không có sự khác biệt với ciprofloxacin về mặt thống kê (P > 0,01). Cao chiết EtOH 70% (100 mg/ml) có hoạt tính ức chế cao nhất đối với chủng S.typhimurium với đường kính vòng ức chế 9,83 mm và ở nồng độ 50 mg/ml có đường kính vòng ức chế là 8,17 mm. Điều này chứng tỏ, ở nồng độ càng cao thì hoạt lực của cao EtOH 70% càng mạnh. Đối với cao chiết EtOH 50% (200 mg/ml) không có hoạt tính ức chế đối với chủng S.typhimurium nhưng lại ức chế được 3 chủng còn lại và đường kính vòng ức chế cao nhất là 12,33 mm đối với chủng S.dublin và tương đương với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml). Ở nồng độ 100 mg/ml, cao chiết EtOH 50% chỉ ức chế được chủng S.dublin, có đường kính vòng ức là 10,83 mm và không có sự khác biệt với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml). Đối với cao nước chỉ thể hiện khả năng kháng khuẩn đối với chủng S.enteritidis, ở nồng độ 200 mg/ml thì cho kết quả tương đương với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) (P > 0,01), ở nồng độ 100 mg/ml có đường kính vòng ức chế trung bình 8,67 mm thấp hơn so với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về mặt thống kê (P < 0,01). 45
Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả nghiên cứu của Muruganantham và ctv (2015) cho thấy rằng hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EtOH từ Plumeria rubra ở nồng độ 40 mg/ml có đường kính vòng ức chế đối với chủng S.typhii là 12 mm tương đương với kết quả thử nghiệm của cao chiết EtOH 96% từ Hoa Sứ trắng với đường kính vòng ức chế là 11,33 mm. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu của Nirosha (2013) cho thấy cao chiết ethanol từ lá Carica papaya L. có khả năng ức chế chủng vi khuẩn S.typhii ở nồng độ 250 mg/ml với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 12 mm thấp hơn hoạt tính của cao chiết EtOH 96% từ Hoa Sứ trắng ở nồng độ 200 mg/ml. 3.2.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. gồm 3 chủng: Shi.boydii, Shi.flexneri, Shi. Sonnei được trình bày ở Hình 3.8. Hình 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. 46
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.9. Vòng ức chế của S.boydii của cao chiết EtOH 96% (A) và cao chiết EtOH 50% (B) Dựa vào kết quả trên hình 3.8 nhận thấy rằng cao chiết EtOH 96% (200 mg/ml và 100 mg/ml) ức chế được 3/3 chủng vi khuẩn nhóm Shigella spp Ở nồng độ 200 mg/ml, cao chiết EtOH 96% có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất đối với chủng Shi.boydii với đường kính vòng ức chế trung bình 11 mm. Ở nồng độ 100 mg/ml có hoạt tính mạnh nhất đối với chủng Shi.flexneri và có đường kính vòng ức chế 10,17 mm thấp hơn so với kháng sinh ciprofloxacin về mặt thống kê (P 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml cao chiết EtOH 70% ức chế được chủng Shi.boydii với đường kính vòng kháng cao nhất là 10,17 mm và ở nồng độ 50 mg/ml cao chiết EtOH 70% ức chế với đường kính vòng ức chế cao nhất là 9,00 mm tương đương với chủng Shi.sonnei. Đối với cao chiết EtOH 50% chỉ ức chế được ở 47
Đồ án tốt nghiệp nồng độ 200 mg/ml và có hoạt tính cao nhất đối với chủng Shi.boydii với đường kính vòng ức chế trung bình 11 mm. Bên cạnh đó, cao chiết nước ức chế được chủng Shi.flexneri có đường kính vòng ức chế 12 mm tương đương với ciprofloxacin (0,5 mg/ml) (P > 0,01). Từ kết quả hình 3.8 nhận thấy rằng kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) không có hoạt tính ức chế được chủng vi khuẩn Shi.boydii (là chủng vi khuẩn gây bệnh lỵ khá nguy hiểm ở người). Nhưng chúng lại bị ức chế bởi cao chiết ethanol từ Hoa Sứ trắng ở nồng độ thấp nhất là 100 mg/ml. Điều này chứng tỏ chủng Shi.boydii nhạy cảm với cao chiết ethanol từ Hoa Sứ trắng. Qua kết quả phân tích trên có thể nhận thấy rằng cao chiết ethanol có hoạt lực mạnh hơn so với các loại cao chiết khảo sát khác, và có đường kính vòng kháng cao nhất là 12,50 mm. Từ kết quả nghiên cứu của Sangita (2013) cho thấy cao chiết methanol (0,8 mg/ml) từ vỏ của Plumeria alba có hoạt tính ức chế chủng Shi.boydii, Shi.flexneri, Shi.sonnei và có đường kính vòng ức chế lần lượt là 9 mm, 12 mm và 9,5 mm. Cao chiết EtOH 70% (200 mg/ml) từ Hoa Sứ trắng ức chế được nhóm vi khuẩn Shigella spp. lần lượt là 12,17 mm, 11,67 mm và 12,5 mm. Dựa vào kết quả trên nhận thấy rằng cao chiết từ Hoa Sứ trắng có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn so với cao chiết từ vỏ Plumeria alba. 3.2.5. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. Tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Hoa Sứ trắng từ các dung môi và nồng độ khác nhau trên nhóm vi khuẩn gây bệnh Vibrio spp. gồm 4 chủng: V.alginolyticus, V.cholera, V.harveyi, V.parahaemolyticus. Kết quả thực nghiệm được thể hiện ở Hình 3.10. 48
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. A B Hình 3.11. A. Vòng ức chế V.cholerae của cao chiết EtOH 96% và B. Vòng ức chế V.harveyi của cao chiết EtOH 70% Dựa vào kết quả trên Hình 3.10 nhận thấy rằng cao chiết nước và EtOH 50% không có hoạt tính ức chế nhóm vi khuẩn Vibrio spp Hoạt tính kháng khuẩn thể hiện ở cao chiết EtOH 96% và kháng được 4/4 chủng vi khuẩn nhóm Vibrio spp Ở nồng độ 200 mg/ml có đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất đối với chủng V.harveyi là 11,67 mm thấp hơn so với kháng ciprofloxacin (0,008 mg/ml) về phương diện thống kê (P < 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml EtOH 96% ức được 4 chủng vi khuẩn thử nghiệm với đường kính vòng ức chế tương đương nhau là 9,5 mm. Nồng độ 50 mg/ml có đường 49
Đồ án tốt nghiệp kính vòng ức chế trung bình từ 8,33 mm đến 8,67 mm. Tương tự, đối với cao chiết EtOH 70% (200 mg/ml) có khả năng ức chế cao nhất đối với 3 chủng V.alginolyticus, V.cholerae, V.parahaemolyticus có đường kính vòng ức chế tương đương nhau và tương đương với ciprofloxacin (0,008 mg/ml) về mặt thống kê (P > 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml EtOH 70% ức chế được 3 chủng và thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất đối với chủng V.parahaemolyticus với đường kính vòng ức chế trung bình 11,17 mm. Nồng độ 50 mg/ml ức chế được 2/4 chủng là V.cholerae, V.parahaemolyticus và đường kính vòng ức chế đối với cả 2 chủng là 9,17 mm. Theo nghiên cứu của Maneemegalai và ctv (2010) đã cho kết quả cao chiết ethanol từ hoa Cassia auriculata L. ở nồng độ 200 mg/ml kháng được chủng V.cholera với đường kính vòng ức chế là 17 mm cao hơn so với cao chiết từ Hoa Sứ trắng. Theo kết quả nghiên cứu của Sangita (2013) cho thấy cao chiết methanol (0,8 mg/ml) từ vỏ của Plumeria alba có hoạt tính ức chế chủng V.cholerae với đường kính vòng ức chế là 11,5 mm và thấp hơn so với cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ trắng có đường kính vòng ức chế trung bình 12,33 mm. 3.2.6. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn còn lại Tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Hoa Sứ trắng từ các dung môi và nồng độ khác nhau trên nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da gồm: P.aeruginosa, Staphylococcus aureus và E.feacalis. Kết quả thực nghiệm được trình bày ở Hình 3.12. 50
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.12. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da A B Hình 3.13. Vòng ức chế S.aureus (A) và P.aeruginosa ở cao chiết EtOH 70% (B) Dựa vào kết quả trên Hình 3.12 nhận thấy rằng các loại cao chiết từ EtOH đều có khả năng ức chế nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da và có đường kính vòng kháng khuẩn trung bình từ 9,8 mm đến 13,7 mm. Trong khi đó cao chiết nước lại không có khả năng ức chế đối với nhóm vi khuẩn này. Cao chiết EtOH 96% ức chế 3/3 chủng vi khuẩn thử nghiệm ở cả 3 nồng độ khảo sát. Nồng độ 200 mg/ml thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất ở chủng S.aureus có đường kính vòng ức chế 13,67 mm cao hơn so với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về phương diện thống kê (P < 0,01). 51
Đồ án tốt nghiệp Đồng thời, cao chiết EtOH 96% (200 mg/ml) cũng thể hiện hoạt tính ức chế chủng P.aeruginosa với đường kính vòng ức chế 10,83 mm tương đương với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml). Nồng độ 100 mg/ml ức chế tốt nhất đối với chủng S.aureus và có đường kính vòng ức chế là 11,17 mm không có sự với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về mặt thống kê (P > 0,01). Nồng độ 50 mg/ml có đường kính vòng ức cao nhất là 9 mm ứng với chủng S.aureus. Điều này chứng tỏ, nồng độ cao chiết càng cao thì hoạt tính kháng khuẩn càng mạnh. Kế đến là cao chiết EtOH 70%, nồng độ 200 mg/ml có hoạt tính ức chế đối với cả 3 chủng là như nhau và cùng có đường kính vòng ức chế trung bình 12,50 mm. Ở nồng độ 100 mg/ml chỉ ức chế được 2 chủng S.aureus và E.feacalis, cả 2 đều có hoạt tính kháng khuẩn tương đương với đối chứng và có đường kính vòng ức chế lần lượt là 10,50 mm và 10,83 mm. Ở nồng độ 50 mg/ml, cao chiết EtOH 70% không có hoạt tính ức chế đối với vi khuẩn gây bệnh về da. Đối với cao chiết EtOH 50% chỉ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở nồng độ 200 mg/ml ức chế được chủng E.feacalis với đường kính vòng ức chế trung bình là 11 mm. Tóm lại từ kết quả phân tích trên nhận thấy rằng cao chiết EtOH 70% có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất nhưng lại có phổ kháng khuẩn hẹp hơn cao chiết EtOH 96% ở nồng độ 100 mg/ml và 50 mg/ml. Từ kết quả nghiên cứu của Kalpana và ctv (2013) về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá cây Moringa oleifera ở nồng độ 200 mg/ml đối với chủng vi khuẩn S.aureus cho thấy cao chiết Moringa oleifera ức chế chủng S.aureus với đường kính trung bình là 10,00 mm thấp hơn cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ trắng ở cùng nồng độ 200 mg/ml là 12,50 mm. Điều này cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng mạnh hơn so với cao chiết từ lá Moringa oleifera. Và kết quả nghiên cứu của Nirosha (2013) từ cao chiết EtOH của lá Carica papaya L. thì cao chiết này kháng được chủng vi khuẩn P.aeruginosa với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 12 mm thấp hơn hoạt tính của cao chiết EtOH từ Hoa Sứ trắng (200 mg/ml), trong khi đó cao chiết từ lá Carica papaya L. lại sử dụng nồng độ 250 mg/ml. 52
Đồ án tốt nghiệp Theo kết quả của Kumar và ctv (2012) cho thấy kết quả của cao chiết nước từ Plumeria rubra acutifolia trên chủng S.aureus là âm tính và trong kết quả thử nghiệm của Hoa Sứ trắng, cao chiết nước không có khả năng ức chế được chủng S.aureus kết quả này tương với nghiên cứu của Naresh Kumar. Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với 20 vi khuẩn gây bệnh gây bệnh Từ kết quả hoạt tính kháng khuẩn có được từ các loại cao chiết khác nhau của Hoa Sứ trắng trên các nhóm vi sinh vật chỉ thị, ta có được kết quả đường kính vòng ức chế trên tổng số 20 chủng vi sinh vật khảo sát trình bày ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2. 53
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) của cao chiết Hoa Sứ trắng từ các loại dung môi khác nhau trên 10 chủng vi khuẩn gây bệnh. Nồng độ Cao chiết ethanol Cao chiết ethanol Cao chiết ethanol Vi sinh vật Cao chiết nước Ciprofloxacin(*) (mg/ml) 50% 70% 96% 200 NA NA 10,17b ± 0,76 11,17b ± 0,76 13,20a ± 0,29 E.coli 100 NA NA NA 8,83b ± 0,29 50 NA NA NA 8,33b ± 0,58 200 NA 10,50b ± 0,50 12,00b ± 1,00 11,33b ± 0,58 31,00a ± 0,50 ETEC 100 NA 8,33b ± 0,58 9,67b ± 0,58 9,33b ± 1,04 50 NA NA NA NA 200 NA NA 11,00a ± 1,00 10,83a ± 0,76 12,30a ± 0,29 E.coli 0208 100 NA NA 9,33b±0,58 9,83b ± ,29 50 NA NA NA NA 200 NA NA 11,17b ± 0,76 10,50b ± 0,50 13,20a ± 0,29 E.coli O157:H7 100 NA NA NA 9,67b±0,58 50 NA NA NA 8,83b ± 0,76 200 NA NA 10,83ab ± 0,76 9,50b ± 0,50 12,00a ± 0,50 L.innocua 100 NA NA 8,67b ± 0,58 9,00b ± 0,00 50 NA NA NA NA 200 11,33ab ± 1,15 NA 13,00a ± 1,00 9,67b ± 0,58 12,20ab ± 0,29 L.monocytogens 100 9,17b ± 0,29 NA 9,67b ± 0,58 8,83b ± 0,76 50 NA NA NA NA 200 NA 12,33a ± 1,53 10,67a ± 0,29 11,00a ± 1,73 12,20a ± 0,76 S.dublin 100 NA 10,83ab ± 0,76 9,00b ± 1,00 9,33b ± 0,58 50 NA NA 8,67b ± 0,58 NA 200 11,00ab ± 1,00 9,5b ± 0,50 10,50ab ± 0,87 11,00ab ± 1,00 13,00a ± 0,50 S.enteritidis 100 8,67b ± 0,76 NA 9,00b ± 0,00 9,67b ± 0,58 50 NA NA NA NA 200 NA 10,17a ± 0,76 NA 11,33a ± 1,53 12,50a ± 0,50 S.typhii 100 NA NA NA 10,67b ± 0,58 50 NA NA NA NA 200 NA NA 11,83ab ± 1,04 9,67b ± 1,15 13,17a ± 0,29 S.typhimurium 100 NA NA 9,83b ± 0,76 8,50b ± 0,50 50 NA NA 8,17b ± 0,29 NA NA: non activity (*): Nồng độ ciprofloxacin là 0,5 mg/ml 54
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2. Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) của cao chiết Hoa Sứ trắng từ các loại dung môi khác nhau trên 10 chủng vi khuẩn gây bệnh Nồng độ Cao chiết ethanol Cao chiết ethanol Cao chiết ethanol Vi sinh vật Cao chiết nước Ciprofloxacin(*) (mg/ml) 50% 70% 96% 200 NA 11,00a ± 1,00 12,17a ± 0,76 11,00a ± 0,87 NA Shi.boydii 100 NA NA 10,17a ± 0,76 9,50a±0,50 50 NA NA NA NA 200 12,00a ± 1,00 NA 11,67a ± 1,53 10,83a ± 1,04 13,17a ± 0,29 Shi.flexneri 100 NA NA 9,67b ± 0,58 10,17b ± 0,29 50 NA NA 8,83b ± 0,29 8,83b ± 0,76 200 NA 10,67b ± 0,58 12,50b ± 1,50 10,17ab ± 0,29 33,00a ± 0,50 Shi.sonnei 100 NA NA 9,50b±0,50 8,83b±0,76 50 NA NA 9,00b ± 0,50 NA 200 NA NA 12,33b ± 0,58 10,00c ± 0,50 16,17a ± 0,29 V.alginolyticus 100 NA NA 10,67b ± 0,58 9,00c ± 0,50 50 NA NA NA 8,17b ± 0,29 200 NA NA 12,33a ± 0,29 10,33b ± 0,58 13.33a ± 0,58 V.cholerae 100 NA NA 9,83b ± 0,76 9,50b ± 0,50 50 NA NA 9,17b ± 0,76 8,67b ± 0,76 200 NA NA 11,67b ± 0,58 11,67b ± 0,58 18,00a ± 0,5 V.harveyi 100 NA NA NA 9,50b ± 0,50 50 NA NA NA 8,67b ± 0,76 200 NA 9,67c ± 0,58 12,33a ± 0,58 10,67bc ± 0,58 11,33ab ± 0,29 V.parahaemolyticus 100 NA NA 11,17a ± 1,04 9,50a ± 0,50 50 NA NA 9,17b ± 0,76 8,33b ± 0,58 200 NA NA 12,50a ± 0,76 10,83a ± 0,76 12,17a ± 0,58 P.aeruginosa 100 NA NA NA 8,67b ± 0,76 50 NA NA NA 8,33b ± 0,29 200 NA NA 12,50ab ± 0,50 13,67a ± 0,58 12,17 ± 0,29 S.aureus 100 NA NA 10,50a ± 0,50 11,17a ± 0,76 50 NA NA NA 9,00b ± 0,00 200 NA 11,00ab ± 1,00 12,50a ± 0,50 10,33b ± 0,58 12,00ab ± 0,50 E.feacalis 100 NA NA 10,83a ± 0,29 8,83b ± 0,76 50 NA NA 8,17b ± 0,29 8,00b ± 0,00 NA: non activity (*): Nồng độ ciprofloxacin đối với nhóm Vibrio spp. là 0,008 mg/ml và đối với các vi sinh vật còn lại là 0,5 mg/ml 55
Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả của bảng 3.1 và bảng 3.2, có thể nhận thấy rằng dung môi tách chiết có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính sinh học của cao chiết thu được. Trong các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng ở những nồng độ khác nhau thì có phổ kháng khuẩn khác nhau trên 20 chủng vi khuẩn gây bệnh. Trong các loại dung môi khảo sát thì dung môi EtOH 70% ở nồng độ 200 mg/ml thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao nhất kháng được 19/20 chủng vi khuẩn khảo sát với đường kính vòng kháng trung bình 8,17 mm đến 12,50 mm, đặc biệt là đối với các chủng thuộc nhóm Listeria spp., Vibrio spp., và nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da. Ở nồng độ 100 mg/ml cao chiết EtOH 70% ức chế được 15/20 chủng và nồng độ 50 mg/ml ức chế được thấp nhất là 7/20 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Tuy nhiên cao chiết EtOH 70% lại có phổ kháng khuẩn hẹp hơn cao chiết EtOH 96%. Ở nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml EtOH 96% ức chế được 20/20 chủng vi khuẩn thử nghiệm, riêng nồng độ 50 mg/ml thì EtOH 96% chỉ ức chế được 10/20 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Bên cạnh đó, cao chiết từ dung môi nước và EtOH 50% thì có phổ kháng khuẩn hẹp và hoạt tính kháng khuẩn cũng thấp hơn, cụ thể là cao chiết EtOH 50% (200 mg/ml) kháng lại 8/20 chủng vi khuẩn và nồng độ 100 mg/ml chỉ ức chế được 2/20 chủng. Cao chiết nước (200 mg/ml) kháng lại 3/20 chủng và ở nồng độ 100 mg/ml ức chế 2/20 chủng vi khuẩn thử nghiệm . Từ kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng trên 20 chủng vi khuẩn khảo sát cho thấy đường kính vòng kháng khuẩn tăng dần từ nồng độ 50 mg/ml đến 200 mg/ml. Điều này chứng tỏ nồng độ khảo sát càng cao thì hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng càng mạnh. Và cũng từ những kết quả trên có thể kết luận rằng tách chiết mẫu Hoa Sứ trắng bằng dung môi ethanol sẽ thể hiện được hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất. Đặc biệt cao chiết từ EtOH 70% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao hơn so với các dung môi khác. Theo kết quả nghiên cứu của Mishra và ctv (2008) đã tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ cây Androgaphis paniculata trên các chủng vi sinh vật như E.coli (7,00 mm), S.typhimurium (6,80 mm), Shi.sonnei (7,00 56
Đồ án tốt nghiệp mm), Shi.boydii (9,00 mm), V.alginolyticus (10,00 mm), và V.cholerae (13,00 mm). Từ kết quả nghiên cứu trên, so sánh với hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ trắng ở nồng độ 200 mg/ml với các chủng vi khuẩn như E.coli (10,17 mm), S.typhimurium (11,83 mm), Shi.sonnei (12,50 mm), Shi.boydii (12,17 mm), V.alginolyticus (12,33 mm), và V.cholerae (12,33 mm) cho thấy cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ trắng có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn cao chiết ethanol từ cây Androgaphis paniculata, riêng chủng V.cholera là có đường kính thấp hơn cao chiết ethanol từ cây Androgaphis paniculata. Từ kết quả nghiên cứu của Vinoth và ctv (2012), khi khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá Moringa oleifera trên các chủng vi khuẩn E.coli, P.aeruginosa, S.aureus, S.typhii có đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 8 mm, 9 mm, 11 mm và 13 mm cho thấy thấp hơn hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ Hoa Sứ trắng tuy khảo sát cùng nồng độ là 200 mg/ml. Cũng trong nghiên cứu này, Vinoth cũng khảo sát trên cao chiết nước từ lá Moringa oleifera cho thấy rằng cao chiết không có khả năng ức chế 4 chủng vi khuẩn thử nghiệm tương và cao chiết nước từ Hoa Sứ trắng cũng không có hoạt tính ức chế 4 chủng vi khuẩn nói trên. Khi so sánh với kết quả của Đinh Vũ Nghị (2017) khi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của Hoa Sứ vàng thì nhận thấy rằng các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn so với các loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng. 3.3. Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết Hoa Sứ trắng từ dung môi ethanol 70% Sau khi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ Trắng từ 4 loại dung môi khảo sát cho thấy cao chiết EtOH 70% có khả năng ức chế các loại vi khuẩn tốt hơn các loại cao chiết khác. Dựa vào cơ sở trên, tiến hành định tính một số thành phần hóa học có khả năng kháng khuẩn trong mẫu cao chiết Hoa Sứ trắng 70%. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.3. 57
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3. Kết quả định tính thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ mẫu Hoa Sứ trắng Nhóm hợp chất Thử nghiệm Kết quả Molisch + Carbohydrate Fehling + Barfoed + Mayer + Dragendorff + Alkaloid Hager + Wagner + Saponin Foam + Legal + Cardiac glycoside Keller Killiani + Alkaline reagent + Flavonoid Ferric chloride + Lead acetate + Phenolic compound Gelatin + Ferric chloride + Tannin Lead acetate + Salkowski + Steroid Libermann Burchard + Amino acid Ninhydrin - Chú thích: (+) : dương tính; (-) âm tính Từ bảng kết quả định tính thành phần hóa học của Hoa Sứ trắng được chiết tách từ ethanol 70% cho thấy rằng dung môi ethanol 70% có khả năng tách chiết được 58
Đồ án tốt nghiệp 8/9 hợp chất khảo sát như carbohydrate, alkaloid, flavonoid, saponin, steroid, cardiac glycosid, tannin, hợp chất phenol, tuy nhiên ethanol 70% lại không chiết xuất được amino aicd. Trong thử nghiệm alkaloid cho kết quả dương tính, điều đó chứng tỏ trong Hoa Sứ trắng có chứa các hợp chất thuộc nhóm alkaloid như: coumarin, polyphenol, purin, amino acid, protein, acid triterpen (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Đối với thử nghiệm phenolic cho phản ứng dương tính, tương ứng với kết quả nghiên cứu của David Wang và ctv, 2007 công bố tìm được các hợp chất acid caffeic, acid 3,5- dicaffeoylquinic, 1,4 - acid dicaffeoylquinic và 3,4 dihydroxy - cinnamic acid methyl ester đều thuộc nhóm phenolic. Trong 3 thử nghiệm hợp chất thuộc nhóm flavonoid có 2 thử nghiệm có kết quả dương tính có thể được giải thích như sau: flavonoid có nhiều nhóm hợp chất trong đó mỗi phản ứng định tính giúp nhận biết một nhóm chất riêng trong trường hợp này phản ứng của ferric clorid giúp nhận biết chalcon trong nhóm chất flavonoid (Đặng Thị Luyến và ctv, 2008), phản ứng alkaline giúp phân biệt nhóm flavon và flavonol (Manpreet Kaur, 2015) và phản ứng shinoda giúp phân biệt anthocyanidins trong nhóm chất flavonoid (Greg, 2014). Ngoài ra còn có hợp chất tannin có dẫn chất ellagitannin, ở hợp chất terpennoid, tinh dầu thì có dẫn chất là capsaicin. Tất cả các dẫn chất trên đều có chức năng phá vỡ màng tế bào, liên kết bám dính, tạo phức hợp với thành tế bào, khử hoạt tính enzyme và bám dính protein, các chức năng trên giúp tiêu diệt vi sinh vật. Từ những kết quả định tính trên có thể kết luận rằng cao chiết Hoa Sứ trắng từ ethanol 70% có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh do có sự hiện diện của các hợp chất alkaloid, flavonoid, phenol, tannin, triterpenoid. Theo nghiên cứu của Ramproshad và ctv (2012), khảo sát thành phần hóa học và dược chất có trong Plumeria rubra đã xác định trong Plumeria rubra chứa các hợp chất như alkaloid, steroid, flavonoid tương ứng với kết quả trong thử nghiệm định tính thành phần hóa học của Hoa Sứ trắng. Nhưng nghiên cứu Ramproshad lại không thấy 59
Đồ án tốt nghiệp có sự xuất hiện của saponin và tannin. Trong khi đó, kết quả từ thành phần hóa học của Hoa Sứ trắng cho thấy có sự hiện diện của saponin. Theo một nghiên cứu khác của Subur Khan (2010) cho thấy kết quả có sự hiện diện của steroid, tannin, glycoside và flavonoid trong chiết từ ethanol của hoa Plumeria rubra, điều này tương đương với kết quả trong thử nghiệm từ Hoa Sứ trắng. Từ những kết quả trên khẳng định rằng cao chiết Hoa Sứ trắng từ dung môi ethanol 70% có sự hiện diện của rất nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học: alkaloid, phenol, alkaloid, tannin, flavonoid, saponin, triterpenoid, glycoside, carbohydrate, sự hiện diện của những hợp chất này tạo nên hoạt tính kháng khuẩn cho Hoa Sứ trắng, đặc biệt là flavonoid. Các flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn do chúng có khả năng tạo phức với các protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn. Flavonoid càng ưa béo thì càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật (Quỳnh Ngọc, 2011 Tóm lại, từ những kết quả trên cho thấy rằng Hoa Sứ trắng là một loại thảo dược có hoạt tính sinh học tương đối cao. Mặc dù dung môi nước cho hàm lượng thu hồi cao cao nhất trong 4 loại dung môi khảo sát nhưng khi khảo sát khả năng kháng khuẩn thì cao chiết EtOH 70% cho hoạt tính sinh học mạnh nhất, ức chế được các chủng vi khuẩn thử nghiệm với đường kính vòng ức chế tương đối cao. Bên cạnh đó, trong cao chiết ethanol 70% cũng hiện diện nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như carbohydrate, alkaloid, flavonoid, saponin, steroid, cardiac glycosid, tannin, hợp chất phenol; những hợp chất này tạo nên hoạt tính kháng khuẩn cho Hoa Sứ trắng. 60
Đồ án tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Qua quá trình thực hiện tách chiết mẫu Hoa Sứ trắng bằng các loại dung môi khác nhau nhận thấy rằng dung môi nước cho hàm lượng thu hồi cao cao nhất trong 4 loại dung môi khảo sát với hàm lượng trung bình là 36,27%. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của 4 loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng trên 20 chủng vi sinh vật thử nghiệm cho thấy cao chiết ethanol 96% từ Hoa Sứ trắng có phổ kháng khuẩn rộng và cao chiết ethanol 70% có hoạt tính kháng khuẩn tương đối mạnh, đặc biệt là đối với chủng Shi.sonnei, S.aureus và E.feacalis. Cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ trắng có phản ứng dương tính với carbohydrate, alkaloid, saponin, cardiac glycoside, flavonoid, phenolic, tannin, steroid, trong đó có những hợp chất kháng khuẩn , điều đó bổ sung cho kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và phù hợp với các nghiên cứu đã từng công bố trước đây. 2. Kiến nghị Tiến hành thí nghiệm hoạt tính của cao thuốc trên mô hình động vật để làm cơ sở ứng dụng điều chế thuốc trị bệnh cho người. Tiến hành đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng trên nhiều vi sinh vật gây bệnh khác. Tiến hành đánh giá khả năng kháng nấm của cao chiết từ Hoa Sứ trắng. Tiến hành khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết từ Hoa Sứ trắng. 61
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đỗ Tất Lợi (2001)- “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Khoa học Kỹ thuật. GV Bùi Thi Hải Hòa và sinh viên thực hiện (2012), Chuyên Đề: Độc Tố E.coli, Viện Đại học Mở Hà Nội. Hoàng Sầm và Hứa Văn Thao (2012). Hoạt tính sinh học của saponin với ung thư, TruongSinhThang. 17/08/2012, xem 17-06-2015, link: . Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng dược liệu, tập I, Trường đại học Dược Hà Nội Ngô Văn Thu (2011), Bài giảng dược liệu, tập I, Trường đại học Dược Hà Nội Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007, Phương pháp cô lập các hợp chất hữu cơ, NXB ĐHQG TPHCM Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp (2007). Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội. Nguyễn Phương Hà Linh Linh (2011). Cấu tạo, tính chất và vai trò của carbohydrate. Nguyễn Tấn Thịnh (2013), Tìm hiểu thành phần hợp chất thứ cấp trong cây lược vàng, Trường đại học công nghệ TP.HCM. Nguyễn Thị Hiền và ctv (2010). Chất kháng khuẩn thực vật. Tiểu luận môn công nghệ chế biến rau trái, Kỹ thuật hóa học. Đại học bách khoa TP.HCM. PGS. TS. Nguyễn Thanh Bảo, 2007, Vi khuẩn học, Trường Đại học Y Dược Tp. HCM. Phạm Minh Nhựt(2013). Thực hành vi sinh đại cương. Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Phùng Trung Hùng và cộng tác viên (2013), Đại cương carbohydrate. 62
Đồ án tốt nghiệp Quỳnh Ngọc (2013), Flavonoid – Bảo vệ sức khỏe an toàn, NXB Trung tâm thông tin KH&CN TP.HCM. Võ Văn Chi, 2012, Từ điển cây thuốc Việt Nam (Bộ mới), tập I, NXB Y học, Hà Nội Vũ Thị Việt Hoa, Tô Minh Châu, Vũ Thị Lân Ân, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thúy Hương (2000) , Vi sinh học đại cương, Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM. Vũ Xuân Tạo (2011), Nghiên cứu alkaloid & quy trình tách chiết một số chất có bản chất là alkaloid, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM. Tài liệu nước ngoài Ahlem Rebaya, Souad Igueld Belghith, Safa Hammrouni, Abderrazak Maaroufi, Malika Trabelsi Ayadi, Jamila Kalthoum Chérif (2016) Antibacterial and Antifungal Activities of Ethanol Extracts of Halimium halimifolium, Cistus salviifolius and Cistus monspeliensis. International Journal of Pharmaceutical and Clinical Research; 8(4): 243-247. Babuselvam M., Farook K.A.M., Abideen S., Mohamed M.P. and Uthiraselvam M. (2012). Screening of antibacterial activity of mangrove plant extracts against fish and shrimp pathogens, International Journal of Applied Microbiology Science, 1 (3), 20-25. Burt, S., 2004 Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods – a review. Int. J. Food Microbiol. 94, 223 – 253. Gislene G. F. Nascimento, 2000. Antibacterial activity of plant extracts and phytochemicals on antibiotic-resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. H. Qiao, T.J. Sun (2014). Antibacterial activity of ethanol extract and fractions obtained from Taraxacum mongolicum flower, Research Journal of Pharmacognosy (RJP) 1: 35-39. 63
Đồ án tốt nghiệp Karkare S., Adou E, Cao S., Brodie P., Miller J. S., Andrianjafy N. M.,Razafitsalama J., Andriantsiferana R., Rasamison V. E., Kingston D. G. I. (2007), Cytotoxic cardenolide glycosides of Roupellina (Strophanthus) boivinii, The Madagascar rainforest, J Nat Prod, pp:70:1766 – 1770. Khalil 2012, Antimicrobial Activity of Ethanol Leaf Extracts of Catharanthus Roseus From Saudi Arabia. International Conference on Environment Science and Biotechnology. Khan et al, 2010, comparative phytochemical screening of flowers of Plumeria alba and Plumeria rubra. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research. ISSN - 0974-2441. Kumar et al 2012, Antimicrobial potential of Plumeria rubra Syn Plumeria acutifolia bark, Der Pharma Chemica, 4(4):1591-1593. Maneemegalai et al 2010, Evaluation of Antibacterial Activity of Flower Extracts of Cassia auriculata L Ethnobotanical Leaflets 14: 182- 92. Mir et al 2016, Estimation of alkaloid, saponin and flavonoid, content in various extracts of Crocus sativa. Journal of Medicinal Plants Studies 2016; 4(5): 171- 174 Muruganatham et al 2015, Antimicrobial activity of Ethanolic extracts of Plumeria rubra flowers. American journal of pharmtech reseach. Oladipupo A. Lawal, Isiaka A. Ogunwande and Andy R. Opoku, 2014, Chemical Composition of Essential Oils of Plumeria rubra L. Grown in Nigeria, European Journal of Medicinal Plants 6(1): 55-61. O. O. Igbinosa et al, 2009. Antimicrobial activity and phytochemical screening of stem bark extracts from Jatropha curcas (Linn). African Journal of Pharmacy and Pharmacology Vol. 3(2). pp. 058-062. 64
Đồ án tốt nghiệp Ramproshad et al, 2012, Screening of phytochemical and pharmacological activities of leaves of medicinal plant Plumeria rubra. International journal of research in pharmacy and chemistry. ISSN: 2231 2781. Rozman T., Jersek B. (2009), Antimicrobial activity of rosemary extracts (Rosmarimus officinalis L.) against diferent species of Listeria, Acta agriculturae Slovenica. S.Kalpana, S.Moorthi and Sushila kumari 2013, Antimicrobial activity of different extracts of leaf of Moringa oleifera (Lam) against gram positive and gram negative bacteria. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. ISSN: 2319 – 7006. Vinoth et al, 2012, Phytochemical analysis and antibacterial activity of Moringa oleifera lam. International journal of research in Biological Sciences. ISSN 2249 – 9687. 65