Đồ án Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt, bảo quản và nảy mầm của hạt nhân tạo đối với cây lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

75 trang thiennha21 12/04/2022 4080

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt, bảo quản và nảy mầm của hạt nhân tạo đối với cây lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_nghien_cuu_cac_yeu_to_anh_huong_den_qua_trinh_tao_hat.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt, bảo quản và nảy mầm của hạt nhân tạo đối với cây lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TẠO HẠT, BẢO QUẢN VÀ NẢY MẦM CỦA HẠT NHÂN TẠO ĐỐI VỚI CÂY LAN THẠCH HỘC TÍA (DENDROBIUM OFFICINALE KIMURA ET MIGO) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : NGUYỄN CỬU THÀNH NHÂN Sinh viên thực hiện : HUỲNH THỊ NGỌC TRÂM MSSV: 1151110528 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của Th.s Nguyễn Cửu Thành Nhân. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. i
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Công Nghệ Tphcm Quý thầy cô trường Đại Học Công Nghệ Tphcm Quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Nguyễn Cửu Thành Nhân đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tâp cũng như thực hiện luận văn này. Cảm ơn công lao cha mẹ đã tận tụy suốt đời vì con để con có được như ngày hôm nay. Xin gửi lời cảm ơn đến: Tập thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Ươm Tạo Doanh Nghiệp Nông Nghiệp Công Nghệ Cao và phòng Nuôi Cấy Tế Bào Thực Vật, cùng tất cả bạn bè trong và ngoài lớp 11DSH04 đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài. Tp. Hồ Chí Minh, Ngày tháng năm 2015 Sinh viên Huỳnh Thị Ngọc Trâm ii
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1 Khái quát về cây lan 4 1.1.1 Phân loại thực vật học 4 1.1.2 Lịch sử cây lan 4 1.1.3 Tình hình sản xuất lan 5 1.1.4 Đặc điểm thực vật học của cây lan 6 1.1.4.1 Cơ quan dinh dưỡng 6 1.1.4.2 Cơ quan sinh dục của lan- tổ chức hoa 8 1.1.5 Các điều kiện cơ bản cho cây lan 9 1.2 Giới thiệu về lan Thạch Hộc Tía: 10 1.2.1 Đặc trưng hình thái và sự phân bố: 10 1.2.2 Công dụng: 10 1.2.3 Giá trị kinh tế: 12 1.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 13 1.3.1 Khái niệm 13 1.3.2 Lịch sử phát triển 14 1.3.3 Ứng dụng: 15 1.3.4 Các phương pháp nuôi cấy in vitro 15 1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng nhân giống in vitro 17 1.3.6 Các bước nhân giống in vitro: 18 1.4 Công nghệ tạo hạt nhân tạo: 19 1.4.1 Khái niệm hạt nhân tạo: 19 iii
Đồ án tốt nghiệp 1.4.2 Ưu điểm của hạt nhân tạo: 20 1.4.3 Quá trình tạo hạt nhân tạo: 20 1.4.4 Quy trình tạo hạt nhân tạo: 22 1.4.5 Các nhân tố cần thiết trong việc tổng hợp hạt nhân tạo: 23 1.4.6 Nguyên tắc và điều kiện khi tạo vỏ bọc bằng chất nền alginate sodium: 23 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu: 25 2.2 Thời gian thực hiện: 25 2.3 Nội dung nghiên cứu : 25 2.4 Vật liệu nghiên cứu 26 2.4.1 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 26 2.4.2 Mẫu sử dụng và điều kiện nuôi cấy 26 2.4.3 Môi trường sử dụng 26 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.5.1 Chuẩn bị môi trường 27 2.5.2 Bố trí thí nghiệm 28 2.6 Xử lý số liệu: 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Thạch Hộc Tía: 32 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 4.1 Kết luận 52 4.2 Đề nghị 52 iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo 28 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt trong dung dịch CaCl2.2H2O. 28 Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tạo hạt nhân 29 Bảng 2.4. Khảo sát môi trường bảo quản hạt nhân tạo 30 Bảng 2.5. Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau 31 Bảng 3.1. Nồng độ alginate ảnh hưởng đến hình thái vỏ hạt nhân tạo 35 Bảng 3.2. Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate 36 Bảng 3.3 Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau 37 Bảng 3.4: Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các thời gian ngâm hạt khác nhau: 41 Bảng 3.5 Khảo sát khả năng bảo quản hạt trên môi trường MS: 43 Bảng 3.6 Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các môi trường dinh dưỡng khác nhau. 44 Bảng 3.7 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bảo quản hạt nhân tạo 46 Bảng3.8 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bảo quản hạt nhân tạo 48 Bảng 3.9: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể 50 v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.2. Cấu tạo hoa lan 9 Hình 1.3. Hình ảnh một số loài lan Thạch Hộc. 13 Hình 2.1. Cấu tạo hạt nhân tạo 20 Hình 2.2. Các giai đoạn phát sinh phôi soma 21 Hình 2.3. Hình dạng phôi soma 21 Hình 2.4. Quy trình tạo hạt nhân tạo 22 Hình 3.1. Vật liệu hạt nhân tạo 33 Hình 3.2. Môi trường tạo hạt nhân tạo 34 Hình 3.3. Các bước tạo hạt nhân tạo 34 Hình 3.4. Hạt nhân tạo 34 Hình 3.5. Quá trình nảy mầm của hạt nhân tạo lan Thạch Hộc Tía. 35 Hình 3.7. Biểu đồ tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau 36 Hình 3.8. Biểu đồ tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau 37 Hình 3.9. Hạt nhân tạo nảy mầm ở các nồng độ alginate khác nhau 39 Hình 3.10. Biểu đồ tỷ lệ nảy mầm của hạt ở các thời gian ngâm CaCl2.2H2O khác nhau 41 Hình 3.11. Hạt nhân tạo nảy mầm ở các nồng độ alginate khác nhau 42 Hình 3.13 Biểu đồ tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo ở môi trường vỏ hạt khác nhau Hình 3.14 Hạt nhân tạo nảy mầm ở các môi trường vỏ hạt khác nhau 45 Hình 3.15. Hình thái vỏ hạt nhân tạo sau 4 tuần bảo quản 47 Hình 3.16. Biểu đồ tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo ở môi trường bảo quản khác nhau 48 Hình 3.17. Hạt nảy mầm trên các giá thể khác nhau 50 Hình 3.18. Biểu đồ tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo ở môi trường bảo quản khác nhau 51 vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BAP Benzyl amino purine GA3 Giberrenlin 2 IP Cytokinin CV Hệ số biến thiên MS Murashige và Skoog PVP Polyvinyl pyrrolidone NSC Ngày sau cấy vii
Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài: Cuộc sống ngày càng hiện đại và phát triển. Con người buộc phải đối mặt với nhiều vấn đề và áp lực từ cuộc sống. Chính vì vậy mà vui chơi, giải trí là một nhu cầu không thể thiếu. Ngoài các hoạt động vui chơi giải trí khác thì thú chơi hoa, cây cảnh cũng có một chỗ đứng nhất định của nó. Không những tạo ra mảng xanh, không gian tươi mát thì cây xanh còn giúp nâng cao hơn chất lượng cuộc sống, giúp con người ta gần gũi hơn với thiên nhiên, sống lâu và sống khỏe. Hoa có mặt trong đời sống con người hết sức phổ biến. Từ làm vật liệu trang trí làm đẹp cho không gian sống, quà tặng đến các công dụng làm thức ăn hay dược liệu. Hoa là biểu tượng cho cái đẹp. Mỗi loài hoa có những màu sắc mùi hương đặc biệt cho từng vùng miền, thời tiết hay khí hậu. Nhiều lễ hội hoa cũng được tổ chức tại các quốc gia hàng năm. Trong số đó, hoa lan được biết đến và yêu mến vì vẻ đẹp, sự sang trọng cũng như lợi ích kinh tế mà hoa lan mang lại. Lan rất đa dạng về chủng loại, màu sắc, mùi hương và phân bố rộng khắp trên toàn thế giới. Trồng và kinh doanh lan cũng từ đó mà phát triển rộng rãi. Sản lượng hoa lan mỗi năm trên thế giới ước tính hàng tỷ đô la. Tại khu vực Đông Nam Á ngành hoa lan phát triển rất mạnh, Thái Lan là nước xuất khẩu lan nhiều nhất thế giới (có đến 1.000 giống hoa lan), tại Malaysia thì chính phủ đã qui hoạch hẳn 300 ha đất ở Johor và giao cho Hiệp hội hoa lan tổ chức thành khu “Trung Tâm Sản Xuất Hoa Cảnh Xuất Khẩu”, ngành trồng hoa lan ở Đài Loan cũng đang tăng nhanh tốc độ từ 15-20%, đạt doanh thu hằng năm hơn 9,3 tỷ đài tệ. gắng hơn nữa trong việc tìm tòi ra cách để sản xuất ra lan nhanh và hiệu quả hơn. Dồng thời đẩy mạnh việc lai và chọn tạo giống để cho ra những giống lan mới, sức chống chịu cao với bệnh hại cũng như thời tiết đang ngày càng trởi nên khắc nghiệt hơn. Trong những năm trở lại đây, Việt Nam chúng ta cũng nghiên cứu rất nhiều về lan đặc biệt là nhân nhanh lan bằng phương pháp nuôi cấy mô. 1
Đồ án tốt nghiệp Cây lan được biết là loài thực vật rất khó gieo hạt trong tự nhiên. Muốn nhân giống lan người ta thường dùng phương pháp tách chiết hoặc nuôi cấy in vitro. Với sự phát triển của kỹ thuật tại hạt nhân tạo, chúng ta có thể ứng dụng lấy phôi soma cho bọc vỏ nhân tạo có chứa môi trường dinh dưỡng, nhằm bảo quản phôi và tại điều kiện cho hạt nhân tạo nảy mầm. Với kỹ thuật này khắc phục hạn chế khó nảy mầm của hạt lan trong tự nhiên và giúp nhân nhanh các giống lan trồng, cũng như các loại thực vật khó nảy mầm. Đồng thời mở ra một hướng mới cho việc sử dụng những hạt vô tính thay cho các hạt hữu tính có khả năng nẩy mầm thấp và không đồng loạt. Xuất phát từ những lý do trên mà tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo hạt, bảo quản và nảy mầm của hạt nhân tạo đối với cây lan Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)” để thực hiện luận văn tốt nghiệp của mình. Khi thực hiện đề tài này, tôi hy vọng sẽ mang đến những hiểu biết mới về quá trình hình thành phôi vô tính trên cây lan Thạch Hộc nói riêng và hoa lan nói chung, đồng thời đem lại những ứng dụng thiết thực cho ngành nuôi cấy mô thực vật tại Việt Nam. 2. Tình hình nghiên cứu: Khái niệm về phôi sinh dưỡng được biết tới đầu tiên là vào năm 1958 nhưng cho đến cuối năm 1970 Murashige mới đua ra khái niệm hạt nhân tạo – phôi sinh dưỡng có vỏ bọc nhân tạo. Trong các năm tiếp theo đã không có những kết quả đáng kể nào ngoài việc xem xét khả năng sống sót của phôi được thực hiện trên cây carrot do Kitto và Janick (1982-1985). Năm 1975, Bingham và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm trên cây cỏ đinh lăng và đã chứng minh được sự phát triển phôi sinh dưỡng thành cây. Năm 1981 Robert Laurence, năm 1991, K.Redenbaugh và cộng sự đã tiến hành tạo phôi vô tính thành công trên cây cần tây và rau diếp. Nghiên cứu về hạt nhân tạo trong nước cũng còn là việc khá mới mẻ. Trong đó có thể thấy vài nghiên cứu về hạt nhân tạo trên cây lan Vanda, lan Hồ Điệp hoặc trên cây hoa Ly, cũng như những cây có giá trị kinh tế cao. Mục đích nhằm 2
Đồ án tốt nghiệp tìm ra phương pháp tối ưu để lưu trữ và góp phần nghiên cứu giải quyết nhu cầu giống phục vụ cho việc tiêu thụ hoa, cây cho giá trị kinh tế cao trong nước và xuất khẩu. 3. Mục đích nghiên cứu: - Tạo hạt nhân tạo có ý nghĩa trong công tác duy trì nguồn mẫu, nguồn gen thực vật quí hiếm trong một thời gian dài phục vụ cho những mục đích sử dụng khác trong tương lai. - Làm cơ sở cho việc kiểm chứng sự khác nhau giữa cây hoa lan Thạch Hộc Tía in vitro có nguồn gốc từ phôi soma với cây hoa lan Thạch Hộc Tía từ các nguồn mô khác. - Làm cơ sở để nghiên cứu tiếp khả năng tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma của các loại cây thân thảo một lá mầm khác. - Bảo quản phôi soma hiệu quả và lưu trữ giống dễ dàng hơn 4. Nội dung nghiên cứu: - Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo. - Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt trong dung dịch CaCl2.2H2O - Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tạo hạt nhân tạo. - Khảo sát môi trường bảo quản hạt nhân tạo. - Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau. 3
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát về cây lan 1.1.1 Phân loại thực vật học Ngành: Angiospermae (hạt kín) Lớp:Monocotyledonae Bộ: Orchidales Họ: Orchidaceae Họ phụ: Orchidoideae 1.1.2 Lịch sử cây lan Họ phong lan phân bố từ 680 vĩ Bắc đến 560 vĩ Nam, nghĩa là từ gần cực Bắc như Thuỵ Điển , Aleska, xuống tận cuối cùng ở cực nam của Ostralia. Tuy nhiên tập trung phân bố của họ này là ở trên các vĩ độ nhiệt đới, đặc biệt châu Mỹ và Đông nam á. Ngay ở các vùng nhiệt đới họ phong lan cũng phân bố rộng khắp từ vùng đầm lầy sát Biển Hồ qua các đồi núi thấp lên các vùng núi cao. Mặc dù đa số các loài lan chỉ mọc ở độ cao dưới 2000 m so với mặt nước biển, song có một số ít loài sống cả ở độ cao 5000m so với mặt nước biển (ở Colômbia óc một số loài phong lan sống ở núi quanh năm tuyết phủ). Ban đầu người ta nghĩ cây Lan được biết đến lần đầu tiên là ở Châu Âu qua bản viết tay bằng tiếng Hy Lạp” Xem Xét Cây Cỏ” (Enquiry intoPlants) của Theophrastus (khoảng năm 370-285 TCN). nhưng thực ra thì cây lan đã được biết đến đầu tiên ở phương Đông từ rất lâu: Khổng Tử (551-479 TCN) sau khi đi chu du thiên hạ về lại nước Lỗ. Trên đường về, ông thấy hoa lan mọc chen với cây cỏ ở rừng sâu bèn than rằng: “Ôi, hoa lan có mùi thơm vương giả, nay tươi tốt một mình ở chốn sơn lâm, mọc xen lẫn với loài cỏ hoang dại, chẳng khác nào bậc hiền giả không gặp thời, đứng chung với bọn bỉ phu”, mà từ đó các bài thơ, phú, vịnh về hoa lan sau này của các thi nhân Trung Hoa đều bị ít nhiều ảnh hưởng. Ở phương Đông, lan đựơc chú ý đến vẻ đẹp duyên dáng của lá và hương thơm tuyệt diệu của hoa. Vì vậy trên thực tế lan chủ yếu chiêm ngưỡng trước 4
Đồ án tốt nghiệp tiên là lá chứ không phải màu sắc của hoa. Ở phương Tây, lan được biết đến trước hết là công dụng về dược liệu và sau đó là sức hấp dẫn của hoa cùng các đặc tính về thực vật của nó. Theophrastus được xem là ông tổ của thực vật học và là cha đẻ của ngành học về lan và đến năm 1836 John Lindley đặt tên cho họ lan là Orchidaceae. Ở Việt Nam dấu vết nghiên cứu về lan buổi đầu không rõ ràng lắm, có lẽ người đầu tiên khảo sát về lan là Gioalas Noureiro- nhà truyền giáo người Bồ Đào Nha đã mô tả cây lan lần đầu tiên ở Việt Nam trong cuốn “flora cochinchinensis” gọi tên các cây lan trong cuộc hành trình đến nam phần Việt Nam là Aerides, Phaijus mà đã được Ben Tham và Hooker ghi lại trong cuốn “ Genera plante rum” (1862 –1883). Chỉ sau khi người Pháp đến Việt Nam mới có những công trình được công bố là F. gagnepain và A.gnillaumin mô tả 101 chi gần 70 loài lan cho cả 3 nước Đông Dương trong bộ “Thực vật Đông Dương chí” do H. lecomte chủ biên, xuất bản từ 1932 – 1934. bên cạnh đó cũng có một số tác giả khác cung đề cấp đén lan Việt Nam. Một số người Việt Nam cũng bắt đầu nghiên cứu về lan như “Cây cỏ Việt Nam” của GS. Phạm Hoàng Hộ với 289 loài được mô tả và có hình vẽ minh hoạ. 1.1.3 Tình hình sản xuất lan Trên thế giới: Châu Âu, Hà Lan là quốc gia duy nhất có công nghệ trồng lan xuất khẩu sớm, ứng dụng trồng trong nhà kính nên xuất khẩu được quanh năm, đặc biệt là lan Cymbidium. Còn Italia là quốc gia nhập khẩu lan nhiều nhất Châu Âu, chủ yếu từ các nước: Thái Lan 64 triệu cành, Hà Lan 10 triệu cành vào năm 1993. Mỹ nhập từ Thái Lan 16,4 triệu cành, Singapore 289 ngàn cành Dendrobium vào năm 1994. Châu Á, đứng đầu thế giới về nhập khẩu lan vẫn là Nhật, chủ yếu là Dendrobium, Oncidium, Cymbidium, Phalaenopsis từ Malaysia, Singapore và Thái Lan là nhiều nhất 5
Đồ án tốt nghiệp Ở Việt Nam Do chúng ta ở vùng có khí hậu nhiệt đới gió mùa, vì vậy phong lan rất đa dạng. Bên cạnh các loại lan rừng nổi tiếng về màu sắc và hương thơm còn có các giống lan nhập ngoại như Dendrobium, Vanda, Mokara, Phalaenopsis, Cattleya còn phân bổ lan rừng thì khắp cả nước: Vùng khí hậu lạnh: Cao Nguyên và các tỉnh phía Bắc có thể trồng được các loài lan như Dendrobium, Cymbidium, Phalaenopsis, Cattleya, Paphiopedilum Vùng khí hậu nóng ẩm như ở Nam và Trung Trung Bộ, nhất là miền Đông Nam Bộ có các loại lan như: Cattleya, Vanda, Mokara, Cymbidium, Ngọc Điểm Tuy nhiên có những khó khăn của người trồng lan ở nước ta: - Nông dân trồng lan còn nhỏ lẻ, thiếu quy hoạch chiến lược, kỹ thuật so với nước ngoài. - Chưa tạo được giống lan riêng biệt cho Việt Nam có thể cạnh tranh với các giống lan nhập ngoại, nhất là Thái Lan. - Thị trường tiêu thụ còn nhiều khó khăn, chưa ổn định kinh tế lâu dài cho người trồng lan. Tuy nhiên, thành phố Hồ Chí Minh đã có nhiều chính sách, nguồn vốn đầu tư để xây dựng và mở rộng khu nông nghiệp cao, chuyển đổi đổi cơ cấu nông nghiệp cho phù hợp với tình hình và xu hướng phát triển của thành phố, trong đó cây lan cũng là cây chủ lực. 1.1.4 Đặc điểm thực vật học của cây lan 1.1.4.1 Cơ quan dinh dưỡng a) Sự phát triển ở cây đa thân . Trường hợp lan Cau diệp (Spathoglottis plicata Bl.) Đây là loài địa lan, giả hành là một thân ngắn phù mập. Mỗi giả hành có một số lá bao che và mang rễ ở đáy. Đáy lá to ra tạo thành bẹ bao 6
Đồ án tốt nghiệp quanh giả hành. Ở nách của mỗi bẹ lá có thể có các chồi mà mỗi chồi có thể phát triển thành cành mang hoa (phát hoa) hay tạo ra cơ quan dinh dưỡng mới (giả hành mới). Các chồi ở nách lá ấy được che chở bởi những lá ngắn không có phiến lá bên trên. Khi chồi bắt đầu phù to có dạng một giả hành sơ khởi thì các lá ló ra về phía đỉnh, sau đó các rễ mới xuất hiện ở về phía đáy. Cuối cùng các lá phát triển lớn lên, tích trữ dưỡng chất về phía đáy làm cho giả hành lớn dần ra. . Trường hợp lan Bạch câu (Dendrobium crumenatum Sw.) Xuất hiện từ đồng bằng đến núi cao, phụ sinh sống bám trên cây hay trên hốc đá, rễ chúng không luôn bị ẩm ướt như ở trong đất như lan Cau diệp. Cành lan mới sinh ra từ gốc của cành cũ: Gồm gốc nhỏ mang rễ, tiếp là đoạn phù mập không rễ, không lá, kế trên là đoạn dài mang lá mọc xen hai hàng, trên cùng là đoạn dài nhỏ lỏng y như vậy nhưng không có lá, tất cả gọi là giả hành. Như vậy Bạch câu sống nhiều năm (cây đa niên) nhờ các đơn vị nối tiếp nhau, chồi mới sinh ra từ chồi bên ở gốc của đơn vị trước đó và cứ thế tiếp tục phát triển theo chiều ngang. Hình 1.1. Lan Bạch Câu 7
Đồ án tốt nghiệp b) Sự phát triển ở cây đơn thân Ở kiểu phát triển độc trụ, nếu ta cắt một đoạn ở phía ngọn của thân thì đoạn bị cắt rời này vẫn phát triển về phía đỉnh. Còn nếu cắt đoạn thân của cây (đỉnh giả hành) thì đoạn cắt rời ấy không thể phát triển về phía đỉnh.Ví dụ như cây Vanda, Ngọc Điểm (Rhynchostys gigantea), Hồ Điệp (Phalaenopsis) Lá có phiến hình trụ dài và có bẹ bọc kín thân. Thân luôn luôn mọc cao lên về phía đỉnh. Sự mọc dài của đỉnh không có giới hạn nên cây chỉ có một thân phát triển vô hạn. Sự phát triển ngừng lại khi đỉnh bị tổn thương, lúc đó chồi bên sẽ xẻ rách bẹ lá để mọc dài ra thành nhánh, nhánh này cũng sinh trưởng không giới hạn như đỉnh ban đầu. 1.1.4.2 Cơ quan sinh dục của lan- tổ chức hoa . Hoa lan kiểu tam phân (chia 3): 3 lá đài, 3 cánh hoa, 3 tâm bì . Phấn hoa dính lại thành phấn khối, ít khi rời từng hạt như ở các loài hoa khác . Sự hiện diện của trụ là phần hợp nhất của bộ phận sinh dục đực và bộ phận sinh dục cái. Đó là đặc điểm quan trọng chỉ có ở hoa lan. . Hình dạng, kích thước của môi, cộng thêm vị trí của nhuỵ đực đã làm cho hoa lan không đều, có sự đối xứng hai bên rõ rệt. Tuy cấu trúc chung như vậy nhưng trong chi tiết từng bông hoa lan cũng có những khác biệt mà từ đó ta chia chúng ra những giống loài khác nhau, chỉ cần đề cập đến cánh môi thôi cũng đã rất phong phú. Nhưng 99% các cây lan có 1 nhuỵ đực thụ mà thôi số còn lại có 2-3 nhuỵ đực thụ (Nguyễn Thiện Tịch,1996). Về phái tính thì đại đa số cây lan là hoa lưỡng tính, nhưng ở giống Catasetum và Cycnoches hoa lại là đơn tính. 8
Đồ án tốt nghiệp Cánh môi: Ở một số loài thì rất lớn so với hai bên cánh, một số loài có cánh môi rất nhỏ. Hình 1.2. Cấu tạo hoa lan Hình dạng: Môi có thể nguyên hay có thuỳ, có rìa, có tua, cuộn hay nhăn có cấu trúc rất kỳ lạ như có sọc, có sóng, có gai, có lông, trơn láng hay nhăn có cựa, móc, túi ở đằng sau Màu sắc: Thường khác hai bên, hoặc có sọc, điểm, những màu khác biệt. 1.1.5 Các điều kiện cơ bản cho cây lan Ẩm độ: Thông thường tối thiểu là 70% thích hợp cho sự tăng trưởng của nhiều loài. Tuy nhiên ẩm độ lý tưởng vẫn là ẩm độ của vùng bản xứ pH của nước: pH của nước phù hợp cho lan tăng trưởng là 5-6, nếu lên 7 hoặc trên 7 thì không nên tưới nước cho cây. Nhiệt độ: Tuỳ thuộc vào nhiệt độ của điều kiện địa lý, vùng cao độ thì sẽ có sự phân bổ giống lan phù hợp. Ánh sáng: Yếu tố quyết định cho sự quang hợp, hô hấp và nhất là cho sự trổ hoa.  Vanda lá tròn cần 100% ánh sáng 9
Đồ án tốt nghiệp  Vanda lá sắp thành hàng cần 70% ánh sáng  Dendrobium cần 70% ánh sáng  Cattleya cần 50% ánh sáng  Phalaenopsis cần khoảng 30% ánh sáng Độ thông gió: Lan có 2 nhóm chính là phong lan và địa lan, tốc độ gió khoảng 10-15 km/giờ, nghĩa là gió làm lá và các cành nhỏ hơi rung động, nếu trồng ở nơi thông gió và mát mẻ, cây lan sẽ tăng trưởng nhanh và ít bị bệnh hơn. 1.2 Giới thiệu về lan Thạch Hộc Tía: Thạch hộc tía có tên khoa học Dendrobium officinale Kimura et Migo Chi: Thạch hộc Họ: Lan (Orchidaceae) Phân bố tự nhiên chủ yếu ở vùng rừng có độ cao 1.000 - 3.400 m so với mặt biển, thường phụ sinh vào cây gỗ hoặc vách đá có mọc rêu dưới tán rừng. 1.2.1 Đặc trƣng hình thái và sự phân bố: Thạch hộc được phân bố ở Việt Nam, Lào, Trung Quốc, Myanma và nhiều nước vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong điều kiện môi trường tự nhiên độ ẩm 70%, nhiệt độ không khí bình quân năm 12 - 18 độ C, lượng mưa 900 - 1.500 mm, thường tập trung sống ở phần dốc núi râm mát, độ ẩm cao và vách đá Thạch hộc khó sinh sản, mọc chậm, khó trồng, những cây mọc hoang dã đã được đưa vào “Công ước buôn bán quốc tế động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng” được pháp luật bảo vệ, do đó nguồn cung cấp tự nhiên đã cạn kiệt, cấm thu hái và buôn bán. 1.2.2 Công dụng: Trong cổ thư đông y Trung Quốc cách đây hơn 1.000 năm đã xác định ở Trung Quốc có 9 loại tiên dược được xếp theo thứ tự như sau: Thạch hộc, Tuyết liên, Nhân sâm, Thủ ô, Phục linh, Tùng dung, Linh chi, Ngọc trai, Đông trùng hạ thảo, trong đó Thạch hộc xếp đầu bảng. 10
Đồ án tốt nghiệp Giá trị của thạch hộc có 2 loại công năng chủ yếu: - Làm thuốc: Thạch hộc tía có giá trị độc đáo và công năng bảo vệ sức khỏe, đã trở thành sản phẩm bổ dưỡng từ lâu đời, được sử dụng trong các mục đích y tế (Li et al, 2008.). Thạch hộc làm thuốc có nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học quý. Thạch hộc tía giàu polysacarit thạch hộc, alkaloit thạch hộc, các acid amine và nhiều chất khoáng kali, canxi, magie, mangan, đồng, titan và nhiều nguyên tố vi lượng, trong đó polysacarit thạch hộc tới 22%, hàm lượng các acid amine như glutamic, asparagic, glucin chiếm tới 35% tổng lượng acid amine (Xiang et el, 2013). Ngoài ra Thạch Hộc Tía còn có những hợp chất đặc thù như phenanthryn, bibenzyl , keton, ester và các chất nhầy, hợp chất amidon. Trong thân Thạch hộc tía có hàm lượng alkaloit sinh học chiếm tới 0,3%, trong đó những chất amine đã được giám định cấu trúc gồm dendrobine, dendramine, nobilonine, dendrin, 6-hydroxy-dendroxine, shiunin, shihunidine và muối amoniac N-methyl-dendrobium, 8-epidendrobine, các chất này có vị hơi đắng Nghiên cứu về dược lý hiện đại, Thạch Hộc Tía có tác dụng chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn mạch máu và kháng đông máu (Liu et al, 2011; Hou et al, 2012; Xia et al, 2012; Xiang et al, 2013). Thạch hộc tía có thể dùng đơn độc hoặc phối trộn với các dược liệu khác, đã có hơn 100 bài thuốc từ Thạch hộc được thị trường đón nhận. Trong dược điển có đề cập đến nhiều loài Thạch hộc nhưng tốt nhất vẫn là Thạch hộc tía. - Làm thực phẩm: Cách sử dụng làm thực phẩm có nhiều cách như nấu súp với hồng sâm, với bách sa sâm lợi phổi sinh tân. Ngoài ra có thể nấu cháo Thạch hộc, trà Thạch hộc và nhiều món ăn khác. Những năm gần đây 11
Đồ án tốt nghiệp công năng làm thực phẩm chức năng đã được khám phá thêm, là sản phẩm thiên nhiên an toàn và bổ dưỡng. Thạch hộc tía có vị hơi ngọt hơi đắng vào 3 kinh phế, vị, thận, công năng tư âm, thanh nhiệt, chỉ khát, hư hao, gầy yếu, miệng khô. 1.2.3 Giá trị kinh tế: Thạch hộc trồng một lần có thể thu hoạch 6 năm, đầu tư ban đầu có thể tốn kém, nhưng năm thứ 2 có thể thu hồi vốn, từ năm thứ 3 có lãi. Trong điều kiện thâm canh, năng suất tươi khoảng 5 tấn/ha/năm với giá bán khoảng 3 triệu đồng/kg, doanh thu đạt 15 tỷ đồng/ha/năm. Thị trường tiêu thụ là khả quan, nếu chế biến sâu, thị trường càng lớn và hiệu qủa càng cao, bao gồm thị trường nội địa, thị trường Đông Nam Á, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và châu Âu, châu Mỹ. Ở Trung Quốc đã có nhiều sản phẩm thuốc từ Thạch hộc bán ra thị trường trong và ngoài nước, đặc biệt là xưởng thuốc Kim Năng ở Nam Kinh tỉnh Giang Tô, trải qua 15 năm nghiên cứu bào chế, được thuốc tiêm: “Mạch lộ ninh”, từ năm 1982 đến nay được đánh giá là thuốc điều trị có hiệu quả đối với bệnh cứng hóa động mạch, viêm màng não. Xưởng thuốc này cũng đã cho ra đời các loại thuốc tiêm, thuốc uống, viên nang đều mang tên “Mạch lộ ninh”. Cùng với sản phẩm thảo dược truyền thống làm từ Thạch hộc là “Phong đấu Thạch hộc” được coi là tuyệt phẩm của thảo dược có hàng ngàn năm lịch sử. Thạch hộc chế biến thành phong đấu, giá xuất khẩu vào những năm 80 thế kỷ trước đạt mức 3.000 USD/kg. Ở Đài Loan giá phong đấu từ 1.000- 3.000USD/kg. Giá phong đấu hảo hạng cực kỳ đắt, ở thị trường Trung Quốc khoảng 30 đến 60 triệu VNĐ/kg. Giá 1 cây Thạch hộc tươi 3 tuổi có giá 25.000 VNĐ – 35.000 VNĐ, 1 ha trồng 1 triệu cây thạch hộc, có thể thu được 25-30 tỷ trong 3 năm. Ở thị trường Trung Quốc giá phong đấu Thạch hộc cao cấp là 60 triệu đồng/kg. Nhu cầu của Trung Quốc và các nước trên thế giới về Thạch hộc còn rất lớn với giá cao, đem lại siêu lợi nhuân cho 12
Đồ án tốt nghiệp những người trồng và chế biến thạch hộc. Nhu cầu thị trường Trung Quốc hiện nay cần khoảng 2000 tấn/năm, nhưng mới sản xuất được 200 tấn/năm. Dự báo trong 10 năm tới thị trường nội địa cần tới 15000 tấn/năm tương đương hàng chục tỉ USD. A: Thạch Hộc Tía B: Tiểu Hoàng Thảo C: Tụ Thạch Hộc D: Thạch Hộc Hình 1.3. Hình ảnh một số loài lan Thạch Hộc. 1.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.3.1 Khái niệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi nuôi cấy thực vật in vitro để phân biệt với các quá trình 13
Đồ án tốt nghiệp nuôi cấy trong điều kiện tuej nhiên ngoài ống nghiệm. Nhờ áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất. Hơn nữa dựa vào kĩ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quí hiếm để phục tráng giống cây trồng. 1.3.2 Lịch sử phát triển Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwann đề xướng học thuyết tế bào và nêu rõ: “Mọi sinh vật phức tạp đều gồm nhiều sinh vật nhỏ, các tế bào hợp thành, các tế bào phân chia mang thông tin di truyền chứa trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh và là những đơn vị độc lập từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể”. Năm 1902, Haberlandt đề xướng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào, nghĩa là mỗi tế bào đều mang đầy đủ thông tin di truyền của cá thể. Ông tiến hành trên cây họ hòa thỏa (cây một lá mầm) một lọai cây khó thực hiện và ông bị thất bại. Năm 1922, Kote và Robbins đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt và nuôi cấy được đỉnh sinh trưởng tách ra từ đầu rễ của một loại cây thuộc họ hòa thảo tạo ra hệ rễ nhỏ và có cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm lại và ngừng hẳn mặc dù tác giả đã chuyển sang môi trường mới. Năm 1934, White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua. Năm 1937, Gautheret và Nobecout đã tạo ra và duy trì được sự sinh trưởng mô sẹo cây cà rốt trong một thời gian dài trong môi trường thạch cứng. Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy phôi họ cà. Trong thời gian này chất hích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công. 14
Đồ án tốt nghiệp Và năm 1948 Steward đã xác định được tác dụng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà rốt Năm 1955, người ta tìm ra tác dụng kích thích phân bào của kinetin.Sau đó các chất cytokinine khác như BAP, 2 IP, Zeatin cũng được phát hiện. Năm 1957, SKoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về ty lệ giữa kinetin/auxin đối với sự hình thành các cơ quan từ mô sẹo trên cây thuốc lá. Từ năm 1954, đến năm1959 kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơnđã được phát triển, các tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn chỉnh. Năm 1966, Guha và Mahheswari nuôi cấy thành công tế bào đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. Năm1967, Bougin và Nistsh tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá. 1.3.3 Ứng dụng: Năm 1986, một số lượng lớn cây trồng sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô đã được tiêu thụ tên thị trường thương mại với hàng chục triệu dollar. Kỹ thuật này thể hiện một số ưu điểm đã được ứng dụng: - Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh. - Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh. - Cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến. - Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn. - Lai xa. - Lai tế bào soma và tạo dòng protoplast. - Gây biến tính thực vật qua hấp thụ DNA và ngoại lai. - Cố định nitrogen. - Cải thiện hiệu quả của quang tổng hợp. - Bảo quản nguồn gen quý. 1.3.4 Các phƣơng pháp nuôi cấy in vitro Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 15
Đồ án tốt nghiệp Mẫu cấy bao gồm: đỉnh sinh dưỡng, chồi đỉnh, chồi bên, có kích thước khoảng 0.58 - 1 cm. Đây là phương pháp dễ dàng nhất, mẫu sau khi vô trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp cho loại cây đó thì sau một thời gian nuôi cấy tạo thành một hay nhiều chồi. Sau đó, nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thì sẽ tạo thành nhiều chồi, rễ, tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo Mẫu cấy là những tế bào đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra trong môi trường giàu auxin thì mô sẹo được hình thành. Mô sẹo là những tế bào vô tổ chức có màu trắng. Khối mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với những cây không có khả năng nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng. cây tái sinh từ mô sẹo có nhiều chồi hơn so với cây tái sinh từ đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma của phương pháp này rất cao. Phương pháp nuôi cấy tế bào đơn Những khối sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng, đặt trong máy lắc thì khối sẹo dứơi tác dụng cơ học và hóa học sẽ tách ra nhiều tế bào đơn lẻ gọi là tế bào đơn. Những tế bào đơn này nuôi cấy trong môi trường đặc biệt thì sẽ tăng sinh khối. Sau một thời gian nuôi cấy trong môi trường lỏng tế bào đơn tách ra và đặt trải trong môi trường thạch thì sẽ phát sinh thành những tế bào mô sẹo. Những tế bào mô sẹo này được nuôi cấy trong môi trường cytokinin/auxin thích hợp thì sẽ tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Trong chọn giống cây trồng người ta dựa vào phương pháp này để tạo ra giống mới bằng cách đột biến tế bào đơn bằng hóa chất hay phóng xạ. Nuôi cấy protoplast- chuyển gen 16
Đồ án tốt nghiệp Protoplast thực chất là tế bào đơn được tách vỏ cellulose, có sức sống và duy trì chức năng sẵn có. Protoplast có thể tái sinh trực tiếp từ thân, lá, rễ bằng cơ học, hoặc từ những tế bào đơn sẵn có. Trong môi trường thích hợp các protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Trong chọn giống cây trồng người ta sử dụng phương pháp này để cải tiến giống cây trồng bằng cách cho dung hợp protoplast ở 2 protoplast cùng loài hoặc khác loài (Nguyễn Hoàng Lộc, 2009) Protoplast có khả năng hấp thu tế bào ngoại lai để cải thiện đặc tính của một số loại cây trồng mà không thông qua các phương pháp chuyển gen khác. Nuôi cấy tế bào đơn bội Hạt phấn của cây trồng được nuôi cấy trong môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh có bộ nhiễm sắc thể n gọi là cây đơn bội. Trong nuôi cấy mô thực vật người ta sử dụng những mô sẹo này xử lý colchicin để tạo thành cây đa bội. 1.3.5 Các yếu tố ảnh hƣởng nhân giống in vitro Lựa chọn mẫu cấy Mô non (chồi đỉnh), chồi nách hay chồi bất định tái sinh tốt hơn so với mô già của cùng một cây. Môi trường nuôi cấy Môi trường MS (Murashige và Skoog) cho kết quả tốt trong nhân giống cây ban đầu và nhân chồi tiếp theo. Để tạo chồi nách nồng độ auxin và cytokinin tương đối thấp, còn tạo chồi bất định cần nồng độ cytokinin cao và auxin thấp; Còn tạo mô sẹo thì ngược lại. Môi trường rắn hay lỏng cũng ảnh hưởng đến khả năng phát triển rễ. Agar giúp cây đứng vững và tăng khả năng thoáng khí tạo điều kiện hấp thu dưỡng chất. 17
Đồ án tốt nghiệp Đối với cây tiết các độc tố như phenol thì cần thêm than hoạt tính hay PVP để hấp thụ các chất này giúp cây tăng trưởng tốt hơn. Môi trường có thể bổ sung các chất ngăn cản sự oxyt hoá phenols như citric acid, ascorbic acid, thiourea hoặc L- cystine. Hoặc bổ sung thêm amino acid như glutamine, arginine và asparagine. Thường xuyên cấy chuyền vào môi trường mới nhằm tạo điều kiện dinh dưỡng đầy đủ cho cây nuôi cấy in vitro sinh dưỡng tốt. Ánh sáng và nhiệt độ Ánh sáng: Cường độ ánh sáng phù hợp trong khoảng 1000-5000 lux. Thời gian chiếu sáng thường 16 giờ sáng/8 giờ tối. Nhiệt độ: Ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây in vitro. Nhiệt độ tối ưu khoảng 20-250C. 1.3.6 Các bƣớc nhân giống in vitro:  Bước 1: Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Mẫu cấy thường là chồi, mắt lóng, đỉnh sinh trưởng, lá, rễ đem rửa sạch và khử trùng bằng cồn, natri hypochlorit, calci hypochlorit. Sau đó, mẫu được đưa vào môi trường tạo điều kiện phân chia và phân hoá mạnh. Đối với mẫu dễ bị hoá nâu, môi trường thường bổ sung than hoạt tính hoặc ngâm mẫu với ascorbic acid và citric acid (25-150 mg/l mỗi loại) trước khi cấy (Bùi Bá Bổng, 1995).  Bước 2: Tạo thể nhân giống in vitro Thể chồi (multiple shoot) và thể cắt đốt (cutting) cấy vào môi trường có chất kích thích sinh trưởng (cytokinin, GA3 ) để tạo mô sẹo, tạo cụm chồi.  Bước 3: Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng nhất nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Sự nhân giống này tuỳ thuộc vào khả năng tạo chồi nách hoặc phát khởi chồi bất định từ những khối giống như callus dưới gốc chồi, rồi ra rễ.  Bước 4: Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro 18
Đồ án tốt nghiệp Các chồi, callus hay mô sẹo sẽ đƣợc cấy vào môi trường có auxin để tạo rễ, tạo thân, lá đầy đủ. Cây phải được nuôi cấy trong điều kiện giống như bên ngoài vườn ươm để thuần hoá cho đến khi cây con khỏe mạnh.  Bước 5: Chuyển cây in vitro ra vườn ươm Cây con phát triển tốt trong môi trường in vitro được lấy ra và rửa sạch môi trường nhân tạo bám ở gốc rễ, rồi đem trồng ra vườn ươm. Do thay đổi về điều kiện sống, cây con dễ bị tress, mất nước và mau héo nên vườn phải mát, ẩm độ cao. 1.4 Công nghệ tạo hạt nhân tạo: 1.4.1 Khái niệm hạt nhân tạo: Trong nhân giống vô tính in vitro việc tạo hạt nhân tạo từ các phôi vô tính, tiểu chồi là hướng tiến và có khả năng công nghiệp hóa cao. Công nghệ hạt nhân tạo là phương pháp tạo một dạng mô phỏng hạt tự nhiên, có phôi sinh dưỡng được bọc trong một lớp Alginate có chứa chất dinh dưỡng (không đường). phôi này sau đó nảy mầm thành cây con hoàn chỉnh (k.Redenbaugh, 1987). Hạt nhân tạo khác hạt tự nhiên ở chỗ hạt nhân tạo bao gồm phôi soma hay phôi sinh dưỡng được nằm trong một lớp vỏ bảo vệ (nhân tạo). Có hai kiểu hạt nhân tạo đó là hạt nhân tạo khô và hạt nhân tạo ướt: - Hạt nhân tạo ướt: là những phôi soma được bọc trong lớp màng gel ướt làm bằng Natri-alginate. Hạt này có thể nảy mầm được trong đĩa petri hoặc có thể chuyển trực tiếp ra đất để nảy mầm. - Hạt nhân tạo khô: được tạo bằng cách bọc vỏ phôi soma bằng dung dịch resin hòa tan trong nước hay polyethylene glycol hoặc làm khô phôi không cần có vỏ bọc. Công nghệ hạt nhân tạo sử dụng phôi vô tính có vai trò rất quan trọng trong việc trồng trọt ở những loài thực vật : (1) Không tạo được hạt (2) Hạt được tạo thành với một số lượng thấp 19
Đồ án tốt nghiệp (3) Khả năng hạt sống sót thấp (4) Việc nhân giống thực vật khó khăn và chất mầm không thể bảo quản được. Hình 2.1. Cấu tạo hạt nhân tạo 1.4.2 Ƣu điểm của hạt nhân tạo: - Trong quá trình nuôi cấy có thể sử dụng làm sạch vius để tạo cây sạch bệnh - Có thể đưa vi khuẩn cố định đạm vào lớp vở để tạo cây có khả năng cố định đạm. - Có thể trộn thêm chất dinh dưỡng thích hợp vào lớp vỏ làm cho cây sau này sinh trưởng tốt hơn. - Có thể nạp gên lạ vào hạt nhân tạo dễ dàng hơn để tạo giống mới. - Có thể sản xuất hàng loạt, vận chuyển dễ dàng hơn hạt thật, lại không phụ thuộc thời tiết thời vụ - Có thể đưa một lượng thuốc trừ sâu, trừ cỏ dại vào vỏ hạt để cây sau này không bị sâu và cỏ dại phá hoại. 1.4.3 Quá trình tạo hạt nhân tạo: - Tạo phôi soma hoặc tiền phôi: + Phôi soma được tạo ra từ một bộ phận của cây như bào tử, phôi non, phôi chín, mầm lá, lá mầm, mô biểu bì, hoặc rễ và toàn bộ mô tế bào sinh ra từ tế bào nuôi cấy và cả tế bào trần. 20
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2. Các giai đoạn phát sinh phôi soma + Tiền phôi được hình thành từ phôi soma hoặc tiền callus trong nuôi cấy mô. Tiền chồi riêng lẻ có thể sinh trưởng một cách dễ dàng bởi chúng có khả năng sử dụng các chất hóa học trong môi trường nuôi cấy. Hình 2.3. Hình dạng phôi soma (cây 2 lá mầm) - Tạo vỏ hạt: + Vỏ hạt là một hydrogel có nguồn gốc tự nhiên mà bản chất là: 21
Đồ án tốt nghiệp Tảo biển (Agar Carageenan hoặc Alginate); các cây (Arabic và Tragacanth); chất keo của một loại hạt (Guar, Locust ); hoặc từ vi sinh (Dextran, Gellan, Xanthangum), những hỗn hợp này sẽ thành gel khi được thả vào một chất điện phân CuSO4, CaCl2, muối amoni Trong thí nghiệm này chúng tôi chọn Na-alginate là chất được chiết xuất từ tảo nâu làm vỏ gel bao bọc hạt nhân tạo. Chất này có đặc tính là khi dùng rất dễ tạo thành vỏ hạt lại ít độc với phôi. 1.4.4 Quy trình tạo hạt nhân tạo: Bước 1: Dùng dao tách rời các phôi hình tim. Bước 2: Dùng pipette hoặc micro pipette hút dung dịch alginate Bước 3: Dùng pince gắp chồi/phôi đưa vào giọt dung dịch alginate nhỏ xuống dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM trong 15 phút. Bước 4: Dùng pince gắp hạt cho vào nước cất vô trùng trong 5 phút để làm sạch lượng CaCl2.2H2O còn sót lại. Sau khi thực hiện xong giai đoạn tạo vỏ hạt nhân tạo, hạt được cấy vào môi trường nuôi cấy (MS không bổ sung điều hòa sinh trưởng) Dung dịch Sodium Alginate Đưa phôi/chồi vào giọt sodium Ngâm trong dung dịch CaCl2.2H2O 100mM trong 15 phút Rửa hạt trong nước cất 5 phút để sạch CaCl2.2H2O Hình 2.4. Quy trình tạo hạt nhân tạo 22
Đồ án tốt nghiệp 1.4.5 Các nhân tố cần thiết trong việc tổng hợp hạt nhân tạo: Quá trình tổng hợp hạt nhân tạo từ phôi vô tính là một công việc được thực hiện với nhiều bước nhưng ít tốn kém. Để việc tổng hợp hạt thành công thì đòi hỏi một yêu cầu cơ bản đó là phải có một số lượng lớn các phôi vô tính chất lượng cao, có sức sống tốt, và các phôi này phải phát triển đồng bộ. Yêu cầu về một chất lượng tốt toàn diện của các phôi vô tính là yếu tố quan trọng hơn cả để đạt được tần suất biến đổi từ phôi đến cây con cao. Quá trình làm vỏ bọc cho phôi chỉ quan trọng trong sự vận chuyển phôi, nó không phải là một nhân tố làm giới hạn sự phát triển của hạt nhân tạo. Có rất nhiều tác nhân tạo gel được sử dụng làm vỏ bọc cho phôi. Đó có thể là agar, alginate, carboxyl methyl cellulose, carrageenan, guargum, sodium pectate, tragacanth gum, dextran, xanthan gum những hợp chất này sẽ đông lại thành gel khi được cho vào môi trường có chất điện phân thích hợp như đồng sulphate, calcium chloride hoặc ammonium chloride nhờ vào những liên kết ion. Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để tạo vỏ bọc cho phôi đó là sử dụng sodium alginate. Alginate được sử dụng nhiều do nó có những đặc tính rất thuận lợi như tính dính vừa phải, không gây độc cho phôi sinh dưỡng, có các đặc tính tương hợp sinh học, khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để được lâu, độ cứng của gel vừa phải để có thể vừa tạo thuận lợi cho sự hô hấp của phôi và vừa bảo vệ được phôi khỏi những tổn thương bên ngoài. 1.4.6 Nguyên tắc và điều kiện khi tạo vỏ bọc bằng chất nền alginate sodium: 23
Đồ án tốt nghiệp Alginate, chất hữu cơ mạch thẳng, kỵ nước, muối của acid alginic, là một polyuronic bao gồm -D-mannuronate (M) và mảnh bên C5 -L-guluronate (G) Nguyên tắc chính trong quá trình tạo vỏ bọc alginate đó là sodium alginate chứa phôi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn và cứng khi nhỏ vào trong hỗn hợp NaCl2.2H2O nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na+ có trong hỗn hợp sodium 2+ alginate với Ca có trong hỗn hợp CaCl2.2H2O. Vỏ bọc cứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào số lượng ion Na+ trao đổi với ion Ca2+. Do đó nồng độ của hai tác nhân tạo gel, sodium alginate và CaCl2.2H2O, và thời gian cho việc tạo liên kết ion phải thật tối ưu để có thể tạo thành vỏ bọc ở một độ cứng thích hợp nhất. Không như phôi hợp tử, phôi vô tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh dưỡng bên ngoài nuôi phôi, do đó bằng việc thêm vào chất nền gel những chất dinh dưỡng, chất điều hòa tăng trưởng, carbohydrate sẽ tạo một nội nhũ nhân tạo thích hợp tối đa cho tăng trưởng và sống sót của phôi. Ngoài ra nhằm tránh cho phôi bị mất nước, hay các tổn thương cơ học, tăng sức đề kháng cho phôi người ta có thể thêm vào chất nền gel chất kháng sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật. Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phôi vô tính bằng sodium alginate cho thấy có một số thành công nhất định trong việc tái sinh cây con, vẫn còn nhiều vấn đề khó khăn khi sử dụng vỏ bao alginate này, chất dinh dưỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ bao (Redenbaugh và csv, 1987), sự trao đổi khí kém Đã có một số đề nghị cho rằng, việc thêm vào than hoạt tính sẽ giúp nâng cao khả năng sống sót, phát triển của phôi vô tính hơn. Nguyên nhân là do than hoạt tính tăng cường khả năng hô hấp của phôi, và nó giữ lại những chất dinh dưỡng nhiều hơn trong vỏ bọc, phóng thích chúng rất chậm dùng cho sự phát triển của phôi. 24
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu: Các thí nghiệm đều được tiến hành trên cây lan Thạch Hộc Tía. 2.2 Thời gian thực hiện: Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 6/2015 đến tháng 8/2015 tại phòng nuôi cấy tế bào thực vật_ Trung tâm ươm tạo doanh nghiệp nông nghiệp khu công nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh. 2.3 Nội dung nghiên cứu : Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Thạch Hộc Tía  Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo Phôi soma được bọc trong các nồng độ sodium alghinate khác nhau để xác định hình thái và khả năng nảy mầm của hạt.  Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt trong dung dịch CaCl2.2H2O Ngâm hạt trong dung dịch CaCl2.2H2O với các thời gian khác nhau để xác định tỷ lệ nảy mầm tối ưu.  Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tạo hạt nhân tạo Sử dụng môi trường MS có nồng độ khoáng đa lượng khác nhau để xác định tỷ lệ sống và nảy mầm của hạt.  Thí nghiệm 4: Khảo sát môi trường bảo quản hạt nhân tạo. Hạt nhân tạo đem lưu trữ ở các môi trường bảo quản khác nhau để xác định điều kiện môi trường bảo quản tối ưu.  Thí nghiệm 5: Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau Hạt nhân tạo cho nẩy mầm trên các giá thể khác nhau để xác định tỷ lệ nẩy mầm. 25
Đồ án tốt nghiệp 2.4 Vật liệu nghiên cứu 2.4.1 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu  Thiết bị - Tủ cấy vô trùng - Nồi hấp (autolave), - Máy đo pH - Cân phân tích - Cân kỹ thuật  Dụng cụ - Pince - Kéo - Dao cấy - Chai nước biển - Đĩa petri - Đèn cồn - Ống đong - Pipet - Micro pipet 2.4.2 Mẫu sử dụng và điều kiện nuôi cấy Mẫu: PLB Điều kiện phòng nuôi cấy: - Cường độ ánh sáng 2000 lux - Nhiệt độ 26 ± 20C Ẩm độ 60-80% - Thời gian chiếu sáng: 8 giờ/ngày 2.4.3 Môi trƣờng sử dụng Môi trường sử dụng trong thí nghiệm: Môi trường MS (Murashige và Skoog 1962) Thành phần Dạng sử dụng Nồng độ (mg/l) Khoáng đa lượng NH4NO3 1650 26
A Đồ án tốt nghiệp (Macro MS) KNO3 1900 KH2PO4 170 MgSO4.7H2O 370 CaCl2 332,02 Khoáng vi lượng H3BO3 6,2 MnSO4.H2O 16,9 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 ZnSO4.7H2O 8,6 Na2MoO4.2H2O 0,25 KI 0,83 Vitamin Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 5 Thiamine-HCl (B1) 0,1 Glycine 2 Pyridoxine-HCl (B6) 0,5 Các chất khác: Nước cất Đường: 30 g/l Agar: 8,4 g/l CaCl2.2H2O Sodium Alginate. pH môi trường trước khi hấp: 5,8 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.5.1 Chuẩn bị môi trƣờng Tất cả môi trường đều phải được khử trùng bằng nồi hấp autoclave ở 1210C trong 20 phút. 27
Đồ án tốt nghiệp 2.5.2 Bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, lập lại 3 lần. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo Nghiệm thức Môi trường Nồng độ alginate 1 MS 10 g/l 2 MS 20 g/l 3 MS 30 g/l 4 MS 40 g/l 5 MS 50 g/l  Ghi chú: Số nghiệm thức: 5 Số bình mỗi nghiệm thức: 1 Số hạt mỗi bình: 10 Tổng số bình: 15 Tổng số hạt: 150 hạt Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi tính chất vỏ hạt, tỷ lệ sống và nảy mầm của phôi sau khi bọc vỏ hạt trên môi trường MS. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt trong dung dịch CaCl2.2H2O. Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt trong dung dịch CaCl2.2H2O. 28
Đồ án tốt nghiệp Nghiệm thức Môi trường Thời gian ngâm 1 MS 5 phút 2 MS 10 phút 3 MS 15 phút 4 MS 20 phút 5 MS 25 phút  Ghi chú Số nghiệm thức: 5 Số bình mỗi nghiệm thức:1 Số hạt mỗi bình: 10 Tổng số bình: 15 Tổng số hạt: 150 Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo trên môi trường MS. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tạo hạt nhân tạo Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tạo hạt nhân Nghiệm thức Môi trường Nồng độ alginate 1 MS 30 g/l 2 ½ MS 30 g/l 3 ¼ MS 30 g/l 4 1/8MS 30 g/l  Ghi chú Số nghiệm thức: 4 Số bình mỗi nghiệm thức:1 Số hạt mỗi bình: 10 Tổng số bình: 12 Tổng số hạt: 120 Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi tỷ lệ sống và nảy mầm của hạt nhân tạo trên môi trường MS 29
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 4: Khảo sát môi trường bảo quản hạt nhân tạo Bảng 2.4. Khảo sát môi trường bảo quản hạt nhân tạo Nghiệm thức Môi trường Nồng độ alginate Môi trường bảo quản 1 ½ MS 30 g/l Không có dinh dưỡng 2 ½ MS 30 g/l Nước cất 3 ½ MS 30 g/l Nước đường 4 ½ MS 30 g/l MS 5 ½ MS 30 g/l ½ MS 6 ½ MS 30g/l ¼ MS 7 ½ MS 30g/l 1/8 MS  Ghi chú: Số nghiệm thức: 7 Số bình mỗi nghiệm thức: 1 Số hạt mỗi bình: 10 Tổng số bình: 21 Tổng số hạt: 210 Đối với Các dạng môi trường bảo quản hạt: Môi trường không dinh dưỡng: Bình nước biển không, đem hấp khử trùng. Môi trường nước cất: Nước cất cho vào mỗi bình 50 ml đem hấp khử trùng Môi trường nước đường: Nước cất bổ sung 30 g/l đường sucrose, cho vào mỗi bình 50 ml đem hấp khử trùng. Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi màu sắc của phôi khi bảo quản, tỷ lệ sống của hạt nhân tạo khi bảo quản và khi cho nảy mầm trên môi trường MS Thí nghiệm 5: Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau 30
Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.5. Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau Nghiệm thức Môi trường Giá thể nảy mầm 1 ½ MS Bông gòn 2 ½ MS MS  Ghi chú: Số nghiệm thức: 2 Số bình mỗi nghiệm thức: 1 Số hạt mỗi bình:10 Tổng số bình: 6 Tổng số hạt: 60 Phương pháp tạo giá thể bông gòn Bông gòn cắt thành lớp dày 2cm đem hấp khử trùng. Nước cất 50ml đem hấp khử trùng. Cho 50ml nước cất đã được hấp vào bông gòn (thực hiện trong tử cấy vô trùng). Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể. 2.6 Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm STATGRAPHIS 7.0 và phần mềm Excel 31
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Thạch Hộc Tía:  Cơ chế phát sinh phôi soma Những quan sát chi tiết về quá trình phát sinh phôi phát hiện có 4 pha : 0, 1, 2 và 3, được nhận thấy trong giai đoạn đầu của tiến trình phát sinh phôi trong hệ thống nuôi cấy nói trên (Fujimura và Komamine, 1979). Ở pha 0, những tế bào đơn (giai đoạn 0) hình thành những cụm tế bào có khả năng phát sinh phôi (giai đoạn 1) trên môi trường có auxin. Ở giai đoạn này, những cụm tế bào hình thành từ những tế bào đơn có khả năng tạo phôi khi môi trường nuôi cấy không có auxin, để hình thành những cụm tế bào giai đoạn 1. Sau đó, pha 1 xuất hiện khi cấy chuyển những cụm tế bào giai đoạn 1 qua môi trường không có auxin. Trong suốt pha 1, những cụm tế bào tăng sinh chậm và dường như không biệt hóa. Sau pha 1 sự phân bào xuất hiện nhanh trên một phần của những cụm tế bào, dẫn đến việc hình thành những tế bào phôi hình cầu. Pha này được gọi là pha 2. Pha tiếp theo sau, pha 3, cây con in vitro phát triển từ những phôi hình cầu qua phôi hình tim và phôi hình thủy lôi. 32
Đồ án tốt nghiệp Cụm Protocorm Hình 3.1. Vật liệu hạt nhân tạo A B C A: Sodium alginate B: Nước cất C: CaCl2.2H2O 33
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2. Môi trường tạo hạt nhân tạo A: Dùng micro pipette hút alginate B: phôi và Đưa phôi vào giọt alginate C: Nhỏ giọt phôi xuống CaCl2.2H2O Hình 3.3. Các bước tạo hạt nhân tạo Hình 3.4. Hạt nhân tạo 34
Đồ án tốt nghiệp A - 0 NSC B - 20 NSC C - 30 NSC D - 40 NSC Hình 3.5. Quá trình nảy mầm của hạt nhân tạo lan Thạch Hộc Tía. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo: Hạt nhân tạo ở các nồng độ Sodium Alginate khác nhau 10g/l, 20g/l, 30g/l, 40g/l, 50g/l sẽ cho ra các hình thái vỏ hạt khác nhau. Bảng 3.1. Nồng độ alginate ảnh hưởng đến hình thái vỏ hạt nhân tạo NT Môi trường Sodium Alginate Hình thái vỏ hạt 1 MS 10g/l Rất mềm, không bao được phôi 2 MS 20g/l Mềm, bọc được phôi 3 MS 30g/l Vừa, bọc hạt tròn đẹp 4 MS 40g/l Dày, cứng, hạt tròn đều 5 MS 50g/l Rất dày và cứng *Ảnh hưởng lên khả năng bảo quản 35
Đồ án tốt nghiệp Hạt nhân tạo ở nồng độ sodium alginate 20 g/l,30 g/l, 40 g/l, 50g/l tạo hình dạng hạt rõ ràng, đưa những hạt nhân tạo này lên môi trường MS không có chất kích thích sinh trưởng, theo dõi tỷ lệ sống của hạt nhân tạo trong khoảng thời gian dãn cách 1 tuần. Bảng 3.2. Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate NT Nồng độ Tỷ lệ sống (%) alginate 1 tuần 2 tuần 3 tuần 1 10g/l - - - 2 20g/l 93,33AB 90A 83,33A 3 30g/l 96,67A 96,67A 90A 4 40g/l 80AB 73,33B 63,33B 5 50g/l 76,67B 66,67B 60B CV 10,26% 12,22% 12,54% Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học 120 100 80 20g/l % 60 30g/l 40g/l 40 50g/l 20 0 1 tuần 2 tuần 3 tuần Tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ Alginate khác nhau Hình 3.7. Biểu đồ tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau 36
Đồ án tốt nghiệp Khả năng sống sót hạt nhân tạo từ phôi vô tính của lan Thạch Hộc Tía được thể hiện trên bảng 3.2. Trong thí nghiệm này, hạt được nuôi cấy trên môi trường MS (môi trường thạch có đường). Dựa vào hình 3.7 có thể thấy tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo giảm dần sau 1, 2, 3 tuần nuôi cấy. Hạt nhân tạo từ phôi của lan Thạch Hộc Tía có khả năng sống sót khá cao. Điều này chỉ ra rằng các phôi vô tính của lan Thạch Hộc Tía có sức sống mạnh. Trong đó có thể thấy ở nồng độ alginate 30g/l tỷ lệ sống sót của hạt lên đến 90%. Đây là một trong những điều kiện thuận lợi để làm đối tượng cho hạt nhân tạo. *Ảnh hưởng lên tỷ lệ nẩy mầm Ngoài theo dõi tỷ lệ sống của hạt nhân tạo, tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo trên môi trường MS cũng quan trọng. Bảng 3.3 Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau NT Nồng độ Tỷ lệ nảy mầm sau 4 tuần Tỷ lệ nảy mầm sau 6 tuần alginate 1 10g/l - - 2 20g/l 53,33A 63,33A 3 30g/l 63,33A 76,67A 4 40g/l 36,67B 40B 5 50g/l 26,67B 30B CV 13,06% 17,09% Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học 37
Đồ án tốt nghiệp 90 80 70 60 50 20g/l % 40 30g/l 40g/l 30 50g/l 20 10 0 4 tuần 6 tuần Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau Hình 3.8. Biểu đồ tỷ lệ sống của hạt nhân tạo ở các nồng độ alginate khác nhau A 38
Đồ án tốt nghiệp A: Nồng độ alginate 20g/l B: Nồng độ alginate 30g/l C: Nồng độ alginate 40g/l D: Nồng độ alginate 50g/l Hình 3.9. Hạt nhân tạo nảy mầm ở các nồng độ alginate khác nhau Dựa vào bảng số liệu 3.3 có thể thấy trong trường hợp vỏ hạt có nồng độ alginate là 30 g/l, tỉ lệ hạt nẩy mầm cao nhất lần lượt là 63,66%, 76,67% sau 4 và 6 tuần nuôi cấy. Số lượng hạt nảy mầm cao, sinh trưởng và phát triển tốt. Trong trường hợp vỏ hạt có nồng độ alginate 20 g/l tỉ lệ hạt nảy mầm cao 53,33%, 63,33%. Tuy 39
Đồ án tốt nghiệp nhiên dựa vào bảng 3.1 vỏ hạt ở nồng độ alginate 20g/l mềm, dễ vỡ, khó gieo hạt và bảo quản. Cây con được tái sinh từ những hạt này sinh trưởng và phát triển tốt. Trong trường hợp vỏ hạt có nồng độ alginate 40 g/l, 50g/l tỉ lệ hạt sống sót và nẩy mầm thấp. Riêng nồng độ alginate 10g/l hạt rất mềm, không bao trọn được phôi để tạo thành hạt hoàn chỉnh. Bên cạnh việc nẩy chồi, ra lá và ra rễ, hạt nhân tạo từ phôi của lan Thạch Hộc Tía với các nồng độ alginate trong vỏ hạt khác nhau được nuôi cấy trên môi trường thạch có đường còn cho thấy có hiện tượng phát sinh mô sẹo. Như vậy, từ các số liệu thu được, ta nhận thấy nồng độ alginate quá đậm đặc sẽ làm giảm số lượng cây mới được tái sinh trên mỗi hạt nhân tạo. Bên cạnh đó, các kết quả này còn mở ra một hướng mới trong việc sử dụng hạt nhân tạo từ phôi của lan Thạch Hộc Tía với nồng độ alginate trong vỏ hạt là 30 g/l. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt trong CaCl2.2H2O Với mục đích tìm ra yếu tố có tác động tích cực đến quá trình nảy mầm của hạt nhân tạo, làm kéo dài thời gian sống của các thể protocorm trong lớp vỏ nhân tạo, giúp cho quá trình bảo quản hạt đạt kết quả cao nhất chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt trong dung dịch CaCl2.2H2O với các khoảng thời gian là: 5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút và 25 phút. Môi trường nuôi cấy gồm MS có bổ sung đường, nồng độ CaCl2.2H2O là 100 Mm. Theo dõi tỷ lệ hạy nảy mầm trong vòng 4 tuần. 40
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4: Tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo ở các thời gian ngâm hạt khác nhau: NT Môi trường Nồng độ Alginate thời gian ngâm hạt Tỷ lệ nảy mầm 1 MS 30g/l 5 phút 33,33B 2 MS 30g/l 10 phút 60AB 3 MS 30g/l 15 phút 90A 4 MS 30g/l 20 phút 56,67AB 5 MS 30g/l 25 phút 70AB CV 17,31% Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học. 100 90 80 70 60 % 50 40 tỷ lệ nảy mầm 30 20 10 0 5 phút 10 phút 15 phút 20 phút 25 phút Tỷ lệ nảy mầm của hạt ở các thời gian ngâm CaCl2.2H2O khác nhau Hình 3.10. Biểu đồ tỷ lệ nảy mầm của hạt ở các thời gian ngâm CaCl2.2H2O khác nhau 41
Đồ án tốt nghiệp A: Hạt ngâm CaCl2.2H2O trong 5 phút B: Hạt ngâm CaCl2.2H2O trong 10 phút C: Hạt ngâm CaCl2.2H2O trong 15 phút D: Hạt ngâm CaCl2.2H2O trong 20 phút E: Hạt ngâm CaCl2.2H2O trong 25 phút Hình 3.11. Hạt nhân tạo nảy mầm ở các nồng độ alginate khác nhau 42
Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả bảng số liệu 3.4 cho thấy thời gian ngâm hạt trong dung dịch CaCl2.2H2O đã có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ nảy mầm của hạt. Với thời gian ngâm hạt 5 phút cho tỷ lệ hạt nảy mầm thấp nhất (33,33%), vỏ hạt mềm dễ vỡ. Với thời gian ngâm hạt 10 phút, 20 phút, 25 phút hạt cho tỷ lệ nảy mầm tương đương nhau, không có sai khác về mặt thống kê, lần lượt là 60%, 56,67%, 70%. Hình thái hạt đẹp, tròn đều, tỷ lệ nảy mầm cao nhất (90%) tương ứng với thời gian ngâm hạt là 15 phút. Xem hình 3.11 nhận thấy về mặt hình thái, hạt ngâm CaCl2.2H2O trong thời gian 10 phút, 20 phút, 25 phút không có sự khác biệt, hạt màu vàng xanh, nảy chồi đều. Với hạt ngâm CaCl2.2H2O trong thời gian 15 phút, hạt nảy chồi và phát triển mạnh. Kết quả phù hợp với các nghiên cứu và phương pháp tạo hạt nhân tạo trên thế giới. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tạo hạt nhân tạo Bảng 3.5 Khảo sát khả năng bảo quản hạt trên môi trường MS: NT Môi trường Tỷ lệ sống % 1 tuần 2 tuần 3 tuần 1 MS 96,67A 76,67AB 73,33AB 2 ½ MS 90A 90A 86,67A 3 ¼ MS 76,67B 63,33B 60BC 4 1/8 MS 73,33B 60B 46,67C CV 9,7% 12,87% 14,36% Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học 43
Đồ án tốt nghiệp 120 100 80 MS % 60 ½ MS 40 ¼ MS 1/8 MS 20 0 1 tuần 2 tuần 3 tuần Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo ở môi trường vỏ hạt khác nhau Hình 3.12 Biểu đồ tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo ở môi trường vỏ hạt khác nhau *Khảo sát tỷ lệ hạt nẩy mầm Khoáng đa lượng có trong vỏ hạt nhân tạo cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo trên môi trường MS Bảng 3.6 Tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo ở các môi trường dinh dưỡng khác nhau. NT Môi trường Tỷ lệ nảy mầm sau 4 Tỷ lệ nảy mầm sau 6 tuần tuần 1 MS 56,67AB 66,67AB 2 ½ MS 70A 83,33A 3 ¼ MS 33,33B 50B 4 1/8 MS 13,33C 30C CV 19,89% 18,51% 44
Đồ án tốt nghiệp Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học 90 80 70 60 50 MS % 40 ½ MS 30 ¼ MS 1/8 MS 20 10 0 4 tuần 6 tuần Tỷ lệ hạt nảy mầm ở các môi trường tạo vỏ hạt khác nhau Hình 3.13 Biểu đồ tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo ở môi trường vỏ hạt khác nhau Hình 3.14 Hạt nhân tạo nảy mầm ở các môi trường vỏ hạt khác nhau 45
Đồ án tốt nghiệp Dựa vào bảng 3.6 có thể thấy môi trường ½ MS đóng vai trò là nguồn dinh dưỡng cho vỏ hạt cho tỷ lệ phôi vô tính nảy mầm cao nhất (83,33%), hạt nảy mầm và phát triển mạnh (hình 3.14), trong khi môi trường MS cho tỷ lệ phôi vô tính nảy mầm là 66,67%, trên môi trường ¼ MS là 50% và trên môi trường 1/8 MS là 30%. Tỷ lệ hạt nhân tạo nảy mầm khá cao là do chất lượng phôi tốt, đồng thời cũng do môi trường tạo vỏ bao và nồng độ alginate thích hợp. Dựa vào hình 3.14 và bảng 3.6 có thể kết luận rằng nồng độ khoáng ½ MS là môi trường thích hợp nhất để làm vỏ bọc hạt nhân tạo của phôi lan Thạch Hộc Tía (Bihua et al, 2014). Nồng độ khoáng càng giảm, khả năng sống sót và nảy mầm của hạt càng thấp. Thí nghiệm 4: Khảo sát môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo * Ảnh hưởng đến vỏ hạt Hạt nhân tạo có vỏ bọc tối ưu (1/2 MS, 30 g/l alginate) được thí nghiệm bảo quản ở các môi trường khác nhau trong 4 tuần và theo dõi tỉ lệ nảy mầm sau 4 tuần. Bảng 3.7 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bảo quản hạt nhân tạo NT Môi trường Nồng độ Môi trường Hình thái vỏ hạt alginate bảo quản 1 ½ MS 30g/l Không dinh dưỡng Vỏ hạt khô, hóa nâu đen 2 ½ MS 30g/l Nước cất Vỏ hạt mềm, màu xanh 3 ½ MS 30g/l Nước đường Vỏ hạt mềm, hóa vàng nâu 4 ½ MS 30g/l MS Vỏ hạt không đổi, phôi mất màu 5 ½ MS 30g/l ½ MS Vỏ hạt không đổi, phôi mất màu 6 ½ MS 30g/l ¼ MS Vỏ hạt không đổi, phôi mất màu 7 ½ MS 30g/l 1/8 MS Vỏ hạt không đổi, phôi mất màu 46
Đồ án tốt nghiệp A: Không dinh dưỡng B: Nước cất C: Nước đường D: MS E: ½ MS F: ¼ MS G: 1/8 MS Hình 3.15. Hình thái vỏ hạt nhân tạo sau 4 tuần bảo quản 47
Đồ án tốt nghiệp Bảng3.8 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bảo quản hạt nhân tạo NT Môi Nồng độ Môi trường bảo Tỷ lệ nảy mầm trường alginate quản 1 ½ MS 30g/l Không dinh dưỡng - 2 ½ MS 30g/l nước cất 83,33A 3 ½ MS 30g/l nước đường 63,33A 4 ½ MS 30g/l MS 26,67B 5 ½ MS 30g/l ½ MS 40B 6 ½ MS 30g/l ¼ MS 23,33B 7 ½ MS 30g/l 1/8 MS 23,33B CV 14% Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học 90 80 70 60 50 % 40 Tỷ lệ nảy mầm 30 20 10 0 nước nước MS ½ MS ¼ MS 1/8 MS cất đường Tỷ lệ nảy mầm của hạt trong các môi trường bảo quản khác nhau Hình 3.16. Biểu đồ tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo ở môi trường bảo quản khác nhau 48
Đồ án tốt nghiệp Dựa vào bảng 3.7 và 3.8, sau thời gian bảo quản 4 tuần trong môi trường lỏng (nước cất) vỏ hạt bị thẩm thấu và nở to ra nhưng không vỡ, hạt vẫn giữ được màu xanh. Tỉ lệ nảy mầm rất cao (83,33%). Trong môi trường bảo quản lỏng có đường, hạt nhân tạo từ PLB của lan Thạch Hộc Tía được bảo quản với mực chất lỏng môi trường cao hơn phần hạt khoảng 2 cm. khi thời gian bảo quản kéo dài phần phôi bên trong hạt hóa vàng chuyển dần sang màu nâu và số hạt chết tăng dần. Điều này cho thấy thể tích môi trường bảo quản có ảnh hưởng nhất định đến quá trình bảo quản hạt trong thời gian dài vì thể tích môi trường lỏng cao hơn phần hạt từ 1 cm trở lên làm hạt bị tù không hô hấp được. Trong môi trường không có chất dinh dưỡng, vỏ hạt nhân tạo khô, bám chặt vào phôi. Điều này xảy ra khi độ ẩm bên trong dụng cụ bảo quản thấp dẫn đến hiện tượng mất nước trong vỏ hạt.Trong môi trường dinh dưỡng MS, ½ MS, ¼ MS, 1/8 MS hình thái vỏ hạt không thay đổi, phôi dần mất màu xanh và số hạt chết tăng dần. Điều này có thể giải thích như sau, trong quá trình bọc phôi bằng môi trường dinh dưỡng, vỏ hạt được bổ sung một lượng khoáng cần thiết cho quá trình sinh tưởng và phát triển. Việc bảo quản hạt nhân tạo của phôi Lan Thạch Hộc trong môi trường khoáng thay đổi có thể dẫn đến việc phôi bị ngộ độc kháng gây nên tình trạng chết dần của hạt nhân tạo. Hạt nhân tạo được giữ trong môi trường lỏng không bổ sung nguồn carbon, các hoạt tính tế bào của phôi giảm đến mức tối thiểu, chẳng hạn như hô hấp ở mức thấp nhất, không có sự tăng trưởng. Tuy nhiên, nếu thời gian giữ trong dịch lỏng quá lâu và thể tích dịch lỏng lớn, hạt sẽ rơi vào tình trạng ngập úng kéo dài, phôi dần dần mất khả năng tái lập lại sự sống sau khi chuyển sang môi trường thích hợp cho nảy mầm. Vì vậy, thời gian bảo quản và thể tích dịch lỏng bảo quản rất có ý nghĩa. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau Khả năng sống sót và tái sinh in vitro của hạt nhân tạo lan Thạch Hộc Tía trên các giá thể khác nhau được thể hiện trên bảng 3.8. Trong thí nghiệm này, vỏ hạt có nồng độ alginate 30 g/l. 49
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.9: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể NT Môi trường tạo Nồng độ Điều kiện nảy Tỷ lệ nảy mầm hạt alginate mầm 1 ½ MS 30g/l Bông gòn 96,67A 2 ½ MS 30g/l MS 53,33B CV 41,83% Các giá trị theo sau bởi chữ cái không cùng ký tự có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học A: Bông gòn B: MS Hình 3.17. Hạt nảy mầm trên các giá thể khác nhau 50
Đồ án tốt nghiệp 120 100 80 % 60 Tỷ lệ nảy 40 mầm 20 0 Bông gòn MS Tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau Hình 3.18. Biểu đồ tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo ở môi trường bảo quản khác nhau Dựa vào bảng số liệu 3.9 có thể kết luận hạt nhân tạo có khả năng sống sót cao khi được nuôi cấy trên các giá thể khác nhau. Với giá thể MS có bổ sung đường, sau 4 tuần nuôi cấy, hạt có tỉ lệ nảy mầm tương đối cao. Mặc dù hạt có thể nẩy chồi nhưng các chồi chưa phát triển mạnh. (Hình 3.17). Trong khi đó, trên giá thể bông gòn, mỗi chồi phát triển 1 – 2 lá và lá dài nhất đạt 1 cm, tỉ lệ nảy mầm cao 96,67%. Như vậy, các kết quả trên hình 3.17 và hình 3.18 có thể đưa ra kết luận giá thể bông gòn là thích hợp nhất cho sự tái sinh của hạt nhân tạo trên lan Thạch Hộc Tía, so với giá thể MS (có ý nghĩa về mặt thống kê). Vì sợi gòn xốp tạo môi trường thông thoáng, khô ráo, giữ độ ẩm lâu nên thích hợp cho hạt nhân tạo nẩy mầm. 51
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận * Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Thạch Hộc Tía Hạt nhân tạo từ phôi cây lan Thạch Hộc Tía có hình dạng đẹp, tỷ lệ nẩy mầm cao khi nồng độ sodium alginate (30 g/l) và môi trường dinh dưỡng (1/2 MS) bổ sung vào vỏ hạt nhân tạo thích hợp cho phôi cây lan Thạch Hộc Tía. Thời gian ngâm hạt trong dung dịch CaCl2.2H2O 100Mm (15 phút) thích hợp cho phôi cây lan Thạch Hộc Tía. Môi trường bảo quản (nước cất) thích hợp cho việc lưu trữ hạt nhân tạo, bảo đảm chất lượng và tỷ lệ nẩy mầm cao cho hạt nhân tạo. Hạt nhân tạo nẩy mầm cho tỷ lệ cao trên môi trường giá thể (bông gòn) 4.2 Đề nghị * Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Thạch Hộc Tía Tiếp tục khảo sát các điều kiện và môi trường bảo quản hạt nhân tạo lâu hơn nhằm tìm ra môi trường bảo quản tối ưu hơn. Tìm giá thể khác gieo hạt nhân tạo có giá rẻ nhưng có tỷ lệ nẩy mầm cao. Tối ưu hóa hạt nhân tạo để giống với hạt tự nhiên. 52
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt 1. Bùi Bá Bổng (1995). Nhân giống cây bằng nuôi cấy mô, Nhà Xuất Bản Sở Khoa Học Công Nghệ Và Môi Trường An Giang. 2. Dương Công Kiên (2002). Nuôi cấy mô thực vật (tập 1), Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh 3. Lê Văn Hoàng (2008). Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật, ĐH Đà Nẵng. 4. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thuỷ Tiên (2002). Công nghệ tế bào, Nhà Xuất Bản. 5. Nguyễn Hoàng Lộc – Lê Việt Dũng (2009). Nuôi cấy mô và tế bào thực vật, Viện tài nguyên môi trường và công nghệ sinh học đại học Huế. *Tài liệu nước ngoài: 6. Hou B, Tian M, Luo J, Ji Y, Xue Q, Ding X (2012). Genetic diversity assessment and ex situ conservation strategy of the endangered Dendrobium officinale (Orchidaceae) using new trinucelotide microsatellite markers. Plant Systematics and Evolution , 298, 1483-91. 7. Bihua Chen, Stephen J. Trueman, Jianmin Li, Qianzhen Li, Huihua Fan, Juan Zhang (2014). Micropropagation of the Endangered Medicinal Orchid, Dendrobium officinale. Life Science Journa,11(9), 526-530 8. Fujimura T. and Komamine A. (1979). Synchronization of somatic embryogenesis in carrot cell suspension culture. Plant physiol 9. Xiang L, Sze CWS, Ng TB, Tong Y, Shaw PC, Tang CWS, Zhang YBK (2013). Polysaccharides of Dendrobium officinale inhibit TNF-α-induced apoptosis in A- 253 cell line. Inflammation Research, 62, 313-24. 10. Xia L, Liu X, Guo H, Zhang H, Zhu J, Ren F (2012). Partial characterization and immunomodulatory activity of polysaccharides from the stem of Dendrobium officinale (Tiepishihu) in vitro. Journal of Functional Foods, 4, 294-301. 53
Đồ án tốt nghiệp 11. Redenbaugh K. et al., 1986. Somatic seed: encapsulation of asexual plant embryo. Biotechnology 12. Liu X-F, Zhu J, Ge S-Y, Xia L-J, Yang H-Y, Qian Y-T, Ren F-Z (2011). Orally administered Dendrobium officinale and its polysaccharides enhance immune functions in BALB/c mice. Natural Product Communications, 6, 867-70. 13. Li X, Ding X, Chu B, Zhou Q, Ding G, Gu S (2008). Genetic diversity analysis and conservation of the endangered Chinese endemic herb Dendrobium officinable Kimura et Migo (Orchidaceae) based on AFLP. Genatica, 133, 159-66 54
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Thí nghiệm 1:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 1 tuần 1
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 1:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 2 tuần 2
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 1:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 3 tuần 3
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 1: Tỷ lệ nẩy mầm sau 4 tuần 4
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 1: Tỷ lệ nẩy mầm sau 6 tuần: 5
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 2: tỷ lệ nảy mầm của hạt sau 4 tuần: 6
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 3:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 1 tuần: 7
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 3:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 2 tuần: 8
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 3:Tỷ lệ sống sót của hạt nhân tạo sau 3 tuần: 9
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 3:Tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo sau 4 tuần: 10
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 3:Tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo sau 6 tuần: 11
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 4:Tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo sau 4 tuần: 12
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 5:Tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo sau 4 tuần: 13