Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố và hệ thống LED lên quá trình nhân nhanh sinh khối, tích lũy saponin in vitro của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố và hệ thống LED lên quá trình nhân nhanh sinh khối, tích lũy saponin in vitro của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ELICITOR, HỆ THỐNG LED CẢI TIẾN, MÔI TRƯỜNG HAI LỚP ĐẾN QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG, TẠO CỦ VÀ TÍCH LŨY SAPONIN TRONG SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Trịnh Thị Lan Anh Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Kim Ngân MSSV: 1411100609 Lớp: 14DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2018
2. i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố và hệ thống LED lên quá trình nhân nhanh sinh khối, tích lũy saponin in vitro của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)” là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Trịnh Thị Lan Anh. Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong đề tài này là trung thực chưa được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong đề tài đã được ghi rõ nguồn gốc. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này. Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Kim Ngân
3. ii LỜI CẢM ƠN Warren Buffett cũng đã từng nói rằng: “Nếu muốn đi nhanh hãy đi một mình, nếu muốn đi xa hãy đi cùng nhau”. Câu nói ấy quả thật không sai, trong suốt quá trình hoàn thành đề tài của mình, em đã được sự quan tâm chăm sóc và dạy dỗ từ Cô TS. Trịnh Thị Lan Anh. Em xin chân thành và trân trọng cảm ơn sự ân cần dạy bảo và những yêu thương mà cô dành cho em, cũng như là các thế hệ sinh viên. Cảm ơn cô vì cô không chỉ là người giảng viên đầy tâm huyết đã cho em hành trang kiến thức vững vàng để vững bước trên con đường nghiên cứu khoa học, mà cô còn yêu thương em như người thân trong một gia đình, luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ em để em sống trọn vẹn với cái tuổi đôi mươi tại giảng đường đại học. Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô, các Anh Chị nhân viên phòng thí nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và hỗ trợ cho em trong suốt quá trình hoàn thành đề tài này. Có người từng nói: “Đời cho ta bao lần đôi mươi”. Tuổi đôi mươi là lứa tuổi đẹp nhất của mỗi người trong chúng ta. Tuổi đôi mươi của em thật đẹp khi là sinh viên ngành Công nghệ sinh học của Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ HUTECH. Trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại giảng đường đại học dưới sự chỉ dạy tận tình và được sự hỗ trợ nhiệt tình từ các thầy cô, em đã được học tập và cháy hết mình với lứa tuổi đôi mươi của mình trog các hoạt động tại Viện, tại Trường. Em xin chân thành cảm ơn bạn Thảo và em Hải đã hỗ trợ tận tình và giúp đỡ em như người thân trong gia đình. Và để có được thành công của ngày hôm nay, có em của ngày hôm nay thì không thể không nhắc đến tình yêu thương và sự ủng hộ từ phía gia đình. Gia đình đã là hậu phương vững chắc cho con vượt qua mọi khó khăn, thử thách trong cuộc sống và tiếp thêm nghị lực cho con. Con cảm ơn Ông Bà ngoại, Ba Mẹ và Cậu đã dạy dỗ, dìu dắt con từ khi chập chững bước đi cho đến khi lớn khôn thành người, luôn cho con những điều tốt nhất. Công ơn trời biển và tình yêu thương vô bờ bến của gia đình là món quà lớn nhất và quý giá nhất mà con được nhận. Con xin biết ơn gia đình vì đã luôn bên cạnh, ủng hộ và động viên con trên mỗi bước đường mà con đã chọn.
4. iii Vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình thực tập, hoàn thiện đề tài này em không tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận được những ý kiến đóng góp từ quý thầy cô. TP. Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 07 năm 2018 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Kim Ngân
5. iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC HÌNH ẢNH ix DANH MỤC BẢNG xii MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Tầm quan trọng của đề tài 1 1.3. Ý nghĩa của đề tài 3 1.3.1. Ý nghĩa khoa học 3 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn 3 1.4. Lý do chọn đề tài 4 2. Tình hình nghiên cứu 4 3. Mục đích nghiên cứu 6 4. Tình hình nghiên cứu 7 5. Phương pháp nghiên cứu 8 6. Các kết quả đạt được của đề tài 8 7. Kết cấu của đề tài 9 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1. Giới thiệu về vi nhân giống và các elicitor 10 1.1.1. Khái niệm vi nhân giống 10 1.1.2. Các chất cảm ứng – Elicitor 10 1.1.2.1. Than hoạt tính 11 1.1.2.2. Saccharose 12 1.1.2.3. Bạc nitrate 13 1.1.3. Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc 13 1.1.4. Vai trò của ánh sáng trong vi nhân giống 15 1.1.4.1. Vai trò của ánh sáng đối với quá trình quang hợp ở thực vật 15
6. v 1.1.4.2. Vai trò của ánh sáng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật 16 1.1.4.3. Vai trò của ánh sáng trong nhân giống in vitro 18 1.1.4.4. Nguồn chiếu sáng nhân tạo sử dụng trong nuôi cấy in vitro hiện nay 19 1.1.5. Đèn LED (Light Emitting Diode) 22 1.1.5.1. Giới thiệu đèn LED 22 1.1.5.2. Ưu, nhược điểm của đèn LED 23 1.1.5.3. Một số thành tựu trên thế giới và Việt Nam khi sử dụng nguồn sáng LED trong nuôi cấy in vitro 24 1.1.5.4. Hướng phát triển ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in vitro ở Việt Nam 27 1.1.6. Ánh sáng đối với thực vật 28 1.1.6.1. Vai trò của một số phổ ánh sáng đơn sắc đến đời sống thực vật 28 1.1.6.2. Vai trò của ánh sáng đến quá trình tích lũy các chất hữu cơ đối với thực vật 30 1.2. Phương pháp định tính và định lượng saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 33 1.2.1. Định tính saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) bằng phương pháp Sắc ký lớp mỏng 33 1.2.2. Định lượng saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao 34 1.3. Sơ lược về cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 37 1.3.1. Giới thiệu sơ lược về cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 37 1.3.2. Đặc điểm hình thái 38 1.3.3. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển 39 1.3.4. Đặc điểm phân bố 40 1.3.5. Nhân giống cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 40 1.3.5.1. Nhân giống từ hạt 40 1.3.5.2. Nhân giống in vitro 42 1.3.6. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 42 1.3.6.1. Thành phần hóa học 42 1.3.6.2. Tác dụng dược lý 43
7. vi 1.3.7. Một số nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 45 1.3.7.1. Nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn nguồn gene cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trên thế giới 45 1.3.7.2. Nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn nguồn gene cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam 46 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 50 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 50 2.1.1. Địa điểm 50 2.1.2. Thời gian 50 2.2. Vật liệu 50 2.2.1. Nguồn mẫu 50 2.2.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy 50 2.2.3. Thiết bị và dụng cụ 51 2.3. Phương pháp nghiên cứu 51 2.3.1. Thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn 53 2.3.2. Thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED hỗn hợp 54 2.4. Bố trí thí nghiệm 55 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 55 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 55 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của bạc nitrate (AgNO3) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 56 2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 57 2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp với tỷ lệ 50:50 (đỏ- vàng; đỏ-xanh dương, vàng-xanh dương) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 58
8. vii 2.4.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 59 2.4.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường hai lớp (kiểu bổ sung các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 60 2.5. Hình thái giải phẫu củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 62 2.6. Thu nhận hợp chất saponin triterpenoid từ sản phẩm của quá trình nuôi cấy in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường hai lớp 62 2.6.1. Định tính saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 62 2.6.2. Định lượng saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chrotomatography – HPLC) 63 2.7. Chỉ tiêu theo dõi 64 2.8. Thống kê và xử lý số liệu 64 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 65 3.2. Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 68 3.3. Thí nghiệm 3. Ảnh hưởng của elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 71 3.4. Thí nghiệm 4. Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 74 3.5. Thí nghiệm 5. Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 76 3.6. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 80 3.7. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy (môi trường hai lớp) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro và tích lũy saponin của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 82
9. viii 3.8. Hình thái Giải phẫu củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 88 3.9. Định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng 90 3.10. Định lượng saponin trong củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi cấy bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 90 KẾT LUẠN VÀ KIẾN NGHỊ 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 PHỤ LỤC
10. ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AC Than hoạt tính BA Benzyladenine BAP 6-Benzyl Amino Purin DNA Deoxyribonucleic Acid GA3 Acid gibberellic HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPTLC Sắc ký lớp mỏng cao áp IAA Acid b-Indolyacetic IBA Acid b-Indolybutyric IFR Cường độ ánh sáng đỏ xa IR Cường độ ánh sáng đỏ KH2PO4 Monopotassium phosphate KH&CN Khoa học công nghệ Kin Kinetin LED Light-Emmitting Diode MS Murashige và Skoog, 1962 NAA Acid a-naphtaleneacetic NaClO Sodium hypocloride SH Schenk và Hildebrandt (1972) TDZ Thidiazuron TLC Sắc ký lớp mỏng UFLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao siêu nhanh WPM Woody Plant Medium 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid
11. x DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Các bước sóng ánh sáng (nguồn Internet) 15 Hình 1.2. A. Sự hấp thu các bước sóng bởi các loại sắc tố quang hợp và cường độ quang hợp; B. Sự hấp thu ánh sáng của chlorophyll a và chlorophyll b (nguồn Internet) 17 Hình 1.3. Các hệ thống chiếu sáng bằng đèn LED. a. Đèn LED với tỷ lệ chiếu sáng 70% LED đỏ kết hợp 30% LED xanh; b. LED uni-Pack (LP) (Nguyễn Bá Nam, 2012) 22 Hình 1.4. Hệ thống nuôi cấy LED truyền điện không dây (Wireless power transfer – LED uni-Pack (WPT - LP)). a. Thiết bị phát; b. Thiết bị thu; c.d. Hoạt động của hệ thống (Nguyễn Bá Nam, 2012) 27 Hình 1.5. Các bước của quá trình sắc ký lớp mỏng 34 Hình 1.6. Sơ đồ hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC 36 Hình 1.7. Hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC 36 Hình 1.8. Cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (Nhut et al., 2011) 37 Hình 1.9. Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (nguồn Internet) 38 Hình 2.1. Mô hình thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn a. Hệ thống chiếu sáng đèn LED trắng; b. Hệ thống chiếu sáng đèn LED vàng; c. Hệ thống chiếu sáng đèn LED xanh dương; d. Hệ thống chiếu sáng đèn LED đỏ 53 Hình 2.2. Hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn sau khi thiết kế và thi công. a. Hệ thống chiếu sáng đèn LED trắng; b. Hệ thống chiếu sáng đèn LED vàng; c. Hệ thống chiếu sáng đèn LED xanh dương; d. Hệ thống chiếu sáng đèn LED đỏ 53 Hình 2.3. Mô hình hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED kết hợp a. 100% LED đỏ (ĐC); b. 50% LED đỏ kết hợp 50% LED vàng; c. 50% LED đỏ kết hợp 50% LED xanh dương; d. 50% LED vàng kết hợp 50% LED xanh dương 54 Hình 2.4. Hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED hỗn hợp sau khi thiết kế và thi công. a. Tỷ lệ chiếu sáng 100% LED đỏ (ĐC); b. Tỷ lệ 50% LED đỏ kết hợp 50% LED vàng; c. Tỷ lệ 50% LED đỏ kết hợp 50% LED xanh dương; d. Tỷ lệ 50% LED vàng kết hợp 50% LED xanh dương 54 Hình 3.1 Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy. A0,
12. xi A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 tương ứng với nồng độ than hoạt tính lần lượt là 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 g/L 67 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy. B0, B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 tương ứng với nồng độ saccharose lần lượt là 30; 40; 50; 60; 70; 80 g/L 70 Hình 3.3. Ảnh hưởng nồng độ elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy. C0, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7 tương ứng với nồng độ AgNO3 lần lượt là 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 mg/L 73 Hình 3.4. Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy. D0, D1, D2, D3, D4 tương ứng với với nguồn sáng là đèn huỳnh quang; LED trắng; LED vàng; LED xanh dương; LED đỏ 75 Hình 3.5. Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy. G0, G1, G2, G3 tương ứng với với các tỷ lệ 100% đỏ; 50% đỏ:50% vàng; 50% đỏ:50% xanh dương và 50% vàng:50% xanh dương 79 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 3 tuần nuôi cấy. L0, L1, L2 tương ứng với trạng thái nuôi cấy là rắn (agar), lỏng tĩnh, lỏng lắc 81 Hình 3.7. Ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy 83 Hình 3.8. Ảnh chụp hiển vi soi nổi hình thái cây và củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi cấy 87 Hình 3.9. Cấu tạo củ Sâm Ngọc Linh Ngọc in vitro sau 16 tuần nuôi cấy 88 Hình 3.10. Ảnh chụp hình thái giải phẫu dưới kính hiển quang học củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy; a) Lát cắt dọc chồi mọc từ củ; b) Lát cắt ngang củ; c1) Lát cắt ngang mô củ, c2) Hình thái tế bào
13. xii mô củ, c3) Mô củ với tế bào nhân bắt màu hồng đậm (mũi tên), c4) Hình thái bó mạch trong lát cắt dọc củ 89 Hình 3.11. Sắc ký đồ HPLC định lượng Rg1 và Rb1 ở nghiệm thức ĐC (nuôi cấy trên môi trường agar một lớp: không than hoạt tính) Sâm Ngọc Linh (Panaxx vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy 91 Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC định lượng Rg1 và Rb1 ở nghiệm thức E8 (nuôi cấy trên môi trường 2 lớp lỏng-rắn: có than hoạt tính) Sâm Ngọc Linh (Panaxx vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy 91
14. xiii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Ảnh hưởng của các bước sóng ánh sáng khác nhau lên thực vật (Trần Thị Hồng Thúy, 2014) 18 Bảng 1.2. Thành phần hoá học chung của Sâm Ngọc Linh 43 Bảng 1.3. So sánh thành phần và hàm lượng của saponin trong Sâm Ngọc Linh và các loài Sâm nhóm 1 44 Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 55 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của saccharose đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 56 Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của AgNO3 đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 57 Bảng 2.4. Ảnh hưởng ánh sáng LED đơn đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 58 Bảng 2.5. Ảnh hưởng của ánh sáng LED cải tiến hỗn hợp với tỷ lệ 50:50 (đỏ-vàng; đỏ- xanh dương, vàng-xanh dương) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 59 Bảng 2.6. Khảo sát ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 60 Bảng 2.7. Khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin trong củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 61 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy 65 Bảng 3.2. Ảnh hưởng nồng độ elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy 68 Bảng 3.3. Ảnh hưởng nồng độ elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy 71 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy 74
15. xiv Bảng 3.5. Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy 77 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả năng tăng trưởng của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 3 tuần nuôi cấy 80 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của môi trường hai lớp đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro và tích lũy saponin của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy 82 Bảng 3.8. Kết quả phân tích HPLC hàm lượng saponin (ginsenoside Rg1 và Rb1) trong củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi cấy khi khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy 78
16. 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài 1.1. Đặt vấn đề Sâm Ngọc Linh có tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv., thuộc họ Nhân Sâm (Araliaceae). Chữ Panax xuất phát từ chữ Panacea trong tiếng Hy Lạp, có nghĩa là thuốc trị bá bệnh, thần dược. Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là một loài Sâm đặc hữu của Việt Nam được biết đến từ năm 1973. Tại hội nghị quốc tế về Sâm, loài Sâm này được xếp vào nhóm Sâm quý trên thế giới cùng với Sâm Triều Tiên (Panax ginseng), Sâm Mỹ (Panax quinquefolium), (Phai et al., 2002). Sâm Ngọc Linh là một trong những cây dược liệu quý cần được bảo tồn, có tên trong Sách Đỏ Việt Nam 2007 [25]. Sâm Ngọc Linh chứa 52 loại saponin, 17 acid amin, 20 chất khoáng vi lượng và 0,1% tinh dầu. Sâm Ngọc Linh có hàm lượng saponin khung dammaran cao nhất (khoảng 12 – 15%) và lượng saponin triterpenoidoid nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax trên thế giới (Le Thi Hong Van et al., 2015). Qua nhiều nghiên cứu, các nhà khoa học ở Việt Nam và trên thế giới đã thấy rằng Sâm Ngọc Linh không chỉ có các tác dụng dược lý đặc trưng của chi Nhân Sâm mà còn có những tác dụng dược lý điển hình như chống stress, chống trầm cảm, chống oxy hóa, chống ung thư và tăng cường hệ miễn dịch (Nguyễn Thượng Dong và cộng sự, 2007). Với những đặc điểm đó, Sâm Ngọc Linh không chỉ là loài Sâm quý của Việt Nam mà còn là của thế giới. 1.2. Tầm quan trọng của đề tài Sâm Ngọc Linh là một cây dược liệu quý và có giá trị kinh tế cao của Việt Nam (40 – 100 triệu VNĐ/kg). Từ đầu tháng 10/2017, Ủy Ban Nhân Dân huyện Nam Trà My (Quảng Nam) đã chính thức mở phiên chợ Sâm Ngọc Linh nhằm góp phần tìm ra giải pháp duy trì, bảo tồn và phát huy giá trị Sâm Ngọc Linh theo Chương trình phát triển sản phẩm quốc gia đến năm 2020 do Thủ tướng Chính Phủ phê duyệt. Tại phiên chợ Sâm Ngọc Linh lần thứ 6 được tổ chức vào đầu tháng 3/2018, Sâm Ngọc Linh có giá bán từ 85 triệu/kg [79]. Từ khi phát hiện năm 1973 đến 1995 thì loài này đã bị khai thác cạn kiệt và đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng mất nguồn gene quý hiếm (Trần Công Luận, 2003). Đến nay, quần thể Sâm Ngọc Linh tự nhiên đang bị khai thác mạnh mẽ, dẫn tới nguy cơ tận diệt do nhu cầu của thị trường dược liệu ngày càng tăng cao. Ngày 12/9/2015, Phó
17. 2 Thủ tướng Chính phủ Vũ Đức Đam đã phê duyệt Đề án bảo tồn và phát triển cây Sâm Ngọc Linh (Sâm Việt Nam) đến năm 2030 trị giá 9.500 tỷ đồng nhằm bảo vệ nguồn gene quý, kết hợp bảo vệ và phát triển nguồn nguyên liệu Sâm góp phần xóa đói giảm nghèo, phát triển kinh tế - xã hội (nguồn Internet). Hoàng Hải Anh và cộng sự (2011) đã báo cáo rằng Sâm Việt Nam nuôi cấy mô cũng có các saponin chính tương tự như Sâm Việt Nam tự nhiên, gồm G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1 và M-R2. Tuy hàm lượng tổng cộng các saponin chính trong Sâm Việt Nam nuôi cấy mô chưa cao (0,3% so với 12,96% trong Việt Nam thiên nhiên). Việc nghiên cứu hoàn chỉnh quy trình nuôi cấy mô cây Sâm Ngọc Linh cung cấp nguồn cây Sâm giống cho trồng trọt và sử dụng để thay thế Sâm thiên nhiên, đã mở ra một hướng mới trong sản xuất nguyên liệu cây Sâm Ngọc Linh: chủ động được nguồn nguyên liệu dồi dào trong thời gian ngắn, phục vụ công tác nghiên cứu, sản xuất thuốc và các sản phẩm thực phẩm chức năng. Từ trước đến nay, các nghiên cứu trong lĩnh vực nuôi cấy mô ở đối tượng cây Sâm Ngọc Linh chưa nhiều vì đây là loài Sâm đặc hữu của Việt Nam. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc cải tiến thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy, chuyển gene, chủ yếu là nghiên cứu tạo mô sẹo, phát sinh phôi, nuôi cấy rễ tóc, thu sinh khối trong bioreactor, các kết quả đạt được là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn. Đặc điểm của Sâm Ngọc Linh là tăng trưởng rất chậm, yêu cầu sinh thái khắt khe, việc nghiên cứu về tạo củ in vitro vẫn chưa nhiều, chưa có nghiên cứu nào báo cáo về kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy (môi trường hai lớp lỏng-rắn) lên sự tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin ở cây Sâm Ngọc Linh. Nghiên cứu về ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc đến quá trình sinh trưởng của Sâm Ngọc Linh chỉ có một vài báo cáo được công bố, các nghiên cứu cũng đã cho thấy rằng Sâm Ngọc Linh được nuôi cấy in vitro có thành phần hóa học tương tự như Sâm Ngọc Linh tự nhiên tuy nhiên với hàm lượng thấp, thậm chí một số chất chỉ được phát hiện ở dạng vết, một số chất chưa được phát hiện trong Sâm nuôi cấy in vitro. Một số nghiên cứu đã cho thấy rằng các elicitor có tác động tích cực đến sự tăng trưởng cũng như quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp ở thực vật. Tuy nhiên, đối với từng loại thực vật và mục đích nuôi cấy, việc lựa chọn loại và nồng độ các elicitor phải được xem xét kỹ lưỡng. Đây là một loài dược liệu vô cùng quý giá, việc hoàn
18. 3 thiện quy trình nhân giống và gia tăng hàm lượng dược chất quý hiếm là điều mà nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và được Chính phủ chú trọng phát triển nguồn cây trồng quốc gia. Trong đó, nghiên cứu tạo củ in vitro, kích thích tăng trưởng, rút ngắn thời gian nhân giống, tăng sức sống của cây con nhằm tạo được số lượng lớn cây giống khỏe mạnh, tăng tỷ lệ sống sót khi chuyển ra vườn ươm là điều vô cùng cấp thiết. 1.3. Ý nghĩa của đề tài 1.3.1. Ý nghĩa khoa học Đề tài sẽ giúp hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sẽ cung cấp những cơ sở khoa học cho công tác nhân giống in vitro cây trồng nói chung và cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nói riêng. Cung cấp cơ sở khoa học cho bảo vệ nguồn gen cây Sâm Ngọc Linh là một trong những mối quan tâm hàng đầu hiện nay. Nghiên cứu ảnh hưởng hệ thống LED cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro của Sâm Ngọc Linh cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá ảnh hưởng của đèn LED đến nuôi cấy in vitro cây Sâm Ngọc Linh. Góp phần định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo về ảnh hưởng của ánh sáng LED đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh in vitro. Đề tài sẽ cung cấp những tài liệu khoa học về Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), thuộc chi Panax. Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Các kết quả nghiên cứu sẽ bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho nghiên cứu khoa học về loài Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn Xây dựng quy trình nhân nhanh Sâm Ngọc Linh thông qua khảo sát các chất yếu tố ảnh hưởng đến cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nhằm nhân nhanh với số lượng lớn, hạ giá thành cây giống, góp phần bảo tồn nguồn gene cây thuốc quý. Nghiên cứu ảnh hưởng của đèn LED đến sự sinh trưởng của cây Sâm Ngọc Linh là cơ sở đánh giá khả năng ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in vitro cây trồng nói chung và Sâm Ngọc Linh nói riêng, hướng tới tìm nguồn ánh sáng thích hợp thay thế đèn huỳnh quang và các loại đèn đang dùng trong nuôi cấy Sâm Ngọc Linh hiện nay, là cơ sở
19. 4 giúp hạ giá thành sản phẩm cây Sâm Ngọc Linh giống. Hoặc định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về ứng dụng của đèn LED đến cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 1.4. Lý do chọn đề tài Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là loài Sâm đặc hữu của Việt Nam đã được nghiên cứu về thực vật học, dược tính, thành phần hóa học. Các kết quả nghiên cứu đã cho thấy đây là loài dược liệu quý giá và được xem là một trong những phát hiện quan trọng bậc nhất trong lĩnh vực y dược. Việc nhân giống Sâm Ngọc Linh còn gặp nhiều khó khăn do đây là loài đặc hữu của Việt Nam, yêu cầu sinh thái rất khắt khe, tăng trưởng rất chậm và chỉ trồng được ở các khu vực quanh đỉnh núi Ngọc Linh (thuộc địa phận hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam). Thời gian trồng trọt phải kéo dài từ 6 đến 7 năm mới có thể thu hoạch (do củ cần nhiều thời gian để tích lũy các hợp chất sinh học quý giá). Các nghiên cứu về loài Sâm này chưa nhiều, chưa có một quy trình nhân giống hoàn chỉnh phổ biến được chuyển giao công nghệ. Đây là loài dược liệu đắt tiền bậc nhất, nhu cầu thị trường rất cao, khai thác cạn kiệt và đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng. Đang được Chính phủ quan tâm và chú trọng đầu tư phát triển. Xuất phát từ những yêu cầu cấp thiết đó chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống LED cải tiến, môi trường hai lớp đến quá trình nhân giống, tạo củ và tích lũy saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh nhằm mục đích cải tiến môi trường, điều kiện nuôi cấy, hệ thống nuôi cấy, kiểu bổ sung thành phần dinh dưỡng (môi trường hai lớp lỏng-rắn) và hoàn thiện quy trình nhân nhanh loài Sâm quý này góp phần bảo tồn và nhân nhanh giống loài Sâm đặc hữu của Việt Nam. 2. Tình hình nghiên cứu Hiện nay, cây Sâm Ngọc Linh là đối tượng đang rất được quan tâm và chú ý nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình nhân giống nhanh, rút ngắn được thời gian sinh trưởng so với cây Sâm Ngọc Linh trong tự nhiên mà vẫn đảm bảo được hàm lượng các dược chất quý giá vốn có như saponin triterpenoid, ginsenoside để đảm bảo được nhu cầu tiêu dùng của thị trường. Trong đó phải kể đến các công trình nghiên cứu như Hoàng Văn Cương
20. 5 (2012) đã chứng minh ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và khả năng tích lũy saponin thông qua quá trình nuôi cấy mô sẹo và cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro. Nguyễn Thị Liễu và cộng sự (2011) đã tạo được rễ bất định của Sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. Hà Thị Loan (2014) đã sử dụng Agrotobacterium rizogenes chứa gene rol cảm ứng tạo rễ tóc. Kết quả cho thấy rễ tóc được nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc sinh trưởng tốt và có sự hiện diện của 3 hoại chất saponin đặc trưng trong Sâm Ngọc Linh. Nuôi cấy rễ tóc với những ưu điểm vượt bậc đã được khẳng định là sinh trưởng mạnh, không hướng đất, không phụ thuộc vào chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh, bền vững về mặt di truyền và có khả năng tổng hợp các hoạt chất thứ cấp với hàm lượng cao hơn hoặc bằng cây mẹ giúp giảm được những ảnh hưởng không mong muốn đến sức khỏe người tiêu dùng và nâng cao tính an toàn của sản phẩm, mở ra giải pháp mới cho sản xuất saponin ở quy mô công nghiệp. Mai Trường và cộng sự (2014) đã thành công trong việc tạo và nhân phôi soma Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường lỏng. Vũ Thị Hiền và cộng sự (2015) đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong nghiên cứu quá trình cứu hình thái của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Trước nhu cầu rất lớn về Sâm Ngọc Linh dùng để làm thuốc, thực phẩm chức năng của các công ty dược và người dân, một số Trung tâm nuôi cấy mô đã chuyển hướng nghiên cứu nhân nhanh giống Sâm Ngọc Linh in vitro. Trong nhân giống in vitro thực vật, ánh sáng khác nhau về chất lượng, cường độ và thời gian chiếu sáng đều có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng, phát triển của thực vật. Tổng lượng ánh sáng mà cây thu nhận trong suốt quá trình chiếu sáng có tác động trực tiếp lên quang hợp, sự sinh trưởng và năng suất của cây. Nguồn sáng nhân tạo sử dụng phổ biến trong nhân giống in vitro hiện nay là đèn huỳnh quang. Mặc dù một số đèn huỳnh quang thích hợp cho sự tăng trưởng thực vật nhưng tất cả các đèn huỳnh quang đều tỏa nhiệt, lại phải tiêu tốn thêm một phần điện năng để làm giảm nhiệt độ nóng do các đèn này gây ra. Theo Dương Tấn Nhựt (2002), chi phí điện năng ước tính khoảng 65% dùng cho thắp sáng trong phòng nuôi cây và khoảng 25% để làm mát phòng nuôi. Do đó, sự phát triển
21. 6 nguồn bức xạ hiệu quả hơn được sử dụng trong các phòng nuôi cấy mô sẽ mang lại nguồn lợi đáng kể để giảm chi phí sản xuất trong vi nhân giống. Các nghiên cứu trong nước về lĩnh vực nuôi cấy mô hiện nay chủ yếu tập trung vào nghiên cứu ảnh hưởng của các phytohormone trong quá trình phát sinh hình thái hay sinh trưởng và phát triển của thực vật mà chưa đi sâu tìm hiểu vai trò của ánh sáng trong nhân giống in vitro, đặc biệt là nguồn chiếu sáng từ đèn LED (Light Emitting Diode). Hiện nay, đèn LED là thiết bị chiếu sáng đầy hứa hẹn cho các phòng nuôi cấy mô và nâng cao khả năng tăng trưởng sinh học nhờ vào kích thước nhỏ, cấu trúc rắn, an toàn và tuổi thọ cao. LED có những đặc tính tốt hơn so với các nguồn sáng khác như: đèn huỳnh quang, đèn sợi đốt, đèn natri cao áp. Bước sóng của nó phát ra rất đặc biệt, chiều rộng của vạch quang phổ ngắn, do vậy hiện nay LED được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu về quang sinh học như là sự tổng hợp chlorophyll, quang hợp và quang phát sinh hình thái. 3. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor (than hoạt tính, saccharose và AgNO3) ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và tích lũy saponin của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nhằm tìm ra nồng độ thích hợp của các elicitor trên bổ sung vào môi trường nuôi cấy giúp mẫu cấy tăng trưởng và tích lũy saponin tối ưu. Sau khi xác định được nồng độ các elicitor (than hoạt tính, saccharose và AgNO3) thích hợp, tiến hành thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến sử dụng đèn LED bóng tròn được sản xuất sẵn có thể sử dụng trực tiếp nguồn điện 220V để lắp đặt và thi công trong thiết kế hệ thống LED đơn và LED kết hợp để khảo sát ảnh hưởng của các bước sóng ánh sáng LED riêng lẻ (đỏ, xanh dương, vàng và trắng) và LED kết hợp (đỏ-vàng; đỏ-xanh dương, vàng-xanh dương với tỷ lệ kết hợp là 50:50) đến quá trình quá trình sinh trưởng, tạo củ và tích lũy saponin của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Sau khi xác định được nguồn chiếu sáng thích hợp, để đẩy nhanh tốc độ tăng trưởng của mẫu cấy, tiến hành nuôi cấy lỏng (lỏng tĩnh và lỏng lắc) nhằm tìm ra điều kiện nuôi cấy thích hợp (lỏng lắc-giai đoạn cảm ứng) giúp thúc đẩy mẫu cấy tăng trưởng nhanh. Sau giai đoạn nuôi cấy cảm ứng các mẫu cấy sẽ được cấy chuyền sang môi trường nuôi cấy hai lớp nhằm tìm ra kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp (môi
22. 7 trường hai lớp) cho sự tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin trong củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Mục đích nghiên cứu giúp rút ngắn thời gian nhân giống, tăng số lượng và chất lượng cây giống, giúp hạ giá thành sản phẩm, góp phần bảo tồn và cung cấp nguồn gene Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) quý giá. Cung cấp cây giống chất lượng cao với số lượng lớn không giới hạn cho các nhà vườn, doanh nghiệp trồng làm nguyên liệu dược và thực phẩm chức năng, từ đó có thể cải thiện đời sống nhân dân, tiến dần đến thương mại hóa sản phẩm Sâm Ngọc Linh, tạo thương hiệu cho sản phẩm đặc hiệu của Việt Nam. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất cảm ứng – elicitor đến quá trình sinh trưởng và tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.): + Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến quá trình sinh trưởng và tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). + Nghiên cứu ảnh hưởng của saccharose đến quá trình sinh trưởng và tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). + Nghiên cứu ảnh hưởng của bạc nitrate đến quá trình sinh trưởng và tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Nghiên cứu ảnh hưởng của hệ thống LED cải tiến đến quá trình sinh trưởng và tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.): + Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến quá trình sinh trưởng và tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). + Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp với tỷ lệ 50:50 (đỏ-vàng; đỏ-xanh dương, vàng-xanh dương) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Nghiên cứu ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường hai lớp (kiểu bổ sung các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro.
23. 8 Giải phẫu hình thái củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro. Thu nhận hợp chất saponin triterpenoid từ sản phẩm của quá trình nuôi cấy in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường hai lớp: + Định tính saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng + Định lượng saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chrotomatography – HPLC) 5. Phương pháp nghiên cứu Tùy vào mục đích thí nghiệm mà chúng tôi thay đổi các yếu tố khảo sát để bố trí thí nghiệm (các elicitor, nguồn chiếu sáng cải tiến LED đơn hay LED hỗn hợp, hệ thống nuôi cấy lỏng tĩnh, lỏng lắc, kiểu bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy – môi trường hai lớp). Mỗi thí nghiệm có nhiều nghiệm thức khác nhau. Thiết kế và thi công hệ thống đèn LED cải tiến sử dụng các bóng LED tròn được sản xuất sẵn tỏa nhiệt thấp sử dụng trực tiếp nguồn điện 220V tiết kiệm chi phí cho bộ chuyển đổi điện một chiều 110V sang 220V dễ dàng thi công lắp đặt. Định tính saponin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng, định lượng saponin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố với 3 lần lặp lại (30 bình nuôi cấy/lần). Các số liệu thu được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.1 và chương trình MicroSoft Excel 2013. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c, ) chỉ sự sai khác thống kê ở mức ý nghĩa 0,05. 6. Các kết quả đạt được của đề tài Xác định được nồng độ các elicitor như than hoạt tính, saccharose, AgNO3, thích hợp cho nhân giống, tăng trưởng, và tạo củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), cụ thể như sau: + Môi trường SH bổ sung 1 g/L than hoạt tính là thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (nghiệm thức A2). + Tùy vào mục đích nghiên cứu mà nồng độ saccharose thay đổi (tạo cây hoàn chỉnh 30 m/L; nhân nhanh sinh khối mô sẹo: 70 g/L).
24. 9 + Môi trường SH bổ sung 2,0 mg/L AgNO3 (C4) là thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). + Hệ thống chiếu sáng cải tiến LED đỏ thích hợp cho việc thay thế các nguồn sáng huỳnh quang truyền thống nhằm kích thích sự phát triển và tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh mang lại hiệu suất kinh tế cao hơn do tiết kiệm năng lượng chiếu sáng và năng lượng làm mát không gian phòng nuôi mẫu. + Hệ thống chiếu sáng cải tiến LED xanh dương và ánh sáng LED đỏ kết hợp với tỷ lệ 50:50 thích hợp cho sự phát triển và tạo củ in vitro của Sâm Ngọc Linh. Nuôi cấy lỏng lắc (nghiệm thức L2) cho kết qủa mẫu cấy Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) tăng trưởng tốt nhất sau 3 tuần nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy 2 lớp dạng lỏng-rắn (lỏng-agar) (E8), lớp trên lỏng có than hoạt tính, lớp dưới đặc có than hoạt tính thích hợp nhất cho sự tăng trưởng và tạo củ in vitro. Sau 16 tuần nuôi cấy, mẫu cấy tăng trưởng khỏe mạnh, tạo củ in vitro với kích thước lớn, hình thái củ tương tự với củ Sâm Ngọc Linh trong tự nhiên. Kết quả phân tích sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy, sắc đồ sắc ký lớp mỏng của củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi xuất cấy hiện các vết tương tự như Sâm Việt Nam tự nhiên, các vết saponin tương ứng với các vết của saponin chuẩn. Kết quả phân tích cho thấy củ Sâm Ngọc Linh in vitro có sự hiện diện của các saponin Rg1, Rb1, MR2. Kết quả phân tích định lượng saponin (ginsenoside Rg1 và Rb1) trong củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy in vitro cho thấy có sự hiện diện của 2 loại saponin với hàm lượng cao (G-Rg1: 1,314 mg/g và G-Rb1: 1,425 mg/g). 7. Kết cấu của đồ án Đồ án gồm những chương sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị
25. 10 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về vi nhân giống và các elicitor 1.1.1. Khái niệm vi nhân giống Vi nhân giống (micropropagation) hay còn gọi là nhân giống in vitro (in vitro propagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác. Nhân giống in vitro, trong nhiều thập niên vẫn được xem là một trong những kỹ thuật hữu hiệu nhất dùng để nhân nhanh các giống cây trồng sạch bệnh đã được tuyển chọn hoặc các nguồn gene thực vật quý hiếm. 1.1.2. Các chất cảm ứng – Elicitor Hợp chất thứ cấp của thực vật không chỉ giúp thực vật tự vệ, chống chịu lại sâu bệnh và điều kiện môi trường khắc nghiệt mà còn hữu ích cho con người khi có khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: y dược, hóa học, mỹ phẩm và nông nghiệp. Saponin triterpenoid là hợp chất quý hơn cả vàng có trong chi Nhân Sâm nói chung và Sâm Ngọc Linh nói riêng. Để thu được lượng lớn hợp chất thứ cấp, theo phương pháp truyền thống đòi hỏi hao tốn rất nhiều sinh khối thực vật. Do đó, khoa học hiện đại đã nghiên cứu ứng dụng các chất cảm ứng (elicitor) trong nuôi cấy mô tế bào thực vật để thu được lượng lớn hợp chất đích như mong muốn. Elicitor được định nghĩa là một chất cơ bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì kích thích sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong tế bào. Sự kích kháng thực vật là quá trình cảm ứng hoặc tăng cường sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp do sự bổ sung theo hàm lượng của elicitor (Namdeo, 2007). Đối với loài có thời gian tăng trưởng kéo dài và khó nhân giống trong tự nhiên như Sâm Ngọc Linh, việc bổ sung các chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy vừa giúp nhân nhanh sinh khối, rút ngắn thời gian tăng trưởng và thu được lượng lớn hợp chất thứ cấp. Elicitor bao gồm các chất có nguồn gốc từ mầm bệnh và các chất được tiết ra từ thực vật bằng phản ứng của mầm bệnh (elicitor nội sinh). Trên cơ sở bản chất tự nhiên, elicitor có thể được phân thành 2 nhóm là: elicitor phi sinh học và elicitor sinh học.
26. 11 Elicitor phi sinh học là các chất có nguồn gốc không thuộc sinh vật học, gồm các muối vô cơ, các kim loại nặng và các tác nhân vật lý như sóng siêu âm, áp suất, nhiệt độ, và pH. Elicitor sinh học là các chất có nguồn gốc sinh vật học, bao gồm các polysacharide có nguồn gốc từ thành tế bào thực vật (pectin hoặc cellulose), các vi sinh vật (chitin hoặc glucan) và các glycoprotein, G-protein hay các protein nội bào có chức năng là gắn với các receptor và tác động bằng cách hoạt hóa hoặc bất hoạt một số enzyme hoặc các kênh ion. Ngoài ra, có thể phân loại elicitor dựa trên nguồn gốc của chúng 2 loại elicitor là elicitor ngoại sinh và elicitor nội sinh. Elicitor ngoại sinh là các chất có nguồn gốc bên ngoài tế bào như các polysaccharide, polyamine và các acid béo. Elicitor nội sinh là các chất có nguồn gốc bên trong tế bào, được hình thành thông qua các phản ứng thứ cấp, được cảm ứng bằng tín hiệu sinh học hay phi sinh học, chẳng hạn như galacturonide hoặc hepta-β-glucoside, (Namdeo, 2009). 1.1.2.1. Than hoạt tính Trước đây, than hoạt tính (Actived charcoal – AC) thường được sử dụng để phòng độc, lọc không khí và các chất lỏng. Hiện nay, than hoạt tính đã được tinh chế và sản xuất rộng rãi như một chất có tính hấp phụ cao và được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô nhờ tác động lên sự phát sinh hình thái và phát sinh cơ quan của thưc vật (Pan et al., 1998). Vai trò của AC trong nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu là tạo điều kiện “tối” cho môi trường nuôi cấy, hấp phụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vậy như phenolic, dịch rỉ nâu sinh ra từ mẫu môi trường nuôi cấy (Biniak, 1990). Ngoài ra than hoạt tính cũng có thể hấp thụ các vitamin, cytokinin và auxin (Ebert et al., 1990; Fridborg et al., 1978), làm thay đổi tỷ lệ thành phần các chất có trong môi trường nuôi cấy cũng như pH môi trường (Wann et al., 1997). Từ khi AC được ứng dụng trong lĩnh vực nuôi cấy mô, các nhà khoa học chủ yếu tập trung nghiên cứu và đã công bố về ảnh hưởng của nó trong việc cải tiến môi trường nuôi cấy (Buter et al., 1993), tăng cường khả năng tái sinh cây (Krajnáková et al., 2009), phát sinh phôi (Mathews et al., 1993), tăng sinh tế bào trần (Kunitake H. et al., 1995),
27. 12 ngăn cản sự phát triển bất bình thường của cây con, kích thích quá trình hình thành và phát triển chồi (Kee-Kee-oeup et al., 2000), thúc đây hay ức chế sự tăng trưởng và hình thành rễ (Christopher et al., 2012); ngoài ra AC còn có khả năng làm giảm hiện tượng thủy tinh thể ở một số loài thực vật (Debergh et al.1981). Nguyễn Thị Nhật Linh và cộng sự (2012) đã tiến hành cấy các chồi cây Hồng môn vào môi trường được phân thành 2 phần, một phần không có AC và phần còn lại bổ sung các nồng độ AC tối ưu đã khảo sát ở hai đối tượng cây Cúc (3 g/L AC) và Hồng môn (2 g/L AC) bằng cách thay đổi vị trí lớp AC trong môi trường nuôi cấy (trên, giữa hoặc dưới). Kết quả cho thấy, hầu hết các rễ phát sinh trong lớp môi trường có AC (trên 80% rễ). Ngoài ra, các kết quả cũng cho thấy sự định hướng rễ của cây Hồng môn phụ thuộc vào vị trí lớp AC nhiều hơn ở cây Cúc. Vị trí lớp môi trường có AC ở dưới là tối ưu cho sự phát triển của cây và rễ in vitro của cả cây Cúc và cây Hồng môn. Mặt khác, những cây sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện in vitro cũng sinh trưởng và phát triển tốt ở điều kiện ex vitro; điều này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu nhân giống vô tính cây trồng. 1.1.2.2. Saccharose Trong nuôi cấy in vitro, mô và tế bào thực vật sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, nên việc đưa đường vào môi trường nuôi cấy làm nguồn chất hữu cơ là điều bắt buộc (Lê Trần Bình và cộng sự, 1997). Đường saccharose không chỉ điều hòa áp suất thẩm thấu của môi trường mà còn là nguồn cacbohydrate tốt nhất cung cấp cho mô và tế bào. Nhưng khi nồng độ đường quá cao sẽ hạn chế hiệu quả hấp thu nước của mô cây. Hai dạng đường thường gặp nhất trong nuôi cấy in vitro là glucose và saccharose, trong đó saccharose được sử dụng phổ biến hơn (Nguyễn Đức Lượng, 2001). Tùy theo mục đích nuôi cấy mà hàm lượng đường cho vào môi trường khác nhau, thông thường là 30 – 40 g/L là tương đối thích hợp cho nhiều loại cây (Vuylsteke, 1989). Các nghiên cứu trên dưa Cucumis hystrix (Michael et al., 2001), cây dâu tây (Hyung, 1996) và cây hành (Teruyuki, 1999) đều cho thấy hàm lượng đường 30 g/L là thích hợp cho chồi phát triển tốt trong nuôi cấy in vitro. Theo nghiên cứu của Lâm Ngọc Phương và cộng sự (2005) đã chứng minh rằng cho thấy sự phát triển của chồi dưa hấu tam bội tốt nhất trong môi trường MS có chứa 30 g/L
28. 13 saccharose với 0,5 mg/L BA dưới cường độ ánh sáng 1.800 lux. Những chồi này phát triển rất tốt, cao và nhiều lá sẽ là vật liệu tốt để nhân chồi, ra nhiều rễ và dễ thuần dưỡng. 1.1.2.3. Bạc nitrate AgNO3 còn được gọi là bạc nitrate. AgNO3 là chất có khả năng điều khiển quá trình sinh trưởng, phát triển của chồi thông qua tác động vào quá trình trao đổi ethylene (Biddington, 1992). Chính vì thế, bổ sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy có thể ức chế việc tổng hợp ethylene hoặc chức năng của ethylene bằng cách tác động lên quá trình tổng hợp hoặc tác động lên tín hiệu trao đổi chất (Pua và Chi, 1993), qua đó ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Do vậy, bạc nitrate cũng là một elicitor. Các ion bạc dưới dạng nitrate (AgNO3) có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến quá trình phát sinh cơ quan, sinh phôi, ra rễ in vitro, cảm ứng hoa, ra hoa sớm, kiểm soát hiện tượng rụng lá thông qua việc ức chế hoạt động của ethylene (Sharma, 2008). Nguyễn Thị Phương Thảo và cộng sự (2015) nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật và khoáng vi lượng đến sự sinh trưởng và ra hoa in vitro của cây hoa hồng cho thấy kết quả là bổ sung 30 µM AgNO3 là tốt nhất cho sự sinh trưởng và hình thành hoa với tỷ lệ ra hoa ở các giống hoa hồng. Trương Thị Phương Lan và cộng sự (2017) nghiên cứ ảnh hưởng của AgNO3 đến quá trình tái sinh cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) cho thấy kết quả là bổ sung 1,5 mg/L AgNO3 vừa có thể tạo rễ lẫn phát sinh chồi mới. 1.1.3. Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc Nuôi cấy lỏng lắc: nuôi cấy lỏng lắc thúc đẩy sự phân chia và tăng trưởng của tế bào trong môi trường lỏng (Torres, 1989). Là phương pháp nuôi cấy thực vật bằng môi trường lỏng, bình nuôi cấy được đặt trên máy lắc (shaker), tuỳ vào mục đích nuôi cấy, đối tượng nuôi cấy mà số vòng quay của máy lắc được điều chỉnh khác nhau (từ 90 – 180 vòng/phút). Các tế bào được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng do mẫu được ngâm trực tiếp vào dung dịch môi trường. Sự thông khí được thực thực hiện nhờ máy lắc ở tốc độ 100 – 150 vòng/phút. Khí đưa vào phải đảm bảo vô trùng. Quá trình thông khí còn ngăn chặn và làm giảm sự kết dính của các tế bào với nhau.
29. 14 Theo Thomass và Davey (1975), nuôi cấy huyền phù tế bào có dung tích 25 mL, tốc độ phù hợp nhất của máy lắc là 100 − 150 vòng/phút. Thể tích của môi trường lỏng phải phù hợp với kích thước bình nuôi cấy, thường chiếm 20% thể tích bình. Debergh (1983) và George (1993) đã cho rằng lượng nước trong môi trường thạch rắn thấp khiến cho sự hấp thụ bởi thực vật thấp hơn so với môi trường lỏng lắc. Các nuôi cấy quy mô nhỏ như phòng thí nghiệm và trong những thời gian ngắn, có thể máy lắc từ ở tốc độ 250 vòng/phút và thời gian nuôi cấy thường từ 10 – 15 ngày. Sau đó, các mẫu nuôi cấy phải được chuyển vào môi trường mới để đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào. Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc có ưu thế hơn các phương pháp khác là mẫu cấy được tiếp xúc đầy đủ hơn với môi trường dinh dưỡng nên tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh. Nhờ việc liên tục được di chuyển trong môi truờng nuôi cấy nên ít xảy ra hiện tượng ưu thế ngọn, sự ngủ của chồi biến mất và kết quả là tạo ra được nhiều chồi hơn.  Mục đích của nuôi cấy lỏng lắc: Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật bằng môi trường lỏng sẽ khắc phục được một số nhược điểm khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn: Các mẫu nuôi cấy được ngập và phân bố theo không gian 3 chiều nên tiết kiệm được không gian, mẫu cấy hấp thụ hết môi trường dinh dưỡng trong bình nuôi cấy. Tăng cường được sự thoáng khí nên kích thích mẫu phát triển nhanh. Khi nuôi cấy ngập và được di chuyển tự do trong môi trường, hiệu ứng ưu thế ngọn bị biến mất và các chồi phát triển tương đối đồng đều nhau. Giảm chi phí sản xuất thông qua việc giảm được lượng agar sử dụng cho môi trường nuôi cấy.  Khó khăn của nuôi cấy lỏng lắc: Khó khăn lớn nhất của nuôi cấy lỏng lắc là mẫu mô nuôi cấy bị tổn thương do quá trình lắc. Những khối mô hay cơ quan tế bào thực vật mới hình thành còn non yếu, nếu bị va đập mạnh sẽ làm dập nát khối mô non. Từ đó khả năng nhân nhanh tế bào bị giảm sút. Quá trình nhân nhanh khối mô hay tế bào sử dụng môi trường lỏng thay cho môi trường bán rắn kể từ giai đoạn tái sinh đến giai đoạn tăng sinh khối. Môi trường nuôi cấy lỏng thường dẫn đến sự phát sinh hình thái bất thường, chẳng hạn như hiện tượng thủy tinh thể (hyperhydricity hay vitrification).
30. 15 Hiện nay, khoa học và kỹ thuật phát triển nên hệ thống nuôi cấy lỏng lắc đã cải thiện nhằm phục vụ nhân nhanh sinh khối, hoạt tính có trong cây, hoạt chất, Các hệ thống như: bioreactor, hệ thống quang tự dưỡng, hệ thống TIS, hệ thống RITA, hệ thống bình sinh đôi BIT, hệ thống Plantima, 1.1.4. Vai trò của ánh sáng trong vi nhân giống Trong môi trường nuôi cấy, quang tổng hợp không phải là một hoạt động cần thiết do sự có mặt của đường trong môi trường, nhưng ánh sáng cần thiết để điều hòa một số quá trình liên quan tới phát sinh hình thái của cây. Tùy từng loại nuôi cấy, yêu cầu cường độ cũng như thời gian chiếu sáng khác nhau, ví dụ như khi nuôi cấy mô sẹo, thường không cần ánh sáng. Ánh sáng còn ảnh hưởng tới sinh trưởng của mô nuôi cấy thông qua tác động vào trạng thái và cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cũng như dinh dưỡng khoáng. Thông thường trong phòng nuôi cấy người ta sử dụng ánh sáng huỳnh quang chiếu sáng từ 14 − 15 giờ/ngày với cường độ 2000 lux. 1.1.4.1. Vai trò của ánh sáng đối với quá trình quang hợp ở thực vật Sự sống trên trái đất phụ thuộc vào ánh sáng mặt trời bởi ánh sáng là điều kiện cho quá trình quang hợp xảy ra. Mọi sự sống trên trái đất không thể tách rời quá trình này. Ngày nay, chúng ta biết đến quang hợp là quá trình giúp thực vật dùng năng lượng ánh sáng để tạo glucose và phóng thích oxy từ carbonic và nước. Hình 1.1. Các bước sóng ánh sáng (nguồn Internet)
31. 16 Cường độ ánh sáng mà thực vật sử dụng trong phản ứng quang hợp thuộc vùng quang phổ có bước sóng từ 400 đến 700 nm với cực đại hấp thụ từ 660 đến 680 nm. Đơn vị đo cường độ ánh sáng trong các nghiên cứu về thực vật hiện nay là dòng photon quang hợp (photosynthetic photon flux – PPF), tính bằng μmol.m-2.s-1, nghĩa là số lượng photon tham gia vào quá trình quang hợp của thực vật tính trong 1 giây trên một đơn vị diện tích 1 m2. Các bước sóng ánh sáng được sử dụng trong quang hợp chỉ là một phần nhỏ của toàn bộ quang phổ điện từ. Ở thực vật bậc cao, ánh sáng đỏ, tím, xanh điều khiển quá trình quang hợp hiệu quả nhất. Khả năng kích thích các electron của ánh sáng liên quan đến bước sóng hơn là cường độ của chùm sáng. Chỉ có một phần nhỏ ánh sáng được thực vật thực sự hấp thu. 1.1.4.2. Vai trò của ánh sáng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật Năng lượng bức xạ được thực vật sử dụng theo hai cách hoàn toàn riêng biệt: như một nguồn năng lượng và như một nguồn thông tin. Ánh sáng đặc biệt phù hợp với vai trò thứ hai. Ánh sáng có thể truyền thông tin qua nhiều dạng khác nhau; trong đó, có tối thiểu 4 dạng đặc trưng: chất lượng, lượng, hướng và quang kỳ. Chất lượng: dạng năng lượng bức xạ, màu, quang phổ, thành phần bước sóng là tất cả những từ dùng diễn tả đặc trưng này của ánh sáng. Lượng: số lượng năng lượng bức xạ, cường độ, số photon, tốc độ dòng xác định rõ đặc trưng thứ hai này. Hướng: có sự đa dạng rất lớn giữa các môi trường sống khác nhau theo hướng chiếu sáng. Quang kỳ: mô tả sự khác nhau đều đặn do chu kì ngày đêm và sự thay đổi độ dài ngày theo mùa. Nhiều đặc tính về phát triển hình thái của thực vật ex vitro bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường như ánh sáng (về chất lượng, cường độ, thời gian và hướng chiếu sáng), nhiệt độ, thành phần khí (CO2, O2, H2O, C2H4), thành phần môi trường. Năng lượng bức xạ có những ảnh hưởng quan trọng lên hình thái và hoạt động của thực vật bao gồm sự phát triển khả năng quang hợp, tham gia vào nhịp nội sinh và định hướng về không gian và thời gian.
32. 17 Quang phát sinh hình thái là quá trình kiểm soát sự sinh trưởng, phát triển và phát sinh hình thái của thực vật dưới ánh sáng. Quá trình này được điều khiển bởi ít nhất bốn con đường khác nhau của các quang thụ thể. Trong điều kiện tối, cây phát triển theo một chương trình gọi là “kotomorphogensis”, chẳng hạn như kéo dài chồi, có rất ít hay không có lá mầm và lá thật, bị vàng hóa. Sự phát sinh hình thái do ánh sáng (sự nảy mầm, sự kéo dài đốt thân, ) xảy ra ở những dải bước sóng từ 400 − 500 nm (xanh lục), 600 − 700 nm (đỏ) và 700 − 800 nm (đỏ xa). Ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn lên sự quang phát sinh hình thái ở thực vật thông qua các quang thụ thể. Thực vật bậc cao có ít nhất ba loại quang thụ thể (photoreceptor) có độ hấp thu chọn lọc với các ánh sáng quang phổ khác nhau, điều hòa sự phát sinh hình thái, đó là: Phytochrome (650 − 680 nm; ánh sáng đỏ/đỏ xa). Các thụ thể nhận ánh sáng xanh gồm cryptochrome (340 − 520 nm; ánh sáng xanh UV − A), phototropin. Thụ thể hấp thu tia cực tím UV − B (290 − 350 nm) và UV − A. Sự chiếu sáng có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng của tế bào, mô thực vật và sự sinh tổng hợp chất biến dưỡng sơ cấp và thứ cấp. Chúng tăng theo cường độ chiếu sáng và hiện tượng bão hòa ánh sáng xuất hiện sau khi cường độ chiếu sáng đạt đến điểm bão hòa ánh sáng, khác nhau từ loài này đến loài khác. Hình 1.2. A. Sự hấp thu các bước sóng bởi các loại sắc tố quang hợp và cường độ quang hợp; B. Sự hấp thu ánh sáng của chlorophyll a và chlorophyll b (nguồn Internet )
33. 18 a. Cường độ ánh sáng Cường độ ánh sáng từ 1000 – 2500 lux được dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại mô. Với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng của chồi chậm lại. Theo Ammirato (1987), ánh sáng tham gia vào sự phát sinh và phát triển của phôi soma. Ánh sáng ở cường độ cao gây nên sự sinh trưởng của mô sẹo, ở cường độ trung bình kích thích tạo chồi; ngoài ra, ở cường độ thấp sẽ tăng chiều cao và lá có màu xanh đậm. b. Quang phổ ánh sáng Vấn đề quang phổ ánh sáng đã được nhiều tác giả nghiên cứu như Pierik (1987). Ảnh hưởng của ánh sáng ở các bước sóng khác nhau được trình bày tóm tắt trong bảng 1.1. Bảng 1.1. Ảnh hưởng của các bước sóng ánh sáng khác nhau lên thực vật Loại ánh Bước sóng Ký hiệu Tác động sáng (nm) Hồng ngoại 1400 IR – A Không có ảnh hưởng đặc biệt nhưng có tác động lên thực vật 800 780 Kéo dài thực vật Đỏ 760 Nảy mầm (730 nm) 700 Da cam 640 Quang hợp cực đại (635 nm) do được chlorophyll hấp thụ cực 610 đại; nảy mầm (660 nm) Ánh sáng 590 khả kiến Vàng Quang hợp 570 Xanh lá cây 510 Được hấp thu bởi sắc tố vàng Xanh 500 Được hấp thu bởi sắc tố vàng dương 450 Tím 400 Được hấp thu bởi sắc tố vàng 380 Chiều cao cây UV – A 315 Độ dày lá; kích thích sắc tố Cực tím UV – B Không tốt cho quang hợp (ở cường độ cao); làm tổn thương 280 các mô thực vật UV – C 100 Cây chết ngay lập tức (Trần Thị Hồng Thúy, 2014) 1.1.4.3. Vai trò của ánh sáng trong nhân giống in vitro Cường độ ánh sáng mà thực vật sử dụng trong phản ứng quang hợp có bước sóng từ 400 − 700 nm, với đỉnh từ 660 − 680 nm. Sự phát sinh hình thái do ánh sáng (sự nảy
34. 19 mầm, sự kéo dài đốt thân, ) xảy ra ở những dải bước song từ 400 − 500 nm (xanh lục), 600 − 700 nm (đỏ) và 700 − 800 nm (đỏ xa). Sự phân phối phổ ánh sáng, quang kỳ và hướng chiếu sáng cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của thực vật nuôi cấy mô. Hiện nay, ánh sáng trắng (phổ ánh sáng từ khoảng 200 nm đến 800 nm) của đèn huỳnh quang được sử dụng phổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô. Ánh sáng đơn sắc từ đèn LED (đi-ốt phát quang) cũng đã và đang được nghiên cứu làm nguồn sáng trong nhân giống thực vật. Sử dụng ánh sáng đơn sắc đỏ (600 − 700 nm) hoặc đỏ xa (700 − 800 nm) hoặc kết hợp với xanh lam của đèn LED làm cây tăng trưởng rất tốt và tiết kiệm điện năng hơn so với dùng đèn huỳnh quang. Một trong những yếu tố của môi trường ảnh hưởng lên quá trình tạo rễ của mẫu cấy là ánh sáng. Ánh sáng góp phần vào việc tạo rễ và chồi bất định của đoạn cắt. Chỉ cần cường độ ánh sáng thấp cho quá trình tạo rễ, vì cường độ ánh sáng cao quá sẽ ngăn cản sự tạo rễ. Đối với một số loài, quang kỳ có thể ảnh hưởng đến sự tạo rễ. Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự ra rễ. Ánh sáng đỏ cam thích hợp cho sự ra rễ hơn ánh sáng xanh da trời. Sự phát sinh hình thái thực vật bị ảnh hưởng bởi các nhân tố của môi trường như nhiệt độ, CO2, chất dinh dưỡng, chất lượng ánh sáng, thời gian và cường độ chiếu sáng. Những nhân tố này ảnh hưởng đến sự tăng trưởng chồi và phát sinh hình thái bên cạnh vai trò của nó trong quang hợp. Debergh và cộng sự (1992) đã chứng minh rằng cường độ chiếu sáng có tác dụng điều hòa kích thước lá và thân cũng như con đường phát sinh hình thái đồng thời ảnh hưởng đến sự hình thành sắc tố và thủy tinh thể của cây con. Chất lượng ánh sáng có ảnh hưởng quan trọng trên một số đặc tính hình thái như sự kéo dài ở cây Cúc và cây Cà chua. Hình thái giải phẫu lá và kích thước lá ở cây Phong. 1.1.4.4. Nguồn chiếu sáng nhân tạo sử dụng trong nuôi cấy in vitro hiện nay Nguồn chiếu sáng được sử dụng thông dụng trong nuôi cấy in vitro là ánh sáng huỳnh quang. Các loại đèn halogen kim loại, natri cao áp, dây tóc được sử dụng nhằm làm tăng cường độ ánh sáng. Tuy nhiên, những nguồn sáng này bao gồm các bước sóng không cần thiết cho sự sinh trưởng của cây (Kim et al., 2004). Ánh sáng đơn sắc là một nguồn
35. 20 năng lượng đầy hứa hẹn cho các phòng nuôi cấy mô với khả năng nâng cao quá trình tăng trưởng sinh học nhờ vào kích thước nhỏ, cấu trúc rắn, an toàn, ít tỏa nhiệt, tuổi thọ cao. Ánh sáng đơn sắc bao gồm các bước sóng có lợi cho quá trình quang hợp, từ đó ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái và sinh tổng hợp của cây. Hiện nay, ánh sáng đơn sắc được sử dụng trong nhiều nghiên cứu về quang sinh học như sự tổng hợp chlorophyll, quang hợp và phát sinh hình thái hay quá trình tích lũy các hợp chất có hoạt tính sinh học. Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và phát triển của một số loài cây đã được nghiên cứu, ví dụ như: Euphorbia milii (Dewir et al., 2007), Zantedeschia (Jao et al., 2005), Khoai tây (Jao et al., 2004; Miyashita et al., 1995), Cúc (Kim et al., 2004), Lilium (Lian et al.,2002), Chuối (Nhut et al., 2003), Dâu tây (Nhut et al., 2003), Lan Ý (Nhut et al., 2005), Nho (Puspa et al., 2008), Cymbidium (Schuerger et al., 1997) và Lan Hồ Điệp (Wongnok et al., 2008). Những nghiên cứu này đều chỉ ra rằng ánh sáng đơn sắc thích hợp cho sinh trưởng của cây hơn ánh sáng huỳnh quang. Ảnh hưởng của chất lượng ánh sáng lên sự sinh trưởng và phát triển thực vật đã được nghiên cứu nhiều. Tuy nhiên, các nghiên cứu về tác động của ánh sáng đến quá trình tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học vẫn còn rất hạn chế. Krewzaler và Hahlbrock (1973) đã cho rằng ánh sáng có vai trò kích thích sự tổng hợp flavonoid glycosides trong nuôi cấy tế bào cây Petroselinum hortense (Krewzaler và Hahlbrock, 1973). Một số nghiên cứu khác cũng đã tìm hiểu ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tích lũy các chất trên một số đối tượng như: anthocyanin trong cây Perilla fruttiescnens (Zhong et al., 1991), artemisinin từ nuôi cấy rễ tơ cây Artimisia annua (Liu et al., 2002). Trên đối tượng chi Panax, Yu và cộng sự (2005) đã nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tổng hợp ginsenoside trong rễ tơ cây Nhân Sâm (Panax ginseng C. A. Mayer). Hoàng Văn Cương và cộng sự (2012) nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự khởi tạo và tăng sinh của mô sẹo, cũng như sự sinh trưởng, phát triển và khả năng tích lũy hoạt chất saponin trong cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro đã được nghiên cứu. Việc sử dụng ánh sáng nhân tạo trong nhân giống thực vật theo 2 khuynh hướng sau: hoàn toàn thay thế hay cung cấp một phần ánh sáng ban ngày cho quang hợp hay quang phát sinh hình thái.
36. 21 Việc sử dụng ánh sáng nhân tạo trong nhân giống thực vật đòi hỏi phải cân bằng giữa các quá trình sinh lý của thực vật và các vấn đề kinh tế của người nuôi trồng. Ánh sáng khác nhau về chất lượng, cường độ và thời gian chiếu sáng, mỗi đặc tính này đều có ảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật. Tổng lượng ánh sáng mà cây thu nhận trong suốt quá trình chiếu sáng có tác động trực tiếp lên quang hợp, sự tăng trưởng và năng suất cây trồng. Sự tác động này có thể đo được dựa trên kích thước cây, số lượng hoa và các thuộc tính khác. Trong nhiều trường hợp, hình thái thực vật (chiều cao, hình dáng, ) bị ảnh hưởng chủ yếu bởi chất lượng ánh sáng. Điều này tùy thuộc vào cường độ và sự phân phối dải năng lượng như ánh sáng xanh, đỏ và đỏ xa phát ra từ đèn. Thực vật rất nhạy cảm với các điều kiện ánh sáng, vì vậy sự tăng trưởng và phát triển ở thực vật có thể tăng bởi ánh sáng nhân tạo và các đặc tính thích nghi. Trong các nguồn chiếu sáng nhân tạo hiện nay, các nguồn sáng chủ yếu được sử dụng cho thực vật là: đèn sợi đốt, đèn compact, đèn huỳnh quang, đèn LED. Đèn sợi đốt là một trong những nguồn sáng nhân tạo cổ điển nhất mà hiện nay vẫn được dùng ở nước ta. Trong đó năng lượng trong vùng khả kiến khoảng 5%, còn chủ yếu là bức xạ hồng ngoại. Tuy nhiên, trong thực tế đèn sợi đốt có ưu điểm là giá rẻ, dễ lắp đặt. Đèn sợi đốt được dùng phổ biến để ức chế sự ra hoa của cây hoa Cúc và kích thích sự ra hoa của cây Thanh long trong mùa đông (với cây hoa Cúc mỗi đêm phải thắp khoảng 4 giờ, cây Thanh long khoảng 8 giờ). Hiện nay trong các phòng nuôi cấy in vitro phần lớn sử dụng đèn huỳnh quang. Đèn huỳnh quang chủ yếu được sử dụng cho sinh hoạt của con người. Ánh sáng đèn huỳnh quang là sự phối trộn của nhiều vùng quang phổ từ những vùng ánh sáng có bước sóng ngắn 320 nm đến bước sóng dài 800 nm. Có những vùng bước sóng ngắn không có lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Một loại đèn nữa cũng thường được sử dụng cho cây trồng là đèn huỳnh quang compact. Đèn compact là loại đèn huỳnh quang áp suất thấp, sử dụng bột huỳnh quang đất hiếm 3 màu. So với đèn sợi đốt, đèn compact có hiệu suất sáng cao hơn đối với mắt người, nhưng đối với phổ quang hợp của thực vật, đèn compact có ít thành phần đỏ (660 nm) và không có đỏ xa (730 nm). Mặc dù quang phổ phát ra từ đèn huỳnh quang compact bao gồm các vùng sáng đỏ và xanh có hiệu quả hơn đèn sợi đốt, tuy nhiên còn có một tỷ
37. 22 lệ lớn các vùng quang phổ xanh lá cây (Green) và vàng (Yellow) nên làm lãng phí năng lượng. Như vậy, mặc dù một số đèn huỳnh quang thích hợp cho sự tăng trưởng thực vật nhưng đèn huỳnh quang trong nuôi cấy mô chiếm nhiều không gian, tuổi thọ thấp, có những vùng quang phổ không cần thiết, tiêu tốn nhiều điện năng và tạo ra nhiệt lượng cao trong phòng nuôi cây, do đó chúng ta phải tốn thêm một lượng điện năng đáng kể để điều hòa nhiệt độ trong phòng. Chi phí điện năng ước tính khoảng 65% dùng cho tăng sáng trong phòng nuôi cấy và khoảng 25% để làm mát phòng nuôi. 1.1.5. Đèn LED (Light Emitting Diode) 1.1.5.1. Giới thiệu đèn LED Đi–ốt phát quang (LED) là nguồn sáng bán dẫn, sẽ cung cấp lượng ánh sáng đơn sắc khi có dòng điện một chiều chạy qua nó. Đèn LED (khác với bóng LED) được định nghĩa là tổ hợp bóng LED, phần quang học, tỏa nhiệt và nguồn nuôi. LED đầu tiên được phát minh bởi Texas Instrument vào năm 1960. Tại thời điểm đó cường độ sáng của LED còn rất thấp và chỉ có ánh sáng đơn sắc đỏ. Sau này cường độ sáng của LED đã tăng lên rất nhiều và biên độ dải màu cũng tăng theo (đỏ, cam, vàng, xanh lá, xanh dương, trắng, ). Đến những năm cuối thế kỷ 20 và đầu thế kỷ 21, đèn LED tạo nên một cuộc cách mạng nhanh chóng, đem lại nhiều tiện dụng cho các thiết bị kỹ thuật số và một dãy các thiết bị mới đa chức năng, như tín hiệu ra vào, đèn nổi, đèn giao thông, đèn vòm, đèn tường, đèn dưới nước, đèn ngoài trời. Trong những năm gần đây, LED mới thực sự được quan tâm như là một nguồn bức xạ cho thực vật do tiềm năng ứng dụng thương mại của nó rất lớn. Hình 1.3. Các hệ thống chiếu sáng bằng đèn LED. a. Đèn LED với tỷ lệ chiếu sáng 70% LED đỏ kết hợp 30% LED xanh; b. LED uni-Pack (LP) (Nguyễn Bá Nam, 2012)
38. 23 Để tiến hành nghiên cứu chế tạo các hệ thống đèn LED thích hợp trong nhân giống cây trồng và kỹ thuật phá đêm, chúng ta sẽ phải lựa chọn các bước sóng thích hợp với phổ hoạt động của các sắc tố thực vật. 1.1.5.2. Ưu, nhược điểm của đèn LED LED đem lại nhiều lợi ích trên các phương diện như sau: Tiết kiệm điện năng: LED có năng suất cao, do đó năng lượng tiêu thụ bởi LED nhỏ, giúp cho việc nhân giống có chi phí hiệu quả và tiết kiệm. Sử dụng đèn LED có thể tiết kiệm điện năng đến 11% và giảm khí thải CO2 từ 261 − 348 triệu tấn vào năm 2020. Tuổi thọ: LED có tuổi thọ cao, từ 20.000 – 100.000 giờ (đèn sợi đốt có tuổi thọ 1000 giờ, đèn huỳnh quang có tuổi thọ 8000 giờ). Dải màu: LED có nhiều các dải màu, gồm cả các ánh sáng trắng. Ánh sáng trắng cũng có thể được tạo ra khi hòa trộn LED màu đỏ, xanh lơ và xanh lục. Thay vào đó, thông qua việc kết hợp một cách sáng tạo các LED có màu sắc khác nhau, ảnh hưởng thay đổi màu có thể tạo ra từ một vật cố định đơn giản nhờ sự hoạt hóa động lực của các phần khác nhau của LED. Không phát ra tia UV và tia hồng ngoại: LED không tạo ra tia UV, tạo rất ít nhiệt, vì vậy là đối tượng phát sáng lý tưởng. Ánh sáng LED không gây chói, mỏi mắt. Do tiêu hao nhiệt rất ít, LED hầu như không làm nóng môi trường xung quanh, do đó giảm nhiều nhu cầu sử dụng hệ thống làm lạnh để tạo điều kiện cho cây sinh trưởng. Độ bền: đèn LED có độ bền rất cao chịu được sốc nhiệt và va đập. Kích thước nhỏ và dễ thay đổi linh hoạt trong thiết kế: Một LED đơn lẻ rất nhỏ và tạo ra ít ánh sáng toàn bộ. Tuy vậy, điểm yếu này thực sự là thế mạnh của nó. Các LED có thể gắn với nhau thành bất cứ hình dạng nào tạo nên một loạt kiện lumen mong muốn. Thêm nữa, LED có thể thu nhỏ hỗn hợp ánh sáng, kiểm soát sự phân phối ánh sáng nhờ các thấu kính epoxy, đơn giản hóa cấu trúc của hệ đèn LED. Một thiết bị kiểm soát có thể được gắn với phức hợp LED để làm mờ một cách chọn lọc các đèn LED độc lập, dẫn đến việc kiểm soát phân phối động lực, lượng và màu của ánh sáng. Thân thiện với môi trường, không chứa thủy ngân và các chất độc khác. Thời gian bật sáng rất ngắn (<100 ns). Dễ điều khiển bằng kỹ thuật số với khả năng thay đổi độ sáng 100%.
39. 24 Hiệu suất biến đổi năng lượng cao. Điện áp nuôi một chiều thấp (3V). Phân bố ánh sáng định hướng cao dẫn đến hiệu suất hữu ích cao. Chi phí bảo hành và thay thế hệ thống thấp. Tạo màu có độ bão hòa cao không cần bộ lọc sáng. Hoạt động trong dải nhiệt độ môi trường cao (-40°C đến 60°C). Ngoài những lợi ích đó, rào cản duy nhất của công nghệ chiếu sáng rắn là giá thành của LED, nhưng với tốc độ phát triển mau chóng, rào cản này sẽ được dỡ bỏ. 1.1.5.3. Một số thành tựu trên thế giới và Việt Nam khi sử dụng nguồn sáng LED trong nuôi cấy in vitro Trên thế giới gần đây các đi-ốt phát sáng (LED) là thiết bị chiếu sáng được xem là đầy hứa hẹn cho các phòng nuôi cấy mô và nâng cao khả năng tăng trưởng sinh học. Bước sóng của LED phát ra rất đặc biệt, chiều rộng của vạch quang phổ ngắn, do vậy hiện nay LED được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu về quang sinh học như là sự tổng hợp diệp lục, quang hợp và phát sinh hình thái. Một vài loại cây trồng thành công dưới hệ thống LED, những cây này bao gồm: Tiêu dưa, Lúa mì, Bó xôi. Xu hướng nghiên cứu ứng dụng đèn LED vào sản xuất rau và hoa đang được nhiều nước xác định là nhiệm vụ ưu tiên đầu tư để nâng cao chất lượng sản phẩm và tiết kiệm năng lượng. Ở Việt Nam ngoài việc được sử dụng rộng rãi trong các thiết bị, LED cũng được ứng dụng trong các nghiên cứu nông nghiệp. Việc sử dụng LED như một nguồn bức xạ cho thực vật được đặc biệt chú trọng trong những năm gần đây do tiềm năng của nó trong ứng dụng thương mại rất lớn. Hệ thống bức xạ LED toàn phần có một số lợi điểm vượt trội so với những hệ thống chiếu sáng hiện đang được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô. Sự phát sáng cực đại của LED đỏ và xanh với độ dài sóng thích hợp tạo hiệu quả quang hợp tối đa. LED đỏ có thể được ứng dụng cho thực tiễn vi nhân giống do sự phát photon cao cũng như giá thành thấp khi so sánh đèn LED với đèn có màu khác. Sự kết hợp giữa các đèn LED có màu sắc khác nhau có thể tạo ra ánh sáng thích hợp cho quá trình quang hợp. Một số loại cây như Dâu tây, Chuối sinh trưởng tốt dưới đèn LED.
40. 25 Từ năm 1996 đến nay, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã ứng dụng thành công hệ thống phát sáng LED trên một số loại cây trồng như Dâu tây, Bạch đàn, Địa lan, Lan hồ điệp, Chuối, Lan Ý, Lily, Cúc và Lan Hài. Những cây này nuôi cấy ở điều kiện in vitro dưới hệ thống đèn LED không những sinh trưởng và phát triển tốt, mà còn sinh trưởng và phát triển tốt cả ở điều kiện ex vitro. Đến nay các nhà khoa học đã đạt được một số thành tựu trong nghiên cứu hệ thống chiếu sáng LED trên thực vật như: Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2003) đã nghiên cứu đáp ứng của cây Dâu tây in vitro dưới ánh sáng đơn sắc đỏ và xanh. Kết quả cây Dâu tây sinh trưởng bình thường dưới điều kiện chiếu sáng 90% ánh sáng LED đỏ + 10% ánh sáng LED xanh, 80% ánh sáng LED đỏ + 20% ánh sáng LED xanh, 70% ánh sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh. Trong đó, dưới điều kiện chiếu sáng 70% ánh sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh, các chỉ tiêu đánh giá sự sinh trưởng của cây Dâu tây đều tốt hơn so với các điều kiện chiếu sáng còn lại. Năm 2003, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã đánh giá sự sinh trưởng và phát triển của cây Chuối nuôi cấy in vitro dưới tỷ lệ đèn LED khác nhau: 100% ánh sáng LED đỏ, 90% ánh sáng LED đỏ + 10% ánh sáng LED xanh, 80% ánh sáng LED đỏ + 20% ánh sáng LED xanh, 70% ánh sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh, 100% ánh sáng LED xanh và đèn huỳnh quang. Nghiên cứu đã khẳng định cây Chuối sinh trưởng và phát triển tốt dưới điều kiện chiếu sáng 80% ánh sáng LED đỏ + 20% ánh sáng LED xanh. Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2006) đã tiến hành nghiên cứu nguồn phát sáng nhân tạo sử dụng ánh sáng đơn sắc trong nhân giống vô tính hiệu quả của cây Lan Ý. Kết quả trọng lượng tươi của cây cao nhất khi sinh trưởng dưới điều kiện 80% ánh sáng LED đỏ kết hợp với 20% ánh sáng LED xanh. Dương Tấn Nhựt và Nguyễn Bá Nam (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của hệ thống chiếu sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa Cúc (Chrysanthemum morifoliumcv. “Nút”) nuôi cấy in vitro. Dưới các điều kiện chiếu sáng khác nhau: 100% LED đỏ, 100% LED xanh, 50% LED đỏ + 50% LED xanh, 70% LED đỏ + 30% LED xanh, 80% LED đỏ + 20% LED xanh, 90% LED đỏ + 10% LED xanh và ánh sáng đèn huỳnh quang (neon). Những chồi Cúc phát triển tốt nhất dưới điều kiện chiếu sáng 90%
41. 26 ánh sáng LED đỏ kết hợp với 10% ánh sáng LED xanh, cho trọng lượng tươi và số lá lớn nhất so với các điều kiện chiếu sáng còn lại. Nguyễn Bá Nam và cộng sự (2012) đã nghiên cứu thành công ảnh hưởng của các loại mẫu cấy và hệ thống chiếu sáng đơn sắc lên khả năng tái sinh chồi cây hoa Cúc (Chrysanthemum morifolium ramat.cv. “Jimba”) nuôi cấy in vitro. Dưới các điều kiện chiếu sáng khác nhau: 100% LED đỏ, 100% LED xanh, 50% LED đỏ + 50% LED xanh, 70% LED đỏ + 30% LED xanh, 80% LED đỏ + 20% LED xanh, 90% LED đỏ + 10% LED xanh, ánh sáng đèn huỳnh quang (neon) và trong tối. Kết quả 70% ánh sáng LED đỏ kết hợp với 30% ánh sáng LED xanh là tỷ lệ phù hợp cho sự tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá và gián tiếp từ lớp mỏng tế bào thân cây Cúc so với các điều kiện chiếu sáng còn lại. Hoàng Văn Cương và cộng sự (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và khả năng tích lũy hoạt chất saponin thông qua nuôi cấy mô sẹo của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv) in vitro. Các mẫu mô sẹo và cây được nuôi cấy dưới 5 loại ánh sáng khác nhau: 100% ánh sáng LED xanh, 100% ánh sáng LED đỏ, ánh sáng LED xanh và ánh sáng LED đỏ kết hợp với tỷ lệ 50:50, 30:70, 20:80; ánh sáng huỳnh quang được sử dụng làm đối chứng. Kết quả cho thấy trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mô sẹo thu được là cao nhất khi các mẫu lá được nuôi cấy dưới ánh sáng xanh và ánh sáng đỏ kết hợp với tỷ lệ 50:50. Ngoài những nghiên cứu trên, phòng Sinh học phân tử và Chọn tạo giống cây trồng thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên còn thực hiện trên một số đối tượng khác như: Lan Hài, Đồng tiền đều cho kết quả tốt. Theo Dương Tấn Nhựt (2010), nguồn sáng LED chưa được chú trọng ở Việt Nam. Các nghiên cứu về ánh sáng đèn LED trong nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nước chủ yếu được thực hiện ở phòng Sinh học phân tử và Chọn tạo giống cây trồng thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên. Hiện nay một số Viện nghiên cứu và Trung tâm nhân giống cây trồng đã bắt đầu nghiên cứu về đèn LED với mục đích tìm nguồn sáng thích hợp thay thế đèn huỳnh quang để giảm giá thành trong sản xuất cây giống.
42. 27 1.1.5.4. Hướng phát triển ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in vitro ở Việt Nam Hệ thống đèn LED là một nguồn sáng cho cây trồng đang được chú ý đặc biệt trong những năm gần đây vì ứng dụng rộng rãi của nó trong thương mại. Công nghệ chiếu sáng bằng chất rắn (Solid - state lighting) dựa vào việc sử dụng đèn LED là một trong những tiến bộ lớn nhất trong lĩnh vực chiếu sáng nhân tạo cho cây trồng đã được ứng dụng trong vài thập kỷ gần đây. LED có rất nhiều ứng dụng như: nghiên cứu điều khiển môi trường, chiếu sáng trong nuôi cấy mô, chiếu sáng bổ sung và chiếu sáng theo quang chu kỳ trong nhà kính (greenhouse). Hình 1.4. Hệ thống nuôi cấy LED truyền điện không dây (Wireless power transfer – LED uni- Pack (WPT - LP)). a. Thiết bị phát; b. Thiết bị thu; c.d. Hoạt động của hệ thống (Nguyễn Bá Nam, 2012) Tạ Thế Hùng và Lê Tất Khương đã đưa ra đề xuất nghiên cứu ứng dụng đèn LED vào sản xuất nông nghiệp công nghệ cao ở Đà Lạt và vùng phụ cận như sau: Nghiên cứu phát triển các dạng đèn LED hiệu quả cao và ứng dụng trong sản xuất rau, hoa, quả. + Phát triển các dạng đèn LED tiết kiệm năng lượng, hiệu quả cao tiến tới thay thế dần các dạng đèn truyền thống. + Nghiên cứu ứng dụng đèn LED điều khiển nở hoa. + Nghiên cứu ứng dụng đèn LED sản xuất một số loại rau, quả có giá trị kinh tế cao. Nghiên cứu ứng dụng đèn LED sản xuất các cây dược liệu có giá trị kinh tế cao (Sâm Ngọc Linh, Sâm Hàn Quốc, ).
43. 28 Nghiên cứu ứng dụng đèn LED trong ngành nuôi cấy mô. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước về lĩnh vực nuôi cấy mô hiện nay chủ yếu tập trung vào nghiên cứu ảnh hưởng của các phytohormone trong quá trình phát sinh hình thái hay sinh trưởng và phát triển của thực vật nuôi cấy mà chưa đi sâu tìm hiểu vai trò của ánh sáng trong vi nhân giống, đặc biệt là nguồn chiếu sáng từ đèn LED. Hiện nay ở nước ta còn hạn chế những nghiên cứu cụ thể tác động của đèn chiếu sáng LED đến sự sinh trưởng của cây trồng, so sánh ưu nhược điểm của việc sử dụng đèn chiếu sáng LED để thay thế các đèn chiếu sáng khác như đèn sợi đốt, đèn huỳnh quang đặc biệt là so sánh về tác động tăng trưởng cây trồng và hiệu quả tiết kiệm điện năng khi sử dụng các nguồn sáng nhân tạo khác nhau. Vì vậy nghiên cứu ứng dụng công nghệ chiếu sáng LED trong nuôi cấy in vitro là một hướng nghiên cứu có giá trị khoa học và công nghệ cao, có ý nghĩa thực tiễn rất to lớn đối với công nghệ vi nhân giống ở nước ta. Đây là hướng nghiên cứu liên nghành, cần có sự phối hợp chặt chẽ của các nhà sinh học, nông nghiệp, vật lý và công nghệ cao. 1.1.6. Ánh sáng đối với thực vật 1.1.6.1. Vai trò của một số phổ ánh sáng đơn sắc đến đời sống thực vật  Ánh sáng trắng: Là tổng hợp của các loại ánh sáng có bước sóng khác nhau (400 − 800 nm), thích hợp cho nhiều loại đáp ứng của thực vật. Trong nuôi cấy dịch huyền phù của cây Perilla frutescens, sự chiếu ánh sáng trắng với cường độ 27,2 W.m-2 trong suốt thời gian nuôi cấy rất hiệu quả và lượng anthocyanin được tạo ra cao gấp hai lần so với không chiếu sáng. Ánh sáng trắng tăng cường sự sinh trưởng của chồi cây Artemisia annua L. và làm tăng hàm lượng artemisinin của nó. Trong điều kiện tối, chồi không sinh trưởng và artemisinin không tạo ra.  Ánh sáng đỏ (700 − 780 nm)/đỏ xa (trên 750 nm): có 2 tác động chủ yếu là: Kéo dài rễ: trong nuôi cấy lông rễ của Artemisia annua L., sinh khối lông rễ và hàm lượng artemisinin dưới ánh sáng đỏ cao hơn 17 đến 67% so với dưới ánh sáng trắng. Kéo dài lóng thân: tỷ lệ bức xạ tia đỏ: đỏ xa (R: Fr) có ảnh hưởng đến sự kéo dài lóng thân ở thực vật.
44. 29 Ngoài ra protein phytochrome có trong hầu hết các loại thực vật rất nhạy cảm với ánh sáng đỏ và đỏ xa. Ánh sáng đỏ sẽ kích thích phytochrome chuyển đổi thành phytochrome FR (PFR). Thực vật có hoa dựa vào protein này để điều chỉnh thời điểm ra hoa (dựa vào nồng độ PFR) và thiết lập nhịp sinh học, ngoài ra nó cũng điều tiết các phản ứng khác như sự nảy mầm của hạt giống, kéo dài thân cây, kích thước-hình dạng và số lượng lá. Ánh sáng đỏ là bước sóng quan trong nhất đối với quá trình quang hợp, ra hoa, đậu quả. Được dùng để mở rộng chu kỳ ánh sáng, kích thích cây ra hoa cho cây dài ngày (cây Thanh long, hoa Lay ơn, ) hoặc ngăn chặn ra hoa ở cây ngắn ngày (hoa Cúc, ). Mặc dù bước sóng 730 nm nằm phạm vi quang hợp của cây nhưng nó tác động mạnh mẽ trong việc chuyển đổi phytochrome FR (PFR) thành phytochrome R (PR). Các loại cây ngắn ngày sẽ ra hoa dựa trên nồng độ protein phytochrome R (PR), vậy nên bước sóng này thường được dùng ở cuối chu kỳ ánh sáng (mỗi ngày là 1 chu kỳ ánh sáng) để kích thích ra hoa ở cây ngắn ngày.  Ánh sáng xanh dương: Phổ ánh sáng 450 nm cho phép cryptochrome và phototropin phản ứng trong cây trồng. Cryptochromes sẽ làm thay đổi nhịp sinh học (chuyển từ chu trình hô hấp sang chu trình quang hợp). Protein phototropins kích thích cây mở khí khổng, uốn cong về phía ánh sáng giúp phát triển thân cây và hình thành diệp lục tố. Bước sóng này kích thích tăng trưởng thực vật thông qua hình thành rễ mạnh mẽ và quang hợp với cường độ cao. Được dùng trong giai đoạn cây giống, cây non trong giai đoạn sinh trưởng nếu muốn cây ngừng phát triển thì bước sóng này phải được giảm bớt hoặc loại bỏ. Thúc đẩy sự sinh trưởng của mô sẹo và ức chế sự kéo dài thân. Mô sẹo được nuôi cấy dưới ánh sáng xanh (435 nm) cho nhiều sinh khối (18,4 g DW/l) và PeG (2,4 g/L) nhất, lần lượt cao hơn 19 và 41% so với khi nuôi cấy dưới ánh sáng trắng. Điều này được giải thích do hoạt tính của PAL trong mô sẹo được nuôi cấy dưới ánh sáng xanh cao hơn so với dưới ánh sáng trắng trong toàn bộ thời gian nuôi cấy. Ánh sáng xanh tăng cũng làm giảm chiều cao của Antirrhinum.
45. 30  Ánh sáng xanh lục: Ánh sáng lục thường được trộn một tỷ lệ nhỏ với ánh sáng xanh dương và đỏ để tạo ánh sáng tổng hợp cho mắt người dễ quan sát. Ánh sáng xanh lục có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của thực vật do tác động đến quang hợp và sự phát triển bình thường của cây, nhưng ngược lại xanh lục từ ánh sáng trắng sẽ tăng cường sinh trưởng cho cây.  Ánh sáng tia cực tím: Bước sóng UV gần (200 − 380 nm) có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của thực vật do tác động đến quang hợp và sự phát triển bình thường của cây. Ngược lại khi loại bỏ một cách có chọn lọc các tia UV gần từ ánh sáng trắng sẽ tăng cường sinh trưởng cho cây. Nếu tiếp xúc quá nhiều với tia cực tím (tia UV) sẽ gây nguy hiểm cho hệ thực vật, tuy nhiên với một lượng nhỏ vừa đủ ánh sáng cận cực tím sẽ có lợi. Trong nhiều trường hợp tia UV có vai trò quan trọng trong việc hình thành màu sắc thực vật, mùi vị và hương liệu. Nghiên cứu cho thấy ánh sáng UV ở bước sóng 385 nm thúc đẩy sự tích tụ hợp chất phenolic, tăng cường hoạt động chống oxy hóa của các chất chiết xuất từ thực vật. Như vậy, ánh sáng được coi là yếu tố sinh thái vừa có tác dụng giới hạn, vừa có tác dụng điều chỉnh đối với đời sống sinh vật, đặc biệt là thực vật. Ánh sáng trắng trực tiếp tham gia vào quá trình quang hợp. Ánh sáng điều khiển chu kỳ sống của sinh vật. Tùy theo cường độ và chất lượng của ánh sáng mà nó ảnh hưởng nhiều hay ít đến quá trình trao đổi chất và năng lượng cùng nhiều quá trình sinh lý của các cơ thể sống. Ngoài ra ánh sáng còn ảnh hưởng nhiều đến nhân tố sinh thái khác như nhiệt độ, độ ẩm, không khí đất và địa hình. 1.1.6.2. Vai trò của ánh sáng đến quá trình tích lũy các chất hữu cơ đối với thực vật Ánh sáng được coi là nguồn sống của thực vật. Ánh sáng có ảnh hưởng đến toàn bộ đời sống của thực vật từ khi nảy mầm, sinh trưởng và phát triển cho đến khi cây ra hoa, kết trái rồi chết. Sự chiếu sáng có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng của tế bào, mô thực vật và sự sinh tổng hợp chất biến dưỡng sơ cấp và thứ cấp (Ouyang et al., 2003). Ánh sáng khác nhau về chất lượng, cường độ và thời gian chiếu sáng. Mỗi đặc tính đều có ảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật. Tổng lượng ánh sáng mà cây thu nhận trong suốt quá trình chiếu sáng có tác động trực tiếp lên quang hợp, sự tăng trưởng của
46. 31 cây. Ánh sáng góp phần vào việc tạo rễ và chồi bất định của đoạn cắt. Cường độ ánh sáng thấp cần cho quá trình tạo rễ và ngược lại cường độ ánh sáng quá cao sẽ ngăn cản sự tạo rễ. Chất lượng ánh sáng có vai trò quan trọng đối với đặc điểm hình thái của cây như kéo dài, hình thành chồi nách, hình thái lá, kích thước lá và hình thành rễ. Ánh sáng đỏ cam thích hợp cho sự ra rễ hơn ánh sáng xanh da trời. Trong nhiều trường hợp, hình thái thực vật (chiều cao, hình dáng, ) bị ảnh hưởng chủ yếu bởi chất lượng ánh sáng (Dương Tấn Nhựt, 2011). Debergh và cộng sự (1992) đã công bố cường độ chiếu sáng ngoài tác dụng điều hòa kích thước lá và thân cũng như con đường phát sinh hình thái thực vật. Ngoài ra, ánh sáng còn ảnh hưởng đến sự hình thành sắc tố và hiện tượng mọng nước của cây con in vitro (Dương Tấn Nhựt, 2011). Ánh sáng xanh cảm ứng nhiều hiện tượng tăng trưởng và cử động: cử động lục lạp, tính hướng sáng, cử động khí khổng, kích thích tổng hợp chlorophyll và carotenoid, biểu hiện gene, sinh tổng hợp enzyme, (Tibbitts et al., 1983). Cryptochrome là một flavoprotein của nhân, là thể nhận ánh sáng xanh giống như photolyase, là một enzyme có chức năng sửa chữa sai hỏng DNA phụ thuộc vào ánh sáng (Ahmad, 1993). Cryptochrome không có hoạt tính sinh hóa, nhưng sự biểu hiện của gene cryptochrome lại được điều hòa bởi ánh sáng bằng các cơ chế khác nhau từ sự phiên mã cho đến sự thoái hóa. Chức năng của cryptochrome trong sự phát sinh hình thái thực vật chồng lấp với hầu hết chức năng của phytochrome (như ở Arabidopsis). Vai trò của cryptochrome ở Arabidopsis được thể hiện trong sự điều khiển phản vàng hóa dưới ánh sáng xanh, biểu hiện gene và điều hòa sự ra hoa đáp ứng với ngày dài (Liu et al., 2011). Phototropin được biết đến như một protein liên kết với màng sinh chất có trọng lượng 120 kDa, có thể cảm ứng quá trình phosphoryl hóa bởi ánh sáng xanh ở cây con Arabidopsis thaliana (Gallagher et al., 1988). Phototropin điều khiển không chỉ sự quang hướng động ở thực vật mà nó còn có vai trò quan trọng trong sự tích lũy lục lạp (Sakai et al., 2001), sự mở khí khổng (Kinoshita et al., 2001) và ức chế nhanh việc khởi đầu sinh trưởng trụ hạ diệp (Folta, 2001) và chu trình sinh sản ở Chlamydomonas (Huang và Beck, 2003). Ánh sáng đỏ rất quan trọng cho sự kéo dài thân, đáp ứng với phytochrome và thay đổi cấu trúc giải phẫu (Schuerger et al., 1997). Phytochrome là một thể nhận tín hiệu ánh sáng, hiện diện ở hai dạng có thể chuyển đổi qua lại: dạng hấp thu ánh sáng đỏ R gọi là Pr
47. 32 (không hoạt động), dạng hấp thu ánh sáng đỏ xa FR gọi là Pfr là dạng hoạt động thực hiện các chức năng sinh lý của phytochrome, cảm ứng nhiều đáp ứng ở thực vật: nảy mầm của hạt, tăng trưởng, tạo sơ khởi lá, tái bản lục lạp, khử hoàng hóa, sản xuất anthocyanin, tích lũy chlorophyll và cản ra hoa. Phytochrome giữ vai trò truyền thông tin qua các thành phần khác nhau trong tế bào, dẫn tới biểu hiện gene. Pfr có thể tương tác với màng plasma, làm biến đổi các đặc tính của màng và truyền thông tin qua trung gian protein D, hay hoạt động như protein kinase để điều hòa biểu hiện gene ở mức sao mã (Bùi Trang Việt, 2000). Theo nghiên cứu của McCree (1972) đỉnh biểu diễn của ánh sáng LED xanh và đỏ phối hợp với nhau là ngưỡng phù hợp cho sự quang hợp của chlorophyll và đã được báo cáo có những bước sóng ảnh hưởng đến quang hợp cực đại. LED có tuổi thọ cao, có thể thay đổi được nguồn sáng nên có thể giảm được giảm được giá thành trong các phòng thí nghiệm (Dương Tấn Nhựt, 2011). Ngoài ra, LED còn phát nhiệt ít do vậy chỉ cần một lượng điện năng nhỏ để làm mát phòng nuôi đồng thời năng lượng được sử dụng cho các LED thấp nên có thể làm giảm giá thành trong sản xuất thương mại. Bước sóng của LED phát ra rất đặc biệt, chiều rộng của vạch quang phổ ngắn do vậy hiện nay LED được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về sự tổng hợp chlorophyll, quang hợp và phát sinh hình thái (Dương Tấn Nhựt, 2011). Sự kết hợp giữa các đèn LED có màu sắc khác nhau có thể tạo ra ánh sáng thích hợp cho quá trình quang hợp (Tripathy và Brown, 1995). Nghiên cứu tính năng giải phẫu ở lá và thân cây ớt (Capsicum annuum L.) cho thấy tốc độ quang hợp, hàm lượng diệp lục tố trong lá, số lượng lá và trọng lượng khô tích lũy trong lá, thân và rễ đều giống nhau khi được chiếu sáng bằng đèn halogen kim loại, đèn LED xanh dương và đèn LED đỏ xa (Schuerger et al., 1995). Haln và cộng sự (2000) đã báo cáo rằng tốc độ quang hợp thực của cây Rehmannia glutinose nuôi cấy in vitro là rất cao dưới hệ thống LED hỗn hợp (50 % LED đỏ: 50 % LED xanh), trong khi đó, cây con nuôi cấy dưới hệ thống LED xanh hoặc LED đỏ có tốc độ quang hợp thấp.
48. 33 1.2. Phương pháp định tính và định lượng saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 1.2.1. Định tính saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) bằng phương pháp Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) là một kỹ thuật sắc ký được dùng để tách các chất trong hỗn hợp. Phương pháp sắc ký lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silicagel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch. Sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: Xét định độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc Nhận biết những hóa chất trong một mẫu cho sẵn Một số cải tiến có thể kết hợp phương pháp truyền thống để tự động hóa một vài bước, làm tăng độ dung giải của sắc ký lớp mỏng và cho số liệu chính xác hơn. Phương pháp này được gọi là Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin Layer Chromatography - HPTLC) Hệ thống sắc ký lớp mỏng bao gồm: Bình triển khai sắc ký: bằng thủy tinh, có nắp đậy. Bản sắc ký (pha tĩnh): một lớp mỏng khoảng 0,25 nm được làm bằng cách trộn chất hấp phụ, như silica gel, với một lượng nhỏ chất trơ để kết dính, như canxi sulfat (thạch cao), và nước. Hỗn hợp này được trải ra như một lớp vữa đặc trên một bề mặt chất trơ, như thủy tinh, nhôm, hoặc nhựa. Dung môi (Pha động): được lựa chọn dựa trên độ phân cực của hợp chất đích cần sắc ký.
49. 34 Hình 1.5. Các bước của quá trình sắc ký lớp mỏng Hoàng Văn Cương và cộng sự (2012) đã sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để định tính saponin trong mô sẹo Sâm Ngọc Linh in vitro. Kết quả bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy các mẫu mô sẹo Sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro có sự hiện diện của Rg1, Rb1, MR2. Ngoài ra, ở mẫu mô sẹo Sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro còn xuất hiện các vết tương đồng với Sâm ngoài tự nhiên, điều này chứng tỏ rằng trong mô sẹo Sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro còn có mặt của nhiều loại saponin khác tương tự như saponin của cây ngoài tự nhiên. Quách Thanh Tâm và cộng sự (2014) đã ứng dụng thành công kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để định tính ginsengoside Rg1 và Rb1 trong thực phẩm chức năng. 1.2.2. Định lượng saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography – HPLC) là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp. Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa hỗn hợp mẫu, qua một cột sắc ký. Cột sắc ký được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn. Mỗi thành phần trong mẫu tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng của mỗi thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tới sự
50. 35 phân tách các thành phần khì mà chúng chảy ra khỏi cột. HPLC đã và đang được sử dụng cho những mục đích sản xuất, nghiên cứu, pháp lý và y dược. Sắc ký có thể được mô tả là một quá trình dịch chuyển khối lượng liên quan tới hấp phụ. HPLC dựa trên hệ thống bơm để đẩy chất lỏng đã bị nén và hỗn hợp mẫu qua một cột đổ bằng một chất hấp phụ, dẫn tới sự phân tách của các thành phần trong mẫu. Thành phần hoạt động của cột, chất hấp phụ, tiêu biểu là một vật liệu cấu trúc hạt làm từ những hạt rắn như silica hay polymers, có kích thước trong khoảng 2 – 50 m. Những thành phần của hỗn hợp mẫu được tách ra khỏi nhau bởi mức độ tương tác khác nhau với các hạt hấp phụ. Chất lỏng bị nén là hỗn hợp dung môi ví dụ nước, acetonitrile hay methanol và được gọi là "pha động". Thành phần và nhiệt độ của pha động đóng vai trò chính trong quá trình phân tách bằng cách tác động lên nhưng tương tác xảy ra giữa những thành phần trong mẫu và chất hấp phụ ở cột. Đây là những tương tác vật lý trong tự nhiên, như hydrophobic, lưỡng cực – lưỡng cực và ion, thông thường nhất là sự kết hợp của các tương tác. HPLC được phân biệt với sắc ký lỏng truyền thống áp suất thấp bởi vì áp suất hoạt động của nó cao hơn nhiều (50 – 350 bar), trong khi sắc ký lỏng thông thường chỉ dự trên lực hút trái đất để pha động đi qua cột. Do chỉ có một lượng nhỏ mẫu được tách bằng phân tích HPLC, cột có kích thước 2,1 – 4,6 mm cho đường kính và 30 – 250 mm cho chiều dài. Cột HPLC cũng đổ với kích thước hạt hấp phụ nhỏ hơn (trung bình kích thước hạt 2 – 50 m). Điều này mang lại HPLC hiệu quả phân giải cao (khả năng tách biệt từng chất) khi mà tách hỗn hợp, làm cho nó trở thành phương pháp sắc ký phổ biến. Sơ đồ của một thiết bị HPLC đặc thù gồm có cổng lấy mẫu, bơm, và một đầu dò. Cổng lấy mẫu đưa hỗn hợp mẫu và dòng pha động để đi qua cột. Hệ thống bơm đảm bảo tốc độ dòng mong muốn và thành phần của qua động qua cột. Đầu dò tạo ra tín hiệu tỷ lệ với lượng mẫu thành phần đi ra từ cột, do đó cho phép phân tích định lượng của những thành phần trong mẫu. Một bộ vi xử lý số và phần mềm điều khiển thiết bị HPLC và cung cấp dữ liệu phân tích. Một vài mẫu bơm cơ trong thiết bị HPLC có thể trộn nhiều dung môi với nhau trong những tỉ mà thay đổi theo thời gian, tạo ra thành phần gradient trong pha động. Các đầu dò như UV/Vis, PDA hay khối phổ được sử dụng phổ biến. Phần lớn các thiét bị HPLC có lò cột để điều chỉnh nhiệt độ phân tách.
51. 36 Hình 1.6. Sơ đồ hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC 1. Bình chứa pha động. 2. Bộ phận khử khí 3. Bơm cao áp 4. Bộ phận tiêm mẫu 5. Cột sắc ký (pha tĩnh) 6. Đầu dò 7. Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống. 8. Máy in dữ liệu. Hình 1.7. Hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC
52. 37 1.3. Sơ lược về cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 1.3.1. Giới thiệu sơ lược về cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Cây Sâm Việt Nam là cây thuốc dấu của đồng bào dân tộc Xê Đăng sống trên vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam; thân thảo sống đan xen trong quần thể thực vật đa dạng vùng rừng núi hiểm trở, lạnh và mây mù gần như quanh năm, không có dân cư. Năm 1973, đoàn điều tra dược liệu Ban Dân Y khu 5 do dược sỹ Đào Kim Long và Nguyễn Châu Giang hướng dẫn đã phát hiện được một loài Panax mọc thành quần thể ở độ cao 1800 m tại vùng Đắc Lây, huyện Đắc Tô, tỉnh Kon Tum và đặt tên là “Sâm Đốt trúc” với tên khoa học sơ bộ xác định là Panax articulatus L., họ Araliaceae. Năm 1974, qua báo cáo của dược sỹ Nguyễn Thới Nhâm về kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học cây Sâm K5 so với cây Sâm Triều Tiên và Sâm tam thất. Khu ủy Khu 5 đã cho bảo vệ chặt chẽ vùng Sâm này và cũng từ đấy Sâm K5 được sử dụng để chữa bệnh có hiệu quả cho các thương bệnh binh, cán bộ và nhân dân. Trải qua hơn 30 năm, Sâm K5 còn gọi là Sâm Ngọc Linh hay Sâm Việt Nam, một loài Sâm đặc hữu của nước ta đã được thế giới biết đến với tên khoa học là Panax vietnamesis Ha et Grushv. (Hà Thị Dụng và Grushvisky, 1985). Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Bộ : Apiales Họ : Araliaceae Chi : Panax Loài : Panax vietnamensis Ha et Grushv Hình 1.8. Cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (Nhut et al., 2011) Sâm Ngọc Linh là một loài Sâm đặc hữu của Việt Nam, với tên khoa học là (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), thuộc họ Nhân Sâm (Araliaceae). Sâm Ngọc Linh không chỉ có tác dụng dược lý đặc trưng của chi Nhân Sâm mà còn có những tác dụng điển hình như
53. 38 tăng trí nhớ, tác động tốt lên hệ miễn dịch, chống stress, chống trầm cảm, tác dụng lên sự chống oxy hóa in vitro và in vivo, Nhóm chất có tác dụng quyết định nhất đến tác dụng dược lý của loài Sâm này là các saponin triterpenoid mà đại diện chính là MR2, Rb1 và Rg1 (Trần Công Luận, 2003). Sâm Ngọc Linh là một trong những loài Sâm có hàm lượng saponin khung dammaran cao nhất trên thế giới (khoảng 12 – 15%) và lượng saponin nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax trên thế giới (Nguyễn Thượng Dong và cộng sự, 2007). Với những đặc điểm đó, Sâm Ngọc Linh không chỉ là loài Sâm quý của Việt Nam mà còn là của thế giới. Hình 1.9. Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (nguồn Internet) 1.3.2. Đặc điểm hình thái Sâm Ngọc Linh là cây thân thảo sống nhiều năm, cao 40 – 60 cm, có khi cao tới 1 m. Thân rễ thường nhiều đốt, cong ngoằn ngoèo, ít khi có hình trụ thẳng, dài 3 – 15 cm, đường kính 0,5 – 1,5 cm. Mặt ngoài màu nâu hay mà vàng xám, có những vết nhăn dọc, mảnh; những vết vân ngang nổi rõ chia rễ thành nhiều đốt, đặc biệt có nhiều sẹo do thân khí sinh hàng năm lụi tàn để lại. Thể chất cứng chắc, giòn, dễ bẻ, mặt bẻ lởm chởm, màu xám nhạt. Mùi thơm nhẹ đặc trưng,vị đắng, hơi ngọt. Rễ củ có dạng hình con quay dài 2,4 – 4 cm, đường kính 1,5 – 2 cm (ở cây mọc hoang), thường hợp thành bó 2 – 4 rễ củ hình thoi, đôi khi có rễ trụ dài (ở cây trồng). Rễ củ có màu nâu nhạt, có những vân ngang và nốt các rễ con. Thể chất nạc, chắc, khó bẻ gãy. Vị đắng, hơi ngọt (Dược điển Việt Nam, 2009).
54. 39 Thân khí sinh mọc thẳng đứng, màu xanh hoặc hơi tím, đường kính 5 – 8 mm, thường rụng hàng năm, nhưng đôi khi vẫn tồn tại 2 – 3 thân trong vài năm. Lá kép hình chân vịt mọc vòng, thường là 3 – 5, ở ngọn thân; cuống lá kép dài 6 – 12 mm mang 5 lá chét, mà lá chét giữa dài hơn 15 cm, rộng 3,5 cm; lá chét có phiến hình trứng mọc ngược, hình má ngược hay bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn có khi kéo dài thành mũi, gốc hình nêm, có lông ở cả hai mặt, gân bên 10 đôi hình lông chim, gân nhỏ hình mạng. Cụm hoa ở cây 4 – 5 năm là một tán hoa đơn trên cuống dài 10 – 20 cm, đôi khi có thêm 1 – 4 tán bên hay 1 hoa đơn độc ở phía đưới tán chính; mỗi tán 50 – 120 hoa, cuống hoa dài 1 – 1,5 cm; lá dài 5, hợp ở dưới thành hình chuông, cánh hoa 5, màu vàng lục nhạt; nhị 5; bầu 1 ô với (2 – 3) vòi nhụy. Quả nang, màu đỏ tươi thường có chấm đen ở đỉnh; hạt 1 – 2, hình thận, màu trắng hay màu vàng nhạt. Mùa hoa: tháng 4 – tháng 6; mùa quả: tháng 7 – tháng 9 (Võ Văn Chi, 2011). 1.3.3. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là cây thân thảo, ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải rác, có khi thành từng đám dưới tán rừng ẩm thường xanh có độ che phủ cao, ít dốc, dọc theo các suối, trên đất nhiều mùn, ở độ cao 1.200 – 2.100 m so với mực nước biển. Môi trường rừng nơi có Sâm mọc luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây mù, nhiệt độ khoảng 15 – 18°C, lượng mưa khoảng 3000 mm/năm. Đất rừng ở đây được tạo thành do lá cây mục lâu ngày, có màu nâu đen, tơi xốp, hàm lượng mùn cao và chứa nhiều nước. Loài Sâm này sống lâu năm có thể cao 40 – 100 cm, thân rễ có sẹo và các đốt do thân khí sinh rụng hàng năm để lại. Sâm Ngọc Linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm. Vào đầu tháng 1 hàng năm, Sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần thành cây Sâm trưởng thành có 1 tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả. Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng để lại một vết sẹo ở đầu củ Sâm và cây bắt đầu giai đoạn ngủ đông hết tháng 12. Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ Sâm mỗi mùa đông đến mà người ta có thể nhận biết cây Sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi tức trên củ có 1 sẹo (sau 3 năm
55. 40 đầu Sâm mới rụng 1 lá) mới có thể khai thác, khuyến cáo nên thu hoạch Sâm trên 5 tuổi. Mùa đông là mùa thu hoạch tốt nhất. 1.3.4. Đặc điểm phân bố Trong số hơn 10 loài và dưới loài đã được biết của chi Nhân Sâm (Panax), trong Danh lục thực vật thế giới (The Plant List, 2014) có 12 loài được công nhận. Chi Nhân Sâm (Panax) ở Việt Nam hiện biết có 3 loài mọc tự nhiên: Sâm Vũ Diệp (P.bipinatifidus), Tam Thất trắng (P.stipuleanatus) và Sâm Việt Nam hay Sâm Ngọc Linh (P.vietnamensis). Cả 3 loài Sâm này đều thuộc các loài quý hiếm cần bảo vệ ghi trong Sách đỏ Việt Nam (Bộ KH&CN, 2007). Sâm Ngọc Linh được phát hiện sau cùng vào năm 1973. Đến năm 1985, nó mới được công bố là hoàn toàn mới đối với khoa học (Hà và Grushv,1985). Đến nay Sâm Ngọc Linh chỉ mới được phát hiện duy nhất ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum. Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107o50’ – 108o7’ kinh tuyến Đông và từ 15o0’ – 15o10’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc Linh cao 2.598 m. Những điểm trước đây vốn có Sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1.500 m đến 2.200 m, chủ yếu tập trung ở 1.800 – 2.000 m, thuộc địa bàn hai huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam). Về giới hạn cũng như phân bố của loài Sâm này ở núi Ngọc Linh hiện nay có nhiều thay đổi. (Nguyễn Thượng Dong và cộng sự, 2007). 1.3.5. Nhân giống cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 1.3.5.1. Nhân giống từ hạt Sâm Việt Nam có vùng phân bố rất hẹp và mọc rải rác. Do là loài Sâm quý nên số lượng cá thể giảm sút mạnh, hiện đang nằm trong 250 loài quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng do bị khai thác quá mức và buôn bán bất hợp pháp, hiện Sâm Ngọc Linh đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam cần được bảo vệ. Với mục đích bảo tồn và phát triển nguồn gene quý hiếm của Quốc gia đồng thời phát triển những vùng trồng để cung cấp nguyên liệu cho ngành dược, từ lâu công tác tạo nguồn giống Sâm đã được đề cập đến với hai hình thức chủ yếu là nhân giống từ hạt và tạo giống từ đầu mầm (thân rễ ngầm). Song những kết quả đạt được còn yếu kém, lượng