›

Đồ án Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự phát sinh mô sẹo cây xạ đen (Celastrus hindsii)

pdf 56 trang thiennha21 12/04/2022 4440
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự phát sinh mô sẹo cây xạ đen (Celastrus hindsii)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_mot_so_yeu_to_anh_huong_len_su_phat_sinh_mo_seo_cay_xa.pdf

Nội dung text: Đồ án Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự phát sinh mô sẹo cây xạ đen (Celastrus hindsii)

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG LÊN SỰ PHÁT SINH MÔ SẸO CÂY XẠ ĐEN (Celastrus hindsii) Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: ThS. Trần Trọng Tuấn Sinh viên thực hiện : Nguyễn Anh Phi MSSV: 1151110258 Lớp: 11DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG LÊN SỰ PHÁT SINH MÔ SẸO CÂY XẠ ĐEN (Celastrus hindsii) Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: ThS. Trần Trọng Tuấn Sinh viên thực hiện : Nguyễn Anh Phi MSSV: 1151110258 Lớp: 11DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào. Ký tên Nguyễn Anh Phi
  4. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành để tài này, chúng em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến: Thầy ThS Trần Trọng Tuấn và cô ThS Nguyễn Thị Huyền Trang, thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và động viên chúng em trong suốt thời gian qua. Ban chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực phẩm - Môi Trường, trường Đại Học Công Nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi, hỗ trỡ tận tình trong 4 năm học tại trường. Ban lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới Tp. HCM và các anh chị đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này. Chúng em xin cảm ơn các anh chị trong phòng Công nghệ Tế Bào Thực Vật Viện Sinh học Nhiệt đới đã giúp đỡ chúng em trong thời quan qua. Tập thể 11DSH02 đã luôn bên cạnh động viên. Con xin cảm ơn Bố Mẹ đã luôn ủng hộ, động viên và giúp đỡ con. Tp HCM, tháng 8, năm 2015 Sinh viên thực hiện Nguyễn Anh Phi
  5. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ iv CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI CELASTRUS 2 1.1.1 Tổng quan về chi celastrus 2 1.2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ CÂY XẠ ĐEN (CELASTRUS HINDSII) 3 1.2.1 Phân loại 3 1.2.2 Đặc điểm thực vật 3 1.2.3 Phân bố, sinh thái 4 1.2.4 Thành phần các hợp chất có trong cây 4 1.2.5 Công dụng dƣợc lý 4 1.2.6 Một số nghiên cứu của cây xạ đen trong và ngoài nƣớc 6 1.3 NUÔI CẤY MÔ SẸO (CALLUS) 8 1.3.1 Hình thái tế bào trong sự phát sinh mô sẹo từ các mảnh mô hay cơ quan song tử diệp khi nuôi cấy in vitro 8 1.3.2 Vai trò của loại cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng trong sự tạo mô sẹo 9 1.4 MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG LÊN NUÔI CẤY TẠO MÔ SẸO 9 1.4.1 Môi trƣờng 9 1.4.2 Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật 10 1.4.3 Sơ lƣợc về chất điều hòa sinh trƣờng 12 1.5 HỆ THỐNG NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO 15 1.5.1 Khái niệm 15 2 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 1 2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI 1 2.2 VẬT LIỆU 1 2.2.1 Nguồn mẫu 1 2.2.2 Môi trƣờng nuôi cấy 1 2.2.3 Dụng cụ thiết bị 1 2.2.4 Điều kiện nuôi cấy 1 2.2.5 Kệ đèn LED 2 i
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 2 2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của một số môi trƣờng khoáng lên sự phát triển mô sẹo từ lớp mỏng đốt thân và lá cây Xạ đen 2 2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của CĐHSTTV lên khả năng tăng sinh mô sẹo 2 2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện ánh sáng lên khả năng tăng sinh mô sẹo 3 2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng (rắn, bán rắn, lỏng, lỏng lắc) lên khả năng tăng mô sẹo 3 2.3.5 Cách thu các chỉ tiêu khảo sát 4 2.3.6 Phƣơng pháp thu thập số liệu 4 3.1. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng khoáng lên sự phát triển mô sẹo từ đốt non thân và mẫu lá của cây Xạ đen 5 3.2. Ảnh hƣởng của 2,4-D lên khả năng tăng sinh mô sẹo 8 3.3. Ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng lên khả năng tăng sinh mô sẹo 12 3.4. Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng (rắn, bán rắn, lỏng, lỏng lắc) lên khả năng tăng sinh mô sẹo 15 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN 17 CHƢƠNG 5: KIẾN NGHỊ 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO 19 ii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-Dicholorophenoxy acetic acid BA : 6 - Benzyl adenin IAA : Indole -3- acetic acid IBA : Indole - 3 - butyric acid NAA : α - Naphthalene acetic acid MS : Murashige và skoog, 1962 1/2MS : Môi trường MS với thành phần khoáng đa lượng giảm còn ½ SH : Schenk và Hildebrandt TCL : Thin cell layer tTCL : Transverse TCL PGRs : Plant growth regulators ITCL : Longitudinal TCL ED50 : Effective dose LED : Light- Emitting diode CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật iii
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hưởng của một số môi trường khoáng lên sự phát triển mô sẹo từ đốt thân non cây Xạ đen. 5 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của 2,4-D lên khả năng tăng sinh mô sẹo cây Xạ đen 9 Bảng 3.3Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên khả năng tăng sinh mô sẹo 12 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên khả năng tăng sinh mô sẹo 15 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biều đồ 3.1 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên tỷ lệ sống mô sẹo 6 Biều đồ 3.2 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên trọng lượng tươi mô sẹo 6 Biểu đồ 3.3Ảnh hưởng của 2,4-D lên khả năng tăng sinh trọng lượng tươi mô sẹo 11 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của 2,4-D lên tỷ lệ gia tăng trong lượng mô sẹo 12 Biểu đồ3.5 Ảnh hưởng ánh sáng lên trọng lượng tươi mô sẹo 13 Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng ánh sáng lên tỷ lệ gia tăng trọng lượng tươi mô sẹo 13 Biểu đồ 3.7Ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên khả năng tăng sinh trọng lượng tươi mô sẹo 16 iv
  9. Đồ án tốt nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ Nước Việt Nam ta được thiên nhiên ưu đãi với những cánh rừng nguyên sinh chạy dọc đất nước, theo thống kê có hơn 5000 loại cây thuốc trong đó có nhiều cây đặc hữu. Ngày nay, tuy thuốc tây đang lưu hành rộng rãi và dồi dào, nhưng sự ưa thích và sự tín nhiệm của nhân dân đối với cây thuốc không hề giảm sút. Trên các phương tiện thông tin đại chúng hiện nay đã đề cập tới nhiều loại thảo dược có nguồn gốc từ thiên nhiên như Sâm ngọc linh, Xáo tam phân, Bá bệnh và trong đó có cây Xạ đen được dùng làm dược liệu trong điều trị và chữa bệnh. Từ những kinh nghiệm sử dụng phong phú, các vị lương y đã đúc kết được nhiều bài thuốc tâm đắc trong việc trị bệnh cứu người. Các loại thảo mộc có công dụng chữa trị được nhiều loại bệnh nan y. Chính vì vậy, con người ngày nay đang có xu hướng tìm và khai thác các loại thảo mộc ngoài tự nhiên, hơn nữa tình trạng môi trường ngày nay đang bị ô nhiễm nặng nề đã đe dọa lên tình trạng sống và phát triển của các loài thảo mộc ngoài tự nhiên. Các phương pháp nhân giống truyền thống không đáp ứng được nguồn cung cấp dược liệu từ thiên nhiên cho con người sử dụng và duy trì được mức độ ổn định về số lượng chủng loại. Chính vì vậy, việc nghiên cứu nhân giống cũng như phát triển nguồn sinh khối các loại thảo dược có hoạt chất thứ cấp trong điều kiện in vitro đang được các nhà khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam tìm hiểu và thực hiện với mục đích cung cấp được các loại hoạt chất thứ cấp có tác dụng dược lý cho con người mà vẫn đảm bảo được sự đang dạng về chủng loại của các loại thảo dược ngoài tự nhiên. Chính vì các lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự phát sinh hình thái mô sẹo của cây Xạ đen (Celastrus hindsii)” nhằm tạo nguồn vật liệu cho các nghiên cứu nhân sinh khối cây Xạ đen và sau đó thu nhận các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ cây này để ứng dụng trong y học hiện đại. 1
  10. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI CELASTRUS 1.1.1 Tổng quan về chi celastrus Chi Celastrus bao gồm có 50 loài được phân bố khắp nơi trên thế giới, đặc biệt nhiều nhất ở Châu Á (Su và cộng sự, 2009). Các loài thuộc chi Celastrus đã được sử dụng như là một loại thuốc diệt côn trùng tự nhiên, cũng như những bài thuốc dân gian quan trọng để chữa trị các bệnh như sốt, nhiễm khuẩn, viêm đa khớp dạng thấp, Ví dụ như, C. hypoleucus được dùng để chữa trị bệnh viêm và sưng tấy (Bruning và cộng sự, 1978). C. orbiculatushas được dùng để chữa trị bệnh viêm đa khớp dạng thấp và những nghiên cứu trước đó về thành phần hóa học đã cho thấy sự hiện diện của nhiều loại ester β-dihydroagarofuran sesquiterpene polyol và alkaloids (Bruning và cộng sự, 1978). Một số loài thì kích thích việc kháng sâu và kháng khối u. Gần đây, chất β-dihydroagarofuran đã được nghiên cứu có tác dụng chống lại sự hình thành khối u (Takaishi và cộng sự, 1993). Các hợp chất tự nhiên và những nghiên cứu về sinh học ở chi Celastrus: Nhóm sesquiterpennes (β-Agarofurans). Họ Celastraceae được biết đến như là việc sản xuất các dẫn xuất khác nhau của β-dihydroagarofuran. Trong bài báo cáo của Su và cộng sự (2009) đã cho thấy có khoảng 97 chất của dạng dẫn xuất này được tìm thấy kể từ thập niên 1980. Các loài được nghiên cứu bao gồm C. angulatus, C. orbiculatus, C. paniculatus, C. stephanotiifolius, C. flagellaris, C. gemmatus, C. hindsii, C. rosthornianus, Nhóm diterpenes: năm 1999, Chen và Liang đã chiết suất thành công ba loại diterpenes, 98-100, từ thân của cây C. stephaotifolius. Celaphanol A cũng đã được tìm thấy từ cây C. orbiculatus. Xiong và cộng sự đã báo cáo rằng việc chiết suất và tổng hợp(+)-7-deoxynimbidiol vào năm 2006. Trong cùng năm này, Wang và cộng sự đã chiết suất thành công ba loại diterpenes là celahypodiol, furreginol và suigol từ cây C. hypoleucus. 2
  11. Đồ án tốt nghiệp Nhóm triterpenes: Các chất thuộc nhóm này cũng đã lần lượt tìm thấy ở các loài C. angulatus, C. paniculatus, C. hypoleucus và C. hindsii. Nhóm alkaloids: Từ quả của cây C. orbiculatus chất 3-Oxo-4-benzyl-3,4- dihydro-1H-pyrrolo[2,1-c]-oxazine-6-carbaldehyde đã được tìm thấy. Ngoài ra nhiều chất thuộc nhóm alkaloid cũng đã được tìm thấy trong chi Celastrus. Nhóm flavonoids: Năm 2006, tám hợp chất phenol đã được tìm thấy ở loài Celastrus Hindsii, bao gồm 5 hợp chất và ba oligomer mới của rosmarinic acid, một dimer và hai trimers. Thành phần chính trong dịch chiết là rosmarinic acid và lithospermic acid B. Những hợp chất này có thể kìm hãm sự oxi hóa của nhóm methyl linoleate ở phần lớn các giai đoạn ức chế phản ứng peroxidation ở cây đậu tương, phosphatidylcholine ở liposomes. Vì thế, dịch chiết từ cây C. hindsii được mong đợi có thể trở thành nguồn dược liệu tự nhiên để kháng oxi hóa (Ly và cộng sự, 2006). 1.2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ CÂY XẠ ĐEN (CELASTRUS HINDSII) 1.2.1 Phân loại Cây Xạ đen có tên khoa học là Celastrus hindsii thuộc: - Giới : Viridiplante - Ngành : Streptophyta - Lớp : Embryophyta - Bộ : Celastrales - Họ : Celastraceae - Chi : Celastrus - Loài : Celastrus hindsiii (www.ncbi.nlm.nih.gov) 1.2.2 Đặc điểm thực vật Cây Xạ đen còn được gọi là cây cùm cụm răng, dây gối Ấn Độ hoặc dây gối bắc, quả nâu, dân tộc Mường gọi là cây ung thư. 3
  12. Đồ án tốt nghiệp Thân cây dạng dây dài 3 - 10 m. Bụi leo, nhánh non tròn, không lông. Lá không rụng theo mùa, phiến lá hình bầu dục, xoan ngược, diện tích lá từ 6 - 11 x 2 - 5 cm, dài, gân phụ 7 cặp, bìa có răng thấp. Cuống lá dài 5 - 7 mm. Chùm hoa ở ngọn hay ở nách lá, dài 5 - 10 cm, cuống hoa dài 2 - 4 mm. Hoa mẫu 5, cánh hoa trắng, hoa cái có tiểu nhụy lép, noãn sào có 3 buồng. Quả nang hình trứng, dài khoảng 1 cm, nổ thành 3 mảnh. Hạt có áo hạt màu.Ra hoa từ tháng 3 - 5, ra quả tháng 8 - 12. Cánh tròn, lúc non có màu xám nhạt, sau chuyển sang màu nâu, có lông, về sau màu xanh. 1.2.3 Phân bố, sinh thái Cây Xạ đen được phân bố ở nhiều nước như:Trung Quốc, Ấn độ, Thái Lan, Myanmar và một số quốc gia khác. Ở nước ta cây Xạ đen phân bố chủ yếu ở các tỉnh Hà Nam, Quảng Ninh, Ninh Bình, Hòa Bình, rừng quốc gia Cúc Phương, rừng quốc gia Ba Vì mọc tự nhiên trong rừng và rất dễ trồng. 1.2.4 Thành phần các hợp chất có trong cây Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện trong cây Xạ đen có sesquiterpenes (Huang và cộng sự, 2000; Kuo và cộng sự, 1996), triterpenes (Huang và cộng sự 2000; Kuo và Yang-kup, 1997), alkaloids (Huang và cộng sự, 2000, 2006; Kuo và cộng sự,1995), flavonoids (Ly và cộng sự, 2006), các polyphenol, tannin, acid amin, đường khử, cyanoglycosid. Trong đó hai hợp chất chính có trong dịch chiết lá Xạ đen là rosmarinic acid và lithospermic acid B (Ly và cộng sự, 2006). 1.2.5 Công dụng dƣợc lý Theo Đông y Cây Xạ đen có vị đắng chát, tính hàn, có tác dụng hữu hiệu trong điều trị mụn nhọt, ung thũng, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch trong xơ gan cổ chướng và đặc biệt trong chữa trị ung thư. Có tác dụng thông kinh lợi tiểu. Cây dùng trị kinh nguyệt không đều, bế kinh, viêm gan, bệnh lậu. 4
  13. Đồ án tốt nghiệp Điều trị, ức chế và ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư, tiêu hạch, tiêu độc, thanh nhiệt, mát gan, hành thủy, điều hòa hoạt huyết, giảm đau, an thần, tăng cường sức đề kháng cơ thể. Vài chục năm trước, cây Xạ đen, tiếng Mường gọi là Xạ cái, từng được lương y dân tọc Mường Bùi Thị Bẻn, đặt tên là cây ung thư, chuyên dùng để chữa các loại ung thối. Bài thuốc cây Xạ đen, sau đó được bà Bẻn tặng cho Hội Đông y tỉnh Hòa Bình, nhưng vẫn ít người biết đến (www.laocai.gov.vn). Theo Tây y Các nghiên cứu trong và ngoài nước đã chứng minh hoạt tính sinh học của Xạ đen. Kết quả thử hoạt tính in vitro cho thấy dịch chiết cồn của vỏ cây Xạ đen có hoạt tính kháng tế bào ung thư, giảm thiểu quá trình oxy hóa của cơ thể, tăng cường hệ miễn dịch và phòng chống HIV-AIDS. Các nghiên cứu về thực vật học, hóa được, dược lý, nghiên cứu thực nghiệm trên động vât được gây ung thư của GS.TS. Lê Thế Trung và các bác sĩ của Học viện Quân Y đã phát hiện ở Xạ đen này tác dụng hạn chế sự phát triển của khối u ác tính. Hơn nữa, theo GS.TS. Lê Thế Trung, các hợp chất lấy từ Xạ đen nếu được kết hợp với chất phylamin có thể kéo dài tuổi thọ trung bình của động vật bị ung thư hơn nhiều chất lấy từ trinh nữa hoàng cung hay tỏi Thái Lan (www.laocai.gov.vn). Dịch chiết cồn của vỏ cây Xạ đen chứa bốn hợp chất triterpen gồn celasdin A, celasdin C, anti-AIDS celasdin B và cytotoxic maytenfolone A đã được các nhà khoa học Đài Loan chứng minh, qua kết quả thử hoạt tính in vitro, có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan (Hepatocellular carcinoma, HEP-G2), ung thư mũi (Nasopharynx carcinoma), ung thư ruột kết (Colon carcinnoma, COLO-205). Đặc biệt trong đó, anti-AIDS celasdin B có khả năng kháng hoạt động tái bản của virus HIV trong các tế bào lympho H9 (Kuo và Yang Kuo, 1997). Đây là phát hiện quan trọng mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc điều trị căn bệnh thế kỷ HIV - AIDS. Ngoài ra dịch chiết lá Xạ đen khô còn được chứng minh có chứa các chất chống oxy hóa, trong đó thành phần chính của các chất chống oy hóa này là rosmarinic acid cùng các oligomer của nó và lithospermic acid B. Các hợp chất 5
  14. Đồ án tốt nghiệp thuộc nhóm phenolic này được chứng minh là có hoạt động chống oxy hóa chống lại quá oxy hóa tự nhiên của methyl linoleate trong pha chính và các gốc khởi động quá trình peroxy hóa phosphatidylcholine của đậu tương trong liposome (Ly và cộng sự, 2006). Sự thần kỳ của cây Xạ đen chính là làm hạn chế sự phát triển của các khối u trong cơ thể người bệnh. Tuy nhiên, các nhà khoa học đã luôn cảnh báo cho các người bệnh ung thư rằng, Xạ đen được xem như là một thực phẩm chức năng, chỉ có tác dụng hỗ trợ trong điều trị ung thư, hoàn toàn không phải là thuốc chữa khỏi căn bệnh này. Tất cả các báo cáo khoa học đều khẳng định, cây Xạ đen chỉ có tác dụng làm tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể, ức chế tiến triển của tế bào ung thư, không phải thuốc có thể chữa căn bệnh này. 1.2.6 Một số nghiên cứu của cây xạ đen trong và ngoài nƣớc Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về cây Xạ đen được công bố, tuy nhiên các nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào nghiên cứu cấu trúc phân tử của các hợp chất tách chiệt được từ cây Xạ đen và tác dụng dược lý của dịch chiết Xạ đen. Tình hình nghiên cứu về cây Xạ đen trên thế giới Năm 1996, Kuo và Yang Kuo công bố nghiên cứu về khả năng kháng ung thư và kháng virus HIV của dịch chiết lá Xạ đen. Kết quả từ dịch chiết lá Xạ đen đã phân lập được bốn chất trong đó có maytenfolone-A đã được chứng minh có tác dụng gây độc với tế bào ung thư gan (HEPA-2B) với liều lượng ảnh hưởng ED50= -1 -1 2,3 µg ml và ung thư mũi (KB) với liệu lượng gây ảnh hưởng ED50 = 3,8 µg ml . Celasdin B có khả năng kháng hoạt động tái bản của virus HIV trong các tế bào -1 lumpho H9 với nồng độ gây ảnh hưởng EC50 là 0,8 µg ml . Năm 2006, Ly và cộng sự đã công bố phát hiện mới về khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá Xạ đen. Các hợp chất chống oxy hóa được phân lập từ dịch chiết xuất methanol 50% của lá Xạ đen khô chứa tám hợp chất phenolic gồm rutin, kaempferol 3-rutinoside, rosmarinic acid, lithospermic acid, và lithospermic acid, và 6
  15. Đồ án tốt nghiệp lithospermic acid B, và ba oligomer mới lạ của rosmarinic acid, một dimer và hai trimer, các chất này có khả năng kháng quá trình oxy hóa các gốc tự do rất mạnh. Năm 2013, nghiên cứu của Hua và các cộng sự đã xác định được hai chất mới gồm một macrocyclic lactone (được đặt tên là Hindsii lactone A) và 5,8- quinoflavan (được đặt tên là Hindsii quinoflavan B). Hai chất này được kiểm tra khả năng gây độc đối với tế bào ung thư ở người gồm : Ung thư phổi (NCI-H187), ung thu ruột kết (HCT116), ung thư vú (BC-1) và ung thư gan (HuH7). Kết quả cho thấy Hindsii lactone A biểu hiện hoạt tính độc đối với các dòng tế bào của NCI- -1 H187 và HCT116 với các giá trị IC50 là 14,9 - 36,8 µg ml trong khi đó Hindsii quinoflavan B biểu hiện hoạt tính độc đối với các dòng tế bào của BC-1 và HuH7 -1 với giá trị IC50 là 19,8 và 21,2 µg ml . Tình hình nghiên cứu về cây Xạ đen ở Việt Nam Ở nước ta, Lê Thế Trung (Chủ tịch Hôi Ung thư TP.Hà Nội) và các bác sĩ của Học viện Quân y là những người tiên phong trong nghiên cứu, tìm hiểu về cây Xạ đen, kể từ khi phát hiện loài cây này năm 1987. Sau 12 năm nghiên cứu, Học viện Quân y đã chiết xuất được từ loài cây này một loại tinh thể có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Năm 1999, đề tài của các bác sĩ Học viện Quân y được nghiệm thu, cây Xạ đen chính thực được công nhận là một trong không nhiều những vị thuốc nam có tác dụng điều trị hỗ trợ bệnh nhân ung thư. Năm 2007, Lê Thị Huyền và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính độc tế bào của Xạ đen trong việc kháng tế bào ung thư phổi và ung thư gan ở người. Kết quả cho thấy 3 chất được phân lập từ Xạ đen gồm: 5α-olean-12-en-3β-ol (β -Amyrin); β-Amyrin-3-O-succinate; 6-methoxy-2,2-dimethyl-5-nitrogen-2H-chromen-7-ol đều có tác dụng với dòng tế bào ung thư phổi ở mức vừa phải. 7
  16. Đồ án tốt nghiệp 1.3 NUÔI CẤY MÔ SẸO (CALLUS) Để nuôi cấy mô sẹo, người ta sử dụng hầu hết các cơ quan đang còn sống của thực vật như là thân, lá, cuống Tuy nhiên, người ta thường sử dụng các mẫu cấy còn non để quá trình cảm ứng của mẫu với chất kích thích sinh trưởng diễn ra dễ dàng. Trong hầu hết trường hợp, người ta sử dụng chất kích thích sinh trường là 2,4- D với nồng độ thay đổi tử 0,1 - 3,0 ppm. Mô sẹo được hình thành là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt và có hình dáng không nhất định với màu vàng, trắng và hơi xanh. Các tế bào thuộc các mô hoặc các cơ quan này, trừ các tế bào của mô phân sinh, phải chịu một sự phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên. Sự phản phân hóa có vai trò rất quan trọng, nó cho phép một tế bào đã trưởng thành trở lại trạng thái trẻ hóa. Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phôi soma trong điều kiện thích hơp (Pierik, 1987). Mô sẹo được tạo ra ngoài nguyên nhân do các tế bào nhu mô chịu sự phân hóa còn do sự phân chia các tế bào tượng tầng, sự xáo trộn trong các mô phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Hunault, 1979). 1.3.1 Hình thái tế bào trong sự phát sinh mô sẹo từ các mảnh mô hay cơ quan song tử diệp khi nuôi cấy in vitro Ở thân, auxin kích thích hoạt động của tượng tầng và có thể cảm ứng sự phản phân hóa của các tế bào nhu mô vỏ trong, libe 1 và libe 2, các tia tủy và tủy tạo nên những vùng mô phân sinh rộng lớn. Các tế bào vỏ ngoài và các tế bào biểu bì thường chỉ phù ra mà không phân chia. Sự biến đổi của các mô phân sinh mới có tính hỗn loạn, không bình thường về cấu trúc giải phẫu và về những mối quan hệ giữa các cơ quan. 8
  17. Đồ án tốt nghiệp 1.3.2 Vai trò của loại cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng trong sự tạo mô sẹo Các mô và các cơ quan của thực vật đều có khả năng tạo mô sẹo. Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen. Sự tăng sinh của mô sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong môi trường nuôi cấy. Tuổi của những mảnh mô hay cơ quan có ảnh hưởng rất lớn trong khả năng tạo mô sẹo. Những mảnh cơ quan đã trưởng thành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo. Ngược lại, cây non (còn nguyên vẹn hay cắt đoạn) hay những mảnh thân còn rất non của cây trưởng thành có thể tạo mô sẹo trên môi trường có chất điều hòa sinh trưởng. Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần hay không cần trong suốt thời gian tạo mô sẹo (Pierik, 1987). Đa số trường hợp, sự tạo mô sẹo trong tối tốt hơn ngoài sáng đặc biệt với mẫu cấy lá. 1.4 MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG LÊN NUÔI CẤY TẠO MÔ SẸO 1.4.1 Môi trƣờng 1.4.1.1 Nguồn đạm Nguồn đạm từ các muối nitrate thường được tế bào dễ hấp thụ nhiều nhất. Đôi khi người ta sử dụng nguồn đạm từ muối nitrate và amomonium. Cũng có nhiều trường hợp sử dụng nguồn đạm hữu cơ. Nhưng về cơ bản những nguồn đạm từ muối vô cơ hòa tan thích hợp cho nuôi cấy tế bào đơn. 1.4.1.2 Nguồn carbohydrate Người ta thường sử dụng sucrose như nguồn carbon trong nuôi cấy tế bào đơn thực vật. Điều này còn phụ thuộc vào từng loại cây dùng để thu nhận tế bào. Đối với một số loài thực vật, tế bào lại cần maltose, galactose hay glucose hơn. 9
  18. Đồ án tốt nghiệp 1.4.1.3 Các chất vi lƣợng và các chất khác Tùy theo loài thực vật mà nhu cầu về các nguyên tố vi lượng, vitamin và các chất khác có khác nhau. Do đó, khi nuôi cấy phải chú ý đến nhu cầu sinh lý của tế bào để tạo ra môi trường nuôi cấy thích hợp (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). 1.4.2 Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật Năng lượng bức xạ có ảnh hưởng quan trọng lên hình dạng và hoạt động của thực vật bao gồm sự phát triển khả năng quang hợp, tham gia vào nhịp nội sinh và định hướng về không gian và thời gian. Vai trò khác nhau của ánh sáng lên sinh trưởng và phát triển của thực vật như: định hướng theo thời gian đối với nhiều hoạt động trao đổi chất, phân chia tế bào và phát triển, mở khí khổng, di chuyển về đêm; quang kỳ ảnh hưởng đến sự nở hoa, cảm ứng ngủ, sự rụng lá, sự tạo ống tràng, hoa, thân hành, củ và thân bò, ánh sáng định hình sạng như tạo màu xanh trong sự tổng hợp sắc đỏ và phát triển lục lạp, định hình dạng mở lá mầm, sự phát triển cuống, sự mở rộng lá, dạng nhánh và sự phát triển rễ. Quá trính phát sinh hình thái ở thực vật được điều hòa ít nhất 4 loại thụ quan ánh sáng (photoreceptor) - Các phytochrome nhạy cảm với ánh sáng đỏ và đỏ xa - Các thụ quan nhận ánh sáng xanh - Các thụ quan hấp thụ ánh sáng cực tím - A - Các thụ quan hấp thụ tia cực tím - B Phytochrome kiểm soát sự nảy mầm hạt, sự tăng trưởng lá và thân, sự phát triển thể hạt và sự nở hoa ở thực vật bậc cao. Đó là một protein xanh, một phân tử thưởng ở thực vật bậc cao, hấp thụ ánh sáng đỏ (660 nm) và đỏ xa (730 nm). 1.4.2.1 Vai trò của đèn LED đối với sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật LED: là từ viết tắt của cụm từ Light Emitting Diode, tạm dịch là Diode phát sáng. Lá các diode có khả năng phát sinh ra ánh sáng hay tia hồng ngoại, tử ngoại. 10
  19. Đồ án tốt nghiệp Cũng giống như diode, LED có cấu tạo từ một bán dẫn loại P ghép với một bán dẫn loại N. Tương tự như bóng đèn tròn dụng sợi đốt nhưng không phải chiếu sáng bằng sợi đốt, đèn LED được coi là loại đèn tiết kiệm điện năng nhất, tạo ra hiệu suất ánh sáng tốt nhất, tỏa nhiệt ít hơn so với các thiết bị chiếu sáng thông thường (Wikipedia, 2011). Ưu điểm của đèn LED: có nhiều kích thước, hình dạng, máu khác nhau; giá hành phải chăng, tiết kiệm được chi phí. Được chế tạo từ vật liệu polymer. Đèn LED có độ bền cao, dễ vận chuyển mà không bị vỡ. Đèn LED cho nhiều ánh sáng, có tuổi thọ tới 70 nghìn giờ sử dụng, (nếu một ngày thắp sáng 8 giờ thì sau 23 năm mới phải thay bóng), tiết kiệm 70 - 80 % so với đèn thông thường. Đèn LED nhiệt năng phát sinh ra trong quá trình hoạt động không đáng kể. Đèn LED hoạt động tốt trong điều kiện nhiệt độ thấp, sử dụng dòng điện một chiếu với hiệu điện thế nhỏ và thân thiện với môi trường giảm lượng khí thải CO2 vì không sinh ra tia cực tím, không có thủy ngân, tối thiểu hóa lượng khí thải ra môi trường do đèn LED có tuổi thọ cao trung bình gấp 10 - 20 lần các loại bóng đèn chiếu sáng thông thường. Nhìn chung đèn LED an toàn cho người sử dụng, giảm nguy cơ cháy nổ, nâng cao hiệu suất làm việc của điều hòa không khí do đèn LED phát ra nhiệt thấp trong quá trình làm việc, chất lượng ánh sáng thân thiện, tối thiểu hóa tia cực tím và bức xạ hồng ngoại, không nhấp nháy, không gấy nhức mỏi mắt. Hệ thống đèn LED có một số thuận lợi trong nuôi cấy mô: Đỉnh của đường biểu diễn ánh sáng LED đỏ và LED xanh kết hợp với nhau là ngưỡng phù hợp cho sự quang hợp của chlorophyll và được báo cáo có những bước sóng ảnh hưởng lên sự quang hợp cực đại. LED có tuổi thọ cao và có thể thay đổi được nguồn sáng, vì vậy nó sẽ giảm được giá thành trong các phòng thí nghiệm. LED phát nhiệt ít, do vậy chỉ cần một lượng điện năng nhỏ để làm mát phòng nuôi cấy. Năng lượng được sử dụng cho LED thấp nên có thể làm giảm giá thành trong sản xuất thương mại. Một cấu trúc đặc của hệ thống đèn LED cũng là một đặc tính hấp dẫn (Dương Tấn Nhựt, 2011). 11
  20. Đồ án tốt nghiệp 1.4.3 Sơ lƣợc về chất điều hòa sinh trƣờng 1.4.3.1 Chất kích thích sinh trƣởng Chất điều hòa sinh trưởng là một trong những phức hợp hữu cơ với một lượng nhỏ và hiệu chỉnh đặc biệt phân tử của nó có thể thúc đẩy, ức chế hay làm thay đổi sự phát triển của cây trồng. Người ta phân chia ba nhóm chất điều hòa sinh trưởng chính: Auxin, cytokinin và giberelin. CĐHSTTV có vai trò rất quan trọng trong việc đảm bảo mối quan hệ hài hòa giữa các cơ, bộ phân trong cơ thể để điều chỉnh các quá trình sinh trưởng, phát triển và các hoạt động sinh lý của thực vật. 1.4.3.2 Cytokinin Các cytokinin là những CĐHSTTV liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô. Các cytokinin thường được sử dụng là BA, kinetin, zeatin. Trong đó, zeatin là cytokinin tự nhiên còn BA và kinetin là cytokinin tổng hợp. Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi cấy. Đối với sự phát sinh phôi để tạo callus và tạo rễ, cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự phát sinh chồi và chồi nách. Vấn đề không kém quan trọng là nồng độ của hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng này. Chẳng hạn, 2,4-D cùng với BA ở nồng độ 5 ppm sẽ kích thích sự tạo thành callus ở Agrostic nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích tạo chồi mặc dù trong cả hai trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin đều bằng một. Trong sự tăng trưởng tế bào, cytokinin kích thích sự phân hóa tế bào, giúp gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein, kích thích sự gia tăng kích thước tế bào lá trưởng thành. Trong sự tạo cơ quan cytokinin giúp tạo chồi. Sự phối hợp giữa auxin và cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái ở mẫu nuôi cấy in vitro. Khi phối hợp hai loại CĐHSTTV lại với nhau thì sự phân chia tế bào xảy ra nhanh hơn. 12
  21. Đồ án tốt nghiệp Cytokinin làm chậm rõ rệt sự lão suy lá, khi được phun lên cây hay xử lý lá tách rời. Đồng thời cytokinin còn huy động chất dinh dưỡng về các tế bào nhận. Kích thích sự phát triển của chồi cũng như sự nảy mầm của một số hạt. Nhu cầu về auxin và cytokinin trong sự tạo chồi bất định có phần phức tạp. Có những loại thực vật về mặt cơ bản không cần cả auxin lẫn cytokinin để tạo chồi bất định nhu rau Diếp xoăn, Caramin pratensis, Streptocarpus. Tuy nhiên, khi bổ sung auxin hoặc cytokinin vào môi trường nuôi cấy thì những chất này cũng có tác dụng trên sự tạo chồi. Hầu hết các loài thực vật đều cần đến cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi, trong khi auxin lại có vai trò ngược lại. Có một nhóm thực vật cần đến auxin ngoại sinh để tạo chồi, đó là trường hợp của Lilium. Một nồng độ cytokinin cao phối hợp với lượng auxin thấp rất quan trong trong việc tạo chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau như: Cây Thu hải đường, cây Cải ốc biển (Horse radish), cây Mao địa hoàng; Atropobelladonna và cây Bông cải. Có thể kết luận rằng những cây này có nhu cầu về cytokinin và auxin cho sự tạo chồi bất định, nồng độ auxin thấp còn cytokinin thì cao. Nồng độ cytokinin được sử dụng trong môi trường nuôi cấy khoảng từ 0,1 đến 10,0 ppm. Cytokinin thường dùng phối hợp với auxin, khi dùng ở nồng độ cao thì mẫu cấy có thể cho ra nhiều chồi con nhưng sự tăng trưởng của chồi sẽ bị hạn chế. BA là loại cytokinin có hiệu quả cao trong sự cảm ứng tạo chồi ở nhiều loài thực vật và có thể sử dụng rộng rãi trên các loài hạt trần. Các loại cytokinin khác (Kinetin, 2i-P, BAP và zeatin) cũng có thể được sử dụng nhưng ít hơn BA. 1.4.3.3 Auxin Môi trường nuôi cấy được bổ sung các loại khác nhau như IAA, IBA, NAA. Trong đó, IAA là auxin nội sinh có trong mô thực vật, còn IBA và NAA là các auxin tổng hợp. Auxin được tổng hợp trong thân, trong mô phân sinh và lá non sau đó sẽ di chuyển trong libe tới rễ và tích tụ trong rễ. 13
  22. Đồ án tốt nghiệp Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật thường xuyên được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các cytokinin. Sự áp dụng loại và nông độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cúu Hàm lượng auxin trong mẫu cấy Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy Sự tác động qua lại giữa auxin nội sinh và ngoại sinh Auxin có vai trò kích thích và kéo dài sự tăng trưởng của tế bào. Auxin cũng có tác dụng trong quá trình khởi phát của sự phân chia tế bào. Đặc điểm chung của auxin là tính chất phân chia tế bào. Các chất thuộc nhóm này có hoạt tính: Tăng trưởng chiều dài thân, tính hướng (sáng,đất); Tính ưu thế ngọn; tạp rễ và phân hóa dẫn mạch dẫn. Vai trò của auxin trong sự kéo dài và phân chia tế bào: Ở nồng độ thấp, auxin kích thích sự gia tăng kích thước tế bào. Ở nồng độ cao hơn, auxin kích thích sự phân chia tế bào. Khi nồng độ tăng quá cao, sự phân chia tế bào trở nên hỗn hợp và tạo thành một loại mô vô tổ chức gọi là mô sẹo. Auxin còn kích thích sự hoạt động của thượng tầng này. Axin cũng có vai trò lớn trong sự tăng trưởng chồi bên. Auxin được sinh ra từ chồi ngọn, di chuyển xuống dưới cản trở sự tăng trưởng của chồi bên và kích thích kéo dài thân. Hiện tượng này được dọi là hiện tượng ưu thế ngọn. Skoog (1944) thấy rằng, thêm auxin vào môi trường giúp mô cấy tạo rễ, đồng thời ức chế chồi; ảnh hưởng ức chế này có thể được đảo ngược bằng cách thêm vào cả đường và phosphate hữu cơ. Nghiên cứu này của Skoog và công sự dẫn đến một giả thuyết rằng sự phát sinh cơ quan được điều khiển bởi sự cân bằng giữa cytokinin và auxin. Cơ chế điều hòa phát sinh cơ quan có thể được thấy rõ bằng cách nuôi cấy những lớp mỏng chỉ gồm vài lớp tế bào biểu bì và dưới biểu bì. 14
  23. Đồ án tốt nghiệp Trong đó, chồi phát hoa, chồi sinh dưỡng và rễ hình thành từ lớp cắt mỏng của một số loài khác nhau bằng cách điều khiển tỷ lê auxin/cytokinin, nguồn cung cấp carbon và điều kiện môi trường. Trong sự tạo rễ, nồng độ auxin cao giúp tạo rễ sơ khởi nhưng lại ngăn cản sự tăng trưởng của những sơ khởi rễ này. Đặc điểm này giúp cho việc kích thích tạo rễ bất định trong nhân giống vô tính cây trồng. Ngoài auxin còn có vai trò trong sự rụng, sự phát triển của trái, kích thích phân chia của tế bào thượng tầng, kích thích sự phân hóa libe - mộc. Trong nuôi cấy mô, NAA và IBA là hai loại được sử dụng nhiều nhất, IAA ít được sử dụng hơn vì ít bên trong khi tiến hành khử trùng ở nhiệt độ cao. 1.5 HỆ THỐNG NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO 1.5.1 Khái niệm Các khái niệm về mạng lươi ức chế, trong đó sự tăng trưởng, phát triển và lão hóa bắt nguồn từ mối tương quan có thể điều chỉnh được giữ: 1) cơ quan, mô, tế bào; 2) các cụm tế bào khác nhau; 3) các bào quan trong tế bào đã đưa GS. K. Trần Thanh Vân đến với khái niệm hệ thống lớp mỏng tế bào (TCL) (Trần Thanh Vân, 2003). Thực vật có khả năng tái chương trình hóa (reprogram) các chương trình biệt hóa sự phát triển của cơ thể và có khả năng xây dựng quá trình phân chia chức năng mới, cấu trúc mới (mô sẹo, rễ, chồi, phôi soma và hoa), mẫu phát sinh hình thái mới. Trong trường hợp hình thành cấu trúc mới là chôi và phôi soma, cá thể mới có thể hình thành mà không cần quá trình giảm phân và sinh sản hữu tính. Sự phát triển bên trong thực vật được kiểm soát về không gian và thời gian trong một mạng lưới các đơn vị khác nhau: cơ quan, mô và tế bào. Nếu như có sự thay đổi trong mạng lưới này thì sự ức chế ở mức cá thể có thể xảy ra. Khái niệm về phương pháp TCL là cô lập tế bào từ mạng lưới ức chế này và tái chương trình chúng bằng nuôi cấy in vitro (Nhựt và cộng sự, 2003). 15
  24. Đồ án tốt nghiệp Đặc điểm của phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) bao gồm các mẫu cấy có kích thước nhỏ được cắt ra từ các bộ phận khác nhau của thực vật (thân, lá rễ, phát hoa, các bộ phận của hoa, lá mầm, phôi). Hệ thống TLC là một hệ thống có thể tái chương trình hóa những tế bào đã biệt hóa thành những tế bào mang tính toàn thể với một không gian và thời gian chuyên biệt. Nếu mẫu cấy được cắt theo chiều dọc được gọi là ITCL, nếu được cắt theo chiều nang gọi là tTCL. Các lTCL (1,0 x 0,5 mm hay 10 mm) chỉ chứa một loại mô như lớp đơn của tế bào biểu bì hoặc một vài lớp (3-6 lớp) của tế bào vỏ, ngược lại các tTCL (dày khoảng 0,2 đến 0,5 mm hoặc vài mm) bao gồm một số tế bào thuộc các mô khác nhau (mô biểu bì, mô vỏ, thượng tầng, mô ruột, hay tế bào nhu mô)(Trần Thanh Vân và Gendy, 1996). tTCL và ITCL có đặc điểm chung là mỏng. Đặc điểm mỏng đóng vai trò quan trọng vì các phân tử đánh dấu sự biệt hóa có thể định vị in situ ở những tế bào đích hay những tế bào đáp ứng. Qúa trình định vị này cho phép giới hạn các tế bào cảm ứng không mong muốn (Trần Thanh Vân, 2003). Khi cắt mẫu, mô thực vật bị thương, nhiều enzyme hoặc các polysaccharide sinh ra rất cần cho quá trình cảm ứng sự sinh trưởng và phát triển của thực vật (Trần Thanh Vân và Mutaftshiew, 1990). Lý do cơ bản của việc ứng dụng một vài tế bào trong hệ thống TCL là chúng có mối liên hệ mật thiết với các tế bào bị thương (nơi xảy ra tổng hợp cấu tạo vách tế bào mới và nơi phóng thích của oligosaccharide) và chất dinh dưỡng cùng với các yếu tố khác bên trong môi trường để kiểm soát sự phát sinh hình thái. Tuy nhiên, cũng bởi lý do đó có thể nói chúng khá phụ thuộc vào môi trường. Ngược lại, các mẫu cấy lớn (như thân hoặc các mảnh lá) cho thấy sự phân cực mạnh trong phản ứng với môi trường và chúng có thể chứa các hợp chất nôi sinh cao hơn, bao gồm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nên chúng không phụ thuộc nhiều vào môi trường. Một hệ thống đa bào như hệ thống TCL được định nghĩa như trên mang những tổ chúc không gian và thời gian cố hữu. Khác với khi sử dụng một tế bào tách ra hay tế bào trần, sau khi tách, chúng tạo nên vách tế bào và hình thành nên cụm tế bào mới với tổ chức không gian và thời gian khác biết với sự hỗ trợ trước 16
  25. Đồ án tốt nghiệp khi tiến hành quá trình tách ra từ mô hay cơ quan cho. Hơn nữa hầu hết các trường hợp trong quá trình phát triển của tế bào đơn hay tế bào trần có sự hình một lượng nhỏ mô sẹo, phôi soma trộn lẫn tế bào không phải là phôi như các tế bào ống và rễ. Ngược lại, hệ thống TCL có sự hình thành những thành phần đó với số lượng lớn hơn. Không những chúng được tiếp xúc trực tiếp với môi trường mà còn được chương trình hóa một cách riêng biệt hoặc kết hợp tương ứng với không gian và thời gian (Trần Thanh Vân, 1973; 1974; 1981). Việc giảm số lượng tế bào trong phương pháp lớp mỏng tế bào có ý nghĩa quan trọng vì ảnh hưởng đến quá trình phát triển hoặc các chương trình biệt hóa mô, cơ quan. Các chương trình biệt hóa có thể thay đổi từ việc thay đổi mối tương quan giữa cơ quan và mô nuôi cấy với kích thước của chúng khi nuôi trên môi trường cùng tính chất. Lát cắt dọc được dùng phổ biến và các dạng phát sinh hình thế mong muốn có thể tạo được qua việc điều khiển mức độ tác động của các nhân tố ngoại sinh. Bên cạnh đó, khoảng thời gian để quá trình phát sinh hình thái xuất hiện tương đối ngắn (trung bình khoảng 14 ngày sau khi cấy). Tần số cũng khá cao, gần 100% mẫu có phản ứng. Cường độ của các cơ quan được thiết lập trước, do đó tỷ số giữa số lượng tế bào phản ứng và tế bào hiện diện trên mẫu TCL là rất cao. Ví dụ như trên một mẫu ITCL của cây thuốc lá (Nicotiana tobacum) có kích cỡ 1x10 mm bao gồm 3 - 6 lớp tế bào biểu bì và được thu nhận từ cánh hoa, các cơ quan sau đây được biệt hóa trực tiếp trên bề mặt của TCL (mà không trải qua quá trình mô sẹo trung gian: 1) 50 hoa trong chương trình hoa, 2) 500-700 chồi trong chương trình chồi, 3) 15-20 rễ trong chương trình rễ. Các tính chất mong muốn khác có được trong phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào là sự động nhất về sinh lý, di truyền và có thể ứng dụng phương pháp này cho mọi thực vật. Tuy nhiên, điều kiện môi trường lý tưởng phù hợp cho sự tồn tại của mẫu TCL phụ thuộc bào loài và đòi hỏi chúng ta phải thử nghiệm lại tất cả các điều kiện nuôi cấy in vitro bao gồm PGRs, chất dinh dưỡng, ánh sáng, sự thẩm thấu nhiệt độ (Trần thanh Vân, 1980). 17
  26. Đồ án tốt nghiệp Ưu điểm của phương pháp o Diện tích tiếp xúc của mẫu với môi trường lớn nên mẫu dễ dàng hấp thu các chất dinh dưỡng từ môi trường. o Dễ định vị vùng cho phản ửng do chỉ có một lớp mỏng tế bào. o Lượng hormone nội sinh trong mẫu thấp vì thế các chất điều hòa sinh trưởng thực vật dễ tác động lên mẫu. o Mẫu muôi cấy đồng nhất và nhanh chóng trả lời các cảm ứng. 18
  27. Đồ án tốt nghiệp 2 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI Luận văn tốt nghiệp được tiến hành tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Sinh Học Nhiệt đới Tp Hồ Chí MINH, Số 9/621 Xa lộ Hà Nội, Khu Phố 6, phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, TP. Hồ Chí Minh.Thời gian thực hiện luận văn từ 15/01/2015 đến 20/08/2015. 2.2 VẬT LIỆU 2.2.1 Nguồn mẫu Nguồn mẫu: Sử dụng cây Xạ đen in vitro ở trong phòng phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Thực Vật. 2.2.2 Môi trƣờng nuôi cấy Môi trường được sử dụng là MS, 1/2MS, SH, WPM, B5 có bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar. Môi trường được điều chỉnh pH trong khoảng 5,7 - 5,8. Sau đó được hấp khử trùng ở điều kiện 121oC, 1atm trong 20 phút. 2.2.3 Dụng cụ thiết bị Thiết bị: tủ cấy vô trùng, nồi hấp Autoclave, cân phân tích, phòng nuôi cấy được trang bị hệ thống đèn và máy lạnh. Dụng cụ: Ống đong 100ml, phễu, micropipette 5ml, đĩa petri, đũa khuấy thủy tinh, bình thủy tinh 250 ml. Hóa chất: Hóa chất phòng thí nghiệm. 2.2.4 Điều kiện nuôi cấy Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25oC, thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng: 45µmol.m-2.s-1 và độ ẩm phòng nuôi cấy: 55 - 60%. 1
  28. Đồ án tốt nghiệp 2.2.5 Kệ đèn LED Mỗi tỷ lệ ánh sáng của đèn LED có 1000 bóng lắp đặt trong một ngăn kệ có chiều dài 1000 cm, chiều rộng 40 cm và chiều cào 40 cm. Khoảng cách từ các bảng đèn LED xuống bình nuôi cấy là 30 cm. Các tỷ lệ ánh sáng của đèn LED có cường độ ánh sáng từ 17 - 25 µmol.m-2.s-1. 2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của một số môi trƣờng khoáng lên sự phát triển mô sẹo từ lớp mỏng đốt thân và lá cây Xạ đen - Mục đích thí nghiệm Xác định được môi trường khoáng thích hợp nhất lên sự cảm ứng hình thành mô sẹo của cây Xạ đen. - Mô tả thí nghiệm Mẫu cấy được cấy lên các loại môi trường khoáng khác nhau (MS, 1/2MS, SH, WPM, B5) có bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar và 1,5 mg/l 2,4-D (Trần Trọng Tuấn và cộng sự, 2014). Môi trường được chỉnh pH về 5,7 - 5,8 sau đó hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút. Các mẫu cấy được nuôi cấy và ghi nhật kết quả sau 40 ngày nuôi cấy. - Chỉ tiêu theo dõi: Sau 6 tuần nuôi cấy, tiến hành lấy số liệu các chỉ tiêu sau: - Số mẫu sống, mẫu chết - Tỉ lệ hình thành mô sẹo - Trọng lượng tươi 2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của CĐHSTTV lên khả năng tăng sinh mô sẹo - Mục đích thí nghiệm Xác định loại và nồng độ CĐHSTTV thích hợp cho sự tăng sinh mô sẹo xốp 2
  29. Đồ án tốt nghiệp Cách tiến hành Mẫu mô sẹo (1 g) được cấy lên môi trường khoáng thích hợp nhất cho sự tạo mô sẹo (Môi trường SH bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar và 2,4-D ở các nồng độ khác nhau (0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6 mg/l)). Môi trường được chỉnh pH về 5,7 - 5,8 sau đó hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút. Các mẫu cấy được nuôi cấy và ghi nhận kết quả sau 40 ngày nuôi cấy. - Chỉ tiêu theo dõi: Trọng lương tươi Trọng lượng khô 2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện ánh sáng lên khả năng tăng sinh mô sẹo - Mục đích thí nghiệm Xác định loại ánh sáng thích hợp nhất cho sự tăng sinh mô sẹo xốp. - Cách tiến hành Mẫu cấy mô sẹo (250mg) sau khi được cấy lên môi trường thích hợp (môi trường khoáng tốt nhất có bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar). Môi trường được chỉnh pH 5,7 - 5,8 sau đó hấp khử trùng 121oC, 1atm trong 20 phút. Sau đó, mẫu được nuôi dưới các điều kiện ánh sáng khác nhau như: đèn huỳnh quang, đèn LED xanh, đèn LED đỏ. Chỉ tiêu theo dõi: - Trọng lượng tươi sau 40 ngày nuôi cấy - Sự biến thiên hhối lượng mô sẹo trước và sau khi cấy truyền. 2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng (rắn, bán rắn, lỏng, lỏng lắc) lên khả năng tăng mô sẹo - Mục đích thí nghiệm 3
  30. Đồ án tốt nghiệp Xác định trạng thái môi trường thích hợp nhất cho sự tăng sinh mô sẹo xốp thích hợp. - Môi trường nuôi cấy Môi trường khoáng tốt nhất ở thí nghiệm 1 bổ sung 30 g/l sucrose và bổ sung agar với hàm lượng thay đổi: 8 g/l, 4 g/l, 0 g/l. Môi trường được chỉnh pH về 5,7 - 5,8 sau đó hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút. - Cách tiến hành Mẫu cấy mô sẹo (200 mg) được cấy lên môi trường khoáng tốt nhất ở thí nghiệm 1 nhưng thay đổi hàm lượng agar để có trường rắn (8 g/l), bán rắn (4 g/l agar) và môi trường lỏng không có agar. Các nghiệm thức môi trường rắn, bán rắn, lỏng tĩnh được đặt ở điều kiện nuôi cấy tĩnh. Nghiệm thức lỏng lắc được nuôi trên máy lắc với tốc độ lắc 120 vòng/phút. Chỉ tiêu theo dõi: Trọng lượng tươi, trọng lượng khô. 2.3.5 Cách thu các chỉ tiêu khảo sát Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)= Tỷ lệ mẫu sống (%) = Khối lƣợng tƣơi mô sẹo: Mô sẹo được đặt trên đĩa petri vô trùng và được cân bằng cân phân tích trong tủ cấy vô trùng để xác định khối lượng tươi. 2.3.6 Phƣơng pháp thu thập số liệu Thu thập và xử lý số liệu bằng phần mềm excel 2010 và phần mềm spss 16.0 (michigan) theo phương pháp ducan (Duncan, 1955) với độ tin cậy p ≤ 0,05. 4
  31. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng khoáng lên sự phát triển mô sẹo từ đốt non thân và mẫu lá của cây Xạ đen Một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy in vitro là thành phần môi trường nuôi cấy. Thành phần môi trường này thay đổi tùy theo loài thực vật và bộ phận nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Trong nuôi cấy mô có rất nhiều loại môi trường khác nhau, tuy nhiên chúng có thể chia thành ba nhóm: nhóm nghèo dinh dưỡng như môi trường Knudson (Knudson, 1946); môi trường có dinh dưỡng trung bình như môi trường White (White, 1954), môi trường B5 (Gamborg và cộng sự, 1968) và môi trường giàu dinh dưỡng điển hình là môi trường MS (Murashige và skoog, 1962). Trong nghiên cứu này, mẫu cấy được cắt lớp mỏng theo tiết diện ngang (0,2 - 0,5 mm). Chúng tôi đã sử dụng loại vật liệu và môi trường tối ưu cho việc tạo mô sẹo xốp từ mẫu thân non được cấy trên môi trường có bổ sung 1,5 mg/l 2,4-D (Trần Trọng Tuấn và công sự, chưa công bố). Bảng 3.1 Ảnh hưởng của một số môi trường khoáng lên sự phát triển mô sẹo từ đốt thân non cây Xạ đen. Loại mẫu Tỉ lệ mẫu sống Tỉ lệ hình thành Trọng lƣợng Môi trƣờng cấy (%) mô sẹo (%) tƣơi (g) MS 91,11 0,00 0b* WPM 80,00 0,00 0b 1/2MS Thân 66,67 31,11 0,017b B5 84,44 44,44 0,10b SH 66,67 55,56 0,32a MS - - - WPM Lá - - - 1/2MS - - - B5 - - - SH - - - *Các chữ cái a, b, trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan; -: Mẫu bị chết. 5
  32. Đồ án tốt nghiệp % tỉ lệ hình thành mô sẹo 60 50 40 30 20 10 0 MS WPM 1/2MS B5 SH Biều đồ 3.1 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên tỷ lệ sống mô sẹo g trọng lượng tươi 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 MS WPM 1/2MS B5 SH Biều đồ 3.2 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên trọng lượng tươi mô sẹo 6
  33. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.1 Mô sẹo được nuôi cấy trên những môi trường khác nhau theo thứ tự từ trên xuống lần lượt là MS, WPM, ½MS, SH, B5.a1, a2) Mô sẹo hình thành trên môi trường ½ MS; b1, b2) Mô sẹo hình thành trên môi trường SH; c1, c2) Mô sẹo hình thành trên môi trường B5 Trong thí nghiệm này, các mẫu thân non Xạ đen được nuôi cấy trên 5 loại môi trường khoáng khác nhau (MS, ½MS, B5, SH, WPM). Sau 4 tuần nuôi cấy, khả năng hình thành mô sẹo trên năm loại môi trường có sự khác biệt về mặt thống kê. Tỷ lệ hình thành mô sẹo đạt cao nhất trên môi trường SH (55,56%), tiếp theo là môi trường B5 (44,44%), ½MS (31,11%), hai môi trường MS và WPM thì không tạo mô sẹo (Biểu đồ 3.1). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trên cây sâm Ngọc Linh 7
  34. Đồ án tốt nghiệp (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2012). Kết quả của nghiên cứu này cho thấy các mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường SH cho tỷ lệ tăng sinh trọng lượng tươi cao nhất (0,977g) (Biểu đồ 3.2). Khi so sánh về thành phần khoáng của 5 loại môi trường được khảo sát nhận thấy có sự khác biệt đáng kể về hàm lượng nitrogen (N). Hàm lượng N tổng (ở cả + - dạng NH4 và NO3 ) trong môi trường MS cao hơn 2 lần so với môi trường B5, hơn 3 lần so với môi trường WPM và môi trường SH. Điều này cho thấy môi trường SH với hàm lượng N thấp thích hợp cho việc phát sinh hình thái mô sẹo. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thành phần môi trường đóng vai trò quan trọng đối với sự phát sinh cơ quan, trong đó có sự thay đổi về hàm lượng N. Hàm lượng N thích hợp giúp cho sự hình thành và tăng sinh mô sẹo tốt hơn, nếu hàm lượng N quá cao quá thấp sẽ không hình thành hay gây ức chế sự tăng sinh trọng lượng của mẫu (Kim và cộng sự, 2005). Quá trình hình thành mô sẹo bị tác động bởi nhiều yếu tố như chất điều hòa sinh trưởng thực vật, môi trường khoáng và đặc biệt là sự khác nhau giữa các nguồn nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu.Trong thí nghiệm này, chúng tôi cũng khảo sát sự ảnh hưởng môi trường khoáng lên sự phát sinh hình thái của mẫu lớp mỏng lá cây Xạ đen. Tuy nhiên, chúng tôi đã không thu được mô sẹo như mong muốn, hầu hết các mẫu cấy ở tất cả nghiệm thức hóa nâu và chết. Sự phát sinh hình thái ở các loài thực vật khác nhau thì khác nhau. Trong nghiên cứu trên đối tượng cây kiwi của Nguyen Phuc Huy và Duong Tan Nhut (2012), kết quả cho thấy mô sẹo được hình thành từ mẫu lá tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l đến 2,0 mg/l 2,4-D. 3.2. Ảnh hƣởng của 2,4-D lên khả năng tăng sinh mô sẹo Hoạt động cảm ứng tạo mô sẹo của 2,4-D đã được chứng minh ở rất nhiều loài cây như: cây Solanum chrysotrichum (Luisa Villarreal và cộng sự, 1997), cây Sâm Triều Tiên (Panax ginseng) (Nguyễn Trung Thành và Kee Yoeup Paek, 2009), cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (Nguyễn Thị Liễu và cộng sự, 2010). 2,4-D đã được chứng minh là thích hợp cho nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền 8
  35. Đồ án tốt nghiệp phù tế bào của cây Bèo đất (Drosera burmanni vahl) (Quách Ngô Diễm Phương và cộng sự, 2010), cây Dừa cạn (Catharanthus roseus) (Bùi Văn Lệ và Nguyễn Ngọc Hồng, 2006; Saifullah và Saifullah Khan, 2011), cây Củ cải đường (Beta vulgaris L.) (Gürel S. và cộng sự, 2001). Trong nghiệm thức này, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên khả năng tăng sinh mô sẹo “xốp” của cây Xạ đen. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2 Ảnh hưởng của 2,4-D lên khả năng tăng sinh mô sẹo cây Xạ đen Trọng lƣợng tƣơi Nồng độ 2,4- Trọng lƣợng tƣơi Tỷ lệ gia tăng mô sẹo ban đầu D(mg/l) (mg) trọng lƣợng tƣơi (mg) 0,2 381,73d* 1,91d 0,4 456,20d 2,28d 0,6 651,73c 3,26c 0,8 812,29ab 4,06ab 200 1,0 819,27a 4,10a 1,2 770,27ab 3,85ab 1,4 789,80ab 3,95ab 1,6 708,33bc 3,54bc *Các chữ cái a, b, trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan Khi sự cân bằng các chất kích thích sinh trưởng trong thực vật thay đổi, cụ thể các mô đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra nuôi cấy trên môi trường giàu auxin thì mô sẹo được hình thành. Đó là các khối tế bào phát sinh vô tổ chức và có hình dạng không nhất định với màu vàng, trắng hoặc hơi xanh. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là thành phần quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy. 9
  36. Đồ án tốt nghiệp Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu qua sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất. Trong số các auxin, 2,4-D sử dụng rất có hiệu quả trong việc tạo mô sẹo ở nhiều loài thực vật và không được dùng trong môi trường tái sinh cơ quan (Vũ Văn Vụ, 2007). Hình 3.2Hình thái mô sẹo.a, b, c) Mô sẹo tăng sinh trên môi trường có 2,4-D nồng độ 1,0 mg/l; d) Sự tăng sinh mô sẹo trên ba loại ánh sáng khác nhau theo thứ tự LED đỏ, LED xanh, huỳnh quang; e) Mẫu lá chết trên hầu hết môi trường; f) Mô sẹo tăng sinh trên môi trường thạch. Các mẫu mô sẹo “xốp” được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 2,4-D sau 40 ngày nuôi cấy được thể hiện qua bảng 3.3. Sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo khác 10
  37. Đồ án tốt nghiệp nhau ở các nồng độ 2,4-D khác nhau. Trọng lượng tươi và tỷ lệ gia tăng trọng lượng tươi đạt cao nhất ở nghiệm thức sử dụng 1,0 mg/l 2,4-D (819,29mg và 4,10), mô sẹo xốp, mọng nước và có màu trắng trong. Ở các nghiệm thức có bổ sung 2,4-D thấp (0,2-0,6 mg/l) thì tỷ lệ gia tăng trọng lượng tươi thấp (1,91 - 3,26) (Biều đồ 3.4). Còn đối với nghiệm thức không bổ sung 2,4-D thì mẫu hóa nâu và chết. Điều này chứng tỏ 2,4-D có vai trò quan trọng trong việc cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp”. Kết quả này cũng tương tự với kết quả của một số nghiên cứu của Lê Kim Cương và công sự (2012) trên cây sâm Ngọc Linh, Thanh và cộng sự trên cây sâm Triều Tiên, mẫu cảm ứng và hình thành mô xẹo “xốp” và tăng sinh nhanh trên môi trường có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D. Một số nghiên cứu khác, người ta cũng đã sử dụng 2,4-D đề tăng sinh mô sẹo, nhưng hàm lượng thì khác nhau ở các loại mẫu cấy và môi trường khác nhau. Trong nghiên cứu trên đối tượng cây kiwi Nguyen Phu Huy và Duong Tan Nhut (2012), kết quả cho thấy mô sẹo được hình thành từ mẫu lá tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l đến 2,0 mg/l 2,4-D.g g 1.80 1.60 1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 Biểu đồ 3.3Ảnh hưởng của 2,4-D lên khả năng tăng sinh trọng lượng tươi mô sẹo 11
  38. Đồ án tốt nghiệp g 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của 2,4-D lên tỷ lệ gia tăng trong lượng mô sẹo 3.3. Ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng lên khả năng tăng sinh mô sẹo Tùy theo từng loại mẫu cấy, ánh sáng cần hoặc không cần trong suốt thời gian tạo mô sẹo. Nghiên cứu của về sự kết hợp giữa auxin và ánh sáng trên đối tượng Cucumis sativuscho thấy mô sẹo phát sinh từ lá có trọng lượng tươi cao nhất với sự kết hợp giữa 2,4-D 2,0 mg/l và điều kiện chiếu sáng là 16 giờ/ngày. Bảng 3.3Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên khả năng tăng sinh mô sẹo Trọng Trọng lƣợng Trọng lƣợng Tỷ lệ gia tăng Loại đèn lƣợng ban tƣơi (g) tƣơi gia tăng trọng lƣợng đầu (g) (g) tƣơi Đèn huỳnh 0,40b 0,15b 0,60 quang LED đỏ 0,25 0,40b 0,15b 0,60 LED xanh 0,60a 0,35a 1,71 *Các chữ cái a, b, trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan 12
  39. Đồ án tốt nghiệp g 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Huỳnh quang LED đỏ LED xanh Biểu đồ3.5 Ảnh hưởng ánh sáng lên trọng lượng tươi mô sẹo g 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Huỳnh quang LED đỏ LED xanh Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng ánh sáng lên tỷ lệ gia tăng trọng lượng tươi mô sẹo Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát điều kiện chiếu sáng khác nhau là lên khả năng tăng sinh mô sẹo của cây Xạ đen. Mô sẹo được cấy chuyền sang môi trường SH dưới điều kiện chiếu sáng khác nhau. Kết quả ghi nhận sau 40 ngày nuôi cấy được thể hiển ở bảng 3.2. 13
  40. Đồ án tốt nghiệp Ánh sáng điều khiển sự sinh trưởng và phát triển của thực vật thông qua hai con đường: quang hợp và phát sinh hình thái. Ở các mô nuôi cấy, có ba yếu tố ảnh hưởng đến ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái đó là bước sóng, cường độ và thời gian chiếu sáng. Kết quả của thí nghiệm này cho thấy ánh sáng đơn sắc có vai trò khác nhau trong quá trình khởi tạo và tăng sinh mô sẹo cây Xạ đen trong nuôi cấy in vitro. Ánh sáng xanh của đèn LED cho sự khởi tạo và tăng sinh mô sẹo tốt hơn ánh sáng huỳnh quang và LED đỏ, với trọng lượng tươi và tỉ lệ gia tăng mô sẹo lần lượt là 0,35 g và 1,75 lần (Bảng 3.3). Trong khi đó sự gia tăng về trọng lượng tươi mô sẹo bị hạn chế khi nuôi cấy dưới ánh sáng huỳnh quang và ánh sáng đỏ. Các nghiên cứu trước cũng chỉ ra rằng ánh sáng đỏ giúp cho sự kéo dài thân và chồi, đáp ứng phytochrome và thay đổi cấy trúc giải phẩu của cấy. Ánh sáng xanh có vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp chlorophyll, sự mở khí khổng, tổng hợp các enzyme, sự trưởng thành của lục lạp và quá trình quang hợp. Ánh sáng đỏ cần thiết cho sự sinh trưởng của thực vật, trong khi đó, ánh sáng xanh lại góp phần vào quá trình quang hợp của cây. Trong nghiên cứu này chúng tôi thấy rằng sự gia tăng trong lượng tươi mô sẹo của cây Xạ đen là cao nhất khi nuôi cấy dưới đèn LED xanh. Ánh sáng huỳnh quang và ánh sáng đỏ không thích hợp cho sự tăng sinh mô sẹo của cây. Kết quả này cũng tương đồng với các nghiên cứu ở một số loài cây khác như Lilium, Cây Bông. Các tác giả đều cho rằng sự sinh trưởng thu được là tốt nhất khi các cây được nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sáng có ánh sáng xanh. Abdullahil Baque và cộng sự (2010) đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất lượng ánh sáng lên sự sinh trưởng của cây Calanthe in vitro và cho thấy rằng sự sinh trưởng tốt nhất khi được nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sang của ánh sáng xanh và đỏ. Tuy nhiên, vai trò của từng loại ánh sáng có sự ảnh hưởng khác nhau giữa các loài cây khác nhau. Các mẫu mô sẹo xốp được cấy trên môi trường SH có bổ sung 2,4 D sau 40 ngày nuôi cấy được thể hiện qua bảng 3.2. Sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo khác 14
  41. Đồ án tốt nghiệp nhau ở các điều kiện sáng khác nhau. Trong lượng tươi và tỷ lệ gia tăng trọng lương đạt cao nhất ở điều kiện ánh sáng LED xanh (0,35 g và 1,75). Dưới ánh sáng LED xanh mô sẹo hình thành có dạng xốp, mọng nưới và có màu trắng trong. Đối với ánh sáng LED đỏ và huỳnh quang thì quá trình tăng sinh mô sẹo bị hạn chế. Trọng lương tươi giảm (0,15g)và một vài mẫu có hiện tượng hóa nâu. 3.4. Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng (rắn, bán rắn, lỏng, lỏng lắc) lên khả năng tăng sinh mô sẹo Phần lớn trong vi nhân giống đều sử dụng hệ thống nuôi cây trên môi trường thạch. Kỹ thuật này đã trở thành phương pháp nhân giống chuẩn mực và phổ biến đối với nhiều loại cây trồng. Sự phát triển của các khối mô có thể bị thay đổi hoàn toàn hoặc không có sự thay nếu chúng được nuôi cấy trong một môi trường đặc hoặc trong một môi trường lỏng (Dương Công Kiên, 2002). Trong nghiên cứu này, các trạng thái môi trường như rắn (8 g/l agar), bán rắn (4 g/l), lỏng tĩnh và lỏng lắc (120 vòng/phút) được khảo sát lên sự tăng sinh mô sẹo của cây Xạ đen, kết quả được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.4 Ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên khả năng tăng sinh mô sẹo Tỷ lệ gia tăng Trọng lượng Trọng lượng Trọng lượng Nghiệm thức trọng lượng ban đầu (mg) tươi (mg) khô (mg) tươi Rắn 811,13a* 73,47a 4,06 Bán rắn 804,80a 19,53 4,02 200 mg Lỏng tĩnh 238,29c 43,93c 1,19 Lỏng lắc 709,33b 56,33b 3,54 *Các chữ cái a, b, trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan Trong thí nghiệm này, chúng tôi thấy có sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê giữa bốn trạng thái môi trường được khảo sát. Các mẫu mô sẹo được nuôi cấy ở môi trường rắn và bán rắn có tỷ lệ gia tăng về trọng lượng đáng kể, trọng lượng 15
  42. Đồ án tốt nghiệp tươi của mô sẹo đạt 804,80 mg đối với môi trường bán rắn và môi trường rắn đạt 811,13 mg, tuy nhiên các khối mô sẹo chỉ gia tăng về kích thước mà không tách rời hay lan rộng ra môi trường. Mô sẹo được cấy trên môi trưởng lỏng lắc và môi trường lỏng tĩnh có sự gia tăng về trọng lượng tươi không tốt bằng trên môi trường rắn, khối lượng đạt lần lượt là 709,33 mg trên môi trường lỏng lắc và 238,20 mg trên môi trường lỏng tĩnh. Khi các mô sẹo được nuôi trên môi trường lỏng lắc thì các tế bào có khuynh hướng tách rời ra và có khả năng tăng sinh lên trong môi trường, điều này có thể được ứng dụng để nuôi cấy huyền phù tế bào ở các hệ thống lớn hơn có trao đổi khí như bioreactor nhằm thu nhận được sinh khối nhiều hơn. Tỷ lệ gia tăng trọng lượng tươi ở môi trường rắn và bán rắn đạt kết quả tốt hơn hai môi trường còn lại (Biểu đồ 3.7). mg mg 900 80 800 70 700 60 600 50 500 40 400 30 300 200 20 100 10 0 0 Rắn Bán rắn Lỏng tĩnh Lỏng lắc TL tươi TL Khô 3 Biểu đồ 3.7Ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên khả năng tăng sinh trọng lượng tươi mô sẹo 4 16
  43. Đồ án tốt nghiệp 5 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN - Môi trường phát sinh hình thái mô sẹo tốt nhất của cây Xạ đen là SH - Trọng lượng tươi và tỷ lệ gia tăng trong lượng đạt cao nhất ở nghiệm thức sử dụng 1,0 mg/l 2,4-D (819,29 mg và 4,10), mô sẹo xốp, mọng nước và có mà trắng trong. - Ở các nghiệm thức có bổ sung 2,4-D thấp (0,2-0,6 mg/l) thì tỷ lệ gia tăng trọng lượng tươi thấp (1,91 - 3,26) - Trong lượng tươi và tỷ lệ gia tăng trọng lương đạt cao nhất ở điều kiện ánh sáng LED xanh (0,35 và 1,75 g). Dưới ánh sáng LED xanh mô sẹo hình thành có dạng xốp, mọng nước và có màu trắng trong. - Đối với ánh sáng LED đỏ và huỳnh quang thì quá trình tăng sinh mô sẹo bị hạn chế. Trọng lương tươi giảm (0,15g) và một vài mẫu có hiện tượng hóa nâu. - Các mẫu nuôi cấy ở môi trường rắn và bán rắn có tỷ lệ gia tăng trọng lượng đáng kể, trọng lượng tươi đạt 804,80 mg đối với môi trường bán rắn và môi trường rắn đạt 811,13 ng, tiếp theo là nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc (709,33 mg) và thấp nhát là lỏng tĩnh (238,20 mg). 17
  44. Đồ án tốt nghiệp 6 CHƢƠNG 5: KIẾN NGHỊ • Cần khảo sát thêm tỉ lệ phối hợp đèn LED xanh và đèn LED đỏ lên sự hình thành môi sẹo. • Khảo sát thêm một số chất điều hòa sinh trưởng khác lên sự tăng sinh mô sẹo. 18
  45. Đồ án tốt nghiệp 7 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1]. Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng (2006). Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật và đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào Dừa cạn (Catharanthus Roseus), Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, 9, 59- 66. [2]. Lê Thị Huyền, Phạm Huyền Trang, Nguyễn Đình Chung, Nguyễn Văn Đậu (2007). Hoạt tính độc tế bào của cây Xạ đen và cây Bông ổi – Cytotoxity of celastrus hindsii Benth et Hook and Lantana camara L., Hội nghị Khoa học và Công nghệ hóa hữu cơ toàn quốc lần thứ IV, 624-627. [3]. Nguyễn Thị Vân Khanh, Triệu Duy Điệt, Nguyễn Văn Minh, Vũ Bình Dương, Nguyễn Tuấn Quang, Lương Quang Anh, Phạm Quốc Long (2007). Kết quả ban đầu về nghiên cứu cấu trúc hóa học của chất phân lập từ cây Xạ đen (Ehretia Zoll. Et mor.), Hội nghị Khoa học và Công nghệ hóa hữu cơ toàn quốc lần thứ IV, 422-425. [4]. Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết (2010). Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định của sâm Ngọc Linh (Panax vietnamens is Ha et Grushv.) trong nuôi cấy in vitro, Tạp chí Khoa học, 27, 30-36. [5]. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006). Công nghệ Tế bào, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh. [6]. Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thành Hải, Mai Xuân Phán, Phan Xuân Huyên, Đinh Văn Khiêm (2005). Nuôi cấy lắc và nuôi cấy bioreactor trong nhân giống cây hoa Thu hải đường (Begonia tubeous), Tạp chí Công Nghệ Sinh Học, 3(3), 363-372. [7]. Dương Tấn Nhựt (2011). Ra hoa trong ống nghiệm và kỹ thuật di truyền trong công nghệ chọn tạo giống hoa, Công Nghệ Sinh Học Thực Vật: Nghiên cứu cơ bản và ứng dụng (tập 1), NXB Nông nghiệp, 257-316. 19
  46. Đồ án tốt nghiệp [8]. Dương Tấn Nhựt, Trần Thị Thu Hà, Trịnh Thị Hu o ng, Hoàng Va n Cu o ng, Nguyễn Phúc Huy (2011). Nghiên cứu sự hình thành mô sẹo và tế bào đơn cây Kiwi (Actinidia delicosa), Tạp chí Công nghệ inh học, 34(4), 505- 514. [9]. Quách Ngô Diễm Phương, Hoàng Thị Thanh Minh, Hoàng Thị Thu, Bùi Văn Lệ (2010). Nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù tế bào cây bèo đất Drosera Burmanni Vahl cho mục tiêu thu nhận Quinone, Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, 13, 53-61. [10]. Trần Trọng Tuấn (2015). Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây xạ đen (celastrus hindsii. et Hook) bằng bioreactor, Tạp chí Công nghệ Sinh học, Đã nhận đăng. [11]. Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. Tài liệu nƣớc ngoài [12]. Abdullahil B.M., Yun-Kyong S., Elshmari T., Eun-Jung L., Paek K.Y. (2010). Effect of light quality, sucrose and coconut water concentration on the microporpagation of Calanthe hybrids (‘Bukduseong’ × ‘Hyesung’ and ‘Chunkwang’ × ‘Hyesung’), Aust. J. Calanthe hybrids (‘Bukduseong’ × ‘Hyesung’ and ‘Chunkwang’ × ‘Hyesung’), Aust. J. Crop Sci. 5 (10), 1247- 1254. [13]. Bruning R., Wagner H. (1978). Ubersicht uber die celastraceen Inhalstsstoffe chemite, cehmotaxonomie biosynthese, Pharmakologie. Phytochemistry 17, 1821-1858. [14]. Duncan D.B. (1955), Multiple range and multiple F tests, Biometrics 11, 1-42. [15]. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. (1968). Nutrient requirements of suspension cultures of soyabean root cells, Exp. Cell Res., 50, 151-158. [16]. Hunault G. (1979). Recherches sur le comportement des fragments d’organs et des tissue de monocotyle dones cultives in vitro II, Estude de cas de quelques agavacees, Rev. Cytol. Biot. Veg. Bot., 2, 21-66. 20
  47. Đồ án tốt nghiệp [17]. Jung B., Shin M. (1999). Encyclopedia of illustrated Korea Natural Drugs. In Encyclopedia of illustrated Korea Natural Drugs, Yong Lim Sa: Seoul, 845- 846. [18]. Hu X.Q., Han W., Han Z.Z., Liu Q.X., Liu Q.X, Xu X.K, Fu P., Li Hu (2014). A new macrocyclic lactone and a new quinoflavan from Celastrus hindsii, Phytochemistry Letters, 7, 169-172. [19]. Huang H.C., Shen C.C., Chen C.F, Wu Y.C.C, and Kuo Y.H. 2000. A novel Agarofuran Sesquiterpene, Celahin D fromCelastrus hindsii, chemical and Pharmaceutical Bulletin 48, 1079-1080. [20]. Knudson L. (1946). A new nutrient solution for germination orchid seed. American orchid Soc. Bull. 1,: 215-217. [21]. Kuo Y.H., and Yang-Kuo L.M. (1997). Antitumour and anti-AIDS triterpenes from Celastrus hindsii, Phytochemistry, 44, 1275-1281. [22]. Kuo Y.H., Chen C.F. and Yang-Kuo L.M. (1995). Celahinine A, a new sesquiterpene pyridine alkaloid from Celastrus hindsi, Journal of National Product, 58, 1735-1738. [23]. Kuo Y.H., Chou C.J., Yang-Kuo L.M., Hu Y.Y., Chen Y.C., Chen C.F. and Lee K.H (1996). A sesquiterpene ester from Celastrus hindsii, Phytochemistry, 41, 549-551. [24]. Luisa V., Carlos A., Alfredo F. V., Octavio T., Rodolfo Q. (2007). Cell suspension culture of Solanum chrysotrichum (Schldl.) - A Plant producing an antifungal spirostanolsaponin, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 50, 39- 44. [25]. Ly T.N., Shimoyamada M. and Yamauchi R. (2006). Isolation and characterization of rosmarinic acid oligomers in Celastrus hindsii Benth leaves and their antioxidative activity, Journal of Agricultural and Food Chemitry, 54, 3786-3793. [26]. Murashige T. and Skoo F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant, 15, 473-497. 21
  48. Đồ án tốt nghiệp [27]. Pierik R.L.M. (1987). In vitro culture of higher plants, Martinus Nijhoff Publishers. [28]. Schenck R.U., Hildebrandt A.C. (1972). Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell culture, Can. J. Bot., 50, 199-204. [29]. Su X.H., Zang M.L., Zan W.H, Huo C.H., Shi Q.W., Gu Y.C., Kiyota H. (2009). Chemical and pharmacological studies of the plants from genus Celastrus, Chemistry & Biodiversity, 6, 146-161. [30]. Takaishi Y., Ujita K., Tokuda H., Nishino H., Iwashima A., Fujita T. (1993). Inhibitory effects of dihydroagarofuran sesquiterpenes on Epstein-Barr virus activation, Cancer Lett, 67(2-3), 2, 15. [31]. Thanh N.T. and Paek K.Y. (2009). Cell suspension culture Panax ginseng C. A. Meyer, Role of plant growth regulators and medium composition on biomass and ginsenoside production, Tạp chí Khoa Học, 26, 191-196. [32]. Tran Thanh Van K. (2003), Thin cell layer concept, In: Nhut, D.T., LE, B.V., Tran Thanh Van K. and Thorpe T. (eds). Thin cell layer culture system Regeneration and transformation applications, Kluwer Academic Publishers, Dorrecht, 1-11. [33]. Tran Thanh Van K., Mutaftschiev S. (1990). Signals influencing cell elongation, cell, cell enlargement, cell division and morphogenesis, In: Nijkam H.J.J., Van der Plas L.H.W., Aartif J. (eds), Progress in plant cellular and molecular biology, Kluwer Academic, 514-519. [34]. Tran Thanh Van M. (1973). In vitro control of de novo flower, bud, root and callus differentiation from excised epidermal tissues, Nature, 245, 44-55. [35]. Tran Thanh Van K. (1974). Methods of acceleartion of growth flowering in a few species of orchids, Amer, Orchid Soc, Bull, 43, 699-707. [36]. White P. R. (1954). The Cultivation of Animal and Plant Cells. New York, NY: The Ronald Press Company. Tài liệu internet 22
  49. Đồ án tốt nghiệp [37]. [38]. www.ncbi.nlm.nih.gov 23
  50. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trƣờng khoáng Dạng sử Thành phần ` dụng MS B5 SH WP M Khoáng đa 1990 2500 2500 KNO3 lượng 2500 195,05 MgSO4.7H2O 370 1340 300,0 (NH4)2SO4 1500 151,0 96 CaCl2.2H2O 440 NaH2PO4 1340 (NH4)2SO4 NH4NO3 1650 400 KH2PO4 170 170 Ca3(PO4)2 2500 MgSO4.7H2O Ca(NO3)2.anhydrous 559 KCL NaH2PO4.anhydours Khoáng vi MnSO4.4H2O 22,3 lượng 300 80,86 6,2 H3BO3 6,2 ZnSO4.7H2O 8,6 200 3,48 KI 0,83 6,02 2,5 0,9 CuSO4.5H2O 0,025
  51. Đồ án tốt nghiệp 25 0,41 Na2MoO4.2H2O 37,3 25 0,42 CoCl2.6H2O 0,025 MnSO4.H2O 1000 59,17 Fe2(C4H4O6)3 MoO3 Na2SO4 Vitamin Myo-Inositol 1000,0 Thiamin HCL 5,0 Mocptomoc Acide 5,0 Pyridoxin HCL 0,5 Glycine Sắt EDTA Na2EDTA 20 FeSO4.7H2O 15 Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng khoáng lên sự phát triển mô sẹo từ đốt non thân và mẫu lá của cây Xạ đen Trọng lượng mô sẹo
  52. Đồ án tốt nghiệp descriptive 95% Confidence Std. Interval for Mean Minim Maxim N Mean Deviatio Std. Error Lower Upper um um n Bound Bound 1 9 ,32667 ,149833 ,049944 ,21149 ,44184 ,090 ,550 2 9 ,01744 ,045752 ,015251 -,01772 ,05261 ,000 ,139 3 9 ,10400 ,228118 ,076039 -,07135 ,27935 ,000 ,698 4 10 ,00000 ,000000 ,000000 ,00000 ,00000 ,000 ,000 5 9 ,00000 ,000000 ,000000 ,00000 ,00000 ,000 ,000 Total 46 ,08767 ,171240 ,025248 ,03682 ,13853 ,000 ,698 Anova VAR00002 Sum of Squares Df Mean Square F Sig. Between Groups ,707 4 ,177 11,827 ,000 Within Groups ,613 41 ,015 Total 1,320 45 Duncan VAR000 Subset for alpha = 0.05 N 01 1 2 4 10 ,00000 5 9 ,00000 2 9 ,01744 3 9 ,10400 1 9 ,32667 Sig. ,103 1,000 Ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng lên khả năng tăng sinh mô sẹo Descriptives
  53. Đồ án tốt nghiệp 95% Confidence Interval for Mean Minimum Std. Lower Upper N Mean Deviation Std. Error Bound Bound Maximum Huỳnh 5 ,15040 ,068449 ,030611 ,06541 ,23539 ,085 ,259 quang LED đỏ 5 ,15880 ,105410 ,047141 ,02792 ,28968 ,071 ,341 LED xanh 5 ,34580 ,066960 ,029946 ,26266 ,42894 ,269 ,395 Total 15 ,21833 ,120462 ,031103 ,15162 ,28504 ,071 ,395 ANOVA VAR00002 Sum of Squares Df Mean Square F Sig. Between Groups ,122 2 ,061 9,026 ,004 Within Groups ,081 12 ,007 Total ,203 14 VAR00002 Duncan VAR000 Subset for alpha = 0.05 N 01 1 2 1 5 ,15040 2 5 ,15880 3 5 ,34580 Sig. ,874 1,000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Ảnh hƣởng của 2,4-D lên khả năng tăng sinh mô sẹo
  54. Đồ án tốt nghiệp ANOVA Sum of Squares df Mean Square F Sig. tltuoi Between Groups 2961135.325 7 423019.332 22.587 .000 Within Groups 2097568.267 112 18728.288 Total 5058703.592 119 tile Between Groups 74.028 7 10.575 22.587 .000 Within Groups 52.439 112 .468 Total 126.468 119 Tltuoi Duncan Subset for alpha = 0.05 c24D N 1 2 3 4 1 15 3.8173E2 2 15 4.5620E2 3 15 6.5173E2 8 15 7.0833E2 7.0833E2 6 15 7.7027E2 7.7027E2 7 15 7.8980E2 7.8980E2 4 15 8.1220E2 8.1220E2 5 15 8.1927E2 Sig. .139 .260 .059 .379 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Tile Duncan Subset for alpha = 0.05 c24D N 1 2 3 4 1 15 1.9087 2 15 2.2810 3 15 3.2587 8 15 3.5417 3.5417
  55. Đồ án tốt nghiệp 6 15 3.8513 3.8513 7 15 3.9490 3.9490 4 15 4.0610 4.0610 5 15 4.0963 Sig. .139 .260 .059 .379 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng ANOVA Sum of Squares df Mean Square F Sig. tltuoi Between Groups 3340395.067 3 1113465.022 101.622 .000 Within Groups 613589.867 56 10956.962 Total 3953984.933 59 tlkho Between Groups 23167.250 3 7722.417 117.269 .000 Within Groups 3687.733 56 65.852 Total 26854.983 59 Tltuoi Duncan Subset for alpha = 0.05 trangthai mt N 1 2 3 3 15 2.3820E2 4 15 7.0933E2 2 15 8.0480E2 1 15 8.1113E2 Sig. 1.000 1.000 .869 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Tlkho Duncan trangthai N Subset for alpha = 0.05
  56. Đồ án tốt nghiệp mt 1 2 3 4 3 15 19.5333 2 15 43.9333 4 15 56.3333 1 15 73.4667 Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed.