›

Đồ án Khảo sát tối ưu hóa một số thông số của quá trình lên men bioethanol từ vỏ chuối bằng phương pháp sscf sử dụng saccharomyces cerevisiae kết hợp với pichia anomala

pdf 99 trang thiennha21 12/04/2022 5590
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát tối ưu hóa một số thông số của quá trình lên men bioethanol từ vỏ chuối bằng phương pháp sscf sử dụng saccharomyces cerevisiae kết hợp với pichia anomala", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_toi_uu_hoa_mot_so_thong_so_cua_qua_trinh_len.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát tối ưu hóa một số thông số của quá trình lên men bioethanol từ vỏ chuối bằng phương pháp sscf sử dụng saccharomyces cerevisiae kết hợp với pichia anomala

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TỐI ƯU HÓA MỘT SỐ THÔNG SỐ CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN BIOETHANOL TỪ VỎ CHUỐI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SSCF SỬ DỤNG SACCHAROMYCES CEREVISIAE KẾT HỢP VỚI PICHIA ANOMALA Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S Trần Thị Tưởng An Sinh viên thực hiện: Đoàn Thị Diễm Phương MSSV: 1151110026 Lớp: 11DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, đồ án tốt nghiệp “Khảo sát tối ưu hóa một số thông số quá trình lên men bioethanol từ vỏ chuối bằng phương pháp SSCF sử dụng Saccharomyces cerevisiae kết hợp với Pichia anomala.”là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân tôi, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức và dựa trên sự hướng dẫn của Th.S Trần Thị Tưởng An. Các số liệu sử dụng trong đồ án là trung thực và có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng. Nội dung đồ án có kham khảo và sử dụng các tài liệu thông tin được đăng tải trên các sách, tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu của đồ án.
  3. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm- Môi Trường đã tạo điều kiện cho em được thực hiện bài khóa luận này. Em xin cảm ơn toàn thể thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt các kiến thức và kỹ năng chuyên sâu để em có thể hoàn thành bài khóa luận này. Trong suốt khoảng thời gian làm khóa luận tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm Năng Lượng Sinh Học – Đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh. Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Th.S Trần Thị Tưởng An, trường Đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh. Cô luôn luôn theo sát, tận tình chỉ bảo, truyền đạt các kiến thức, kinh nghiệm chuyên môn, hướng dẫn, động viên em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh, các chị làm việc trong phòng thí nghiệm đã nhiệt tình hỗ trợ em trong suốt thời gian làm việc ở đây. Cảm ơn bố mẹ, người đã luôn luôn bên cạnh động viên tinh thần em trong những lúc em cảm thấy khó khăn nhất. Cuối cùng, cảm ơn tất cả các bạn trong phòng thí nghiệm những người bạn đã luôn bên cạnh và giúp đỡ em trong mọi việc. Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn. Đoàn Thị Diễm Phương
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC  LỜI CẢM ƠN 2 MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi LỜI MỞ ĐẦU 8 1. Đặt vấn đề. 8 2. Mục tiêu đề tài. 9 3. Nội dung nghiên cứu. 9 4. 9 5. Bố cụ 10 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1. Giới thiệu về bioethanol. 11 1.1.1. Các thế hệ của bioethanol. 14 1.1.2. Khái niệm. 11 1.1.3. Nguồn nguyên liệu lignocellulose để sản xuất bioethanol 15 1.1.4. Ứng dụng lợi ích và hạn chế của Bioethanol 17 1.1.5. Quy trình sản xuất bioethanol từ nguồn lignocellulose 18 1.1.6. Tình hình sản xuất và tiêu thụ Bioethanol ở tại Việt Nam và trên thế giới. 26 1.1.7. Tình hình nghiên cứu bioethanol tại Việt Nam và trên thế giới 30 1.2. Giới thiệu về cây chuối sứ. 1 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.2.1 ối. 1 1.2.2 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của vỏ trái chuối 1 1.2.3 Tình hình sản xuất, diện tích và sản lượng chuối tại Việt Nam 2 1.2.4 Tình hình sản xuất và sản lượng chuối trên thế giới 4 1.3. Giới thiệu chủng nấm men lên men bioethanol. 5 1.3.1 Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae. 5 1.3.2 Chủng nấm men Pichia anomala. 7 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 9 2.3 Vật liệu. 9 2.3.1 Nguyên vật liệu. 9 2.3.2 Hóa chất sử dụng. 9 2.3.3 Thiết bị ứu. 10 2.4 Phương pháp 11 2.4.1 Bố trí thí nghiệm. 11 2.4.2 Tiến hành thực hiện. 12 2.5 Phương pháp phân tích. 15 2.5.1 Phương pháp vi sinh. 15 2.5.2 Phương pháp hóa lý. 17 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Khảo sát giống nấm men. 24 3.1.1.1 Nấm men Saccharomyces cerevisiae. 24 3.1.1.2 Nấm men Saccharomyces cerevisiae. 25 3.2 Khảo sát một số thành phần hóa học của vỏ chuối khô 27 3.3 Khảo sát tiền xử lý nguyên liệu bằng acid acetic 4%. 28 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 3.4 Khảo sát thủy phân và lên men đồng thời (SSCF). 29 3.4.1 Khảo sát thời gian lên men. 30 3.4.2 Khảo sát nhiệt độ lên men. 34 3.4.3 Khảo sát tỷ lệ nấm men 37 3.4.4 Khảo sát tỷ lệ enzyme. 40 3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH. 42 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PL Phụ lục SSF Simultaneous saccharification and fermentation SSCF Simultaneous sacchrification and co- fermentation CT Công thức PT Phương trình SHF Separate hydrolysis and fermentation SC Saccharomyces cerevisiae PA Pichia anomala DNS 3,5 – dinitrosalycylic acid SA Đường hóa các thành phần của cellulose HF Lên men hexose PF Lên men pentose HPLC High-performance liquid chromatography SDA Sabouraud Dextroe Broth SDB Sabouraud Dextroe Agar iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thông số của bioethanol so với xăng. 12 Bảng 1.2. Ước tính chi phí sản xuất bioethanol so với xăng 12 Bảng 1.3. Ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp tiền xử lý 20 Bảng 1.4. Một số nhà máy sản xuất bioethanol đang hoạt động ở Việt Nam [34]. 28 Bảng 1.5. Một số công trình nghiên cứu bioethanol từ phụ phẩm trái cây trên thế giới 30 Bảng 1.6. Tình hình nghiên cứu sản xuất bioethanol từ vỏ chuối. 1 Bảng 3.1. Bố trí các nghiệm thức thí nghiệm. 14 Bảng 3.1. Thành phần hóa học của vỏ chuối. 27 Bảng 3.2. Một số thành phần hóa học của vỏ chuối khô sau khi tiền xử lý với acid acetic 4% 29 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol. 11 Hình 1.2 Giá dầu năm năm gần đây. 13 Hình 1.3 Quy trình chuyển đổi sinh khối lignocellulose thành bioethanol. 19 Hình 1.4 Tiền xử lý lignocellulose giải phóng cellulose. 20 Hình 1.5 Chuối sứ. 1 Hình 1.6 Saccharomyces cerevisiae. 5 Hình 1.7 Pichia anomala. 8 Hình 3.1 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 24 Hình 3.2 Nấm men Pichia anomala 24 Hình 3.3 Đường cong sinh trưởng Saccharomyces cerevisiae trong môi trường SDB 25 Hình 3.4 Đường cong sinh trưởng Pichia anomala trong môi trường SDB 26 Hình 3.6a. Thay đổi độ cồn theo thời gian lên men. 32 Hình 3.6c. Sự thay đổi đường khử theo thời gian lên men. 32 Hình 3.6d. Sự thay đổi hàm lượng cellulose theo thời gian lên men. 33 Hình 3.7a. Sự thay đổi nồng độ cồn theo nhiệt độ lên men. 35 Hình 3.7b.Sự thay đổi mật độ tế bào theo nhiệt độ lên men. 35 Hình 3.7c. Thay đổi hàm lượng đường khử và cellulose theo nhiệt độ lên men. 36 Hình 3.8a. Thay đổi độ cồn theo tỷ lệ nấm men. 38 Hình 3.8b. Thay đổi mật độ tế bào theo tỷ lệ nấm men 38 Hình 3.8c. Sự thay đổi đường khử và cellulose theo tỷ lệ nấm men. 39 Hình 3.9b. Thay đổi mật độ tế bào theo tỷ lệ enzyme. 41 Hình 3.9c. Sự thay đổi đường khử và cellulose theo tỷ lệ enzyme. 41 Hình 3.10a. Sự thay đổi độ cồn theo pH. 43 Hình 3.10b. Thay đổi mật độ tế bào theo pH 43 Hình 3.10c.Sự thay đổi đường khử và cellulose theo pH. 44 Hình 3.11a. Sự thay đổi độ cồn theo tốc độ khuấy đảo. 45 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.11b. Sự thay đổi mật độ tế bào theo tốc độ khuấy đảo. 45 Hình 3.11c Sự thay đổi hàm lượng đường khử và cellulose theo tốc độ khuấy đảo. 46 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hiện nay, thế giới đang đứng trước nguy cơ khủng hoảng năng lượng trầm trọng. Như chúng ta đã biết, dầu mỏ và khí đốt hiện chiếm 60 – 80 % nguồn năng lượng thế giới. Theo dự báo của các nhà khoa học trên thế giới, với tốc độ tiêu thụ như hiện nay và trừ lượng dầu mỏ hiện có, nguồn năng lượng này sẽ bị cạn kiệt trong vòng 40 – 50 năm nữa. Để ổn định và đảm bảo an ninh năng lượng đáp ứng cho nhu cầu con người cũng như các ngành công nghiệp, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm ra những nguồn nhiên liệu mới, trong đó nghiên cứu phát triển nhiên liệu sinh học có nguồn gốc từ sinh khối động, thực vật là một hướng đi có thể tạo ra nguồn nhiên liệu thay thế phần nào nguồn nhiên liệu hoá thạch đang cạn kiệt, đảm bảo an ninh năng lượng cho từng quốc gia. Sử dụng nhiên liệu sinh học mang lại các lợi ích như giảm thiểu ô nhiễm môi trường vì nguyên liệu sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học không chứa các hợp chất thơm, hàm lượng lưu huỳnh thấp, không chứa chất độc hại, mặt khác nhiên liệu sinh học khi thải vào đất có tốc độ phân hủy sinh học cao nhanh hơn gấp 4 lần so với nhiên liệu dầu mỏ và do đó giảm được rất nhiều tình trạng ô nhiễm nước ngầm. Bioethanol là nguồn nhiên liệu đầy hứa hẹn trong tương lai thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch, bởi nó là nguồn nhiên liệu có thể tái tạo. Bioethanol tồn tại ở dạng lỏng có thể được sử dụng thích nghi như nguồn nhiên liệu mới cho tương lai. Tuy nhiên, những sản phẩm bioethanol có nguồn gốc từ tinh bột dễ bị biến động do tinh bột là nguồn lương thực của con người. Việc sử dụng tinh bột hoặc nguyên liệu giàu đường sẽ lập tức đẩy giá của lương thực và bioethanol tăng cao hơn so với sản xuất bằng con đường hóa học. Trong khi đó, giá của vật liệu phải chi trả 40 – 75 % tổng chi phí của sản xuất ethanol. Vì vậy, việc thay thế nguồn nguyên liệu là yêu cầu cho việc sản xuất bioethanol. Như các nguồn nguyên liệu là các phụ phẩm của ngành nông nghiệp: rơm rạ, bã mía, vỏ cacao, vỏ chuối. Vỏ chuối là nguồn phế phẩm nông nghiệp giàu lignocellulose nên có thể sử dụng để lên men tạo bioethanol rất hiệu quả, tận dụng được nguồn vỏ phế phẩm. 8
  12. Đồ án tốt nghiệp Hiện nay, một phần vỏ chuối phế thải sau khi bóc ruột từ các nhà máy sản xuất các sản phẩm từ chuối, các quán xá, các khu chợ được thải loại đi như rác là tác nhân gây hại cho môi trường, hoặc chỉ 1 phần được sử dụng làm thức ăn gia súc mang lại hiệu quả kinh tế không cao. Với tình hình phế phẩm vỏ chuối như vậy, và qua nghiên cứu những công trình liên quan của các tác giả đi trước về bioethanol, vỏ chuối chứa hàm lượng glucid cao nên việc sử dụng để chuyển hóa thành đường glucose để lên men tạo rượu ethanol là rất có hiệu quả. Và những ưu điểm như rẻ tiền, phổ biế ối sẽ là một nguồn nguyên liệu tiềm năng trong quá trình nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học. Chính vì ý nghĩa thực tế trên đề tài tiến hành khảo sát tối ưu hóa một số thông số quá trình lên men bioethanol từ vỏ chuối bằng phương pháp SSCF lên men và thủy phân đồng thời sử dụng kết hợp hai chủng nấm men Saccharomyces cerevisiace và Pichia anomala. 2. Mục tiêu đề tài Khảo sát tối ưu hóa một số thông số quá trình lên men bioethanol từ vỏ chuối sử dụng phương pháp SSCF lên men nguồn phế phẩm vỏ chuối để thu bioethanol có hiệu quả. 3. Nội dung nghiên cứu. Đề tài: “Khảo sát tối ưu hóa một số thông số quá trình lên men bioethanol từ vỏ chuối bằng phương pháp SSCF sử dụng Saccharomyces cerevisiae kết hợp với Pichia anomala” với nội dung nghiên cứu sau: - Khảo sát một số thành phần hóa học của vỏ chuối. - Khảo sát điều kiện tối ưu tiền xử lý vỏ chuối bằng acid acetic. - Khảo sát tối ưu hóa một số thông số cho quá trình lên men SSCF sử dụng kết hợp Saccharomyces cerevisiace và Pichia anomala. 4. - 9
  13. Đồ án tốt nghiệp - Saccharomyces cerevisiae và Pichia anomala. - Phương pháp phân tích sinh hóa. - Xác định độ ẩm bằ . - Định lượng đường khử bằng phương pháp Miller. - Định lượ -Hofft. - Định lượng hàm lượng lignin theo phương pháp Klasm. - - - Trích ly bằng nước nóng và định lượng pectin bằng cách tạo tủa calcium pectate. - - Dùng phương pháp đếm mậ ờng chuyên biệt cho từng nhóm vi sinh vật. - - Các số được xử lý bằng chương trình StatGraphics Centurion XV. 5. Bố cụ Kết cấu đồ án gồm 4 chương: - C - . - - . 6. Các kết quả đạt được - Khảo sát một số thành phần hóa học của vỏ chuối. - Khảo sát thành phần hóa học của vỏ chuối sau khi tiền xử lý. - Tìm ra thông số tối ưu nhất cho quá trình lên men SSCF đạt nồng độ cồn cao nhất: thời gian 45 giờ, nhiệt độ 350C, tỷ lệ nấm men (SC:PA): (1:4). Tỷ lệ enzyme 0,7%. pH 5,5 ,tốc độ khuấy đảo 150 vòng/phút. 10
  14. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về bioethanol 1.1.1. Khái niệm Bioethanol là rượu ethanol sinh học thu được từ quá trình lên men vi sinh các loại nguyên liệu chứa đường hoặc từ tinh bột, cellulose nhờ vào phản ứng trung gian thủy phân thành đường của vi sinh. Bioethanol được tổng hợp thông qua quá trình sinh học, vi sinh sử dụng nguồn nguyên liệu đường làm thức ăn để thực hiện hô hấp kỵ khí và thải ra ethanol và khí CO2. Trong khi đó, ethanol có nguồn gốc dầu mỏ thì được tổng hợp thông qua quá trình hoá học, không có mặt tham gia của cơ thể sống trong quá trình tạo ethanol. Bioethanol được tạo ra từ rất nhiều nguyên liệu nông nghiệp khác nhau được thể hiện qua hình 1.1 Hình 1.1: Nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol. Quá trình lên men đường tạo thành ethanol và carbon dioxide thể hiện qua PT1: C6H12O6 2C2H6O + 2CO2 (PT1) Ethanol dùng làm nhiên liệu cho động cơ đốt trong sẽ bị đốt cháy hòa trộn với oxygen trong động cơ tạo ra carbon dioxide, nước và nhiệt lượng dựa vào PT2: 11
  15. Đồ án tốt nghiệp C2H6O + 3O2 2CO2 + 3H2O + nhiệt lượng (PT2) Tổng hợp 2 phương trình PT1 và PT2 trên ta có: C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + nhiệt (PT3) Nhiệt lượng sinh ra trong quá trình dùng để chạy máy. CO2 được sinh ra trong quá trình này là carbon trung tính khác với loại khí carbon được tạo thành sau khi đốt các nhiên liệu hóa thạch. Carbon được tạo ra sau khi đốt các nhiên liệu hóa thạch không nằm trong chu trình carbon nên việc đốt chúng sẽ làm tăng hàm lượng carbon trong không khí gây hiệu ứng nhà kính. Bioethanol có thể được sử dụng như một nhiên liệu lỏng trong động cơ đốt trong do nó có chỉ số octane cao (129), chỉ số octane càng cao thì chỉ số chống gõ tránh được những tiếng gõ làm tổn thương lòng máy. Có thể sử dụng bioethanol nguyên chất hoặc pha chung với xăng dầu. Thông số của bioethanol so với xăng được thể hiện qua bảng 1.1 Bảng 1.1 Thông số của bioethanol so với xăng. Nhiên Tỷ Điểm Năng Năng Độ nhớt Chỉ số liệu trọng chớp lượng lượng (mm2/s) octane tương (kg/L) cháy (20OC) (MJ/L) đương Xăng 0,76 0,6 <21 42,7 32,45 92 1 Bioethanol 0,79 1,5 <21 26,8 21,17 129 0,65 ( Nguồn: Paul & Kemnitz 2) Bảng 1.2. Ước tính chi phí sản xuất bioethanol so với xăng Nguồn sinh khối Chi phí sản xuất (€/L) Xăng 0,25 Bắp Mỹ 0,42 Rơm từ bắp 0,45 – 0,58 12
  16. Đồ án tốt nghiệp Lúa mì Châu Âu 0,27 – 0,43 Củ cải đường Châu Âu 0,32 – 0,54 Mía Brazil 0,16 – 0,28 Mật rỉ đường (Trung Quốc) 0,24 Lúa miến ngọt (Trung Quốc) 0,22 Rơm từ lúa mì (Mỹ) 0,44 Gỗ Vân Sam (gỗ mềm) 0,44 – 0,63 Cây liễu (gỗ cứng) 0,48 – 0,71 Lignocellulose (rác thải sinh 0,11 – 0,32 học) (Nguồn: www.eubia.org; Sassner et al, 2008; Abbas, personal communicatio) Để Bioethanol có thể cạnh tranh về kinh tế với nhiên liệu hóa thạch thì chi phí sản xuất phải không lớn hơn 0,2 €/L so với xăng. Theo bảng 1.2 cho thấy nguồn sinh khối lignocellulose có tiềm năng rất lớn trong sản xuất nguồn năng lượng thay thế. (Nguồn: Hình 1.2. Giá dầu năm năm gần đây. 13
  17. Đồ án tốt nghiệp 1.1.2. Các thế hệ của bioethanol Bioethanol được chia thành 3 thế hệ chính: 1.1.2.1. Bioethanol thế hệ thứ nhất Bioethanol ban đầu được sản xuất từ ngũ cốc hay mía đường – các sản phẩm giàu tinh bột và các loại đường đơn giản và dễ được lên men thành ethanol. Nhiên liệu sinh học được sản xuất nhờ những nguồn nguyên liệu như trên được gọi là nhiên liệu sinh học thế hệ một. Việc sản xuất từ những nguồn nguyên liệu này dễ thực hiện do các phân tử tinh bột dễ được phân cắt và lên men. Tuy nhiên những nguồn nguyên liệu kể trên cũng đồng thời là thức ăn cho người và vật nuôi. Do những lo ngại xung quanh vấn đề về an ninh lương thực, đặc biệt sự thiếu hụt lương thực còn dai dẳng ở nhiều nước trên thế giới, nhất là các quốc gia Châu Phi, việc sản xuất ethanol từ các nguyên liệu này vấp phải sự phản đối gay gắt của dư luận ở nhiều nơi. Hạn chế tiếp theo của việc sản xuất bioethanol thế hệ thứ nhất là tạo gánh nặng cho sản xuất nông nghiệp. Đất nông nghiệp ngày một giảm, không thể cung cấp đủ cho việc sản xuất bioethanol mà không ảnh hưởng đến nguồn cung cấp thực phẩm trong nước và việc cạnh tranh chi phí với các nguồn năng lượng hóa thạch. 1.1.2.2. Thế hệ thứ hai Để khắc phục nhược điểm của bioethanol thế hệ thứ nhất, người ta đã sử dụng nguồn nguyên liệu phế thải hay các loại nguồn nguyên liệu không phải là thực phẩm với khả năng cung cấp bền vững, chi phí thấp và có lợi ích cho môi trường. Bioethanol thế hệ thứ hai được sản xuất từ sinh khối lignocellulose (bộ khung tạo nên tính chất “gỗ” của thực vật) đang trở thành xu hướng hiện nay. Nguồn cung cấp chủ yếu là than cây, rơm rạ cũng như các loại cây trồng không phải cây lương thực như cỏ, jatropha hay các phế phẩm trong sản xuất nông nghiệp như vỏ chuối, vỏ cacao với hàm lượng lignocellulose cao. 14
  18. Đồ án tốt nghiệp Tuy nhiên, loại nhiên liệu này cung cấp nguồn năng lượng hiệu suất thấp so với dầu mỏ. Tiết kiệm được chi phí nguyên liệu ban đầu nhưng lại tiêu tốn chi phí cho quá trình tiền xử lý. 1.1.2.3. Bioethanol thế hệ thứ ba Từ rong biển hay còn gọi là tảo người ta có thể sản xuất ra 19000 lít cồn, tức là gấp 5 lần sản xuất cồn từ ngô, và gấp 2 lần năng suất sản xuất cồn từ mía đường. Trong khi ngô hay mía đều đòi hỏi những diện tích canh tác và nguồn nước ngọt lớn, cạnh tranh với các nguồn lực trong nông nghiệp. Tảo mặt khác có thể sinh trưởng trong nước mặn, có hàm lượng đường cao. Chỉ cần sử dụng chưa tới 3 % diện tích mặt nước ở vùng ven biển là có thể sản xuất đủ lượng tảo để sản xuất cồn. Đặc điểm nổi bật của nhiên liệu từ tảo là không ảnh hưởng đến nguồn nước ngọt, có thể sản xuất bằng cách sử dụng nước biển và nước thải, tương đối vô hại cho môi trường. Nhưng chi phí cho các dự án sản xuất rất cao nên chỉ dừng ở mức thử nghiệm. 1.1.3. Nguồn nguyên liệu lignocellulose để sản xuất bioethanol Xuất phát từ điều kiện Việt Nam là một nước nông nghiệp có sản phẩm nông nghiệp rất phong phú nên có thể sản xuất ethanol từ các nguồn nguyên liệu khác nhau trong đó lignocellulose là nguồn nguyên liệu phong phú nhất. Các loại cây trồng quay vòng ngắ ạch dương, bạch đàn), các chất thải nông nghiệp (rơm, bã mía, fruit watse ), các phế thả ệp gỗ, gỗ thả ợp để làm nguyên liệu sản xuất bioethanol. Cứ khoảng 2 - 4 tấn vật liệu gỗ khô hoặ ể cho 1 tấn bioethanol [1]. Nguyên nhân khiến người ta chuyển sang sản xuất bioethanol từ sinh khối lignocellulose là vì các loại này sẵn có và rẻ ới các loại tinh bột ngũ cốc hoặc cây trồng khác, đặc biệt là vớ ồn chất thải hầ ế thì vấ ển hóa các vật liệu này sẽ khó khăn hơn. Nguyên liệu chứa lignocellulose khác nhau có thành phần cấu tạo chất không giống nhau nhưng về cơ bản chúng được cấu tạo từ 3 hợp chất cellulose, 15
  19. Đồ án tốt nghiệp hemicellulose, lignin. Các thành phần cấu tạo nên lignocellulose (cellulose, hemicellulose, lignin) là các đối tượng khó bị phân hủy. Tính khó phân hủy gia tăng lên nhiều lần khi liên kết với nhau và với các thành phần khác nữa tạo thành một thể cấu trúc chặt chẽ và phức tạp. Các vi sợi cellulose, lignin, hemicellulose được sắp xếp theo những nguyên tắc nhất định để hình thành nên cấu trúc vi sợi. Với cấu trúc nhiều lớp, gồm nhiều thành phần có bản chất hóa học khác nhau như vậy, lignocellulose có độ bền vật lý cao, rất khó xâm nhập đối với các vi sinh vật và enzyme. Hơn nữa để phân hủy bất cứ thành phần nào của phức hợp một cách hiệu quả và triệt để cần phải tác động đến nhiều thành phần khác. Ví dụ, để phân giải lignocellulose thì cần đồng thời tác động của lignin, cellulose và hemicellulose. Cellulose chiếm 40-60% trọng lượng khô. Công thức phân tử (C6H10O5)n. Là thành phần cấu tạo chủ yếu của màng tế bào thực vật và là hợp chất chính của nguyên liệu chứa cellulose để sản xuất ethanol. Nguyên liệu càng giàu cellulose thì sản xuất ethanol càng đạt hiệu quả cao. Hemicellulose chiếm 20-40% trọng lượng khô, dễ bị thủy phân hơn so với cellulose. Khi thủy phân đến cùng, hemicellulose tạo ra các monosaccaride chủ yếu là hexose, pentose. Trong đó hexose có khả năng lên men tạo ethanol còn pentose không có khả năng này. Lignin chiếm 10-25% trọng lượng khô, lignin là một polyphenol có cấ ự ếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose. Rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn trong quá trình sản xuất ethanol từ cellulose thì nó hoàn toàn không bị thủy phân để tạo các hợp chất có khả năng lên men tạo ethanol. Vì vậy lignin là thành phần không mong muốn trong quá trình sản xuất ethanol từ cellulose.[2] 16
  20. Đồ án tốt nghiệp 1.1.4. Ứng dụng lợi ích và hạn chế của Bioethanol 1.1.4.1. Ứng dụng và lợi ích của bioethanol Bioethanol được sử dụng làm nhiên liệu do khi đốt cháy bioethanol cho nhiệt lượng tương đối cao mà không sản sinh ra các chất độc hại. Ngày nay, vấn đề môi trường đang là vấn đề cấp bách, do đó cần có nguồn nhiên liệu sạch để hạn chế vấn đề ô nhiễm.Trong đó xăng sinh học là nguồn nhiên liệu đầy triển vọng trong tương lai. ếu được nghiên cứu sử ệu, có thể được sử ới dạng nguyên chất (E100), hoặc có thể pha trộn với xăng để tạo ra xăng sinh học. Nế ệ pha trộn dưới 10% ethanol thì không cần thay đổi các động cơ xe thông thường . Xăng sinh học đượ ự “E” kèm theo một con số ố phầ ọc được pha trộn trong xăng đó, các loại xăng sinh học như E5, E20, E95 tức là xăng sinh học chứa 5%, 20%, 95% ethanol. Trộ ệu, tức là thêm oxy vào hỗn hợp nhiên liệu, làm nó cháy hoàn thiện hơn, cải thiện được quá trình cháy và giảm đượ o môi trường. Khi đốt cháy xăng có pha ethanol, dướ ệ ế 2 và H2O, nhưng thực tế thì CO cũng được sinh ra, tuy nhiên lượng CO thường thấp hơn đối với xăng. Nguyên nhân ethanol có chứa 6% oxygen theo thể tích cho phép động cơ tự đốt cháy nhiên liệu hoàn toàn, kết quả là làm giảm sự Bioethanol là nguồn nhiên liệu có khả năng tái sinh vì được sản xuất từ cây nông nghiệp thu hoạch hàng năm, sử ợng mặt trời là chính. Bioethanol có nguồn gốc thực vật nên CO2 sinh ra khi đốt được cây cối hấ ại tạo nên sự ợng CO2, do đó không gây nên hiệu ứng nhà kính. 1.1.4.2. Hạn chế của bioethanol Bên cạnh những ưu điểm đã biết, quá trình sản xuất bioethanol cũng có một số hạn chế 17
  21. Đồ án tốt nghiệp - Vấn đề kinh tế: bioethanol cho hiệu quả về năng lượng thấp hơn xăng (đạt 70% so với năng lượng khi xử dụng xăng), vì vậy sẽ cần một lượng bioethanol lớn hơn để đạt hiệu quả ngang bằng với xăng. [3] - Vấn đề kỹ thuật : Quá trình sản xuất bioethanol từ nguồn biomass đòi hỏi kỹ thuật cao và đầu tư lớn. - Vấn đề nguồn nguyên liệu: sản xuất bioethanol phải đảm bảo không cạnh tranh lương thực, cũng như bình ổn giá cả. Bên cạnh đó hạn chế cơ bản của Bioethanol chính là khả năng hút ẩm cao nên cần phải được tồn trữ và bảo quản đặc biệt. Tuy việc sử dụng Bioethanol cũng gây ra nhiều tranh cãi giữa mặt lợi và mặt hại, nhưng mặt lợi có phần lớn hơn nên thế giới vẫn tiếp nghiên cứu để tìm ra phương thức sản xuất nào tối ưu nhất trong sản xuất bioethanol. 1.1.5. Quy trình sản xuất bioethanol từ nguồn lignocellulose Có rất nhiều nguồn nguyên liệu để sản xuất bioethanol trong đó nguồn nguyên liệu lignocellulose là nguồn nguyên liệu phong phú để sản xuất bioethanol. Sau đây là quy trình sản xuất bioethanol từ nguồn lignocellulose được thể hiện qua sơ đồ hình 1.3 18
  22. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Quy trình chuyển đổi sinh khối lignocellulose thành bioethanol. Quá trình lên men ethanol từ các nguồn nguyên liệu lignocellulose cũng giống như từ tinh bột hay rỉ đường. Bao gồm bốn bước cơ bản: - Tiền xử lý nguyên liệu. - Thủy phân nguyên liệu. - Lên men. - Tinh chế sản phẩm (chưng cất, tách nước, bốc hơi, tách lỏng rắn) tùy vào nồng độ cồn mà có phương pháp tinh chế khác nhau. Quá trình này phụ thuộc nhiều vào công nghệ hóa học nên trong giới hạn của đề tài xin được không trình bày. 1.1.5.1 Phương pháp tiền xử lý Do cấu trúc phân tử lớn, có độ kết tinh cao lại liên kết chặt chẽ với lignin và hemicelluloses, phân tử cellulose rất khó bị tác động bởi enzyme thủy phân. Vì vậy, 19
  23. Đồ án tốt nghiệp việc tiền xử lý là rất cần thiết. Mục đích của quá trình tiền xử lý là để loại bỏ lignin và hemicellulose, giảm kích thước vi sợi cellulose và tăng độ xốp của vật liệu lignocellulose (hình 1.4). Tiền xử lý cũng giúp cho cellulose dễ tiếp cận hơn với enzyme cellulase trong quá trình thủy phân tiếp sau đó, do đó yêu cầu enzyme sử dụng sẽ giảm, dẫn tới chi phí cũng sẽ giảm [4]. Quá trình tiền xử lý phải trong sinh khối Lignocellulose thì cellulose là thành phần chính để lên men đáp ứng những yêu cầu: - Nâng cao được hiệu quả của quá trình thủy phân tiếp theo. - Hạn chế sự mất mát hydrocarbon. - Tránh sự tạo thành các sản phẩm phụ làm ức chế quá trình thủy phân và quá trình lên men. - Tiết kiệm được chi phí. Hình 1.4. Tiền xử lý lignocellulose giải phóng cellulose. Có nhiều phương pháp tiền xử lý lignocellulose khác nhau, ưu và nhược điểm của chúng được tóm tắt trong bảng 1.3. Lựa chọn phương pháp tiền xử lý phù hợp phụ thuộc vào thành phần cấu tạo của sinh khối lignocellulose và sản phẩm phụ sinh ra trong quá trình tiền xử lý. Bảng 1.3. Ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp tiền xử lý Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Chia nhỏ vật liệu (xay, Giảm kích thước vi sợi Tiêu tốn nhiều năng lượng nghiền) cellulose, tăng bề mặt tiếp 20
  24. Đồ án tốt nghiệp xúc Nổ hơi nước (tăng Loại bỏ hemicellulose, Phân hủy và biến đổi cấu giảm biến đổi lignin; chi phí trúc các hydro carbon; áp lực đột ngột) thấp tạo ra các hợp chất ức chế Nổ amoniac (AFEX) Tăng độ xốp, không tạo Việc loại bỏ lignin và ra hợp chất ức chế hemicellulose bị giới hạn, không thích hợp cho vật liệu chứa nhiều lignin. Nổ CO2 Tăng độ xốp, chi phí thấp, Hemicellulose và lignin ít không tạo ra hợp chất ức bị chế biến đổi Ozon (O3) Giảm hàm lượng lignin, Cần lượng lớn ozon, tốn không tạo ra chất ức chế nhiều chi phí Acid thủy phân Thủy phân hemicellulose Chi phí cao; ăn mòn thiết thành Xylose, thay đổi cấu bị; trúc lignin tạo ra các hợp chất ức chế Kiềm thủy phân Loại bỏ lignin và Thời gian phản ứng dài; hemicellulose; tăng độ xốp muối sinh ra sẽ liên kết chặt chẽ với vật liệu Dung môi hữu cơ Lignin và hemicellulose Khó loại bỏ và thu hồi được thủy phân dung môi; chi phí cao Nhiệt phân Tạo sản phẩm ở dạng khí Nhiệt độ cao; tạo thành tro và dạng lỏng 21
  25. Đồ án tốt nghiệp Điện từ trường Thiết bi đơn giản; phá hủy Phương pháp đang trong được tế bào thực vật quá trình nghiên cứu Sinh học Loại bỏ lignin; tiêu tốn ít Hiệu quả còn thấp năng lượng; thân thiện với môi trường Có rất nhiều phương pháp tiền xử lý, thường dùng nhất là phương pháp hóa học , acid vô cơ này sử dụng phương pháp hóa học, thay thế acid vô cơ như H2SO4, HCl, bằng acid hữu cơ như acid acetic. Do acid acetic khả năng hòa tan tốt lignin tạo ra cellulose , không tạo ra các chất ức chế quá trình lên men sau đó, 1.1.5.2 Phương pháp thủy phân Sau quá trình tiền xử lý, cellulose và hemicellulose sẽ bị thủy phân thành các đường đơn (hexose và pentose). Ở đây, quan tâm nhiều đến sự thủy phân cellulose, do nó là thành phần chính trong sinh khối lignocellulose. Quá trình thủy phân cellulose được thực hiện bởi acid thủy phân hoặc enzyme thủy phân.  Quá trình thủy phân bằng acid Vào cuối thế kỉ 19 và đầu thế kỉ 20, quá trình thủy phân được thực hiện bởi phản ứng giữa cellulose với acid. Acid loãng được sử dụng dưới điều kiện nhiệt độ cao và áp suất cao, còn acid đậm đặc được sử dụng ở nhiệt độ thấp và áp suất khí quyển. Quá trình thủy phân bằng acid loãng xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao dẫn đến sự tạo thành các chất độc hại có thể ảnh hưởng không tốt đến quá trình lên men như các acid hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất furfuran và các hợp chất vô cơ.  Quá trình thủy phân bằng enzyme 22
  26. Đồ án tốt nghiệp Các mắt xích của cellulose có thể bị phân cắt thành các phân tử đường glucose riêng lẻ bằng cellulase. Vì cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucoside trong cellulose tạo ra sản phẩm glucose. 1.1.5.3 Phương pháp lên men Trong quá trình lên men, các sản phẩm của quá trình thủy phân bao gồm đường hexose (glucose, mannose và galactose) và pentose (xylose và arabinose) sẽ được lên men thành ethanol nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae, tổ hợp nhiều loại nấm men hoặc vi khuẩn (vi khuẩn Zymomonas spp). Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử diễn ra trong cơ thể sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme là quá trình oxy hóa sinh học. Có rất nhiều phương pháp lên men để tạo bioethanol, bước cuối để biến đổi sinh khối lignocellulose thành ethanol là thủy phân và lên men có thể được thực hiện một cách độc lập (SHF), đồng thời (SSF), hay đồng thời kết hợp nhiều chủng vi sinh vật (SSCF).  Phương pháp thủy phân và lên men riêng lẻ (SHF).  Ưu điểm : - Thủy phân và lên men được thục hiện trong điều kiện tối ưu của mỗi quá trình, không phụ thuộc vào nhau. [5]  Nhược điểm: - Sự tích tụ các chất ức chế cản trở hoạt động của enzyme thủy phân cellulose và glucose. Điều này làm cho quá trình biến đổi kém hiệu quả, và gây tốn kém (phải bổ sung một lượng lớn enzyme). - Dễ nhiễm các vi sinh vật khác do thời gian ủ dài ở quá trình thủy phân.  Phương pháp thủy phân và lên men đồng thời (SSF). Các sản phẩm cuối của quá trình thủy phân sẽ được trực tiếp chuyển đổi thành ethanol ngay nhờ vi sinh vật. [6]  Ưu điểm: - Tăng tỉ lệ thủy phân và giảm ức chế ngược khi sản phẩm tạo thành. 23
  27. Đồ án tốt nghiệp - Giảm lượng enzyme dùng cho quá trình. - Cho hiệu suất ethanol cao. - Đòi hỏi điều kiện vô trùng thấp. - Thời gian ngắn.  Nhược điểm: - Cần phải lựa chọn được điều kiện nhiệt độ và pH gắn với điều kiện tối ưu của mỗi quá trình riêng - Ethanol tạo thành sẽ quay lại ức chế enzyme cellulase làm cho lượng ethanol thu được không cao. - Cơ chế thủy phân không hoàn toàn nên lượng đường do enzyme cellulase tạo ra chỉ đủ để cho nấm men tăng trưởng hơn là việc lên men đường sinh ethanol.  Phương pháp thủy phân và lên men đồng thời sử dụng kết hợp hai chủng vi sinh vật (SSCF). Việc sản xuất bioethanol từ nguồn cellulose bao gồm ba bước như đường hóa các thành phần của cellulose (SA), lên men hexose (HF), và lên men pentose (PF). Các quá trình này được kết hợp với nhau để đơn giản hóa các bước và tăng cường sản lượng ethanol.[7] SSF là quá trình đồng thời đồng thời đường hóa các thành phần của cellulose (SA) và lên men hexose (HF) nhưng không diễn ra quá trình lên men pentose (PF) SSCF là quá trình đồng thời của SA,HF Và PF. Như vậy SSCF là quá trình cùng lúc đường hóa các thành phần của cellulose và lên men đường 5 carbon và 6 carbon nhờ vi sinh vật. Các vi sinh vật thường được áp dụng để sản xuất ethanol sinh học không thể sử dụng tất cả các nguồn đường có nguồn gốc từ quá trình thủy phân. Ví dụ S.cerevisiae không thể sử dụng đường pentose , và điều này sẽ làm lãng phí sinh khối và làm giảm sản lượng ethanol sinh học. Do đó trong SSCF sẽ sử dụng kết hợp các chủng vi sinh có khả năng sử dụng đường 5 carbon và chủng vi sinh có khả năng sử dụng đường 6 carbon. 24
  28. Đồ án tốt nghiệp  Ưu điểm: - Cải tiến của phương pháp SSF. - Chi phí thấp, thời gian xử lý ngắn, giảm nguy cơ ô nhiễm và tác dụng ức chế ít. - Hiệu suất lên men bioethanol cao và lên men được cả đường 5 carbon và 6 carbon.  Nhược điểm: - Nhiệt độ của quá trình thủy phân enzyme và lên men ethanol khác nhau đáng kể , làm cho việc tối ưu hóa đồng thời hai hoạt động rất khó. - Quá trình SSCF phải được vận hành ở nhiệt độ thấp hơn để phù hợp tăng trưởng của vi khuẩn và lên men ethanol. - Đề tài này tiến hành phương pháp SSCF để thủy phân và lên men thu bioethanol. 1.1.5.4 Các giống vi sinh vật trong lên men bioethanol Nấm men là đối tượng lên men chủ yếu. Tế bào nấm men có dạng hình ovan, sinh sản bằng cách nảy chồi hay tạo bào tử, sống k khí không bắt buộc, có khả năng lên men các loại đường khác nhau. Trong điều kiện hiếu khí, nấm men oxy hóa hoàn toàn đường thành CO2 và H2O, gia tăng sinh khối, ngược lại trong điều kiện k khí, nấm men sẽ không tăng sinh khối vì không tổng hợp được sterol cần cho cấu trúc tế bào, nấm men tiến hành lên men đường để thu năng lượng. Không giố ệu tinh bộ ủy phân sinh khố ố lượng đáng kể các loại đườ ờ Saccharomyces cerevisiae hoặc Zymomonas mobilis, không thể lên men các loại đường pentose thành ethanol hiệu quả. Nếu chỉ đường hexose từ sinh khối lignocellulose được lên men, với các loại đường pentose bỏ lạ ụ nguyên liệu cho sản xuất ethanol sinh họ  ử 25
  29. Đồ án tốt nghiệp Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men được biết đến nhiều nhất có trong bánh mì nên thường gọi là men bánh mì. Đây là một loại vi sinh vật thuộc chi Saccharomyces, lớp nấm nang (Ascomycetes), ngành nấm. Loài này có thể xem là loài nấm hữu dụng nhất trong đời sống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay. Nó được dùng rộng rãi trong quá trình lên men làm bánh mì, rượu và bia. Trong quá trình thủy phân cellulose có tạo ra đường 5 carbon - xylose thì chủng men Saccharomyces cerevisiae không thể sử dụng để lên men tạo ethanol nên hiệu suất tạo ethanol không cao. Zymomonas mobilis ể lên men glucose thành ethanol và CO2. Ngoài ra, Z. mobilis có thể chịu được nồng độ cao như 120 g / L ethanol, cao hơn nhiều so với các vi khuẩn khác, và sinh khối của nó thường được công nhận là an toàn (GRAS) cho thức ăn gia súc, làm cho loài này thích hợp cho kỹ thuật chuyển hóa với khả năng lên men pentose.  ử Pichia amomala sử dụng glucose và xylose để chuyể 1.1.6. Tình hình sản xuất và tiêu thụ Bioethanol ở tại Việt Nam và trên thế giới 1.1.6.1. Tại Việt Nam Nhiên liệu sinh học đã được các nhà khoa học ethanol sinh học Từ sau năm 2000 đã có một số xí nghiệp, công ty, đơn vị nghiên cứu tổ chức sản xuất nhiên liệu sinh học dưới dạng pilot như công ty Minh Tú (Cần Thơ), ĐH Bách khoa TP Hồ Chí Minh, Viện Hóa Công Nghiệp Hà Nội, Viện khoa học Ngày 20/11/2007, "Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025" đã được Thủ tướng Chính phủ ký quyết định số177/2007/QĐ- 26
  30. Đồ án tốt nghiệp TTG với mục tiêu phát triển năng lượng, một dạng năng lượng mới, tái tạo được thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch truyền thống, góp phần bảo đảm an ninh năng lượng và bảo vệ môi trường. Đến năm 2015, sản lượng bioethanol sinh học và dầu thực vật đạt 250 nghìn tấn, đáp ứng 1% nhu cầu xăng dầu của cả nước. Và tầm nhìn đến năm 2025, công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học ở nước ta đạt trình độ tiên tiến trên thế giới. Sản lượng bioethanol và dầu thực vật đạt 1.8 triệu tấn, đáp ứng khoảng 5% nhu cầu xăng dầu của cả nước. Để thực hiện chiến lược này, PetroVietNam dự kiến từ 2011 đến 2015 sẽ đưa 3 nhà máy ethanol sinh học ở Quảng Ngãi, Phú Thọ, Bình Phước vào hoạt động với tổng công suất 230.000 tấn/năm và từ sản phẩm này sẽ pha thành nhiên liệu E5- E10, đáp ứng khoảng 20% tổng nhu cầu tiêu thụ xăng sinh học cả nước.[8] Theo n tháng 3/2012, cả nước có 5 nhà máy sản xuất ethanol nhiên liệu đi vào hoạt động ổn định với công suất thiết kế đạt khoảng 435.000 triệu lít ethanol/năm (bảng 1.4). Trong số 4 nhà máy đang hoạt động mới chỉ có 03 nhà máy của Công ty CP Đồng Xanh, Cty TNHH Tùng Lâm và Công ty CP Nhiên liệu sinh học miền Trung là sản xuất được ethanol nồng độ 99,5% đạt tiêu chuẩn để pha xăng sinh học. Sản phẩm được tiêu thụ trong nước khoảng 20% để phối trộn xăng E5 và bán theo hệ thống phân phối của Tập đoàn Dầu khí quốc gia Việt Nam (PVN). Phần còn lại khoảng 80% sản lượng sản xuất trong năm 2011 được xuất khẩu cho các nước như Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippine ở dạng 99,5% và 96% ethanol. [9] Sản xuất nhiên liệu sinh học Bioethanol ở Việt Nam cũng được nhiều đối tác nước ngoài rất quan tâm. Đáng chú ý trong số này là các Dự án JICA - Nhật Bản hỗ trợ Việt Nam nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học sử dụng các loại phế phẩm bã mía, rơm rạ; dự án do Chính phủ Hà Lan tài trợ sử dụng trấu, vỏ cà phê, trái điều, vỏ điều, rong biển sản xuất diesel sinh học và các hóa chất tinh khiết thân thiện với môi trường từ dầu thực vật. 27
  31. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.4. Một số nhà máy sản xuất bioethanol đang hoạt động ở Việt Nam [10] TT 1 – Nam Xanh 2 – Lâm – 3 Nông. 4 Kon Tum Đăk Tô – Kon Tum 5 Trung) (Nguồn: Khoa học và công nghệ, số 9 – 08/2012) 1.1.6.2. Trên thế giới  Tình hình sản xuất Theo báo cáo F.O. Licht thì bioethanol được sử dụng làm nhiên liệu đốt trong từ năm 1860 do nhà khoa học Nicolas August Otto (Đức) khám phá. Đến sau 1930 thì Mỹ, Brazil, Anh, Pháp, Đức, Ý, Thuỵ Điển đã bắt đầu sử dụng Bioethanol thay thế xăng. Nhưng trào lưu này thực sự bùng nổ vào những năm 1970 khi nguồn nhiên liệu chính là dầu mỏ bị khủng hoảng nguồn cung. 28
  32. Đồ án tốt nghiệp Cũng theo báo cáo trên thì 47 % bioethanol nhiên liệu trên thế giới được sản xuất từ mía đường, 53% là từ cây có chứa tinh bột (bắp, sắn lát và lúa mì). Sản lượng bioethanol sản xuất năm 2006 khoảng 50 tỷ lít. Nhu cầu Bio-Ethanol nhiên liệu trên toàn thế giới vào năm 2015 sẽ cao gấp hơn 2 lần sản lượng năm 2006 (100 tỷ lít). Trước đó, Brazil là quốc gia đứng đầu về sản xuất và tiêu thụ bioethanol. Đến năm 2006, Mỹ vượt qua Braxin và trở thành nước sản xuất bioethanol nhiên liệu lớn nhất thế giới. Các quốc gia sản xuất bioethanol lớn như Braxin, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ và Pháp chiếm 84% sản lượng bioethanol nhiên liệu của toàn thế giới trong năm 2005. [7] Brazil: là nước đi đầu trên thế giới trong việc sản xuất bioethanol nhiên liệu từ mật rỉ trong năm 2004 và đến cuối năm 2007, Braxin đã sản xuất được 20.5 tỷ lít, chiếm 34 % sản lượng bioethanol toàn thế giới. Nhóm các nước nhập khẩu bioethanol nhiên liệu từ Braxin là Mỹ, Ấn Độ, Hàn Quốc , Nhật Bản, Thụy Điển và Hà Lan. Hoa Kỳ: năm 2006, Mỹ đã vượt qua Braxin trở thành quốc gia lớn nhất thế giới về sản xuất bioethanol nhiên liệu, chiếm 37 % sản lượng toàn thế giới. Theo chương trình phát triển năng lượng quốc gia, Mỹ sẽ sản xuất 25.7 tỷ lít bioethanol vào năm 2010. Nguồn nhiên liệu chính để sản xuất bioethanol nhiên liệu tại Mỹ là ngô. EU: năm 2006, sản lượng bioethanol của EU là 341.250.000 lít, trong đó Pháp là quốc gia sản xuất bioethanol nhiên liệu lớn nhất châu Âu (114 triệu lít, chiếm 33 %), Tây Ban Nha 47.8 triệu lít ( chiếm 14 %) và Đức 44.4 triệu lít ( chiếm 13 %). Trung Quốc: là nước sản xuất bioethanol lớn nhất khu vực Châu Á. Năm 2005, tổng sản lượng bioethanol của quốc gia này xấp xỉ 3.8 tỷ lít (trong đó 1.3 tỷ lít là bioethanol nhiên liệu), chiếm gần 8 % sản lượng toàn thế giới. Các quốc gia khác đã có những thành tựu đáng kể trong việc sản xuất bioethanol đó là Ấn Độ, Thái Lan và một số quốc gia khác: 29
  33. Đồ án tốt nghiệp Ấn Độ: đây là quốc gia đứng thứ 2 ở châu Á về sản xuất bioethanol sau Trung Quốc. Năm 2005 sản lượng bioethanol của Ấn Độ là 1.7 tỷ lít, trong đó 200 triệu lít là bioethanol nhiên liệu.  Tình hình tiêu thụ Năm 2006, sản lượng Bioethanol được sử dụng trên thế giới là 50 tỷ lít, trong đó bioethanol nhiên liệu là 38.5 tỷ lít (chiếm 77 %), Bioethanol công nghiệp là 4 tỷ lít (chiếm 8 %) và Bio-Ethanol cho đồ uống là 7.5 tỷ lít (chiếm 15 %). [11] 1.1.7. Tình hình nghiên cứu bioethanol tại Việt Nam và trên thế giới 1.1.7.1. Tại Việt Nam ệ đã nghiên cứu “sản xuất ethanol sinh học từ ử lý vớ 0C trong 4 giờ thu hồi được 21,93% lượng đường khử, quá trình lên men đạt hiệu quả cao nhấ -300C, thời gian lên men 72 giờ [12]. ứu sản xuất biethanol từ rong biể 0 ử 2SO4 1,5%, nhiệt độ ử C, thờ ử 40 phút, nồng độ cơ chấ ử ử ồng độ enzyme cellulase 12,18%, nồng độ enzyme β-glucosidase 4,8%, nhiệt độ 500C, pH 5, tốc độ lắc 200 rpm, thờ ờ. Sau đó lên men vớ ấm men được chuyển giao từ USDA (Bộ nông nghiệp Mỹ 0C trong 72 giờ thu được 20,92 g/l cồn, hiệu suất quá trình đạt 90% [13] 1.1.7.2. Trên thế giới Bảng 1.5. Một số công trình nghiên cứu bioethanol từ phụ phẩm trái cây trên thế giới PP Tài liệu tham Năm Tác giả Đối tượng lên Kết quả khảo men Pilanee Kasetsart 2011 Vaithanom Journal. p: 159 – sat SSF 164, 2011 30
  34. Đồ án tốt nghiệp khô. Ethanol theo SSF: 20.67 %. % (v/v) Journal of Yeast Cam 1.32 and Fungal 2012 SSF Research Vol. %(v/v) 3(2), p: 12 - 17, Chanh March 2012 1.46%(v/v) Biotechnology 4% (w/v) 2013 SSCF for Biofuels, ethanol 2013. International Journal of Environmental 2013 SSF Science and 7.45 % (v/v) Development, Vol. 4, No. 2, April 2013 Bioesource Technology, Vol 2013 Melaleuca SSF - 136, p: 213-22, leucadendron 63.2 g/l May 2013. SpringerPlus Masahide journal, 2014 2014 Yasuda Napie SSCF gerplus.com/cont ent/3/1/333 31
  35. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.6. Tình hình nghiên cứu sản xuất bioethanol từ vỏ chuối Pp lên Tài liệu tham Năm Tác giả Đối tượng Kết quả men khảo Thu cồn có Đại học Vỏ chuối sấy 2011 SSF nồng độ [14] Kansas khô 28,2g/L Ahmed S. A Phế phẩm Ethanol 4,1- 2011 SHF [15] và cộng sự chuối 7,1% Mohit S Mishra Phế phẩm 2011 SHF Ethanol 8-9% [16] -Siman Sheet chuối 1.2. Giới thiệu về cây chuối sứ 1.2.1 ối Tên khoa học: Musa Paradisiaca Giới (regnum): Plantae Ngành (phylum): Magnoliophyta Phân lớp (subfamilia): Zingiberiadae Bộ(ordo): Zingiberales Họ (familia): Musaceae Hình 1.5. Chuối sứ. Chi (genus): Musa 1.2.2 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của vỏ trái chuối Những nghiên cứu khoa học đã và đang được thực hiện đều hướng đến sự phát triển bền vững của xã hội. Một trong những sự phát triển bền vững đó là sử dụng nguồn cung cấp đường từ vỏ chuối chuyển hóa vi sinh để tạo ra ethanol sinh học. Điều đó sẽ giải quyết các vấn đề về ô nhiễm môi trường và chất thải nông nghiệp. 1
  36. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.7. Thành phần hóa học của vỏ chuối Chỉ tiêu Vỏ chuối Đường(%) 1.61 -1.97% Chất béo(%) - Protein(%) 1.40 -1.45% Pectin(%) - Lignin(%) - Cellulose(%) 4.5 - 4.6% Hemicellulose(%) - (Nguồn: Luận văn Bước đầu khảo sát tiền xử lí và thủy phân ca cao làm nguyên liệu cho lên men bioethanol bằng Saccharomyces cerevisiae_Nguyễn Văn Pháp) Ghi chú: “-“: không có số liệu 1.2.3 Tình hình sản xuất, diện tích và sản lượng chuối tại Việt Nam Chuối sứ thường được trồng ở các vùng trung du, miền núi, cây mọc khỏe, cao to, lá dài rộng, cuống lá có phấn trắng. trái to, ngắn, mập, vỏ mỏng, khi chín có màu vàng tươi, vị ngọt, kém thơm. Khả năng vận chuyển bảo quản kém. Ở nước ta, chuối là loại cây lương thực có diện tích và sản lượng cao. Tuy nhiên diện tích trồng chuối lại không tập trung. Do đặc điểm là loại cây ngắn ngày, nhiều công dụng và ít tốn diện tích nên chuối được trồng ở rất nhiều nơi trong các vườn cây ăn trái và hộ gia đình. Một số tỉnh miền trung và miền nam có diện tích trồng chuối khá lớn (Thanh Hóa, Nghệ An, Khánh Hòa, Đồng Nai, Sóc Trăng, Cà Mau có diện tích từ 3.000 ha đến gần 8.000 ha) trong khi đó các tỉnh miền bắc có diện tích trồng chuối lớn nhất như: Hải Phòng, Nam Định, Phú Thọ chưa đạt đến 3.000 ha. 2
  37. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.8. Diện tích trồng chuối theo các vùng (đơn vị: ha) Năm Năm Năm Năm Năm Vùng 2001 2002 2003 2004 2005 Đồng bằng sông Hồng 17900 18100 17407 17407 16400 Đông Bắc bộ 8900 6300 9021 8849 8700 Tây Bắc bộ 2300 2200 18100 17456 2600 Bắc Trung bộ 15400 15500 6300 9021 16400 Duyên hải Nam Trung bộ 10200 10500 10642 10713 11400 Tây Nguyên 2900 3400 3492 3630 3700 Đông Nam bộ 12100 12300 12689 12653 12800 Đồng bằng sông Cửu 31600 27700 27706 30142 31303 Long (nguồn: luận văn nghiên cứu sản xuất nectar chuối) Bảng 1.9. Sản lượng trồng chuối theo vùng (Đơn vị: tấn) Năm Năm Năm Năm Năm Vùng 2001 2002 2003 2004 2005 Đồng bằng sông 359500 342700 426161 352181 403500 Hồng Đông Bắc bộ 95900 65200 100575 98517 96600 Tây Bắc bộ 19300 25400 27285 30691 30600 Bắc Trung bộ 80800 98300 102966 205666 110800 Duyên hải Nam 66000 103500 99636 99504 111800 Trung bộ Tây Nguyên 33900 41400 44262 53027 58300 Đông Nam bộ 114800 146400 150717 165596 175800 Đồng bằng sông Cửu 310200 274800 330203 351629 366900 Long (nguồn: luận văn nghiên cứu sản xuất nectar chuối) 3
  38. Đồ án tốt nghiệp 1.2.4 Tình hình sản xuất và sản lượng chuối trên thế giới Theo số liệu của FAO hàng năm toàn thế giới sản xuất trên 88 triệu tấn chuối. Chuối được trồng chủ yếu ở các nước đang phát triển trên thế giới. Khoảng 98% sản lượng chuối được trồng ở các nước đang phát triển và xuất khẩu tới các nước đang phát triển. Năm 2004 tổng cộng có 130 nước xuất khẩu chuối. mười nước sản xuất chính chiếm đến 75% sản lượng thế giới. Trong đó Ấn Độ, Equador, Brazil và Trung Quốc chiếm 1 nửa của toàn thế giới. Bảng 1.10. Sản lượng chuối hằng năm của các nước trên thế giới Stt Quốc gia Sản lượng ( triệu tấn) 1 India 29,7 2 Uganda 11,1 3 China 10,7 4 Philippines 9,2 5 Equador 8,0 6 Brazil 7,3 7 Indonesia 6,1 8 Colombia 5,1 9 Cameroon 4,8 10 Nzania 3,9 (Nguồn: Theo bảng thống kê của tổ chức FAO năm 2011) Như vậy, vỏ chuối chiếm 20-30% khối lượng trái nên ở Việt Nam trung bình mỗi năm có tới ~ 350.000 tấn vỏ phế phẩm. Trên thế giới lượng vỏ chuối thải ra hàng năm ~ 24 triệu tấn. Để giải quyết vấn đề môi trường các nước phải cấp chi phí cho việc xử lí rác thải. Tuy nhiên, nếu lượng rác thải được tận dụng vào mục đích hợp lí khác thì vừa giữ vệ sinh môi trường, vừa đỡ tốn kém, vừa tạo thêm sản phẩm có thêm thu nhập. Và hiện nay xu hướng cho vấn đề này chính là lên men sản xuất ethanol sinh học. 4
  39. Đồ án tốt nghiệp 1.3. Giới thiệu chủng nấm men lên men bioethanol 1.3.1 Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae 1.3.1.1 Phân loại khoa học Giới (regnum) Fungi Ngành (phylum) Ascomycota Phân ngành (subphylum) Saccharomycotina Lớp (class) Saccharomycetes Bộ (ordo) Saccharomycetales Họ (familia) Saccharomycetaceae Chi (genus) Saccharomyces Loài (species) S. cerevisiae 1.3.1.2 Đặc điểm hình thái Hình 1.6. Saccharomyces cerevisiae. Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có dạng hình cầu hay hình trứng, có kích thuớc từ 5-6µm đến 10-14µm, sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử. Nguồn dinh dưỡng carbon chủ yếu của chúng là đường glucose, galactose, 5
  40. Đồ án tốt nghiệp saccharose, maltose. Chúng sử dụng acid amin và muối amoni như nguồn nitơ chính. Saccharomyces cerevisiae thuộc loại nấm men chìm có đặc điểm: - Nấm men chìm chỉ phát triển trong môi trường lên men, chúng không tạo thành bọt dày trên bề mặt, lắng nhanh khi lên men kết thúc. - Đặc điểm nổi bậc của nấm men chìm là một số chủng có chứa enzyme α - galactosidase nên lên men hoàn toàn đường rafinose, còn đối với nấm men nổi thì một số ít chủng có khả năng chuyển hóa đường rafinose thành CO2 và H2O. 1.3.1.3 Nguồn dinh dưỡng của nấm men ờng thành cồn nhờ Saccharomyces cerevisiae. Quá trình lên men cồn được tiến hành ở nhiệt độ 32 ÷ 34 0C trong thờ – ờ ồn được thực hiệ kiện kị ờ ộc loại Saccharomyces cerevisae nguồn dinh dưỡng củ - Dinh dưỡng carbon các loại hợ ữu cơ nhờ mộ ợu, acid hữ ồn dinh dưỡng carbon củ men. Tuy nhiên, S. cerevisiae ồ ờ tinh bột, celluluse, dextrin. - Dinh dưỡng nitơ s.cerevisiae: ồng hoá các hợ ữu cơ ở dạ ữu cơ. Nguồn nitơ vô cơ được S. cerevisiae sử dụ ặc biệt là amonium sulfate. Nguồn nitơ hữu cơ thường được S. cerevisiae sử dụ ợ toàn không sử dụng được protein. - Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ: ớn trong các hoạt động trao đổ ợng của tế ồ 6
  41. Đồ án tốt nghiệp diphosphate và monophosphate. Lưu huỳnh là thành phần của mộ amin và mộ ế ậy, việ ủ lưu huỳnh sẽ làm ngừng hoạt động tổng hợp protein. Nguồn lưu huỳnh thường được sử dụ cho Saccharomyces cerevisiae ợ ần cho các hoạt động sinh lý củ Saccharomyces cerevisiae là một trong những loại nấm quan trọng nhất trong lịch sử thế giới. Loại nấm này có tác dụng cho việc sản xuất cồn ethanol. Nguồn năng lượng chủ yếu là quá trình chuyển đổi đường glucose thành năng lượng. 1.3.2 Chủng nấm men Pichia anomala 1.3.3.1. Phân loại khoa học Giới (regnum) Nấm Ngành (phylum) Ascomycota Phân ngành ( subphylum) Saccharomycotina Lớp (class) Saccharomycetes Bộ (ordo) Saccharomycetales Họ (familia) Saccharomycetaca Chi (genus) Pichi Loài (species) Pichi anomala 1.3.3.2 Đặc điểm hình thái 7
  42. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7 Pichia anomala. Tế bào nấm men có hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ. Sinh sản bằng cách nảy chồi, hình thành đơn lẻ, cặp, cụm nhỏ. Tăng trưởng lỏng: màng mỏng, thay đổi từ mỏng ,dày mịn, gấp. 1.3.2.3 Nguồn dinh dưỡng của nấm men Pichia anomala: là loại nấm men phổ biến nhất trong các chủng nấm men có thể lên men đường 5 carbon (xylose). Pichia anomala có các ưu điểm như cho hiệu suất tiêu thụ xylose cao, chịu được nhiệt độ và nồng độ cơ chất cao. Tuy nhiên lại bị ức chế bởi ethanol nồng độ cao. Ngày nay, thế giới có xu hướng sử dụng công nghệ gene để kết hợp các chủng nấm men vừa có khả năng lên men đường 6 carbon, vừa có khả năng lên men đường 5 carbon. Trong nghiên cứu này, nghiên cứu quá trình lên men đường 6(glucose) và đường 5 carbon (xylose) nên sử dụng kết hợp nấm men Saccharomyces cerevisiae và Pichia anomala. 8
  43. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian thực hiện đề tài : từ 25/05/2015 – 15/08/2015. - Địa điểm: Phòng Thí nghiệm năng lượng sinh học – trường ĐH Bách Khoa TP.HCM. 2.2 Đối tượng nghiên cứu Các thí nghiệm được tiến hành bằng phương pháp Thủy phân và lên men sử dụng kết hợp nhiều chủng vi sinh vật (SSCF) trên vỏ chuối sứ. 2.3 Vật liệu 2.3.1 Nguyên vật liệu Vỏ chuối : thu gom từ các cơ sở sản xuất sản phẩm từ chuối tại TP.Hồ Chí Minh. - Enzyme: Enzyme thương mại Viscozyme do công ty Brenntag cung cấp là enzyme cellulase. - Nấm men:  Saccharomyces cerevisiae (ATCC).  Pichia anomala (VTCC). Chủng này đã được hoạt hóa và cấy truyền trên thạch nghiêng, bảo quản ở 40C và được cấy truyền hai tuần một lần để giữ giống. 2.3.2 Hóa chất sử dụng - H2SO4, HCl. - Acid acetic. - NaOH. - Thuốc thử DNS (3,5 dinitrosalicylic acid). - Peptone. - D- Glucose. - Alcohol. - Thuốc thử Anthrone. 9
  44. Đồ án tốt nghiệp Môi trường hoạt hóa và nhân giống nấm men Sabouraud Dextrose Broth (SDB). - D-glucose: 20g . - Pepton. - Nước cất: 1000 ml. Môi trường nuôi cấy nấm men Sabouraud Dextrose Agar (SDA). - D-glucose: 40g. - Peptone: 10g. - Agar: 20g. - Nước cất: 1000 ml. 2.3.3 Thiết bị ứu.  Thiết bị dùng trong nghiên cứu - Nồi hấp tiệt trùng Autoclave Tomy ES 315. - Lò nung Nabertherm 240398. - Tủ sấy. - Tủ lạnh. - Cồn kế Portable refractometer. - Máy khuấy từ IKA RH busis 2. - Máy lắc Sino Sourc HY- 5A. - Máy lắc ổn nhiệt Sluart SI 500. - Máy đo quang phổ UV VIS. - Máy đo độ ẩm Shimadzu MOC-30S. - Máy lọc nước Eyela RP-2100. - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – Shimadzu RID10A). - Máy xay cầm tay Phillips. - Cân kỹ thuật electronic KD- TBED - Bể ổn nhiệt. - Tủ ủ SanYo MIR -162. - Tủ lạnh Sharp SJ-F75 PV- SL. 10
  45. Đồ án tốt nghiệp - Kính hiển vi Olympus CX21 - pH kế - Trans Instrument  ứu - Bình lên men 100ml. - Erlen 100ml. - Becher các loại. - Ống nghiệm. - Ống đong các loại. - Pipet các loại. - Đĩa petri. - Cuvet. - Đũa khuấy. - Cốc sứ 2.4 Phương pháp 2.4.1 Bố trí thí nghiệm Nghiên cứu này tập trung vào quá trình thủy phân và lên men (SSCF) kết hợp đồng thời giống nấm men Sacharomyces cerevisiae và Pichia anomala. Sơ đồ thực hiện thí nghiệm của đồ án được trình bày tóm tắt trong hình 2.1 11
  46. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1. thực hiện thí nghiệm của đồ án. 2.4.2 Tiến hành thực hiện 2.4.2.1 Thí nghiệm 1 - Khảo sát một số thành phần của nguyên liệu vỏ chuối khô. Nội dung 1: Xác định độ ẩm bằng máy đo độ ẩm (Shimadzu MOC-30S) đo độ ẩm của vỏ chuối trong 25 phút ở 900C. Nội dung 2: Xác định độ tro toàn phần bằng cách nung ở nhiệt độ cao. Nội dung 3: Xác định acid toàn phần bằng cách chuẩn độ với dung dịch NaOH và thuốc thử phenolphthalein. Nội dung 4: Phương pháp định lượng đường khử bằng phương pháp Miller. Nội dung 5: Phương pháp định lượng hàm lượng cellulose theo phương pháp Kiursher – Hofft. Nội dung 6: Định lượng hàm lượng lignin theo phương pháp Klasm. Nội dung 7: Xác định hàm lượng tinh bột bằng enzyme amylase. 12
  47. Đồ án tốt nghiệp Nội dung 8: Xác định hàm lượng pectin bằng cách trích ly bằng nước nóng và định lượng pectin bằng cách tạo tủa calcium pectate. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần đo. 2.4.2.2 Thí nghiệm 2 - Khảo sát tiền xử lý nguyên liệu vỏ chuối bằng acid acetic 4% Việc tiền xử lý vỏ chuối có ý nghĩa rất quan trọng. Điều này ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình lên men. Nội dung: Tiền xử lý vỏ chuối bằng acid acetic 4%. Tỷ lệ (mẫu: tác chất) là (1:15). Thời gian (giờ) Nhiệt độ Tốc độ khuấy đảo 16 giờ Phòng 150 v/phút Để có tỷ lệ (mẫu: tác chất) là (1:15) dựa vào đề tài “Khảo sát tiền xử lý vỏ chuối (Musa paradisiaca) bằng dung môi hữu cơ và ứng dụng trong lên men bioethanol”, Phạm Nữ Sơn Giang 2014. Sau khi tiền xử lý , tiến hành xác định hàm lượng đường: đường khử (mg/mL), cellulose (mg/mL), lignin(%). Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần đo. 2.4.2.3 Thí nghiệm 3 - Khảo sát thủy phân và lên men đồng thời Nguyên liệu sau khi tiền xử lý sẽ được điều chỉnh pH, hấp khử trùng (1210C,10 atm,10 phút) để tiêu diệt vi sinh vật tránh gây nhiễm trong quá trình lên men. Cuối cùng bổ sung enzyme Viscozyme và nấm men Sacharomyces serevisiae và Pichia anomala tiến hành thủy phân và lên men đồng thời. Sau lên men thu dịch cồn. Nhiệt độ tối thích của nấm men bình thường là 250C – 300C, enzyme là 450C – 500C. Nếu sử dụng nấm men bình thường thì nhiệt độ thì nhiệt độ nuôi cấy quá thấp so với nhiệt của enzyme. Do đó, đề tài sử dụng nấm men chịu nhiệt để nâng cao nhiệt độ cho phù hợp. Đề tài khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân và lên men đồng thời được trình bày tóm tắt trong bảng 3.1 13
  48. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Bố trí các nghiệm thức thí nghiệm Nghiệm Thời gian Nhiệt độ Tỷ lệ nấm Tỷ lệ pH Tốc độ thức (giờ) (0C) men (5%) enzyme khuấy (SA:PA) (%) đảo (V/p) 1->16 0,5,10 70, Nhiệt độ 1:1 0,3 5 150 75 phòng (25- 350C) 17->20 Thời gian Room 1:1 0,3 5 150 0 tối ưu (topt) 30 C 350C 400C 21->25 Thời gian Nhiệt độ tối 1:1 0,3 5 150 0 tối ưu (topt) ưu (t opt) 1:4 4:1 2:3 3:2 26->31 Thời gian Nhiệt độ tối Tỷ lệ nấm 0,1% 5 150 0 tối ưu (topt) ưu (t opt) men tối ưu 0,3% 0,5% 0,7% 0,9% 32->34 Thời gian Nhiệt độ tối Tỷ lệ nấm Tỷ lệ 4,5 150 0 tối ưu (topt) ưu (t opt) men tối ưu enzyme 5 tối ưu 5,5 35->39 Thời gian Nhiệt độ tối Tỷ lệ nấm Tỷ lệ pH 50 0 tối ưu (topt) ưu (t opt) men tối ưu enzyme tối 100 tối ưu ưu 150 200 14
  49. Đồ án tốt nghiệp Sau khi thủy phân và lên men các chỉ tiêu cần theo dõi : nồng độ cồn(%), hàm lượng đường khử(mg/mL), hàm lượng cellulose (mg/mL),mật độ vi sinh (cfu/ml) Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần đo. 2.5 Phương pháp phân tích 2.5.1 Phương pháp vi sinh 2.5.1.1 Phương pháp giữ giống nấm men Chuẩn bị môi trường SDA có chứa agar. Tiệt trùng, rót dung dịch vào ống nghiệm và để yên đến khi agar đông lại. Tiến hành cấy giống nấm men từ ống nghiệm gốc sang ống môi trường thạch nghiêng đã chuẩn bị sẵn từ trước. Công việc này tiến hành trong tủ cấy vi sinh để tránh bị nhiễm các vi sinh vật khác có ảnh hưởng xấu đến men giống và quá trình lên men sau này. 2.5.1.2 Phương pháp nhân giống và hoạt hóa giống nấm men Giống nấm men trước khi đưa vào lên men cần được nhân giống nhằm tăng sinh khối, tăng hoạt lực giống. Ở quy mô phòng thí nghiệm, đề tài tiến hành nhân giống qua các bước: - Sau khi môi trường nấm men đã phát triển tốt trên môi trường thạch nghiêng, cấy ria vào đĩa Petri chứa môi trường SDA, nuôi ở nhiệt độ phòng. - Nhân giống cấp 1: lấy 1 khuẩn lạc rời cấy vào ống nghiệm chứa 10mL môi trường SDB, nuôi ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. - Nhân giống cấp 2: chuyển ống nghiệm sang chai chứa 90 mL môi trường SDB nuôi ở nhiệt độ thường trong 24 giờ. - Chia đôi bình nhân giống cấp 2 ở trên  Chai 1: bảo quản trong tủ lạnh để ức chế không cho nấm men phát triển.  Chai 2: đo OD, mẫu trắng là môi trường SDB. 15
  50. Đồ án tốt nghiệp 2.5.1.3 Định lượng số tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc  Nguyên tắc: Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch, qua đó xác định được số tế bào sống.  Tiến hành: - Pha loãng mẫu: pha loãng mẫu theo các dãy số thập phân thích hợp như : 10- 1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. - Cấy mẫu: Dùng micropipette hút 0,1mL dịch mẫu đã pha loãng cho vào mỗi đĩa thạch. Khi tất cả các thể tích 0,1mL dịch mẫu ở các độ pha loãng khác nhau đều đã được chuyển lên bề mặt thạch của đĩa Petri, sử dụng que cấy gạt bằng thủy tinh để dàn đều các tế bào trên bề mặt thạch. Ủ ở nhiệt độ phòng. - Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc đếm được từ 25 – 250 để tính toán. Mật độ tổng của nấm men được tính theo công thức 1: A = (cfu/mL) (CT1) Trong đó: A: số tế bào (cfu) nấm men trong 1ml mẫu. N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn. ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i. V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. fi: độ pha loãng tương ứng. Làm tròn kết quả có được, ghi lại 2 số có nghĩa và biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số mũ).  - 7 cfu/mL. - 3 cfu/mL. 16
  51. Đồ án tốt nghiệp 2.5.2 Phương pháp hóa lý 2.5.2.1. Xác định độ ẩm  Nguyên tắc: là dùng máy đo độ ẩm Shimadzu (1000C, 20 phút) để xác định hàm lượng ẩm trong mẫu. Dùng nhiệt nóng của tủ sấy làm bay hết nước trong mẫu.  - . - 1). - 2). - 0 3).  theo công thức 2: W = x 100% (CT2) 2.5.2.2 Xác định độ tro toàn phần bằng cách nung ở nhiệt độ cao  Nguyên tắc: Đốt cháy các chất hữu cơ trong mẫu ở nhiệt độ cao (5500C – 6500C). Các chất vô cơ không bị đốt cháy chính là tro. Đem cân, tính hàm lượng tro.  Tiến hành: - Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung 5000C – 6500C đến trọng lượng không đổi. Để nguội ở bình hút ẩm, cân xác định khối lượng chén sứ (G1), cân phân tích độ chính xác đến 0,0001g. - Cho vào chén 5-10g mẫu. Khối lượng chén sứ và khối lượng mẫu là G2, cân phân tích với độ chính xác như trên. 0 0 - Cho vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ lên đến 550 C – 600 C, nung cho đến tro trắng ( khoảng 8 giờ). Trường hợp tro còn đen, lấy ra để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 hoặc HNO3 đậm đặc và nung đến cho trắng. 17
  52. Đồ án tốt nghiệp - Để nguội trong bình hút ẩm và cân lại lần nữa (G3), cân phân tích với độ chính xác như trên.  Tính kết quả: Hàm lượng tro toàn phần theo phần trăm (X) tính bằng công thức 3: X = X 100% (CT3) Trong đó: G1: Trọng lượng của chén (g). G2: Trọng lượng của chén và trọng lượng mẫu thử (g). G3: Trọng lượng của chén và tro trắng sau khi nung đến khối lượng không đổi (g). 2.5.2.3 Xác định hàm lượng acid toàn phần  Nguyên tắc: Dùng một dung dịch kiềm chuẩn ( NaOH) để trung hòa hết các acid trong mẫu, với phenolphthalein làm chỉ thị màu.  Tiến hành: - Cân 10 gam mẫu cho vào một cốc nhỏ. Bổ sung 100ml nước. Trộn đều. - Ngâm mẫu khoảng 30 – 45 phút. - Hút 5 mL dịch cho vào erlen. - Nhỏ 1 giọt phenolphthalein. - Nhỏ từ từ dung dịch NaOH 0.1N từ buret xuống đến khi dịch mẫu có màu hồng nhạt bền vững.  Tính kết quả: Độ acid toàn phần theo phần trăm (X) tính bằng công thức 4: (CT4) Trong đó: n: số mL NaOH 0,1N sử dụng để chuẩn độ V2 mL dịch thử. V1: thể tích mẫu ngâm (mL) m: trọng lượng mẫu thử (g) K: hệ số của acid citric, K=0,006904. 18
  53. Đồ án tốt nghiệp 2.5.2.4 Xác định hàm lượng đường khử bằng Miller  Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử 3, 5 -dinitrosalycylic acid (DNS). DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3 - amino - nitrosalycylic có màu đỏ cam khi đun nóng hỗn hợp phản ứng. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định được đo bằng máy quang phổ so màu UV VIS. Dựa theo đồ thị chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử, ta sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất trong khoảng bước sóng 540 nm.  - Chiết xuất đường trong vỏ chuối (xác định đường khử trong vỏ tươi, khô).  ố 30mL cồn 960 → đun cách thủy (sôi 3 lần) → khuấy đều bằng đũa thủy tinh → để nguội → lọc (chỉ gạn lấy phần trong).  Cho tiếp 10mL cồn 80o vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun sôi 2 lần trên nồi đun cách thủy → để nguội → lọc (lặp lại 2 lần).  Đưa phần bã lên lọc và rửa bằng rượu nóng (80o)  Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong phòng hoặc trên nồi cách thủy đun nhẹ. Sau khi cho bay hơi rượu, mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm.  Cặn khô trong cốc được pha loãng thành thể tích V = 50mL với nước cất ta được dung dịch đường gốc. Pha loãng dung dịch đường gốc với một hệ số pha loãng n thích hợp. -  Cho 3mL dung dịch mẫu (đã pha loãng đến nồng độ thích hợp) vào ống nghiệm, thêm 1mL thuốc thử DNS. 19
  54. Đồ án tốt nghiệp  Đun cách thủy hỗn hợp trong 15-20 phút. Làm lạ ồi đo OD ở bước sóng 540nm.  Từ giá trị OD đo được, dựa vào đồ thị đường chuẩn glucose suy ra hàm lượng đường khử trong mẫu. ức 5: D = (mg/g) (CT5) 2.5.2.5 Định lượng cellulose -Hoff  Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa cellulose với thuốc thử anthrone có màu vàng trong dung dịch acid H2SO4 đặc sẽ tạo màu xanh từ nhạt đến đậm đến nâu khi đun nóng hỗn hợp phản ứng. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ cellulose trong một phạm vi nhất định được đo bằng máy quang phổ so màu UV VIS. Dựa theo đồ thị chuẩn cellulose với thuốc thử, sẽ tính được hàm lượng cellulose của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 630 nm.  Cách tiến hành: - Cho 0.5mL dịch mẫu (đã pha loãng đến nồng độ thích hợp) và ống nghiệm, thêm 5mL thuốc thử Anthrone. - Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút. Làm lạnh nhanh rồi đo OD ở bước sóng 630nm. - Từ giá trị OD thu được, dựa vào đồ thị đường chuẩn cellulose suy ra hàm lượng cellulose trong mẫu. 20
  55. Đồ án tốt nghiệp 2.5.2.6 Xác định hàm lượng lignin  Chuẩn bị mẫu - Cân chính xác 0.3g ± 0.01g mẫu bỏ vào chai 100mL có nắp vặn, thêm 3mL ± O O 0.01mL acid H2SO4 72%. Đặt chai nắp vặn vào bể ổn nhiệt ở 30 C ± 3 C trong 60 ± 5 phút. Dung dịch phản ứng luôn luôn phải được khuấy từ. - Sau 60 phút thủy phân, pha loãng acid tới nồng độ - 4% bằng cách thêm 84mL ± 0.04mL nước cất. Trộn mẫu bằng cách đảo ngược chai nhiều lần để loại bỏ sự tách pha giữa các lớp acid nồng độ cao và thấp.  Phân tích lignin không hòa tan trong acid - Nung crucible (cốc lọc chân không) ở 600OC trong ít nhất 4 tiếng, sau đó bỏ vào hộp hút ẩm để nguội trong 2 tiếng rồi đem cân trọng lượng, ghi trọng lượng tới 0.1mg. - Lọc mẫu bằng phương pháp lọc chân không, chuyển 50mL dịch lọc vào bình bảo quản mẫu, dịch này sẽ dùng để đo lignin hòa tan. Dịch này phải được đo trong vòng 6 tiếng sau thủy phân, nếu không phải được bảo quản trong tủ lạnh tối đa là 2 tuần. - Rửa phần rắn còn lại bằng ít nhất 50 mL nước cất, chia làm 3 lần rửa. - Đem phần rắn sấy ở 105OC trong hơn 4 tiếng, sau đó bỏ vào hộp hút ẩm để nguội 1 tiếng, cân và ghi lại khối lượng mẫu. - Sau đó đem crucible nung ở 600OC qua đêm, đem cân xác định hàm lượng tro.  Phân tích lignin hòa tan trong acid - Sử dụng máy đo quang phổ UV-Visible, chạy mẫu trắng là acid H2SO4 4%. - Sử dụng dịch thủy phân thu được (pha loãng đến nồng độ thích hợp bằng H2SO4 4%) đo ở bước sóng 240nm và 320nm. - Tính hàm lượng lignin bằng đường chuẩn. 21
  56. Đồ án tốt nghiệp 2.5.2.7 Phương pháp xác hàm lượng pectin Quy trình chiết suất pectin như sau: Tiền xử lý nguyên liệu vỏ chuối tươi -> trộn 3g vỏ chuối khô vào 60ml nước cất -> điều chỉnh pH bằng HCl 0,5N -> Đun và khuấy đều -> lọc thu dịch lọc -> Bổ sung them nước cất đến thể tích 100ml ->Bổ sung thêm 200ml cồn 960 để tủa pectin -> lọc thu tủa (dùng giấy lọc Whatman 41 -> Rửa tủa 2 lần với ethanol 700 -> Sấy khô tủa pectin (ở 700C) đến khối lượng không đổi -> thu pectin thô. Hàm lượng (HL) pectin được tính theo công thức HL pectin (%) = (CT6) 2.5.2.8 Phương pháp xác định hàm lượng tinh bột. (1) xác định hàm lượng đường tổng theo phương pháp DNS như bình thường. (2) cân mẫu nghiền nhỏ với nước, đun nóng khoảng 20 phút, để nguội xuống khoảng <750C thì bổ sung 1% amylase, dùng Iot thử cho đến khi thấy hết tinh bột thì đem trích đường đo thep phương pháp DNS. Lấy kết quả (2) trừ đi hàm lượng đường (1) do tinh bột tạo ra. Nhân kết quả với 0,9 thì được hàm lượng tinh bột trong mẫu. 2.5.2.9 Phương pháp xác định pH Dùng pH kế điện tử. 2.5.2.10 Phương pháp xác định độ cồn Dùng cồn kế. .  Chuẩn bị pha động. - 2SO4 - ử ion. 22
  57. Đồ án tốt nghiệp - 267µl H2SO4 - - - - -  Tính kết quả cồn. Mẫu được lọc qua màng lọc vi sinh (NSX: Membrance solution, kích thước 0,22 µm) và đo bằng HPLC. Từ diện tích peak thu được trên sắc kí đồ, tính được nồng độ cồn theo phương trình: y=5,031*10-7 – 0.002 23
  58. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát giống nấm men 3.1.1 Khảo sát đại thể và vi thể giống nấm men 3.1.1.1 Nấm men Saccharomyces cerevisiae a. Hình dạng khuẩn lạc b.Hình dạng tế bào Hình 3.1. Nấm men Saccharomyces cerevisiae Khuẩn lạc nấm men Saccharomyces cerevisiae lúc đầu có màu trắng, khuẩn lạc nhỏ. Sau 1-2 ngày khuẩn lạc chuyển sang màu trắng ngà, mịn màng, rìa tròn lồi, bề mặt sáng, khuẩn lạc lớn hơn, đường kính khoảng 1 – 2 mm (hình 3.1a). Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có dạng hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ, sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử.( hình 3.1b). 3.1.1.2 Nấm men Pichia anomala a.Hình dạng khuẩn lạc b. Hình dạng tế bào Hình 3.2. Nấm men Pichia anomala 24
  59. Đồ án tốt nghiệp Khuẩn lạc nấm men Pichia anomala có màu kem, rìa có hình rang cưa, bề mặt lồi, trơn bóng. Ban đầu, khuẩn lạc có kích thước nhỏ. Sau 1-2 ngày khuẩn lạc có đường kính khoảng 1 – 1,5mm.(hình 3.2a). Tế bào nấm men Pichia anomala có dạng hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ. (hình 3.2b). 3.1.2 Xây dựng đường cong sinh trưởng của nấm men trong môi trường SDB 3.1.1.2 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Mật Mật bào tế độ (cfu/mL) log 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 Thời gian khảo sát (giờ) Hình 3.3. Đường cong sinh trưởng Saccharomyces cerevisiae trong môi trường SDB Từ hình 3.3, có thể thấy đường cong sinh trưởng Saccharomyces cerevisiae trong môi trường SDB được chia thành bốn pha khá rõ rệt. - Pha tiềm phát : Trong 6 giờ đầu, nấm men phải thích ứng với môi trường mới nên chưa có sự tăng sinh mạnh trong giai đoạn này. - Pha lũy thừa: Từ thời điểm 6 đến 39 giờ, số lượng tế bào nấm men tăng nhanh chóng. - Pha cân bằng: Từ thời điểm 39 đến 51 giờ, có thể thấy số lượng tế bào nấm men khá là cân bằ (7,75 – 8,28). -Pha suy vong: Từ 51 -72 giờ số lượng tế bào chết nhiều hơn số tế bào sinh ra, và trong giai đoạn này, chất dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, không đủ 25
  60. Đồ án tốt nghiệp cung cấp cho hoạt động sinh trưởng, phát triển của nấm men do đó tế bào già và chết đi. 3.1.2.2 Nấm men Pichia anomala Hình 3.4. Đường cong sinh trưởng Pichia anomala trong môi trường SDB Từ hình 3.4, có thể thấy đường cong sinh trưởng Pichia anomala trong môi trường SDB được chia thành bốn pha khá rõ rệt. - Pha tiềm phát : Trong khoảng 4 giờ đầu, nấm men phải thích ứng với môi trường mới nên chưa có sự tăng sinh mạnh trong giai đoạn này (log(cfu/mL) (7,58 – 7,66)). - Pha lũy thừa: Từ thời điểm 6 đến 20 giờ, số lượng tế bào nấm men tăng 9,01). - Pha cân bằng: Từ thời điểm 20 đến 36 giờ, có thể thấy số lượng tế bào nấm men khá là cân bằ (9,01 – 9,07), số lượng tế bào chết cân bằng với số tế bào được sinh ra. - Pha suy vong: Từ 36 giờ trở về sau, số lượng tế bào chết nhiều hơn số tế bào sinh ra, và trong giai đoạn này nên tổng số lượng tế bào giảm dần, chất dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, không đủ cung cấp cho hoạt động sinh trưởng, phát triển của nấm men do đó tế bào già và chế 8,72). 26
  61. Đồ án tốt nghiệp 3.2 Khảo sát một số thành phần hóa học của vỏ chuối khô Vỏ chuối sau khi sấy ở 700C, độ ẩm vỏ chuối là 10.45 ± 0.08 (%) được đem đi xay và rây ( kích thước lỗ sàn ~ 0,5 mm), thu được dạng bột như hình 3.1. Hình 3.5. Bột vỏ chuối Điều kiện bảo quản : - Dụng cụ bảo quản trong hộp PE. - Nhiệt độ bảo quản : nhiệt độ phòng. Kết quả thành phần hóa học của vỏ chuối được trình bày trong bảng 3.1 Bảng 3.1. Thành phần hóa học của vỏ chuối Thành phần Hàm lượng Độ ẩm (%) 10,45 ± 0,08 Pectin (%) 2,42 ± 0,15 Độ tro (%) 8,70 ± 0,20 Acid toàn phần (%) 3,64 ± 0,21 Lignin (%) 12,0 ± 0,10 Tinh bột (mg/g) 21,55 ± 0,11 Đường khử (mg/g) 24,69 ± 1,39 Cellulose (mg/g) 66,56 ± 0,98 27
  62. Đồ án tốt nghiệp Qua khảo sát một số thành phần của vỏ chuối khô được trình bày trong bảng 3.1 ta thấy sau khi sấy khô vỏ chuối đến độ ẩm 10,45 ± 0,08 %, cellulase lúc này chiếm 66,56 ± 0,98% thành phần chất khô, khi so sánh hàm lượng cellulose với các nguyên liệu lignocellulose được sử dụng để sản xuất bioethanol khác như: rơm rạ (34-38%), bã mía (50%),phế phẩm cây bắp (36,4%), rơm lúa mì (38,2%) có thể thấy vỏ chuối khô có hàm lượng cellulose cao và là một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất bioethanol. Độ acid toàn phần của vỏ chuối (3,64 ± 0,21%) tương đối phù hợp với khả năng lên men của nấm men. (với môi trường lên men có khối lượng gấp 10 lần nguyên liệu thì từ độ acid toàn phần đổi ra nồng độ acid acetic là 0,011M tính pH của môi trường đạt 4,77 nằm trong khoảng pH = 4 – 5 tối ưu). Độ tro của vỏ chuối là 8,70 ± 0,20 % tương đối phù hợp với khả năng lên men cung cấp khoáng tạo môi trường dinh dưỡng cho nấm men phát triển. Tuy nhiên, hàm lượng đường cao 24,69 ± 1,39 mg/g trong vỏ chuối tươi rất dễ bị nấm mốc phát triển và gây hư hỏng nguồn nguyên liệu sẽ ức chế hiệu suất tạo ethanol của nấm men, tạo mùi hôi khó chịu gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy, nguyên liệu phải có độ ẩm thích hợp nhằm ngăn cản hoạt động của nấm dại. Nên đề tài tiến hành khảo sát quá trình tiền xử lý nguyên liệu được sấy khô đến độ ẩm thích hợp. 3.3 Khảo sát tiền xử lý nguyên liệu bằng acid acetic 4% Tiền xử lý nguyên liệu là giai đoạn quan trọng trong quá trình lên men bioethanol từ lignocellulose. Vì nguyên liệu sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới hiệu suất tạo ethanol. Do đó, việc lựa chọn nguyên liệu lên men phù hợp có ý nghĩa rất quan trọng. Nguyên liệu sau khi sấy được xay nhuyễn đem tiền xử lý bằng acid acetic 4%. Căn cứ vào kết quả của đề tài “ Khảo sát tiền xử lý vỏ chuối (Musa paradisiaca) bằng dung môi hữu cơ và ứng dụng trong lên men bioethanol”, Phạm Nữ Sơn Giang 2014. 28
  63. Đồ án tốt nghiệp Đề tài đã chọn phương pháp tiền xử lý bằng acid acetic 4% , tỷ lệ ( nguyên liệu : tác chất) là (1:15) trong 16 giờ. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Một số thành phần hóa học của vỏ chuối khô sau khi tiền xử lý với acid acetic 4% Thành phần Hàm lượng Tinh bột (mg/g) 34,37 ± 0,38 Đường khử (mg/g) 88,38±1,80 Cellulose(mg/g) 69,09±1,09 Lignin (%) “ – ” Ghi chú: “-“: không có số liệu Qua khảo sát tiền xử lý nguyên liệu bằng acid acetic 4% được trình bày trong bảng 3.2 ta thấy hàm lượng cellulose sau khi tiền xử lý acid là (69,09±1.09 mg/g) không chênh lệch nhiều so với hàm lượng cellulose trong nguyên liệu vỏ chuối khô (66,56 ± 0,98 mg/g). Vì dung dịch acid loãng chỉ có tác động tới lớp vỏ lignin bao bọc bên ngoài và hemicellulose do đó hàm lượng cellulose tăng nhưng không tăng nhiều. Hàm lượng đường khử được đóng góp do một số vị trí trong cấu trúc của mạch cellulose có tính vô định hình cao nên tác nhân acid dễ dàng tấn công và thủy phân một phần cellulose thành đường các hoạt lực cao bẻ gãy các liên kết trong phân tử hemicellulose thành các phân tử đường, do đó hàm lượng đường khử sau khi tiền xử lý tăng từ 24,69 ± 1,39 mg/g lên 88,38±1,80 mg/g. 3.4 Khảo sát thủy phân và lên men đồng thời (SSCF) Quá trình thủy phân và lên men đồng thời kết hợp nhiều giống nấm men có nhiều ưu điểm so với quá trình thông thường như đỡ hao tốn thiết bị, thời gian, năng lượng, hiệu suất toàn quá trình cao hơn. Thu nhận bioethanol từ quá trình này là một hướng nghiên cứu mới, chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ ở Việt Nam. Trên thế giới đã tiến hành rất nhiều nghiên cứu và đã triển khai thử mô hình này. 29
  64. Đồ án tốt nghiệp Nghiên cứu này sẽ tiến hành khảo sát các chất có trong dịch thủy phân và lên men đồng thời, ảnh hưởng của thời gian lên men, nhiệt độ lên men, tỷ lệ nấm men bổ sung, tỷ lệ enzyme bổ sung, pH và tốc độ khuấy đảo lên quá trình lên men. 3.4.1 Khảo sát thời gian lên men Thời gian cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm. Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng nấm men Thời gian lên men được tính bắt đầu từ khi cấy chủng nấm men vào môi trường lên men, nhưng thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng môi trường lên men cụ thể và tùy thuộc vào mục đích lên men mà ta dừng quá trình lên men. Nếu thời gian lên men quá ngắn, quá trình lên men chưa xảy ra hoàn toàn, đường sót sẽ còn nhiều trong dịch lên men và độ cồn tạo ra thấp. Nếu thời gian lên men quá dài, môi trường lên men sẽ dễ bị nhiễm các loại vi sinh vật không mong muốn, đồng thời nếu có sự hiện diện của oxy thì rượu sẽ bị oxy hóa thành acid acetic, làm giảm độ cồn và gây hư hỏng rượu. Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men phải cho dịch đường tiếp xúc với oxy. Lúc này nấm men cần oxy để tích lũy một lượng sinh khối cần thiết cho quá trình lên men. Tiếp theo, để chuyển hóa đường thành ethanol, nấm men phải được phát triển trong điều kiện yếm khí hoàn toàn. Vì trong môi trường này, sự hô hấp của nấm men bị ức chế và bắt đầu phải tìm năng lượng cần thiết bằng con đường lên men. Để đáp ứng năng lượng cần thiết thì nấm men cần phân hủy một lượng đường lớn và đường sẽ chuyển hóa thành ethanol và CO2. Đó là nguyên nhân muốn có ethanol nhiều thì không được thoáng khí môi trường. Nếu có oxy thì trong giai đoạn này rượu sẽ tiếp tục chuyển hóa thành acid acetic làm sản phẩm bị chua Giống nấm men sau khi nhân giống đạt đủ sinh khối sẽ được dùng trong lên men bioethanol. Trước khi giống này được sử dụng cho đợt sau lên men thì cần hoạt hóa 8 – 24 giờ trong môi trường mới để nấm men phát triển sinh khối và có hoạt lực trở lại. Thông thường, người ta xác định thời điểm kết thúc lên men khi tổng số các chất rắn hòa tan không đổi ít nhất sau 6 giờ liên tiếp. Khi đó nấm men không còn 30
  65. Đồ án tốt nghiệp chuyển hóa đường thành cồn nữa, do độ cồn tạo thành đã đủ gây ức chế quá trình lên men rượu của nấm men. Do đó, việc chọn thời gian lên men phù hợp có ý nghĩa rất quan trọng, chọn thời gian lên men sao cho có lợi nhất. Đề tài tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới quá trình lên men ở các mức thời gian từ 0 giờ đến 75 giờ , mỗi nghiệm thức cách nhau 5 giờ. Dịch thủy phân và lên men đồng thời đượxzc lọc qua phễu lọc vi sinh (NSX: Membrane solutions, kích thước 0,22 µm) và đo bằng máy HPLC. Kết quả khảo sát một số thành phần trong thời gian lên men được trình bày trong biểu đồ hình 3.6 a,b,c,d. 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 Nồngcồn độ(%) 1.00 0.50 0.00 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Thời gian lên men ( giờ) 31
  66. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.6a. Thay đổi độ cồn theo thời gian lên men. 7.1 ) 7 6.9 (cfu/ml 6.8 log 6.7 6.6 6.5 6.4 Mật Mật bào tế độ 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Thời gian lên men (giờ) Hình 3.6b.Mật độ tế bào thay đổi theo thời gian lên men. . 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Hàm Hàm lượng đường khử (mg/ml) Thời gian lên men (giờ) Hình 3.6c. Sự thay đổi đường khử theo thời gian lên men. 32
  67. Đồ án tốt nghiệp 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Hàm Hàm lượng cellulose (mg/ml) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Thời gian lên men (giờ) Hình 3.6d. Sự thay đổi hàm lượng cellulose theo thời gian lên men.  Nhận xét. Qua biểu đồ hình 3.6 a,b,c,d cho thấy: Đối với nguyên liệu được xử lý bằng acid và thủy phân bằng enzyme thì lượng cồn bắt đầu tăng.Vì trong thời gian đầu nấm men có thời gian để thích nghi với môi trường lên men, hô hấp hiếu khí để tăng sinh khối. Tuy nhiên, thời gian để nấm men tăng sinh khối không nhiều vì nấm men đã được nuôi trong môi trường SDB đã đủ hoạt lực để sử dụng đường có trong dịch nguyên liệu để bắt đầu lên men tạo cồn. Ngoài ra, nguyên liệu đã được tiền xử lý trước để thủy phân cellulose thành đường. Do đó, nấm men có thể sử dụng đường có sẵn trong môi trường lên men để thực hiện chuyển hóa bioethanol khi oxy trong bình lên men hết hẳn. Trong khoảng 15 giờ đầu nấm men phải thích ứng với môi trường mới nên chưa có sự tăng sinh mạnh trong giai đoạn này. Đây là giai đoạn tiềm phát và lũy thừa, nấm men chủ yếu sử dụng lượng O2 có trong bình lên men và đường trong dịch lên men để tăng sinh khối. log(cfu/mL) từ 6,521 đến 6,864 do đó nồng độ cồn trong giai đoạn này có tăng nhưng chưa nhiều từ 0,73% đến 1,72%. Qua biểu đồ hình 3.4c cho thấy hàm lượng đường trong giai đoạn này được tạo thành tăng từ 11,88 ± 0,94 mg/mL đến 23,08 ± 0,94 mg/mL nhưng không nhiều do nấm men cần thời gian để thích nghi với môi trường. Hoạt động của nấm men trong giai đoạn này còn yếu, 33
  68. Đồ án tốt nghiệp glucose không bị tiêu thụ nhiều. Hàm lượng cellulose trong dung dịch được quyết định bởi tốc độ thủy phân của enzyme Viscozyme trong giai đoạn này thì hàm lượng cellulose giảm dần từ 75,92 ± 0,26 mg/mL xuống 68,58 ± 0,54mg/mL ( từ 0 giờ đến 15 giờ). (Bảng 1-PLC) Quá trình lên men xảy ra nhanh trong khoảng từ 20 giờ đến 45 giờ, nấm men đi vào pha ổn định thích nghi với môi trường ,số lượng tế bào nấm men cũng tăng nhanh chóng log(cfu/mL) 6,896 đến 7,057. Nấm men hấp thụ đường và chất dinh dưỡng hòa tan khác để lên men tạo thành cồn. Đường và chất dinh dưỡng được chuyển hóa phần lớn ở giai đoạn này, độ cồn tăng từ 1,83% đến 3,47% từ 20 đến 45 giờ và độ cồn đạt cao nhất ở 45 giờ là 3,47%. Hàm lượng đường khử tăng do nấm men đã thích nghi được với môi trường và tăng sinh khối đáng kể dẫn đến độ cồn tăng và hàm lượng đường khử cũng tăng, phản ứng tạo thành ethanol diễn ra nhanh. Hàm lượng đường khử từ 30,74 ± 1,11 mg/mL tăng lên 51,08 ± 0,89 mg/mL. Đồng thời hàm lượng cellulose cũng giảm mạnh 61,76 ± 0.79 mg/mL xuống còn 44,87 ± 0,93 mg/mL do hoạt lực enzyme cho vào còn mạnh nên dễ dàng phân cắt cellulose thành đường nên làm cho hàm lượng đường tăng còn hàm lượng cellulose thì giảm. (Bảng 1-PLC). Sau 50 giờ trở đi, độ cồn giảm dần và hầu như không thay đổi nữa .Vì trong thời gian dài thì ethanol dễ bị oxy hóa thành acid acetic làm giảm độ cồn và làm giảm pH của dịch lên men, quá trình lên men kết thúc. Điều này sẽ ức chế nấm men hoạt động và nấm men bắt đầu chuyển sang giai đoạn suy vong mật độ nấm men giảm log(cfu/mL) từ 7,052 xuống 6,974. (Bảng 1-PLC). Từ những kết quả trên ta có thể kết luận 45 giờ là thời gian tối ưu để thủy phân và lên men đồng thời vỏ chuối thu bioethanol và tiến hành lấy 45 giờ là thời gian tối ưu cho những thí nghiệm tiếp theo. 3.4.2 Khảo sát nhiệt độ lên men Nhiệt độ của môi trường lên men cũng ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng thủy phân của enzyme và khả năng lên men của nấm men. Đề tài tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men ở các mức nhiệt độ phòng(25-350C), 300C, 34
  69. Đồ án tốt nghiệp 350C, 400C trong thời gian tối ưu đã khảo sát là 45 giờ. Kết quả khảo sát nhiệt độ lên men được trình bày trong biểu đồ hình 3.5 a,b,c. 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 Nồng Nồng cồn độ (%) 1 0.5 0 Nhiệt độ phòng 30 35 40 Nhiệt độ Hình 3.7a. Sự thay đổi nồng độ cồn theo nhiệt độ lên men. 7.08 7.07 7.06 7.05 7.04 7.03 7.02 7.01 7 Mật Mật bào tế độ log(cfu/mL) 6.99 Nhiệt độ phòng 30 35 40 Nhiệt độ Hình 3.7b.Sự thay đổi mật độ tế bào theo nhiệt độ lên men. 35
  70. Đồ án tốt nghiệp 60 50 40 30 20 Hàm Hàm lượngmg/mL 10 0 Nhiệt độ 30 35 40 Nhiệt độ phòng Đường khử Cellulose Hình 3.7c. Thay đổi hàm lượng đường khử và cellulose theo nhiệt độ lên men.  Nhận xét: Dựa vào biểu đồ hình 3.7a,b,c cho thấy sự chênh lệch nồng độ ethanol thu được ở các nhiệt độ khác nhau không lớn, ở 350C cho kết quả nồng độ ethanol cao nhất là 3,86%, thông thường nhiệt độ tối thích của enzyme là 400C – 450C và nấm men là 280C – 300C thì 350C là nhiệt độ thích hợp nhất cho cả sự hoạt động của enzyme và hoạt động của nấm men do đó mật độ tế bào ở nhiệt độ này đạt cao nhất log(cfu/mL) là 7,075. Ở nhiệt độ này, hàm lượng cellulose thấp 31,02 ± 0,32 mg/mL và hàm lượng đường tạo ra đã được nấm men sử dụng một phần cho lên men nên đường không cao 44,16 ± 0,25 mg/mL (Bảng 2-PLC). Nhiệt độ phòng và nhiệt độ 300C thích hợp cho nấm men lên men, nhưng lại thấp cho enzyme hoạt động nên hàm lượng cellulose vẫn còn, đường tạo ra cao 45,25 ± 0,25 mg/mL (nhiệt độ phòng), 46,70 ± 0,60 mg/mL(300C) nên tạo ra nồng độ cồn thấp hơn ( 3,16 -3,33%)(Bảng 2-PLC). Nhiệt độ 400C thích hợp cho enzyme hoạt động, nhưng lại không thích hợp cho nấm men hoạt động nên nồng độ cồn ở nhiệt độ này giảm 3,43%, hàm lượng đường khử giảm 40,40 ± 0,40mg/mL và hàm lượng cellulose vẫn còn 37,95 ± 0,39mg/mL. (Bảng 2-PLC). 36
  71. Đồ án tốt nghiệp Từ những kết quả trên có thể kết luận 350C là nhiệt độ tối ưu để thủy phân và lên men đồng thời vỏ chuối thu ethanol. 3.4.3 Khảo sát tỷ lệ nấm men Nấm men là nhân tố tạo ra quá trình lên men, chuyển hóa đường thành ethanol và khí carbonic. Mỗi loài nấm men có khả năng lên men khác nhau. Cùng loài nấm men, nhưng ở những điều kiện lên men khác nhau thì khả năng lên men khác nhau và sản phẩm của quá trình lên men cũng khác nhau. Nấm men tiến hành lên men đường tạo thành ethanol. Lignocellulose được cấu tạo từ đường 5 carbon và đường 6 carbon. Nấm men Saccharomyces cerevisiae có thể lên men đường 6 carbon( glucose) hiệu quả nhưng vẫn chưa tìm được chủng nấm men thích hợp để lên men đường 5 carbon (xylose). Nấm men thích hợp cho quá trình lên men cần một số tính chất sau:hiệu suất lên men cao, chịu được ethanol,chịu được các sản phẩm phụ của quá trình thủy phân, lên men ở pH thấp, có thể tiêu thụ nhiều cơ chất khác nhau. Ngày nay thế giới đang có xu hướng sử dụng công nghệ gen để kết hợp các chủng nấm men có khả năng lên đường đường 5 carbon và đường 6 carbon. Trong đề tài này kết hợp 2 chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae (SC) và Pichia anomala (PA) để lên men thu bioethanol và việc bổ sung tỷ lệ giống lên men là 5% (theo Trần Tưởng An,2014) nhưng tỷ lệ giữa hai chủng nấm men (SC:PA) cũng phải được lựa chọn. Do đó ta tiến hành khảo sát tìm ra tỷ lệ giữa 2 chủng nấm men tối ưu nhất. Kết quả khảo sát tỷ lệ nấm men được trình bày trong biểu đồ hình 3.8 a,b,c 37
  72. Đồ án tốt nghiệp 7.3 7.2 7.1 7 6.9 6.8 Nồng Nồng cồn độ (%) 6.7 6.6 1:1 1:4 4:1 2:3 3:2 Tỷ lệ nấm men Hình 3.8a. Thay đổi độ cồn theo tỷ lệ nấm men. 4 3.95 3.9 3.85 3.8 3.75 3.7 3.65 3.6 3.55 Mật Mật bào tế độ log(cfu/mL) 3.5 3.45 1:1 1:4 4:1 2:3 3:2 Tỷ lệ nấm men Hình 3.8b. Thay đổi mật độ tế bào theo tỷ lệ nấm men 38
  73. Đồ án tốt nghiệp 60 50 40 30 20 Hàm Hàm lượngmg/mL 10 0 1:1 1:4 4:1 2:3 3:2 Tỷ lệ nấm men Đường khử Cellulose Hình 3.8c. Sự thay đổi đường khử và cellulose theo tỷ lệ nấm men.  Nhận xét: Tỷ lệ nấm men đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men bioethanol, hơn nữa sự kết hợp tỷ lệ giữa hai chủng nấm men đóng vai trò quan trọng hơn. Qua sơ đồ hình 3.6a,b,c cho thấy tỷ lệ giữa (SC:PA) : (1:4) tạo ra nồng độ cồn cao nhất là 3,93% và mật độ tế bào log(cfu/Ml) đạt cao nhất là 7,16 ở tỷ lệ này hàm lượng đường khử tăng cao hơn các tỷ lệ còn lại là 51,28 ± 0,99 mg/Ml, đồng thời hàm lượng cellulose cũng giảm 31,13 ± 0,63 mg/mL(Bảng 3-PLC). Qua xử lý số liệu ANOVA (Bảng 3-PLC) cho thấy nồng độ cồn ở tỷ lệ (SC:PA) %: (1:4) khác biệt so với các tỷ lệ còn lại, tỷ lệ (SC:PA) (1:1) nồng độ cồn (3,83%),(4:1) nồng độ cồn (3,68%),(2:3) nồng độ cồn (3,67%),(3:2) nồng độ cồn (0,63%) cho thấy sự kết hợp giữa hai chủng Saccharomyces cerevisiae và Pichia anomala với tỷ lệ 1:4 đạt nồng độ cồn cao nhất. Do Saccharomyces cerevisiae (SC) là loại nấm men được sử dụng phổ biến cho lên men glucose. S. cerevisiae có các ưu điểm như : chịu được nồng độ ethanol cao, ít sản phẩm phụ, tốc độ lên men cao trong môi trường acid, chịu được acid acetic. Tuy nhiên nấm men này không có khả năng lên men đường 5 carbon cụ thể là không lên men xylose vì vậy khi kết hợp với Pichia anomala chủng nấm men vừa có khả năng sử dụng để lên men đường 5 carbon và 6 carbon và còn có khả năng 39
  74. Đồ án tốt nghiệp chịu được nồng độ và tiêu thụ cơ chất cao và với tỷ lệ cao hơn SC hơn nên nồng độ cồn cao nhất. Từ những kết quả trên cho thấy tỷ lệ nấm men (SC:PA)% (1:4) là tỷ lệ tốt nhất để lên men vỏ chuối thu bioethanol. 3.4.4 Khảo sát tỷ lệ enzyme Tỷ lệ enzyme cũng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thủy phân và lên men đồng thời (SSCF) .Đề tài tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme tới quá trình thủy phân và lên men ở các mức 0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,7%, 0,9%. Kết quả khảo sát được trình bày trong sơ đồ hình 3.9 a,b,c. 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 Nồng cồn độ (%) 0.5 0 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 Tỷ lệ enzyme Hình 3.9a. Sự thay đổi nồng độ cồn theo tỷ lệ enzyme. 40
  75. Đồ án tốt nghiệp 7.25 7.2 7.15 7.1 7.05 7 6.95 Mật Mật bào tế độ log(cfu/mL) 6.9 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 Tỷ lệ enzyme Hình 3.9b. Thay đổi mật độ tế bào theo tỷ lệ enzyme. 40 35 30 25 20 15 10 Hàm Hàm lượngmg/mL 5 0 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 Tỷ lệ enzyme Đường khử Cellulose Hình 3.9c. Sự thay đổi đường khử và cellulose theo tỷ lệ enzyme.  Nhận xét: Khi lượng enzyme cho vào tăng, tốc độ phản ứng ban đầu tăng. Khi % enzyme tăng từ 0,1% đến 0,7% thì tốc độ phản ứng tăng nhanh độ cồn từ 2,36% lên 4,07% và mật độ tế bào log (cfu/mL) tăng từ 7,042 lên 7,232 (hình 3.9b). Khi % enzyme tăng từ 0.7% đến 0.9% thì tốc độ phản ứng tăng chậm lại nồng độ cồn chỉ tăng từ 4,07% tăng lên 4,1% trong lúc này thì mật độ tế bào không chênh lệch nhiều log (cfu/mL) từ 7,232 đến 7,235. Thật vậy, khi lượng enzyme cho vào tăng thì tốc độ 41
  76. Đồ án tốt nghiệp phản ứng tăng, tuy nhiên khi lượng enzyme tăng đến một giới hạn nhất định độ cồn không tăng nữa hoặc tăng nhưng tăng rất ít. Trong giới hạn enzyme khảo sát trong nghiên cứu này, chưa thể hiện được giá trị mà enzyme tai đó không tăng nữa. Tuy nhiên cũng thể hiện được đoạn độ cồn tăng chậm trên đồ thị % enzyme từ 0,7% đến 0,9%. Do đó ta lấy tỷ lệ enzyme là 0,7% để khảo sát tiếp tốc độ khuấy đảo và pH (Bảng 4-PLC) Đối với cellulose, khi % enzyme tăng lên lượng cellulose tích tụ trong dung dịch ở thời điểm cuối giảm. Khi lượng enzyme tăng cellulose bị tiêu thụ mạnh và nồng độ cellulose còn trong dung dịch ít 37,27 ± 0,16 mg/mL(0,1%) giảm xuống còn 28,23 ± 0,44 mg/mL(0,9%).(Bảng 4-PLC) Đối với đường khử, khi % enzyme tăng từ 0,1% - 0,7% thì hàm lượng đường cũng tăng từ 16,5 ± 0,47 mg/mL lên 20,72 ± 0,57mg/mL( hình 3.9c). Khi % enzyme tăng từ 0,7% - 0,9% thì hàm lượng glucose tăng nhưng tăng nhẹ từ 20,72 ± 0.57 mg/mL lên 21,00 ± 0,75 mg/mL (Bảng 4-PLC).Điều này có thể được giải thích khi lượng enzyme tăng sẽ có nhiều enzyme tấn công vào cơ chất hơn nên glucose tạo thành tăng. Khi enzyme tấn công, những phần cellulose dễ bị tấn công như cấu trúc cellulose xốp, vô định hình sẽ bị thủy phân trước. Khi những phần cellulose này bị mất đi thì tốc độ phản ứng cũng giảm dần, khả năng tấn công của enzyme sẽ trở nên khó khăn. Vì vậy, ở giai đoạn này nếu lượng enzyme tăng lên thì nồng độ cồn cũng tăng ít cũng như không tạo nhiều glucose hơn. Đối với yếu tố này 0,7% là giá trị thích hợp, cho hiệu suất cao, nồng độ glucose cao và tiêu tốn một lượng enzyme thích hơp. 3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH Độ pH hay nồng độ ion H+ ảnh hưởng đến sản phẩm lên men. Do đó, pH của môi trường lên men sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới kết quả lên men. Đề tài tiến hành lên men. Với pH môi trường ngay khi trung hòa tức là trước khi lên men ở các mức 4.5 , 5 , 5.5. Kết quả khảo sát pH được thể hiện qua biểu đồ hình 3.8a,b,c. 42
  77. Đồ án tốt nghiệp 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 Nồng Nồng cồn độ (%) 1 0.5 0 4.5 5 5.5 pH Hình 3.10a. Sự thay đổi độ cồn theo pH. 7.3 7.25 7.2 7.15 7.1 7.05 7 6.95 Mật Mật bào tế độ log(cfu/mL) 6.9 4.5 5 5.5 pH Hình 3.10b. Thay đổi mật độ tế bào theo pH 43
  78. Đồ án tốt nghiệp 45 40 35 30 25 20 15 10 Hàm Hàm mg/mL lượng 5 0 4.5 5 5.5 pH Đường khử Cellulose Hình 3.10c.Sự thay đổi đường khử và cellulose theo pH.  Nhận xét: Khi lên men nguyên liệu có pH 5,5 thì thu được dịch có độ cồn cao nhất là 4,2%. (hình 3.10a). Nồng độ cồn tăng khi pH 4,5 (3,43%) , pH 5 (4,1%), pH 5.5 (4,2%) (hình 3.10a). Do việc làm giảm ion H+ trong môi trường tạo thuận lợi cho sự chuyển hóa đường thành rượu của nấm men. Nghiệm thức pH 4,5 có độ cồn thấp nhất (3,43%) và mật độ tế bào log(cfu/mL) là 7,041 chứng tỏ môi trường này có nồng độ ion H+ cao vượt quá mức độ bình thường đối với nấm men (Bảng 5-PLC). Môi trường lên men có pH 5 ( nồng độ cồn 4,1%) và pH 5,5 ( nồng độ cồn 4,2%) thu được nồng độ cồn chênh lệch không nhiều mật độ tế bào trong mức pH này đạt log cfu/mL là 7,179 (pH 5) và 7,209 (pH 5,5). Vì đây là vùng pH hoạt động tối ưu của nấm men (Bảng 5-PLC). Môi trường có pH 4,5 khi lên men thì có hàm lượng đường khử thấp nhất 31,47 ± 0,90 mg/mL. Môi trường có pH 5,5 có hàm lượng đường khử cao nhất là 35,21 ± 0,98 mg/mL. Và hàm lượng cellulose cũng giảm dần từ pH 4,5 (37,88 ± 0.41mg/mL) xuống còn (35,85 ± 0,53mg/mL) ở pH 5,5. (Bảng 5-PLC). Như vậy pH bằng 5,5 tối ưu cho quá trình lên men thu ethanol từ vỏ chuối. 44
  79. Đồ án tốt nghiệp 3.4.6 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy đảo Tốc độ khuấy đảo cũng ảnh hưởng đến quá trình lên men SSCF thu bioethanol. Sau đây là kết quả khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy đảo lên quá trình thủy phân và lên men đồng thời được trình bày trong biểu đồ hình 3.9a,b,c. 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 Nồng Nồng cồn độ (%) 0.5 0 50 100 150 200 Vòng/phút Hình 3.11a. Sự thay đổi độ cồn theo tốc độ khuấy đảo. 7.25 7.2 7.15 7.1 7.05 7 6.95 6.9 Mật Mật bào tế độ log(cfu/mL) 6.85 50 100 150 200 Vòng/phút Hình 3.11b. Sự thay đổi mật độ tế bào theo tốc độ khuấy đảo. 45
  80. Đồ án tốt nghiệp 50 45 40 35 30 25 20 15 10 Hàm Hàm lượngmg/mL 5 0 50 100 150 200 Vòng/phút Đường khử (mg/mL) Cellulose (mg/mL) Hình 3.11c Sự thay đổi hàm lượng đường khử và cellulose theo tốc độ khuấy đảo.  Nhận xét: Sự khuấy đảo trong lên ất cần thiết, góp phần làm tăng hiệu quả ự khấy đả ồng nhất môi trường lên men, tạ ện cho nấm men không kết lắng và tiế ới cơ chất chuyển đường thành cồn với hiệu suất cao nhất. Qua các kết quả trên và sự thay đổi như sơ đồ hình 3.9a,b,c cho thấy tốc độ khuấy đảo (vòng/phút) ảnh hưởng đến quá trình thủy phân và lên men thu ethanol. Tốc độ khuấy đảo càng mạnh thì nồng độ cồn tạo ra càng nhiều, lắc 50 vòng/phút có nồng độ cồn (3,6%), 100 vòng/phút ( 3,85%), 150 vòng/phút (4,10%), 200 vòng/phút (4,13%). Mật độ tế bào log(cfu/mL) ở từng tốc độ khuấy đảo cũng tăng dần cụ thể từ 7,000 (50 vòng/phút) đến 7,230 (200 vòng/phút) Đồng thời hàm lượng đường khử cũng tăng 19,36 ± 0,17mg/mL(50 vòng/phút) lên 29,41 ± 0.48mg/mL(200 vòng/phút) và cellulose thì giảm từ 46,41 ± 0,23mg/mL (50 vòng/phút) 39,25 ± 1,30mg/mL (200 vòng/phút) (Bảng 6-PLC). Ở tốc độ 150 vòng/phút và 200 vòng/phút thì nồng độ cồn tăng nhưng không có sự chênh lệch nhiều. Khi khuấ ể làm cho tế bào nấ ổn thương và hạn chế ế hơn làm thất thoát một lượng ethanol đáng kể nên nồng độ cồn tăng rất ít. Vì vậy ở tốc độ khuấy đảo 150 vòng/phút cho nồng độ cồn với hiệu quả tốt nhất. 46
  81. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Quá trình lên men SSCF: Từ các thí nghiệm khảo sát các yếu tố, rút ra được các thông số tối ưu cho quá trình lên men SSCF vỏ chuối:  Thời gian lên men : 45 giờ.  Nhiệt độ : 350C.  5,5.  Tỷ lệ bổ sung nấm men (SC:PA):((1:4).  Tỷ lệ enzyme bổ sung 0,7%.  Tốc độ khuấy đảo 150 vòng/phút. 4.2 Kiến nghị Những kết quả từ nghiên cứu này cũng phần nào chứng minh được tính khả thi của quá trình thủy phân và lên men đồng thời. Tuy nhiên nghiên cứu này vẫn còn nhiều hạn chế. Việc nghiên cứu kỹ hơn quá trình thủy phân và lên men đồng thời là rất có ý nghĩa đối với việc sản xuất bioethanol. Cần tiếp tục nghiên cứu cụ thể là: Cần phải phân tích số lượng nấm men để kiểm tra xem lượng đường mất đi có phải do nấm men sử dụng lên men kỵ khí hay để tăng sinh khối nhằm điều chỉnh lại khả năng lên men của nấm men trong giai đoạn nhân giống và tăng hoạt lực nấm men. Trong điều kiện thời gian hạn hẹp nên quá trình chỉ nghiên cứu thời gian lên men tới 75 giờ nên cần kéo dài thêm thời gian lên men để nấm men sử dụng hết nguồn đường. Bổ sung chất dinh dưỡng khoáng đa vi lượng để nâng cao quá trình lên men. Tìm ra chủng nấm men có khả năng sử dụng đường 5 carbon thay thế cho Pichia anomala kết hợp với chủng Saccharomyces cerevisiae để lên men bioethanol. 47
  82. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bước đầu khảo sát tiền xử lý và thủy phân vỏ cacao để làm nguyên liệu cho quá trình lên men bioethanol bằng saccharomyces cerevisiae 2. Phạm Nữ Sơn Giang (2014),Khảo sát tiền xử lý vỏ chuối (Musa padisiaca) bằng dung môi hữu cơ và ứng dụng trong lên men bioethanol”, Phạm Nữ Sơn Giang 2014. 3. ển, nghiên cứu khoa học, Viện sinh học Nhiệt Đới, TP. Hồ . [13] 4. ệ (2013), , Nghiên cứu khoa học, đại học Nông Lâm TP. Hồ [12] TÀI LIỆU TIẾNG ANH 5. African Journal of Microbiology Research, 2011, 5(6), 586 [15] 6. Biofuel Production”, Industrial & Engineering Chemistry Research, 48, 3713-3729. [4] 7. BC, Lee H Genetic improvement of Saccharomyces cerevisiae for xylose fermentation Biotechnol Adv, 2007, 25, 425-441. [6] 8. Dian Nasir Azam, Sami Ullah and Farheen Sadullah, Akhlaq Ahma, Mir Sadiq Shah and Nisar Khan (2011), “Production of bioethanol through enzymatic hydrolysis of potato”, African Journal of Biotechnology, 11(25), 6739 -6743. 9. Graeme M.Walker Bioethanol: Science and technology of fuel alcohol, 2010, 8 – 9. 10. Hossain, A.B.M.S, Ahmed, S. A, Ahmed M. Alshammari, Faris M. A. Adnan, Annuar, M. S. M, Hadeel Musfa1 and Norah Hammad Bioethanol fuel production from rotten banana as anenvironmenl waste management and susinable energy Jing Zhao, Liming Xia (2010), “Bioconversion of corn 48
  83. Đồ án tốt nghiệp stover hydrolysate to ethanol by a recombinant yeast strain”, Fuel Processing Technology, 4(91), 1807-1811. 11. Hossain, A.B.M.S, Ahmed, S. A, Ahmed M. Alshammari, Faris M. A. Adnan, Annuar, M. S. M, Hadeel Musfa1 and Norah Hammad Bioethanol fuel production from rotten banana as anenvironmenl waste management and susinable energy African Journal of Microbiology Research, 2011, 5(6), 586- 598. 12. Huseyin Serdar Yucesu, Tolga Topgul, Can Cinar and Melih Okur (2006), “Effect Of Ethanol Gasoline Blends On Engine Performance And Exhaust Emissions In Different Compression Ratios”, Applied Thermal Engineering, 26, 2272-2278. [3] 13. Parveen Kumar, Diane M. Barrett, Michael J. Delwiche, and Pieter Stroeve (2009), “Methods for Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis” . 14. Jing Zhao, Liming Xia (2010), “Bioconversion of corn stover hydrolysate to ethanol by a recombinant yeast strain”, Fuel Processing Technology, 4(91), 1807–1811. [2] 15. Karhumaa K, W.B, Hahn-Hagerdal B, Boles E, Gorwa-Grauslund MF Co- utilization of L-arabinose and D-xylose by laboratory and industrial Saccharomyces cerevisiae strains Microb Cell Fact, 2006, 5:18. 16. Marín, F.R., Soler-Rivas, C., Benavente-García, O., Castillo, J., Pérez- Alvarez, J.A., 2007. By-products from different citrus processes as a source of customized functional fibres Food Chemistry, 100, 736–741. 17. Palvira, Tomás-Pejó, Ballesteros, Negro (2010), “Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis”, A review Bioresource Technology, 101, 4851-4861. [5] 18. Päivi Ylitervo Production of ethanol and biomass from orange peel waste by Mucor indicus, 2008 49
  84. Đồ án tốt nghiệp 19. R. Arumugam & M.Manikandan Production of ethanol from mango (Mangifera indica L.) peel by Saccharomyces cerevisiae, 2011, vol10(20), 712-749. 20. Graeme M.Walker Bioethanol: Science and technology of fuel alcohol, 2010, 8-9. [7] TÀI LIỆU TỪ TRANG WEB 21. Bước đột phá mới về năng lượng, 34 22. Bạch Hoàn, Tháo chạ ọc, te/580204/thao-chay-khoi-xang-sinh-hoc [9] 23. Luận văn nghiên cứu sản xuất nectar chuối, tai-nghien-cuu-san-xuat-nectar-chuoi-37922/ 24. ệu sinh học - nguồn năng lượng tái tạo trong tương lai, 2005/1749/ [1] 25. Nhiên liệu sinh học, 26. Tình hình sản xuất và tiêu thụ Ethanol trên thế giới, the-gioi/%22 27. Trần Ngọc Toản, Nhiên liệu sinh học và hiện trạng sản xuất, sử ệt Nam, www.nangluongvietnam.vn/news/vn/dien-hat-nhan-nang-luong-tai-tao. [8]. 50
  85. Đồ án tốt nghiệp 1. Cách dựng đường chuẩn glucose - Cân chính xác 1 g glucose hòa tan trong 200 mL nước cất. - Hút lần lượt 1, 2, 3, 4, 5 mL dung dịch đường glucose vào 5 bình định mức 50 mL, thêm nước cất đến vạch mức. Các dung dịch mới pha này có nồng độ glucose lần lượt là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/mL. - Hút 1 mL dung dịch glucose ở mỗi nồng độ vào 5 ống nghiêm, thêm 3mL thuốc thử DNS. - Mẫu trắng: Hút 1 mL nước cất cho vào ống nghiệm, thêm 3 mL thuốc thử DNS. - Nung cách thủy hỗn hợp trong 15-20 phút. Làm lạnh nhanh rồi đo OD ở bước sóng 540 nm. - Từ giá trị OD, vẽ đồ thị đường chuẩn glucose. Đồ thị đường chuẩn glucose 0.9 y = 1.863x - 0.1153 0.8 R² = 0.9822 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Hàm Hàm lượng đường khử (mg/mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Mật độ quang OD 1
  86. Đồ án tốt nghiệp 2. Cách dựng đường chuẩn cellulose. - Dung dịch cellulose chuẩn (20 mg/mL): cân chính xác 1g cellulose hòa tan trong 50 mL nước cất. - Hút lần lượt 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 mL dung dịch cellulose vào 6 bình định mức 100 mL, thêm nước cất đến vạch mức. Các dung dịch mới pha này có nồng độ cellulose lần lượt là 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 mg/mL. - Cho 5mL thuốc thử anthrone vào mỗi ống nghiệm chứa 0.5mL dung dịch trên. - Mẫu trắng: Hút 0.5 mL nước cất cho vào ống nghiệm, thêm 5mL thuốc thử anthrone. - Nung cách thủy trong 5 phút. Làm lạnh nhanh rồi đi đo OD ở bước sóng 630nm. - Từ giá trị OD, vẽ đồ thị đường chuẩn cellulose. Đồ thị đường chuẩn cellulose 2 y = 1.3455x + 0.0069 1.8 R² = 0.992 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 Hàm lượng cellulose (mg/mL) 0.2 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 Mật độ quang OD 2
  87. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU 1.1. Khảo sát thời gian lên men. 1.1.1 Hàm lượng đường khử. ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 12649,4 15 843,291 1678,93 0,0000 Within groups 16,0729 32 0,502279 Total (Corr.) 12665,4 47 Multiple Range Tests Thời gian( giờ) Count Mean Homogeneous Groups 0 3 11,8787 X 5 3 18,2517 X 10 3 18,624 X 15 3 23,0793 X 20 3 30,737 X 25 3 34,3157 X 30 3 34,405 X 35 3 39,4683 X 40 3 46,5897 X 45 3 50,7763 X 50 3 51,0807 XX 55 3 51,957 X 60 3 57,7723 X 65 3 59,1143 X 70 3 62,8517 X 75 3 61,058 X 3
  88. Đồ án tốt nghiệp 1.1.2 Hàm lượng cellulose ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 9289.07 15 619.271 1203.53 0.0000 Within groups 16.4654 32 0.514544 Total (Corr.) 9305.54 47 Multiple Range Tests Thời gian(giờ) Count Mean Homogeneous Groups 75 3 31.2 X 70 3 37.3433 X 65 3 38.0867 XX 60 3 38.8533 X 55 3 42.4467 X 50 3 44.8467 X 45 3 44.8733 X 40 3 45.89 X 35 3 51.1133 X 30 3 54.2133 X 25 3 61.4233 X 20 3 61.7567 X 10 3 67.4633 X 15 3 68.58 X 0 3 75.9167 X 5 3 76.09 X 4