›

Đồ án Phân lập nấm Paecilomyces spp và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được

pdf 133 trang thiennha21 12/04/2022 4910
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập nấm Paecilomyces spp và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_phan_lap_nam_paecilomyces_spp_va_xac_dinh_mot_so_dac_d.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập nấm Paecilomyces spp và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM Paecilomyces spp VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, KHẢ NĂNG PHỊNG TRỪ BỌ PHẤN TRẮNG, TUYẾN TRÙNG CỦA CÁC CHỦNG THU NHẬN ĐƯỢC Ngành: Cơng nghệ sinh học Chuyên ngành: Cơng nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện: Phùng Lê Kim Yến MSSV: 1051110195 Lớp: 10DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 7/2014
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kì cơng trình nào trước đây. Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện Phùng Lê Kim Yến
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Lời cám ơn đầu tiên em xin chân thành gửi đến tập thể Quý thầy cơ khoa Cơng nghệ Sinh học – Thực phẩm – Mơi trường, trường Đại Học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy kiến thức và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tơi trong suốt 4 năm đại học. Đặc biệt em xin gửi lời cám ơn chân thành đến cơ Nguyễn Thị Hai người đã tận tình dẫn dắt, động viên, tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ, hướng dẫn em cĩ những hiểu biết nhiều hơn về kiến thức chuyên ngành để em cĩ thể hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp. Em xin gửi lời cám ơn đến thầy Thành, người đã nhiệt tình hỗ trợ về thiết bị, vật tư giúp đỡ em hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp. Em xin cám ơn anh Ngơ Văn Bình đã tạo điều kiện, giúp đỡ em cĩ thể thực hiện các thí nghiệm để hồn thành đồ án tốt nghiệp. Em cũng cám ơn các bạn ở phịng thí nghiệm và đặc biệt là những người bạn trong nhĩm ESS đã động viên, giúp đỡ tơi. Và lời cám ơn chân thành, sâu sắc nhất con xin dành cho Ba Mẹ, người đã theo dõi, ủng hộ và nuơi con khơn lớn đến ngày hơm nay. Cám ơn gia đình đã luơn chia sẻ và tạo mọi điều kiện để con hồn thành từng chặng đường học vấn của mình.
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1. 1. Phân lập và tuyển chọn nấm Paecilomyces spp 3 1.1.1. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces 3 1.1.1.1 Phân loại khoa học 3 1.1.1.2 Đặc điểm sinh thái 3 1.1.1.3. Đặc điểm hình thái 4 1.1.1.4. Độc tố của nấm Paecilomyces spp 6 1.1.1.5. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của Paecilomyces spp đối với ký chủ 7 1.1.2. Các chủng nấm Paecilomyces spp. đã được phân lập 11 1.1.3. Một số ứng dụng của nấm Paecilomyces spp. vào thực tiễn đời sống 13 1.1.3.1. Sản xuất enzyme 13 1.1.3.2. Sản xuất kháng sinh và hợp chất thứ cấp 14 1.1.3.3. Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật 15 1.1.3.4. Xứ lý mơi trường 15 1.1.4. Một số sản phẩm của Paecilomyces spp 16 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp 17 1.3. Các nghiên cứu về sử dụng Paecilomyces spp. trong phịng trừ bọ phấn và tuyến trùng gây hại 20 1.3.1. Tổng quan về bọ phấn trắng 20 1.3.1.1. Phân loại khoa học 20 1.3.1.2. Đặc điểm sinh thái 21 1.3.1.3. Đặc điểm hình thái 22 1.3.1.4. Tổng quan về bệnh vàng lá do bọ phấn trắng gây ra 23 1.3.2. Tổng quan về tuyến trùng 24 1.3.2.1. Phân loại khoa học 25 1.3.2.2. Đặc điểm sinh thái 25 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.3.2.3. Tổng quan về bệnh sần rễ do tuyến trùng gây ra 26 1.3.3. Đánh giá khả năng ký sinh của chủng Paecilomyces spp 28 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 34 2.2. Thiết bị - hĩa chất - vật liệu nghiên cứu 34 2.2.1 Thiết bị - hĩa chất 34 2.2.1.1 Thiết bị 34 2.2.1.2 Hĩa chất 34 2.2.2. Vật liệu 35 2.2.3. Các mơi trường sử dụng 35 2.2.3.1 Mơi trường phân lập ban đầu PDA (Potato D - Glucose Agar) 35 2.2.3.2 Mơi trường thử nghiệm hoạt tính chitinase, protase sử dụng chitin và casein làm cơ chất 35 2.2.3.3 Mơi trường Sauboraud + Khống chất 36 2.2.3.4 Mơi trường Czapeck - Dox 36 2.2.3.5 Mơi trường Malt agar 36 2.3. Phương pháp nghiên cứu 37 2.3.1. Phân lập nấm Paecilomyces spp 37 2.3.1.1. Phân lập nấm Paecilomyces spp. từ chế phẩm 37 2.3.1.2. Phân lập nấm Paecilomyces spp. từ bọ phấn trắng 37 2.3.2. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của Peacilomyces spp 38 2.3.2.1. Xác định hoạt tính enzyme chitinase 38 2.3.2.2. Xác định hoạt tính enzyme protease 38 2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố mơi trường đến sự phát triển của của nấm 39 2.3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces 39 2.3.3.2. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. trong các mơi trường khác nhau 40 2.3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp 41 2.3.4. Đánh giá khả năng ký sinh bọ phấn của 2 chủng Paecilomyces sp1. và sp2. 41 2.3.5. Đánh giá khả năng ký sinh con cái và tuyến trùng Meloidogyne spp. 42 2.4. Phương pháp xử lý số liệu 42 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1. Phân lập nấm 44 3.1.1. Phân lập nấm cĩ nguồn gốc từ chế phẩm xử lý đất 44 3.1.2. Phân lập nấm Paecilomyces sp2. 45 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng nấm Paecilomyces phân lập được 46 3.3. Định tính hệ enzyme ngoại bào cĩ khả năng đối kháng tuyến trùng và bọ phấn 50 3.3.1. Khả năng tổng hợp enzyme protease của 2 chủng nấm Paecilomyces50 3.3.2. Khả năng tổng hợp enzyme chitinase của 2 chủng nấm Paecilomyces sp1. và sp2. 52 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố mơi trường sự phát triển của nấm . 54 3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển nấm của chủng nấm Paecilomyces spp 54 3.4.1.1. Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp1. 54 3.4.1.2. Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp2. 56 3.4.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp 58 3.4.2.1. Ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp1. 58 3.4.2.2. Ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp2. 61 3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm 64 3.4.3.1. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp1 64 3.4.3.2. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp2 66 3.5. Khả năng ký sinh bọ phấn của 2 chủng Paecilomyces sp1. và sp2. 68 3.6. Khả năng ký sinh con cái và tuyến trùng Meloidogyne spp của 2 chủng nấm Paecilomyces 70 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72 4.1. Kết luận 72 4.2. Đề nghị 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PDA: Potato D - Glucose Agar SB: Sabouraud + KC MA: Malt CZA: Czapeck - Dox iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG STT BẢNG NỘI DUNG TRANG 1 1.1 Hiệu quả phịng trừ của các chủng nấm 29 - 31 Paecilomyces spp. đối với tuyến trùng hại thực vật. 2 3.1 So sánh hình thái của chủng nấm Paecilomyces sp1. 45 - 46 3 3.2 So sánh hình thái của chủng nấm Paecilomyces sp2. 47 - 48 4 3.3 Kết quả sinh tổng hợp enzyme protease của 2 chủng 49 nấm Paecilomyces sp1. và sp2. 5 3.4 Kết quả sinh tổng hợp enzyme chitinase của 2 51 chủng nấm Paecilomycessp1. và sp2. 6 3.5 Sự ảnh hưởng của pH đến đường kính nấm 54 Paecilomyces sp1. qua các ngày 7 3.6 Sự ảnh hưởng của pH đến đường kính nấm 56 Paecilomyces sp2. qua các ngày 8 3.7 Ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy đến sự phát 58 triển đường kính nấm Paecilomyces sp1. qua các ngày. 9 3.8 Ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy đến sự phát 61 triển đường kính nấm Paecilomyces sp2. qua các ngày. 10 3.9 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát 63 triển đường kính của Paecilomyces sp1. 11 3.10 Số liệu sự phát triển của nấm dưới các điều kiện 66 v
  9. Đồ án tốt nghiệp chiếu sáng qua các ngày nuơi cấy. 12 3.11 Hiệu lực diệt bọ phấn 67 13 3.12 Đánh giá khả năng ký sinh tuyến trùng của 2 chủng 69 Paecilomycessp1. và sp2. DANH MỤC CÁC HÌNH STT HÌNH NỘI DUNG TRANG 1 1.1 Đặc điểm đại thể của Paecilomyces spp. 5 Đặc điểm vi thể của Paecilomyces spp. 2 1.2 6 3 1.3 Cấu tạo hĩa học của độc tố paecilotoxin 7 Bio Nematon - Sản phẩm của cơng ty T.Stanes cĩ khả 4 1.4 16 năng trừ tuyến trùng 5 1.5 Sản phẩm trừ bọ phấn 17 Sự ảnh hưởng của nhiệt độ mơi trường đến sự phát 6 1.6 19 triển của tản nấm Paecilomyces 7 1.7 Các giai đoạn trong vịng đời của bọ phấn trắng 21 Đặc điểm tuyến trùng hại rễ được quan sát dưới kính 8 1.8 25 hiển vi quang học ×10 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp Vịng đời của tuyến trùng hại rễ 9 1.9 27 10 2.1 Chế phẩm xử lý đất 37 11 2.2 Các lọ thủy tinh dùng để bố trí thí nghiệm 38 Dịch chế phẩm được trang ra đĩa PDA ở nồng độpha -4 12 3.1 lỗng 10 vào ngày thứ 3. 43 Nấm nghi ngờ mọc lên từ bọ phấn trên mơi trường 13 3.2 44 PDA. 14 3.3 Sự phân giải casein của chủng Paecilomyces sp1. 50 15 3.4 Sự phân giải casein của chủng Paecilomyces sp2. 50 16 3.5 Sự phân giải chitin của chủng Paecilomyces sp1. 52 17 3.6 Sự phân giải chitin của chủng Paecilomyces sp2. 52 Sự phát triển của Paecilomyces sp1. trên mơi trường cĩ 18 3.7 53 pH khác nhau ở 14 ngày nuơi cấy. Đường kính tản nấm chủng Paecilomyces sp1. ở các 19 3.8 54 pH mơi trường 5, 6 ,7, 8 qua các ngày nuơi cấy 20 3.9 Nấm Paecilomyces sp2. ở pH 5,6,7,8 14 ngày sau cấy 55 Đường kính tản nấm chủng Paecilomyces sp2. ở các 21 3.10 56 pH mơi trường 5, 6 ,7, 8 qua các ngày nuơi cấy vii
  11. Đồ án tốt nghiệp Nấm Paecilomyces sp1. ở ngày thứ 14 sau khi cấy 22 3.11 57 Sự phát triển của Paecilomyces sp1. trên các mơi 23 3.12 trường khác nhau qua các ngày. 59 24 3.13 Nấm Paecilomyces sp2. ở ngày thứ 14 sau khi cấy 60 Sự phát triển của Paecilomyces sp2. trên các mơi 25 3.14 62 trường khác nhau qua các ngày. 26 3.15 Tản nấm Paecilomyces sp1. ở ngày thứ 14 sau nuơi cấy 63 27 Sự phát triển của Paecilomyces sp1. ở các điều kiện 3.16 64 chiếu sáng khác nhau 28 3.17 Tản nấm Paecilomyces sp2. ở ngày thứ 14 sau nuơi cấy 65 Sự phát triển của Paecilomyces sp2. ở các điều kiện 29 3.18 66 chiếu sáng khác nhau Mẫu bọ phấn khơng bị ký sinh được soi bằng kính hiển 30 3.19 vi quang học 68 31 3.20 Mẫu tuyến trùng được soi bằng kính hiển vi quang học 69 Tuyến trùng được soi bằng kính hiển vi sau khi bị gây 32 3.21 nhiễm bởi nấm Paecilomyces sp2. 70 viii
  12. Đồ án tốt nghiệp 1
  13. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam là đất nước của nền nơng nghiệp và nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên thích hợp cho nhiều mầm bệnh sinh sơi nảy nở. Trong số đĩ cĩ bệnh héo lá do bọ phấn trắng và bệnh sần rễ do tuyến trùng gây ra. Hai mầm bệnh ấy đang mang lại những tổn thất nặng nề về sản lượng nơng nghiệp hiện nay. Vì vậy, việc tìm ra giải pháp để kiểm sốt hai tác nhân gây bệnh này rất quan trọng. Đa số người nơng dân hiện nay thường dùng các loại thuốc hĩa học để phịng trừ các lồi gây hại này. Tuy nhiên, thuốc hĩa học khơng những để lại tồn lưu cao trong nơng san3anh3 hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng, đến mơi trường sống mà cịn tăng tính kháng thuốc của sâu hại, làm cho việc phịng trừ ngay càng khĩ khăn hơn. Vì vậy, hiện nay người ta đang tìm kiếm các tác nhân sinh học để sử dụng thay thế một phần hoặc hồn tồn thuốc hĩa học trong quản lý các lồi sâu bệnh và tuyến trùng gây hại. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu ở các nước trên thế giới như Úc, Brasil, Mỹ, Pháp, Colombia, Venezuela đã cho thấy việc sử dụng các loại nấm ký sinh cơn trùng, tuyến trùng trong phịng trừ các lồi gây hại đã mang lại hiệu quả cao (Burges H. D., 1998; Butt T. M and Copping L., 2000). Trong đĩ, Paecilomyces là một trong những lồi nấm tiềm năng đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới. Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về lồi này vẫn cịn khá hạn chế. Xuất phát từ vấn đề trên, sinh viên quyết định chọn nghiên cứu đề tài: "Phân lập nấm Paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phịng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được". 2. Mục đích nghiên cứu Phân lập được các chủng Paecilomyces spp. và bước đầu đánh giá khả năng ký sinh của các chủng Paecilomyces spp. phân lập được trên bọ phấn trắng, tuyến trùng nhằm phịng trừ bệnh hại thực vật. 1
  14. Đồ án tốt nghiệp 3. Nội dung nghiên cứu − Phân lập các chủng Paecilomyces từ chế phẩm và bọ phấn trắng thu thập được − Định tính hệ enzyme ngoại bào cĩ khả năng đối kháng tuyến trùng và bọ phấn trắng − Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. phân lập được − Đánh giá khả năng ký sinh bọ phấn và tuyến trùng của nấm Paecilomyces spp. phân lập được 2
  15. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1. 1. Phân lập và tuyển chọn nấm Paecilomyces spp. 1.1.1. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces 1.1.1.1 Phân loại khoa học Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Paecilomyces Chi Paecilomyces do Bainier mơ tả vào 1907, sau đĩ được nhiều tác giả chấp nhận chi mới này và bổ sung nhiều lồi mới. Chuyên luận về chi nấm này của Samson (1974) chấp nhận 16 lồi đã mơ tả, đồng thời tổ hợp mới 9 lồi và đề nghị 6 lồi mới, tất cả tập hợp trong 2 nhĩm lồi. Nhĩm lồi thứ nhất là nhĩm lồi Paecilomyces cĩ các giai đoạn bào tử túi thuộc các chi Byssochlamys Westling, Talaromyces C.R.Benjamin và Thermoascus Miehe, gồm các lồi ưa nhiệt ơn hịa (mesophile), chịu nhiệt và ưa nhiệt, cĩ khuẩn lạc màu nâu vàng hay các màu nâu khác. Nhĩm lồi thứ hai là nhĩm lồi Isarioides gồm các lồi khơng cĩ giai đoạn bào tử túi, ưa nhiệt ơn hịa và cĩ khuẩn lạc màu tím hồng, màu lục và màu vàng. Nhiều lồi trong nhĩm hai này ký sinh gây bệnh cơn trùng. 1.1.1.2 Đặc điểm sinh thái Nấm Paecilomyces spp. cĩ rất nhiều lồi, cĩ phổ ký sinh cơn trùng rất rộng, cả ở vùng nhiệt đới và ơn đới (Trần Văn Mão, 2002). Ngồi ra, cĩ thể tìm thấy lồi nấm này ở các loại đất nơng nghiệp (Brand et al., 2010). Chúng hiện diện ở những nơi khá ẩm ướt, trong đất, khơng khí, trong phịng thí nghiệm hay ngồi tự nhiên. Ký chủ của nấm bao gồm hơn 25 họ cơn trùng và nhiều loại ve khác nhau. Trong đĩ, những lồi ký chủ là cơn trùng dễ bị nhiễm nấm đĩ là: bọ phấn trắng, rệp, bướm đêm ; cịn những lồi ký chủ là ve thì cĩ: ve nâu, ve đỏ châu Âu Cịn đối với ký chủ là tuyến trùng thì thường phân lập được chủng nấm Paecilomyces lilacinus, 3
  16. Đồ án tốt nghiệp một lồi cĩ trong đất và thảm thực vật (Jatala, 1986). Trong nghiên cứu của Eng (2001), cĩ 82,9% trong số 41 nơng trại được khảo sát ở Sarawalk cĩ sự hiện diện của P.lilacinus, mặc dù người ta đã sử dụng các loại thuốc diệt nấm. Từ đĩ cĩ thể nhận thấy P.lilacinus cĩ khả năng thích ứng cao với điều kiện sống, cĩ phạm vi thích ứng rộng và cĩ khả năng phát triển tốt ở 26 – 300C. Chi Paecilomyces cĩ nhiều lồi nhưng chủ yếu là hai lồi Paecilomyces lilacinus và Paecilomyce variotii. Một vài lồi Paecilomyces spp. cĩ khả năng chịu nhiệt như: nhiệt độ tối ưu của Paecilomyces fulvus là 450C, Paecilomyces crustaceous là dưới 550C (Samson, 1974). Hai lồi nấm chịu nhiệt trên cĩ khả năng làm hư hỏng thực phẩm nhưng cũng là lồi quan trọng ứng dụng trong cơng nghiệp sản xuất các enzyme chịu nhiệt. Những nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều lồi Paecilomyces đem lại nhiều hợp chất cĩ hoạt tính sinh học hữu ích (Liang et al., 2003) . Một số lồi Paecilomyces spp. phổ biến: − Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết cơn trùng. − Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất. − Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, cơn trùng. − Paecilomyces lilacinus phân lập được từ xác bã hữu cơ, trứng tuyến trùng và đơi khi cịn ở cơn trùng chết, rừng cao su. (Crop Protection Compennium, 2002). 1.1.1.3. Đặc điểm hình thái a. Đặc điểm đại thể Paecilomyces spp. là loại nấm sợi được tìm thấy trong đất hay xác cơn trùng. Khi được nuơi cấy trong mơi trường nhân tạo nấm thường phát triển khá chậm, cĩ dạng thảm nhung, dạng bĩ sợi và thường lúc đầu cĩ màu trắng sau đĩ khi bào tử phát triển thì chuyển sang màu hồng nhạt, màu tím hay màu lục nhạt (nên thường được gọi là nấm tím) tùy vào từng lồi. Cũng cĩ lồi màu nâu hay vàng sẫm. Sợi nấm mềm, cĩ vách, trong suốt và rộng từ 2,5 - 4 µm (Wikipedia). Khuẩn lạc thường 4
  17. Đồ án tốt nghiệp mọc theo hình trịn đồng tâm. Cĩ thể phân biệt các lồi khác nhau của Paecilomyces thơng qua hình thái đại thể và vi thể. Hình 1.1. Đặc điểm đại thể của Paecilomyces spp. (Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp) b. Đặc điểm vi thể Cuống bào tử đính thường phân nhánh và mức độ phân nhánh của nấm Paecilomyces spp. thường lớn hơn nấm mốc xanh Penicillium spp. Cuống bào tử hình thành từ phần gốc hay giữa sợi nấm, dài 400 - 600 µm. Paecilomyces spp. cĩ thể bình trên đầu của cuống với kích thước 3 - 4 × 400 - 600 µm. Thể bình nhỏ, phồng lên ở phần gốc, thon dài, nhỏ và uốn cong ở phần đầu. Thường phần gốc chụm lại thành nhĩm như cây chổi tương tự như cấu trúc ở phần đuơi của cuống bào tử đính. Bào tử phân sinh đơn bào, cĩ dạng hình oval đến hình thoi, trong suốt đến nâu, cĩ hình thành dạng chuỗi, bề mặt nhẵn hoặc cĩ gai (Trần Văn Mão, 2002). Giá bào tử trần, đơn độc hoặc bĩ thành giá, phân nhánh khơng đều hoặc thành vịng. Nhánh mang ở đỉnh thể bình mọc thành vịng. Thể bình đơi khi đơn độc trên các sợi nấm khơng phân hĩa. Thể bình gồm phần gốc hình trụ hoặc hình gần trứng và phần ngọn thon nhỏ đột ngột thành một cổ dài. Bào tử trần thuộc tip phialoconidi (tip cơ bản euconidi), khơng ngăn vách, khơng màu hoặc màu nhạt, 5
  18. Đồ án tốt nghiệp nhẵn hoặc cĩ gai, thành chuỗi gốc non. Các chuỗi bào tử trần tách xa nhau, ít khi tụ họp thành khối. Hình 1.2. Đặc điểm vi thể của Paecilomyces spp. (Nguồn: 1.1.1.4. Độc tố của nấm Paecilomyces spp. Độc tố chính của nấm Paecilomyces spp. là paecilotoxin (leucinostatins), là một trong các tác nhân gây ra cái chết cho kí chủ. Paecilotoxin cĩ cấu trúc cực kỳ phức tạp, là một chuỗi peptide thẳng gồm nhiều acid béo chưa bão hịa ở đầu N và amine ở đầu C. Paecilotoxin cĩ pháp danh hĩa học là (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-1- [[(1S)-1-[2[2-(3-arbamoylpropylcarbomoyl)propan-2-ylcarbamoyl] propan-2- ylcarbamoy]-3-methylbutyl] carbomoyl]-3-methyl-butyl]carbomoyl]propan-2- ycarbomoyl]-2-hydroxy-3-methyl-butul] carbomyl]-5-hydroxy-3-methyl-7-oxo- nonyl]-4-methyl-1-[(E,4S)-4-methylhex-2-enoyl] pyrrolidin-2-carboxamide. (Nevalainen Helena, 1977). Sản phẩm của paecilotoxin cĩ rất nhiều dạng, nhưng khá giống nhau ở mỗi chủng, thường thì độc tố chính là Paecilotoxin A hoặc Paecilotoxin B. Tùy từng lồi khác nhau mà cĩ sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriubin, viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hố thứ cấp này cĩ thể gây ra tác động diệt tuyến trùng. 6
  19. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Cấu tạo hĩa học của độc tố paecilotoxin. 1.1.1.5. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của Paecilomyces spp. đối với ký chủ a. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp. đối với bọ phấn trắng Chu kỳ sống của Paecilomyces spp. cĩ thể chia làm 3 giai đoạn: đầu tiên các bào tử sẽ tiếp xúc với cơn trùng qua lớp vỏ và lớp chân lơng. Các bào tử bám váo lớp vỏ của cơn trùng, nảy mầm và phát triển một ống mầm trong 8 - 16 giờ. Ống mầm phát triển dưới dạng một vịi bám xuyên qua biểu bì cơn trùng và đi vào trong xoang máu. Vịi bám là một tế bào cĩ kích thước gấp 2 - 3 lần bào tử, cĩ dịch nhầy để bám vào vỏ cơn trùng. Sự xâm nhập của nấm đạt được bằng cách tiết ra hỗn hợp enzyme bao gồm chitinase, protease và áp lực cơ học. Sau khi tế bào đơn nảy mầm, bào tử sẽ xâm nhập và lưu thơng trong xoang máu của cơn trùng, nhân lên, và sử dụng chất dự trữ trong cơ thể cơn trùng để sinh trưởng và sinh sản. Các sợi nấm phân nhánh tạo thành một mạng lưới chằng chịt trong cơ thể cơn trùng. Paecilomyces spp. sản sinh ra các hợp chất, phá bỏ hệ thống miễn dịch của cơn trùng, cạnh tranh với các vi sinh vật tiềm tàng, giết chết vật chủ trong 7 - 14 ngày. Cuối cùng sau khi ký chủ chết, nấm sẽ lan ra khỏi biểu bì rồi bao lấy cơ thể của cơn trùng và phát triển thành đảm bào tử. Khi gặp điều kiện phù hợp sẽ sản sinh ra bào tử, bào tử sẽ được phát tán rồi lây nhiễm cho các vi sinh vật khác. Tuy nhiên, 7
  20. Đồ án tốt nghiệp chu kỳ sống được hồn thành trong điều kiện phải thích hợp, trong khoảng 48 - 72 giờ và khơng cĩ sự cĩ mặt của vi sinh vật hoại sinh. Thơng thường đối với các loại bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn hay do virus thì chúng lây truyền thơng qua đường ruột hay đường thức ăn, nhưng đối với nguồn bệnh là vi nấm thì chủ yếu là do sự tiếp xúc trực tiếp hay qua trung gian truyền bệnh. Trung gian đĩ cĩ thể là những lồi ký sinh hay cơn trùng ăn thịt. Nấm Paecilomyces spp. tấn cơng vào xoang máu của bọ phấn thơng qua lớp biểu bì hoặc đường miệng. Bọ phấn chết là sự kết hợp của nhiều yếu tố như tổn thương mơ cơ do sự xâm chiếm, suy giảm nguồn dinh dưỡng và nhiễm độc tố do nấm tiết ra khi ở trong cơ thể cơn trùng. Quá trình bám của bào tử nấm vào cơ thể của cơn trùng là một quá trình thụ động nhờ giĩ và nước. Đầu tiên bào tử của nấm sẽ bám lên thành biểu bì. Bào tử của nấm cĩ một lớp bên ngồi là bĩ sợi đan xen là các đuơi kị nước. Độ bám dính của bào tử trên bề mặt biểu bì một phần là nhờ các đuơi kị nước. Lectins, một loại cacborhydrate glycoprotein được phát hiện cĩ trên bào tử, giúp cho việc bám vào bề mặt biểu bì cơn trùng dễ hơn. Khi đạt tới điều kiện thích hợp bào tử sẽ nảy mầm và tăng trưởng nhanh chĩng với sự tác động của các điều kiện sẵn cĩ của nước, chất dinh dưỡng, oxy cũng như pH, nhiệt độ và bởi sự tác động của hợp chất độc tố trên bề mặt cơn trùng. Nấm nảy mầm trong phạm vi cĩ đủ nguồn Carbon và Nitơ. Nấm xâm nhập vào cơn trùng bằng quá trình lây nhiễm, xâm nhập qua lớp biểu bì hay tạo áp lực cơ học nhờ giác bám. Lớp biểu bì của cơn trùng cĩ hai lớp: ngồi là epicuticle và trong là procuticle. Epicuticle cĩ cấu trúc phức tạp là một lớp mỏng khơng cĩ chitin nhưng chứa protein, phenol ổn định và được bao phủ bởi một lớp sáp cĩ chứa acid béo, lipid, sterol.Các procuticle phần lớn cĩ các sợi chitin bên trong hỗn hợp protein, lipid, quinon. Nấm cần xuyên qua lớp biểu bì vào cơ thể cơn trùng để cĩ thể lấy được chất dinh dưỡng cần cho sự tăng trưởng và sinh sản. Sự xâm nhập vào cơ thể cơn trùng bao gồm cả sự phân hủy của enzyme do nấm tiết ra và nhờ áp lực cơ học. 8
  21. Đồ án tốt nghiệp Khởi đầu cho quá trình xâm nhiễm, nấm xâm nhập tại những vị trí dễ bị tổn thương trên lớp biểu bì. Nấm sẽ xuyên qua lớp biểu bì ngồi nhờ áp lực cơ học. Bào tử nảy mầm và hình thành các giác bám trên bề mặt biểu bì. Giác bám là đầu tận cùng của ống mầm phát sinh từ bào tử. Giác bám gắn vào biểu bì cơn trùng là nhờ tương tác kị nước giữa các thành bào tử và các lipid nằm trong lớp biểu bì trên. Sau đĩ, ống mầm xuyên qua lớp biểu bì dưới, nội bì rồi vào xoang máu. Các nghiên cứu cịn cho thấy cĩ sự tham gia của các chất truyền tin nội bào như Ca2+ và cAMP (cyclicadenosine monophosphate) trong sự hình thành giác bám trong trường hợp khi lớp biểu bì cứng khĩ xuyên qua. Sau khi xâm nhập vào trong cơ thể cơn trùng, nấm thường tạo ra rất nhiều sợi nấm ngắn. Những sợi nấm này được phân tán khắp cơ thể theo dịch máu, chúng tiêu diệt dần các tế bào bạch huyết. Sau đĩ, sợi nấm xâm nhập mơ, phá hủy tất cả các tế bào bạch huyết rồi làm chết vật chủ. Sự sinh sản của nấm trước hết là sự biến đổi thành phần dịch thể làm giảm tác dụng oxy hĩa khử lympo trong máu. Do nấm sinh sản nhiều sẽ làm tắc hệ tuần hồn của cơn trùng, làm cơn trùng biếng ăn; đồng thời chất độc sinh ra làm thay đổi sinh hĩa của cơ thể và làm tê liệt thần kinh, từ đĩ làm rối loạn và mất chức năng sinh lý. Sau khi cơn trùng chết, nấm tiếp tục hoại sinh cơ thể cơn trùng rồi phát triển sợi nấm ra tồn bộ cơ thể cơn trùng và hình thành bào tử. Quá trình xâm nhập vào cơ thể cơn trùng cịn nhờ vào sự hỗ trợ mạnh mẽ của các enzyme và hệ enzyme. Một loạt các loại enzyme ngoại bào cĩ thể thủy phân các thành phần chính của lớp biểu bì cơn trùng như chitinase, lipase, esterase, lipoxygenase và ít nhất bốn loại protease khác nhau đã được ghi nhận cĩ vai trị quan trọng trong việc xâm nhiễm. Do cấu trúc phức tạp của lớp biểu bì cơn trùng nên cần cĩ sự phối hợp hoạt động của nhiều enzyme khác nhau. Trong đĩ, chitanase và endoprotease là hai enzyme giữ vai trị quan trọng nhất. 9
  22. Đồ án tốt nghiệp b. Chu kỳ sống và tác động của nấm Paecilomyces spp. tác động đối với tuyến trùng Thuật ngữ “nematophagous fungi – nấm kí sinh tuyến trùng” được dùng để mơ tả một nhĩm đa dạng các lồi nấm cĩ khả năng xâm nhiễm và ký sinh tuyến trùng. Nhiều loại vi nấm đã được phân lập từ trứng tuyến trùng sần rễ (Stirling và West, 1991). Được nghiên cứu nhiều nhất là Paecilomyces lilacinus, cĩ thể kí sinh cả trứng lẫn con cái (Siddiqui và Mahmood,1996). Cĩ hai rào cản đối với nấm kí sinh tuyến trùng khi xâm nhiễm kí chủ là lớp biểu bì ấu trùng tuổi 2 (J2) và vỏ trứng. Cĩ rất nhiều lồi Paecilomyces cĩ khả năng ký sinh tuyến trùng, trong đĩ cĩ Paecilomyces lilacinus và Paecilomyces chlamydosporia được xem là nấm kí sinh trứng tuyến trùng hiệu quả. Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình xâm nhiễm là enzyme protease và chitinase, bởi vì vỏ trứng được cấu tạo bởi ba lớp riêng biệt: một lớp vitelline bên ngồi, một lớp chitin và một lớp lipoprotein bên trong. Các thí nghiệm đã cho thấy trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm, một mạng lưới sợi nấm phân nhánh tiếp xúc với vỏ trứng, sau đĩ chúng tiết enzyme để phân hủy vỏ trứng (Llorca và Claugher, 1990) dẫn đến sự tan rã của lớp vitelline, phân hủy của lớp chitin và lipoprotein (Morton et al., 2004). Các loại nấm cĩ sự khác nhau về khả năng phân hủy vỏ trứng tuyến trùng, và quá trình xâm nhiễm được tìm thấy bị ảnh hưởng bởi kí chủ tuyến trùng (Segers et al., 1998). Sự xâm nhiễm tuyến trùng và trứng của chúng bởi các nấm khác nhau thì cĩ thể theo các phương thức khác nhau. Ban đầu, các bào tử và sợi nấm sẽ tiếp xúc với vỏ trứng. Khi bào tử nấm bám trên bề mặt kí chủ, bào tử sẽ mọc mầm xuyên qua lớp vỏ trứng. Như trong các cách xâm nhập bề mặt kí chủ của các nấm kí sinh cơn trùng khác, nấm kí sinh trứng tuyến trùng sử dụng cả cách thức hĩa học (enzyme) và cơ học. Nấm tiết ra các enzyme làm mềm lớp vỏ trứng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc mầm 10
  23. Đồ án tốt nghiệp rồi thơng qua lớp lổ thủng đĩ mầm của bào tử nấm sẽ xâm nhập vào bên trong trứng tuyến trùng (Perry và Starr, 2009). Vỏ trứng tuyến trùng cĩ chứa chitin và protein được tổ chức thành một cấu trúc sợi nhỏ và vơ định hình (Wharton, 1980), do đĩ chitinase và protease giữ một vị trí quan trọng trong quá trình xâm nhập tuyến trùng (Tikhonov et al., 2002). Để chứng minh tầm quan trọng của enzyme trong quá trình phân hủy các polymer trong trứng tuyến trùng, một nghiên cứu về các enzyme ngoại bào phân hủy các polymer này đã được thực hiện trên một chất ngoại bào (ECM - extracellular material chứa protease P32) hoặc chất kết dính được tiết ra từ nấm P.rubescens cĩ liên quan đến lectin Concanavalin A (Con A). Trong nghiên cứu đĩ, protein serine 32 kDa đã được ly trích từ P. rubescens kí sinh trứng. Sự tham gia của enzyme trong quá trình này đã được kiểm tra trên các protein vỏ trứng Globodera pallid (Llorca, 1990). Người ta cho rằng mặc dù quá trình gây bệnh phức tạp và liên quan tới nhiều yếu tố, nhưng ức chế P32 bằng hĩa chất và kháng thể đa dịng làm giảm sự nhiễm trùng và xâm nhập trứng (Llorca et al., 2002). Các lồi tương tự P. chlamydosporia cũng tiết ra enzyme protease ngoại bào (VcP1) liên quan với P32 và các enzyme tương tự từ nấm nội kí sinh (Segers et al., 1994). Trứng được xử lý với VcP1 bị xâm nhiễm dễ hơn trứng chưa được xử lý, điều này cho thấy vai trị của enzyme trong quá trình kí sinh vỏ trứng bởi nấm kí sinh trứng. 1.1.2. Các chủng nấm Paecilomyces đã được phân lập Nấm Paecilomyces spp. cĩ rất nhiều lồi trên thế giới, khoảng 83 lồi phân bố trên diện rộng, trong đĩ cĩ thể kế đến là Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces amoeneroseu, Paecilomyces javanicus, Paecilomyces tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces variotii, Paecilomyces lilacinus (Dilip K.Arora, P.D.Bridge, Deepak Bhatnagar, 2004). 11
  24. Đồ án tốt nghiệp Một số lồi quan trọng trong phịng trừ sinh học như: - Paecilomyces lilacinus Được tìm thấy đầu tiên trong trứng tuyến trùng vào năm 1966 và sau này được phát hiện ký sinh trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita ở Peru. Hiện tại, cĩ thể phân lập lồi nấm này ở trong đất và thỉnh thoảng là ở cả trong cơn trùng. Đường kính khuẩn lạc dao động trong khoảng 5 - 7cm trong 14 ngày ủ ở nhiệt độ phịng 270C ± 20C. Sợi nấm ban đầu cĩ màu trắng sau đĩ chuyển sang màu hồng khi sinh bào tử. Sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể hình bình cổ hẹp với số lượng lớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài. Các thể bình phình ra ở phần gốc và thon nhỏ lại ở cổ. Bào tử trần hình elip đến hình thoi (Samson, 1975). - Paecilomyces fumosoroseus Khuẩn lạc trên mơi trường MEA (Malt extract agar) cĩ màu xám. Sau 14 ngày đường kính khuẩn lạc đạt 15 mm. Cuống bào tử trần đơn độc, kích thước 40 - 60 × 2 - 3µm. Bào tử cĩ dạng hình trụ, kích thước 3 - 4 × 1 - 2µm và tạo thành chuỗi dài. Lồi này cĩ khả năng ký sinh trên các lồi cơn trùng. - Paecilomyces variotii Bainier Paecilomyces variotii Bainier là lồi thường gặp nhất ở khơng khí, đất và trên các sản phẩm cơng nơng nghiệp ở nước ta (D.H.Miên, 1960), cĩ khả năng sinh ra kháng sinh variotin (kháng sinh chống nấm), ngồi ra cịn tạo thành mycotoxin là acid byssochlamic và một số sản phẩm trao đổi chất khác. Thường sống hoại sinh trên các loại gỗ, đồ thuộc da, sách, đồ bằng sợi nilon hay sợi đay. Nhưng lồi nấm này cĩ khả năng gây bệnh trên người và thực vật. - Paecilomyces inflatus Khuẩn lạc trên mơi trường MEA (Malt extract agar) phát triển chậm, đường kính từ 33 - 35mm ở 14 ngày và ở nhiệt độ 280C. Khuẩn lạc mịn, mềm như bơng khi mới phân lập. Phát triển thành sợi nấm trong suốt và mịn vài ngày sau đĩ. 12
  25. Đồ án tốt nghiệp Khuẩn lạc trên PDA cũng phát triển chậm, khoảng 33 - 35mm ở 14 ngày và ở nhiệt độ 250C. Khuẩn lạc cĩ màu trắng hơi vàng nhạt. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của nấm là ở 250C. Cuống bào tử cĩ cấu trúc khơng đều thường gồm 1 - 3 thể bình trên nhánh ngắn của sợi nấm. Thể bình, bào tử: chủ yếu là các thể bình đơn cĩ cấu trúc khơng đều trên sợi nấm hoặc ngẫu nhiên cĩ 2 – 3 thể bình nằm trên sợi nấm. Thể bình cĩ dạng bình, với phần gốc phình to, phần đầu nhọn. Thể bình dài khoảng 12,8 – 2,3 µm, trong suốt và mịn. Bào tử độc lập, hình chanh. 1.1.3. Một số ứng dụng của nấm Paecilomyces spp. vào thực tiễn đời sống 1.1.3.1. Sản xuất enzyme Paecilomyces spp. được biết đến như một chủng nấm sản xuất và cung cấp nguồn enzyme tiềm năng. Paecilomyces spp. tiết ra enzyme để dễ xâm nhập vào ký chủ hơn và giúp chúng phát triển nhờ thủy phân cơ chất hay thâm chí cịn lấn át các lồi vi sinh vật khác phát triển. Đã cĩ nhiều nghiên cứu về sự sản sinh enzyme của Paecilomyces spp., nhiều nhất là về các enzyme hydrolase: protease, cellulase, dextranase Paecilomyces spp. sinh ra ba loại protease: acid, trung tính và kiềm. Các protease acid và trung tính cĩ thể ứng dụng trong cơng nghệ sản xuất bia và bánh kẹo. Protease kiềm thì ứng dụng trong cơng nghiệp thuộc da. Paecilomyces spp. thuộc nhĩm nấm Ascomycetes cĩ mặt trong đất, nước, khơng khí, gỗ, tàn dư thực vật, đất Paecilomyces spp. cịn gọi là nấm thối mềm, vì chúng cĩ khả năng phân hủy cellulose. Dextranase (α -1,6-D-glucan, 6 glucanohydrolase; EC: 3.2.1.11) cĩ nhiều ứng dụng trong y học và nền cơng nghiệp vì nĩ thủy phân dextran. Sự hiện diện của dextran cĩ nhiều tác động tiêu cực ở mức độ chế biến như mất sucrose, tăng độ nhớt của quá trình siro và phục hồi kém của sucrose. Sử dụng dextran sẽ giải quyết được các vấn đề này. Dextranase cĩ thể thủy phân hay ức chế quá trình tổng hợp glucans, 13
  26. Đồ án tốt nghiệp cĩ thể được sử dụng trong điều trị mảng bám răng. Nĩ cũng được sử dụng để tạo ra các dextran cĩ trọng lượng phân tử thấp và gây độc cho tế bào. Hơn nữa, dextranase cĩ ảnh hưởng tiêu cực đến sự tổng hợp isomaltooligosaccharides, chất ức chế hoạt động của các cơ chất cĩ lợi cho vi khuẩn đường ruột probiotic. Và loại enzyme này cũng đã được tiết ra bởi nhiều lồi nấm trong đĩ cĩ nấm Paecilomyces spp. 1.1.3.2. Sản xuất kháng sinh và hợp chất thứ cấp Paecilomyces spp. là nguồn quan trọng cho việc sản xuất các hợp chất thứ cấp. Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng một số lồi Paecilomyces spp. cĩ thể tổng hợp các hợp chất cĩ hoạt tính sinh học rất hữu ích. Fingolimod làhợp chất được tổng hợp dựa trên chất chuyển hĩa thứ cấp do nấm tổng hợp là myriocin (ISP-I), là một chất ức chế miễn dịch mạnh đã được phê duyệt bởi FDA (U.S. Food and Drug Administration) như là một loại thuốc điều trị mới cho chứng đa sơ cứng. Fingolimod đã được tổng hợp bởi nhĩm nghiên cứu Tetsuro Fujita ở Đại học Kyoto (1992). ISP-I được thu nhận từ P. cicadae. Fingolimod cĩ tiềm năng được sử dụng trong liệu pháp ghép cơ quan. Các nhà khoa học cho rằng nĩ cĩ thể ngăn ngừa mạnh các phản ứng miễn dịch thơng qua trung gian lympo bào để đáp ứng việc cấy ghép cơ quan mới. Ngồi ra, fingolimod cịn được cho rắng làm tăng tế bào nội mơ và bảo vệ chức năng của chúng. Một chất tương tự như anarcadic acid được tách chiết từ P. variotii. Hợp chất này lần đầu tiên được cơ lập từ nguồn tự nhiên và được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chống lại các tác nhân gây bệnh cho người bao gồm cả các chủng đa kháng thuốc MDR (Multidrugresistan). Paecilomyces farinosus B05 đã được nghiên cứu để tách chiết các thành phần polysaccharide ngoại bào từ mơi trường lên men và sản xuất để ứng dụng vào sản xuất các chất chống oxy hĩa. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các polysaccharide được chiết xuất từ P. farinosus cĩ hoạt tính chống oxy hĩa cao, chỉ thấp hơn vitamin C một ít. 14
  27. Đồ án tốt nghiệp 1.1.3.3. Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật Việc sử dụng các vi sinh vật tự nhiên để phịng trừ các dịch hại là một cơng việc quan trọng hiện nay trong ngành nơng nghiệp vì sự an tồn, thân thiện với mơi trường và hiệu quả cao. Ở Ai Cập đã sản xuất Priority - một sản phẩm từ P. fumosoroseus để diệt trừ các loại cơn trùng. Đây là thuốc trừ sâu sinh học giúp diệt trừ bướm trắng để bảo vệ cây cà chua, dưa leo, cây cảnh. Sản phẩm chứa bào tử của chủng nấm P.fumosoroseus, và được xem là cĩ khả năng lây nhiễm ở tất cả giai đoạn (trứng, ấu trùng, nhộng, bướm trưởng thành). Ngồi ra trên thị trường cịn cĩ một số sản phẩm như Pelicide, Bio - Nematon, PL Plus chứa bào tử nấm P.lilacinus nhằm phịng trừ tuyến trùng gây hại cho cây nằm trong đất. 1.1.3.4. Xứ lý mơi trường Nấm là đối tượng thường được sử dụng trong hệ thống lọc khí sinh học để xử lý ơ nhiễm khơng khí thơng qua việc sử dụng khả năng của nấm để biến đổi các chất ơ nhiễm hữu cơ và vơ cơ thành hợp chất ít độc hại hơn. Formaldehyde là một chất phổ biến và nĩ là sản phẩm của các nguồn sinh học và từ mơi trường (sinh ra từ nhà máy cơng nghiệp). Formaldehyde cĩ độc tính cao do phản ứng khơng đặc hiệu với protein và nucleic acid, vì thế nĩ là chất gây ơ nhiễm mơi trường. P. variotii đã được thử nghiệm xử lý formaldehyde do chủng nấm này cĩ enzyme S - hydroxymethylglutathione dehydrogenase. Enzyme này cĩ tính đặc hiệu cơ chất rất cao với cơ chất là formaldehyde. Ngồi ra, enzyme alcohol oxidase từ P. variotii cĩ khả năng làm giảm lượng formaldehyde đáng kể và là tiềm năng cho việc ứng dụng xử lý formaldehyde. Ngồi ra, cĩ một số ứng dụng quan trọng của chi Cordyceps trong việc làm thuốc và thực phẩm cĩ lợi cho sức khỏe của con người là chi Paecilomyces (Liang et al., 2003). 15
  28. Đồ án tốt nghiệp 1.1.4. Một số sản phẩm của Paecilomyces spp. Bio - Nematon là thuốc trừ tuyến trùng sinh học chứa chủng nấm Paecilomyces lilacinus được chọn lọc trong tự nhiên. Sản phầm bao gồm những bào tử và sợi nấm của P.lilacinus, dạng lỏng chứa 1x109 CFU/ml và dạng bột chứa 1x108 CFU's/gm. Khi sản phẩm được sử dụng, bào tử của nĩ sẽ phá hủy vỏ trứng, ấu trùng và con nhỏ của hấu hết các loại tuyến trùng gây hại ở thực vật. Khi mà bảo tử tìm thấy những giai đoạn khác nhau của tuyến trùng, chúng sẽ nảy mầm và phát triển, nảy nở trong cơ thể ký chủ, thậm chí làm tê liệt dẫn đến chết. Hình 1.4. Bio Nematon - Sản phẩm của cơng ty T.Stanes cĩ khả năng trừ tuyến trùng (Nguồn: www.tstanes.com) NoFly WP là thuốc trừ sâu sinh học chứa chủng nấm Paecilomyces fumosoroseus nhằm kiểm sốt bọ trĩ và bọ phấn trắng trên thực vật ở nhiều giai đoạn sống của chúng như: trứng, ấu trùng và con trưởng thành. Khi sản phẩm được sử dụng, bào tử của P.fumosoroseus sẽ bám vào cơn trùng, nảy mầm và xâm nhập qua lớp cutin. Khi ký sinh được ký chủ, chúng sẽ phát triển nhanh chĩng, phá vỡ tế bào dẫn đến bị mất chức năng sống. Cơn trùng sẽ chết trong vịng từ 3 - 10 ngày, phụ thuộc vào nhiệt độ. Khi cơn trùng chết, bào tử của nấm sẽ nảy mầm trên bề mặt của cơn trùng ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, làm cho 16
  29. Đồ án tốt nghiệp cơ thể cơn trùng bị phủ một lớp tơ xám trắng ra bên ngồi. Trong điều kiện bất lợi, sẽ khơng cĩ sự hình thành bào tử tuy nhiên ta cĩ thể nhận thấy sự ký sinh của nấm qua màu sắc của cơ thể cơn trùng khi chết, đĩ là màu nâu. Hay qua sự méo mĩ của cơ thể cơn trùng. Hình 1.5. Sản phẩm trừ bọ phấn (Nguồn:www.plantprod.com) 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. Điều kiện cần thiết cho quá trình hình thành bào tử cũng như hệ sợi nấm cơn trùng là ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, độ pH trong mơi trường, cũng như phương pháp nuơi cấy. Quá trình tác động đến đất như sử dụng phân bĩn hữu cơ, thuốc trừ sâu hĩa học đều cĩ ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của một số chủng vi nấm sống trong đất. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát tiển của nấm: - Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng là yếu tố quan trọng cho sinh trưởng và phát triển của nấm. Nếu mơi trường khơng tốt nấm mọc yếu hoặc khơng mọc và sẽ hạn chế khả năng gây bệnh đối với cơn trùng. Trong quá trình hình thành bào tử, nấm cần các nguồn C, N. Các nguồn Carbon đã được nghiên cứu ảnh hưởng là: glucose, sucrose, arabinose, mannose và acid citric đều ảnh hưởng đến sự phát triển của Paecilomyces spp. (Bharati et al., 2007). Kết quả cuối cùng thu được: 17
  30. Đồ án tốt nghiệp sucrose là cơ chất tốt nhất (87,25 cm) cho sự tăng trưởng; tiếp theo là glucose (56,25 cm). Mannose cĩ khả năng thấp nhất, các cơ chất khác cĩ tác dụng vừa phải. Cịn đối với nguồn Ni-tơ, Bharati et al. (2007) đã sử dụng các nguồn Nitơ thử nghiệm: ammonium photphase, sodium nitrate, glycin, calcium nitrate, ammonium nitrate để nghiên cứu khả năng sử dụng Nitơ của Paecilomyces spp. Kết quả thu được Calcium nitrate là nguồn Nitơ tốt nhất rồi đến glycin, natri nitrate, ammonium nitrate. Ammonium phosphate được vi nấm sử dụng ít nhất. - Ảnh hưởng của các loại mơi trường: Theo Sung Mi Shim (2003) nghiên cứu rằng cĩ sự chênh lệch về sự phát triển của nấm trên hai mơi trường PDA (6,73 cm sau 14 ngày nuơi cấy) và Czapeck - Dox (6,25 cm sau 14 ngày nuơi cấy). - Ảnh hưởng của ẩm độ và nhiệt độ là yếu tố cần cho sự hình thành và phát triển của bào tử nấm Paecilomyces spp. Nhiệt độ thích hợp cho nấm trong khoảng 20 - 250C, nhưng ở 250C nấm phát triển tốt nhất (Lee et al., 1999), cịn nhiệt độ phù hợp cho sự hình thành bào tử lại là ở 240C. Đối với nấm Paecilomyces papillata, khi lây nhiễm thì ở 180C cĩ tỷ lệ ký sinh cao hơn đến 18% so với nhiệt độ 250C. Nguyên nhân cĩ thể là do dưới nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình dị hĩa, tăng quá trình đồng hĩa, từ đĩ làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần văn Mão, 2002). Gần đây, Statbers, T.E, D.Moore và C.Prior (2004) đã cho cơng bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. và xác định lồi này thích hợp ở nhiệt độ 280C (Phạm Thị Thùy, 2004). Nếu nhiệt độ quá cao thì bào tử dễ bị chết hoặc khơng hình thành. Julio J.D et al. (2004) đã chứng minh rằng rất ít hoặc khơng cĩ bào tử nấm được tạo nên ở các nhiệt độ 12, 16 và 300C. Các nhà khoa học cũng cho biết rằng nấm Paecilomyces spp. khi tấn cơng vào cơ thể cơn trùng nếu gặp điều kiện khơng thích hợp về nhiệt và ẩm độ hay ánh sáng thì sẽ tạo nên những thể chịu đựng để đối phĩ lại mơi trường (Penland, 1982). 18
  31. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ mơi trường đến sự phát triển của tản nấm Paecilomyces Ẩm độ thích hợp trong phạm vi 80 - 90% (Phạm Thị Thùy, 2004). Độ ẩm cao sẽ cĩ lợi cho sự sinh trưởng của sợi nấm và sự nảy mầm của bào tử. Tuy nhiên, độ ẩm thấp sẽ duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm cĩ khả năng sống lâu trong điều kiện độ ẩm từ 0 - 34% hơn là khi ẩm độ 75% (Trần Văn Mão, 2002). - Ảnh hưởng của ánh sáng: Nấm cơn trùng phát triển tốt trong điều kiện phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng yếu, chỉ cần một lượng ánh sáng nhỏ trong thời gian 6 - 8 giờ cũng đủ cho nấm cơn trùng phát triển. Ánh sáng cũng rất cần thiết cho quá trình sinh bào tử của nấm. Nếu thiếu ánh sáng thì nấm Paecilomyces spp. sẽ khơng tạo nhiều bào tử. Theo như nghiên cứu của Li Gao et al (2009) thì thời gian chiếu sáng cĩ ảnh hưởng đến sự phát triển nấm và hình thành bào tử đối với Paecilomyces lilicinus IPC - P, cụ thể như sau: nấm phát triển tốt nhất ở điều kiện tối hồn tồn (49,96 mg/cm2), cịn ở điều kiện 12h sáng/12h tối thì thấp hơn rất nhiều (29,75 mg/cm2). Tương tự cho sự hình thành bào tử, ở điều kiện tối hồn tồn thì bào tử tạo thành nhiều nhất 91,7.105 bào tử/cm2; trong điều kiện 12h sáng/12h tối thì thấp hơn (46,79 bào tử/cm2). Đối với chủng P.lilacinus M-14 thì trong điều kiện tối hồn tồn nấm phát triển tốt (56,58 mg/cm2); cịn điều kiện 12h sáng/12h tối nấm đạt giá trị 55,05 mg/cm2. Đối với sự hình thành bào tử thì lượng bào tử tạo 19
  32. Đồ án tốt nghiệp thành nhiều ở điều kiện 12h sáng/ 12 tối (121,57.105 bào tử/cm2); cịn ở điều kiện tối hồn tồn thì lượng bào tử tạo thành thấp hơn (55,91. 105 bào tử/cm2). - Ảnh hưởng của độ pH: thường nấm sống trong phạm vi pH = 3,5 - 8. Nhưng nấm cơn trùng ưa pH acid và nấm phát triển thích hợp ở pH = 5,5 - 6. Theo như nghiên cứu của Sung Mi Shim et al. (2003), thì giá trị pH phù hợp cho sự phát triển của P.fumosoroseus nằm trong khoảng 6 - 9, cịn nấm P.japonica phát triển tối ưu ở pH 7 (Choi et al., 1999), P. sinclairii phát triển tối ưu ở pH 8 (Shim et al., 2003). - Ảnh hưởng của độ thống khí: nấm cơn trùng đa số đều thuộc loại hiếu khí, khi nấm phát triển chúng địi hỏi cĩ lượng oxy thích hợp trong dụng cụ nhân nuơi hay trong cả biên độ rộng của khơng gian nuơi cấy, nếu phù hợp nấm sẽ phát triển tốt. 1.3. Các nghiên cứu về sử dụng Paecilomyces spp. trong phịng trừ bọ phấn và tuyến trùng gây hại 1.3.1. Tổng quan về bọ phấn trắng 1.3.1.1. Phân loại khoa học Giới: Animanila Ngành: Arthropoda Lớp: Insecta Bộ: Hemiptera Họ: Sternorrhyncha Chi: Aleyrodoidea Lồi: Aleyrodidae 20
  33. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7. Các giai đoạn trong vịng đời của bọ phấn trắng. (Nguồn: organicsoiltechnology.com) 1.3.1.2. Đặc điểm sinh thái Bọ phấn là một trong những dịch hại nguy hiểm đối với nhiều lồi cây trồng. Ký chủ ọ phấn chủ yếu là thực vật hạt kín hai lá mầm, trong đĩ cây họ cam quýt (Rutaceae) là ký chủ của hơn 60 lồi, cây họ dâu tằm (Moracea) là ký chủ của hơn 80 lồi. Ở các nước ơn đới, bọ phấn Trialeurodes vaporariorum gây hại nặng cho cây trồng trong nhà kính và ngồi đồng ruộ Aleyrodes proletella gây hại nặng cho rau họ thập tự. Ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, các lồi 21
  34. Đồ án tốt nghiệp Aleurodicus dispersus, Trialeurodes vaporariorum và Bemisia tabaci gây hại thiệt nghiêm trọng cho bơng và nhiều loại cây trồng khác cĩ giá trị kinh tế cao. Cho đến nay trên thế giới đã ghi nhận 1556 lồi bọ phấn. Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (BVTV) các năm 1967 - 1968, 1977 - 1978, 1997 - 1998, ở nước ta cĩ 7 lồi bọ phấn cĩ tên khoa học là: Aleurocanthus spiniferus, Aleurocanthus woglumi, Aleurocanthus spp. gây hại trên cam quýt; Aleurocybotus indicus gây hại trên lúa; Dialeurodes citri gây hại trên na; Parabemisia myricae gây hại trên đậu tương, thuốc lá, đậu đỗ, dưa chuột, cà chua, cà tím. Theo kết quả điều tra mới đây của các tác giả Nguyễn Thị Thu Cúc, Lê Thị Tuyết Nhung, Lê Quang Khải, thành phần bọ phấn nước ta đã được bổ sung thêm 4 lồi: Aleurodicus dispersus gây hại trên ổi; Aleyrodes proletella gây hại trên súp lơ xanh; Dialeurolonga rusotigmoides, Ochamoplatus citri gây hại trên cam, quýt. 1.3.1.3. Đặc điểm hình thái Trưởng thành cĩ kích thước nhỏ, thích bay và thường cĩ màu trắng đục, cĩ lớp sáp phấn trên cánh, chiều dài cơ thể 1 -3 mm. Trưởng thành của bọ phấn trắng cái cĩ màu vàng nhạt hoặc trắng . Lá non chưa hồn chỉnh (chưa mở) là nơi con cái ưa thích đẻ trứng, giao phối ngay sau khi vũ hĩa. Trứng cĩ hình quả lê hoặc quả trứng, cĩ cuống gắn chặt cố định trên các mơ lá và thời gian pha trứng từ 8-31 ngày. Phần mở rộng của cuống ĩc dính này là phương tiện để thụ tinh. Mỗi con cái cĩ thể đẻ 80 trứng, số lượng trứng thay đổi theo mùa. Ấu trùng tuổi 1 - 3 cĩ thể di chuyển và gây hại trong phạm vi ngắn; T . Ấu trùng mới nở cĩ màu kem nhạt và dần dần chuyển sang một màu đen bĩng. Chúng hình thành các tua sáp và phủ một lớp sáp trên cơ thể . Ngay sau khi nở, các ấu trùng di chuyển tìm vị trí thích hợp để định cư gây hại. Thời gian phát dục của tuổi 1: 4 - 7 ngày, tuổi 2: 3 - 7 ngày và tuổi 3: 3 - 8 ngày. Mỗi lần lột xác là cĩ sự thay đổi màu sắc từ màu nhạt chuyển sang hơi đen. 22
  35. Đồ án tốt nghiệp Hầu hết tuổi 2, 3 của ấu trùng cĩ hình bầu dục hoặc thuơn dài và cĩ những khe (nếp gấp) thở cạn ở thành bụng và lưng. Đĩ là các lỗ thở và cĩ thể hỗ trợ cho việc dẫn truyền khơng khí. Giai đoạn nhộng (ấu trùng tuổi 4) trong giai đoạn đầu, kéo dài 9-14 ngày sau đĩ vũ hĩa thơng qua khe hình chữ 'T' trên lưng vào buổi sáng. Cả ấu trùng và trưởng thành đều chích vào mơ cây trồng và hút dịch nhưng giai đoạn ấu trùng gây thiệt hại nặng nhất cho cây mía. Khi ấu trùng phát triển, chúng phủ một lớp bọc bằng sáp trắng giúp bảo vệ khỏi các tác động bên ngồi, nhất là thuốc trừ sâu, đây là đặc điểm riêng biệt của bọ phấn trắng ở các pha phát dục, trừ pha trứng. 1.3.1.4. Tổng quan về bệnh vàng lá do bọ phấn trắng gây ra Bọ phấn trắng non và bọ phấn trưởng thành thường tập trung ở mặt dưới lá cà chua, ổi, ớt chích hút dịch cây. Khi mật độ bọ phấn cao làm cây suy yếu, cĩ thể bị héo, vàng lá, thậm chí cĩ thể chết. Chất bài tiết của bọ phấn trắng cĩ đường tạo điều kiện cho nấm bồ hĩng phát triển hại cây. Bọ phấn thường gây hại trong mùa khơ, chúng cĩ phân tán trên phạm vi rộng nhờ giĩ. Ngồi ra, bọ phấn cịn là vật trung gian truyền bệnh xoăn lá do virus gây ra và gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau trong đĩ cĩ nhĩm cây rau thực phẩm bị hại nghiêm trọng nhất là cà chua, ớt Bệnh xoăn lá cĩ thể xuất hiện ngay từ khi cây cịn nhỏ trong vườn ươm cho đến khi trồng ra ruộng và thu hoạch, phổ biến nhất là cây bắt đầu ra hoa. Bệnh xuất hiện càng sớm thì mức độ thiệt hại càng nặng. Cây bị bệnh cịi cọc, lá biến màu vàng nhạt, trong khi gân lá cịn xanh tạo thành những vết xanh vàng loang lổ, lá nhỏ lại, nhăn nheo và thơ cứng, các lá ngọn bị xoăn, cây sinh trưởng kém, thấp nhỏ, phân nhiều nhánh cằn khơng phát triển được. Đốt thân hoặc các đốt ngắn lại và hơi uốn cong. Cây bị bệnh sớm và nặng cĩ thể 23
  36. Đồ án tốt nghiệp chết. Nếu bị muộn và nhẹ thì những lá non ra sau mới bị xoăn, cây cĩ thể ra hoa và trái nhưng rụng nhiều. Nếu cĩ trái thì trái nhỏ, méo mĩ, cứng, chất lượng kém. Virus lây lan bằng dịch cây, bằng tiếp xúc cơ giới và chủ yếu là do bọ phấn chích hút từ cây bệnh rồi truyền sang cây khỏe. Bọ phấn Bemisia tabaci là cơn trùng mơi giới truyền bệnh. Virus lan truyền rất nhanh, khi bọ phấn bắt đầu ăn cây cà chua, virus được truyền đi trong vịng 15 - 30 phút. Mật độ bọ phấn càng cao thì tỷ lệ cây bị bệnh xoăn lá càng nhiều. Bệnh khơng tồn tại lan truyền qua hạt giống và qua đất. Hàng năm, bệnh thường phát sinh mạnh từ tháng 10 đến đầu tháng 11 và gây hại nặng vụ cà chua xuân - hè tháng 3 - 4, đặc biệt khi trời ấm và nắng, ít mưa. Mức độ bị bệnh ở các giống cũng khác nhau: giống cà chua lai dễ nhiễm bệnh hơn các giống cà chua thuần; các giống mới nhập nội dễ nhiễm hơn các giống trồng qua nhiều năm; các giống cà chua địa phương cĩ khả năng kháng bệnh virus cao. 1.3.2. Tổng quan về tuyến trùng Tuyến trùng ký sinh thực vật cĩ thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những vết thương nhỏ đến tồn bộ vật chất của thực vật (Sharman và et al., 1997). Tổn hại về mặt kinh tế từ 40%- 50% hay thậm chí tổn hại cịn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấn cơng bởi những lồi tuyến trùng cĩ khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry, 1997). Bởi vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra khơng biểu hiện rõ ràng, nên các nhà nơng thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra. Thiệt hại do tuyến trùng gây ra đặc biệt leo thang vào những mùa mưa, trong đĩ những thành viên thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua là bị ảnh hưởng nhiều. Ở vùng Botswana, những cây thương mại thuộc họ cà được trồng suốt năm trong nhà kính. Những rối loạn sinh lý ở cây do tuyến trùng gây ra thường được quan sát trên cây họ cà (Nilsson, 1972). Tuyến trùng hại rễ là một lồi sống ký sinh thực vật, thuộc chi Meloidogyne. Người ta ước tính rằng tuyến trùng hại rễ Meloidogyne spp. gây tổn hại 20% - 50% sản lượng cà chua (Nilsson, 1972). Chúng tồn tại trong đất ở những vùng cĩ khí hậu nĩng bức hay cĩ mùa đơng ngắn. Cĩ khoảng 2000 lồi thực vật cĩ thể bị nhiễm 24
  37. Đồ án tốt nghiệp tuyến trùng hại rễ và chúng gây mất mát 5% sản lượng thực vật trên tồn cầu mỗi năm. Ấu trùng của chúng xâm nhiễm vào rễ cây, hình thành những nốt sần ở rễ, đồng thời chúng làm mất khống chất của cây và khả năng quang hợp. Khi chúng xâm nhiễm vào cây con thì kết quả chắc rằng cây đĩ sẽ chết, cịn nếu nhiễm vào cây đã trường thành thì chỉ làm giảm năng suất của cây đĩ. 1.3.2.1. Phân loại khoa học Giới: Animalia Ngành: Nematoda Lớp: Secernentea Bộ: Tylenchida Họ: Heteroderidae Hình 1.8. Đặc điểm tuyến trùng hại rễ được quan sát dưới kính hiển vi quang học vật kính × 10 1.3.2.2. Đặc điểm sinh thái Meloidogyne thuộc nhĩm động vật kí sinh cây trồng, chúng phân bố khắp thế giới và gần như kí sinh ở tất cả thực vật bậc cao. Chúng sống và sinh sản trong các tế bào sống bị biến đổi của rễ thực vật. Vì tạo nên những vết sưng trên rễ nên người ta gọi chúng là tuyến trùng sần rễ. Chúng cĩ khả năng sinh sản và phát triển rất nhanh làm cho cây trồng bị thiệt hại nặng nề. Theo phân loại của Goldi (1887, cĩ chỉnh sửa vào năm 2000), Meloidogyne spp. cĩ các đặc điểm như sau: 25
  38. Đồ án tốt nghiệp Đối với con cái trưởng thành thì cĩ hình trịn hay quả lê, màu trắng, ít vận động, khơng cĩ giai đoạn u nang. Cĩ kim chích nhỏ và mảnh, thường dài từ 12 - 15 µm. Lỗ bài tiết nằm trước tới khoảng giữa khối trịn, thường chỉ sau kim chích. Sáu tuyến trực tràng lớn tiết các chấ đặc sệt để bảo quản trứng và đẻ trứng ra ngồi. Con đực trưởng thành cĩ hình giống con giun, dài đến 2 mm, đuơi xoắn và trịn, phát triển qua các lần biến thái trong rễ. Cĩ kim chích nhỏ nhưng mảnh, dài 18 - 25µm. Tuyến hầu nằm ở phần bụng đến ruột. Gai nhỏ và mảnh, thường dài 25 - 33µm, ống dẫn dài từ 7 - 11µm. Cĩ một tinh hồn. Ấu trùng: Trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra ngồi trong một bọc gelatine (gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt hay bên trong của nốt sần rễ. 1.3.2.3. Tổng quan về bệnh sần rễ do tuyến trùng gây ra Tuyến ký sinh thực vật cĩ thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những vết thương nhỏ đến tồn bộ vật chất của thực vật (Sharman et al., 1997). Tổn hại về mặt kinh tế từ 40% - 50% hay thậm chí tổn hại cịn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấn cơng bởi những lồi tuyến trùng cĩ khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry, 1997). Bởi vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra khơng biểu hiện rõ ràng, nên các nhà nơng thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra. Thiệt hại do tuyến trùng gây ra đặc biệt leo thang vào những mùa mưa, trong đĩ những thành viên thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua là bị ảnh hưởng nhiều. Ở vùng Botswana, những cây thương mại thuộc họ cà được trồng suốt năm trong nhà kính. Những rối loạn sinh lý ở cây do tuyến trùng gây ra thường được quan sát trên cây họ cà (Nilsson, 1972). Người ta ước tính rằng tuyến trùng hại rễ Meloidogyne spp. gây tổn hại 20%- 50% sản lượng cà chua (Nilsson, 1972) Trong khi ở Việt Nam thì tiêu cĩ lượng xuất khẩu tiêu lớn nhất thế giới. Do đĩ, cây tiêu đĩng một vai trị quan trọng trong nền kinh tế của đất nước. Nhưng hiện nay, cĩ nhiều loại bệnh hại làm giảm năng suất của tiêu đĩ là bệnh sần rễ do tuyến trùng Meloidogyne gây ra. Chúng phá hoại bộ rễ, tạo nhiều vết thương làm cho các lồi vi nấm, vi khuẩn cĩ hại xâm nhập và gây bệnh dễ dàng hơn. Do đĩ, việc tìm hiểu và phịng trừ bệnh hại cho tiêu rất quan trọng. 26
  39. Đồ án tốt nghiệp Khi bị tuyến trùng gây hại, cây ngừng sinh trưởng, lá vàng, ra hoa và đậu quả kém. Đặc biệt, khi quan sát dưới rễ sẽ thấy cĩ những nốt sần xuất hiện, nếu bệnh quá nặng cây sẽ chết. Bệnh sần rễ khơng chỉ biểu hiện ở những cây lá vàng mà cịn cả những cây xanh tươi do bệnh mới phát triển ở giai đoạn đầu, rễ vẫn vận chuyển nước và khống chất được. Sự phát triển của bệnh trải qua 3 giai đoạn: − Giai đoạn 1: tuyến trùng mới xâm nhập vào rễ và tạo nốt sần, lúc này rễ chưa bị ảnh hưởng nhiều, rễ vẫn cịn màu sáng. − Giai đoạn 2: rễ bị đổi màu, chức năng vận chuyển nước và chất dinh dưỡng bị ảnh hưởng. Rễ bị tổn thương và tạo cơ hội cho các vi sinh vật tấn cơng gây nhiều bệnh khác cho cây. − Giai đoạn 3: rễ bị đổi màu đen và chức năng vận chuyển đã khơng cịn. Cĩ 29 lồi thuộc các họ khác nhau cĩ mặt trên các vùng trồng tiêu của Việt Nam. Trong đĩ, chủ yếu và phổ biến nhất là chi Meloidogyne. (Trịnh Thị Thu Thủy và cộng sự, 2007). Hình 1.9. Vịng đời của tuyến trùng hại rễ (Nguồn: www.apsnet.org) 27
  40. Đồ án tốt nghiệp Tác động kinh tế: Meloidogyne spp. là một trong ba chi tuyến trùng ký sinh rễ gây thiệt hại nhất về cây trồng và sản lượng. Chúng cĩ hiện diện ở tương đối nhiều nơi trên thế giới, và chúng ký sinh bắt buộc với rễ của hàng ngàn lồi thực vật. Chi này gồm hơn 60 lồi, trong đĩ một số lồi lại cĩ nhiều chủng khác nhau. Trong 60 lồi thì cĩ 4 lồi gây hại chính trên thế giới đĩ là M. javanica, M. arenaria, M. incognita và M. hapla. Meloidogyne spp. hiện diện ở 23 trong tổng số 43 lồi thực vật chính yếu, từ các cây lương thực, đồng cỏ, cây cảnh. Nếu tuyến trùng tấn cơng vào những cây lâu năm, cĩ rễ ăn sâu vào đất thì việc kiểm sốt sẽ rất khĩ khăn và bị hạn chế. Meloidogyne spp. được phát hiện đầu tiên ở cây sắn do Neal vào năm 1889. Rau màu được trồng ở những vùng cĩ khí hậu ấm áp thường trải qua những mùa bị thiệt hại nghiêm trọng do tuyến trùng gây ra, và thường người ta dùng chất hĩa học gọi là nematicide để ngăn chặn điều này. Rễ bị tuyến trùng ký sinh sẽ hấp thu nước và các khống chất yếu đi so với bình thường. Hậu quả bởi tuyến trùng gây ra cho thực vật là làm giảm sự tăng trưởng, chất lượng, năng suất của cây trồng, từ đĩ kéo theo sự suy giảm sức đề kháng của cây trồng với các yếu tố ngoại cảnh (như là: hạn hán, dịch bệnh, ) và tình huống xấu nhất là cĩ thể sẽ mất trắng mùa màng. 1.3.3. Đánh giá khả năng ký sinh của chủng Paecilomyces spp. Kiểm sốt sinh học được định nghĩa là các hoạt động kí sinh, ăn thịt hay gây bệnh trong việc duy trì mật độ sinh vật khác tại một số nơi thấp hơn trung bình (Bach, 1964). Tuy nhiên, kiểm sốt sinh học là sự giảm mật độ quần thể tuyến trùng thơng qua hoạt động của các sinh vật sống khác so với cây chủ cĩ thể kháng lại tuyến trùng, xảy ra trong tự nhiên hay thơng qua các thao tác mơi trường (Stirling, 1991). Trước đây, việc kiểm sốt tuyến trùng hại thực vật chủ yếu dựa vào các hĩa chất diệt tuyến trùng, sức đề kháng của kí chủ thực vật và luân canh cây trồng. Mặc dù cĩ nhiều thành cơng trong nghiên cứu kiểm sốt tuyến trùng bằng phương pháp sinh học trong suốt 20 năm qua, đến nay nĩ vẫn ít được áp dụng. Hầu hết các sản 28
  41. Đồ án tốt nghiệp phẩm cĩ chứa độc tố được ly trích từ vi sinh vật và chỉ một vài sản phẩm cĩ chứa vi sinh vật hữu hiệu (Dong và Zhang, 2006). Dưới đây là một số nghiên cứu về hiệu quả phịng trừ tuyến trùng của nấm kí sinh trứng trong những năm 1991 - 1996: Bảng 1.1. Hiệu quả phịng trừ của các chủng nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến trùng hại thực vật. Hiệu quả phịng trừ của Nấm Tuyến trùng nấm đối với tuyến trùng Tác giả (năm) hại thực vật Giảm số lượng tuyến Stephan et al. P.lilacinus M. javanica trùng gây hại dưa leo. (1991) M.incognita Giảm số lượng tuyến Vicente et al. P.lilacinus R.reniformis trùng gây hại dưa hấu. (1991) Xử lý nấm cĩ hiệu quả Walia et al. P.lilacinus M.javanica tốt cho sự phát triển của (1991) đậu bắp. Bĩn vào đất 2g/chậu Zaki và trước khi chủng tuyến P.lilacinus M.javanica Maqbool trùng cho hiệu quả tốt (1991) nhất. Trộn vào hạt giống với M.incognita liều trung bình và cao Khan et al. P.lilacinus acrita làm giảm đáng kể sự hư (1992) hại của bộ rễ. 29
  42. Đồ án tốt nghiệp Lồi nấm này là một Marban- Meloidogyne trong những sinh vật đất P.marquandii Mendoza và spp. tự nhiên gĩp phần kiểm cs (1992) sốt tuyến trùng. Xử lý hạt đậu đũa bằng nấm cho hiệu quả diệt Siddiqui và M.incognitarace P.lilacinus tuyến trùng tốt hơn so Mahmood 3 với xử lý bằng ascorbic (1992a) acid. P.lilacinus gây ra sự giảm mật độ tuyến trùng Siddiqui và P.lilacinus M. incognitarace nhiều hơn so với B. Mahmood B. licheniforrnis 3 licheniforrnis trên đậu (1992b) đũa. Cĩ sự giảm số lượng nốt sần, khối trứng và mật độ Pandey và P.lilacinus M.incognita tuyến trùng trong đất Trivedi (1992) trồng nhiều loại thực vật khi xử lý với nấm. Khi phun chế phẩm lên Siddiqui và M.incognita gốc tiêu làm tăng số P. lilacinus Mahmood R.reniformis lượng và cân nặng chùm (1993) quả. Xử lý nấm cĩ hiệu quả P.lilacinus M.incognitarace hơn so với B.subtilis Zaki (1994) B.subtilis 3 trong việc giảm số lượng 30
  43. Đồ án tốt nghiệp tuyến trùng trên đậu đũa. Liều lượng tốt nhất để Walters và P.lilacinus M.javanica kiểm sốt tuyến trùng là Barker (1994) 4 gam/kg đất. Nấm kiểm sốt tuyến Siddiqui và trùng hiệu quả cả trong P.lilacinus R.reniformis Mahmood điều kiện nhà lưới và (1995b) đồng ruộng. P. lilacinus kiểm sốt P. lilacinus tuyến trùng khơng hiệu Heterodera Siddiqui et al. P. quả bằng P. cajani (1996) chlamydosporia chlamydosporia trên pigeonpea. P.lilacinus kết hợp với P. P. chlamydosporia và Siddiqui et al. chlamydosporia M. javanica T. harzianum làm giảm (1996) T. harzianum mật độ tuyến trùng trên đậu đũa. P.chlamydosporium kết P. hợp với T.harzianum và Siddiqui và chlamydosporia Glomus mosseae làm Mahmood H. cajani T.harzianum giảm tuyến trùng hiệu (1996) Glomus mosseae quả nhất nhất trên pigeonpea. 31
  44. Đồ án tốt nghiệp Theo R.P. Esser và N.E.El-Gol thì Paecilomyces spp. cĩ khả năng gây ảnh hưởng và kí sinh trên con cái và trứng tuyến trùng. Nấm này cũng là tác nhân kiểm sốt sinh học đáng kể theo nhiều khám phá trước đây vào năm 1979 và hiện nĩ đang được chú ý vì là " tác nhân kiểm sốt sinh học cĩ tiềm năng tuyệt vời trong đất nơng nghiệp ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới". Lồi Paecilomyces spp. ký sinh tuyến trùng sẽ tiếp cận với kí chủ thơng qua một số con đường như: sợi nấm sẽ bám váo lớp vỏ keo của tuyến trùng hoặc thâm nhập thơng qua phần hậu mơn và cổ tử cung của tuyến trùng. Mặt khác, sợi nấm cũng cĩ thể phân nhánh và bám vào bề mặt của trứng tuyến trùng. Theo một báo cáo gần đây của Gortari et al. (2008) thì Paecilomyces lilacinus là một lồi vi nấm cĩ khả năng ký sinh trứng của tuyến trùng trong điều kiện in vitro. Hai chủng ngồi tự nhiên P. Lilacinus LPSC # 876 và P. Lilacinus LPSC # 44 được phân lập từ đất trong tại cơng viên trung tâm của thành phố La Plata và trên một cánh đồng nơng nghiệp ở Argentina cho thấy cĩ khả năng ký sinh trên trứng của T. cannis. Theo kết quả thực nghiệm của tác giả thì tỷ lệ ký sinh trứng T. cannis của 2 chủng tuyến trùng nhiên P. Lilacinus LPSC # 876 và P. Lilacinus LPSC # 44 lần lượt là 65,6% và 63,2%. Đồng thời, theo Fransen (1990) và Lacey et al. (1996) vi nấm là tác nhân sinh học duy nhất ký sinh trên cơ thể bọ phấn trắng và một trong số đĩ cĩ lồi Paecilomyces spp. Khi một bào tử của Paecilomyces spp. nằm trong đất tìm thấy được kí chủ nhất định, nĩ sẽ tiết ra hệ enzyme để xuyên qua lớp da ngồi của cơn trùng. Paecilomyces spp. cũng cĩ thể xâm nhập vào cơ thể cơn trùng qua lỗ thở, hậu mơn và cả đường miệng. Sau đĩ phát triển thành các ống mầm và hình thành nhiều sợi nấm, sợi nấm cĩ thể lây lan trong lớp dịch giữa các tế bào hay các mơ rồi bao phủ cả bên trong và bên ngồi cơ thể cơn trùng rồi sinh ra bào tử. Theo nhiều nghiên cứu thì đa phần sự tử vong của cơn trùng là do sự cạn kiệt chất dinh dưỡng, phá hoại các mơ và các độc tố mà vi nấm tạo ra trong cơ thể cơn trùng. 32
  45. Đồ án tốt nghiệp Theo nghiên cứu của Ayhan GOKCE và M. Kubilay ER (2004), Paecilomyces fumoroseus cĩ khả năng ký sinh với giai đoạn nhộng của bọ phấn và tỷ lệ ký sinh lên đến hơn 70% sau 6 ngày gây nhiễm. Cịn theo Claire Vidal et al. (1998), điều kiện thích hợp cho sự xâm nhiễm của Paecilomyces fumosoroseus với ký chủ tối ưu ở điều kiện nhiệt độ từ 22-330C và độ ẩm từ 68% - 100% ( với tỷ lệ ký sinh là trên 70% sau một tuần gây nhiễm). 33
  46. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được tiến hành từ ngày 7/4 đến ngày 13/7 tại phịng thí nghiệm trường Đại Học Cơng Nghệ TPHCM. 2.2. Thiết bị - hĩa chất - vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Thiết bị - hĩa chất 2.2.1.1 Thiết bị − Nồi hấp khử trùng − Que cấy điểm − Đèn cồn − Ống nghiệm − Kính hiển vi quang học − Dao cấy − Dụng cụ đục lỗ thạch 5mm − Đĩa petri − Micropipet − Erlen 2.2.1.2 Hĩa chất − Dịch TCA 5% − Lugol − Tween 80 − Cồn 960, 700 − Methylene blue − Lactocotton phenol blue − MgSO4.7H2O − K2HPO4 − KNO3 − NaCl 34
  47. Đồ án tốt nghiệp − FeSO4.7H2O − Glucose − Pepton − NaNO3 − KCl − CaCl2 2.2.2. Vật liệu − Mẫu nấm được phân lập từ chế phẩm sinh học được người dân bĩn vào đất. − Mẫu bọ phấn thu được từ vườn của nhà dân quận Bình Tân. − Tuyến trùng cái từ Trung tâm cơng nghệ sinh học TP.HCM 2.2.3. Các mơi trường sử dụng 2.2.3.1 Mơi trường phân lập ban đầu PDA (Potato D - Glucose Agar) D-glucose 20 g Agar 20 g Dịch chiết khoai tây 1000 ml Cách chuẩn bị dịch chiết khoai tây: Cân 200 g khoai tây đã được gọt vỏ, sau đĩ thái nhỏ thành hình vuơng. Đong vào cốc thủy tinh 1 lít nước cất, thêm khoai tây đã thái ở trên vào đun sơi trong 20 phút. Để nguội, dùng bơng thấm nước lọc phần dịch, gạn bỏ phần xác khoai tây thu được dịch chiết khoai tây. Sau đĩ đem bảo quản lạnh ở 40C. 2.2.3.2 Mơi trường thử nghiệm hoạt tính chitinase, protase sử dụng chitin và casein làm cơ chất (Nguyễn Thị Hồng Thương, 2000 -2001) Cơ chất: 1 % MgSO4.7H2O 3 g/l K2HPO4 3 g/l KNO3 1 g/l NaCl 0,5 g/l FeSO4.7H2O 0,01 g/l Agar 15 g 35
  48. Đồ án tốt nghiệp Chloramphenicol 0,1 g/l 2.2.3.3 Mơi trường Sauboraud + Khống chất Glucose 40 g/l Pepton 15 g/l KH2PO4 1 g/l MgSO4.7H2O 1 g/l Agar 20 g/l 2.2.3.4 Mơi trường Czapeck - Dox Glucose 1 % NaNO3 3,5 g/l K2HPO4 1,5 g/l MgSO4.7H2O 0,5 g/l KCl 0,5 g/l FeSO4.7H2O 0,01 g/l Agar 20 g/l 2.2.3.5 Mơi trường Malt agar (Nguyễn Đức Lượng, 2006) Chuẩn bị dịch chiết malt: Lấy 250g malt nghiền nhỏ, hịa vào 1 lít nước cất. Dùng đũa thủy tinh khuấy đều và gia nhiệt từ từ, cĩ khuấy, đến 45 - 500C, giữ ở nhiệt độ này 30 phút. Sau đĩ, nâng nhiệt độ lên 65 - 680C, cĩ khuấy, giữ ở nhiệt độ này cho đến khi quá trình đường hĩa xảy ra hồn tồn (kết quả là khơng thấy màu xanh xuất hiện khi thử dịch cháo với dung dịch lugol). Lọc tách bã qua vải thơ hoặc bơng thấm nước, đem hấp phần dịch trong 1210C, 30 phút, lấy ra để lắng. Lọc tách hết tủa lần nữa, pha lỗng để dịch cĩ hàm lượng chất khơ hịa tan khoảng 6 - 8 độ Brix. Thêm 2% agar vào dịch chiết malt, đun khuấy đều cho đến khi agar tan hết. Phối mơi trường vào các dụng cụ chứa, hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, 15 phút. 36
  49. Đồ án tốt nghiệp 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phân lập nấm Paecilomyces spp. 2.3.1.1. Phân lập nấm Paecilomyces spp. từ chế phẩm Thực hiện: Cân 1 gam chế phẩm rồi đổ vào erlen cĩ chứa 100ml nước cất vơ trùng và 1% đường glucose. Tiến hành tăng sinh chế phẩm trong máy lắc, 150 vịng/phút trong 24 giờ. Sau khi lắc tăng sinh, dùng micropipet 1000µl và đầu típ đã khử trùng hút 1ml dịch chế phẩm cho vào các ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý vơ trùng đã được chuẩn bị để pha lỗng ra thành các nồng độ khác nhau 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 Tiến hành trang đĩa bằng cách hút 0,1ml dịch pha lỗng cho vào đĩa petri cĩ chứa mơi trường PDA (G. Gayathri, 2010). Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Dùng que cấy trang bằng thủy tinh để trang đến khi khơ dịch chế phẩm. Hình 2.1. Chế phẩm xử lý đất 2.3.1.2. Phân lập nấm Paecilomyces spp. từ bọ phấn trắng Thực hiện: Thu bọ phấn trắng trên đồng và đem về nuơi trên lá chuối, cuống lá được quấn bằng bơng hút ẩm để giữ lá tươi, khơng bị héo. Hằng ngày quan sát và thu bọ phấn bị chết. Các cá thể bọ phấn bị chết được cho vào đĩa petri cĩ đặt giấy hút ẩm. Tiến hành thu thập cá thể bị chết và được bao bọc bởi sợi nấm màu trắng. Sau đĩ tiến hành phân lập nấm ký sinh trên mơi trường PDA theo phương pháp của Lawrence (1997). 37
  50. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2. Các lọ thủy tinh dùng để bố trí thí nghiệm 2.3.2. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của Peacilomyces spp. Các dịng vi nấm cĩ khả năng ký sinh tuyến trùng và bọ phấn trắng đều nhờ hoạt động của các enzyme ngoại bào như: chitinase và protease. Do vậy, để đảm bảo chủng nấm Paecilomyces cĩ khả năng ký sinh với tuyến trùng phải tiến hành định tính hệ enzyme chitinase, protase trên mơi trường cảm ứng. 2.3.2.1. Xác định hoạt tính enzyme chitinase Nguyên tắc: Khi nuơi cấy trong mơi trường thạch cĩ bổ sung chitin 1% làm chất cảm ứng, nấm sợi sinh enzyme chitinase phân giải chitin thành các dạng cĩ cấu trúc mạch ngắn hơn là N-acetyl- D-glucosamine. Các dạng đơn phân này khơng cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol. Do đĩ sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, độ lớn của phần mơi trường trong suốt bao quanh nấmphản ảnh khả năng sinh tổng hợp chitinase. Thực hiện: Chuẩn bị mơi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Dùng các đĩa petri vơ trùng đã hấp ở 1210C trong 15 phút, cho mơi trường từ bình vào 2/3 đĩa. Dùng khoan thạch cĩ đường kính 5mm ấn nhẹ lên bề mặt nuơi cấy nấm rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa mơi trường cảm ứng, ủ ở nhiệt độ phịng trong 4 ngày. Cho thuốc thử Lugol vào, để yên 10 phút rồi sau đĩ đổ Lugol đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch và tiến hành đo đường kính vịng phân giải và đường kính nấm. 2.3.2.2. Xác định hoạt tính enzyme protease Nguyên tắc: Khi nuơi cấy trong mơi trường thạch cĩ bổ sung casein 1% , nấm sợi sẽ sinh enzyme protease phân giải casein thành các amino acid. Các dạng 38
  51. Đồ án tốt nghiệp amino acid được tạo thành sẽ khơng phản ứng với thuốc thử TCA 5%, chỉ cĩ casein mới tạo tủa trắng đục với TCA 5%. Thực hiện: Chuẩn bị mơi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Dùng các đĩa petri vơ trùng đã hấp ở 1210C trong 15 phút, cho mơi trường từ bình vào 2/3 đĩa. Dùng khoan thạch cĩ đường kính 5mm ấn nhẹ lên bề mặt nuơi cấy nấm rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa mơi trường cảm ứng, ủ ở nhiệt độ phịng trong 4 ngày. Cho thuốc thử TCA 5% vào, để yên 10 phút rồi sau đĩ đổ thuốc thử đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch và tiến hành đo đường kính vịng phân giải và đường kính nấm. 2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố mơi trường đến sự phát triển của của nấm 2.3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces Nguyên tắc: Tùy thuộc vào pH khác nhau mà sự tăng trưởng của nấm cũng thay đổi. Sự thay đổi của pH tức là sự thay đổi của ion H+ cĩ trong mơi trường sẽ làm thay đổi trạng thái điện tích của thành tế bào, điều này làm ảnh hưởng khả năng thẩm thấu của tế bào vi sinh đối với những ion nhất định; làm thay đổi trạng thái điện ly các phân tử của chất dinh dưỡng, từ đĩ làm giảm khả năng sử dụng dinh dưỡng của vi sinh vật. Bên cạnh đĩ, pH ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cĩ mặt trên thành tế bào. Điều này, quyết định đến sự phát triển của vi sinh vật trong mơi trường.Paecilomyces spp. thường được phân lập từ đất hay cơn trùng nên pH thường là pH hơi acid. Tiến hành khảo sát ở các pH: 5, 6, 7, 8 cơng thức cụ thể như sau: Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên. Cơng thức 1: pH 5 Cơng thức 2: pH 6 Cơng thức 3: pH 7 Cơng thức 4: pH 8 Thí nghiệm được thực hiện trên mơi trường PDA. Mỗi cơng thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa. 39
  52. Đồ án tốt nghiệp Thực hiện: Mơi trường được khử trùng ở 1210C trong 15 phút, sau đĩ đổ mơi trường vào các đĩa. Đổ được 2/3 đĩa thì ngưng đổ rồi lắc cho đều đĩa. Cấy một khoanh nấm cĩ đường kính 5mm (lấy từ mép của tản nấm cấy sẵn) vào giữa đĩa mơi trường và để ở nhiệt độ 250C ± 20C trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối. Chỉ tiêu theo dõi: − Đường kính tản nấm (cm): 2 ngày/lần ngày đo sự phát triển của nấm bằng cách lấy trung bình đường kính trên hai trục của khuẩn lạc theo cơng thức: d = (d1+ d2)/2 Trong đĩ: d1, d2 là độ dài hai đường chéo phần khuẩn lạc phân bố Thời gian theo dõi: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ngày sau khi cấy. − Tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày): trung bình của 3 lần đo đường kính nấm từ 6 - 8; 8 - 10; 10 - 12 ngày sau nuơi cấy. Sau đĩ so sánh và nhận xét ở giá trị pH nào thì nấm Paecilomyces spp. phát triển tốt hơn cả. 2.3.3.2. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. trong các mơi trường khác nhau Nguyên tắc: Trong quá trình phát triển nấm cần nhiều chất dinh dưỡng. Tùy vào từng mơi trường nuơi cấy khác nhau mà nấm sẽ cĩ tốc độ sinh trưởng khác nhau, do đĩ tiến hành khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. trong các mơi trường: PDA, Malt agar, Czapeck – dox agar, Sabouraud agar. Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên. Cơng thức 1: mơi trường PDA Cơng thức 2: mơi trường Malt agar Cơng thức 3: mơi trường Czapeck - Dox Cơng thức 4: mơi trường Sabouraud agar Mỗi cơng thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa. Thực hiện: Thí nghiệm được thực hiện trên mơi trường PDA, Malt agar, Czapeck – dox agar, Sabouraud agar với 3 lần lặp lại cho mỗi mơi trường. Mơi trường được khử trùng ở 1210C trong 15 phút, sau đĩ đổ mơi trường vào các đĩa. Đổ được 2/3 đĩa thì ngưng đổ rồi lắc cho đều đĩa. Cấy một khoanh nấm cĩ đường 40
  53. Đồ án tốt nghiệp kính 5mm (lấy từ mép của tản nấm cấy sẵn) vào giữa đĩa mơi trường và để ở nhiệt độ 250C ± 20C trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối. Chỉ tiêu theo dõi được thực hiện tương tự như mục 2.3.3.1. Sau đĩ so sánh và nhận xét ở mơi trường nào thì nấm Paecilomyces spp. phát triển tốt hơn cả. 2.3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. Nguyên tắc: Thực hiện theo phương pháp Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền và Nguyễn Ánh Tuyết (2006). Mỗi lồi Paecilomyces spp. khác nhau thì sống ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau. Do vậy, tiến hành khảo sát chế độ chiếu sáng: 12 giờ sáng/12 giờ tối và tối liên tục và theo dõi, đánh giá sự phát triển của nấm. Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên. Cơng thức 1: điều kiện 12h sáng/12h tối Cơng thức 2: điều kiện tối liên tục Mỗi cơng thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa. Thực hiện: Thí nghiệm được thực hiện trên mơi trường PDA với 3 lần lặp lại cho mỗi điều kiện chiếu sáng - Mơi trường được khử trùng ở 1210C trong 15 phút, sau đĩ đổ mơi trường vào các đĩa. Đổ được 2/3 đĩa thì ngưng đổ rồi lắc cho đều đĩa. Cấy một khoanh nấm cĩ đường kính 5mm (lấy từ mép của tản nấm cấy sẵn) vào giữa đĩa mơi trường và để ở nhiệt độ 250C ± 20C trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối. Chỉ tiêu theo dõi thực hiện tương tự mục 2.2.3.1. Sau đĩ so sánh và nhận xét ở điều kiện chiếu sáng nào thì nấm Paecilomyces spp. phát triển tốt hơn cả. 2.3.4. Đánh giá khả năng ký sinh bọ phấn của 2 chủng Paecilomyces sp1. và sp2. Thực hiện: Theo phương pháp của Ayhan GƯKÇE và M. Kubilay ER. (2004), các cá thể bọ phấn trắng trưởng thành nằm trên lá thu thập được ngồi tự nhiên được bỏ vào 6 hộp thủy tinh cĩ nắp đậy bằng lưới. Sau đĩ, hút 1ml phân NPK vào bơng thấm nước quấn trên cuống lá giúp lá tươi lâu hơn. Tiến hành phun 10ml 41
  54. Đồ án tốt nghiệp dịch huyền phù bào tử nấm cĩ nồng độ 108 vào các hộp đã chuẩn bị. Mẫu đối chứng được phun bằng nước cất. Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên. Cơng thức 1: Mỗi lọ thủy tinh cho vào 30 cá thể bọ phấn và phun 10ml dịch huyền phù bào tử nấm Paecilomyces cĩ nồng độ 108 vào. Cơng thức 2: Mỗi lọ thủy tinh cho vào 30 cá thể bọ phấn và phun 10ml nước cất vào. Mỗi cơng thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 lọ thủy tinh. 2.3.5. Đánh giá khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. Thực hiện: Dùng micropipet hút mơi trường PDA đã khử trùng vào đĩa petri. Sau đĩ, cấy nấm Paecilomyces spp. vào mơi trường đã hút. 3 ngày sau khi cấy, cho 5 tuyến trùng vào xung quanh mép tản nấm đã cấy. Sau đĩ quan sát qua các ngày để theo dõi sự ký sinh của Paecilomyces spp. đến tuyến trùng. Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên. Cơng thức 1: Mẫu đối chứng khơng cấy nấm sau 3 ngày cho tuyến trùng vào. Cơng thức 2: Mẫu thí nghiệm cĩ cấy nấm sau sau 3 ngày cho tuyến trùng vào. Mỗi cơng thức lặp lại 2 lần, mỗi lần 1 đĩa. 2.4. Phương pháp xử lý số liệu Dùng phần mềm Statgraphic và Excel 2007 để xử lý số liệu cĩ được. Tiến hành xử lý số liệu thống kê trong Statgraphis theo trình tự: - Xử lý số liệu của kết quả nghiên cứu - So sánh các tham số đặc trưng của hai hay nhiều kết quả nghiên cứu. Phép phân tích phương sai ANOVA và giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD với độ tin cậy 95%. 42
  55. Đồ án tốt nghiệp - Hiệu lực phịng trừ của nấm Paecilomyces được tính theo cơng thức Abbot (1925): Ca- Ta M (%) = x 100 Ca Trong đĩ: Ca là số sâu sống ở cơng thức đối chứng sau thí nghiệm Ta là số sâu sống ở cơng thức thí nghiệm sau thí nghiệm 43
  56. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập nấm 3.1.1. Phân lập nấm cĩ nguồn gốc từ chế phẩm xử lý đất Việc phân lập nấm Paecilomyces từ trong chế phẩm được tiến hành ở các nồng độ pha lỗng khác nhau 10-1, 10-2, 10-3, 10-4. Kết quả cho thấy, cĩ sự xuất hiện của chủng nấm Paecilomyces trong chế phẩm xử lý đất. Cụ thể, khi pha lỗng và cấy trang trên đĩa petri chứa mơi trường PDA, sau 3 ngày nuơi cấy, trên đĩa xuất hiện các tản nấm ban đầu cĩ màu trắng, xốp sau chuyển dần sang màu tím nhạt rồi tới tím đậm. Đặc điểm này trùng với mơ tả của Bùi Xuân Đồng và cộng sự (2002) nên được tạm gọi là Paecilomyces sp1. Tuy nhiên, để khẳng định, cần phải cĩ sự theo dõi về các đặc điểm đại thể, vi thể và một số chỉ tiêu sinh hĩa của chủng nấm phân lâp được. Hình 3.1. Dịch chế phẩm được trang ra đĩa PDA ở nồng độ pha lỗng 10-4 vào ngày thứ 3. 44
  57. Đồ án tốt nghiệp 3.1.2. Phân lập nấm Paecilomyces sp2. Từ những cá thể bọ phấn trắng nghi ngờ bị chết do nhiễm nấm Paecilomyces, sinh viên đã tiến hành phân lập và cho những kết quả sau: Sau 3 ngày nuơi cấy trên mơi trường PDA đã xuất hiện tản nấm cĩ màu trắng xốp sang màu hồng rồi màu hồng tím. Đặc điểm đại thể này theo mơ tả của Bùi Xuân Đồng và cộng sự (2002) là chi Paecilomyces. Vì thế, sinh viên tạm gọi chủng nấm này là Paecilomyces sp2. Hình 3.2. Nấm nghi ngờ mọc lên từ bọ phấn trên mơi trường PDA. 45
  58. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng nấm Paecilomyces phân lập được Bảng 3.1: So sánh hình thái của chủng nấm Paecilomyces sp1. Chỉ tiêu Đặc điểm đại thể của chi Đặc điểm đại thể và vi thể của quan sát Paecilomyces theo khĩa phân loại chủng nấm phân lập từ chế của Bainier (1907), Bùi Xuân phầm Đồng (2000) - Tản nấm - Hình trịn đồng tâm, dạng thảm - Hình trịn đồng tâm, cĩ dạng nhung. thảm nhung. - Sợi nấm - Dạng bĩ sợi màu trắng, hồng - Chủng nấm phân lập được từ nhạt hoặc tím (nên thường gọi là chế phẩm khi được nuơi cấy trên nấm tím), nâu vàng, nâu xám, mơi trường PDA, ban đầu sợi tơ thỉnh thoảng cĩ màu lục nhạt nấm cĩ màu trắng, mềm, mịn. (Trần Văn Mão, 2002). Sau 3 ngày, sợi nấm chuyển sang màu tím nhạt, rồi tới tím đậm là do sự xuất hiện của bào tử nấm và ở 16 ngày sau khi cấy thì trên bề mặt của tản nấm xuất hiện những giọt dịch. - Bào tử - Giá bào tử trần đơn độc hoặc - Quan sát dưới kính hiển vi cĩ thành bĩ giá, phân nhánh khơng thể thấy chủng nấm phân lập từ đều hoặc thành vịng. Nhánh chế phẩm cĩ cuống bào tử dài, mang ở đỉnh thể bình mọc thành phân nhánh và mọc lên từ sợi vịng. Thể bình đơi khi đơn độc nấm. Trên phần cuống cĩ thể trên các sợi nấm khơng phân hĩa. bình phồng ở phần gốc, nhọn ở Thể bình gồm phần gốc hình trụ phần đầu và mọc vươn thẳng, hoặc hình gần trứng và phân ngọn tạo thành cụm. Trên thể bình là thon nhỏ đột ngột thành một cổ những bào tử hình oval liên kết 46
  59. Đồ án tốt nghiệp dài. Bào tử trần thuộc với nhau thành dạng chuỗi dài tipphialoconidi (tip cơ bản và hay bị đứt đoạn. euconidi), khơng ngăn vách, khơng mu hoặc màu nhạt, nhẵn \ hoặc cĩ gai, thành chuỗi gốc non. Các chuỗi bào tử trần tách xa nhau, ít khi tụ họp thành khối. - Hình thái đại thể - Hình thái vi thể Từ những so sánh trên, sinh viên khẳng định chủng nấm phân lập được từ chế phẩm thuộc chi Paecilomyces. 47
  60. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2. So sánh hình thái của chủng nấm Paecilomyces sp2. Chỉ tiêu Đặc điểm đại thể của chi Đặc điểm đại thể và vi thể của quan sát Paecilomyces theo khĩa phân chủng nấm phân lập từ chế loại của Bainier (1907), Bùi phầm Xuân Đồng (2000) - Tản nấm - Hình trịn đồng tâm, dạng mịn - Hình trịn đồng tâm, dạng thảm thảm nhung hoặc dạng bột, nhung mềm. - Sợi nấm lúc đầu cĩ màu trắng, - Sợi nấm - Chủng nấm phân lập được từ sau đĩ chuyển qua màu vàng, chế phẩm khi được nuơi cấy trên vàng nâu, da bị, hồng hoặc tím. mơi trường PDA, ban đầu sợi tơ nấm cĩ màu trắng, mềm, mịn. Sau 3 ngày, nấm chuyển sang màu hồng rồi màu hồng tím cho thấy sự xuất hiện của bào tử. - Giá bào tử trần đơn độc hoặc - Quan sát dưới kính hiển vi - Bào tử thành bĩ giá, phân nhánh khơng quang học x 100, sinh viên nhận đều hoặc thành vịng. Nhánh thấy sự xuất hiện của cuống bào mang ở đỉnh thể bình mọc thành tử phân nhánh mọc lên từ sợi vịng. Thể bình đơi khi đơn độc nấm. Phía trên cuống là thể bình trên các sợi nấm khơng phân dài với phần cuống phồng ở gốc, hĩa. Thể bình gồm phần gốc nhọn ở đầu và mọc thành từng hình trụ hoặc hình gần trứng và cụm. Tiếp trên thể bình là chuỗi phân ngọn thon nhỏ đột ngột bào tử dài với những bào tử cĩ thành một cổ dài. Bào tử trần dạng thoi và những đoạn bào tử 48
  61. Đồ án tốt nghiệp thuộc tipphialoconidi (tip cơ bản này cũng hay bị đứt ra. euconidi), khơng ngăn vách, khơng mu hoặc màu nhạt, nhẵn hoặc cĩ gai, thành chuỗi gốc non. Các chuỗi bào tử trần tách xa nhau, ít khi tụ họp thành khối - Hình thái đại thể - Hình thái vi thể Từ những so sánh trên, sinh viên khẳng định chủng nấm phân lập được từ cá thể bọ phấn trắng thuộc chi Paecilomyces. 49
  62. Đồ án tốt nghiệp 3.3. Định tính hệ enzyme ngoại bào cĩ khả năng đối kháng tuyến trùng và bọ phấn 3.3.1. Khả năng tổng hợp enzyme protease của 2 chủng nấm Paecilomyces Bảng 3.3. Kết quả sinh tổng hợp enzyme protease của 2 chủng nấm Paecilomyces sp1. và Paecilomyces sp2. Đường kính vịng phân giải (D), đường kính nấm (d) của 2 chủng Chỉ tiêu Paecilomyces theo dõi 1 NSC 2 NSC 3 NSC 4 NSC Chủng Paecilomyces sp1. D 1,233 ± 0,058 1,300 ± 0,100 2,100 ± 0,100 2,300 ± 0,100 D 0,567 ± 0,058 0,733 ± 0,058 1,533 ± 0,058 1,800 ± 0,000 D/d 2,189 ± 0,201 1,780 ± 0,196 1,369 ± 0,034 1,278 ± 0,056 Chủng Paecilomyces sp2. 1 NSC 2 NSC 3 NSC 4 NSC D 1,200 ± 0,100 1,533 ± 0,153 2,100 ± 0,100 2,900 ± 0,100 D 0,600 ± 0,000 0,900 ± 0,100 1,433 ± 0,058 2,233 ± 0,058 D/d 2,000 ± 0,167 1,706 ± 0,042 1,465 ± 0,036 1,298 ± 0,023 Ghi chú: NSC: ngày sau cấy, các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, ở mức ý nghĩa α= 0,05 theo trắc nghiệm LSD. 50
  63. Đồ án tốt nghiệp b c d a Hình 3.3. Sự phân giải casein của chủng Paecilomyces sp1. (a, b, c, d là vịng phân giải protease của chủng Paecilomyces sp1. qua 1, 2, 3, 4 ngày). a b c d Hình 3.4. Sự phân giải casein của chủng Paecilomyces sp2. (a, b, c, d là vịng phân giải protease của chủng Paecilomyces sp1. qua 1, 2, 3, 4 ngày). Dựa vào số liệu ở bảng 3.3 cĩ thể thấy, nấm Paecilomyces spp. cĩ khả năng sinh tổng hợp enzyme protease. Đây là enzyme cần thiết đối với lồi nấm ký sinh cơn trùng hay tuyến trùng. Tỷ lệ D/d cao nhất trong 1NSC trên mơi trường cĩ cơ chất cảm ứng là casein. Điều này là do, tản nấm được chuyển từ mơi trường PDA với nguồn cơ chất là D - Glucose sang mơi trường mới cĩ cơ chất là casein nên nấm sẽ tiết ra lượng lớn enzyme protease phân giải casein thành các amino acid để dễ sử dụng. Kích thước nấm cũng phát triển nhưng ít vì đây là cơ chất mới nên cần cĩ thời gian để nấm quen và sử dụng. Ở giai đoạn này tỷ lệ D/d đối với chủng Paecilomyces sp1. là 2,189 và đối với chủng Paecilomyces sp2. là 2,000. Sang đến những ngày sau, lúc này nấm đã quen và thích nghi với mơi trường mới nên nấm phát triển nhanh hơn. Nấm sẽ điều tiết ra một lượng enzyme vừa đủ để phân hủy casein nuơi bản thân phát triển. Do đĩ, các ngày sau tỷ lệ D/d thấp dần. 51
  64. Đồ án tốt nghiệp Đồng thời cũng theo J-O.Park et al. (2004), phần lớn những nấm ký sinh cơn trùng hay tuyến trùng thì tiết ra khá nhiều enzyme protease. Tuy nhiên, việc ký sinh cịn phải phụ thuộc vào những yếu tố khác nữa, trong đĩ cĩ enzyme chitinase. Như vậy, cả 2 chủng nấm Paecilomyces phân lập được đều cĩ khả năng sinh enzyme protease, điều này là hồn tồn phù hợp với các loại nấm ký sinh cơn trùng và tuyến trùng. 3.3.2. Khả năng tổng hợp enzyme chitinase của 2 chủng nấm Paecilomyces sp1. và Paecilomyces sp2. Bảng 3.4. Kết quả sinh tổng hợp enzyme chitinase của 2 chủng nấm Paecilomyces sp1. và Paecilomyces sp2. Đường kính vịng phân giải (D), đường kính nấm (d) của 2 chủng Chỉ tiêu Paecilomyces theo dõi 1 NSC 2 NSC 3 NSC 4 NSC Chủng Paecilomyces sp1. D (cm) 1,000 ± 0,000 1,700 ± 0,000 2,800 ± 0,000 2,867 ± 0,153 d (cm) 0,500 ± 0,000 0,633 ± 0,058 1,333 ± 0,058 1,667 ± 0,058 D/d 2,000 ± 0,000 2,698 ± 0,234 2,103 ± 0,089 1,719 ± 0,040 Chủng Paecilomyces sp2. D (cm) 1,333 ± 0,115 2,433 ± 0,058 2,833 ± 0,289 3,433 ± 0,058 d (cm) 0,633 ± 0,058 0,9 ± 0,000 1,367 ± 0,058 2,100 ± 0,000 D/d 2.111 ± 0,192 2,704 ± 0,064 2,070 ± 0,127 1,635 ± 0,027 Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, ở mức ý nghĩa α = 0,05 theo trắc nghiệm LSD. 52
  65. Đồ án tốt nghiệp a b c d Hình 3.5. Sự phân giải chitin của chủng Paecilomyces sp1. (a, b, c, d là vịng phân giải chitin của chủng Paecilomyces sp1. qua 1, 2, 3, 4 ngày sau cấy). a b c d Hình 3.6. Sự phân giải chitin của chủng Paecilomyces sp2. (a, b, c, d là vịng phân giải chitin của chủng Paecilomyces sp2. qua 1, 2, 3, 4 ngày sau cấy). Dựa vào số liệu bảng 3.4, cĩ thể nhận thấy rằng cả 2 chủng nấm đều cĩ khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase ngoại bào để phân giải chitin. Khi mới tiếp xúc với mơi trường cĩ cơ chất cảm ứng là chitin, khác hồn tồn so với mơi trường ban đầu là PDA cĩ cơ chất glucose, nấm sẽ phải tiết một lượng enzyme lớn để thủy phân cơ chất làm nguồn dinh dưỡng. Do đĩ, ở các ngày đầu nấm ít phát triển về kích thước và lượng enzyme tạo thành khá nhiều nên tỷ lệ D/d lớn hơn 2 ngày cịn lại. Sau đĩ, khi nấm đã thích nghi với mơi trường mới và một lượng lớn enzyme ở các ngày đầu tiết ra đã phân giải lượng lớn chitin thì nấm sẽ phát triển nhanh về kích thước, đồng thời do đã quen với nguồn cơ chất nên lượng enzyme tiết ra cũng được điều chỉnh về mức thích hợp do đĩ làm cho tỷ lệ D/d giảm dần ở ngày 3 và ngày 4. 53
  66. Đồ án tốt nghiệp Tĩm lại, cả 2 chủng Paecilomyces cĩ khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase ngoại bào, điều này phù hợp với những nghiên cứu trước đây đối với những lồi nấm cĩ khả năng ký sinh cơn trùng và tuyến trùng. 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố mơi trường sự phát triển của nấm 3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển nấm của chủng nấm Paecilomyces spp. 3.4.1.1. Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp1. Hình 3.7. Sự phát triển của Paecilomyces sp1. trên mơi trường cĩ pH khác nhau ở 14 ngày nuơi cấy. 54
  67. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.5: Sự ảnh hưởng của pH đến đường kính nấm Paecilomyces sp1. qua các ngày Cơng thức Đường kính nấm (cm) qua các ngày nuơi cấy 2 NSC 6 NSC 10 NSC 14NSC pH 5 1,050a ± 0,050 2.733b ± 0.153 4.700a ± 0.265 6.450a ± 0.150 pH 6 1,050a± 0,000 2.933a ± 0.058 4.612a ± 0.325 6.067ab ± 0.404 pH 7 1.100a 2.933a ± 0.058 4.567a ± 0.451 5.933ab ± 0.751 pH 8 0.933b ± 0.058 2.433c ± 0.058 3.967b ± 0.153 5.367c ± 0.153 Mức ý nghĩa Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, ( ): Khác biệt với mức ý nghĩa α= 0,05, theo trắc nghiệm LSD. Hình 3.8. Đường kính tản nấm chủng Paecilomyces sp1. ở các pH mơi trường 5, 6 ,7, 8 qua các ngày nuơi cấy 55
  68. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào bảng số liệu trên, cĩ thể thấy rằng khơng cĩ sự khác biệt về sự phát triển của Paecilomyces sp1. ở các pH 5, 6, 7 đối với sự phát triển của nấm. Cịn ở pH 8, chủng nấm luơn cĩ giá trị thấp nhất ở mỗi lần đo. Theo Fred Waner (2009), tuyến trùng gây hại thực vật được xem như là một sinh vật chỉ thị sinh học đối với pH thấp trong đất. Do vậy, để cĩ thể ký sinh trên tuyến trùng thì nấm Paecilomyces spp. phải cĩ khả năng thích nghi với điều kiện pH thấp. Xét ở ngày thứ 14 thấy rằng, đường kính nấm cĩ giá trị cao nhất ở pH 5 sau đĩ là pH 6, 7, 8. Điều này phù hợp vì nhiều nghiên cứu cho rằng, nấm Paecilomyces cĩ khoảng pH rộng, nhưng tốt nhất là ở pH hơi acid. Theo Bansal et al (1989), nấm ký sinh tuyến trùng P.lilacinus cĩ thể phát triển tốt nhất ở pH 5 và sự phát triển càng bị ức chế khi pH càng tăng cao (Rajeev K. Upadhyay, 2001). Đồng thời, khi quan sát hình thái các đĩa nấm thì thấy rằng, ở các pH 5,6,7 cĩ màu tím đậm hơn so với đĩa cĩ pH 8. Điều này chứng tỏ, nấm Paecilomyces sp1. cĩ khả năng tạo bào tử tốt ở pH trung tính và hơi acid. 3.4.1.2. Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp2. Hình 3.9. Nấm Paecilomyces sp2. ở pH 5,6,7,8 14 ngày sau cấy 56
  69. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6: Sự ảnh hưởng của pH đến đường kính nấm Paecilomyces sp2. qua các ngày Cơng thức Đường kính nấm (cm) qua các ngày nuơi cấy 2 NSC 6 NSC 10 NSC 14NSC pH 5 1,333 ± 0,104 3,717 ± 0,076 6,217ab ± 0,029 8,400 ± 0,100 pH 6 1,300 ± 0,000 3,633 ± 0,058 6,083b ± 0,126 8,501 ± 0,100 pH 7 1,250 ± 0,087 3,633 ± 0,104 6,150ab ± 0,132 8,433 ± 0,115 pH 8 1,367 ± 0,058 3,717a± 0,076 6,300a ± 0,087 8,467 ± 0,058 Mức ý NS NS NS nghĩa Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, NS: Khơng cĩ sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05, ( ): Khác biệt với mức ý nghĩa ý nghĩa α = 0,05, theo trắc nghiệm LSD. Hình 3.10. Đường kính tản nấm chủng Paecilomyces sp2. ở các pH mơi trường 5, 6, 7, 8 qua các ngày nuơi cấy 57
  70. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào số liệu bảng 3.6 và biểu đồ, cĩ thể thấy rằng chủng nấm Paecilomyces sp2. phát triển khá đồng đều ở các pH 5 - 8 cũng như khơng cĩ sự khác biệt nhiều về màu sắc nấm khi quan sát bằng mắt thường. Theo Sung Mi Shim et al. (2003) pH phù hợp cho sự phát triển của nấm ký sinh cơn trùng Paecilomyces fumosoroseus là từ 5 đến 9, nhưng tốt nhất là ở pH 6. Cịn Choi et al. (1999) sợi nấm của P. japonica phát triển tốt nhất ở pH 7. Ngồi ra Shim et al. (2003) đề cập rằng P.sinclairii phát triển tốt nhất ở mơi trường PDA pH 8. Như vậy cĩ thể thấy rằng sự phát triển của nấm Paecilomyces ký sinh cơn trùng cĩ phổ rộng và tùy từng lồi sẽ cĩ pH tối ưu riêng. 3.4.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. 3.4.2.1. Ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp1. a b c d Hình 3.11. Nấm Paecilomyces sp1. ở ngày thứ 14 sau khi cấy (a. mơi trường PDA, b. mơi trường Malt agar, c. mơi trường Sabouraud, d. mơi trường Czapeck - Dox) 58
  71. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7: Ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy đến sự phát triển đường kính nấm Paecilomyces sp1. qua các ngày. Cơng thức Đường kính nấm (cm) qua các ngày nuơi cấy 2 NSC 6 NSC 10 NSC 14NSC PDA 1,333a ± 0,058 4,500b ± 0,100 5,633b ± 0,058 7,567b ± 0,153 MA 1,400a ± 0,000 4,733a ± 0,153 5,933a ± 0,058 7,967a ± 0,058 CZA 1,133b ± 0,058 3,983c ± 0,029 4,967d ± 0,058 5,900c ± 0,000 SB 1,133b ± 0,058 4,467b ± 0,115 5,500c ± 0,100 7,333b ± 0,231 Mức ý nghĩa Ghi chú: Các giá trị được biểu diễn ở dạng TB ± SD, P: mơi trường PDA, M: mơi trường Malt, C: mơi trường Czapeck - Dox, S: mơi trường Sabouraud + KC, NS: Khơng cĩ sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05; ( ): Khác biệt với mức ý nghĩa ý nghĩa α = 0,05 theo trắc nghiệm LSD. 59
  72. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.12. Sự phát triển của Paecilomyces sp1. trên các mơi trường khác nhau qua các ngày. Dựa vào số liệu bảng 3.7 và biểu đồ, cĩ thể thấy đường kính nấm đạt giá trị cao nhất ở mơi trường malt, tiếp đĩ là mơi trường PDA, Sabouraud-KC và cuối cùng là Czapeck - Dox. Điều này là phù hợp theo nghiên cứu của Sung Mi Shim (2003) rằng cĩ sự chênh lệch về sự phát triển của nấm trên hai mơi trường PDA (6,73 cm sau 14 ngày nuơi cấy) và Czapeck - Dox (6,25 cm sau 14 ngày nuơi cấy).Mặc dù mơi trường Czapeck - Dox cĩ nhiều thành phần khống nhưng hàm lượng đường chỉ chiếm 1% nên điều này hạn chế phần nào sự phát triển của tơ nấm và tạo điều kiện hình thành bào tử sớm hơn các mơi trường cịn lại (quan sát thấy xuất hiện màu tím trên tản nấm). Cịn ở mơi trường Sabouraud-KC tuy hàm lượng khống ít hơn nhưng lại cĩ hàm lượng đường đến 4% cùng nguồn protein, vitamin cĩ trong peptone hỗ trợ tốt cho sự phát triển của nấm nên ở mơi trường này tơ nấm phát triển tốt hơn. Cịn ở mơi trường PDA, hàm lượng đường chiếm 2% (ít hơn so với mơi trường Sabouraud - KC), protein chiếm 2% cùng nhiều khống chất và các vitiamin (Wikipedia), do đĩ ở mơi trường PDA nấm phát triển tốt hơn 2 mơi trường trước. Và nấm phát triển tốt nhất ở mơi trường malt bởi vì trong dịch malt ,thành phần amino acid và peptide chiếm 5 - 7% chất hịa tan (Nguyễn Hồi Hương, 2009) 60
  73. Đồ án tốt nghiệp nhiều khống chất, cùng với một số vitamin. Lượng đường chiếm tới 60 - 63% trong dịch malt, trong đĩ là đường maltose và các đường đơn khác. Tĩm lại mơi trường thích hợp cho sự phát triển của nấm Paecilomyces sp1. là mơi trường malt. 3.4.2.2. Ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp2. b a c d Hình 3.13. Nấm Paecilomyces sp2. ở ngày thứ 14 sau khi cấy (a. Mơi trường PDA, b. Mơi trường Malt agar, c. Mơi trường Sabouraud, d. Mơi trương Czapeck -Dox) 61
  74. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.8: Ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy đến sự phát triển đường kính nấm Paecilomyces sp2. qua các ngày. Cơng thức Đường kính nấm (cm) qua các ngày nuơi cấy 2 NSC 6 NSC 10 NSC 14NSC P 1,367 ± 0,029 3,650a ± 0,050 5,900a ± 0,100 8,067a ± 0,058 M 1,367 ± 0,058 3,600ab ± 0,100 5,900a ± 0,100 8,133a ± 0,153 C 0,967 ± 0,058 2,900c ± 0,100 4,700b ± 0,100 6,767c ± 0,058 S 1,367 ± 0,058 3,500b ± 0,000 5,733a ± 0,058 7,867b ± 0,058 Mức ý NS nghĩa Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, P: mơi trường PDA, M: mơi trường Malt, C: mơi trường Czapeck - Dox, S: mơi trường Sabouraud + KC, NS: Khơng cĩ sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05, ( ): Khác biệt với mức ý nghĩa ý nghĩa α = 0,05, theo trắc nghiệm LSD. 62
  75. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.14. Sự phát triển của Paecilomyces sp2. trên các mơi trường khác nhau qua các ngày. Dựa vào bảng số liệu và biểu đồ ở ngày 14 cĩ thể thấy rằng trong mơi trường Malt nấm phát triển tốt nhất, sau đĩ đến mơi trường PDA, Sabouraud và Czapeck - Dox. Theo Archana MR và Ramaswamy K (2012), nấm Paecilomyces ký sinh cơn trùng cĩ sự phát triển khơng đồng đều giữa 3 mơi trường: PDA, Sabouraud-KC và Czapeck - Dox. Trong đĩ, nấm sẽ phát triển mạnh nhất trong mơi trường PDA với đường kính sau 1 tuần là 5,1 cm. Tiếp đến là mơi trường Sabouraud với đường kính nấm là 4,06 cm và Czapeck - Dox với 4 cm. Ngồi ra, cĩ nhiều lồi ký sinh cơn trùng phát triển rất nhanh trên mơi trường dinh dưỡng Malt agar là: Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces lilacinus, Paecilomyces aerugineus . Điều này cũng được giải thích như với chủng Paecilomyces sp1. Tĩm lại, mơi trường tốt nhất cho sự phát triển của Paecilomyces sp2. là mơi trường Malt agar. 63
  76. Đồ án tốt nghiệp 3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm 3.4.3.1. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp1. a b Hình 3.15. Tản nấm Paecilomyces sp1. ở ngày thứ 14 sau nuơi cấy a) Ở điều kiện 12h sáng/12h tối; b) Ở điều kiện tối liên tục. Bảng 3.9: Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển đường kính của Paecilomyces sp1. Cơng thức Đường kính nấm (cm) qua các ngày nuơi cấy 2 NSC 6 NSC 10 NSC 14NSC ST 1,217 ± 0,029 2,233b ± 0,153 5,033 ± 0,115 6.433 ± 0,058 T 1,217 ± 0,029 2,600a ± 0,000 5,117 ± 0,352 6,533 ± 0,058 Mức ý NS NS NS nghĩa Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, ST: điều kiện 12h sáng/12h tối, T: điều kiện liên tục tối, NS: Khơng cĩ sự khác biệt ở mức ý nghĩa α = 0,05 theo trắc nghiệm LSD. 64
  77. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.16. Sự phát triển của Paecilomyces sp1. ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau Dựa vào số liệu bảng 3.9 và biểu đồ, cĩ thể thấy rằng khơng cĩ sự khác nhau về sự phát triển của nấm dưới ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng qua các ngày nuơi cấy. Tuy nhiên ở ngày 6 sau nuơi cấy, đường kính nấm của chủng nấm ở điều kiện tối liên tục phát triển tốt hơn so với 12h sáng/12h tối. Điều này cĩ thể là do sự thay đổi nhiệt độ của mơi trường làm ảnh hưởng đến chủng nấm đặt ngồi mơi trường 12h sáng/12h tối. Xét ở ngày thứ 14, đường kính tản nấm chủng Paecilomyces sp1. trong điều kiện 12h sáng/12h tối là 6,433 cm khơng khác biệt so với điều kiện tối liên tục là 6,533. Theo nghiên cứu của của Li Gao et al. (2009), đối với chủng P.lilacinus M - 14 cĩ khả năng ký sinh tuyến trùng thì trong điều kiện tối hồn tồn nấm phát triển tốt (56,58 mg/cm2); cịn điều kiện 12h sáng/12h tối nấm đạt giá trị 55,05 mg/cm2 (ởngày thứ 14). Điều này hợp lý vì tuyến trùng gây bệnh sần rễ là lồi sống trong đất, nên điều kiện sống thích hợp của Paecilomyces sp1. phải là nơi ít ánh sáng để phù hợp với ký chủ của nĩ. Đồng thời khi quan sát màu sắc tản nấm thì thấy trong điều kiện 12h sáng/12h tối thì nấm cĩ màu tím đậm hơn và dày hơn so với điều kiện 65
  78. Đồ án tốt nghiệp tối liên tục. Điều này cĩ thể thấy rằng, nếu cĩ ánh sáng, nấm Paecilomyces sẽ tạo bào tử nhiều hơn (Trần Văn Mão, 2002). 3.4.3.2. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp2. a b c d Hình 3.17. Tản nấm Paecilomyces sp2. ở ngày thứ 14 sau nuơi cấy a,b) Ở điều kiện 12h sáng/12h tối; c,d) Ở điều kiện tối liên tục. 66
  79. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.10. Số liệu sự phát triển của nấm dưới các điều kiện chiếu sáng qua các ngày nuơi cấy. Cơng thức Đường kính nấm (cm) qua các ngày nuơi cấy 2 NSC 6 NSC 10 NSC 14NSC ST 1,383 ± 0,029 3,633 ± 0,076 5,867 ± 0,058 8,100 ± 0,100 T 1,400 ± 0,000 3,717 ± 0,029 6,100 ± 0,000 8,250 ± 0,050 Mức ý NS NS NS NS nghĩa Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, ST: điều kiện 12h sáng/12h tối, T: điều kiện liên tục tối, NS: Khơng cĩ sự khác biệt ở mức ý nghĩa α = 0,05 theo trắc nghiệm LSD. Hình 3.18. Sự phát triển của Paecilomyces sp2. ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau Dựa vào bảng số liệu, nhận thấy khơng cĩ khác biệt về sự phát triển của nấm Paecilomyces sp2. ở 2 điều kiện chiếu sáng. Điều này cĩ thể giải thích là mặc dù được phân lập từ bọ phấn - một ký chủ sống ở điều kiện 12h sáng/12h tối, song các 67
  80. Đồ án tốt nghiệp chủng nấm mà ký sinh bọ phấn như Paecilomyces fumososeus vẫn cĩ thể thường xuyên được tìm thấy trong đất (Domsch và Gams, 1972). Cũng cĩ thể nhận thấy bằng mắt thường, ở điều kiện 12h sáng/12h tối thì tản nấm cĩ màu tím đậm hơn, và ở điều kiện này tản nấm phát triển cĩ các vịng trịn đồng tâm nhiều hơn và khít hơn là so với điều kiện tối liên tục. Theo Trần Văn Mão (2002), ánh sáng là nhân tố khơng thể thiếu trong sự hình thành bào tử của nấm Paecilomyces spp. Cũng theo Brown và Smith (1957) thì lồi nấm ký sinh tuyến trùng Paecilomyces sẽ cĩ màu tím nhạt hơn khi được nuơi cấy và phát triển trong điều kiện tối. 3.5. Khả năng ký sinh bọ phấn của 2 chủng Paecilomyces sp1. và Paecilomyces sp2. Bảng 3.11: Hiệu lực diệt bọ phấn Hiệu lưc diệt bọ phấn Cơng thức 4 ngày 5 ngày 6 ngày Phun nấm 0 0 0 Paecilomyces sp1. Phun nấm 22% 24% 86% Paecilomyces sp2. Nước cất 0 0 0 Ghi chú: Hiệu lực được hiệu đính theo cơng thức Abbot (1925) Nồng độ 108 bào tử/ml Sau khi phun thì cá thể bọ phấn ở cả 3 cơng thức đều bị chết. Các cá thể bị chết được đem cho vào đĩa petri cĩ đặt giấy hút ẩm, cho nước cất vào tạo độ ẩm để tăng khả năng hình thành nấm trên các cá thể. Sau đĩ, tiến hành quan sát và thấy chỉ cĩ những cá thể bọ phấn bị chết trong cơng thức phun nấm Paecilomyces sp2. là xuất hiện tơ nấm màu trắng rồi màu tím hồng. Sinh viên tiến hành phân lập lại, kết quả phân lập cho 68
  81. Đồ án tốt nghiệp thấy đặc điểm đại thể và vi thể của chủng phân lập được từ bọ phấn giống với chủng Paecilomyces sp2. đã phân lập ban đầu. Dựa vào số liệu ở bảng 3.11 cĩ thể thấy, hiệu lực diệt bọ phấn của Paecilomyces sp2. là 86%. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Claire Vidal et al là tỷ lệ ký sinh của nấm Paecilomyces trên bọ phấn là trên 70% sau một tuần. Như vậy, chủng Paecilomyces sp1. khơng cĩ khả năng ký sinh bọ phấn, cịn chủng Paecilomyces sp2. cĩ khả năng ký sinh bọ phấn. a b c d Hình 3.19. Mẫu bọ phấn khơng bị ký sinh được soi bằng kính hiển vi quang học a) độ phĩng đại 10 lần; b) độ phĩng đại 100 lần Mẫu bọ phấn bị ký sinh được soi bằng kính hiển vi quang học c) độ phĩng đại 10 lần; d) độ phĩng đại 100 lần. 69
  82. Đồ án tốt nghiệp 3.6. Khả năng ký sinh con cái và tuyến trùng Meloidogyne spp. của 2 chủng nấm Paecilomyces Bảng 3.12. Đánh giá khả năng ký sinh tuyến trùng của 2 chủng Paecilomycessp1. và sp2. Số tuyến trùng bị chết do Cơng thức Số tuyến trùng thử nghiệm mọc nấm Paecilomyces sp1. 10 10 Paecilomyces sp2. 10 0 Nước cất 10 0 a b c d e f Hình 3.20. Mẫu tuyến trùng được soi bằng kính hiển vi quang học a) Tuyến trùng cái trước khi cho tiếp xúc với Paecilomyces sp1. b-f) Tuyến trùng cái sau khi cho tiếp xúc với Paecilomyces sp1. ở ngày 3, 5, 7, 9, 11. 70
  83. Đồ án tốt nghiệp Sau khi cấy tuyến trùng vào đĩa cĩ chứa nấm Paecilomyces sp1. và quan sát theo ngày thì thấy được: ở ngày thứ 3, sợi nấm đã phát triển một ít trên tuyến trùng. Điều này cĩ thể giải thích là bào tử của nấm đã bám vào tuyến trùng, phá hủy lớp vỏ và xâm nhiễm vào tuyến trùng bằng các enzyme như protease và chitinase (Khan et al., 2004), sau đĩ sử dụng chất dinh dưỡng cĩ trong ký chủ để hình thành sợi nấm. Qua nhiều các ngày tiếp theo, nấm phát triển và bám kín cả tuyến trùng, dần phá hủy bên trong làm cho tuyến trùng bị biến dạng hồn tồn và chết đi. Từ đĩ cĩ thể thấy rằng, chủng Paecilomyces sp1. cĩ khả năng ký sinh trên tuyến trùng cái. b a Hình 3.21. Tuyến trùng được soi bằng kính hiển vi sau khi bị gây nhiễm bởi nấm Paecilomyces sp2. a,b) Tuyến trùng cái sau 3 ngày cho tiếp xúc với Paecilomyces sp2. Chủng Paecilomyces sp2. cũng được thực hiện thí nghiệm tương tự như chủng Paecilomyces sp1. Tuy nhiên, sau khi quan sát thấy được, mặc dù các sợi nấm đã phát triển song chúng khơng bám vào tuyến trùng. Và tuyến trùng vẫn giữ nguyên hình thái ban đầu. Do đĩ, đây khơng phải là ký chủ của chủng này. Đây chỉ là thử nghiệm bước đầu vì số cá thể tuyến trùng để thử nghiệm cịn ít (10 tuyến trùng). Nhưng qua kết quả thử nghiệm cĩ thể khẳng định rằng, cĩ sự ký sinh của nấm Paecilomyces đối với tuyến trùng vì ở mẫu đối chứng khơng cĩ sự xuất hiện sợi tơ nấm bám vào. Điều này là tiền đề cho những nghiên cứu sau. Như vậy, chủng Paecilomyces sp1. cĩ khả năng ký sinh tuyến trùng, cịn chủng Paecilomyces sp2. khơng cĩ khả năng ký sinh tuyến trùng. 71