›

Đồ án Khảo sát sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép củ tỏi Lý Sơn (Allium sativum L.)

pdf 74 trang thiennha21 12/04/2022 6230
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép củ tỏi Lý Sơn (Allium sativum L.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_su_phat_sinh_hinh_thai_tu_mau_cay_lop_mong_de.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép củ tỏi Lý Sơn (Allium sativum L.)

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI TỪ MẪU CẤY LỚP MỎNG ĐẾ TÉP CỦ TỎI LÝ SƠN (Allium sativum L.) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. Trần Trọng Tuấn ThS. Nguyễn Thị Huyền Trang Sinh viên thực hiện : Đoàn Phạm Khánh Linh MSSV: 1151110183 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài này là do chính tôi thực hiện, các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong đề tài là trung thực, không sao chép từ bất kỳ nghiên cứu nào của tác giả khác, đề tài không trùng với bất kỳ đề tài nghiên cứu khoa học nào. Nội dung đề tài có tham khảo và sử dụng một số thông tin, tài liệu. Những thông tin tham khảo trong khóa luận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng và được liệt kê trong danh mục các tài liệu tham khảo. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015 Đoàn Phạm Khánh Linh
  3. LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thầy ThS. Trần Trọng Tuấn và ThS. Nguyễn Thị Huyền Trang đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài này với sự tân tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình nghiên cứu. Xin gửi đến chị Thuý, anh Thăng, chị Tâm, em Tuyền, em Dương và các anh chị cán bộ tại phòng Thí nghiệm Trọng điểm, Viện Sinh học Nhiệt đới lòng biết ơn của em vì đã tận tâm giúp đỡ em hoàn thành báo cáo này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã giảng dạy và cung cấp cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian em theo học tại trường. Cảm ơn những người bạn thực hiện đồ án tốt nghiệp cùng phòng đã giúp đỡ mình, đặc biệt là bạn Thái và bạn Tiên đã cùng mình chia sẻ những khó khăn trong thời gian thực hiện đồ án và những buồn vui trong cuộc sống. Cảm ơn tập thể lớp 11DSH04 đã tạo những kỷ niệm đẹp bên nhau trong suốt quãng đời sinh viên ngắn ngủi này. Trên tất cả, con xin gửi lời cảm ơn từ tận đáy lòng với sự kính trọng yêu thương sâu sắc đến ba mẹ vì đã luôn ủng hộ và tạo những điều kiện tốt nhất cho con theo đuổi ước mơ của mình và là chỗ dựa vững chắc nhất. Cuối cùng, em xin kính chúc quý thầy cô, quý cơ quan cùng gia đình, bạn bè luôn khoẻ mạnh, hạnh phúc và thành công. Đoàn Phạm Khánh Linh
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii LỜI MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Đối tƣợng và mục đích nghiên cứu 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 2 4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 6. Kết quả đạt đƣợc 3 7. Kết cấu của đề tài 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1 Giới thiệu chung về cây tỏi 5 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 5 1.1.2 Đặc điểm hình thái 7 1.2 Thành phần hóa học và công dụng của cây tỏi 8 1.2.1 Thành phần hóa học 8 1.3 Tình hình sản xuất tỏi trên thế giới và tại Việt Nam 12 1.3.1 Trên thế giới 12 1.3.2 Tại Việt Nam 13 1.4 Giới thiệu nuôi cấy lớp mỏng tế bào 14 1.4.1 Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào (TCL) 14 1.4.2 Một số nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào 15 1.5 Giới thiệu về hiện tƣợng xuân hóa 17 1.5.1 Định nghĩa xuân hóa 17 1.5.2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiện tƣợng xuân hóa 17 1.5.3 Một số nghiên cứu về hiện tƣợng xuân hóa 18 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.6 Giới thiệu về chất điều hòa sinh trƣởng 19 1.6.2 Cytokinin 21 1.7 Tình hình nghiên cứu cây tỏi trên thế giới và Việt Nam 22 1.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 22 1.7.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 24 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 26 2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 26 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.3 Vật liệu 26 2.3.1 Nguồn mẫu 26 2.3.2 Môi trƣờng 26 2.3.3 Điều kiện nuôi cấy 26 2.3.4 Trang thiết bị và dụng cụ 27 2.3.5 Xử lý thống kê 27 2.4 Phƣơng pháp 27 2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng chế độ khử trùng tạo mẫu sạch 27 2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 28 2.4.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 31 2.4.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA, NAA kết hợp lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi ở nhiệt lạnh 5C 33 2.5 Cách thu các chỉ tiêu khảo sát 34 2.5.1 Tỷ lệ mẫu nhiễm và tỷ lệ mẫu sống vô trùng 34 2.5.2 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, tỷ lệ mẫu tạo chồi và tỷ lệ mẫu tạo rễ 34 2.5.3 Số lƣợng chồi trung bình, số lƣợng rễ trung bình 35 2.5.4 Giải phẫu, quan sát phát sinh hình thái 35 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Ảnh hƣởng chế độ khử trùng tạo mẫu 37 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ BA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 40 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 46 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ BA, NAA kết hợp lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi với nguồn mẫu đƣợc xử lý ở nhiệt độ lạnh 5C 51 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Kiến nghị 59 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4 - D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 2ip : 6-(3-methyl-2-butenylamino)purine B5 : Môi trƣờng Gamborg BA : Benzyladenine ĐC : Đối chứng CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật KIN : Kinetin lTCL : Long Thin Cell Layer MS : Môi trƣờng Murashige và Skoog (1962) NAA : Naphthalene acetic acid SD-dome : Stem-disc dome TCL : Thin Cell Layer tTCL : Transverse Thin Cell Layer Tp.HCM : Thành Phố Hồ Chí Minh iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Giá trị dinh dƣỡng của tỏi 9 Bảng 1.2 Top 10 nƣớc sản xuất tỏi lớn nhất thế giới trong năm 2010 13 Bảng 2.1 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng thời gian khử trùng mẫu . 28 Bảng 2.2 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 30 Bảng 2.3 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 32 Bảng 2.4 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA và NAA kết hợp lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi với nguồn mẫu đƣợc xử lý ở nhiệt độ lạnh 5C .34 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng mẫu 39 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ BA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 41 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 47 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ BA và NAA két hợp lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tỏi với nguồn mẫu ở nhiệt độ lạnh 5ᵒC 53 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng mẫu 39 Biểu đồ 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ BA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi với nguồn mẫu ở nhiệt độ phòng. 42 Biểu đồ 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ BA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi với nguồn mẫu ở nhiệt độ lạnh 5C. 42 Biểu đồ 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh tạo mô sẹo từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi. 48 Biểu đồ 3.5 Ảnh hƣởng nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý lên sự phát sinh tạo chồi từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi. 48 Biểu đồ 3.6 Ảnh hƣởng nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý lên sự phát sinh tạo rễ từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi. 49 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình thái tỏi (Allium sativum) 6 Hình 3.1 Mẫu cấy lớp mỏng đế trên môi trƣờng bổ sung BA 44 Hình 3.2 Mẫu cấy lớp mỏng đế trên môi trƣờng bổ sung NAA 50 Hình 3.3 Hình thái mẫu cấy trên môi trƣờng bổ sung BA và NAA kết hợp . 55 Hình 3.4 Hình thái mô sẹo trên môi trƣờng bổ sung BA và NAA kết hợp dƣới kính soi nổi. 56 Hình 3.5 Hình thái giải phẫu mẫu cấy tỏi sau 4 tuần nuôi cấy 57 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngày nay, khoa học kỹ thuật ngày càng tiến bộ và phát triển, bên cạnh đó nhu cầu tăng cƣờng sức khỏe, làm đẹp gia tăng. Khuynh hƣớng quay về với thiên nhiên, thảo mộc, thảo dƣợc tìm tòi ra các phƣơng thức truyền thống an toàn, đảm bảo sức khỏe ngày càng đƣợc chú trọng. Thảo dƣợc đƣợc ƣa chuộng bởi tính an toàn sinh học, không có hay ít có tác dụng phụ, thậm chí chƣa tìm thấy vi khuẩn kháng thuốc (Seyyednejad và cộng sự, 2010) [38]. Bởi lý đó thảo dƣợc, thảo mộc thiên nhiên ngày càng đóng vai trò quan trọng trong việc phòng, chữa bệnh và làm đẹp cho mọi ngƣời. Nhiều loài thực vật là nguồn nguyên liệu quý cho ngành y học dân tộc cũng nhƣ y học hiện đại và cũng là nguồn có giá trị kinh tế trong dƣợc phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm, hƣơng liệu, Tỏi là một dƣợc liệu quý trong ngành dƣợc phẩm, với vô vàn công dụng. Từ xa xƣa tỏi đã đƣợc mệnh danh là thần dƣợc, thuốc bách bệnh, là món quà kì diệu của thiên nhiên ban tặng. Không chỉ là một loại gia vị quen thuộc hằng ngày để tăng cƣờng mùi vị món ăn nhờ vào mùi thơm đặc trƣng, mà theo kinh nghiệm dân gian và những nghiên cứu đã chứng minh ngoài tính kháng khuẩn tỏi còn có tác dụng chữa trị rất nhiều loại bệnh từ đƣờng tiêu hóa cho đến các loại bệnh nhƣ: tim mạch, huyết áp, phòng chống ung thƣ, giảm viêm khớp và đặc biệt là tỏi có khả năng kháng khuẩn rất tốt. Vào năm 1944, Cavallito và cộng sự phát hiện trong khi nghiền nát củ tỏi (Allium sativum L.) có chất allicin, là một hợp chất kháng sinh và kháng nấm (phytoncide) [19]. Nghiên cứu của Yamada và cộng sự (1977) cho thấy allicin nguyên chất trong điều kiện in vitro ức chế cả sự nảy mầm của bào tử lẫn phát triển sợi nấm [37]. Một bác sĩ thuộc Viện y học Sơn Đông Trung Quốc xác nhận rằng tỷ lệ ung thƣ dạ dày ở những ngƣời thƣờng xuyên ăn tỏi thấp hơn 60% so với những ngƣời khác cùng khu vực. Ở trƣờng Đại học tại bang Texas và Los Angeles (Mỹ) đã phát hiện nƣớc tỏi chiết có tác dụng ức chế một số bệnh ung thƣ ác tính và đề phòng ung thƣ da. 1
  12. Đồ án tốt nghiệp Việt Nam ta có rất nhiều vùng trồng tỏi, nhƣng nổi tiếng thơm ngon nhất và có giá trị kinh tế là tỏi Lý Sơn – Quảng Ngãi, đƣợc mệnh danh là “Vua tỏi” Lý Sơn. Tỏi Lý Sơn thơm, có vị cay đặc trƣng, củ nhỏ, đều, các nhánh tỏi (tép tỏi) rất đều nhau. Với những điều kiện đặc trƣng về thổ nhƣỡng, khí hậu, cùng với hƣơng vị và chất lƣợng của giống cây, tỏi Lý Sơn đã mang lại thƣơng hiệu riêng cho mình. Với những công dụng thần kỳ mà hiếm có loài cây nào có đƣợc đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu, với mục đích tìm ra các phƣơng thức thức truyền thống an toàn, đảm bảo sức khỏe. Những sản phẩm thƣơng mại hóa đƣợc ra đời, nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng của con ngƣời. Hiện nay, thời tiết luôn diễn biến thất thƣờng, cùng với sự cạn kiệt nguồn cát trắng, việc nhân giống gặp nhiều trở ngại, đặc biệt cây tỏi dễ mắc các bệnh do tuyến trùng, nấm, virus khiến cho việc thu trồng tỏi Lý Sơn trở nên ngày càng khó khăn hơn. Bên cạnh đó nhu cầu sử dụng ngày càng cao không chỉ dùng làm gia vị, mà còn đƣợc dùng làm mỹ phẩm, thuốc chữa nhiều loại bệnh. Vì vậy giống tỏi Lý Sơn luôn cần đƣợc đáp ứng và bảo vệ nguồn giống. Với thực tiễn đó, chúng tôi đã chọn đề tài “Khảo sát sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép củ tỏi Lý Sơn (Allium sativum L.)”, nhằm góp phần tạo ra những cây tỏi khỏe mạnh sạch bệnh, nâng cao chất lƣợng và có thể sản xuất quanh năm, góp phần cùng ngƣời dân trên Đảo Lý Sơn tìm lối thoát cho cây tỏi. 2. Đối tƣợng và mục đích nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Củ tỏi đƣợc thu hoạch ở Lý Sơn – Quảng Ngãi. - Mục đích nghiên cứu: Khảo sát sự phát sinh hình thái từ nguồn mẫu là đế tép tỏi Lý Sơn (Allium sativum L.), làm tiền đề cho các nghiên cứu về vi nhân giống, nuôi cấy tế bào hay tạo phôi vô tính. Giai đoạn đầu của quá trình vi nhân giống từ đó nhằm tạo ra số lƣợng lớn, đồng nhất về chất lƣợng, rút ngắn thời gian nhân giống, góp phần tạo những cây giống khỏe mạnh và sạch bệnh. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát ảnh hƣởng của chế độ khử trùng mẫu. 2
  13. Đồ án tốt nghiệp - Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ lớp cắt mỏng đế tép tỏi. - Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ lớp cắt mỏng đế tép tỏi. - Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA và NAA kết hợp lên sự phát sinh hình thái từ lớp cắt mỏng đế xử lý ở nhiệt độ lạnh (5C). 4. Phƣơng pháp nghiên cứu Các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên LSD. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi bình cấy 3 mẫu, kết quả là trị số của 3 lần lặp lại. Các số liệu thu thập đƣợc xử lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV.I và Microsoft Excel 2010. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Đề tài đã đƣa ra đƣợc các minh chứng về tác động của phƣơng pháp khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cấy, tác động của CĐHSTTV và hiện tƣợng xuân hóa đến khả năng phát sinh hình thái. Kết quả nghiên cứu đề tài có thể sử dụng nguồn nguyên liệu để nghiên cứu trong nuôi cấy huyền phù tế bào và phôi. Góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lƣợng tốt, ứng dụng vào sản xuất nhằm nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành sản xuất tỏi Lý Sơn. 6. Kết quả đạt đƣợc ‒ Xác định đƣợc thời gian khử trùng thích hợp nhất cho việc khử trùng tạo mẫu sạch. ‒ Xác định ảnh hƣởng nồng độ BA và nhiệt độ lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi ở nhiệt độ phòng. ‒ Xác định ảnh hƣởng nồng độ NAA và nhiệt độ lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi ở nhiệt độ lạnh (5C). ‒ Xác định ảnh hƣởng nồng độ BA, NAA kết hợp lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi ở nhiệt độ lạnh (5C). 3
  14. Đồ án tốt nghiệp 7. Kết cấu của đề tài Đề tài bao gồm các chƣơng sau: Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu. Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp. Chƣơng 3: Kết quả và thảo luận. Chƣơng 4: Kết luận và kiến nghị. 4
  15. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây tỏi 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 1.1.1.1 Nguồn gốc Giới : Plantae Bộ : Asparagales Họ : Alliaceae Phân họ : Allioideae Chi : Allium Loài : A. sativum Tỏi có tên khoa học là Alliums sativum L. thuộc họ Hành tỏi (Alliaceae) và có nguồn gốc ở Trung cận Đông: (Afghanistan, Iran). Đó là những vùng có nắng nhiều, độ ẩm không khí thấp, biên độ nhiệt ngày và đêm giữa các mùa chênh lệch rõ rệt. ‒ Tên gọi khác: Tỏi ta, Hồ (vị thuốc), Đại toán (vị thuốc). ‒ Tên tiếng anh: Garlic, (Leek – chỉ loại tỏi khác). ‒ Tên đồng nghĩa: Allium sativum var sativum. 5
  16. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1 Hình thái tỏi (Allium sativum L.). a) Cây tỏi; b,c) Mô phỏng cấu trúc chi tiết cắt dọc củ tỏi. 1.1.1.1 Phân loại [39] Theo các nhà phân loại thực vật, trong loài Allium sativum có 2 thứ (loài phụ). Trong đó, thứ Allium sativum var. ophioscorodon, còn đƣợc gọi là nhóm tỏi cổ cứng, bao gồm: tỏi sứ (porcelain garlics); tỏi tầm (rocambole garlics) và tỏi sọc tía (purple stripe garlics). Thứ Allium sativum var. sativum, còn đƣợc gọi là nhóm tỏi cổ mềm, bao gồm: tỏi atisô (artichoke garlics), tỏi bạc (silverkin garlics) và tỏi creole. Đặc biệt, nhóm tỏi cổ cứng là nguồn gốc tổ tiên ban đầu của loài Allium sativum, còn nhóm tỏi cổ mềm là nhóm giống đã cải tiến thông qua quá trình phát triển và chọn lọc của tự nhiên. 6
  17. Đồ án tốt nghiệp 1.1.1.2 Phân bố [43] Chi Hành (Allium) là chi thực vật có chứa hành, tỏi với khoảng 1.250 loài, thông thƣờng đƣợc phân loại trong họ Hành (Alliaceae). Một số nhà thực vật học đã từng phân loại nó trong họ Loa kèn (Liliaceae). Các cây thuộc chi hành là các loại thực vật sống lâu năm có thân phình ra thành củ giống nhƣ củ hành. Chúng phát triển tốt trong vùng ôn đới của Bắc bán cầu, ngoại trừ một số loài có mặt ở Chile (loài Allium juncifolium), Brazil (loài Allium sellovianum) hoặc nhiệt đới châu Phi (loài Allium spathaceum). 1.1.2 Đặc điểm hình thái Chiều cao thân cây của chúng dao động từ 5 – 150 cm. Các hoa tạo thành dạng hoa tán ở trên đỉnh của thân cây không có lá. Các chồi (thân cây có lá đã biến đổi hay các gốc lá dày đặc, trong cách gọi thông thƣờng là củ) dao động về kích thƣớc giữa các loài, từ rất nhỏ (đƣờng kính khoảng 2 – 3 mm) đến rất lớn (8 – 10 cm). Một số loài (chẳng hạn hành tăm A. schoenoprasum) phát triển các gốc lá dày đặc chứ không tạo ra chồi nhƣ những loài khác. Phần lớn các chồi cây trong các loài thuộc chi hành đều gia tăng bằng cách tạo ra các chồi nhỏ hay “mầm cây” xung quanh chồi già, cũng nhƣ bằng cách phát tán hạt. Mỗi vài loài có thể tạo ra nhiều củ (quả) nhỏ trong cụm hình đầu ở gốc lá; tạo ra cụm nhỏ gọi là “mắt hành (tỏi)” (chẳng hạn A.cepa nhóm Proliferum). Các mắt này có thể phát triển thành cây. Chi này chứa một số loài cây có giá trị nhƣ hành, hẹ tây, tỏi tây, tỏi và hành tăm. Mùi của “hành” là đặc trƣng cho cả chi nhƣng không phải mọi loài đều có mùi giống nhau. ‒ Thân: Thân thật của tỏi rất ngắn đã thoái hóa. Trên thân thật có mầm sinh dƣỡng và sinh thực, những mầm này đƣợc che phủ bởi những bẹ lá dày mọng nƣớc. Thân củ bao gồm một số nhánh (ánh, tép) đƣợc liên kết với nhau bởi những màng mỏng. 7
  18. Đồ án tốt nghiệp ‒ Lá: Lá thật đầu tiên của tỏi là một lá mầm, sau khi nảy mầm đƣợc 10 – 15 ngày tùy theo điều kiện thời tiết mà lá tỏi có dạng hình bản bằng phẳng, trên lá có phủ lớp sáp. Thời kỳ đầu lá tỏi sinh trƣởng rất chậm sau khi nảy mầm chỉ vài cm. ‒ Hoa: Hoa tỏi thuộc hoa đầu trạng, hoa có 6 lá đài, 6 nhị và nhụy. Hoa thụ phấn chéo, có màu trắng xám, phớt tím hoặc hồng. ‒ Củ: Tỏi trắng củ to có đƣờng kính khoảng 4 cm và có vỏ màu trắng. Tỏi tía củ nhỏ hơn, đƣờng kính 3,5 – 4 cm, củ chắc và cay, dọc thân gần củ có màu tía. Trong củ tỏi chứa 60 – 70 % nƣớc, 35 – 42 % chất khô, 6,7 – 8,0 % chất béo, 0,3 – 3,2 % đƣờng, 0,1% chất sơ hữu cơ, 0,1 – 0,5 % dầu este, 0,06% mỡ, các chất khoáng Ca, Na, Mn, P, Fe và các Vitamin C, E, B1, B6, B12. ‒ Rễ: Rễ tỏi thuộc loại rễ chùm, khả năng chịu hạn kém. Rễ tỏi có nhiều sợi dài phân nhánh yếu, chúng đƣợc bao phủ bởi một số lƣợng lớn lông hút. 1.2 Thành phần hóa học và công dụng của cây tỏi 1.2.1 Thành phần hóa học Theo phân tích của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ: 8
  19. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1 Giá trị dinh dƣỡng của tỏi Giá trị dinh dƣỡng 100 g (3,5oz) tỏi tƣơi Năng lƣợng 623 kJ (149 kcal) Cacbohydrat 33,06 g Đƣờng 1,00 g Chất xơ thực phẩm 2,1 g Chất béo 0,5 g Protein 6,39 g Beta – carotene 5 g (0%) Thiamin (Vit. B1) 0,2 mg (15%) Riboflavin (Vit. B2) 0,11 mg (7%) Niacin (Vit. B3) 0,7 mg (5%) Axit pantothenic (Vit. B5) 0,596 mg (12%) Vitamin B6 1,235 mg (95%) Axit folic (Vit. B9) 3 g (1%) Vitamin C 31,2 mg (52%) Canxi 181 mg (18%) Sắt 1,7 mg (14%) Magie 25 mg (7%) Mangan 1,672 mg (84%) Phospho 153 mg (22%) Kali 401 mg (9%) Natri 17 mg (1%) Kẽm 1,16 mg (12%) Selen 14,2 g Tỷ lệ % theo lƣợng hấp thụ hàng ngày của ngƣời lớn. Nguồn: Cơ sở dữ liệu USDA [42] Theo các kết quả phân tích khác: Thành phần trong củ tỏi khoảng 84,09% nƣớc, 13,38% chất hữu cơ và các chất vô cơ 1,53%. Trong khi lá tỏi là 87,14% nƣớc, 11,27% chất hữu cơ, các chất vô cơ 1,59%. Tỏi tƣơi hoặc nghiền chứa nhiều hợp chất lƣu huỳnh nhƣ: alliin, ajoene, polysulfides diallyl, vinyldithiins, S – allylcysteine và các enzyme, vitamin nhóm B, protein, khoáng chất, saponin, flavonoid và các sản phẩm phản ứng Maillard không phải là các hợp chất có chứa lƣu huỳnh.[40] 9
  20. Đồ án tốt nghiệp Trong củ tỏi có 3 hoạt chất chính là allicin, diallyl sulfide và ajoene. Cavallito và cộng sự (1994) phát hiện trong khi nghiền nát củ tỏi (Allium sativum L.) có chất allicin, là một hợp chất kháng sinh và kháng nấm (phytoncide) [19]. Allicin không hiện diện sẵn trong tỏi. Tuy nhiên, khi đƣợc cắt mỏng hoặc đập dập và dƣới sự xúc tác của phân hóa tố anilaza, chất aliin có sẵn trong tỏi biến thành allicin. Do đó, càng cắt nhỏ hoặc càng đập nát, hoạt tính allicin càng cao. Một ký tỏi có thể cho ra từ 1 – 2 g allicin. Song, allicin dễ biến chất sau khi đƣợc sản xuất ra. Càng để lâu sẽ càng mất bớt hoạt tính. Khi đun nấu sẽ đẩy nhanh quá trình mất chất này, đun qua lò vi sóng sẽ phá hủy hoàn toàn chất allicin. Nƣớc tỏi pha loãng 125.000 lần vẫn có dấu hiệu ức chế nhiều loại vi trùng gram âm và gram dƣơng nhƣ Staphylococcus, Streptococcus, Samonella, V.cholerae, B.dysenteriae, Mycobacterium tuberculosis. Tỏi cũng ức chế sự phát triển của nhiều loại siêu vi nhƣ siêu vi trái rạ, bại liệt, cúm và một số loại nấm gây bệnh ở da hoặc bộ phận sinh dục nữ nhƣ candida. [41]. 1.2.1.1 Lá và cụm hoa tỏi dùng làm rau Ở Châu Âu và Trung Đông lá và cụm hoa (bulbils) của cây tỏi đôi khi đƣợc dùng làm rau để ăn sống hay xào nấu, có hƣơng vị nhƣ hành, ít cay nồng so với củ tỏi. Ngoài ra, lá và cuống hoa non (Scapes) của cây tỏi đôi khi đƣợc dùng làm rau “tỏi xanh”, tƣơng tự nhƣ măng tây xào. 1.2.1.2 Củ tỏi được dùng làm gia vị Củ tỏi là loại gia vị đƣợc sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới do hƣơng vị cay nồng của nó nhƣ là một chất khử mùi tanh và kích thích tiêu hóa. Các dạng đƣợc dùng phổ biến là củ tỏi tƣơi, củ tỏi khô, bột tỏi, củ tỏi ngâm giấm, muối chua, đóng hộp, dầu tỏi, hỗn hợp sa tế tỏi ớt, 1.2.1.3 Tỏi được dùng làm đẹp Tỏi có tác dụng làm tăng tuần hoàn máu, tăng lƣợng hồng cầu trong máu, giúp sản sinh thêm lƣợng máu tƣơi mới trong cơ thể, làm trẻ hóa tế bào, chống lão hóa, duy trì sức khỏe và sự trẻ trung. 10
  21. Đồ án tốt nghiệp Chống lão hóa: tỏi có tác dụng tăng cƣờng bài tiết hormone, tăng sức sống cho tế bào và thúc đẩy quá trình tái tạo tế bào mới giúp da đẹp hơn. Giúp da trắng mịn, trị mụn: chất allicin trong tỏi có tác dụng khử trùng, bảo vệ tế bào da, tăng cƣờng sức đề kháng, hạn chế sự phát triển của vi khuẩn, giúp da trắng mịn. 1.2.1.4 Tỏi được dùng làm thuốc a. Tác dụng kháng sinh Allicin là một chất kháng sinh tự nhiên rất mạnh, có khả năng ức chế tới hơn 70 loại vi khuẩn ở các nồng độ khác nhau. Allicin nguyên chất trong thử nghiệm in vitro có tác động chống lại các loài Candidal, Cryptococcus, Trichophyton, Epidermophyton và Microsprorum ở nồng độ thấp (Yamada và cộng sự, 1977) [38]. Tỏi có thể ngăn ngừa đƣợc một số bệnh gây ra do virus nhƣ cúm, cảm lạnh, kể cả virus gây lở mồm long móng bò, ngựa, trâu. Tỏi còn có tác dụng diệt giun sán nhƣ giun đũa, giun kim, giun móc và trứng của chúng. b. Tác dụng phòng chống các bệnh tim mạch - Tỏi làm giảm cholesterol để phòng bệnh tim mạch. Nhiều nghiên cứu thấy rằng nƣớc chiết từ tỏi để lâu ngày làm giảm 30% lƣợng cholesterol nên giúp phòng ngừa xơ cứng động mạch nhờ khả năng làm tăng albunin mật độ cao (HDL), hoặc giảm mật độ thấy albunin (LDL). c. Tỏi đề phòng tắc nghẽn mạch máu. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy nƣớc tỏi có tác dụng phòng tắc nghẽn mạch máu nhờ khả năng phân giải và hòa tan một loại protein dễ gây tắc. Nhiều chứng minh qua nghiên cứu đã thấy thuốc hỗn hợp có tỏi có tác dụng nhƣ aspirin. Vì vậy, các chuyên gia y tế đã khuyên ngƣời bệnh tăng mỡ máu cần ăn từ 3 – 4 nhánh tỏi mỗi ngày. d. Tác dụng giảm đƣờng huyết Tỏi có tác dụng gia tăng sự phóng thích Insulin tự do trong máu, tăng cƣờng chuyển hóa glucose trong gan, giảm lƣợng đƣờng trong máu và trong nƣớc tiểu (tác dụng tƣơng đƣơng với tolbutamid, một loại sunfamid chữa tiểu đƣờng type II). 11
  22. Đồ án tốt nghiệp e. Tác dụng tăng cƣờng hệ miễn dịch Tỏi có tác dụng đáng kể lên hệ miễn dịch; tăng hoạt tính các thực bào lymphocyte nhất là với thực bào CD4 giúp cơ thể bảo vệ màng tế bào chống tổn thƣơng nhiễm sắc thể ADN; kháng virus; phòng chống nhiễm trùng. f. Tác dụng phòng chống ung thƣ Chất phytoalexin (allicin) đã đƣợc tìm thấy, một hợp chất nonsulfur với γ – pyrone có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, tác dụng chống ung thƣ, sự ức chế của DNA B2 aflatoxin ràng buộc, tác dụng dinh dƣỡng thần kinh và allixin cho thấy tác dụng kháng u trong cơ thể, ức chế sự bắt đầu hình thành khối u da TPA và DMBA chuột. Các chất tƣơng tự của hợp chất này đã thể hiện tác dụng kháng khối u thúc đẩy trong điều kiện thí nghiệm in vitro. Ở đây, allicin và các chất tƣơng tự có thể sẽ là những hợp chất hữu ích cho công tác phòng chống bệnh ung thƣ hoặc các biện pháp hóa trị đối với các bệnh khác. Các nhà nghiên cứu thuộc Viện ung thƣ Mỹ hiện đang sản xuất loại thuốc tổng hợp đƣợc chiết từ tỏi, có khả năng chống ung thƣ tốt, mặc dù đã thành khối u vẫn có hiệu lực. Một bác sĩ thuộc Viện y học Sơn Đông Trung Quốc xác nhận rằng tỷ lệ ung thƣ dạ dày ở những ngƣời thƣờng xuyên ăn tỏi thấp hơn 60% so với những ngƣời khác cùng khu vực. Ở trƣờng Đại học tại bang Texas và Los Angeles (Mỹ) đã phát hiện nƣớc tỏi chiết có tác dụng ức chế một số bệnh ung thƣ ác tính và đề phòng ung thƣ da. 1.3 Tình hình sản xuất tỏi trên thế giới và tại Việt Nam 1.3.1 Trên thế giới Cây tỏi đƣợc trồng hầu hết ở tất cả các nƣớc trên thế giới. Tuy nhiên diện tích không nhiều. Ở nhiều nƣớc cây tỏi chỉ đƣợc trồng làm thức ăn và làm thuốc chữa bệnh trong gia đình, chƣa là cây xuất khẩu ra nƣớc ngoài. Trong những năm gần đây diện tích và năng suất trồng tỏi không ngừng tăng lên, trong đó diện tích trồng hành tỏi ở Châu Á là lớn nhất. Trung Quốc là nhà sản 12
  23. Đồ án tốt nghiệp xuất tỏi lớn nhất thế giới với khoảng 13,5 triệu tấn củ tỏi hàng năm, chiếm hơn 80% sản lƣợng tỏi trên thế giới. Các nƣớc trồng nhiều tỏi khác là Ấn Độ (4,1%), Hàn Quốc (2%), Ai Cập, Nga (1,6%) Bảng 1.2 Top 10 nƣớc sản xuất tỏi lớn nhất thế giới trong năm 2010 Quốc gia Sản lƣợng (tấn) Trung Quốc 13,664,069 Ấn Độ 833,970 Hàn Quốc 271,560 Ai Cập 244,626 Nga 213,480 Myanmar 185,900 Ethiopia 180,300 Hoa Kỳ 169,510 Bangladesh 164,392 Ukraina 157,400 Thế giới 17,674,893 Nguồn: FAO, 2011 [41] 1.3.2 Tại Việt Nam Ở Việt Nam cây tỏi đƣợc trồng ở khắp cả nƣớc. Những vùng trồng tỏi nổi tiếng gồm có Phan Rang, Đảo Lý Sơn, Quảng Ngãi, Hà Nội. Đặc biệt là tỏi Lý Sơn với hƣơng vị đặc trƣng đã tạo nên thƣơng hiệu “vua tỏi”. Làm nên hƣơng vị đặc biệt của tỏi Lý Sơn chính là nhờ vào loại đất đỏ và cát trắng. Tỏi Lý Sơn đƣợc trồng ở ngoài đảo, bốn bề là biển cả, nguồn nƣớc là mạch nƣớc ngầm dƣới lòng đất, cát là những hạt đƣợc bào mòn từ rạn san hô biển (vốn là những con ốc, con sò từ hàng triệu năm trƣớc đã bị phân hủy), lòng đất là lớp đất đỏ bazan đƣợc hình thành do quá trình hoạt động của ngọn núi lửa đã ngừng hoạt động cách đây hàng trăm năm. Rễ cây tỏi bám vào các loại nguyên liệu đặc biệt nói trên để nuôi củ của nó. Ở huyện đảo Lý Sơn tỉnh Quảng Ngãi với hơn 300 ha trồng tỏi nhiều hộ gia đình đã đi lên từ cây tỏi, với 8 sào đất trồng tỏi lãi xuất lên tới 30 – 40 triệu đồng. Có thể 13
  24. Đồ án tốt nghiệp nói cây tỏi là cây chủ lực của nhiều địa phƣơng, diện tích trồng tỏi mỗi năm một tăng, kinh tế nhiều gia đình ngày càng ổn định và đi lên. 1.4 Giới thiệu nuôi cấy lớp mỏng tế bào 1.4.1 Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào (TCL) [3] Hệ thống TCL chứa những mẫu cấy có kích thƣớc nhỏ đƣợc cắt ra từ các cơ quan thực vật khác nhau (chồi, lá, rễ, cụm hoa, đế hoa hoặc các cơ quan của hoa, lá mầm, trụ trên hay trụ dƣới lá mầm, vùng chồi đỉnh hoặc phôi). Chúng đƣợc cắt theo chiều dọc (đƣợc gọi là lTCL) hoặc theo chiều ngang (đƣợc gọi là tTCL). Dạng lTCL (kích thƣớc 1 mm x 0,5 mm hay 10 mm) chỉ bao gồm một loại tế bào, ví dụ một lớp các tế bào biểu mô có thể tách ra từ một số cơ quan hoặc vài lớp từ các tế bào vỏ; trong khi đó, dạng tTCL (kích thƣớc 0,2 x 0,5 mm hay vài mm bề dày) bao gồm một số lƣợng nhỏ các dạng tế bào từ các mô khác nhau (biểu mô, vỏ, vùng tƣợng tầng, mô mạch, cũng nhƣ nhu mô). Một số đặc tính phổ biến của lTCL và tTCL là tính mỏng, có nghĩa là mảnh cấy có số lƣợng tế bào càng ít càng tốt. Đặc tính “mỏng” đóng vai trò cực kỳ quan trọng bởi những phân tử marker dự tuyển cho sự biệt hóa có thể đƣợc xác định in situ trong những tế bào đích (hay tế bào đáp ứng). Sự xác định vị trí nhƣ vậy cho phép giới hạn những tế bào đáp ứng. Khi cắt mẫu, mô thực vật bị tổn thƣơng, nhiều enzyme hoặc các polysacharide sinh ra rất cần cho quá trình cảm ứng sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật (Tran Thanh Van và Mutaftschiew, 1990). Lý do cơ bản của việc ứng dụng một vài tế bào trong hệ thống TCL là chúng có mối liên hệ mật thiết với các tế bào bị thƣơng (nơi xảy ra tổng hợp cấu tạo vách tế bào mới và nơi phóng thích của oligosachride) và chất dinh dƣỡng cùng các yếu tố khác bên trong môi trƣờng để “kiểm soát” sự phát sinh hình thái. Tuy nhiên, cũng bởi vì lý do đó có thể nói chúng khá phụ thuộc vào môi trƣờng, lát mỏng có ƣu điểm là đồng nhất, nên dễ phản ứng một cách đồng nhất với môi trƣờng. Ngƣợc lại các mẫu cây lớn hơn (nhƣ thân hoặc các mảnh lá) cho thấy sự phân cực mạnh trong phản ứng với môi trƣờng và có thể chứa các hợp chất nội sinh cao hơn, bao gồm các CĐHSTTV nên chúng không phụ thuộc nhiều vào môi trƣờng. 14
  25. Đồ án tốt nghiệp Việc giảm số lƣợng tế bào trong phƣơng pháp lớp mỏng tế bào có ý nghĩa quan trọng vì ảnh hƣởng đến quá trình phát triển hoặc các chƣơng trình biệt hóa mô, cơ quan. Bên cạnh đó, khoảng thời gian để quá trình phát sinh hình thái xuất hiện tƣơng đối ngắn (trung bình khoảng sau 14 ngày sau khi cấy). 1.4.2 Một số nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào trên các đối tƣợng nhƣ cây lƣơng thực, ngũ cốc và dƣợc liệu. Amaranthus edulis Amaranthus edulis là cây hai lá mầm C4 rất quý, thuôc họ Amaranthaceae. Hạt của cây đƣợc quan tâm rất nhiều do có chừa hàm lƣợng protein (16 – 18%) và lysin cao. Các nghiên cứu liên quan đến tái sinh chồi in vitro đối với nhiều loài thuộc chi Amaranthus đã đƣợc báo cáo trên mô sẹo xuất phát từ mặt lá, trụ dƣới lá mầm, cuống lá, thân,phát hoa và cả thân cây. Tuy nhiên, thời gian trung bình cần để tái sinh chồi khoảng 4 – 6 tuần và tần số tái sinh rất thấp đối với các kiểu di truyền đƣợc thí nghiệm (Bagga và cộng sự, 1987). Trong một nỗ lực để thu đƣợc tần số tái sinh cây cao hơn trong một thời gian ngắn đối với cây A. edulis, Bui và cộng sự (1998) đã sử dụng hệ thống nuôi cấy TCL để cảm ứng biệt hóa chồi in vitro. Chỉ sau một tuần nuôi cấy, 100% mẫu cấy tTCL từ rễ, lá mầm và trụ dƣới đều hình thành mô sẹo dạng bở và xốp. Beta vulgaris L. Có nhiều phƣơng pháp khác nhau đƣợc sử dụng để nhân giống in vitro đối với cây củ cải đƣờng. Sự hình thành chồi nách từ đỉnh chồi của cây con (Hussey và Hepher, 1978) và sự phát triển của chồi nách từ các phân đoạn thể phát hoa (Saunden, 1982) là hai phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng để tạo ra một số lƣợng lớn chồi. Kỹ thuật TCL đối với cây củ cải đƣờng là một phƣơng pháp tỏ ra rất hiệu quả trong việc nghiên cứu phát sinh hình thái và vi nhân giống (Dectrez và cộng sự, 1988). 15
  26. Đồ án tốt nghiệp Brassica napus Brassica napus (cây cải dầu) khá phổ biến trong việc nghiện cứu nuôi cấy mô mở rộng. Klimaszewska và cộng sự (1985) đã tiến hành thí nghiệm với các lát mỏng TCL bao gồm biểu bì và lớp tế bào cận biểu bì đƣợc cắt dọc theo lóng thân cây. Chồi có thể đƣợc phát hiện ở một đầu cuối của mẫu cấy sau 12 – 15 ngày. Hệ thống nuôi cấy này có khả năng tạo ra tần số tái sinh chồi và số lƣợng chồi trên mỗi mẫu cấy cao. Hơn nữa, nguy cơ nhiễm vi sinh vật của mẫu cấy cũng không còn là một vấn đề nghiêm trọng. Lupinus mutabilis và Lipinus albus Đậu lupin là cây trồng quan trọng giúp khắc phục vấn đề thiếu hụt protein trong nguồn dinh dƣỡng động vật. Nhƣng khả năng thành công bị giới hạn trong quá trình nhân giống đối với nhiều loài đậu lupin đã đƣợc báo cáo (Sator, 1985). Mulin và Bellio-Spataru (2000) đã nghiên cứu thành công khả năng tái sinh của mẫu cấy TCL đƣợc cắt từ vùng nốt trụ dƣới lá mầm của cây Lupinus spp. Phaseolus vulgaris L. Là cây đậu xanh, loại đậu chủ yếu tự thụ phấn, cung cấp nguồn protein lớn trong khẩu phần ăn của ngƣời dân các nƣớc Mỹ La Tinh và Đông Phi. Tuy nhiên, cây trồng này rất nhạy cảm với hạn hán và nhiều tác nhân gây bệnh. Việc tạo ra cây đậu chuyển gen có khả năng kháng hạn hoặc mang gen phòng vệ thông qua di truyền sẽ rất có ích, nhƣng quá trình chuyển gen chỉ có thể thành công nếu thiết lập đƣợc một hệ thống tái sinh có hiệu quả. Carvalho và cộng sự (2002) đã phát triển thành công một hệ thống tái sinh chồi trực tiếp bằng tTCL, nhờ đó tăng khả năng áp dụng phƣơng pháp này cho quá trình chuyển gen. Oryza sativa L. Cây lúa đã đƣợc trồng nhƣ một loại cây lƣơng thực chính yếu cách đây hơn 7.000 năm và hiện đang nuôi sống hơn 50% dân số thế giới. Trong những năm gần đây, nuôi cấy mô đóng một vai trò rất quan trọng trong việc cải tiến chất lƣợng cây lúa. Tuy nhiên, cũng nhƣ các loài đơn tử diệp khác, không phải tất cả các loài lúa 16
  27. Đồ án tốt nghiệp đều đáp ứng nhƣ nhau với các điều kiện tái sinh khi nuôi cấy trong ống nghiệm và cần có một quy trình gồm nhiều bƣớc đòi hỏi một khoảng thời gian dài để phát triển thành cây hoàn chỉnh. Nhut và cộng sự (2000) đã nỗ lực tìm kiếm một phƣơng pháp tái sinh trực tiếp đối với cây lúa bằng cách sử dụng hệ thống nuôi cấy TCL. tTCL đƣợc nuôi cấy trong tối 2 tuần và sau đó đƣa ra sáng. Vào ngày thứ 7, hơn 93% tTCL hình thành các cấu trúc giống phôi (Embryo-like Structure – ELS) trong môi trƣờng bổ sung 1μM BAP. Các cấu trúc này biệt hóa trực tiếp thành chồi mà không qua trung gian mô sẹo. Tóm lại, cây lƣơng thực, thực phẩm và dƣợc liệu tạo nên một phần không thể thiếu trong đời sống con ngƣời. Cho đến nay, có rất nhiều loài thực vật chƣa đƣơc nhân giống in vitro thành công, quá trình cải thiện và nhân giống với số lƣợng lớn thông qua các phƣơng pháp truyền thống hay phân tử vẫn còn giới hạn. Kỹ thuật TCL cho phép tái sinh thành công các cơ quan in vitro và nhờ sự phát sinh hình thái đƣợc kiểm soát đã mở đƣờng cho những thành công trong chuyển gen nhờ vào các đặc tính vốn có của hệ thống. 1.5 Giới thiệu về hiện tƣợng xuân hóa 1.5.1 Định nghĩa xuân hóa Sự xuân hoá: Là quá trình xúc tiến hay kích thích phản ứng ra hoa trong cây nhờ trải qua nhiệt độ thấp. 1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiện tượng xuân hóa 1.5.2.1 Đặc trưng về yêu cầu nhiệt độ xuân hoá  Ảnh hƣởng của nhiệt độ thấp là bắt buộc Những thực vật loại này thƣờng bị cảm ứng rất rõ rệt với nhiệt độ thấp. Chúng chỉ ra hoa khi có một giai đoạn phát triển nhất định trong điều kiện nhiệt độ thấp thích hợp (nhiệt độ xuân hoá). Nếu nhiệt độ cao hơn nhiệt độ xuân hoá thì chúng không ra hoa. Nhóm này gồm các thực vật nhƣ củ cải đƣờng, rau cần tây, bắp cải, su hào,  Ảnh hƣởng của nhiệt độ thấp là không bắt buộc 17
  28. Đồ án tốt nghiệp Với các thực vật này, nếu nhiệt độ cao hơn nhiệt độ xuân hoá thì cây vẫn ra hoa nhƣng muộn hơn. Nhóm cây này có thể xử lý nhiệt độ thấp giai đoạn quả và hạt, có thể thay thế xuân hoá nhƣ lúa mì mùa đông, lúa mạch, đậu Hà Lan, xà lách, củ cải đỏ, 1.5.2.2 Giới hạn nhiệt độ ‒ Giới hạn nhiệt độ cho phản ứng xuân hoá rất khác nhau tuỳ theo thực vật. Nhìn chung thì giới hạn nhiệt độ trong khoảng 0 - 15C. Các cây ôn đới thƣờng có nhiệt độ xuân hoá thấp hơn các cây nhiệt đới. Trong khoảng nhiệt độ xuân hoá, nếu nhiệt độ càng thấp thì thời gian tiếp xúc càng ngắn và ngƣợc lại. ‒ Yêu cầu nhiệt độ trổ hoa có 2 loại : + Yêu cầu định tính: cây sẽ không trổ hoa từ khi nó đƣợc cung cấp một nhiệt độ nhất định trong một khoảng thời gian tối thiểu nào đó. + Yêu cầu định lƣợng: sự trổ hoa có thể điều chỉnh đƣợc bằng cách thay đổi nhiệt độ vào thời điểm trổ hoa, vị trí trổ. 1.5.3 Một số nghiên cứu về hiện tượng xuân hóa 1.5.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới ‒ Năm 1984, Koutepas đã nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ thấp đến sự hình thành củ trong quá trình sinh trƣởng và nở hoa ở Tulip các loại củ Tulip giữ ở nhiệt độ 5C trong 10-12 tuần. Kết quả cho thấy vậy nhiệt độ thấp có kết hợp với nhà kính chống nóng đã rút ngắn đƣợc thời gian ra hoa và chất lƣợng hoa cũng cao hơn so với trồng trong điều kiện ngoài đồng ruộng không có thiết bị chống nóng [36]. ‒ Klipart (1857) đã thành công trong việc biến lúa đông thành lúa mì mùa xuân mà chỉ cần cho nảy mầm nhẹ và bảo quản hạt của chúng trong điều kiện nhiệt độ thấp cho đến khi đem gieo vào mùa xuân. Từ lâu ngƣời ta đã chứng minh đƣợc rằng cơ quan tiếp nhận (cảm thụ) phản ứng nhiệt độ là đỉnh sinh trƣởng của thân. Chỉ cần đỉnh sinh trƣởng chịu tác động của nhiệt độ thấp cũng có thể gây nên sự phân hóa mần hoa. Nhƣ vậy, đối với sự cảm nhận quá trình xuân hóa cần có các tế bào đang phân chia của đỉnh sinh trƣởng [9]. 18
  29. Đồ án tốt nghiệp 1.5.3.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ‒ Năm 1986, Nguyễn Quang Thạch và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ thấp lên cây mạ xuân IR8. Thí nghiệm đã đƣợc tiến hành ở các tuổi mạ khác nhau, giai đoạn nứt nanh đến 5 lá với thời gian xử lý lạnh khác nhau (1 – 10 ngày ở 5C) [11]. ‒ Năm 1988, Vũ Quang Sáng đã nghiên cứu ảnh hƣởng của việc xử lý nhiệt độ thấp đến sinh trƣởng, phát triển và năng suất của tỏi cho thấy trong điều kiện nhiệt độ dƣới 6o C [8]. ‒ Năm 1991, Hoàng Minh Tấn và cộng sự đã nghiên cứu hiệu quả của nhiệt độ thấp trong quá trình bảo quản đến sinh trƣởng, phát triển và hình thành năng suất khoai tây [10]. ‒ Năm 1994, Phạm Thị Cậy nghiên cứu về ảnh hƣởng của xử lý nhiệt độ thấp và GA3 đến sinh trƣởng và phát triển của một số cây họ hành tỏi Liliaceae. Kết quả đã rút ngắn thời gian sinh trƣởng của cây và tác dụng của GA3 đã làm cho cây sinh trƣởng phát triển tốt hơn [1]. Trên thế giới và Việt Nam có rất nhiều nghiên cứu về phản ứng xuân hóa cho nhiều loại cây trồng. Tuy nhiên trên củ tỏi vấn đề này vẫn còn mới mẻ chƣa có nhiều tác giả nghiên cứu. Vì vậy, những nghiên cứu trên củ tỏi còn hạn chế. 1.6 Giới thiệu về chất điều hòa sinh trƣởng Kĩ thuật nuôi cấy mô là một kĩ thuật quan trọng trong công nghệ tế bào thực vật. Các cơ quan hoặc cây nguyên vẹn đƣợc chuyên hóa theo những lộ trình khác nhau trong môi trƣờng nuôi cấy khác nhau và chính điều đó ngƣời ta đã sử dụng cytokinin và auxin để điều khiển theo ý muốn tùy nhu cầu theo giai đoạn phát triển. Nếu tỷ lệ auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn tỷ lệ cytokinin cao hơn auxin sẽ kích thích sự xuất hiện và phát triển của chồi. Nên để nhân nhanh in vitro, trong giai đoạn đầu cần phải điều khiển mô nuôi cấy phát sinh thật nhiều chồi để tăng hệ số nhân. Vì vậy ngƣời ta tăng nồng độ cytokinin trong môi trƣờng nuôi cấy. Để tạo cây hoàn chỉnh đƣa ra đất ngƣời ta tách chồi và cấy vào môi trƣờng ra rễ trong đó hàm lƣợng auxin đƣợc tăng lên. 19
  30. Đồ án tốt nghiệp 1.6.1 Auxin [39] Việc phát hiện ra auxin đã đƣợc Darwin (1880) khảo sát trên hiện tƣợng quang hƣớng động. Ông thấy ngọn diệp tiêu hƣớng về phía có ánh sáng và cho rằng ánh sáng đã kích thích ngọn diệp tiêu hƣớng về phía đó. Bằng nhiều thí nghiệm đơn giản dùng một nắp che chóp diệp tiêu hay cắt nó đi thì diệp tiêu không còn hƣớng về ánh sáng nữa. Auxin là thuật ngữ chung đại diện cho lớp của những hợp chất đƣợc đặc tính hóa bởi khả năng gây ra sự vƣơn dài trong tế bào chồi trong vùng gần đỉnh và giống nhƣ indole-3-acetic acid (IAA) trong hoạt động sinh lý. Auxin cũng có những ảnh hƣởng khác bên cạnh sự vƣơn dài, nhƣng sự vƣơn dài đƣợc xem là then chốt nhất. Auxin nói chung mang tính acid với một nhân không bảo hòa hoặc những dẫn xuất của chúng. Từ các nghiên cứu của Darwin (1880) về hiện tƣợng quang hƣớng động đến các khám phá của Went (1926) về một chất có hoạt tính sinh học trong diệp tiêu yến mạch Avena đã dẫn đến sự phát hiện ra IAA trong nƣớc tiểu của ngƣời do công của Kogl và Haagen-Smit (1931). IAA sau đó đã đƣợc phân lập từ men bia, trong nhiều loài thực vật bậc thấp và thực vật bậc cao khác. Nhƣ vậy IAA đã đƣợc xem nhƣ là auxin đƣợc phát hiện sớm nhất. Ngày nay, bên cạnh IAA nội sinh còn có nhiều auxin đƣợc tổng hợp với nhiều mục đích khác nhau. Auxin tổng hợp là những hợp chất có hoạt tính tƣơng tự nhƣ IAA, nhƣng không hoàn toàn tƣơng tự về cấu trúc. Auxin hiện diện trong các tế bào thực vật dƣới nhiều hình thức khác nhau: auxin tự do, tiền auxin và auxin liên kết. Các phƣơng pháp ly trích thông thƣờng sẽ thu đƣợc auxin tổng số (cả ba loại trên). Các hình thức trích auxin theo kiểu khuếch tán thƣờng thu đƣợc auxin tự do và auxin liên kết thƣờng kết chặt với protein. Auxin can thiệp vào nhiều hiện tƣợng sinh lý, hoạt động của nó tuỳ thuộc vào nồng độ và các sự hỗ tƣơng qua lại của chúng với các chất điều hoà khác. Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào ở ngọn chồi. Sự kéo dài tế bào là một quá trình phức tạp, kết hợp nhiều hiện tƣợng: hấp thu nƣớc; giãn dài vách với sức trƣơng; đặt các hợp chất mới của vách giữa các mạng vi sợi cellulose; sinh tổng hợp protein và 20
  31. Đồ án tốt nghiệp các chất khác. Auxin (phối hợp với cytokinin) giúp sự tăng trƣởng chồi non và khởi phát sự tạo mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Tuy nhiên, ở nồng độ cao, auxin cản sự phát triển của phát thể chồi vừa thành lập hay chồi nách: ở thời điểm này đi vào trạng thái tiềm sinh. Auxin gây hiện tƣợng ƣu thế ngọn: Hiện tƣợng ƣu thế ngọn là một hiện tƣợng phổ biến ở trong cây. Khi chồi ngọn hoặc rễ chính sinh trƣởng sẽ ức chế sinh trƣởng của chồi bên và rễ bên. Ðây là một sự ức chế tƣơng quan vì khi loại trừ ƣu thế ngọn bằng cách cắt chồi ngọn và rễ chính thì cành bên và rễ bên đƣợc giải phóng khỏi ức chế và lập tức sinh trƣởng. Hiện tƣợng này đƣợc giải thích rằng auxin đƣợc tổng hợp chủ yếu ở ngọn chính và vận chuyển xuống dƣới làm cho các chồi bên tích luỹ nhiều auxin nên ức chế sinh trƣởng. Khi cắt ngọn chính, lƣợng auxin tích luỹ trong chồi bên giảm sẽ kích thích chồi bên sinh trƣởng. Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ (phát thể non của rễ), nhƣng cản sự tăng trƣởng của các sơ khởi này. Đặc tính này đƣợc ứng dụng phổ biến trong giâm cành. Sự hình thành rễ phụ trong giâm cành có thể chia làm 3 giai đoạn: giai đoạn đầu là phản phân hoá tế bào trƣớc tầng phát sinh, tiếp theo là xuất hiện mầm rễ và cuối cùng mầm rễ sinh trƣởng thành rễ phụ chọc thủng vỏ và ra ngoài. Giai đoạn đầu cần hàm lƣợng auxin cao, giai đoạn rễ sinh trƣởng cần ít auxin và có khi không cần có auxin. 1.6.2 Cytokinin Cytokinin là những hợp chất adenin đƣợc thay thế, nó kích thích sự phân chia tế bào và những chức năng điều hòa sinh trƣởng khác giống nhƣ kinetin (6- furfurylaminopurine). Cytokinin đầu tiên đƣợc phân lập từ DNA tinh trùng cá trích đƣợc thanh trùng và đƣợc gọi là kinetin bởi vì nó có khả năng kích thích sự phân chia tế bào hay sự phân bào (cytokinensis) trong mô lõi thuốc lá. Cytokinin có nguồn gốc tự nhiên đƣợc phân lập đầu tiên từ hột bắp non và đƣợc gọi là zeatin 21
  32. Đồ án tốt nghiệp (6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenyl-amino)purine). Ngày nay, hầu hết cytokinin đƣợc tìm thấy trong cây là zeatin. Hiện nay, có nhiều cytokinin tổng hợp đƣợc biết đến với 3 chất thông dụng là kinetin (6-furfurylaminopurine), BA (6-benzylaminopurine) và BAP (6-benzylamino)-9-(2-tetrahydropyranyl)-9H-purine). Cytokinin đã đƣợc tìm thấy ở hầu hết thực vật bậc cao, rêu, nấm ký sinh và không ký sinh, vi khuẩn và cũng có trong phần lớn tRNA của vi sinh vật và tế bào động vật. Hiện tại có hơn 200 cytokinin tự nhiên và tổng hợp đã đƣợc phát hiện. Vai trò chính của cytokinin trong cây là kích thích sự phân chia tế bào. Callus có thể đƣợc tạo thành ban đầu chỉ cần auxin hoặc cytokinin riêng lẽ. Tuy nhiên để duy trì sự phát triển của callus, sự kết hợp của auxin và cytokinin tỏ ra cần thiết. Tỉ lệ auxin/ cytokinin sẽ ảnh hƣởng lên sự tạo callus, rễ hay chồi. Khả năng tái sinh cây từ callus là một công cụ kỹ thuật sinh học phổ biến dùng để chọn lọc những cây kháng với điều kiện khô hạn, stress do mặn, bệnh, thuốc cỏ hay những yếu tố khác. Cytokinin có thể kích thích hoặc ức chế sự khởi đầu và phát triển của rễ tùy theo nồng độ và thời gian xử lý. Cytokinin có thể giúp làm giảm quá trình lão hóa khi tách lá ra khỏi thân cây và hoạt động nhƣ là chất thay thế cho sự cần thiết của rễ để giảm lão hóa. 1.7 Tình hình nghiên cứu cây tỏi trên thế giới và Việt Nam 1.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Haque và cộng sự (1997) đã nghiên cứu về tần số tái sinh chồi và hình thành cây từ đỉnh rễ cây tỏi (Allium sativum L.). Kết quả cho thấy, khi sử dụng phối hợp l M/1 NAA với 10 M/l 2,4-D cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất với 75%. Tần số tái sinh chồi ở những môi trƣờng cơ bản khác nhau thì tƣơng tự nhau: môi trƣờng MS cho hơn 10 chồi/mẫu, môi trƣờng B5 tạo ra những chồi có kích thƣớc nhỏ hơn nhƣng số lƣợng chồi lại cao hơn [24]. 22
  33. Đồ án tốt nghiệp Haque và cộng sự (1998) khi nghiên cứu về khả năng tái sinh cây thông qua phát sinh phôi vô tính từ đỉnh rễ cây tỏi (Allium sativum L.) đã cho thấy, môi trƣờng MS bổ sung 0,5 M/l 2,4-D là tối ƣu nhất cho sự hình thành callus và phát sinh phôi. Các phôi vô tính bắt đầu nảy chồi và hình thành cây con trong môi trƣờng MS bổ sung 5 M/l KIN [25]. Alejandrina và cộng sự (2000) đã nghiên cứu tái sinh cây tỏi (Allium sativum L.) từ đỉnh rễ trên môi trƣờng N6 hoặc MS bổ sung các chất ĐHST ở các nồng độ khác nhau. Kết quả cho thấy môi trƣờng MS bổ sung 4,5 M/1 2,4-D và 4,6 M/1 KIN cho tỷ lệ mẫu hình thành callus cao nhất, đạt 100% sau 8 tuần nuôi cấy trong tối. Môi trƣờng MS bổ sung 4,4 M/1 BA cho khả năng tái sinh chồi mạnh nhất sau 3 tuần nuôi cấy trong điều kiện có ánh sáng và những chồi này có khả năng tạo củ sau 6 tuần nuôi cấy [16]. Sata và cộng sự (2001) khi nghiên cứu về khả năng phát sinh phôi vô tính ở cây tỏi (Allium sativum L.) đã cho thấy, môi trƣờng White hiệu quả hơn môi trƣờng MS trong việc phát sinh phôi cây tỏi. Môi trƣờng White bổ sung 0,1 mg/l 2,4-D và 0,5 mg/l kinetin cho khả năng phát sinh phôi cao nhất với tỷ lệ phát sinh phôi đạt 60%. Ở nồng độ chất kích thích sinh trƣởng cao hơn sẽ làm cho các chồi bị xoắn lại và khối mô bị sƣng phồng lên. Nghiên cứu cũng cho thấy, phần gốc thân của cây tỏi cho tỷ lệ phát sinh phôi cao hơn so với các phần còn lại khi nuôi cấy trong cùng một môi trƣờng [33]. Fereol và cộng sự (2002) trong nghiên cứu về khả năng phát sinh phôi vô tính và tái sinh cây tỏi (Allium sativum L.) đã cho thấy mẫu rễ có khả năng tạo callus cao hơn nhƣng mẫu lá lại có tiềm năng tạo phôi vô tính lại cao hơn. Hơn 75% phôi phân hóa thành hình cầu sau 2 tháng nuôi cấy trên môi trƣờng B5 bổ sung 0,1 2,4-D mg/L và 0,5 mg/l KIN, 30% phôi vô tính có khả năng tạo thành cây hoàn chỉnh sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng BDS bổ sung 0,3 mg/L BA [21]. Khan và cộng sự (2004) đã nghiên cứu khả năng tái sinh cây tỏi (Allium sativum L.) in vitro thông qua nuôi cấy callus từ những đỉnh rễ cây tỏi in vitro. Kết quả cho thấy, môi trƣờng thích hợp cho sự cảm ứng callus là môi trƣờng MS bổ 23
  34. Đồ án tốt nghiệp sung 5 mg/l KIN và l,5 mg/l 2,4-D với 85% mẫu hình thành callus. Môi trƣờng thích hợp cho tái sinh chồi từ callus là MS bổ sung l0 mg/l BA với tỷ lệ mẫu tái sinh chồi đạt 56,8% [27]. Gabriela và cộng sự (2006) khi nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng và loại mô cấy đến sự hình thành callus và tái sinh cây tỏi (Allium sativum L.). Kết quả cho thấy phần gốc và đỉnh sinh trƣởng cho tỷ lệ tạo callus cao hơn so với đỉnh rễ, tỷ lệ phát sinh callus từ phần gốc đạt 41% trên môi trƣờng BDS bổ sung 0,045 M/l 2,4 – D và 4,43 M/l BA. Việc sử dụng mẫu đỉnh sinh trƣởng và 2,4-D có khả năng tăng cƣờng sự hình thành callus và tái sinh cây [22]. Salam và cộng sự (2008) khi nghiên cứu về khả năng tạo callus và tái sinh cây tỏi đã cho thấy, môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/L 2,4-D cho khả năng tạo callus tốt nhất với 71,42% mẫu lá hình thành callus. Callus sau khi đƣợc hình thành đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng tái sinh chồi. Nghiên cứu cũng cho thấy, môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/L BA và 1 mg/L NAA cho khả năng tái sinh chồi cao nhất với tỷ lệ tái sinh chồi đạt 71,42%, hệ số nhân chồi đạt 10 chồi/mẫu cấy [33]. 1.7.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam Nguyễn Thị Thanh Phƣơng và cộng sự (2012) đã nghiên cứu làm sạch virus cho cây tỏi ta (Allium sativum L.) bằng nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng. Kết quả cho thấy môi trƣờng tái sinh đỉnh sinh trƣởng tốt nhất là MS kết hợp 30 g/l sucrose và 1 mg/l BA [6] Bùi Thị Thơ và cộng sự (2014) đã nghiên cứu khả năng tạo callus và tái sinh in vitro cây tỏi cô đơn (Allium sativum L.) của đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi. Kết quả cho thấy khả năng tạo callus tốt nhất (77,33%) từ mẫu gốc thân cây tỏi trên môi trƣờng MS có 3% saccharose, 0,8% agar, bổ sung 2 mg/L 2,4-D và 1 mg/L KIN. Môi trƣờng MS có 3% saccharose, 0,8% agar, bổ sung 5 mg/L BA thích hợp cho phát sinh phôi và tái sinh chồi in vitro từ callus, với tỷ lệ mẫu tái sinh chồi đạt 77,38%, hệ số nhân chồi đạt 6,62 chồi/mẫu [12]. 24
  35. Đồ án tốt nghiệp Đỗ Ngọc Thanh Mai và cộng sự (2015) đã nghiên cứu tạo hạt nhân tạo từ phôi vô tính hình thành từ nuôi cấy chóp rễ in vitro cây tỏi ta (Allium sativum L.). Kết quả thu đƣợc cho thấy sau 3 tuần bảo quản hạt nhân tạo cây tỏi trong môi trƣờng MS lỏng, tỷ lệ nảy mầm của hạt trên môi trƣờng MS bổ sung 0,5 mg/l BA và 1 g/l than hoạt tính đạt trên 60% [5]. 25
  36. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ‒ Thời gian: từ tháng 4 đến tháng 8 năm 2015. ‒ Địa điểm: đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc Gia về Tế bào Thực vật – Viện Sinh học Nhiệt đới trực thuộc Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam. 2.2 Nội dung nghiên cứu ‒ Nội dung 1: Khảo sát ảnh hƣởng chế độ khử trùng mẫu. ‒ Nội dung 2: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi. ‒ Nội dung 3: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi. ‒ Nội dung 4: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA, NAA kết hợp lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi ở nhiệt độ lạnh (5C). 2.3 Vật liệu 2.3.1 Nguồn mẫu Củ tỏi (Allium sativum L.) giống đƣợc chọn từ ruộng tỏi ở Lý Sơn – Quảng Ngãi. 2.3.2 Môi trường Môi trƣờng khoáng cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) [31] có bổ sung 30 g/l sucrose và các CĐHSTTV NAA, BA. 2.3.3 Điều kiện nuôi cấy ‒ Thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày. ‒ Cƣờng độ sáng: 45 µmol.m-2.s-1. ‒ Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 26 ± 2oC. ‒ Độ ẩm: 60 – 65 %. 26
  37. Đồ án tốt nghiệp 2.3.4 Trang thiết bị và dụng cụ Các thiết bị phục vụ nuôi cấy mô nhƣ tủ cấy vô trùng, autoclave, máy cất nƣớc, dao cấy, kéo, kẹp cấy, đĩa cấy, bình tam giác, bình cấy, cân phân tích chính xác đến 0,1 mg, đèn cồn. Hóa chất dùng cho khử trùng mẫu cấy gồm: HgCl2 0,1%. 2.3.5 Xử lý thống kê Số liệu thu đƣợc từ các thí nghiệm đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV.I., biểu đồ đƣợc vẽ bằng Microsoft Ecxel 2010. 2.4 Phƣơng pháp 2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng chế độ khử trùng tạo mẫu sạch  Mục đích thí nghiệm Xác định thời gian khử trùng thích hợp cho từng loại mẫu cấy. Thí nghiệm là tiền đề cần thiết cho những thí nghiệm tiếp theo.  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên LSD, gồm 4 nghiệm thức lặp lại 3 lần.  Phƣơng pháp tiến hành Mẫu cấy đƣợc chọn nhƣ sau: củ to đều nhau, sạch bệnh. Chọn mẫu cấy, củ tỏi đƣợc bóc ra từng tép, nhẹ nhàng bóc hết lớp vỏ lụa bên ngoài và khử trùng bằng xà phòng loãng, rửa sạch mẫu bằng nƣớc và tiếp tục rửa mẫu dƣới vòi nƣớc chảy trong 30 phút rồi đƣa vào khử trùng trong tủ cấy vô trùng. Lắc mẫu trong dung dịch khử trùng HgCl2 0,1% trong thời gian theo từng nghiệm thức thí nghiệm, rửa lại 3 – 4 lần bằng nƣớc cất vô trùng. Dùng dao cắt bỏ phần mẫu bị tổn thƣơng do hoá chất khử trùng gây ra, mẫu cấy đƣợc cắt thành các lớp mỏng theo tiết diện ngang ở phần đế của tép củ tỏi (từ 0,7 – 1,0 mm) và cấy vào môi trƣờng MS. ‒ Môi trƣờng thí nghiệm: Môi trƣờng MS cơ bản bổ sung 8 g/l agar, 30 g/l sucrose chỉnh pH về 5,8 và đƣợc hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1 atm trong 20 phút. 27
  38. Đồ án tốt nghiệp ‒ Hóa chất khử trùng đƣợc sử dụng: HgCl2 nồng độ 0,1%. ‒ Vật liệu thí nghiệm: Mẫu cấy là phần đế của tép củ tỏi. ‒ Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi kết quả sau 15 ngày nuôi cấy dựa trên các chỉ tiêu: . Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) . Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) Bảng 2.1 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của thời gian khử trùng mẫu STT Nghiệm thức Thời gian khử trùng (phút) 1 T4 4 2 T6 6 3 T8 8 4 T10 10 2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi  Mục đích thí nghiệm Xác định nồng độ BA thích hợp để cảm ứng nuôi cấy có và không xử lý nhiệt nhằm tạo mô sẹo, chồi, rễ từ phần đế của tép củ tỏi bằng phƣơng pháp lớp mỏng tế bào.  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên LSD, gồm 17 nghiệm thức, lặp lại 3 lần.  Phƣơng pháp tiến hành Mẫu cấy sử dụng cho thí nghiệm là hai loại mẫu cấy tép tỏi có và không có xử lý nhiệt. ‒ Mẫu không xử lý nhiệt là các tép tỏi đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng. 28
  39. Đồ án tốt nghiệp ‒ Mẫu xử lý nhiệt là các tép tỏi đƣợc để ở nhiệt độ lạnh 5C trong thời gian 4 tuần trƣớc khi sử dụng làm mẫu cấy thí nghiệm. Mẫu cấy đƣợc chọn và khử trùng theo chế độ khử trùng tối ƣu ở thí nghiệm 1. Các mẫu cấy đƣợc cắt thành các lớp mỏng theo tiết diện ngang (từ 0,7 – 1,0 mm) và cấy vào môi trƣờng MS có bổ sung BA ở những nồng độ khác nhau. ‒ Môi trƣờng thí nghiệm: Môi trƣờng MS cơ bản bổ sung 8 g/l agar, 30 g/l sucrose và nồng độ BA khác nhau theo từng nghiệm thức thí nghiệm, chỉnh pH về 5,8 và đƣợc hấp khử trùng ở 121oC, 1atm trong 20 phút. ‒ Vật liệu thí nghiệm: Mẫu cấy là phần đế của tép củ tỏi. ‒ Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi kết quả sau 6 tuần nuôi cấy dựa trên chỉ tiêu sau: . Tỷ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo (%) . Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi (%) . Tỷ lệ mẫu cấy tạo rễ (%) . Số lƣợng chồi trung bình . Số lƣợng rễ trung bình 29
  40. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.2 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA và nhiệt độ xử lý lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi. Nhiệt Nồng độ BA STT Nghiệm thức độ ( mg/l) 1 ĐC 0 2 B-KL0,5 0,5 3 B-KL1,0 1,0 4 B-KL1,5 1,5 5 B-KL2,0 Phòng 2,0 6 B-KL2,5 2,5 7 B-KL3,0 3,0 8 B-KL3,5 3,5 9 B-KL4,0 4,0 10 B-TL 0,5 0,5 11 B-TL 1,0 1,0 12 B-TL 1,5 1,5 13 B-TL 2,0 2,0 Lạnh 14 B-TL2,5 2,5 5C 15 B-TL3,0 3,0 16 B-TL3,5 3,5 17 B-TL4,0 4,0 30
  41. Đồ án tốt nghiệp 2.4.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi  Mục đích thí nghiệm Xác định nồng độ NAA thích hợp để cảm ứng mẫu cấy tạo mô sẹo, chồi, rễ từ phần đế của tép tỏi bằng phƣơng pháp lớp mỏng tế bào.  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên LSD, gồm 17 nghiệm thức trên thí nghiệm.  Phƣơng pháp tiến hành Mẫu cấy sử dụng cho thí nghiệm là hai loại mẫu cấy tép tỏi có và không có xử lý nhiệt. ‒ Mẫu không xử lý nhiệt là các tép tỏi đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng. Mẫu xử lý nhiệt là các tép tỏi đƣợc để ở nhiệt độ lạnh 5C trong thời gian 4 tuần trƣớc khi sử dụng làm mẫu cấy thị nghiệm. Chọn mẫu cấy nhƣ đã trình bày trong thí nghiệm 1, khử trùng mẫu theo nghiệm thức cho kết quả khử trùng tối ƣu cho từng loại mẫu cấy ở thí nghiệm 1. Các mẫu cấy đƣợc cắt thành các lớp mỏng theo tiết diện ngang (từ 0,7 – 1,0 mm) và cấy vào các chai 100 ml chứa 10 ml môi trƣờng MS có bổ sung auxin ở những nồng độ khác nhau. ‒ Môi trƣờng thí nghiệm: Môi trƣờng MS cơ bản bổ sung 8 g/l agar và 30 g/l sucrose và NAA theo từng nghiệm thức thí nghiệm, chỉnh pH về 5,8 và đƣợc hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1atm trong 20 phút. ‒ Loại auxin sử dụng: α – naphthalene acetic acid (NAA). ‒ Vật liệu thí nghiệm: Mẫu cấy là phần đế của tép tỏi. ‒ Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi kết quả sau 6 tuần nuôi cấy dựa trên chỉ tiêu sau: . Tỷ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo (%) . Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi (%) . Tỷ lệ mẫu cấy tạo rễ (%) 31
  42. Đồ án tốt nghiệp . Số lƣợng chồi trung bình . Số lƣợng rễ trung bình Bảng 2.3 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi Nhiệt Nồng độ STT Nghiệm thức độ NAA (mg/l) 1 ĐC 0 2 N-KL0,5 0,5 3 N-KL1,0 1,0 4 N-KL1,5 Phòng 1,5 5 N-KL2,0 2,0 6 N-KL2,5 2,5 7 N-KL3,0 3,0 8 N-KL3,5 3,5 9 N-KL4,0 4,0 10 N-TL 0,5 0,5 11 N-TL 1,0 1,0 12 N-TL 1,5 1,5 13 N-TL 2,0 2,0 Lạnh 14 N-TL2,5 5C 2,5 15 N-TL3,0 3,0 16 N-TL3,5 3,5 17 N-TL4,0 4,0 32
  43. Đồ án tốt nghiệp 2.4.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA, NAA kết hợp lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi ở nhiệt lạnh 5C  Mục đích thí nghiệm Xác định nồng độ auxin, cytokinin kết hợp thích hợp để cảm ứng tạo mô sẹo, chồi, rễ từ phần đế của tép tỏi bằng phƣơng pháp lớp mỏng tế bào.  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên LSD, gồm 65 nghiệm thức mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.  Phƣơng pháp tiến hành Nguồn mẫu đƣợc xử lý ở nhiệt độ 5C trong 4 tuần. Chọn mẫu cấy nhƣ đã trình bày trong thí nghiệm 1, khử trùng mẫu theo nghiệm thức cho kết quả khử trùng tối ƣu cho từng loại mẫu cấy ở thí nghiệm 1. Các mẫu cấy đƣợc cắt thành các lớp mỏng theo tiết diện ngang (từ 0,7 – 1,0 mm) và cấy vào môi trƣờng MS có bổ sung BA và NAA ở những nồng độ khác nhau. ‒ Môi trƣờng thí nghiệm: Môi trƣờng MS cơ bản bổ sung 8 g/l agar kết hợp với đƣờng sucrose và nồng độ và auxin, cytokinin theo từng nghiệm thức thí nghiệm, chỉnh pH về 5,8 và đƣợc hấp khử trùng ở 121oC, 1atm trong 20 phút. ‒ Loại auxin sử dụng: α – naphthalene acetic acid (NAA). Loại cytokinin sử dụng: 6 – benzylladenine acid (BA). ‒ Vật liệu thí nghiệm: Mẫu cấy là phần đế của tép tỏi. ‒ Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi kết quả sau 30 ngày nuôi cấy dựa trên chỉ tiêu sau: . Tỷ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo (%) . Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi (%) . Tỷ lệ mẫu cấy tạo rễ (%) . Số lƣợng chồi trung bình . Số lƣợng rễ trung bình 33
  44. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.4 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA và NAA kết hợp lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế xử lý ở nhiệt độ lạnh (5C). BA (mg/l) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 NAA (mg/l) 0,5 BN05-1 BN05-2 BN05-3 BN05-4 BN05-5 BN05-6 BN05-7 BN05-8 1,0 BN10-1 BN10-2 BN10-3 BN10-4 BN10-5 BN10-6 BN10-7 BN10-8 1,5 BN15-1 BN15-2 BN15-3 BN15-4 BN15-5 BN15-6 BN15-7 BN15-8 2,0 BN20-1 BN20-2 BN20-3 BN20-4 BN20-5 BN20-6 BN20-7 BN20-8 2,5 BN25-1 BN25-2 BN25-3 BN25-4 BN25-5 BN25-6 BN25-7 BN25-8 3,0 BN30-1 BN30-2 BN30-3 BN30-4 BN30-5 BN30-6 BN30-7 BN30-8 3,5 BN35-1 BN35-2 BN35-3 BN35-4 BN35-5 BN35-6 BN35-7 BN35-8 4,0 BN40-1 BN40-2 BN40-3 BN40-4 BN40-5 BN40-6 BN40-7 BN40-8 2.5 Cách thu các chỉ tiêu khảo sát 2.5.1 Tỷ lệ mẫu nhiễm và tỷ lệ mẫu sống vô trùng ố ẫ ị ễ ẩ ấ ỷ ệ ẫ ( ) ổ ố ẫ ấ ố ẫ ố ô ị ễ ẩ ấ ỷ ệ ẫ ố ô ù ( ) ổ ố ẫ ấ 2.5.2 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, tỷ lệ mẫu tạo chồi và tỷ lệ mẫu tạo rễ ‒ Tỷ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo: ố ẫ ạ ẹ ỷ ệ ạ ô ẹ ( ) ổ ố ẫ ấ ‒ Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi: ố ẫ ạ ồ ỷ ệ ạ ồ ( ) ổ ố ẫ ấ 34
  45. Đồ án tốt nghiệp ‒ Tỷ lệ mẫu cấy tạo rễ: ố ẫ ạ ễ ỷ ệ ạ ễ ( ) ổ ố ẫ ấ 2.5.3 Số lượng chồi trung bình, số lượng rễ trung bình ‒ Số lượng chồi trung bình: ổ ố ẫ ạ ồ ố ƣợ ồ ( ) ổ ố ẫ ấ ‒ Số lượng rễ trung bình: ổ ố ẫ ạ ễ ố ƣợ ễ ( ) ổ ố ẫ ấ 2.5.4 Giải phẫu, quan sát phát sinh hình thái 2.5.4.1 Mục đích Trong chu trình phát triển, mỗi thực vật đều ở trạng thái cử động phát sinh hình thái. Các cơ quan thực vật tác động lẫn nhau trong sự phát triển của riêng mình, sự tiến hóa của mỗi cơ quan phụ thuộc vào sự tiến hóa của các cơ quan khác, cấu trúc toàn vẹn của cơ thể thực vật là do toàn bộ các tƣơng tác giữa các cấu trúc hợp thành. Trong nuôi cấy in vitro, sự hình thành cây con xảy ra theo một trong hai con đƣờng phát sinh hình thái: phát sinh cơ quan (chồi, rễ) hay phát sinh phôi. Để có thể kiểm soát các quá trình phát sinh hình thái chúng tôi đã tiến hành giải phẫu để có thể quan sát sự biến đổi hình thái và cấu trúc. 2.5.4.2 Cách nhuộm tế bào Đặt mẫu lên tấm thớt bằng khoai lang hay cục gôm rồi dùng dao lam thật bén để cắt, các lát cắt phải thẳng góc với trục của mẫu và phải thật mỏng. Cắt xong, dùng dao mui mác đƣa mẫu vào một cái rổ (nửa trái bóng bàn đục lỗ) đƣợc đựng trong một cái ly nhỏ có chƣa nƣớc cất. Sau đó đổ nƣớc cất, ngâm các lớp mỏng trong Javel 0,1% trong 10 phút. Rửa sạch, rồi ngâm các lớp mỏng trong thuốc tím đã pha sẵn trong 15 phút. 35
  46. Đồ án tốt nghiệp Rửa sạch mẫu, dùng lame sạch lấy dao mui mác vớt 2 – 3 lớp mỏng (màu nhạt) vào, rồi đậy lại bằng lamelle. Khi đặt lamelle, dùng kim mui mác để nghiêng 45 đối với lame rồi hạ từ từ và rút dần kim sang bên phải để tránh bọt khí. 2.5.4.3 Quan sát hình thái Đặt lame đã cố định mẫu lên kính hiển vi để soi mẫu. Chỉnh kính hiển vi dƣới các vật kính 4 và điều chỉnh tiêu cự thích hợp bằng cách vặn núm chỉnh thô rồi chỉnh tinh đến khi quan sát đƣợc rõ hình thái mẫu. Chỉnh kính sang vật kính 10 và điều chỉnh tiêu cự sao cho có thể thấy tốt nhất. 36
  47. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hƣởng chế độ khử trùng tạo mẫu Vào năm 1998 Ayabe và cộng sự bằng cách sử dụng phần đế của tỏi đã phát triển và gọi nó là phƣơng pháp “stem disc”. Theo Ayabe và cộng sự (1998) [17] phần “stem disc” là một phần hạn chế của các thân cây không phát triển của chồi ở tỏi. Đó là lớp dƣới cùng của lá chƣa trƣởng thành. Các cấu trúc của “stem disc” sau 5 ngày nuôi cấy đã bắt đầu cảm ứng và phát triển mạnh với chồi cao khoảng 1 cm sau 3 tuần nuôi cấy. Theo quan sát mô học cho thấy quá trình tổ chức tế bào hình thành bên trong cấu trúc “stem disc” tƣơng tự với mô phân sinh. Và kết quả của nhiều cuộc thử nghiệm cho thấy phƣơng pháp nuôi cấy “stem disc” là hữu ích cho việc sản xuất cây tỏi. Tới năm 2001, Ayabe và cộng sự tiếp tục nghiên cứu phƣơng pháp này và gọi nó là “stem-disc dome (SD-Dome) culture”. SD-Dome có hình dạng 15 – 25 vòm hình tròn hình thành trên một đế từ một tép tỏi đơn đƣợc cắt. Những SD-Dome sau 8 tuần chồi cao hơn 5 cm và rễ cũng đƣợc hình thành và đã thành công khi cấy vào đất [18]. Bên cạnh đó, phần đế tỏi có độ dày rất mỏng do đó chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp TCL nhằm có thể tạo ra những mẫu cấy thuộc phần đế có độ chính xác cao nhất. Hệ thống TCL chứa những mẫu cấy có kích thƣớc nhỏ đƣợc cắt ra từ các cơ quan thực vật khác nhau cũng bởi vì lý do đó có thể nói chúng khá phụ thuộc vào môi trƣờng, lát mỏng có ƣu điểm là đồng nhất, nên dễ phản ứng một cách đồng nhất với môi trƣờng. Ngƣợc lại trong tỏi có chứa các chất kháng sinh mạnh và các mẫu cấy lớn hơn cho thấy sự phân cực mạnh trong phản ứng với môi trƣờng và có thể chứa các hợp chất nội sinh cao hơn, bao gồm các chất sinh trƣởng thực vật nên chúng không phụ thuộc nhiều vào môi trƣờng và có thể ức chế một số hoạt động. Bên cạnh đó, khoảng thời gian để quá trình phát sinh hình thái xuất hiện tƣơng đối ngắn (trung bình khoảng sau 14 ngày sau khi cấy). Khử trùng mẫu cấy là bƣớc quan trọng trong nuôi cấy bất kỳ loài thực vật nào từ nguồn mẫu thực sinh ngoài môi trƣờng. Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là 37
  48. Đồ án tốt nghiệp nguồn gây nhiễm chính và đƣa mẫu từ bên ngoài vào là giai đoạn khó khăn trong vi nhân giống. Nếu vi sinh vật đã nhiễm vào hệ thống mô mạch thì chất khử trùng khó mà làm sạch mẫu. Khác với vi sinh vật, thực vật không có khả năng ức chế sinh học, vì vậy mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất cao mới có hy vọng thành công. Tuy củ tỏi có chứa hoạt chất kháng sinh mạnh allicin nhƣng hoạt chất này không sẵn có trong tỏi mà sản sinh khi tỏi bị đập dập hoặc cắt mỏng, hoạt chất này không bền và dễ biến chất theo thời gian và nhiều tác nhân khác. Ngoài ra, do nguồn mẫu đƣợc vận chuyển từ Lý Sơn – Quảng Ngãi thƣờng luôn đƣợc bảo quản trong túi nilon kín tạo hơi nƣớc, độ ẩm cao, ít ánh nắng là điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Cùng với việc lựa chọn mẫu cấy là phần đế nằm vị trí gần phần rễ của củ tỏi, đây là phần nằm trong đất khi cây sinh trƣởng và phát triển nên khiến cho việc khử trùng gặp khó khăn. Vì vậy HgCl2 đƣợc lựa chọn làm chất khử trùng trong thí nghiệm này. Đây là một chất khử trùng mạnh, rất độc đối với sinh vật, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn và các bào tử nấm. HgCl2 có tác dụng phá hủy liên kết − SH trong các phân tử protein làm cho các tế bào vi sinh vật bị phá hủy nhanh chóng khi nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp. Mục tiêu của thí nghiệm này là xác định thời gian khử trùng tốt nhất của chất khử trùng HgCl2 0,1% trên đối tƣợng mẫu cấy. Kết quả thu nhận đƣợc ghi nhận ở bảng 3.1. 38
  49. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng mẫu Thời gian khử Tỷ lệ mẫu nhiễm Tỷ lệ mẫu sống Nghiệm thức trùng (%) vô trùng (%) a c T4 4 phút 83,33 16,67 b b T6 6 phút 40,00 60,00 bc ab T8 8 phút 16,67 83,33 c a T10 10 phút 0 100 Các chữ cái a, b, c, trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD % 120 100 80 60 40 20 0 Nghiệm thức T4 T6 T8 T10 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) Biểu đồ 3.1 Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng mẫu Theo kết quả bảng 3.1 và biểu đồ 3.1 cho thấy, khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm rõ rệt, tỷ lệ mẫu sống vô trùng tăng và đạt cao nhất ở nghiệm thức T10. Nghiệm thức T4 có tỷ lệ mẫu nhiễm là 83,33% cao nhất so với các thí nghiệm khảo sát. Ở thời gian này có thể do Hg2+ chƣa kịp tác động để loại hết các vi sinh vật trên bề mặt mẫu, cộng với mẫu cấy đƣợc cắt rất gần với phần rễ nên khiến cho vi sinh vật có thể vẫn còn bám trên mẫu cấy. Tỷ lệ mẫu sống vô trùng tăng cao khi tăng thời gian khử trùng ở nghiệm thức T6 (60,00%), T8 (83,33%) và đến thời gian khử trùng là 10 phút cho kết quả tỷ lệ sống vô trùng là 100% cao gấp gần 6 lần so với nghiệm thức T4 và không có mẫu khảo sát nào bị 39
  50. Đồ án tốt nghiệp nhiễm. Bản thân củ tỏi có ba hoạt chất chính là allicin, diallyl sulfide và ajoene. Khi đƣợc cắt mỏng dƣới sự xúc tác của phân hóa tố anilaza, chất aliin có sẵn trong tỏi biến thành allicin. Allicin là một chất kháng sinh tự nhiên rất mạnh, nó có thể ức chế nhiều loại vi trùng gram âm và gram dƣơng. Ngoài ra có thể do Hg2+ là một ion kim loại nặng nên có khả năng tác động mạnh vào các vi sinh vật mà không ảnh hƣởng nhiều đến tế bào. Vì vậy khi tăng thời gian khử trùng cộng với bản thân nhƣ một kháng sinh kháng khuẩn tốt khiến cho việc khử trùng đạt kết quả tốt và không ảnh hƣởng nhiều đến mẫu. Nhƣ vậy, thời gian khử trùng tối ƣu cho mẫu cấy trong thí nghiệm này là 10 phút. Kết quả này tƣơng tự với Nguyễn Thị Thanh Phƣơng và cộng sự (2012) mẫu tỏi đƣợc xử lý với ethanol 70% trong 1 phút, HgCl2 nồng độ 0,1% trong 10 phút trƣớc khi tách đỉnh sinh trƣởng với 84,56% tỷ lệ mẫu sạch [6]. Từ kết quả thí nghiệm khảo sát chế độ khử trùng với chất khử trùng là HgCl2 0,1% ở các nghiệm thức đã khảo sát cho thấy nghiệm thức có thời gian khử trùng là 10 phút có kết quả tốt nhất ở tỷ lệ mẫu cấy vô trùng với số liệu ghi nhận đƣợc là 100%. Chế độ khử trùng này sẽ đƣợc sử dụng ở các thí nghiệm tiếp theo. 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ BA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi Cytokinin là chất có khả năng thúc đẩy sự phân chia tế bào mạnh mẽ. Nguyên nhân là do cytokinin hoạt hóa quá trình tổng hợp nucleic acid và protein dẫn đến kích thích sự phân chia tế bào. Nhiều nghiên cứu khẳng định rằng cytokinin đƣợc hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ. Ngoài ra một số cơ quan còn non đang sinh trƣởng cũng có khả năng tổng hợp cytokinin nhƣ chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh, BA đƣợc biết đến là một loại cytokinin khá phổ biến và đƣợc ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật. Vì vậy mục tiêu của thí nghiệm này là khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi. Kết quả thu nhận đƣợc ghi nhận ở bảng 3.2. 40
  51. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2 Ảnh hƣởng của nồng độ BA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi. Nồng Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Số Nhiệt Số rễ Nghiệm độ mẫu mẫu tạo mẫu chồi STT độ xử trung thức BA tạo mô chồi tạo rễ trung lý bình (mg/l) sẹo (%) (%) (%) bình e d c f d 1 ĐC 0 0 0 0 0 0 de* bcd c c-f cd 2 B-KL0,5 0,5 3,33 6,67 0 0,07 0,03 b ab ab ab ab 3 B-KL1,0 1,0 26,67 16,67 10,00 0,23 0,17 bc bcd bc a-d cd 4 B-KL1,5 1,5 20,00 10,00 3,33 0,17 0,07 cd bcd bc c-f cd 5 B-KL2,0 Phòng 2,0 13,33 6,67 3,33 0,10 0,07 e bcd c c-f cd 6 B-KL2,5 2,5 0 6,67 0 0,07 0,03 e cd c c-f cd 7 B-KL3,0 3,0 0 3,33 0 0,03 0,03 e d c f d 8 B-KL3,5 3,5 0 0 0 0 0 e d c f d 9 B-KL4,0 4,0 0 0 0 0 0 de bcd bc b-e cd 10 B-TL0,5 0,5 6,67 6,67 3,33 0,13 0,07 a a a a a 11 B-TL1,0 1,0 46,67 23,33 13,33 0,26 0,20 b abc abc abc bc 12 B-TL1,5 1,5 26,67 13,33 6,67 0,20 0,10 bc abc abc abc cd 13 B-TL2,0 Lạnh 2,0 20,00 13,33 6,67 0,20 0,07 cd bcd c c-f cd 14 B-TL2,5 5C 2,5 13,33 6,67 0 0,10 0,03 de cd c c-f d 15 B-TL3,0 3,0 6,67 3,33 0 0,07 0 de d c c-f d 16 B-TL3,5 3,5 3,33 0 0 0,03 0 e d c f d 17 B-TL4,0 4,0 0 0 0 0 0 Các chữ cái a, b, c, trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD 41
  52. Đồ án tốt nghiệp % 40 0.25 35 0.2 30 % 25 0.15 20 15 0.1 10 0.05 5 0 0 ĐC B-KL0,5 B-KL1,0 B-KL1,5 B-KL2,0 B-KL2,5 B-KL3,0 B-KL3,5 B-KL4,0 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) SL chồi TB SL rễ TB Biểu đồ 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ BA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi với nguồn mẫu ở nhiệt độ phòng. 50 0.3 45 40 0.25 35 0.2 30 25 0.15 20 15 0.1 10 0.05 5 0 0 ĐC B-TL0,5 B-TL1,0 B-TL1,5 B-TL2,0 B-TL2,5 B-TL3,0 B-TL3,5 B-TL4,0 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) SL chồi TB SL rễ TB Biểu đồ 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ BA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi với nguồn mẫu ở nhiệt độ lạnh 5C. 42
  53. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.2 với các nghiệm thức mẫu cấy bảo quản ở nhiệt độ phòng cho thấy BA có ảnh hƣởng rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa cơ quan đối với mẫu cấy, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Các nghiệm thức của nguồn mẫu đƣợc xử lý ở nhiệt độ phòng (B-KL0,5 - B- KL4,0) cho thấy khi nồng độ BA tăng từ 0,0 – 1,0 mg/l có sự gia tăng ở các chỉ tiêu theo dõi, tỷ lệ tạo chồi tăng (0% - 16,67%) bên cạnh đó mô sẹo và rễ cũng đƣợc hình thành. Ở nồng độ 1 mg/l BA so với các nghiệm thức đƣợc khảo sát ở các mẫu cấy đƣợc xử lý ở nhiệt độ phòng có sự khác biệt về mặt thống kê đáng kể. Sự sinh trƣởng của tỏi tăng dần và đạt cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 1,0 mg/l BA với các chỉ tiêu nhƣ tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, tỷ lệ mẫu tạo chồi, tỷ lệ mẫu tạo rễ, số lƣợng chồi trung bình, số lƣợng rễ trung bình (lần lƣợt 26,67%; 16,67%; 10,00%; 0,23 chồi/mẫu; 0,17 rễ/mẫu). Khi tiếp tục bổ sung BA (nồng độ 1,5 – 4,0 mg/l) vào môi trƣờng nuôi cấy thì các chỉ tiêu theo dõi giảm dần theo nồng độ. Môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung nồng độ BA (nồng độ 2,5 – 4,0 mg/l) không có sự hình thành mô sẹo cũng nhƣ là sự tạo rễ. Tƣơng tự với các nghiệm thức đƣợc xử lý ở nhiệt độ phòng, thì các mẫu ở các nghiệm thức đã đƣợc bảo quản lạnh ở 5C trong 4 tuần trƣớc khi sử dụng nuôi cấy cho thấy ở cùng nồng độ 1,0 mg/l BA khi đƣợc bổ sung vào môi trƣờng cho kết quả tốt nhất ở các chỉ tiêu theo dõi. Qua giai đoạn xử lý lạnh cho thấy sau 2 tuần nuôi cấy các mẫu đã cảm ứng và hình thành chồi, mô sẹo và rễ. Sau 4 tuần các chồi, mô sẹo và rễ tăng về số lƣợng và kích thƣớc. Qua bảng 3.2 và biểu đồ 3.3 cho thấy ở nồng độ 1,0 mg/l BA đạt kết quả tốt nhất với 46,67% mẫu tạo mô sẹo, 23,33% mẫu tạo chồi, 13,33% mẫu tạo rễ và 0,26 chồi/mẫu, 0,20 rễ/mẫu. Khi bổ sung 1,5 – 4,0 mg/l BA cho thấy sự phát sinh hình thái của các mẫu giảm, không có sự cảm ứng ở một số mẫu cấy, đồng thời các tỷ lệ tạo mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ và các số chồi, rễ trung bình cũng giảm. Qua nghiên cứu cho thấy, cytokinin và nhiệt độ ảnh hƣởng rõ rệt đến quá trình phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi. Ở các nghiệm thức của nguồn mẫu đƣợc xử lý ở nhiệt độ lạnh, các mẫu cấy có sự cảm ứng rõ rệt và tốt hơn so với 43
  54. Đồ án tốt nghiệp nguồn mẫu bảo quản ở nhiệt độ phòng. Mẫu đƣợc bảo quản lạnh đƣợc cảm ứng nhanh với tác nhân là BA chỉ sau 2 tuần nuôi cấy đã có sự xuất hiện của chồi và mô sẹo, chồi xanh và phát triển đều, các mô sẹo có màu trắng ngà hay màu xanh (Hình 3.1). Trong khi các nghiệm thức xử lý ở nhiệt độ phòng phải mất 4 tuần để cảm ứng, và tới tuần thứ 6 mới có sự hình thành chồi, mô sẹo và rễ. Qua đó cho thấy, tốc độ cảm ứng của mẫu khi đƣợc xử lý lạnh nhanh hơn so với mẫu không đƣợc xử lý lạnh. Việc xử lý lạnh củ giống tuy không có thay đổi gì về hình thái bên ngoài nhƣng có sự thay đổi rõ rệt về phát sinh hình thái dƣới tác động của chất cảm ứng BA. Hình 3.1 Mẫu cấy lớp mỏng đế trên môi trƣờng bổ sung BA. a) So sánh kết quả phát sinh hình thái giữa các nghiệm thức thí nghiệm; b) hình thái mô sẹo ở nghiệm thức B-TL1,0; c) chồi ở nghiệm thức B-TL2,0.; d) rễ ở nghiệm thức B-TL1,0. Theo Hoàng Minh Tấn và cộng sự (2000) có rất nhiều thực vật mà nhiệt độ thấp có ảnh hƣởng sâu sắc đến sự khởi đầu và phát triển của cấu trúc sinh sản [9]. Với hầu hết cây trồng, việc xử lý và bảo quản hạt giống, củ giống ở nhiệt độ thấp (trong tủ lạnh hoặc kho lạnh) sẽ có tác dụng rất tốt cho thế hệ sau, rút ngắn thời gian sinh trƣởng, ra hoa nhanh, tăng năng suất và phẩm chất thu hoạch. Bên cạnh đó, với 44
  55. Đồ án tốt nghiệp kinh nghiệm dân gian tỏi đƣợc trồng ở vụ “Đông Xuân” với sự chênh lệch biên độ giữa hai mùa lớn, có thể thấy nhiệt độ lạnh có tác động đến sự phát triển của tỏi. Theo Louis và cộng sự (1958) tỏi khi đƣợc xử lý lạnh ở 5C cho kết quả tốt nhất so với các mẫu cấy xử lý lạnh ở 0; 10; 15; 20C khi nuôi cấy in vitro và trồng thử nghiệm ở nhà kính [30]. Theo kết quả của nghiên cứu này thì mẫu khi đƣợc xử lý ở 5 – 10C cho chồi phát triển nhanh nhất và xanh tốt nhất. Ở mẫu đƣợc xử lý 0C và mẫu đƣợc xử lý ở 20C thì chồi hình thành chậm, phát triển kém hơn. Điều này cũng cho thấy, khi xử lý ở nhiệt độ thấp (0C) có thể xảy ra quá trình phản xuân hóa, dẫn đến sự hình thành chồi chậm (Nguyễn Kim Thanh và cộng sự, 2005) [14]. Kết quả tƣơng tự với Vũ Quang Sáng (1988) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của việc xử lý lạnh đến sinh trƣởng và phát triển, năng suất của tỏi cho thấy trong điều kiện nhỏ hơn 6C là tốt nhất. Vì vậy, chúng tôi đã chọn nhiệt độ xử lý lạnh 5C trong 4 tuần để xử lý mẫu tỏi. Theo số liệu đã thu nhận thì các nghiệm thức mà mẫu cấy đƣợc xử lý lạnh có kết quả cao hơn so với các nghiệm thức tƣơng ứng cùng nồng độ BA bổ sung đối với mẫu cấy bảo quản ở nhiệt độ phòng. Kết quả tốt nhất ở tất cả các chỉ tiêu đƣợc ghi nhận cũng ở mẫu cấy có xử lý lạnh và nồng độ chất cảm ứng là 0,1 mg/l BA. Khi so sánh ở cùng nồng độ này giữa nghiệm thức mẫu đƣợc xử lý lạnh và mẫu xử lý nhiệt độ phòng đều đạt giá trị cao hơn ở các chỉ tiêu theo dõi. Kết quả nghiên cứu tƣơng tự nhƣ Nguyễn Thị Thanh Phƣơng và cộng sự (2012) đã nghiên cứu làm sạch virus cho cây tỏi ta (Allium sativum L.) bằng nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng với môi trƣờng nuôi cấy tái sinh đỉnh sinh trƣởng tốt nhất là MS bổ sung 30g succrose và 1mg/l BA [6]. Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy ở các nồng độ BA khảo sát cao hơn 1 mg/l có sự giảm dần theo nồng độ chất cảm ứng ở tất cả các chỉ tiêu. Điều này có thể là do BA nồng độ 1 mg/l là ngƣỡng nồng độ thích hợp cảm ứng đối với mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi. Ở nồng độ cao hơn ngƣỡng thích hợp sẽ ức chế sự phát sinh hình thái. Đây cũng là nhận định của Lithy và công sự (2011) đã đƣa ra khi nghiên cứu nhân giống in vitro từ các mảnh lá của cây mầm Abelmoschus moschatus [28]. 45
  56. Đồ án tốt nghiệp Vậy mẫu có qua giai đoạn xử lý lạnh sẽ đƣợc cảm ứng tốt hơn và phát triển nhanh khi tiếp xúc với môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung BA, đặc biệt ở nồng độ là 1,0 mg/l cho kết quả tốt nhất với 23,33% mẫu tạo chồi, 46,67% mẫu tạo mô sẹo và 13,33% mẫu tạo rễ. 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực chất là kết quả của các quá trình biệt hoá và phản biệt hoá. Quá trình này phụ thuộc vào tỷ lệ cân bằng của hai nhóm chất ĐHST [32]. Phát sinh hình thái có thể phát triển theo hƣớng thông qua tái sinh trực tiếp thành cơ quan hoặc cá thể mới hay sinh sản liên tục thành mô sẹo [37]. Auxin ảnh hƣởng đến nhiều khía cạnh của sự lớn mạnh và phát triển ở thực vật, bao gồm sự mở rộng của tế bào, ức chế sự phát triển của các chồi phụ và sự đâm rễ. Các auxin tổng hợp đƣợc dùng trong loại bột làm cho bén rễ để chiết cành, giâm cành. Chúng còn dùng để ngăn cản sự rụng trái. Auxin cũng có vai trò trong điều khiển sự tăng trƣởng và phát triển của thực vật. Auxin giúp tính hƣớng tối của thực vật và tùy thuộc vào việc bổ sung auxin ngoại sinh thì có sự cảm ứng hình thành rễ chính và rễ phụ khác nhau. Auxin kích thích sự sinh trƣởng giãn của tế bào. Nhƣng nếu kích thích với hàm lƣợng quá cao, tác dụng quá mạnh sẽ xảy ra hiện tƣợng ức chế ngƣợc trở lại, lúc này auxin sẽ trở thành chất ức chế. Vì vậy mục tiêu của thí nghiệm này là khảo sát ảnh hƣởng nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi. Kết quả thu nhận đƣợc ghi nhận ở bảng 3.3. 46
  57. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3. Kết quả ảnh hƣởng nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi. Nồng Tỷ lệ Số Tỷ lệ Tỷ lệ Số rễ Nghiệm Nhiệt độ mẫu tạo chồi STT mẫu tạo mẫu tạo trung thức độ mg/l mô sẹo trung chồi (%) rễ (%) bình NAA (%) bình 1 ĐC - 0g 0f 0d 0f 0c cd* ef bc def ab 2 N-KL0,5 0,5 26,67 6,67 13,33 0,10 0,17 b ef ab bcd a 3 N-KL1,0 1,0 40,00 6,67 20,00 0,20 0,23 cd cde bc bcd ab 4 N-KL1,5 1,5 26,67 13,33 13,33 0,20 0,17 de ab bc ab ab 5 N-KL2,0 Phòng 2,0 20,00 26,67 13,33 0,30 0,17 ef bcd cd bcd bc 6 N-KL2,5 2,5 13,33 20,00 6,67 0,20 0,10 fg cde cd cde bc 7 N-KL3,0 3,0 3,33 13,33 6,67 0,13 0,07 g cde d cde c 8 N-KL3,5 3,5 0 13,33 0 0,13 0 g ef d ef c 9 N-KL4,0 4,0 0 6,67 0 0,07 0 de ef cd ef bc 10 N-TL0,5 0,5 20,00 3,33 6,67 0,07 0,10 a ef a abc a 11 N-TL1,0 1,0 53,33 6,67 26,67 0,23 0,26 bc def bc cde ab 12 N-TL1,5 1,5 33,33 10,00 13,33 0,17 0,17 ef a bc a ab 13 N-TL2,0 Lạnh 2,0 13,33 33,33 13,33 0,33 0,17 ef abc cd abc bc 14 N-TL2,5 5C 2,5 13,33 23,33 6,67 0,23 0,10 fg cde cd cde bc 15 N-TL3,0 3,0 6,67 13,33 6,67 0,13 0,07 fg ef cd ef bc 16 N-TL3,5 3,5 6,67 3,33 6,67 0,07 0,07 g f d f c 17 N-TL4,0 4,0 0 0 0 0 0 Các chữ cái a, b, c, trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD 47
  58. Đồ án tốt nghiệp % Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo % 60 50 40 30 20 10 0 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 N-KL N-TL Biểu đồ 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh tạo mô sẹo từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi % Tỷ lệ mẫu tạo chồi % 35 30 25 20 15 10 5 0 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 N-KL N-TL Biểu đồ 3.5 Ảnh hƣởng nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh tạo chồi từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi 48
  59. Đồ án tốt nghiệp % Tỷ lệ mẫu tạo rễ % 30 25 20 15 10 5 0 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 N-KL N-TL Biểu đồ 3.6 Ảnh hƣởng nồng độ NAA và nhiệt độ xử lý mẫu lên sự phát sinh tạo rễ từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi. Dựa vào bảng 3.3 và biểu đồ 3.4 cho thấy môi trƣờng khi đƣợc bổ sung NAA các mẫu cấy có sự ảnh hƣởng rõ rệt lên sự hình thành mô sẹo. Theo dõi thời gian nuôi cấy thấy rằng mẫu cấy có xử lý nhiệt có dấu hiệu đƣợc cảm ứng bởi NAA sau 2 tuần nuôi cấy. Trong khi mẫu cấy bảo quản ở nhiệt độ phòng thì phải mất 4 tuần nuôi cấy mới bắt đầu có cảm ứng. Đặc biệt nồng độ 1,0 mg/l BA cho thấy mẫu đã xử lý nhiệt đạt kết quả tốt nhất (53,33%), gấp 1,3 lần so với mẫu chƣa xử lý nhiệt (40,00%). Các mẫu cấy không xử lý nhiệt có màu xanh, khối mô sẹo cứng, mọng nƣớc, các tế bào trơn láng, không hình thành cụm. Mô sẹo từ mẫu có xử lý nhiệt độ mô sẹo màu trắng hơi vàng, các tế bào có cụm tròn, rời rạc nên có khả năng tái sinh cao hơn (Hình 3.2). Khi tăng nồng độ NAA thì các mẫu đƣợc xử lý lạnh và không xử lý lạnh cho thấy sự hình thành mô sẹo giảm, kích thƣớc mô sẹo giảm dần. Ở nồng độ 3,5 – 4,0 mg/l NAA nguồn mẫu không xử lý lạnh không hình thành mô sẹo. 49
  60. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2 Mẫu cấy lớp mỏng đế trên môi trƣờng bổ sung NAA. a) So sánh kết quả phát sinh hình thái giữa các nghiệm thức thí nghiệm; b) Hình thái mô sẹo ở nghiệm thức N-TL1,0; c) Mô sẹo ở nghiệm thức N-TL1,0; d) Chồi ở nghiệm thức N-TL2,0. Tƣơng tự nhƣ sự hình thành mô sẹo, hiện tƣợng xuân hóa cũng đã cho thấy rõ sự khác biệt giữa nguồn mẫu xử lý ở nhiệt độ lạnh và nguồn mẫu xử lý ở nhiệt độ phòng ở sự hình thành chồi. Hiện tƣợng xuân hóa đã góp phần làm tăng tốc độ cảm ứng của mẫu cấy và sự hình thành chồi cũng tăng đáng kể. Khi tăng nồng độ NAA từ 0,5 – 2,0 mg/l cho thấy tỷ lệ mẫu tạo chồi tăng dần thể hiện ở bảng 3.3 và biểu đồ 3.5. Bên cạnh đó có sự gia tăng số lƣợng chồi trực tiếp và gián tiếp từ mô sẹo ở nghiệm thức bổ sung 0,5 mg/l NAA là 0,10 chồi lên đến 0,30 chồi ở nghiệm thức 2,0 mg/l NAA. Ở nồng độ 2,0 mg/l NAA cho kết quả tỷ lệ mẫu chồi cao nhất ở nguồn mẫu đƣợc xử lý lạnh (33,33%) gấp 1,3 lần nguồn mẫu không qua giai đoạn xử lý (26,67%). Khi nồng độ NAA tăng lên cao (2,5 mg/l – 4,0 mg/l) thì chất lƣợng chồi thấp, chồi còi cọc, có màu hơi vàng đến vàng. Môi trƣờng đƣợc bổ sung NAA bên cạnh sự hình thành mô sẹo, chồi thì rễ cũng đƣợc hình thành. Qua bảng 3.3 và biểu đồ 3.6 cho thấy tỷ lệ mẫu tạo rễ cao nhất với 26,67% mẫu tạo rễ ở nguồn mẫu xử lý lạnh (1,0 mg/l NAA) cao hơn gấp 50
  61. Đồ án tốt nghiệp 1,3 lần so với kết quả ở các nghiệm thức nhiệt độ phòng. Kết quả này có sự khác biệt về mặt thống kê so với các nghiệm thức khảo sát còn lại ở cùng điều kiện nuôi cấy. Khi tăng nồng độ NAA từ 1,5 mg/l lên 4,0 mg/l thì đã có sự ức chế kéo dài rễ và số lƣợng rễ tạo thành ít dần. Điều này có thể do auxin – NAA khi ở nồng độ cao đã kích thích sự tạo sơ khởi rễ nhƣng sẽ cản trở sự tăng trƣởng của các rễ sơ khởi này (Bùi Trang Việt, 2000) [13]. Qua kết quả thí nghiệm cho thấy auxin và nhiệt độ xử lý mẫu có ảnh hƣởng rõ rệt đến quá trình phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế. Tùy từng nồng độ NAA cho kết quả phát sinh hình thái khác nhau. Ở nghiệm thức với mẫu cấy đƣợc xử lý ở nhiệt độ lạnh và bổ sung 1,0 mg/l NAA cho thấy mẫu cấy cho sự hình thành mô sẹo tốt nhất với tỷ lệ mẫu tạo sẹo là 53,33%, mô sẹo trắng xốp, bở có khả năng làm nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tạo huyền phù tế bào và phôi. Bên cạnh đó, môi trƣờng đƣợc bổ sung 2,0 mg/l NAA lại cho kết quả tạo chồi tốt nhất với 33,33% mẫu cấy tạo chồi. 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ BA, NAA kết hợp lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi với nguồn mẫu đƣợc xử lý ở nhiệt độ lạnh 5C Kết quả của hai thí nghiệm 2 và 3 cho thấy hiện tƣợng xuân hoá khi tỏi đƣợc xử lý lạnh ở 5C đã ảnh hƣởng rõ rệt lên sự phát sinh hình thái mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi. Thí nghiệm cũng ghi nhận BA và NAA có tác động kích thích sự hình thành và phát triển các chồi, mô sẹo và rễ từ mẫu cấy. Từ những nhận định trên chúng tôi đã tiếp tục tiến hành nghiên cứu khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA và NAA kết hợp lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế với nguồn mẫu đã đƣợc xử lý ở nhiệt độ lạnh 5C .Kết quả thu nhận đƣợc ghi nhận ở bảng 3.4. 51
  62. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ BA và NAA kết hợp lên sự phát sinh hình thái từ mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi với nguồn mẫu ở nhiệt độ lạnh 5C. Nồng độ Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ Tỷ lệ Số chồi Số rễ Nghiệm (mg/l) tạo mô sẹo mẫu tạo mẫu tạo trung trung thức BA NAA (%) chồi (%) rễ (%) bình bình ĐC - - 0g 0m 0f 0q 0j BN05-1 0,5 6,67fg 46,67ef 13,33de 0,57ef 0,13hi BN05-2 1,0 26,67cd 60,00cd 13,33de 0,70cd 0,13hi BN05-3 1,5 53,33a 73,33ab 33,33ab 0,83b 0,43a BN05-4 2,0 33,33bc 53,33de 13,33de 0,60de 0,17gh 0,5 BN05-5 2,5 20,00de 40,00fg 13,33de 0,30h-k 0,13hi BN05-6 3,0 6,67fg 23,33hij 6,67ef 0,23j-m 0,07ij BN05-7 3,5 6,67fg 23,33hij 0f 0,20k-n 0j BN05-8 4,0 3,33fg 6,67lnm 0f 0,07opq 0j BN10-1 0,5 13,33ef 66,67bc 0f 0,73bc 0j BN10-2 1,0 20,00de 80,00a 40,00a 0,97a 0,40ab BN10-3 1,5 26,67cd 73,33ab 26,67bc 0,77bc 0,37abc BN10-4 2,0 20,00de 53,33de 26,67bc 0,60de 0,30cde 1,0 BN10-5 2,5 20,00de 33,33gh 20,00cd 0,40ghi 0,20fgh BN10-6 3,0 13,33ef 26,67hi 6,67ef 0,30h-k 0,07ij BN10-7 3,5 13,33ef 23,33hij 0f 0,20k-n 0j BN10-8 4,0 6,67fg 20,00ijk 0f 0,20k-n 0j BN15-1 0,5 6,67fg 6,67lnm 0f 0,07opq 0j BN15-2 1,0 6,67fg 26,67hi 6,67ef 0,30h-k 0,07ij BN15-3 1,5 13,33ef 40,00fg 20,00cd 0,47fg 0,23efg BN15-4 2,0 20,00de 46,67ef 23,33c 0,57ef 0,33bcd 1,5 BN15-5 2,5 13,33ef 40,00fg 13,33de 0,37g-j 0,13hi BN15-6 3,0 6,67fg 26,67hi 6,67ef 0,30h-k 0,07ij BN15-7 3,5 6,67fg 26,67hi 0f 0,27i-l 0j BN15-8 4,0 3,33fg 23,33hij 0f 0,20k-n 0j BN20-1 0,5 6,67fg 26,67hi 0f 0,27i-l 0j BN20-2 1,0 13,33ef 26,67hi 6,67ef 0,30h-k 0,07ij BN20-3 1,5 40,00b 33,33gh 13,33de 0,40ghi 0,17gh BN20-4 2,0 33,33bc 33,33gh 26,67bc 0,33g-j 0,27def 2,0 BN20-5 2,5 33,33bc 40,00fg 0f 0,40ghi 0j BN20-6 3,0 26,67cd 33,33gh 0f 0,33g-j 0j BN20-7 3,5 20,00de 23,33hij 0f 0,20k-n 0j BN20-8 4,0 6,67fg 13,33j-n 0f 0,13m-p 0j BN25-1 0,5 10,00efg 10,00k-m 0f 0,13m-p 0,03j BN25-2 2,5 1,0 6,67fg 13,33j-n 0f 0,13m-p 0j BN25-3 1,5 6,67fg 13,33j-n 0f 0,13m-p 0j 52
  63. Đồ án tốt nghiệp BN25-4 2,0 6,67fg 13,33j-n 0f 0,13m-p 0j BN25-5 2,5 6,67fg 10,00k-m 0f 0,10n-q 0j BN25-6 3,0 3,33fg 6,67lnm 0f 0,07opq 0j BN25-7 3,5 3,33fg 6,67lnm 0f 0,07opq 0j BN25-8 4,0 3,33fg 6,67lnm 0f 0,07opq 0j BN30-1 0,5 10,00efg 33,33gh 0f 0,43gh 0,03j BN30-2 1,0 6,67fg 23,33hij 0f 0,27i-l 0j BN30-3 1,5 3,33fg 16,67i-l 0f 0,17l-o 0j BN30-4 2,0 3,33fg 13,33j-n 0f 0,13m-p 0j 3,0 BN30-5 2,5 0g 13,33j-n 0f 0,13m-p 0j BN30-6 3,0 0g 13,33j-n 0f 0,13m-p 0j BN30-7 3,5 0g 6,67lnm 0f 0,07opq 0j BN30-8 4,0 0g 3,33nm 0f 0,03pq 0j BN35-1 0,5 3,33fg 23,33hij 0f 0,27i-l 0j BN35-2 1,0 3,33fg 23,33hij 0f 0,20k-n 0j BN35-3 1,5 3,33fg 16,67i-l 0f 0,17l-o 0j BN35-4 2,0 3,33fg 13,33j-n 0f 0,13m-p 0j 3,5 BN35-5 2,5 0g 6,67lnm 0f 0,07opq 0j BN35-6 3,0 0g 6,67lnm 0f 0,07opq 0j BN35-7 3,5 0g 3,33nm 0f 0,03pq 0j BN35-8 4,0 0g 3,33nm 0f 0,03pq 0j BN40-1 0,5 0g 10,00k-m 0f 0,10n-q 0j BN40-2 1,0 0g 16,67i-l 0f 0,17l-o 0j BN40-3 1,5 0g 13,33j-n 0f 0,13m-p 0j BN40-4 2,0 3,33fg 10,00k-m 0f 0,10n-q 0j 4,0 BN40-5 2,5 3,33fg 6,67lnm 0f 0,07opq 0j BN40-6 3,0 0g 6,67lnm 0f 0,07opq 0j BN40-7 3,5 0g 6,67lnm 0f 0,07opq 0j BN40-8 4,0 0g 0m 0f 0q 0j Các chữ cái a, b, c, trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử CRD Qua bảng 3.4 cho thấy khi kết hợp BA (0,5 – 4,0) và NAA (0,5 – 4,0) cho tỷ lệ mẫu tạo sẹo cao hơn so với các nghiệm thức ở các thí nghiệm 2 và 3 khi bổ sung BA, NAA riêng lẻ. Tuy nhiên ở những nghiệm thức có nồng độ BA và NAA kết hợp cao (3,0 – 4,0 mg/l) không có sự hình thành mô sẹo. Các nghiệm thức có tỷ lệ auxin/cytokinin trong khoảng 1 – 2 lần có tỷ lệ tạo sẹo cao. Khi so sánh giữa các hệ nghiệm thức có nồng độ BA khác nhau thì thấy rằng BA ở nồng độ 0,5 mg/l kết hợp NAA cho kết quả tốt hơn các nghiệm thức có NAA tƣơng ứng và nồng độ BA cao 53
  64. Đồ án tốt nghiệp hơn. Chỉ tiêu tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo đạt giá trị cao ở nồng độ 0,5 mg/l BA kết hợp NAA trong khoảng 1,0 – 2,5 mg/l và đạt cao nhất ở nghiệm thức BN05-3 có thành phần CĐHSTTV là 0,5 mg/l BA và 1,5 mg/l NAA với 53,33% mẫu tạo sẹo. Hình thái mô sẹo có màu trắng xốp, đôi khi có màu xanh. Trong thí nghiệm này, trong thời gian đầu sau 5 ngày nuôi cấy, cho thấy có hiện tƣợng hóa trắng sữa hơi vàng; nhƣng sau 2 tuần, bắt đầu có sự hình thành mô sẹo ngay tại vị trí vết thƣơng. Do tác động của các CĐHSTTV mô sẹo bắt đầu hình thành từ vị trí vết thƣơng, sau đó các tế bào mô sẹo phát triển mạnh tạo thành khối. Theo Nguyễn Thị Quý Cơ và cộng sự (2014) mô thực vật khi bị tổn thƣơng luôn có khuynh hƣớng làm lành vết thƣơng bằng cách phản phân hóa các tế bào để phân chia tạo các tế bào khác che lấp vùng bị tổn thƣơng [2]. Sau 4 tuần nuôi cấy, khối mô sẹo phát triển mạnh, xốp và có màu trắng ngà vàng, xốp, các tế bào có dạng cụm tròn, rời rạc nên có khả năng tái sinh cao (Hình 3.4). Tuy nhiên khi nồng độ BA và NAA tăng thì tỷ lệ tạo mô sẹo giảm. Đồng thời, khối mô sẹo mềm, mọng nƣớc, màu trắng đục, các tế bào trơn láng, không hình thành cụm. Khoảng nồng độ BA (2,5 – 4,0 mg/l) kết hợp NAA ở các nồng độ khác nhau cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo cũng giảm, các mô sẹo có kích thích nhỏ dần, có màu xanh vàng và cứng. Có thể do ở nồng độ BA và NAA tăng đã dẫn đến mẫu cấy bị ức chế. Nhận định trên phù hợp với (Bùi Trang Việt, 2000) cho thấy việc cảm ứng tạo mô sẹo thƣờng đòi hỏi sự kết hợp giữa auxin và cytokinin [13]. Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin trong môi trƣờng nuôi cấy với những tỷ lệ nhất định sẽ ảnh hƣởng đến quá trình tạo sẹo (Letham, 1974; Akiyashi và cộng sự.,1983) [29], [15]. Mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung BA, NAA nồng độ khác nhau đƣợc giải phẫu và quan sát mẫu giải phẫu cắt ngang bằng kính hiển vi. Quan sát giải phẫu nhận thấy có sự phân chia mạnh của các tế bào nhu mô tại vị trí vết thƣơng. Các tế bào này tiếp tục phân chia lộn xộn tạo thành khối mô sẹo (Hình 3.5). 54
  65. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.3 Hình thái mẫu cấy trên môi trƣờng bổ sung BA và NAA kết hợp. a) Chồi ở nghiệm thức BN10-2; b) Chồi ở nghiệm thức BN10-3; c) Rễ ở nghiệm thức BN10-2. Nhƣ vậy, mẫu cấy trên môi trƣờng có sự hiện diện đồng thời của auxin và cytokinin đã giúp cho các tế bào nhu mô ngay vùng vết thƣơng phân chia để hình thành khối mô sẹo. Bên cạnh sự phát sinh hình thái tạo mô sẹo thì khi kết hợp BA với NAA cho thấy có sự hình thành chồi ở tất cả các nghiệm thức. Tỷ lệ mẫu tạo chồi khi kết hợp cho kết quả cao hơn so với khi bổ sung BA, NAA riêng lẻ. Hệ nghiệm thức BA 1,0 mg/l kết hợp NAA cho kết quả tốt hơn so với các hệ nghiệm thức còn lại. Môi trƣờng bổ sung 1,0 mg/l BA và 1,0 mg/l NAA sau 4 tuần nuôi cấy cho tỷ lệ mẫu tạo chồi, số chồi trung bình cao nhất so với các nghiệm thức khác khảo sát trong báo cáo này 55
  66. Đồ án tốt nghiệp (80,00% mẫu tạo chồi và 0,97 chồi/mẫu). Từ những mẫu cấy ban đầu có kích thƣớc nhỏ mỏng thì chỉ sau 2 tuần nuôi cấy các mẫu cấy có kích thƣớc gia tăng đáng kể, chồi dài, xanh, khỏe (Hình 3.3.a). Một số mẫu cũng có sự hình thành mô sẹo với tỷ lệ thấp (20,00%) và rễ phát triển tốt. Khi nồng độ BA bổ sung cao hơn 2,0 mg/l kết hợp NAA (0,5 – 4,0 mg/l) lại làm giảm tỷ lệ mẫu tạo chồi và giảm số lƣợng chồi trung bình. Những chồi hình thành ở các nghiệm thức có BA nồng độ cao trên 3,0 mg/l sau tuần thứ 3 lá trở nên vàng, mất dần sắc tố xanh, chồi phát triển kém (Hình 3.3.b). Hình 3.4 Hình thái mô sẹo trên môi trƣờng bổ sung BA và NAA kết hợp dƣới kính soi nổi. a,b) Mô sẹo ở nghiệm thức BN05-3; c) Mô sẹo ở nghiệm thức BN15-2. 56
  67. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5 Hình thái giải phẫu mẫu cấy tỏi sau 4 tuần nuôi cấy Auxin là nhóm chất có ý nghĩa quan trọng trong sự hình thành rễ ở thực vật. Trong nhóm chất này NAA là loại auxin nhân tạo khá phổ biến đƣợc ứng dụng đối với nhiều đối tƣợng nghiên cứu nhằm mục đích tạo rễ và tạo sẹo. Ở nồng độ cao NAA kích thích tạo rễ nhƣng lại ức chế sự kéo dài của các sơ khỏi rễ này. Sự kéo dài rễ cần hoặc không cần sự hiện diện của auxin ở nồng độ thấp. Ở thí nghiệm này, các nghiệm thức có nồng độ BA dƣới 2,0 mg/l và NAA dƣới 3,0 mg/l có sự hình thành rễ với tỷ lệ khác nhau theo từng nghiệm thức. Trong đó các nghiệm thức có nồng độ auxin và cytokinin tƣơng đƣơng có tỷ lệ tạo rễ cao hơn các nghiệm thức còn lại. Đặc biệt là ở môi trƣờng bổ sung 1 mg/l BA và NAA có tỷ lệ mẫu tạo rễ cao nhất là 40,00% (Hình 3.3.c). Với nồng độ BA trên 2,0 mg/l không có sự hình 57
  68. Đồ án tốt nghiệp thành rễ ở tất cả các nghiệm thức. Môi trƣờng có nồng độ NAA từ 3,5 mg/l cũng không có sự hình thành rễ khi kết hợp với BA trong khoảng nồng độ khảo sát. Theo Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự (2013) thì auxin sẽ cảm ứng mẫu cấy tạo mô sẹo và hình thành sơ khởi rễ khi phối hợp với cytokinin theo một tỷ lệ thích hợp. Vì vậy mà với môi trƣờng có sự kết hợp của BA và NAA không chỉ giúp gia tăng tỷ lệ tạo chồi mà cũng giúp tăng tỷ lệ tạo sẹo và tạo rễ ở những nồng độ thích hợp [7]. Gaspar và cộng sự (1996) cho rằng việc bổ sung cytokinin có thể gây ức chế một số hoạt tích của auxin. Đây có thể là lý do giải thích tại sao các nghiệm thức có thành phần BA từ 2,0 đến 4,0 mg/l hầu nhƣ không có sự hình thành rễ ở tất cả các nghiệm thức bổ sung NAA các nồng độ khác nhau [23]. Ngoài ra, trong quá trình theo dõi sự sinh trƣởng của mẫu cấy còn nhận thấy, ở nghiệm thức BA là 1,5 mg/l kết hợp với NAA 1,0 mg/l có sự xuất hiện của phôi. Các phôi hình thành trực tiếp từ mô sẹo (Hình 3.4.c). Tuy nhiên hiện tƣợng này không xảy ra đồng đều với tất cả các mẫu cấy trong cùng nghiệm thức. Song đây cũng có thể là tham khảo cho việc khảo sát môi trƣờng thích hợp cảm ứng tạo phôi đối với đối tƣợng là củ tỏi. Nhƣ vậy khi sử dụng kết hợp BA và NAA để cảm ứng sự phát sinh hình thái đối với mẫu cấy lớp mỏng đế của các tép tỏi đã đƣợc xử lý lạnh ở 5C trong 4 tuần trƣớc thí nghiệm thì cho thấy hiệu quả cảm ứng tốt hơn so với các nghiệm thức chỉ bổ sung riêng lẻ các chất này. Nghiệm thức có 0,5 mg/l BA và 1,5 mg/l NAA cho tỷ lệ mẫu cấy tạo sẹo đạt cao nhất (53,33%). Các chỉ tiêu theo dõi còn lại đầu đạt giá trị cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 1,0 mg/l BA và 1,0 mg/l NAA. 58
  69. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi rút ra một số kết luận: ‒ Thời gian khử trùng thích hợp nhất đối với mẫu cấy tép tỏi Lý Sơn là 10 phút bằng dung dịch khử trùng HgCl2 0,1%. ‒ Nguồn mẫu đƣợc xử lý lạnh ở 5C trong 4 tuần trƣớc khi sử dụng làm mẫu cấy có đáp ứng tốt hơn với các chất cảm ứng so với mẫu cấy không đƣợc xử lý nhiệt. ‒ Môi trƣờng MS bổ sung 1,0 mg/l BA cảm ứng hiệu quả sự tạo sẹo, tạo chồi và tạo rễ. ‒ Môi trƣờng MS bổ sung 1,0 mg/l NAA cảm ứng tạo sẹo hiệu quả với tỷ lệ 53,33% và 26,67% mẫu tạo rễ, NAA ở nồng độ 2,0 mg/l cảm ứng tạo chồi tốt khi sử dụng riêng lẻ (33,33%) đối với mẫu cấy đã đƣợc xử lý nhiệt. ‒ BA và NAA kết hợp giúp gia tăng khả năng cảm ứng phát sinh hình thái đối với mẫu cấy đƣợc xử lý lạnh. ‒ Môi trƣờng MS bổ sung 0,5 mg/l BA kết hợp 1,5 mg/l NAA có tỷ lệ tạo sẹo cao nhất 53,33%. ‒ BA kết hợp NAA ở cùng 1,0 mg/l cảm ứng mẫu cấy phát sinh hình thái đạt kết quả cao nhất ở các chỉ tiêu tỷ lệ tạo chồi (80,00%), tỷ lệ tạo rễ (40,00%), số chồi trung bình (0,97 chồi) và số rễ trung bình (0,4 rễ) 4.2 Kiến nghị Sau quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đƣa ra một số kiến nghị: ‒ Khảo sát ảnh hƣởng của các loại CĐHSTTV khác khi bổ sung riêng lẻ hoặc kết hợp đến sự phát sinh hình thái mẫu cấy lớp mỏng đế tép tỏi. ‒ Khảo sát sự phát sinh hình thái từ các nguồn mẫu khác của cây tỏi. ‒ Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sự phát sinh hình thái mẫu cấy. 59
  70. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nƣớc [1]. Phạm Thị Cậy (1994). Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý nhiệt độ thấp và GA3 đến sinh trưởng và phát triển của một số cây họ hành tỏi Liliaceae, Luận văn tốt nghiệp, Trƣờng Đại Học Nông Nghiệp I, Hà Nội. [2]. Nguyễn Thị Quý Cơ, Trần Văn Tiến, Võ Thị Bạch Mai, Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Hải Sơn (2014). Quá trình phát sinh hình thái mô sẹo và chồi của cây long não (cinnamomum camphora ( L.) sieb.) nuôi cấy in vitro, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2014, 12 (7), 1034 - 1041. [3]. Dƣơng Tấn Nhựt (2011). Hệ thống nuôi cấy tế bào trong nghiên cứu tái sinh và vi nhân giống thực vật. Công nghệ sinh học thực vật: Nghiên cứu cơ bản và ứng dụng Tập 1, Nông nghiệp, Tp. HCM, 105 – 106. [4]. Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thuỷ Tiên (2002). Công nghệ tế bào, Đại Học Quốc Gia , TP. Hồ Chí Minh. [5]. Đỗ Ngọc Thanh Mai, Phạm Thị Ngọc Tú, Phạm Thị Phƣơng Thảo, Tô thị Nhã Trầm, Hoàng Thanh Tùng, Hoàng Văn Cƣơng, Hoàng Xuân Chiến, Dƣơng Tân Nhựt (2015). Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo từ phôi vô tính hình thành từ nuôi cấy chóp rễ invitro cây tỏi ta (Allium sativum L.), Tạp chí Công nghệ Sinh học 13 (2A), 493 – 499. [6]. Nguyễn Thị Thanh Phƣơng, Nguyễn Thị Lý Anh (2012). Nghiên cứu làm sạch virus cho cây tỏi ta (Allium sativum L.) bằng nuôi cấy Meristem, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 10 (2), 244 – 255. [7]. Nguyễn Thị Quỳnh, Hoàng Ngọc Nhung, Nguyễn Lê Anh Thƣ (2013). Sự hình thành và tăng trưởng của rễ bất định từ nuôi cấy in vitro của cây đương quy nhật bản (Angelica Acutiloba Kitagawa), Tạp chí sinh học , 35 (3E), 165 – 173. 60
  71. Đồ án tốt nghiệp [8]. Vũ Quang Sáng (1988). Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý lạnh đến năng suất tỏi, Tạp chí KHKT và quản lý kinh tế. [9]. Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Trần Văn Phẩm (2000), Giáo trình sinh lý thực vật, Nông nghiệp, Hà Nội. [10].Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Kim Thanh (1991). Nghiên cứu hiệu quả của nhiệt độ thấp trong quá trình bảo quản đến sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất Khoai Tây, Kết quả nghiên cứu khoa học trƣờng Đại học Nông nghiệp I 1986 – 1991, Nông Nghiệp, 43 – 46. [11].Nguyễn Quang Thạch, Mai Thị Tân, Hoàng Minh Tấn (1986). Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thấp lên cây mạ xuân IR8, Tuyển tập công trình nghiên cứu KHKT nông nghiệp, Nông nghiệp, Hà Nội. [12]. Bùi Thị Thơ, Võ Châu Tuấn, Đoàn Thị Hạnh (2014). Nghiên cứu khả năng tạo callus và tái sinh in vitro cây tỏi cô đơn (Allium sativum L.) của đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi, Hội thảo khoa học cán bộ trẻ các trƣờng Đại học Sƣ phạm toàn quốc, 4, 604 – 612. [13]. Bùi Trang Việt (2000). Đại cƣơng, Phần I: Dinh dƣỡng, Sinh lý thực vật đại cương, Đại học Quốc gia Tp. HCM, Hồ Chí Minh. [14]. Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005). Tính chống chịu sinh lý của thực vật với các điều kiện ngoại cảnh bất thuận, Giáo trình sinh lý thực vật, Hà Nội, Hà Nội, 245 – 248. Tài liệu nƣớc ngoài [15]. Akiyashi D.E, Morris R.O, Hinz R., Mischke B.S., Kosuge T., Garfinket D.J., Gordon M.P., Nester W. (1983). Cytokinin/auxin balance in crown gall tumors is regulated by specific loci in the T-DNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 407 – 411. 61
  72. Đồ án tốt nghiệp [16]. Alejandrina Robledo-Paz, Víctor M. Villalobos-Arámbula, Alba E. Jofre- Garfias (2000). Efficient plant regeneration of garlic (Allium sativum L.) by root-tip culture, Cell. Dev. Biol. – Plant, 36, 416 – 419. [17]. Ayabe M., Sumi S. (1998). Establishment of a novel tissue culture method, stem-disc culture, and its practical application to micropropagation of garlic (Allium sativum L.), Plant Cell Reports, 17 (10), 773 – 779. [18]. Ayabe M., Sumi S. (2001). A novel and efficient tissue culture method – “stem-disc dome culture” – for producing virus-free garlic (Allium sativum L.), Plant Cell Rep (2001) (20), 503–507. [19].Cavallito Chester J., John Hays Bailey (1944). Allicin, the Antibacterial Principle of Allium sativum., Isolation, Physical Properties and Antibacterial Action, J. Am. Chem. Soc., 66 (11), 1950–1951. [20]. Chand, S. and A. K. Singh (1999). In vitro propagation of Bombax ceiba L. (Silkcotton), Silvae genetica ISSN 0037-5349 Conden Sigeaq, 48 (6), 313-317. [21]. Fereol L., V. Chovelon, S. Causse, N. Michaux-Ferriere, R. Kahane (2002). Evidence of a somatic embryogenesis process for plant regeneration in garlic (Allium sativum L.), Plant Cell Rep, 21, 197 – 203. [22]. Gabriela F. Luciani, Ana K. Mary, Ceilia Pellegrini, N. R. Curvetto (2006). Effects of explants and growth regulators in garlic callus formation and plant regeneration, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 87(2), 139-143. [23]. Gaspar T., Kevers C., Penel C., Greppin H., Reid D.M., Thrope T.A. (1996). Plant hormone and plant growth regulators in plant tissue culture, In vitro Cell Dev Biol Plant, 32, 272 – 289. [24]. Haque MS, Wada T, Hattori K (1997). High frequency shoot regeneration and plantlet formation from root tip of + garlic, Plant Cell Tissue Organ Cult, 50, 83–89. 62
  73. Đồ án tốt nghiệp [25]. Haque MS, Wada T, Hattori K (1998). Efficient plant regeneration in Garlic through somatic embryogenesis from root tip explants, Plant Prod Sci, 1, 216- 222. [26]. Javed, A.M., H. Said and N. Saima (1996). In vitro propagation of Bougainvillea spectubilis through shoot apex culture, Pak. J. Bot., 28, 207- 211. [27]. Khan N., M.S. Alam and U.K. Nath (2004). In vitro Regeneration of Garlic Through Callus Culture, Journal of Biological Sciences, 4 (2), 189-191. [28]. Lithy S. S., Lisa S. F., Azam F. M. S., Rahman S., Noor F. A., Sintaha M., Paul A. K., Rahmatullah M. (2011). In vitro Propagation from cotyledonary nodes of germinated seedlings of Abelmoschus moschatus, American-Eurasian Journal of Sustainable Agriculture, 5(3), 364-370. [29]. Letham D.S (1974). Regulators of cell division in plant tissue XX. The cytokinins of coconut mikl, Physiol. Plant, 32, 66 – 70. [30]. Louis K.Mann and P.A.Minges (1958). Growth and bulbing of garlic (Allium sativum L.) in respone to storage temperature of planting stocks, day length, and planting date, Hilgardia, 27(15), 385-419. [31]. Murashige T and Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and bio- assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3), 473-497. [32]. Narayanaswamy S. (1994). Plant Cell and Tissue Culture, Mc Graw-Hill Publishing Company limited, New Delhi. [33]. Salam M.A., M.R. Ali, M.E. Ali, K.A. Alam and M.S.H. Reza, (2008). Callus induction and regeneration of indigenous garlic (Allium sativum L.), Am. J. Plant Physiol., 3, 33-39. 63