Đồ án Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh long

144 trang thiennha21 13/04/2022 4650

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh long", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_khao_sat_kha_nang_doi_khang_cua_cac_chung_nam_trichode.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh long

New Text Document.txt Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh long Nguyễn Thị Bích Tuyền Nguyễn Thị Hai (giảng viên hướng dẫn) Page 1
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Đối tượng nghiên cứu 3 5. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma spp. 5 1.1.1 Phân loại. 5 1.1.2 Các chủng nấm Trichoderma spp. đã được phân lập 5 1.1.3 Đặc điểm hình thái 8 1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 10 1.1.5 Cơ chế kiểm soát sinh học của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng 11 1.1.6 Mối liên hệ giữa khả năng đối kháng nấm gây bệnh thực vật và hoạt động enzyme chitinase của Trichoderma spp 17 i
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.7 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma spp. trên thế giới và ở Việt Nam 18 1.1.8 Ứng dụng của Trichoderma spp. trong nông nghiệp 21 1.2 Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh long 24 1.2.1 Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum 24 1.2.2 Khái quát về bệnh đốm trắng trên Thanh long 25 1.2.3 Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum 26 1.2.4 Các biện pháp trong phòng trừ bệnh đốm trắng trên thanh long 32 1.3 Thực trạng về phế phẩm Thanh long và ứng dụng trong sản xuất phân hữu cơ sinh học 34 1.3.1 Thực trạng về nguồn phế phẩm thanh long tại Việt Nam 34 1.3.2 Sản xuất và sử dụng phân compost 34 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 41 2.2 Vật liệu 41 2.2.1 Nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh 41 2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 41 2.2.3 Hóa chất 42 2.2.4 Các loại môi trường 42 2.3 Phương pháp nghiên cứu. 45 2.3.1 Sơ đồ tổng quát nội dung thí nghiệm 46 Giải thích sơ đồ 46 ii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.2 Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm 48 2.3.3 Phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long 49 2.3.4 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma 50 2.3.5 Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long 52 2.3.6 Thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh đốm trắng trên cây thanh long ở điều kiện trong chậu 54 2.3.7 Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh của chế phẩm Trichoderma ngoài đồng ruộng 55 2.3.8 Thử nghiệm ủ phân compost từ cành thanh long của nấm Trichoderma 57 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 60 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 61 3.1 Kết quả phân lập nấm gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long 61 3.2 Kết quả khảo sát một số đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của các chủng nấm Trichoderma spp. 63 3.2.1 Đặc điểm hình thái của các chủng Trichoderma phân lập 63 3.2.2 Đặc điểm sinh trưởng 75 3.2.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma spp. sau 2 ngày nuôi cấy 78 3.3 Khảo sát khả năng sinh đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long 83 3.4 Kết quả định danh chủng Trichoderma T3 88 iii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.5 Thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh đốm trắng trên cây thanh long ở điều kiện trong chậu 89 3.6 Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh của chế phẩm Trichoderma ngoài đồng ruộng 92 3.7 Thử nghiệm ủ phân compost từ cành thanh long của chủng nấm Trichoderma asperellum 95 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 98 4.1 Kết luận 98 4.2 Kiến nghị 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO 100 PHỤ LỤC 1 Phụ lục A. Bảng số liệu thô 1 A.1. Tốc độ tăng tưởng của các chủng Trichoderma spp. sau 2 ngày. 1 A.2. Đường kính trung bình vòng phân giải cellulose (cm) của các chủng Trichoderma sau 2 ngày 3 A.3 Đường kính trung bình vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma sau 2 ngày 5 A.4. Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp. sau 2 ngày đối kháng invitro. 7 A.5. Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp. sau 4 ngày đối kháng invitro. 9 A.6. Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp. sau 6 ngày đối kháng invitro. 11 iv
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP A7. Tỉ lệ đối (%) kháng của các chủng Trichoderma spp. sau 7 ngày đối kháng invitro. 13 Phụ lục B: Hình ảnh 16 B1. Hình thái đại thể của các chủng nấm Trichoderma spp. sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA 16 B2. Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) và chitin (cm) của các chủng Trichoderma 2NSC 18 B3 Kết quả khảo sát khả năng sinh đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long 25 B4. Lô thí nghiệm và lô đối chứng trong thử nghiệm hiệu lực phòng trừ bệnh của chế phẩm Trichoderma ngoài đồng ruộng 30 v
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CMC: Carboxymethyl cellulose. NT: nghiệm thức. ĐC: Đối chứng. PDA: Potato D-glucose Agar. VSV: Vi sinh vật NSC: ngày sau cấy vi
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma 5 Bảng 1.2 Các thông số quan trọng trong quá trình làm phân hữu cơ hiếu khí 37 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Trichederma asperellum 54 Bảng 3.1 So sánh đặc điểm hình thái của chủng nấm phân lập được và nấm Neoscytalidium dimidiatum theo mô tả bởi Crous & Slippes (2006) 61 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái của các chủng Trichoderma phân lập 62 Bảng 3.3 Đường kính tản nấm Trichodema spp. (cm) sau 2 ngày nuôi cấy 75 Bảng 3.4 Đường kính vòng phân giải cellulose của các chủng Trichodema spp 78 Bảng 3.5 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichodema spp 80 Bảng 3.6 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp. với Neoscytalidium dimidiatum 82 Bảng 3.7 Chiều dài và khối lượng thanh long trong từng công thức sau 30 ngày thử nghiệm. 90 Bảng 3.8 Tình hình bệnh đốm trắng thanh long ở các công thức 94 Bảng 3.9 Kết quả phân tích hàm lượng carbon, hàm lượng nitơ tổng của nguyên liệu ban đầu và 15 ngày sau ủ 94 vii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái vi thể của Trichoderma harzianum 5 Hình 1.2 Hình thái đại thể của một số chủng Trichoderma spp 9 Hình 1.3 Hệ sợi nấm Trichoderma kí sinh trên khuẩn nấm gây bệnh Rhizoctonia solan 13 Hình 1.4 Ức chế sự phát triển của nấm Pythiumultimum bởi chất kháng sinh được tiết ra từ Trichoderma harzianum 16 Hình 1.5 Một số chế phẩm sinh học từ Trichoderma spp 21 Hình 1.6 Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose 35 Hình 1.7 Hợp chất cao phân tử Cellulose 35 Hình 3.1 Hình thái đại thể của chủng nấm gây bệnh đốm trắng sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA 60 Hình 3.2 Hình thái vi thể của chủng nấm bệnh: (a) Sợi nấm, (b) Bào tử 61 Hình 3.3 Hình thái đại thể của chủng nấm Trichoderma T3, T22 và T26 sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA 77 Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải cellulose của chủng Trichoderma.T22, TC15 và TC6 79 Hình 3.5 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng Trichoderma T22, T3 và TC7 82 Hình 3.6 Đĩa nấm đối chứng Neoscytalidium dimidiatum ở 2,4,6,7NSC 86 viii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.7 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 2,4,6,7 NSC 86 Hình 3.8 Sợi nấm Trichoderma T3 tấn công Neoscytalidium dimidiatum dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100X 86 Hình 3.9 Kết quả giải trình tự gen 18S 87 Hình 3.10 Kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH của chủng nấm Trichoderma spp 87 Hình 3.11 Thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh đốm trắng trên cây thanh long ở điều kiện trong chậu 88 Hình 3.12 Kết quả thử nghiệm ở điều kiện trong chậu 89 Hình 3.13 Tỷ lệ bệnh của thanh long trong từng công thức 30 ngày sau tưới 90 Hình 3.14 Sinh viên thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm Trichoderma asperellum ngoài đồng ruộng 92 Hình 3.15 Cây thanh long ở công thức đối chứng và thí nghiệm 93 Hình 3.16 Cành thanh long bị nhiễm bệnh ở công thức đối chứng (a) và thí nghiệm (b) 93 Hình 3.17 Thanh long trước khi ủ: (a) đối chứng ; (b) công thức thí nghiệm 95 Hình 3.18 Thanh long ở công thức đối chứng 15 ngày sau ủ 95 Hình 3.19 Thanh long ở công thức thí nghiệm 15 ngày sau ủ 96 ix
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cây Thanh long (Hylocereus undulatus Haw) thuộc họ xương rồng có nguồn gốc ở các vùng sa mạc thuộc Mehico và Colombia. Đây là cây ăn quả nhiệt đới, thích hợp khí hậu nắng nóng, chịu hạn tốt nhưng không chịu úng, sau khi trồng một năm cây bắt đầu cho quả. Cây Thanh long thích hợp với nhiều chân đất như đất xám, đất phù sa, đất đỏ và đất phèn, quả có nhiều chất dinh dưỡng nên có hiệu quả kinh tế cao do giá bán cao và có giá trị xuất khẩu. Trên thế giới, Thanh long đã và đang là cây ăn quả quan trọng đem lại hiệu quả kinh tế lớn cho nhiều nước như Đài Loan, Thái Lan, Malaysia, Trung Quốc, Thanh long được người Pháp đưa vào trồng ở Việt Nam khoảng 100 năm nay, nhưng mới được đưa lên thành hàng hóa từ những năm 1980. Thanh long gồm có 3 loại: ruột trắng vỏ đỏ, ruột đỏ vỏ đỏ và ruột trắng vỏ vàng nhưng phổ biến ở Việt Nam là hai giống ruột trắng vỏ đỏ, ruột đỏ vỏ đỏ. Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thích hợp cho cây Thanh long sinh trưởng phát triển tốt. Theo Cục Bảo vệ thực vật (Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông thôn), trên cả nước hiện trồng khoảng 33.600 ha cây thanh long thương phẩm. Trong đó, tại tỉnh Bình Thuận có 24.000 ha, Long An có 5.400 ha và tỉnh Tiền Giang trồng 4.200 ha (năm 2014) [39]. Tuy nhiên, nhiệt độ cao lượng mưa lớn cũng là điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật phát triển và gây hại. Trong quá trình sinh trưởng, Thanh long bị gây hại bởi một số loại dịch hại như kiến, bọ xít, ruồi vàng, bệnh thối đầu cành (Alternaria sp), bệnh đốm nâu trên cành (Gleosporium agaves), bệnh đốm xám hay còn gọi là nám cành (Sphaceloma sp) và gần đây là bệnh đốm trắng do nấm gây ra. 1
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bệnh đốm trắng mới phát hiện tại nước ta từ tháng 6 năm 2013, gây hại trên thân, quả và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch. Bệnh gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển của cây, làm giảm năng suất, chất lượng quả ở các vùng sản xuất Thanh long tập trung như Bình Thuận, Tiền Giang. Đặc biệt, các vết đốm tồn tại trên quả đã làm giảm giá trị thương phẩm. Các nghiên cứu về bệnh đốm trắng trên cây Thanh long ở Việt Nam hầu như rất ít. Xuất phát từ thực trạng trên, việc nghiên cứu tìm hiểu tình trạng dịch bệnh đặc biệt là bệnh đốm trắng trên cây Thanh long là vấn đề rất quan trọng được các nhà chuyên môn, tổ chức trong nước và quốc tế quan tâm. Theo Võ Thị Thu Oanh (2015), nấm gây bệnh đốm trắng thanh long có trong đất, việc lây lan cũng bắt đầu từ đất và nguồn nấm bệnh trên cành, quả. Hiện vẫn chưa có giải pháp quản lý bệnh hiệu quả, việc phòng trừ bệnh đốm trắng thanh long chủ yếu dựa vào biện pháp hóa học để phun lên cây, nhưng hiệu quả không cao. Hơn nữa, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong sản phẩm là rào cản lớn nhất để xuất khẩu thanh long ra các thị trường khó tính như EU, Mỹ, Nhật Xuất phát từ tình hình trên, sinh viên tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp. với nấm gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh long”, nhằm tìm ra biện pháp an toàn để quản lý tác nhân này. 2. Mục tiêu nghiên cứu Tìm kiếm các chủng Trichoderma spp. có khả năng phòng trừ nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long. Đồng thời bổ sung các chủng mới cho bộ sưu tập nấm Trichoderma spp. của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học trường đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh. 3. Nội dung nghiên cứu – Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long. – Xác định khả năng sinh trưởng của chủng nấm Trichoderma spp 2
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm Trichoderma spp. – Tuyển chọn chủng Trichoderma spp. có khả năng đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum gây hại trên thanh long, từ đó đánh giá khả năng phòng trừ bệnh trên đồng ruộng. – Xử lí các phế phẩm thanh long bằng phương pháp ủ compost. 4. Đối tượng nghiên cứu - Các dòng nấm đối kháng thuộc chi Trichoderma. - Bệnh đốm trắng thanh long. - Cây trồng: Thanh long. 5. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp “Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp. với nấm gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh long” có tất cả 3 chương gồm: Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU: Giới thiệu tổng quan về nguồn gốc, phân bố, tình hình sản xuất, tiêu thụ và thực trạng canh tác cây thanh long ở Việt Nam. Qua đó, trình bày các đặc điểm sinh học cũng như triệu chứng, thiệt hại của nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên cây thanh long. Từ đó, đưa ra các kết quả nghiên cứu và ứng dụng của các biện pháp sinh học trong nông nghiệp, nổi bật là nấm Trichoderma spp. trong quản lý bệnh hại trên cây thanh long, cụ thể như khả năng phân hủy chất hữu cơ hay những cơ chế đối kháng với nấm bệnh cây trồng. Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP: Trình bày về vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu bao gồm phần trình bày về thời gian và địa điểm tiến hành đề tài, nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh. Phương pháp nghiên cứu tập trung ở nấm bệnh, cũng như đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm bệnh bằng phương pháp sử lý số liệu thống kê SAS. 3
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trình bày kết quả phân lập nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum. Qua đó, đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma với nấm bệnh trên cây thanh long đã được phân lập. 4
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma spp. 1.1.1 Phân loại. Chi Trichoderma được mô tả bởi Christiaan Hendrik Persoon năm 1794, nhưng các nguyên tắc phân loại vẫn khó xác định. Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường dựa vào sự khác biệt về đặc trưng hình thái, đặc điểm bào tử, cành bào tử và quá trình sinh sản bào tử vô tính. Năm 1801, Persoon đã xác định Trichoderma thuộc phân loại [38]: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Hình 1. 1 Hình thái vi thể của Trichoderma harzianum [38]. Chi: Trichoderma 1.1.2 Các chủng nấm Trichoderma spp. đã được phân lập Kubicek và Harman (1998) đã mô tả chi tiết 33 loài Trichoderma, ông cho rằng tùy từng loài nấm mà chúng có hình dạng và kích thước khác nhau [6] 5
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Một số loài Trichoderma spp. được ứng dụng trong phòng trừ sinh học: Bảng 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma Tên loài Đặc điểm Hình ảnh Đại thể: Khuẩn lạc phát triển nhanh, đạt 8 - 9cm sau 14 ngày nuôi cấy ở 20 0C, sợi nấm trong suốt, vách dày, trơn láng rộng 2 - 14µm. Bào tử màu Trichoderma xanh, có hình cầu méo hoặc bầu dục atroviride đường kính từ 4 - 12µm, khi nấm già thường mất màu hay màu vàng nhạt hoặc xám, bào tử già phát ra mùi hương dừa (Kubicek và Harman, 1998) [6]. Đại thể: Môi trường có nhiệt độ từ 15 - 350C, pH: 3,7 - 4,7 rất thích hợp cho sự phát triển của nấm (Dosmch và Gams, 1980). Khuẩn Trichoderma lạc phát triển nhanh, đường kính hazianum khoảng 9cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 200C. Bào tử đính có hình cầu méo đến bầu dục ngắn, màu xanh lục, vách trơn láng, kích thước (2,7 - 3,2)x(2,5 - 2,8)µm 6
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sinh hóa: Là loài nấm rất phổ biến trong đất (cook và baker, 1983), nảy mầm tốt nhất trong môi trường mùn cưa có độ ẩm khoảng 30% (Domsch và Gams,1980) [5]. Đại thể: Khuẩn lạc có đường kính 3 - 5cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 200C, bào tử có hình trụ ngắn, vách trơn láng, kích thước Trichoderma (3,0 - 4,8)x(1,9 - 2,8)µm. koningii Sinh hóa: Hiện diện nhiều ở lớp đất mặt, nhưng ở độ sâu 120cm vẫn có sự hiện diện của loài nấm này. Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ từ 260C trở lên tùy theo nguồn gốc của loài, pH: 3,7 - 6,0 [6]. Đại thể: Đường kính khuẩn lạc đạt 7 cm khi nuôi cấy 5 ngày ở 200C. Bào tử màu xanh lục, trơn, dạng Trichoderma elip, có kích thước khác nhau tùy hamatum theo chủng (Domsch và Gams,1980). Sinh hóa: Nhiệt độ 240C và pH: 3,7 - 4,7 là những điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển của 7
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trichoderma hamatum và chúng phát triển chậm lại ở 00C (Domsch và Gams,1980) [5]. Đại thể: Bào tử màu xanh lục, vách xù xì, dạng hình cầu, kích thước (4- 5)x(2,5-3)µm. (cook và baker, 1983) [6]. Sinh hóa: Có thể sử dụng cả hai Trichoderma nguồn nitrogen đơn giản và phức viride tạp. Khi Trichoderma tăng trưởng trên nguồn cacbonhydrate như là nguồn cacbon cho dinh dưỡng thì ammonium được sử dụng tốt hơn là nitrate (Danielson và Davey, 1973) [19]. 1.1.3 Đặc điểm hình thái [9]. 8
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.2 Hình thái đại thể của một số chủng Trichoderma spp [38]. Sinh thái học của Trichoderma cho chúng ta biết sự phân bố của chúng trong đất. Nấm Trichoderma có khu vực phân bố rất rộng, chúng hiện diện khắp nơi trong đất, trên vỏ cây mục nát. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Khi quan sát hạch nấm hay chồi mầm của nhiều loại nấm khác cũng có thể tìm thấy các loài Trichoderma (Klein và Eveleigh,1998). Sự phân bố và điều kiện môi trường sống của các loài Trichoderma có liên hệ mật thiết với nhau. Nhìn chung các loài Trichoderma xuất hiện ở vùng đất trung tính hoặc kiềm. Cành bào tử không màu, sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phân nhánh nhiều và cho lượng bào tử rất lớn. Bào tử thường có màu xanh, đơn bào hình trứng, tròn, elip hoặc hình oval tùy từng loài. Bào tử đính ở đỉnh của cành. Bào tử của hầu hết các loài có hình elip, 3 – 5 x 2 – 4 µm (L/W=1,3), bào tử hình cầu (L/W < 1,3) rất hiếm, chỉ thấy ở một vài loài. Đa số các bào tử trơn láng, kích thước không quá 5 µm. Khuẩn lạc Trichoderma tăng trưởng rất mạnh đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 250C (Elisa Esposito và Manuela da Silva, 1998). Chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, các loài nấm khác), chúng cũng tồn tại khi nồng độ CO2 ở mức cao (10%). Đất tự nhiên có khả năng kháng nấm và khả năng này mất dần đi. Điều này có liên quan đến sự xuất hiện và mật độ phân bố cơ học của Trichoderma. Bào tử phân sinh của Trichoderma có khả năng kháng nấm cao và liên quan đến hiện tượng làm giảm khả năng kháng nấm trong đất. Độ nhạy của đất kháng nấm được công bố trên đất trung tính, đất kiềm chua và acide. Các bào tử phân sinh kháng nấm nhiều hơn hậu mô bào tử, sợi nấm ít kháng nấm hơn bào tử phân sinh. Thiết lập quần 9
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP thể và hiện tượng nảy mầm trong đất: VSV trong đất hoạt động phụ thuộc vào nhiều loại chất nền trong đất, có nhiều phương pháp xác định khác nhau. Khi sợi nấm non (chưa có bào tử) vào đất chịu ảnh hưởng nhiều bởi thành phần môi trường đất. Bào tử sinh sôi nảy nở và thiết lập quần thể cân bằng trong đất (mật độ duy trì cân bằng trong đất từ 9 – 36 tuần sau khi cấy nấm vào đất). Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà Trichoderma harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng. Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng nên Chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học. 1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn hợp nguồn carbon và nitrogen. Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được là monosaccharide, disaccharide, polysaccharide NH3 là nguồn đạm mà nấm Trichoderma dễ sử dụng nhất, nên trong môi trường nuôi cấy Trichoderma người ta thường bổ sung NH3, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trường có nhiều dinh dưỡng. Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng của Trichoderma [28]. Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 300C, có một vài loài Trichoderma tăng trưởng được ở 350C. Một số ít phát triển tốt ở 400C. Trichoderma phát triển tốt ở đất có độ pH từ 3,5 – 7,0 nhưng không thể phát triển trong điều kiện pH < 3,5 và phát triển tốt ở pH trung tính [16]. Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau. Ví dụ: Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống trong môi trường có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum 10
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum thường phân bố ở vùng có khí hậu ấm áp. Ánh sáng có tác động sâu sắc trên nhiều loại nấm bằng cách ảnh hưởng đến quá trình sống đa dạng của chúng, chẳng hạn như: tác động đến tốc độ tăng trưởng, quá trình chuyển hóa, sắc tố, và sự chuyển hóa. Tác động của ánh sáng trên nấm đã là chủ đề được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và bàn luận (Kubicek và Harman, 1998). Quá trình hình thành bào tử được cảm ứng theo hai con đường khác nhau: thiếu dinh dưỡng hoặc ánh sáng. Khi khuẩn lạc của Trichoderma viride phát triển trong cảm ứng tối do thiếu dinh dưỡng, hình thành bào tử màu xanh đậm và bắt đầu khuếch tán từ trung tâm của khuẩn lạc, tại đó chất dinh dưỡng đã bị sử dụng hết. Mặt khác, việc hình thành bào tử được cảm ứng bởi các xung ánh sáng tạo điều kiện cho các khuẩn lạc phát triển trong tối, trước khi để chiếu sáng [26]. 1.1.5 Cơ chế kiểm soát sinh học của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng Trichoderma được sử dụng để bảo vệ cây trồng chống lại các loài nấm gây hại như: Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp., Botrytisspp. và Fusarium spp. gây bệnh khô vằn ở lúa; bệnh thối gốc chảy mủ ở cam quýt, sầu riêng; bệnh thối gốc trên các loại cây trồng như lúa, hồ tiêu, bắp, đậu, cà rốt, cà chua [1]. Nấm Trichoderma spp. đối kháng với nấm bệnh bằng nhiều cơ chế khác nhau: ký sinh, tiết kháng sinh để tiêu diệt nấm bệnh và cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh nơi sống với nấm bệnh [29]. 11
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.5.1 Cạnh tranh. Dinh dưỡng có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng của VSV. Thiếu dinh dưỡng là được coi là nguyên nhân gây chết rất phổ biến. Trichoderma cạnh tranh khai thác với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết dưỡng chất một cách thụ động và dai dẳng bằng những bào tử chống chịu (chlamydospores). Ngoài ra, Trichoderma còn cạnh tranh mô già hoặc chết với nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng chúng làm nền tảng để từ đó xâm nhập vào những mô khỏe). Nấm Trichoderma sử dụng những mô già và mô chết của cây chủ làm nguồn dinh dưỡng, bằng cách đó nấm Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. [18]. Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Pythium spp. do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào tử Pythium spp. (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây. Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Pythium spp. bằng cách sử dụng dịch tiết của cây vì thế mà các bào tử Pythium spp. không thể nảy mầm. Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh [18]. Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn carbon, nitơ và yếu tố cần thiết cho sự tăng trưởng khác với nấm bệnh. T. harzianum có thể kiểm soát nấm Botrysis cinerea (gây bệnh trên nho) bằng cách chiếm các mô ở hoa và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh tại những vùng bị nhiễm (Gullino, 1992). Sivan và Chet (1989), đã chứng minh rằng sự cạnh tranh chất dinh dưỡng là cơ chế chính được T. harzianum sử dụng để kiểm soát nấm bệnh F. oxysporum [26]. 12
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.5.2 Kí sinh [11]. Là hiện tượng "giao thoa sợi nấm". Trước tiên sợi nấm Trichoderma vây xung quanh sợi nấm gây bệnh cây, sau đó các sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm. Cuối cùng nấm Trichoderma xuyên qua sợi nấm bệnh làm thủng màng ngoài của nấm bệnh, gây nên sự phân huỷ các chất nguyên sinh trong sợi nấm bệnh. Những nghiên cứu chi tiết gần đây bằng kính hiển vi điện tử về vùng "giao thoa sợi nấm" cho thấy cơ chế chính của hiện tượng ký sinh ở nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh là sự xoắn của sợi nấm Trichoderma quanh sợi nấm vật chủ, sau đó xảy ra hiện tượng thủy phân thành sợi nấm vật chủ, nhờ đó mà nấm Trichoderma xâm nhập vào bên trong sợi nấm vật chủ. Điều này dẫn đến hiện tượng chất nguyên sinh ở sợi nấm vật chủ bị phá rối từng phần hoặc hoàn toàn. Hình 1.3 Hệ sợi nấm Trichoderma kí sinh trên khuẩn nấm gây bệnh Rhizoctonia solani [22] Cuối cùng, nguyên sinh chất bị mất đi và sợi nấm vật chủ bị phá vỡ, giải phóng các sợi nấm đang sinh sản của nấm Trichoderma. Một điều quan trọng cho sự ký sinh của nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh cây là các bao tử của nấm Trichoderma sau khi mọc mầm tạo thành sợi nấm phải tiếp xúc được với nấm vật chủ và phải hình thành được thể giác bám. Thể giác bám này sẽ bám chắc và xâm nhập vào trong thành tế bào 13
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP của nấm vật chủ. Tỷ lệ ký sinh sẽ tăng lên khi tăng sự tiếp xúc trực tiếp của nấm Trichoderma với nấm vật chủ. 1.1.5.3 Tiết kháng sinh [9]. Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy những vị trí mà nấm Trichoderma tiếp xúc và ký sinh đã làm cho nấm bệnh chết. Tuy nhiên, ở những điểm không có sự tiếp xúc của nấm Trichoderma với nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động của chất kháng sinh từ nấm Trichoderma sinh ra gây độc cho nấm gây bệnh. Howell (1987), thấy rằng những chủng T. virens đột biến mất khả năng ký sinh nhưng vẫn giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh có hiệu quả kháng nấm bệnh Rhizoctonia solani tương đương với chủng tự nhiên. Kết quả này đã chỉ ra rằng ký sinh không là cơ chế chính yếu trong phòng trừ sinh học một bệnh cụ thể. Sự sinh kháng sinh cũng là một trong những đặc tính quen thuộc của chi Trichoderma. Nó là một trong những cơ chế chính đối với điều khiển sinh học. Những kháng sinh này có thể ức chế mạnh sự sinh trưởng của những vi sinh vật khác. Khả năng sinh kháng sinh của các loài, các chủng không giống nhau. Chúng gồm: – Gliotoxin: chất kháng sinh này được R. Weindling và O. Emerson mô tả năm 1936 do nấm T. lignorum sinh ra. Gần đây được xác định lại là do nấm T. virens sinh ra. Chất gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều vi sinh vật: vi khuẩn, nấm (Ascochyta, Botrytis, Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia ). – Steroids (viridin): Đây là chất kháng sinh thứ cấp do nấm Trichoderma tạo thành trong hoạt động của chúng. Chất kháng sinh này được phát hiện năm 1945. Viridin độc hơn rất nhiều so với gliotoxin và là một độc tố thực vật, có hiệu lực như một loại thuốc diệt cỏ, giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử nấm, được sản xuất từ T. virens. 14
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – Trichodermin và Dermadin: Ở Nhật Bản năm 1975, Atsushi, Shunsuke đã phát hiện được hai chất kháng sinh Trichodermin và Dermadin có trong dịch nuôi cấy loài T. koningii và T. aureoviride. Cho tới nay đã phát hiện được nhiều kháng sinh khác do Trichoderma sinh ra có liên quan tới khả năng đối kháng của chúng như pyridine, anthraquinones, butenolides, isonitrin D và F, trichorzianines, furanone do T. harzianum sinh ra; các kháng sinh gliovirin, viridian, viridiol và valinotricin do T. virens sinh ra. Các chất trao trao đổi thứ cấp được sản sinh từ Trichoderma là bao gồm một loạt các hợp chất hóa học. Theo Ghisalberti và Sivasitham param (1991), chúng có thể được phân loại như sau: (i) các chất kháng sinh dễ bay hơi như 6-pentyl - α – pyrone (6PP), (ii) các hợp chất hòa tan trong nước như heptelidic acid hoặc koningic acid, (iii) peptaibol. Chất kháng sinh peptaibols là một chuỗi các oligopeptides của 12-22 aminoacid có chứa nhiều α - aminoisobutyric acid, N-acetylated tại N-terminus và chứa một amino alcohol (Phenol hoặc Trypol) tại C-terminus do T. polysporum, harzianum, koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh, và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh. Francesco Vinale và các cộng sự (2008), đã khảo sát khả năng đối kháng của Trichoderma từ việc tiết kháng sinh để ức chế sự phát triển của các chủng nấm bệnh. Ông sử dụng chất kháng sinh được tiết ra từ T. harzianum bổ sung vào môi trường nuôi cấy của chủng Pythium ultimum. Kết quả ông thu được là: ở đĩa (1) môi trường có chứa kháng sinh 6PP được tiết ra từ chủng T. harzianum, ức chế sự phát triển của chủng Pythium ultimum [23]. 15
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1. 4 Ức chế sự phát triển của nấm Pythiumultimum bởi chất kháng sinh được tiết ra từ Trichoderma harzianum [9]. 1.1.5.4 Tăng khả năng kháng của thực vật. Ngoài khả năng bảo vệ giúp thực vật chống lại các tác nhân gây bệnh tiềm ẩn trong đất, nhiều loài trong chi Trichoderma được bổ sung vào đất còn có khả năng kích thích cơ chế tự bảo vệ thực vật chống lại virus, vi khuẩn, nấm. Trong trường hợp này, các nấm Trichoderma đóng vai trò là những nhân tố mẫn cảm với rễ, kích thích hệ rễ miễn dịch chủ động và bị động ở thực vật. Nấm Trichoderma còn có tác dụng tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm phát triển trong đất, kích thích sự tăng trưởng và phục hồi bộ rễ, đồng thời có khả năng phân giải chất xơ, chitin, ligin trong các phế thải hữu cơ thành các chất dinh dưỡng tạo điều kiện cho cây trồng hấp thu dễ dàng [41]. Các chủng đặc trưng của nấm thuộc chi Trichoderma xâm nhập vào mô rễ, sau đó bắt đầu làm một loạt các thay đổi và hình thái và hóa sinh trong cây, điều này được xem như là phản ứng phòng vệ của cây. Khi bón T. harzianum vào rễ cây đậu cho thấy rằng giảm được từ 25% - 100% mốc xám trên lá do Botrytis cinerea gây ra. Các nhà khoa học đã sử dụng T. harzianum T39 và chất benzothiadiazol để kiểm tra khả năng chống chịu Botrytis cinerea của cây cà chua, và thấy rằng chủng T. harzianum T39 16
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ngăn cản sự phát triển của nấm bệnh ngay ở giai đoạn đầu và giảm đến 30% tổn thương cho cây (Audenaert et al., 1998). Theo Yedidia et al. (1999), thì sự kích hoạt hệ thống phòng vệ của cây có liên quan đến rễ cây được xử lí với T. harzianum T-203. Những rễ được bổ sung chủng T 203 cho thấy hoạt tính chitinase, β-1,3-glucanase, cellulase và perosidase cao hơn so với đối chứng không xử li trong 72 giờ. Còn những cây dưa leo được xử lí với 2,6- dichloroisonicotinic acid, một chất cảm ứng cho hệ thống phòng vệ của thực vật, cho thấy cũng có những phản ứng diễn ra nhưng không giống với khi xử lí bằng T. harzianum. Theo Khan et al. ,(2001) thì T. hamatum chủng 382 kích ứng hệ thống kháng của cây cà chua đối với bệnh thối rễ và bạc lá do Phytophthora gây ra [18]. 1.1.6 Mối liên hệ giữa khả năng đối kháng nấm gây bệnh thực vật và hoạt động enzyme chitinase của Trichoderma spp. [15] Trichoderma spp. có khả năng phân giải vách tế bào nấm. Harran (2004) đã khảo sát cơ chế phân tử của enzyme phân giải liên quan đến hoạt động kiểm soát sinh học của Trichoderma harzianum. Sự thủy phân vách tế bào nấm chủ yếu dựa vào hoạt tính của enzyme chitinase, glucanase và protease. Sau khi bám và quấn quanh nấm bệnh, sợi nấm của nấm kí sinh tạo lỗ hổng trên vách của sợi nấm ký chủ. Màu sắc của sợi nấm ký sinh thay đổi và phát huỳnh quang mạnh bởi sự kết hợp của fluorescein isothiocyanat với lectin gắn vào chitotriose hoặc với calcoflour White. Cả phức hợp này được gắn với B – glucan và oligomer N – acetyl – D – glucosamine. Hiện tượng này được nhận định do enzyme phân giải được tiết ra tại vị trí tiếp xúc bởi Trichoderma harzianum khi phân hủy vách của Rhizoctonia solani và Sclerotium rolfsii. Nếu có sự hiện diện của cycloheximid, hiện tượng đối kháng bị ngăn chặn và hoạt tính của enzyme bị suy giảm. Hoạt tính của enzyme chitinase cũng được tìm thấy khi Trichoderma tấn công Rhizoctonia solani và Sclerotium rolfsii trong môi trường đất. 17
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP T. harzianum có khả năng tấn công lên nấm bệnh thì tiết B – 1,3 – glucanase và chitinase nhiều hơn những chủng không có khả năng tấn công nấm bệnh, khả năng đối kháng của Rhizoctonia solani khi bị T. harzianum tấn công cũng đã được nghiên cứu. Sợi nấm T. harzianum khi xâm chiếm vào hạch của Sclerotium rolfsii và tạo lỗ trên bề mặt của hạch này, cuối cùng làm thay đổi hình dạng và làm biến mất tế bào chất của nó. Các chủng Trichoderma khác nhau tùy thuộc vào hoạt tính enzyme thủy phân được để tấn công sợi nấm của các loại nấm bệnh. 1.1.7 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma spp. trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.7.1 Trên thế giới Cho tới nay có khoảng 30 nước đã có những nghiên cứu sử dụng nấm Trichoderma để trừ bệnh hại cây trồng (Nga, Mỹ, Đức, Hunggari, Ấn Độ, Thái Lan, Philippin ) cho khoảng hơn 150 loài vi sinh vật gây bệnh trên hơn 40 loại cây trồng. Ở Nam Mỹ, người ta dùng nấm T.harzianum phòng trừ các nấm Pythium spp. và R. solani gây bệnh chết héo đậu và củ cải (Chet và cộng sự,1981). Ở Ấn Độ, hiệu quả ức chế bệnh do R. Solani gây trên khoai tây của nấm T. harzianum đạt tới 89,1%. Ở Thái Lan, sử dụng nấm T.viride phòng trừ bệnh thối thân cà chua do nấm S.rolfsii: tỷ lệ cây sống đạt 91,7%; trong khi đó ở đối chứng chỉ đạt 61,9%. Ở Philippin, nấm T.harzianum làm giảm đáng kể tỷ lệ bị bệnh do nấm R.Solani ở đậu xanh: tỷ lệ bị bệnh khi dùng T.harzianum là 14-19%; đối chứng là 79-86% (Davide, 1991). Theo Buimistru (1997), Elad và cộng sự (1980), Udaidulaev và cộng sự (1979), Wu. W. S (1996) dùng chế phẩm Trichoderma spp. có tác dụng phòng trừ bệnh hại cây trồng, làm giảm tỷ lệ cây bị bệnh rõ rệt, chế phẩm nấm đối kháng nấm Trichoderma sp. có thể giúp cây khỏe hơn, tăng sức đề kháng với vi sinh vật gây bệnh, 18
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP tác dụng kích thích sinh trưởng đối với cây. Nghiên cứu của Diby và cộng sự, 2003 đã ghi nhận nấm Trichoderma harzianum IISR - 1369, 1370 được phân lập từ vùng rễ của cây hồ tiêu có khả năng kích thích sinh trưởng và hạn chế được bệnh chết nhanh cây hồ tiêu do nấm Phytophthora capsici gây nên. Khi sử dụng chế phẩm hỗn hợp giữa nấm Trichoderma harzianum IISR - 1369 với vi khuẩn Pseudomonas fluorescens IISR - 11 cho hiệu quả phòng trừ đạt 63%, cao hơn so với đối chứng là 36% [25]. Năm 2010, Vinit Kumar Mishra đã chọn được 10 chủng Trichoderma để đối kháng với Pythium aphanidermatum bằng phương pháp đồng nuôi cấy [29]. Năm 2011, Th. Kamala và S. Indira đã chọn được 21 chủng Trichoderma để đối kháng với Pythium aphanidermatum cũng bằng phương pháp đồng nuôi cấy. Và ông cũng đã thử nghiệm thành công 4 chủng nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh Pythium aphanidermatum ở điều kiện nhà lưới [32]. 1.1.7.2 Tại Việt Nam Tuy chỉ mới được nghiên cứu khoảng 20 năm tại Việt Nam nhưng Trichoderma spp. đã có ảnh hưởng rất lớn trong lĩnh vực nông nghiệp. Với việc sử dụng chế phẩm Trichoderma đã làm giảm đáng kể các nấm gây bệnh như: Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Phytophthora spp., Pythiumaphanidermatum và Rhizoctonia bataticola. Việc sử dụng chế phẩm này đạt hiệu quả cao hơn thuốc diệt nấm và duy trì lâu hơn. Ngoài ra còn làm giảm rủi ro về sức khỏe, chi phí và thiệt hại về môi trường do tập quán sử dụng thuốc hóa học gây ra. Hiện nay, đã có những nỗ lực để mở rộng sản phẩm thương mại Trichoderma và đã được phát triển bởi các trường đại học, các viện nghiên cứu và các công ty phân bón [9]. Một số đề tài nghiên cứu về nấm Trichoderma ở Việt Nam: Tác giả Trần Thị Thuần và cộng sự (2004), đã tiến hành phân lập từ các nguồn 19
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP khác nhau và xác định khả năng ức chế của nấm Trichoderma đã thu thập, kết quả cho thấy các loài nấm Trichoderma có hiệu quả ức chế cao từ 67,7 - 85,5% đối với các nấm gây bệnh như Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Fusarium spp. , Aspergillus spp.[-6] Năm 2006, Huỳnh Văn Phục với đề tài nghiên cứu “ Khảo sát tinh đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúa và bắp”. Kết quả thu được là phân lập được 17 dòng nấm Trichoderma spp. có khả năng đối kháng tốt với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum [9]. Theo Trần Kim Loang và cộng sự (2008), sử dụng chế phẩm Trico-VTN (gồm Trichoderma virens và Trichoderma asperellum) với nồng độ 0,3 – 0,4% mỗi tháng một lần, hạn chế được sự phát triển và gây hại của bệnh do nấm Phytophthora trên cây tiêu và ca cao trong điều kiện vườn ươm. [17] Hồng Châu, 2009 cho rằng nấm Trichoderma giúp thúc đẩy tiến trình phân giải chất hữu cơ nhanh hơn được dùng để ủ phân chuồng, phân xanh sẽ rút ngắn thời gian hoai mục [4]. Năm 2010, Trần Nguyên Hà với đề tài “Sử dụng các chủng Trichoderma để điều khiển sinh học các tác nhân gây bệnh trên cây trồng ở Việt Nam” kết quả là phân lập được 7 chủng Trichoderma từ một số cây trồng ở Việt Nam có khả năng kiểm soát tốt các loài nấm bệnh. Nhóm nghiên cứu Nguyễn Văn Hòa, Nguyễn Ngọc Anh Thư thuộc viện cây ăn quả miền nam đã phân lập được 3 chủng nấm Trichoderma cho hiệu quả đối kháng tốt với nấm Phytophthora và Fusarium. Hiệu quả sản phẩm được kiểm tra trên cây ăn quả và cây hoa được kiểm chứng bằng số khuẩn lạc của nấm Fusarium có trong 1g đất sau khi tưới nấm Trichoderma giảm rất nhiều so với đối chứng và so với trước khi tưới [9]. Theo các tác giả Phạm Ngọc Dung và cộng sự (2012), sử dụng nấm đối kháng Trichoderma Asperellum trong phòng trừ nấm Phytophthora spp. gây hại trên cây cao su 20
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP đã được một nhóm tác giả thuộc Viện Bảo vệ Thực vật nghiên cứu. Trong điều kiện phòng thí nghiệm nấm Trichoderma Asperellum có khả năng phòng trừ bằng ký sinh sợi nấm đạt hiệu quả là 100% đối với nấm Phytophthora Botryosa và nấm Phytophthora Citrophthora. Khả năng phòng trừ bằng chất kháng sinh bay hơi đạt hiệu quả là 84,8 – 93,4% đối với nấm Phytophthora Botryosa và đạt hiệu quả là 90,4 – 91,8% đối với nấm Phytophthora Citrophthora. Các nguồn khác có khả năng ức chế nhưng với hiệu quả thấp hơn (70,3 – 85,9). Nấm Trichoderma asperellum có khả năng đối kháng cao với nấm Phytophthora spp. gây bệnh trên cao su bằng ký sinh trực tiếp sợi nấm và chất kháng sinh bay hơi. Đồng thời nấm này có hoạt độ các enzyme phân giải như Cellulase, Chitinase, β-Glucanase cao [10]. Hình 1.5 Một số chế phẩm sinh học từ Trichoderma spp. 1.1.8 Ứng dụng của Trichoderma spp. trong nông nghiệp Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần Thơ, Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, Công ty Thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng bằng Sông Cửu Long và Đông Nam Bộ. Các nghiên cứu cho ta thấy: 1.1.8.1 Khả năng kiểm soát bệnh cây 21
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhiều chủng nấm Trichoderma có khả năng kiểm soát các loài nấm gây bệnh cho cây trồng. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với các loại nấm gây bệnh thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium [2]. Các loài nấm Trichoderma nói chung phát triển trong môi trường tự nhiên trên bề mặt của rễ cây, do đó có tác dụng kiểm soát sinh học với một số bệnh trên rễ gây ra bởi tuyến trùng và nấm, nó còn giúp tái tạo, phục hồi các rễ bị tổn thương do tuyến trùng hoặc rệp sáp gây ra. Nấm Trichoderma còn tạo ra các chất có hoạt tính tương tự như “thuốc kháng sinh”, có tác dụng kìm hãm sự tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh đồng thời Trichoderma còn ký sinh các loài nấm gây bệnh, tiết ra các enzyme phân hủy chúng [13]. Ngoài ra nấm Trichoderma phòng trừ được các bệnh trên lá do loài nấm này kích thích bộ rễ tổng hợp chất đề kháng để chống lại các tác nhân vi sinh vật xâm nhập, các chất đề kháng này từ rễ di chuyển đến các bộ phận phía trên của cây [2]. Những phát hiện mới hiện nay cho thấy rằng một số chủng nấm Trichoderma có khả năng hoạt hóa cơ chế tự bảo vệ của thực vật, từ đó những chủng nấm này cũng có khả năng kiểm soát những bệnh do các tác nhân khác ngoài nấm. 1.1.8.2 Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng Nấm Trichoderma kích thích sự tăng trưởng và phát triển của bộ rễ. Trichoderma bám vào những vùng rễ cây như những sinh vật cộng sinh khác. Nó tiết ra đất những chất kích thích để rễ cây ăn sâu xuống lòng đất, làm cho rễ cây khỏe hơn và tăng khả năng hút dinh dưỡng, tăng khả năng phòng vệ, tạo thành một lớp thành bảo vệ vùng rễ tránh sự xâm nhập của nấm bệnh, làm giảm khả năng nhiễm bệnh nhờ Trichoderma bám vào các đầu rễ cây, tăng khả năng ra hoa, thụ phấn, tăng trọng lượng quả và chiều cao của cây, tăng năng suất cây trồng. 22
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hiện nay, một chủng nấm Trichoderma đã được phát hiện có khả năng tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất). Những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán [2]. 1.1.8.3 Khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan. Lợi dụng khả năng phân hủy cellulose, phân giải lân của nấm Trichoderma mà trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân hủy hữu cơ được nhanh chóng. Sử dụng chế phẩm Trichoderma ủ phân hữu cơ để bón cho cây trồng sẽ giúp tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất. Phân giải nhanh các chất hữu cơ thành dạng dễ tan, cung cấp dinh dưỡng cho cây, phòng một số nấm bệnh gây hại cho cây trồng, chất lượng phân cao hơn. Chế phẩm nấm Trichoderma được sử dụng để xử lý giúp phân hủy rơm rạ, sau đó được dùng phối hợp với phân lân sinh học như dạng phân hữu cơ. Phân hữu cơ được bón riêng rẽ hoặc phối hợp với phân vô cơ (NPK) trên nền sét nặng. Kết quả nghiên cứu hai năm trên giống lúa IR64 cho thấy: nếu bón liên tục 100% phân hữu cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 13,58% và nếu bón kết hợp 50% phân hữu cơ với 50% phân vô cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 22,46%. Khi bón 100% phân hữu cơ thì côn trùng và bệnh khô vằn xuất hiện trể hơn và ít gây hại cho cây lúa và quần thể vi sinh vật đất ổn định hơn, có chiều hướng gia tăng hơn so với bón 100% phân vô cơ (Lưu Hồng Mẫn và cộng sự, 2001) [14]. Với những hiệu quả mà chế phẩm Trichoderma mang lại, bà con nông dân nên sử dụng chế phẩm sinh học thay cho việc dùng các loại phân bón hóa học để cải thiện năng suất và chất lượng cây trồng, góp phần bền vững môi trường đất canh tác nông nghiệp. 23
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2 Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh long 1.2.1 Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum Dựa vào đặc điểm hình thái bào tử, cành bào tử, kích thước bào tử và hình thái tản nấm dựa vào khóa phân loại của Ellis (1976) đã xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên Thanh long là do nấm Scytalidium dimidiatum (B. Sutton & Dyko, 1989), hiện nay nấm còn được gọi tên là Neoscytalidium dimidiatum (Crous & Slippers, 2006) [31]. Đặc điểm vị trí phân loại của nấm N.dimidiatum (Agrios, 2005; Crous & Slippers, 2006). Ngành: Ascomyta Lớp: Dothideomycetes Bộ: Botryosphaeriales Họ: Botryosphaeceae Chi: Neoscytalidium Loài: Neoscytalidium dimidiatum N. dimidiatum thuộc ngành nấm túi (Ascomycota), Ascomyta có cơ thể sinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, có vách ngăn, một tế bào thường có một nhân, đôi khi có nhiều nhân, dạng chuyên hóa dạng sợi bắt đầu đứt đoạn ra tạo thành cơ thể đơn bào hình tròn, bầu dục chứa nhiều nhân hay một nhân. Vách tế bào cấu tạo bằng chitin hay glucan, đa số hoại sinh gây mục gỗ, hoại sinh trên đất, trong nước, trên cạn, thực vật, động vật, một số lại ký sinh gây bệnh trên thực vật, động vật, người, gây nên những thiệt hại lớn. Ascomyta sinh sản dinh dưỡng bằng sự chia đôi tế bào nảy chồi, đứt đoạn sợi nấm, bào tử áo, bào tử màng dày, sinh sản vô tính bằng bào tử đính (conidia) và sinh sản hữu tính bằng bào tử túi. Các bào tử khác tính (+,-) sợi nấm đơn bội, phân nhánh thành hệ sợi nấm hình thành các cặp cơ quan sinh sản, giao phối sinh 24
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP chất, hình thành sợi sinh túi đa bào, sau đó phân chia nguyên nhiễm kết hợp thành nhân lưỡng bội rồi giảm nhiễm tạo thành bào tử túi. Chu trình sống của Ascomyta gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đơn bội, giai đoạn song hạch và giai đoạn lưỡng bội, trong đó giai đoạn đơn bội chiếm ưu thế. Một số Ascomyta hình thành quả thể trong đó có quả thể kín, quả thể mở lỗ và quả thể hở. 1.2.2 Khái quát về bệnh đốm trắng trên Thanh long [36] Bệnh đốm trắng hay còn gọi là bệnh đốm nâu, tắc kè, bệnh ma là những tên gọi khác nhau mà bà con nông dân trồng Thanh long ở Bình Thuận, Tiền Giang và Long An đặt cho một loại dịch hại mới phát sinh, gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng trái Thanh long và có xu hướng ngày càng phát triển và lây lan rộng trên diện lớn, ảnh hưởng đến xuất khẩu.  Triệu chứng: Bào tử nấm nảy mầm trên bề mặt thân cành, quả thanh long, sau đó xâm nhập vào trong mô gây hoại tử Trên cành: Khi mới xuất hiện, vết bệnh là những chấm li ti (như vết kim châm) nhỏ, hơi lõm vào bề mặt bẹ hoặc trái và chuyển sang màu trắng sau khoảng 3-4 ngày. Về sau vết bệnh xuất hiện những chấm nhỏ màu cam ở vị trí trung tâm được bao bọc bởi vòng tròn màu vàng (10-20 ngày) và dần dần vết bệnh nổi lên thành đốm tròn màu nâu (18-20 ngày). Khi gặp điều kiện thời tiết thuận lợi, các vết bệnh phát triển lan rộng ra, liên kết nhau thành từng mãng lớn làm sần sùi bề mặt cành, trong một số trường hợp bệnh gây thối từng mảng lớn. Trên quả: Bệnh tấn công và gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của quả, đặc biệt ở giai đoạn sau trổ hoa và giai đoạn chuẩn bị chín. Triệu chứng bệnh gây hại 25
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP trên quả cũng tương tự như trên cành và những quả nhiễm nặng thì không thể bán được.  Tác nhân: Do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra.  Điều kiện phát sinh: Bệnh chủ yếu xuất hiện và tấn công mạnh vào mùa mưa (tháng 5 đến tháng 11 dương lịch). Nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển từ 30-350C và ẩm độ càng cao tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh tấn công và lây lan nhanh.  Nguồn bệnh và sự lây lan: Ở điều kiện ngoài đồng, bệnh thường tồn tại trong đất, tán cây, xác bả thực vật có trên vườn hoặc trên cành, trái bị bệnh không được tiêu hủy. Bào tử nấm bệnh lây lan chủ yếu qua hom giống, cành và quả thanh long bị bệnh, qua gió, dòng nước chảy và qua dụng cụ cắt tỉa 1.2.3 Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum 1.2.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước: Thanh long là cây ăn quả phổ biến và được sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới. Vì vậy, việc nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm đang được quan tâm, đã có rất nhiều nghiên cứu về tình hình bệnh hại trên Thanh long. Thanh long bị gây hại bởi một số bệnh như bệnh thối đầu cành (Alternaria sp), bệnh đốm nâu trên cành (Gleosporium agaves), bệnh đốm xám hay còn gọi là nám cành (Sphaceloma sp). Tuy nhiên những năm gần đây Thanh long lại bị gây hại nặng bởi nấm Neoscytalidium dimidiatum đây là một bệnh có ảnh hưởng lớn đến năng suất chất lượng sản phẩm gây thiệt hại lớn cho người trồng Thanh long. Trước vấn đề cấp thiết trên, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu tìm hiểu về nấm N.dimidiatum. 26
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Theo báo cáo đầu tiên về nấm N. dimidiatum trên cây có múi tại Italya (G. Polizzi và cs, 2008) [27] vào tháng 9 năm 2008 một căn bệnh mới đã được phát hiện và chú ý ở phía Sicily, Italy trong vườn cây có múi (cam ngọt (Citrus sinensis (L.) Osbeck cv. Tarocco Scires) 2 tuổi đã xuất hiện một bệnh mới với triệu chứng điển hình là chồi kém phát triển và thối trên thân, cành, gốc ghép, vết thối chảy gôm. Trong một thời gian ngắn xuất hiện khối bào tử của nấm màu đen dưới lớp vỏ cây và trên bề mặt vết thối. Sau khi phân lập trên môi trường PDA, xác định nấm có đặc điểm giống nấm Scytalidium với các đặc điểm như sợi nấm màu nâu phân nhánh có vách ngăn, bào tử hình trứng, elip, đỉnh tròng có 0-2 vách ngăn, màu nâu. Sau khi phân lập tiến hành kiểm tra bằng phương pháp PCR, DNA được chiết suất từ sợi nấm sau đó sử dụng các mồi V9G và ITS4 để khếch đại operon rRNA hạt nhân kéo dài đầu 3’ của gen 18S rRNA, các miếng đệm bên trong sao chép, gen rRNA 5.8S, và một phần của kết thúc 5’ của gen 28S rRNA. Sau khi phân tích trình tự DNA trên cơ sở đặc điểm hình thái và các dữ liệu phân tử, bệnh đã được xác định là do nấm N.dimidiatum gây ra. Bệnh đã được kiểm tra lại bằng phương pháp lây nhân tạo trên cây cam ngọt 2 tuổi. Theo báo cáo đầu tiên về nấm N.dimidiatum và N.novaehollandiae trên cây xoài tại Australia của ( J. D. Ray, T. Burgess anh V. M. Lanoiselet. 2010). N.dimidiatum là loài nấm có phạm vi phân bố và có nhiều ký chủ: cây dương mai, hạt sung, vả, cây có múi, chuối, mận, và nhiều cây trồng khác ở Mỹ (Farret al. 1980). N.dimidiatum còn gây hại trên xoài (Reckhaus 1987) và nhất là trên Thanh long (Brown 2012). N.dimidiatum gây nên các triệu chứng như héo cành, chết mầm, thối, chảy gôm và làm cây chết. Yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm N.dimidiatum là độ ẩm (Punithalingam and Waterson 1970; Reckhaus 1987; Elshafie and Ba-Omar 2001). N.dimidiatum được báo cáo lần đầu tiên tại Australia liên quan đến bệnh chết mầm của xoài (2010). Tại Australia đã tiến hành khảo sát về sức khỏe cây trồng do Bộ 27
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP nông nghiệp và thực phẩm Tây Australia kết hợp với kiểm dịch viên Australia thực hiện. Tháng 8 năm 2008 trong cuộc khảo sát này các nghiên cứu đã tiến hành phân lập các triệu chứng chết mầm trên cây xoài và rễ cây sung, sau khi tiến hành phân lập đã phát hiện nguyên nhân gây bệnh làm chết mầm, thối rễ, thối cây là do nấm Neoscytalidium spp gây ra. Neoscytalidium spp tiếp tục được phân lập và tiến hành giải trình tự một phần DNA của từng vùng ITS kết qủa xác định là do Neoscytalidium gây ra. Trong cuộc khảo sát, N.dimidiatum cũng được phân lập từ các mẫu xoài lấy tại Derby, trong tháng 9 năm 2008, Broome vào tháng 9 năm 2008 và Đảo Bathurst, Northen Territory vào tháng 10 năm 2008. Sau khi phân lập, các nhà khảo sát đã tiến hành lây bệnh nhân tạo và tái phân lập theo quy tắc Kock đã thu được kết quả tốt. Tiến hành kiểm tra lại các chủng thu thập với các cuộc điều tra trước (2005) các nhà khảo sát đã phát hiện rằng N.dimidiatum đã xuất hiện và gây hại tại Australia trong thời gian dài trước đó (phân lập từ cây có múi (Torula dimidiate 1914)). Theo báo cáo này, yếu tố nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển gây hại của bệnh. Trước đây N.dimidiatum có nhiều tên gọi khác nhau như: Fusicoccum dimidiatum, Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea, (Crous et ai. 2006). Theo nghiên cứu của Mohd và ctv. 2013 viện nghiên cứu sở nông nghiệp, Đại học quốc gia Đài Loan, Trung Quốc, vào tháng 9 năm 2009 và 2010 bệnh đốm trắng đã xuất hiện ở một số cây Thanh long tại Đài Loan. Triệu chứng của bệnh là các vết nhỏ, tròn, vết bệnh lõm, màu cam. Bệnh được xác định do nấm N.dimidiatum gây ra. Năm 2008, 2009 nấm N.dimidiatum đã phát hiện trên các quả Thanh long trồng ở Malaysia. N.dimidiatum đã gây ra triệu chứng như chấm tròn nhỏ, thối và sau đó mục nát. Mẫu bệnh đã được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở 250C trong 7 ngày. Nấm thu được nuôi cấy trên môi trường PDA , nấm có quả cành màu đen, đường kính 90 mm, hình elip, hình trứng, hình que hoặc hình tròn trong pha lê có 2 28
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP vách ngăn. DNA chiết từ sợi nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA thực hiện phản ứng khếch đại sử dụng mồi ITS4 và ITS5. Cuối cùng thực hiện lây bệnh nhân tạo để so sánh đánh giá bệnh. Đến tháng 7 năm 2011 bệnh đốm trắng trên Thanh long đã được phát hiện ở Trung Quốc với các đặc điểm là có nhiều vết nhỏ đốm nâu nhỏ hơn các vết bệnh ban đầu, các vết này lan rộng và hình thành các vùng rộng lớn gây chết hoại. Nấm được nuôi cấy trên môi trường thạch đường khoai tây (PDA) và ủ ở 280C trong 3 ngày. Sau khi phân lập tiến hành phản ửng PCR (phản ứng khếch đại gen), DNA được chiết suât từ sợi nấm đã được nuôi cấy trong 7 ngày sử dụng Kit DNAsecure thực vật, miếng đệm ghi chép nội bộ (ITS) khu vực của rDNAs từ phân lập được khếch đại bởi mồi ITS1 và ITS4. Đến năm 2012, Brown đã công bố báo cáo đầu tiên về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây hại trên Thanh long tại tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc. 1.2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước: Hiện nay tại Việt Nam có rất ít thông tin về nấm gây bệnh đốm trắng trên cây Thanh long, chỉ có thông tin nghiên cứu của Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền nam (2011) rằng bệnh đốm trắng do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Nấm này còn có tên khác là Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea, bệnh chủ yếu xuất hiện và tấn công mạnh và mùa mưa, nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển từ 20-300C. Ẩm độ càng cao càng tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh tấn công và lây lan mạnh. Bệnh lây theo gió và nguồn nước nhiễm bệnh. Qua theo dõi thấy bệnh hại nặng ở những vùng có mực nước ngầm cao, những vườn vệ sinh kém, rậm rạp và bị che mát nhiều, vườn sử dụng nhiều phân đạm hay phân bón phân chuồng chưa ủ hoai, vườn sử dụng nhiều chất kích thích tăng trưởng hay vườn bón thiếu trung vi lượng đều có tỉ lệ bệnh cao hơn bình thường và khi có bệnh thì khó 29
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP phòng trừ hơn. Vết bệnh ban đầu là những đốm tròn nhỏ màu trắng, hơi lõm, về sau chuyển sang màu vàng cam và khi bệnh phát triển nặng đốm bệnh trở thành vết loét có màu nâu, hơi nổi lên và gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây, năng suất và giá trị thương phẩm của quả. Bệnh thường gây hại trên bẹ non, nụ bông, quả non và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch. Năm 2009, khi những ổ dịch đầu tiên được phát hiện ở Bình Thuận thì một số nhà chuyên môn nhận định trên báo chí rằng: “Đây là bệnh do sinh lý, do thâm canh kém và thắp đèn quá mức” (Báo điện tử nông nghiệp). Tại Việt Nam mặc dù cũng có vài báo cáo công bố sơ lược về tác nhân gây bệnh đốm trắng trên Thanh long nhưng vẫn còn tồn tại nhiều vấn đề nghiên cứu cần làm sáng tỏ thêm (Nguyễn Thành Hiếu và ctv, 2011). Đến đầu mùa mưa năm 2012 bệnh lây lan mạnh, với diện tích gần 1.000ha, tỷ lệ nhiễm nặng từ 10% trở lên chiếm trên 80% và bệnh đã có mặt ở khắp các vùng trồng Thanh long tập trung của Việt Nam như Bình Thuận, Tiền Giang và Long An, đến tháng 6 năm 2013 diện tích nhiễm bệnh đốm trắng đã lên đến 3.000ha, tỷ lệ gây hại từ 20-50%. Theo thống kê đến cuối năm 2013, diện tích Thanh long bị nhiễm bệnh đốm trắng nhẹ ở tỉnh Bình Thuận là 800ha, nặng 400ha, trong tổng số 21 nghìn ha. Tiền Giang, với gần 3.000ha Thanh long thì có đến 2.420ha nhiễm bệnh đốm trắng nhẹ, diện tích nhiễm nặng 80ha. Long An, nhiễm đốm trắng nhẹ 766ha, nặng 41ha, trong tổng số gần 2.700ha và đang có xu hướng lan nhanh. Đến đầu tháng 9/2014, có gần 16.500ha thanh long ở các tỉnh Bình Thuận, Long An, Tiền Giang bị nhiễm bệnh đốm nâu, tăng khoảng 7.000ha so với năm trước, trong đó diện tích bị nhiễm nhẹ với tỷ lệ bệnh phổ biến từ một vài đốm đến dưới 5%, là hơn 30
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 8.000ha, chiếm tỷ lệ 24,1% so với tổng diện tích gieo trồng; tỷ lệ nhiễm nặng từ 5% trở lên là 8.262ha, chiếm tỷ lệ 24,6% tổng diện tích gieo trồng [40]. Theo báo điện tử nông nghiệp Việt Nam 28/11/2013 Thạc sĩ Nguyễn Mỹ Phi Long, người phụ trách kỹ thuật của công ty Điền Trang cho biết đã phân lập và nhân nuôi thành công bào tử của nấm gây nên bệnh đốm trắng. Mặc dù chưa khẳng định 100% nhưng có thể chắc chắc đến 90% rằng đấy là nấm N.dimidiatum. Nấm bệnh này không mới nhưng là mới khi nó gây bệnh nặng trên cây Thanh long. Các báo cáo khoa học về bệnh hại trên cây Thanh long của cả trong và ngoài nước đến hiện nay vẫn chưa ghi tên nấm N.dimidiatum. N.dimidiatum chẳng những có mặt trên thân, cành, lá, hoa, quả thực vật mà còn tồn tại cả trong đất. Trong quá trình nuôi cấy bào tử nấm bệnh, nhóm nghiên cứu đã phát hiện ra một loài vi khuẩn đối kháng Bacillus subtilis có khả năng kiềm chế quá trình phát triển của nấm này. Công ty Điền trang đã nhanh chóng đưa ra ứng dụng tại Long An, An Lục Long và Dương Xuân Hội-Châu Thành-Long An đã thu được nhiều kết quả rất khả quan [35]. Theo Võ Thị Thu Oanh và cộng sự (2014) khi so sánh trình tự vùng gen ITS- RADN của mười một mẫu phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum tại Viện Nghiên Cứu CNSH và Môi Trường - trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh cho thấy các mẫu phân lập tương đồng rất cao với trình tự của loài Neoscytalidium dimidiatum đã được định danh về hình thái [21]. Tại hội thảo Quốc Gia về Khoa học và công trồng diễn ra vào ngày 11/08/2016. Hà Thị Thúy và Cộng sư thuộc Viện Môi trường Nông nghiệp dựa trên phương pháp khuếch trên thạch đĩa đã tìm ra 2 chủng vi sinh vật có khả năng ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum đó là Streptomyces fradiae và Bacillus polyfermenticus [3]. 31
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.4 Các biện pháp trong phòng trừ bệnh đốm trắng trên thanh long [36] Bệnh đốm trắng là loài dịch hại mới, khó quản lý và do tính đặc thù của cây Thanh long là có khả năng ra hoa, mang quả gần như liên tục quanh năm nên việc phòng trị bệnh phải áp dụng nhiều giải pháp tổng hợp, đồng bộ và triệt để thì mới đạt hiệu quả cao. Để quản lý bệnh đốm nâu hại thanh long hiệu quả phải áp dụng các biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp (IPM), trong đó nhất thiết phải áp dụng các biện pháp sau: a. Biện pháp giống Trồng giống sạch bệnh, kiểm tra kỹ để loại bỏ hom giống nhiễm bệnh; chỉ được lấy giống ở vườn thanh long không nhiễm bệnh. b. Biện pháp canh tác  Trong mùa khô - Những vườn trồng trên 4 năm cần cắt tỉa bớt cành già vô hiệu phí trong để trụ thông thoáng, giảm nguồn bệnh và giảm ẩm độ. - Cắt bỏ những cành, quả bị bệnh, thu gom và xử lý bằng chế phẩm sinh học để làm phân bón; không vứt cành, quả bị bệnh xuống nguồn nước hoặc bỏ lại trong vườn nếu chưa qua xử lý. - Bón phân hữu cơ hoai mục, tăng cường bón lân, kali; bổ sung thêm phân trung - vi lượng (Canxi, Magie, Silic, Bo, ) để làm tăng sức kháng cho cây; không bón phân đạm và phun kích thích sinh trưởng khi cây đang bị bệnh. - Không vận chuyển cành, quả bị bệnh sang vườn khác; không tưới nước cho cây lúc chiều tối. - Cuối mùa khô, những cành còn phần non nên tiến hành cắt 2-3 cm ở đầu mút cành đẻ thoát nước đọng trên cành, giúp thúc nhanh quá trinh già hóa cành nhằm hạn chế bệnh gây hại.  Trong mùa mưa: 32
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Không để chồi non trong mùa mưa, nếu chồi non ra phải cắt tỉa hết và khử trùng ngay vết cắt bằng thuốc có chứa gốc đồng (có thể phun thuốc phòng bệnh ngay khi cắt). - Trong các đợt khô kéo dài nếu cần tưới nước phải tưới dưới gốc, không tưới lúc chiều tối sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho bào tử nấm gây bệnh nảy mầm, gây hại nặng. c. Biện pháp sinh học Cuối mùa khô hoặc đầu mùa mưa bón chế phẩm sinh học Trichoderma trộn với phân hữu cơ để tăng khả năng kiểm soát nguồn bệnh trong đất. Có thể bón chế phẩm sinh học lần 2 vào giữa mùa mưa để tăng khả năng kiểm soát nấm bệnh trong đất. Liều lượng theo khuyến cáo ghi trên bao bì sản phẩm. d. Biện pháp hóa học  Cuối mùa khô tiến hành rắc vôi bột khử trùng trên mặt đát với liều lượng 1 – 2 tấn/ha.  Thường xuyên kiểm tra vườn, phát hiện bệnh sớm khi mới chớm xuất hiện để phun kịp thời. Trong mùa mưa, sau mỗi đợt khô kéo dài cần chú ý kiểm tra bệnh để phun thuốc phòng bệnh kịp thời. Những vùng thường xuyên bị bệnh hại nặng cần phun phòng ngay sau khi hết đợt mưa kéo dài.  Phun phòng bệnh bằng các loại thuốc trong danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng ở Việt Nam được Bộ Nông Nghiệp và phát triển nông thôn ban hành hàng năm như hoạt chất Phosphorous acid (Agri-Fos 400 ; có thể sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật chứa gốc đồng hoặc hoạt chất Azoxystrobin, Difenoconazole, Hexaconazole, Mancozeb, Metalaxul, phối hợp với chất bám dính để phòng trừ bệnh đốm nâu, lượng dùng theo khuyến cáo của nhà sản xuất ghi trên bao bì.  Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật theo nguyên tắc “4 đúng” và đảm bảo thời gian cách ly ghi trên bao bì. 33
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Lưu ý: vùng trồng thanh long xuất khẩu phải tuân thủ quy định về sử dụng thuốc bảo vệ thực vật củ quốc gia hoặc vùng lãnh thổ nhập khẩu. 1.3 Thực trạng về phế phẩm Thanh long và ứng dụng trong sản xuất phân hữu cơ sinh học 1.3.1 Thực trạng về nguồn phế phẩm thanh long tại Việt Nam Lâu nay, nông dân trồng thanh long đang gặp khó trong các khâu đảm bảo vệ sinh môi trường. Một trong những nguyên do là sau khi cắt tỉa cành, phế phẩm từ cây thanh long không có chỗ tiêu hủy. Tìm biện pháp để “biến” các loại phế phẩm đó trở thành phân hữu cơ sinh học, đang là sự quan tâm của không ít nông dân. Trong số hơn 13.000 ha thanh long phế phẩm hàng ngày thải ra một lượng lớn các phế phẩm như cành, bông lép, trái thối Nhiều hộ dân đã dùng biện pháp tủ dưới gốc thanh long, hoặc đổ đống ngay tại vườn, gây hôi thối. Điều này vừa ảnh hưởng đến môi trường, vừa không đảm bảo đúng quy trình sản xuất theo tiêu chuẩn VietGAP [42]. 1.3.2 Sản xuất và sử dụng phân compost 1.3.2.1 Định nghĩa compost và quá trình chế biến compost Theo Haug, 1993, quá trình chế biến compost và compost được định nghĩa như sau: Quá trình chế biến compost là quá trình phân hủy sinh học và ổn định của chất hữu cơ dưới điều kiện nhiệt độ thermorpholic. Kết quả của quá trình phân hủy sinh học tạo ra nhiệt, sản phẩm cuối cùng ổ định, không mang mầm bệnh và có ích trong việc ứng dụng cho cây trồng. Compost là sản phẩm của quá trình chế biến compost, đã được ổ định như humus, không chứa các mầm bệnh, không lôi kéo các côn trùng, có thể được lưu trữ an toàn và có lợi cho sự phát triển của cây trồng. Các phản ứng hóa sinh 34
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Quá trình phân hủy chất thải xảy ra rất phức tạp, theo nhiều giai đoạn và sản phẩm trung gian. Ví dụ quá trình phân hủy protein bao gồm các bước: protein => protides =>amono acids => hợp chất ammonium => nguyên sinh chất của vi khuẩn và N hoặc NH3 Đối với carbonhydrates, quá trình phân hủy xảy ra theo các bước sau: carbonhydrate => đường đơn => acids hữu cơ => CO2 và nguyên sinh chất của vi khuẩn. 1.3.2.2 Cấu trúc và cơ chế phân giải cellulose Xenlulose là thành phần chủ yếu trong tế bào thực vật, chiếm tới 50% tổng số hydratcacbon trên trái đất. Trong vách tế bào thực vật, Xenlulose tồn tại trong mối liên kết chặt chẽ với các polisaccarit khác; Hemixenlulose, Pectin và Lignin tạo thành liên kết bền vững Hình 1.6 Các mắt xích β-D- Hình 1.7 Hợp chất cao phân tử Glucose trong cellulose cellulose Xenlulose thường có mặt ở các dạng sau: - Phế liệu nông nghiệp: rơm rạ, lá cây, vỏ lạc, vỏ trấu, vỏ thân ngô . - Phế liệu trong công nghiệp chế biến gỗ: rễ cây, mùn cưa, gỗ vụn - Các chất thải gia đình: rác, giấy loại Trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh ra các men xúc tác trong quá trình phân giải xenlulose. Chúng có ý nghĩa rất lớn đối với việc thực hiện vòng tuần hoàn Cacbon trong tự nhiên, góp phần quan trọng trong việc nâng cao độ phì nhiêu của đất. 35
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trong điều kiện tự thoáng khí, cenlulose có thể bị phân giải dưới tác dụng của nhiều vi sinh vật hiếu khí. Ngoài ra, còn có một số vi khuẩn kỵ khí có khả năng tham gia tích cực vào quá trình phân giải xenlulose. Các loài vi sinh vật như: Cytophaga, Cellulomonas, giống Bacillus, giống Clostridium, Aspergillus, Penicillium Xenlulose bị VSV phân hủy thành các thành phần có phân tử lượng nhỏ hơn. Chính những thành phần nhỏ này kết hợp với những thành phần khác có trong đất tạo ra mùn. 36
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Cơ chế phân giải: Xenlulozo→disaccarit→monosaccarit (glucozo) Khi mùn được tạo thành, vi sinh vật lại tiếp tục phân hủy mùn bằng quá trình amon hóa, sự chuyển hóa này giúp đất tích lũy NH3. Sự tạo thành NH3 trong đất xảy ra rất chậm chạp và điều này rất có lợi cho cây trồng vì quá trình này giải phóng từ từ NH3 cho cây hấp thụ: Chất mùn + O2 –vi sinh vật => CO2 + H2O + NH3 Dựa trên cơ sở này, nhiều công ty đã sản xuất phân vi sinh phân giải Xenlulose, trong đó người ta chú ý đến sự phân hủy của xạ khuẩn Actinomyces và nấm sợi Trichoderma, Aspergillus. Các loài nấm sợi và xạ khuẩn này được nuôi trong những môi trường tương ứng để thu sinh khối. Sinh khối này được trộn với than bùn và đưa vào đất trồng. Việc sử dụng xạ khuẩn và nấm Trichoderma trong sản xuất phân vi sinh phân giải Xenlulose còn tận dụng khả năng tạo kháng sinh và chất diệt côn trùng (mycotoxin) của 2 loài này để chống sâu bệnh. Các nhóm vi sinh vật có mặt trong quá trình ủ phân - Vi khuẩn: với các dạng phân hủy hình que, hình cầu hay hình xoắn. Nhiều loài có khả năng tự di chuyển. Khi bắt đầu của quá trình ủ phân rác, các vi khuẩn chịu nhiệt trung bình chiếm ưu thế. Khi nhiệt độ gia tăng trên 40oC, các vi khuẩn hiếu nhiệt sẽ tiếp quản. Trong giai đoạn này, khuẩn hình que sẽ chiếm ưu thế về số lượng. Khi quá trình ủ phân rác được làm mát, vi khuẩn chịu nhiệt trung bình lại chiếm ưu thế. - Xạ khuẩn: có vai trò quan trọng trong việc phân hủy các chất hữu cơ phức tạp như cellulose, lignin, chitin và protein trong quá trình ủ rác. Enzyme của chúng cho phép xạ khuẩn phân hủy hóa học các mảnh vụn như thân cây, vỏ cây hoặc tạp chí. Một vài loài xuất hiện trong giai đoạn chịu nhiệt trung bình, những loài khác đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn làm mát và ổn định. 37
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Nấm: có vai trò quan trọng trong việc phân hủy các mảnh vụn, tạo cho các vi khuẩn tiếp tục quá trình phân hủy hết các cellulose còn lại. Các loài nấm có số lượng lớn trong cả 2 giai đoạn: nhiệt độ trung bình và nhiệt độ cao. Hầu hết nấm sống ở lớp bên ngoài của đống ủ khi nhiệt độ cao. - Động vật nguyên sinh: được tìm thấy ở trong nước rỉ rác của đống ủ nhưng có vai trò khá nhỏ trong phân hủy phân rác. - Trùng roi: được tìm thấy trong nước rỉ rác của đống ủ. Chúng ăn các hợp chất hữu cơ, vi khuẩn và nấm. 1.3.2.3 Các thông số quan trọng trong quá trình làm phân hữu cơ hiếu khí Bảng 1.2 Các thông số quan trọng trong quá trình làm phân hữu cơ hiếu khí Thông số Giá trị Quá trình ủ đạt hiệu quả tối ưu khi kích thước CTR khoảng 25 – 1. Kích thước 75mm Tỉ lệ C:N tối ưu dao động trong khoảng 25 - 50 2. Tỉ lệ C/N - Ở tỉ lệ thấp hơn, dư NH3, hoạt tính sinh học giảm - Ở tỉ lệ cao hơn, chất dinh dưỡng bị hạn chế. 3. Pha trộn Thời gian ủ ngắn hơn Nên kiểm soát trong phạm vi 50 – 60% trong suốt quá trình ủ. Tối 4. Độ ẩm ưu là 55% Nhằm ngăn ngừa hiện tượng khô, đóng bánh và sự tạo thành các 5. Đảo trộn rảnh khí, trong quá trình làm phân hữu cơ, CTR phải được xáo trộn định kỳ. Tần suất đảo trộn phụ thuộc vào quá trình thực hiện 38
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhiệt độ phải được duy trì trong khoảng 50 – 550C đối với một vài 6. Nhiệt độ ngày đầu và 55 – 600C trong những ngày sau đó. Trên 660C, hoạt tính vi sinh vật giảm đáng kể. 7. Kiểm soát Nhiệt độ 60 – 700C, các mầm bệnh đều bị tiêu diệt mầm bệnh Lượng oxy cần thiết được tính toán dựa trên cân bằng tỷ lượng. 8. Nhu cầu về Không khí chứa oxy cần thiết phải được tiếp xúc đều với tất cả các không khí phần của CTR làm phân Tối ưu: 7 – 7,5. Để hạn chế sự bay hơi Nitơ dưới dạng NH3, pH 9. pH không được vượt quá 8,5 10. Mức độ Đánh giá qua sự giảm nhiệt độ vào thời gian cuối phân hủy 11. Diện tích Công suất 50T/ngày cần 1 hecta đất đất yêu cầu 1.3.2.4 Sản xuất phân compost [34] Sử dụng chế phẩm vi sinh Trichoderma dùng ủ phân chuồng, xác, bã thực vật thành phân hữu cơ vi sinh là một mô hình sản xuất phân đơn giản với các nguyên liệu sẵn có như: phân chuồng, xác bã thực vật (rơm rạ, thân cây đậu, bắp, lá cây ) kết hợp với phân lân. Các bước tiến hành để tạo ra phân hữu cơ sinh học cũng không khó. Chọn nơi khô ráo, có mái che để tránh ánh nắng trực tiếp của mặt trời và che mưa tránh bị rửa trôi làm chế phẩm sinh học Trichoderma không thể lên men phân hủy các chất bả đang ủ. 39
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Việc sản xuất phân hữu cơ sinh học từ cây thanh long vừa tận dụng được nhiều phế, phụ liệu trong nông nghiệp, giúp đất trồng màu mỡ, không gây hại đến môi trường sống vừa giải quyết được lượng rác thải xả ra hàng ngày từ vườn cây thanh long mặt khác lại giúp hạn chế phần nào tình trạng lây bệnh trên diện rộng. Cách thứ nhất: Các phế phẩm, phụ phẩm nông nghiệp được băm thành những đoạn ngắn (10-15 cm) trước khi cho vào ủ. Sau đó trải một lớp mỏng phân chuồng, rác bã thực vật rồi rải đều một lớp mỏng chế phẩm vi sinh Trichoderma đã được pha loãng trong nước, với tỷ lệ 1 tấn phân chuồng hay rác, bã thực vật sử dụng 2 kg chế phẩm vi sinh Trichoderma. Kế đến hòa với 6-7 lít nước để tưới trên bề mặt, cứ thế ủ nhiều lớp, sau đó dùng tấm bạt để che. Cách thứ hai: Trộn men vi sinh Trichoderma với phân lân, sau đó cho một lớp phân chuồng vào hố ủ dày khoảng 20 cm. Tiếp theo, rải một lớp hỗn hợp vi sinh Trichoderma và phân lân. Hết lớp này lại rải tiếp một lớp hỗn hợp, một lớp phân gia súc, gia cầm. Đống phân ủ được thiết kế theo hình khối chữ nhật, có chiều cao khoảng từ 1-1,5 m để dễ đảo, trộn. Sau đó tưới nước đủ độ ẩm cho đống phân. Độ ẩm ủ phân phải đạt khoảng 50-55% (dùng tay nắm hỗn hợp phân ủ, thấy nước vừa rịn kẽ tay là được). Không nên để quá khô cũng như quá ướt làm chậm quá trình phát triển của nấm men. Không nên nén quá chặt sẽ làm hạn chế sự phát triển của nấm men, kéo dài thời gian ủ, chất lượng phân không tốt. Nên dùng bạt màu tối phủ kín đống phân để che nắng, che mưa. Sau 5-7 ngày, tiến hành đảo một lần. Sau gần 2 tháng có thể đưa vào sử dụng bón cho các loại cây trồng, lúc này tất cả xác bã thực vật, phân chuồng đã nhuyễn bột, khô ráo không còn mùi. Lưu ý, khi ủ phân không nên dùng vôi vì sẽ làm hủy diệt các vi sinh vật trong phân, nên bón ngoài ruộng trước khi làm đất là tốt nhất. 40
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Thời gian: tháng 9/2016 đến tháng 8/2017. Địa điểm: Phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ sinh học, Thực phẩm và Môi trường thuộc trường Đại học Công nghệ Tp.HCM. 2.2 Vật liệu 2.2.1. Nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh 2.2.1.1 Nấm đối kháng Các chủng nấm đối kháng Trichoderma được phân lập lần lượt từ mẫu đất thu thập tại vườn trồng tiêu tại Long Thành tỉnh Đồng Nai, phân lập từ tai nấm linh chi thuộc huyện Hóc Môn thành phố Hồ Chí Minh và phân lập từ đất Ca Cao tại Bến Tre. 2.2.1.2 Nấm gây bệnh Nấm Neocystilidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên thanh long được phân lập từ các vườn thanh long bị nấm bệnh tấn công thuộc xã Bình Trinh Đông, huyện Tân Trụ, tỉnh Long An. 2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 2.2.2.1 Dụng cụ. – Ống nghiệm – Cốc thủy tinh – Đĩa petri – Ống đong – Que cấy – Đèn cồn – Đũa thủy tinh – Khay nhựa – Khoan thạch hình trụ – Bình xịt nước 41
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.2.2.2 Thiết bị. Tủ cấy Kính hiển vi Máy hấp Autoclave Cân phân tích Tủ lạnh Máy cất nước Lò nung Bếp từ Tủ hút khí độc Hệ thống chưng cất mẫu kjeldahl 2.2.3 Hóa chất D – Glucose NaOH CMC ZnSO4 Bột chitin KCl NaNO3 FeSO4 Agar K2HPO4 Nước cất MgSO4 Cồn 700, 960 MgSO4.7H2O NH4NO3 42
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.2.4 Các loại môi trường 2.2.4.1 Môi trường phân lập nấm bệnh WA.  Thành phần: – Agar: 20 g – Nước cất: 1000 ml 2.2.4.2 Môi trường nuôi cấy nấm mốc PDA.  Thành phần: – Khoai tây: 200 g – D – glucose: 20 g – Agar: 20 g – Nước cất: 1000 ml  Cách pha môi trường: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt hạt lựu, cân đủ 200 g cho nước cất vào đun sôi khoảng 20 phút kể từ khi bắt đầu sôi. Sau đó, lọc bỏ phần bã, đun sôi trở lại, rồi cho lần lượt đường và agar vào (Lưu ý vừa cho vừa khuấy đều để tránh bị vón cục). và đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. 2.2.4.3 Môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase CMC [8].  Thành phần môi trường: – NaNO3 0,4 g – K2HPO4 0,2 g – MgSO4 0,1 g – KCl 0,1 g – CMC 1% – Agar 2% – Nước cất: 1000 ml  Cách pha môi trường: 43
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đun tan CMC trong nước cất rồi cho các thành phần môi trường còn lại vào chai thủy tinh và khuấy đều sau đó đậy kính nắp đem hấp khử trùng ở 1210C, 1atm. Sau khi hấp khử trùng lấy ra chờ nguội, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn lửa đèn cồn, lần lượt đổ môi trường vào đĩa, sau đó chờ cho môi trường nguội và đặc lại. 2.2.4.4 Môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase [7]:  Thành phần môi trường: – NaNO3 3,5 g/l – K2HPO4 1,5 g/l – MgSO4.7H2O 0,5 g/l – KCl 0,5 g/l – FeSO4.7H2O 0,01 g/l – Cloramphenicol 0,005 g/l – Dịch chitin huyền phù 1%: Bổ sung đến 1 lít. – pH: 7  Cách pha huyền phù chitin 1%: Dung dịch chitin huyền phù 1% được chuẩn bị như sau: 1g bột chitin được cho dần vào 20 ml HCl đậm đặc, ủ ở 4oC và để qua đêm [12]. Thêm vào hỗn hợp 200 ml ethanol lạnh (-20oC) khuấy đều thật nhanh và ủ qua đêm. Ly tâm hỗn hợp ở 4000 vòng/ phút, trong 10 phút, thu lấy kết tủa và rửa bằng nước cất cho đến khi pH trung tính. Thêm vào tủa nước cất cho đến thể tích 100 ml. 2.2.4.5 Môi trường Czapeck dox để nhân giống cấp 2 Trichoderma  Thành phần môi trường: – Saccharose 30g – NaNO3 3 g – K2HPO4 1 g – MgSO4.7H2O 0,5 g – KCl 0,5 g 44
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – FeSO4.7H2O 0,01 g – Nước cất 1000ml – pH: 6 45
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3 Phương pháp nghiên cứu. 2.3.1 Sơ đồ tổng quát nội dung thí nghiệm Các chủng nấm Trichoderma đã Phân lập nấm được phân lập bệnh Quan sát hình thái Quan sát hình thái Test sinh hóa Thử nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm Sàng lọc Định danh Xử lý cành Lên men tạo chế phẩm thanh long Thử nghiệm trong chậu Thử nghiệm ngoài đồng 46
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Giải thích sơ đồ Các chủng nấm Trichoderma có sẵn trong phòng thí nghiệm, được phân lập từ đất hồ tiêu, đất ca cao và tai nấm linh chi và được giữ trong ống thạch nghiêng. Các chủng nấm này sẽ được cấy lên đĩa petri và được sử dụng để nghiên cứu. Ủ nấm trong 1 tuần để nấm mọc, tạo thành sợi nấm và bào tử. Sau đó các chủng nấm này được sử dụng để quan sát hình thái sợi nấm, thử nghiệm các phản ứng sinh hóa và thử nghiệm khả năng đối kháng với chủng nấm bệnh trong điều kiện phòng thí nghiệm. Quá trình sàng lọc diễn ra sau khi tìm ra được chủng tốt nhất, tiến hành định danh và lên men tạo chế phẩm. Môi trường được sinh viên sử dụng để nhân giống cấp 2 là môi trường Czapeck được trình bày ở mục 2.2.4.5. Nguyên liệu là các chất khoáng sau khi chuẩn bị, được đưa vào bucher, thực hiện khuấy tan từng chất cho đến khi kết thúc chất cuối cùng, dung dịch có màu trong. Phân phối dịch môi trường vào trong các erlen đã được chuẩn bị trước. Các erlen môi trường được đem đi hấp khử trùng trong 15 phút, nhiệt độ 1210C, áp suất 1 atm để loại bỏ hoàn toàn bào tử của các VSV có thể gây nhiễm. Để nguội môi trường cho tới nhiệt độ phòng rồi tiến hành cấy giống Trichoderma T3 đã nuôi cấy 7 ngày trên môi rường PDA, với mỗi erlen chứa 200ml môi trường là ¼ đĩa nấm đã cấy và ủ 7 ngày trước đó. Lắc đều trên máy lắc ngang với tốc độ lắc 60v/ph, thời gian lắc là 48h, nhiệt độ 290C. Giống sau khi được nhân giống cấp 2 trên môi trưởng 200ml Czapeck lỏng sẽ được cấy vào 500g môi trường rắn với cơ chất là lúa bổ sung D-Glucose 3% và (NH4)2SO4 1%. Ủ ở nhiệt độ phòng. 47
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Quá trình lấy mẫu được thực hiện khi tơ nấm đã ăn lan và bào tử bắt đầu phủ kín cơ chất trên môi trường nhân sinh khối, tiến hành lấy 10g mẫu sau đó đem đi pha loãng với nồng độ thích hợp và đếm số bào tử bằng phương pháp đếm gián tiếp từ đó xác định được (số bào tử)/g chế phẩm theo công thức sau: N A CFU / g nn1VfVf1 n n Trong đó: - A: số khuẩn lạc trong 1g mẫu - N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn - n là số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ i - V là thể tích mẫu (ml) cấy vào mô trường - F là hệ số pha loãng tương ứng Chế phẩm Trichoderma sau quá trình lên men thể rắn được sử dụng cho các thử nghiệm tiếp theo. Đó là thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh đốm trắng trên cây thanh long ở điều kiện trong chậu, ngoài đồng và thử nghiệm ủ phân compost từ cành thanh long. 2.3.2 Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm  Quan sát hình thái đại thể: Dùng que cấy móc vô trùng gạt nhẹ lên bào tử đính của nấm rồi chuyển sang đĩa petri chứa môi trường PDA, bằng cách cắm que cấy xuống mặt thạch tại điểm trung tâm của đĩa môi trường mới. Quan sát hình thái tản nấm (hình dạng, màu sắc) ở mặt trên và mặt dưới theo từng ngày cho tới khi tản nấm mọc đầy đĩa.  Quan sát hình thái vi thể (phương pháp phòng ẩm) [22]. – Nguyên tắc: Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với các thành phần khác của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng bền vững. Thường để 48
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP quan sát hình thái cấu trúc sợi nấm và các cơ quan sinh sản của nấm ở trạng thái tự nhiên. – Tiến hành: Chuẩn bị một đĩa môi trường PDA và một đĩa petri vô trùng nuôi cấy chứa: mảnh giấy lọc, hai thanh đũa tre đặt trên giấy lọc, lame và lamelle. Nhỏ nước cất vô trùng cho ướt toàn bộ giấy thấm trong đĩa petri. Sau đó, đặt hai thanh đũa tre lên đĩa rồi đặt lame lên hai thanh đũa tre. Sử dụng dao mổ vô trùng cắt một khối thạch (1 cm2) từ đĩa môi trường PDA chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuôi cấy. Dùng dây cấy đã khử trùng, lấy sinh khối nấm thí nghiệm cấy vào 4 mặt bên của khối thạch. Sau đó đậy lamelle lên trên khối thạch. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử xảy ra (thường là 2 – 4 ngày). Mẫu quan sát được chuẩn bị bằng cách lấy lamelle ra khỏi khối thạch đặt lên một lame sạch có sẵn một giọt Methylene blue. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 40X và 100X rồi mô tả đặc điểm: Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn, hình dạng cuống bào tử, đặc điểm hình thái, màu sắc, kích thước bào tử. 2.3.3 Phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long  Nguyên tắc Trong thiên nhiên hoặc trong vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, sinh hóa hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần. Tức là tìm cách phân lập, tách riêng từng tế bào vi sinh vật, nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng nhằm thu được các dòng thuần khiết mục tiêu.  Tiến hành Mẫu bệnh thu thập từ các vườn Thanh long là những mẫu bệnh điển hình, còn tươi đó là những vết đốm tròn nhỏ màu trắng, vết bệnh lõm sâu vào trong và thấp so 49
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP với bề mặt bẹ. Sau khi thu mẫu về, tiến hành phân lập trong điều kiện phòng thí nghiệm. Rửa mẫu dưới vòi nước đang chảy để loại bỏ bụi bẩn. Nhúng dụng cụ trong cồn 90o và hơ khô trên ngọn lửa. Khử trùng bề mặt bằng dung dịch Javel 1 % khoảng 10 - 15 giây, sau đó rửa lại bằng nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng. Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt mẫu thành từng mẫu cấy nhỏ 1 - 2 mm ở phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh, sau đó cấy lên môi trường WA. Dùng kẹp ấn nhẹ những mẫu cấy lên mặt thạch gần mép đĩa môi trường. Đặt ngược đĩa cấy để tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường ở nhiệt độ phòng trong 3 - 5 ngày cho đến khi tản nấm phát triển, quan sát hàng ngày dưới kính hiển vi để kiểm tra các sợi nấm mọc từ các mẫu cấy. Cấy truyền lên môi trường PDA, làm thuần nấm bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm. 2.3.4 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma 2.3.4.1 Xác định hoạt tính cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch [14]. – Nguyên tắc: Cellulase tác động lên cơ chất CMC trong môi trường thạch. CMC bị phân hủy thành các đường khử làm độ đục của môi trường bị giảm và trở nên trong suốt khi nhuộm bằng Lugol. Độ lớn của vòng phân giải phản ánh hoạt tính của enzyme. – Tiến hành: Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm: Cấy điểm các chủng nấm thí nghiệm lên môi trường PDA và ủ tại nhiệt độ phòng trong thời gian 7 ngày. Dùng khoan thạch hình trụ đường kính 5mm đục một miếng thạch (từ đĩa môi trường PDA đã nuôi cấy nấm thí nghiệm) đặt lên tâm đĩa môi trường CMC và ủ trong thời gian 2 ngày ở 28-320C. 50
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sau 2 ngày, nhuộm màu môi trường bằng cách đổ dung dịch lugol vào đĩa thí nghiệm, để yên 5 phút rồi đổ lugol thừa ra, cho nước cất vào tráng đĩa, đổ nước cất ra, và tiến hành đo đường kính vòng phân giải. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri. – Chỉ tiêu theo dõi: đường kính vòng phân giải [20]. + D – d ≥ 2,5 cm: hoạt tính enzyme rất mạnh. + D – d ≥ 2 cm: hoạt tính enzyme mạnh. + D – d ≥ 1,5 cm: hoạt tính enzyme trung bình. + D – d ≥ 1 cm: hoạt tính enzyme yếu. Trong đó: D: đường kính vòng phân giải CMC (cm). d: đường kính khoanh thạch chứa nấm thí nghiệm (cm). 2.3.4.2 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma trên môi trường thạch [14]. – Nguyên tắc: Khi chitinase có mặt trong môi trường chứa chitin nó sẽ phân giải chitin thành N - acetyl glucosamine và các cấu trúc mạch ngắn hơn không bắt màu với thuốc thử lugol. Khi tác dụng với thuốc thử lugol, độ lớn của phần môi trường trong suốt (vòng phân giải) phản ánh hoạt tính chitinase của chủng nấm sợi. Đo đường kính vòng phân giải để xác định khả năng sinh enzyme chitinase. Phương pháp này chỉ dùng để định tính enzyme, chỉ đánh giá sơ bộ khả năng sinh tổng hợp enzyme chứ không xác định chính xác hoạt độ của enzyme. – Tiến hành: Lấy khuẩn lạc Trichoderma sau 7 ngày nuôi cấy trong đĩa môi trường PDA bằng cách: lấy cây đục lỗ thạch có đường kính 5mm (khử trùng bằng cồn 960, đốt trên ngọn lửa đèn cồn) để đục lỗ, đục trên cùng 1 đường tròn chu vi tâm là điểm đã cấy trước đó. 51
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sau đó, đặt miếng thạch từ đĩa môi trường PDA sang đĩa chứa môi trường có chitin (đặt miếng thạch ngay tâm đĩa) và ủ ở 28-320C. Sau 2 ngày, tiến hành đổ lugol vào đĩa để quan sát vòng phân giải, lugol đổ ngập bề mặt đĩa, để 5 phút rồi đổ lugol thừa ra, cho nước cất vào tráng đĩa, đổ nước cất ra, rồi tiến hành quan sát. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri. – Chỉ tiêu theo dõi: đường kính vòng phân giải [20]. + D – d ≥ 2,5cm: hoạt tính enzyme rất mạnh. + D – d ≥ 2cm: hoạt tính enzyme mạnh. + D – d ≥ 1,5cm: hoạt tính enzyme trung bình. + D – d ≥ 1cm: hoạt tính enzyme yếu. Trong đó: D: đường kính vòng phân giải chitin (cm). d: đường kính khoanh thạch chứa nấm thí nghiệm (cm). 2.3.5 Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long  Phương pháp đồng nuôi cấy: Hoạt động đối kháng invitro của chủng Trichoderma với nấm Neoscytalidium dimidiatum đã được đồng nuôi cấy bằng cách làm theo phương pháp mô tả bởi Upadhyay and Rai (1987) [33].  Cách tiến hành: – Chuẩn bị nguồn nấm Nguồn nấm Trichoderma: Các chủng nấm Trichoderma được nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày để làm nguồn đối kháng nấm bệnh. Nguồn nấm bệnh: nấm Neoscytalidium dimidiatum sau khi phân lập được nuôi cấy trên môi trường PDA trong 7 ngày để làm vật liệu thí nghiệm. – Thí nghiệm đối kháng trực tiếp Đĩa đối kháng: Dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch có chứa nấm đối kháng Trichoderma từ đĩa nấm đối kháng đã chuẩn bị và đặt 52
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP vào đĩa chứa môi trường PDA (đặt cách mép đĩa 1cm). Sau đó, làm tương tự đặt khoanh thạch có chứa nấm Neoscytalidium dimidiatum đối xứng với khoanh thạch chứa nấm Trichoderma qua tâm đĩa và cách mép đĩa 1cm. Khoảng cách giữa 2 tản nấm cấy vào cách nhau 7cm . Đĩa đối chứng: Cấy khoanh thạch nấm bệnh, đường kính 5mm đặt tương tự trên đĩa môi trường PDA cách mép đĩa petri 1cm và không cấy nấm Trichoderma spp. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phòng. Quan sát ghi nhận kết quả sau 2, 4, 6 và 7 ngày nuôi cấy.  Chỉ tiêu theo dõi: – Bán kính khuẩn lạc nấm bệnh (cm) – Khả năng ức chế của nấm Trichoderma spp. với nấm Neoscytalidium dimidiatum được tính theo công thức của Fokkema, 1976 [33]: 푅1−푅2 PMIG = × 100(%) 푅2 Trong đó: R1: Bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh ở công thức đối chứng (không cấy nấm đối kháng) (cm). R2: Bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh ở công thức đối kháng (cm). PIMG (Percent Inhibition of Mycelial Grow): Chỉ số đối kháng của Trichoderma. + PIMG ≤ 50: Chỉ số đối kháng thấp. + 51 ≤ PIMG ≤ 60: Chỉ số đối kháng trung bình. + 61 ≤ PIMG ≤ 75: Chỉ số đối kháng cao. + PIMG > 75: Chỉ số đối kháng rất cao. 53
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.6 Thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh đốm trắng trên cây thanh long ở điều kiện trong chậu  Phương pháp: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được thực hiện trên các chậu Thanh long 3 tháng tuổi gồm 3 lần lặp lại với 2 yếu tố: Yếu tố A gồm tác nhân sinh học là chủng Trichoderma asperellum; yếu tố B là 2 thời điểm xử lý: - Công thức 1: đối chứng, chỉ tưới nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum. - Công thức 2: tưới nấm Trichoderma asperellum (106cfu/g) trước rồi tưới nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum ngay sau đó. - Công thức 3: tưới nấm Trichoderma asperellum trước 3 ngày, sau đó tưới nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum  Tiến hành Thanh long được trồng cùng thời điểm để đảm bảo sự đồng đều, sau khi các chậu Thanh long được 3 tháng tuổi tiến hành tưới dịch huyền phù nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum và nấm Trichoderma asperellum tương ứng với các thời điểm trên. Tạo dịch huyền phù nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum: hòa 10ml nước cất vô trùng vào đĩa nấm đã được nuôi cấy sau 7 ngày rồi dùng que cấy trang trang đều khắp mặt thạch để cạo hết phần bào tử trên bề mặt. Sau đó pha loãng sao cho dung dịch đạt 106 CFU/ml. Tạo dịch huyền phù nấm Trichoderma asperellum với nồng độ 106 CFU/ml bằng cách cân 100g chế phẩm Trichoderma hòa với nước cất sao cho dung dung dịch đạt 106 CFU/ml. Theo dõi và đánh giá kết quả thí nghiệm sau 30 ngày.  Chỉ tiêu theo dõi: - Tỷ lệ bệnh: là tỷ lệ (%) cành thanh long bị bệnh so với tổng số cành làm thí nghiệm ở mỗi công thức. - Chiều dài mỗi cành thanh long sau khi làm thí nghiệm ở mỗi công thức. 54
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Khối lượng các cành thanh long sau khi làm thí nghiệm ở mỗi công thức 2.3.7 Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh của chế phẩm Trichoderma ngoài đồng ruộng Mục đích: xác định hiệu quả phòng trị bệnh đốm trắng hại thanh long trên đồng ruộng của chủng nấm Trichederma asperellum. Tiến hành: Địa điểm: trên vườn thanh long tại xã Bình Trinh Đông, huyện Tân Trụ, tỉnh Long An. Thí nghiệm được thử nghiệm trên vườn thanh long 9 tháng tuổi, gồm 2 lô (mỗi lô gồm 18 trụ thanh long). Lô đối chứng do nông dân tự phòng trị. Lô thí nghiệm tưới nấm Trichederma asperellum, liều lượng 106 bào tử /ml, mỗi trụ thanh long tưới 10 lít dung dịch nấm sau khi pha. Sau 45 ngày thử thử nghiệm, chọn ngẫu nhiên 54 cành thanh long trên mỗi lô để đánh giá tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh. Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Trichederma asperellum Nghiệm thức Công thức Liều dùng Tưới nước, bón phân và phun thuốc hóa học: siêu phos kali (20- 40ml/16 lít nước), nano đồng (20- Phun thuốc hóa học phòng Đối chứng 40ml/16 lít nước), antracol (50g/ trừ bệnh đốm trắng 16 lít nước), phân trung lượng Wincrop (50g/25 lít nước) Phun định kỳ 7 ngày/ lần. 55
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chế phẩm từ nấm Trichederma Phun chế phẩm nấm asperellum nồng độ 106 bào tử/ml, NT1 Trichederma spp. tưới đều vào các gốc thanh long, tưới 6 lần với định kỳ 7 ngày/lần.  Chỉ tiêu theo dõi: – Tỷ lệ bệnh: Là tỉ lệ (%) cành thanh long bị bệnh so với tổng số cành làm thí nghiệm ở mỗi công thức. – Chỉ số bệnh (%): Là cường độ bệnh, biểu thị mức độ nhiễm bệnh hại nặng hay nhẹ của cây ở một thời điểm nào đó theo thang đo 9 cấp theo Quy phạm khảo nghiệm trên đồng ruộng hiệu lực phòng trừ bệnh của các loại thuốc trừ bệnh.[15] Tổng số lá (hoặc quả)bị bệnh Tỷ lệ bệnh/Tỷ lệ hại (%) = x 100 Tổng số lá (hoặc quả) điều tra [( 1 1) + ( 3 3) + ( 5 5) + ( 푛 푛 )] Chỉ số bệnh/Chỉ số hại (%) = x 100 푛 Trong đó: N1 là số lá (hoặc quả) bị bệnh ở cấp 1. N3 là số lá (hoặc quả) bị bệnh ở cấp 3. Nn là số lá (hoặc quả) bị bệnh ở cấp n. N là tổng số lá (hoặc quả) điều tra. n là cấp bệnh cao nhất (cấp 9). Bảng phân cấp bệnh: Cấp 1: ≤ 1% diện tích lá/quả bị bệnh, vết bệnh tròn, nhỏ 56
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Cấp 3: > 1% - 5% diện tích lá/quả bị bệnh, vết bệnh lõm xuống Cấp 5: > 5% - 25% diện tích lá/quả bị bệnh, vết bệnh có màu đen Cấp 7: > 25% - 50% diện tích lá/quả bị bệnh, vết bệnh biến màu, thối đen Cấp 9: > 50% diện tích lá/quả bị bệnh, xuất hiện nhiều vết bệnh trên lá/quả, các vết bệnh có thể liên kết lại với nhau. 2.3.8 Thử nghiệm ủ phân compost từ cành thanh long của nấm Trichoderma Các phế phẩm thanh long được băm thành những đoạn ngắn từ 5-10 cm và phơi nắng 1 ngày để giảm bớt ẩm độ. Sau đó, các phế phẩm này được cho vào thùng xốp (kích thước 60,5 x 45,5 x 18 cm ) để ủ, trong quá trình ủ chú ý luôn đảo trộn đều. Theo dõi và ghi nhận kết quả sau 15 ngày ủ. 2.3.8.1 Xác định độ tro a. Nguyên tắc: Xác định lượng tro tổng hoặc tro không tan trong acid bằng cách nung mẫu ở nhiệt độ 5500C đến khối lượng không đổi b. Tiến hành - Nung cốc sứ 1 giờ ở 5500C, để nguội trong bình hút ẩm 30 phút. Cân khối lượng cốc với độ chính xác 0,1 mg (m1). - Cân chính xác 5 g mẫu (m) đã được nghiền và đồng nhất vào cốc. - Đặt cốc lên bếp điện và đốt cho đến khi hết khói. - Đưa cốc vào tủ nung ở 5500C trong 4 giờ. - Sau khi nung nếu mẫu chưa hoá tro hoàn toàn thì làm nguội tro và thêm vài giọt H2O2. Đặt chén nung lên bếp và đun cho đến khi hết sủi bọt, tiếp tục đốt cho đến khô. 57
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Đưa chén nung trở lại tủ nung, tiếp tục nung cho đến khi tro hoá hoàn toàn. Làm nguội trong bình hút ẩm. Lặp lại quá trình này cho đến khi đạt khối lượng không đổi (m2). c. Tính toán kết quả - Hàm lượng tro được tính bằng số gam tro còn lại sau khi đốt trên 100 g mẫu. (m m ) Hàm lượng tro (%) = 2 1 x 100 m - m: khối lượng mẫu đã sấy khô (g) - m1: khối lượng cốc (g) - m2: khối lượng cốc có chứa tro sau khi nung (g). 2.3.8.2 Xác định hàm lượng cacbon Hàm lượng cacbon được xác định theo công thức sau: 100 %tro %C 1,8 2.3.8.3 Xác định độ ẩm a. Nguyên tắc Dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu. Độ ẩm được xác định bởi sự chênh lệch về khối lượng mẫu tươi trước khi sấy và sau khi sấy ở 105±20C đến khối lượng không đổi. b. Tiến hành - Mở nắp chén sấy và để chúng trong tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 105 ± 20C trong một giờ, lấy ra để nguội ở bình hút ẩm 30 phút, cân khối lượng cốc (m1). - Cân chính xác 5 gam mẫu (m) đã nghiền nhỏ vào chén sấy. - Mở nắp chén sấy có chứa mẫu và để chúng trong tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 105 ± 20C trong thời gian 4 giờ kể từ lúc nhiệt độ tủ sấy đạt 105oC. - Đậy nắp (không kín) lại và để nguội ở bình hút ẩm 30 phút. 58
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Đậy nắm thật kín lấy ra khỏi bình hút ẩm và cân xác định khối lượng. Lặp lại quá trình từ bước 3 đến bước 5 cho tới khi xác định được khối lượng không đổi (m2). (chênh lệch giữa hai lần cân liên tiếp không quá 0,1%). c. Tính toán kết quả mmm Ẩm độ (%) = ( 12)*100 m Trong đó: m: là khối lượng mẫu tươi đem sấy (gam) m1 : là khối lượng cốc khô (gam) m2 : là khối lượng chén và mẫu sau khi sấy (gam) 2.3.8.4 Xác định hàm lượng Nitơ a. Vô cơ hóa mẫu Cân 100g chất hữu cơ. Lưu ý: giai đoạn này phải thực hiện trong tủ Hottle, đặt bình hơi nghiêng trên bếp, tránh trường hợp khi sôi mạnh hóa chất bắn ra ngoài, khi đã sôi giữ nhiệt độ bếp đun vừa phải để tránh hóa chất ra ngoài và không bị mất ammoniac. Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình còn chưa bị oxy hóa vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình kjeldahl và định mức đến vạch. b. Cất đạm: Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử tashiro lúc này trong bình có màu tím hồng. Tiếp tục cho vào bình cất 15ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu 59
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển heat sang màu xanh lá mạ). Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0.1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn. Bật công tắc cất đạm. Sau khi cất đạm 10 – 12 phút để kiểm tra xem NH4OH còn ở được tạo ra không, dùng giấy quỳ thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy quỳ không đổi màu xanh là được. ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa. a. Chuẩn độ: Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0.1N sử dụng. Công thức tính hàm lượng % nitơ tống số: 1.42 ∗ (V1 − V2) ∗ 100 % = Trong đó: V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng. V2: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độ. a: số miligam nguyên liệu. 1,42: hệ số; cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42 mg Nitơ. 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu Tất cả số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2010 và SAS (Statistical Analysis System) 9.4. 60
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phân lập nấm gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long Từ cành thanh long bị bệnh đốm trắng tại xã Bình Trinh Đông, huyện Tân Trụ, tỉnh Long An, sinh viên đã phân lập được chủng nấm bệnh có đặc điểm như sau:  Hình thái đại thể: Khuẩn lạc có màu trắng đến nâu đen, sợi nấm dạng bông, đan xen nhau dày đặc, hướng dạng tia từ điểm cấy ra ngoài mép đĩa, không hình thành những vòng tròn đồng tâm. Mặt trước Mặt sau Hình 3.1 Hình thái đại thể của chủng nấm gây bệnh đốm trắng sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA.  Vi thể: Bào tử dạng chuỗi hoặc đơn, hình trụ, có vách ngăn, kích thước 9-20 x 5-7 μm. 61
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP a b Hình 3.2 Hình thái vi thể của chủng nấm bệnh: (a) Sợi nấm, (b) Bào tử. Dựa vào đặc điểm của loài nấm Neoscytalidium dimidiatum được mô tả bởi Crous & Slippes (2006) [31] chủng nấm sinh viên phân lập được trùng khớp với đặc điểm hình thái của chủng Neoscytalidium dimidiatum. Kết quả này cũng tương tự như kết quả nghiên cứu của Danupat Thongkham and Kasem Soytong (2016) [24]. Bảng 3.1 So sánh đặc điểm hình thái của chủng nấm phân lập được và nấm Neoscytalidium dimidiatum theo mô tả bởi Crous & Slippes (2006) [31]. Loài Neoscytalidium dimidiatum Đặc điểm Chủng nấm phân lập được được mô tả bởi Crous & Slippes hình thái (2006) Khuẩn lạc màu nâu đến nâu đen, Tản nấm ban đầu có màu trắng sợi nấm dạng bông, hướng dạng xám, sau 10 ngày nuôi cấy có tia từ điểm cấy ra ngoài mép đĩa, màu xám đen đến nâu đen, mặt Đại thể không hình thành vòng tròn đồng sau tản nấm có màu đen, không tâm có vòng tròn đồng tâm. Sợi nấm có màu nâu đến nâu đậm, vươn cao như bông gòn trên bề mặt 62
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP môi trường. Bào tử dạng chuỗi hoặc đơn, hình Bào tử dạng chuỗi hoặc đơn, đốt trụ, có vách ngăn, kích thước 9- có màu nâu đến nâu sẫm, có vách 20 x 5-7 μm. ngăn. Bào tử có hình que, hình tròn, hình quả lê, hình trứng, hình trụ. Kích thước trung bình bào tử Vi thể khoảng 9,17-21,2 x 4,05-7,75 μm. 3.2 Kết quả khảo sát một số đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của các chủng nấm Trichoderma spp. 3.2.1 Đặc điểm hình thái của các chủng Trichoderma phân lập Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái của các chủng Trichoderma phân lập 63
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chủng Nguồn Đặc điểm đại thể Đặc điểm vi thể nấm gốc Phân Sợi tơ nấm mảnh, dạng bông, Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ mọc nổi lên bề mặt thạch, tử phân nhánh nhiều, bào tử đính tai nấm hướng dạng tia ra ngoài mép có hình cầu méo đến hình oval, linh chi đĩa. vách trơn láng. T1 Phân Sợi tơ dạng bông mịn, mảnh, Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ đan xen nhau dày đặc, mọc tử phân nhánh nhiều, bào tử đính đất hồ nổi lên bề mặt thạch, hướng có hình cầu hoặc hình oval, vách tiêu dạng tia ra ngoài mép đĩa. trơn láng. T3 Phân Sợi nấm mảnh, dạng bông, Sợi nấm có vách ngăn, cành bào T7 lập từ mọc sát bề mặt thạch, đan xen tử phân nhánh nhiều, bào tử đính 64
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP tai nấm vào nhau, hướng dạng tia ra có hình cầu méo đến hình oval, linh chi ngoài mép đĩa. vách trơn láng. Phân Sợi nấm mảnh, mọc sát bề Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ mặt thạch, đan xen vào nhau tử phân nhánh nhiều, bào tử đính tai nấm hướng dạng tia ra ngoài mép có hình cầu, vách trơn láng. linh chi đĩa. T9 Phân Sợi nấm mảnh, mọc đan xen Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ vào nhau, màu trắng sữa, tử phân nhánh nhiều, bào tử đính T11 tai nấm hướng dạng tia ra ngoài mép có hình cầu méo đến hình oval, linh chi đĩa. vách trơn láng. 65
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân Sợi nấm dạng bông, mọc sát Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ bề mặt thạch, hướng dạng tia tử phân nhánh nhiều, bào tử đính tai nấm ra ngoài méo đĩa. có hình cầu méo đến hình oval, linh chi vách trơn láng. T12 Phân Sợi nấm mảnh, dạng bông, Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ đan xen vào nhau, mọc sát bề tử phân nhánh nhiều, bào tử đính tai nấm mặt thạch, hướng dạng tia ra có hình cầu méo đến hình oval, T13 linh chi ngoài mép đĩa. vách trơn láng. 66
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân Sợi tơ nấm mảnh, mọc sát mặt Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ thạch, hướng tia ra ngoài mép tử phân nhánh nhiều, bào tử đính tai nấm đĩa, tạo thành những vòng có hình cầu méo đến hình oval, linh chi tròn đồng tâm. vách trơn láng. T15 Phân Sợi nấm mảnh, đan xen nhau Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ dày đặc, hướng dạng tia từ tử phân nhánh nhiều, bào tử đính tai nấm tâm ra ngoài mép đĩa. có hình cầu méo đến hình oval, T21 linh chi vách trơn láng. 67
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân Sợi nấm mảnh, mọc nổi lên bề Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ mặt thạch, hướng tia ra ngoài tử phân nhánh nhiều, bào tử đính tai nấm mép đĩa. có hình cầu méo đến hình oval, linh chi vách trơn láng. T22 Phân Sợi nấm mảnh, mọc sát bề Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ mặt thạch, đan xen vào nhau, tử phân nhánh nhiều, bào tử đính tai nấm hướng dạng tia ra ngoài mép có hình cầu méo đến hình oval, T23 linh chi đĩa. vách trơn láng. 68
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân Sợi nấm mảnh, mọc sát bề Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ mặt thạch, đan xen nhau, tử phân nhánh nhiều, bào tử đính tai nấm hướng dạng tia ra ngoài mép có hình cầu méo đến hình oval, linh chi đĩa. vách trơn láng. T25 Phân Tản nấm gồm các sợi tơ Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ mảnh, mọc nổi lên bề mặt tử phân nhánh nhiều, bào tử đính tai nấm thạch, hướng dạng tia ra ngoài có hình cầu méo đến hình oval, linh chi mép đĩa. vách trơn láng. T26 69
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân Tản nấm gồm các sợi tơ Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ mảnh, mọc sát bề mặt thạch, tử phân nhánh nhiều, bào tử đính đất hồ hướng dạng tia ra ngoài mép có hình cầu méo đến hình oval, tiêu đĩa. vách trơn láng. TC1 Phân Sợi nấm mảnh, mọc sát bề Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ mặt thạch, đan xen vào nhau, tử phân nhánh nhiều, bào tử đính đất hồ hướng dạng tia ra ngoài mép có hình cầu méo đến hình oval, tiêu đĩa. vách trơn láng. TC2 Phân Tản nấm gồm các sợi tơ Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ mảnh, mọc nổi lên bề mặt tử phân nhánh nhiều, bào tử đính TC3 đất hồ thạch, hướng dạng tia ra ngoài có hình cầu méo đến hình oval, tiêu mép đĩa. vách trơn láng. 70
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân Sợi tơ nấm mảnh, mọc sát mặt Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ thạch, hướng tia ra ngoài mép tử phân nhánh nhiều, bào tử đính đất hồ đĩa. có hình cầu, vách trơn láng. tiêu TC5 Phân Sợi tơ nấm mảnh, mọc sát mặt Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ thạch, hướng tia ra ngoài mép tử phân nhánh nhiều, bào tử đính đất hồ đĩa, tạo thành những vòng có hình cầu, vách trơn láng. tiêu tròn đồng tâm. TC6 71
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân Sợi nấm mảnh, mọc sát bề Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ mặt thạch, đan xen nhau, tử phân nhánh nhiều, bào tử đính đất hồ hướng dạng tia ra ngoài mép có hình cầu, vách trơn láng. tiêu đĩa. TC7 Phân Tản nấm gồm các sợi tơ Sợi nấm có vách ngăn, cành bào lập từ mảnh, mọc nổi lên bề mặt tử phân nhánh nhiều, bào tử đính đất hồ thạch, hướng dạng tia ra ngoài có hình cầu méo đến hình oval, tiêu mép đĩa. vách trơn láng. TC8 Phân Tản nấm gồm các sợi tơ Sợi nấm có vách ngăn, cành bào TC9 lập từ mảnh, mọc nổi lên bề mặt tử phân nhánh nhiều, bào tử đính đất hồ thạch, hướng dạng tia ra ngoài có hình cầu, vách trơn láng. 72