›

Đồ án Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía

pdf 115 trang thiennha21 12/04/2022 7430
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_hoat_tinh_sinh_hoc_cua_cay_nhan_tran_tia.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY NHÂN TRẦN TÍA Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Ngọc Hồng Sinh viên thực hiện: Lê Hoàng Khải MSSV: 1211100095 Lớp: 12DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2016
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung trong đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hồng - giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP.HCM. Tất cả số liệu, kết quả trong đề tài này đều thu được qua nghiên cứu thực nghiệm và hoàn toàn trung thực. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 8 năm 2016 Lê Hoàng Khải
  3. LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công nghệ TP.HCM đã tạo điều kiện cho em được học tập tại trường. Xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến quý thầy, cô trong Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, những người đã tận tình chỉ dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu cho em, cho em được thỏa sức tìm tòi học hỏi những điều mới, dù có đi đâu làm gì, em vẫn luôn tự hào là đứa con của đại gia đình Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường. Con xin cảm ơn cha, mẹ và em trai, những người đã cho con ngày hôm nay. Gia đình đã luôn hỗ trợ tài chính, động viên tinh thần con trong suốt thời gian qua. Em xin gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Ngọc Hồng, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy cho em những kiến thức tuyệt vời, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cũng như kỹ năng sống. Được làm việc trong nhóm nghiên cứu của cô đối với em là một niềm vinh dự và hạnh phúc. Xin cảm ơn các bạn trong thể lớp 12DSH đã luôn giúp đỡ trong quá trình học tập, nghiên cứu và động viên tinh thần mình trong thời gian qua. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 8 năm 2016 Lê Hoàng Khải
  4. MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2 3. Mục đích nghiên cứu 2 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 3 5. Phương pháp nghiên cứu 3 6. Các kết quả đạt được của đề tài 4 7. Kết cấu của ĐATN 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Tổng quan về chi Adenosma sp.và loài Adenosma bracteosum Bonati 5 1.1.1. Tổng quan về chi Adenosma sp 5 1.1.2. Tổng quan về Nhân trần tía Adenosma Bracteosum Bonati 6 1.1.2.1. Tên khoa học 6 1.1.2.2. Đặc điểm thực vật và phân bố 7 1.1.2.3. Một số thành phần hóa học đã nghiên cứu 8 1.1.2.4 Hoạt tính sinh học 12 1.1.2.5 Một số bài thuốc từ Nhân trần 15 1.2. Định nghĩa về gốc tự do, stress oxy hóa và chất chống oxy hóa 15 1.2.1. Khái niệm về gốc tự do và stress oxy hóa 15 1.2.2. Chất chống oxy hóa 17 1.2.3. Tác hại của sự stress oxy hóa 18 i
  5. 1.2.3.1. Tác động lên DNA 18 1.2.3.2. Tác động lên protein 19 1.2.3.3. Tác động lên lipid 19 1.3. Hợp chất tự nhiên từ thực vật và hoạt tính sinh học 20 1.3.1. Terpenoid 20 1.3.1.1. Định nghĩa, phân loại 20 1.3.1.2. Nguồn gốc và ứng dụng 20 1.3.2. Steroid 22 1.3.2.1. Định nghĩa, phân loại 22 1.3.2.2. Nguồn gốc và ứng dụng 23 1.3.3. Polyphenol 24 1.3.3.1. Định nghĩa, phân loại 24 1.3.3.2. Nguồn gốc, ứng dụng 25 1.3.3.3. Flavonoid 25 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27 2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 27 2.1.1 Địa điểm 27 2.1.2 Thời gian thực hiện đề tài 27 2.2 Vật liệu 27 2.2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 27 2.2.2 Đối tượng thí nghiệm 27 2.2.3 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 27 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1. Xác định độ ẩm 30 2.3.2. Quá trình chiết và thu nhận cao chiết 31 2.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng cao thu được 33 2.3.4. Phương pháp định tính các thành phần hóa học trong Nhân trần tía 33 ii
  6. 2.3.5. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số 36 2.3.6. Phương pháp định lượng flavonoid tổng số 36 2.3.7. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH 37 2.3.8. Phương pháp xác định năng lực khử 38 2.3.9. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 39 2.3.10. Xác định độc tính cấp diễn 41 2.3.11. Đánh giá hoạt tính cao chiết trên chuột bạch ứng dụng trong mô hình ổn định lượng đường trong máu 42 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1. Thử độ ẩm của dược liệu 45 3.2. Khảo sát hàm lượng cao chiết 45 3.3. Định tính các thành phần hóa học có trong dịch chiết Nhân trần tía 47 3.4. Định lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết 54 3.5. Định lượng flavonoid tổng số 56 3.6. Xác định hoạt tính kháng gốc tự do DPPH 58 3.7. Xác định năng lực khử 60 3.8. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 62 3.8.1. Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao cồn và cao nước 62 3.8.2. Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao phân đoạn 63 3.9. Kết quả thử độc tính cấp diễn 64 3.10. Ảnh hưởng của dịch chiết Nhân trần tía lên lượng đường trong máu 65 3.10.1. Ảnh hưởng của việc uống glucose liều cao đến nồng độ đường trong máu của chuột 66 3.10.2. Ảnh hưởng của các loại cao chiết đến nồng độ đường trong máu 66 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 4.1. Kết luận 69 4.2. Kiến nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 iii
  7. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AG: Acid Gallic. AQ: aqueous (nước). BU: n-butanol. CH: chloroform. db: gam dược liệu khô. DMSO: Dimethyl sulfoxyde. DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl. EA: Ethyl acetate. ET: ethanol (cồn). GE: Gallic acid equivalent. HCTN: hợp chất tự nhiên. IC50: half maximal inhibitory concentration . RE: Rutin equivalent. RNS: Reactive Nitrogen Species ROS: Reactive Oxygen Species TFC: Total Flavonoids Content (Hàm lượng flavonoid tổng số). TPC: Total Polyphenols Content (Hàm lượng polyphenol tổng số). TPHH: thành phần hóa học. TSA: tryptone soya agar. TSB: tryptone soya broth. iv
  8. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các thành phần hóa học có trong tinh dầu Adenosma bracteosum Bonati 10 Bảng 1.2. Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học 16 Bảng 1.3. Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa DNA 18 Bảng 1.4. Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa protein 19 Bảng 1.5. Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa lipid 20 Bảng 2.1. Nồng độ khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết. 41 Bảng 2.2. Bảng tra nồng độ đường huyết. 44 Bảng 3.1. Độ ẩm dược liệu 45 Bảng 3.2. Khảo sát hàm lượng cao chiết theo dung môi. 45 Bảng 3.3. Khảo sát hàm lượng thu hồi sau khi chiết lỏng-lỏng cao cồn. 46 Bảng 3.4. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học 47 Bảng 3.5. Hình ảnh định tính thành phần hóa học. 48 Bảng 3.5. Kết quả đường chuẩn acid gallic 54 Bảng 3.6. Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số các cao chiết 55 Bảng 3.7. Bảng kết quả đường chuẩn Rutin 56 Bảng 3.8. Kết quả hàm lượng Flavonoid tổng số 57 Bảng 3.9. Độ hấp thụ quang ở bước sóng 700 nm tại nồng độ 25 g/ml 61 Bảng 3.10. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao tổng cồn và cao tổng cồn tại nồng độ 100 mg/ml. 62 Bảng 3.11. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của các cao phân đoạn. 63 Bảng 3.12. Kết quả thử độc tính cấp diễn 65 Bảng 3.13. Kết quả nồng độ lượng đường trong máu chuột 65 Bảng 3.14. Nồng độ đường trong máu của nhóm uống glucose liều cao 66 Bảng 3.15. Khả năng làm giảm đường huyết của dịch chiết Nhân trần tía lên đường huyết của nhóm chuột được uống đường glucose ở liều cao 67 v
  9. DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cây Nhân trần tía Adenosma Bracteosum Bonati 7 Hình 2.1. Sơ đồ tiến trình thí nghiệm 29 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình chiết cao chiết Nhân trần tía 31 Hình 2.3. Phản ứng quét gốc tự do DPPH 37 Hình 2.4. Phản ứng xác định năng lực khử. 39 Hình 2.5. Chuột bạch dùng cho thí nghiệm 42 Hình 3.1. Dung dịch dựng đường chuẩn acid gallic 54 Hình 3.2. Đường chuẩn acid gallic 54 Hình 3.3. Dung dịch Rutin chuẩn 56 Hình 3.4. Đường chuẩn Rutin 57 Hình 3.6. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của các cao chiết trong thí nghiệm quét gốc tự do DPPH. 59 Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện năng lực khử của các cao chiết. 61 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Gốc tự do được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của cơ thể là một tác nhân oxy hóa gây ra nhiều bệnh nguy hiểm như các bệnh về đường tim mạch, viêm gan, đục thủy tinh thể, lão hóa, đột biến gen gây ung thư Về mặt hóa học, gốc tự do rất kém bền nên dễ dàng tấn công các đại phân tử sinh học như protein, lipid, carbohydrate, DNA. Điều này dẫn đến sự rối loạn và mất cân bằng của các quá trình sinh hóa và là nguyên nhân chính gây ra nhiều loại bệnh tật. Do đó, việc tìm ra những hợp chất chống oxy hóa có khả năng ức chế các gốc tự do hoặc các quá trình gián tiếp sinh ra gốc tự do là điều cần thiết. Chất chống oxy hóa có thể có nguồn gốc từ thiên nhiên hoặc được tổng hợp hóa học. Tuy nhiên, những hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên có nhiều lợi thế hơn so với những hợp chất tổng hợp do hợp chất tổng hợp gây ra những phản ứng phụ như viêm gan và ung thư. Bên cạnh đó, những hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên đôi khi tác dụng dược lý tốt hơn. Ngoài ra vấn đề liên quan đến đường huyết luôn được mọi người quan tâm đến vì lượng đường trong máu dù tăng hay giảm đi so với mức bình thường thì sẽ tác động không tốt đến sức khỏe. Chứng tăng đường huyết ảnh hưởng trực tiếp đến bệnh đái tháo đường, là một trong những căn bệnh trước đây dân gian vẫn thường gọi là “bệnh của người giàu”. Tăng đường huyết chỉ biểu hiện ra ngoài bằng các triệu chứng lâm sàng khi vấn đề đường huyết đã nghiêm trọng. Các thói quen trong ăn uống không điều độ, chế độ dinh dưỡng quá nhiều đồ ngọt, đồ béo hoặc uống những loại thức uống có cồn như rượu, bia và ít hoạt động thể chất hay các hoạt động được lựa chọn cũng ảnh hưởng đến lượng đường trong máu và dần dần sẽ hình thành bệnh tiểu đường. Cây Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati từ lâu trong dân gian được sử dụng như là một vị thuốc với tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, lợi mật, tiêu độc, lợi tiểu, chữa cảm cúm, táo bón, bệnh vàng da Ngoài ra trong cây có chứa nhiều hợp flavonoid và 1
  11. Đồ án tốt nghiệp tinh dầu, đây là những hợp chất tự nhiên với nhiều hoạt tính sinh học nổi bật. Tuy nhiên, cho đến nay Nhân trần tía vẫn chỉ được xem là một vị thuốc Đông y, chưa có công trình nghiên cứu nào chứng minh một cách cụ thể nhất về các hoạt tính sinh học như kháng oxy hóa, điều trị tiểu đường, kháng khuẩn Do đó đề tài “Khảo sát hoạt tính sinh học của cây Nhân trần tía” được thực hiện, tạo tiền đề khoa học cho các sản phẩm ứng dụng từ nguồn dược liệu này. 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ❖ Những nghiên cứu trong nước: Nguyễn Viết Tựu và cộng sự (1975) đã phân tích hàm lượng tinh dầu trong cây Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati. Dương Thị Mộng Ngọc và cộng sự (2006) chứng minh cao toàn phần phối hợp giữa lá Đinh lăng và Nhân trần tía thể hiện tác động bảo vệ gan trên ba mô hình gây tổn thương gan bằng ethanol, tetraclorua và paracetamol. Nguyễn Đức Hạnh và cộng sự (2008) đã phân lập được một số hợp chất polyphenol trong Nhân trần tía. Vũ Mạnh Hùng và Bùi Thị Bích Vân (2008) đã xác định khả năng chống nhiễm độc gan do tác dụng phụ của Rifampicin bằng sản phẩm kết hợp giữa cao Nhân trần tía và Tảo Spirulina. ❖ Những nghiên cứu ngoài nước: Tsankova và cộng sự (1994) đã phân tích thành phần tinh dầu của Adenosma bracteosum Bonati bằng GS và GC/MS. 3. Mục đích nghiên cứu Định tính thành phần hóa học cây Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati. Xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid và khả năng kháng oxy hóa cao chiết từ cây Nhân trần tía. Xác định độc tính cấp diễn và hoạt tính làm ổn định đường huyết của cao chiết thô trên chuột bạch. 2
  12. Đồ án tốt nghiệp Đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của Nhân trần tía. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Nhiệm vụ 1: Nghiên cứu về cơ sở khoa học, tổng quan tài liệu vấn đề nghiên cứu, làm cơ sở cho các nhiệm vụ tiếp theo. Nhiệm vụ 2: Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm, thông qua các phương pháp xác định, khảo sát, phân tích. Nhiệm vụ 3: Thu nhận cao chiết toàn phần từ cây Nhân trần tía bằng dung môi nước và dung môi cồn; tách và thu nhận các cao phân đoạn từ cao chiết cồn. Nhiệm vụ 4: Định tính sơ bộ các thành phần hóa học. Nhiệm vụ 5: Xác định hàm lượng polyphenol tổng số, flavonoid tổng số của các cao chiết và cao phân đoạn từ cây Nhân trần tía. Nhiệm vụ 6: Đánh giá khả năng kháng oxy hóa thông qua nồng độ ức chế 50% gốc tự do DPPH, đánh giá năng lực khử của các cao chiết và cao phân đoạn. Nhiệm vụ 7: Xác định độc tính cấp diễn của cao chiết nước và cao chiết cồn. Nhiệm vụ 8: Đánh giá hoạt tính của cao chiết nước và cao chiết cồn trên mô hình động vật ổn định lượng đường trong máu. Nhiệm vụ 9: Đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết và cao phân đoạn. 5. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu thu thập tài liệu: các tài liệu về cây Nhân trần tía, sơ bộ thành phần hóa học của cây Nhân trần tía, các phương pháp xác định hàm lượng các hợp chất thứ cấp, mô hình đánh giá khả năng kháng oxy hóa, kháng khuẩn. Phương pháp xác định độc tính cấp diễn, mô hình thử nghiệm hoạt tính hạ đường huyết trên chuột bạch. Phương pháp làm thí nghiệm: tiến hành làm các thí nghiệm nhằm giải quyết các nhiệm vụ nghiên cứu. 3
  13. Đồ án tốt nghiệp Phương pháp xử lý số liệu bằng toán học và phân tích phương sai ANOVA bằng phần mềm SAS 9.4: các số liệu thu được sẽ được xử lý nhằm đưa ra kết luận cho đề tài. 6. Các kết quả đạt được của đề tài Thu nhận được cao chiết nước và cao chiết cồn từ cây Nhân trần tía bằng phương pháp ngâm dầm, thu nhận các cao phân đoạn từ cao tổng cồn qua quá trình chiết lỏng – lỏng. Xác định được hàm lượng của các cao chiết và cao phân đoạn. Định tính sơ bộ các thành phần hóa học trong cây Nhân trần tía. Định lượng được hàm lượng polyphenol tổng số, flavonoid tổng số của các cao chiết và cao phân đoạn. Tìm ra giá trị IC50 của các cao chiết trên mô hình DPPH, xác định giá trị hấp thu của các cao chiết trên mô hình năng lực khử. Xác định sử dụng cao chiết với liều 3000 mg/kg thể trọng không gây độc cho chuột bạch. Chứng minh khả năng giúp làm ổn định đường huyết trên chuột bạch của cao nước và cao cồn. Đánh giá sơ bộ khả năng kháng khuẩn của các cao chiết từ Nhân trần tía. 7. Kết cấu của ĐATN Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4
  14. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về chi Adenosma sp.và loài Adenosma bracteosum Bonati 1.1.1. Tổng quan về chi Adenosma sp. Chi Adenosma sp. (hay còn được gọi là Chi Tuyến hương, Nhân trần) được xếp vào Họ Scrophulariaceae. Là loài cỏ mọc hằng năm, có mùi thơm, có khoảng 15 loài phân bố ở khu vực Bắc Á, Đông Nam Á, Trung Quốc và quần đảo Thái Bình Dương. Theo Phạm Hoàng Hộ (1999) và Đỗ Tất Lợi (2004), Việt Nam có sự phân bố của nhiều loài trong chi Adenosma sp. bao gồm: - Adenosma annamensis Yam. (Tuyến hương Trung bộ). Cây thân cỏ cao khoảng 30-40 cm, phiến lá xoăn và có lông thưa, có hoa ở nách lá, mọc chủ yếu ở Quảng Nam và Đà Nẵng. - Adenosma bracteosum Bonati (Tuyến hương lá bắc, Nhân trần tía). Thân và cành có màu tím đỏ, cụm hoa nằm ở ngọn có những lá bắc lợp lên nhau, dạng màng, trong suốt. Mọc nhiều ở miền nam Việt Nam và rãi rác ở Campuchia , Lào. - Adenosma caeruleum R. Br. (Nhân trần nam, Hoắc hương núi, Tuyến hương lam). Thân thảo cao tới gần 1 m. Lá phía dưới mọc đối, lá phía trên có khi mọc so le, hình trái xoan nhọn. Thân màu tía hay lam, chia 2 môi, nhị 4, bầu có vòi nhuỵ hơi dãn ra ở đỉnh. Quả nang dài hình trứng, có mỏ ngắn nở thành 4 van. Hạt nhiều, bé, hình trứng. Mùa hoa quả tháng 4 – 9. Phân bố nhiều ở miền bắc Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Thái Lan. - Adenosma hirsuta (Miq.) Kurz. (Tuyến hương phún). Thân thảo cao hơn 1 m, có nhiều lông, lá hình bầu dục, hai mặt lá nhiều lông. Mọc nhiều ở vùng Tây Nguyên, rãi rác ở Đông Nam Bộ. - Adenosma indiana (Lour.) Merr. (Nhân trần hoa đầu, Nhân trần bồ bồ, Tuyến hương Ấn). Thân hình trụ, cành non mang nhiều lông về sau nhẵn, lúc đầu thân màu xanh sau chuyển sang màu tím nhạt, chiều cao cây 70 cm đến 100 cm. Lá mọc đối, phiến lá hình mác, đầu nhọn, mép lá có răng cưa, gân lá hình lông chim, mặt trên mang 5
  15. Đồ án tốt nghiệp nhiều lông hơn mặt dưới, chiều dài lá 5 cm - 8 cm, rộng lá 2 cm - 4 cm. Rễ thuộc loại rễ chùm, có nhiều lông tơ nhỏ màu trắng, rễ dài 10 - 18 cm. Hoa nhỏ, màu tím, mọc tụ tập thành đầu nang, đài có lông với hai môi, môi trên nguyên, môi dưới xẻ bốn. Tràng cánh hợp với hai môi, môi trên xẻ bốn, môi dưới nguyên,bốn nhị có hai chiếc dài, hai chiếc ngắn. Quả thuộc loại quả nang nằm gọn trong đài hoa. Nhiều hạt nhỏ, hình trứng thuôn, có nhiều gai, màu cánh gián. Loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. phân bố chủ yếu ở Ấn Độ, Myanma, Nam Trung Quốc, Campuchia, Lào, Việt Nam, Thái Lan. - Adenosma javanica (Bl.) Kds. (Tuyến hương java). Loài cỏ cứng, bò dưới mặt đất, nhánh dài 0,2 - 0,4 m. Lá có phiến tròn, thon, dài 1 - 5 cm, có lông phún. Hoa mọc ở nách lá. Mọc rãi rác một số nơi ở Việt Nam như Quảng Ninh, Kon Tum. Trong đó ba loài Adenosma bracteosum Bonati, Adenosma caeruleum R. Br. Adenosma indiana (Lour.) Merr. là mọc phổ biến nhất ở Việt Nam. Mặc dù cả ba loài này đã dùng từ lâu trong Y học cổ truyền như một loại dược liệu giúp giải độc, mát gan nhưng lại có rất ít công trình nghiên cứu về chúng. Chỉ mới có một số công trình nghiên cứu về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của Adenosma caeruleum (De Abreu và cộng sự, 2009; Adam và cộng sự, 1992; Nguyễn Hoàng Tuấn, 2000) và thành phần hóa học loài Adenosma indiana (Dương Hồng Nhung, 2015). Hiện tại loài Adenosma bracteosum chỉ mới dừng lại ở việc khảo sát thành phần tinh dầu (Tsankova và cộng sự, 1994) và một số hợp chất polyphenol (Nguyễn Đức Hạnh và cộng sự, 2008). 1.1.2. Tổng quan về Nhân trần tía Adenosma Bracteosum Bonati 1.1.2.1. Tên khoa học Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Lamiales Họ: Scrophulariaceae 6
  16. Đồ án tốt nghiệp Chi: Adenosma Loài: Adenosma bracteosum Bonati (Nhân trần tía, Nhân trần Tây Ninh, Tuyến hương lá bắc). 1Hình 1.1. Cây Nhân trần tía Adenosma Bracteosum Bonati 1.1.2.2. Đặc điểm thực vật và phân bố Theo Dược Điển Việt Nam III (2002), Đỗ Tất Lợi (2004) và Phạm Hoàng Hộ (1999) thì cây Nhân trần tía thuộc loại cây thân thảo, rất thơm, cao 20 – 30 cm; ít phân nhánh. Thân có 4 cạnh, nhẵn hoặc có lông tuyến rải rác. Cành màu tím đỏ. Lá cây có hình phiến thon, dài 2 – 2,5 cm, rộng 6 – 8 mm, nửa ôm thân, mép hơi có răng nhọn ở nửa trên, mặt dưới có ít lông và có tuyến, khi khô rất dễ rụng. Cụm hoa nhân trần Tía có hình trụ, mọc ở đầu cành. Đài hoa có 5 lá đài hình tim nhọn, kích thước không đều, rời nhau, có lông rậm và có tuyến ở mép. Tràng hoa cao 5 mm, màu lam, có lông rải rác ở mặt ngoài, môi trên tròn, môi dưới dài bằng môi trên và chia thành 3 thùy hình 7
  17. Đồ án tốt nghiệp trứng. Cây có quả dạng quả nang, hình trứng, đôi khi thuôn dài, cao 3 mm. Quả không lông, màu nâu và có nhiều hạt. Nhân trần tía đang được trồng và mọc hoang tại Campuchia, Lào và miền nam Việt Nam. Cây thường mọc vào mùa mưa trên đất sét ẩm, các bờ ruộng ở độ cao 300 - 800 m. Cây thường mọc thành đám có khi tới hàng chục mét vuông trên những bãi đất bằng dưới chăn đồi, trong thung lũng hay những đám ruộng cao bỏ hoang. Ở những nơi đất ít dinh dưỡng thì cây chỉ cao 15 cm đã thấy có hoa và quả. Cây mọc tốt trên đất có phèn ở vùng thấp và dọc đường đi một số nơi từ Kontum, Đắk Lắk tới Tây Ninh, Thành phố Hồ Chí Minh (Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2004). Nhân trần tía chỉ gặp vào thời gian từ giữa mùa mưa đến đầu mùa khô hằng năm. Cây bắt đầu mọc vào tháng 6 và ra hoa vào khoảng tháng 10 - 11, tàn lụi vào tháng 12. Cây ưa táng, ưa ẩm và có thể chịu được khô hạn sau khi đã ra hoa, kết quả. Sau khi quả già, toàn cây tàn lụi. So với các loài khác thuộc chi Adenosma sp., thì Nhân trần tía có vòng đời ngắn hơn, chỉ tồn tại 5 - 6 tháng nên mức độ khai thác và sử dụng ít hơn. 1.1.2.3. Một số thành phần hóa học đã nghiên cứu ❖ Thành phần hóa học của một số loài trong chi Adenosma sp. ➢ Adenosma caeruleum Adenosma caeruleum R. Br. có chứa monoterpenoid peroxyde (Adam, 1992), betulinic acid, arbutin, aucubin, β-sitosterol, stigmasterol, campesterol, adenosmoside, crenatoside, verbascoside, cistanoside F, campneoside I, campneoside II, apigenin 7-O- β-D-glucuronopyranoside, apigenin 7-O-β-D-glucopyranoside (De abreu, 2009). Năm 1975, Lê Tùng Châu và cộng sự phân tích trong Adenosma caeruleum R.Br. có saponin triterpenoid, flavonoid, acid nhân thơm, coumarin và tinh dầu. Cả cây o o có 1% tinh dầu, hoa có 1,86% tinh dầu tỷ trọng 0,8042 (25 ) nD=1,4705 (20 ) (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2004). ➢ Adenosma indiana 8
  18. Đồ án tốt nghiệp Năm 1939, F. Guichard và J. Clemensat phân tích loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dưới định danh Nhân trần và thấy 1,67% kali nitrat, một saponin có chỉ số bọt 2.600, một glucozit tan trong axeton, trong ete, không tan trong nước, khoảng 0,7% tinh dầu. Tinh dầu của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr lỏng, màu vàng, mùi hăng gần giống như mùi long não và bạc hà, vị nóng; tan trong methanol, ethanol, chloroform và các dung môi hữu cơ khác. Thành phần chủ yếu của tinh dầu 20% hợp chất oxy tan trong dung dịch reorcin. Chỉ số acid 1,4; chỉ số xà phòng hóa 11,5; chỉ số axetyl hóa 38; chỉ số iot 121,4 (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2004). Năm 1950, P.V. Nair và cộng sự đã chưng cất được từ loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. 1% tinh dầu và đã phân tích thấy có 5L.monoterpen và 2D.secquiterpen trong đó có 38,5% cineol. Ngoài ra còn thấy saponin triterpenoid, flavonoid, acid nhân thơm, coumarin và tinh dầu (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2004). Vào năm 2015, Dương Hồng Nhung đã phân lập được từ Adenosma indiana (Lour.) Merr. các hợp chất 2-(4’-hydroxyphenyl)etyl triacontanoat, β-sitosterol glucosid, acid betulinic. ❖ Thành phần hóa học của Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati ➢ Tinh dầu: Nguyễn Viết Tựu và cộng sự phân tích thấy trong Adenosma bracteosum Bonati có 0,25% tinh dầu, màu vàng sẫm, tỷ trọng 0,890, chỉ số khúc xạ 1,496, sắc ký khí thấy 19 peak trong đó có 5 peak lớn cineol khoảng 18% (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2004). Tsankova và cộng sự (1994) đã phân tích tinh dầu của Adenosma bracteosum Bonati bằng GS và GC/MS thấy một số hợp chất chính gồm thymol (25.6%), linalool (13.1%) và (E)-β-farnesene (9.5%). Ngoài ra còn có sự hiện diện của carvacrol, đây là một tinh dầu kháng khuẩn mạnh và có khả năng chống ung thư (Can Baser, 2008; Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2004). 9
  19. Đồ án tốt nghiệp 1 Bảng 1.1. Các thành phần hóa học có trong tinh dầu Adenosma bracteosum Bonati (Tsankova và cộng sự, 1994; Đỗ Tất Lợi, 2004) STT Tên chất Công thức 1 -terpinene 2 p-cymene 3 menthone 4 camphor 5 Linalool 10
  20. Đồ án tốt nghiệp 6 Borneol 7 α-humulene 8 -caryophyllene 9 (E)-β-farnesene 10 Thymol 11
  21. Đồ án tốt nghiệp 11 thymol methyl ether 12 carvacrol 13 Cineol ➢ Polyphenol và Flavonoid Nguyễn Đức Hạnh và cộng sự (2008) đã phân lập và tách chiết các hợp chất polyphenol trong Nhân trần tía. Ngoài ra, bằng cách sử dụng phổ UV, IR và NMR, họ đã phân lập, 1 flavon lạ được phân lập và xác định cấu trúc là scutellarein-6-O- glycoside. Scutellarein đã được biết đến trong tự nhiên nhưng đây là lần đầu tiên các nhà khoa học đã phân lập và xác định được scutellarein-6-O-glycoside hiện diện trong Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati của Việt Nam. 1.1.2.4 Hoạt tính sinh học ❖ Hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Adenosma sp. 12
  22. Đồ án tốt nghiệp Lê Tùng Châu và Nguyễn Viết Tựu (1975) đã có một số nghiên cứu về hoạt tính sinh học của những loài thuộc chi Adenosma sp. ở Việt Nam (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2004). Bao gồm: - Tác dụng trên gan mật: các loài thuộc chi Adenosma sp. có tác dụng làm tăng tiết dịch mật, thúc đẩy quá trình bài xuất dịch mật. Đồng thời giúp bảo vệ tế bào gan, tăng cường chức năng giải độc của gan, phòng chống tích cực tình trạng gan nhiễm mỡ. Nhân trần bồ bồ có tác dụng sinh học học mạnh hơn Nhân trần nam. - Tác dụng chống viêm: các loài thuộc chi Adenosma sp.có tác dụng giải nhiệt, giảm đau, chống viêm. Tác dụng chống viêm ở giai đoạn cấp tính mạnh hơn mãn tính. Thử nghiệm trên 3 mô hình (mô hình kaolin, mô hình u hạt, mô hình teo tuyến ức), kết quả Nhân trần nam và Nhân trần bồ bồ có tác dụng kháng viêm trên cả 3 mô hình. - Tác dụng kháng khuẩn: dịch chiết từ các loài thuộc chi Adenosma sp. có khả năng ức chế một số vi khuẩn. Cao cồn và cao nước của Nhân trần bồ bồ có tác dụng ức chế sự phát triển của các khuẩn Shigella dyseteriae, Shigella shigae, Staphylococus aureus 209 P và Streptococcus hemolyticus S84. Khả năng kháng khuẩn của Nhân trần nam kém hơn Nhân trần bồ bồ, nhất là với trực khuẩn lỵ. Nhưng Nhân trần nam ức chế mạnh hơn với Staphylococus và Streptococcus. - Tác dụng trên tuần hoàn: làm hạ huyết áp, điều chỉnh rối loạn lipit máu, cải thiện lưu lượng tuần hoàn nuôi tim và não. - Ứng dụng trên lâm sàng: các loài thuộc chi Adenosma sp. được sử dụng để điều trị các bệnh viêm gan, truyền nhiễm cấp tính thể vàng da, vàng da tán huyết do thương hàn ở trẻ sơ sinh, giun chui ống mật, rối loạn lipit máu, thiểu năng mạch vành, viêm loét miệng, nấm da - Độc tính cấp: Nhân trần nam và Nhân trần bồ bồ không gây độc. Guichard và Clemensat (1939) đã nghiên cứu tác dụng của diệt giun của Nhân trần nam và Nhân trần bồ bồ. Tinh dầu và nước cất từ Nhân trần bồ bồ có tác dụng diệt giun đất, giun đũa và giun móc. Giun đất sau khi tiếp xúc với thuốc sẽ quần quại trong 13
  23. Đồ án tốt nghiệp vòng 10 – 15 phút rồi chết, còn giun đũa phải sau 2 – 3 giờ mới chết. Thí nghiệm trên giun đũa của lợn (Ascaris suum) sơ bộ thấy Nhân trần nam có tác dụng tốt (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2004). Nguyen Bich Thu và cộng sự (2010) đã chứng minh Nhân trần nam Adenosma caeruleum có khả năng các dòng tế bào ung thư phổi A54, ung thư vú MCF-7, ung thư gan HepG2 và dòng tế bào fibrosarcoma người HT 1080 bằng phương pháp MTT; với chỉ số IC50 từ 2.0 – 3.3 µg/ml. ❖ Hoạt tính sinh học của Nhân trần tía Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati đã được dùng trong y học cổ truyền để phòng ngừa và chữa trị các bệnh lý về tiêu hóa và gan mật. Đây là loại thực vật gây được sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế gỉới do khả năng phòng chống viêm gan, chữa viêm gan virus, bảo vệ gan trước các hóa chất hóa độc hại (Nguyễn Đức Hạnh, 2008). Cây thường được sử dụng trong dân gian với tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, lợi mật, tiêu độc, lợi tiểu, chữa cảm cúm, táo bón, bệnh vàng da Tác dụng tăng tiết mật thí nghiệm trên chuột lang cho thấy dịch chiết Nhân trần tía làm tăng tiết mật 24.7% so với lô đối chứng. Độc tính cấp Cho chuột uống với liều 300 mg/kg thể trọng dịch chiết nước không thấy chuột lang chết. Chữa viêm gan virus trên lâm sàng Bệnh viện Chợ Quán thành phố Hồ Chí Minh đã dùng Nhân trần tía chữa trị viêm gan virus cho các bệnh nhân, kết quả số bệnh nhân khỏi hẳn là 24%, số bệnh nhân có chuyển biến khá và tốt là 46.6% (Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2004). Protecliv là một sản phẩm thuốc được bào chế từ 50% cao Nhân trần tía và 50% Tảo Spirulina có tác dụng chống nhiễm độc gan do tác dụng phụ của Rifampicin và các dẫn xuất Rifampicin (INH và RIF) ở các bệnh nhân phải điều trị bệnh lao bằng các loại thuốc này (Vũ Mạnh Hùng và Bùi Thị Bích Vân, 2008). 14
  24. Đồ án tốt nghiệp Cao toàn phần phối hợp giữa lá Đinh lăng và Nhân trần Tây Ninh thể hiện tác động bảo vệ gan trên ba mô hình gây tổn thương gan bằng ethanol, tetraclorua và paracetamol (Dương Thị Mộng Ngọc và cộng sự, 2011). 1.1.2.5 Một số bài thuốc từ Nhân trần Ở miền nam, dược liệu mang tên Nhân trần chủ yếu là Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati. Nhưng trong Y học cổ truyền Việt Nam chưa có sự phân biệt rõ ràng cách sử dụng, do đó cả ba loại Nhân trần nam Adenosma caeruleum R. Br., Nhân trần bồ bồ Adenosma indiana (Lour.) Merr., Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati thường được dùng như là cùng một loại dược liệu. Theo Đỗ Tất Lợi (2004), dược liệu Nhân trần được dùng trong các bài thuốc sau: - Trong thú y, người ta dùng Nhân trần bồ bồ chữa bệnh trâu bò đi tiêu ra phân trắng. Ngày dùng 4 – 6 g, có khi tới 20 g dưới hình thức thuốc sắc, thuốc pha hay thuốc viên. - Chữa sốt vàng da, ra mồ hôi ở đầu mà người không có mồ hôi, miệng khô, tiểu tiện khó khăn, bụng đầy (Nhân trần cao thang) Nhân trần nam hoặc Nhân trần bồ bồ 24 g, Chi tử (Dành dành) 12 g, Đại hoàng 4 g, nước 800 ml, sắc còn 250 ml chia 3 lần uống trong ngày. - Viêm gan vàng da có sốt Bạch hoa xà thiệt thảo 0,5 kg, Nhân trần 150 g, Sinh cam thảo 50 g. Mỗi ngày dùng 60 g hỗn hợp này đun với nước cho sôi trong bình kín, sau 15 phút thì lấy ra dùng. - Người miền Bắc hay sử dụng cây Nhân trần và Cam thảo dùng làm nước uống giải nhiệt hằng ngày có tác dụng hỗ trợ điều trị viêm gan, rối loạn tiêu hóa, phòng chống ung Dùng 80 g Nhân trần với 40 g Cam thảo dùng với 3000 ml nước, sắc cho ra nước màu nâu đậm để nguội uống thay nước. 1.2. Định nghĩa về gốc tự do, stress oxy hóa và chất chống oxy hóa 1.2.1. Khái niệm về gốc tự do và stress oxy hóa Gốc tự do là các phân tử hay nguyên tử có lớp ngoài cùng chỉ chứa điện tử độc 15
  25. Đồ án tốt nghiệp thân. Vì chỉ có một điện tử đơn lẻ nên gốc tự do luôn ở trạng thái bất ổn và tìm cách chiếm lấy điện tử của các nguyên tử khác. Các gốc tự do hoạt động chứa oxy là các dẫn xuất dạng khử của oxy phân tử (Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư, 2009). Các “gốc tự do” hay nói chính xác hơn là các chất hoạt động chứa oxy và nitơ (Reactive Oxygen Species - ROS và Reactive Nitrogen Species - RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nitơ phân tử. Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các “gốc tự do” và các dẫn xuất không phải gốc tự do. Các “gốc tự do” là các phân tử hoặc nguyên tử có một hoặc nhiều điện tử độc thân. Các dẫn xuất không phải gốc tự do như oxy đơn, hydroperoxyde, nitroperoxyde là tiền chất của các gốc tự do. 2 Bảng 1.2. Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học (Wallace, 1997; Puri, 2014) ● Gốc superoxyde O2 ●OH Gốc hydroxyl ROO● Gốc peroxyde H2O2 Hydrogenperoxyde 1 O2 Oxy đơn NO● Oxyde nitrice ONOO- Peroxynitrite HOCl Acid hypochlorique ❖ Nguồn gốc phát sinh gốc tự do: Nguồn nội sinh: Gốc tự do được chính cơ thể tạo ra bởi những quá trình sinh lý như quá trình hô hấp ở tế bào, hoặc các quá trình bệnh lý như quá trình viêm nhiễm, hoặc bởi hệ thống enzyme thân oxy hóa (prooxydant enzyme), ion kim loại chuyển tiếp trong cơ thể. 16
  26. Đồ án tốt nghiệp Nguồn ngoại sinh: Ngoài những yếu tố nội sinh, gốc tự do còn được hình thành trong cơ thể bởi các yếu tố ngoại sinh như sự ô nhiễm môi trường, bức xạ, khói thuốc lá, sử dụng thuốc giảm đau quá liều, uống nhiều rượu bia Khi nồng độ thấp, các gốc tự do là các tín hiệu làm nhiệm vụ điều hoà quá trình chết theo chu trình của tế bào (apoptosis), kích hoạt các yếu tố phiên mã cho các gen tham gia vào quá trình miễn dịch, kháng viêm, điều hoà các gen mã hóa cho các enzyme chống oxy hóa. Khi nồng độ cao, các gốc tự do gây ra sự phá hủy các đại phân tử sinh học dẫn đến nhiều bệnh nghiêm trọng. Stress oxy hóa là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do và hoạt động của các chất chống oxy hóa gây tác động xấu đến cơ thể sinh vật. 1.2.2. Chất chống oxy hóa Các chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể (Jovanovic và Simic, 2000). Dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được phân thành hai loại các chất chống oxy hóa bậc một và các chất chống oxy hóa bậc hai. Các chất chống oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với các gốc tự do do đó kìm hãm pha khởi phát hoặc bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quá trình oxy hóa. Các chất chống oxy hóa bậc hai kìm hãm sự tạo thành các gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo gốc tự do như Cu, Fe; vô hoạt oxy đơn) (Singh và Rajini, 2004). Hệ thống các chất chống oxy hóa của cơ thể người được cung cấp bởi hai nguồn bên trong và bên ngoài. Các chất chống oxy hóa bên trong bao gồm các protein (ferritine, transferrine, albumine, protein sốc nhiệt) và các enzyme chống oxy hóa (superoxyde dismutase, glutathion peroxydase, catalase). Các chất chống oxy hóa bên ngoài là các cấu tử nhỏ được đưa vào cơ thể qua con đường thức ăn và đó chủ yếu là các hợp chất tự nhiên. Các chất này có nhiều trong rau và quả. Chúng được coi là các chất chống oxy hóa tự nhiên. Việc sử dụng nhiều rau quả là con đường đơn giản 17
  27. Đồ án tốt nghiệp và hữu hiệu nhất để tăng cường hoạt động của hệ thống chống oxy hóa và ngăn ngừa các bệnh có nguồn gốc stress oxy hóa (Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư, 2009). 1.2.3. Tác hại của sự stress oxy hóa 1.2.3.1. Tác động lên DNA Hydroxyl là gốc tự do có khả năng phá hủy DNA mạnh nhất, thường là qua con đường biến đổi các base hay phân cắt chuỗi DNA. Sợi đôi DNA bị bẽ gãy sẽ gây ra hiện tượng chết tế bào. Bản thân superoxyd không tương tác với DNA nhưng có khả năng khử Fe3+ thành Fe2+ xúc tác phản ứng Fenton, khởi đầu cho sự phá hủy DNA. Mặt khác, gốc perhydroxyl có thể lấy đi nguyên tử 5’-hydrogen từ vòng deoxyribose và cơ chế này có thể chuyên biệt cho phản ứng của HOO● (Dix và cộng sự, 1996). 3 Bảng 1.3. Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa DNA (Cooke và cộng sự, 2003) Cơ quan Bệnh Máu Bạch cầu cấp; Rối loạn đường huyết; Thiếu máu Hệ thống thần Parkinson; Alzheimer; Đa xơ cứng gây tê liệt dần; Teo cơ; Mất kinh – não bộ điều hoà. Phụ khoa Các loại ung thư thuộc phụ khoa; Ung thư cổ tử cung; Ung thư vú. Gan Nhiễm virus viêm gan C (HCV); Xơ gan mãn tính; Ung thư tế bào biểu mô thận Phổi Xơ hóa nang; Ung thư tế bào biểu mô; Ung thư phổi Da Viêm da phân bào; Vẩy nến da; Ung thư da Dạ dày Ung thư dạ dày Một số bệnh Lão hóa; Đái tháo đường; Hội chứng Down; Viêm thấp khớp; khác Rối loạn tim mạch; Ung thư trực tràng; Ung thư tế bào biểu mô thận 18
  28. Đồ án tốt nghiệp 1.2.3.2. Tác động lên protein Sự oxy hóa protein diễn ra do sự biến đổi các protein gây ra trực tiếp bởi các gốc tự do hoặc gián tiếp do các sản phẩm thứ cấp của stress oxy hóa. Có rất nhiều cơ chế gây ra sự oxy hóa protein cũng như toàn bộ chuỗi acid amin đều có thể bị oxy hóa, do đó gây ra một số lượng rất lớn các protein bị biến đổi. Hai acid amin dễ bị tác động nhất là cystein và methionin do cả hai chứa nguyên tử sulfur linh hoạt, hầu như tất cả các tác nhân oxy hóa đều có thể oxy hóa hai acid amin này. Trong khi ở các acid amin khác, sự oxy hóa cần các điều kiện nghiêm ngặt hơn. Cách oxy hóa hiệu quả nhất là tấn công thông qua xúc tác kim loại ở các vị trí chuyên biệt, trong đó các dạng khử của kim loại chuyển vị liên kết với protein sẽ khử H2O2 thành dạng trung gian hoạt động (Shacter, 2000). 4 Bảng 1.4. Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa protein Protein bị oxy hóa Bệnh Carbonyl; Glutamine synthetase Lão hóa; Alzheimer; Thiếu máu cục bộ IgG Viêm thấp khớp Protein não Thiếu máu cục bộ Protein thủy tinh thể Đục thủy tinh thể Protein cơ Teo cơ Một số protein chưa biết Lão hóa; Parkinson; Xơ vữa động mạch; Viêm phổi mãn tính 1.2.3.3. Tác động lên lipid Sự oxy hóa lipid bị gây ra bởi nhiều tác nhân và sự cân bằng giữa các tác nhân này bao gồm một hệ thống dựa trên dung môi, nồng độ và thành phần acid béo, nhiệt độ, áp suất oxy, đặc biệt là các nguồn hydrogen (Denisov, 2005). 19
  29. Đồ án tốt nghiệp 5 Bảng 1.5. Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa lipid (Adibhatla, 2010) Cơ quan Bệnh Thần kinh Azheimer; Parkinson; Teo cơ; Đa xơ cứng; Tâm thần phân liệt; Tổn thương dây thần kinh cột sống; Thoái hóa Tim mạch hệXơ thần vữa kinh;động Độngmạch; kinhNhồi máu cơ tim Thận Phù hạch bạch huyết mãn tính; Viêm thận mãn tính Gan Gan nhiễm mỡ; Xơ gan; Ung thư gan; Kháng insulin ngoại vi; Nhiễm virus viêm gan C Một số cơ quan khác Viêm; Tiểu đường; Ung thư; Lão hóa 1.3. Hợp chất tự nhiên từ thực vật và hoạt tính sinh học Qua khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của Nhân trần tía, nhận thấy thành phần chủ yếu của loài này terpenoid, steroid và polyphenol, do đó xin được giới thiệu thông tin sơ bộ về các nhóm họp chất này. 1.3.1. Terpenoid 1.3.1.1. Định nghĩa, phân loại Terpenoid (hay isoprenoid) là một nhóm các hợp chất tự nhiên (HCTN) hình thành do sự kết hợp của các đơn vị isopren mang 5C, chiếm số lượng lớn (>35000 chất) trong các nhóm HCTN và có cấu trúc rất đa dạng. Tùy theo số đơn vị isopren có trong phân tử, người chia thành các nhóm hemi- (1 đơn vị isopren và 5C), mono- (2 đơn vị và 10C), sesqui- (13 đơn vị và 15C), di- (4 đơn vị và 20C), sester- (5 đơn vị và 25C), tri- (6 đơn vị và 30C), tetra- (8 đơn vị và 40C) và polyterpenoid (>8 đơn vị isopren và >40C) (Nguyễn Diệu Liên Hoa và Phạm Đình Hùng, 2015). 1.3.1.2. Nguồn gốc và ứng dụng Terpenoid được tìm thấy rộng rãi với số lượng lớn trong thực vật bậc cao, ở tất cả bộ phận của cây như hoa, lá, hạt, rễ , gỗ và cũng xuất hiện ở rêu, tảo, địa y, đĩa tiễn. Một số nguồn gốc từ động vật (đặc biệt là côn trùng) và vi khuẩn. 20
  30. Đồ án tốt nghiệp Mono- và sesquiterpenoid là thành phần chính của tinh dầu, dễ bay hơi và có mùi thơm, tìm thấy trong nhựa cây. Tuy nhiên các di- và sesquiterpenoid tồn tại ở dạng glycosid hay ester với acid béo thì không bị lôi cuốn theo hơi nước. Di- và triterpenoid có trong nhựa cây và không bị lôi cuốn theo hơi nước. Sesterterpenoid hiếm gặp. Tetraterpenoid chủ yếu là các sắc số tự nhiên, tiêu biểu nhất là carotenoid. Terpenoid từ lâu đã được dùng trong mỹ phẩm, xà phòng, hương liệu, dược phẩm, chất khử trùng. Terpenoid sở hữu khả năng kháng oxy mạnh, nhờ đó chúng có khả năng bảo vệ cơ thể khỏi sự tác động của stress oxy hóa, nhất là một số căn bệnh như viêm gan, thận, thần kinh, bệnh tim mạch, ung thư, tiểu đường, lão hóa. Trong phạm vi đề tài xin được giới thiệu một hoạt tính sinh học tiêu biểu của nhóm chất này. - Kháng khuẩn: trong chi Nhân trần có sự hiện diện của p-cymen, carvacrol, thymol là các monoterpenoid một vòng; carvacrol, thymol là 2 chất kháng khuẩn mạnh được dùng làm thuốc sát khuẩn trong nha khoa. Một thành phần khác là camphor thuộc dạng monoterpenoid hai vòng, có mùi thơm và thể hiện khả năng kháng khuẩn, được dùng trong nước hoa. Cơ chế chính được cho terpenoid đã làm rối loạn thành phần màng tế bào vi khuẩn, dẫn đến sự thay đổi tính thấm và làm rò rĩ tế bào chất, ngoài ra sau khi xâm nhập vào trong tế bào vi khuẩn, các hợp chất này tiếp tục gây hư hại các cấu trúc sinh học của vi khuẩn (Trombetta, 2005). - Chất chống oxy hóa: những hợp chất monoterpenoid trong cấu trúc có nhóm methylene như terpinolene, α-terpinene, -terpinene và sabinene có tính kháng oxy hóa mạnh; những monoterpenoid có cấu trúc phenol như thymol và carvacrol cũng thể hiện khả năng kháng oxy hóa. Khả năng kháng oxy hóa khả quan nhất là ở nhóm tetraterpenoid, thể hiện mạnh nhất ở các carotenoid (α-carotene, -carotene, lutein, zeaxanthin, -cryptoxanthin, lycopene) (Gonzalez-Burgos và Gomez-Serranillos, 2012). - Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng hổ trợ điều trị tiểu đường của terpenoid thông qua việc làm giảm stress oxy hóa. Nhiều báo cáo thu được kết quả khả 21
  31. Đồ án tốt nghiệp quan trên mô hình động vật mang gen tiểu đường và mô hình chuột gây độc bằng alloxan và streptozotocin. Nhiều nghiên cứu dịch tễ học cũng được tiến hành, tập trung vào chế độ ăn giàu carotenoid. Ở những monoterpenoid, nổi bật là catapol với khả năng bảo vệ não khỏi bệnh tật trong khi mắc bệnh đái tháo đường, aucubin tác động lên tuyến tụy để điều khiển bệnh, loganin và morroniside làm giảm hoạt động của ROS, logarin bảo vệ gan khỏi tác động của bệnh tiểu đường. Những sesquiterpenoid như costunolide, eremanthin thể hiện khả năng chống stress oxy hóa trong mô hình chuột streptozocin thông qua cơ chế làm tăng các enzyme chống oxy hóa như SOD, CAT, GPx và các chất chống oxy hóa phi enzyme như GSH. Một số triterpenoid như arjunolic acid và glycyrrhizin, ginsenoside là những hợp chất chống lại bệnh tiểu đường rất mạnh. Carotenoid một lần nữa thể hiện khả năng dược lý, một nhóm bệnh nhân tiểu đường type 2 cho cho sử dụng chế độ ăn giàu caraotenoid lycopene đã làm giảm nguy cơ tim mạch cho những bệnh nhân này. Trên mô hình chuột tiểu đường type 2, astaxanthin giúp giảm stress oxy hóa gây ra bởi nồng độ đường cao (Gonzalez- Burgos và Gomez-Serranillos, 2012). - Chống tế bào ung thư: betulinic acid là một triterpenoid tiêu biểu có trong chi Adenosma sp., betulinic acid được biết tới như là một chất ức chế u ác tính trên người, qua thực nghiệm đã chứng minh được betulinic acid có khả năng phá hủy tế bào trong các hệ thống ung thư (Fulda, 2009). Safe và cộng sự (2012) đã đặt ra một số cơ chế chống ung thư của terpenoid như khả năng loại gốc tự do, làm giảm tác nhân gây ung thư và tác động lên thụ thể hạt nhân và cặp thụ thể G-protein tế bào ung thư. 1.3.2. Steroid 1.3.2.1. Định nghĩa, phân loại Steroid là một nhóm HTCN quan trọng, phân bố rộng rãi trong động vật, thực vật và vi sinh vật. Cholesterol là steroid tiêu biểu nhất. Khi biến đổi, đặc biệt trên mạch nhánh, cholestrol tạo thành các hợp chất có hoạt tính quan trọng như acid mật, vitamin D, kích thích tố. Nhiều steroid tự nhiên, một lượng lớn steroid tổng hợp và bán tổng 22
  32. Đồ án tốt nghiệp tổng hợp có hoạt tính sinh học hữu ích nên được sử dụng nhiều trong y học. Mặc dù có cùng khung sườn, hoạt tính sinh học của các steroid rất khác nhau, có lẽ một phần là do sự hiện diện của các nhóm định chức gắn lên sườn steroid và một phần là do hóa học lập thể của các vòng dung hợp. Steroid là các triterpenoid biến đổi, chứa hệ bốn vòng có khung gonan. Steroid trong tự nhiên được chia thành các nhóm chính như sau sterol (zoosterol, phytosterol và mycosterol), acid mật, nội tiết tố giới tính, corticosteroid, vitamin D, glycosid tim, saponin steroid. Các sterol từ thực vật được gọi chung là phytosterol, trong đó ergostrol và stigmasterol là hai sterol thực vật chính (Nguyễn Diệu Liên Hoa và Phạm Đình Hùng, 2015). 1.3.2.2. Nguồn gốc và ứng dụng Những phytosterol như β-sitosterol, campesterol, stigmasterol and cycloartenol được tìm thấy nhiều trong dầu olive, dầu phộng, dầu nành, hạt dẻ, hạt vừng, hạnh nhân Chúng từ lâu được biết đến như một chất giúp làm ngăn chặn các vấn đề về tim mạch, béo phì, tiểu đường (Nguyễn Diệu Liên Hoa và Phạm Đình Hùng, 2015). Yosida và cộng sự (2003) đã chứng minh khả năng chống oxy hóa của β- sitosterol, campesterol, stigmasterol. Mặc dù cơ chế không được giải thích đầy đủ nhưng qua thực nghiệm các phytosterol đều có khả năng loại gốc tự do mạnh. Các phytosterol có khả năng ngăn chặn nhiều loại ung thư khác nhau, như ung thư phổi (Mendilaharsu và cộng sự, 1998), ung thư dạ dày (De Stefani và cộng sự, 2000), ung thư vú, dạ dày (Awad và Fink, 2000). Cơ chế chính của chúng tác động lên các tế bào ung thư được Woyengo và cộng sự (2009) mô tả như sau: + Phytosterol làm giảm sự sản sinh các chất gây ung thư và có khả năng loại bỏ các gốc tự do, kích hoạt các enzyme chống oxy hóa, superoxide dismutase và glutathione peroxidase, làm giảm sự hư hại tế bào. + Kích thích quá trình apoptosis (chương trình tự chết tế bào) bằng cách kích thích tăng hoạt động của caspase-3 (một loại enzyme pro-apoptosis họ MAPK). 23
  33. Đồ án tốt nghiệp Một cơ chế khác là phytosterol giúp thúc đẩy quá trình apoptosis bằng cách hạ thấp mức cholesterol trong máu. Việc giảm mức cholesterol trong máu có thể giúp tăng quá trình apoptosis. Cholesterol trong máu cao có sự liên quan đến bệnh ung thư, Oadir và Malik (2008) ghi nhận ở phụ nữ bị ung thư vú có nồng độ tryglyceride, cholesterol và LDL-cholesterol cao hơn so với người bình thường; chúng sẽ tích tụ trên màng tế bào, làm thay đổi tính chất của màng tế bào; ngoài ra cholesterol còn làm giảm quá trình apoptosis của tế bào. + Ngăn chặn di căn và sự hình thành mạch của tế bào ung thư. Sự tạo mạch của tế bào ung thư nhằm lấy dinh dưỡng để phát triển và di căn là nguyên nhân chính gây tử vong bởi ung thư. Campesterol và β-sitosterol được Awad và cộng sự (2001) chứng minh là có khả năng làm giảm quá trình di căn của tế bào ung thư. 1.3.3. Polyphenol 1.3.3.1. Định nghĩa, phân loại Đây là nhóm hợp chất lớn trong các nhóm hợp chất thứ cấp ở thực vật. Các nhà khoa học đã phát hiện ra hơn 8000 hợp chất phenol tự nhiên. Đặc biệt trong cấu trúc của nhóm này trong phân tử có vòng 6C (vòng benzen) gắn trực tiếp một hay nhiều nhóm hydroxyl (OH). Vì vậy chúng là những alcol bậc 4 và được đặc trưng bởi tính acid yếu. Dựa vào thành phần chính và cấu trúc phenol, người ta chia chúng thành 3 nhóm là phenol đơn giản, phenol phức tạp và nhóm polyphenol. Phân loại này dựa trên bộ khung carbon của các hợp chất trong đó là C6 là nhóm phenyl, C1 là nhóm methyl, C2 là nhóm acetyl, C3 là nhóm thế có 3 carbon, C4 là nhóm thế có 4 carbon C6 (phenol đơn giản, benzoquinone), C6-C1 (acid phenolic), C6-C2 (acetophenone, phenylacetic acid), C6-C3 (acid hydroxycinnamic, coumarin, phenylpropene, chromone), C6-C4 (naphthoquinone), C6-C1-C6 (xanthone), C6-C2-C6 (stilbene, anthraquinone), C6-C3-C6 (flavonoid, isoflavonoid), (C6-C1)2 (tannin thủy phân), (C6-C3)2 (lignan, neolignan), (C6- 24
  34. Đồ án tốt nghiệp C3-C6)2 (biflavonoid), (C6-C3)n (lignin), (C6)n (catechol melanin), (C6-C3-C6)n (tannin ngưng tụ). Nhóm hợp chất polyphenol là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chất phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc sự trùng hợp của các đơn phân. Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng. 1.3.3.2. Nguồn gốc, ứng dụng Thực vật tổng hợp rất nhiều các chất thứ cấp so với động vật vì chúng không thể lẫn trốn đươc kẻ thù mà phải dựa vào hệ thống phòng thủ hóa học này. Các phenol còn có vai trò quan trọng trong hình thành các sắc tố của hoa như đỏ, xanh, tím Đặc tính chống oxy hóa hay tạo phức với kim loại; tạo ra các tín hiệu thông tin giữa phần ở trên cũng như dưới mặt đất, giữa các cây khác với sinh vật khác; polyphenol còn là các tác nhân che chắn tia tử ngoại (UV) từ mặt trời. Khả năng chống tia UV giúp cho thực vật có thể chuyển từ sống dưới nước lên cạn hoàn toàn. Các nghiên cứu còn cho thấy trao đổi hợp chất phenol không chỉ bảo vệ chống lại các yếu tố sinh học mà còn tham gia quá trình điều hòa ở cấp độ phân tử giúp cây sinh trưởng và phát triển bình thường. Một số hợp chất polyphenol tham gia tạo màu sắc tự nhiên của hoa, quả, hấp dẫn côn trùng thụ phấn cho hoa. 1.3.3.3. Flavonoid Flavonoid là một trong các nhóm polyphenol thường gặp ở thực vật, với hơn 4500 hợp chất, được phân loại thành các nhóm flavanol, flavanone, flavon, isoflavone, catechin, anthocyanin, proanthocyanidin. Phần lớn chúng dễ tan trong nước, tạo màu vàng nên được gọi là “flavonoid” (flavus – tiếng Latin, có nghĩa là màu vàng, một sắc tố xanh đỏ tím hoặc không màu cũng được sắp xếp vào nhóm flavonoid nếu chúng có chung đặc điểm cấu tạo hóa học. Flavonoid là sản phẩm của con đường acid shikimic, chúng có khung carbon chung là C6-C3-C6. 25
  35. Đồ án tốt nghiệp ❖ Tính chất sinh học Tác dụng sinh học của các flavonoid rất đa dạng và phong phú. Các cơ chế hóa học của chúng có nhiều điểm còn chưa sáng tỏ, tuy nhiên cơ chế đóng vai trò quyết định là tác dụng chống oxyl hóa. Nhờ đó flavonoid có thể triệt tiêu gốc tự do có hại trong cơ thể, giúp cơ thể động vật và con người phòng chống bệnh tật. - Flavonoid có khả năng kiềm hãm các quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi gốc tự do. Tuy nhiên hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếu phụ thuộc vào đặc điểm cấu tọa hóa học của từng chất flavonoid cụ thể. Do bản chất cấu tạo polyphenol nên flavonoid ở trong tế bào thực vật hoặc ở trong cơ thể động vật chịu tác động của các biến đổi oxy hóa khử, tồn tại ở dạng hydroxyl, semiquinone. Semiquinone hoặc quinone là những gốc tự do bền vững, gọi là gốc phenoxyl, kí hiệu ArO*. Chúng có thể nhận điện tử và hydrogen từ chất cho khác nhau để trở lại dạng hydroquinone. Các chất này có khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động sinh ra trong quá trình sinh lý và bệnh lý để triệt tiêu chúng. - Sự có mặt của các nhóm hydroxyl nhân thơm của các flavonoid cũng như các polyphenol làm cho chúng có khả năng tương tác với protein. Tương tác này có thể làm hoạt hóa hay ức chế hoạt động của enzyme. Tác dụng của flavonoid lên các enzyme là một trong những cơ sở hóa sinh để định hướng cho việc sử dụng các chất flavonoid để chữa bệnh. - Các công trình nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định flavonoid có khả năng chống ung thư. Các flavonoid có tác dụng kiềm hãm các enzyme oxy hóa, kìm hãm quá trình đường phân, quá trình hô hấp, kìm hãm quá trình giảm phân, hạn chế sự phá vỡ cân bằng các quá trình trao đổi chất bình thường trong tế bào; ngăn ngừa hoặc trì hoãn một số bệnh mãn tính và thoái hóa như ung thư, bệnh tim mạch, viêm khớp, lão hóa, đục thủy tinh thể, giảm trí nhớ, đột quỵ, bệnh Alzheimer, viêm, nhiễm trùng (Pham-Huy và cộng sự, 2008). 26
  36. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 2.1.1 Địa điểm Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.1.2 Thời gian thực hiện đề tài Đề tài được thực hiện trong 12 tuần, từ ngày 16/06/2016 đến ngày 07/08/2016. 2.2 Vật liệu 2.2.1 Nguyên liệu nghiên cứu Cây Nhân trần tía thu hái tại núi Bà Đen, tỉnh Tây Ninh vào tháng 12, năm 2015. Mẫu cây được định danh bởi PGS TS Trần Hợp, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. 2.2.2 Đối tượng thí nghiệm Chuột bạch giống swiss albino mice được mua ở Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh. Vi sinh vật chỉ thị (Escherichia coli, Enterotoxigenic Escherichia coli -ETEC, Listeria monocytogenes, Salmonella typhii, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) được cung cấp bởi Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh. Dòng tế bào ung thư gan HepG2 cung cấp bởi được cung cấp bởi ATCC (ATCC® HTB-8065™), được nuôi cấy và bảo quản tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc bộ môn Di truyền, khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. 2.2.3 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm ❖ Dụng cụ thí nghiệm: - Máy sấy; Máy cô quay chân không; Máy lọc chân không. - Máy lắc; Máy quang phổ UV-Vis. - Bể điều nhiệt; Bếp đun cách thủy. 27
  37. Đồ án tốt nghiệp - Tủ cấy, que cấy, tủ ấm, nồi hấp, đĩa petri, ống nghiệm. - Máy đo đường huyết Benecheck Plus (Đài Loan). ❖ Hóa chất: - Thuốc thử Folin-Ciocalteau (Merck – Đức); Acid Gallic (Sigma – Đức). - Rutin (Ấn Độ); Ciprofloxacin (Flamingo - Ấn Độ). - Vitamin C; 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma – Đức). - FeCl3, K3Fe(CN)6; CCl3COOH; H3PO4; NaCO3; AlCl3; BaCl2; H2SO4; D- glucose; Đệm phosphate (pH=6,6). - Dung môi dùng cho phân tích (AR): Ethanol (Việt Nam); Methanol (Xilong – Trung Quốc); Dimethyl sulfoxyde - DMSO (Xilong - Trung Quốc); Chloroform (Việt Nam); Ethyl acetate (Xilong - Trung Quốc); n-butanol (Xilong - Trung Quốc). - Môi trường TSA (Himedia - Ấn Độ); Môi trường TSB (Himedia - Ấn Độ). 28
  38. Đồ án tốt nghiệp 2.3 Phương pháp nghiên cứu Sơ đồ tiến trình thí nghiệm Nhân trần tía o Sấy ở nhiệt độ 60 C Xay nhỏ Trích ly nguyên liệu thu dịch chiết Định tính Xác định sơ bộ Cao chiết và Cao phân đoạn hàm lượng TPHH cao thu được Xác định Đánh giá Xác định Khảo sát hàm lượng khả năng độc tính hoạt tính polyphenol quét gốc tự cấp diễn. kháng / flavonoid do DPPH. khuẩn tổng số. Đánh giá Đánh giá năng lực hoạt tính khử. cao chiết lên đường huyết. 2 Hình 2.1. Sơ đồ tiến trình thí nghiệm 29
  39. Đồ án tốt nghiệp 2.3.1. Xác định độ ẩm Độ ẩm của dược liệu được thực hiện bằng phương pháp Xác định mất khối lượng do làm khô. Cụ thể là dùng phương pháp: sấy trong tủ sấy ở áp suất thường theo Dược điển Việt Nam Quyển III, Phụ lục 5.16. ❖ Cách thực hiện Sấy cốc cân ở nhiệt độ 125oC – 130oC trong 1 giờ. Cho cốc vào bình hút ẩm 30 phút. Dùng cân phân tích có độ chính xác 0,001 g cân khối lượng của cốc. Cân chính xác 1g bột dược liệu cho vào cốc cân (đã biết trước khối lượng). Đặt vào tủ sấy ở nhiệt độ 125oC – 130oC trong 1 giờ và cân khối lượng. Làm tương tự như vậy cho đến khi trọng lượng giữa 2 lần cân không vượt quá 0,5 mg. ❖ Tính toán kết quả Độ ẩm được tính bằng phần trăm theo công thức: ( − ) 푾 = 풅 풔 풖 . (%) 풅 Trong đó: W: độ ẩm của dược liệu (%) mbd: Khối lượng ban đầu (g) msau: Khối lượng sấy (g) 30
  40. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Quá trình chiết và thu nhận cao chiết 2.3.2.1. Sơ đồ quy trình Bột dược liệu khô Ngấm kiệt với cồn 96% Ngấm kiệt với nước Cô quay loại dung môi Cô quay loại dung môi Cao chiết cồn Cao chiết nước Hòa vào nước. Chiết lỏng–lỏng với dung môi chloroform (CHCl3) Cô quay loại dung môi Dịch chiết cồn-nước sau lắc CHCl 3 Cao phân đoạn CHCl3 Chiết lỏng–lỏng với Ethyl acetate (EA) Cô quay loại dung môi Dịch chiết cồn-nước sau lắc EA Chiết lỏng– Cao phân đoạn lỏng EA với n-butanol Cô quay loại Cô quay loại dung môi dung môi Cao phân đoạn Cao phân đoạn n-butanol nước 3Hình 2.2. Sơ đồ quy trình chiết cao chiết Nhân trần tía 31
  41. Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình ❖ Nguyên liệu: toàn cây Nhân trần tía tươi sau khi hái, sẽ được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 60oC và xay cho đến khi tạo thành bột có kích thước từ d = 1,5 - 2 mm. ❖ Chiết: Mục đích: Chiết các hợp chất có trong cây Nhân trần tía nhờ dung môi ethanol và nước, quá trình chiết được diễn ra trong thời gian 24 - 48 giờ, trên máy lắc 150 vòng /phút. Cách thực hiện: Ngâm bột cây Nhân trần tía vào dung môi ethanol 96% và dung môi nước, tỉ lệ khối lượng và dung môi là 1:10, lắc 24 - 48 giờ với tốc độ lắc 150 vòng/phút, lặp lại 3 lần. ❖ Lọc: Để thu hồi dịch chiết cần phải qua lọc thô để loại cặn bã nguyên liệu lẫn trong dịch chiết, thu dịch trong để chuẩn bị quá trình thu cao. ❖ Cô quay: Nhằm thu hồi dung môi để tái sử dụng. Dịch sau cô quay được chuyển sang dung môi khác để loại bỏ tạp chất khác không mong muốn cũng như thực hiện quá trình tiếp theo. Sau khi thu được cao khô từ dịch chiết nước và dịch chiết cồn, một phần cao cồn và toàn bộ cao nước được bảo quản ở nhiệt độ 0oC - 4oC để tiếp tục dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. Sử dụng một phần cao khô từ dịch chiết cồn để tiếp tục quá trình chiết phân đoạn. ❖ Chiết phân đoạn: - Cao ethanol thô sau đó được hoà vào lượng nước cất vừa đủ để hòa tan cao và tiếp tục được phân chia bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng. - Cho dung dịch cao ethanol vào bình lóng, thêm vào khoảng một thể tích chloroform (CHCl3) với tỉ lệ so với cao chiết là 1:1, lắc nhẹ, chờ cho hỗn hợp phân lớp hoàn toàn. Lúc này, nhẹ nhàng tháo van chiết lấy pha CHCl3 nằm dưới, pha nước nằm trên được cho vào bình chứa, lặp lại quá trình này 4 lần. 32
  42. Đồ án tốt nghiệp - Đuổi dung môi bằng phương pháp cô quay ở nhiệt độ 45oC, thu được cao phân đoạn CHCl3. - Dịch còn lại tiếp tục được chiết với dung môi Ethyl actete (EA) theo phương pháp tương tự như trên, đuổi dung môi bằng phương pháp cô quay ở nhiệt độ 45oC, thu được cao phân đoạn EA. - Cuối cùng, dịch được chiết tương tự với dung môi n-butanol (BU), đuổi dung môi bằng phương pháp cô quay ở nhiệt độ 60oC, thu được cao phân đoạn BU. - Pha nước cuối cùng được cô quay ở nhiệt độ 60oC, thu được cao phân đoạn nước (ký hiệu W). - Các cao phân đoạn được bảo quản ở nhiệt độ 0oC – 4oC để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng cao thu được Với mỗi loại dược liệu, sau quá trình chiết xuất ta thu được cao chiết. Cân khối lượng các cao thu được trên cân phân tích 4 số lẻ. Tính toán % cao thu được cho phép ta biết được hiệu quả kinh tế của dược liệu. Với mỗi loại dược liệu, % cao được tính theo công thức sau: Trong đó: mcao : khối lượng cao thu được (g) mdl : khối lượng dược liệu đem chiết (g) wdl : độ ẩm của dược liệu đem chiết 2.3.4. Phương pháp định tính các thành phần hóa học trong Nhân trần tía Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học được áp dụng phương pháp của bộ môn Dược liệu- Khoa Dược- Đại học Y dược TP. Hồ Chí Minh (cải tiến từ phương pháp của trường đại học Dược khoa Rumani), tham khảo thêm quy trình định tính terpenoid của Yadav và cộng sự (2011). Nguyên tắc là dựa vào độ hòa tan của các hợp chất trong 33
  43. Đồ án tốt nghiệp dược liệu để tách các hợp chất bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau. Sau đó, xác định các hợp chất này bằng các phản ứng chuyên biệt. Cao cồn và cao nước được chia làm 2 phần. Phần thứ nhất pha với H2SO4 10% sau đó lọc hết cặn, dịch thu được dùng để thực hiện các thử nghiệm kiểm tra sự có mặt của nhóm alkaloid. Phần thứ hai sẽ pha trong DMSO 1% sau đó bỏ cặn thu dịch, dịch này được đem phân tích và định tính một số thành phần hóa học như carbohydrate, saponin, flavonoid, amino acid, anthraquinone glycoside, steroid, polyphenol, tanin. ❖ Định tính thành phần khử: Thử nghiệm Fehling: hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào, đun cách thủy trong 5 phút và quan sát sự xuất hiện kết tủa màu đỏ của CuO. ❖ Xác định tinh dầu: Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Nếu cắn có mùi thơm nhẹ, thêm vào cắn một ít cồn cao độ rồi lại bốc hơi cho đến cắn. Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng: có tinh dầu. ❖ Định tính thành phần alkaloid: Thử nghiệm Mayer: hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, cho vài giọt thuốc thử Mayer. Quan sát kết tủa màu đục tạo thành. Thử nghiệm Dragendroff: hút 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendroff và quan sát sự hình thành kết tủa màu vàng cam. Thử nghiệm Hager: hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Hager và quan sát hình thành kết tủa màu vàng. Thử nghiệm Wagner: hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Wagner và quan sát sự hình thành kết tủa màu nâu đỏ. ❖ Định tính thành phần saponin: Thử nghiệm tạo bọt: hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm, lắc mạnh và quan sát sự hình thảnh bọt ổn định. 34
  44. Đồ án tốt nghiệp ❖ Định tính thành phần anthraquinone glycoside: Thử nghiệm Bontrager: hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml H2SO4 loãng và đun sôi trong 30 phút, thêm vài giọt FeCl3. Tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc, thêm 3 ml benzene và lắc đều rồi để yên, tách lấy lớp benzene, thêm 2 ml ammonia 10% và đun trong 30 phút quan sát màu trong lớp ammonia. Nếu có sự xuất hiện màu đỏ kết luận là có anthraquinone glycosides, nếu không thì kết luận là âm tính. ❖ Định tính thành phần polyphenol: Lấy 0.5ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5%, lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu: có polyphenol. ❖ Định tính thành phần tanin: Thử nghiệm chì acetate: 2 ml dịch chiết được cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%. Cho vào 4 giọt chì acetate. Quan sát sự xuất hiện kết tủa màu vàng. Lấy 2ml dịch chiết, thêm vào 5 giọt dung dịch Gelatin – muối, lắc đều, so sánh với dung dịch ban đầu. Nếu có tủa bông trắng: có tannin. ❖ Định tính thành phần flavonoid: Thử nghiệm alkaline: hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện với đối chứng là mẫu và nước cất để so sánh, thêm vài giọt HCl loãng. Quan sát sự xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho HCl. Thử nghiệm Shinoda: hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. Cho một ít bột Mg và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm. Bổ sung 5 ml cồn 95%. Nếu mẫu có màu cam, hồng, đỏ đến tím chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid. ❖ Định tính thành phần steroid: Thử nghiệm Salkowski: hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp và quan sát ở mặt phân cách nếu xuất hiện màu đỏ ở lớp dưới, kết luận có sterol; màu vàng ở lớp dưới, kết luận là triterpenoid. 35
  45. Đồ án tốt nghiệp ❖ Định tính thành phần triterpenoid: Thử nghiệm Liebermann-Burchard: hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2ml acetic anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh, nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm. Quan sát nếu xuất hiện màu xanh dương đậm hay xanh lá cây, kết luận là steroid; nếu hình thành vòng màu nâu đỏ đậm, chứng tỏ có triterpenoid. 2.3.5. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số ❖ Nguyên tắc: dựa vào phản ứng oxy hóa của các polyphenol với thuốc thử Folin- Ciocateau, tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. So màu ở bước sóng λ=765 nm, hàm lượng polyphenol được tính toán theo đường chuẩn acid gallic. ❖ Xây dựng đường chuẩn acid gallic: - Chuẩn bị các dung dịch acid gallic có các nồng độ khác nhau: 0,04; 0,06; 0,08; 0,1; 0,12; 0,14; 0,16 mg/ml. - Hàm lượng phenol tổng số được xác định bằng phương pháp quang phổ sử dụng thuốc thử Folin–Ciocalteau theo phương pháp của Waterhouse (2002), tham khảo thêm TCVN 9745-1:2013. Cho 1 ml dung dịch tác dụng với 5ml thuốc thử Folin–Ciocalteu o 10% và lắc đều, sau 5 phút bổ sung thêm 4 ml Na2CO3 7,5% và ủ 30 phút ở 40 C. Mật độ quang của các mẫu được đo tại bước sóng 760 nm. - Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn), hàm lượng polyphenol được tính toán dựa theo đường chuẩn acid gallic. 2.3.6. Phương pháp định lượng flavonoid tổng số ❖ Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch khi phản ứng với AlCl3 tại bước sóng λ=420 nm; tạo ra dung dịch có màu vàng (theo phương pháp của Woisky và Salatino, 1998). ❖ Dựng đường chuẩn Rutin - Pha các dung dịch Rutin chuẩn bằng ethanol 96o theo dãy nồng độ: 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 (mg/ml) 36
  46. Đồ án tốt nghiệp - Hút 2 ml từ mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch. - Thêm 2 ml dung dịch AlCl3 2%. - Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ. Mật độ quang của các mẫu được đo ở bước sóng λ = 420 nm. - Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên, hàm lượng flavonoid được tính toán dựa theo đường chuẩn Rutin. 2.3.7. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH ❖ Nguyên tắc: Cơ chế của hoạt động quét gốc tự do DPPH là sự ghép đôi hydro và chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn định hơn. Khi có mặt của chất chống oxy hóa, các gốc tự do DPPH sẽ bị bắt và làm cho dung dịch bị giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm đi. Thí nghiệm được tiến thành theo hương pháp của Von Gadow, Joubert và Hansmann (1997). 4Hình 2.3. Phản ứng quét gốc tự do DPPH 37
  47. Đồ án tốt nghiệp Đánh giá khả năng kháng oxy hóa thông qua IC50 là một giá trị nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do. ❖ Dựng đường chuẩn Vitamin C - Pha dung dịch vitamin C theo các nồng độ sau: 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75 (mg/ml). - Dùng micropipet hút 50 휇푙 mỗi nồng độ vào các ống nghiệm đã chứa sẵn 2 ml dung dịch DPPH. - Ủ trong tối 15 phút ở nhiệt độ phòng. So màu ở bước sóng λ=517 nm. - Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên. Kết quả được đánh giá thông qua giá trị IC50 (Inhibitory concentration) là nồng độ chất chống oxy hóa cần để ức chế (trung hòa) 50% gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định. - Mẫu Vitamin C được dùng để so sánh giá trị IC50. ❖ Tính toán kết quả Dựa theo Yen và Duh (1994), giá trị IC50 được tính toán như sau: A −A Phần trăm ức chế (%I) = ( DPPH TN)x100% ADPPH Trong đó: ADPPH là giá trị OD517nm của dung dịch DPPH ban đẩu pha trong methanol. ATN là giá trị OD517nm của dung dịch chuẩn (hoặc dung dịch mẫu). Giá trị IC50 được tính toán dựa theo đường chuẩn: y = ax+b theo công thức 50 − b x = a 2.3.8. Phương pháp xác định năng lực khử Năng lực khử của dịch chiết Nhân trần tía được xác định theo phương pháp của Mayakrishnan và cộng sự (2012). 38
  48. Đồ án tốt nghiệp ❖ Nguyên tắc: Chất kháng oxy hóa có khả năng khử ion Fe3+ trong phân tử 4- 2+ [Fe(CN)6] thành Fe trong Fe4[Fe(CN)6]3, kết quả thu được là phức mành xanh ngọc bích có độ hấp thu cực đại tại bước sóng 700nm. 5Hình 2.4. Phản ứng xác định năng lực khử ❖ Quy trình thực hiện: - Chuẩn bị dung dịch mẫu cần khảo sát trong khoảng nồng độ 1 – 25 g/ml. Sử dụng chứng dương là Vitamin C. - Hút 2,5 ml dịch mẫu vào ống nghiệm, sau đó cho vào thêm 2,5 ml dung dịch đệm sodium phosphate 0,2M pH = 6,0. - Thêm 2,5 ml dung dịch K3[Fe(CN)6]) 1% vào hỗn hợp trên, lắc đều. - Ủ ở 50oC trong 20 phút. - Thêm 2,5 ml dung dịch TCA 10%, lắc đều. Ly tâm hỗn hợp 3000 vòng/10 phút. - Hút 2,5 ml dịch nổi vào 2,5 ml nước cất. Thêm vào 0,5 ml FeCl3 1%. - Đo mật độ quang ở bước sóng 700nm. - Ghi nhận kết quả và lập biểu đồ biểu diễn OD theo nồng độ. 2.3.9. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ❖ Nguyên tắc: Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết dựa trên phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Aibinu và cộng sự (2007), các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết khuếch tán vào trong môi trường agar và tác động lên 39
  49. Đồ án tốt nghiệp vi khuẩn chỉ thị. Nếu các hợp chất trong cây có khả năng ức chế vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. ❖ Chuẩn bị mẫu thử: Pha 6 loại dịch chiết từ: cao nước (ký hiệu AQ), cao cồn (ET), cao phân đoạn Chloroform (CH), cao phân đoạn Ethyl acetate (EA), cao phân đoạn n-butanol (BU), cao phân đoạn nước (W) trong DMSO 1%. Chuẩn bị 6 loại vi khuẩn chỉ thị: Escherichia coli, Enterotoxigenic Escherichia coli -ETEC, Listeria monocytogenes, Salmonella typhii, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Sử dụng đối chứng dương là kháng sinh ciprofloxacin 500 g/ml. Đối chứng âm là dung dịch DMSO 1%. ❖ Tăng sinh vi sinh vật chỉ thị: Mục đích: giúp tăng nhanh sinh khối của vi sinh vật chỉ thị đến số lượng cần thiết để phục vụ cho thí nghiệm ngoài ra còn giúp hoạt hóa vi khuẩn trở về với trạng thái bình thường sau khi bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Đối với các giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật được chỉ thị giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào chai thủy tinh chứa 10 ml môi trường TSB đã được hấp khử trùng. Sau đó lắc với tốc độ 150 vòng/ phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. ❖ Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn: Sau khi tiến hành đo quang phổ bước sóng 620 nm và so sánh với dung dịch McFarland 0,5 các chai môi trường được pha loãng theo dãy thập phân trong ống nước muối sinh lý vô trùng sao cho mật độ vi sinh vật đạt 106 cfu/ml. Hút 0,1 ml dịch khuẩn cho vào đĩa môi trường thạch TSA, tiến hành trang dịch vi khuẩn trên đĩa cho tới khi khô hoàn toàn. Các đĩa thạch sau đó được đục lỗ tạo thành các miệng giếng bằng một ống kim loại hình trụ thẳng, không gỉ có đường kính 6 mm, khoảng cách giữa các lỗ được tính toán từ trước sao cho cân bằng và khoảng cách giữa các vòng kháng không 40
  50. Đồ án tốt nghiệp trùng lên nhau. Các công đoạn trên được thực hiện trong điều kiện vô trùng với ngọn lửa đèn cồn. Tiến hành pha các loại cao cần khảo sát trong DMSO 1%. Nồng độ được thể hiện như bảng 2.1. 6 Bảng 2.1. Nồng độ khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết Mẫu thí nghiệm Nồng độ (mg/ml) Cao chiết nước 100 Cao chiết cồn 100 Cao chiết phân đoạn chloroform 50 Cao chiết phân đoạn ethylacetate 50 Cao chiết phân đoạn n-butanol 50 Cao chiết phân đoạn nước 100 Sử dụng micropipet hút chính xác 100 l dịch chiết và nhỏ vào các giếng trong đĩa môi trường TSA đã được đục lỗ trước đó, thí nghiệm được lặp lại 3 lần trên mỗi chủng vi sinh vật chỉ thị. Các thao tác trên đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Đường kính vòng kháng khuẩn được xác định sau khi ủ các đĩa TSA ở 37°C trong vòng 24 giờ. 2.3.10. Xác định độc tính cấp diễn Thử nghiệm xác định độc tính cấp diễn theo phương pháp Bộ Y tế Việt Nam ban hành. Cao chiết được pha ở nồng độ cao nhất có thể pha loãng nhằm khảo sát độc tính cấp diễn. Chuột bạch đực được chia thành nhiều nhóm tương tự nhau, mỗi con ở cùng nhóm sẽ nhận cùng một liều khảo sát. Sự đánh giá dựa vào phản ứng sống hay chết của chuột trong mỗi nhóm. Sau khi cho chuột uống thuốc với liều duy nhất trong ngày, quan sát hành vi, thể trạng của chuột sau 24, 36 và 48 giờ. Ghi nhận giờ xuất hiện các triệu chứng bất thường như co giật hoặc chết. Nếu có chuột chết thì xét 41
  51. Đồ án tốt nghiệp nghiệm đại thể chủ yếu gan, thận, tim, phổi. Xác định liều làm chết 50% động vật thử. [16] 6Hình 2.5. Chuột bạch dùng cho thí nghiệm Để thăm dò liều, đối với mỗi cao chiết, liều dùng 6 con chuột, mỗi con có trọng lượng 20 ± 3 g, cho uống liều duy nhất trong ngày với thể tích thuốc tối đa chuột có thể nhận được là 0,2 ml/10 gam thể trọng/lần/ngày (quy định cho chuột nhắt), đây là liều thực hiện cho lượng cao chiết tối đa có thể hòa tan được trong 0,2 ml nước cất và chất trợ tan (Đỗ Trung Đàm, 2003). Cao chiết nước và cao chiết cồn được pha thành liều 3000 mg/kg thể trọng chuột nhằm khảo sát độc tính cấp diễn. Chuột được uống dịch chiết nước và dịch chiết cồn từ cây Nhân trần tía, với liều là 3000 mg/kg trong 1 ngày. Sau đó ghi nhận kết quả sau khi uống dịch chiết nước và dịch chiết cồn từ cây Nhân trần tía. 2.3.11. Đánh giá hoạt tính cao chiết trên chuột bạch ứng dụng trong mô hình ổn định lượng đường trong máu Tiến hành theo phương pháp của Joy và Kuttan (1999) và được thay đổi bởi Rahman và cộng sự (2011), có một số sự thay đổi về liều lượng mẫu thử. 42
  52. Đồ án tốt nghiệp Chuột được nuôi ổn định trong 2 tuần đầu, cho ăn thức ăn mua ở Viện Pasteur. Chuột được bỏ đói trước khi tiến hành thí nghiệm 6 giờ, chuột bạch được chia thành 5 nhóm, mỗi nhóm 6 con. Thiết kế thí nghiệm theo mô hình sau: + Nhóm 1 – nhóm chứng trắng: Chuột được uống Tween 1% liều 10 ml/kg thể trọng. + Nhóm 2 – nhóm độc: Chuột được uống Tween 1% liều 10 ml/kg thể trọng. + Nhóm 3 – nhóm chứng sinh học: Chuột được uống thuốc với thành phần glibenclamide (10 mg/kg thể trọng). + Nhóm 4 – Chuột được uống dịch chiết nước (50 mg/kg thể trọng). + Nhóm 5 – Chuột được uống dịch chiết cồn (50 mg/kg thể trọng). Sau 1 giờ các nhóm từ 2 đến 5 được dùng thêm đường glucose, liều dùng 2 g/kg thể trọng. Sau 2 giờ, các nhóm từ 1 đến 5 được tiến hành lấy máu kiểm tra lượng đường huyết. ❖ Xác định lượng đường huyết trong máu chuột: Xác định nồng độ đường huyết bằng máy đo Benecheck Plus (Đài Loan). ➢ Phương pháp: Máy đo đường huyết đo dòng điện nhỏ và hiển thị kết quả đo đường huyết. Dòng điện được cung cấp từ quá trình phản ứng của lượng đường trong máu kết hợp với chất hóa học trên que thử. Người sử dụng cần lấy 10 µl máu tươi trong mao mạch cho mỗi lần thử, và kết quả sẽ hiển thị sau 5 giây. ➢ Nguyên tắc phản ứng: Enzyme glucose oxidase xúc tác quá trình oxy hóa β-D-glucose thành D- gluconic acid. α-D-glucose trong máu nhanh chóng chuyển sang dạng β, vì vậy tất cả glucose đều được đo trong cùng một thời điểm. Cảm biến sinh học enzyme glucose sử dụng một điện cực thay O2, tác động lên lượng glucose khử. Trong phản ứng mở vòng, dưới tác dụng của enzyme glucose oxidase và điện cực trong que thử làm mất các 43
  53. Đồ án tốt nghiệp electron cần thiết, nhóm aldehyde ở C1 bị chuyển thành acid, acid-D-gluconic và hình thành H2O2. Dòng điện tử được tạo ra tương ứng với nồng độ glucose trong máu. ➢ Thực hiện qua các bước: - Chuẩn bị que thử. - Lấy mẫu máu. - Đọc kết quả giá trị đường huyết hiện trên máy đo. - Đối chiếu với bảng đổi đơn vị chuẩn như trong bảng 2.2. 7 Bảng 2.2. Bảng tra nồng độ đường huyết mmol/L mg/dL mmol/L mg/dL mmol/L mg/dL mmol/L mg/dL mmol/L mg/dL 0,06 1 4,4 80 8,0 145 12,0 216 22,2 400 0,28 5 4,7 85 8,3 150 12,5 225 23,0 414 0,55 10 5,0 90 8,9 160 13,9 250 24,0 432 1,0 18 5,5 100 9,0 162 14,4 260 25,0 450 1,5 27 6,0 106 9,4 170 15,0 270 25,4 475 2,0 36 6,1 110 10,0 180 16,0 288 27,7 500 2,2 40 6,7 120 10,5 190 16,6 300 30,0 540 2,5 45 7,0 126 11,0 196 17,0 306 33,3 600 2,8 50 7,2 130 11,1 200 18,0 325 38,8 700 3,0 54 7,5 135 19,0 342 40,0 720 3,3 60 7,8 140 20,0 360 44,4 800 3,9 70 Thể nhẹ 20,8 375 50,0 900 4,0 72 Thể bình thường Thể nặng Thể thấp 44
  54. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thử độ ẩm của dược liệu Nguyên liệu được sấy khô đến khối lượng không đổi. Độ ẩm được xác định bằng công thức nêu trong mục 2.3.1 và biểu thị trong bảng 3.1 8 Bảng 3.1. Độ ẩm dược liệu Đối tượng Bột cây Nhân trần tía Độ ẩm (%) 6,58 ± 0,11 Độ ẩm là lượng nước chứa trong 100 g dược liệu. Dược liệu tươi thường chứa một lượng nước rất lớn: lá chứa khoảng 60-80% nước, thân và cành chứa khoảng 40- 50% nước. Không có một dược liệu nào đạt độ khô tuyệt đối (độ ẩm 0%), nhưng đối với mỗi dược liệu đều được quy định một độ ẩm an toàn. Để bảo quản tốt, dược liệu cần có độ ẩm bằng hoặc dưới độ ẩm an toàn. Theo Dược điển Việt Nam, dược liệu Nhân trần tía sau khi sấy khô có độ ẩm không quá 13%. Như vậy mẫu cây của được sấy đảm bảo cho quá trình bảo quản. 3.2. Khảo sát hàm lượng cao chiết Bột cây Nhân trần tía sau được chiết cao theo quy trình chiết cao ở mục 2.1.2 và biểu diễn bằng sơ đồ ở hình 2.2. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2 và bảng 3.3. 9 Bảng 3.2. Khảo sát hàm lượng cao chiết theo dung môi Dược liệu Hàm lượng cao (%) Cao nước (AQ) Cao cồn (ET) Nhân trần tía 15,52 8,88 Hàm lượng chiết của cao nước cao hơn cao cồn, chứng tỏ trong cây Nhân trần tía chứa một lượng lớn hợp chất có độ phân cực mạnh nên tan được trong nước. 45
  55. Đồ án tốt nghiệp Nguyên nhân khác là do khi chiết bằng ethanol nồng độ cao, ethanol sẽ háo nước làm các thành tế bào bị mất nước cục bộ dẫn tới hiện tượng các tế bào bị khô và co lại ngăn cản quá trình chiết, đồng thời nhiều hợp chất khác cũng được chiết ra khỏi tế bào như chlorophyll làm cho dịch trích chuyển sang màu xanh lục. Nhưng dung môi nước chỉ có thể chiết được những chất có độ phân cực cao, còn dung môi cồn có thể chiết được hầu hết các có độ phân cực từ thấp đến cao trong cây. (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 10 Bảng 3.3. Khảo sát hàm lượng thu hồi sau khi chiết lỏng - lỏng cao cồn Hàm lượng thu hồi từ quá trình tách phân đoạn (%) Cao phân đoạn Cao phân đoạn Cao phân đoạn Cao phân đoạn Tổng các chloroform (CH) ethyl acetate n-butanol (BU) nước (W) phân đoạn (EA) 51,13 9,63 20,75 9,38 90,89 So sánh hàm lượng thu hồi từ quá chiết lỏng-lỏng từ cao tổng cồn, cho thấy các thành phần chất tan nhiều nhất trong dung môi chloroform (chiếm 51,13% so với khối lượng cao cồn sử dụng cho quá trình chiết) chứng tỏ trong Nhân trần tía chứa nhiều hợp chất không phân cực và phân cực thấp. Hàm lượng cao chiết được từ phân đoạn ethylacetate thấp, chỉ chiếm 9,63%, cho thấy có rất ít hợp chất tan có độ phân cực trung bình. Hàm lượng cao n–butanol chiếm 20,75%. Ở độ phân cực của ethylacetate và n– butanol dễ dàng chiết được các hợp chất flavonoid (Harborne, 2013), chứng tỏ trong cây chứa một lượng đáng kể hợp chất này. Cao phân đoạn nước đạt thấp nhất, chỉ chiếm 9,38%. Đây là những nghiên cứu đầu tiên về khảo sát hàm lượng thu cao chiết bằng các loại dung môi thông dụng. 46
  56. Đồ án tốt nghiệp 3.3. Định tính các thành phần hóa học có trong dịch chiết Nhân trần tía 11 Bảng 3.4. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học Nhóm hợp chất Thuốc thử và cách thực hiện Kết quả Cao cồn Cao nước Tinh dầu Bốc hơi tới cắn +++ + Triterpenoid Phản ứng Liebermann-Burchard +++ - Steroid Salkowski ++ - Alkaloid Mayer - - Dragendroff - - Hager - - Wager - - Polyphenol FeCl3 +++ +++ Flavonoid Alkaline +++ +++ Shinoda +++ +++ Tannin Chì acetate +++ +++ Dung dịch gelatin-muối +++ +++ Saponin Lắc mạnh với dung dịch nước + ± Anthraquinone Borntrager - - glycoside Chất khử Thuốc thử Fehling - - Ghi chú: (-): Không có; (±): Nghi ngờ, (+): Có ít, (++): Có, (+++): Có nhiều. Kết quả cho thấy dược liệu Nhân trần tía có nhiều các nhóm hoạt chất khác nhau như flavonoid, tanin, tinh dầu, triterpenoid, steroid, saponin. Đặc biệt không có sự hiện diện của alkaloid, anthraquinone glycoside và đường khử. Qua kết quả có thể nhận thấy ảnh hưởng của dung môi lên việc trích ly các hợp chất có trong cây, điều đó lý giải khả năng thể hiện hoạt tính sinh học của từng loại cao chiết là khác nhau. 47
  57. Đồ án tốt nghiệp Hình ảnh kết quả thí nghiệm được tình bày trong bảng 3.5. 12 Bảng 3.5. Hình ảnh định tính thành phần hóa học Nhóm hợp chất Phương pháp Cao nước Cao cồn Dịch gốc (sau ngâm H2SO4 10%) Alkaloid Mayer Dragendroff 48
  58. Đồ án tốt nghiệp Hager Wagner Dịch gốc 49
  59. Đồ án tốt nghiệp Saponin Tạo bọt Anthraquinone Bontrager glycoside Polyphenol Ferric chloride 50
  60. Đồ án tốt nghiệp Alkaline Flavonoid Shinoda 51
  61. Đồ án tốt nghiệp Chì acetate Tannin Gelatin – muối Steroid Salkowski 52
  62. Đồ án tốt nghiệp Libermann Terpenoid Burchard Đường khử Fehling 53
  63. Đồ án tốt nghiệp 3.4. Định lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết ❖ Đường chuẩn Acid Gallic Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định thông qua đường chuẩn acid gallic 7Hình 3.1. Dung dịch dựng đường chuẩn acid gallic 13 Bảng 3.5. Kết quả đường chuẩn acid gallic Nồng độ AG (mg/ml) 0,04 0,07 0,10 0,13 0,16 OD765nm 0,197 0,379 0,553 0,717 0,871 8Hình 3.2. Đường chuẩn acid gallic 54
  64. Đồ án tốt nghiệp Việc định lượng polyphenol tổng của các phân đoạn được tính toán dựa vào đường chuẩn. 14 Bảng 3.6. Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số các cao chiết Mẫu thí nghiệm Polyphenol tổng số (mg GE/g cao chiết) Cao chiết nước 202,70 2,69 e Cao chiết cồn 249,68 3,61 c Cao chiết phân đoạn chloroform 106,31 3,77 f Cao chiết phân đoạn ethylacetate 499,93 3,77 a Cao chiết phân đoạn n-butanol 454,61 2,96 b Cao chiết phân đoạn nước 228,26 7,14 d Nhận xét: Polyphenol là một trong những thành phần quan trọng nhất, chiếm tỉ lệ lớn trong thực vật nói chung. Chúng cũng là một trong những chất có tiềm năng chống oxy hóa mạnh, do đó chỉ tiêu này khá quan trọng trong nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của thực vật (Zheng và cộng sự, 2001). Theo Marja và cộng sự (1999), những loài thực vật có hàm lượng polyphenol tổng số lớn hơn 20 mg GE/db thì có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Qua kết từ bảng 3.6 cho thấy Nhân trần tía cơ bản có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Hàm lượng polyphenol tổng số thu được phụ thuộc vào loại dung môi sử dụng trong quá trình chiết tách. Trong cao cồn chứa hàm lượng polyphenol tổng (249,68 3,61) mg GE/g cao chiết, lớn hơn rõ rệt so với cao nước (202,70 2,69) mg GE/g cao chiết. Khi tiến hành quá trình chiết lỏng-lỏng, các hợp chất có độ phân cực gần bằng với dung môi sử dụng sẽ hòa vào dung môi, dung môi ethyl acetate đã chiết được nhiều polyphenol nhất (499,93 3,77) mg GE/g cao chiết, tiếp sau đó là n-butanol (454,61 55
  65. Đồ án tốt nghiệp 2,96) mg GE/g cao chiết, cao nước giữ lại một lượng các polyphenol rất phân cực (228,26 7,14) mg GE/g cao chiết, phân đoạn chloroform chiết được (106,31 3,77) mg GE/g cao chiết. 3.5. Định lượng flavonoid tổng số ❖ Xây dựng đường chuẩn Rutin - Dung dịch Rutin chuẩn ban đầu được pha loãng thành các nồng độ thích hợp, cho phản ứng với AlCl3, phản ứng tạo màu vàng từ nhạt đến đậm, so màu ở bước sóng λ= 420nm. - Độ đậm nhạt của dịch màu tùy thuộc nồng độ Rutin. 9Hình 3.3. Dung dịch Rutin chuẩn 15 Bảng 3.7. Bảng kết quả đường chuẩn Rutin Nồng độ Rutin (mg/ml) 0,01 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 OD 420nm 0,107 0,202 0,429 0,583 0,768 0,933 56
  66. Đồ án tốt nghiệp 10Hình 3.4. Đường chuẩn Rutin Mẫu thí nghiệm được pha loãng thành nồng độ 0,5 mg/ml và cho phản ứng với dung dịch AlCl3. Từ phương trình đường chuẩn Rutin, ta tiến hành tính toán hàm lượng Flavonoid tổng số (mg RE/g cao chiết). 16 Bảng 3.8. Kết quả hàm lượng Flavonoid tổng số Mẫu thí nghiệm Flavonoid tổng số (mg RE/g cao chiết) Cao chiết nước 53,75 1,42 d Cao chiết cồn 101,82 0,88 b Cao chiết phân đoạn chloroform 95,35 1,12 c Cao chiết phân đoạn ethylacetate 162,81 4,60 a Cao chiết phân đoạn n-butanol 57,23 2,06 d Cao chiết phân đoạn nước 26,01 1,75 e Nhận xét: Các flavonoid là nhóm hợp chất có khả năng kháng oxy hoá mạnh trong số các hợp chất polyphenol thực vật, hàm lượng flavonoid tổng ảnh hưởng lớn đến khả năng kháng oxy hóa của dược liệu (Pietta, 2000; Kuma, 2013). 57
  67. Đồ án tốt nghiệp Cao chiết cồn và cao chiết nước thu được hàm lượng flavonoid tổng lần lượt là 101,82 0,88 mg RE/g cao chiết và 53,75 1,42 mg RE/g cao chiết. Dung môi ethylacetate đã tách được nhiều flavonoid nhất (162,81 4,60 mg RE/g cao chiết). Phân đoạn chloroform thu được hàm lượng flavonoid là (95,35 1,12 mg RE/g cao chiết). Phân đoạn n-butanol thu được 57,23 2,06 mg RE/g cao chiết và xếp cuối cùng là phân đoạn nước với 26,01 1,75 mg RE/g cao chiết. Mặc dù flavonoid được biết biết đến là một hợp chất tự nhiên thường có độ phân cực trung bình đến rất phân cực, nhưng cũng có một số flavonoid có độ phân cực thấp. Phụ thuộc vào cấu trúc phân tử mà flavonoid sẽ thể hiện tính phân cực khác nhau; các isoflavone, flavanone, methylated flavone và flavonol là những flavonoid có độ phân cực thấp đến trung bình; trong khi flavonoid glycosid (hydroxylated flavone, biflavonyl, aurone, chalcone) có tính phân cực cao, dễ dàng hòa tan vào nước (Harborne và cộng sự, 2003; Nguyễn Diệu Liên Hoa và Phạm Đình Hùng, 2015). 3.6. Xác định hoạt tính kháng gốc tự do DPPH Hoạt tính loại gốc tự do DPPH được sử dụng rộng rãi để sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất tự nhiên từ thực vật và vi khuẩn. Phương pháp này là một trong những phương pháp hiệu quả, nhanh chóng và đơn giản nhất. Việc mẫu khảo sát có khả năng bắt gốc DPPH tự do chứng tỏ trong mẫu có chứa các hợp chất có khả năng kết hợp với các gốc tự do tạo thành các sản phẩm ổn định hơn (Dix và cộng sự, 1996). Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc DPPH dựa trên giá trị IC50 được thể hiện trong hình 3.6. 58
  68. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ so sánh giá trị IC50 a 82.53 2.03 90 84.69 0.41a 73.34 5.2 b b 80 75.45 1.44 70 60 c 50 43.31 0.15 c 40 38.17 + 0.42 30 20 10 4.79 0.18d 0 Vitamin C Cao nước Cao cồn Cao phân Cao phân Cao phân Cao phân đoạn đoạn Ethyl đoạn n- đoạn nước chloroform acetate butanol 11Hình 3.6. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của các cao chiết trong thí nghiệm quét gốc tự do DPPH Nhận xét: Ở 6 mẫu khảo sát đều thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa, giá trị IC50 càng thấp, chứng tỏ khả năng kháng oxy hóa càng cao. Theo Kuete và Efferth (2010), những cao chiết thực vật thể hiện chỉ số IC50 dưới 50 g/ml là những hợp chất có khả năng chống oxy hóa mạnh, từ mức 50 g/ml đến 100 g/ml thì có khả năng chống oxy hóa ở mức khá mạnh. 59
  69. Đồ án tốt nghiệp Cao chiết nước và cao chiết cồn có giá trị IC50 lần lượt là (82,53 2,03) g/ml và (73,34 5,2) g/ml. Chứng tỏ cao chiết nước và cao chiết cồn cũng có khả năng kháng oxy hóa đáng kể. Ở phân đoạn chloroform giá trị IC50 là cao nhất (84,70 g/ml) trong các mẫu khảo sát, do thành phần của cao này là các hợp chất không phân cực đến phân cực thấp nên chứa ít nhóm chức linh động có khả năng bắt gốc tự do. Phân đoạn ethyl actetate và n-butanol đã thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mạnh mẽ, với IC50 lần lượt là 37,50 g/ml và 43,31 g/ml. Kết quả này chứng tỏ hai phân đoạn này chứa nhiều hợp chất kháng oxy hóa mạnh, qua phân tích thành phần hóa học ở mục 3.4 và mục 3.5 có thể thấy cao phân đoạn ethyl acetate và cao phân đoạn n-butanol chứa một lượng lớn các polyphenol và flavonoid nên hai phân đoạn này đã thể hiện hoạt tính mạnh. Có thể tiến hành các kỹ thuật sắc ký trên hai phân đoạn này để sàng lọc ra những hợp chất kháng oxy hóa để ứng dụng vào các nghiên cứu sâu hơn. Phân đoạn nước thể hiện khả năng kháng oxy hóa ở mức khá với IC50 bằng 75,28 g/ml. Qua xử lý thống kê, nhận thấy kết quả IC50 có mối tương quan ngược rất chặt với hàm lượng polyphenol tổng số TPC (r = -0,96779; p = 0,0015 < 0,01), chứng tỏ những cao chiết chứa càng nhiều polyphenol thì khả năng kháng oxy hóa của chúng càng mạnh. 3.7. Xác định năng lực khử Năng lực khử là một trong những đặc tính quan trọng nhằm đánh giá khả năng kháng oxy hóa, cho thấy sự hiện diện của các chất khử cũng như khả năng nhường nguyên tử hydrogen tạo nên các sản phẩm ổn định hơn nhằm kết thúc phản ứng chuỗi điện tử tự do, dẫn đến việc khử Fe3+ về Fe2+, làm dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu xanh lục (Köksal và cộng sự, 2009). Đo độ hấp thụ ở bước sóng 700nm, khi độ hấp thụ càng tăng cho thấy năng lực khử càng mạnh. Kết quả xác định năng lực khử của các dịch chiết từ Nhân trần tía được thể hiện trong hình 3.7. 60
  70. Đồ án tốt nghiệp Năng lực khử của các cao chiết OD 0.900 0.806 0.800 0.751 0.671 Vita C 0.700 ET 0.600 AQ 0.500 0.433 CH 0.400 0.319 EA 0.300 BU 0.200 W 0.100 0.000 g/ml 0 5 10 15 20 25 30 12Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện năng lực khử của các cao chiết 17 Bảng 3.9. Độ hấp thụ quang ở bước sóng 700 nm tại nồng độ 25 g/ml Mẫu Vitamin C Cao Cao Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn Phân (acid cồn nước chloroform Ethyl n-butanol đoạn ascorbic) acetate nước OD 0,806 0,336 0,231 0,245 0,359 0,268 0,315 Trong 6 cao chiết được khảo sát, tại nồng độ 25 g/ml cao chiết ethyl acetate thể hiện hoạt tính cao nhất, bằng 0,45 lần năng lực khử của acid ascorbic, cao cồn có hoạt tính bằng 0,42 lần năng lực khử của acid ascorbic. Các cao còn lại đều thể hiện khả năng khử, trong đó cao nước thể hiện khả năng khử yếu nhất so các mẫu còn lại. Có thể dự đoán hàm lượng các chất khử trong Nhân trần tía chủ yếu tập trung ở độ phân cực trung bình và rất phân cực, riêng cao cồn so 61
  71. Đồ án tốt nghiệp với các cao còn lại chứa nhiều các hợp chất với nhiều độ phân cực, nhờ vào điều này giúp cho cao cồn thể hiện hoạt tính khử nổi bật. Qua xử lý thống kê cho thấy, năng lực khử tương quan ở mức khá với hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid tổng, đây là lý do vì sao các phân đoạn có độ phân cực trung bình và phân cực cao thể hiện khả năng khử rất tốt. Ngoài ra, trong dãy nồng độ khảo sát, hoạt tính năng lực khử của các mẫu vẫn tăng tuyến tính cho thấy giá trị khảo sát chưa đạt ngưỡng cao nhất. Cần khảo sát với dãy nồng độ cao hơn để xác định rõ hơn kết quả năng lực khử. 3.8. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 3.8.1. Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao cồn và cao nước Hoạt tính kháng khuẩn của cao cồn và cao nước từ cây Nhân trần tía được xác định thông qua mức độ kháng khuẩn với 6 vi khuẩn chỉ thị. Kết quả thu được cho thấy Nhân trần tía thể hiện hoạt tính kháng trên 2 vi khuẩn chỉ chỉ thị là Escherichia coli và Enterotoxigenic Escherichia coli – ETEC. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao tổng cồn và cao tổng nước của Nhân trần tía được thể hiện qua bảng 3.10. 18 Bảng 3.10. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao tổng cồn và cao tổng cồn tại nồng độ 100 mg/ml Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Vi khuẩn Cao cồn Cao nước Đối chứng Escherichia coli 10,17 0,29 b - 14,83 0,29 a Enterotoxigenic Escherichia coli 16,50 0,50 b 13,83 0,29 c 30,17 0,29 a –ETEC. 62
  72. Đồ án tốt nghiệp Tại nồng độ 100 mg/ml, trên dòng E. coli chỉ có cao cồn thể hiện hoạt tính kháng với vòng ức chế 10,17 0,29 mm. Cao cồn thể hiện hoạt tính kháng tương đối cao trên chủng ETEC với vòng ức chế 16,5 0,50 mm, cao nước kháng chủng ETEC với vòng ức chế 13,83 0,29 mm. Điều này chứng tỏ trong Nhân trần tía có chứa những hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn đường ruột thuộc chi Escherichia. 3.8.2. Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao phân đoạn Các phân đoạn chloroform, ethyl acetate, n-butanol được pha ở nồng độ 50 mg/ml; riêng phân đoạn nước khảo sát ở nồng độ 100 mg/ml. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của các cao phân đoạn cây Nhân trần tía được thể hiện qua bảng 3.11. 19 Bảng 3.11. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của các cao phân đoạn Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Cao phân Cao phân Cao phân Cao phân Đối Vi khuẩn đoạn đoạn ethyl đoạn n- đoạn nước chứng chloroform acetate butanol Escherichia coli 8,00 0,50b 8,33 0,76b - - 14,83 0,29a Enterotoxigenic 7,50 0,50b 7,83 0,29b 7,50 0,50b 7,83 30,17 Escherichia coli 0,29b 0,29a – ETEC Staphylococcus - - 8,33 0,58b - 14,50 aureus 0,50a 63
  73. Đồ án tốt nghiệp Trên chủng vi khuẩn E. coli chỉ có cao phân đoạn chloroform 50 mg/ml và cao phân đoạn ethylacetate 50 mg/ml thể hiện hoạt tính kháng, kết quả vòng kháng của 2 phân đoạn này không có khác biệt về mặt thống kê. Qua đó cho thấy các hợp chất có khả năng kháng E. coli trong cây Nhân trần tía tập trung chủ yếu ở 2 phân đoạn chloroform và ethyl acetate. Cả 4 phân đoạn đều thể hiện khả năng kháng trên chủng ETEC, đường kính vòng vô khuẩn 4 phân đoạn không có khác biệt thống kê. Chỉ có phân đoạn n-butanol thể hiện khả năng kháng trên chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus với vòng vô khuẩn là 8,33 0,58 mm. Phân đoạn chloroform và phân đoạn ethyl acetate đều thiện hoạt tính kháng trên E. coli và ETEC. Phân đoạn n-butanol thể hiện khả năng kháng trên ETEC và S. aureus. Phân đoạn nước ở nồng độ 100 mg/ml chỉ kháng được chủng ETEC. So sánh với kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của Nhân trần bồ bồ và Nhân trần nam của Lê Tùng Châu và Nguyễn Viết Tựu (1975), Nhân trần tía cho kết quả tương đồng trên chủng Staphylococcus aureus. Đây là những thông tin khoa học đầu tiên về khả năng kháng khuẩn của Nhân trần tía trên các chủng vi khuẩn chỉ thị thông dụng. Do thời gian không cho phép nên chưa thể khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của các cao chiết, ngoài ra có thể tiến hành khảo sát ở nồng độ cao hơn và trên một số chủng vi khuẩn gây bệnh khác. 3.9. Kết quả thử độc tính cấp diễn Quan sát hành vi của chuột sau thời gian thử nghiệm, kết quả cho thấy chuột hoàn toàn khỏe mạnh, di chuyển tốt và linh hoạt, không có dấu hiệu tổn thương. Kết quả khảo sát độc tính của dịch chiết nước và dịch chiết cồn cây Nhân trần tía sau thời gian thử nghiệm 48 giờ được thể hiện ở bảng 3.12. 64
  74. Đồ án tốt nghiệp 20 Bảng 3.12. Kết quả thử độc tính cấp diễn Nhóm chuột thử nghiệm Tỉ lệ sống (%) Dịch chiết nước 100 Dịch chiết cồn 100 Như vậy, qua thử nghiệm cho thấy dịch chiết từ loại cây này hoàn toàn an toàn cho chuột, không thể hiện độc tính ở liều thử nghiệm. So sánh với kết quả của Đỗ Tất Lợi (2004) thử nghiệm độc tính cấp diễn ở liều thử 300 mg/kg thể trọng, liều thử 3000 mg/kg thể trọng gấp 10 lần nhưng vẫn không gây độc cho chuột, chứng tỏ thêm độ an toàn của loài cây này. 3.10. Ảnh hưởng của dịch chiết Nhân trần tía lên lượng đường trong máu Sau tổng thời gian bố trí thí nghiệm theo mô hình giảm lượng đường trong máu đã nêu trong phần 2.3.11, kết quả đo nồng độ đường huyết trong máu được thể hiện qua bảng 3.13. 21 Bảng 3.13. Kết quả nồng độ lượng đường trong máu chuột Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm cao nước Nhóm cao cồn trắng đường thuốc Nhân trần tía Nhân trần tía (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) 6,9 12,2 5,4 6,3 5,2 6,2 11,5 6,4 7,4 4,8 5,9 12,3 6,2 4,4 4,7 6,8 12,5 4,3 4,9 5,3 6,1 12,7 4,6 5,1 5,3 6,6 11,1 4,4 7,2 5,8 65
  75. Đồ án tốt nghiệp 3.10.1. Ảnh hưởng của việc uống glucose liều cao đến nồng độ đường trong máu của chuột 22 Bảng 3.14. Nồng độ đường trong máu của nhóm uống glucose liều cao STT Nghiên cứu N Chỉ số đường trong máu Nhóm 1 Nhóm trắng 6 6,42 0,41 b 2 Nhóm đường 6 12,05 0,62 a Kết quả cho thấy nồng độ đường trong máu của nhóm chuột uống đường đều tăng lên có ý nghĩa so với nhóm trắng chỉ uống nước bình thường. Nồng độ đường trong máu tăng lên 1,88 lần (187,69%) so với nhóm chứng (12,05 mmol/l so với 6,42 mmol/l). So sánh kết quả với bảng 2.2, cho thấy lượng glucose cho chuột uống trong 2 giờ đã tạo được mô hình tăng lượng đường trong máu. 3.10.2. Ảnh hưởng của các loại cao chiết đến nồng độ đường trong máu Nồng độ cao chiết của các cao chiết được thử nghiệm ở những liều khác nhau. Kết quả thực nghiệm hợp lí là dùng liều 50 mg/kg thể trọng cho cao nước và cao cồn từ Nhân trần tía. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.15. 66
  76. Đồ án tốt nghiệp 23 Bảng 3.15. Khả năng làm giảm đường huyết của dịch chiết Nhân trần tía lên đường huyết của nhóm chuột được uống đường glucose ở liều cao Hàm lượng đường Điều trị Liều dùng % Ức chế trong máu (mmol/l) Nhóm - 6,42 0,47 b - trắng Nhóm 2 g Glucose /kg thể trọng 12,05 0,62 a - đường Nhóm 10 mg thuốc /kg thể trọng + thuốc 5,22 0,93 b 56,71% 2 g Glucose /kg thể trọng glibenclamide Nhóm 50 mg cao /kg thể trọng + 5,88 1,26 b 51,18% cao nước 2 g Glucose /kg thể trọng Nhóm 50 mg cao /kg thể trọng + 5,18 0,40 b 56,98% cao cồn 2 g Glucose /kg thể trọng Ghi chú: Giá trị thể hiện là số trung bình (n=6) và độ lệch chuẩn. Kết quả trắc nghiệm phân hạng ở mức ý nghĩa 0,01. Các kết quả có cùng chữ cái thì sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Bảng 3.15 cho thấy nồng độ đường trong máu ở các nhóm thử nghiệm đều thấp hơn nhóm uống đường không dùng thuốc và không có khác biệt với nhóm dùng thuốc. Điều này chứng tỏ dịch chiết từ các loại nguyên liệu có tác dụng trong việc làm giảm đường huyết trong máu (p<0,05) với mức ý nghĩa 95%. Nhóm trắng do chỉ uống nước bình thường nên lượng đường trong máu sau khi thử nghiệm nằm ở mức lý tưởng (6,42 + 0,47 mmol/l). 67
  77. Đồ án tốt nghiệp Nhóm đường do chỉ uống nước đường liều cao (2 g/kg thể trọng) nên sau thời gian thử nghiệm giá trị nồng độ lượng đường trong máu nằm ở mức cao, báo động so với bảng 2.1. Nồng độ lượng đường trong máu của các nhóm gồm nhóm thuốc glibenclamide (5,22 0,93 mmol/l), nhóm uống dịch chiết nước (5,88 1,26 mmol/l) và nhóm uống dịch chiết cồn Nhân trần tía (5,18 0,40 mmol/l) sau thời gian thử nghiệm có kết quả nằm trong mức lý tưởng so với bảng 2.2. Cả hai nhóm uống dịch chiết cồn và dịch chiết nước từ Nhân trần tía có tác động mạnh mẽ đến nồng độ đường trong máu, cao cồn đã ức chế sự tăng đường đến 56,98% so với nhóm đường. Cả ba nhóm này đều không có sự khác biệt thống kê so với nhóm chứng trắng, điều này chứng tỏ cao chiết từ Nhân trần tía rất có tiềm năng trong việc ứng dụng làm thuốc điều trị tiểu đường vì cao tổng ở nồng độ 50 mg/kg thể trọng đã thể hiện hoạt tính giúp ổn định đường huyết. Khả năng giúp làm ổn định đường huyết của cao chiết thực vật xuất phát từ nhiều yếu tố. Các hợp chất tự nhiên có thể ảnh hưởng tích cực lên sự tiết insulin của tuyến tụy hoặc làm tăng sự hấp thu glucose (Nyunai, 2004). Các hợp chất tự nhiên cũng có thể ức chế sự hấp thu glucose trong ruột, dẫn đến làm giảm nồng độ glucose trong huyết thanh (Bhowmik, 2009). Stress oxy hóa đóng một vai trò trong rối loạn chức năng tế bào β và hiện tượng kháng insulin dẫn đến bệnh tiểu đường và tăng đường huyết (Omotayo, 2012). Một số hợp chất tự nhiên như terpenoid và flavonoid có khả năng làm giảm stress oxy hóa, giúp ổn định đường huyết (Mukherjee, 2006; Gonzalez-Burgos, 2012). Trong thành phần của Nhân trần tía chứa chủ yếu là terpenoid, steroid, flavonoid, nên có thể nhờ những hợp chất này mà cây đã thể hiện khả năng làm ổn định đường tốt. Qua các kết quả trên có thể kết luận Nhân trần tía có tiềm năng trong việc giúp ổn định đường huyết trong máu trên cơ thể người. Do đề tài không có nhiều thời gian nên không thể tiến hành khảo sát trên các cao phân đoạn và bố trí thí nghiệm xác định nồng độ dịch chiết tối ưu nhất trong việc làm giảm nồng độ đường trong máu. 68
  78. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Hàm lượng cao thu được khi sử dụng dung môi nước và dung môi cồn để chiết lần lượt là 15,52% và 8,88%. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học thực vật cho thấy trong cây Nhân trần tía có nhiều các nhóm hợp chất tự nhiên như terpenoid, steroid, flavonoid, saponin, tanin và tinh dầu. Xác định được hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid tổng của các cao chiết và cao phân đoạn. Ở thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenol tổng, cao phân đoạn ethyl acetate đạt kết quả cao nhất, thấp nhất là phân đoạn chloroform. Hàm lượng flavonoid tổng đạt kết quả cao nhất ở phân đoạn ethyl acetate, thấp nhất là phân đoạn nước. Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa in vitro theo 2 phương pháp: loại gốc tự do DPPH và xác định năng lực khử; thu được kết quả: - Ở tất cả mẫu khảo sát đều có khả năng loại gốc tự do DPPH, cao phân đoạn ethyl acetate và n-butanol đạt kết quả IC50 tốt nhất so với các mẫu còn lại. Hàm lượng polyphenol có mối tương quan với kết quả kháng oxy hóa. - Ở tất cả mẫu khảo sát đều thể hiện khả năng khử trong dãy nồng độ thử nghiệm (từ 1 g/ml đến 25 g/ml), trong đó cao phân đoạn ethyl acetate đạt kết quả cao nhất, bằng 0,45 lần năng lực khử của Vitamin C. Hoạt tính kháng khuẩn: cao chiết nước từ Nhân trần tía có hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn Enterotoxigenic Escherichia coli – ETEC. Cao chiết cồn có hoạt tính trên chủng Escherichia coli và chủng ETEC. Phân đoạn chloroform và phân đoạn ethyl acetate đều thiện hoạt tính kháng trên E. coli và ETEC. Phân đoạn n- butanol thể hiện khả năng kháng trên ETEC và S. aureus. Phân đoạn nước ở nồng độ 100 mg/ml chỉ kháng được chủng ETEC. 69
  79. Đồ án tốt nghiệp Về khả năng làm giảm nồng độ đường trong máu: kết quả nghiên cứu cho thấy cây Nhân trần tía có khả năng giúp làm ổn định lượng đường trong máu. Hiệu quả giảm nồng độ đường máu của 2 nhóm động vật dùng dịch chiết cồn và dịch chiết nước ở cùng liều 50 mg/kg thể trọng tương đương với nhóm dùng thuốc trị bệnh tiểu đường glibenclamide (10 mg/kg thể trọng). Nghiên cứu sẽ là cơ sở cho việc ứng dụng trong sản xuất thuốc có tác dụng ngăn ngừa bệnh đái tháo đường. 4.2. Kiến nghị Khảo sát thêm một số dung môi và phương pháp khác để tăng hàm lượng trích ly. Tiến hành thử nghiệm trên những mô hình như đái tháo đường với thời gian dài với các liều dùng dịch chiết khác nhau trên các dung môi khác nhau. Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của các cao chiết, thử nghiệm trên một số chủng vi khuẩn gây bệnh khác. Tiếp tục nghiên cứu thêm để phát triển sản phẩm thành thuốc có tác dụng trong việc làm thuốc đặc trị đái tháo đường, viêm gan. 70
  80. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO ❖ Tài liệu Tiếng Việt: 1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập II, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. 2. Bộ Y Tế (2002). Dược điển Việt Nam III, Hà Nội. 3. Đỗ Trung Đàm (2003). Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp của thuốc, NXB Y học. 4. Thiard Franck, Tất Tố Trinh, Nguyễn Thụy Vy, Nguyễn Hoài Nghĩa, Nguyễn Diệu Liên Hoa, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008). Khảo sát hoạt tính ức chế tăng trưởng của các cây thuốc Việt Nam trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela, Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 11(1), 74-81. 5. Lại Thị Ngọc Hà, Vũ Thị Thư (2009). Stress oxy hóa các chất chống oxy hóa tự nhiên, Tạp chí Khoa học và Phát triển, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, 7(5), 667-677. 6. Nguyễn Đức Hạnh, Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Minh Cang (2008). Nghiên cứu hợp chất polyphenol từ cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati - Scrophulariaceae), Tạp chí Dược liệu, 13(1), 5-12. 7. Nguyễn Diệu Liên Hoa, Phạm Đình Hùng (2015). Hóa học các hợp chất tự nhiên, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 8. Phạm Hoàng Hộ (1999). Cây cỏ Việt Nam, Tập 2. Nhà xuất bản Trẻ, Tp.HCM, 902-904. 9. Trần Hùng (2004). Phương pháp nghiên cứu dược liệu. Đại học Y Dược TP.HCM. 71
  81. Đồ án tốt nghiệp 10. Vũ Mạnh Hùng, Bùi Thị Bích Vân (2008). Tác dụng bảo vệ gan của protecliv trên thực nghiệm, Tạp chí Dược liệu, 13(1), 40-44. 11. Đỗ Tất Lợi (2004). Những Cây Thuốc Và Vị Thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 625-629. 12. Dương Thị Mộng Ngọc, Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Thanh Tâm, Trần Công Luận (2006). Tác dụng bảo vệ gan của cao phối hợp từ lá Đinh lăng và Nhân trần Tây Ninh, Nghiên cứu phát triển dược liệu và đông dược ở Việt Nam, Viện Dược liệu. 13. Dương Hồng Nhung (2015). Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Bồ bồ Adenosma indiana (Lour.) Merr. phân bố ở địa bàn huyện Đại Từ - tỉnh Thái Nguyên. Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên. 14. Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Bộ môn Di Truyền. Thử nghiệm SRB, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM. 15. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007). Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 16. TCVN 9745-1:2013 (ISO 14502-1:2005). Phần 1: Hàm lượng polyphenol tổng số trong chè - Phương pháp đo màu dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu. 17. Nguyễn Hoàng Tuấn (2000). Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá của Nhân trần Adenosma caeruleum và một số dược liệu khác, Luận văn tốt nghiệp Dược sỹ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội. 18. Viện Dược Liệu - Bộ Y Tế (2006). Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ Thuật. ❖ Tài liệu Tiếng Anh: 19. Adam, G., Porzel, A., Sung, T. V., Schmidt, J. (1992). A monoterpenoid peroxyde from Adenosma caeruleum. Phytochemistry, 31(8), 2885-2887. 72