Đồ án Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây lan một lá Nervilia aragoana

105 trang thiennha21 13/04/2022 6000

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây lan một lá Nervilia aragoana", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_khao_sat_hoat_tinh_sinh_hoc_cua_cao_chiet_va_cac_cao_p.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây lan một lá Nervilia aragoana

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN TỪ CÂY LAN MỘT LÁ NERVILIA ARAGOANA Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. Trần Thị Ngọc Mai Sinh viên thực hiện : Trịnh Kim Thảo MSSV: 1311100686 Lớp: 13DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2017
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của em. Các số liệu và kết quả nêu trong đồ án là đúng sự thật và chƣa có ai công bố ở các công trình khác. TP.HCM, ngày 6 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Trịnh Kim Thảo
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô Trần Thị Ngọc Mai – Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ TPHCM, ngƣời đã tận tình dìu dắt, hƣớng dẫn và chỉ bảo em trong suốt thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến thầy Mai Đình Trị - Trƣởng phòng Hợp chất thiên nhiên hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, ngƣời trực tiếp quản lí, giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp tại đây và em cũng xin cảm ơn đến những anh chị đang công tác tại đơn vị đã nhiệt tình và chỉ bảo để em có thể hoàn thành tốt đồ án nghiên cứu của mình. Xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ TPHCM cũng nhƣ nhà trƣờng đã tạo điều kiện tốt nhất cho em đƣợc học tập nghiên cứu để hoàn thành đồ án này. Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến chị Đỗ Phƣơng Vy, ngƣời đã hỗ trợ và cho em nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Xin gửi lời cảm ơn đến những bạn bè, anh chị đang nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ TPHCM đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ cùng nhau vƣợt qua khó khăn để hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp. Cuối cùng xin cảm ơn những ngƣời thân yêu trong gia đình dành cho tôi sự quan tâm, chia sẻ, động viên, khích lệ trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu để tôi hoàn thành đồ án này. Do thời gian thực hiện có hạn, kiến thức còn nhiều hạn chế nên đồ án thực hiện chắc chắn không tránh khỏi những sai sót nhất định. Em rất mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp của thầy cô để em có thêm kinh nghiệm và tiếp tục hoàn thiện đồ án tốt nghiệp của mình. TP.HCM, ngày 6 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Trịnh Kim Thảo
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 2 3. Mục tiêu nghiên cứu 3 4. Nội dung nghiên cứu 3 5. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3 5.1 Đối tƣợng nghiên cứu 3 5.2 Phạm vi nghiên cứu 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 5 1.1 Tổng quan về cây Lan một lá (Nervilia aragoana) 5 1.1.1 Phân loại khoa học và phân bố 5 1.1.1.1 Phân loại khoa học 5 1.1.1.2 Phân bố 6 1.1.2 Đặc điểm thực vật 6 1.1.3 Thành phần hóa học 7 1.1.4 Giá trị dƣợc liệu 9 1.1.5 Các nghiên cứu trên thế giới về Lan một lá (Nervilia aragoana) 11 1.2 Tổng quan về các phƣơng pháp chiết xuất 12 1.2.1 Các quá trình xảy ra trong chiết xuất 12 1.2.1.1 Sự hòa tan 13 1.2.1.2 Sự khuếch tán 13 1.2.1.3 Quá trình thẩm tích 14 1.2.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết xuất 15 1.2.2.1 Nguyên liệu 15 i
Đồ án tốt nghiệp 1.2.2.2 Dung môi 16 1.2.2.3 Kỹ thuật chiết 17 1.2.3 Các phƣơng pháp chiết 18 1.2.3.1 Phƣơng pháp ngâm 18 1.2.3.2 Chiết bằng phƣơng pháp ngấm kiệt 20 1.2.3.3 Các phƣơng pháp chiết khác 21 1.3 Tổng quan về hoạt tính kháng oxy hóa 21 1.3.1 Giới thiệu chung 21 1.3.1.1 Khái niệm về stress oxy hóa 21 1.3.1.2 Sự hình thành các gốc tự do của oxy trong cơ thể 22 1.3.1.3 Sự phòng vệ của cơ thể chống lại gốc tự do 24 1.3.2 Một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính kháng oxy hóa 26 1.3.2.1 Flavonoid 26 1.3.2.2 Terpenoid 28 1.1.3 Các phƣơng pháp xác định tác dụng chống oxi hóa 29 1.1.3.1 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA 29 1.1.3.2 Các phƣơng pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 30 1.4 Tổng quan về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm 32 1.4.1 Khái niệm chung 32 1.4.2 Cơ chế đối kháng 33 1.4.3 Một số loài vi khuẩn, nấm gây bệnh thƣờng gặp 33 1.4.3.1 Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) 33 1.4.3.2 Trực khuẩn (Escherichia coli) 34 1.4.3.2 Nấm mốc Aspergillus 36 1.4.3.3 Nấm sợi Fusarium 37 1.4.3.4 Nấm Neoscytalidium dimidiatum 38 1.4.4 Các phƣơng pháp thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm in vitro 40 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 42 ii
Đồ án tốt nghiệp 2.1.1 Thời gian nghiên cứu 42 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 42 2.2 Vật liệu nghiên cứu 42 2.2.1 Nguồn mẫu 42 2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị 42 2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 42 2.3.1 Thiết bị 42 2.3.2 Dụng cụ 43 2.3.3 Hóa chất 43 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 43 2.4.1 Phƣơng pháp thu và xử lý mẫu 43 2.4.2 Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận cao chiết 44 2.4.2.1 Phƣơng pháp chiết ngâm dầm 44 2.4.2.2 Phƣơng pháp chiết bằng máy Soxhlet 45 2.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa bằng phƣơng pháp DPPH 47 2.4.4 Đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch (well diffusion agar method) 49 2.4.5 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 51 2.4.6 Phƣơng pháp xử lí số liệu 53 2.5 Bố trí thí nghiệm 53 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của phƣơng pháp tách chiết đến tỷ lệ thu hồi của cao chiết cây N. aragoana 60 3.2 Kết quả khảo sát quá trình chiết phân đoạn từ cao chiết cây N. aragoana 61 3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự do DPPH của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana 63 3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn cây N. aragoana 68 iii
Đồ án tốt nghiệp 3.4.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết và các cao phân đoạn cây N. aragoana 68 3.4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn cây N. aragoana 70 3.5 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn đối với các chủng vi sinh vật gây bệnh 75 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 4.1 Kết luận 78 4.2 Kiến nghị 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DMSO : Dimethyl sulfoxide DPPH : 1,1 diphenyl – 2 – picrylhydrazyl EA : Ethyl Acetate EtOH : Ethanol MeOH : Methanol MIC : Minimum Inhibitory Concentration : Nồng độ ức chế tối thiểu PDA : Potato Dextro Agar PE : Petroleum ether TSA : Tryptic Soy Agar TSB : Tryptone Soya Broth v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1. Giá trị I % ức chế gốc tự do DPPH của cao chiết Ethanol 63 Bảng 3.2. Giá trị I % ức chế gốc tự do DPPH của cao phân đoạn PE 64 Bảng 3.3. Giá trị I % ức chế gốc tự do DPPH của cao phân đoạn EA 65 Bảng 3.4. Giá trị I % ức chế gốc tự do DPPH của cao phân đoạn nƣớc 66 Bảng 3.5. Giá trị I % ức chế gốc tự do DPPH của Vitamin C 67 Bảng 3.6. Kết quả so sánh hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn đối với 5 chủng vi sinh vậy gây bệnh 74 Bảng 3.7. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn đối với 5 chủng vi sinh vật gây bệnh 76 vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Ảnh Nervilia aragoana 7 Hình 1.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus 34 Hình 1.3. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi với kích thƣớc 2 µm 35 Hình 1.4. Nấm mốc Aspergillus 37 Hình 1.5. Nấm sợi Fusarium 38 Hình 1.6. Nấm Neoscytalidium dimidiatum 39 Hình 2.1. Mẫu bột N. aragoana 44 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 54 Hình 2.3. Mẫu bột chiết bằng hệ thống Soxhlet 56 Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ thu hồi cao chiết cây N. aragoana 60 Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ thu hồi các cao phân đoạn từ cao chiết cây N. aragoana 62 Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn % ức chế của cao Ethanol 63 Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn % ức chế của cao phân đoạn PE 64 Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn % ức chế của cao phân đoạn EA 65 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn % ức chế của cao phân đoạn nƣớc 66 Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn % ức chế của mẫu Vitamin C 67 Hình 3.8. Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng kháng sinh Ampicillin đối với vi khuẩn Escherichia coli 69 Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng kháng sinh Ampicillin đối với vi khuẩn S.aureus 70 Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng thuốc Ketoconazole đối với chủng nấm Aspergillus niger 71 Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng thuốc Ketoconazole đối với chủng nấm Fusarium solani 72 Hình 3.12. Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng thuốc Ketoconazole đối với chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum 73 vii
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây dƣợc liệu từ lâu đƣợc xem là cơ sở để điều trị các bệnh truyền nhiễm khác nhau trong y học cổ truyền, và một loạt các hợp chất đƣợc biết đến mang tính chất điều trị. Các hợp chất có nguồn gốc thực vật đang có tầm quan trọng lớn trong dƣợc phẩm và các ứng dụng điều trị vì thƣờng có ít tác dụng phụ và không gây độc. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Theo kết quả điều tra của Viện Dƣợc Liệu gần đây đƣợc ghi nhận đƣợc 3948 loài thực vật và nấm lớn có công dụng làm thuốc, 52 loài tảo biển, 408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc ở Việt Nam. Kết quả này cũng đã cho thấy nguồn dƣợc liệu ở nƣớc ta rất phong phú. Con số này sẽ còn tăng thêm, nếu đi sâu điều tra cụ thể hơn một số nhóm động - thực vật tiềm năng. Stress oxy hóa, gây ra bởi các gốc oxy, đuợc cho là nguyên nhân chính trong các bệnh thoái hóa khác nhau nhƣ ung thƣ, xơ vữa động mạch, loét dạ dày. Chất chống oxy hoá là những hợp chất giúp ức chế nhiều phản ứng oxy hóa gây ra bởi các gốc tự do nhƣ vậy nhƣ oxy đơn, superoxide, gốc peroxy, hydroxyl các gốc tự do và peroxy nitrate, do đó ngăn ngừa hoặc trì hoãn thiệt hại cho tế bào và các mô. Mặc dù có một số chất chống oxy hoá tổng hợp các hợp chất nhƣ butylated hydroxyl anisole (BHA) và butyl hóa toluene hydroxyl (BHT), thƣờng đƣợc sử dụng trong thực phẩm chế biến, tuy nhiên nhiều nghiên cứu đã báo cáo rằng các hợp chất này có thể có tác dụng phụ [21]. Bên cạnh những loại thuốc chống nấm, kháng oxy hóa đƣợc tổng hợp bằng con đƣờng hóa học đƣợc bày bán tràn lan trên thị trƣờng không rõ độc hại thì tình trạng tiêu thụ lạm thuốc kháng sinh tại Việt Nam ngày càng gia tăng. Một nghiên cứu của Bộ Y tế trong thời gian gần đây đã chỉ ra rằng, việc tự ý sử dụng thuốc kháng sinh của ngƣời dân Việt Nam ở thành thị là 88%, trong khi ở nông thôn lên tới 91%, không phải bệnh viện tuyến trung ƣơng sử dụng thuốc kháng sinh nhiều hơn các bệnh viện địa phƣơng. Mà ngƣợc lại, tỉ lệ sử dụng kháng sinh ở các bệnh 1
Đồ án tốt nghiệp viện tuyến trung ƣơng chỉ chiếm gần 30% chi phí điều trị trong khi các bệnh viện tuyến tỉnh là 35%, tuyến huyện là 45%, sự quan tâm đến y học cổ truyền đã tăng lên. Theo WHO đã đƣa ra cảnh báo đến năm 2050, tình trạng kháng thuốc kháng sinh có thể là nguyên nhân gây tử vong cho 10 triệu ngƣời trên toàn cầu. Đáng báo động hơn, trong số các quốc gia có tình trạng kháng thuốc kháng sinh nghiêm trọng thì Việt Nam là một trong số những nƣớc đứng đầu. Để tìm ra giải pháp cho vấn đề sản xuất thuốc kháng kháng sinh, thuốc chống nấm, chống oxy hóa đồng thời giảm chi phí trong sản xuất và tiêu dùng dƣợc liệu, các nhà khoa học bắt đầu tiềm kiếm và nghiên cứu các loài cây có chứa hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc. Để làm đƣợc điều đó việc đầu tiên là cần phải xác định hoạt tính trị liệu và độc tính của một số loài thực vật trƣớc khi dùng làm thuốc là điều rất cần thiết. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây Lan một lá (Nervilia aragoana)” nhằm nâng cao giá trị sử dụng và góp phần vào kho tàng cây thuốc đặc hữu của Việt Nam. 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc Tại Việt Nam vẫn chƣa tìm thấy tài liệu về nghiên cứu hoạt tính sinh học của loài cây Lan một lá, tuy nhiên ở một số nƣớc trên thế giới đã có những nghiên cứu liên quan đƣợc công bố: - Năm 2009, K. Himakar Reddy, P.V.G.K. Sharma, và cộng sự đã so sánh hoạt tính chống nấm và chống oxy hoá từ chiết xuất Ethyl acetate của toàn bộ cây Nervilia aragoana Gaud. (Orchidaceae) với chiết xuất Ethanol của Atlantica monophylla Linn. (Rutaceae) [21]. - Năm 2013, Elizabeth Thomas, Aneesh T. P, và cộng sự, đã nghiên cứu xác định thành phần hóa học có trong thân rễ của Nervilia aragoana bằng phƣơng pháp quang phổ [16]. - Năm 2013, Elizabeth Thomas và cộng sự đã nghiên cứu về đặc điểm, tác dụng dƣợc lý của cây Lan một lá [18]. 2
Đồ án tốt nghiệp - Năm 2013, EK Dilipkurma và GR Janardhana công bố kết quả nghiên cứu hoạt tính tái tạo tận, tuyến tụy và bình thƣờng hóa lƣợng đƣờng trong máu từ các chiết xuất Nervilia aragoana trên đối tƣợng chuột [15]. 3. Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết và các cao phân đoạn cây Nervilia aragoana. Xác định nồng độ ức chế 50% gốc tự do (IC50). - Khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn cây Nervilia aragoana. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn cây Nervilia aragoana. 4. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá ảnh hƣởng của phƣơng pháp tách chiết đến tỷ lệ thu hồi cao chiết cây Nervilia aragoana. Xác định hiệu suất chiết giữa các phƣơng pháp tách chiết. - Xác định tỷ lệ thu hồi các cao phân đoạn sau trích ly của cao chiết cây Nervilia aragoana. - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự do từ cao chiết và các cao phân đoạn cây Nervilia aragoana. Xác định nồng độ ức chế 50% gốc tự do (IC50) từ cao chiết và các cao phân đoạn cây Nervilia aragoana. - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn cây Nervilia aragoana đối với các chủng vi khuẩn và nấm gây bệnh. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn cây Nervilia aragoana. 5. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 5.1 Đối tƣợng nghiên cứu Thực hiện nghiên cứu trên đối tƣợng cây Nervilia aragoana, tiến hành khảo sát các hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm từ cao chiết các cao phân đoạn của loài cây này. 5.2 Phạm vi nghiên cứu Mẫu cây Nervilia aragoana đƣợc tách chiết từ dung môi Ethanol sau khi thu cao chiết tiến hành trích ly cao chiết với các loại dung môi khác nhau từ kém phân 3
Đồ án tốt nghiệp cực đến phân mạnh: Petroleum ether, Ethyl acetate, nƣớc. Sau đó cao chiết và các cao phân đoạn thu đƣợc tiến hành khảo sát khả năng kháng oxy hóa bắt gốc tự do DPPH (1,1-dihenyl-2-picrylhydrazyl); khả năng kháng khuẩn trên các vi khuẩn gây bệnh: Escherichia coli, Staphylococcus aureus; khả năng kháng nấm trên các chủng nấm gây bệnh nhƣ: Fusarium solani, Aspergillus niger, Neoscytalidium dimidiatum. 4
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây Lan một lá (Nervilia aragoana) 1.1.1 Phân loại khoa học và phân bố 1.1.1.1 Phân loại khoa học Hệ thống phân loại của Nervilia aragoana [34] Kingdom Plantae Division Angiospermae Class Monocotyledoneae Order Asparagales Family Orchidaceae Subfamily Epidendroideae Tribe Gastrodieae Subtribe Nervilliinae Genus Nervilia Species Nervilia aragoana GAUD Nervilia bao gồm một số loài sau: Nervilia aragoana Commons ex Gaudich. (Trân châu xanh, Thanh thiên quỳ xanh), Nervilia fordii (Hance) Schltr. (Trân châu, Thanh thiên quỳ, Lan một lá, Lan cờ), Nervilia plicata (Andrews) Schltr. (Trân châu xếp, Thanh thiên quỳ lá xếp) [2], [35]. Một số tên gọi khoa học khác của Nervilia aragoana: Aplostellis aragoana (Gaudichaud-Beaupré) Ridley; Aplostellis flabelliformis (Lindley) Ridley; Epipactis carinata Roxburgh; Nervilia carinata (Roxburgh) Schlechter; Nervilia flabelliformis (Lindley) Tang & Wang; Nervilia scottii (Reichenbach f.) Schlechter; Nervilia tibetensis Rolfe; Nervilia yaeyamensis Hayata; Pogonia carinata (Roxburgh) Lindley; Pogonia gracilis Blume; Pogonia flabelliformis Lindley; Pogonia nervilia Blume; Pogonia scottii Reichenbach f. [36], [37], [38], [39]. 5
Đồ án tốt nghiệp 1.1.1.2 Phân bố N. aragoana là một loài hoa phong lan sống trên mặt đất (địa lan) đƣợc tìm thấy chủ yếu ở những khu rừng rậm rạp ẩm ƣớt ở Ấn Độ [40], [41]. Nó chủ yếu đƣợc tìm thấy trong các khu rừng của Darjeeling Himalaya trồng ở độ cao 400 – 1000 m [28]. Nó cũng đƣợc báo cáo là có trong dãy McIlwraith ở Queensland, Australia, từ độ cao 0 – 150 mét. Vì vậy cây chủ yếu đƣợc tìm thấy ở Ấn Độ, Malaysia, bắc Thái Lan, Lào, Miến Điện, Indonesia và New Guinea. Ở nƣớc ta Lan một lá mọc trên kẽ đá, nơi rợp vùng núi đá vôi và ở nơi ẩm vùng chân núi Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai, Hoà Bình, Ninh Bình. Cây chỉ mọc ở khe núi, nơi thấp và ẩm ƣớt, dƣới bóng cây to. Miền núi phía bắc gồm: Văn Uyên, Cao Lộc, Đồng Mỏ, Hữu Lũng, Trùng Kháng, Quảng Uyên (Cao Bằng). Gần đây xuất hiện tại các tỉnh: Lao Cai, Hà Giang, Tuyên Quang, Hà Tây, Hoà Bình, Sơn La, Lai Châu Loài cây này cho ra hoa quả vào khoảng độ tháng 3 – 6. Thu hái vào mùa thu, rửa sạch, phơi khô, vò nhẹ rồi phơi lại. Phơi và vò ngày 2 – 3 lần cho tới khô hẳn. Cũng có thể thu hái toàn cây quanh năm, dùng tƣơi hay phơi khô. Hiện loài cây này đang bị suy giảm nghiêm trọng do chặt phá rừng hủy hoại nơi cƣ trú và nhất là đối tƣợng săn tìm khai thác "tuyệt diệt". Nervilia aragoana nằm trong danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thƣơng mại. Vì vậy cần có biện pháp xây dựng khu bảo tồn và nhân giống Lan trong các vƣờn quốc gia và di chuyển một lƣợng cây sống có thể của loài này về khu vực bảo tồn và chăm sóc. 1.1.2 Đặc điểm thực vật [17] Cây thân thảo cao dƣới 20 cm, mọc ở đất, có củ chìm, thân rễ tròn to 15 mm, ra hoa và lá không đồng thời (cho ra hoa trƣớc rồi mới đến lá). Cuống lá cao 10 – 15 cm. Lá màu xanh, đôi khi có chấm màu tía sẫm, không có lông, dài 12 cm, rộng 16 cm, hình tim rất rộng, mép hơi lƣợn sóng, thùy gốc ít nhiều phủ lên nhau. Cụm hoa cao tới 30 cm, cán mang vài bẹ nhỏ, dài 1,5 cm, hẹp. Cuống và bầu dài 6
Đồ án tốt nghiệp 8 – 10 mm. Lá đài và cánh hoa hẹp, xoè, màu xanh nhợt, dài 2 – 2,5 cm. Môi ngắn hơn lá đài, màu trắng có các gân màu xanh hoặc tía nhạt; thùy bên nhỏ, hình tam giác, đứng, đỉnh xòe; thùy giữa hình trứng có mép cong, có lông ở trên gân. Cây mới tái sinh bằng chồi và hạt. Mọc rải rác trong rừng thƣa, ở độ cao 200 – 500 m. Hình 1.1. Ảnh Nervilia aragoana [42] 1.1.3 Thành phần hóa học Bhogaonkar và cộng sự cho biết thành phần hóa học của N. aragoana bằng cách sử dụng các xét nghiệm nhận dạng thông thƣờng. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng cây N. aragoana có chứa hợp chất alkaloids, flavonoid, triterpenoid, khoáng chất, acid amin. Lá của cây đƣợc báo cáo là chứa flavonoid, glycosid cyanogenic, terpenoid và tannin [25], [27]. Beena và Radhakrishnan cũng báo cáo các thành phần hóa học loài cây này bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) các vết chất khác nhau đƣợc phát hiện có trong chiết xuất cao Methanolic của N. aragoana bằng cách soi đèn UV và phun thuốc thử hiện màu. Các tác giả cũng đã báo cáo về phân tích thành phần hóa học các chất chiết xuất từ thân, rễ và lá bằng các phƣơng pháp xác định thành phần hóa học khác nhau. Phân tích từ chiết xuất nƣớc của rễ đã cho thấy sự hiện diện của flavonoid, glycoside, sterol và tannin. Và phân tích từ chiết xuất nƣớc của lá cho thấy sự có mặt của flavonoids, glycosides và tannin. Họ cũng ghi nhận sự hiện diện của alkaloid có trong thành phần hóa học loài cây này [14]. 7
Đồ án tốt nghiệp Tohru và cộng sự đã báo cáo các acid béo khác nhau trong các chiết xuất khác nhau của toàn bộ cây khô. Các chiết xuất ether của toàn bộ cây đã đƣợc phân tích bởi GC – MS sau khi methyl hóa và báo cáo có chứa các acid béo nhƣ methyl palmitate, methyl lenolate và methyl lenolinate. Phần trung tính của chiết xuất ethereal đƣợc báo cáo chứa phytol, glyceride hỗn hợp, hai chất kết tinh tạo thành hỗn hợp các rƣợu triterpene. Hỗn hợp này đã đƣợc xác định có chứa cycloeucalenol acetate, dihydrocyclonervilol acetate, dihydrocycloeucalenol acetate (Sau khi acetyl hóa), hai triterpene cyclonervilol và cyclohomonervilol theo phân tích GC – MS [32]. Loài cây này cũng báo cáo có chứa 24 – Isopropenyl cholesterol [29]. Các chiết xuất methanolic đƣợc báo cáo là chứa một lƣợng lớn L – norelucine bằng cách so sánh trực tiếp với mẫu thực bằng phƣơng pháp phân tích acid amin. Phần hòa tan của chiết xuất methanolic đƣợc báo cáo có chứa hợp chất giống nhƣ chiết xuất ethereal [32]. Các cấu trúc hóa học thành phần hóa học đƣợc xác định có trong chiết xuất của N. aragoana báo cáo bởi Tohru Kikuchi đƣợc đƣa ra dƣới đây [32]: CH3 (CH2)3 (CH2 CH=CH)2 (CH2)7 COOCH3 Methyl linolate CH3 (CH2CH=CH)3 CH7 COOCH3 Methyl linolenate Phytol 8
Đồ án tốt nghiệp Cycloeucalenol acetate Dihydroeucalenol acetate Stigmasterol 1.1.4 Giá trị dược liệu Loài cây N. aragoana đã có nhiều sử dụng trong y học cổ truyền và cũng trong y học dân gian. Củ và lá là những phần chính đƣợc dùng làm thuốc [40]. Cây có tác dụng làm mát, thuốc lợi tiểu và thuốc bổ. Hữu ích trong chữa đau dạ dày, đau thắt 9
Đồ án tốt nghiệp ngực, đau thắt cổ, bệnh hoại tử [27]. Củ đƣợc sử dụng làm thuốc cho điều trị chứng động kinh, trong bệnh tiểu tiện, tiêu chảy và hen suyễn [40, 14]. Củ tƣơi đƣợc làm sạch đúng cách đƣợc tin rằng có thể giúp kiểm soát đói và khát [27], [33]. N. aragoana còn có tác dụng trong hỗ trợ điều trị bệnh tâm thần, liệt nửa ngƣời, ho và nôn mửa [40]. Loài cây này đang đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc đƣợc nhiều bộ lạc của Ấn Độ sử dụng. Các bộ lạc đã phát triển dƣợc phẩm riêng của họ bằng những kiến thức truyền thống của họ về việc sử dụng thuốc của thực vật từ các thử nghiệm và phƣơng pháp xƣa. N. aragoana đang đƣợc sử dụng bởi bộ lạc Bhilla của Maharashtra. Bột củ đƣợc đắp trên trán cho chữa trị bệnh đau đầu [31]. Có một vài thông báo rằng các củ của cây này đang đƣợc sử dụng để điều trị bệnh kiết lỵ máu do bộ tộc cƣ dân của cao nguyên Amarkantak, Madhya Pradesh, Ấn Độ. Trong phƣơng pháp điều trị bệnh này, ngƣời dân tộc đã sử dụng củ của cây N. aragoana và đƣợc báo cáo là dùng làm hỗn hợp với mật ong 5 (ml), liều dùng là uống hai lần một ngày trong năm ngày [13]. Các lá của cây có thể dùng làm thuốc bảo vệ cho phụ nữ sau khi sinh [33], [14], [26]. Các nƣớc sắc của lá cây này đƣợc sử dụng làm thuốc bổ cho phụ nữ và củ đƣợc sử dụng nhƣ là một chất kích thích tăng lƣợng sữa mẹ [27]. Theo Dƣợc học cổ truyền Tàu và Việt Nam: Toàn cây và có khi chỉ lá đƣợc dùng làm thuốc. Vị thuốc đƣợc xem là: Vị đắng, tính mát. Thân củ có tác dụng tán ứ, tiêu thụng; trấn tinh, chỉ thống. Toàn cây thanh nhiệt, giải độc, nhuận phế, chỉ khái. Đƣợc dùng trị bệnh tâm thần, ho, hạ đàm. Làm nƣớc sắc, hay ngâm ruợu trị thƣơng tổn, đau đớn, té ngã [35]. Theo tài liệu Trung Quốc thuốc có tác dụng trị lao phổi, làm mát phổi. Dùng ngoài làm thuốc xoa bóp, đáng gió giải cảm. Thƣờng ngâm trong rƣợu. Công dụng, chỉ định và phối hợp: ở nƣớc ta đồng bào sử dụng lá làm thuốc giải độc, nhất là ngộ độc nấm. Ngƣời ta dùng 2 – 3 lá phơi khô thái nhỏ, hãm với nƣớc sôi trong ít phút rồi chiết nƣớc uống. Ngày uống 2 lần. Ngƣời ta cũng dùng nó làm thuốc bồi dƣỡng cơ thể, thuốc bổ và mát phổi, chữa lao phổi, ho. Ngày dùng 10 – 20 lá dƣới dạng 10
Đồ án tốt nghiệp thuốc sắc, thuốc hãm, hấp đƣờng hoặc chế biến thành cao lỏng để uống. Dùng ngoài lấy lá tƣơi giã nát, đắp lên các chỗ đau nhức hoặc đắp mụn nhọt các vết lở. Ở Trung Quốc, toàn cây đƣợc dùng trị: Ho lao phổi, viêm phế quản, viêm miệng, viêm họng cấp tính, tạng lao, trẻ em hấp thụ kém và nuôi dƣỡng kém, rối loạn kinh nguyệt, đòn ngã tổn thƣơng, viêm mủ da. Liều dùng 10 – 15 g dạng thuốc sắc hoặc ngâm rƣợu. Dùng ngoài giã củ tƣơi vừa đủ đắp vào chỗ đau [43]. 1.1.5 Các nghiên cứu trên thế giới về Lan một lá (Nervilia aragoana) Năm 2009, K. Himakar Reddy, P.V.G.K. Sharma, và O.V.S. Reddy đã nghiên cứu chiết xuất Ethyl acetate của toàn bộ cây Nervilia aragoana Gaud. (Orchidaceae) và chiết xuất Ethanol từ bộ phận lá của Atlantica monophylla Linn. (Rutaceae) đƣợc đánh giá cho các hoạt động kháng nấm và kháng oxy hoá. Kết quả nghiên cứu cho thấy chất này có hoạt tính ức chế hơn so với kháng nấm. Thứ tự của các giá trị MIC cho Nervilia aragoana là: Saccharomyces cerevisiae > Aspergillus niger > Aspergillus fumigatus > Cryptococcus neoformans. Đối với loài Atlantica monophylla là Cryptococcus neoformans > Candida albicans > Aspergillus niger. Thử nghiệm phƣơng pháp DPPH đƣợc tiến hành để đánh giá khả năng chống oxy hoá. Chiết xuất N. aragoana (85%) có hoạt tính bắt gốc tự do nhiều hơn A. monophylla (66%) [21]. Năm 2013, Elizabeth Thomas, Aneesh T. P, Della Grace Thomas, R. Anandan đã nghiên cứu tất cả các chất chiết xuất đƣợc tập trung và phân tích bằng cách sử dụng phƣơng pháp sắc ký khí quang phổ kế để xác định các thành phần hoá học có trong thân rễ của N. aragoana. Kết quả phân tích đƣợc trong chiết xuất Ethanol tập trung chứa một loạt các acid béo. Hợp chất 5 – hydroxyl – 2 - (hydroxyl methyl) – 4H – pyran – 4 – one có đặc tính chống nấm kháng khuẩn và ức chế sản sinh melanin. Các chất chống viêm nhƣ acid hexadecanoic, hƣơng thơm và hƣơng liệu nhƣ 2 – octenoic acid, Acid pentadecanoic cũng đƣợc tiềm thấy trong chiết xuất này. Chiết xuất Ether chứa acid hexadecanoic có hoạt động chống viêm, các chất hƣơng liệu nhƣ acid pentadecanoic, 2 – chloroethyl linoleate, Isoamyl laureate là 11
Đồ án tốt nghiệp chất làm sạch da, acid phthalic đƣợc sử dụng trong rối loạn thoái hoá cơ tim. Các chiết xuất Methanol chứa vitamin C có hoạt tính chống oxy hoá. Các lớp nƣớc tách ra khỏi chiết xuất Ethanol chứa 2 – propyl thiophene là một chất tạo hƣơng vị. Nghiên cứu này tìm thấy sự tiềm năng của bộ phân rễ thân cây Nervilia aragoana [16]. Năm 2013, Elizabeth Thomas, Aneesh T. P, Della Grace Thomas đã công bố kết quả nghiên cứu đặc điểm, tác dụng dƣợc lý của cây Lan một lá. N. aragoana bao gồm alkaloid, flavonoid, triterpenoid, khoáng chất, amino acid glycoside tannin Loài thực vật này đƣợc sử dụng làm thuốc lợi tiểu và thuốc bổ, có ích trong bệnh u nắng, đau thắt ngực, đau bụng, sự mất ổn định về tinh thần, bệnh huyết khối, động kinh [18]. Năm 2013, EK Dilipkurma, GR Janardhana đã nghiên cứu hoạt tính tái tạo tận, tuyến tụy và bình thƣờng hóa lƣợng đƣờng trong máu từ các chiết xuất Nervilia aragoana trên đối tƣợng chuột. Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát tiềm năng hồi phục và tái tạo từ chiết xuất cồn của Nervilia aragoana Gaud. Trên các mô hình bệnh tiểu đƣờng loại 2 gây ra streptozotocin – nicotinamide. Ở nồng độ 5 mg/ml chiết xuất thực vật, nồng độ glucose máu trong chuột NIDDM cho thấy 65,91% và 76,58% giảm mức đƣờng huyết vào ngày 0 và ngày 30 ngày. Thiệt hại gây ra cho mô thận là không đáng kể hoặc không nhìn thấy. Urea và creatinine huyết thanh giảm 65,00% và 71,00% vào ngày 30. Mức độ thận và tụy giảm xuống tƣơng ứng là 76,47% và 74,19%. Những kết quả này chứng tỏ tiềm năng chống lại bệnh đái tháo đƣờng và tái phát của Nervilia aragoana Gaud [15]. 1.2 Tổng quan về các phƣơng pháp chiết xuất [6] 1.2.1 Các quá trình xảy ra trong chiết xuất Trong chiết xuất, nguyên liệu thực vật thƣờng đƣợc chia nhỏ thành các tiểu phần có đƣờng kính thích hợp, thƣờng từ 0,1 – 2 mm, các tế bào ngoài cùng thƣờng bị “vỡ” có thể tiếp xúc trực tiếp với dung môi, trong khi các tế bào phía bên trong vẫn còn nguyên vẹn dung môi và chất tan phải đi qua vách tế bào. Vì thế, trong chiết xuất có 3 quá trình quan trọng đồng thời xảy ra là: 12
Đồ án tốt nghiệp - Sự hòa tan - Sự khuếch tán - Sự thẩm thấu qua vách tế bào 1.2.1.1 Sự hòa tan Khi cho dƣợc liệu tiếp xúc với dung môi, dung môi sẽ thấm vào tế bào dƣợc liệu. Các chất tan sẽ hòa tan vào dung môi xung quanh nó tạo thành dung dịch. Quá trình hòa tan xảy ra nhanh hay chậm phụ thuộc vào khả năng hòa tan của chất tan trong dung môi, diện tích bề mặt tiếp xúc của chất tan với dung môi, nhiệt độ và sự khuếch tán của chất tan trong dung môi. Nồng độ dung dịch phụ thuộc vào bản chất của dung môi, chất tan, số lƣợng của dung môi và chất tan. Sự hòa tan chủ yếu là một quá trình vật lý trong đó chất tan đƣợc solvat hóa và kéo vào dung môi. Tuy nhiên quá trình hóa học đôi khi cũng xảy ra nhƣ khi hòa tan các chất kiềm trong dung môi có tính acid hay ngƣợc lại. Sự hòa tan chất tan từ các tế bào vỡ sẽ đƣa chất tan vào thẳng dịch chiết. Quá trình tạo thành dịch chiết xảy ra nhanh vì dung môi không mất thời gian đi tới chỗ chất tan và dung dịch ngay khi đƣơc tạo thành đã là một bộ phận của dịch chiết. Tuy nhiên, sự hòa tan này không có tính chọn lọc, tất cả những chất tan đƣợc trong dung môi đều có mặt trong dịch chiết. Sự hòa tan xảy ra trong các tế bào nguyên vẹn chỉ tạo nên dung dịch chất tan bên trong tế bào. Sự hòa tan đơn thuần không đƣa chất tan trong tế bào vào dịch chiết. 1.2.1.2 Sự khuếch tán Khi cho dung môi tiếp xúc với các tiểu phân dƣợc liệu, ở những nơi dung môi tiếp xúc với chất tan (các tế bào, còn nguyên hay bị vỡ) dung dịch có nồng độ cao hơn với những nơi không hoặc ít tiếp xúc với chất tan tạo nên sự chênh lệch nồng độ. Quá trình khuếch tán xảy ra nhằm làm triệt tiêu sự chênh lệch nồng độ này. Các phân tử chất tan sẽ di chuyển từ nơi có nồng độ cao tới nơi có nồng độ thấp hơn làm cho chất tan có mặt đồng đều trong dung dịch. Sự khuếch tán trong dung dịch xảy ra đƣợc là do chuyển động nhiệt của phân tử (chuyển động Brown) của chất tan cũng nhƣ của dung môi. 13
Đồ án tốt nghiệp Các yếu tố chính ảnh hƣởng đến quá trình khuếch tán gồm: - Sự chênh lệch nồng độ - Nhiệt độ - Độ nhớt của dung môi Sự khuếch tán giúp thúc đẩy quá trình hòa tan và kéo chất tan từ các tế bào vỡ ra khỏi tế bào đi vào dịch chiết. 1.2.1.3 Quá trình thẩm tích Vách tế bào thực vật cấu tạo bằng cellulose và hemicellulose với những kênh bào tƣơng (plasmodesmata, còn đƣợc gọi đơn giản là các ống trao đổi) thông thƣờng giữa các tế bào. Các phân tử nhỏ nhƣ dung môi, các chất có phân tử lƣợng nhỏ có thể qua lại vách tế bào dễ dàng thông qua các kênh bào tƣơng, các phân tử lớn hơn đi qua khó khăn hơn và đôi khi cần những cơ chế vận chuyển chủ động. Việc di chuyển chất tan phân tử nhỏ qua các kênh bào tƣơng trong quá trình chiết xuất đƣợc thực hiện bởi sự khuếch tán thụ động theo gradient nồng độ. Trong khuếch tán qua các kênh bào tƣơng, đƣờng kính của các kênh bào tƣơng sẽ quyết định kích thƣớc và vận tốc của những chất có thể qua màng. Các chất có kích thƣớc nhỏ hơn các kênh bào tƣơng (đa số các chất chuyển hóa bậc 2) sẽ đi qua dễ dàng trong khi các phân tử lƣợng lớn (protein, polysaccharide ) sẽ khó đi qua hơn và sẽ nằm lại trong tế bào. Nhƣ thế, sự thẩm tích làm cho quá trình hòa tan chiết xuất có tính chọn lọc hơn. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình hòa tan thẩm tích bao gồm: - Sự chênh lệch nồng độ giữa bên trong và bên ngoài tế bào - Cấu trúc của vách tế bào và các tiểu phân dƣợc liệu - Kích thƣớc chất tan - Nhiệt độ - Độ nhớt của dung môi 14
Đồ án tốt nghiệp 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất 1.2.2.1 Nguyên liệu Bản chất của nguyên liệu Bản chất của nguyên liệu đóng vai trò rất lớn trong quá trình chiết xuất. Bề dày của vách tế bào, đƣờng kính của ống trao đổi là hai yếu tố quan trọng nhất. Độ dày của vách tế bào hay chiều dài của các kênh bào tƣơng càng lớn thì quá trình hòa tan chiết xuất xảy ra càng chậm. Các nguyên liệu là gỗ quá trình chiết sẽ chậm hơn các nguyên liệu là lá hay cánh hoa. Đƣờng kính các kênh bào tƣơng càng lớn, các chất qua lại vách tế bào càng dễ dàng. Quá trình chiết xảy ra càng nhanh. Mức độ chia nhỏ của nguyên liệu Nguyên liệu càng đƣợc chia nhỏ, tỉ lệ của số tế bào nguyên vẹn so với số tế bào bị “vỡ” giảm, quá trình hòa tan đơn giản tăng và thời gian khuếch tán chất tan vào dịch chiết giảm, thời gian thẩm thấu qua vách tế bào giảm làm cho quá trình chiết nhanh hơn. Tuy nhiên càng chia nhỏ nguyên liệu, tính chọn lọc của quá trình càng giảm, dịch chiết càng có nhiều “tạp chất” làm cho lƣợng cao chiết nhiều lên, thành phần phức tạp và khó tách các chất hơn. Chất tan Độ tan trong dung môi của chất tan càng lớn, quá trình chiết tách xảy ra càng nhanh. Kích thƣớc phân tử chất tan càng lớn, tốc độ khuếch tán và khả năng qua vách tế bào càng giảm. Quá trình hòa tan một chất vào dung môi là quá trình solvat hóa chất đó tạo nên một lớp solvat bên ngoài phân tử chất tan và giúp cho chất tan “phân tán” vào dung dịch. Năng lƣợng solvat hóa có ảnh hƣởng nhiều đến khả năng và tốc độ hòa tan. 15
Đồ án tốt nghiệp Năng lƣợng solvat hóa là năng lƣợng cần thiết để phá vỡ các liên kết giữa các phân tử chất tan trong pha rắn và tạo nên lớp vỏ dung môi. Cấu tạo của dung môi,sự gia nhiệt là những yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình này. Dạng thù hình của chất tan có ảnh hƣởng nhiều đến tốc độ hòa tan. Các chất tồn tại dƣới dạng vô định hình sẽ hòa tan nhanh hơn do bề mặt tiếp xúc với dung môi lớn, lực liên kết giữa các phân tử trong pha rắn nhỏ, dễ bị phá vỡ. Đối với các dạng tinh thể, tốc độ hòa tan phụ thuộc nhiều vào cấu trúc tinh thể. Các chất có nhiều nhóm có thể tạo các liên kết hydro liên phân tử nhƣ hydroxyl, carboxyl, amin, amid v.v sẽ khó tan trở lại trong dung dịch khi đƣợc kết tinh. Đặc biệt có những chất, liên kết hydro tạo nên giữa các phân tử quá lớn sẽ rất khó tan. Ví dụ nhƣ các flavonoid có nhiều nhóm hydroxyl. Dƣới dạng tinh thể, các chất này tạo nên các “polymer” rắn khá bền vững nên rất khó tan. Muốn hoà tan cần có sự gia nhiệt trong một thời gian dài. Đa số các chất tan trong tế bào dƣợc liệu đã phơi khô tồn tại dƣới dạng vô định hình trong một hỗn hợp gồm nhiều chất nên sự hòa tan xảy ra nhanh hơn so với dạng tinh thể hay đơn chất. Tuy nhiên cũng có trƣờng hợp các chất khác làm cản trở sự hòa tan này do tạo các phức hợp khó tan với chất tan (ví dụ các tannat alkaloid) hay ngăn cản sự tiếp xúc của dung môi với chất tan (chất béo khi chiết dƣợc liệu nhiều chất béo với dung môi phân cực, chất nhầy, protein khi chiết dƣợc liệu với dung môi phân cực). 1.2.2.2 Dung môi Khả năng hòa tan của dung môi Khả năng hòa tan của dung môi với chất tan càng lớn, quá trình hòa tan càng nhanh làm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn. Khả năng hòa tan của các chất trong các dung môi khác nhau thì khác nhau và phụ thuộc nhiều vào bản chất của chất tan và của dung môi. Có những chất hòa tan tốt trong dung môi này nhƣng lại hòa tan kém trong dung môi khác có đặc tính tƣơng tự. Có những chất hòa tan vừa phải trong 2 dung môi khác nhau nhƣng lại tan tốt trong hỗn hợp của hai dung môi này 16
Đồ án tốt nghiệp Khả năng hòa tan chất tan của dung môi có thể dự đoán vào độ phân cực của dung môi theo nguyên tắc “similia similibus solvuntur” dung môi phân cực hòa tan các chất phân cực, dung môi kém phân cực hòa tan các chất kém phân cực. Độ phân cực của dung môi thƣờng đƣợc đánh giá bằng hằng số điện môi. Hằng số điện môi càng lớn, dung môi càng phân cực. Độ nhớt của dung môi Độ nhớt của dung môi càng thấp, khả năng thấm vào tế bào, sự khuếch tán của chất tan và dung môi xảy ra càng dễ dàng, quá trình chiết xảy ra càng nhanh. Sự thấm của dung môi qua vách tế bào Vách tế bào thực vật là một màng thân nƣớc. Ở trạng thái tƣơi, nƣớc trên vách cũng nhƣ trong tế bào ngăn cản không cho dung môi kém phân cực, ít tan trong nƣớc thấm vào tế bào hay tiếp xúc với chất tan làm quá trình chiết với các dung môi này khó khăn hơn. Ở các tế bào khô, lớp nƣớc ngăn cách này đã mất đi nên quá trình chiết sẽ dễ dàng hơn. 1.2.2.3 Kỹ thuật chiết Sự chênh lệch nồng độ Chênh lệch nồng độ càng lớn thì tốc độ khuếch tán càng cao. Việc tăng lƣợng dung môi hay sử dụng phƣơng pháp chiết ngấm kiệt làm tăng sự chênh lệch nồng độ này nên quá trình chiết xuất xảy ra nhanh hơn. Sự khuấy trộn Sự khuấy trộn làm tăng quá trình cân bằng nồng độ của dung dịch bên ngoài các tiểu phân dƣợc liệu bằng phƣơng pháp cơ học. Sự chênh lệch nồng độ giữa trong và ngoài tế bào tăng lên nên quá trình thẩm tích xảy ra nhanh hơn. Trong chiết xuất bằng phƣơng pháp ngâm, các chất tan từ trong tế bào khuếch tán ra làm cho nồng độ lớp dịch chiết ở ngay sát tiểu phân dƣợc liệu là cao nhất, càng xa tiểu phân dƣợc liệu nồng độ càng giảm dần. Việc “giải tỏa” nồng độ của lớp dịch chiết ngay sát tiểu phân dƣợc liệu chỉ do sự khuếch tán nên sẽ rất chậm. Sự khuấy trộn sẽ làm cân bằng nồng độ của dịch chiết bên ngoài các tiểu phân trở nên 17
Đồ án tốt nghiệp nhanh chóng hơn, giảm nồng độ của lớp dịch chiết ngay sát tiểu phân dƣợc liệu làm cho quá trình chiết xuất xảy ra nhanh hơn. Nhiệt độ Tăng nhiệt độ làm khả năng hòa tan của chất tan vào dung môi và đẩy nhanh quá trình chiết xuất do làm tăng chuyển động nhiệt của phân tử và giảm độ nhớt của dung môi dẫn tới tăng khả năng và tốc độ hòa tan, tăng quá trình khuếch tán làm cân bằng nồng độ. Áp suất Tăng áp suất làm tăng tốc độ độ thấm dung môi vào nguyên liệu. Thông thƣờng sự tăng áp suất này thƣờng đi kèm với việc tăng nồng độ dung dịch. Các yếu tố khác Chất trợ tan: Các chất diện hoạt, một khi đƣợc sử dụng trong chiết xuất có tác dụng làm tăng tính thấm của chất tan, làm quá trình phân tán chất tan vào dung môi dễ dàng hơn do đó làm đẩy nhanh quá trình chiết xuất. Siêu âm và vi sóng: Siêu âm và vi sóng có tác dụng làm tăng chuyển động nhiệt của các phân tử chất tan dung môi, làm tăng nhiệt độ, tăng sự hòa tan và đẩy nhanh quá trình khuếch tán. 1.2.3 Các phương pháp chiết 1.2.3.1 Phương pháp ngâm Ngâm là một phƣơng pháp chiết gián đoạn trong đó toàn bộ lƣợng dung môi đƣợc tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lƣợng dƣợc liệu trong những dụng cụ thích hợp. Quá trình chiết xuất xảy ra ở mọi điểm trong thiết bị chiết là nhƣ nhau và dịch chiết đƣợc rút ra khỏi thiết bị cùng một lúc. Quá trình ngâm này có thể đƣợc lặp lại thêm 1 hay vài lần để chiết kiệt hoạt chất trong dƣợc liệu. - Phương pháp ngâm lạnh: Trong phƣơng pháp ngâm lạnh, dƣợc liệu đƣợc ngâm với dung môi ở nhiệt độ phòng. Thời gian ngâm bình thƣờng không dƣới 12 giờ với các dƣợc liệu mỏng manh hay dƣợc liệu đã xay nhỏ để đảm bảo quá trình chiết đƣợc căn bản hoàn tất. Trong thời gian này cân bằng về nồng độ giữa hoạt chất bên trong và bên ngoài 18
Đồ án tốt nghiệp thành tế bào đƣợc thiết lập và quá trình thẩm thấu sẽ kết thúc. Thời gian ngâm có thể kéo dài hơn, từ một đến vài ngày, tùy theo dƣợc liệu, loại dung môi và yêu cầu chiết xuất. - Phương pháp ngâm nóng: Phƣơng pháp ngâm nóng là phƣơng pháp ngâm đƣợc thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhƣng dƣới nhiệt độ sôi của dung môi. Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu đƣợc có nồng độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn. Quá trình hãm (hãm thuốc, hãm trà) trong y học cổ truyền và trong cuộc sống hằng ngày chính là quá trình ngâm nóng với dung môi là nƣớc. Chƣng cũng có thể đƣợc coi là một biến thể của phƣơng pháp này. Các dụng cụ chiết đặc biệt cho phƣơng pháp này ở quy mô vừa và nhỏ là Soxhlet và Kumagawa. - Chiết bằng Soxhlet và Kumagawa Là phƣơng pháp ngâm nóng nhiều lần với một lƣợng nhỏ dung môi. Kumagawa cho phép chiết ở nhiệt độ gần với nhiệt độ sôi của dung môi còn Soxhlet nhƣng thực ra gần với phƣơng pháp ngâm lạnh hơn. Ƣu điểm: lƣợng dung môi sử dụng ít mà vẫn có thể chiết kiệt đƣợc hoạt chất. Nhƣợc điểm: Khó thực hiện cho một lƣợng lớn dƣợc liệu. Thông thƣờng, chỉ dùng để chiết trong phòng thí nghiệm hoặc quy mô pilot. Không khuấy trộn đƣợc trong quá trình chiết xuất. - Chiết bằng dung môi ở nhiệt độ sôi Là phƣơng pháp ngâm đƣợc thực hiện ở nhiệt độ sôi của dung môi. Do đƣợc chiết ở nhiệt độ sôi của dung môi nên khả năng hòa tan của chất tan vào dung môi thƣờng là cao nhất và quá trình hòa tan xảy ra nhanh. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là quá trình chiết phải đƣợc thực hiện trong các thiết bị thích hợp, trong nhiều trƣờng hợp phải có bộ phận ngƣng tụ dung môi và phải gia nhiệt. 19
Đồ án tốt nghiệp Các phƣơng pháp sắc, hầm hay nấu cao trong y học cổ truyền là phƣơng pháp chiết với dung môi ở nhiệt độ sôi với dung môi là nƣớc. Với các dung môi khác, dụng cụ chiết cần có bộ phận ngƣng tụ dung môi nên cũng đƣợc gọi là phƣơng pháp chiết hồi lƣu. 1.2.3.2 Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt Ngấm kiệt (Percolation) là một phƣơng pháp chiết liên tục trong đó dung môi đƣợc đi qua dƣợc liệu theo một hƣớng nhất định, với một tốc độ nhất định. Quá trình hòa tan xảy ra trong phƣơng pháp ngấm kiệt không giống nhau trong toàn bộ khối dƣợc liệu mà theo gradient nồng độ, dung môi/dịch chiết đi từ nơi dƣợc liệu có lƣợng hoạt chất thấp tới nơi có lƣợng hoạt chất cao hơn. Do quá trình chiết xảy ra theo gradient nồng độ nên quá trình chiết xảy ra triệt để hơn, lƣợng dung môi sử dụng ít hơn phƣơng pháp ngâm và dƣợc liệu đƣợc chiết kiệt hơn. Các yếu tố phụ trợ nhƣ nhiệt độ, chất điện hoạt có thể đƣợc sử dụng để gia tăng quá trình chiết. Quá trình ngấm kiệt đƣợc thực hiện trong bình chiết đƣợc gọi là bình ngấm kiệt (percolator). Hình dạng, cấu tạo và kích thƣớc của bình ngấm kiệt có thể thay đổi thùy theo mục đích sử dụng nhƣng thông thƣờng phần ngâm chính của bình ngấm kiệt có dạng hình nón cụt có thể kín và có van điều chỉnh lƣu lƣợng ở một đầu hay có nắp kín với van điều chỉnh ở cả hai đầu. Quá trình ngấm kiệt có thể đƣợc tiến hành dƣới nhiệt độ thƣờng hay ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhƣng dƣới nhiệt độ sôi của dung môi (ngấm kiệt nóng). Bình đƣợc thiết kế với bộ phận gia nhiệt và bảo ôn, dung môi đƣợc đƣa vào bình ở nhiệt độ cao. Có thể thực hiện ngấm kiệt và rút kiệt dịch chiết trên từng bình ngấm kiệt riêng lẻ hay kết hợp nhiều bình ngấm kiệt nối tiếp với nhau (ngấm kiệt ngƣợc dòng). Trong ngấm kiệt ngƣợc dòng, hệ thống đƣợc bố trí sao cho dịch chiết loãng của bình chiết trƣớc sẽ là dung môi đầu cho bình chiết sau và mỗi bình chỉ lấy ra một lƣợng dịch chiết đậm đặc nhất định. Với ngấm kiệt ngƣợc dòng, lƣợng dịch 20
Đồ án tốt nghiệp chiết thu đƣợc từ mỗi bình luôn nhỏ hơn nhiều và có nồng độ cao nhất so với ngấm kiệt từng bình riêng lẻ mà vẫn đảm bảo chiết kiệt dƣợc liệu. 1.2.3.3 Các phương pháp chiết khác Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển nhƣ trên, trong thực tế ngƣời ta còn dùng các kỹ thuật hỗ trợ khác để đẩy nhanh quá trình hòa tan nhƣ chiết xuất sử dụng siêu âm, chiết xuất sử dụng vi sóng, chiết dƣới áp suất hay sử dụng các dung môi đặc biệt để chiết nhƣ chiết chất lỏng tới hạn. 1.3 Tổng quan về hoạt tính kháng oxy hóa 1.3.1 Giới thiệu chung 1.3.1.1 Khái niệm về stress oxy hóa [3], [10], [30] Oxy hóa không thể thiếu với vi sinh vật ái khí. Con ngƣời có thể nhịn ăn khá lâu song không thể nhịn thở quá 5 – 10 phút. Khoảng vài thập niên gần đây, các thành tựu khoa học đã chứng tỏ rằng oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa học. Trong các quá trình đó, oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do. Từ đầu những năm 70 I.W.Fridovich đã nhận thấy rằng khi nhận một điện tử đầu tiên, oxy tạo ra gốc superoxyde. Đây là gốc tự do quan trọng nhất của tế bào. Từ gốc superoxyde (O2‾) nhiều gốc tự do và các phân tử khác của oxy có khả năng 1 phản ứng cao đƣợc tạo ra nhƣ: HO (gốc hydroxyl), H2O2, O2 (oxy đơn bội), LO (gốc lipoxyde), LOO (gốc lipoperoxyde), RO (gốc alkoxyde), LOOH. Tên chung của các gốc là các dạng oxy hoạt động. Các nhà khoa học cũng đã phát hiện rằng sự sản sinh ra nhiều dạng oxy hoạt động cũng có thể đƣợc loại bỏ bằng các chống oxy hóa (antioxidant), tự nhiên trong cơ thể. Tiêu biểu là enzyme superoxyd dismutase (SOD), glutathione (GSH), ezyme glutathione peroxidase (GSH – Px), enzyme catalase và phân tử nhỏ nhƣ: tocopherol, ascorbat. Trong cơ thể luôn tồn tại sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa. Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội môi (homeostasis). Do ảnh hƣởng của nhiều yếu tố tác động từ bên ngoài hay bên trong 21
Đồ án tốt nghiệp cơ thể, làm cho cân bằng này di chuyển theo hƣớng gia tăng các dạng oxy hoạt động. Trạng thái sinh lý này đƣợc gọi là stress oxy hóa. Hay nói một cách khác, stress oxy hóa là sự rối loạn cân bằng giữa các chất chống oxy hóa và oxy hóa theo các hƣớng tạo ra nhiều các oxy hóa. 1.3.1.2 Sự hình thành các gốc tự do của oxy trong cơ thể [11] Trong tế bào, gốc tự do đƣợc sinh ra do các phản ứng chuyển nhƣờng điện tử. Những phản ứng này có thể đƣợc thực hiện bởi enzyme hoặc không enzyme, thông qua sự oxy hóa khử của các ion kim loại chuyển tiếp. Sự hình thành gốc tự do trong trao đổi bình thƣờng Trong sinh học, nguồn quan trọng sinh ra gốc tự do là sự cung cấp điện tử ở chuỗi hô hấp tế bào trong ty lạp thể cho oxy. Trong ty lạp thể có một hệ thống enzyme và các chất trung gian làm nhiệm vụ vận chuyển hydro và điện tử từ cơ chất tới oxy. Những hợp chất này tạo ra một loại các phản ứng dây chuyển nối tiếp nhau gọi là chuỗi hô hấp tế bào Quá trình oxy nhận điện tử ở chuỗi hô hấp tế bào thực tế phải xảy ra qua nhiều giai đoạn. Mỗi giai đoạn oxy chỉ nhận đƣợc một điện tử. Oxy nhận điện tử đầu tiên tạo ra gốc superoxyde (O2‾). Oxy nhận điện tử chủ yếu ở màng ty lạp thể. Khoảng 80% lƣợng O2‾ hình thành chuyển vào ty lạp thể, còn 20% thoát ra bào tƣơng. O2‾ có các chức năng nhƣ sau: là nguồn sinh ra H2O2; cùng với NO và các chất phóng thải từ tế bào trong tham gia chi phối trạng thái tĩnh hay hoạt động của tiểu cầu, quyết định sự bám dính hay kết tụ của tiểu cầu vào thành mạch. Các gốc O2‾ hình thành nhanh chóng đƣợc enzyme SOD chuyển thành H2O2 theo cơ chế tự oxy hóa khử: + O2‾ + O2‾ + 2H → H2O2 + O2 H2O2 là tác nhân oxy hóa và dễ dàng bị phân hủy theo phản ứng: H2O2 + 2GSH → GSSG + 2H2O GSH: glutathione; GSH – Px: enzyme glutathione peroxidase 22
Đồ án tốt nghiệp Ở cơ thể bình thƣờng, oxy qua các chuyển hóa trong cơ thể tạo ra O2‾, H2O2 để thực hiện các chức năng sinh lý. Chúng chỉ tồn tại với một nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại cho cơ thể. Sự hình gốc tự do ngẫu nhiên - Sự hình thành gốc tự do không có enzyme SOD xúc tác Các gốc O2‾ có khả năng phản ứng với nhau trong điều kiện không có enzyme SOD xúc tác theo phản ứng sau: + 1 O2‾ + O2‾ + 2H → H2O2 + O2 1 Oxy đơn bội ( O2) có tính oxy rất mạnh. Nó có thể phản ứng với bất kỳ một chất hữu cơ nào khi nó gặp tạo ra các peroxyd. - Phản ứng Harber – Weiss Các gốc O2‾ va đập với H2O2: 1 ‾ O2‾ + H2O2 → O2 + OH + OH Phản ứng này xảy ra chậm, nhƣng có mặt Fe2+, Cu2+ xúc tác thì tốc độ phản ứng xảy ra rất nhanh (phản ứng Fenton). Hai tiểu phân O2‾ và H2O2 không độc, có 1 thể tạo ra O2, OH là những phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào. - Sự hình thành gốc tự do từ các ion kim loại chuyển tiếp 2+ 2+ Ion kim loại chuyển tiếp (Fe , Cu ) dễ dàng phân tách H2O2 thành gốc OH. 2+ 3+ H2O2 + Fe → Fe + OH + OH ‾ Bình thƣờng phản ứng này trong sinh học ít xảy ra, vì H2O2 ở nồng độ thấp còn Fe2+, Cu2+ thƣờng bị khóa ở dạng phức, ít ở trạng thái tự do. Các ion kim loại chuyển tiếp có thể phản ứng với oxy tạo ra gốc O2‾ . Phản ứng này đặc biệt quan trọng vì nó khơi mào cho các phản ứng gốc tự do xảy ra. 2+ 3+ Fe + O2 → O2‾ + Fe 2+ 3+ Cu + O2 → O2‾ + Cu 23
Đồ án tốt nghiệp Nhƣ vậy, từ các tiểu phân O2‾, H2O2, O2 và kim loại chuyển tiếp cùng hợp 1 biến sinh ra gốc OH và O2 những tác nhân có khả năng phản ứng mạnh. Gốc OH phản ứng mạnh với hầu hết các phân tử sinh học ở tốc độ khuếch tán, có khả năng gây tổn thƣơng lớn trong phạm vi bán kính nhỏ mà nó sinh ra. 1.3.1.3 Sự phòng vệ của cơ thể chống lại gốc tự do [11] Hệ thống phòng vệ các gốc tự do trong cơ thể Do việc sinh ra các gốc tự do trong tế bào là không thể tránh khỏi, nên việc bảo vệ chống lại những tác hại của gốc tự do là tất yếu. Đó là sự phòng vệ của các chất chống oxy hóa nội sinh trong cơ thể với hai phƣơng cách tác động sau: Phòng ngừa sinh ra các gốc Khả năng phòng ngừa sinh ra các gốc bao gồm hiệu lực vận chuyển điện tử của oxy và sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, đặc biệt với các protein nhƣ: transferrin, lactoferin, ferritin. Phòng vệ loại bỏ các gốc đã sinh ra Ở trong tế bào quan trọng nhất là sinh enzyme SOD và hệ thống glutathione. Ở tổ chức màng thì quan trọng nhất là các chất kiểu vitamin E, ubiquinone, β – carotene loại bỏ các gốc LOO, LO theo phản ứng mỗi phân tử vitamin E này loại bỏ hai gốc LOO. Ở pha nƣớc có vai trò của vitamin C và một số chất nhƣ acid uric. Việc sửa chữa loại bỏ các phân tử sinh học đã bị tổn thƣơng trƣớc khi chúng tích tụ lại hoặc trƣớc khi chúng đủ mức gây ra những biến đổi chuyển hóa và định hƣớng đến sự sống của tế bào. Ví dụ: các protein đã bị oxy hóa sẽ bị proteinase phân hủy; các lipid màng sẽ bị các lipase phân hủy, acyl transferase tác động. Hệ thống enzyme chống oxy hóa gan Gan là cơ quan có nhiều enzyme trong đó những enzyme đóng vai trò quan trọng trong nhiều việc chống oxy hóa là: các chất chống peroxyd, enzyme SOD, phân hủy các gốc tự do khác, những ion khóa kim loại chuyển tiếp , trong đó các chất chống peroxyd chiếm thành phần chủ yếu ở gan. - Các chất chống peroxyd 24
Đồ án tốt nghiệp Đó là các chất glutathione (GSH), enzyme glutathione peroxidase (GSH – Px) xúc tác phân hủy các peroxyd với hằng số tốc độ phản ứng k = 108 mol/giây theo phản ứng sau: 2GSH + LOOH → LOH + GSHG + H2O Nhƣ vậy, hàm lƣợng GSH, hoạt độ enzyme GSH – Px liên quan đến việc phân hủy các peroxyd. Khẩu phần ăn đủ protein và hàm lƣợng selen liên quan chặt chẽ với GSH và hoạt tính GSH – Px. Nếu hàm lựng selen không đủ thì GSH giảm, hoạt độ enzyme GSH – Px thấp. Ngoài ra, peroxysom còn có catalase phân hủy H2O2 nồng độ cao theo phản ứng sau: 2H2O2 → 2H2O + O2‾ - Enzyme superoxyd dismutase (SOD) Enzyme này có khả năng phân hủy đặc hiệu các gốc O2‾ với hằng số tốc độ rất lớn (k = 109 mol/giây). + O2‾ + O2‾ + 2H → H2O2 + O2 Bản chất của enzyme này là một protein có hai đồng phân là MnSOD (có trong ty lạp thể) còn có CuZnSOD có ở bào tƣơng. Cả hai đều xúc tác phân hủy gốc O2‾ - Phân hủy các gốc tự do khác Vitamin E (α – tocopherol) là chất chống oxy hóa quan trọng ở các tổ chức màng. Mỗi phân tử vitamin E có khả năng loại bỏ bớt hai gốc LOO theo phản ứng sau: 2LOO + vitE(OH)2 → 2LOOH + vitE(O2) Ngoài phản ứng trực tiếp với gốc tự do vitamin E có khả năng loại bỏ oxy đơn bội theo phản ứng sau: 1 vitE + O2 → O2 + vitE* → vitamin E vitE*: dạng oxy hóa (dạng kích thích) Trong tế bào có nhiều chất có cấu trúc tƣơng tự vitamin E nhƣ ubiquinone (coenzyme Q10 ) cũng có tính chất này. 25
Đồ án tốt nghiệp Vitamin C: là những chất có khả năng loại bỏ các gốc tự do ở pha nƣớc của tế bào. Ngoài ra vitamin C còn có khả năng tái tạo vitamin E dạng oxy hóa trở về dạng khử. Những chất nhƣ acid uric huyết tƣơng, GSH ở dịch tế bào cũng có tính chất loại bỏ gốc tự do. Phân tử β - caroten cũng có tính chất chống oxy hóa theo cơ chế nhận năng lƣợng kích thích của oxy đơn bội, biến oxy đơn bội thành oxy thƣờng và bản thân β - carotene trở thành dạng kích thích, sau đó trở về trạng thái bình thƣờng hoàn toàn bằng hiện tƣợng vật lý là năng lƣợng kích thích truyền cho các liên kết nội tạng dƣới dạng nhiệt. - Những protein khóa ion kim loại chuyển tiếp Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Việc phức hóa các ion này, không để cho tồn tại ở trạng thái tự do sẽ làm mất khả năng xúc tác gốc. Trong cơ thể có nhiều protein có chức năng này. Khóa sắt transferin, lactoferin. Khóa đồng có ceruloplasmin. Cơ thể khỏe mạnh chỉ cần 30% lƣợng các protein đã đủ khóa tất cả sắt và đồng ở dạng phức, không có ion sắt, đồng tự do trong cơ thể. 1.3.2 Một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính kháng oxy hóa Hợp chất thiên nhiên là các sản phẩm hữu cơ của các quá trình trao đổi chất trong cơ thể sống. Ngành hóa học nghiên cứu tính chất và cấu trúc của các hợp chất thiên nhiên đƣợc gọi là hóa học các hợp chất thiên nhiên. Lịch sử các hợp chất thiên nhiên có từ xa xƣa. Ngành y học cổ truyền của nhiều nƣớc đã biết nhiều đến độc tính và tác dụng kháng oxy hoá của nhiều chất có nguồn gốc động thực vật. Các nhóm hợp chất có trong tự nhiên bao gồm: terpennoid, steroid, flavonoid, alkaloid .Chúng là sản phẩm của quá trình trao đổi thứ cấp. Các chất trao đổi thứ cấp đƣợc nghiên cứu nhiều do tác dụng dƣợc lý và các hoạt tính sinh học của chúng. 1.3.2.1 Flavonoid Đại cƣơng về flavonoid 26
Đồ án tốt nghiệp Flavonoit là những chất màu thực vật có cấu trúc cơ bản nhƣ sau: 2' 3' 8 1 O 2 7 4' 3 5' 6 6' 4 5 O Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 – diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một dây có 3 carbon, nên thƣờng đƣợc gọi là C6 – C3 – C6. Thƣờng các flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B. Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hoặc dạng glycoside. Các đƣờng thƣờng gặp nhất là đƣờng D – glucose, kế đó là D – galactose, L – rhamnose, L – arabinose, D – xylose, D – apiose và acid uronic [39]. Tại các vòng có liên kết với hay một vài nhóm hydroxyl tự do hay đã thay thế một phần. Vì vậy về bản chất chúng là những poliphenol có tính acid. Các poliphenol có thể phản ứng với nhau qua các nhóm OH để tạo thành phân tử phức tạp hơn hoặc có thể liên kết với các hợp chất khác trong cây nhƣ các đƣờng hoặc protein. Hoạt tính kháng oxy hóa của flavonoid [44] Flavonoid là một nhóm các hợp chất đƣợc gọi là “những ngƣời thợ sửa chữa sinh hóa của thiên nhiên” nhờ vào khả năng sửa chữa các phản ứng cơ thể chống lại các hợp chất khác trong các dị ứng nguyên, virus và các chất sinh ung thƣ. Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động khác thƣờng. Các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất thƣờng là các gốc tự do nhƣ -OH, ROO- (là các yếu tố gây biến dị, huỷ hoại tế bào, ung thƣ, tăng nhanh sự lão hoá ). Một trong những nhóm flavonoid thực vật hữu ích nhất là proanthocyanidins (còn đƣợc gọi là procyanidins). Nhóm này mang lại rất nhiều ích lợi cho sức khỏe. Mỗi proanthocyanidins liên kết với các loại proanthocyanidins khác. Một hỗn hợp gồm các proanthocyanidins liên kết với nhau dạng dime, trime polime đƣợc gọi chung là procyanidolic oligomer, gọi tắt là PCO. 27
Đồ án tốt nghiệp Năm 1986, Jacques Masquelier là ngƣời khám phá ra các đặc tính chống ôxy hóa và thu dọn gốc tự do của PCO. Nhiều phƣơng pháp hiện đại và phức tạp đã chứng minh hoạt động bảo vệ mạch máu của PCO và tạo cơ sở vững chắc cho việc sử dụng PCO trong điều trị các bệnh lý mạch máu. Các phƣơng pháp này cho thấy PCO có khả năng: + Bắt giữ gốc tự do hydroxyl. + Bắt giữ lipide peroxide. + Làm chậm trễ đáng kể sự khởi đầu của quá trình peroxide hóa lipide. + Kìm giữ các phân tử sắt tự do, giúp ngăn chặn sự peroxide hóa lipide do sắt. + Ức chế sự sản sinh ra gốc tự do bằng cách ức chế không cạnh tranh men xanthin oxidase. + Ức chế sự tổn thƣơng do các enzyme (hyaluronidase, elastase,collagenase ) có thể làm thoái hóa cấu trúc mô liên kết. - Các Flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng nhƣ những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hoá. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá, thoái hoá gan, tổn thƣơng do bức xạ. 1.3.2.2 Terpenoid Đại cƣơng về terpennoid [45] Trong thiên nhiên, terpenoid chủ yếu có trong các loại thực vật. Chúng có vai trò quan trọng đối với cơ chế bảo vệ cũng nhƣ trong việc sinh sản của nhiều loại cây, vì phát ra mùi hƣơng và dẫn dụ côn trùng thụ phấn. Vào năm 1818 ngƣời ta đã tìm đƣợc một số hợp chất và xác định đƣợc rằng tỉ lệ nguyên tử C : H ở tinh dầu là 5 : 8. Tiếp thep đó là một số hợp chất hidrocacbon không no, không vòng hoặc có vòng đã đƣợc tách ra. Chúng có công thức tổng quát là (C5H8)n , (n ≥ 2) và đƣợc đặt tên là Terpen. Phân tử của các hợp chất này có các mạch nhánh là các nhóm CH3- xuất hiện một cách có chu kì trong mạch cacbon. 28
Đồ án tốt nghiệp Phân tử terpenoid có cấu tạo mạch hở hoặc mạch vòng và có chứa các liên kết đôi C=C . Cấu trúc của terpenoid đƣợc tạo thành do isoprene kết hợp với nhau theo kiểu “ đầu nối với đuôi”, hoặc đuôi nối với đuôi. Phân tử terpenoid có thể có 1 vòng hoặc nhiều vòng, có thể là vòng hở hay vòng kín và các liên kết phải tuân theo qui tắc isopren. Hoạt tính kháng oxy hóa của terpenoid Terpenoid có tác dụng chống viêm, chống lại sự hình thành các khối u và giúp giảm hàm lƣợng chất béo. Theo công bố của Mahato và công sự năm 1997 terpenoid đƣợc tìm thấy trong các loại thực vật thuộc nhóm bạch quả, ví dụ nhƣ hƣơng thảo (Rosemarinus officinalis) và nhân sâm (Panax ginseng) có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe. Triterpene là một phân lớp của terpenoid và có độ dài mạch carbon là 30. Khối lƣợng phân tử khoảng từ 400 đến 600 kDa, triterpene có cấu trúc hóa học phức tạp và có khả năng bị oxy hóa cao. Nhiều loài cây có khả năng tổng hợp triterpene trong quá trình sinh trƣởng và phát triển. Một số có chứa nhiều triterpene trong nhựa, qua đó giúp các cây này chống lại các loại bệnh. Mặc dù có hàng trăm loại triterpene đã đƣợc phân lập từ rất nhiều loại thực vật khác nhau và phân nhóm này cũng đã cho thấy có rất nhiều tiềm năng nhƣng hiện nay có rất ít những ứng dụng của triterpene đƣợc sử dụng trong thực tế. 1.1.3 Các phương pháp xác định tác dụng chống oxi hóa 1.1.3.1 Phương pháp xác định hàm lượng MDA[4], [5], [20], [24] Có nhiều phƣơng pháp đƣợc dùng trong nghiên cứu quá trình peroxyd hóa lipid màng tế bào. Các phƣơng pháp này dựa trên: - Sự xác định các sản phẩm của quá trình peroxyd hóa lipid 29
Đồ án tốt nghiệp - Sự nhận biết các gốc tự do trong chuỗi phản ứng nhƣ đo phát quang sinh học đánh giá các gốc LOO hình thành, đo lƣợng các dien liên hợp hình thành. - Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của mô Hai nhóm 1 và 2 đơn giản và dễ thực hiện hơn so với nhóm 3, đặc biệt là phƣơng pháp xác định sản phẩm sinh ra trong quá trình peroxyd hóa lipid: malonyl dialdehyt (MDA), là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxyd hóa lipid màng tế bào do đó đƣợc áp dụng rộng rãi trong thực tế. Phƣơng pháp sử dụng acid thiobarbituric thƣờng đƣợc áp dụng để xác định hàm lƣợng MDA trong tổ chức tế bào, từ đó đánh giá khả năng chống oxi hóa in vitro hoặc in vivo của chất nghiên cứu thể hiện qua việc làm giảm hàm lƣợng MDA. Nguyên tắc MDA đƣợc sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid, khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 532 nm. Phản ứng thực hiện ở môi trƣờng pH 2 – 3, nhiệt độ 90 – 100 °C trong vòng 10 – 15 phút. Đo cƣờng độ màu của phức suy ra lƣợng MDA có trong mẫu. 1.1.3.2 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa Phƣơng pháp sử dụng DPPH [12] Marsden Blois là ngƣời đầu tiên đặt nền móng cho phƣơng pháp DPPH cách đây gần 50 năm (1958), ở thí nghiệm đầu tiên Blois đã thử hoạt tính chống oxi hóa của amino acid cystein bằng cách dùng DPPH chuẩn độ nó rồi đo độ hấp thu theo thời gian ở bƣớc sóng 517nm. Tên khoa học của DPPH là 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl (2,2 diphenyl- picrylhydrazyl), là gốc tự do bền, màu tím, phân tử không bị dimer hóa nhƣ một số gốc tự do khác. 30
Đồ án tốt nghiệp O2N . N N NO2 O2N DPPH (1,1 – dihenyl – 2 – picrylhydrazyl) Khi DPPH phản ứng với chất có khả năng cho nguyên tử H, nó sẽ chuyển về dạng khử có màu vàng nhạt (màu của nhóm picryl). Phản ứng đƣợc thực hiện nhƣ sau: O N O2N 2 H . . + N N NO2 + RH N N NO2 R O2N O2N * Nguyên tắc Hoạt tính chống oxi hóa oxi hóa của một chất đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo phổ UV, sử dụng thuốc thử là DPPH. Phản ứng đƣợc tiến hành dựa theo trên nguyên lý: DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cƣờng độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hóa đƣợc đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy so màu ở bƣớc sóng 517 nm. Phƣơng pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating activity) [22] Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Đánh giá khả năng phòng ngừa sinh ra các gốc tự do của chất nghiên cứu thể hiện qua sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không thể cho tồn tại ở trạng thái tự do, sẽ làm mất khả năng xúc tác gốc. Hoạt tính chống oxy hóa đƣợc thể hiện qua 31
Đồ án tốt nghiệp việc ngăn chặn sự tạo thành phức chất có màu giữa ion sắt II với 2,2’ – bipyridyl (thuốc thử ferrozine, đặc hiệu với ion sắt II) và đƣợc đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy so màu ở bƣớc sóng 562 nm. Phƣơng pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd O2‾ (Superoxide scavenging) [23] Đánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ các gốc tự do đã sinh ra của chất nghiên cứu qua việc ngăn chặn sự tạo thành gốc superoxyd O2‾. Gốc superoxyd đƣợc tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxydase sẽ đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp khử sử dụng nitroblue tetrazolium (NBT) cho phức chất có màu tím đƣợc đo quang ở bƣớc sóng λ = 550 nm. Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử đƣợc thể hiện qua việc làm giảm sự hình thành phức màu tím. Phƣơng pháp đánh giá khả năng đánh bắt peroxyhydro H2O2 (Hydrogen peroxide scavenging activity) [19] Hai tiểu phân O2‾ và H2O2 sinh ra từ các chuyển hóa trong cơ thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại cho cơ thể nhƣng nếu hiện diện ở 1 nồng độ cao (do stress oxy hóa) chúng có thể tạo ra O2, OH là những phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào. Hoạt tính chống oxy hóa và mẫu thử đƣợc thể hiện qua việc làm giảm lƣợng H2O2 đƣa đến làm giảm phản ứng màu giữa H2O2 và đỏ phenol (màu của đỏ phenol sẽ chuyển sang màu tím sau phản ứng với H2O2 trong sự hiện diện của enzyme peroxydase từ cải gia vị (horseradish). 1.4 Tổng quan về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm 1.4.1 Khái niệm chung Theo Silva và Fernandes (2010), kháng khuẩn, kháng nấm thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn, kháng nấm thƣờng có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thƣờng rất nhỏ. 32
Đồ án tốt nghiệp Những tính chất này có thể phụ thuộc vào cấu trúc hóa học khác nhau nhƣ: alkaloid, tannin, flavonoid, tinh dầu 1.4.2 Cơ chế đối kháng - Ức chế quá trình tổn hợp vách tế bào (vỏ) của vi khuẩn, nấm. Do tác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm cho vi sinh vật dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu. - Ức chế chức năng của màng tế bào. Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân tử có khối lƣợng lớn và các ion bị thoát ra ngoài. - Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein và lipid, quá trình tổng hợp acid nucleic. 1.4.3 Một số loài vi khuẩn, nấm gây bệnh thường gặp 1.4.3.1 Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) [1] Tụ cầu đã đƣợc R. Koch mô tả từ năm 1878. Sau đó, Pasteur (1880) và Ogston (1881) gọi vi khuẩn này là tụ cầu và xếp vào loài Staphylococcus. Đến năm 1884, Rosenbach nghiên cứu chi tiết về khả năng gây bệnh và xếp loại của tụ cầu. Tụ cầu có nhiểu loại: có loại gây bệnh, thƣờng gặp nhất là tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và có loại bình thƣờng sống trên da và niêm mạc, không gây bệnh. Tuy nhiên, trong một số điều kiện nhất định, loại không gây bệnh có thể trở nên gây bệnh. Ngoài ra, còn có những tụ cầu kỵ khí đôi khi cũng gây bệnh Đặc điểm Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) có hình cầu, đƣờng kính 0,8 – 1µm, đứng tụ lại với nhau thành từng đám nhƣ chùm nho, có thể đứng lẻ tẻ hoặc thành từng đôi hay thành từng chuỗingắn. Staphylococcus spp. là nhóm vi khuẩn Gram dƣơng, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, không có vỏ, không di động, không sinh bào tử và có khả năng sinh nội độc tố. Chúng phát triển đƣợc trong điều kiện nhiệt độ và pH chênh lệch nhiều (nhiệt độ từ 100C – 450C). 33
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus Khả năng gây bệnh - Các bệnh ngoài da: trên mặt da có những vết xây xát, tụ cầu xuống tổ chức dƣới da gây các bệnh mụn nhọt, viêm da, đầu đinh, đinh râu - Nhiễm khuẩn huyết do tụ cầu: thƣờng xảy ra ở những ngƣời có sức đề kháng yếu hoặc trẻ em. Thƣờng mắc sau các nhiễm khuẩn địa phƣơng. Bệnh thƣờng nặng, có thể gây chết ngƣời hoặc có thể trở thành mạn tính gây nên viêm xƣơng, viêm khớp, viêm phổi, viêm cơ, - Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp tính: bệnh xảy ra nhanh, trầm trọng với các dấu hiệu nôn mữa dữ dội. 1.4.3.2 Trực khuẩn (Escherichia coli) [1] Đặc điểm E.coli là trực khuẩn Gram âm, hình que thẳng. Kích thƣớc dài, ngắn khác nhau trung bình từ 2 – 3 µm, rộng 0,5 µm; trong những điều kiện nuôi cấy không thích hợp (ví dụ trong môi trƣờng có kháng sinh) trực khuẩn có thể rất dài (6 – 8 µm). Rất ít chủng E.coli có vỏ, không sinh bào tử, hầu hết có lông và có khả năng di động. Trực khuẩn E. coli hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, có thể phát triển ở nhiệt độ từ 150C – 400C, phát triển thích hợp ở nhiệt độ 370C với pH = 7,2 –7,4; phát triển đƣợc ở pH = 5,5 – 8,0. 34
Đồ án tốt nghiệp Trong môi trƣờng lỏng, sau 4 – 5 giờ, E. coli đã làm đục nhẹ môi trƣờng, càng để lâu càng đục nhiều và sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi trƣờng, để lâu vi khuẩn lắng xuống đáy ống. Trên môi trƣờng thạch thƣờng, sau 18 – 24 giờ, khuẩn lạc tròn, đều, bóng, không màu hay màu xám nhẹ, đƣờng kính 2 – 3 mm. Hình 1.3. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi với kích thƣớc 2 µm Khả năng gây bệnh E.coli là nguyên nhân gây ra các bệnh ở ngƣời nhƣ tiêu chảy, gây viêm đƣờng tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục, đƣờng mật, đƣờng hô hấp. Là một trong những nguyên nhân chính gây ra bệnh nhiễm khuẩn huyết, là căn nguyên thƣờng gặp trong bệnh viêm màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh.Nhƣng nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm dạ dày ruột ở trẻ em. E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng. Trong các loại độc tố của E.coli, độc tố shiga là nguy hiểm nhất đƣợc biết đến trên ngƣời, làm hủy hoại các vi nhung mao hấp thu của tế bào biểu mô ruột. Nó xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, ức chế quá trình tổng hợp protein làm chết tế bào. Hậu quả là gây viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân nhƣ máu. Những trƣờng hợp hoại tử nặng có thể gây thủng ruột. 35
Đồ án tốt nghiệp E.coli gây bệnh thực nghiệm: khả năng gây bệnh cho súc vật tƣơng đối thấp, phải cần một số lƣợng lớn vi khuẩn vào phúc mạc chuột nhắt hoặc đƣờng tĩnh mạch cho thỏ mới gây chết đƣợc súc vật. 1.4.3.2 Nấm mốc Aspergillus [7] Aspergillus là một trong những chi có tên lâu đời nhất của nấm. Đến năm 1926, Aspergillus đã trở thành một trong những nhóm nấm mốc nỗi tiếng và đƣợc nghiên cứu nhiều nhất. Cuối thế kỉ thứ 19, một số công trình nghiên cứu cho biết một số sản phẩm lên men của một số loài thuộc giống Aspergillus là acid hữu cơ nhƣ acid oxalic, acid citric và do đó Aspergillus bắt đầu đƣợc chú ý nghiên cứu về nhiều mặt nhƣ: sinh hóa, lên men, phân loại. Đặc điểm Nấm mốc Aspergillus có hình dạng sợi, phân nhánh có vách ngăn (cấu tạo đa bào), không màu, màu nhạt hoặc trở nên nâu, nâu nhạt ở một số vùng nhất định của khuẩn lạc. Có bào tử đính (conidiophore). Bào tử đính phát triển thành từ tế bào rất dày ở bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc (foot cell). Nó tạo thành sợi cuống dài và kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là túi. Xung quanh túi là một hoặc hai cuống để đính bào tử gọi là cuống đính bào tử hay thể bình. Từ cuống đính bào tử ngoài cùng, bào tử đƣợc sinh ra, gọi là bào tử đính. 36
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4. Nấm mốc Aspergillus Khả năng gây bệnh Nấm mốc Aspergillus là vi nấm không chỉ gây hại ở thực vật mà còn gây những bệnh nguy hiểm ở ngƣời. Sau đây là một số loài: - Aspergillus flavous – một loại nấm thuộc chi Aspergillus là tác một nhân gây bệnh viêm phổi, viêm giác mạc cho ngƣời. Nhiều chủng sản sinh ra độc tố aflatoxin – một hợp chất gây ung thƣ gan. - Aspergillus niger loài nấm này gây ra căn bệnh đƣợc gọi là mốc đen trên một số loại trái cây và rau quả nhƣ nho, hành tây, đậu phộng và là một chất gây ô nhiễm phổ biến của thực phẩm. Ngoài ra chúng còn là một trong những nguyên nhân phổ biến nhất của nhiếm trùng tai nấm, mà có thể gây đau thính lực và trong trƣờng hợp nghiêm trọng gây thiệt hại cho ống tai và màng tympanic. 1.4.3.3 Nấm sợi Fusarium [43] Đặc điểm Giống nấm này sinh trƣởng tốt trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa đến lạnh, có ít nhất đến 100 loài. Trên thạch – khoai tây – dextrose, giống này tạo khuẩn lạc giống nhƣ bông và có màu trắng. Tuy nhiên, cũng có một số loài cho khuẩn lạc có màu đỏ, xanh hay vàng. Một vài loài có giai đoạn sinh sản hữu tính. Hệ bào tử đính tạo bởi giống này có kích thƣớc bé tí và đôi khi rất khó phát hiện. Có hai loại bào tử: bào tử lớn và bào tử bé. Loại bé thƣờng đƣợc tạo từ 1 – 2 tế bào bào tử có hình chữ nhật hay hình quả lê. Đa số các loài giống Fusarium tạo bào tử bé. Bào tử lớn có kích thƣớc lớn hơn, có dạng xuồng hay hình dấu phẩy, bào tử có nhiều vách ngăn đứng. Một số loài của Fusarium tạo chlamydospore (bào tử vách dày) có vách ngăn dày trong các hệ sợi, ở dạng đơn, dang chuỗi hoặc dạng chùm. Nhiều loài cũng sinh ra mycotoxin. Tất cả chúng đều không gây nhiễm trùng. 37
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5. Nấm sợi Fusarium Khả năng gây bệnh Các bệnh héo Fusarium là vấn đề quan trọng ở Việt Nam. Những bệnh héo này do các dạng loài của F. oxysporum gây ra. Một vài dạng F. oxysporum cũng có thể gây thối dƣa hấu và củ khoai tây đã bị sâu hoặc dụng cụ gặt hái làm tổn thƣơng. Thối bắp ngô, chủ yếu do F. graminearum và F. verticillioides gây ra, ngày càng trở nên nghiêm trọng ở Việt Nam. Cả hai loài đều sản sinh độc tố nấm tồn tại trong hạt. Một số dạng Fusarium solani gây thối cổ rễ cây con họ đậu nhƣ đậu Hà Lan, đậu cô ve, và thối rễ ở các cây trƣởng thành. Các dạng khác có thể gây hại ở khu vực gốc thân cây lớn, nhƣ cây vải, bị yếu đi do yếu tố môi trƣờng làm stress và do các bệnh khác. Fusarium decemcellulare đã đƣợc phân lập từ cành nhãn bị thối ở miền bắc Việt Nam (theo L. Burgess, thông tin chƣa xuất bản) và từ cà phê ở Tỉnh Đắc Lắc. 1.4.3.4 Nấm Neoscytalidium dimidiatum [8] Đặc điểm Neoscytalidium dimidiatum thuộc ngành nấm túi (Ascomycota), Ascomyta có cơ thể sinh dƣỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, có vách ngăn, một tế bào thƣờng có một nhân đôi khi có nhiều nhân, dạng chuyên hóa dạng sợi bắt đầu đứt đoạn ra tạo thành cơ thể đơn bào hình tròn, bầu dục chứa nhiều nhân hay một nhân. Vách tế bào cấu tạo bằng chitin hay glucan, đa số lại ký sinh gây bệnh trên thực vật, 38
Đồ án tốt nghiệp động vật, ngƣời gây nên những thiệt hại lớn. Ascomycota sinh sản sinh dƣỡng bằng sự chia đôi tế bào nảy chồi, đứt đoạn sợi nấm, bào tử áo, bào tử màng nhày, sinh sản vô tính bằng bào tử đính (conidia), và sinh sản hữu tính bằng bào tử túi. Các bào tử khác tính (+, -) sợi nấm đơn bội, phân nhánh thành sợi nấm hình thành các cặp cơ quan sinh sản, giao phối sinh chất, hình thành sợi sinh túi đa bào, sau đó phân chia nguyên nhiễm kết hợp thành nhân lƣỡng bội rồi giảm nhiễm tạo thành bào tử túi. Chu trình sống của Ascomycota gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đơn bội, giai đoạn song hạch và giai đoạn lƣỡng bội, trong đó giai đoạn đơn bội chiếm ƣu thế. Một số Ascomycota hình thành quả thể trong đó có quả thể kín, quả thể mở lỗ và quả thể hở. Hình 1.6. Nấm Neoscytalidium dimidiatum Khả năng gây bệnh Theo báo cáo đầu tiên về nấm N. dimidiatum và N. novaehollandiae trên cây xoài tại Australia (J. D. Ray, T. Burgess, V. M. Lanoielet. 2010) N. dimidiatum là loài nấm có phạm vi phân bố và có nhiều ký chủ: cây dƣơng mại, hạt sẻ, sung, vả, cây có múi, chuối, mận, và nhiều cây trồng khác ở Mỹ. N. dimidiatum còn gây hại trên xoài và nhất là trên thanh long, chúng gây các triệu chứng nhƣ héo cành, chết mầm, thối, chảy gôm và làm cây chết. 39
Đồ án tốt nghiệp 1.4.4 Các phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm in vitro [28] Mục đích của việc thử nghiệm tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm in vitro là xác định thuốc nghiên cứu có tác dụng trên vi sinh vật nào và mức độ tác dụng in vitro nhƣ thế nào. Có nhiều phƣơng pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm in vitro sau đây là một số phƣơng pháp chính: - Kỹ thuật định tính để thăm dò tác dụng trên vi sinh vật Nếu tiến hành thử định lƣợng tác dụng của dịch chiết trên tất cả các loài vi sinh vật sẽ mất nhiều thời gian mà có khi cũng không thu đƣợc kết quả mong muốn. Để giảm thiểu khối lƣợng công việc mà vẫn thu đƣợc kết quả, trƣớc hết thử định tính tác dụng của A trên tất cả loại vi sinh vật thử nghiệm. + Nếu thử định tính mà thấy dịch chiết không có tác dụng trên một loại vi khuẩn nào thì có thể kết luận ngay mà không phải thử định lƣợng. + Nếu thử định tính mà thấy dịch chiết có tác dụng trên loại vi sinh vật nào thì khi thử định lƣợng chỉ cần thử trên loại vi sinh vật đó. + Nếu thử định tính mà thấy dịch chiết có tác dụng trên nhiều trong số những loại vi sinh vật thử thì có thể phân tích, đánh giá xem dịch chiết có chiều hƣớng tác dụng trên vi khuẩn Gram dƣơng hay vi khuẩn Gram âm nhiều hơn, cũng nhƣ chiều hƣớng sử dụng dịch chiết để làm thuốc tác dụng trên loại vi sinh vật gây bệnh gì để đi sâu vào nghiên cứu có tính chất định lƣợng một số loại vi sinh vật nhất định. - Kỹ thuật dùng khoanh giấy trên môi trƣờng đặc Nguyên tắc của phƣơng pháp: xác định khả năng của thuốc đƣợc tẩm vào khoanh giấy, khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh khoanh giấy tẩm thuốc. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh. - Kỹ thuật dùng ống trụ trên môi trƣờng đặc Cũng nhƣ kĩ thuật dùng khoanh giấy, nguyên tắc của phƣơng pháp là xác định khả năng của thuốc, cho vào trong ống trụ, khuếch tán vào lớp thạch, gây ức chế sự 40
Đồ án tốt nghiệp phát triển của vi khuẩn ở xung quanh ống trụ đựng thuốc. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng thuốc càng mạnh. - Kỹ thuật dùng hệ nồng độ trong môi trƣờng lỏng Nguyên tắc: dùng hàng loạt ống nghiệm chứa môi trƣờng lỏng có chất dinh dƣỡng thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn định nghiên cứu. Thêm những nồng độ khác nhau của thuốc nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn vào các ống. Xác định nồng độ thấp nhất của thuốc ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Nồng độ này đƣợc gọi là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: Minimal Inhibitory Concentration). Phƣơng pháp này còn đƣợc gọi là kĩ thuật hòa loãng 2 lần liên tiếp (Two – fold serial dilution) hoặc phƣơng pháp hệ nồng độ. - Kỹ thuật sinh tự ký Khi đã xác định đƣợc dịch chiết toàn phần của một cây dƣợc liệu có tác dụng kháng trên một loại vi sinh vật nào đó. Muốn xác định xem thành phần nào trong cây dƣợc liệu có tác dụng thì có thể phân lập ra một dạng chiết khác nhau rồi đem thử với vi sinh vật đó, ta sẽ biết đƣợc thành phần nào không có tác dụng, thành phần nào có tác dụng và mức độ tác dụng. Nhƣng để thăm dò nhanh hơn, ta có thể dùng phƣơng pháp sinh tự kí. 41
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 2.1.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài nghiên cứu đƣợc thực hiện từ tháng 3 năm 2017 đến tháng 6 năm 2017. 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Viện Công nghệ Hóa Học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. HCM. 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Nguồn mẫu Mẫu cây Lan một lá (Nervilia aragoana) đƣợc thu hái tại tỉnh Kom Tum. 2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị Vi sinh vật chỉ thị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là 2 chủng vi khuẩn đƣợc cung cấp bởi Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh (Escherichia coli, Staphylococcus aureus) và 3 chủng nấm đƣợc cung cấp bởi phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. HCM (Fusarium solani, Neoscytalidium dimidiatum của TS. Nguyễn Thị Hai; Aspergillus niger của TS. Nguyễn Hoài Hƣơng). 2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.3.1 Thiết bị - Autoclave (Huxky Đài Loan) - Tủ ủ 370C (Memmert mermany) - Máy ly tâm (Tuttligen Germany) - Máy đo UV – VIS (Hach) - Cân phân tích (Orbital Germany) - Bếp từ (Billy – England) - Máy chƣng cất nƣớc (Branstead USA) - Máy cô quay chân không (IKA RV 10 digital V) - Tủ sấy (Memmert mermany) 42
Đồ án tốt nghiệp - Bộ chiết Soxhlet - Tủ cấy an toàn sinh học 2.3.2 Dụng cụ - Đĩa petri nhựa, thủy tinh 9cm - D ụ ng c ụ đục lỗ (d= 6 mm) - Ống đong 100 ml, 250 ml, 500 ml - Thƣớc đo - Ống nghiệm lớn, nhỏ - Bông thấm và bông không thấm nƣớc - Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml - Đũa thuỷ tinh - Pipet 1 ml, 2ml, 5ml, 10 ml, 20ml - Micropipette 100 µl, 1000 µl - Pipet pasteur thủy tinh - Đầu típ 100 µl, 1000 µl - Ống ly tâm ependoff 2 ml - Đèn cồn - Bình môi trƣờng 250 ml, 500 ml, 1000 - Các loại dụng cụ khác nhƣ: bao chịu ml nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp gấp, muỗng, - Que cấy trang dao, thun, - Bình tam giác 100 ml 2.3.3 Hóa chất - Môi trƣờng nuôi cấy: TSA, TSB, PDA. - Dung môi: Entanol, Metanol, Chloroform, Ethyl acetate, Petroleum ether, Dimethylsulfoxid (DMSO) (Trung Quốc), Nƣớc cất. - DPPH. - Vitamin C tinh khiết, Ampicilin 500mg (Việt Nam), Ketoconazole 200mg (Việt Nam). - H2SO4 đậm đặc, glyxerol. 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu Mẫu cây đƣợc thu hái một lƣợng lớn toàn bộ các bộ phận rễ, thân, lá, sau khi thu hái về đƣợc tiến hành rửa sạch với nƣớc, để ráo, làm khô bằng cách sấy mẫu ở nhiệt độ 400C. Mẫu cây sau khi sấy khô đƣợc tiến hành xay nghiền thành dạng bột. Lƣợng mẫu đã xay mịn thu đƣợc sẽ đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng. 43
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1. Mẫu bột N. aragoana 2.4.2 Phương pháp tách chiết và thu nhận cao chiết Mẫu bột cây đƣợc chiết tách và thu nhận cao chiết bằng 2 phƣơng pháp: chiết ngâm dầm và chiết Soxhlet 2.4.2.1 Phương pháp chiết ngâm dầm Nguyên tắc Sử dụng phƣơng pháp chiết ngâm dầm, mẫu thực vật đƣợc ngâm trong lƣợng lớn dung môi (w/v) ở khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hòa tan vào dung môi. Tiến hành + Tiến hành ngâm a (g) mẫu bột N. aragoana với dung môi Ethanol theo tỷ lệ 1 : 20 (w/v) trong bình erlen thủy tinh đậy kính tránh sự bay hơi của dung môi. Bình ngâm mẫu đƣợc đặt trên máy lắc, quá trình đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ để dung môi có thể xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. + Sau đó, dung dịch chiết sẽ đƣợc lọc chân không bằng giấy lọc, thu riêng dịch chiết, phần bã bột mẫu cây đƣợc tiếp tục cho thêm lƣợng dung môi mới vào và tiến hành chiết nhiều lần cho đến khi dịch lọc thu đƣợc có màu trong suốt. Phần dịch chiết thu đƣợc cô đặc, thu hồi cao chiết bằng phƣơng pháp cô quay chân không ở 700C. Cao chiết đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 40C để thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo. 44
Đồ án tốt nghiệp Tỷ lệ thu hồi cao đƣợc tính theo công thức sau: (%) Trong đó TLTH_ND: tỷ lệ thu hồi cao thu đƣợc (%) a1: khối lƣợng bình cô quay chứa cao chiết (g) a2: khối lƣợng bình cô quay ban đầu (g) a: khối lƣợng mẫu bột ban đầu dùng để ngâm với dung môi (g) 2.4.2.2 Phương pháp chiết bằng máy Soxhlet Nguyên tắc Chiết Soxhlet là một kiểu chiết liên tục đƣợc thực hiện nhờ cấu tạo đặc biệt của dụng cụ chiết. Bản chất của quá trình chiết là tuân theo định luật phân bố chất trong hai pha không trộn lẫn vào nhau. Trong đó pha rắn nằm trong mẫu sẽ đƣợc hòa tan bởi pha lỏng gọi chung là dung môi. Tiến hành + Mẫu bột N. aragoana chứa m (g) đƣợc cho vào các túi lọc nhỏ, mỗi túi chứa khoảng 5g bột cây sau đó đặt trực tiếp các túi vào hệ thống chiết Soxhlet. + Rót dung môi Ethanol đã lựa chọn vào bình cầu của hệ thống (lƣợng dung môi cho vào khoảng 2/3 thể tích của bình cầu). Kiểm tra hệ thống kín. Mở cho nƣớc chảy hoàn lƣu trong ống ngƣng hơi. Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt độ đến nhiệt độ sôi của dung môi trong bình cầu. Dung môi tinh khiết khi đƣợc đun nóng sẽ bốc hơi lên theo ống ngƣng hơi lên cao và đƣợc làm lạnh, ngƣng tụ thành thể lỏng, rớt thẳng xuống ống đang chứa mẫu bột cây. Dung môi ngấm vào bột cây và chiết những chất hữu cơ nào có thể tan vào dung môi. Đến một mức cao nhất, dung môi sẽ bị hút về bình cầu, các chất đƣợc hút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môi tinh khiết là đƣợc bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết. Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột cây. + Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu, tiến hành lọc chân không bằng giấy lọc, loại bỏ phần bã thu đƣợc dịch chiết. Phần dịch chiết thu đƣợc cô đặc, thu hồi cao chiết bằng phƣơng pháp cô quay chân không ở 700C. 45
Đồ án tốt nghiệp Cao chiết đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 40C để thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo. - Xác định tỷ lệ thu hồi cao chiết Lƣợng cao thu đƣợc sau khi đƣợc cô khô đến khối lƣợng không đổi, đem đi cân để xác định tỷ lệ thu hồi cao so với khối lƣợng bột mẫu ban đầu. Tỷ lệ thu hồi cao đƣợc tính theo công thức sau: (%) Trong đó TLTH_SO: tỷ lệ thu hồi cao thu đƣợc (%) m1: khối lƣợng bình cô quay chứa cao chiết (g) m2: khối lƣợng bình cô quay ban đầu (g) m: khối lƣợng mẫu bột ban đầu dùng để ngâm với dung môi (g) 2.4.1.1. Chiết phân đoạn bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng Phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng đƣợc áp dụng để phân chia cao EtOH thô ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau. Nguyên tắc Dung môi không phân cực (ví dụ eter dầu hoả) sẽ hoà tan tốt các hợp chất có tính không phân cực (ví dụ các ancol béo, ester béo ), dung môi phân cực trung bình (ví dụ dietyl eter, chloroform ) hoà tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức eter –O–, andehide –CH=O, cetone –CO–, ester –COO– ) và dung môi phân cực mạnh (ví dụ methanol ) hoà tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức –OH, –COOH ). Tiến hành Việc chiết lỏng – lỏng đƣợc thực hiện bằng bình lóng, trong đó lƣợng cao EtOH ban đầu (x (g)) đƣợc hòa tan vào pha nƣớc, tuy nhiên cao EtOH ban đầu hòa tan rất kém trong nƣớc nên trƣớc tiên cần hòa cao EtOH vào một lƣơng tối thiểu Ethanol. Sử dụng lần lƣợt các dung môi hữu cơ Petroleum ether và Ethyl acetate để chiết chất ra khỏi pha nƣớc thành các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi). Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nƣớc, pha 46
Đồ án tốt nghiệp hữu cơ (tan trong dung môi PE) nằm ở lớp trên so với pha nƣớc và pha EA sẽ nằm ở lớp dƣới so với pha nƣớc. Muốn kiểm tra xem các hợp chất nào đã đƣợc chiết vào pha hữu cơ cũng nhƣ các hợp chất nào còn ở lại trong pha nƣớc và chiết bao nhiêu lần thì hoàn tất, có thể nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên trên một tấm kính sạch, sau khi bay hơi hết dung môi, nếu không còn để lại vết gì trên mặt kính quá trình chiết có thể dừng lại. Các dịch chiết phân đoạn thu đƣợc tiến hành cô quay chân không ở 600C, đuổi dung môi thu đƣợc cao phân đoạn. Các cao phân đoạn đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 40C để thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo. Lƣợng cao phân đoạn thu đƣợc sau khi đƣợc cô khô đến khối lƣợng không đổi, đem đi cân để xác định tỷ lệ thu hồi cao phân đoạn so với khối lƣợng cao chiết EtOH ban đầu. Tỷ lệ thu hồi cao phân đoạn đƣợc tính theo công thức sau: (%) Trong đó TLTH_PĐ: tỷ lệ thu hồi cao phân đoạn thu đƣợc (%) x1: khối lƣợng bình cô quay chứa cao phân đoạn (g) x2: khối lƣợng bình cô quay ban đầu (g) x: khối lƣợng cao chiết EtOH ban đầu (g) 2.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH Nguyên tắc Hoạt tính chống oxi hóa oxi hóa của một chất đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo phổ UV, sử dụng thuốc thử là DPPH. 47
Đồ án tốt nghiệp Chuẩn bị - Pha mẫu: + Cân 10 mg mẫu cao EtOH và các cao phân đoạn, hòa tan trong 10 ml MeOH, lắc cho mẫu tan hoàn toàn. Nồng độ mẫu cao EtOH và các cao phân đoạn lúc này là 1000 µg/ml. + Pha loãng mẫu: Pha loãng nồng độ mẫu cao EtOH và các cao phân đoạn thành các dãy nồng độ 400, 350, 300, 250, 200 (µg/ml). - Pha thuốc thử: Cân 15,77 mg DPPH hòa tan trong 40 ml MeOH. Dung dịch DPPH lúc này có nồng độ là 1mM. - Pha dung dịch mẫu tham chiếu: Mẫu tham chiếu đƣợc sử dụng là Vitamin C + Cân 10 mg Vitamin C hòa tan trong 5 ml MeOH. Nồng độ Vitamin C lúc này là 500 µg/ml. + Pha loãng dung dịch mẫu đối chứng Vitamin C từ nồng độ ban đầu thành các dãy nồng độ 30, 25, 20, 15, 10 (µg/ml). Tiến hành - Đo dung dịch mẫu cao chiết EtOH và các cao phân đoạn + Hút lần lƣợt 0,5 ml dịch cao ở mỗi nồng độ + 0,5 ml dung dịch DPPH + 3 ml MeOH. + Để ổn định dung dịch mẫu 30 phút trong bóng tối. + Tiến hành đo quang dung dịch mẫu ở bƣớc sóng 517 nm. - Đo dung dịch mẫu Vitamin C + Hút lần lƣợt 0,5 ml dung dịch mẫu Vitamin C ở mỗi nồng độ + 0,5 ml dung dịch DPPH + 0,5 ml MeOH. + Để ổn định dung dịch mẫu 30 phút trong bóng tối. + Tiến hành đo quang ở bƣớc sóng 517 nm. - Đo dung dịch mẫu đối chứng + Hút lần lƣợt 0,5 ml dung dịch DPPH + 3,5 ml MeOH. + Để ổn định dung dịch 30 phút trong bóng tối. + Tiến hành đo quang dung dịch mẫu ở bƣớc sóng 517 nm. 48
Đồ án tốt nghiệp - Mẫu trắng sử dụng là MeOH. Khả năng loại bỏ gốc tự do của một chất đƣợc tính dựa trên phần trăm ức chế I (%). Phần trăm ức chế I (%) đƣợc xác định theo công thức: A A I(%) c s *100% Ac Trong đó: Ac: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có dịch cao chiết (mẫu đối chứng) As: Giá trị mật độ quang của dung dịch có dịch cao chiết. Dựa trên độ hấp thu của các mẫu, tính đƣợc giá trị phần trăm ức chế I (%) của mỗi nồng độ khảo sát, ứng với mỗi nồng độ tính đƣợc 3 giá trị I (%). Từ đó xác định giá trị phần trăm ức chế trung bình ứng với từng nồng độ khảo sát. Từ giá trị I (%), xác định đƣợc giá trị IC50. Giá trị IC50 đƣợc định nghĩa là nồng độ của một mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do. Giá trị IC50 dùng để đánh giá hoạt tính ức chế gốc tự do của một chất mạnh hay yếu. Giá trị IC50 càng nhỏ (IC50 < 10 μg/ml), mẫu có hoạt tính ức chế gốc tự do càng cao. Cách tính giá trị IC50: Từ các giá trị I% ứng với các nồng độ, vẽ đồ thị đƣờng thẳng: y = ax + b Trong đó: y: phần trăm ức chế (%), x : nồng độ mẫu (μg/ml). Thay giá trị I = 50% vào đồ thị tính đƣợc IC50. 2.4.4 Đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (well diffusion agar method) Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch (well diffusion agar method) dựa trên phƣơng pháp của Anonymous (1996) và Hadacek và cộng sự (2000). 49
Đồ án tốt nghiệp Nguyên tắc Dịch cao chiết đƣợc cho vào các giếng sẽ khuếch tán vào môi trƣờng thạch và gây ức chế sự phát triển của các chủng vi sinh vật chỉ thị xung quanh giếng thạch. Nếu cao chiết có khả năng ức chế các chủng vi sinh vật thì sẽ xuất hiện quầng sáng trong bao quanh các giếng thạch (vòng ức chế). Từ đó, đánh giá khả năng kháng các chủng vi khuẩn, nấm của các loại cao chiết bằng cách đo đƣờng kính vòng ức chế (mm). Chuẩn bị - Chuẩn bị mẫu thử: Cao chiết và các cao phân đoạn lần lƣợt cân chính xác 0,58 g hòa tan với 2,91 ml (nƣớc cất vô trùng + dung môi DMSO 10%) để đạt nồng độ ban đầu 200 mg/ml. - Chuẩn bị các dung dịch thuốc tham chiếu: Thuốc tham chiếu đƣợc sử dụng trong thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn là kháng sinh Ampicillin 500 mg, đối với thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng nấm mẫu thuốc dùng để tham chiếu là thuốc chống nấm Ketoconazole 200 mg. Cân chính xác 100 mg mẫu thuốc cần thử, hòa tan vào 10 ml nƣớc cất để đƣợc dung dịch có nồng độ 10 mg/ml. - Chuẩn bị môi trƣờng thạch nền, thƣờng là môi trƣờng TSA (đối với các chủng vi khuẩn), môi trƣờng PDA (đối với các chủng nấm). Môi trƣờng sau khi đƣợc phối chế đƣợc khử trùng ở 1210C, 1 atm trong 15 phút. - Chuẩn bị chủng vi sinh + Các chủng vi khuẩn chỉ thị từ ống giống gốc đƣợc tăng sinh trong erlen chứa 20 ml môi trƣờng TSB (môi trƣờng TSB đã đƣợc hấp khử trùng trƣớc đó), để lắc với tốc độ 120 vòng/phút từ 18 - 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi lắc đƣợc đo quang ở bƣớc sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào và pha loãng bằng các ống nƣớc muối sinh lí vô trùng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106 cfu/ml. + Các chủng nấm chỉ thị từ ống giống gốc đƣợc tăng sinh trong erlen chứa 20 ml môi trƣờng PDA lỏng (môi trƣờng PDA đã đƣợc hấp khử trùng trƣớc đó), để lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch nuôi cấy nấm sau khi 50
Đồ án tốt nghiệp lắc đƣợc cấy điểm sang môi trƣờng thạch PDA, các đĩa sau khi cấy đƣợc ủ ở 280C, 72 giờ. Sau 72 giờ bào tử nấm mọc đầy đĩa, tiến hành cạo bào tử ghiền trong nƣớc muối sinh lý vô trùng sau đó cho vào ống nghiệm đo độ đục, tiếp tục pha với nƣớc muối sinh lý vô trùng để đạt mật độ 105 cfu/ml. Tiến hành - Hút 100 µl dịch vi sinh đã đƣợc pha loãng cho vào giữa đĩa thạch môi trƣờng nuôi cấy vi sinh đƣợc chuẩn bị sẵn và hấp khử trùng trƣớc đó. Tiến hành trang đĩa đến khi khô, dịch vi sinh vật đƣợc trãi khắp bề mặt đĩa thạch trong điều kiện vô trùng, ghi chú các đĩa với các chủng vi sinh tƣơng ứng. - Dùng que đục có đƣờng kính d = 6 mm đã khử trùng, đục 3 giếng trên bề mặt đĩa thạch sau khi trang, mỗi giếng cách nhau 2 cm và cách mép đĩa 1 cm. Dùng dao vô trùng lấy phần thạch đã đục ra khỏi đĩa. - Hút vào mỗi giếng 100 µl dịch cao. Mẫu thuốc tham chiếu thực hiện tƣơng tự. - Các đĩa petri đƣợc để yên ở nhiệt độ phòng 3 giờ để dịch cao chiết từ các giếng khuếch tán vào môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật, sau đó ủ ở tủ ấm 370C trong thời gian 18 – 24h (đối với các đĩa vi khuẩn) riêng các đĩa nấm đƣợc ủ ở 280C trong 72 giờ. - Đọc kết quả bằng cách đo đƣờng kính vòng kháng (tính bằng mm) và so sánh đƣờng kính vòng kháng của các loại cao với mẫu thuốc tham chiếu . 2.4.5 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC Nguyên tắc Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho cao chiết và các cao phân đoạn có số lƣợng vi sinh vật bị kháng cao nhất. Nhằm mục đích xác định nồng độ ức chế nhỏ nhất của cao chiết đối với các vi sinh vật bị kháng. Sử dụng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) với cao chiết và cao phân đoạn pha ở các nồng độ khác nhau. 51
Đồ án tốt nghiệp Chuẩn bị - Chuẩn bị mẫu thử: Cao chiết và các cao phân đoạn lần lƣợt cân chính xác 0,58 g hòa tan với 2,91 ml (nƣớc cất vô trùng + dung môi DMSO 10%) để đạt nồng độ ban đầu 200 mg/ml. Từ nồng độ ban đầu pha loãng theo cấp số 2 thành nhiều dãy nồng độ thấp hơn. Ví dụ: nồng độ gốc ban đầu là 200 mg/ml sẽ đƣợc pha loãng thành các dãy nồng độ 100, 50, 25, 12,5 (mg/ml). - Chuẩn bị môi trƣờng thạch nền, thƣờng là môi trƣờng TSA (đối với các chủng vi khuẩn), môi trƣờng PDA (đối với các chủng nấm). Môi trƣờng sau khi đƣợc phối chế đƣợc khử trùng ở 1210C, 1 atm trong 15 phút. - Chuẩn bị chủng vi sinh + Các chủng vi khuẩn chỉ thị từ ống giống gốc đƣợc tăng sinh trong erlen chứa 20 ml môi trƣờng TSB (môi trƣờng TSB đã đƣợc hấp khử trùng trƣớc đó), để lắc với tốc độ 120 vòng/phút từ 18 - 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi lắc đƣợc đo quang ở bƣớc sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào và pha loãng bằng các ống nƣớc muối sinh lí vô trùng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106 cfu/ml. + Các chủng nấm chỉ thị từ ống giống gốc đƣợc tăng sinh trong erlen chứa 20 ml môi trƣờng PDA lỏng (môi trƣờng PDA đã đƣợc hấp khử trùng trƣớc đó), để lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch nuôi cấy nấm sau khi lắc đƣợc cấy điểm sang môi trƣờng thạch PDA, các đĩa sau khi cấy đƣợc ủ ở 280C, 72 giờ. Sau 72 giờ bào tử nấm mọc đầy đĩa, tiến hành cạo bào tử ghiền trong nƣớc muối sinh lý vô trùng sau đó cho vào ống nghiệm đo độ đục, tiếp tục pha với nƣớc muối sinh lý vô trùng để đạt mật độ 105 cfu/ml. Tiến hành - Hút 100 µl dịch vi sinh đã đƣợc pha loãng cho vào giữa đĩa thạch môi trƣờng nuôi cấy vi sinh đƣợc chuẩn bị sẵn và hấp khử trùng trƣớc đó. Tiến hành trang đĩa đến khi khô, dịch vi sinh vật đƣợc trãi khắp bề mặt đĩa thạch trong điều kiện vô trùng, ghi chú các đĩa với các chủng vi sinh tƣơng ứng. 52
Đồ án tốt nghiệp - Dùng que đục có đƣờng kính d = 6 mm đã khử trùng, đục 3 giếng trên bề mặt đĩa thạch sau khi trang, mỗi giếng cách nhau 2 cm và cách mép đĩa 1 cm. Dùng dao vô trùng lấy phần thạch đã đục ra khỏi đĩa. - Bổ sung 100 µl dịch cao chiết và dịch cao phân đoạn ở mỗi nồng độ vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ để dịch cao đƣợc khuếch tán đều vào môi trƣờng thạch. Sau đó, ủ các đĩa vào tủ ấm 370C trong 24 giờ (đối với vi khuẩn), riêng các chủng nấm đƣợc ủ ở 280C trong 72 giờ. Sau thời gian ủ, tiến hành đọc kết bằng cách đo giá trị đƣờng kính vòng ức chế (mm) trên đĩa thạch. - Đọc kết quả: đĩa có nồng độ thấp nhất mà vi sinh vật không phát triển đƣợc thì đó là giá trị MIC của cao chiết. 2.4.6 Phương pháp xử lí số liệu Các số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey. Dữ liệu phân tích theo phƣơng sai One – Way ANOVA (P < 0,05) có ý nghĩa thống kê. 2.5 Bố trí thí nghiệm Nội dung các thí nghiệm khảo sát hoạt tính sinh học của cây N. aragoana đƣợc trình bày ở Hình 2.2. 53
Đồ án tốt nghiệp Mẫu cây N. aragoana Xử lý mẫu Ngâm dầm Chiết Soxhlet Thu hồi cao Thu hồi cao chiết chiết Xác định tỷ lệ Xác định tỷ lệ thu hồi thu hồi Trích ly cao Xác định hiệu phân đoạn suất chiết Thu hồi cao Xác định tỷ lệ phân đoạn thu hồi Khảo sát hoạt tính sinh học Ho ạt tính Hoạt tính Hoạt tính kháng oxy hóa kháng khuẩn kháng nấm Xác định MIC Xác định MIC Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 54
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của phƣơng pháp tách chiết đến tỉ lệ thu hồi của cao chiết cây N. aragoana  Mục đích thí nghiệm - Khảo sát ảnh hƣởng của các phƣơng pháp tách chiết khác nhau đến tỷ lệ thu hồi cao chiết để tìm ra phƣơng pháp cho tỷ lệ thu hồi cao nhất, nhƣng ít ảnh hƣởng đến hoạt tính sinh học cao chiết cây N. aragoana. - Xác định hiệu suất chiết giữa 2 phƣơng pháp tách chiết.  Cách tiến hành - Mẫu bột N. aragoana (50 g) đƣợc chia làm 2 phần, khối lƣợng mỗi phần đều nhau, tiến hành tách chiết thu hồi cao chiết bằng 2 phƣơng pháp là ngâm dầm và chiết Soxhlet. Đối với phương pháp ngâm dầm Ngâm 25 g mẫu bột N. aragoana + 500 ml dung môi Ethanol trong bình erlen thể tích 1 lít, đậy kín bình chuyển bình ngâm đặt lên máy lắc, quá trình đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, cách tiến hành và xác định tỷ lệ thu hồi cao chiết từ phƣơng pháp ngâm dầm đƣợc trình bày ở mục 2.4.2.1. Đối với phương pháp chiết Soxhlet + Lƣợng mẫu bột N. aragoana còn lại 25 g đƣợc chia vào 5 túi lọc nhỏ (mỗi túi chứa 5 g), đặt trực tiếp các túi vào hệ thống chiết Soxhlet. + Thể tích Ethanol sử dụng là: 300 ml. Quá trình chiết đƣợc thực hiện ở nhiệt độ đun nóng của dung môi 1000C trong 24 giờ. Cách tiến hành và xác định tỷ lệ thu hồi cao chiết từ phƣơng pháp Soxhlet đƣợc trình bày ở mục 2.4.2.2. 55
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3. Mẫu bột chiết bằng hệ thống Soxhlet - Sau khi xác định đƣợc tỷ lệ thu hồi cao chiết, ta tính đƣợc hiệu suất chiết giữa hai phƣơng pháp chiết ngâm dầm và chiết Soxhlet. Hiệu suất chiết đƣợc tính theo công thức sau: H = Trong đó H: Hiệu suất chiết (%) TLTH_ND: tỷ lệ thu hồi cao chiết từ phƣơng pháp chiết ngâm dầm TLTH_SO: tỷ lệ thu hồi cao chiết từ phƣơng pháp chiết Soxhlet  Chỉ tiêu theo dõi: - Tỷ lệ hồi thu hồi cao chiết từ phƣơng pháp chiết ngâm dầm và chiết Soxhlet. - Hiệu suất chiết giữa phƣơng pháp chiết ngâm dầm và chiết Soxhlet. Thí nghiệm 2: Khảo sát quá trình chiết phân đoạn từ cao chiết cây N. aragoana  Mục đích thí nghiệm - Phân chia cao chiết Ethanol ban đầu thành các cao phân đoạn chứa những hợp chất có độ phân cực khác nhau. - Xác định tỷ lệ thu hồi cao phân đoạn so với cao chiết Ethanol ban đầu. 56
Đồ án tốt nghiệp  Cách tiến hành Trích ly lần lƣợt phân đoạn cao PE, EA, nƣớc. + Tổng thể tích Petroleum ether dùng: 150 ml. + Tổng thể tích Ethyl acetate dùng: 100 ml. + Tổng thể tích nƣớc dùng: 50ml Cách tiến hành và xác định tỷ lệ thu hồi cao phân đoạn đƣợc trình bày cụ thể ở mục 2.4.2.3.  Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ thu hồi cao phân đoạn PE, EA và nƣớc. Thí nghiệm 3: Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết và các cao phân đoạn bằng phƣơng pháp DPPH  Mục đích thí nghiệm Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao chiết Ethanol ban đầu và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana.  Cách tiến hành - Các mẫu cao chiết đƣợc pha ở nồng độ 1000 g/ml, 400 g/ml, 350 g/ml, 300µg/ml, 250µg/ml, 200µg/ml. - Riêng mẫu Vitamin C đƣợc pha ở nồng độ 30 µg/ml, 25 µg/ml, 20 µg/ml, 15 µg/ml, 10 µg/ml. - Dung dịch DPPH trong thử nghiệm đƣợc pha ở nồng độ 1 mM. Thử nghiệm hoạt tính bắt gốc tự do DPPH đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần. Cách tiến hành và xác định giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50 % gốc tự do) đƣợc trình bày ở mục 2.4.3.  Chỉ tiêu theo dõi - Phần trăm ức chế gốc tự do I (%) của cao chiết và các cao phân đoạn ở các nồng độ pha loãng. - Giá trị ức chế 50 % gốc tự do (IC50) của cao chiết và các cao phân đoạn. 57
Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn cây N. aragoana  Mục đích thí nghiệm Đánh giá khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của cao chiết Ethanol ban đầu và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana.  Cách tiến hành - Thử nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn đƣợc tiến hành trên 5 chủng vi sinh với mật độ thử nghiệm là 106 cfu/ml (đối với 2 chủng Escherichia coli, Staphylococcus aureus), đối với 3 chủng nấm Aspergillus niger, Fusarium solani, Neoscytalidium dimidiatum mật độ trong thử nghiệm này là 105 cfu/ml. - Môi trƣờng dùng trong thử nghiệm là TSA đối với các chủng vi khuẩn và môi trƣờng PDA đối với các chủng nấm. - Cao chiết Ethanol, cao PE và cao nƣớc trong thử nghiệm đƣợc pha loãng ở nồng độ 200 mg/ml. - Mẫu đối chứng dùng trong thử nghiệm kháng khuẩn là kháng sinh Ampicillin 500 mg đƣợc pha ở nồng độ 10 mg/ml. Đối với thử nghiệm kháng nấm mẫu đối chứng sử dụng là thuốc chống nấm Ketoconazole 200mg với nồng độ thử nghiệm là 10 mg/ml. Cách tiến hành thử nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana đƣợc trình bày ở mục 2.4.4. Mỗi mẫu thử trên 1 chủng vi sinh vật khảo sát đƣợc thực hiện lặp lại 3 lần.  Chỉ tiêu theo dõi: Đo đƣờng kính vòng kháng của cao chiết và các cao phân đoạn sau thời gian ủ. Thí nghiệm 5: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn đối với các chủng vi khuấn, nấm.  Mục đích thí nghiệm Xác định nồng độ ức chế nhỏ nhất của cao chiết và các cao phân đoạn đối với các vi sinh vật bị kháng. 58
Đồ án tốt nghiệp  Cách tiến hành - Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn đƣợc tiến hành trên 5 chủng vi sinh với mật độ thử nghiệm là 106 cfu/ml (đối với 2 chủng Escherichia coli, Staphylococcus aureus), đối với 3 chủng nấm Aspergillus niger, Fusarium solani, Neoscytalidium dimidiatum mật độ trong thử nghiệm này là 105 cfu/ml. - Môi trƣờng dùng trong thử nghiệm là TSA đối với các chủng vi khuẩn và môi trƣờng PDA đối với các chủng nấm. - Cao chiết Ethanol, cao PE và cao nƣớc trong thử nghiệm đƣợc pha loãng thành 5 dãy nồng độ: 200 mg/ml, 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12,5 mg/ml. Cách tiến hành thử nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana đƣợc trình bày ở mục 2.4.5. Mỗi nồng độ mẫu thử trên 1 chủng vi sinh vật khảo sát đƣợc thực hiện lặp lại 3 lần.  Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát các đĩa, xác định đĩa có nồng độ thấp nhất của cao chiết và cao phân đoạn mà tại đó vi khuẩn hoặc nấm không phát triển đƣợc. 59