›

Đồ án Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc dân gian tại vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng

pdf 83 trang thiennha21 12/04/2022 7350
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc dân gian tại vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_hoat_tinh_khang_khuan_cao_chiet_nuoc_cua_mot.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc dân gian tại vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CAO CHIẾT NƯỚC CỦA MỘT SỐ LOẠI CÂY THUỐC DÂN GIAN TẠI VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP – NÚI BÀ, TỈNH LÂM ĐỒNG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: Th S. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện: Phạm Thị Thảo MSSV: 1151110516 Lớp: 11DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015 Sinh viên Phạm Thị Thảo i
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên tôi xin cảm ơn quý thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã truyền đạt những kiến thức thật quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Đặc biệt xin chân thành cảm ơn thầy Thạc sĩ Phạm Minh Nhựt đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp. Thầy đã luôn ở bên, quan tâm, và giúp đỡ tôi trong việc gợi ra các ý tưởng trong quá trình làm luận văn cũng như cung cấp các tài liệu và sách vở liên quan trong suốt quá trình nghiên cứu. Ngoài ra tôi cũng xin cám ơn các bạn sinh viên trong nhóm của thầy như Tâm, Hằng, Hồng Vân, Nhân, Vân Anh, Tuấn, Trí, Hiền và tất cả các bạn trong phòng thí nghiệm của trường đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015 Sinh viên Phạm Thị Thảo ii
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC TRANG LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1 4. PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Sơ lược về một số loại cây thuốc dân gian có khả năng trị tiêu chảy tại vườn quốc gia Bidoup 3 1.1.1. Cây Podocarpus sp. 3 1.1.2. Cây Polygala sp. 4 1.1.3. Cây Medinilla sp. 5 1.1.4. Cây Elephantopus sp. 6 1.1.5. Cây Eupatorium sp. 7 1.2. Đại cương về một số nhóm chất hữu cơ có trong cao chiết nước 8 1.2.1. Carbohydrate 8 1.2.2. Flavonoid 9 1.2.3. Tannin 10 1.2.4. Alkaloid 11 1.2.5. Saponin 12 iii
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.2.6. Anthraglycoside 13 1.3. Tổng quan cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất thực vật 15 1.3.1. Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn của thực vật 15 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn chung của các hợp chất từ thực vật 16 1.4. Nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy 17 1.4.1. Đại cương về họ vi khuẩn đường ruột 17 1.4.2. Một số vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy 18 1.4.3. Nhóm vi khuẩn gây bệnh trên da 23 CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25 2.2. Vật liệu nghiên cứu 25 2.2.1. Nguyên liệu nghiên cứu 25 2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị 25 2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 26 2.3.1. Thiết bị và dụng cụ 26 2.3.2. Hóa chất 26 2.4. Phương pháp nghiên cứu 27 2.4.1. Phương pháp tách chiết cao nước của cây thuốc 27 2.4.2. Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật chỉ thị 27 2.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của thực vật 29 2.4.4. Phương pháp xử lí số liệu 29 2.5. Bố trí thí nghiệm 29 2.5.1. Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của các loại cây thuốc 30 2.5.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc 32 2.5.3. Thí nghiệm 3: Định tính thành phần hóa học của cao chiết nước một số loại cây thuốc dân gian 33 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của một số loại cây thuốc dân gian 38 iv
  6. Đồ án tốt nghiệp 3.1.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước một số loại cây thuốc dân gian 39 3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học cao chiết nước của một số loại cây thuốc 50 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 4.1. Kết luận 54 4.2. Đề nghị 54 v
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TSB: Trypton Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar DMSO: Dimethyl sulfoxide pABA: p – aminobenzoic acid mRNA: RNA thông tin tRNA: RNA vận chuyển DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid vi
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao nước của một số loại cây thuốc đối với một số chủng vi sinh vật 48 Bảng 3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học cao chiết nước của một số loại cây thuốc 51 vii
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1.1. Cây Podocarpus imbricartus 3 Hình 1.2. Cây Polygala paniculata 4 Hình 1.3. Cây Medinilla septentrionalis 5 Hình 1.4. Cây Elephantopus mollis 6 Hình 1.5. Cây Eupatorium odoratum 7 Hình 1.6. Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm. 16 Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm 30 Hình 2.2. Sơ đồ chung đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của một số cây thuốc dân gian 31 Hình 2.3. Sơ đồ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc dân gian 32 Hình 2.4. Định tính sơ bộ thành phần hóa học cao chiết nước của các loại cây thuốc . Hình 3.1. Hiệu suất thu hồi cao nước của một số loại cây thuốc dân gian 38 Hình 3.2. Màu sắc dịch lọc cao chiết nước cây Elephantopus sp. qua các lần ngâm mẫu 38 Hình 3.3. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết nước cây Podocarpus sp. 39 Hình 3.4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Polygala sp. 41 Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Medinilla sp. 43 Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Eupatorium sp. 45 Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước cây Elephantopus sp. 47 Hình 3.8. Kết quả kháng khuẩn cao nước của cây Medinilla sp. đối với chủng SD (A1) và ShB (A2), cây Polygala sp. đối với VH (B1) và EC (B2), cây Eupatorium viii
  10. Đồ án tốt nghiệp sp. đối với chủng VH (C1) và LM (C2), cây Podocarpus sp. với chủng ST (D1) và cạy Elephantopus sp. đối với chủng ShF (D2). 49 ix
  11. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngay từ những ngày đầu khi xã hội loài người còn chưa phát triển, con người đã biết tận dụng các loại cây cỏ trong tự nhiên để phục vụ vào cuộc sống hằng ngày như làm thực phẩm, và đặc biệt là trong chữa bệnh. Tài nguyên cây thuốc là một trong số những tài sản vô giá mà thiên nhiên ban tặng cho con người. Gần 150000 loài cây thuốc trong số 250000 – 300000 loài thực vật có hoa ở vùng nhiệt đới được sử dụng làm cây thuốc, gần 5 % trong số cây thuốc đó được nghiên cứu thành phần hóa học. Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam có nhiều nhà khoa học nghiên cứu về cây thuốc, đi sâu tìm hiểu từng hoạt chất có trong cây cỏ có trong các bài thuốc dân gian. Từ đó chiết suất tạo ra các dược phẩm có giá trị chữa bệnh có hiệu quả. Do đó, việc điều tra các loại cây cỏ có tác dụng chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian là rất cần thiết. Trong dân gian người ta thường sử dụng các loại cây cỏ để chữa bệnh bằng cách sử dụng trực tiếp hoặc nấu nước uống để chữa các bệnh thông thường như tiêu chảy, cảm mạo Đối với các mẫu cây này người ta thường rửa sạch, sau đó cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn rồi đem đi nấu với nước trong nồi kín cho đến khi gần cạn rồi chắt dịch cạn thu được để dùng . Do đó, người dân chủ yếu tách chiết các hợp chất trong cây thuốc bằng dung môi là nước. Tuy nhiên, hiệu quả mang lại thật sự của phương pháp này chưa thể chứng minh được hoạt tính thật sự của cây thuốc vì trong cây thuốc có khá nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao không hòa tan được trong nước. Vì thế, việc đánh giá hoạt tính của cao chiết nước của một số cây thuốc dân gian đóng vai trò rất quan trọng. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài "Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc của một số loại cây thuốc dân gian tại Vƣờn Quốc gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng". Đề tài 1
  12. Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường ĐH Công nghệ Tp.HCM. 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của các loại cây thuốc đối với một số chủng vi sinh vật gây bệnh và bước đầu định tính thành phần hóa học cao chiết nước của một số loại cây thuốc. 3. Nội dung nghiên cứu Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước của một số loại cây thuốc dân gian Bước đầu định tính thành phần hóa học cao chiết nước một số loại cây thuốc dân gian. 4. Phạm vi nghiên cứu Chỉ khảo sát một số cây thuốc dân gian như Podocarpus sp., Polygala sp., Medinilla sp., Eupatorium sp., Elephantopus sp. thu được ở vườn quốc gia Bidoup núi Bà – tỉnh Lâm Đồng. Chỉ sử dụng một loại dung môi là nước 2
  13. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lƣợc về một số loại cây thuốc dân gian có khả năng trị tiêu chảy tại vƣờn quốc gia Bidoup 1.1.1. Cây Podocarpus sp. 1.1.1.1. Phân loại khoa học Giới: Plantae Ngành: Pinophyta Lớp: Pinopsida Bộ: Pinaes Họ: Podocarpaceae Chi: Podocarpus Hình 1.1. Cây Podocarpus imbricatus 1.1.1.2. Đặc điểm Chi Podocarpus trong tiếng việt được gọi là chi thông tre. Có khoảng 105 loài thuộc chi này, thân của các loài trong chi có chiều cao từ 1 – 25 m, có thể lên tới 40 m. Trong thân thường có nhựa mủ, lá của các loài thường là lá kim thon dài như hình liềm hoặc tre trúc, dài từ 0,5 – 15 cm ( Farjon, 1998). Podocarpus imbricatus là dạng cây gỗ lớn thuộc họ Kim giao (Podocarpaceae), chi podocarpus. Cây cao tới 35 m, đường kính 50 – 70 cm có khi tới 200 cm, thân thẳng, tròn, có nhiều cành xòe rộng, quả hơi vuông cạnh. Vỏ cây có màu nâu đỏ, ghồ ghề, khi chặt chảy nhựa màu nâu nhạt, thịt vỏ màu da cam. Hoa đực mọc ở nách lá dài 1 cm, hoa cái màu đỏ mọc trên đế nạc (Laub D, 1969). Cây mọc rải rác trong rừng thường xanh ở các tỉnh Quảng Bình, Nghệ An, Hà tĩnh, Gia Lai, Phân bố ở độ cao từ 300 – 1000 m, có khi xuống dưới 200 m. Cây ưa sáng, nhưng lúc non cần che bóng, ưa ẩm ướt, tốt nhất là đất cát pha. 1.1.1.3. Công dụng Cây có vị nhạt chát, có tác dụng tán nhiệt, sát trùng, chỉ dương. Có thể dùng để trị cảm mạo và bệnh ngoài da Ngoài ra lá thông còn có tác dụng trừ phong 3
  14. Đồ án tốt nghiệp thấp, sát trùng, kích thích mọc tóc nhanh, chữa bệnh cước khí (phù do thiếu vitamin B1). Gỗ nhẹ, không bền thường dùng để đóng đồ trong nhà, làm bột giấy 1.1.2. Cây Polygala sp. 1.1.2.1. Phân loại khoa học Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Fabales Họ: Polygalaceae Chi: Polygala Hình 1.2. Cây Polygala paniculata 1.1.2.2. Đặc điểm Polygalaceae là một họ thực vật có hoa, chúng gần như phân bố khắp thế giới, có khoảng từ 17 – 20 chi, 900 – 1000 loài cây thân thảo, cây bụi và cây gỗ. Khoảng một phần ba tổng số loài của họ này thuộc về chi Viễn chí (Polygala) (Lüdtke và ctv, 2013). Polygala paniculata L là một loài thuộc họ viễn chí Polygalaceae. Cây còn được gọi là cây dầu nóng, cây thảo nhỏ hay bụi mảnh cao 30 – 40 cm. Đặc điểm dễ nhận của cây là khi nhổ cây lên ngửi phần gốc rễ cây sẽ thơm mùi tinh dầu salicylat methyl, thân cây mảnh không lông. Lá có phiến nhỏ hẹp 1,5 x 0,15 cm, đầu nhọn mỏng không lông. Hoa có màu trắng nhỏ, cao 2 mm, không lông (Đỗ Tất Lợi, 2004). Trên thế giới, Viễn chí lá nhỏ phân bố ở Nam Mỹ, châu Đại Dương, châu Á Ở nước ta thường gặp ven đường đi, đất hoang và có số lượng lớn ở Lâm Đồng Thành phần hóa học: Rễ chứa nhiều tinh dầu có salicylat methyl nên có mùi rất thơm, saponin 4
  15. Đồ án tốt nghiệp 1.1.2.3. Công dụng Cây có vị đắng the, có tác dụng an thần, ích trí, khan đàm, hoạt huyết, trị sổ mũi. Ngoài ra saponin có trong dược liệu sẽ kích thích sự bài tiết niêm dịch ở khí quản, có tác dụng chữa ho, kích thích sự bài tiết nước bọt, bài tiết các tuyến ở da 1.1.3. Cây Medinilla sp. 1.1.3.1. Phân loại khoa học Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Myrtales Họ: Melastomataceae Chi: Medinilla Hình 1.3. Cây Medinilla septentrionalis 1.1.3.2. Đặc điểm Medinilla là chi có khoảng 150 loài thực vật nở hoa trong họ Melastomataceae, chủ yếu nằm trong các vùng nhiệt đới. Chúng là cây thường xanh, cây bụi hoặc dây leo. Medinilla thường mọc thành bụi nhỏ, cao khoảng từ 1 – 2 m, với những lá đơn mọc đối với cụm hoa dạng chùm lớn với những hoa nhỏ li ti. Chùm hoa mọc từ nách lá, cành hoa kéo dài khoảng 25 cm, hoa có màu tím hồng (Renner, 2004). Medinilla septentrionalis thuộc loại cây bụi cây cao khoảng 1 – 7 m, cây có nhiều nhánh. Cuống lá có bề dày từ 0,4 – 0,9 mm, có dạng hình trứng bản rộng rất mỏng, kích thước lá 7 – 8,5 x 2 – 2,5 cm. Hoa của cây mọc theo từng chùm, dạng hình chuông, cuống hoa mọc từ lá nách kéo dài khoảng 1 – 2,5 cm, hoa có màu hồng hoặc đỏ tía (Chen Cheih và ctv, 1984). Phân bố: Cây được phân bố chủ yếu ở các rừng rậm, lề rừng, các khu vực ẩm ướt trong độ cao từ 200 – 1800 m. Cây mọc chủ yếu tại các vùng Quảng Đông, 5
  16. Đồ án tốt nghiệp Quảng Tây, Vân Nam của Trung Quốc, ngoài ra còn có ở các nước như Thái lan, Việt Nam 1.1.4. Cây Elephantopus sp. 1.1.4.1. Phân loại khoa học Giới: Plantae Ngành: Spermatophyta Lớp: Dicotyledonae Bộ: Asterales Họ: Asteraceae Chi: Elephantopus Hình 1.4. Cây Elephantopus mollis 1.1.4.2. Đặc điểm Elephantopus mollis có tên thường gọi là cúc chỉ thiên hoa trắng hay cúc chân voi mềm. Là loại cây thân thảo lâu năm cao từ 0,5 – 1 m, cây phủ đầy lông. Lá mọc dài theo thân, không cuống dài từ 10 – 15 cm. Cụm hoa dài theo thân, nhánh mang nhiều hoa đầu kép trong một bao chung (Mercadante, 2013) Phân bố: Loài này có nguồn gốc ở Trung và Nam Mĩ, thường gặp ở các vùng nhiệt đới. Ở nước ta, cây Elephantopus mollis mọc ở rừng thưa, rừng thông, dọc đường đi ở các tỉnh Tây Nguyên. 1.1.4.3. Một số nghiên cứu dược liệu về cây E. mollis Tại Brazil lá cây được sử dụng như một chất làm mềm, làm lành vết thương, ra mồ hôi và để điều trị viêm phế quản, ho, cảm cúm trong y học dân gian (Empinotti và Duarte, 2008) Chiết xuất E. mollis chứng minh tác dụng bảo vệ chống lại nhiễm độc gan do β – D –galactosamine và acetaminophen, bằng cách giảm nồng độ trong huyết thanh glutamate – oxalate – transaminase và huyết thanh glutamate – pyruvate – transaminase. Các biến đổi chất béo ở gan và hoại tử của lobule trung tâm rõ ràng đã được cải thiện bằng cách xử lí với E. mollis (Lin và ctv, 1995) 6
  17. Đồ án tốt nghiệp Tabopda và ctv, (2008) đã xác định được một sesquiterpene lactone mới trong E. mollis. Nó thể hiện tác động gây độc tế bào quan trọng chống lại tế bào B104 chuột neuroblastoma. 1.1.4.4. Công dụng Có vị đắng, se, có tác dụng thanh nhiệt giải độc, trị cảm mạo 1.1.5. Cây Eupatorium sp. 1.1.5.1. Phân loại khoa học Giới: Plantae Ngành: Angiospermae Lớp: Eudicots Bộ: Asterales Họ: Asteraceae Chi: Eupatorium Hình 1.5. Cây Eupatorium odoratum 1.1.5.2. Đặc điểm Cây Eupatorium odoratum có tên thường gọi là cây cỏ hôi, cây cỏ lào Là một loại cây nhỏ, mọc thành bụi, thân hình trụ thẳng cao tới hơn 2 m, có nhiều cành. Khi cây trưởng thành lá có hình dạng quả trám lệch, mép có răng cưa thưa, có lông thưa và ngắn ở cả hai mặt lá. Nếu vò lá và cành non có mùi thơm hắc. Cụm hoa đầu, hình trụ dài 9 – 11 mm, đường kính 5 – 6 mm. Lúc nở hoa có màu tím nhạt, sau trắng (King, R. M. and H. Robinson, 1987). Phân bố: Cây mọc ở khắp nơi và trên mọi địa hình Thành phần hóa học: Tinh dầu 0,7 – 2,0 % màu vàng nhạt, ageratochromen, demethoxy, cadinen, caryophyllen. Ngoài ra còn có saponin, alkaloid 1.1.5.3. Công dụng Có tác dụng chống viêm, chống dị ứng, chữa rong huyết sau đẻ 7
  18. Đồ án tốt nghiệp 1.2. Đại cƣơng về một số nhóm chất hữu cơ có trong cao chiết nƣớc 1.2.1. Carbohydrate 1.2.1.1. Khái niệm Carbohydrate là nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rãi trong cơ thể sinh vật, là hợp chất có chứa nhiều nhóm chức OH và một nhóm CHO (aldehyde) hoặc một nhóm CO (ketone). Cây xanh có khả năng sử dụng năng lượng ánh sáng để tổng hợp carbohydrate từ CO2 và H2O. Carbohydrate thực vật là nguồn dinh dưỡng quan trọng của người và động vật. Là hợp chất hữu cơ được tạo nên từ các nguyên tố C, H, O Công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n. 1.2.1.2. Phân loại Carbohydrate được chia làm 3 nhóm chính: Monosaccharide: Hay còn gọi là đường đơn vì chúng là thành phần đơn giản nhất của carbohydrate và không bị thủy phân như glucose, fructose, galactose. Monosaccharide đầu tiên được tìm thấy là glucose với cấu trúc 5 nhóm hydroxyl, (Alexander Kolli, 1869). Oligosaccharide: Khi thủy phân cho từ 2 – 8 đường đơn như sucrose, maltose, lactose Polysaccharide: Do nhiều gốc monosaccharide kết hợp với nhau, có khối lượng phân tử lớn, do đó polysaccharide không có tính khử như tinh bột, glycogen 1.2.1.3. Vai trò Cung cấp năng lượng cho cơ thể, carbohydrate đảm bảo khoảng 60% năng lượng cho các quá trình sống. Có vai trò cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidoglycan ) Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide) 8
  19. Đồ án tốt nghiệp Góp phần bảo đảm tương tác đặc hiệu của tế bào (polysaccharide trên màng tế bào hồng cầu, thành tế bào một số vi sinh vật). 1.2.1.4. Tính chất Các monosaccharide là những chất không màu, phần lớn có vị ngọt. Chúng hoà tan tốt trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ không phân cực, tan trong dung dịch ethanol 80%. Momosaccharide có tính khử Các oligosaccharide bị thủy phân trong môi trường acid, tuy nhiên chúng khá bền với môi trường kiềm 1.2.2. Flavonoid 1.2.2.1. Khái niệm Là một sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc của hoa, giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa Bộ khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon 1.2.2.2. Phân loại Dựa theo gốc aryl, flavonoid được chia như sau: 1.2.2.3. Tính chất Ðộ tan không giống nhau Flavonoid glycosides, flavonoid sulfat không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước, cồn Aglycon flavonoid tan trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước 9
  20. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2.4. Vai trò Là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn acid ascorbic trong tế bào, ngăn cản 1 số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng ) Tham gia lọc tia cực tím (UV), cộng sinh cố định đạm và sắc tố hoa 1.2.3. Tannin 1.2.3.1. Khái niệm Là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino axit và alkaloid). 1.2.3.2. Phân loại Tannin thủy phân được(Tannin pyrogalic) o Thuỷ phân bằng acid (hoặc enzyme tanaza) tạo ra phần đường (glucose) và phần không đường (các acid), nối với nhau theo dây nối este. o Tủa xanh đen với muối sắt III o Dễ tan trong nước o Ví dụ: Ðại hoàng, Ðinh hương, lá cây Bạch đàn Tannin không thủy phân được(Tannin pyrocatechic) o Dễ tạo thành chất phlobaphen không tan o Thường là chất trùng hợp từ catechin (hoặc từ leucoanthoxyanidin), (hoặc là những chất đồng trùng hợp của hai loại) o Tủa xanh với muối sắt III o Ví dụ: Vỏ Quế, Canhkina, Ðại hoàng 1.2.3.3. Tính chất Có vị chát, tan trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và acetone Đa số không tan trong các dung môi hữu cơ Tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt) 10
  21. Đồ án tốt nghiệp 1.2.3.4. Vai trò Bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy 1.2.4. Alkaloid 1.2.4.1. Khái niệm Là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được cung cấp bởi amino acid, đa số có nhân dị vòng, thường gặp chủ yếu ở thực vật. 1.2.4.2. Phân loại Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử chung của chúng, dựa trên kiểu trao đổi chất được sử dụng để tạo ra phân tử. Các nhóm alkaloid hiện nay bao gồm: o Nhóm pyridine: piperin, coniin, cytisin, o Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin o Nhóm tropan: atropine, cocain, ecgonin, scopolamine o Nhóm quinolin: quinine, quinidin, brucin o Nhóm isoquinolin: các alkaloid gốc thuốc phiện như morphin, codein o Nhóm phenethylamin: mescalin, ephedrine, dopamine, serotonin o Nhóm indol: serotonin, ergin, reserpin o Nhóm purin: caffeine, theobromin, theophyllin o Nhóm terpenoid: cholin, aconitin, 1.2.4.3. Tính chất Đa số các Alkaloid đều có tính base yếu Alkaloid trong tự nhiên thường tồn tại ở dạng thể rắn như morphine (C17H17NO3), quinine (C20H24N2O2) Tuy nhiên nó cũng có thể tồn tại ở dạng lỏng như coniin (C8H17N) 11
  22. Đồ án tốt nghiệp Đa số alkaloid không có mùi, không có màu, có vị đắng và một số ít có vị cay như piperin Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, ) tạo ra muối phức. 1.2.4.4. Vai trò Diệt khuẩn Tác động lên hệ thần kinh Hạ huyết áp Chống ung thư 1.2.5. Saponin 1.2.5.1. Khái niệm Thuộc nhóm glycoside, gặp rộng rãi trong thực vật. Dưới tác dụng của các enzyme thực vật, vi khuẩn hay acid loãng, saponin bị thuỷ phân thành genin (gọi là sapogenin) và phần glucid 1.2.5.2. Phân loại Dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia làm 2 loại: saponin triterpenoid và saponin steroid. Saponin triterpenoid được chia làm hai nhánh lớn là saponin triterpenoid pentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic. o Saponin triterpenoid pentacyclic gồm có các nhóm olean, ursan, lupan, hopan. Đặc điểm của nhóm này là phần aglycon thường có 5 vòng. o Ví dụ: Asiaticosid có trong rau má là saponin của nhóm ursan o Saponin triterpenoid tetracyclic gồm có các nhóm drammaran, lanostan, cucurbitan. Đặc điểm của nhóm này là phần aglycon có 4 vòng. o Ví dụ: Đại diện cho nhóm drammaran là saponin của nhân sâm, lanostan có trong các loài hải sâm Saponin steroid gồm có các nhóm spirostan, furostan, aminofurostan, spirosolan. Đặc điểm chung của nhóm này là gồm có 27 carbon như cholesterol, nhưng mạch nhánh từ C 20 – 27 tạo thành hai vòng có oxy. Một 12
  23. Đồ án tốt nghiệp là hydrofutan (vòng E), và vòng còn lại là hydropyran (vòng F). Các nhóm trên chỉ khác nhau ở sự biến đổi ở vòng F 1.2.5.3. Tính chất Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch. Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng. Ðộc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với một số các chất khác Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc, abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt. Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ete, hexan. 1.2.5.4. Vai trò Tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi lỏng) Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt Một số saponin có tác dụng chống viêm Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus 1.2.6. Anthraglycoside 1.2.6.1. Khái niệm Những hợp chất anthranoid nằm trong nhóm lớn hydroxyquinon. Những hợp chất quinon được tìm thấy chủ yếu trong ngành nấm, địa y, thực vật bậc cao và cả trong động vật. Căn cứ vào số vòng thơm đính thêm vào nhân quinon mà người ta sắp xếp thành benzoquinon, naphthoquinon, anthraquinon và naphthacenequinon hay còn gọi là anthracyclinon (4 vòng). 13
  24. Đồ án tốt nghiệp Anthranoid hay anthraquinon khi tồn tại dưới dạng glycosid thì được gọi là anthraglycosid hay anthracenosid. Cũng như các loại glycosid khác Anthraglycosid là những glycosid khi bị thuỷ phân sẽ cho phần đường và phần aglycon (genin). Đa số các anthraglycosid là các polyoxy anthraquinon. Gắn vào nhân thường có các nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH Tuỳ theo vị trí các nhóm chức đính vào nhân mà có các dẫn chất khác nhau. 1.2.6.2. Phân loại Dẫn chất antraquinon có thể chia làm ba nhóm là nhóm phẩm nhuộm, nhóm nhuận tẩy và nhóm dimer. Nhóm phẩm nhuộm (các dẫn chất 1,2 dihydroxy anthraquinon). Các dẫn chất của nhóm này thường có màu đỏ cam đến đỏ tía, trong cấu trúc có hai nhóm OH kế cận nhau o Ví dụ: Alizarin, purpurin Nhóm nhuận tẩy (các dẫn chất 1,8 dihydroxy anthraquinon). Nhóm này thường có nhóm CH3, CH2OH, CHO, COOH ở vị trí C3, các dẫn chất này có thể ở dạng tự do hoặc kết hợp với phần đường ở dạng glycoside o Ví dụ: Rein, cryzophanol Nhóm dimer được hình thành do hai phân tử ở dạng anthron bị oxy hóa rồi trùng hợp với nhau tạo thành o Ví dụ: Hypericin, ararobinol 1.2.6.3. Tính chất Những dẫn chất anthraquinon đều có màu từ vàng, vàng cam đến đỏ. Dễ thăng hoa Ở thể glycosid dễ tan trong nước, có thể tan trong ether, chloroform và một số dung môi hữu cơ khác. OH ở vị trí α thì có tính acid yếu hơn ở vị trí β do tạo dây nối hydro với nhóm carbonyl 14
  25. Đồ án tốt nghiệp Dẫn chất có 1,4-dihydroxy sẽ có huỳnh quang trong dung dịch acid acetic. Ngoài ra các dẫn chất này còn cho màu xanh dương với H2SO4. Các dẫn chất thuộc nhóm nhuận tẩy khi ở trong dung dịch kiềm tạo phenolat có màu đỏ và dưới ánh sáng UV (365 nm) cho huỳnh quang tím hoặc đỏ nâu. Các dẫn chất anthranol có phản ứng với p-nitroso dimethylanilin để tạo thành azomethin có màu. 1.2.6.4. Vai trò Các dẫn chất anthraglycoside, chủ yếu là các β-glucoside dễ hoà tan trong nước, không bị hấp thu cũng như bị thủy phân ở ruột non. Khi đến ruột già, dưới tác dụng của β-glucosidase của hệ vi khuẩn ở ruột thì các glycoside bị thủy phân và các dẫn chất anthraquinon bị khử tạo thành dạng anthron và anthranol là dạng có tác dụng tẩy xổ, do đó có thể giải thích lí do tác dụng đến chậm sau khi uống thuốc. Dạng genin thì bị hấp thu ở ruột non nên không có tác dụng. Do tác dụng làm tăng nhu động ruột nên với liều nhỏ các dẫn chất 1,8- dihydroxyanthraquinon dưới dạng heteroside giúp cho sự tiêu hoá được dễ dàng, liều vừa nhuận, liều cao xổ. Các dẫn chất anthraglycoside có tác dụng thông mật. Hỗn hợp các dẫn chất anthraquinon có trong rễ cây Rubra tinctoria L. có tác dụng thông tiểu và có khả năng tống sỏi thận. Chrysophanol có tác dụng kháng nấm dùng để trị nấm, hắc lào, lang ben. Một số nghiên cứu cho thấy các dẫn chất quinon đặc biệt là các dẫn chất anthraquinon có tác dụng kích thích miễn dịch chống ung thư. 1.3. Tổng quan cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất thực vật 1.3.1. Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn của thực vật Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triên của vi sinh vật. Các chất kháng 15
  26. Đồ án tốt nghiệp khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở nồng độ thường rất nhỏ (Nguyễn Thị Hiền và ctv, 2010) 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn chung của các hợp chất từ thực vật Cơ chế kháng khuẩn chung của các hợp chất từ thực vật bao gồm việc phá vỡ màng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình tổng hợp cùng chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian tế bào, gây đông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền thông tin của tế bào. Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả PSMs (Plant secondary metabolites) tác động tới màng tế bào, khuếch tán qua màng tế bào rồi tác động tương tác với các thành phần nội bào từ đó ảnh hưởng tác động tới hoạt động tế bào (Radulovíc và ctv, 2013). Hình 1.6. Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn. Do tác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu. 16
  27. Đồ án tốt nghiệp Ức chế chức năng của màng tế bào: Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân tử có kích thước lớn và các ion bị thoát ra ngoài Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: o Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác o Nhóm chlorarnphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các aid amin mới vào chuỗi polypeptide o Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide Ức chế quá trình tổng hợp nucleic acid: o Nhóm rifampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA o Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA o Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzoic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp nucleic acid o Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo nucleic acid. 1.4. Nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy 1.4.1. Đại cương về họ vi khuẩn đường ruột 1.4.1.1. Khái niệm Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, không có lên men oxidase, lên men đường glucose có kèm theo sinh hơi hoặc không, khử nitrat thành nitrit, có thể di động hoặc không và không sinh nha bào. 17
  28. Đồ án tốt nghiệp 1.4.1.2. Đặc điểm hình thể và tính chất nuôi cấy Tất cả vi khuẩn họ này đều là trực khuẩn gram âm, kích thước trung bình 2 – 4 µm x 0,4 – 0,6 µm. Một số loài hình thể không ổn định, có thể xuất hiện dạng sợi. Những vi khuẩn di động thì có nhiều lông phân bố ở xung quanh tế bào. Họ vi khuẩn đường ruột có thể mọc trên môi trường nuôi cấy thông thường, trên môi trường lỏng có thể lắng cặn hoặc làm đục môi trường Trên môi trường đặc có 3 dạng khuẩn lạc: o Dạng S: Khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng o Dạng R: Mặt khuẩn lạc khô, xù xì o Dạng M: Khuẩn lạc nhầy, các khuẩn lạc có xu hướng hòa vào nhau 1.4.1.3. Khả năng gây bệnh Khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đường ruột, đầu tiên là khả năng nhiễm khuẩn đường tiêu hóa. Chúng đứng đầu trong các căn nguyên gây bệnh vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy. Ngoài ra chúng còn có khả năng gây bệnh ở nhiều cơ quan khác như tiết niệu, thần kinh Chúng cũng đứng đầu trong các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết. 1.4.2. Một số vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy 1.4.2.1. Nhóm Salmonella a, Đặc điểm hình thái Hình thái khuẩn lạc: Trên môi trường XLD khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hoặc không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc Hình thái tế bào: o Salmonella do Daniel E. Salmon phát hiện ra năm 1885. Năm 1880 Grafhy đã mô tả hình ảnh vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản và là người đầu tiên phân lập được S.typhi vào năm 1884. 18
  29. Đồ án tốt nghiệp o Salmonella là vi sinh vật thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae. Salmonella là vi khuẩn gram âm, hình que, kích thước khoảng 0,6 – 2,0 μm, kị khí tùy nghi, có tiên mao, có thể di động (trừ S. gallinarum và S. pullorum) không tạo bào tử, có khả năng sinh hơi, lên men dextrose và sinh khí H2S. b, Khả năng gây bệnh Salmonella có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện trong thực phẩm, đến mức cả triệu tế bào trong một gram thực phẩm. Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh kể từ tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm khuẩn đến khi có các triệu chứng biểu hiện là 12 – 36 giờ. Không phải tất cả mọi người khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm salmonella đều bị ngộ độc. Các loại thực phẩm có nguy cơ nhiễm salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng Salmonella xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng và hầu hết là do ăn phải thức ăn bị nhiễm khuẩn như thực phẩm, sữa, nước uống Sau khi qua hàng rào acid dạ dày, vi khuẩn di chuyển về phía ruột non và sinh sản ở đó, tiếp tục đi qua màng nhày và vào thành ruột. c, Một số chủng salmonella gây bệnh cho người S. typhi: Loài này chỉ gây bệnh cho người, nó là vi khuẩn quan trọng nhất trong các căn nguyên gây bệnh thương hàn S. paratyphi A: Chỉ gây bệnh cho người, là căn nguyên gây bệnh thương hàn S. paratyphi B: Chủ yếu gây bệnh ở người, nhưng có thể gây bệnh cho động vật S. paratyphi C: Vừa có khả năng gây bệnh thương hàn vừa có khả năng gây viêm dạ dày, ruột và nhiễm khuẩn huyết S. typhimurium và S. enteritidis: Có khả năng gây bệnh cho người và động vật 19
  30. Đồ án tốt nghiệp S. choleraesuis: Là căn nguyên thường gặp trong các nhiễm khuẩn huyết do Salmonella 1.4.2.2. Nhóm Escherichia coli a, Đặc điểm của E. coli Escheriachia coli do Escherich phân lập 1885 từ phân trẻ em. E. coli là trực khuẩn hình que ngắn kích thước 2 – 3 x 6µm, hai đầu tròn, tế bào đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, có tiên mao chung quanh thân nên có thể di động, không tạo bào tử, gram âm, thỉnh thoảng có hiện tượng bắt màu ở hai đầu. E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy nghi, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 15 – 44oC (tối ưu ở 37oC), pH từ 5,5 – 8,5 (tối ưu ở 7,4). Trên môi trường EMB E. coli hình thành những khuẩn lạc màu tím đen, thường có ánh kim, bờ tròn đều. Có phản ứng lên men đường với các loại đường như Lactose, Glucose, Ngoài ra còn có phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứn H2S, VP, Urea âm tính. b, Khả năng gây bệnh của vi khuẩn E. coli là vi khuẩn chiếm nhiều nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí sống ở đường tiêu hóa. Tuy là vi khuẩn cộng sinh với người nhưng E. coli có thể gây bệnh cơ hội. Chúng có thể gây viêm đường tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục Nhưng nguy hiểm nhất là gây viêm dạ dày ruột ở trẻ em Trước hết vi khuẩn E. coli phải bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng kháng nguyên F. Sau đó, nhờ các yếu tố xâm nhập vào tế bào biểu mô của thành ruột. ở đó, vi khuẩn phát triển, nhân lên, phá vỡ lớp tế bào biểu mô, gây viêm ruột, đồng thời sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin, gây ra hiện tượng tiêu chảy. 1.4.2.3. Nhóm Shigella a, Đặc điểm chung Là trực khuẩn gram âm, không di động, không sinh bào tử, kỵ khí tùy nghi, tăng trưởng ở nhiệt độ 10 40oC, pH 6 – 8, có kháng nguyên O, một số có kháng nguyên K, không có kháng nguyên H 20
  31. Đồ án tốt nghiệp Shigella lên men glucose, không sử dụng nitrat, không sinh hơi Shigella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae nên có cấu trúc kháng nguyên phức tạp. Shigella có kháng nguyên O, không có kháng nguyên H, một số có kháng nguyên K b, Khả năng gây bệnh trên người Các loài shigella có tính chuyên biệt ký chủ cao, chúng chỉ xâm nhiễm và tăng trưởng trong người và các loài linh trưởng. Trong môi trường nước các loài này có thể tồn tại hơn 6 tháng. Ngộ độc thực phẩm do shigella chủ yếu là do ăn phải thực phẩm kém vệ sinh. Shigella cũng có thể lây nhiễm trực tiếp từ người qua người. Shigella chủ yếu gây nên các triệu chứng lỵ trong 1 – 7 ngày sau khi sử dụng thực phẩm bị nhiễm khuẩn. Biểu hiện bệnh lý có thể thay đổi từ tiêu chảy nhẹ đến đi tiêu ra máu, mất nước, sốt cao Các triệu chứng trên có thể kéo dài trong nhiều ngày Một số chủng shigella: Shigella dysenteriae, shigella flexneri, shigella sonnei, shigella boydii 1.4.2.4. Nhóm Vibrio a, Đặc điểm hình thái Là phẩy khuẩn, Gram âm, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6µm. Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004). Là vi khuẩn gram âm, sống kỵ khí tùy nghi, có phản ứng catalase và oxidase dương tính, lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H2S và vi khuẩn không phát triển trên môi trường không muối (NaCl). (Trần Linh Phước, 2008) b, Khả năng gây bệnh Các loài vibrio thường hiện diện trong nước biển do chúng cần ion Na+ để phát triển. Nhóm vibrio là tác nhân gây ra bệnh tả, được lan truyền rất nhanh qua đường nước, gây nhiễm thực phẩm, và truyền nhiễm qua con người khi điều kiện vệ 21
  32. Đồ án tốt nghiệp sinh kém. Nguồn thực phẩm có nguy cơ nhiễm và lan truyền dịch tả là nước uống, rau quả Ngoài khả năng gây nhiễm các bệnh về đường ruột, một số chủng của nhóm này còn có khả năng gây nhiễm trùng máu cho người. Một số chủng gây bệnh của nhóm vibrio: V. alginolyticus, V. harveyi, V. parahaemolyticus 1.4.2.5. Nhóm Listeria a, Đặc điểm chung Đại diện của nhóm Listeria là L. monocytogenes, là trực khuẩn gram dương, kỵ khí tùy nghi phát triển ở nhiệt độ 1 – 45oC, không tạo bào tử nhưng có di động. Là vi khuẩn hình que mảnh, chiều ngang khoảng 0,5µm, chiều dài khoảng 1 - 2µm. Cho phản ứng Catalase dương tính Giống Listeria bao gồm 6 loài: L. monocytogens, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayi b, Khả năng gây bệnh Bệnh do nhóm Listeria gây ra ít gặp ở người tuy nhiên các triệu chứng của bệnh rất nguy hiểm và gây tỉ lệ tử vong cao. Việc tiêu thụ các thực phẩm nhiễm khuẩn là nguyên nhân gây ra bệnh viêm dạ dày – ruột với triệu chứng sốt. L. monocytogenes là nguyên nhân gây chết đặc biệt là ở trẻ em dưới 1 tuổi, phụ nữ mang thai, những người nhận mô cấy ghép và những bệnh nhân có hệ miễn dịch kém. Sự nhiễm trùng là một dạng bệnh khác do Listeria gây ra tác động đến các bệnh nhân mang bệnh về miễn dịch. Ngoài ra nhóm này cũng là nguyên nhân gây ra các bệnh như viêm màng kết, bệnh về hạch bạch huyết Phần lớn người bị nhiễm bệnh đều có các dấu hiệu lâm sàng nhẹ, và triệu chứng không rõ ràng. 22
  33. Đồ án tốt nghiệp 1.4.3. Nhóm vi khuẩn gây bệnh trên da 1.4.3.1. Staphylococcus a, Đặc điểm chung của staphylococcus Là vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính từ 0,5 – 1,5 µm, có thể đứng riêng lẻ, từng đôi hoặc từng chùm. Vi khuẩn không di động và không sinh bào tử thường cư trú trên da và màng nhày của người và động vật máu nóng (Koch, 1878; Pasteur, 1880) Là những vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có cả sự trao đổi chất, hô hấp và lên men. Chúng cho phản ứng catalase dương tính và có thể sử dụng nhiều loại carbohydrate khác nhau tạo acid lactic nhưng không sinh hơi. Staphylococcus có thể mọc ở nhiều điều kiện và môi trường khác nhau, nhưng tốt nhất ở nhiệt độ từ 30 – 37oC và pH gần trung tính. Chúng kháng được với các chất diệt trùng, độ khô nóng và có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 1,5% NaCl (Scott E Martin và John J Iandolo, 2000). b, Khả năng gây bệnh cho người Các bệnh ngoài da: trên mặt da có những vết xây xát, tụ cầu xuống tổ chức dưới da gây các bệnh mụn nhọt, viêm da, đầu đinh Nhiễm khuẩn huyết do tụ cầu: Thường xảy ra ở những người có sức đề kháng yếu hoặc trẻ em. Trong tự nhiên staphylococcus aureus thường được tìm thấy trên da, mũi, tóc hay móng của các động vật máu nóng. Staphylococcus aureus sản sinh một số loại độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị thủy phân ở 100oC trong 30 phút. Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này thì sau 4 – 6 giờ người bệnh có những triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8 giờ. Các loại thực phẩm như jambon, nước súp thường nhiễm các loài vi sinh vật này. Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trính chế biến. 23
  34. Đồ án tốt nghiệp 1.4.3.2. Streptococcus a, Đặc điểm Là liên cầu khuẩn, có hình cầu hoặc oval kéo dài, thuộc vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhày. Là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi nhưng vẫn có thể phát triển trong điều kiện kỵ khí. Khuẩn lạc có màu hồng đến đỏ đậm khi nuôi cây trong môi trường azide tetrazolium chứa TTC b, Khả năng gây bệnh Mặc dù streptococcus có khả năng gây nhiễm trùng trong cộng đồng và bệnh viện. Nhưng phải đến sau những năm 1970 mới được biết đến như tác nhân gây bệnh nhiễm trùng bệnh viện. Nhóm vi khuẩn này trở thành tác nhân phổ biến đứng thứ hai nhiễm khuẩn đường tiết niệu và nhiễm trùng vết thương. Một số nghiên cứu cho thấy nhóm vi khuẩn này cũng là nguyên nhân của viêm màng trong tim. Nhiễm trùng hô hấp hay hệ thần kinh trung ương cũng như viêm khớp, hạch, viêm xoang cũng có thể do nhóm này gây ra nhưng rất hiếm gặp. 24
  35. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm thu mẫu: Vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng Địa điểm nghiên cứu: Phòng Thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Thời gian nghiên cứu: 2/2015 – 8/2015 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Nguyên liệu nghiên cứu Các loại cây thuốc dân gian bao gồm: Podocarpus sp., Medinilla sp., Elephantopus sp., Eupatorium sp., Polygala sp. 2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị Các chủng vi sinh vật chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp tại Trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh bao gồm: Nhóm vi khuẩn Escherichia coli: E. coli (EC), E. coli O157 : H7 (EC.O157: H7), E. coli 0208 (EC.0208), E. coli – ETEC (Enterotoxigenic). Nhóm vi khuẩn Listeria: L. innocua (LI), L. monocytogenes (LM). Nhóm vi khuẩn Samonella: S. dublin (SD), S. enteritidis (SE), S. typhi (ST), S. typhimurium (STy). Nhóm vi khuẩn Shigella: Shi. boydii (ShB), Shi. flexneri (ShF), Shi. sonnei ShS). Nhóm vi khuẩn Vibrio: V. alginolyticus (VA), V. cholera (VC), V. harveyi (VH), V. parahaemolyticus (VP) Và một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ngoài da khác: Pseudomonas aeruginosa (PA), Staphylococcus aureus (SA), Enterococcus feacalis (EF) 25
  36. Đồ án tốt nghiệp 2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.3.1. Thiết bị và dụng cụ Tủ sấy, bình hút ẩm Đĩa petri, que trang, đèn cồn, dây cấy vòng Máy say mẫu Máy lọc, giấy lọc Bình tam giác, cốc thủy tinh Máy lắc Máy nước cất (Branstead USA) Máy đo quang phổ Tủ ấm 30oC, 37oC (Memmert mermany) Máy ly tâm (Tuttligen Germany) Micropipette loại 100 – 1000 휇l, đầu tipe Cân phân tích (Orbital Germany) Đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn Ống eppendorf, parafirm Nồi hấp autoclave (Huxky Đài Loan) Bông không thấm, dây cấy vòng 2.3.2. Hóa chất Cồn, nước cất, muối NaCl Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ). Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ). Thuốc thử Fehling A, Fehling B, Ninhydrin, Gelatin 1%, NaOH 10%, Ferric chloride 10%, thuốc thử Hager, Wagner, chì acetate 10%, thuốc thử Molisch, Barfoed, Dragendroff, Benzene, bột Magnesium. 26
  37. Đồ án tốt nghiệp 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp tách chiết cao nước của cây thuốc Khái niệm: Chiết xuất là tách các chất hòa tan trong dược liệu nhưng vẫn giữ đủ thành phần và bản chất của của các hợp chất có trong cây. Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan với nhau. Phương pháp chiết bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và kĩ thuật chiết, mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi. Phương pháp tiến hành: Mẫu cây thuốc tươi được rửa sạch để loại bỏ bụi bẩn, sau đó đem phơi khô rồi nghiền thành dạng bột. Bột cây thuốc sẽ được ngâm để trích ly các hợp chất có trong mẫu cây, tiến hành ngâm trong 24 giờ rồi đem lọc, quá trình lặp lại từ 3 – 5 lần cho đến khi dịch lọc trong thì thôi. Tiến hành cô quay dịch lọc ở nhiệt độ thấp hơn 50oC. Cao chiết thu được sẽ bảo quản lạnh ở - 4oC (Atta và Mouneir, 2004) 2.4.2. Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật chỉ thị 2.4.2.1. Phương pháp tăng sinh Mục đích: Hoạt hoá các vi khuẩn có sẵn trong mẫu phát triển lại bình thường vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không chỉ cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường. Phương pháp tiến hành: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường TSB. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013). 27
  38. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.2. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật Nguyên tắc: Các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 5oC) để bảo quản. Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tuỳ từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển một lần. Đối với giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật chỉ thị: Cấy chuyển định kỳ 1 tháng/lần trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 4oC (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.7.3. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Mục đích: o Các giống vi sinh vật rất dễ bị thoái hóa, nhầm lẫn hay bị mất hoạt tính. Vì vậy việc bảo quản giữ giống vi sinh vật là rất quan trọng trong thí nghiệm cũng như sản xuất. o Làm cho các giống vi sinh vật có tỉ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền ổn định và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật khác. Phương pháp bảo quản lạnh sâu (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). o Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt độ thích hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log. o Pha dịch tế bào với glycerol 40% đã thanh trùng trước để đạt nồng độ cuối cùng 10% và mật độ tế bào 106. o Dịch huyền phù tế bào được đưa vào eppendoff và đóng. 28
  39. Đồ án tốt nghiệp o Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào. o Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định. Và được tiến hành giữ giống ở - 15oC 2.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của thực vật Nguyên tắc: Mẫu thử được nhỏ vào các giếng thạch đã cấy vi sinh vật kiểm định. Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào môi trường agar và tác động lên vi sinh vật chỉ, khi đó nó sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật chỉ thị tạo thành vòng vô khuẩn. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết dựa trên phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của (Murray và ctv, 1995; Olurinola, 1996) Phương pháp được thực hiện trên môi trường TSA, vi khuẩn sau khi được trang đều trên mặt đĩa, khi đó sẽ tiến hành đục lỗ với đường kính d = 6 mm. Chuẩn bị các các loại dịch chiết khác nhau với nồng độ thích hợp. Hút 100 µl các loại dịch chiết khác nhau vào trong từng giếng thạch, sau đó để yên ở nhiệt độ phòng khoảng 2 giờ. Tất cả các đĩa petri sau đó sẽ được đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 – 24 giờ rồi đọc kết quả bằng cách đo vòng kháng khuẩn thu được. 2.4.4. Phương pháp xử lí số liệu Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey. 2.5. Bố trí thí nghiệm 29
  40. Đồ án tốt nghiệp Vi sinh vật chỉ thị Mẫu cây thuốc Tăng sinh Xử lí mẫu Đo OD (600nm) Cao chiết nước Pha loãng thành 106 cfu/ml Khảo sát hoạt tính Định tính thành Cấy trang kháng khuẩn phần hóa học Đọc kết quả Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm 2.5.1. Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của các loại cây thuốc 2.5.1.1. Quy trình xử lí mẫu và đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của một số cây thuốc dân gian 30
  41. Đồ án tốt nghiệp Mẫu cây Các mẫu cây thuốc xay thuốc mịn Rửa sạch Ngâm trong 4 giờ (tỉ lệ 1 : 20; w/v) Phơi khô Lọc tinh Xay mẫu thành bột mịn Cô cách thủy 70oC Cân, xác định khối lượng ban đầu Bảo quản Cao nước o lạnh ở 4 C Hình 2.2. Sơ đồ chung đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của một số cây thuốc dân gian 2.5.1.2. Thuyết minh quy trình Các mẫu cây thuốc sau khi được thu mua sẽ được rửa sạch bằng nước máy, sau đó đem đi phơi phô tự nhiên ở nơi có bóng mát, tránh cường độ ánh sáng quá mạnh. Mẫu cây sau khi phơi khô đến khối lượng không đổi sẽ được đem đi xay thành bột, Cân và xác định khối lượng bột thu được. Để xác định được hiệu suất thu hồi cao nước của mỗi loại cây thuốc, ta tiến hành cân một lượng mẫu bột cây thuốc nhất định, sau đó đem mẫu đi ngâm với nước cất ở tỉ lệ mẫu: nước là 1/20 (w/v) trong vòng 4 giờ rồi tiến hành lọc mẫu. Dịch lọc thu được sẽ được đem đi đun cách thủy ở 70oC cho đến khi cô cạn, còn bã cây thuốc sau khi lọc sẽ tiếp tục được ngâm với nước cất, quá trình trên được tiến hành cho đến khi dịch lọc trong thì ngừng. Mẫu cao nước thu được sẽ được bảo quản lạnh ở 4oC để tiến hành các thử nghiệm liên quan. Mỗi nghiệm thức được tiến hành lăp lại 3 lần. 31
  42. Đồ án tốt nghiệp ′− Hiệu suất thu hồi cao: H (%) = x100 mo Trong đó o m’: Khối lượng cốc và cao thu được (g) o m: Khối lượng cốc ban đầu (g) o mo: Khối lượng bột mẫu ban đầu (g) 2.5.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc 2.5.2.1. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Vi sinh vật chỉ thị Hút 100휇l vào đĩa petri chứa TSA/TSA + NaCl 1,5% Pha cao Tăng sinh trong Cấy trang bằng TSB/TSB +NaCl DMSO 1% 1,5% Lắc, 18 – 24 giờ Đục lỗ (d= 6 mm) Dịch cao ở nhiệt độ phòng [100] mg/ml Đo OD (600nm) ủ 37oC/24 giờ 6 Pha loãng đến 10 Đọc kết quả cfu/ml Hình 2.3. Sơ đồ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc dân gian 32
  43. Đồ án tốt nghiệp 2.5.2.2. Thuyết minh quy trình Tiến hành tăng sinh cho 20 chủng vi sinh vật chỉ thị thuộc các nhóm vi khuẩn như Escherichia coli spp., Salmonella spp., Shigella spp., Listeria spp., Staphylococcus spp., Enterococcus spp., và môi trường tăng sinh TSB có bổ sung 1,5 % muối cho các chủng Vibrio spp. rồi đem đi hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau đó tiến hành tăng sinh bằng cách sử dụng que cấy vòng lấy sinh khối của vi khuẩn cấy vào môi trường TSB và đem lắc 120 vòng/phút, trong 18 – 24 giờ. Lưu ý là tiến hành tăng sinh trong tủ cây vô trùng. Vi khuẩn sau khi tăng sinh được đem đi đo OD ở bước sóng 600 nm, sau đó dựa vào công thức McFahrland để pha loãng thành nồng độ 106 CFU/ml bằng nước muối. Sử dụng micropipette hút 100 µl dịch vi khuẩn sau khi đã pha loãng cho vào đĩa petri có chứa môi trường TSA hay môi trường TSA có bổ sung 1,5% NaCl đối với các chủng Vibrio spp., thực hiện trang đĩa để vi khuẩn được trải đều trên mặt đĩa sau đó để yên 15 phút để cho đĩa khô hoàn toàn. Tiến hành pha cao các mẫu cây thuốc ở nồng độ 100 mg/ml bằng DMSO 1%. Đĩa thạch sau khi khô được đem đi đục lỗ với đường kính mỗi lỗ là 6 mm. Hút 100 µl dịch cao của mỗi cây thuốc rồi nhỏ vào các giếng thạch và để yên trong 2 giờ, sau đó các đĩa được đem đi ủ ở 37oC trong 24 giờ và đọc kết quả. Đối chứng được sử dụng là kháng sinh Ciprofloxacin pha theo dãy nồng độ ở cấp số 2 từ nồng độ 1000 µg/ml đến 8 µg/ml, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 2.5.3. Thí nghiệm 3: Định tính thành phần hóa học của cao chiết nƣớc một số loại cây thuốc dân gian 2.5.3.1. Quy trình định tính thành phần hóa học cao chiết nước của một số cây thuốc 33
  44. Đồ án tốt nghiệp Cao chiết nước Pha loãng bằng Pha loãng bằng dung H2SO4 10% dịch DMSO 1% Lọc Lọc Định tính alkaloid Định tính carbohydrate, flavonoid, tanins, anthraquinon glycosides, amino acid, saponin, phenolic, steroids Hình 2.4. Định tính sơ bộ thành phần hóa học cao chiết nước của các loại cây thuốc 2.5.3.2. Thuyết minh quy trình Mẫu cao nước các loại cây thuốc được tiến hành thử nghiệm định tính thành phần hóa học theo hai phần. Đối với các chỉ tiêu alkaloid, mẫu cao nước được ngâm trong H2SO4 10% trong khoảng thời gian từ 30 – 60 phút sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc. Thu phần dịch để tiến hành thử nghiệm. Riêng đối với các thử nghiệm còn lại thì lại tiến hành ngâm mẫu cao trong dung dịch DMSO 1%, sau đó tiến hành lọc, thu dịch và tiến hành làm các thử nghiệm còn lại. a, Thử nghiệm carbohydrate Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, thêm vào từ 5 – 6 giọt thuốc thử Molisch. Sau đó nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 trên thành ống nghiệm. Kết quả dương tính nếu hình thành phức hợp màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách hai chất lỏng. Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm. Cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml thuốc thử Fehling B vào ống nghiệm chứa sẵn dịch 34
  45. Đồ án tốt nghiệp mẫu cây thuốc. Đun cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả. Kết tủa dương tính nếu có kết tủa màu đỏ của CuO ở dưới đáy ống nghiệm Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Barfoed. Sau đó đun cách thủy hỗn hợp trên trong 5 phút , làm lạnh nhanh và quan sát kết quả. Kết quả dương tính nếu xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch. b, Thử nghiệm alkaloid Thử nghiệm Mayer: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, cho vào vài giọt thuốc thử Mayer và quan sát kết quả. Kết tủa dương tính nếu kết tủa màu đục được tạo thành. Thử nghiệm Dragendorff: Hút 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và quan sát kết quả. Nếu dương tính sẽ hình Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Hager và quan sát. Kết quả dương tính nếu hình thành kết tủa màu vàng Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Wagner và quan sát. Kết quả dương tính nếu hình thành kết tủa màu nâu đỏ. c, Thử nghiệm saponin Thử nghiệm Foam: Hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm, lắc mạnh rồi quan sát. Nếu trong ống nghiệm hình thành một lớp bọt ổn định thì cho kết quả dương tính. d, Thử nghiệm anthraquinon glycosides Thử nghiệm Bontrager: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml H2SO4 loãng và đun sôi, tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc. Rồi thêm 3 ml benzene, lắc đều rồi để yên sẽ thấy dung dịch trong ống nghiệm tách làm 2 lớp. Tiếp tục thêm 2 ml ammonia và quan sát màu trong lớp ammonia. Kết quả dương tính nếu lớp ammonia xuất hiện màu đỏ 35
  46. Đồ án tốt nghiệp e, Thử nghiệm flavonoid Thử nghiệm alkaline: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, rồi cho vào vài giọt NaOH 10 %, thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện với mẫu đối chứng là mẫu cây thuốc và nước cất để so sánh. Sau đó thêm HCl loãng nếu mất màu thì chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid. Thử nghiệm Shinoda: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, cho ít bột Magnesium và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm, bổ sung thêm 5 ml cồn 95%, rồi quan sát kết quả. Nếu dương tính thì dung dịch có cam, hồng hoặc đỏ tím Thử nghiệm Ferric Chloride: Lấy 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Ferric Chloride 10%. Dung dịch cho kết quả dương tính nếu xuất hiện màu xanh hoặc tím. f, Thử nghiệm phenolic Thử nghiệm Lead acetate: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 1,5 ml chì acetate 10%. Kết quả dương tính nếu xuất hiện kết tủa trắng. Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt gelatin 1%. Kết quả dương tính nếu xuất hiện kết tủa trắng trong ống nghiệm. g, Thử nghiệm tannin Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2ml NaCl 10%. Cho vào 4 giọt Ferric chloride 10%. Kết quả dương tính nếu dung dịch xuất hiện màu xanh. Thử nghiệm Lead acetate: Hút 2 ml dịch chiết mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml NaCl 10%, rồi thêm 4 giọt chì acetate. Kết quả dương tính nếu dung dịch xuất hiện kết tủa màu vàng h, Thử nghiệm steroid Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc vào. Lắc mạnh rồi để yên cho dung dịch tách thành 2 lớp. Quan sát kết quả ở mặt phân cách hai chất lỏng. Nếu xuất 36
  47. Đồ án tốt nghiệp hiện màu đỏ ở lớp dưới thì là steroid, còn nếu là màu vàng ở lớp dưới là triterpenoid. Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml acetic anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh. Tiếp đó nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm và quan sát hiện tượng. Nếu xuất hiện vòng màu đỏ ở mặt phân cách thì là steroid, còn nếu hình thành vòng màu nâu đỏ đậm là triterpenoid i, Thử nghiệm amino acid Thử nghiệm Ninhydrin: Hút 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin, đun sôi cách thủy trong 5 phút rồi quan sát hiện tượng. Kết quả là dương tính nếu xuất hiện màu tím. 37
  48. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao nƣớc của một số loại cây thuốc dân gian Các mẫu cây thuốc được tiến hành xử lí cao nước trong 4 giờ và sau đó tiến hành đánh giá hiệu suất thu hồi cao. 30.0 c (%) i 25.0 b ồ b 20.0 a th thu 15.0 a ấ 10.0 u su u ệ 5.0 Hi (% 0.0 Cây thuốc Hình 3.1. Hiệu suất thu hồi cao nước của một số loại cây thuốc dân gian Hình 3.2. Màu sắc dịch lọc cao nước cây Elephantopus sp. qua các lần ngâm mẫu Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao được thể hiện trong Hình 3.1. Dựa vào Hình 3.1 chúng tôi nhận thấy rằng đối với các loại cây khác nhau thì dung môi nước có ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết cao khác nhau. Trong 5 mẫu cây khảo 38
  49. Đồ án tốt nghiệp sát thì hiệu suất thu hồi cao nước của cây Eupatorium sp. là cho kết quả cao nhất với 25,5 % và cao hơn một cách có ý nghĩa so với các mẫu cây còn lại (P < 0,05). Kế đến là hiệu suất thu hồi cao của cây Medinilla sp., Polygala sp., Elephantopus sp., và cuối cùng là cây Podocarpus sp. cho kết quả thu hồi cao nước thấp nhất với 11,6 %. Khi tiến hành so sánh hiệu suất thu hồi của từng mẫu cây với nhau, chúng tôi thấy rằng hiệu suất thu hồi của cây Podocarpus sp. và cây Elephantopus sp. không có sự sai khác về mặt thống kê với nhau nhưng lại khác biệt có ý nghĩa so với các cây còn lại. Tương tự đối với hiệu suất thu hồi cao nước của cây Medinilla sp. và cây Polygala sp. cũng không có sự khác biệt về mặt thống kê với nhau với giá trị lần lượt là 20,2 % và 20,6 % nhưng lại khác biệt có ý nghĩa thống kê với 3 mẫu còn lại. Sở dĩ kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của các mẫu cây thuốc có sự khác biệt như vậy có thể là do mức độ hòa tan của các hợp chất có trong mẫu cây thuốc đối với dung môi nước là khác nhau 3.1.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc một số loại cây thuốc dân gian 3.1.1.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc cây Podocarpus sp. 39
  50. Đồ án tốt nghiệp 40.0 35.0 b 30.0 25.0 20.0 b 15.0 b a b a Podocarpus 10.0 a a Ciprofloxacin 5.0 0.0 Đƣờng kính kháng vòng (mm) ST ShS VH SA Vi sinh vật Hình 3.3. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết nước cây Podocarpus sp. (Ciprofloxacin đối với các chủng Vibrio spp. thì sử dụng nồng độ là 8 µg/ml, còn đối với các chủng còn lại thì sử dụng nồng độ là 500 µg/ml; nồng độ cao nước là 200 mg/ml) Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước từ cây Podocarpus sp. được trình bày trong Hình 3.3. Dựa vào kết quả này chúng tôi nhận thấy rằng phổ kháng khuẩn của cao chiết nước từ cây Podocarpus sp. khá hẹp. Chúng chỉ ức chế được 4/20 chủng vi sinh vật chỉ thị bao gồm các chủng như S. typhii, Shi. sonnei, V. harveyi, S. aureus. Đồng thời, hoạt tính kháng khuẩn của mẫu cây thuốc thể hiện thông qua đường kính vòng kháng khuẩn cũng khá thấp (từ 7,7 mm đến 13,5 mm). Khi so sánh kết quả kháng khuẩn của mẫu cây thuốc với kháng sinh Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml và 8 µg/ml (đối với nhóm vi khuẩn Virio spp.) thì cao chiết nước của cây Podocarpus sp. thể hiện hoạt tính kháng khuẩn thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). 40
  51. Đồ án tốt nghiệp Kết quả này chứng tỏ rằng đối với cây Podocarpus sp. thì sự hòa tan các hợp chất hữu cơ có trong cây với dung môi nước là khá yếu và kết quả này phù hợp với kết quả thu được trong Hình 3.1 (với hiệu suất thu hồi của mẫu cây là 12,0 %). 3.1.1.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc cây Polygala sp. 20.0 b 18.0 b 16.0 b 14.0 b b a a 12.0 a a 10.0 a a a 8.0 6.0 Polygala 4.0 Đƣờng kính kháng vòng (mm) 2.0 Ciprofloxacin 0.0 EC VA VC VH PA EF Vi sinh vật Hình 3.4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Polygala sp. (Ciprofloxacin đối với các chủng Vibrio spp. thì sử dụng nồng độ là 8 µg/ml, còn đối với các chủng còn lại thì sử dụng nồng độ là 500 µg/ml; nồng độ cao nước là 200 mg/ml) Sau khi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của mẫu cao chiết nước của cây Polygala sp. thì kết quả được thể hiện trong Hình 3.4 Dựa theo kết quả trên Hình 3.4 cho thấy mẫu cao nước Polygala sp. ở nồng độ 200 mg/ml có phổ kháng khuẩn hẹp, chỉ kháng được 6/20 chủng vi sinh vật chỉ thị. Hoạt tính kháng khuẩn tương đối yếu do vòng đường kính vòng kháng khuẩn là từ 41
  52. Đồ án tốt nghiệp 8,0 mm đến 11,5 mm. Điều này chứng tỏ khả năng kháng khuẩn của mẫu cây đối với các chủng vi sinh vật khảo sát là chưa cao. Mẫu cao nước Polygala sp. kháng được các chủng gây bệnh trên da và gây bệnh đường ruột. Trong đó có chủng Enterococcus feacalis có đường kính vòng kháng cao nhất với 11,5 mm và cho kết quả kháng thấp nhất đối với chủng V. harveyi với đường kính vòng kháng là 8,0 mm. Dựa vào kết quả đã xử lí thống kê trên Hình 3.4 cho thấy rằng khả năng kháng khuẩn của cao nước Polygala sp. đối với mỗi chủng vi sinh vật gây bệnh là khác nhau và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05). Theo đó khi so sánh với kháng sinh Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml và 8 µg/ml (đối với các chủng Vibrio spp.) cũng cho thấy rằng đường kính vòng kháng khuẩn của mẫu cây còn rất nhỏ và hầu hết là thấp hơn một cách có ý nghĩa về mặt thống kê so với vòng kháng của mẫu đối chứng. Tuy vậy vẫn có trường hợp khả năng kháng khuẩn của mẫu cây và kháng sinh Ciprofloxacin được cho là không có sự sai khác với nhau về mặt thống kê. Cụ thể ở đây là trường hợp của chủng E. feacalis, đường kính vòng kháng trung bình của cả mẫu cây và đối chứng được xem là tương đương về mặt thống kê với số liệu lần lượt là 11,5 mm và 12,0 mm. Điểm đáng chú ý ở đây là khi tiến hành đối chiếu kết quả thu được với kết quả nghiên cứu của (Uthiraselvam và ctv, 2012) về hoạt tính kháng khuẩn đối với các chủng như E. coli, Pseudomonas aeruginosa và E. feacalis thì kết quả cho thấy mẫu Polygala sp. có đường kính vòng kháng khuẩn tốt hơn hẳn với đường kính vòng kháng lần lượt là 8,2 mm; 9,3 mm và 11,5 mm, trong khi đường kính vòng kháng của mẫu cây Polygala javana lần lượt chỉ là 7,0 mm; 7,0 mm và 9,0 mm. Kết quả này chứng tỏ rằng sự hòa tan của các hợp chất có trong mẫu cao nước của cây Polygala sp. tuy nhiều (hiệu suất thu hồi cao nước là 20,5 %) nhưng với dung môi nước thì chỉ lôi kéo được phần lớn các hợp chất không có hoạt tính sinh học như carbohydrate và amino acid. Trong khi đó phần lớn các thành phần hóa học có hoạt tính sinh học lại không hòa tan được trong nước. Do đó, việc sử dụng nước 42
  53. Đồ án tốt nghiệp để tách chiết các hợp chất từ cây Polygala sp.sẽ không thu được tất cả các thành phần hóa học có hoạt tính sinh học cao. 3.1.1.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc cây Medinilla sp. 40.0 35.0 b 30.0 25.0 20.0 b a a Medinilla 15.0 b b b a a aa b b ab a a a a a 10.0 a a Ciprofloxacin 5.0 Đƣờng kính kháng vòng (mm) 0.0 Vi sinh vật Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Medinilla sp. (Ciprofloxacin sử dụng nồng độ là 500 µg/ml; nồng độ cao nước là 100 mg/ml) Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi của mẫu cao nước Medinilla sp. đối với một số chủng vi sinh vật chỉ thị được thể hiện trong Hình 3.5 Theo Hình 3.5 mẫu cao chiết nước Medinilla sp. kháng được 12/20 chủng vi sinh vật chỉ thị. Trong đó kháng mạnh nhất là đối với chủng shigella flexneri với đường kính vòng kháng là 13,3 mm, sau đó vòng kháng giảm dần và cuối cùng cho kết quả kháng yếu nhất là đối với chủng Shi. sonnei với đường kính vòng kháng là 7.5 mm Mẫu cao chiết nước kháng được cả những chủng gây bệnh đường ruột và gây bệnh trên da. Trong đó kháng chủ yếu vẫn là các chủng gây bệnh tiêu chảy thuộc 43
  54. Đồ án tốt nghiệp các nhóm như Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp. và Listeria spp. Ngoài ra còn kháng các chủng vi sinh vật khác như P. aeruginosa, S.aureus, và E. feacalis. Mặc dù đường kính vòng kháng còn chưa cao nhưng nhìn chung phổ kháng của mẫu cao chiết nước Medinilla sp. là khá rộng. Điều này chứng tỏ mẫu cây Medinilla sp. cho khả năng kháng khuẩn khá tốt. Dựa theo kết quả xử lí thống kê được thể hiện trên Hình 3.5 cho thấy rằng mức độ kháng khuẩn của mẫu cao nước Medinilla sp. đối với các chủng vi sinh vật chỉ thị so với mẫu đối chứng Ciprofloxacin là khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với (P < 0,05). Ngoài ra dựa vào Hình 3.5 cũng cho thấy rằng khả năng kháng của cao nước và mẫu kháng sinh đối với một số chủng vi sinh vật là tương đương nhau về mặt thống kê, như đối với trường hợp của chủng S. dublin, S. typhi, và Shi. flexneri. Đặc biệt đối với chủng Shi. boydii thì đường kính vòng kháng của mẫu cao nước đối với chủng này là 11,3 mm trong khi mẫu đối chứng Ciprofloxacin lại không có khả năng kháng được chủng này. Nhìn chung đối với mẫu cao nước Medinilla sp. cho kết quả hoạt tính kháng khuẩn khá tốt. Mặc dù mới khảo sát ở nồng độ là 100 mg/ml nhưng kết quả thu được là rất khả quan với 12 chủng trên cho 20 chủng khảo sát và sự sai khác giữa những lần lặp lại của các nghiệm thức là khá nhỏ và số liệu được chấp nhận về mặt thống kê. Kết quả này là phù hợp với kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước trong Hình 3.1 (hiệu suất thu hồi cao nước của cây Medinilla sp. là 20,2 %). Mặc dù phổ kháng của mẫu cao nước là khá rộng song kết quả thu được khi đo vòng kháng khuẩn là khá yếu. Sở dĩ có sự khác biệt này là do dung môi nước hòa tan được nhiều hợp chất có trong mẫu cây thuốc nhưng hàm lượng của các thành phần hóa học có hoạt tính sinh học trong mẫu cây còn ít dẫn đến kết quả là vòng kháng khuẩn thu được yếu. 44
  55. Đồ án tốt nghiệp 3.1.1.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc cây Eupatorium sp. 20.00 b 18.00 16.00 b a 14.00 b b b 12.00 a a a 10.00 8.00 a 6.00 4.00 Eupatorium Đƣờngkính vòngkháng (mm) 2.00 Ciprofloxacin 0.00 Vi sinh vật LM ShF VH PA EF Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Eupatorium sp. (Ciprofloxacin đối với các chủng Vibrio spp. thì sử dụng nồng độ là 8 µg/ml, còn đối với các chủng còn lại thì sử dụng nồng độ là 500 µg/ml; nồng độ cao nước là 100 mg/ml) Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của mẫu cây Eupatorium sp. được thể hiện trong Hình 3.6 Dựa vào kết quả được biểu hiện trên Hình 3.6 cho thấy rằng mẫu cao chiết nước Eupatorium sp. kháng được 5 trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị. Nhìn chung thì mẫu cao chiết nước kháng được một vài chủng vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy như Listeria monocytogens, Shigella flexneri, Vibrio harveyi. Ngoài ra còn kháng được các chủng gây bệnh ngoài da như Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus feacalis. Mặc dù phổ kháng của mẫu cao chiết nước còn hẹp, nhưng xét một cách tổng quát thì khả năng kháng khuẩn của mẫu cây thuốc đối với các chủng vi sinh là rất tích cực tại nồng độ là 100 mg/ml. Và nhìn chung là mẫu Eupatorium sp. có thể 45
  56. Đồ án tốt nghiệp kháng rải rác ở cả 2 nhóm vi khuẩn gây bệnh trên da và đường ruột. Với kết quả trên sẽ là cơ sở quan trọng để tiếp tục làm thêm thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của mẫu cao nước Eupatorium sp. ở các chủng vi sinh vật khác. Theo như kết quả trên Hình 3.6 thì cho thấy cao nước Eupatorium sp. cho khả năng kháng tốt nhất đối với chủng V. harveyi với đường kính vòng kháng là 12,8 mm, sau đó đường kính vòng kháng giảm dần với các chủng lần lượt là E. feacalis, P. aeruginosa, Shi. flexneri và cuối cùng là cho kết quả kháng yếu nhất là chủng Lis. monocytogenes với đường kính vòng kháng khuẩn là 7,0 mm Dựa theo kết quả xử lí số liệu được thể hiện trên Hình 3.6 cho biết rằng khả năng kháng khuẩn của mẫu cao nước Eupatorium sp. so với kháng sinh Ciprofloxacin là sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05). Và cụ thể ở đây là hoạt tính kháng khuẩn của mẫu cao nước yếu hơn nhiều so với hoạt tính kháng khuẩn của mẫu đối chứng Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml và 8 µg/ml (đối với các chủng Vibrio spp.) Kết quả này cho thấy rằng đối với mẫu cây Eupatorium sp. thì sự hòa tan của các hợp chất tuy nhiều (Hiệu suất thu hồi cao là 25,46 %) nhưng khả năng hòa tan của các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn như alkaloid và tannin trong dung môi nước là rất yếu. Khi đó việc sử dụng dung môi nước sẽ không thể tách chiết được các hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học cao. 3.1.1.5. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc cây Elephantopus sp. 46
  57. Đồ án tốt nghiệp 14 b 13.5 13 12.5 a 12 ShF Đƣờng kính kháng vòng (mm) 11.5 Elephantopus sp. Ciprofloxacin Mẫu thử nghiệm Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước cây Elephantopus sp. (Ciprofloxacin sử dụng nồng độ là 500 µg/ml; nồng độ cao nước là 100 mg/ml) Kết quả kháng khuẩn cao nước của mẫu câu Elephantopus sp. được trình bày trong Hình 3.7 Theo kết quả trên Hình 3.7 ta thấy rằng với nồng độ 100 mg/ml mẫu cao nước Elephantopus sp. chỉ kháng được 1/20 chủng vi sinh vật khảo sát đó là chủng Shi. flexneri với đường kính vòng kháng là 12,2 mm Dựa theo kết quả xử lí thống kê được thể hiện trên Hình 3.7 ta thấy rằng khi so sánh hoạt tính kháng khuẩn của cao nước cây Elephantopus sp. so với mẫu kháng sinh Ciprofloxacin tại nồng độ là 500 µg/ml thì cho kết quả thấp hơn một cách có ý nghĩa về mặt thống kê. Cụ thể ở đây là đường kính vòng kháng khuẩn của mẫu kháng sinh là 13,2 mm và đường kính vòng kháng khuẩn của mẫu cao nước là 12,2 mm. Mặc dù mẫu cao nước chỉ kháng được một chủng vi sinh vật nhưng đây sẽ là cơ sở để có thể tiếp tục đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trên nhiều chủng khác nữa. 47
  58. Đồ án tốt nghiệp Và kết quả này phù hợp với kết quả hiệu thu hồi ở Hình 3.1 (hiệu suất thu hồi là 15,2 %). Điều này chứng tỏ rằng đối với mẫu cây Elephantous sp. thì hàm lượng thành phần hóa học có trong mẫu là rất ít và khi sử dụng dung môi nước để tách chiết các hợp chất sinh học có trong mẫu cây thì kết quả thu được sẽ không khả quan. Bảng 3.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao nước các loại cây thuốc đối với một số chủng vi sinh vật chỉ thị sp. sp. sp. sp. sp. Chủng VSV sp. mg/ml 00]mg/ml 2 [ [100]mg/ml [100]mg/ml Polygala Polygala [200] mg/ml [100] Medinilla Podocarpus Eupatorium Elephantopus E.coli O157:H7 - - 13,2 ± 0,3 - - E.coli 0208 - - 12,3 ± 0,3 - - E.coli 7,8 ± 0,3 8,2 ± 0,3 13,2 ± 0,3 - - Lis.monocytogenes - - - 7,0 ± 0,5 - Lis. innocua - - 8,7 ± 0,3 - - S.dublin - - 10,8 ± 0,8 - - S.typhii - - 12,0 ± 0,5 - - Shi.boydii - - 11,3 ± 0,3 - - Shi.flexneri - 13,3 ± 0,6 9,5 ± 0,5 12,2 ± 0,3 Shi.sonnei - - 7,5 ± 0,9 - - V.alginolyticus 9,3 ± 0,3 9,2 ± 0,3 - - - V.cholerae 13,5 ± 0,5 9,5 ± 0,9 - - - V.harveyi 7,7 ± 0,6 8,0 - 12,8 ± 0,3 - P. aeruginosa - 9,3 ± 1,0 9,2 ± 0,8 10,0 - 48
  59. Đồ án tốt nghiệp S.aureus - - 11,0 - - E.feacalis - 11,5 ± 1,5 10,8 ± 0,3 10,8 ± 0,3 - (A2 ) (A1) (B1) (B2) (C1) (C2) (D1) (D2) Hình 3.8. Kết quả kháng khuẩn cao nước của cây Medinilla sp. đối với chủng SD (A1) và ShB (A2), cây Polygala sp. đối với VH (B1) và EC (B2), cây Eupatorium sp. đối với chủng VH (C1) và LM (C2), cây Podocarpus sp. với chủng ST (D1) và cạy Elephantopus sp. đối với chủng ShF (D2). 49
  60. Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao nước trên Bảng 3.1 cho thấy rằng khả năng kháng khuẩn của mỗi loại cao nước là khác nhau. Trong đó mẫu cây Podocarpus sp. và Elephantopus sp. cho kết quả kháng yếu nhất với mẫu Podocarpus sp. thì kháng được 4 chủng vi sinh vật chỉ thị ở nồng độ là 200 mg/ml và mẫu Elephantopus sp. thì chỉ kháng được 1 chủng vi sinh vật ở nồng độ 100 mg/ml. Trong khi đó với nồng độ khảo sát là 100 mg/ml thì các mẫu cây khác cho khả năng kháng khuẩn tốt hơn như mẫu cây Eupatorium sp. kháng được 6/20 chủng vi sinh vật khảo sát. Và cho kết quả kháng tốt nhất là mẫu cây Medinilla sp, với phổ kháng khá rộng là 12/20 chủng vi khuẩn khảo sát. Dựa vào kết quả ở Bảng 3.1 cũng cho thấy rằng các mẫu cao nước chủ yếu kháng các chủng vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy. Cụ thể như đối với chủng Shi. flexneri thì cả ba mẫu cây Medinilla sp., Eupatorium sp., Elephantopus sp. đều cho kết quả kháng với vòng kháng khuẩn lần lượt là 13,3 mm, 9,5 mm, 12,2 mm. Kết hợp với kết quả thu hồi hiệu suất cao nước của các mẫu cây thuốc trong Hình 3.1 cho thấy kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên là phù hợp với kết quả thu được Nhìn chung với dung môi nước thì khả năng kháng khuẩn của các mẫu cây thuốc đối với các chủng vi sinh vật gây bệnh còn khá yếu. Nguyên nhân có thể là do các hợp chất kháng khuẩn có trong các mẫu cây hòa tan kém trong dung môi nước. Và hàm lượng thành phần hóa học có hoạt tính sinh học trong các mẫu cây còn khá thấp. 3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học cao chiết nƣớc của một số loại cây thuốc Bảng 3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học cao chiết nước của một số loại cây thuốc 50
  61. Đồ án tốt nghiệp anthra Thí nghiệm carbohydrate alkaloid saponin quinone ff r o d Cây thuốc Molisch Fehling Barfoe Mayer Dragend Hager Wagner test Foam Bontrager Medinilla + + + - - - - + - Polygala + - + + + + + + - Elephantopus + + + - - - - + - Eupatorium + - + - - - - + - Podocarpus + + + - - - - + - phenolic Thí nghiệm flavonoid compoun tannin steroid Aa d e Cây thuốc acetate ydrin Alkaline Shinoda clorid Ferric acetate Lead Gelatin cloride Ferric Lead Salkowski Libermann Ninh Triterpe Triterpe + - + + + + + - Medinilla noid noid Polygala + + + + - + + Triterpe Triterpe - 51
  62. Đồ án tốt nghiệp noid noid Elephantopus + - + + - + + Sterol Sterol - Triterpe Triterpe + - + + - + + - Eupatorium noid noid Podocarpus - - + + + + + Sterol Sterol - Dựa vào kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy đối với mỗi loại cao nước khác nhau sẽ cho kết quả định tính thành phần hóa học không giống nhau, ngoài ra chúng còn khác nhau trong từng thử nghiệm. Cụ thể ở đây là đối với thử nghiệm carbohydrate thì đối với mẫu cao nước Medinilla sp., Elephantopus sp., Podocarpus sp. thì cho kết quả dương tính với tất cả các thử nghiệm trong khi các mẫu cao nước khác như Polygala sp., Eupatorium sp., lại cho kết quả dương tính với thử nghiệm Molisch và Barfoed nhưng lại cho kết quả âm tính với thử nghiệm Fehling. Hoặc nếu xét ở thử nghiệm alkaloid thì chỉ có cây Polygala sp. là cho kết quả dương tính với các thử nghiệm như Wagner, Hager, Mayer, Dragendorff trong khi tất cả các mẫu cao nước còn lại đều cho kết quả âm tính hết. Sở dĩ có sự khác biệt như vậy là do đối với mỗi hợp chất có trong mỗi loại cây thuốc có độ hòa tan trong dung môi nước khác nhau và đối với mỗi thử nghiệm sẽ dùng để kiểm tra một loại thành phần khác nhau. Do đó mà có thể trong cùng một thử nghiệm mà khi dùng thuốc thử này thì cho kết quả âm tính nhưng khi sử dụng loại thuốc thử khác thì lại cho kết quả dương tính. Cụ thể như đối với trường hợp của thử nghiệm carbohydrate của cây Polygala sp., đối với thử này chúng tôi sử dụng ba loại thuốc thử là Molisch, Fehling và Barfoed. Kết quả của mẫu cây cho thấy rằng đối với thử nghiệm Molisch và Barfoed thì mẫu cây cho kết quả dương tính trong khi thử nghiệm Fehling lại cho kết quả âm tính. Nguyên nhân là do đối với thử nghiệm Molisch thì cho kết quả dương tính với tất cả các loại carbohydrate, còn Barfoed thì cho kết quả dương tính với các loại đường không khử như 52
  63. Đồ án tốt nghiệp saccarose và thử nghiệm Fehling thì dùng để thử nghiệm sự có mặt của đường khử như glucose, fructose Đối với mẫu cây Polygala sp. cho kết quả dương tính với thử nghiệm sapoin và cho kết quả là Triterpenoid trong thử nghiệm Steroid. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của (K’ Eogh, 1935). Đặc biệt khi so sánh kết quả này với nghiên cứu của (Uthiraselvam và ctv, 2012) cũng cho kết quả tương tự với thử tất cả các thử nghiệm. Dựa theo kết quả trên Bảng 3.1 cho thấy đối với cây Eupatorium sp. ta nhận được kết quả dương tính với thử nghiệm saponin, cardiac glycoside, tannin, flavonoid và steroid. Đây là những hợp chất có khả năng kháng khuẩn đối với các vi sinh vật, và kết quả này phù hợp với nghiên cứu của (Okeke và ctv, 2001; Ralman và ctv, 2010). Tuy nhiên với kết quả âm tính của thử nghiệm alkaloid thì lại khác biệt đối với kết quả nghiên cứu của (Okeke và ctv, 2001; Ralman và ctv, 2010), sự khác nhau này có thể giải thích là do sự khác biệt về phương pháp tiến hành, hay do tác động của môi trường nuôi cấy mẫu cây thuốc làm ảnh hưởng đến thành phần hóa học có trong cây. Theo nghiên cứu của (Wang và ctv, 2007) đã công bố kết quả tìm được các hợp chất acid caffeic, acid 3,5-dicaffeoylquinic, 1,4-acid dicaffeoylquinic và 3,4- dihydroxy-cinnamic acid methyl ester đều thuộc nhóm phenolic. Còn đối với thử nghiệm hợp chất steroid nghiên cứu của (Liang và ctv, 2012) công bố tìm được các hợp chất betulinic acid thuộc nhóm triterpenoid và hợp chất stigmasterol thuộc nhóm sterol. Khi đối chiếu kết quả này với kết quả định tính thành phần hóa học thu được từ mẫu cây Elephantopus sp. là trùng khớp 53
  64. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Khi đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của năm mẫu cây thuốc thu tại vườn quốc gia Bioup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng cho thấy rằng hiệu suất thu hồi cao nước của các mẫu cây thuốc là khác nhau. Trong đó cho kết quả hiệu suất thu hồi cao nước tốt nhất là mẫu cây Eupatorium sp. với 25,5 % rồi đến các mẫu cây như Medinilla sp., Polygala sp., Elephantopus sp. và cuối cùng cho kết quả thấp nhất là mẫu cây Podocarpus sp. với hiệu suất thu hồi là 12,0 %. Với kết quả thu được khi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của năm mẫu cao nước đối với một số nhóm vi sinh vật chỉ thị cho thấy rằng kết quả kháng khuẩn rất khác nhau đối với mỗi cao nước. Cụ thể là đối với mẫu cây Podocarpus sp. kháng được 4/20 chủng vi sinh vật chỉ thị với đường kính vòng kháng từ 7,7 mm đến 13,5 mm. Mẫu cây Polygala sp. kháng được 6/20 chủng vi sinh vật chỉ thị với đường kính vòng kháng là từ 8,0 mm đến 11,5 mm. Mẫu cây Medinilla sp. kháng được 12/20 chủng vi sinh vật chỉ thị với nồng độ kháng là 100 mg/ml, mẫu cây Eupatorium sp. kháng được 5/20 chủng vi sinh vật chỉ thị và cuối cùng là mẫu cây Elephantopus sp. chỉ kháng được 1/20 chủng vi sinh vật chỉ thị ở nồng độ kháng là 100 mg/ml. Kết quả định tính thành phần hóa học cao nước của các mẫu cây thuốc cho thấy sự khác nhau về thành phần hóa học của các mẫu cây. Cụ thể ở đây là đối với thử nghiệm carbohydrate, saponin, flavonoid, phenolic và tannin đều cho kết quả dương tính với các thử nghiệm. Với thử nghiệm alkaloid thì chỉ có cây Polygala sp. là cho kết quả dương tính. Trong khi đó, năm mẫu cao nước đều cho kết quả âm tính với thử nghiệm anthraquinone và thử nghiệm amino acid. Đối với thử nghiệm Steroid thì mẫu cây Medinilla sp., Polygala sp., Eupatorium sp. đều cho kết quả là triterpenoid, còn mẫu Elephantopus sp., và Podocarpus sp. cho kết quả là sterol. 4.2. Đề nghị Khảo sát thêm hoạt tính kháng khuẩn của một số cây thuốc dân gian tại vườn quốc gia Bioup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng 54
  65. Đồ án tốt nghiệp Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên nhiều chủng vi sinh vật gây bệnh khác Tiến hành khảo sát các mẫu cây thuốc trên nhiều loại dung môi khác nhau Định lượng một số thành phần hóa học có trong các mẫu cây thuốc. 55
  66. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Ngô Văn Thu. 2011. Bài giảng dược liệu, tập I. Trường đại học Dược Hà Nội Phạm Thanh Kỳ và ctv. 1998. Bài giảng dược liệu, tập II. Trường đại học Dược Hà Nội Đỗ Tất Lợi. 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học Viện dược liệu. 2004. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I, Nhà xuất bản khoa hoc kỹ thuật. Viện Dược liệu. 2004. Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam, tập II, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật. Phạm Minh Nhựt. 2013. Thực hành vi sinh đại cương. Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp. Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật. Lê Ngọc Thuỳ Trang. 2013. Phân lập và khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum. Khoá luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Công Nghệ Tp HCM. Trần Linh Thước. 2010. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, tái bản lần thứ sáu. Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam. 56
  67. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU TIẾNG ANH Radulovíc 2013. Antimicrobial Plant Metabolites: Structural Diversity and Mechanism of Action. Current Medicinal Chemistry, 20, 932-952. Aljos F., 1998. World Checklist and Bibliography of Conifers. Royal Botanic Gardens, Richmond, UK Laubenfels D., David J., 1985. A taxonomic revision of the genus Podocarpus. Blumea 30 : 51- 278. Lüdtke R., 2013. The genus Polygala L. in Southern Brazil. Hoehnea 40(1), 1-50. Renner S. S., 2004. Multiple Miocene Melastomataceae dispersal between Madagascar, Africa and India. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 359(1450): 1485-1494 Chen Cheih., 1984. Melastomataceae. In: Chen Cheih, ed., Fl. Reipubl. Popularis Sin. 53(1): 135–293. King R. M., Robinson H., 1987. The genera of Eupatorieae. Monographs in Systematic Botany, Missouri Botanical Garden 22: 1-581. Okeke MI., Iroegbu CU., Eze EN., Okali AS., Esimone., CO., 2001. Evaluation of extracts of the root of Landolphia owerrience for antibacterial activity. Ethnopharmacol J., 78: 119-127. Rahman MA., Ahsna T., Islam S., 2010. Antibacterial and antifungal properties of methanol extract from the stem of Argyreia argentea. Bang J. Pharmacol., 5: 41-44. Abdillahi HS., 2011. Anti-inflammatory, antioxidant, anti-tyrosinase and phenolic contents of four Podocarpus species used in traditional medicine in South Africa. Journal of Ethnopharmacology 136(3), 496-503. Jemmi T., Stephan R., 2006. Listeria monocytogenes: food-borne pathogen and hygiene indicator. Science Magazine Vol (25):571-580. 57
  68. Đồ án tốt nghiệp Cavalcanti T. B., 2008. A New Species of Polygala from Brazil. Novon 18 (1), 90-93 Consolacion Y., Ragasa., Agnes B., Alimboyoguen., and Chien-Chang Shen Antimicrobial Terpenoids from Elephantopus mollis. NRCP Research Journal, 2009, 10(1):33-38 Tomoko N., Takashi A., Hiromu T., Yuka I., Hiroko M., Munekazu I., Totshiyuki T., Tetsuro I., Fujio A., Iriya I., and Tsutomu N., Kazuhito W. Antibacterial activity of extracts prepared from tropical and subtropical plants on methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Health Sci (2002). 48, 273–276. Fakras, G. L. and Kiraly, Z. Relation between phenol metabolism and stem rust resistance in wheat. Phytopathology, (1962) 52;651 – 664. Uthiraselvam M., et al. Screening Of Phytochemical And Antibacterial Activity Of Polygala javana Plant Leaf, Stem And Root Extract Against Human Pathogen. International Journal of PharmTech Research CODEN (USA): IJPRIF ISSN : 0974-4304 Vol.4, No.4, pp 1792-1796. 58
  69. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CAO CHIẾT NƢỚC CỦA MỘT SỐ LOẠI CÂY THUỐC A.1.1. Kết quả khảo sát hoạt tínhh kháng khuẩn của cao chiết nƣớc cây Podocarpus sp. đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị. Podocarpus sp. (Cao nƣớc) STT Chủng [200] mg/ml lần 1 lần 2 lần 3 1 Escherichia coli O157:H7 - - - 2 Escherichia coli 0208 - - - 3 Escherichia coli (K) - - - 4 Enterotoxigenic E.coli-ETEC - - 5 Listeria innocua - - - 6 Listeria monocytogenes - - 7 Salmonella dublin - - - 8 Salmonella enteritidis - - - 9 Salmonella typhi (K) 8 8 7.5 10 Salmonella typhimurium - - - 11 Shigella boydii - - - 12 Shigella flexneri - - - 13 Shigella sonnei 9.5 9 9.5 14 Vibrio alginolyticus - - - 15 Vibrio cholerae - - - 16 Vibrio harveyi 13 14 13.5 17 Vibrio parahaemolyticus - - - 18 Pseudomonas (K) - - - 19 Staphylococcus aureus 8 8 7 20 Enterococcus feacalis - - - 1
  70. Đồ án tốt nghiệp A.2. Kết quả khảo sát hoạt tínhh kháng khuẩn của cao chiết nƣớc cây Polygala sp. đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị. Polygala sp. (cao nƣớc) [100] mg/ml [200] mg/ml STT Chủng lần 1 lần 2 lần 3 lần 1 lần 2 lần 3 1 E. coli O157:H7 - - - - - - 2 Escherichia coli 0208 - - - - - - 3 Escherichia coli (K) 8.5 8 8 8 8.5 8 4 E.coli-ETEC - - - - - - 5 Listeria innocua - - - - - - 6 Listeria monocytogenes - - - - - - 7 Salmonella dublin - - - - - - 8 Salmonella enteritidis - - - - - - 9 Salmonella typhi (K) - - - - - - 10 Salmonella typhimurium - - - - - - 11 Shigella boydii - - - - - - 12 Shigella flexneri - - - - - - 13 Shigella sonnei - - - - - - 14 Vibrio alginolyticus - - - 9 5 9.5 15 Vibrio cholerae - - - 10 10 8.5 16 Vibrio harveyi 8 8.5 8 8 8 8 17 Vibrio parahaemolyticus - - - - - - 18 Pseudomonas (K) - - - 9 10.5 8.5 19 Staphylococcus aureus - - - - - - 20 Enterococcus feacalis 11 10 10.5 13 10 11.5 A.3. Kết quả khảo sát hoạt tínhh kháng khuẩn của cao chiết nƣớc cây Medinilla sp. đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị STT Chủng Medinilla sp. (Cao nƣớc) 2
  71. Đồ án tốt nghiệp [100] mg/ml lần 1 lần 2 lần 3 1 Escherichia coli O157:H7 10 10 10 2 Escherichia coli 0208 10.5 11 10 3 Escherichia coli (K) 10.5 11 11.5 4 Enterotoxigenic E.coli-ETEC - - - 5 Listeria innocua 8.5 9 8.5 6 Listeria monocytogenes - - - 7 Salmonella dublin 11 10 11.5 8 Salmonella enteritidis - - - 9 Salmonella typhi (K) 12 11.5 12.5 10 Salmonella typhimurium - - - 11 Shigella boydii 11.5 11 11.5 12 Shigella flexneri 13 14 13 13 Shigella sonnei 8 8 6.5 14 Vibrio alginolyticus - - - 15 Vibrio cholerae - - - 16 Vibrio harveyi - - - 17 Vibrio parahaemolyticus - - - 18 Pseudomonas (K) 10 9 8.5 19 Staphylococcus aureus 11 11 11 20 Enterococcus feacalis 10.5 11 11 A.4. Kết quả khảo sát hoạt tínhh kháng khuẩn của cao chiết nƣớc cây Eupatorium sp. đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị STT Chủng Eupatorium sp. (Cao nƣớc) 3
  72. Đồ án tốt nghiệp [100] mg/ml lần 1 lần 2 lần 3 1 Escherichia coli O157:H7 - - - 2 Escherichia coli 0208 - - - 3 Escherichia coli (K) - - - 4 Enterotoxigenic E.coli-ETEC - - 5 Listeria innocua - - - 6 Listeria monocytogenes 7.0 7.5 6.5 7 Salmonella dublin - - - 8 Salmonella enteritidis - - - 9 Salmonella typhi (K) - - - 10 Salmonella typhimurium - - - 11 Shigella boydii - - - 12 Shigella flexneri 9.5 9.0 10.0 13 Shigella sonnei - - - 14 Vibrio alginolyticus - - - 15 Vibrio cholerae - - - 16 Vibrio harveyi 13 13 12.5 17 Vibrio parahaemolyticus - - - 18 Pseudomonas (K) 10 10 10 19 Staphylococcus aureus - - - 20 Enterococcus feacalis 11 11 10.5 A.5. Kết quả khảo sát hoạt tínhh kháng khuẩn của cao chiết nƣớc cây Elephantopus sp. đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị Elephantopus sp. (Cao nƣớc) STT Chủng [100] mg/ml lần 1 lần 2 lần 3 1 Escherichia coli O157:H7 - - - 4
  73. Đồ án tốt nghiệp 2 Escherichia coli 0208 - - - 3 Escherichia coli (K) - - - 4 Enterotoxigenic E.coli-ETEC - - 5 Listeria innocua - - - 6 Listeria monocytogenes - - 7 Salmonella dublin - - - 8 Salmonella enteritidis - - - 9 Salmonella typhi (K) - - - 10 Salmonella typhimurium - - - 11 Shigella boydii - - - 12 Shigella flexneri 12 12 12.5 13 Shigella sonnei - - - 14 Vibrio alginolyticus - - - 15 Vibrio cholerae - - - 16 Vibrio harveyi - - - 17 Vibrio parahaemolyticus - - - 18 Pseudomonas (K) - - - 19 Staphylococcus aureus - - - 20 Enterococcus feacalis - - - A.6. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh Ciprofloxacin đối với các nhóm vi sinh vật chỉ thị Ciprofloxacin [100] mg/ml [500] mg/ml STT Chủng lần 1 lần 2 lần 3 lần 1 lần 2 lần 3 Escherichia coli 0 0 0 13 13 13.5 1 O157:H7 Escherichia coli 0 0 0 12.5 12 12.5 2 0208 0 0 0 13 13 13.5 3 Escherichia coli 5
  74. Đồ án tốt nghiệp (K) Enterotoxigenic 0 0 0 30.5 31 31.5 4 E.coli-ETEC 0 0 0 11.5 12 12.5 5 Listeria innocua Listeria 0 0 0 12 12 12.5 6 monocytogenes Salmonella 0 0 0 12 11.5 13 7 dublin Salmonella 0 0 0 13.5 13 12.5 8 enteritidis Salmonella typhi 0 0 0 13 12 12.5 9 (K) Salmonella 0 0 0 11 11 11 10 typhimurium 0 0 0 0 0 0 11 Shigella boydii 0 0 0 13 13 13.5 12 Shigella flexneri 15 14.5 15.5 33.5 33 32.5 13 Shigella sonnei Vibrio 16.5 16 16 34 34.5 34 14 alginolyticus 13 13 14 22.5 22.5 22 15 Vibrio cholerae 17.5 18 18.5 32.5 33 33.5 16 Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticu 11.5 11.5 11 28 28 28.5 17 s Pseudomonas 0 0 0 12.5 11.5 12.5 18 (K) Staphylococcus 0 0 0 12 12 12.5 19 aureus Enterococcus 0 0 0 12 11.5 12.5 20 feacalis 6
  75. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH KHÁNG KHUẨN CAO CHIẾT NƢỚC CỦA MỘT SỐ MẪU CÂY THUỐC B.1. Hình ảnh kháng khuẩn cao chiết nƣớc mẫu cây Polygala sp. đối với một số chủng vi sinh vật gây bệnh B.2. Hình ảnh kháng khuẩn cao chiết nƣớc mẫu cây Eupatorium sp. đối với một số chủng vi sinh vật gây bệnh 7
  76. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ XỬ LÍ SỐ LIỆU BẰNG PHẦN MÊM STATGRAPHIC C.1. Kết quả sử lí thống kê đối với mẫu cao nƣớc Medinilla sp. đối với một số chủng vi sinh vật chỉ thị. Bảng One way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 7.04167 1 7.04167 42.25 0.0029 Within groups 0.666667 4 0.166667 Total (Corr.) 7.70833 5 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD Col_5 Count Mean Homogeneous Groups E.coli(K) 3 11.0 X Cipro-E.coli 3 13.1667 X Bảng One way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 16.6667 1 16.6667 100.00 0.0006 Within groups 0.666667 4 0.166667 Total (Corr.) 17.3333 5 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD B.Col_1 Count Mean Homogeneous Groups Lis.inno 3 8.66667 X Cipro-inno 3 12.0 X 8
  77. Đồ án tốt nghiệp Bảng One way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2.66667 1 2.66667 4.57 0.0993 Within groups 2.33333 4 0.583333 Total (Corr.) 5.0 5 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD C.Col_1 Count Mean Homogeneous Groups S.dublin 3 10.8333 X Cipro-dub 3 12.1667 X Bảng One way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.375 1 0.375 1.50 0.2879 Within groups 1.0 4 0.25 Total (Corr.) 1.375 5 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD C.Col_3 Count Mean Homogeneous Groups S.typhi 3 12.0 X Cipro-typhi 3 12.5 X Bảng One way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 5.04167 1 5.04167 30.25 0.0053 Within groups 0.666667 4 0.166667 Total (Corr.) 5.70833 5 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD A.Col_3 Count Mean Homogeneous Groups 0208 3 10.5 X Cipro-0208 3 12.3333 X Bảng One way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 15.0417 1 15.0417 361.00 0.0000 Within groups 0.166667 4 0.0416667 Total (Corr.) 15.2083 5 9
  78. Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for A.Col_2 by A.Col_1 Method: 95.0 percent Tukey HSD A.Col_1 Count Mean Homogeneous Groups 0157:H7 3 10.0 X Cipro-H7 3 13.1667 X Bảng One way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 192.667 1 192.667 4624.00 0.0000 Within groups 0.166667 4 0.0416667 Total (Corr.) 192.833 5 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD D.Col_1 Count Mean Homogeneous Groups Cipro-boy 3 0.0 X Shi.boy 3 11.3333 X Bảng One way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0416667 1 0.0416667 0.20 0.6779 Within groups 0.833333 4 0.208333 Total (Corr.) 0.875 5 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD D.Col_3 Count Mean Homogeneous Groups Cipro-flex 3 13.1667 X Shi.flex 3 13.3333 X Bảng One way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 975.375 1 975.375 1950.75 0.0000 Within groups 2.0 4 0.5 Total (Corr.) 977.375 5 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD D.Col_5 Count Mean Homogeneous Groups Shi.sonnei 3 7.5 X Cipro-son 3 33.0 X Bảng One way ANOVA 10
  79. Đồ án tốt nghiệp Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 13.5 1 13.5 29.45 0.0056 Within groups 1.83333 4 0.458333 Total (Corr.) 15.3333 5 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD E.Col_1 Count Mean Homogeneous Groups Pseu 3 9.16667 X Cipro-pseu 3 12.1667 X Bảng One way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2.04167 1 2.04167 49.00 0.0022 Within groups 0.166667 4 0.0416667 Total (Corr.) 2.20833 5 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD E.Col_3 Count Mean Homogeneous Groups S.aureus 3 11.0 X Cipro-aure 3 12.1667 X Bảng One way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2.04167 1 2.04167 12.25 0.0249 Within groups 0.666667 4 0.166667 Total (Corr.) 2.70833 5 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD E.Col_5 Count Mean Homogeneous Groups E.feacalis 3 10.8333 X Cipro-fea 3 12.0 X B.2. Kết quả xử lí thống kê của với mẫu Podocarpus sp. đối với một số chủng vi sinh vật chỉ thị Bảng One – Way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 10.6667 1 10.6667 64.00 0.0013 Within groups 0.666667 4 0.166667 Total (Corr.) 11.3333 5 11
  80. Đồ án tốt nghiệp Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD B.Col_1 Count Mean Homogeneous Groups S.typhi(K) 3 9.83333 X Ciprofloxacin 3 12.5 X Bảng One way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 704.167 1 704.167 4225.00 0.0000 Within groups 0.666667 4 0.166667 Total (Corr.) 704.833 5 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD B.Col_1 Count Mean Homogeneous Groups Shi.sonnei 3 11.3333 X Ciprofloxacin 3 33.0 X Bảng One way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 459.375 1 459.375 1837.50 0.0000 Within groups 1.0 4 0.25 Total (Corr.) 460.375 5 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD C.Col_1 Count Mean Homogeneous Groups V.harveyi 3 15.5 X Ciprofloxacin 3 33.0 X Bảng One way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 9.375 1 9.375 45.00 0.0026 Within groups 0.833333 4 0.208333 Total (Corr.) 10.2083 5 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD D.Col_1 Count Mean Homogeneous Groups S.aureus 3 9.66667 X Ciprofloxacin 3 12.1667 X 12
  81. Đồ án tốt nghiệp B.3. Kết quả xử lí thống kê hiệu suất thu hồi cao nƣớc của một số mẫu cao nƣớc cây thuốc Bảng One way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 326.492 4 81.6229 56.73 0.0000 Within groups 14.3868 10 1.43868 Total (Corr.) 340.878 14 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD Col_1 Count Mean Homogeneous Groups podocarpus 3 11.99 X elephantopus 3 15.1533 X medinilla 3 20.1833 X polygala 3 20.5267 X eupatorium 3 25.46 X 13
  82. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D: CÁC THUỐC THỬ DÙNG TRONG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC D.1. Thử nghiệm carbohydrate Thuốc thử Molisch: Hòa tan 5g α- napthol vào ethanol 95% và pha loãng thành 100 ml Thuốc thử Fehling: o Fehling A: Hòa tan 34,6g CuSO4.5H2O vào 500 ml nước cất. o Fehling B: Hòa tan 125g KOH và 173g KaliNatritartrate.7H2O vào 500 ml nước cất Thuốc thử Barfoed: Thêm 10 ml acid acetic glacial vào 1000 ml nước cất. Cân 66,5g copper (II) acetate monohydrate, đổ hỗn hợp trên vào và đem đi đun, khuấy cho đến khi tan hoàn toàn. D.2. Thử nghiệm alkaloid Thuốc thử Mayer : Hòa tan 1,358g HgCl2 trong 60 ml nước, sau đó đổ vào trong dung dịch này 5g KI được pha trong 10 ml nước. Định mức hỗn hợp lên 100 ml Thuốc thử Dragendorff: Gồm 2 dung dịch o Dung dịch A: Hòa tan 0,5g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml acid acetic 20% o Dung dịch B: Dung dịch KI 40% pha trong nước cất o Khi sử dụng thì trộn 20 ml dung dịch A với 5 ml dung dịch B và 70ml nước Thuốc thử Hager: Hòa tan 1g acid picric vào 100 ml nước cất Thuốc thử Wagner: Hòa tan 2g Iodine và 6g KI vào 100 ml nước cất. D.3. Thử nghiệm cardiac glycosides 14
  83. Đồ án tốt nghiệp Thuốc thử Na nitro prusside: 1g Na nitroferricyanide và bổ sung 10 ml nước cất. 15