›

Đồ án Khảo sát đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình

pdf 62 trang thiennha21 13/04/2022 5980
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_dot_bien_gen_ret_tren_ca_lam_sang_u_sac_bao_t.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN RET TRÊN CA LÂM SÀNG U SẮC BÀO TUYẾN THƯỢNG THẬN MANG TÍNH GIA ĐÌNH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS.BS Đỗ Đức Minh Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Mỹ Hiền MSSV: 1515100017 Lớp: 15HSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan nội dung trình bày trong đồ án tốt nghiệp với đề tài “Khảo sát đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình” là thành quả nghiên cứu trên cơ sở số liệu thực tế và được thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp của giáo viên hướng dẫn. Mọi tham khảo trong đồ án này đều được trích dẫn rõ ràng nguồn gốc. Mọi sao chép vi phạm quy chế của nhà trường em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tp.Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 07 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Mỹ Hiền
  3. LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp.HCM đã tận tình giảng dạy và truyền đạt những kiến thức, lòng nhiệt huyết cũng như niềm đam mê nghiên cứu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Em xin gửi lời cảm ơn đến TS.BS. Đỗ Đức Minh, người thầy, người anh đã tận tình hướng dẫn em các thông tin về lâm sàng, về kiến thức sinh học phân tử trong suốt thời gian làm đồ án. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các anh chị ở Trung tâm Y sinh học phân tử - Đại học Y Dược Tp. HCM đã luôn quan tâm, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận này. Thời gian học hỏi và làm việc trong môi trường thân thiện, luôn nhận được sự giúp đỡ cũng như góp ý nhiệt tình của anh chị ở Trung tâm là khoảng thời gian quý báu, mang lại cho em thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm trong quá trình làm việc. Và trên hết, con xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới gia đình. Cảm ơn cha, mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng con khôn lớn, luôn bên cạnh động viên, ủng hộ, dõi theo bước đường con đi. Tp.Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 07 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Mỹ Hiền
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. U sắc bào tuyến thượng thận 2 1.1.1. Giới thiệu 2 1.1.2. Nguyên nhân 3 1.1.3. Biểu hiện 4 1.1.4. Xét nghiệm chẩn đoán 4 1.1.5. Điều trị 4 1.2. Bất thường di truyền 5 1.3. Các bệnh và hội chứng liên quan 8 1.3.1. Hội chứng NF1 8 1.3.2. Hội chứng VHL 8 1.3.3. Hội chứng MEN 9 1.4. Cấu trúc, đột biến, chức năng của gen RET 10 1.5. Các phương pháp giải trình tự 13 1.5.1. Phương pháp hóa học 13 1.5.2. Phương pháp enzyme 13 1.5.3. Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer) 14 1.5.4. Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới-454 Pyrosequencing 15 1.6. Cơ sở dữ liệu và phần mềm phân tích trình tự nucleotide 16 1.6.1. Cơ sở dữ liệu 16 1.6.2. Phần mềm phân tích trình tự nucleotide 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 2.1. Thiết kế nghiên cứu 17 2.2. Đối tượng nghiên cứu 17 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 2.3. Vật liệu 19 2.3.1. Dụng cụ và thiết bị 19 2.3.2. Hóa chất 20 2.4. Sơ đồ quy trình thực hiện 23 2.5. Thuyết minh quy trình 24 2.5.1. Quy trình tách chiết DNA 24 2.5.1.1. Nguyên tắc: 24 2.5.1.2. Các bước thực hiện: 24 2.5.2. Quy trình PCR gen RET 25 2.5.2.1. Nguyên tắc: 25 2.5.2.2. Các bước thực hiện: 27 2.5.3. Điện di sản phẩm PCR 27 2.5.3.1. Nguyên tắc: 27 2.5.3.2. Các bước thực hiện: 29 2.5.4. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR 30 2.5.4.1. Nguyên tắc: 30 2.5.4.2. Các bước thực hiện: 30 2.5.5. Quy trình cycle sequencing 31 2.5.5.1. Mục đích: 31 2.5.5.2. Các bước thực hiện: 31 2.5.6. Quy trình tủa sản phẩm cycle 32 2.5.6.1. Nguyên tắc: 32 2.5.6.2. Các bước thực hiện: 32 2.5.7. Giải trình tự bằng máy ABI 3500 33 2.5.7.1. Nguyên tắc: 33 2.5.7.2. Đọc trình tự chuỗi DNA: 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 3.1. Kết quả, bàn luận tách chiết 35 3.2. Kết quả, bàn luận PCR với cặp mồi đặc hiệu 35 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 3.3. Kết quả, bàn luận tinh sạch sản phẩm PCR 37 3.4. Phản ứng cycle sequencing và đọc kết quả giải trình tự 38 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận 44 4.2. Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Aa Amino acid Bp Base pair CATE Catecholamines CT Computed tomography DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide triphosphate ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate GDNF Glial cell line Derived Neurotrophic Factor GFLs Family Ligands MEN2 Đa u tuyến nội tiết loại 2 MRI Chụp cộng hưởng từ (Magnetic resonance imaging) NCBI National Center For Biotechnology Information NF1 Neurofibromatosis loại 1 PCCs Pheochromocytomas PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi gen invitro) PGLs Paragangliomas PPGLs Pheochromocytomas và Paragangliomas RNA Ribonucleic acid SNP Điểm đa hình nucleotide đơn (Single Nucleotide Polymorphisms) VHL Hội chứng Von Hippel-Lindau iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Trình tự mồi xuôi và mồi ngược dùng cho phản ứng PCR 21 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR 27 Bảng 2.3: Các thông số điêṇ di DNA bằ ng gel agarose 28 Bảng 2.4: Thành phần trong một phản ứng cycle sequencing 32 Bảng 2.5: Thành phần hỗn hợp tủa DNA 33 Bảng 3.1: Kết quả đo nồng độ nucleic acid trong mẫu 35 Bảng 4.1: Kết quả giải trình tự phát hiện SNP tại exon 11, 13 [1] 44 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Mô tả cách tiếp cận xét nghiệm gen theo hướng dẫn của Hội Nội tiết 5 Hình 1.2: Bé trai 4 tuổi có biểu hiện điểm hạt cà phê và tàn nhang 8 Hình 1.3: Vị trí gen RET trên nhiễm sắc thể số 10 10 Hình 1.4: Cơ chế phân tử của đột biến gen RET 12 Hình 1.5: Hình kí xạ tự ghi kết quả giải trình tự DNA trên gel polyacrylamide 14 Hình 1.6: Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tự dùng bản gel polyarylamide 15 Hình 2.1: Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân 18 Hình 2.2: Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase 26 Hình 2.3: Các chu kỳ của PCR 26 Hình 2.4: Mô tả quá trình tinh sạch sản phẩm PCR 30 Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm các exon 10, 11,13, 14 - 15,16 36 Hình 3.2: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 11) với trình tự chuẩn 39 Hình 3.3: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 13) với trình tự chuẩn 39 Hình 3.4: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 11) với trình tự chuẩn 40 Hình 3.5: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 13) với trình tự chuẩn 40 Hình 3.6: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 11) với trình tự chuẩn 41 Hình 3.7: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 13) với trình tự chuẩn 41 Hình 3.8: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 11) với trình tự chuẩn 42 Hình 3.9: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 13) với trình tự chuẩn 42 Hình 3.10: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 11) với trình tự chuẩn 43 Hình 3.11: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 13) với trình tự chuẩn 43 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU U sắc bào tuyến thượng thận (PPGLs) là bệnh nội tiết hiếm tại Việt Nam. Tìm hiểu về căn bệnh này giúp chúng ta có những biện pháp phòng ngừa, giảm nguy cơ mắc bệnh cũng như kịp thời thăm khám nếu gặp các triệu chứng bất thường. Paragangliomas (PGLs) là khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh nằm ở các hạch thần kinh giao cảm hoặc phó giao cảm khắp cơ thể, khi khối u nằm ở tủy thượng thận thì gọi là pheochromocytomas (PCCs), với các triệu chứng lâm sàng là đánh trống ngực, nhức đầu và ra nhiều mồ hôi, kèm theo tăng huyết áp, tiết các chất catecholamines (CATE) [9]. Theo dõi lâm sàng là điều cần thiết để chẩn đoán và điều trị PPGLs, hầu hết các khối u tiết CATE nếu không được điều trị thì tỷ lệ tử vong do tim mạch cũng như di căn sang các mô, cơ quan lân cận rất cao. Việc xác định bất thường di truyền là quan trọng vì ít nhất 1/3 bệnh nhân bị PPGLs có đột biến dòng mầm gây bệnh ở 1 trong số 14 gen gây bệnh gồm: NF1, RET, VHL, SDHD, SDHC, SDHB, EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2, IDH1, TMEM127, SDHA, MAX và HIF2A [5,9,11]. Theo hướng dẫn thực hành của Hội Nội tiết lâm sàng, bệnh nhân PPGLs cần được thăm khám và kiểm tra di truyền cho người thân để sàng lọc di truyền gây bệnh. Xuất phát từ thực tiễn trên nhóm tiến hành đề tài “Khảo sát đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình” bằng cách sử dụng phương pháp mô tả hàng loạt ca, với mục tiêu cụ thể: - Giải trình tự 6 exon gen RET (exon 10,11,13,14,15,16) - Phân tích kết quả giải trình tự gen dựa trên dữ liệu ngân hàng gen National Center For Biotechnology Information (NCBI) Đồ án tốt nghiệp gồm có 4 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Đối tượng – Vật liệu – Phương pháp Chương 3: Kết quả – Bàn luận Chương 4: Kết luận – Kiến nghị 1
  11. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
  12. Đồ án tốt nghiệp 1.1. U sắc bào tuyến thượng thận 1.1.1. Giới thiệu Paragangliomas (PGLs) là khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh nằm ở các hạch thần kinh giao cảm hoặc phó giao cảm khắp cơ thể, khi khối u nằm ở tủy thượng thận thì gọi là pheochromocytomas (PCCs) và thường tiết các chất catecholamines (CATE): epinephrine, norepinephrine, dopamine. Khoảng 80-85% các khối u là PCCs và 15-20% là PGLs [9]. Tủy thượng thận nằm ở trung tâm của mỗi tuyến thượng thận bao gồm các tế bào thần kinh nội tiết (chromaffin) sản xuất và giải phóng epinephrine (adrenaline) vào máu để đáp ứng với kích hoạt của hệ thống thần kinh giao cảm. Neuroblastoma (u nguyên bào thần kinh) và pheochromocytomas (PCCs) là hai loại u quan trọng nhất phát sinh từ tủy thượng thận. Cả hai loại u này cũng có thể phát sinh từ các vị trí ngoài tuyến thượng thận, cụ thể trong vùng cận hạch của chuỗi giao cảm [17]. U sắc bào tuyến thượng thận bao gồm u lành tính hoặc ác tính của thượng thận. Một trong số đó được chú ý đến do sản xuất thừa hormones nội tiết. Ung thư thượng thận là sự hiện diện của các khối u ác tính ở tuyến thượng thận, bao gồm u nguyên bào thần kinh, ung thư biểu mô vỏ thượng thận (adrenocortical carcinoma) và một số u tế bào ưa crôm thượng thận (PGLs) [1]. Hầu hết u tế bào ưa crôm và tất cả các u tuyến thượng thận là những khối u lành tính, không di căn hoặc xâm lấn các mô lân cận, nhưng có thể gây ra vấn đề sức khỏe đáng kể bởi sự mất cân bằng hormones. Sự phổ biến của PPGLs ở bệnh nhân tăng huyết áp trong phòng khám ngoại trú nói chung dao động từ 0,2 - 0,6%. Ở trẻ em bị tăng huyết áp, sự phổ biến của PPGLs là khoảng 1,7%. Gần 5% bệnh nhân PCCs có khối u thượng thận tình cờ được phát hiện trên hình ảnh giải phẫu. Nghiên cứu khám nghiệm tử thi cho thấy khối u không được chẩn đoán trong 0,05 - 0,1% bệnh nhân [9]. PCCs sản xuất, tích trữ và tiết CATE. Hầu hết PCCs tiết cả epinephrine và norepinephrine và sự tiết này không liên quan đến kích thích thần kinh. Ngoài ra, PCCs còn tiết các hormones khác như adrenocorticotropic hormone, somatostatin, 2
  13. Đồ án tốt nghiệp calcitonin, oxytocin và vasopressin. Nhiều công trình nghiên cứu về PPGLs đã đúc kết quy luật số 10 của bệnh lý này, đó là: 10% xảy ra ở trẻ em, 10% ác tính, 10% ngoài thượng thận và 10% không chức năng [11]. PCCs có ở mọi lứa tuổi, có thể độc lập hoặc liên kết với một hội chứng ung thư di truyền, chẳng hạn như đa u thần kinh nội tiết (Multiple endocrine neoplasma- MEN) loại 2A và 2B, u xơ thần kinh (neurofibromatosis) loại 1 (NF1), hoặc hội chứng Von Hippel-Lindau (VHL). Chỉ có 10% PCCs thượng thận ác tính, phần còn lại là lành tính [21]. Chẩn đoán xác định bằng đo nồng độ của các chất chuyển hóa CATE trong nước tiểu. Hầu hết PCCs được điều trị ban đầu với các thuốc kháng adrenergic, phẫu thuật được sử dụng để loại bỏ khối u khi bệnh nhân ổn định. 1.1.2. Nguyên nhân U sắc bào tuyến thượng thận có thể xuất hiện đơn lẻ (các khối u đặc, một bên và u ở trong vùng thượng thận) hoặc có tính chất gia đình (điển hình cũng ở tủy thượng thận nhưng thường nhiều ổ và ở cả 2 bên), ở hai nghiên cứu lớn, tần suất u tủy thượng thận có tính chất gia đình chiếm khoảng 30% và thường nằm trong bệnh cảnh của hội chứng di truyền trội nhiễm sắc thể thường. Những bất thường di truyền phối hợp với u tủy thượng thận có thể là nguyên nhân do đột biến gen sinh ung thư như RET hoặc gen ức chế u như VHL hoặc NF1. Khuyến cáo sàng lọc di truyền cho những bệnh nhân được chẩn đoán u tủy thượng thận trước 20 tuổi, u thượng thận 2 bên, đa u cận hạch, hay cho những bệnh nhân có tiền sử gia đình có người mắc u tủy thượng thận hay u cận hạch [22]. Vì PCCs xuất phát từ vùng tủy thượng thận, các khối u này giải phóng không liên tục một lượng các CATE có tác dụng sinh học gây ra các triệu chứng co mạch với tăng cả huyết áp tâm thu, tâm trương và tăng nhịp tim. Trong tế bào ưa crôm, norepinephrine và epinephrine được chuyển hóa bởi enzyme O-methyl transferase thành các dẫn xuất O-methyl tương ứng lần lượt là normetanephrine và metanephrine. Vì chuyển hóa CATE trong khối u độc lập với sự tình trạng giải phóng CATE (CATE có thể được giải phóng từng lúc hoặc với tỷ lệ thấp), định lượng các chất chuyển hóa của CATE ở huyết tương và ở nước tiểu có độ nhạy cao 3
  14. Đồ án tốt nghiệp hơn và đóng vai trò căn bản trong chẩn đoán u tủy thượng thận [22]. Ngoài ra, môi trường ô nhiễm, chế độ ăn uống không khoa học, hút thuốc lá, sử dụng rượu bia trong thời gian dài, cũng làm tăng nguy cơ ung thư tuyến thượng thận. 1.1.3. Biểu hiện - Triệu chứng lâm sàng thường có: đánh trống ngực, nhức đầu, ra nhiều mồ hôi, kèm theo tăng huyết áp (lúc này triệu chứng trên sẽ có độ nhạy 91%, độ đặc hiệu 94%). - Tiết nhiều CATE có thể dẫn đến suy tim, phù phổi, loạn nhịp và xuất huyết nội sọ. Tuy nhiên triệu chứng nổi trội nhất vẫn là tăng huyết áp. Tăng tiết CATE làm cho bệnh nhân loạn nhịp tim. Các cơn kịch phát thường kéo dài dưới 1 giờ và có thể bị thúc đẩy bởi phẫu thuật, thay đổi tư thế, tập thể dục, mang thai [22]. 1.1.4. Xét nghiệm chẩn đoán Theo hướng dẫn thực hành của Hội Nội tiết lâm sàng khuyến cáo: - Xét nghiệm sinh hóa ban đầu: đo huyết tương metanephrines tự do hoặc metanephrines phân đoạn niệu, lấy mẫu máu bệnh nhân theo hướng dẫn của tài liệu tham khảo, sử dụng phương pháp sắc ký lỏng: phổ khối lượng hoặc phát hiện điện hóa. Đề nghị những bệnh nhân có kết quả xét nghiệm là dương tính cần được theo dõi mức độ tăng giá trị và biểu hiện lâm sàng [9]. - Hình ảnh học: chụp cắt lớp vi tính (CT), chụp MRI ở bệnh nhân có di căn, sử dụng 123 I-metaiodobenzylguanidine (MIBG) ghi xạ hình, sử dụng 18 F- fluorodeoxyglucose (18 FFDG) chụp cắt lớp phát xạ [9]. - Kiểm tra di truyền: thử nghiệm di truyền tại các phòng thí nghiệm uy tín với những bệnh nhân nghi ngờ đột biến dòng mầm và được tư vấn sau khi có kết quả [9]. 1.1.5. Điều trị - Cắt bỏ hoàn toàn khối u. - Điều chỉnh chế độ ăn uống có nhiều natri và chất lỏng để điều hòa việc tiết CATE gây ra co huyết khối để ngăn chặn hạ huyết áp nghiêm trọng sau khi loại bỏ khối u. 4
  15. Đồ án tốt nghiệp 1.2. Bất thường di truyền Cứ 3 ca PPGLs thì có 1 ca là do nguyên nhân di truyền và chủ yếu là do đột biến dòng mầm tại 1 trong số 14 gen gồm: NF1, RET, VHL, SDHD, SDHC, SDHB, EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2, IDH1, TMEM127, SDHA, MAX và HIF2A [9] Hình 1.1: Mô tả cách tiếp cận xét nghiệm gen theo hướng dẫn của Hội Nội tiết Có thể nghi ngờ 6 bệnh khác nhau về gia đình có biểu hiện lâm sàng: bệnh NF1, MEN2, VHL, ung thư biểu mô tế bào thận với đột biến SDHB [13], khối u car-ney (u tuyến thượng thận, khối u hạch dạ dày, chondroma phổi) và hội chứng Carney- Stratakis (u tuyến tụy và sarcomas dạ dày) [14]. Các hội chứng MEN2 và VHL thường được đặc trưng bởi các dấu hiệu lâm sàng riêng biệt hướng tới việc kiểm tra các gen RET và VHL. Phát hiện đột biến gen NF1 rất phức tạp mặc dù xét nghiệm có sẵn trong các phòng xét nghiệm trực tuyến, việc chẩn đoán xác định hội chứng chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng [12]. Tuy nhiên, một số bệnh nhân có đột biến gen NF1 và một số báo cáo về PPGLs đều có đặc điểm tương đồng [4, 6]. Những phát hiện này cho thấy tầm quan trọng của việc 5
  16. Đồ án tốt nghiệp điều tra về dấu hiệu lâm sàng có thể xảy ra của một đột biến cơ bản ở tất cả các bệnh nhân PPGL. Với bệnh gia đình (di truyền) việc phát hiện nguyên nhân gây bệnh giúp tư vấn di truyền chẩn đoán, điều trị sớm các thành viên khác trong gia đình. *Theo tờ báo của Hiệp hội Mỹ về việc quản lý bệnh Ung thư tuyến giáp dạng tuỷ [16] Nhóm bệnh MEN2A có đến 95% bệnh nhân đột biến gen RET ở codon 609, 611, 618 và 620 ở vị trí exon 10 hoặc codon 630, 634 của exon 11. Hầu như tất cả bệnh nhân có biểu hiện u tuyến giáp dạng tuỷ và một số ít bệnh nhân mắc bệnh PCCs hoặc u tuyến cận giáp, thường phụ thuộc vào đột biến đặc trưng của RET. Ví dụ như đột biến RET ở codon 634 khiến nguy cơ mắc PCCs cao và tăng theo độ tuổi. · 30 tuổi – 25%. · 50 tuổi – 52%. · 77 tuổi – 82%. Song, bệnh nhân mắc bệnh PCCs lại chiểm tỷ lệ thấp hơn khi bị đột biến exon 10. Tỷ lệ như sau: · Codon 609 – 4 → 26%. · Codon 611 – 10 → 25%. · Codon 618 – 12 → 23%. · Codon 620 – 13 → 24%. Nhóm bệnh MEN2B Khoảng 75% trường hợp MEN2B riêng lẻ và bệnh nhân bị ảnh hưởng bởi đột biến ở gen RET, 25% trường hợp xảy ra có liên quan đến di truyền trong gia đình. Với những bệnh nhân đột biến ở gen RET, có đến 95% bệnh nhân bị đột biến ở exon 16 (codon M918T) và 5% ở exon 15 (codon A883F). Tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh MEN2B phổ biến ở độ tuổi 20 cho đến 30. Tại Bệnh viện Chợ Rẫy (2005 – 2010), theo khảo sát ở 74 bệnh nhân về đặc điểm 6
  17. Đồ án tốt nghiệp lâm sàng và cận lâm sàng các trường hợp u sắc bào tuỷ thượng thận, chúng tôi nhận thấy rằng độ tuổi mắc bệnh trung bình từ 40 – 49 tuổi (chiếm 39,2%). Đặc điểm thường gặp ở các khối u được thống kê như sau: · U có ở 2 tuyến: 4,1% · U ở 1 tuyến phải: 70,3% · U ở 1 tuyến trái: 25,6% Kích thước trung bình của khối u: 5,86 ± 4,14 cm · Kích thước thường gặp: 3 → 5 cm (37,3%) · U bên trái: 7,79 → 5,11 cm · U bên phải: thường nhỏ hơn u bên trái và có kích thước khoảng 5,38 ± 3,65 cm · U ở cả 2 bên: 3 ± 0,82 cm và nhỏ hơn so với những trường hợp chỉ có 1 u (6,02 ± 4,19 cm) Một công trình khảo sát các yếu tố di truyền liên quan PCCs cho thấy: - Khảo sát trên 2499 đối tượng trong khoảng thời gian 10 năm (2001 – 2010), có 1620 trường hợp riêng lẻ và 879 trường hợp liên quan đến di truyền gia đình [5]. - Trong 363 trường hợp riêng lẻ (22,4%) có 269 đột biến ở hệ gen SDHx (137 – SHDB, 100 – SDHD, 30 – SHDC, 2 – SHDA), 64 đột biến xảy ra ở gen VHL, 23 – RET và 7 – TMEM127 [5]. - Xét theo tỷ lệ 363/1620 trường hợp đột biến riêng lẻ (22,4%; 23,5% là các bệnh nhận bị hội chứng NF1). Các gen SDHB, SDHD và gen VHL là những gen đột biến xảy ra ở phần lớn các bệnh nhân, mà trong đó đột biến SDHB chiếm 37,7%; 27,5% ở SDHD; 17,6% ở VHL; 8,26% ở SDHC; 6,3% ở RET; 1,93% ở TMEM127 và 0,55% ở SDHA. Không phát hiện đột biến ở gen SDHAF2 [5]. - 137 bệnh nhân đột biến gen SDHB (119 đột biến điểm, bao gồm: đột biến thay thế, nhân đôi, cắt hoặc chèn 1 điểm nhỏ và 18 trường hợp đột biến vùng) [5]. - Ở gen VHL có 64 bệnh nhân (63 trường hợp đột biến điểm và 1 đột biến vùng). - Bệnh nhân mang gen đột biến SDHD có 100 người (95 trường hợp đột biến điểm và 5 trường hợp đột biến vùng). - Đột biến SDHC có 30 bệnh nhân (25 trường hợp đột biến điểm và 5 trường hợp 7
  18. Đồ án tốt nghiệp đột biến vùng) [5]. - Theo tỷ lệ đột biến gen riêng lẻ · Đột biến gen SDHB – 8,46% · Đột biến gen SDHD – 6,2% · Đột biến gen VHL – 3,95% · Đột biến gen SDHC – 1,85% · Đột biến gen RET – 1,42% · Đột biến gen TMEM127 – 0,43% · Đột biến gen SDHA – 0,12% 1.3. Các bệnh và hội chứng liên quan 1.3.1. Hội chứng NF1 NF1 là một rối loạn di truyền đa chức năng được đặc trưng bởi các phát hiện về da, đặc biệt là các điểm hạt cà phê và tàn nhang, do loạn sản xương và do sự phát triển của hệ thống khối u thần kinh lành tính và ác tính, đáng chú ý nhất là các mô thần kinh lành tính [17]. Hình 1.2: Bé trai 4 tuổi có biểu hiện điểm hạt cà phê và tàn nhang 1.3.2. Hội chứng VHL Hội chứng VHL có liên quan đến PCCs. PCCs thường không gây ung thư, chúng có thể không gây triệu chứng, nhưng trong một số trường hợp, chúng có liên quan đến nhức đầu, các cơn hoảng loạn, đổ mồ hôi quá nhiều hoặc huyết áp cao nguy 8
  19. Đồ án tốt nghiệp hiểm và có thể không đáp ứng với thuốc. PCCs đặc biệt nguy hiểm nếu chúng phát triển trong thai kỳ [18]. 1.3.3. Hội chứng MEN Đa u tuyến nội tiết là một nhóm rối loạn ảnh hưởng đến mạng lưới sản sinh hormones của cơ thể được gọi là hệ thống nội tiết. Hormones là những chất hoá học được phóng thích vào máu, điều chỉnh chức năng của tế bào và các mô khắp cơ thể. Đa u tuyến nội tiết thường liên quan đến khối u ở ít nhất hai tuyến nội tiết, khối u cũng có thể phát triển ở các cơ quan và mô khác. Những sự tăng trưởng này có thể không ung thư (lành tính) hoặc ung thư (ác tính). Nếu khối u trở thành ung thư, tình trạng có thể đe dọa tính mạng [19]. Các đột biến gen MEN1 gây ra nhiều loại đa u tuyến nội tiết loại 1. Gen này mã hóa cho việc sản xuất một protein gọi là menin. Menin hoạt động như một chất ức chế khối u, có nghĩa là nó giữ cho tế bào không tăng trưởng và phân chia quá nhanh hoặc phân chia không kiểm soát được. Mặc dù chức năng của menin không rõ ràng, nhưng nó có thể tham gia vào chức năng khác của tế bào như sao chép và sửa chữa DNA và điều chỉnh hoạt động của các gen khác. Khi đột biến làm vô hiệu hóa cả hai bản sao của gen MEN1, menin không còn khả dụng để kiểm soát sự tăng trưởng và phân chia tế bào, sự mất mát của protein này làm cho các tế bào phân chia quá nhiều, dẫn đến sự hình thành các khối u đặc trưng của đa u tuyến nội tiết loại 1 [19, 23]. Dấu hiệu phổ biến nhất của đa u tuyến nội tiết loại 2 là một dạng ung thư tuyến giáp được gọi là ung thư tuyến giáp dạng tủy. Một số người bị rối loạn này cũng đồng mắc PCCs dẫn đến cao huyết áp. Đa u tuyến nội tiết loại 2 được chia thành ba phân típ: loại 2A, loại 2B và ung thư tuyến giáp dạng tủy mang tính gia đình (FMTC). Những phân nhóm này khác nhau về dấu hiệu, triệu chứng đặc trưng và nguy cơ của các khối u cụ thể. Ví dụ, cường giáp xảy ra chỉ ở loại 2A và ung thư tuyến giáp là đặc điểm duy nhất của FMTC. Các dấu hiệu và triệu chứng của đa u tuyến nội tiết loại 2 là tương đối phù hợp trong bất kỳ một gia đình nào [19, 23]. Các đột biến trong gen RET gây ra đa u tuyến nội tiết loại 2. Gen này mã hóa cho 9
  20. Đồ án tốt nghiệp việc sản xuất một protein liên quan đến tín hiệu trong tế bào. Protein RET kích hoạt các phản ứng hóa học hướng dẫn tế bào phản ứng với môi trường của chúng, ví dụ bằng cách phân chia hoặc sinh trưởng. Các đột biến trong gen RET kích hoạt chức năng báo hiệu của protein, có thể kích hoạt sự tăng trưởng và phân chia tế bào khi không có các tín hiệu từ bên ngoài tế bào. Sự phân chia tế bào không kiểm soát này có thể dẫn đến sự hình thành các khối u ở các tuyến nội tiết và các mô khác [19, 23]. 1.4. Cấu trúc, đột biến, chức năng của gen RET Gen RET được tìm thấy sau khi gây nhiễm dòng tế bào nguyên bào sợi 3T3 với DNA lấy từ các tế bào lymphoma của người. Gen RET nằm trên nhiễm sắc thể số 10, nhánh dài, vùng 1, băng 1, băng phụ 2 (10q11.2) và gồm 20 exon [10, 20]. Hình 1.3: Vị trí gen RET trên nhiễm sắc thể số 10 Sự nối ghép tự nhiên của gen RET tạo ra 3 dạng đồng phân khác nhau của protein RET: RET51, RET43 và RET9 chứa 51, 43 và 9 Aa trong đuôi C cuối cùng của chúng [10]. RET là protein xuyên màng. Mỗi protein được chia thành ba miền: một miền ngoại bào N với bốn lần lặp đi lặp lại giống như cadherin (là một protein 2 thành phần, phần bên trong tế bào gắn với khung xương của tế bào và phần bên ngoài tế bào là polypeptide có 5 đồng phân gắn kết với nhau) và một vùng giàu Cystein, một miền màng xốp kẽm và một miền tyrosine kinase nội bào, được chia ra bởi sự chèn thêm 27 Aa. Trong miền tyrosine kinase nội bào, có 16 Tyrosines (Tyrs) trong RET9 và 18 trong RET51. Tyr1090 và Tyr1096 chỉ có ở dạng đồng vị RET51 [10, 15]. Miền ngoại bào của RET chứa chín vị trí N-glycosyl hóa. Protein RET được 10
  21. Đồ án tốt nghiệp glycosyl hóa hoàn toàn được báo cáo có trọng lượng phân tử là 170 kDa mặc dù không rõ ràng là nó có cấu tạo nên trọng lượng phân tử này liên quan [10]. Gen RET mã hóa sản xuất một protein liên quan đến tín hiệu trong tế bào. Protein này dường như rất cần thiết cho sự phát triển bình thường của một số loại tế bào thần kinh, bao gồm hệ thống thần kinh tự trị, thần kinh ruột non. Protein RET cũng cần thiết cho sự phát triển bình thường của thận và sản sinh ra tinh trùng (sự hình thành tinh trùng). Protein RET có một đầu của protein nằm trong màng tế bào và đầu còn lại nằm ngoài màng tế bào. Chính vị trí này của protein cho phép nó tương tác với các yếu tố cụ thể bên ngoài tế bào và nhận các tín hiệu giúp tế bào phản ứng với môi trường của nó. Khi các phân tử kích thích sự phát triển và tăng trưởng (các yếu tố tăng trưởng) gắn với protein RET, một chuỗi các phản ứng hóa học phức tạp bên trong tế bào được kích hoạt. Những phản ứng này chỉ dẫn cho tế bào trải qua những thay đổi nhất định, chẳng hạn như phân chia hoặc trưởng thành để có các chức năng đặc biệt. Đột biến gen RET được biết là gây ra một dạng đa u tuyến nội tiết loại 2. Đa u tuyến nội tiết thường liên quan đến sự phát triển của các khối u ở hai hoặc nhiều tuyến sản sinh hormones của cơ thể, được gọi là tuyến nội tiết. Những khối u này có thể không ung thư hoặc ung thư. Đa u tuyến nội tiết loại 2 được chia thành ba phân típ: loại 2A, loại 2B, và carcinoma tuyến giáp dạng tủy mang tính chất gia đình. Những phân típ này được phân biệt bằng các dấu hiệu và triệu chứng đặc trưng và nguy cơ của các khối u đặc biệt [18]. Hầu hết các đột biến gen RET gây ra đa u tuyến nội tiết loại 2 làm thay đổi protein RET (thông qua thay đổi trình tự amino acid (Aa)). Loại 2A thường xuất phát từ đột biến thay thế Aa Cysteine bằng Arginine ở codon 634 (Cys634Arg hoặc C634R). Hơn 90% các trường hợp loại 2B là do đột biến thay thế Aa Methionine bằng Threonine ở codon 918 (Met918Thr hoặc M918T). Một số thay thế Aa có thể gây ra carcinoma tuyến giáp dạng tủy mang tính chất gia đình [5,9]. Thụ thể tyrosine kinase là một protein xuyên màng, trong điền kiện tự nhiên các thụ thể này được kích hoạt khi có sự phối hợp của các đồng thụ thể (co-receptor) để 11
  22. Đồ án tốt nghiệp tiến hành chuyển nhóm phosphate của phân tử Aa Tyrosine cao năng thành các phân tử đặc hiệu phục vụ chuyển hóa năng lượng cho hoạt động sống bình thường. Khi bị đột biến gen, các thụ thể này hoạt động không kiểm soát, sinh ra các bệnh và có thể là ung thư [10]. Hình 1.4: Cơ chế phân tử của đột biến gen RET Gen RET mã hóa cho thụ thể tyrosine kinase là thành phần của yếu tố dẫn xuất dòng tế bào thần kinh (GDNF) có nguồn gốc tín hiệu ngoại bào, đột biến gen RET có liên quan đến sự phát triển của nhiều loại ung thư ở người, bao gồm phình đại tràng bẩm sinh (Hirschsprung disease), ung thư phổi, ung thư tuyến giáp, đa u tuyến nội tiết loại 2A và 2B, tăng hồng cầu và tăng sản cận tử cung và một số ung thư khác [10]. Kích hoạt Kinase RET là thụ thể cho các phối tử nhóm Glial cell line Derived Neurotrophic Factor - GDNF (GFLs). Để kích hoạt RET, GFL đầu tiên cần phải tạo thành một phức hợp với đồng thụ thể glycosyl phosphatidyl inositol (GPI). Các đồng thụ thể được phân loại là các thành viên của họ protein receptor-α (GFRα) của receptor GDNF. Các thành viên 12
  23. Đồ án tốt nghiệp khác nhau trong họ GFRα (GFRα1, GFRα2, GFRα3, GFRα4) có hoạt động ràng buộc cụ thể đối với một GFL cụ thể. Khi tạo phức GFL-GFRα, phức hợp sau đó sẽ kết hợp hai phân tử của RET, gây ra trans-autophosphorylation các dư lượng Tyrosine cụ thể trong miền tyrosine kinase của mỗi phân tử RET. Tyr900 và Tyr905 trong vòng lặp kích hoạt (vòng lặp A) của miền kinase đã được chứng minh là các vị trí tự quang phổ bằng quang phổ khối. Phosphoryl hóa Tyr905 ổn định cấu hình hoạt tính của kinase, do đó dẫn đến sự tự phospho hóa các dư lượng Tyrosine khác, chủ yếu nằm trong vùng đuôi C của phân tử [3, 15]. 1.5. Các phương pháp giải trình tự 1.5.1. Phương pháp hóa học Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh ra phương pháp hóa học để giải trình tự một đoạn DNA. Tuy nhiên, phương pháp giải trình tự của Maxam và Gilbert khó thực hiện vì phải xác định nhiều thông số cho thí nghiệm. Vì vậy, hiện nay người ta sử dụng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội [21]. 1.5.2. Phương pháp enzyme Phương pháp enzyme được Sanger và cộng sự phát minh vào năm 1977. Nguyên tắc chung của phương pháp này là: - Trước hết chèn các đoạn DNA cần xác định trình tự vào một vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được xác định rõ. - Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí chèn đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng DNA polymerase, bốn loại nucleotide tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và các nucleotide tận cùng (terminator, là ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP, có bốn loại ddNTP tương ứng với bốn base A, T, C, G). Phản ứng được thực hiện trong bốn ống và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. Bắt đầu từ đoạn mồi, DNA polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn trên vector và sự tổng hợp bị dừng lại là vì ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose, mà gốc OH tại vị trí này chính là nơi để dNTP kế tiếp được gắn vào. Nhờ vậy trong ống phản ứng có các 13
  24. Đồ án tốt nghiệp mạch đơn DNA có các chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc. - Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính (hình 1.5). Với phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng đồng vị phóng xạ 32P hay 35S thì sau khi điện di, cũng giống như phương pháp của Maxam và Gilbert, người ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi và từ các vạch này giải trình tự của đoạn DNA [21]. Hình 1.5: Hình kí xạ tự ghi kết quả giải trình tự DNA trên gel polyacrylamide 1.5.3. Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer) Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Cấu tạo của một máy tự động giải trình tự gồm hai phần chủ yếu, đó là: Phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện di polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ [21]. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA (hình 1.6). 14
  25. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6: Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tự dùng bản gel polyarylamide Với các máy thế hệ mới sau này, người ta có thể dùng bốn màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu bốn loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được chi trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng mà không cần phải trên bốn hàng khác nhau như trước đây. Nếu dùng điện di mao quản thì tùy thuộc vào số mao quản có thể chạy một lần mà người làm thí nghiệm có thể có số mẫu cho mỗi lần chạy nhiều hay ít [21]. 1.5.4. Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới-454 Pyrosequencing Kỹ thuật pyrosequencing 454 được sáng tạo đầu tiên bởi Pål Nyrén và Mostafa Ronaghi của Viện Kỹ thuật Stockholm, Thụy Điển năm 1996. Kỹ thuật này được phát triển bởi công ty 454 Life Science, là một hệ thống giải trình tự DNA hai bước có độ tương đồng cao với dung lượng lớn hơn rất nhiều so với hệ thống giải trình tự Sanger. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý “giải trình tự bằng tổng hợp” bao gồm khởi động một sợi DNA được giải trình tự, và giải trình sợi DNA bổ sung bằng phản ứng của enzyme. Đây là một hệ thống được kết hợp với việc khuếch đại số lượng lớn các đoạn DNA kèm cùng pyrosequencing dung 15
  26. Đồ án tốt nghiệp khối lớn trong các giếng picotiter. Nguyên lý “giải trình tự bằng việc tổng hợp” cũng dựa trên việc nhận biết các pyrophosphate (PPi) được giải phóng trong quá trình gắn nucleotide, tạo ra một tín hiệu ánh sáng, hiệu quả hơn kỹ thuật kết thúc chuỗi bằng dideoxynucleotide [7]. 1.6. Cơ sở dữ liệu và phần mềm phân tích trình tự nucleotide 1.6.1. Cơ sở dữ liệu Cơ sở dữ liệu là nơi tập hợp và lưu trữ một cách có tổ chức những thông tin nghiên cứu về tính chất, cấu trúc của các phân tử sinh học, các dữ liệu về bộ gen và vô số những dữ liệu hữu ích khác. Sau quá trình giải trình tự mẫu bệnh phẩm, ta tiến hành phân tích kết quả bằng cách so sánh trình tự thu nhận với cơ sở dữ liệu. Có nhiều nguồn dữ liệu cho việc phân tích: trình tự của những gen đã được công bố, cơ sở dữ liệu gen của tổ chức National Center For Biotechnology Information (NCBI). Trong đó, NCBI là cơ sở dữ liệu thường được lựa chọn vì quy mô lớn và phổ biến rộng rãi. NCBI có giao diện liên kết đơn giản, dễ sử dụng với khả năng lưu trữ, tìm kiếm, so sánh và tính toán nhanh chóng. 1.6.2. Phần mềm phân tích trình tự nucleotide Công cụ CLC Sequence Viewer: Được thiết kế vào năm 2005 với tên gọi ban đầu là CLC Free WorkBench bởi các nhà khoa học của CLC Bio. Năm 2008, phần mềm này được đổi tên lại thành CLC Sequence Viewer. Đây là phần mềm hỗ trợ cho phép người sử dụng dễ dàng thực hiện những phân tích dữ liệu trình tự DNA, ribonucleic acid (RNA) và protein như: sắp gióng cột các trình tự, nhận biết vị trí cắt giới hạn của các enzyme, phân tích biểu hiện gen, thiết kế mồi, sao chép phân tử, phân tích phát sinh loài, kết hợp với quản lý dữ liệu theo thứ tự [8]. 16
  27. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
  28. Đồ án tốt nghiệp 2.1. Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả hàng loạt ca được thực hiện trong thời gian từ 02/2017 đến tháng 05/2017 tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là bệnh nhân đã được chẩn đoán u sắc bào tuyến thượng thận, những bệnh nhân này đồng ý tham gia nghiên cứu khảo sát đột biến gen RET. Mẫu thí nghiệm là 2 ml máu EDTA của người trong một gia đình gồm: 2 chị em gái và 2 người con gái của họ và một mẫu không phải là người trong gia đình này. *Mô tả ca lâm sàng: Theo bài báo đã được công bố từ nghiên cứu trước của nhóm, ca lâm sàng này là bệnh nhân nữ, nhập viện vì biết có khối u tuyến thượng thận phải. Trước thời điểm nghiên cứu 2 năm bệnh nhân đã được phẫu thuật cắt bỏ khối u thượng thận trái do được chẩn đoán u thượng thận 2 bên Cha bệnh nhân có 2 người vợ: Người vợ thứ 1: có 8 con chung, trong số này có 1 người con trai đột tử ở tuổi 30 (không rõ nguyên nhân), 1 người con trai đã phẫu thuật cắt khối u thượng thận 2 bên (không rõ chẩn đoán) và 1 người con gái có khối u thượng thận trái đã được phẫu thuật nhưng đã qua đời do đột quỵ. Người vợ thứ 2: Có 2 người con gái bao gồm bệnh nhân và chị gái. Người chị gái đã phẫu thuật khối u thượng thận hai bên và bị đột quỵ sau khi phẫu thuật. 17
  29. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1: Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân Chú thích: Nam bình thường Nữ bình thường Nam bị bệnh u thượng thận Nữ bị bệnh u thượng thận Về lâm sàng: Không có biểu hiện lâm sàng các hội chứng MEN2A, VHL, NF1. Huyết áp: 100/60 mmHg, trong cơn: 150/100 mmHg. Không có các sang thương da. Về cận lâm sàng: - Xét nghiệm sinh hóa: Catecholamin niệu/24h: (thể tích nước tiểu 2300 ml/24 h) Adrenalin: 7,6 µg (bình thường <20 µg) Noradrenalin: 199 µg (bình thường <90 µg) Dopamin: 278,3 µg (bình thường <600 µg) Metanephrine máu: 758 pg/ml (bình thường <90 µg/ml) Cortisol máu (sau test Dexa liều thấp 1 mg qua đêm): 87,25 nmol/l 18
  30. Đồ án tốt nghiệp Calcitonin: 4,25 pg/ml (bình thường C (p.Cys634Arg), một đột biến thường gặp gây ra hội chứng MEN2A. Bệnh nhân có tiền căn gia đình có tính chất nghi ngờ cao nên đã được tư vấn và chỉ định xét nghiệm di truyền cho những người thân trực hệ. 2.3. Vật liệu 2.3.1. Dụng cụ và thiết bị Dụng cụ: - Micropipet, đầu típ: 10 µl, 20 µl, 200 µl, 1000 µl - Eppendorf 0,2 ml, 1,5 ml - Thiết bị điện di (khay, lược) - Bình tam giác thủy tinh - Ống đong Thiết bị: 19
  31. Đồ án tốt nghiệp - Máy lắc rung (vortex) - Micro ONE, Milipore - Máy ly tâm eppendorf 5415 R (Eppendorf, Mỹ) - Cân kỹ thuật - Lò vi sóng - Máy điện di Mupid – EXU (Advance, Nhật Bản) - Máy soi gel Pringraph (Atto, Nhật Bản) - Máy PCR Mastercycler Pro AG 6325 (Đức) - Máy giải trình tự ABI 3500 Genetic analyzer (Appied Biosystems, Mỹ) - Tủ mát (Sanyo, Nhật Bản) - Tủ âm sâu 300 - Máy đo nồng độ DNA Nano Drop 2000/2000c (Mỹ) 2.3.2. Hóa chất Hóa chất tách chiết: sử dụng bộ kit tách máu QIAGEN DNA Mini Kit Thành phần bộ kit: QIAamp Mini Spin Columns, Collection tubes (2ml), QIAGEN Protease (proteinase K), Ethanol (96 – 100%) và Buffers: AL, AW1, AW2, AE. Bảo quản: hóa chất được bảo quản ở nhiệt độ phòng (15 – 250C) và nơi khô ráo. Hóa chất PCR: - Nước cất khử ion - Takara TaqTM Hot Start Version (Takara, Nhật) (5units) - dNTPs (mỗi loại 2,5 mM). Hòa tan trong nước có pH 7 - 9 - Mồi xuôi, mồi ngược - Buffer 10 X 100 mM Tris-HCl (pH 8,3) 500 mM KCl 15 mM MgCl2 Hóa chất điện di: - Agarose dạng bột - Ethidium bromide (10 mg/ml) 20
  32. Đồ án tốt nghiệp - Dung dịch 5X TBE 1000 ml Tris (Merck, Mỹ) 54 g Boric acid (Merck, Mỹ) 27,5 g 0,5M EDTA pH8 (Merck, Mỹ) 20 ml H2O thêm cho đủ 1000 ml Từ dung dịch 5 X pha thành 0,5 X - Ethdium bromide - Loading dye - GeneRulerTM 1 kb Plus DNA Ladder (5x50 ng) Hóa chất tinh sạch: - Nước cất khử ion - ExoSap-it 500 rcn (enzyme tinh sạch) Hóa chất cycle sequencing: - BigDye terminator (Applied Biosystems, Mỹ) Hóa chất tủa sản phẩm cycle sequencing: - NH4OAC (muối amoni) - Ethanol tuyệt đối (Merck, Đức) - Ethanol 70% - Hidi formamide (Applied biosystems, Mỹ) Bảng 2.1: Trình tự mồi xuôi và mồi ngược dùng cho phản ứng PCR Độ dài khuếch Kí hiệu mồi Tm (oC) Trình tự mồi 5’ - 3’ đại RET – 10F TATGCTTGCGACACCAGTTG 452 bp 56 RET – 10R TTCTGGCCTGTCCATCATAG RET – 11F TGAGCCTCTGTCTCCATCTG 699 bp 56 RET – 11R CCGTTCCCATCTAGGTGAGA 21
  33. Đồ án tốt nghiệp RET – 13F GGCCTCTCTGTCTGAACTTG 420 bp 56 RET – 13R GATGGAAAGTGACCACTCAG RET – 14F GAGAAAGCTGAGGCTTCAAG 948 bp 56 RET – 15R CTTTCCTAGGCTTCCCAAGG RET – 16F GATGTGTGTGGCCAGTTCTG 324 bp 56 RET – 16R AGTGCAATTCCCTGGCCAAG 22
  34. Đồ án tốt nghiệp 2.4. Sơ đồ quy trình thực hiện Mẫu máu bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh u sắc bào tuyến thượng thận Tách chiết DNA bộ gen từ máu bằng bộ kít QIAGEN Mini Kit PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho exon 10, 11, 13, 14, 15, 16 Điện di sản phẩm PCR Tinh sạch sản phẩm PCR bằng ExoSap-it (500 rcn) glycerol solution Thực hiện phản ứng cycle sequencing Tủa sản phẩm cycle sequencing Giải trình tự 6 exon bằng máy ABI 3500 Đọc và phân tích kết quả 23
  35. Đồ án tốt nghiệp 2.5. Thuyết minh quy trình 2.5.1. Quy trình tách chiết DNA 2.5.1.1. Nguyên tắc: - Tách chiết DNA cần đảm bảo độ tinh khiết và nguyên vẹn cấu trúc DNA - Có nhiều phương pháp tách chiết khác nhau, tùy vào mục đích nghiên cứu mà chọn phương pháp thích hợp, tuy nhiên vẫn tuân thủ các nguyên tắc sau: + Phá vỡ tế bào để giải phóng vật liệu di truyền + Bổ sung các chất ức chế enzyme phân giải DNA + Tách DNA ra khỏi các tạp chất + Kết tủa, rửa và hòa tan DNA 2.5.1.2. Các bước thực hiện: Thực hiện các bước theo sách hướng dẫn kèm theo bộ kit - Bổ sung vào tube 1,5 ml: 20 µl Protease (proteinase K), 200 µl mẫu máu (vortex mẫu đều), 200 µl Buffer AL. Vortex 15 giây - Ủ tube ở 56oC/10 phút. Spin down - Bổ sung 200 µl Ethanol (96 - 100%) vào tube. Vortex 15 giây. Spin down - Chuyển hỗn hợp sang cột lọc chứa trong tube 2 ml. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Loại dịch chảy qua cột, thay ống thu (được cấp bởi kit) - Chuyển cột sang tube 2 ml mới, cho 500 µl Buffer AW1 vào cột lọc. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Loại dịch chảy qua cột, thay ống thu (được cấp bởi kit) - Chuyển cột sang tube 2 ml mới, cho 500 µl Buffer AW2 vào cột lọc. Ly tâm 14000 vòng/ phút trong 3 phút - Chuyển cột sang tube 2 ml mới. Ly tâm khan 14000 vòng/phút trong 1 phút - Chuyển sang cột thu 1,5 ml. Thêm 200 µl Buffer AE, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút - Thu DNA và bảo quản ở nhiệt độ - 200C * Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA bằng máy Nanodrop: Phương pháp này dựa vào sự hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của 24
  36. Đồ án tốt nghiệp các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm của các mẫu cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu đo. Độ tinh sạch của dung dịch dựa vào tỷ số OD= 260/280 nm. Một dung dịch nucleic acid được coi là sạch khi tỷ số OD là 1,7 - 2,0. Cách tiến hành: + Nạp 1 µl nuclease free water vào giếng đo của máy Nanodrop, chứng Blank + Nạp 1 µl mẫu vào giếng đo của máy + Đo mật độ quang trên 2 bước sóng 260 nm và 280 nm. + Đọc kết quả trên màn hình hiển thị nồng độ DNA tính bằng ng/µl và OD. 2.5.2. Quy trình PCR gen RET 2.5.2.1. Nguyên tắc: - Dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài primers nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc hiệu trong thiết bị luân nhiệt (thermocycler) còn gọi là máy PCR. PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200 - 3000 bp. Đoạn DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận dạng nhờ cặp mồi đặc hiệu (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide. - PCR thường tiến hành khoảng 25 - 35 chu kỳ qua đó từ 10-6 mg ban đầu có thể khuếch đại (amplification) lên tới 1 mg (khoảng 2 kb). Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau: Gây biến tính (denaturation) ở 90 - 98oC: Trong giai đoạn biến tính, phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single strands). Tất cả các phản ứng enzyme trong giai đoạn này đều bị dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trước đó) Gắn mồi (annealing) ở 40 - 65oC: Trong giai đoạn này các mồi gắn vào vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu. Các mồi bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion được tạo thành và bị đứt gãy liên tục giữa primer sợi đơn và DNA khuôn mẫu sợi đơn. Các liên kết ion ổn định hơn tạo thành một đoạn nhỏ (các mồi đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó 25
  37. Đồ án tốt nghiệp (khuôn mẫu và primer) Taq polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu. Ở giai đoạn này phạm vi nhiệt độ được sử dụng có thể rất rộng tùy thuộc vào trình tự nucleotide của primer, thông thường khoảng 55oC, nhưng có khi chỉ 35oC hoặc đôi lúc lên tới 68oC (long PCR). Kéo dài phân tử (extension) ở nhiệt độ 70 - 72oC: Đây là khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bằng cách bổ sung các dNTP bắt đầu từ các vị trí có primer theo chiều 5’ - 3’. Các primer có một vài base gắn vào khuôn mẫu có mối liên kết ion mạnh hơn lực phá vỡ các liên kết này sẽ không đứt gãy. Các primer ở các vị trí không bắt cặp chính xác bị rời ra (do nhiệt độ cao) khỏi khuôn mẫu đã không tổng hợp được DNA. Hình 2.2: Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase Hình 2.3: Các chu kỳ của PCR 26
  38. Đồ án tốt nghiệp 2.5.2.2. Các bước thực hiện: - Rã đông dNTP, buffer, mồi - Đánh số thứ tự lên các tube 0,2 ml từ một cho tới mẫu chứng âm - Sử dụng các cặp mồi ở bảng 2.1 để khuếch đại gen RET với 6 exon từ DNA bộ gen của mẫu đã ly trích Bước 1: Bổ sung 8,9 µl nước, 1,5 µl Buffer, 1,5 µl dNTP, 0,1 µl Taq polymerase, 0,75 µl mồi xuôi và mồi ngược (primer-R, primer-F), 1,5 µl gDNA vào tube 1,5ml Bước 2: Bổ sung 8,9 µl nước, 1,5 µl Buffer, 1,5 µl dNTP, 0,1 µl Taq polymerase, 0,75 µl mồi xuôi và mồi ngược, 1,5 µl nước vào tube 1,5ml Bước 3: Cài đặt chương trình chạy PCR 35 chu kỳ Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Chu trình nhiệt Buffer 10X 1,5 98oC x 3 phút 98oC x 10 giây 2,5 µM dNTP 1,5 56oC x 20 giây 35 chu kỳ 72oC x 40 giây Primer-F (10 µM) 0,75 72oC x 2 phút 4oC Primer-R (10 µM) 0,75 Takara TaqTM Hot Start 0,1 Polymerase (1,25 U/µl) H2O 8,9 Genomic DNA 1,5 Tổng 15 2.5.3. Điện di sản phẩm PCR 2.5.3.1. Nguyên tắc: - Là hiện tượng dịch chuyển các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường. Sự dịch chuyển này do phần lực điện trong lực Lorentz. Điện di trên gel (gelelectrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử DNA, RNA, protein dựa trên 27
  39. Đồ án tốt nghiệp các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng tích (isoelectic point). Kỹ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo điện trường đều. Một bản gel đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, xanh coomassie, bạc ) để phát hiện vị trí các phân tử gel sau khi điện di. - Điêṇ di là ky ̃ thuâṭ được dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đại phân tử đặc biệt là các protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thước khố i lương,̣ điêṇ tich́ và cấu hình của chúng. - Dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt phân tử nên khi chịu tác động của điện trường chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dương của điện trường, các nucleic acid trong gel agarose sẽ phát quang dưới tia tử ngoại khi liên kết với các phân tử trong ethidium bromide. - Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel. Trong đó gel của agarose và polyacrylamide được sử dụng phổ biến nhất. Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có các giếng để nạp (loading) mẫu. Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện và một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi tương đối. Các kiểu điện di: •Điện di trên gel agarose: khả năng phân tách gel 50 bp – 20 kb •Điện di trên gel polyacrylamide: khả năng phân tách gel 5 bp – 1 kb Bảng 2.3: Các thông số điêṇ di DNA bằ ng gel agarose Hàm lượng agarose Kích thước DNA (kb) trong gel (%) 0,3 60 - 5 0,6 20 - 1 28
  40. Đồ án tốt nghiệp 0,7 10 - 0,8 0,9 7 - 0,5 1,2 6 - 0,4 1,5 4 - 0,2 2,0 3 - 0,1 - Khuôn gel: Nơi đổ gel - Máy điện di 2.5.3.2. Các bước thực hiện: - Quy trình đổ gel Pha 500 ml dung dịch TBE 0,5 X từ dung dịch TBE 5 X TBE 5X 50 ml Nước cất 450 ml Pha 100ml dung dịch gel agarose 2% Agarose 2 g TBE 0,5X 100 ml Lắc đều, cho bình tam giác chứa dung dịch vào lò vi sóng, đun sôi để agarose hòa tan hết trong dung dịch đệm TBE 0,5 X. Chuẩn bị khay, lược, khuôn sạch trên bề mặt phẳng. Để dung dịch agarose 2% nguội khoảng 50 - 55oC Đổ toàn bộ dung dịch agarose vào khuôn đựng gel. Để yên trong 45 phút cho gel đông hoàn toàn. - Sản phẩm sau khi khuếch đại được nạp vào giếng trên gel agarose 2% với thang chuẩn 1kp plus: Cho gel vào bồn điện di. Bổ sung dung dịch điện di TBE 0,5X vào bồn điện di, lưu ý dung dịch cần ngập mặt bản gel. Lấy 2 µl thang chuẩn và 2 µl loading dye trộn đều lần lượt nạp mẫu vào các giếng 29
  41. Đồ án tốt nghiệp 1, 3, 5, 7, 9, các giếng 2, 4, 6, 8, 10 là các giếng chứng âm. Lấy 2 µl ladder và 2 µl loading dye trộn đều, bơm vào giếng số 11. - Điện di với hiệu điện thế 100 vôn trong 30 phút Sau khi chạy diện di xong, tiến hành nhuộm ethidium bromide bằng cách nhúng toàn bộ bảng gel vào trong dung dịch có chứa ethidium bromide (10 mg/ml), ngâm trong 5 phút Đọc kết quả điện di: Xem kết quả trên máy soi gel, đối chiếu với thang chuẩn để xác định kích thước của sản phẩm chụp và lưu hình chụp gel. 2.5.4. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR 2.5.4.1. Nguyên tắc: Sản phẩm DNA sau khi khuếch đại sẽ còn một số sản phẩm phụ dư thừa, việc tinh sạch giúp bất hoạt mồi và các dNTPs dư thừa trong sản phẩm. Xử lý bằng enzyme là một phương pháp rất hiệu quả để làm sạch PCR. ExoSap- it (500 rcn) glycerol solution giúp loại bỏ mồi và các dNTPs dư thừa, bảo tồn các amplification PCR. Việc ủ đầu tiên giúp bất hoạt các mồi thừa và các dNTPs. Nhiệt độ thứ hai, ủ ở nhiệt độ cao kích hoạt các enzyme. Hình 2.4: Mô tả quá trình tinh sạch sản phẩm PCR 2.5.4.2. Các bước thực hiện: Cho 1 µl nước, 1 µl ExoSap và 3 µl sản phẩm PCR vào tube 0,2 trộn đều bằng 30
  42. Đồ án tốt nghiệp máy vortex, spin down. Chạy thời gian 30 phút ở hai nhiệt độ (370C 15 phút, 800C 15 phút) 2.5.5. Quy trình cycle sequencing 2.5.5.1. Mục đích: Nhằm tạo ra các picth dữ liệu với độ cao đồng đều và cân bằng tín hiệu, tối ưu hóa việc đọc được dài hơn, chất lượng cao hơn và chính xác hơn cho việc phát hiện đột biến chúng tôi tiến hành thêm bước chạy cycle sequencing. Với tính năng hóa học vượt trội, BigDye được chọn có các ưu điểm [2]: • Nâng cao chất lượng kết quả giải trình tự • Được tối ưu hóa cho độ dài đọc • Đặc điểm di động nhuộm tốt hơn • Cải thiện hiệu suất đọc qua các vùng giàu G, T • Đọc được lâu hơn, chất lượng cao hơn với độ cao đỉnh cao nhất và cân bằng tín hiệu tối ưu • Nâng cao năng suất và giảm chi phí 2.5.5.2. Các bước thực hiện: - Pha mồi 1,6 µM từ mồi 10 µM: Hút 21 µl nước và 4 µl mồi 10 µM vào tube 0,2ml trộn đều bằng máy vortex, spin down. - Hút 4,5 µl nước, 1,5 µl buffer, 0,5 µl BigDye, 1 µl sản phẩm cycle, 1 µl mồi ở bước trên vào tube 0,2 ml trộn đều bằng máy vortex, spin down. Chạy cycle sequencing 120 phút. 31
  43. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.4: Thành phần trong một phản ứng cycle sequencing Chu trình nhiệt Thành phần Thể tích (µl) BigDye 0,5 96oC x 1 phút Sản phẩm DNA tinh 1 96oC x 10 giây sạch 50oC x 5 giây 25 chu kỳ 60oC x 4 phút Mồi (1,6 µM) 1 4oC 1X sequencing buffer 1,5 Nước 4,5 Tổng thể tích 8,5 2.5.6. Quy trình tủa sản phẩm cycle 2.5.6.1. Nguyên tắc: DNA dễ dàng hòa tan trong các dung môi ưa nước vì có ái lực với các phân tử của dung môi. Khi tủa DNA, kết hợp bổ sung muối, do ethanol có ái lực với nước mạnh hơn DNA nên kéo nước về phía mình, phá bỏ liên kết giữa DNA và nước. Kết quả là các phân tử DNA tập trung lại và bị tủa xuống đáy theo lực ly tâm. Mục đích: Loại bỏ các thành phần dư thừa còn sót lại của BigDye từ hỗn hợp của phản ứng cycle sequencing trước khi tiến hành đưa vào máy giải trình tự. 2.5.6.2. Các bước thực hiện: - Cho hỗn hợp (bảng 2.5) vào tube 1,5 ml - Lắc rung hỗn hợp 15 giây, ly tâm lạnh 13200 vòng/phút ở 4oC, 20 phút - Đổ bỏ dịch, thu tủa - Thêm 300 µl ethanol 70% vào tube, ly tâm lạnh 13200 vòng/phút, 15 phút - Làm khô ở 48oC, 10 - 15 phút - Cho 17 µl hidi formamide, votex kỹ 32
  44. Đồ án tốt nghiệp - Để ở 96oC, 2 phút sau đó chuyển nhanh sang thùng đá, để trong 5 phút. - Lấy 17 µl dung dịch trên cho vào đĩa 96 giếng để chạy phản ứng giải trình tự Bảng 2.5: Thành phần hỗn hợp tủa DNA Thành phần Thể tích (µl) Sản phẩm cycle sequencing 20 5M NH4OAC 12 Ethanol 100% 60 Tổng thể tích 92 2.5.7. Giải trình tự bằng máy ABI 3500 2.5.7.1. Nguyên tắc: Sợi DNA mang điện tích âm khi điện di chạy về cực dương, các đoạn DNA có kích thước khác nhau sẽ phân tách thành các băng vạch khác nhau. Điện di mao quản cho phép phân tích các băng vạch có sự sai khác nhau chỉ 1 nucleotide. 2.5.7.2. Đọc trình tự chuỗi DNA: Exon 10, 11, 13, 14, 15, 16 của gen RET được giải trình tự với các mồi đặc hiệu ghi ở bảng 2.1 trên máy ABI 3500 Genetic Analyzer, dùng POP-7 polymer và Capillary 80cm (Applied Biosystem, Mỹ). Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm Genetic Analyzer Collection Software v3.0. Mỗi loại nucleotide được quy ước bằng 1 sóng với màu khác nhau. - Adenine: màu xanh lá cây - Thymine: màu đỏ - Cytosine: màu xanh da trời - Guanine: màu đen Thông thường, mỗi vị trí chỉ xuất hiện 1 sóng. Khi có sự biến đổi nucleotide sẽ xuất hiện 2 sóng khác nhau trên cùng 1 vị trí hoặc màu của sóng tại ví trí nucleotide thay đổi khác với màu quy ước. Sau đó, dùng công cụ CLC cycle sequence để so với trình tự chuẩn trên GenBank, xác định sự biến đổi nucleotide là SNP hay đột 33
  45. Đồ án tốt nghiệp biến và đột biến loại nào. Các dữ liệu về SNP của gen RET được tra cứu trên hệ thống dữ liệu của NCBI (Nation Central For Biotechnology Information), dữ liệu đột biến tra cứu theo cơ sở dữ liệu trực tuyến. 34
  46. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
  47. Đồ án tốt nghiệp 3.1. Kết quả, bàn luận tách chiết Mẫu máu ngoại vi thu được từ đối tượng nghiên cứu được tiến hành ly trích DNA sử dụng bộ kít tách chiết của QIAGEN để thu nhận DNA bộ gen. Sau đó, nồng độ DNA được đo bằng máy quang phổ Nanodrop 2000c. Bảng 3.1: Kết quả đo nồng độ nucleic acid trong mẫu Tên mẫu OD260nm/OD280nm Nồng độ ng/µl RET1 1,94 40,8 RET2 1,98 14,7 RET3 1,92 21,0 RET4 1,88 24,7 RET5 1,98 19,8 Qua kết quả đo ta thấy nồng độ DNA thu được nằm trong khoảng 1,7 - 2,0 chứng tỏ mẫu DNA này là không bị tạp nhiễm protein. Mẫu DNA được bảo quản ở -20oC, dùng mẫu DNA này để tiến hành PCR khuếch đại gen RET với 6 exon. 3.2. Kết quả, bàn luận PCR với cặp mồi đặc hiệu Sử dụng DNA làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR khuếch đại 6 exon của gen RET với các cặp mồi đặc hiệu trong bảng 2.1. Mồi của phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự chuẩn của gen RET (NG_007489) trong ngân hàng gen đồng thời dựa trên một số nguyên tắc: · Kích thước mồi được thiết kế thường là 20 bp · Đầu 3’ của mồi thường là A hoặc G, không được quá 3G · A+T=10; G+C=10 (mức biến thiên cao nhất của tỷ lệ A+T và G+C là 8:12) · Tỷ lệ A+T/G+C ở mồi xuôi và mồi ngược phải tương đương nhau để có 35
  48. Đồ án tốt nghiệp cùng nhiệt độ bắt cặp · Mồi xuôi, mồi ngược được thiết kế lần lượt trước và sau exon cần khuếch đại là 100bp Kết quả khuếch đại 6 exon (10, 11, 13, 14 - 15, 16) trong phản ứng PCR với 5 cặp mồi được phát hiện nhờ điện di DNA trên gel agarose 2% với thang chuẩn 1kp plus 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 L 948 bp 1000 bp 699 bp 700bp 452bp 420 bp 400 bp 324bp 300bp 75 bp Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm các exon 10, 11,13, 14 - 15,16 Chú thích : Giếng 1: Sản phẩm PCR exon 10 với mồi 10F/R Giếng 3: Sản phẩm PCR exon 11 với mồi 11F/R Giếng 5: Sản phẩm PCR exon 13 với mồi 13F/R Giếng 7: Sản phẩm PCR exon 14 - 15 với mồi 14F/15R Giếng 9: Sản phẩm PCR exon 16 với mồi 16F/R Giếng 2, 4, 6, 8, 10: Chứng âm là nước L: Thang chuẩn 1 kb plus Theo kết quả điện di ở hình 3.1: Giếng 1: Sản phẩm PCR có kích thước ở khoảng giữa 400 và 500. Kích thước này cho thấy phù hợp với lý thuyết của đoạn chứa exon 10 là 452 bp Giếng 3: Sản phẩm PCR có kích thước gần vạch 700. Kích thước này cho thấy phù hợp với lý thuyết của đoạn chứa exon 11 là 699 bp Giếng 5: Sản phẩm PCR có kích thước ở khoảng giữa 400 và 450. Kích thước này cho thấy phù hợp với lý thuyết của đoạn chứa exon 13 là 420 bp 36
  49. Đồ án tốt nghiệp Giếng 7: Sản phẩm PCR có kích thước ở khoảng giữa 900 và 1000. Kích thước này cho thấy phù hợp với lý thuyết của đoạn chứa exon 14 và 15 là 948 bp Giếng 9: Sản phẩm PCR có kích thước ở khoảng 300 và 400. Kích thước này cho thấy phù hợp với lý thuyết của đoạn chứa exon 16 là 324 bp Tất cả phản ứng đều có 1 băng rõ nét và không có băng phụ khác. Mẫu chứng âm: không nhiễm (không xuất hiện vạch), cho thấy sinh phẩm hóa chất sử dụng cho phản ứng không bị nhiễm DNA lạ. Như vậy, phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại 6 exon của gen RET đã thực hiện cho kết quả tốt. Hiện nay, enzyme polymerase sử dụng cho phản ứng PCR có rất nhiều loại với hiệu quả cao như: Takara TaqTM Hot Start Polymerase (Takara Bio), iTaq DNA polymarase (Bio-Rad), FastStart Taq polymerase (Roche), Go Taq® Flexi DNA polymerase (Applied Biosystems) Trong luận này, tôi chọn Takara TaqTM Hot Start polymarase để khuếch đại gen RET với 6 exon. Enzyme này có hoạt tính 5’ - 3’ exonuclease, 5’ - 3’ polymerase và có thể khuếch đại sử dụng trong giải trình tự lên đến vài kb. Ngoài ra, sản phẩm PCR do enzyme này khuếch đại sử dụng trong giải trình tự cho tín hiệu tốt và ổn định. 3.3. Kết quả, bàn luận tinh sạch sản phẩm PCR Thể tích sản phẩm PCR còn lại sau khi điện di được tinh sạch bằng ExoSap-it 500 rcn. Quá trình tinh sạch sản phẩm PCR nhằm bất hoạt các thành phần còn lại sau phản ứng PCR thư Taq polymerase, dNTPs, mồi dư, các ion muối, thu nhận dung dịch chứa các đoạn exon chuẩn bị cho phản ứng giải trình tự. Nồng độ DNA chủ yếu được ước lượng dựa vào độ đậm của các vạch điện di sau khi PCR. Nồng độ DNA được điều chỉnh để sử dụng trong phản ứng cycle sequencing. Tùy theo độ đậm của vạch điện di mà thay đổi lượng nước thêm vào hòa tan DNA ở bước cuối của giai đoạn tinh sạch sản phẩm Phương pháp xác định nồng độ DNA tương đối dựa vào độ đậm của vạch điện di so với thang chuẩn 1 kb. Phương pháp này thực hiện nhanh, tiện lợi, có thể kiểm tra 37
  50. Đồ án tốt nghiệp chất lượng và nồng độ DNA của sản phẩm PCR. Do đó, thời gian thực hiện quy trình cũng sẽ được rút ngắn. 3.4. Phản ứng cycle sequencing và đọc kết quả giải trình tự 3.4.1. Phản ứng cycle sequencing Mỗi sản phẩm PCR được thực hiện với ít nhất 2 phản ứng cycle sequencing (mỗi phản ứng sử dụng với mồi xuôi hoặc mồi ngược). Phản ứng cycle sequencing bằng mồi xuôi hoặc mồi ngược nhằm tạo ra tổ hợp các đoạn DNA chồng lắp lên nhau 1 nucleotide và kết thúc bằng 1 loại ddNTP có gắn chất bắt màu đặc hiệu phát huỳnh quang dưới tia laser. Sau đó, sử dụng phương pháp tủa bằng ethanol để thu lại lượng DNA có gắn chất bắt màu. Tủa DNA được hòa tan trong dung dịch Hidi Formamide, biến tính ở 96oC trong 2 phút trước khi làm giảm nhiệt độ nóng chảy của DNA. Quá trình này giúp DNA duỗi thẳng mạch khi biến tính và cố định DNA ở dạng mạch thẳng, hỗ trợ cho quá trình giải trình tự bằng điện di mao quản. Sau khi thực hiện phản ứng cycle sequencing thì sản phẩm được tủa bằng ethanol để loại bỏ các thành phần của dung dịch đệm, mồi, các nucleotide, các sản phẩm không đặc hiệu, đồng thời có tác dụng cô đặc DNA. Ở bước rửa bằng ethanol 70% sau khi ly tâm hút bỏ dịch nổi ở trên để giữ tủa dưới đáy tube. Lượng DNA tủa thường rất ít nên cần thao tác cẩn thận. Do đó, khi hút bỏ dịch phía trên cần phải thật nhẹ nhàng, hút đến đáy tube chứa tủa không nên cố gắng hút cho khô, tủa được làm khô tự nhiên hay làm nóng ở 50 - 70oC trong 1 - 2 phút. Tủa khô hoàn toàn sẽ làm cho tín hiệu giải trình tự được rõ ràng. Ngoài ra, khi đặt tube vào máy ly tâm chúng ta phải chú ý đặt vai tube hướng ra ngoài, để khi hút dịch nổi tránh hút phải tủa chứa DNA. 3.4.2. Đọc kết quả giải trình tự Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench 5, so sánh mẫu bệnh phẩm với trình tự DNA bộ gen và trình tự các exon chuẩn. Số thứ tự của nucleotide được tính theo chuỗi cDNA của gen RET bình thường với mã số truy cập là NG_007489 trong ngân hàng gen. 38
  51. Đồ án tốt nghiệp Do các điều kiện của phản ứng PCR cycle sequence như: hoạt tính enzyme, nồng độ hóa chất cho phản ứng (ddNTPs, dNTPs ) tín hiệu của một số nucleotide đầu và nucleotide cuối của mỗi trình tự thường bị nhiễu (các đỉnh tín hiệu không rõ ràng) do đó khó xác định chính xác tên nucleotide. Hình 3.2: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 11) với trình tự chuẩn Phân tích dữ liệu hình 3.2 cho thấy vị trí c.1900 có phát hiện sự thay đổi trình tự tại codon 634 làm thay đổi amino acid Cystein (TGC) thành amino acid Arginine (CGC), 2 chân sóng tại điểm conflict gần trùng nhau và 2 màu nucleotide khác nhau (T>C), tra dữ liệu NCBI cho kết luận đột biến này gây ra hội chứng MEN2A Hình 3.3: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 13) với trình tự chuẩn Phân tích dữ liệu hình 3.3 cho thấy vị trí c.2307 có phát hiện sự thay đổi trình tự tại codon 769 (CTT thành CTG), 2 sóng tại điểm conflict chênh lệch nhau và 2 màu 39
  52. Đồ án tốt nghiệp nucleotide khác nhau (T>G), tuy nhiên không làm thay đổi amino acid vẫn là Leucine, tra dữ liệu NCBI cho kết luận lành tính SNP Hình 3.4: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 11) với trình tự chuẩn Phân tích dữ liệu hình 3.4 cho thấy vị trí c.1900 có phát hiện sự thay đổi trình tự tại codon 634 làm thay đổi amino acid Cystein (TGC) thành amino acid Arginine (CGC), 2 chân sóng tại điểm conflict gần trùng nhau và 2 màu nucleotide khác nhau (T>C), tra dữ liệu NCBI cho kết luận đột biến này gây ra hội chứng MEN2A Hình 3.5: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 13) với trình tự chuẩn Phân tích dữ liệu hình 3.5 cho thấy vị trí c.2307 có phát hiện sự thay đổi trình tự tại codon 769 (CTT thành CTG), màu sóng tại điểm conflict khác với màu quy ước (T>G), tuy nhiên không làm thay đổi amino acid vẫn là Leucine, tra dữ liệu NCBI cho kết luận lành tính SNP 40
  53. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.6: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 11) với trình tự chuẩn Phân tích dữ liệu hình 3.6 cho thấy vị trí c.1900 có phát hiện sự thay đổi trình tự tại codon 634 làm thay đổi amino acid Cystein (TGC) thành amino acid Arginine (CGC), 2 sóng tại điểm conflict gần trùng nhau và 2 màu nucleotide khác nhau (T>C), tra dữ liệu NCBI cho kết luận đột biến này gây ra hội chứng MEN2A Hình 3.7: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 13) với trình tự chuẩn Phân tích dữ liệu hình 3.7 cho thấy vị trí c.2307 có phát hiện sự thay đổi trình tự tại codon 769 (CTT thành CTG), 2 sóng tại điểm conflict chênh lệch nhau và 2 màu nucleotide khác nhau (T>G), tuy nhiên không làm thay đổi amino acid vẫn là Leucine, tra dữ liệu NCBI cho kết luận lành tính SNP 41
  54. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 11) với trình tự chuẩn Phân tích dữ liệu hình 3.8 cho thấy vị trí c.1900 có phát hiện sự thay đổi trình tự tại codon 634 làm thay đổi amino acid Cystein (TGC) thành amino acid Arginine (CGC), 2 sóng tại điểm conflict gần trùng nhau và 2 màu nucleotide khác nhau (T>C), tra dữ liệu NCBI cho kết luận đột biến này gây ra hội chứng MEN2A Hình 3.9: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 13) với trình tự chuẩn Phân tích dữ liệu hình 3.9 cho thấy vị trí c.2307 có phát hiện sự thay đổi trình tự tại codon 769 (CTT thành CTG), màu sóng tại điểm conflict khác với màu quy ước (T>G), tuy nhiên không làm thay đổi amino acid vẫn là Leucine, tra dữ liệu NCBI cho kết luận lành tính SNP 42
  55. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 11) với trình tự chuẩn Phân tích dữ liệu hình 3.10 cho thấy vị trí c.2071 có phát hiện sự thay đổi trình tự tại codon 691 (G>A) làm thay đổi amino acid Glycine (GGT) thành amino acid Serine (AGT), 2 sóng tại điểm conflict chênh lệch nhau và 2 màu nucleotide khác nhau, tra dữ liệu NCBI cho kết luận nghi ngờ có thể gây ra hội chứng phình đại tràng bẩm sinh Hình 3.11: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 13) với trình tự chuẩn Phân tích dữ liệu hình 3.11 cho thấy vị trí c.2307 có phát hiện sự thay đổi trình tự tại codon 769 (CTT thành CTG), 2 sóng tại điểm conflict chênh lệch nhau và 2 màu nucleic khác nhau (T>G), tuy nhiên không làm thay đổi amino acid vẫn là Leucine, tra dữ liệu NCBI cho kết luận lành tính SNP 43
  56. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
  57. Đồ án tốt nghiệp 4.1. Kết luận Sau khi tiến hành đề tài, qua kết quả thu nhận và các phân tích đã trình bày trong phần III, chúng tôi kết luận: - Tối ưu hóa thành công phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế - Phân tích được trình tự DNA 6 exon (10, 11, 13, 14, 15, 16) của RET - Phát hiện đột biến trên exon 11 và 13 của gen RET (bao gồm 4 bệnh nhân trong một gia đình và một bệnh nhân không thuộc gia đình này) Bảng 4.1: Kết quả giải trình tự phát hiện SNP tại exon 11, 13 [1] Mẫu Exon 11 Exon 13 RET1 c.1900 T>C (p.Cys634Arg) c.2307 T>G (p.Leu769Leu) RET2 c.1900 T>C (p.Cys634Arg) c.2307 T>G (p.Leu769Leu) RET3 c.1900 T>C (p.Cys634Arg) c.2307 T>G (p.Leu769Leu) RET4 c.1900 T>C (p.Cys634Arg) c.2307 T>G (p.Leu769Leu) RET5 c.2071 G>A (p.Gly691Ser) c.2307 T>G (p.Leu769Leu) Kết luận: Ở exon 11 của các mẫu RET1, RET2, RET3, RET4, có phát hiện đột biến tại vị trí c.1900T>C (p.Cys634Arg) làm thay đổi Aa Cystein thành Arginine tại codon 634, đây là một đột biến thường gặp gây ra hội chứng MEN2A đã được báo cáo trước đây. Riêng mẫu RET5 có phát hiện sự thay đổi SNP ở vị trí c.2071G>A (p.Gly691Ser) và nghi ngờ hội chứng phình đại tràng bẩm sinh (Hirschsprung) Tại exon 13 của các mẫu RET1, RET2, RET3, RET4, RET5 có phát hiện SNP tại vị trí c.2307T>G (p.Leu769Leu) không làm thay đổi Aa, kết luận lành tính. 4.2. Kiến nghị Chúng ta cần tiến hành tầm soát các bất thường di truyền trên các bệnh nhân u 44
  58. Đồ án tốt nghiệp sắc bào tuyến thượng thận để có thể có kế hoạch theo dõi và điều trị. Tiến hành nghiên cứu phát hiện đột biến gây bệnh u sắc bào tuyến thượng thận trên nhiều gen khác. 45
  59. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO
  60. Đồ án tốt nghiệp Tài liệu là bài báo trong tạp chí Tiếng Anh: 1. "MEN2 Database". University of Utah. 2. Applied Biosystems, (2002). “BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Protocol”. 3. Arighi E, Borrello MG, Sariola H (2005). "RET tyrosine kinase signaling in development and cancer". Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4–5): 441– 67. doi:10.1016/j.cytogfr.2005.05.010. PMID 15982921. 4. Bausch B, Koschker AC, Fassnacht M, et al, (2006). “Comprehensive mutation scanning of NF1 in apparently sporadic cases of pheochromocytoma”. J ClinEndocrinolMetab, 91:3478–3481. 5. Buffet A, Venisse A, Nau V, et al, (2012). "A decade (2001-2010) of genetic testing for pheochromocytoma and paraganglioma". Horm Metab Res Horm Stoffwechselforschung Horm Metab, 44(5):359–366 6. Burnichon N, Buffet A, Parfait B, et al (2012). “Somatic NF1 inactivation is a frequent event in sporadic pheochromocytoma”. Hum Mol Genet, 21:5397-5405. 7. Hall. N, (2007). “Advanced sequencing technologies and their wider impact in microbiology”, The Journal of Experimental Biology 209, pp. 1518-1525, UK 8. Knudsen B. et al, (2008): CLC Sequence Viewer 9. Lenders JWM, Duh Q-Y, Eisenhofer G, Gimenez-Roqueplo A-P, Grebe SKG, Murad MH, Naruse M, Pacak K, Young WF, (2014). Endocrine Society. "Pheochromocytoma and paraganglioma: an endocrine society clinical practice guideline". J Clin Endocrinol Metab, 99(6):1915–1942 10. Lois M. Mulligan, (2014). “RET revisited: expanding the oncogenic portfolio” Nature Reviews Cancer 14, 173–186 11. Moonim MT, (2012). "Tumours of chromaffin cell origin: phaeochromocytoma and paraganglioma". Diagn Histopathol, 18(6):234–244 12. Pasmant E, Sabbagh A, Masliah-Planchon J, et al, (2011). Role of non-coding RNA ANRIL in genesis of plexiform neurofibromas in neurofibromatosis type 1. J Natl Cancer Inst, 103:1713–1722. 46
  61. Đồ án tốt nghiệp 13. Ricketts C, Woodward ER, Killick P, et al, (2008). “Germline SDHB mutations and familial renal cell carcinoma”. J Natl Cancer Inst, 100:1260–1262. 14. StratakisCA, Carney JA, (2006).” The triadof paragangliomas, gastric stromal tumours and pulmonary chondromas (Carney triad) and the dyad of paragangliomas and gastric stromal sarcomas (CarneyStratakis syndroe): molecular genetics and clinical implications”. Endocrinol Metab. 91:827–836. 15. Takahashi M, Asai N, Iwashita T, et al, (1993). "Characterization of the ret proto- oncogene products expressed in mouse L cells". Oncogene. 8 (11): 2925– 2929. PMID 8414495. 16. Wells SA, Asa SL, Dralle H, et al (2015). "Revised American Thyroid Association guidelines for the management of medullary thyroid carcinoma". Thyroid Off J Am Thyroid Assoc 25(6):567–610 Tài liệu trích dẫn từ Internet: 17. 18. 19. 20. 21. www.vsmmb.com/data/upload_file/File/ /PCR_sequencing.pdf 22. 23. 47
  62. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Pipetman P10 - P1000 Tủ an toàn sinh học cấp II Máy PCR Bồn điện di Máy soi gel Máy ủ Máy giải trình tự 3500 Thiết bị luân nhiệt Máy đo OD 1